ＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼ変異体をベースにした、百日咳菌に対する改良ワクチン
本発明は、改変ＬＰＳ分子を有する百日咳菌変異体又は取得可能なＬＰＳ分子が使用されている、百日咳に対する改良ワクチンに関する。さらに、これらの変異体又は取得可能なＬＰＳ分子は、アジュバントとして使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変ＬＰＳ分子を有する百日咳菌変異体、及び／又はこれらの変異体から取得可能なＬＰＳ分子を含む、百日咳に対する改良ワクチンに関する。さらに、これらの変異体及び／又は取得可能なＬＰＳ分子は、アジュバントとして使用できる。
【背景技術】
【０００２】
ＬＰＳは、グラム陰性菌外膜の外葉に位置する両親媒性分子である。ＬＰＳは、内毒素活性及びアジュバント活性の両方を有する。両特性とも、宿主のＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体複合体がそれを認識することに基づいている（Palsson-McDermott, E. M., and O'Neill, L. A. J. (2004) Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 113: 153-162；O'Neill, L. A. J. (2006) How Toll-like receptors signal: what we know and what we don't know. Curr. Opin. Immunol. 18: 3-9に概説されている）。ＬＰＳは、リピドＡ、コア及びＯ抗原という３つの異なった構造ドメインからなる。リピドＡは、疎水性の膜アンカーとして機能し、この分子の生理活性成分を形成している（Takada H, and Kotani S. (1989) Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit. Rev. Microbiol. 16: 477-523）。コア領域は、Ｏ抗原と比較して限定的な構造多様性しか示さない複合オリゴ糖からなる。一部の細菌、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）では、コアオリゴ糖（コアＯＳ，core oligosaccharide）を内核及び外核に分けることができる。外核は主として、ピラノシドヘキソース、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース及びＤ−グルコサミンからなり、内核は主として、オクツロソン酸及びヘプトピラノースからなる。大部分のグラム陰性菌では、特定の糖、すなわち２−ケト−３−デオキシオクツロソン酸（Ｋｄｏ，2-keto-3-deoxyoctulosonic acid）によって、コアドメインがリピドＡドメインに連結されている（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700）。Ｏ抗原は、ＬＰＳの最も可変的な部分を含み、細菌の血清型特異性を与える。それは、１〜８残基の糖からなる繰り返しの糖サブユニットで構成されている。各Ｏ鎖は、これらのサブユニットを最大５０個まで含有できる。Ｏ抗原は、細菌の免疫逃避、特に血清補体に媒介された溶解からの逃避に関係づけられている（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700）。
【０００３】
気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）及びパラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）のＬＰＳとは対照的に、百日咳菌（Bordetella pertussis）のＬＰＳは、Ｏ抗原ドメインを全く含有していない（Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232；Di Fabio, J. L., Caroff, M., Karibian, D., Richards, J. C., and Perry, M. B. (1992) Characterisation of the common antigenic lipopolysaccharide O-chains produced by Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis. FEMS Microbiol. Lett. 76: 275-281）。したがって、百日咳菌ＬＰＳはしばしば、リポオリゴ糖と呼ばれる。百日咳菌は、バンドＡ ＬＰＳ及びバンドＢ ＬＰＳという２つの優性なＬＰＳ型を産生する（Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232）。バンドＢ ＬＰＳは、リピドＡと、９残基の糖からなるコアオリゴ糖とで構成されている（Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14）。バンドＢ ＬＰＳに、Ｎ−アセチルグルコサミン、２，３−ジアセトアミド−２，３−ジデオキシ−マンヌロン酸及び２−アセトアミド−４−Ｎ−メチル−２，４−ジデオキシ−フコースからなる末端三糖を付加することによって、バンドＡと呼ばれるＬＰＳ型が生成される。
【０００４】
大腸菌（Escherichia coli）及びサルモネラエンテリカ血清型ティフィムリウム（Salmonella enterica serovar Typhimurium）では、コアＯＳ生合成遺伝子クラスターが、ｇｍｈＤ、ｗａａＱ及びＷａａＡオペロンと名づけられた３つのオペロンからなる。ｇｍｈＤオペロンは、ｇｍｈＤ及びｗａａＦＣＬという４つの遺伝子からなり、これらは内核の合成に関与している（Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682）。ｇｍｈＤ、ｗａａＦ及びｗａａＣ遺伝子は、ヘプトースＩ及びIIの生合成と、Ｋｄｏ２−リピドＡへのそれらの転移とに関与するタンパク質をコードしており（Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682）、一方、ｗａａＬ遺伝子産物は、Ｏ抗原の結合に関与するリガーゼである（MacLachlan, P. R., Kadam, S. K., and Sanderson, K. E. (1991) Cloning, characterization, and DNA sequence of the rfaLK region for lipopolysaccharide synthesis in Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 173: 7151-7163）。ｗａａＱオペロンは、３つのオペロンのなかで最大のものであり、外核の生合成及びコアＯＳの修飾／装飾に関与するタンパク質をコードしている。ｗａａＱオペロン内に存在する遺伝子の数及びタイプは、株ごとに異なっており、これによって、コア組成における株特異的な相違が説明される（Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998) Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica. Mol. Microbiol. 30: 221-232）。ｗａａＡオペロンはしばしば、ＫｄｔＡという１つのタンパク質のみをコードしている。大腸菌Ｋ−１２においてのみ、ＬＰＳに関係ない追加のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ，open reading frame）が存在している（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700）。腸内細菌科のｋｄｔＡ遺伝子は、Ｋｄｏ２−リピドＡ生合成で２つのＫｄｏ残基を付加する二機能性Ｋｄｏトランスフェラーゼをコードしている（Clementz, T., and Raetz, C. R. H. (1991) A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing. J. Biol. Chem. 266: 9687-9696）。
【０００５】
ボルデテラ及び大腸菌のコアＯＳはある程度の類似性を示すが、残基の正確な組成及び配置は著しい相違を示す。例えば、ボルデテラのコアＯＳは、大腸菌を含めた他のほとんどのグラム陰性菌で見出される２残基又は３残基の代わりに、１残基のみのＫｄｏ残基を含有している。これは、ボルデテラＫｄｔＡが、二機能性ではなく一機能性のＫｄｏトランスフェラーゼとして機能していることによると、最近示された（Isobe, T., White, K. A., Allen, A. G., Peacock, M., Raetz, C. R. H., and Maskell, D. J. (1999) Bordetella pertussis waaA encodes a monofunctional 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase that can complement an Escherichia coli waaA mutation. J. Bacteriol. 181: 2648-2651）。ボルデテラコアＯＳの残りの部分を合成する原因である酵素は、今のところ未知であり、さらなる同定が待たれている。
【０００６】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体複合体の活性化を介した、ＬＰＳの生物活性の主要決定基は、通常、そのリピドＡ部分であると考えられているが、オリゴ糖領域も、抗原提示細胞（ＡＰＣ，antigen-presenting cell）とのＬＰＳの相互作用において重要な役割を果たしうる。このタイプのＬＰＳ認識に関係づけられている受容体には、補体受容体ＣＲ３及びスカベンジャー受容体ＳＲ−Ａが含まれる（van Amersfoort, E. S., Van Berkel, T. J., and Kuiper, J. (2003) Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414；Pluddeman, A., Mukhopadhyay, S., and Gordon, S. (2006) The interaction of macrophage receptors with bacterial ligands. Exp. Rev. Mol. Med. 8: 1-25）。
【０００７】
既に、いくつかの百日咳菌ワクチンが使用された。１９４０年代及び１９５０年代における百日咳全菌体（ｗＰ，whole-cell pertussis）ワクチンの導入、並びに、それより後、１９８０年代及び１９９０年代における百日咳無細胞（ａＰ，acellular pertussis）ワクチンの導入は、百日咳発生率の漸減をもたらし、この疾患の罹患率及び死亡率を低レベルにまで低減した。ワクチン接種率が高いのにもかかわらず、百日咳疾患は風土病として残っており、２〜５年ごとの発生率ピークを有する周期性のパターンを示し続けている。最近の２０年間に、オランダを含めた数カ国が、百日咳の症例報告数の増大を経験している。興味深いことに、一部の地域では、年齢構成の移動も観察されている。ワクチン接種前及び初期ワクチンの時代では、主として若年の小児で百日咳の症例が報告されたが、近年の症例では、成人及び青年が占める比率が増大している。報告上の百日咳が再興したいくつかの理由が提唱されており、それらには、（１）伝搬されている百日咳菌株における、ワクチン有効性を低減する遺伝的変化、（２）百日咳ワクチンの効力の低減、（３）免疫の衰弱、（４）百日咳症例の報告の増加、及び（５）百日咳疾患の診断の改良が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Palsson-McDermott, E. M., and O'Neill, L. A. J. (2004) Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 113: 153-162
【非特許文献２】O'Neill, L. A. J. (2006) How Toll-like receptors signal: what we know and what we don't know. Curr. Opin. Immunol. 18: 3-9
【非特許文献３】Takada H, and Kotani S. (1989) Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit. Rev. Microbiol. 16: 477-523
【非特許文献４】Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700
【非特許文献５】Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232
【非特許文献６】Di Fabio, J. L., Caroff, M., Karibian, D., Richards, J. C., and Perry, M. B. (1992) Characterisation of the common antigenic lipopolysaccharide O-chains produced by Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis. FEMS Microbiol. Lett. 76: 275-281
【非特許文献７】Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14
【非特許文献８】Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682
【非特許文献９】MacLachlan, P. R., Kadam, S. K., and Sanderson, K. E. (1991) Cloning, characterization, and DNA sequence of the rfaLK region for lipopolysaccharide synthesis in Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 173: 7151-7163
【非特許文献１０】Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998) Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica. Mol. Microbiol. 30: 221-232
【非特許文献１１】Clementz, T., and Raetz, C. R. H. (1991) A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing. J. Biol. Chem. 266: 9687-9696
【非特許文献１２】Isobe, T., White, K. A., Allen, A. G., Peacock, M., Raetz, C. R. H., and Maskell, D. J. (1999) Bordetella pertussis waaA encodes a monofunctional 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase that can complement an Escherichia coli waaA mutation. J. Bacteriol. 181: 2648-2651
【非特許文献１３】van Amersfoort, E. S., Van Berkel, T. J., and Kuiper, J. (2003) Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414
【非特許文献１４】Pluddeman, A., Mukhopadhyay, S., and Gordon, S. (2006) The interaction of macrophage receptors with bacterial ligands. Exp. Rev. Mol. Med. 8: 1-25
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、既存のワクチンの全欠点を示さない、百日咳菌に対する新規ワクチンが依然として必要性である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、改変されたオリゴ糖鎖を有する百日咳菌変異体が、樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）とのそれらの相互作用において影響されうるであろうという仮説に基づいている。ＤＣなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）への特異的ターゲッティングは、おそらく、百日咳全菌体ワクチンに対する免疫応答の帰結に影響を与えうるであろう。この経路による、全菌体ワクチンの改良に向けた最初のステップとして、本発明者らは終に、百日咳菌におけるＬＰＳオリゴ糖生合成に関与する遺伝子クラスターを同定した。特に、このクラスター内の２つの遺伝子は、不活性化又は過剰発現された際にＤＣと相互作用して、それらを活性化する潜在的能力が改善されている変異体を生じる。
【００１１】
ポリペプチド
第１の態様では、本発明は、２つのポリペプチドを提供する。第１のポリペプチドは、多糖デアセチラーゼであり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。第２のポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼであり、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１２】
多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドそれぞれの活性は、本明細書で下記に定義する通り、百日咳菌株でそれぞれのコード遺伝子をそれぞれ不活性化及び過剰発現し、取得可能なＬＰＳを分析することによって評価することが好ましい。形質転換された百日咳菌株によって産生されたＬＰＳが、本明細書で下記に定義する、本発明のＬＰＳを少なくとも検出可能な量で含む場合、多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドそれぞれが活性且つ機能的であるといわれるであろう。検出可能な量のＬＰＳは、実施例に記載の通り、熱フェノール／水抽出を用いた単離（Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91）、穏やかな加水分解によるＯ−脱アシル化（Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ）、及び陰イオンモードにおけるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ，Electrospray-ionization Mass spectrometry）の後で検出可能であることが好ましい。
【００１３】
さらに好ましい実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。最も好ましい実施形態では、多糖デアセチラーゼが配列番号１を有する。この多糖デアセチラーゼは、百日咳菌から生じたものである。配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号３に示す。
【００１４】
別のさらに好ましい実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。好ましい実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼが配列番号２を有する。このグリコシルトランスフェラーゼは、百日咳菌から生じたものである。配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号４に示す。
【００１５】
同一性のパーセントは、アラインメントされた配列間で同一であるアミノ酸残基の数を、アラインメントされた配列の長さからすべてのギャップの長さを引いた数で割った値として計算される。多重配列アラインメントは、デフォルト設定を用いたDNAman4.0最適アラインメントプログラムを用いて行った。アラインメントは、通常、それらの配列番号によって特定されている配列又はそれらの部分の間で行われる。アラインメントは、それらの配列番号によって特定されている配列を用いて行うことが好ましい。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、それらが必要な活性及び同一性を有する限り、百日咳菌以外の生物からも取得できるであろうことを当業者ならば理解するであろう。好ましい実施形態では、上記に特定した各ポリペプチドを百日咳菌、気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌などのボルデテラ属種から取得する。上記に特定した各ポリペプチドを百日咳菌から取得することが最も好ましい。１株の単独な百日咳菌株又は数株の異なった百日咳菌株が、本発明によるいくつかの相同体ポリペプチドを有しうる。
【００１７】
別の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、上記に定義されたポリペプチド配列のうちのいずれか１つの変種である。変種ポリペプチドは、そのポリペプチドの、天然に存在しない形態のものでもよい。ポリペプチド変種は、なんらかの操作によって、天然源から単離されたポリペプチドと異なっていてもよい。変種は、配列番号１のアミノ酸配列から、又は配列番号２から、又は配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、すなわち配列番号３から、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列、すなわち配列番号４から開始する部位特異的変異導入によって作製できる。ポリペプチド変種は、コードされているポリペプチドの生物学的機能を改変しない変異を含有するものが好ましい。多糖デアセチラーゼ又はグリコシルトランスフェラーゼのいずれかの生物学的機能又は活性は、本明細書で既に定義されている。
【００１８】
本発明の別の態様では、共に薬物を調製するために使用するための、上記に定義した多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼのそれぞれを提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００１９】
核酸配列
本発明の第２の態様では、２つの核酸配列を提供する。第１の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する多糖デアセチラーゼ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有し、且つ／又はボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から生じたものである、多糖デアセチラーゼをコードしている。
【００２０】
第１の核酸配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列であることが好ましい。上記同一性は、少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％あることが好ましい。上記核酸配列は、配列番号３の核酸配列を有することが最も好ましい。配列番号３はＮＰ＿８８０９６６８に相当する。
【００２１】
第２の核酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有し、且つ／又はボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から生じたものである、グリコシルトランスフェラーゼをコードしている。
【００２２】
第２の核酸配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列であることが好ましい。上記同一性は、少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％あることが好ましい。上記核酸配列は、配列番号４の核酸配列を有することが最も好ましい。配列番号４はＮＰ＿８８０９６６９に相当する。
【００２３】
同一性のパーセントは、配列中の同一なヌクレオチドの数を、総ヌクレオチド長からいかなるギャップの長さも引いた数で割った比率を計算することによって決定した。ＤＮＡ多重配列アラインメントは、最適アラインメント（完全アラインメント）プログラムを用いたDNAmanバージョン４．０を用いて行った。５０％以上の同一性レベルを示す関連のＤＮＡ配列の最短長は、４０ヌクレオチド以上であるべきである。アラインメントは、通常、それらの配列番号によって特定されている配列又はそれらの部分の間で行われる。アラインメントは、それらの配列番号によって特定されている配列を用いて行うことが好ましい。
【００２４】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の核酸配列は、上記に定義した核酸配列のうちの任意のものの変種である。核酸配列変種は、上記に定義したポリペプチド変種を調製するのに使用できる。核酸変種は、上記に定義した核酸配列のうちのいずれのものの断片であってもよい。核酸変種は、遺伝暗号の縮重によって配列番号３又は配列番号４とは異なっている核酸配列でもよい。核酸変種は、配列番号３又は配列番号４の対立遺伝子変種でもよい。対立遺伝子変種は、同じ染色体遺伝子座を占める、ある遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれをも指す。好ましい核酸変種は、１又は複数のサイレント変異を含有する核酸配列である。代替として、又はこれらと組み合わせて、ヌクレオチド置換を導入することによって核酸変種を取得してもよく、その際、ヌクレオチド置換は、その核酸配列によってコードされているポリペプチドの別のアミノ酸配列をもたらすものではなく、本発明のポリペプチドの産生用に意図されている宿主生物のコドン使用頻度に対応するものである。好ましい実施形態によれば、核酸変種は、本明細書で上記に定義した生物学的機能を依然として示すポリペプチドをコードしている。核酸配列変種は、それぞれ多糖デアセチラーゼ活性又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードしていることが、より好ましい。そのようなポリペプチドをコードする核酸配列は、いかなる微生物から単離されたものでもよい。
【００２５】
これらすべての変種は、プローブを設計するのに使用できる配列番号３若しくは配列番号４又はその変種の核酸配列を用いた、低、中、高ハイブリダイゼーション条件下におけるハイブリダイゼーション（サザンブロッティング手順）によるライブラリースクリーニングなど、当業者に知られている技法を用いて取得できる。低、中、高ストリンジェンシー条件とは、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、及びそれぞれ低、中、高ストリンジェンシー用に２５％、３５％又は５０％のいずれかのホルムアミド中における、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。これに続いて、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、及び低、中、高ストリンジェンシー用に５５℃、６５℃又は７５℃を用いて、ハイブリダイゼーション反応物を各３０分間、３回洗浄する。
【００２６】
本明細書に提示の配列情報は、誤って同定された塩基を包含する必要があるように、あまり狭義に解釈するべきでない。当業者ならば、そのような誤って同定された塩基を特定でき、そのような間違いを修正する方法を知っている。
【００２７】
本発明の別の態様では、両核酸とも薬物を調製するために使用するための、上記に定義した多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼのそれぞれをコードする核酸を提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００２８】
核酸コンストラクト
さらに別の態様では、本発明は、上記のセクションで定義した核酸配列のうちの任意のものを含む核酸コンストラクトであって、前記核酸配列が、
−多糖活性を示し、且つ配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
−グリコシルトランスフェラーゼ活性を示し、且つ配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードしている核酸コンストラクトに関する。
【００２９】
核酸コンストラクト内に存在している核酸配列は、適した発現宿主におけるポリペプチドの産生を指示する１又は複数の制御配列に作動可能に連結されていてもよい。
【００３０】
作動可能に連結されているとは、本明細書では、制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に対して、上記制御配列が本発明のポリペプチドの産生を指示するような位置に、適切に置かれている配置として定義される。
【００３１】
限定されるものではないが、発現には、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含めた、ポリペプチドの産生に関与するいかなるステップも含まれると理解されよう。
【００３２】
核酸コンストラクトは、天然存在の遺伝子から単離されているか、又はそうでなければ天然に存在しないであろう様式で結合又は並列されている核酸セグメントを含有するように改変されている核酸分子と定義されている。
【００３３】
制御配列は、本明細書では、ポリペプチドの発現に必要又は有利であるすべての構成要素がそれに含まれるように定義されている。最小限でも、制御配列には、プロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。
【００３４】
発現ベクター
本発明はさらに、多糖デアセチラーゼ活性を示し、且つ上記のセクションで定義した、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む発現ベクターに関する。上記発現ベクターは、適した発現宿主における、コードされているポリペプチドの産生を指示する１又は複数の制御配列に作動可能に連結されている前記核酸配列を含むことが好ましい。最小限でも、制御配列には、プロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。上記発現ベクターは、組換え体発現ベクターとして考えることができる。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順を好都合に施すことができ、且つポリペプチドをコードする核酸配列の発現を誘発できるいかなるベクターでもよい（例えば、プラスミド、ウイルス）。この発現ベクターが導入されるであろう宿主のアイデンティティーと、本発明の核酸配列の起源とに応じて、最も適した発現ベクター及び制御配列を選択する方法を、当業者は知っていよう。最も好ましい宿主細胞は、宿主細胞という題のセクションに示す。
【００３５】
本発明との関連では、発現ベクターは、宿主細胞内に導入された際に、発現ベクター内に存在する核酸配列の発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの活性レベルの増大を有する細胞をもたらすであろう。この関連では、上記増大は、前記発現ベクターを含まない宿主細胞と比較することによって、且つ／又は配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する内因性ポリペプチドを含まない宿主細胞と比較することによって評価される。
【００３６】
本発明の別の態様では、薬物を調製するために使用するための、上記に定義した発現ベクターを提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００３７】
不活性化ベクター
本発明はさらに、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、且つ上記のセクションで定義した、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む不活性化ベクターに関する。不活性化ベクターは、所与の宿主における、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列の発現を低下又は不活性化するように設計される。
【００３８】
上記不活性化ベクターは、組換え体発現ベクターとして考えることができる。不活性化ベクターは、組換えＤＮＡ手順を好都合に施すことができ、且つ上記に定義した核酸配列の発現の不活性化を誘発できるいかなるベクターでもよい（例えば、プラスミド、ウイルス）。この不活性化ベクターが導入される宿主のアイデンティティーと、本発明の核酸配列の起源とに応じて、最も適した不活性化ベクターを選択する方法を当業者は知っていよう。最も好ましい宿主細胞は、宿主細胞という題のセクションに示す。
【００３９】
本発明との関連では、不活性化ベクターは、宿主細胞内に導入された際に、発現ベクター内に存在する核酸配列の発現レベルの低減（又は低下）、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現レベルの低減、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの活性レベルの低減を有する細胞をもたらすであろう。この関連では、上記低減は、前記不活性化ベクターを含まない宿主細胞との比較によって評価されることが好ましい。
【００４０】
グリコシルトランスフェラーゼ活性を示し、且つ配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現レベルの低減及び／又は活性レベルの低下は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば宿主における、前記グリコシルトランスフェラーゼをコードする内因性核酸配列の発現を不活性化又は下方制御するなどによって、実現されていてもよい。この不活性化又は下方制御は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列中の１又は複数のヌクレオチドの欠失によって実現されていてもよい。別の実施形態では、本発明は、前記グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に変異を有する宿主、好ましくはボルデテラに関する。グリコシルトランスフェラーゼをコードする、不活性化された核酸配列を有する宿主を構築するには、置換又は不活性化ベクターを調製し、その後、形質転換によって宿主に導入することが好ましい。当業者ならば、そのようなベクターを構築する方法を知っていよう。
【００４１】
グリコシルトランスフェラーゼをコードする内因性核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における低レベルのタンパク質発現に適した弱いプロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現を低下させることができる。
【００４２】
内因性のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における、誘導性レベルのタンパク質発現に適した誘導性プロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現に誘導性を与えることができる。
【００４３】
上記に定義した好ましい実施形態の代替として、又はそれと組み合わせて、自殺ベクターを用いることによって、内因性のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の不活性化を実現することが好ましい。自殺ベクターはpSS1129（Stibitz, S. (1994) Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange）であることが、より好ましい。
【００４４】
本発明の別の態様では、薬物を調製するために使用するための、上記に定義した不活性化ベクターを提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００４５】
宿主細胞
さらに別の態様では、本発明は、共に上記のセクションで定義されている、本発明の発現ベクター及び／又は本発明の不活性化ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞の選択は、大部分、本発明の核酸配列の取得源によるであろう。宿主細胞のアイデンティティーに応じて、当業者ならば、本発明のコンストラクト又はベクターでそれを形質転換する方法を知っていよう。
【００４６】
宿主細胞は、本発明のＬＰＳの発現に適したいかなる微生物細胞、原核細胞又は真核細胞でもよい。好ましい実施形態では、宿主細胞は、本明細書で上述したボルデテラ属種である。上記ボルデテラは百日咳菌であることが最も好ましい。
【００４７】
ボルデテラの形質転換に適した手順は、当業者に知られている様式での接合を含む方法を用いたものでありうる。ボルデテラに適した形質転換手順は、（Stibitz, S. (1994) Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange）に記載されている。
【００４８】
第１の好ましい実施形態によれば、このようにして取得された宿主細胞は、発現ベクター内に存在する核酸配列の発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの活性レベルの増大を有する。この実施形態では、発現コンストラクト内に存在する核酸配列が、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードしている。この関連では、上記増大は、両方とも同じ条件下で培養及び／又はアッセイされた場合に、前記発現ベクターを含まない宿主細胞と比較することによって、且つ／又は配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する内因性ポリペプチドを含まない宿主細胞と比較することによって評価される。
【００４９】
「ポリペプチドの発現レベルの増大」とは、本明細書では、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、上記に定義したポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生するものより多く産生することと定義されることが好ましい。本発明の宿主細胞は、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する本発明のポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生する量より少なくとも３％、６％、１０％又は１５％多く産生することが好ましい。前記ポリペプチドを、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％多く産生する宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞における、このポリペプチドの産生レベルは、Ｂ２１３百日咳菌株の産生レベル（Kasuga, B., Nakase, Y., Ukishima, K., and Takatsu, K. (1953) Studies on Haemophilus pertussis. Kitasato Arch. Exp. Med. 27: 21-28、表１も参照）を対照として、それと比較される。さらに好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における上記ポリペプチドの産生レベルは、上記に定義したＢ２１３株の産生レベルを対照として、それと比較される。
【００５０】
ポリペプチドの産生レベルの評価は、ノーザンブロット又はアレイ分析を行うことによって、ｍＲＮＡレベルで行うことができ、且つ／又はウエスタンブロットを行うことによって、ポリペプチドレベルで行うことができる。これらのすべての方法は当業者によく知られている。
【００５１】
「ポリペプチド活性の増大」とは、本明細書では、前記活性に特異的なアッセイを用いて、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞のものより高い多糖デアセチラーゼ活性を示すことと定義されている。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションで言及するものが好ましい。本発明の宿主細胞は、前記活性に特異的なアッセイを用いてアッセイされた際に、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が示す活性より、少なくとも３％、６％、１０％又は１５％高い多糖デアセチラーゼ活性を示すことが好ましい。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションで言及するアッセイであることが好ましい。前記活性を、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％多く示す宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞における多糖デアセチラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。より好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における多糖デアセチラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。
【００５２】
ポリペプチド発現及び／又は活性の増大は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば、天然に存在しているよりも多くのコピーの、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を宿主に導入することなどによって実現されていてもよく、上記核酸配列は、担体上にあっても、染色体上にあってもよい。代替として、選択された生物における高レベルタンパク質発現に適した強く発現されるプロモーター又は強力なプロモーターに、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、又はこれら２通りのアプローチの組合せによって、上記核酸配列を過剰発現させることもできる。当業者ならば、宿主細胞のアイデンティティーに応じて、どの強力なプロモーターが最も適切であるか知っていよう。宿主細胞が百日咳菌株である場合、強力なプロモーターは、ベクターpMMB67EHのｔａｃプロモーター（Methods for General and Molecular Bacteriology, Editors P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC, 1994, p.409-410）であることが好ましい。
【００５３】
第１の好ましい実施形態の代替として、又はそれと組み合わせて、本発明は、第２の好ましい実施形態を提供し、この実施形態では、宿主細胞は、好ましくは本明細書で上記に定義した本発明の不活性化ベクターの使用を介した、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の発現レベルの低減、及び／又は前記ポリペプチドの発現レベルの低減、及び／又は前記ポリペプチドの活性レベルの増大を有する。この実施形態では、不活性化ベクター内に存在している核酸配列が、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードしている。この関連では、低減は、両方とも同じ条件下で培養及び／又はアッセイした場合に、前記不活性化ベクターを含まない宿主細胞と比較することによって評価される。
【００５４】
「ポリペプチドの発現レベルの低減」とは、本明細書では、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、上記に定義したポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生するものより少なく産生することと定義されることが好ましい。本発明の宿主細胞は、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有する本発明のポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生する量より少なくとも３％、６％、１０％又は１５％少なく産生することが好ましい。前記ポリペプチドを、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％少なく産生する宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞における、このポリペプチドの産生レベルは、上記に定義したＢ２１３株の産生レベルを対照として、それと比較される。さらにより好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における上記ポリペプチドの産生レベルは、上記に定義したＢ２１３株の産生レベルを対照として、それと比較される。
【００５５】
ポリペプチドの産生レベルの評価は、ノーザンブロット又はアレイ分析を行うことによって、ｍＲＮＡレベルで行うことができ、且つ／又はウエスタンブロットを行うことによって、ポリペプチドレベルで行うことができる。これらのすべての方法は当業者によく知られている。
【００５６】
「ポリペプチド活性の低減」とは、本明細書では、前記活性に特異的なアッセイを用いて、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞のものより低いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すことと定義されている。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションで既に本明細書に記載されているものが好ましい。本発明の宿主細胞は、前記活性に特異的なアッセイを用いてアッセイされた際に、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が示す活性より、少なくとも３％、６％、１０％又は１５％低いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すことが好ましい。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションに記載のアッセイであることが好ましい。前記活性を、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％多く示す宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。より好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における多糖デアセチラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。
【００５７】
ポリペプチド発現及び／又は活性の低減は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば、天然に存在しているよりも多くのコピーの、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を宿主に導入することなどによって実現されていてもよく、上記核酸配列は、担体上にあっても、染色体上にあってもよい。代替として、選択された生物における高レベルタンパク質発現に適した、強く発現されるプロモーター又は強力なプロモーターに、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、又はこれら２通りのアプローチの組合せによって、上記核酸配列を過剰発現させることもできる。当業者ならば、宿主細胞のアイデンティティーに応じて、どの強力なプロモーターが最も適切であるか知っていよう。宿主細胞が百日咳菌株である場合、強力なプロモーターは、上述した、ベクターpMMB67EHのｔａｃプロモーターであることが好ましい。
【００５８】
より好ましい実施形態によれば、宿主細胞は、いかなる検出可能な量もの、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを産生せず、且つ／又はいかなる検出可能なグリコシルトランスフェラーゼ活性も示さない。宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼを産生しないか、又は実質的に産生しないことが好ましい。
【００５９】
代替として、別のさらに好ましい実施形態によれば、宿主細胞は、誘導性の量の、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを産生し、且つ／又は誘導性のグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【００６０】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルの低減及び／又はその活性レベルの低減は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば宿主の内因性グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を不活性化又は下方制御することなどによって実現されていてもよい。この不活性化又は下方制御は、コード遺伝子内の１又は複数のヌクレオチドの欠失によって実現されていてもよい。別の実施形態では、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列内に変異を有する宿主、好ましくは百日咳菌に関する。グリコシルトランスフェラーゼをコードする不活性化されている核酸配列を有する宿主を構築するには、置換又は不活性化ベクターを調製して、その後、形質転換によって宿主に導入することが好ましい。当業者ならば、そのようなベクターを構築する方法を知っていよう。
【００６１】
内因性の核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における低レベルのタンパク質発現に適した弱いプロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現を低減することができる。
【００６２】
内因性の核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における、誘導性レベルのタンパク質発現に適した誘導性プロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現に誘導性を与えることができる。宿主細胞が百日咳菌株である場合、誘導性プロモーターは、上記に定義したベクターpMMB67EHのｔａｃプロモーターであることが好ましい。
【００６３】
驚いたことに、本発明の宿主細胞は、百日咳全菌体ワクチンとして、又はアジュバントとしての使用を極めて魅力的なものにする魅力的な特性、すなわちＤＣと相互作用して、それに続いてそれらの成熟を誘導し、且つ炎症誘発性サイトカインの産生を誘導する潜在能の向上を有する。代替として、又は組み合わせて、これらの細胞から取得可能なＬＰＳも、ワクチンとして、又は下記に示すアジュバントとして使用するのに極めて適している。
【００６４】
したがって、本発明の別の態様では、薬物として使用するための、上記に定義した宿主細胞を提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００６５】
宿主細胞によって取得可能なＬＰＳ
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で上記に定義した、本発明の宿主細胞から取得可能なＬＰＳに関する。宿主細胞は、好ましくはボルデテラ属種であり、より好ましくは百日咳菌であり、さらにより好ましくは本発明の多糖デアセチラーゼの過剰発現及び／又は本発明のグリコシルトランスフェラーゼの不活性化を保持する百日咳菌である。本発明のＬＰＳは、実施例で調製されている通り、変異体２３３１から取得可能であることが、より好ましい。
【００６６】
本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、熱フェノール／水抽出を用いた単離（Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91）、穏やかな加水分解によるＯ−脱アシル化（Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ）、及び陰イオンモードにおけるＥＳＩ−ＭＳによる分析の後で分析した際に、野生型ＬＰＳと名づけられた、野生型百日咳菌由来のＬＰＳの対応するＥＳＩ−ＭＳスペクトルより多くのイオンを与えることを特徴とすることが、さらにより好ましい。野生型百日咳菌は、上記に定義した株Ｂ２１３であることが好ましい。いかなる理論にも拘泥するものではないが、これらの追加のイオンは、ヘキソサミン残基を有するＬＰＳのリピドＡ部分の１又は４’リン酸基の置換の増大を少なくとも一部反映したものでありうる。
【００６７】
通常、野生型ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、７種のイオン（表３参照）を示すことを特徴とするが、本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、７種超のイオン、すなわち少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、そしてより好ましくは１４種のイオンを示すことを特徴とする。
【００６８】
上記の実施形態の代替として、又はそれと組み合わせて、本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ヘキソサミンを含むイオンを、野生型ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルより多く含むことが好ましい。通常、野生型ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ヘキソサミンを有するイオンを２種示すが（表３）、本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、２種超のイオン、すなわち少なくとも４種、少なくとも６種、そしてより好ましくは８種のイオンを示すことを特徴とする。
【００６９】
医薬組成物及び医学的使用
本発明はさらに、両方とも本明細書で上記に定義した、本発明の宿主細胞及び／又は本発明のＬＰＳを含む医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、ワクチンとして、又はアジュバントとして使用できる。上記ワクチンは、哺乳動物の免疫化（免疫応答の誘導）又はワクチン接種に使用できる。
【００７０】
アジュバントは、本明細書では、抗原と組み合わせて使用した場合、好ましくはアジュバント自体に対する特異的な免疫応答を生成させずに、哺乳動物、好ましくはヒトを免疫化し、免疫系を刺激し、それによって抗原に対する免疫応答を誘発、強化又は促進する物質又は化合物のいかなるものもそれに含まれると定義されている。好ましいアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を、同一条件下、但しアジュバントの非存在下で抗原に対して生成された免疫応答と比較して、少なくとも係数１．５、２、２．５、５、１０又は２０で強化する。動物又はヒトの群において、対応する対照群を超えて、アジュバントによって産生される、所与の抗原に対する免疫応答の強化の統計的平均を決定する試験が、当技術分野で利用可能である。アジュバントは、少なくとも２種の異なった抗原に対する免疫応答を強化できることが好ましい。通常、本発明のアジュバントは、哺乳動物にとって外来の化合物であり、それにより、例えば、インターロイキン、インターフェロン及び他のホルモンなど、哺乳動物にとって内因性の免疫活性化化合物は除外されるであろう。
【００７１】
好ましい実施形態では、上記医薬組成物がアジュバントとして使用される場合、上記組成物が抗原をさらに含む。
【００７２】
上記組成物がワクチンとして使用される場合、抗原は、本発明の宿主細胞の表面に存在し、且つ／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳ内に存在する。この場合、ワクチンは、本発明の宿主に対するワクチンであり、且つ／又は関連するＬＰＳ分子を発現できる任意の宿主に対するワクチンであることが好ましい。
【００７３】
上記組成物がアジュバントとして使用される場合、抗原が存在することが好ましい。上記抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、癌細胞からの抗原、又はそれらによって産生された抗原、又は下記に定義するアレルゲンであることが好ましい。本発明の抗原及び宿主細胞並びに／又はそのような細胞によって取得可能なＬＰＳは、上記細菌、ウイルス、真菌類若しくは寄生虫によって引き起こされた感染症、又は上記癌細胞によって引き起こされた腫瘍、又は上記アレルゲンによって引き起こされたアレルギーの治療及び／又は予防に用いることが好ましい。
【００７４】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞及び／又はそれから取得可能なＬＰＳを含み、且つ本明細書で上記に定義した抗原を含んでもよい医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む。上記医薬組成物は、薬学的に許容される安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤及び分散剤などをさらに含みうる。上記医薬組成物の好ましい剤形は、投与及び治療適用の意図されている様式に依存する。薬学的担体は、活性成分、すなわち本発明の宿主細胞及び／又はこの宿主細胞から取得可能なＬＰＳ並びにオプションで抗原を、患者に送達するのに適した適合性且つ無毒のいかなる物質でもよい。鼻腔内送達用の薬学的に許容される担体は、水、緩衝生理食塩溶液、グリセリン、ポリソルベート２０、クレモホールEL及びカプリル／カプリングリセリドの水性混合物によって例示され、中性ｐＨ環境を用意するために緩衝化されていてもよい。非経口送達用の薬学的に許容される担体は、０．９％無菌緩衝化ＮａＣｌ、又は２０％アルブミンが補足されていてもよい５％グルコースによって例示される。非経口投与用の製剤は無菌でなければならない。上記活性成分を投与するための非経口経路は、既知な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内又は病巣内経路による注射又は注入に一致している。本発明の組成物は、ボーラス注入によって投与することが好ましい。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば、１〜１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水と、１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの抗原と、１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの本発明の宿主細胞及び／又はＬＰＳとを含有するように調製されよう。経口投与用には、エリキシル剤、シロップ剤及び懸濁液などの液体剤形中で活性成分を投与できる。経口投与用の液体剤形は、患者の認容性を増大させる着色剤及び風味剤を含有しうる。非経口、経口又は鼻腔内投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)（あらゆる目的のために、その全体が、参照により組み込まれる）を含めた、様々な情報源により詳細に記載されている。
【００７５】
本発明の組成物中の抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生生物、癌細胞又はアレルゲン由来であるか、それらによって産生された抗原であることが好ましい。本発明の宿主細胞及び／又はＬＰＳと併用できるウイルス抗原は、あらゆる種類のウイルスに由来するものでありえ、そのようなウイルスの非限定的な例は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ，Human Immunodeficiency virus）などのレトロウイルス科（Retroviridae）；風疹ウイルス（rubellavirus）；パラインフルエンザウイルス（parainfluenza virus）、麻疹（measles）、おたふくかぜ（mumps）、呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus）、ヒトメタニュウモウイルス（human metapneumovirus）などのパラミクソウイルス科（paramyxoviridae）；黄熱ウイルス（yellow fever virus）、デングウイルス（dengue virus）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ，Hepatitis C Virus）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ，Japanese Encephalitis Virus）、ダニ媒介脳炎（tick-borne encephalitis）、セントルイス脳炎（St. Louis encephalitis）又は西ナイルウイルス（West Nile virus）などのフラビウイルス科（flaviviridae）；単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex virus）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）、エプスタイン−バーウイルス（Epstein-Barr virus）などのヘルペスウイルス科（Herpesviridae）；ブニアウイルス科（Bunyaviridae）；アレナウイルス科（Arenaviridae）；ハンタン（Hantaan）などのハンタウイルス科（Hantaviridae）；コロナウイルス科（Coronaviridae）；ヒトパピローマウイルス（human Papillomavirus）などのパポーバウイルス科（Papovaviridae）；狂犬病ウイルス（rabies virus）などのラブドウイルス科（Rhabdoviridae）；ヒトコロナウイルス（human coronavirus）などのコロナウイルス科（Coronaviridae）；アルファウイルス科（Alphaviridae）；アルテリウイルス科（Arteriviridae）；エボラウイルス（Ebolavirus）などのフィロウイルス科（filoviridae）；アレナウイルス科（Arenaviridae）；天然痘ウイルス（smallpox virus）などのポックスウイルス科（poxviridae）及びアフリカブタコレラウイルス（African swine fever virus）である。同様に、本発明の宿主細胞及び／又はＬＰＳは、病原細菌、真菌（酵母を含める）又は寄生虫由来の抗原と組み合わせることができる。そのような抗原には、例えば、ピロリ菌（H. pylori）などのヘリコバクター属（Helicobacter）；髄膜炎菌（N. mengitidis）などのナイセリア属（Neisseria）；インフルエンザ菌（H. influenza）などのヘモフィルス属（Haemophilus）；百日咳菌（B. pertussis）などのボルデテラ属（Bordetella）；クラミジア属（Chlamydia）；連鎖球菌種血清型Ａ（Streptococcus sp. serotype A）などのストレプトコッカス属（Streptococcus）；コレラ菌（V. cholera）などのヴィブリオ属（Vibrio）；例えば、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）及びエシェリキア属（Escherichia）を含めたグラム陰性腸内病原体の細菌抗原が含まれ、同様に、炭疸、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス及び淋疾を引き起こす細菌からの抗原も含まれる。寄生虫からの抗原には、例えば、ウシバベシア原虫（Babeosis bovis）、マラリア原虫（Plasmodium）、リーシュマニア属諸種（Leishmania spp.）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）及びクルーズトリパノソーマ（T. cruzi）などのトリパノソーマ属（Trypanosoma）などの原生動物由来の抗原が含まれる。真菌抗原には、アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）などのクリプトコッカス（Cryptococcus）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）などの真菌に由来する抗原が含まれうる。
【００７６】
ワクチン接種は、通常、病原体に対する予防防御用又は病原体感染に続く疾患の治療用に適用されるが、当業者は、腫瘍治療用のワクチンの適用を認識している。さらに、増加している数の腫瘍特異的タンパク質が、ヒト抗体又はヒト化抗体によってターゲッティングできる適切な実体であると判明している。そのような腫瘍特異的タンパク質も、本発明の範囲に包含される。多くの腫瘍特異抗原が当技術分野で知られている。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、上記に定義した腫瘍特異抗原と、宿主細胞及び／又はＬＰＳとを含む組成物を提供する。適した腫瘍抗原には、例えば、癌胎児抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異抗原、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多型上皮ムチン（ＰＥＭ，polymorphic epithelial mucin）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、（末端欠失型）上皮成長因子受容体（ＥＧＲＦ，epidermal growth factor receptor）、ＨＥＲ２、Ｔ（Thomsen-Friedenreich）抗原、ＧＭ−２及びＧＤ−２ガングリオシド、Ｅｐ−ＣＡＭ、ムチン−１、上皮糖タンパク質−２及び大腸特異抗原が含まれる。
【００７７】
加えて、自己免疫疾患の予防における寛容性を誘導するために、抗原をＤＣにターゲッティングできる。そのようなアレルゲンも、本発明の範囲に包含される。
【００７８】
したがって、さらに別の態様では、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、薬として使用するためのものである。上記薬は、百日咳に対するワクチンであることが好ましい。
【００７９】
別の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳが、アジュバントとして使用するためのものである。本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、抗原と組み合わせて使用するのが、より好ましい。
【００８０】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳの使用に関する。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するためのアジュバントとして使用される。本発明の宿主細胞及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、前記抗原と組み合わせてアジュバントとして使用されることが、より好ましい。
【００８１】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、本明細書で上記に定義した本発明のポリペプチド及び／又は本明細書に定義した本発明の核酸配列の使用に関する。
【００８２】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、アジュバントを調製するための、本明細書で上記に定義した本発明のポリペプチド及び／又は本明細書で上記に定義した本発明の核酸配列の使用に関する。この態様では、本明細書で上記に定義した本発明のポリペプチド及び／又は本明細書で上記に定義した本発明の核酸配列は、抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するために、抗原と組み合わせて使用することが好ましい。
【００８３】
本発明の方法及び使用では、上記哺乳動物がヒトであることが好ましい。
【００８４】
この文書及びこれに添付されている特許請求の範囲では、「含む（to comprise）」という動詞及びその活用型は、その単語に続く項目が含まれるが、明示的に言及されなかった項目も除外されないことを意味するように非限定的な意味で使用される。加えて、不定冠詞「a」又は「an」による要素の指示は、それらの要素が唯一無二で存在することを文脈が明確に要求しない限り、それらの要素が１を超える数で存在する可能性を除外しない。したがって、通常、不定冠詞「a」又は「an」は「少なくとも１（at least one）」を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】同定されたグリコシルトランスフェラーゼオペロンの模式図である。暗灰色の矢印は、推定上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を示し、一方、明灰色及び白色の矢印は、それぞれ、推定上の単糖デアセチラーゼをコードする遺伝子及び隣接のＯＲＦを示す。
【図１Ｂ】トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、野生型百日咳菌株（ＷＴ）、並びにＢＰ２３２９、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３３１変異体株からのＬＰＳプロファイルの分析を示す図である。
【図２Ａ】野生型百日咳菌のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図２Ｂ】百日咳菌変異体株ＢＰ２３２８のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図２Ｃ】百日咳菌変異体株ＢＰ２３２９のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図２Ｄ】百日咳菌変異体株ＢＰ２３３１のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図３Ａ】ＢＰ２３３１変異体株からのＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンモード直列質量分析を示す図であり、ｍ／ｚ １１０８．３のイオンの抽出ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】ＢＰ２３３１変異体株からのＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンモード直列質量分析を示す図であり、ｍ／ｚ １１６２．０のイオンの抽出ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図３Ｃ】ＢＰ２３３１変異体株からのＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンモード直列質量分析を示す図であり、ｍ／ｚ １１６２．０のイオンから、ｍ／ｚ １１１２．６のイオンの抽出ＭＳ３スペクトルを示す図である。
【図４Ａ】野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、ＭＯＩ１０（黒色の実線）又は１００（破線）の、ＰＦＡ固定された野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された２４時間後のヒトＤＣにおける、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ４０の細胞表面発現の分析を示す図である。刺激されていないＤＣを対照として用いた（灰色で塗りつぶされたヒストグラム）。５０００回カウントされたイベントから得られた、表示の百日咳菌株のＦＡＣＳヒストグラムが示されている。縦軸は細胞数を表し、横軸は染色の強度を表す。
【図４Ｂ】野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、ＭＯＩ１０又は１００の、ＰＦＡ固定された野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された後の培養ヒトＤＣによるＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の産生を示す図である。結果は、平均サイトカイン濃度（±ＳＤ）で表されている。
【図５Ａ】精製された野生型及び変異体百日咳菌ＬＰＳで刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、１μｇ／ｍｌの精製ＬＰＳで刺激された２４時間後のヒトＤＣにおける、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ４０の細胞表面発現の分析を示す図である。刺激されていないＤＣを対照として用いた（灰色で塗りつぶされたヒストグラム）。５０００回カウントされたイベントから得られた、表示の百日咳菌株のＬＰＳのＦＡＣＳヒストグラムが示されている。縦軸は細胞数を表し、一方、横軸は染色の強度を表す。
【図５Ｂ】精製された野生型及び変異体百日咳菌ＬＰＳで刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、１μｇ／ｍｌの精製ＬＰＳで刺激された後の培養ヒトＤＣによるＩＬ−１０産生を示す図である。結果は、平均サイトカイン濃度として表されている。
【図６Ａ】野生型百日咳菌株（ＷＴ）、又はＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体株からの精製百日咳菌ＬＰＳによるＩＬ−６誘導を示す図である。ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６によるＩＬ−６の産生を、精製ＬＰＳの保存液の系列希釈液で刺激した。
【図６Ｂ】野生型百日咳菌株（ＷＴ）、又はＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体株からの全細菌細胞によるＩＬ−６誘導を示す図である。ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６によるＩＬ−６の産生を、全細菌細胞の系列希釈液で刺激した。培養上清中のＩＬ−６濃度は、ヒトＩＬ−６に対するＥＬＩＳＡで定量化した。データは３回の個別な実験の平均を表す。
【図７】百日咳菌ＬＰＳの構造を示す図である。ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体株の、提唱されている末端欠失型コアＯＳ構造を赤色の矢印によって示す。（Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14）からの改変。［実施例］
【００８６】
材料及び方法
細菌株及び培養条件
使用されたすべて細菌株を表１に示す。通常、大腸菌（E.coli）株は、２００ｒｐｍで振盪しながら、ルリア−ベルターニ（ＬＢ，Luria-Bertani）ブロス中で、３７℃で培養した。適切な場合には、プラスミドの維持又は株の選択のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン又は１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下で細菌を培養した。百日咳菌は、１５％脱線維素ヒツジ血液（Tritium社製）を補足したボルデー−ジャングー（ＢＧ，Bordet-Gengou）寒天上で３５℃で培養した。
【００８７】
組換えＤＮＡ技法
使用されたすべてのプラスミドを表１に示す。プラスミドＤＮＡは、Promega社製Wizard（登録商標）Plus SVミニプレップシステムを用いて単離した。製造会社（Roche社）の指示に従って、制限エンドヌクレアーゼを用いた。ＤＮＡ断片は、アガロースゲルからPromega社製Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Upシステムを用いて単離した。核酸連結は、迅速ＤＮＡ連結キット（Roche社製）を用いて行った。
【００８８】
使用されたすべてのプライマーを表２に示す。ＰＣＲ反応用の染色体鋳型ＤＮＡは、５０μｌの蒸留水中に約１０９の細菌を再懸濁し、その後、懸濁液を９５℃で１５分間加熱することによって調製した。次に、この懸濁液を１６１００×ｇで１分間遠心処理し、その後、上清を鋳型ＤＮＡとして用いた。百日咳菌変異体株Ｂ２１３ΔＢＰ２３２８及びΔＢＰ２３２９を構築するために、本発明者らは、プライマーＢＰ２３２８＿ＦＷｕｐ、ＢＰ２３２９＿ＦＷｕｐと、プライマーＢＰ２３２８＿ＲＥＶｕｐ及びＢＰ２３２９＿ＲＥＶｕｐとを用いることによって、対応するＯＲＦの５’領域及び上流配列を包含するＤＮＡセグメントを増幅した。プライマーＢＰ２３２８＿ＲＥＶｕｐ及びＢＰ２３２９＿ＲＥＶｕｐは共にBamHI部位を含有していた。加えて、ＯＲＦの３’領域及び下流配列を含有するＤＮＡ断片を、共にBamHI部位を含有するプライマーＢＰ２３２８＿ＦＷｄｏｗｎ、ＢＰ２３２９＿ＦＷｄｏｗｎと、プライマーＢＰ２３２８＿ＲＥＶｄｏｗｎ及びＢＰ２３２９＿ＲＥＶｄｏｗｎとを用いたＰＣＲによって得た。百日咳菌ＢＰ２３３１変異体株を構築するために、プライマーＢＰ２３３１＿ＦＷ及びＢＰ２３３１＿ＲＥＶを用いることによって、対応するＯＲＦを増幅した。ＰＣＲは、各プライマー５ｐｍｏｌを含有する総反応容積２５μｌ中で、pureTaq Ready-To-GoＰＣＲビーズ（Amersham Biosciences社製）を用いて行った。温度プログラムは以下の通り、すなわち、９５℃で３分間；９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３０サイクル；その後、７２℃で７分間及びそれに続く４℃までの冷却であった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、続いてpGEM-T Easyにクローニングし、その結果、それぞれプラスミドpGEM-BP2328up、pGEM-BP2328down、pGEM-BP2329up、pGEM-BP2329down及びpGEM-BP2331を得た。pGEM-BP2328down及びpGEM-BP2329downのBamHI-SpeI断片を、それぞれ、BamHI-SpeI制限されたpGEM-BP2328up及びpGEM-BP2329upに連結した。この結果得られたプラスミド及びプラスミドpGEM-BP2331をそれぞれBamHI及びEcoRVで切断して、BamHI及びHindIII消化によってそれぞれ得られたプラスミドpBSL128由来のカナマイシン耐性カセットの挿入を可能にした。最後に、得られたコンストラクトのEcoRI断片をEcoRI制限された自殺プラスミドpSS1129に連結した。それぞれpSS1129-BP2328KO、pSS1129-BP2329KO及びpSS1129-BP2331KOと名づけられた最終コンストラクトは、そのオペロンの転写方向と同じ方向でカナマイシン耐性カセットを含有していた。pSS1129ベースのプラスミドを用いて大腸菌ＳＭ１０（λｐｉｒ）を形質転換した。これによって、それに続く、百日咳菌へのこれらのプラスミドの導入、並びに対立遺伝子交換による百日咳菌ＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体の構築が可能となった。形質転換体は、様々なプライマーセットを用いたＰＣＲによってスクリーニングした。
【００８９】
ＬＰＳの単離及び脱Ｏ−アシル化ＬＰＳの調製
ＬＰＳは、若干の改変（Geurtsen, J., Steeghs, L., Hamstra, H-J., ten Hove, J., de Haan, A., Kuipers, B., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2006) Expression of the lipopolysaccharide-modifying enzymes PagP and PagL modulates the endotoxic activity of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 74: 5574-5585）を加えた、熱フェノール／水抽出（Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91）を用いて単離した。ＬＰＳの脱Ｏ−アシル化は、穏やかなヒドラジン分解によって行った（Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ）。簡潔には、ＬＰＳを無水ヒドラジン（２００μｌ）中に溶解させ、定常的に撹拌しながら３７℃で５０分間インキュベートして、Ｏ結合脂肪アシル鎖を遊離させた。混合物を冷却し、６００μｌの冷アセトンを少しずつ添加して、ヒドラジンをアセトンヒドラゾンに変えた。脱Ｏ−アシル化ＬＰＳの沈殿物を遠心処理（４０００×ｇ、７℃で３０分間）によって収集した。ペレットを６００μｌの冷アセトンで２回洗浄し、遠心処理し、水中に溶解させた後、凍結乾燥を行った。
【００９０】
毛細管電気泳動エレクトロスプレー質量分析法
Prince CEシステム（Prince Technologies社製）を4000 QTRAP質量分析計（Applied Biosystems/MDS Sciex社製）と連結した。シース溶液（イソプロパノール−メタノール、２：１）を流速１．０μｌ／分で送達した。分離は、１５ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する脱イオン水、ｐＨ９．０を用いて、長さ約９０ｃｍの露出した溶融石英毛細管上で得た。５ｋＶ及び−５ｋＶのエレクトロスプレーイオン化電位を用いて、それぞれ、陽イオンモード及び陰イオンモードでの検出に用いた。すべての質量分光分析実験に、カーテンガス及びコリジョンガスとして、窒素を用いた。ＭＳ２（高感度プロダクトイオンスキャン（ＥＰＩ，enhanced product ion scan））及びＭＳ３実験では、走査速度をＱ０トラップ付きで４０００Ｄａ／ｓに設定し、トラップ部へのインジェクション時間（trap fill time）を「ダイナミック」に設定し、Ｑ１の分解能を「ユニット」に設定した。ＭＳ３実験用には、１価に荷電された前駆体の第１同位元素のみが励起されるように値に励起係数を設定し、励起時間を１００ｍｓに設定した。
【００９１】
トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＬＰＳ分析
約１０９の細菌を５０μｌの試料緩衝液（Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685）中に懸濁し、０．５ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）のプロテイナーゼＫを添加した。試料を５５℃で６０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１０分インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。次に、試料緩衝液を添加することによって、試料を１０倍希釈し、その後、各試料２μｌをトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) Increased resolution of lipopolysaccharides and lipooligosaccharides utilizing tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Immunol. Methods 126: 109-117）に添加した。ブロムフェノールブルーが分離ゲル内に入るまで３５Ｖで泳動し、その後、電位を１０５Ｖまで増強した。最前部がゲルの底部に達した後、さらに４５分間電気泳動を続けた。水／エタノール／酢酸１１：８：１（ｖ／ｖ／ｖ）中でゲルを終夜固定し、続いて、記載（Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 119: 115-119）の通りに銀染した。
【００９２】
細菌細胞懸濁液の調製
０．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ，paraformaldehyde）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate-buffered saline）で３０分間、細菌を不活性化し、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco社製）で徹底的に洗浄した。約１０９細菌／ｍｌに相当する、６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ６００）が１である細菌懸濁液を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地中に調製した。
【００９３】
ヒトＤＣの産生及び培養
未成熟ヒトＤＣは、以前の記載の通り（Sallusto, F., and Lanzavecchia, A. (1994) Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor α. J. Exp. Med. 179: 1109-1118）、わずかに改変して、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ，human peripheral blood mononuclear cell）から生成させた。簡潔には、フィコール勾配（Amersham Biosciences社製）上の密度勾配遠心を用いて、健常ボランティアから得られたヘパリン化血液から、ＰＢＭＣを単離した。１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ，fetal calf serum）（Bodinco BV社製）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地で、回収したＰＢＭＣ画分を３回洗浄した。次に、三層パーコール勾配（GE Healthcare Bio-Sciences AB社製）（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ中に６０％、４７．５％、３４％パーコール）上での遠心処理によって、ＰＢＭＣから単球を調製した。上側の境界面から単球を採取し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ培地で３回洗浄し、６ウェルプレート内（１ウェルあたり４ｍｌ、０．５×１０６細胞／ｍｌ）の、２．４ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco社製）、１００ｎｇ／ｍｌのヒト組換え体ＧＭ−ＣＳＦ（Peprotech社製）及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え体ＩＬ−４（Strathmann-Biotec AG社製）を補足したＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ中でインキュベートした。６日間の培養の後に、未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ，immature DC）を採取した。ｉｍＤＣは、フローサイトメトリーによる評価では、ＣＤ１４及びＣＤ８３に関して陰性であり、低レベルのＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲを発現し、高レベルのＣＤ４０及びＣＤ１１ｃを発現していた。
【００９４】
ＤＣ刺激
ＩｍＤＣを洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ中に、５×１０５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、感染多重度（ＭＯＩ，multiplicity of infection）１０若しくは１００のＰＦＡ固定百日咳菌細胞又は濃度１０若しくは１０００ｎｇ／ｍｌの精製ＬＰＳのいずれかと共に同時インキュベートした。すべての実験の対照として、刺激されていないｉｍＤＣを用いた。２４時間後にＤＣを採取し、細胞表面マーカーの発現に関して直接染色し、サイトカイン測定まで上清を−８０℃で保存した。
【００９５】
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析
ＤＣの成熟マーカー及び共起刺激分子の表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。未成熟ＤＣ又は刺激されたＤＣを採取し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳで洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミンを含有するフィルター滅菌ＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝剤）中に再懸濁した。次に、以下の抗体、すなわち、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１１ｃ（ｍＩｇＧ１）及びＣＤ８３（ｍＩｇＧ１）、フィコエリトリン結合抗ヒトＣＤ８６（ｍＩｇＧ１）及びＣＤ４０（ｍＩｇＧ１）、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１４（ｍＩｇＧ１）及びＨＬＡ−ＤＲ（ｍＩｇＧ２ｂ）並びに適切に蛍光色素標識されたアイソタイプ対照（eBioscience社製のＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０及びＣＤ１４；BD Pharmingen社製のＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ）のいずれかと共に細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー（FACScan，Becton Dickinson社製）を用いて分析した。
【００９６】
サイトカイン測定
刺激されたＤＣの上清中におけるヒトＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０濃度を、製造業者（BD Biosciences Pharmingen社）の指示に従って、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，Enzyme-linked Immunosorbent Assay）を用いて判定した。
【００９７】
内毒素活性分析
ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６（Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int. J. Cancer 41: 456-461）を、記載の通り（Geurtsen, J., Steeghs, L., Hamstra, H-J., ten Hove, J., de Haan, A., Kuipers, B., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2006) Expression of the lipopolysaccharide-modifying enzymes PagP and PagL modulates the endotoxic activity of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 74: 5574-5585）、全細菌細胞懸濁液又は精製ＬＰＳの系列希釈液で刺激した。遠心処理によって培養物から細胞を収集することによって細菌細胞懸濁液を調製し、その後、ＯＤ５９０が１．０となるようにそれらをＰＢＳ中に再懸濁し、８ｍＭホルムアルデヒドの存在下で１０分間、熱不活性化し、４℃で保存した。刺激に続いて、製造業者（PeliKine Compact（商標））の指示に従って、ヒトＩＬ−６に対するＥＬＩＳＡを用いて、培養上清中のＩＬ−６濃度を定量化した。
【００９８】
結果
百日咳菌の新規ＬＰＳ生合成オペロンの同定
本発明者らは、４つの遺伝子クラスター（ＢＰ２３２８からＢＰ２３３１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿８８０９６６からＮＰ＿８８０９６９）を見出した。それらのうち３つ、すなわち、ＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１は、様々な細菌のＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼに高い配列類似性を示した。ＢＰ２３３０は、ピアス病菌（Xylella fastidiosa）の多糖デアセチラーゼに最も高い類似性を示す。これら４つのＯＲＦは、相互に近接しており、一部の場合では、オーバーラップさえしており、これは、それらがオペロンを構成していることを示唆している（図１Ａ）。このオペロンの上流の遺伝子、及び逆の方向性にある下流の遺伝子は、それぞれ、ＤＮＡポリメラーゼIIIサブユニットαであるＤｎａＥの相同体、及び推定上の大腸菌スルファターゼであるＹｈｂＸを推定上コードしている。推定上のＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼの役割を検査するため、本発明者らは、対立遺伝子交換による挿入不活化用に、カナマイシン耐性カセットによって中断されたＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１遺伝子を自殺プラスミドpSS1129内に個別に保持するコンストラクトを作製した。このアプローチを用いて、これら３つの遺伝子すべてのノックアウト変異体を、百日咳菌株Ｂ２１３で容易に得ることができた。全細胞溶解物のトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるそれらのＬＰＳの分析は、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体に関して、末端欠失型のＬＰＳを明確に示した（図１Ｂ）。対照的に、ＢＰ２３３１変異体株のＬＰＳは、より異型遺伝子性であり、野生型長のものを含めた多重バンドからなっていた。
【００９９】
ＬＰＳ構造分析
それらの構造を決定するために、野生型、ＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体株からのＬＰＳを単離し、Ｏ−脱アシル化し、陰イオンモードでのＥＳＩ−ＭＳによって分析した（図２）。提唱されたＬＰＳ組成の概要を表３に示す。野生型ＬＰＳのスペクトル（図２Ａ）は、ＧｌｃＮＡｃ・Ｍａｎ２ＮＡｃ３ＮＡｃＡ・Ｆｕｃ２ＮＡｃ４ＮＭｅ・ＧａｌＮＡ・Ｇｌｃ・ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ３・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨという組成を有する完全長百日咳菌ＬＰＳに相当する、ｍ／ｚ １１０８．５の３価に荷電された主要イオンを明らかにした。追加のイオンは、ｍ／ｚ ７７０．１（［Ｍ−３Ｈ］３−）、８１１．１（［Ｍ−４Ｈ］４−）、８３１．４（［Ｍ−４Ｈ］４−）、８８８．３（［Ｍ−３Ｈ］３−）、９５１．８（［Ｍ−Ｈ］−）、９８７．１（［Ｍ−２Ｈ］２−）、１０８１．７（［Ｍ−３Ｈ］３−）、１１２１．１（［Ｍ−３Ｈ＋Ｋ］３−）、１１５５．０（［Ｍ−２Ｈ］２−）及び１１６２．１（［Ｍ−３Ｈ］３−）に存在していた。これらのイオンの大部分は、脱リン酸化グリコ型又は末端欠失グリコ型に相当したが、ｍ／ｚ １１６２．１の３価荷電イオンは、追加のヘキソサミン部分で置換された完全長百日咳菌ＬＰＳに相当した（表３）。ＢＰ２３２８変異体ＬＰＳ（図２Ｂ）のＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ ７４３．６、７７０．０及び８２３．７の３価荷電イオンを、ｍ／ｚ １１１５．２、１１５５．１及び１２３５．７の、それらに対応する２価荷電イオンと共に示した。追加のピークは、ｍ／ｚ ７７７．３（［Ｍ−３Ｈ＋Ｎａ］３−）、９５２．１（［Ｍ−Ｈ］−）、１０３４．６（［Ｍ−２Ｈ］２−）、１０７４．６（［Ｍ−２Ｈ］２−）及び１１６６．１（［Ｍ−２Ｈ＋Ｎａ］２−）に存在していた。ピークの帰属は、最も完全なコアＯＳ構造が、ＧａｌＮＡ・Ｇｌｃ・ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨという組成に相当する、ｍ／ｚ ８２３．７及び１２３５．７のイオンによって代表されることを明らかにした。ＢＰ２３２９変異体ＬＰＳ（図２Ｃ）は、ｍ／ｚ ６０３．９及び６５７．６の３価荷電イオンを、ｍ／ｚ ９０６．０及び９８６．６の、それらに対応する２価荷電イオンと共に示した。加えて、これらのイオンのナトリウム付加物及びカリウム付加物は、それぞれｍ／ｚ ９１７．４及び９９７．６並びにｍ／ｚ ９２５．０及び１００５．６に存在した。追加ピークは、ｍ／ｚ ８６６．０（［Ｍ−２Ｈ］２−）、９３７．４（［Ｍ−２Ｈ−Ｈ２Ｏ］２−）及び１０６７．１（［Ｍ−２Ｈ］２−）に存在した。この場合、最も完全なコア構造は、ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨという組成に相当するｍ／ｚ １．０６７．１の２価荷電イオンによって代表された。ＢＰ２３３１変異体ＬＰＳ（図２Ｄ）は、それぞれ、完全長百日咳菌ＬＰＳ及び追加のヘキソサミンによって置換された完全長百日咳菌ＬＰＳに相当する、ｍ／ｚ １１０８．３及び１１６２．０の３価荷電イオンを含めた多数のピークを示した。
【０１００】
野生型及びＢＰ２３３１変異体ＬＰＳの両方で観察された追加のヘキソサミン部分の位置を決定するために、ＥＳＩ−ＭＳ２検査を陰イオンモードで行った（図３）。ｍ／ｚ １１０８．３（図３Ａ）及び１１６２．０（図３Ｂ）のイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルは共に、ｍ／ｚ ９５１．５の１価に荷電されたフラグメントイオンを示した。これは、コリジョン誘起解離下で、Ｋｄｏ−リピドＡ結合の間の切断から生じたリピドＡ−ＯＨが、各残基が共にリン酸基で置換された、Ｎ−アシル化（３ＯＨ Ｃ１４）グルコサミン残基のβ−（１→６）結合二糖からなることを明らかにした。ｍ／ｚ １１６２．０のイオンのスペクトルも、ｍ／ｚ １１１２．６の追加イオンを示した。これは、付加的なヘキソサミン残基がリピドＡに直接結合したことを示す。ｍ／ｚ １１１２．６のＭＳ３は、この結論をさらに支持した（図３Ｃ）。
【０１０１】
百日咳菌ＬＰＳ変異体による樹状細胞活性化
ＤＣ活性化へのＬＰＳ変異の影響を判定するために、ＭＯＩ１０及び１００のＰＦＡ固定された百日咳菌野生型及び変異体細菌と共に、未成熟なＤＣを同時培養した。ＤＣ活性化は、フローサイトメトリーによる成熟マーカー（ＣＤ８３及びＨＬＡ−ＤＲ）及び共起刺激分子（ＣＤ８６及びＣＤ４０）発現の分析（図４Ａ）、並びにＥＬＩＳＡによるＩＬ−１０及びＩＬ１２ｐ７０誘導の分析（図４Ｂ）によってモニターした。野生型細菌及びすべての変異体細菌がＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ４０発現を誘導した。これは、すべての株がＤＣを活性化できたことを実証する。しかし、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体細菌は、それぞれ明らかに野生型細菌より弱刺激性及び強刺激性であったが、ＢＰ２３２８変異体株は野生型と同程度に効果的であった。ＢＰ２３２９変異体株の場合に観察されたＤＣ成熟の低減には、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の誘導の低減が伴っていた（図４Ｂ）。同様に、ＤＣ成熟能の増強を示したＢＰ２３３１変異体は、より多くの量のＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０を誘導した。野生型株及びＢＰ２３２８変異体株は、匹敵するレベルのＩＬ−１０を誘導した。これは、これら両株に応答したＤＣ表面における共起刺激分子及び成熟マーカーの発現が同等であったことと一致している。しかし、野生型株がＩＬ−１２ｐ７０産生を明らかに誘導したのに対して、これは、ＢＰ２３２８変異体株では、ほとんど妥当しなかった（図４Ｂ）。これは、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の発現が示差的に調節されうることを示唆している。
【０１０２】
野生型株と変異体株との間で観察されたＤＣ活性化能の相違が、ＬＰＳ組成の相違と直接関係しているかどうか評価するために、１０及び１０００ｎｇ／ｍｌの精製ＬＰＳを用いたＤＣ活性化検査を行った。野生型、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３３１変異体細菌に応答したＤＣ表面における、成熟マーカー及び共起刺激分子の発現の大きな増大とは対照的に、これらの株からのＬＰＳを１０００ｎｇ／ｍｌ用いた場合でさえ、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ４０発現は、わずかな増大が見出されたのみであり（図５Ａ）、ＨＬＡ−ＤＲの発現の増大は見出されなかった（データは示されていない）。同様に、ＬＰＳで刺激されたＤＣの上清中では、ＩＬ−１０誘導が弱く（図５Ｂ）、且つＩＬ−１２ｐ７０が検出できなかった（データは示されていない）。それにもかかわらず、完全な細菌で得られた結果によれば、ＢＰ２３３１変異体株から単離されたＬＰＳで、最も高いＤＣ活性化能が見い出され、ＢＰ２３２８変異体株及び野生型株の活性化能がそれに続くが、ＢＰ２３２９変異体株の活性化能はＤＣを成熟化できなかったことが相互比較（図５Ａ及び５Ｂ）によって明らかになった。したがって、変異体のＬＰＳ構造の改変は、ＤＣが活性化能に示差的に影響を与える。
【０１０３】
ＬＰＳ及び全細菌細胞の内毒素活性
ＬＰＳの内毒素活性へのＬＰＳ変異の帰結を評価するために、ＩＬ−６を産生するように、ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６を刺激する精製ＬＰＳの能力を試験した。野生型ＬＰＳと比較して、ＢＰ２３３１変異体株からの精製ＬＰＳは、マクロファージを刺激する能力が大きく増大していた（図６Ａ）。対照的に、ＢＰ２３２９変異体株からのＬＰＳは、ＩＬ−６産生を刺激する能力が低減していたが、ＢＰ２３２８変異体からのＬＰＳは、野生型ＬＰＳと同程度に活性であった（図６Ａ）。試験したＬＰＳ濃度のうち最も高い２通りの濃度でのみ、後者のＬＰＳが野生型ＬＰＳより活性であった。精製ＬＰＳを用いて得るデータと一致して、ＢＰ２３３１変異体の全細胞懸濁液は、野生型細胞と比較して、マクロファージを刺激する能力の明らかな増大を示した（図６Ｂ）。しかし、ＢＰ２３２８変異体細胞もこの影響を示したが（図６Ｂ）、ＢＰ２３２９変異体細胞は、それらの精製ＬＰＳの活性が、より低かったのにもかかわらず、野生型細胞と同様な活性を有した（図６Ａ）。
【０１０４】
考察
この研究の目標は、百日咳菌ゲノム内の新規ＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼを同定することであった。リード配列として、既知なＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼの配列を用いることによって、本発明者らは４つの遺伝子オペロンを同定することができた。家禽病原体であるトリボルデテラ菌（Bordetella avium）のゲノム配列を他のボルデテラ属ゲノム配列と比較した以前の研究では、ここで同定したものに相同な遺伝子クラスターがＬＰＳ生合成に関与するものとして記載された（Sebaihia et al., 2006）。しかし、この帰属を確認できる機能研究は報告されなかった。
【０１０５】
百日咳菌ＬＰＳ生合成におけるこのオペロンの役割を検査するために、本発明者らは、推定上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を対立遺伝子交換によって不活性化し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＳＩ−ＭＳを用いて、野生型株及び変異体株のＬＰＳプロファイルを比較した。予想外なことに、野生型株が完全長百日咳菌ＬＰＳを含有していたのみでなく、付加的なヘキソサミン部分で置換された完全長種も保持しており、それが、本発明者が示した通り、リピドＡに直接結合していたことを本発明者らは見出した。ヘキソサミンによる百日咳菌リピドＡの置換は、以前には観察されておらず、したがって、百日咳菌リピドＡの新規な修飾を表す。
【０１０６】
ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体株の、提唱されている末端欠失型オリゴ糖構造の概要を図７に示す。ＢＰ２３２８変異体株で最も完全なコアＯＳ構造は、ＧａｌＮＡ・Ｇｌｃ・ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨ・ＨｅｘＮからなるものであった。これは、ＢＰ２３２８変異体株が、末端の三糖、１残基のヘプトース残基、及びＧｌｃＮ残基の１つを欠失していることを示す。この組成は、ＢＰ２３２８にコードされているタンパク質機能がＧｌｃＮ（１−４）からＧｌｃへのトランスフェラーゼであることを示唆する（図７）。ＢＰ２３２９変異体ＬＰＳの分析は、このＬＰＳがさらに末端欠失しており、最も完全な構造がＧｌｃＮ・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨ・ＨｅｘＮからなるものであったことを示した。この構造は、コアＯＳの第２のＧｌｃＮがそれに連結されるべきＧｌｃを欠失しているので、存在して残っているＧｌｃＮ残基は、第２のヘプトースに結合していたに違いない。したがって、この組成は、ＢＰ２３２９にコードされているタンパク質機能が、Ｇｌｃを第１のヘプトースサブユニットに連結するグルコシルトランスフェラーゼであると示唆する（図７）。これは、この遺伝子産物が、この遺伝子を同定するために最初に用いられたｒｆａＫ及びｌｇｔＦ／ｉｃｓＢなどのグルコース（β１−４）ヘプトーストランスフェラーゼと高い相同性を有することと整合するであろう。最も複雑な表現型は、ＢＰ２３３１変異体の場合に観察された。このタンパク質は様々なＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼと高い配列類似性を示すが、この変異体株には依然として完全長百日咳菌ＬＰＳが存在していた。
【０１０７】
この観察は、ＢＰ２３３１遺伝子が活性なＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼをコードしてないこと、又はコードされている酵素が重複を示していることを示唆する。この最後のオプションと整合して、本発明者らは、ＢＰ２３３１にコードされているタンパク質に６９％の同一性を示すタンパク質をコードする遺伝子、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＥ４３９２８を有するＢＰ３６７１を百日咳菌ゲノム内に同定した。野生型及びＢＰ２３３１変異体株のＬＰＳプロファイルは、多かれ少なかれ匹敵するものであったが、ひとつの衝撃的な観察は、この変異体ＬＰＳが、より高い異型遺伝子性を有していたことであった。この現象の正確な理由は、依然として解明されないままであるが、考えられるひとつの解釈は、ＢＰ２３３１変異体が、おそらくヘキソサミンによる、そのＬＰＳの非化学量論的な置換の増大を示しているというものでありうるであろう。アミノ糖によるリピドＡの修飾が、様々な細菌で記載されており、例えば、大腸菌及びサルモネラ（Salmonella）における４−アミノアラビノースによる置換（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001b) An inner membrane enzyme in Salmonella and Escherichia coli that transfers 4-amino-4-deoxy-L-arabinose to lipid A: induction on polymyxin-resistant mutants and role of a novel lipid-linked donor. J. Biol. Chem. 276: 43122-43131）、野兎病菌（Francisella tularensis）におけるガラクトサミンによる置換（Phillips, N. J., Schilling, B., McLendon, M. K., Apicella, M. A., and Gibson, B. W. (2004) Novel modification of lipid A of Francisella tularensis. Infect. Immun. 72: 5340-5348）が記載されている。アミノアラビノース経路は、大腸菌で詳細に研究されており、それがリピドＡに転移される前に、別々のウンデカプレニルリン酸輸送体上における糖部分の集合に関与していることが示されている（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Doerrler, W. T., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001a) Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. J. Biol. Chem. 276: 43132-43144）。ＢＰ２３３１へのカナマイシン耐性カセットの挿入は、下流のＢＰ２３３０遺伝子の発現を増強していると考えられるので、ＢＰ２３３０発現の増大は、リピドＡのヘキソサミン修飾の増大と、その結果として、ＢＰ２３３１変異株細胞におけるＬＰＳの異質性の増大とをもたらしていてもよいと推測できるであろう。この解釈は、ＢＰ２３３１変異体のヘキソサミン修飾レベルの増大によって支持される。表３を参照されたい。
【０１０８】
ＬＰＳの構造について取り組んだ後に、精製ＬＰＳ及び全細菌細胞がＤＣの成熟を誘導する能力及びヒトマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を刺激する能力を有するかどうか、それらを試験した。結果は、野生型株と比較して、ＢＰ２３３１変異体株が、ＤＣの成熟及び炎症誘発性サイトカイン産生を誘導する能力の増大を示したことを示した。精製ＬＰＳを用いた場合も同様な結果を得た。対照的に、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体株からの全細菌細胞及び精製ＬＰＳは、それぞれ、ＤＣを成熟させ、且つマクロファージを刺激する同程度及び低減した能力を示した。これらの結果は、ＬＰＳコアＯＳ組成の改変は百日咳菌ＬＰＳの生物的特性に示差的に影響を与えることを示す。ワクチン開発の観点からは、これによって、より効率的に免疫応答をプライミングする株の開発が可能になりうるので、これは興味深い知見である。さらに、ＢＰ２３３１変異体株など、ＬＰＳの異質性の増大を示す変異体は、より大きな多様性を有する抗ＬＰＳ抗体を誘発しうる。これは、それ自体で、ワクチン有効性に肯定的な影響を与えうる。一方におけるＤＣ及びマクロファージの活性化レベルと、もう一方におけるリピドＡのヘキソサミン修飾の程度との間で見出される良好な相関関係（表３を参照）は、ＢＰ２３３１変異体における修飾の増大がこの点で重要であることを強く示唆する。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
（参考文献）
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Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91
Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int. J. Cancer 41: 456-461
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変ＬＰＳ分子を有する百日咳菌変異体、及び／又はこれらの変異体から取得可能なＬＰＳ分子を含む、百日咳に対する改良ワクチンに関する。さらに、これらの変異体及び／又は取得可能なＬＰＳ分子は、アジュバントとして使用できる。
【背景技術】
【０００２】
ＬＰＳは、グラム陰性菌外膜の外葉に位置する両親媒性分子である。ＬＰＳは、内毒素活性及びアジュバント活性の両方を有する。両特性とも、宿主のＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体複合体がそれを認識することに基づいている（Palsson-McDermott, E. M., and O'Neill, L. A. J. (2004) Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 113: 153-162；O'Neill, L. A. J. (2006) How Toll-like receptors signal: what we know and what we don't know. Curr. Opin. Immunol. 18: 3-9に概説されている）。ＬＰＳは、リピドＡ、コア及びＯ抗原という３つの異なった構造ドメインからなる。リピドＡは、疎水性の膜アンカーとして機能し、この分子の生理活性成分を形成している（Takada H, and Kotani S. (1989) Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit. Rev. Microbiol. 16: 477-523）。コア領域は、Ｏ抗原と比較して限定的な構造多様性しか示さない複合オリゴ糖からなる。一部の細菌、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）では、コアオリゴ糖（コアＯＳ，core oligosaccharide）を内核及び外核に分けることができる。外核は主として、ピラノシドヘキソース、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース及びＤ−グルコサミンからなり、内核は主として、オクツロソン酸及びヘプトピラノースからなる。大部分のグラム陰性菌では、特定の糖、すなわち２−ケト−３−デオキシオクツロソン酸（Ｋｄｏ，2-keto-3-deoxyoctulosonic acid）によって、コアドメインがリピドＡドメインに連結されている（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700）。Ｏ抗原は、ＬＰＳの最も可変的な部分を含み、細菌の血清型特異性を与える。それは、１〜８残基の糖からなる繰り返しの糖サブユニットで構成されている。各Ｏ鎖は、これらのサブユニットを最大５０個まで含有できる。Ｏ抗原は、細菌の免疫逃避、特に血清補体に媒介された溶解からの逃避に関係づけられている（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700）。
【０００３】
気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）及びパラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）のＬＰＳとは対照的に、百日咳菌（Bordetella pertussis）のＬＰＳは、Ｏ抗原ドメインを全く含有していない（Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232；Di Fabio, J. L., Caroff, M., Karibian, D., Richards, J. C., and Perry, M. B. (1992) Characterisation of the common antigenic lipopolysaccharide O-chains produced by Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis. FEMS Microbiol. Lett. 76: 275-281）。したがって、百日咳菌ＬＰＳはしばしば、リポオリゴ糖と呼ばれる。百日咳菌は、バンドＡ ＬＰＳ及びバンドＢ ＬＰＳという２つの優性なＬＰＳ型を産生する（Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232）。バンドＢ ＬＰＳは、リピドＡと、９残基の糖からなるコアオリゴ糖とで構成されている（Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14）。バンドＢ ＬＰＳに、Ｎ−アセチルグルコサミン、２，３−ジアセトアミド−２，３−ジデオキシ−マンヌロン酸及び２−アセトアミド−４−Ｎ−メチル−２，４−ジデオキシ−フコースからなる末端三糖を付加することによって、バンドＡと呼ばれるＬＰＳ型が生成される。
【０００４】
大腸菌（Escherichia coli）及びサルモネラエンテリカ血清型ティフィムリウム（Salmonella enterica serovar Typhimurium）では、コアＯＳ生合成遺伝子クラスターが、ｇｍｈＤ、ｗａａＱ及びＷａａＡオペロンと名づけられた３つのオペロンからなる。ｇｍｈＤオペロンは、ｇｍｈＤ及びｗａａＦＣＬという４つの遺伝子からなり、これらは内核の合成に関与している（Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682）。ｇｍｈＤ、ｗａａＦ及びｗａａＣ遺伝子は、ヘプトースＩ及びIIの生合成と、Ｋｄｏ２−リピドＡへのそれらの転移とに関与するタンパク質をコードしており（Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682）、一方、ｗａａＬ遺伝子産物は、Ｏ抗原の結合に関与するリガーゼである（MacLachlan, P. R., Kadam, S. K., and Sanderson, K. E. (1991) Cloning, characterization, and DNA sequence of the rfaLK region for lipopolysaccharide synthesis in Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 173: 7151-7163）。ｗａａＱオペロンは、３つのオペロンのなかで最大のものであり、外核の生合成及びコアＯＳの修飾／装飾に関与するタンパク質をコードしている。ｗａａＱオペロン内に存在する遺伝子の数及びタイプは、株ごとに異なっており、これによって、コア組成における株特異的な相違が説明される（Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998) Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica. Mol. Microbiol. 30: 221-232）。ｗａａＡオペロンはしばしば、ＫｄｔＡという１つのタンパク質のみをコードしている。大腸菌Ｋ−１２においてのみ、ＬＰＳに関係ない追加のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ，open reading frame）が存在している（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700）。腸内細菌科のｋｄｔＡ遺伝子は、Ｋｄｏ２−リピドＡ生合成で２つのＫｄｏ残基を付加する二機能性Ｋｄｏトランスフェラーゼをコードしている（Clementz, T., and Raetz, C. R. H. (1991) A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing. J. Biol. Chem. 266: 9687-9696）。
【０００５】
ボルデテラ及び大腸菌のコアＯＳはある程度の類似性を示すが、残基の正確な組成及び配置は著しい相違を示す。例えば、ボルデテラのコアＯＳは、大腸菌を含めた他のほとんどのグラム陰性菌で見出される２残基又は３残基の代わりに、１残基のみのＫｄｏ残基を含有している。これは、ボルデテラＫｄｔＡが、二機能性ではなく一機能性のＫｄｏトランスフェラーゼとして機能していることによると、最近示された（Isobe, T., White, K. A., Allen, A. G., Peacock, M., Raetz, C. R. H., and Maskell, D. J. (1999) Bordetella pertussis waaA encodes a monofunctional 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase that can complement an Escherichia coli waaA mutation. J. Bacteriol. 181: 2648-2651）。ボルデテラコアＯＳの残りの部分を合成する原因である酵素は、今のところ未知であり、さらなる同定が待たれている。
【０００６】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体複合体の活性化を介した、ＬＰＳの生物活性の主要決定基は、通常、そのリピドＡ部分であると考えられているが、オリゴ糖領域も、抗原提示細胞（ＡＰＣ，antigen-presenting cell）とのＬＰＳの相互作用において重要な役割を果たしうる。このタイプのＬＰＳ認識に関係づけられている受容体には、補体受容体ＣＲ３及びスカベンジャー受容体ＳＲ−Ａが含まれる（van Amersfoort, E. S., Van Berkel, T. J., and Kuiper, J. (2003) Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414；Pluddeman, A., Mukhopadhyay, S., and Gordon, S. (2006) The interaction of macrophage receptors with bacterial ligands. Exp. Rev. Mol. Med. 8: 1-25）。
【０００７】
既に、いくつかの百日咳菌ワクチンが使用された。１９４０年代及び１９５０年代における百日咳全菌体（ｗＰ，whole-cell pertussis）ワクチンの導入、並びに、それより後、１９８０年代及び１９９０年代における百日咳無細胞（ａＰ，acellular pertussis）ワクチンの導入は、百日咳発生率の漸減をもたらし、この疾患の罹患率及び死亡率を低レベルにまで低減した。ワクチン接種率が高いのにもかかわらず、百日咳疾患は風土病として残っており、２〜５年ごとの発生率ピークを有する周期性のパターンを示し続けている。最近の２０年間に、オランダを含めた数カ国が、百日咳の症例報告数の増大を経験している。興味深いことに、一部の地域では、年齢構成の移動も観察されている。ワクチン接種前及び初期ワクチンの時代では、主として若年の小児で百日咳の症例が報告されたが、近年の症例では、成人及び青年が占める比率が増大している。報告上の百日咳が再興したいくつかの理由が提唱されており、それらには、（１）伝搬されている百日咳菌株における、ワクチン有効性を低減する遺伝的変化、（２）百日咳ワクチンの効力の低減、（３）免疫の衰弱、（４）百日咳症例の報告の増加、及び（５）百日咳疾患の診断の改良が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Palsson-McDermott, E. M., and O'Neill, L. A. J. (2004) Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 113: 153-162
【非特許文献２】O'Neill, L. A. J. (2006) How Toll-like receptors signal: what we know and what we don't know. Curr. Opin. Immunol. 18: 3-9
【非特許文献３】Takada H, and Kotani S. (1989) Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit. Rev. Microbiol. 16: 477-523
【非特許文献４】Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700
【非特許文献５】Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232
【非特許文献６】Di Fabio, J. L., Caroff, M., Karibian, D., Richards, J. C., and Perry, M. B. (1992) Characterisation of the common antigenic lipopolysaccharide O-chains produced by Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis. FEMS Microbiol. Lett. 76: 275-281
【非特許文献７】Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14
【非特許文献８】Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682
【非特許文献９】MacLachlan, P. R., Kadam, S. K., and Sanderson, K. E. (1991) Cloning, characterization, and DNA sequence of the rfaLK region for lipopolysaccharide synthesis in Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 173: 7151-7163
【非特許文献１０】Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998) Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica. Mol. Microbiol. 30: 221-232
【非特許文献１１】Clementz, T., and Raetz, C. R. H. (1991) A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing. J. Biol. Chem. 266: 9687-9696
【非特許文献１２】Isobe, T., White, K. A., Allen, A. G., Peacock, M., Raetz, C. R. H., and Maskell, D. J. (1999) Bordetella pertussis waaA encodes a monofunctional 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase that can complement an Escherichia coli waaA mutation. J. Bacteriol. 181: 2648-2651
【非特許文献１３】van Amersfoort, E. S., Van Berkel, T. J., and Kuiper, J. (2003) Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414
【非特許文献１４】Pluddeman, A., Mukhopadhyay, S., and Gordon, S. (2006) The interaction of macrophage receptors with bacterial ligands. Exp. Rev. Mol. Med. 8: 1-25
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、既存のワクチンの全欠点を示さない、百日咳菌に対する新規ワクチンが依然として必要性である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、改変されたオリゴ糖鎖を有する百日咳菌変異体が、樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）とのそれらの相互作用において影響されうるであろうという仮説に基づいている。ＤＣなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）への特異的ターゲッティングは、おそらく、百日咳全菌体ワクチンに対する免疫応答の帰結に影響を与えうるであろう。この経路による、全菌体ワクチンの改良に向けた最初のステップとして、本発明者らは終に、百日咳菌におけるＬＰＳオリゴ糖生合成に関与する遺伝子クラスターを同定した。特に、このクラスター内の２つの遺伝子は、不活性化又は過剰発現された際にＤＣと相互作用して、それらを活性化する潜在的能力が改善されている変異体を生じる。
【００１１】
ポリペプチド
第１の態様では、本発明は、２つのポリペプチドを提供する。第１のポリペプチドは、多糖デアセチラーゼであり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。第２のポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼであり、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１２】
多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドそれぞれの活性は、本明細書で下記に定義する通り、百日咳菌株でそれぞれのコード遺伝子をそれぞれ不活性化及び過剰発現し、取得可能なＬＰＳを分析することによって評価することが好ましい。形質転換された百日咳菌株によって産生されたＬＰＳが、本明細書で下記に定義する、本発明のＬＰＳを少なくとも検出可能な量で含む場合、多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドそれぞれが活性且つ機能的であるといわれるであろう。検出可能な量のＬＰＳは、実施例に記載の通り、熱フェノール／水抽出を用いた単離（Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91）、穏やかな加水分解によるＯ−脱アシル化（Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ）、及び陰イオンモードにおけるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ，Electrospray-ionization Mass spectrometry）の後で検出可能であることが好ましい。
【００１３】
さらに好ましい実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。最も好ましい実施形態では、多糖デアセチラーゼが配列番号１を有する。この多糖デアセチラーゼは、百日咳菌から生じたものである。配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号３に示す。
【００１４】
別のさらに好ましい実施形態によれば、上記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。好ましい実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼが配列番号２を有する。このグリコシルトランスフェラーゼは、百日咳菌から生じたものである。配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号４に示す。
【００１５】
同一性のパーセントは、アラインメントされた配列間で同一であるアミノ酸残基の数を、アラインメントされた配列の長さからすべてのギャップの長さを引いた数で割った値として計算される。多重配列アラインメントは、デフォルト設定を用いたDNAman4.0最適アラインメントプログラムを用いて行った。アラインメントは、通常、それらの配列番号によって特定されている配列又はそれらの部分の間で行われる。アラインメントは、それらの配列番号によって特定されている配列を用いて行うことが好ましい。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、それらが必要な活性及び同一性を有する限り、百日咳菌以外の生物からも取得できるであろうことを当業者ならば理解するであろう。好ましい実施形態では、上記に特定した各ポリペプチドを百日咳菌、気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌などのボルデテラ属種から取得する。上記に特定した各ポリペプチドを百日咳菌から取得することが最も好ましい。１株の単独な百日咳菌株又は数株の異なった百日咳菌株が、本発明によるいくつかの相同体ポリペプチドを有しうる。
【００１７】
別の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、上記に定義されたポリペプチド配列のうちのいずれか１つの変種である。変種ポリペプチドは、そのポリペプチドの、天然に存在しない形態のものでもよい。ポリペプチド変種は、なんらかの操作によって、天然源から単離されたポリペプチドと異なっていてもよい。変種は、配列番号１のアミノ酸配列から、又は配列番号２から、又は配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、すなわち配列番号３から、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列、すなわち配列番号４から開始する部位特異的変異導入によって作製できる。ポリペプチド変種は、コードされているポリペプチドの生物学的機能を改変しない変異を含有するものが好ましい。多糖デアセチラーゼ又はグリコシルトランスフェラーゼのいずれかの生物学的機能又は活性は、本明細書で既に定義されている。
【００１８】
本発明の別の態様では、共に薬物を調製するために使用するための、上記に定義した多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼのそれぞれを提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００１９】
核酸配列
本発明の第２の態様では、２つの核酸配列を提供する。第１の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する多糖デアセチラーゼ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有し、且つ／又はボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から生じたものである、多糖デアセチラーゼをコードしている。
【００２０】
第１の核酸配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列であることが好ましい。上記同一性は、少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％あることが好ましい。上記核酸配列は、配列番号３の核酸配列を有することが最も好ましい。配列番号３はＮＰ＿８８０９６６８に相当する。
【００２１】
第２の核酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有し、且つ／又はボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から生じたものである、グリコシルトランスフェラーゼをコードしている。
【００２２】
第２の核酸配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列であることが好ましい。上記同一性は、少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％あることが好ましい。上記核酸配列は、配列番号４の核酸配列を有することが最も好ましい。配列番号４はＮＰ＿８８０９６６９に相当する。
【００２３】
同一性のパーセントは、配列中の同一なヌクレオチドの数を、総ヌクレオチド長からいかなるギャップの長さも引いた数で割った比率を計算することによって決定した。ＤＮＡ多重配列アラインメントは、最適アラインメント（完全アラインメント）プログラムを用いたDNAmanバージョン４．０を用いて行った。５０％以上の同一性レベルを示す関連のＤＮＡ配列の最短長は、４０ヌクレオチド以上であるべきである。アラインメントは、通常、それらの配列番号によって特定されている配列又はそれらの部分の間で行われる。アラインメントは、それらの配列番号によって特定されている配列を用いて行うことが好ましい。
【００２４】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の核酸配列は、上記に定義した核酸配列のうちの任意のものの変種である。核酸配列変種は、上記に定義したポリペプチド変種を調製するのに使用できる。核酸変種は、上記に定義した核酸配列のうちのいずれのものの断片であってもよい。核酸変種は、遺伝暗号の縮重によって配列番号３又は配列番号４とは異なっている核酸配列でもよい。核酸変種は、配列番号３又は配列番号４の対立遺伝子変種でもよい。対立遺伝子変種は、同じ染色体遺伝子座を占める、ある遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれをも指す。好ましい核酸変種は、１又は複数のサイレント変異を含有する核酸配列である。代替として、又はこれらと組み合わせて、ヌクレオチド置換を導入することによって核酸変種を取得してもよく、その際、ヌクレオチド置換は、その核酸配列によってコードされているポリペプチドの別のアミノ酸配列をもたらすものではなく、本発明のポリペプチドの産生用に意図されている宿主生物のコドン使用頻度に対応するものである。好ましい実施形態によれば、核酸変種は、本明細書で上記に定義した生物学的機能を依然として示すポリペプチドをコードしている。核酸配列変種は、それぞれ多糖デアセチラーゼ活性又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードしていることが、より好ましい。そのようなポリペプチドをコードする核酸配列は、いかなる微生物から単離されたものでもよい。
【００２５】
これらすべての変種は、プローブを設計するのに使用できる配列番号３若しくは配列番号４又はその変種の核酸配列を用いた、低、中、高ハイブリダイゼーション条件下におけるハイブリダイゼーション（サザンブロッティング手順）によるライブラリースクリーニングなど、当業者に知られている技法を用いて取得できる。低、中、高ストリンジェンシー条件とは、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、及びそれぞれ低、中、高ストリンジェンシー用に２５％、３５％又は５０％のいずれかのホルムアミド中における、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。これに続いて、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、及び低、中、高ストリンジェンシー用に５５℃、６５℃又は７５℃を用いて、ハイブリダイゼーション反応物を各３０分間、３回洗浄する。
【００２６】
本明細書に提示の配列情報は、誤って同定された塩基を包含する必要があるように、あまり狭義に解釈するべきでない。当業者ならば、そのような誤って同定された塩基を特定でき、そのような間違いを修正する方法を知っている。
【００２７】
本発明の別の態様では、両核酸とも薬物を調製するために使用するための、上記に定義した多糖デアセチラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼのそれぞれをコードする核酸を提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００２８】
核酸コンストラクト
さらに別の態様では、本発明は、上記のセクションで定義した核酸配列のうちの任意のものを含む核酸コンストラクトであって、前記核酸配列が、
−多糖活性を示し、且つ配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
−グリコシルトランスフェラーゼ活性を示し、且つ配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードしている核酸コンストラクトに関する。
【００２９】
核酸コンストラクト内に存在している核酸配列は、適した発現宿主におけるポリペプチドの産生を指示する１又は複数の制御配列に作動可能に連結されていてもよい。
【００３０】
作動可能に連結されているとは、本明細書では、制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に対して、上記制御配列が本発明のポリペプチドの産生を指示するような位置に、適切に置かれている配置として定義される。
【００３１】
限定されるものではないが、発現には、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含めた、ポリペプチドの産生に関与するいかなるステップも含まれると理解されよう。
【００３２】
核酸コンストラクトは、天然存在の遺伝子から単離されているか、又はそうでなければ天然に存在しないであろう様式で結合又は並列されている核酸セグメントを含有するように改変されている核酸分子と定義されている。
【００３３】
制御配列は、本明細書では、ポリペプチドの発現に必要又は有利であるすべての構成要素がそれに含まれるように定義されている。最小限でも、制御配列には、プロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。
【００３４】
発現ベクター
本発明はさらに、多糖デアセチラーゼ活性を示し、且つ上記のセクションで定義した、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む発現ベクターに関する。上記発現ベクターは、適した発現宿主における、コードされているポリペプチドの産生を指示する１又は複数の制御配列に作動可能に連結されている前記核酸配列を含むことが好ましい。最小限でも、制御配列には、プロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。上記発現ベクターは、組換え体発現ベクターとして考えることができる。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順を好都合に施すことができ、且つポリペプチドをコードする核酸配列の発現を誘発できるいかなるベクターでもよい（例えば、プラスミド、ウイルス）。この発現ベクターが導入されるであろう宿主のアイデンティティーと、本発明の核酸配列の起源とに応じて、最も適した発現ベクター及び制御配列を選択する方法を、当業者は知っていよう。最も好ましい宿主細胞は、宿主細胞という題のセクションに示す。
【００３５】
本発明との関連では、発現ベクターは、宿主細胞内に導入された際に、発現ベクター内に存在する核酸配列の発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの活性レベルの増大を有する細胞をもたらすであろう。この関連では、上記増大は、前記発現ベクターを含まない宿主細胞と比較することによって、且つ／又は配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する内因性ポリペプチドを含まない宿主細胞と比較することによって評価される。
【００３６】
本発明の別の態様では、薬物を調製するために使用するための、上記に定義した発現ベクターを提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００３７】
不活性化ベクター
本発明はさらに、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、且つ上記のセクションで定義した、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む不活性化ベクターに関する。不活性化ベクターは、所与の宿主における、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する核酸配列の発現を低下又は不活性化するように設計される。
【００３８】
上記不活性化ベクターは、組換え体発現ベクターとして考えることができる。不活性化ベクターは、組換えＤＮＡ手順を好都合に施すことができ、且つ上記に定義した核酸配列の発現の不活性化を誘発できるいかなるベクターでもよい（例えば、プラスミド、ウイルス）。この不活性化ベクターが導入される宿主のアイデンティティーと、本発明の核酸配列の起源とに応じて、最も適した不活性化ベクターを選択する方法を当業者は知っていよう。最も好ましい宿主細胞は、宿主細胞という題のセクションに示す。
【００３９】
本発明との関連では、不活性化ベクターは、宿主細胞内に導入された際に、発現ベクター内に存在する核酸配列の発現レベルの低減（又は低下）、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現レベルの低減、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの活性レベルの低減を有する細胞をもたらすであろう。この関連では、上記低減は、前記不活性化ベクターを含まない宿主細胞との比較によって評価されることが好ましい。
【００４０】
グリコシルトランスフェラーゼ活性を示し、且つ配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現レベルの低減及び／又は活性レベルの低下は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば宿主における、前記グリコシルトランスフェラーゼをコードする内因性核酸配列の発現を不活性化又は下方制御するなどによって、実現されていてもよい。この不活性化又は下方制御は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列中の１又は複数のヌクレオチドの欠失によって実現されていてもよい。別の実施形態では、本発明は、前記グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に変異を有する宿主、好ましくはボルデテラに関する。グリコシルトランスフェラーゼをコードする、不活性化された核酸配列を有する宿主を構築するには、置換又は不活性化ベクターを調製し、その後、形質転換によって宿主に導入することが好ましい。当業者ならば、そのようなベクターを構築する方法を知っていよう。
【００４１】
グリコシルトランスフェラーゼをコードする内因性核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における低レベルのタンパク質発現に適した弱いプロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現を低下させることができる。
【００４２】
内因性のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における、誘導性レベルのタンパク質発現に適した誘導性プロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現に誘導性を与えることができる。
【００４３】
上記に定義した好ましい実施形態の代替として、又はそれと組み合わせて、自殺ベクターを用いることによって、内因性のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の不活性化を実現することが好ましい。自殺ベクターはpSS1129（Stibitz, S. (1994) Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange）であることが、より好ましい。
【００４４】
本発明の別の態様では、薬物を調製するために使用するための、上記に定義した不活性化ベクターを提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００４５】
宿主細胞
さらに別の態様では、本発明は、共に上記のセクションで定義されている、本発明の発現ベクター及び／又は本発明の不活性化ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞の選択は、大部分、本発明の核酸配列の取得源によるであろう。宿主細胞のアイデンティティーに応じて、当業者ならば、本発明のコンストラクト又はベクターでそれを形質転換する方法を知っていよう。
【００４６】
宿主細胞は、本発明のＬＰＳの発現に適したいかなる微生物細胞、原核細胞又は真核細胞でもよい。好ましい実施形態では、宿主細胞は、本明細書で上述したボルデテラ属種である。上記ボルデテラは百日咳菌であることが最も好ましい。
【００４７】
ボルデテラの形質転換に適した手順は、当業者に知られている様式での接合を含む方法を用いたものでありうる。ボルデテラに適した形質転換手順は、（Stibitz, S. (1994) Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange）に記載されている。
【００４８】
第１の好ましい実施形態によれば、このようにして取得された宿主細胞は、発現ベクター内に存在する核酸配列の発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現レベルの増大、及び／又は発現ベクター内に存在する核酸配列によってコードされているポリペプチドの活性レベルの増大を有する。この実施形態では、発現コンストラクト内に存在する核酸配列が、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードしている。この関連では、上記増大は、両方とも同じ条件下で培養及び／又はアッセイされた場合に、前記発現ベクターを含まない宿主細胞と比較することによって、且つ／又は配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する内因性ポリペプチドを含まない宿主細胞と比較することによって評価される。
【００４９】
「ポリペプチドの発現レベルの増大」とは、本明細書では、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、上記に定義したポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生するものより多く産生することと定義されることが好ましい。本発明の宿主細胞は、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、配列番号１と少なくとも５０％の同一性を有する本発明のポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生する量より少なくとも３％、６％、１０％又は１５％多く産生することが好ましい。前記ポリペプチドを、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％多く産生する宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞における、このポリペプチドの産生レベルは、Ｂ２１３百日咳菌株の産生レベル（Kasuga, B., Nakase, Y., Ukishima, K., and Takatsu, K. (1953) Studies on Haemophilus pertussis. Kitasato Arch. Exp. Med. 27: 21-28、表１も参照）を対照として、それと比較される。さらに好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における上記ポリペプチドの産生レベルは、上記に定義したＢ２１３株の産生レベルを対照として、それと比較される。
【００５０】
ポリペプチドの産生レベルの評価は、ノーザンブロット又はアレイ分析を行うことによって、ｍＲＮＡレベルで行うことができ、且つ／又はウエスタンブロットを行うことによって、ポリペプチドレベルで行うことができる。これらのすべての方法は当業者によく知られている。
【００５１】
「ポリペプチド活性の増大」とは、本明細書では、前記活性に特異的なアッセイを用いて、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞のものより高い多糖デアセチラーゼ活性を示すことと定義されている。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションで言及するものが好ましい。本発明の宿主細胞は、前記活性に特異的なアッセイを用いてアッセイされた際に、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が示す活性より、少なくとも３％、６％、１０％又は１５％高い多糖デアセチラーゼ活性を示すことが好ましい。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションで言及するアッセイであることが好ましい。前記活性を、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％多く示す宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞における多糖デアセチラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。より好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における多糖デアセチラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。
【００５２】
ポリペプチド発現及び／又は活性の増大は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば、天然に存在しているよりも多くのコピーの、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を宿主に導入することなどによって実現されていてもよく、上記核酸配列は、担体上にあっても、染色体上にあってもよい。代替として、選択された生物における高レベルタンパク質発現に適した強く発現されるプロモーター又は強力なプロモーターに、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、又はこれら２通りのアプローチの組合せによって、上記核酸配列を過剰発現させることもできる。当業者ならば、宿主細胞のアイデンティティーに応じて、どの強力なプロモーターが最も適切であるか知っていよう。宿主細胞が百日咳菌株である場合、強力なプロモーターは、ベクターpMMB67EHのｔａｃプロモーター（Methods for General and Molecular Bacteriology, Editors P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC, 1994, p.409-410）であることが好ましい。
【００５３】
第１の好ましい実施形態の代替として、又はそれと組み合わせて、本発明は、第２の好ましい実施形態を提供し、この実施形態では、宿主細胞は、好ましくは本明細書で上記に定義した本発明の不活性化ベクターの使用を介した、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の発現レベルの低減、及び／又は前記ポリペプチドの発現レベルの低減、及び／又は前記ポリペプチドの活性レベルの増大を有する。この実施形態では、不活性化ベクター内に存在している核酸配列が、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードしている。この関連では、低減は、両方とも同じ条件下で培養及び／又はアッセイした場合に、前記不活性化ベクターを含まない宿主細胞と比較することによって評価される。
【００５４】
「ポリペプチドの発現レベルの低減」とは、本明細書では、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、上記に定義したポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生するものより少なく産生することと定義されることが好ましい。本発明の宿主細胞は、両タイプの細胞（親細胞及び形質転換細胞）が同じ条件下で培養された場合に、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を有する本発明のポリペプチドを、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が産生する量より少なくとも３％、６％、１０％又は１５％少なく産生することが好ましい。前記ポリペプチドを、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％少なく産生する宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞における、このポリペプチドの産生レベルは、上記に定義したＢ２１３株の産生レベルを対照として、それと比較される。さらにより好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における上記ポリペプチドの産生レベルは、上記に定義したＢ２１３株の産生レベルを対照として、それと比較される。
【００５５】
ポリペプチドの産生レベルの評価は、ノーザンブロット又はアレイ分析を行うことによって、ｍＲＮＡレベルで行うことができ、且つ／又はウエスタンブロットを行うことによって、ポリペプチドレベルで行うことができる。これらのすべての方法は当業者によく知られている。
【００５６】
「ポリペプチド活性の低減」とは、本明細書では、前記活性に特異的なアッセイを用いて、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞のものより低いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すことと定義されている。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションで既に本明細書に記載されているものが好ましい。本発明の宿主細胞は、前記活性に特異的なアッセイを用いてアッセイされた際に、その形質転換宿主細胞が由来した親宿主細胞が示す活性より、少なくとも３％、６％、１０％又は１５％低いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すことが好ましい。上記アッセイは、ポリペプチドというセクションに記載のアッセイであることが好ましい。前記活性を、親細胞より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１５０％多く示す宿主も好ましい。別の好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。より好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞が百日咳菌株である場合、本発明の宿主細胞における多糖デアセチラーゼ活性のレベルは、上記に定義したＢ２１３株の対応する活性を対照として、それと比較される。
【００５７】
ポリペプチド発現及び／又は活性の低減は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば、天然に存在しているよりも多くのコピーの、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を宿主に導入することなどによって実現されていてもよく、上記核酸配列は、担体上にあっても、染色体上にあってもよい。代替として、選択された生物における高レベルタンパク質発現に適した、強く発現されるプロモーター又は強力なプロモーターに、多糖デアセチラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、又はこれら２通りのアプローチの組合せによって、上記核酸配列を過剰発現させることもできる。当業者ならば、宿主細胞のアイデンティティーに応じて、どの強力なプロモーターが最も適切であるか知っていよう。宿主細胞が百日咳菌株である場合、強力なプロモーターは、上述した、ベクターpMMB67EHのｔａｃプロモーターであることが好ましい。
【００５８】
より好ましい実施形態によれば、宿主細胞は、いかなる検出可能な量もの、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを産生せず、且つ／又はいかなる検出可能なグリコシルトランスフェラーゼ活性も示さない。宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼを産生しないか、又は実質的に産生しないことが好ましい。
【００５９】
代替として、別のさらに好ましい実施形態によれば、宿主細胞は、誘導性の量の、本発明のグリコシルトランスフェラーゼを産生し、且つ／又は誘導性のグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す。
【００６０】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルの低減及び／又はその活性レベルの低減は、当技術分野で知られている従来の方法によって、例えば宿主の内因性グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を不活性化又は下方制御することなどによって実現されていてもよい。この不活性化又は下方制御は、コード遺伝子内の１又は複数のヌクレオチドの欠失によって実現されていてもよい。別の実施形態では、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列内に変異を有する宿主、好ましくは百日咳菌に関する。グリコシルトランスフェラーゼをコードする不活性化されている核酸配列を有する宿主を構築するには、置換又は不活性化ベクターを調製して、その後、形質転換によって宿主に導入することが好ましい。当業者ならば、そのようなベクターを構築する方法を知っていよう。
【００６１】
内因性の核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における低レベルのタンパク質発現に適した弱いプロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現を低減することができる。
【００６２】
内因性の核酸配列の不活性化の代替として、又はそれと組み合わせて、選択された生物における、誘導性レベルのタンパク質発現に適した誘導性プロモーターに、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を融合させることによって、その発現に誘導性を与えることができる。宿主細胞が百日咳菌株である場合、誘導性プロモーターは、上記に定義したベクターpMMB67EHのｔａｃプロモーターであることが好ましい。
【００６３】
驚いたことに、本発明の宿主細胞は、百日咳全菌体ワクチンとして、又はアジュバントとしての使用を極めて魅力的なものにする魅力的な特性、すなわちＤＣと相互作用して、それに続いてそれらの成熟を誘導し、且つ炎症誘発性サイトカインの産生を誘導する潜在能の向上を有する。代替として、又は組み合わせて、これらの細胞から取得可能なＬＰＳも、ワクチンとして、又は下記に示すアジュバントとして使用するのに極めて適している。
【００６４】
したがって、本発明の別の態様では、薬物として使用するための、上記に定義した宿主細胞を提供する。前記薬物は、本明細書で下記に定義するワクチン又はアジュバントであることが好ましい。
【００６５】
宿主細胞によって取得可能なＬＰＳ
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で上記に定義した、本発明の宿主細胞から取得可能なＬＰＳに関する。宿主細胞は、好ましくはボルデテラ属種であり、より好ましくは百日咳菌であり、さらにより好ましくは本発明の多糖デアセチラーゼの過剰発現及び／又は本発明のグリコシルトランスフェラーゼの不活性化を保持する百日咳菌である。本発明のＬＰＳは、実施例で調製されている通り、変異体２３３１から取得可能であることが、より好ましい。
【００６６】
本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、熱フェノール／水抽出を用いた単離（Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91）、穏やかな加水分解によるＯ−脱アシル化（Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ）、及び陰イオンモードにおけるＥＳＩ−ＭＳによる分析の後で分析した際に、野生型ＬＰＳと名づけられた、野生型百日咳菌由来のＬＰＳの対応するＥＳＩ−ＭＳスペクトルより多くのイオンを与えることを特徴とすることが、さらにより好ましい。野生型百日咳菌は、上記に定義した株Ｂ２１３であることが好ましい。いかなる理論にも拘泥するものではないが、これらの追加のイオンは、ヘキソサミン残基を有するＬＰＳのリピドＡ部分の１又は４’リン酸基の置換の増大を少なくとも一部反映したものでありうる。
【００６７】
通常、野生型ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、７種のイオン（表３参照）を示すことを特徴とするが、本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、７種超のイオン、すなわち少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、そしてより好ましくは１４種のイオンを示すことを特徴とする。
【００６８】
上記の実施形態の代替として、又はそれと組み合わせて、本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ヘキソサミンを含むイオンを、野生型ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルより多く含むことが好ましい。通常、野生型ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ヘキソサミンを有するイオンを２種示すが（表３）、本発明のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、２種超のイオン、すなわち少なくとも４種、少なくとも６種、そしてより好ましくは８種のイオンを示すことを特徴とする。
【００６９】
医薬組成物及び医学的使用
本発明はさらに、両方とも本明細書で上記に定義した、本発明の宿主細胞及び／又は本発明のＬＰＳを含む医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、ワクチンとして、又はアジュバントとして使用できる。上記ワクチンは、哺乳動物の免疫化（免疫応答の誘導）又はワクチン接種に使用できる。
【００７０】
アジュバントは、本明細書では、抗原と組み合わせて使用した場合、好ましくはアジュバント自体に対する特異的な免疫応答を生成させずに、哺乳動物、好ましくはヒトを免疫化し、免疫系を刺激し、それによって抗原に対する免疫応答を誘発、強化又は促進する物質又は化合物のいかなるものもそれに含まれると定義されている。好ましいアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を、同一条件下、但しアジュバントの非存在下で抗原に対して生成された免疫応答と比較して、少なくとも係数１．５、２、２．５、５、１０又は２０で強化する。動物又はヒトの群において、対応する対照群を超えて、アジュバントによって産生される、所与の抗原に対する免疫応答の強化の統計的平均を決定する試験が、当技術分野で利用可能である。アジュバントは、少なくとも２種の異なった抗原に対する免疫応答を強化できることが好ましい。通常、本発明のアジュバントは、哺乳動物にとって外来の化合物であり、それにより、例えば、インターロイキン、インターフェロン及び他のホルモンなど、哺乳動物にとって内因性の免疫活性化化合物は除外されるであろう。
【００７１】
好ましい実施形態では、上記医薬組成物がアジュバントとして使用される場合、上記組成物が抗原をさらに含む。
【００７２】
上記組成物がワクチンとして使用される場合、抗原は、本発明の宿主細胞の表面に存在し、且つ／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳ内に存在する。この場合、ワクチンは、本発明の宿主に対するワクチンであり、且つ／又は関連するＬＰＳ分子を発現できる任意の宿主に対するワクチンであることが好ましい。
【００７３】
上記組成物がアジュバントとして使用される場合、抗原が存在することが好ましい。上記抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、癌細胞からの抗原、又はそれらによって産生された抗原、又は下記に定義するアレルゲンであることが好ましい。本発明の抗原及び宿主細胞並びに／又はそのような細胞によって取得可能なＬＰＳは、上記細菌、ウイルス、真菌類若しくは寄生虫によって引き起こされた感染症、又は上記癌細胞によって引き起こされた腫瘍、又は上記アレルゲンによって引き起こされたアレルギーの治療及び／又は予防に用いることが好ましい。
【００７４】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞及び／又はそれから取得可能なＬＰＳを含み、且つ本明細書で上記に定義した抗原を含んでもよい医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む。上記医薬組成物は、薬学的に許容される安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤及び分散剤などをさらに含みうる。上記医薬組成物の好ましい剤形は、投与及び治療適用の意図されている様式に依存する。薬学的担体は、活性成分、すなわち本発明の宿主細胞及び／又はこの宿主細胞から取得可能なＬＰＳ並びにオプションで抗原を、患者に送達するのに適した適合性且つ無毒のいかなる物質でもよい。鼻腔内送達用の薬学的に許容される担体は、水、緩衝生理食塩溶液、グリセリン、ポリソルベート２０、クレモホールEL及びカプリル／カプリングリセリドの水性混合物によって例示され、中性ｐＨ環境を用意するために緩衝化されていてもよい。非経口送達用の薬学的に許容される担体は、０．９％無菌緩衝化ＮａＣｌ、又は２０％アルブミンが補足されていてもよい５％グルコースによって例示される。非経口投与用の製剤は無菌でなければならない。上記活性成分を投与するための非経口経路は、既知な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内又は病巣内経路による注射又は注入に一致している。本発明の組成物は、ボーラス注入によって投与することが好ましい。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば、１〜１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水と、１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの抗原と、１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの本発明の宿主細胞及び／又はＬＰＳとを含有するように調製されよう。経口投与用には、エリキシル剤、シロップ剤及び懸濁液などの液体剤形中で活性成分を投与できる。経口投与用の液体剤形は、患者の認容性を増大させる着色剤及び風味剤を含有しうる。非経口、経口又は鼻腔内投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)（あらゆる目的のために、その全体が、参照により組み込まれる）を含めた、様々な情報源により詳細に記載されている。
【００７５】
本発明の組成物中の抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生生物、癌細胞又はアレルゲン由来であるか、それらによって産生された抗原であることが好ましい。本発明の宿主細胞及び／又はＬＰＳと併用できるウイルス抗原は、あらゆる種類のウイルスに由来するものでありえ、そのようなウイルスの非限定的な例は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ，Human Immunodeficiency virus）などのレトロウイルス科（Retroviridae）；風疹ウイルス（rubellavirus）；パラインフルエンザウイルス（parainfluenza virus）、麻疹（measles）、おたふくかぜ（mumps）、呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus）、ヒトメタニュウモウイルス（human metapneumovirus）などのパラミクソウイルス科（paramyxoviridae）；黄熱ウイルス（yellow fever virus）、デングウイルス（dengue virus）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ，Hepatitis C Virus）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ，Japanese Encephalitis Virus）、ダニ媒介脳炎（tick-borne encephalitis）、セントルイス脳炎（St. Louis encephalitis）又は西ナイルウイルス（West Nile virus）などのフラビウイルス科（flaviviridae）；単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex virus）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）、エプスタイン−バーウイルス（Epstein-Barr virus）などのヘルペスウイルス科（Herpesviridae）；ブニアウイルス科（Bunyaviridae）；アレナウイルス科（Arenaviridae）；ハンタン（Hantaan）などのハンタウイルス科（Hantaviridae）；コロナウイルス科（Coronaviridae）；ヒトパピローマウイルス（human Papillomavirus）などのパポーバウイルス科（Papovaviridae）；狂犬病ウイルス（rabies virus）などのラブドウイルス科（Rhabdoviridae）；ヒトコロナウイルス（human coronavirus）などのコロナウイルス科（Coronaviridae）；アルファウイルス科（Alphaviridae）；アルテリウイルス科（Arteriviridae）；エボラウイルス（Ebolavirus）などのフィロウイルス科（filoviridae）；アレナウイルス科（Arenaviridae）；天然痘ウイルス（smallpox virus）などのポックスウイルス科（poxviridae）及びアフリカブタコレラウイルス（African swine fever virus）である。同様に、本発明の宿主細胞及び／又はＬＰＳは、病原細菌、真菌（酵母を含める）又は寄生虫由来の抗原と組み合わせることができる。そのような抗原には、例えば、ピロリ菌（H. pylori）などのヘリコバクター属（Helicobacter）；髄膜炎菌（N. mengitidis）などのナイセリア属（Neisseria）；インフルエンザ菌（H. influenza）などのヘモフィルス属（Haemophilus）；百日咳菌（B. pertussis）などのボルデテラ属（Bordetella）；クラミジア属（Chlamydia）；連鎖球菌種血清型Ａ（Streptococcus sp. serotype A）などのストレプトコッカス属（Streptococcus）；コレラ菌（V. cholera）などのヴィブリオ属（Vibrio）；例えば、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）及びエシェリキア属（Escherichia）を含めたグラム陰性腸内病原体の細菌抗原が含まれ、同様に、炭疸、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス及び淋疾を引き起こす細菌からの抗原も含まれる。寄生虫からの抗原には、例えば、ウシバベシア原虫（Babeosis bovis）、マラリア原虫（Plasmodium）、リーシュマニア属諸種（Leishmania spp.）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）及びクルーズトリパノソーマ（T. cruzi）などのトリパノソーマ属（Trypanosoma）などの原生動物由来の抗原が含まれる。真菌抗原には、アスペルギルス属種（Aspergillus sp.）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）などのクリプトコッカス（Cryptococcus）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）などの真菌に由来する抗原が含まれうる。
【００７６】
ワクチン接種は、通常、病原体に対する予防防御用又は病原体感染に続く疾患の治療用に適用されるが、当業者は、腫瘍治療用のワクチンの適用を認識している。さらに、増加している数の腫瘍特異的タンパク質が、ヒト抗体又はヒト化抗体によってターゲッティングできる適切な実体であると判明している。そのような腫瘍特異的タンパク質も、本発明の範囲に包含される。多くの腫瘍特異抗原が当技術分野で知られている。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、上記に定義した腫瘍特異抗原と、宿主細胞及び／又はＬＰＳとを含む組成物を提供する。適した腫瘍抗原には、例えば、癌胎児抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異抗原、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多型上皮ムチン（ＰＥＭ，polymorphic epithelial mucin）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、（末端欠失型）上皮成長因子受容体（ＥＧＲＦ，epidermal growth factor receptor）、ＨＥＲ２、Ｔ（Thomsen-Friedenreich）抗原、ＧＭ−２及びＧＤ−２ガングリオシド、Ｅｐ−ＣＡＭ、ムチン−１、上皮糖タンパク質−２及び大腸特異抗原が含まれる。
【００７７】
加えて、自己免疫疾患の予防における寛容性を誘導するために、抗原をＤＣにターゲッティングできる。そのようなアレルゲンも、本発明の範囲に包含される。
【００７８】
したがって、さらに別の態様では、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、薬として使用するためのものである。上記薬は、百日咳に対するワクチンであることが好ましい。
【００７９】
別の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳが、アジュバントとして使用するためのものである。本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、抗原と組み合わせて使用するのが、より好ましい。
【００８０】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳの使用に関する。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞、好ましくは百日咳菌及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するためのアジュバントとして使用される。本発明の宿主細胞及び／又はそのような細胞から取得可能なＬＰＳは、前記抗原と組み合わせてアジュバントとして使用されることが、より好ましい。
【００８１】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、本明細書で上記に定義した本発明のポリペプチド及び／又は本明細書に定義した本発明の核酸配列の使用に関する。
【００８２】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、アジュバントを調製するための、本明細書で上記に定義した本発明のポリペプチド及び／又は本明細書で上記に定義した本発明の核酸配列の使用に関する。この態様では、本明細書で上記に定義した本発明のポリペプチド及び／又は本明細書で上記に定義した本発明の核酸配列は、抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するために、抗原と組み合わせて使用することが好ましい。
【００８３】
本発明の方法及び使用では、上記哺乳動物がヒトであることが好ましい。
【００８４】
この文書及びこれに添付されている特許請求の範囲では、「含む（to comprise）」という動詞及びその活用型は、その単語に続く項目が含まれるが、明示的に言及されなかった項目も除外されないことを意味するように非限定的な意味で使用される。加えて、不定冠詞「a」又は「an」による要素の指示は、それらの要素が唯一無二で存在することを文脈が明確に要求しない限り、それらの要素が１を超える数で存在する可能性を除外しない。したがって、通常、不定冠詞「a」又は「an」は「少なくとも１（at least one）」を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】同定されたグリコシルトランスフェラーゼオペロンの模式図である。暗灰色の矢印は、推定上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を示し、一方、明灰色及び白色の矢印は、それぞれ、推定上の単糖デアセチラーゼをコードする遺伝子及び隣接のＯＲＦを示す。
【図１Ｂ】トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、野生型百日咳菌株（ＷＴ）、並びにＢＰ２３２９、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３３１変異体株からのＬＰＳプロファイルの分析を示す図である。
【図２Ａ】野生型百日咳菌のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図２Ｂ】百日咳菌変異体株ＢＰ２３２８のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図２Ｃ】百日咳菌変異体株ＢＰ２３２９のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図２Ｄ】百日咳菌変異体株ＢＰ２３３１のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳを示す図である。
【図３Ａ】ＢＰ２３３１変異体株からのＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンモード直列質量分析を示す図であり、ｍ／ｚ １１０８．３のイオンの抽出ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】ＢＰ２３３１変異体株からのＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンモード直列質量分析を示す図であり、ｍ／ｚ １１６２．０のイオンの抽出ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図３Ｃ】ＢＰ２３３１変異体株からのＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンモード直列質量分析を示す図であり、ｍ／ｚ １１６２．０のイオンから、ｍ／ｚ １１１２．６のイオンの抽出ＭＳ３スペクトルを示す図である。
【図４Ａ】野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、ＭＯＩ１０（黒色の実線）又は１００（破線）の、ＰＦＡ固定された野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された２４時間後のヒトＤＣにおける、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ４０の細胞表面発現の分析を示す図である。刺激されていないＤＣを対照として用いた（灰色で塗りつぶされたヒストグラム）。５０００回カウントされたイベントから得られた、表示の百日咳菌株のＦＡＣＳヒストグラムが示されている。縦軸は細胞数を表し、横軸は染色の強度を表す。
【図４Ｂ】野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、ＭＯＩ１０又は１００の、ＰＦＡ固定された野生型及び変異体百日咳菌細胞で刺激された後の培養ヒトＤＣによるＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の産生を示す図である。結果は、平均サイトカイン濃度（±ＳＤ）で表されている。
【図５Ａ】精製された野生型及び変異体百日咳菌ＬＰＳで刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、１μｇ／ｍｌの精製ＬＰＳで刺激された２４時間後のヒトＤＣにおける、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ４０の細胞表面発現の分析を示す図である。刺激されていないＤＣを対照として用いた（灰色で塗りつぶされたヒストグラム）。５０００回カウントされたイベントから得られた、表示の百日咳菌株のＬＰＳのＦＡＣＳヒストグラムが示されている。縦軸は細胞数を表し、一方、横軸は染色の強度を表す。
【図５Ｂ】精製された野生型及び変異体百日咳菌ＬＰＳで刺激された後のＤＣ活性化を示す図であり、１μｇ／ｍｌの精製ＬＰＳで刺激された後の培養ヒトＤＣによるＩＬ−１０産生を示す図である。結果は、平均サイトカイン濃度として表されている。
【図６Ａ】野生型百日咳菌株（ＷＴ）、又はＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体株からの精製百日咳菌ＬＰＳによるＩＬ−６誘導を示す図である。ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６によるＩＬ−６の産生を、精製ＬＰＳの保存液の系列希釈液で刺激した。
【図６Ｂ】野生型百日咳菌株（ＷＴ）、又はＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体株からの全細菌細胞によるＩＬ−６誘導を示す図である。ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６によるＩＬ−６の産生を、全細菌細胞の系列希釈液で刺激した。培養上清中のＩＬ−６濃度は、ヒトＩＬ−６に対するＥＬＩＳＡで定量化した。データは３回の個別な実験の平均を表す。
【図７】百日咳菌ＬＰＳの構造を示す図である。ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体株の、提唱されている末端欠失型コアＯＳ構造を赤色の矢印によって示す。（Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14）からの改変。［実施例］
【００８６】
材料及び方法
細菌株及び培養条件
使用されたすべて細菌株を表１に示す。通常、大腸菌（E.coli）株は、２００ｒｐｍで振盪しながら、ルリア−ベルターニ（ＬＢ，Luria-Bertani）ブロス中で、３７℃で培養した。適切な場合には、プラスミドの維持又は株の選択のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン又は１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下で細菌を培養した。百日咳菌は、１５％脱線維素ヒツジ血液（Tritium社製）を補足したボルデー−ジャングー（ＢＧ，Bordet-Gengou）寒天上で３５℃で培養した。
【００８７】
組換えＤＮＡ技法
使用されたすべてのプラスミドを表１に示す。プラスミドＤＮＡは、Promega社製Wizard（登録商標）Plus SVミニプレップシステムを用いて単離した。製造会社（Roche社）の指示に従って、制限エンドヌクレアーゼを用いた。ＤＮＡ断片は、アガロースゲルからPromega社製Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Upシステムを用いて単離した。核酸連結は、迅速ＤＮＡ連結キット（Roche社製）を用いて行った。
【００８８】
使用されたすべてのプライマーを表２に示す。ＰＣＲ反応用の染色体鋳型ＤＮＡは、５０μｌの蒸留水中に約１０９の細菌を再懸濁し、その後、懸濁液を９５℃で１５分間加熱することによって調製した。次に、この懸濁液を１６１００×ｇで１分間遠心処理し、その後、上清を鋳型ＤＮＡとして用いた。百日咳菌変異体株Ｂ２１３ΔＢＰ２３２８及びΔＢＰ２３２９を構築するために、本発明者らは、プライマーＢＰ２３２８＿ＦＷｕｐ、ＢＰ２３２９＿ＦＷｕｐと、プライマーＢＰ２３２８＿ＲＥＶｕｐ及びＢＰ２３２９＿ＲＥＶｕｐとを用いることによって、対応するＯＲＦの５’領域及び上流配列を包含するＤＮＡセグメントを増幅した。プライマーＢＰ２３２８＿ＲＥＶｕｐ及びＢＰ２３２９＿ＲＥＶｕｐは共にBamHI部位を含有していた。加えて、ＯＲＦの３’領域及び下流配列を含有するＤＮＡ断片を、共にBamHI部位を含有するプライマーＢＰ２３２８＿ＦＷｄｏｗｎ、ＢＰ２３２９＿ＦＷｄｏｗｎと、プライマーＢＰ２３２８＿ＲＥＶｄｏｗｎ及びＢＰ２３２９＿ＲＥＶｄｏｗｎとを用いたＰＣＲによって得た。百日咳菌ＢＰ２３３１変異体株を構築するために、プライマーＢＰ２３３１＿ＦＷ及びＢＰ２３３１＿ＲＥＶを用いることによって、対応するＯＲＦを増幅した。ＰＣＲは、各プライマー５ｐｍｏｌを含有する総反応容積２５μｌ中で、pureTaq Ready-To-GoＰＣＲビーズ（Amersham Biosciences社製）を用いて行った。温度プログラムは以下の通り、すなわち、９５℃で３分間；９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３０サイクル；その後、７２℃で７分間及びそれに続く４℃までの冷却であった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、続いてpGEM-T Easyにクローニングし、その結果、それぞれプラスミドpGEM-BP2328up、pGEM-BP2328down、pGEM-BP2329up、pGEM-BP2329down及びpGEM-BP2331を得た。pGEM-BP2328down及びpGEM-BP2329downのBamHI-SpeI断片を、それぞれ、BamHI-SpeI制限されたpGEM-BP2328up及びpGEM-BP2329upに連結した。この結果得られたプラスミド及びプラスミドpGEM-BP2331をそれぞれBamHI及びEcoRVで切断して、BamHI及びHindIII消化によってそれぞれ得られたプラスミドpBSL128由来のカナマイシン耐性カセットの挿入を可能にした。最後に、得られたコンストラクトのEcoRI断片をEcoRI制限された自殺プラスミドpSS1129に連結した。それぞれpSS1129-BP2328KO、pSS1129-BP2329KO及びpSS1129-BP2331KOと名づけられた最終コンストラクトは、そのオペロンの転写方向と同じ方向でカナマイシン耐性カセットを含有していた。pSS1129ベースのプラスミドを用いて大腸菌ＳＭ１０（λｐｉｒ）を形質転換した。これによって、それに続く、百日咳菌へのこれらのプラスミドの導入、並びに対立遺伝子交換による百日咳菌ＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体の構築が可能となった。形質転換体は、様々なプライマーセットを用いたＰＣＲによってスクリーニングした。
【００８９】
ＬＰＳの単離及び脱Ｏ−アシル化ＬＰＳの調製
ＬＰＳは、若干の改変（Geurtsen, J., Steeghs, L., Hamstra, H-J., ten Hove, J., de Haan, A., Kuipers, B., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2006) Expression of the lipopolysaccharide-modifying enzymes PagP and PagL modulates the endotoxic activity of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 74: 5574-5585）を加えた、熱フェノール／水抽出（Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91）を用いて単離した。ＬＰＳの脱Ｏ−アシル化は、穏やかなヒドラジン分解によって行った（Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ）。簡潔には、ＬＰＳを無水ヒドラジン（２００μｌ）中に溶解させ、定常的に撹拌しながら３７℃で５０分間インキュベートして、Ｏ結合脂肪アシル鎖を遊離させた。混合物を冷却し、６００μｌの冷アセトンを少しずつ添加して、ヒドラジンをアセトンヒドラゾンに変えた。脱Ｏ−アシル化ＬＰＳの沈殿物を遠心処理（４０００×ｇ、７℃で３０分間）によって収集した。ペレットを６００μｌの冷アセトンで２回洗浄し、遠心処理し、水中に溶解させた後、凍結乾燥を行った。
【００９０】
毛細管電気泳動エレクトロスプレー質量分析法
Prince CEシステム（Prince Technologies社製）を4000 QTRAP質量分析計（Applied Biosystems/MDS Sciex社製）と連結した。シース溶液（イソプロパノール−メタノール、２：１）を流速１．０μｌ／分で送達した。分離は、１５ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する脱イオン水、ｐＨ９．０を用いて、長さ約９０ｃｍの露出した溶融石英毛細管上で得た。５ｋＶ及び−５ｋＶのエレクトロスプレーイオン化電位を用いて、それぞれ、陽イオンモード及び陰イオンモードでの検出に用いた。すべての質量分光分析実験に、カーテンガス及びコリジョンガスとして、窒素を用いた。ＭＳ２（高感度プロダクトイオンスキャン（ＥＰＩ，enhanced product ion scan））及びＭＳ３実験では、走査速度をＱ０トラップ付きで４０００Ｄａ／ｓに設定し、トラップ部へのインジェクション時間（trap fill time）を「ダイナミック」に設定し、Ｑ１の分解能を「ユニット」に設定した。ＭＳ３実験用には、１価に荷電された前駆体の第１同位元素のみが励起されるように値に励起係数を設定し、励起時間を１００ｍｓに設定した。
【００９１】
トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＬＰＳ分析
約１０９の細菌を５０μｌの試料緩衝液（Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685）中に懸濁し、０．５ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）のプロテイナーゼＫを添加した。試料を５５℃で６０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１０分インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。次に、試料緩衝液を添加することによって、試料を１０倍希釈し、その後、各試料２μｌをトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) Increased resolution of lipopolysaccharides and lipooligosaccharides utilizing tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Immunol. Methods 126: 109-117）に添加した。ブロムフェノールブルーが分離ゲル内に入るまで３５Ｖで泳動し、その後、電位を１０５Ｖまで増強した。最前部がゲルの底部に達した後、さらに４５分間電気泳動を続けた。水／エタノール／酢酸１１：８：１（ｖ／ｖ／ｖ）中でゲルを終夜固定し、続いて、記載（Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 119: 115-119）の通りに銀染した。
【００９２】
細菌細胞懸濁液の調製
０．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ，paraformaldehyde）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate-buffered saline）で３０分間、細菌を不活性化し、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco社製）で徹底的に洗浄した。約１０９細菌／ｍｌに相当する、６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ６００）が１である細菌懸濁液を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０培地中に調製した。
【００９３】
ヒトＤＣの産生及び培養
未成熟ヒトＤＣは、以前の記載の通り（Sallusto, F., and Lanzavecchia, A. (1994) Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor α. J. Exp. Med. 179: 1109-1118）、わずかに改変して、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ，human peripheral blood mononuclear cell）から生成させた。簡潔には、フィコール勾配（Amersham Biosciences社製）上の密度勾配遠心を用いて、健常ボランティアから得られたヘパリン化血液から、ＰＢＭＣを単離した。１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ，fetal calf serum）（Bodinco BV社製）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地で、回収したＰＢＭＣ画分を３回洗浄した。次に、三層パーコール勾配（GE Healthcare Bio-Sciences AB社製）（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ中に６０％、４７．５％、３４％パーコール）上での遠心処理によって、ＰＢＭＣから単球を調製した。上側の境界面から単球を採取し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ培地で３回洗浄し、６ウェルプレート内（１ウェルあたり４ｍｌ、０．５×１０６細胞／ｍｌ）の、２．４ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco社製）、１００ｎｇ／ｍｌのヒト組換え体ＧＭ−ＣＳＦ（Peprotech社製）及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え体ＩＬ−４（Strathmann-Biotec AG社製）を補足したＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ中でインキュベートした。６日間の培養の後に、未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ，immature DC）を採取した。ｉｍＤＣは、フローサイトメトリーによる評価では、ＣＤ１４及びＣＤ８３に関して陰性であり、低レベルのＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲを発現し、高レベルのＣＤ４０及びＣＤ１１ｃを発現していた。
【００９４】
ＤＣ刺激
ＩｍＤＣを洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳ中に、５×１０５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、感染多重度（ＭＯＩ，multiplicity of infection）１０若しくは１００のＰＦＡ固定百日咳菌細胞又は濃度１０若しくは１０００ｎｇ／ｍｌの精製ＬＰＳのいずれかと共に同時インキュベートした。すべての実験の対照として、刺激されていないｉｍＤＣを用いた。２４時間後にＤＣを採取し、細胞表面マーカーの発現に関して直接染色し、サイトカイン測定まで上清を−８０℃で保存した。
【００９５】
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析
ＤＣの成熟マーカー及び共起刺激分子の表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。未成熟ＤＣ又は刺激されたＤＣを採取し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳで洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミンを含有するフィルター滅菌ＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝剤）中に再懸濁した。次に、以下の抗体、すなわち、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１１ｃ（ｍＩｇＧ１）及びＣＤ８３（ｍＩｇＧ１）、フィコエリトリン結合抗ヒトＣＤ８６（ｍＩｇＧ１）及びＣＤ４０（ｍＩｇＧ１）、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１４（ｍＩｇＧ１）及びＨＬＡ−ＤＲ（ｍＩｇＧ２ｂ）並びに適切に蛍光色素標識されたアイソタイプ対照（eBioscience社製のＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０及びＣＤ１４；BD Pharmingen社製のＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ）のいずれかと共に細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー（FACScan，Becton Dickinson社製）を用いて分析した。
【００９６】
サイトカイン測定
刺激されたＤＣの上清中におけるヒトＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０濃度を、製造業者（BD Biosciences Pharmingen社）の指示に従って、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，Enzyme-linked Immunosorbent Assay）を用いて判定した。
【００９７】
内毒素活性分析
ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６（Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int. J. Cancer 41: 456-461）を、記載の通り（Geurtsen, J., Steeghs, L., Hamstra, H-J., ten Hove, J., de Haan, A., Kuipers, B., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2006) Expression of the lipopolysaccharide-modifying enzymes PagP and PagL modulates the endotoxic activity of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 74: 5574-5585）、全細菌細胞懸濁液又は精製ＬＰＳの系列希釈液で刺激した。遠心処理によって培養物から細胞を収集することによって細菌細胞懸濁液を調製し、その後、ＯＤ５９０が１．０となるようにそれらをＰＢＳ中に再懸濁し、８ｍＭホルムアルデヒドの存在下で１０分間、熱不活性化し、４℃で保存した。刺激に続いて、製造業者（PeliKine Compact（商標））の指示に従って、ヒトＩＬ−６に対するＥＬＩＳＡを用いて、培養上清中のＩＬ−６濃度を定量化した。
【００９８】
結果
百日咳菌の新規ＬＰＳ生合成オペロンの同定
本発明者らは、４つの遺伝子クラスター（ＢＰ２３２８からＢＰ２３３１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿８８０９６６からＮＰ＿８８０９６９）を見出した。それらのうち３つ、すなわち、ＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１は、様々な細菌のＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼに高い配列類似性を示した。ＢＰ２３３０は、ピアス病菌（Xylella fastidiosa）の多糖デアセチラーゼに最も高い類似性を示す。これら４つのＯＲＦは、相互に近接しており、一部の場合では、オーバーラップさえしており、これは、それらがオペロンを構成していることを示唆している（図１Ａ）。このオペロンの上流の遺伝子、及び逆の方向性にある下流の遺伝子は、それぞれ、ＤＮＡポリメラーゼIIIサブユニットαであるＤｎａＥの相同体、及び推定上の大腸菌スルファターゼであるＹｈｂＸを推定上コードしている。推定上のＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼの役割を検査するため、本発明者らは、対立遺伝子交換による挿入不活化用に、カナマイシン耐性カセットによって中断されたＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１遺伝子を自殺プラスミドpSS1129内に個別に保持するコンストラクトを作製した。このアプローチを用いて、これら３つの遺伝子すべてのノックアウト変異体を、百日咳菌株Ｂ２１３で容易に得ることができた。全細胞溶解物のトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるそれらのＬＰＳの分析は、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体に関して、末端欠失型のＬＰＳを明確に示した（図１Ｂ）。対照的に、ＢＰ２３３１変異体株のＬＰＳは、より異型遺伝子性であり、野生型長のものを含めた多重バンドからなっていた。
【００９９】
ＬＰＳ構造分析
それらの構造を決定するために、野生型、ＢＰ２３２８、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体株からのＬＰＳを単離し、Ｏ−脱アシル化し、陰イオンモードでのＥＳＩ−ＭＳによって分析した（図２）。提唱されたＬＰＳ組成の概要を表３に示す。野生型ＬＰＳのスペクトル（図２Ａ）は、ＧｌｃＮＡｃ・Ｍａｎ２ＮＡｃ３ＮＡｃＡ・Ｆｕｃ２ＮＡｃ４ＮＭｅ・ＧａｌＮＡ・Ｇｌｃ・ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ３・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨという組成を有する完全長百日咳菌ＬＰＳに相当する、ｍ／ｚ １１０８．５の３価に荷電された主要イオンを明らかにした。追加のイオンは、ｍ／ｚ ７７０．１（［Ｍ−３Ｈ］３−）、８１１．１（［Ｍ−４Ｈ］４−）、８３１．４（［Ｍ−４Ｈ］４−）、８８８．３（［Ｍ−３Ｈ］３−）、９５１．８（［Ｍ−Ｈ］−）、９８７．１（［Ｍ−２Ｈ］２−）、１０８１．７（［Ｍ−３Ｈ］３−）、１１２１．１（［Ｍ−３Ｈ＋Ｋ］３−）、１１５５．０（［Ｍ−２Ｈ］２−）及び１１６２．１（［Ｍ−３Ｈ］３−）に存在していた。これらのイオンの大部分は、脱リン酸化グリコ型又は末端欠失グリコ型に相当したが、ｍ／ｚ １１６２．１の３価荷電イオンは、追加のヘキソサミン部分で置換された完全長百日咳菌ＬＰＳに相当した（表３）。ＢＰ２３２８変異体ＬＰＳ（図２Ｂ）のＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ ７４３．６、７７０．０及び８２３．７の３価荷電イオンを、ｍ／ｚ １１１５．２、１１５５．１及び１２３５．７の、それらに対応する２価荷電イオンと共に示した。追加のピークは、ｍ／ｚ ７７７．３（［Ｍ−３Ｈ＋Ｎａ］３−）、９５２．１（［Ｍ−Ｈ］−）、１０３４．６（［Ｍ−２Ｈ］２−）、１０７４．６（［Ｍ−２Ｈ］２−）及び１１６６．１（［Ｍ−２Ｈ＋Ｎａ］２−）に存在していた。ピークの帰属は、最も完全なコアＯＳ構造が、ＧａｌＮＡ・Ｇｌｃ・ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨという組成に相当する、ｍ／ｚ ８２３．７及び１２３５．７のイオンによって代表されることを明らかにした。ＢＰ２３２９変異体ＬＰＳ（図２Ｃ）は、ｍ／ｚ ６０３．９及び６５７．６の３価荷電イオンを、ｍ／ｚ ９０６．０及び９８６．６の、それらに対応する２価荷電イオンと共に示した。加えて、これらのイオンのナトリウム付加物及びカリウム付加物は、それぞれｍ／ｚ ９１７．４及び９９７．６並びにｍ／ｚ ９２５．０及び１００５．６に存在した。追加ピークは、ｍ／ｚ ８６６．０（［Ｍ−２Ｈ］２−）、９３７．４（［Ｍ−２Ｈ−Ｈ２Ｏ］２−）及び１０６７．１（［Ｍ−２Ｈ］２−）に存在した。この場合、最も完全なコア構造は、ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨという組成に相当するｍ／ｚ １．０６７．１の２価荷電イオンによって代表された。ＢＰ２３３１変異体ＬＰＳ（図２Ｄ）は、それぞれ、完全長百日咳菌ＬＰＳ及び追加のヘキソサミンによって置換された完全長百日咳菌ＬＰＳに相当する、ｍ／ｚ １１０８．３及び１１６２．０の３価荷電イオンを含めた多数のピークを示した。
【０１００】
野生型及びＢＰ２３３１変異体ＬＰＳの両方で観察された追加のヘキソサミン部分の位置を決定するために、ＥＳＩ−ＭＳ２検査を陰イオンモードで行った（図３）。ｍ／ｚ １１０８．３（図３Ａ）及び１１６２．０（図３Ｂ）のイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルは共に、ｍ／ｚ ９５１．５の１価に荷電されたフラグメントイオンを示した。これは、コリジョン誘起解離下で、Ｋｄｏ−リピドＡ結合の間の切断から生じたリピドＡ−ＯＨが、各残基が共にリン酸基で置換された、Ｎ−アシル化（３ＯＨ Ｃ１４）グルコサミン残基のβ−（１→６）結合二糖からなることを明らかにした。ｍ／ｚ １１６２．０のイオンのスペクトルも、ｍ／ｚ １１１２．６の追加イオンを示した。これは、付加的なヘキソサミン残基がリピドＡに直接結合したことを示す。ｍ／ｚ １１１２．６のＭＳ３は、この結論をさらに支持した（図３Ｃ）。
【０１０１】
百日咳菌ＬＰＳ変異体による樹状細胞活性化
ＤＣ活性化へのＬＰＳ変異の影響を判定するために、ＭＯＩ１０及び１００のＰＦＡ固定された百日咳菌野生型及び変異体細菌と共に、未成熟なＤＣを同時培養した。ＤＣ活性化は、フローサイトメトリーによる成熟マーカー（ＣＤ８３及びＨＬＡ−ＤＲ）及び共起刺激分子（ＣＤ８６及びＣＤ４０）発現の分析（図４Ａ）、並びにＥＬＩＳＡによるＩＬ−１０及びＩＬ１２ｐ７０誘導の分析（図４Ｂ）によってモニターした。野生型細菌及びすべての変異体細菌がＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＤ４０発現を誘導した。これは、すべての株がＤＣを活性化できたことを実証する。しかし、ＢＰ２３２９及びＢＰ２３３１変異体細菌は、それぞれ明らかに野生型細菌より弱刺激性及び強刺激性であったが、ＢＰ２３２８変異体株は野生型と同程度に効果的であった。ＢＰ２３２９変異体株の場合に観察されたＤＣ成熟の低減には、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の誘導の低減が伴っていた（図４Ｂ）。同様に、ＤＣ成熟能の増強を示したＢＰ２３３１変異体は、より多くの量のＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０を誘導した。野生型株及びＢＰ２３２８変異体株は、匹敵するレベルのＩＬ−１０を誘導した。これは、これら両株に応答したＤＣ表面における共起刺激分子及び成熟マーカーの発現が同等であったことと一致している。しかし、野生型株がＩＬ−１２ｐ７０産生を明らかに誘導したのに対して、これは、ＢＰ２３２８変異体株では、ほとんど妥当しなかった（図４Ｂ）。これは、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の発現が示差的に調節されうることを示唆している。
【０１０２】
野生型株と変異体株との間で観察されたＤＣ活性化能の相違が、ＬＰＳ組成の相違と直接関係しているかどうか評価するために、１０及び１０００ｎｇ／ｍｌの精製ＬＰＳを用いたＤＣ活性化検査を行った。野生型、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３３１変異体細菌に応答したＤＣ表面における、成熟マーカー及び共起刺激分子の発現の大きな増大とは対照的に、これらの株からのＬＰＳを１０００ｎｇ／ｍｌ用いた場合でさえ、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ４０発現は、わずかな増大が見出されたのみであり（図５Ａ）、ＨＬＡ−ＤＲの発現の増大は見出されなかった（データは示されていない）。同様に、ＬＰＳで刺激されたＤＣの上清中では、ＩＬ−１０誘導が弱く（図５Ｂ）、且つＩＬ−１２ｐ７０が検出できなかった（データは示されていない）。それにもかかわらず、完全な細菌で得られた結果によれば、ＢＰ２３３１変異体株から単離されたＬＰＳで、最も高いＤＣ活性化能が見い出され、ＢＰ２３２８変異体株及び野生型株の活性化能がそれに続くが、ＢＰ２３２９変異体株の活性化能はＤＣを成熟化できなかったことが相互比較（図５Ａ及び５Ｂ）によって明らかになった。したがって、変異体のＬＰＳ構造の改変は、ＤＣが活性化能に示差的に影響を与える。
【０１０３】
ＬＰＳ及び全細菌細胞の内毒素活性
ＬＰＳの内毒素活性へのＬＰＳ変異の帰結を評価するために、ＩＬ−６を産生するように、ヒトマクロファージ細胞系ＭＭ６を刺激する精製ＬＰＳの能力を試験した。野生型ＬＰＳと比較して、ＢＰ２３３１変異体株からの精製ＬＰＳは、マクロファージを刺激する能力が大きく増大していた（図６Ａ）。対照的に、ＢＰ２３２９変異体株からのＬＰＳは、ＩＬ−６産生を刺激する能力が低減していたが、ＢＰ２３２８変異体からのＬＰＳは、野生型ＬＰＳと同程度に活性であった（図６Ａ）。試験したＬＰＳ濃度のうち最も高い２通りの濃度でのみ、後者のＬＰＳが野生型ＬＰＳより活性であった。精製ＬＰＳを用いて得るデータと一致して、ＢＰ２３３１変異体の全細胞懸濁液は、野生型細胞と比較して、マクロファージを刺激する能力の明らかな増大を示した（図６Ｂ）。しかし、ＢＰ２３２８変異体細胞もこの影響を示したが（図６Ｂ）、ＢＰ２３２９変異体細胞は、それらの精製ＬＰＳの活性が、より低かったのにもかかわらず、野生型細胞と同様な活性を有した（図６Ａ）。
【０１０４】
考察
この研究の目標は、百日咳菌ゲノム内の新規ＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼを同定することであった。リード配列として、既知なＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼの配列を用いることによって、本発明者らは４つの遺伝子オペロンを同定することができた。家禽病原体であるトリボルデテラ菌（Bordetella avium）のゲノム配列を他のボルデテラ属ゲノム配列と比較した以前の研究では、ここで同定したものに相同な遺伝子クラスターがＬＰＳ生合成に関与するものとして記載された（Sebaihia et al., 2006）。しかし、この帰属を確認できる機能研究は報告されなかった。
【０１０５】
百日咳菌ＬＰＳ生合成におけるこのオペロンの役割を検査するために、本発明者らは、推定上のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を対立遺伝子交換によって不活性化し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＳＩ−ＭＳを用いて、野生型株及び変異体株のＬＰＳプロファイルを比較した。予想外なことに、野生型株が完全長百日咳菌ＬＰＳを含有していたのみでなく、付加的なヘキソサミン部分で置換された完全長種も保持しており、それが、本発明者が示した通り、リピドＡに直接結合していたことを本発明者らは見出した。ヘキソサミンによる百日咳菌リピドＡの置換は、以前には観察されておらず、したがって、百日咳菌リピドＡの新規な修飾を表す。
【０１０６】
ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体株の、提唱されている末端欠失型オリゴ糖構造の概要を図７に示す。ＢＰ２３２８変異体株で最も完全なコアＯＳ構造は、ＧａｌＮＡ・Ｇｌｃ・ＧｌｃＮ２・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨ・ＨｅｘＮからなるものであった。これは、ＢＰ２３２８変異体株が、末端の三糖、１残基のヘプトース残基、及びＧｌｃＮ残基の１つを欠失していることを示す。この組成は、ＢＰ２３２８にコードされているタンパク質機能がＧｌｃＮ（１−４）からＧｌｃへのトランスフェラーゼであることを示唆する（図７）。ＢＰ２３２９変異体ＬＰＳの分析は、このＬＰＳがさらに末端欠失しており、最も完全な構造がＧｌｃＮ・ＧｌｃＡ・Ｈｅｐ２・Ｐ・Ｋｄｏ・リピドＡ−ＯＨ・ＨｅｘＮからなるものであったことを示した。この構造は、コアＯＳの第２のＧｌｃＮがそれに連結されるべきＧｌｃを欠失しているので、存在して残っているＧｌｃＮ残基は、第２のヘプトースに結合していたに違いない。したがって、この組成は、ＢＰ２３２９にコードされているタンパク質機能が、Ｇｌｃを第１のヘプトースサブユニットに連結するグルコシルトランスフェラーゼであると示唆する（図７）。これは、この遺伝子産物が、この遺伝子を同定するために最初に用いられたｒｆａＫ及びｌｇｔＦ／ｉｃｓＢなどのグルコース（β１−４）ヘプトーストランスフェラーゼと高い相同性を有することと整合するであろう。最も複雑な表現型は、ＢＰ２３３１変異体の場合に観察された。このタンパク質は様々なＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼと高い配列類似性を示すが、この変異体株には依然として完全長百日咳菌ＬＰＳが存在していた。
【０１０７】
この観察は、ＢＰ２３３１遺伝子が活性なＬＰＳグリコシルトランスフェラーゼをコードしてないこと、又はコードされている酵素が重複を示していることを示唆する。この最後のオプションと整合して、本発明者らは、ＢＰ２３３１にコードされているタンパク質に６９％の同一性を示すタンパク質をコードする遺伝子、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＥ４３９２８を有するＢＰ３６７１を百日咳菌ゲノム内に同定した。野生型及びＢＰ２３３１変異体株のＬＰＳプロファイルは、多かれ少なかれ匹敵するものであったが、ひとつの衝撃的な観察は、この変異体ＬＰＳが、より高い異型遺伝子性を有していたことであった。この現象の正確な理由は、依然として解明されないままであるが、考えられるひとつの解釈は、ＢＰ２３３１変異体が、おそらくヘキソサミンによる、そのＬＰＳの非化学量論的な置換の増大を示しているというものでありうるであろう。アミノ糖によるリピドＡの修飾が、様々な細菌で記載されており、例えば、大腸菌及びサルモネラ（Salmonella）における４−アミノアラビノースによる置換（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001b) An inner membrane enzyme in Salmonella and Escherichia coli that transfers 4-amino-4-deoxy-L-arabinose to lipid A: induction on polymyxin-resistant mutants and role of a novel lipid-linked donor. J. Biol. Chem. 276: 43122-43131）、野兎病菌（Francisella tularensis）におけるガラクトサミンによる置換（Phillips, N. J., Schilling, B., McLendon, M. K., Apicella, M. A., and Gibson, B. W. (2004) Novel modification of lipid A of Francisella tularensis. Infect. Immun. 72: 5340-5348）が記載されている。アミノアラビノース経路は、大腸菌で詳細に研究されており、それがリピドＡに転移される前に、別々のウンデカプレニルリン酸輸送体上における糖部分の集合に関与していることが示されている（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Doerrler, W. T., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001a) Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. J. Biol. Chem. 276: 43132-43144）。ＢＰ２３３１へのカナマイシン耐性カセットの挿入は、下流のＢＰ２３３０遺伝子の発現を増強していると考えられるので、ＢＰ２３３０発現の増大は、リピドＡのヘキソサミン修飾の増大と、その結果として、ＢＰ２３３１変異株細胞におけるＬＰＳの異質性の増大とをもたらしていてもよいと推測できるであろう。この解釈は、ＢＰ２３３１変異体のヘキソサミン修飾レベルの増大によって支持される。表３を参照されたい。
【０１０８】
ＬＰＳの構造について取り組んだ後に、精製ＬＰＳ及び全細菌細胞がＤＣの成熟を誘導する能力及びヒトマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を刺激する能力を有するかどうか、それらを試験した。結果は、野生型株と比較して、ＢＰ２３３１変異体株が、ＤＣの成熟及び炎症誘発性サイトカイン産生を誘導する能力の増大を示したことを示した。精製ＬＰＳを用いた場合も同様な結果を得た。対照的に、ＢＰ２３２８及びＢＰ２３２９変異体株からの全細菌細胞及び精製ＬＰＳは、それぞれ、ＤＣを成熟させ、且つマクロファージを刺激する同程度及び低減した能力を示した。これらの結果は、ＬＰＳコアＯＳ組成の改変は百日咳菌ＬＰＳの生物的特性に示差的に影響を与えることを示す。ワクチン開発の観点からは、これによって、より効率的に免疫応答をプライミングする株の開発が可能になりうるので、これは興味深い知見である。さらに、ＢＰ２３３１変異体株など、ＬＰＳの異質性の増大を示す変異体は、より大きな多様性を有する抗ＬＰＳ抗体を誘発しうる。これは、それ自体で、ワクチン有効性に肯定的な影響を与えうる。一方におけるＤＣ及びマクロファージの活性化レベルと、もう一方におけるリピドＡのヘキソサミン修飾の程度との間で見出される良好な相関関係（表３を参照）は、ＢＰ２３３１変異体における修飾の増大がこの点で重要であることを強く示唆する。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
（参考文献）
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Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int. J. Cancer 41: 456-461
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する多糖デアセチラーゼポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１を有する、請求項２に記載の多糖デアセチラーゼ。
【請求項４】
配列番号２を有する、請求項１に記載のグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
ポリペプチドがボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から取得される、請求項２又は３に記載の多糖デアセチラーゼ。
【請求項６】
ポリペプチドがボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から取得される、請求項１又は４に記載のグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１及び／又は４及び／又は６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項２及び／又は３及び／又は５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸コンストラクトを含む不活性化ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の発現ベクター及び／又は請求項１２に記載の不活性化ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
百日咳菌株である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の宿主細胞から取得可能なＬＰＳ。
【請求項１６】
請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞及び／又は請求項１５に記載のＬＰＳを含む医薬組成物。
【請求項１７】
抗原をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
薬として使用するための、請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞又は請求項１５に記載のＬＰＳ。
【請求項１９】
百日咳に対するワクチンとして使用するための、請求項１８に記載の宿主細胞及び／又はＬＰＳ。
【請求項２０】
アジュバントとして使用するための、請求項１８に記載の宿主細胞及び／又はＬＰＳ。
【請求項２１】
抗原と組み合わせて使用される、請求項２０に記載の宿主細胞及び／又はＬＰＳ。
【請求項２２】
百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞及び／又は請求項１５に記載のＬＰＳの使用。
【請求項２３】
アジュバントとしての、請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞及び／又は請求項１５に記載のＬＰＳの使用。
【請求項２４】
抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するための、前記抗原と組み合わせた、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド及び／又は請求項７若しくは８のいずれかに記載の核酸配列の使用。
【請求項２６】
アジュバントを調製するための、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド及び／又は請求項７若しくは８のいずれかに記載の核酸配列の使用。
【請求項２７】
抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するための、前記抗原と組み合わせた、請求項２６に記載の使用。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する多糖デアセチラーゼポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１を有する、請求項２に記載の多糖デアセチラーゼ。
【請求項４】
配列番号２を有する、請求項１に記載のグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
ポリペプチドがボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から取得される、請求項２又は３に記載の多糖デアセチラーゼ。
【請求項６】
ポリペプチドがボルデテラ属種、好ましくは百日咳菌から取得される、請求項１又は４に記載のグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１及び／又は４及び／又は６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項２及び／又は３及び／又は５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸コンストラクトを含む不活性化ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の発現ベクター及び／又は請求項１２に記載の不活性化ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
百日咳菌株である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の宿主細胞から取得可能なＬＰＳ。
【請求項１６】
請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞及び／又は請求項１５に記載のＬＰＳを含む医薬組成物。
【請求項１７】
抗原をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
薬として使用するための、請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞又は請求項１５に記載のＬＰＳ。
【請求項１９】
百日咳に対するワクチンとして使用するための、請求項１８に記載の宿主細胞及び／又はＬＰＳ。
【請求項２０】
アジュバントとして使用するための、請求項１８に記載の宿主細胞及び／又はＬＰＳ。
【請求項２１】
抗原と組み合わせて使用される、請求項２０に記載の宿主細胞及び／又はＬＰＳ。
【請求項２２】
百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞及び／又は請求項１５に記載のＬＰＳの使用。
【請求項２３】
アジュバントとしての、請求項１３若しくは１４に記載の宿主細胞及び／又は請求項１５に記載のＬＰＳの使用。
【請求項２４】
抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するための、前記抗原と組み合わせた、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
百日咳を予防及び／又は治療する薬物を調製するための、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド及び／又は請求項７若しくは８のいずれかに記載の核酸配列の使用。
【請求項２６】
アジュバントを調製するための、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド及び／又は請求項７若しくは８のいずれかに記載の核酸配列の使用。
【請求項２７】
抗原に対する免疫応答を引き起こす薬物を調製するための、前記抗原と組み合わせた、請求項２６に記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２２５５７（Ｐ２０１０−５２２５５７Ａ）
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５００８６０（Ｐ２０１０−５００８６０）
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０１６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１８０１５
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０６２１９５９１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０１６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１８０１５
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０６２１９５９１）
【Ｆターム（参考）】
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