Ｍ期キナーゼ基質タンパク質及びその利用
【課題】 Ｍ期キナーゼによってリン酸化される新規基質タンパク質を提供する。また、当該基質の利用形態を提供する。
【解決手段】 a)配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びb)配列番号２のアミノ酸配列と一部において相違するアミノ酸配列を有し、Ｍ期キナーゼの基質となり且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制されるタンパク質、からなる群より選択される、単離されたタンパク質が提供される。
【解決手段】 a)配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びb)配列番号２のアミノ酸配列と一部において相違するアミノ酸配列を有し、Ｍ期キナーゼの基質となり且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制されるタンパク質、からなる群より選択される、単離されたタンパク質が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期の有糸分裂期（Ｍ期）の開始と共にリン酸化され、Ｍ期の終了と共に脱リン酸化されるＭ期キナーゼ基質タンパク質（SAKI：Substrate of an unknown mitotic kinase）及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
AIM-1（Aurora and Ipl1-like midbody-associated protein）は、染色体分配に関する変異体相補遺伝子である酵母Ipl1及びハエAuroraの類似遺伝子として動物細胞から発見された遺伝子である。AIM-1は発癌過程における染色体の異数化原因を解明するためその機能解析が行われてきた（非特許文献１、２）。一方、ヒトにはAIM-1以外に少なくとも２種類の類縁キナーゼ遺伝子（AIM-2及びAIM-3）が存在することが判明している（非特許文献３）。現在、AIM-1はオーロラB（Aurora-B）にクラス分けされており、AIM-2はオーロラA（Aurora-A）に、AIM-3はオーロラC（Aurora-C）にそれぞれ分類されている。
AIM-1は、動物細胞のＭ期進行過程での局在の解析から、Ｍ期パッセンジャータンパク質であることがわかっている。すなわちAIM-1はＭ期前期に染色体動原体部分に集まり、その後、赤道面に染色体が整列した時点で染色体動原体と共に赤道面に整列する。そして姉妹染色体分配後、姉妹染色体と共に両極に随伴するが、姉妹染色体が両極に引っ張られてしまう以前に染色体を降車し、再びＭ期細胞中央部分に集まり、細胞質の収縮のための構造体形成にかかわる（非特許文献４）。一方AIM-1は、Ｍ期進行過程におけるＭ期パッセンジャータンパク質の一つであり、Ｍ期アポトーシスを抑制することで知られるSurvivinや、動原体タンパク質として知られるInner Centromere Protein (INCEP)と複合体を形成して挙動を共にする（非特許文献５）。また、AIM-1は、姉妹染色体分離後、細胞質分離のための収縮開始の重要なシグナルとしても機能しており（非特許文献１〜３、６）、ミオシン、デスミンやビメンチンなどの中間径フィラメント、或いはMgcRacGAPなどをリン酸化することにより、細胞質分離と密接にかかわっている（非特許文献７〜１０）。
一方、AIM-1は、他の２種類のオーロラキナーゼと共に癌細胞において高発現している。これらのキナーゼの高発現は、癌発症進展過程における染色体分配過程の異常生成機構と深い関係があると考えられる（非特許文献２、１１〜１３）。
尚、AIM-1に関する更なる情報については特開平１１−１６４６９４号公報（特許文献１）を参照されたい。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１６４６９４号公報
【非特許文献１】Terada, Y., Tatsuka, M., Suzuki, F., Yasuda, Y., Fujita, S., and Otsu, M.: AIM1: a mammalian midbody-associated protein required for cytokinesis. EMBO J., 17: 667-676, 1998
【非特許文献２】Tatsuka, M., Katayama, H., Ota, T., Tanaka, T., Odashima, S., Suzuki, F., and Terada, Y.: Multinuclearity and increased ploidy caused by overexpression of the aurora- and Ipl1-like midbody-associated protein mitotic kinase in human cancer cells. Cancer Res., 58: 4811-4816, 1998
【非特許文献３】Katayama, H., Ota, T., Morita, K., Terada, Y., Suzuki, F., Katoh, O., and Tatsuka, M.: Human AIM-1: cDNA cloning and reduced expression during endomitosis in megakaryocyte-lineage cells. Gene, 224: 1-7, 1998
【非特許文献４】Murata-Hori, M., Tatsuka, M,, and Wang, Y.L.: Probing the Dynamics and Functions of Aurora B Kinase in Living Cells during Mitosis and Cytokinesis. Mol. Biol. Cell. 13: 1099-1108, 2002.
【非特許文献５】Temme, A., Rieger, M., Reber,F., Lindemann, D., Weigle, B., Diestelktter-Bachert, P., Ehninger, G., Tatsuka, M., Terada, Y., and Rieber, E. P.: Localization, Dynamics and Function of Survivin Revealed by Expression of Functional SurvivinDsRed Fusion Proteins in the Living Cell. Mol. Biol. Cell 14: 78-79, 2003.
【非特許文献６】Kawasaki, A., Matsumura I., Miyagawa, J., Tanaka, H., Terada, Y., Tatsuka, M., Machii, T., Furukawa, Y., and Kanakura Y.: Down-regulation of an AIM-1 kinase couples with megakaryocytic endomitosis of human hematopoietic cells. J. Cell Biol. 152: 257-287, 2001
【非特許文献７】Murata-Hori, M., Tatsuka, M,, and Wang, Y.L.: Probing the Dynamics and Functions of Aurora B Kinase in Living Cells during Mitosis and Cytokinesis. Mol. Biol. Cell. 13: 1099-1108, 2002.
【非特許文献８】Goto, H., Yasui, Y., Kawajiri, A., Nigg, E.A., Terada, Y., Tatsuka, M., Nagata, K., and Inagaki, M..: Aurora-B regulates the cleavage furrow-specific vimentin phosphorylation in the cytokinetic process. J. Biol. Chem. 278: 8526-8530, 2003.
【非特許文献９】Kawajiri, A., Yasui, Y., Goto, H., Tatsuka, M., Takahashi, M., Nagata, K., and Inagaki, M.: Functional Significance of the Specific Sites Phosphorylated in Desmin at Cleavage Furrow: Aurora-B May Phosphorylate and Regulate Type III Intermediate Filaments during Cytokinesis Coordinatedly with Rho-kinase. Mol. Biol. Cell 14: 1489-1500, 2003.
【非特許文献１０】Minoshima, Y., Kawashima, T., Hirose, K., Tonozuka, Y., Kawajiri, A., Bao, Y.C., Deng, X., Tatsuka, M., Narumiya, S., May, W.S., Nosaka, T., Semba, K., Inoue, T., Satoh, T., Inagaki, M., and Kitamura, T.: Phosphorylation by Aurora B Converts MgcRacGAP to a RhoGAP during Cytokinesis. Dev. Cell 4: 549-560, 2003.
【非特許文献１１】Katayama, H., Ota, T., Jisaki, F., Ueda, Y., Tanaka, T., Odashima, S., Suzuki, F., Terada, Y. and Tatsuka, M.: Mitotic kinase expression and colorectal cancer progression. J. Natl. Cancer Inst. 91: 1160-1162, 1999.
【非特許文献１２】Katayama H., Zhou H., Li Q., Tatsuka M., and Sen S.: Interaction and feedback regulation between STK15/BTAK/Aurora-A kinase and protein phosphatase 1 through mitotic cell division cycle. J. Biol. Chem. 276: 46219-46224, 2001.
【非特許文献１３】Ota, T., Suto, S., Katayama, H., Han, Z-B., Suzuki, F., Maeda, M., Tanino, M., Terada, Y., and Tatsuka M.: Increased mitotic phosphorylation of histone H3 due to AIM-1/Aurora-B overexpression contributes to chromosome number instability. Cancer Res. 62: 5168-5177, 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、AIM-1等に代表されるＭ期で活性を持つＭ期キナーゼの基質となるタンパク質を同定することを目的とする。また、当該基質の生体での役割を明らかにし、その利用を図ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の目的を達成すべく本発明者らは鋭意検討した。即ち本発明者らは、AIM-1の基質を同定すること、及び生体におけるその機能ないし役割を明らかにすることを目指して研究を進めた。また、当該基質に関して研究分野及び医療分野でも応用の可能性を模索した。
まず本発明者らは、細胞内におけるH3ヒストンのリン酸化酵素を同定することを試みた。その結果、AIM-1がＭ期リン酸化酵素であることが判明した。一方でH3ヒストン以外にAIM-1によってリン酸化を受ける基質タンパク質の存在が確認された。本発明者らはこの基質タンパク質に注目し、その同定を試みた。その結果、当該タンパク質をコードするcDNA（配列番号１）のクローニングに成功した。そして、得られたcDNAのORF（open reading frame）には推定767残基のアミノ酸（配列番号２）からなるタンパク質がコードされていることが判明した。このタンパク質をSAKI（Substrate of an unknown mitotic kinase）と命名した。
さらに検討を進めた結果、キナーゼによるSAKIのリン酸化部位が明らかになるとともに、SAKIの発現分布及び細胞内局在に関する有益な知見が得られた。一方、SAKIの過剰発現によってｒRNAへのメチル基の取り込みが増加する現象が観察され、SAKIが細胞内でrRNAをメチル化させる活性を有することが予測された。即ち、SAKIがrRNAの成熟過程に関わるメチル化酵素であると考えられた。また、SAKIが試験管内核酸メチル化アッセイによって、DNAを基質にはしないことから、SAKIがDNAメチル化酵素活性を持たず、RNAメチル化酵素であるという可能性を示唆する。さらに、キナーゼによるリン酸化を受けてSAKIは不活性型（リン酸化SAKI）となり、メチル化作用が抑制されるが判明した。ただ、AIM-1等を強制発現させた実験の実験結果は、AIM-1がSAKIリン酸化酵素ではないことを強く示唆している。
続いてSAKIの医療面での応用に関して検討を重ねた結果、各種大腸癌細胞株及び口腔扁平上皮癌細胞株の全例においてSAKIの高発現が観察された。また、SAKIの高発現が認められるHeLa細胞においてSAKI遺伝子の増幅が観察された。臨床解剖組織においてもSAKI遺伝子の増幅が認められた。一方、抗SAKI抗体を用いた免疫染色をヒト癌組織に対して実施したところ、従来からある抗体よりも明瞭な染色性が観察された。そこで、さらに種々の癌組織においてもSAKIの発現状態を検索した結果、検索対象全ての症例においてSAKIの高発現が観察された。これらの結果からSAKIがヒト癌診断における指標として有用であると判断された。加えて、SAKI抗体を利用した免疫ブロット法の結果から、癌細胞がサンプル中に100〜1000個に1個存在する状態でも検出できることが判明した。すなわち、SAKIの検出は癌細胞の同定に極めて有用であり、SAKIの過剰発現による活性亢進は癌形質の発現と密接に関連していることがわかった。そして、これらの知見を総合的に考慮した結果、SAKI過剰発現を抑制することや、また、活性化型である脱リン酸化SAKIをリン酸化状態に維持することによって、SAKIの活性は制御可能であり、そういったSAKI活性の抑制や阻害は、細胞の癌化及びその進行の抑止に有効であると考えられた。
【０００６】
本発明は以上の成果に基づくものであって、以下の各構成を提供する。
本発明の一局面は、以下のa及びbからなる群より選択される、単離されたタンパク質に関する：a)配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びb)配列番号２のアミノ酸配列と一部において相違するアミノ酸配列を有し、Ｍ期キナーゼの基質となり且つ核酸メチル化活性を有するタンパク質。
本発明の他の局面は以下のA及びBからなる群より選択される、単離された核酸に関する：A）上記a又はbのタンパク質をコードする核酸、及びB）A）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
また、本発明の一態様は上記本発明の核酸を保持するベクターに関する。好ましくは発現ベクターの形態に構成される。
また、本発明の一態様は上記本発明の核酸が外来的に導入されている細胞に関する。典型的には、上記ベクターをその宿主細胞に導入することによって当該細胞が構築される。
本発明のさらに他の態様は、以下のa及びbのステップを含む、Ｍ期キナーゼの基質として機能するタンパク質の生産方法に関する：a)上記本発明の細胞を、前記核酸がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ、及びb)産生されたタンパク質を回収するステップ。
本発明はまた、本発明のタンパク質（配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同タンパク質）に特異的に結合する抗体を提供する。
本発明の更に他の局面は、被験細胞の悪性度を判定する方法（悪性度判定法）に関する。本発明の悪性度判定法は、生体から分離された被験細胞内における、本発明のタンパク質の量を検出するステップを含む。ここでのタンパク質量の検出は好適には免疫学的染色法を利用して実施される。本発明はまた、前記ステップに代えて、生体から分離された被験細胞内における本発明の核酸の量を検出するステップを実施することで被験細胞の悪性度を判定する方法も提供する。
本発明はまた、上記方法の実施に使用可能な試薬を提供する。当該試薬は、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、又は本発明の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む。更に本発明は、当該試薬を含むキット（被験細胞の悪性度判定用キット）を提供する。当該キットは使用説明書を含む。
本発明の更に他の態様は、上記本発明のタンパク質の発現量の異常、又は本発明の核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患に対して有効な化合物をスクリーニングする方法に関し、本発明のタンパク質とＭ期キナーゼとの結合を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップを含んで構成される。他の態様では、上記ステップに代えて、本発明のタンパク質の核酸メチル化活性を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップを含んでスクリーニング方法が構築される。
【０００７】
後述の実施例に詳説されるように、本発明者らが新たに同定したＭ期キナーゼ基質タンパク質（以下、SAKI（Substrate of an unknown mitotic kinase）とも呼ぶ）は、Ｍ期にリン酸化され、通常は間期において脱リン酸化状態において核酸メチル化活性を発揮する。この核酸メチル化活性によってrRNAの成熟に関与する。また、リン酸化SAKIはＭ期特異的にリン酸化されて、そのメチル化活性を失う。これらの事実からSAKI又はそれをコードする核酸等はrRNAの成熟活性化やメチル化に関連した疾患ないし病態の治療薬又は診断薬の探索や、治療方法又は診断方法の開発に有用である。また、様々な癌細胞においてSAKIをコードする核酸の量が増大していること及びSAKIが高発現していることが認められたことから、SAKI又はそれをコードする核酸等は、細胞の悪性度を測るための検出対象（指標ないしマーカー）として有用である。
尚、本明細書において用語「〜を含む」又「〜含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。
以下、本発明の具体的構成を詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第一の局面は、Ｍ期キナーゼによってリン酸化され、且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制される新たに同定されたタンパク質に関する。即ち、単離されたＭ期キナーゼ基質タンパク質（SAKI）、及びその生物学的活性部分（以下、これらをまとめて「SAKI等」又は「本発明のタンパク質等」ともいう）に関する。
本発明のタンパク質等はそれが天然に由来する場合には細胞や組織或いは体液など、それが存在する天然材料から標準的な手法を用いて分離・調製することができる。また、本発明のタンパク質等を組換えDNA技術を用いて生産してもよい。さらには本発明のタンパク質等を化学合成によって生産してもよい。数多くのペプチド合成装置が市販されており、それらの中から適当なものを選択して用い、本発明のタンパク質等を得てもよい。
【０００９】
本発明のタンパク質等に関して使用する用語「単離された」とは、本発明のタンパク質等が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該タンパク質等以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたタンパク質等では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
一方、本発明のタンパク質等が組換えDNA技術によって生産されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたタンパク質等では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
また、本発明のタンパク質等が化学合成によって生産されたものである場合の用語「単離された」とは、前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたタンパク質等では前駆体の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
尚、本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。
【００１０】
本明細書において「生物学的活性部分」とは、本発明のSAKIにおいて核酸メチル化活性に関与する部分をいう。従って、その部分が改変（アミノ酸の欠失、置換、挿入、付加など）されると核酸メチル化活性が発揮されなくなるか又は低下する部分をいう。後述の実施例に示されるようにSAKIのメチル化活性は特定のアミノ酸（139番セリン）がリン酸化されることによって発揮されることが認められた。即ち、SAKIのメチル化活性には当該アミノ酸部分が重要であることが判明した。従って、当該生物学活性部分の具体例として、当該アミノ酸部分を含む連続した一部を挙げることができる。
生物学的活性部分は、本発明のタンパク質の部分分解や組換えDNA技術によって調製することができる。
【００１１】
本発明のタンパク質等の一態様は配列番号２のアミノ酸配列を有する。一方、本発明の他の態様は、このタンパク質と比較した場合にその機能は同等であるものの一部においてアミノ酸配列が相違するタンパク質（以下、「相同タンパク質」ともいう）を提供する。「一部においてアミノ酸配列が相違する」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違は、Ｍ期キナーゼの基質であること、及び核酸メチル化活性が保持される限り許容される。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち相同タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。
好ましくは、保存的アミノ酸置換を非必須アミノ酸残基（Ｍ期キナーゼの基質タンパク質であること、及び核酸のメチル化活性を有することに関与しないアミノ酸残基）に生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１２】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本発明のポリペプチド分子に相同的なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
【００１３】
本発明は他の態様として、上記本発明のタンパク質等が他の分子と結合して形成される融合タンパク質を提供する。ここでの他の分子は例えばポリペプチド（シグナルペプチドを含む）又は標識物質（例えばGST）である。このような他の分子を結合させることによって本発明のポリペプチド等の機能の増強や補助、他の機能の付与、組換え生産する場合の発現・分泌の促進（シグナルペプチドの場合）、精製の容易化等を行える。
上記融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって調製することができる。例えば、まず本発明のタンパク質等をコードするDNA断片と他の分子をコードするDNA断片とをそれぞれ調製した後、これらをインフレームで連結する。このようにして得られた融合タンパク質をコードするDNAを適当な細胞内で発現させ、その後、標準的な生化学的手法などを用いて分離・精製する。
【００１４】
SAKI等又はその一部は、SAKI等に対する抗体（以下、「抗SAKI抗体」ともいう）を得るための免疫原として使用することができる。即ち、本発明は抗SAKI抗体を惹起可能なタンパク質ないしペプチド（免疫原）を提供する。
【００１５】
本発明は他の局面としてSAKI又はその相同タンパク質（SAKI等）に特異的に結合する抗体（抗SAKI抗体）に関する。ここでの用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれらの断片（但し、SAKI等に対する特異的結合能を有するもの）等を含む。本発明の抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
【００１６】
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（SAKI等）を調製し、これを用いてマウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物に免疫を施す。抗原としてはSAKI又はその相同タンパク質、或いはその一部を使用することができる。低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としてはKLM（Keyhole Light Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。また、キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製する。このようにしてポリクローナル抗体を得ることができる。一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。尚、抗体の作製方法に関してKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497;Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75; Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72; Kenneth, R.H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E.A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387402; Gefter, M.L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:23136等を参照することができる。
【００１７】
ファージディスプレイ法に関しては種々の文献、例えばHuse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; PCT国際公開第 WO 90/02809号; PCT国際公開第 WO 92/20791号; PCT国際公開第 WO 92/15679号; PCT国際公開第 WO 92/09690号等を参照することができる。また、ファージディスプレイライブラリの作製及びスクリーニング用のキットが市販されており、それらを好適に利用することができる。
【００１８】
本発明の一態様では、Ｍ期キナーゼによるリン酸化を受けた後のSAKI（即ち、139番目セリン残基がリン酸化された状態のSAKI）に対して特異的結合性を有する抗体が提供される。当該抗体を用いれば、リン酸化状態のSAKIを選択的に検出し、Ｍ期キナーゼの活性化の程度（換言すれば活性化Ｍ期キナーゼの量）やSAKIの活性の抑制化の程度（換言すれば活性化SAKIの量）などを把握することができる。これによって得られる情報はＭ期キナーゼないしSAKIが関与する事象の把握、予測等に有用である。例えば、後述の実施例に示されるように癌の診断に有用である。尚、リン酸化SAKIに対して特異的結合性を有する抗体は例えば、リン酸化された139番目セリン残基を含む、SAKIの部分ペプチドを抗原として上記手順で免疫操作を行うことによって得ることができる。
【００１９】
本発明のタンパク質等への特異的結合能を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。このような改変抗体も本発明に含まれる。ここでの改変抗体にはキメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。
【００２０】
本発明の抗SAKI抗体は例えばSAKI等（SAKI又はその相同体）の検出、SAKI等の分離・精製などに用いられる。標識化した抗体を用いることにより、上記の検出等を容易に実施することが可能である。抗体の標識化には例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、125I等の放射性同位体、及びビオチン等を用いることができる。
【００２１】
本発明の抗SAKI抗体はまた、SAKI等が関与する疾患に対する薬剤としても利用され得る。例えば、Ｍ期キナーゼによるリン酸化を受ける部位を認識し、これに特異的に結合する抗SAKI抗体であれば、当該部位を変化させることによって、アスパラギン酸（D）やグルタミン酸（E）にアミノ酸置換したのと同様の恒常的なリン酸化型のSAKI状態を作り、これによって治療効果を奏することが可能と考えられる。また、脱リン酸化SAKIに対して特異的結合能を有する抗SAKI抗体であれば、活性化型SAKIをトラップすることによって脱リン酸化SAKIが核酸メチル化作用を発揮することを阻害し、これによって治療効果を奏することが可能と考えられる。特に、メチル化に関与する部位に対して結合能を有する抗SAKI抗体であれば脱リン酸化SAKIのメチル化作用を直接的に阻害することができ、高い治療効果が期待できる。尚、本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す言葉と交換可能に用いられる。
【００２２】
本発明の他の局面はSAKIに関連する単離された核酸に関する。当該局面では例えば、SAKI等（SAKI又はその相同体）をコードする単離された核酸、SAKI等をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、SAKI等をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
本明細書における用語「核酸」は、DNA（cDNA及びゲノムDNAを含む）、RNA（mRNAを含む）、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合にはその発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。
【００２３】
本明細書において例えば「SAKIをコードする核酸」とは、それを発現させた場合にSAKIが得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸（例えば１又は複数個のイントロンを含むDNA）をも含む。
【００２４】
本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸（例えばヒト生体内の核酸）の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分（天然状態において隣接するDＮＡ配列を含む）を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組換技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dDNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には単離された状態の核酸を意味する。
【００２５】
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。
例えば、配列番号１の塩基配列を有する本発明の核酸は当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。尚、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。
【００２６】
本発明の核酸は好ましい態様として配列番号１又は３の塩基配列を有する。配列番号１の塩基配列を有する核酸はHeLa細胞完全長cDNAライブラリーからSAKIをコードするものとしてクローニングされた全長cDNAである。一方、配列番号３の塩基配列を有する核酸はこの全長cDNAに対応するゲノムDNA（Entrez Genome、NCBI提供、http://www.ncbi.nlm.nih.gov、Accession No. NC_000005、Homo sapiens chromosome 5, complete sequence.）である。
本発明の他の態様は、配列番号１の塩基配列からその5'非翻訳領域又はその一部、及び3'非翻訳領域又はその一部のいずれか一つ以上を欠失したDNA分子（例えばコード領域（配列番号４）のみからなるDNA）を提供する。尚、コード領域の翻訳に悪影響を与えないことを条件として、本来の非翻訳領域とは異なる非翻訳領域をコード領域に組み合わせたDNAも本発明に含まれる。
【００２７】
本発明の他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう）を提供する。相同核酸の例として、配列番号１、３、又は４の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、Ｍ期キナーゼの基質となり、且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制されるタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような相同核酸は例えば部位特異的変異法を用いて特定の部位において塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように配列番号１、３、又は４の配列を有する核酸を遺伝子工学的に改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
相同核酸の他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められる核酸を挙げることができる。
【００２８】
本発明の他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
【００２９】
本発明の更に別の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアルデヒド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアルデヒド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００３０】
本発明の更に他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、配列番号１、３、又は４の塩基配列を有する核酸など、本発明の核酸を検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、配列番号１、３、又は４の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。
プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
【００３１】
本発明のさらに他の局面は本発明の核酸（即ちSAKI又はその一部或いはそれらの相同体をコードする核酸）を含有するベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）を含む。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。例えば大腸菌を宿主とするベクター（M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（pCDM8、pMT2PCなど)を用いることができる。
【００３２】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００３３】
宿主細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット等の哺乳類細胞（COS細胞、CHO細胞など）、大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。
【００３４】
本発明の他の局面は、本発明の核酸が導入された宿主細胞（即ち形質転換体）に関する。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得られる。トランスフェクション等はリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann,M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))等によって実施することができる。
【００３５】
本発明の形質転換体は、SAKI等を生産することに利用することができる。即ち、本発明の他の局面は、上記形質転換体を用いたSAKI等の生産方法を提供する。本発明の生産方法は、SAKI等が産生される条件下で上記形質転換体を培養するステップを少なくとも含む。通常はこのステップに加えて、産生されたタンパク質を回収（分離及び精製）するステップが実施される。
本発明のSAKI等を生産する目的ではなく、例えば特定の細胞内においてSAKI等を発現させた場合の挙動を調べる目的や、特定の細胞内でSAKI等を発現させることによって当該細胞の状態を変化させる目的（例えば治療目的）で形質転換体を得ることもできる。また、トランスジェニック動物（ヒトを含まない）を作製する目的で形質転換体を得ることもできる。即ち、本発明の形質転換体を非ヒトトランスジェニック動物の作製に利用することも可能である。例えば、形質転換体として本発明のSAKI等をコードする核酸を導入した受精卵母細胞又は胚性幹細胞を作製し、これからトランスジェニック動物を発生させることができる。本発明の非トランスジェニック動物はSAKIの生体内での機能の研究に有用である。トランスジェニック動物は、受精卵の前核に直接DNAの注入を行うマイクロインジェクション法、レトロウイルスベクターを利用する方法、ES細胞を利用する方法などを用いて作製することができる。以下、トランスジェニック動物の作製方法の一例としてマイクロインジェクション法を利用した方法を説明する。
マイクロインジェクション法ではまず、交尾が確認された雌マウスの卵管より受精卵を採取し、そして培養した後にその前核にDNAコンストラクト（本発明のタンパク質等をコードしたDNA）の注入を行う。使用するDNAコンストラクトには導入遺伝子の効率的な発現を可能とするプロモーター配列が含まれていることが好ましい。このようなプロモーターとしては例えばチキンβ−アクチンプロモータ、プリオンタンパク質プロモーター、ヒトARプロモーター、ニューロフィラメントL鎖プロモーター、L7プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターなどを用いることができる。注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、移植後のマウスを所定期間飼育して仔マウス（F0）を得る。仔マウスの染色体に導入遺伝子が適切に組込まれていることを確認するため、仔マウスの尾などからDNAを抽出し、導入遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCR法や導入遺伝子に特異的なプローブを用いたドットハイブリダイゼーション法等を行う。
本明細書における「トランスジェニック動物」の種は特に限定されないが、好ましくは哺乳類であって、より好ましくはマウス、ラットなどの齧歯類である。
【００３６】
本発明の更に他の局面は、SAKI又はそれに関連する核酸等の用途又は利用に関する。当該局面ではまず、細胞の悪性度を判定する方法（悪性度判定法）が提供される。本発明の悪性度判定法の一態様では、生体から分離された被験細胞内におけるSAKI又はその相同体（SAKI等）の量を検出するステップが実施される。本発明の他の態様では、生体から分離された被験細胞内における、SAKI等をコードする核酸の量を検出するステップが実施される。
ここで本明細書において「細胞の悪性度」とは、細胞の癌化の程度をいう。即ち、悪性度が高い細胞を癌細胞と呼ぶことができ、これとは逆に悪性度が極めて低い細胞を正常細胞と呼ぶことができる。また、「被験細胞」とは、本発明の方法において悪性度を判定する対象の細胞である。被験細胞は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の被験細胞に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被験細胞が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被験細胞がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。被験細胞は通常、生体で存在していた状態、即ち周囲の細胞と結合した状態で調製され、本発明の方法に使用される。尚、被験細胞を周囲の細胞から分離（単離）した後に本発明の方法に使用してもよい。
被験細胞は例えば被疑癌組織から採取することができる。具体的には、被疑癌組織の一部をバイオプシーで採取し、被験細胞を含む試料としてそれを本発明の方法に供することができる。
【００３７】
本明細書において「癌」は広義に解釈することとし、癌腫及び肉腫を含む。また、本発明において、用語「癌」は「腫瘍」と交換可能に使用される。
一方、「SAKI等の量を検出する」とは、SAKI等の存在量を絶対量として又は相対量として把握することをいう。ここでの相対量の基準は例えば、癌化の程度に応じて用意した標準試料のSAKI等の量とすることができる。尚、「SAKI等の量を検出する」は、SAKI等が存在するか否かを調べることも含む。通常は、SAKI等の存否と、存在する場合にはその量が調べられることになる。厳密にSAKI等を定量することは必須でない。例えば、悪性度の指標となる対照のSAKI等の量と比較することによって被験細胞の悪性度を判定することが可能な程度にSAKI等の量を測定できればよい。尚、用語「SAKI等をコードする核酸の量を検出する」についても、上記と同様に解釈するものとする。
【００３８】
本発明の悪性度判定法では、上記のステップによって得られたSAKI等の検出量、又はSAKI等をコードする核酸の検出量に基づいて被験細胞の悪性度を判定する。具体的には例えば、検出量が多い場合に被験細胞の悪性度が高い（具体的には例えば癌細胞である）と判定できる。検出量に対応させて悪性度を予め区分しておき、前記ステップによって得られた検出量がどの区分に入るかを調べてもよい。このようにすれば、被験細胞の悪性度を統一的なランクによって表すことが可能となる。
【００３９】
本発明の悪性度判定法が対象とする癌の種類は特に限定されない。例えば大腸癌、口腔癌、肺癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、尿管癌、前立腺癌、子宮頚部癌、皮膚癌、乳腺癌の判定に本発明を適用することができる。
【００４０】
上記ステップにおける「SAKI等の量の検出」は、これに限定されるものではないが、好ましくは免疫学的染色法を利用して行う。免疫学的染色法によれば迅速に且つ感度よくSAKI等の量を検出できる。また、操作も簡便である。従って、SAKI等の量の検出に伴う被検者（患者）への負担も小さくなる。
免疫学的染色法では抗SAKI抗体が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標としてSAKI等の量が検出される。具体的には、被験細胞に抗SAKI抗体を接触させるステップを実施した後、抗SAKI抗体の結合量を測定する。そして測定結果から被験細胞内のSAKI等の検出量を算出する。具体的には、以下に示す免疫学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。
【００４１】
生体組織の免疫学的染色は一般に以下の手順(1)〜(9)で実施される。尚、生体組織の免疫学的染色法については様々な文献及び成書を参照することができる（例えば、Sternberger LA, Hardy PH, Cuculis JJ, et al.: The unlabeled antibody enzyme method of immunochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase anti horseradish peroxidase) and its use in identification of spirochates. J Histochem Cytochem 18: 315-333, 1970; Nakane PK and Kawaoi A: Peroxidasde-labeled antibodies. A new method of conjugation. J Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974.; Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S: The use of avidin-biotin inreraction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 27: 1131-1139, 1979.; 堤 寛：免疫組織化学−生検診断．臨床検査31（増刊）:1330-1342, 1987.; 渡辺慶一，中根一穂編：酵素抗体法，学際企画，1992.）。
(1)固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば3〜5μm厚）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理（抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために加熱処理及び／又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液（例えば1%溶液）で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液にDAB（3,3'-diaminobenzidine）を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間（例えば5分間）切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする（通常、数分間）。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
【００４２】
免疫学的染色法に使用する抗SAKI抗体は、SAKI等に対する特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。抗SAKI抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗SAKI抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。
【００４３】
抗SAKI抗体として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を直接検出することが可能である。従って、より簡易な方法となる。その反面、標識物質を結合させた抗SAKI抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは抗SAKI抗体に特異的結合性を有する抗体であって、例えばウサギ抗体として抗SAKI抗体を調製した場合には抗ウサギ抗体が使用される。ウサギやヤギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ・バイオ株式会社など）、本発明で使用する抗SAKI抗体に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。
【００４４】
一方、SAKI等をコードする核酸の量を指標として被験細胞の悪性度を判定する場合には、SAKI等をコードする核酸に対してハイブリダイズする核酸（即ち、配列番号１、３、又は４の塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（上記参照）が利用される。
本発明の悪性度判定法に使用するプローブ、プライマーには、検出方法に応じて適宜DNA断片又はRNA断片が用いられる。プローブ、プライマーの塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、選択性や検出感度及び再現性を考慮すればプライマーの塩基長としては例えば10bp以上、好ましくは15bp以上、具体的には10〜30bp程度、好ましくは15〜25bp程度である。尚、プライマーの場合には増幅対象に特異的にハイブリダイズし、目的の核酸フラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列と多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては例えば１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。プローブの場合も同様に、検出に影響のない範囲で検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。
【００４５】
尚、特定の核酸の量を測定する方法は当該分野で公知であって、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション法、RT-PCT法等を用いることができる。
【００４６】
本発明は他の態様として、上記方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットを用いることによって上記方法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。本発明のキットは、それが対象とする方法に応じた必要な試薬を含む。具体的には、SAKI等を検出対象とする方法（即ちタンパク質を検出する方法）の場合にはSAKI等に特異的結合性を有する試薬が使用される。当該試薬の好適な例は抗SAKI抗体であるがこれに限られるものではない。抗SAKI抗体の結合量を直接検出する方法用のキットの場合には標識された抗SAKI抗体が用いられる。一方、間接的検出方法用のキットの場合には未標識の抗SAKI抗体が用いられる。この場合には標識物質で標識化された二次抗体（標識二次抗体）をキットに含めてもよい。二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用した検出法用のキットとする場合には当該ポリマーをキットに含めてもよい。また、本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要な一以上の試薬（例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など）や器具などを更に含めてもよい。
他方、SAKI等をコードする核酸を検出対象とする方法（即ち核酸を検出する方法）の場合には当該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（プローブ及び／又はプライマー）が用いられる。この場合にはハイブリダイゼーションの実施に必要な一以上の試薬（例えば緩衝液、pH調製用試薬など）や器具などを更に含めてもよい。
尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【００４７】
本発明は更に、SAKIに関連する疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供する。本明細書において「SAKIに関連する疾患」とは、SAKI（又はその相同体）の異常な発現に起因する疾患、より具体的には配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質（又はその相同体）の発現量の異常、又は配列番号１若しくは３の塩基配列を有する核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患をいう。ここでの「異常」とは、正常な状態の範囲を超えて増加又は減少した状態をいう。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法の一態様では、被験化合物が、SAKI等とそのリン酸化酵素であるＭ期キナーゼとの結合を阻害する能力を有するか否か（阻害能の有無）及び／又は阻害能の程度を調べるステップを実施する。このステップの結果、被験化合物に阻害能の存在が認められれば、当該化合物を有効な薬剤候補として選択することができる。特に、高い阻害能が認められれば当該化合物は有力な薬剤候補と考えられる。
例えば、上記ステップを以下の手順で実施することができる。まず、被験化合物の存在下、SAKI等とそのリン酸化酵素であるＭ期キナーゼとを接触させる（ステップ１）。その後、SAKI等とＭ期キナーゼの結合量を、被験化合物の非存在下で上記と同様にSAKI等とＭ期キナーゼとを接触させた場合の結合量と比較する（ステップ２）。その結果、後者の結合量の方が多いようであれば、SAKI等とＭ期キナーゼとの結合を阻害する能力を被験化合物が有すると判定することができる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様では、被験化合物が、SAKI等の核酸メチル化活性、リン酸化SAKIの核酸メチル化活性の抑制を阻害する能力を有するか否か（阻害能の有無）及び／又は阻害能の程度を調べるステップを実施する。例えば、このステップを以下の手順で実施することができる。まず、被験化合物及びメチル基供給源の存在下、リン酸化SAKIと基質核酸とを接触させる（ステップ１）。その後、基質核酸のメチル化の程度を、被験化合物の非存在下で上記と同様にリン酸化SAKIと基質核酸とを接触させた場合のメチル化の程度と比較する（ステップ２）。その結果、後者のメチル化の程度の方が高いようであれば、SAKI等の核酸メチル化活性を阻害する能力を被験化合物が有すると判定することができる。
ここでのステップ１は例えば以下の手順で実施される。まず、リン酸化SAKIを生成させる（リン酸化反応：ステップ１−１）。次に、被験化合物、メチル基供給源、リン酸化SAKI、及び基質核酸を混合し反応させる（メチル化反応：ステップ１−２）。この態様ではSAKIのリン酸化とリン酸化SAKIによるメチル化反応とを互いに独立した工程として実施する。尚、メチル化反応は例えば以下の条件で行うことができる。
温度：約37℃、pH：約7.8、反応時間：約30分
【００５０】
一方、以下の手順でステップ１を実施してもよい。即ち、被験化合物、メチル基供給源、SAKI、キナーゼ、及び基質核酸を混合し反応させる（リン酸化反応及びメチル化反応）。この態様ではリン酸化SAKIの生成とリン酸化SAKIによるメチル化反応とを一つの工程として実施する。これによって操作が容易化されるとともに反応時間も短縮化される。また、生体内の環境により近い条件下で反応が進むこととから検出結果は被験化合物の生体における作用をより良好に反映したものとなり、有効性のより高い化合物を選択できると考えられる。
【００５１】
上記の方法においてSAKIのリン酸化に使用するキナーゼとしてはＭ期キナーゼが好適に用いられる。また、メチル基供給源としてはメチオニン又はメチオニン誘導体が好適に用いられるが、これらに限定されない。また、メチル基供給源は標識化されていてもよい（例えば放射性標識）。
基質核酸としては、メチル化活性の検出を容易に且つ高感度で行うため、シトシンを豊富に含有するものが好適に用いられる。具体的には例えばPoly-dI:dCを好適に用いることができる。このような核酸試薬は市販されており（例えばロッシュ社）、容易に入手可能である。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法における被験化合物としては様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。被験化合物は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを被験化合物として用いてもよい。
以下、実施例（実験例を含む）を用いて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００５３】
１．SAKIの同定
１−１．AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体の作製と分子量約100 kDaタンパク質の発見
酵母および線虫のIpl1がH3ヒストンのＭ期リン酸化酵素であるという報告をC.D. Allisたちの研究グループは2000年に発表した（Hsu, J.Y. et al.: Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipl1/aurora kinase and Glc7/PP1 phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell102: 279-291, 2000.）。本発明者らは、AIM-1発見当初の1996年の時点において、ほぼ同時期に岐阜大学の岡野らによって発見されていた類縁キナーゼであるAik（現在、Aurora-Aと呼称）との構造上の比較や、酵母への移入実験結果、抗体を用いた細胞内のタンパク質局在性の比較などから、AIM-1が、酵母で１種類しかない存在しないIpl1の動物細胞における機能的な類縁キナーゼであることを確信し、C.D. Allisたちの報告を受けて間も無く、Ｍ期H3ヒストンの動物細胞におけるキナーゼはAIM-1であることを証明した。AIM-1の存在は、酵母で１種類しか存在しないCdc2が動物細胞には複数個あり、その中でG2期HuCdc2がCdk1として認識されるという状況に似ていると考えられた。しかしながら、E.A. Niggの総説には、全く異なる解釈がなされていた（Nigg, E. A.: Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 21-32, 2001.）。
【００５４】
本発明者らが行った予備的な実験（試験管内リン酸化実験）において、AIM-1もAikもH3ヒストンをリン酸化した。この結果を受けて本発明者らは、細胞内における責任酵素の同定を以下の方法で試みた。まず、H3ヒストンのリン酸化部位（Ser10）を特異的に認識するポリクローナル抗体を作製した。具体的には、H3ヒストンの７〜２０番目の合成ペプチドにおいて１０番セリンをリン酸化させた牛アルブミン結合複合体（ARKS*TGGKAPRKQL (S*=phosphorylated serine)：配列番号５）を抗原としてウサギに免疫し、H3ヒストンのＭ期リン酸部位特異的抗体を得た。細胞内におけるリン酸化状態を知るために、FLAGでタグされた野生型のAIM-1及びAikの発現ベクター、並びにATP結合部位リジンをアラニンに置換したキナーゼ欠失型変異タンパク質の発現ベクターをHeLa細胞に導入し、抗FLAG抗体、DNA染色（DAPIにより、染色体凝縮しているＭ期細胞を識別）、及び抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体で免疫染色を行なった。その結果、AIM-1がH3ヒストンのＭ期リン酸化酵素であることが判明した（図１）。また、免疫蛍光抗体法による観察実験と同時に、抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体による免疫ブロットによる解析を行なった。その結果、約16 kDa付近のH3ヒストンのリン酸化はAIM-1のキナーゼ欠失型変異タンパク質発現により抑制されていることが確認されるとともに、100 kDa付近にもAIM-1によりリン酸化を受けていると考えられているタンパク質の存在が認められた（図２）。
【００５５】
１−２．AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体を用いたプロイテオミクスによる100 kDaタンパク質の同定
約100 kDaの分子量を有し、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体によって検出されるタンパク質の同定を行なうために、このリン酸化セリン部位を認識する抗体を用いた免疫沈降を試みた。まず、HeLa細胞をダブル・チミジン処理法によって同調し、目的とする約100 kDaタンパク質のリン酸化と、H3ヒストンのリン酸化の細胞周期依存的な動態を調べた（図３）。その結果から、同調細胞の培養開始後、10時間目の細胞をリン酸化タンパク質の回収時期とし、また、6時間目をリン酸化されていない時期とした。それぞれの時間での細胞からタンパク質を回収して、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体での免疫沈降実験を行なった。その結果、同調培養開始後10時間目のサンプルに存在する約100 kDa のタンパク質が免疫沈降されてくることが確認された（図４左欄）。このタンパク質は、BPB染色により肉眼で確認できた（図４右欄）。そこで、HeLa細胞（10cmシャーレ100枚分）を出発材料とし、同調リリース後10時間目の細胞を、リン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫沈降し、免疫沈降されてきた約100 kDaタンパク質をゲルから切り出し、エドマン分解法にて部分アミノ酸配列を分析した。
【００５６】
１−３．100 kDaタンパク質（SAKI:Substrate of an unknown mitotic kinase）の遺伝子クローニング
免疫沈降されてきた約100 kDaタンパク質から４つのペプチド断片の部分アミノ酸配列を決定した（lep56: LFEHYYQELK（配列番号６）, lep77-1: VPQPLSWYPE（配列番号７）, lep77-2: LIEMLHADM（配列番号８）, lep60: LESPSFTGTG（配列番号９））。BLASTによる相同性検索の結果、BC001041のcDNA配列をコードするアミノ酸とlep60の部分のみ完全一致したが、その他３断片と一致するコーディング配列が見当たらなかった。そこで、lep56およびlep77-1に対応するmRNA配列をdbESTより探し出し、それぞれのアミノ酸配列に対応する部分を持つ5'-RACEのためのプライマー（lep56に対応するアンチセンス配列5'-CTGGTAGTAGTGCTCGAACAG-3'（配列番号１０）、lep77-1に対応するアンチセンス配列5'-ATACCAACTCAGTGGCTGTGGAAC-3'（配列番号１１））を作製後、HeLa細胞のmRNAを用いて5'-RACEを行なった。その後、得られた5'-RACEの産物cDNA断片の配列を決定すると共に、この断片を用いてHeLa完全長cDNAライブラリーよりコロニー・ハイブリダイゼーション法で全長cDNAをクローニングした。得られた約3380-bpのcDNA（配列番号１）のオープンリーディングフレーム（配列番号４））には、推定767残基のアミノ酸（配列番号２）がコードされていた（図５−１〜図５−４）。このコーディング配列から予想されるタンパク質をSAKI（Substrate of an unknown mitotic kinase）と命名した。
【００５７】
１−４．SAKIタンパク質のリン酸化部位の同定
抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体（AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体）のエピトープ部分（セリン10番付近）のアミノ酸配列（RKS）がSAKIの想定アミノ酸配列中に存在した（SAKIの137-139アミノ酸残基部分）。また、予備実験により、Ｎ末1-157アミノ酸残基を欠いたSAKI遺伝子産物（Δ1-157-SAKI）、ならびに、Ｃ末541-767アミノ酸残基を欠いたSAKI遺伝子産物（Δ541-767-SAKI）をHeLa強制発現後、ノコダゾール処理をしてＭ期回収した細胞の免疫ブロット実験から、リン酸化部位がＮ末1-157アミノ酸残基内に存在することが判明した。そこで、SAKIの139番目セリン残基をアラニンに置換した変異体遺伝子（SAKI-SA）を作製してHeLa細胞で発現させ、ノコダゾール処理してＭ期リン酸化状態をAIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体の免疫ブロットで調べたところ、SAKI-SA発現細胞におけるSAKIリン酸化は抑制された（図６）。このことより、AIM-1によるSAKIのリン酸化サイトは139番目セリン残基であると考えられた。
【００５８】
１−５．SAKIタンパク質のホモロジー・サーチ
推定アミノ酸配列の全長から、SAKIはNOL1/NOP2/sunファミリーに属する核小体タンパク質と構造的な類似性のあることがわかった。しかしながら、ヒトですでに知られているHuman NOL1 120-kDaタンパク質とは異なる新規なタンパク質であった。最新のデータベース・サーチでは、ゲノムから予想される理論的なコーディングタンパク質として、2003年12月23日にデータベース(Entrez Protein、NCBI提供、http://www.ncbi.nlm.nih.gov)に登録されていることがわかった（hypothetical protein FLJ20303, Accession: NP_060225）。
【実施例２】
【００５９】
２．SAKIの発現分布
２−１．抗SAKI抗体の作製
（１）Ｃ末合成ペプチドによる抗体（抗Ｃ末SAKI抗体）の作製
Ｃ末部分のアミノ酸配列に相当する合成ペプチド（GCDPAGVHPPR：配列番号１２）を作製し、これを抗原としてウサギに免疫を行ない、ポリクローナル抗体を得た。
（２）全長SAKIの抗原とした抗体の作製
Ｃ末認識抗体とは別に、pRSETにより大腸菌にてHisタグＮ末標識したSAKI全長タンパク質をHis精製し、これをウサギに免疫し、SAKIの全長に対する抗体も作製した（抗全長SAKI抗体）。
【００６０】
２−２．SAKIの発現プロファイル（細胞周期依存性と発現の臓器特異的な分布）
SAKI発現の細胞周期依存性に関して以下の知見が得られた。即ち、Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫ブロットにより、同調したHeLa細胞（図３参照）のSAKI発現パターンを調べた結果、SAKIはHeLa細胞において、細胞周期の全期を通じて発現レベルが変化しないことがわかった（図７）。また、リリース後６時間目（間期）と10時間目（Ｍ期）の同調HeLa細胞の免疫沈降実験を行ない、SAKI抗体での免疫沈降物100-kDaタンパク質がＭ期特異的にリン酸化されていることを確認した（図８）。
【００６１】
２−３．免疫染色による細胞内局在
SAKIの細胞内局在を調べるために免疫染色を行った。その結果、SAKIの染色性は間期細胞において、位相差細胞像の核小体部分及び核小体タンパク質C23の染色性と一致しており、SAKIは核小体に局在することが明らかとなった（図９）。Ｍ期細胞ではSAKIは染色体外に多く観察された（データ示さず）。核小体の構造はＭ期に入ると消失するが、それに伴いSAKIタンパク質も核外に移行すると考えられた。尚、図９では正常ヒト線維芽細胞（以下、NHDF）の染色試験の結果を示したが、HeLa細胞においても核小体部分におけるSAKIの染色が確認されている。但し、HeLa細胞ではNHDF細胞のような明瞭な局在性は観察されなかった。これは、HeLa細胞ではSAKIが高発現しているためであると考えられる。
【実施例３】
【００６２】
３．SAKIの細胞内での想定される機能
３−１．SAKIタンパク質のrRNA成熟活性化活性（SAKIはRNA代謝の律速酵素である）
構造上の類似性、及び細胞内での核小体への局在性から、SAKIはrRNAの成熟過程にかかわるメチル化酵素であることが予想された。そこでHeLa細胞にSAKI遺伝子発現ベクターをトランスフェクション後、L-[mehyl-14C]methionineをメチル基供給源として加えた培地で18時間培養し、全RNAを回収してRNAゲルで泳動後、RNAブロットを行ない、14C標識メチル基の取り込みをオートラジオグラフィーで調べた。その結果、SAKIの過剰発現は、rRNAへの14C標識メチル基の取り込みを増加させることがわかった（図１０）。即ち、SAKIが細胞内でrRNAをメチル化させる活性を持つことが予測された。
【００６３】
３−２．Ｍ期リン酸化SAKIタンパク質の生理的意義
SAKIは、間期核小体において核小体タンパク質B23やC23と共局在し（図９）、免疫沈降によりこれらのタンパク質と共沈されてくることから、複合体を形成していると考えられる。一方、Ｍ期に入る時に、SAKIはリン酸化を受けている。この時期、B23やC23もリン酸化されることが知られている。Ｇ２／Ｍ移行の過程で核膜消失と同時に核小体構造も消失するが、核小体構造が崩壊したＭ期において、リン酸化C23とリン酸化B23の挙動が異なることが知られている。ノコダゾール処理した細胞のSAKI、C23、B23のタンパク質発現量は間期の発現量と変化は無い。しかし、間期とは異なりB23もC23もSAKIタンパク質と免疫沈降されにくくなっている。また、Ｍ期でのこれらの細胞内局在を観察すると、それぞれ異なった局在性を持つ。SAKIタンパク質の局在性は一部においてC23とオーバーラップする部分があり、同様に免疫沈降実験においてもSAKIはC23とＭ期で部分的に相互作用しているようである。尚、Ｍ期では、SAKIはC23と同様、染色体外に局在している。
一方、大腸菌で産生させた活性型AIM-1を酵素として用いて、試験管内でのDNAメチル化活性を調べた。その結果、λDNAを用いたホモ・メチル化活性はSAKIには検出できなかった（通常、真核生物にはこの活性は存在しない）（図１１）。更に、polydI:dCを基質に用いたヘミ・メチル化活性を調べた結果、大腸菌で産生させたAIM-1-WTタンパクでヒトDnmt1と同程度のヘミ・メチル化活性を認めたが、SAKIタンパクを添加してもヘミ・メチル化活性の増加は認められず（図１２）、SAKIタンパク単独でのヘミ・メチル化活性も認めなかった（データは示していない）。すなわち、SAKIには、DNAメチル化酵素活性は認められなかった。
一方、SAKIのリン酸化の意義を調べるために、HeLa細胞にSAKI-WT、SAKI-SA（139番目セリンをアラニンに置換）、SAKI-SE（139番目セリンをグルタミン酸に置換）の発現ベクターを移入して後、細胞を1 μCi/mlのL-[methyl-14C]methionineで18時間ラベルした。ラベルの期間中に対数増殖にあった群（exp）と200ng/mlのノコダゾール処理群（noc）について、rRNAを分離してRNAゲルに泳動後、BAS2000によってRI検出を行なった。その結果を図１３に示す。なお、図の上段はBAS2000の結果、下段はメチル化された量の定量値である。また、レーンEはempty vector（ベクターのみ）、レーンWTはSAKI-WT、レーンSAはSAKI-SA、レーンSEはSAKI-SEをそれぞれ意味している。
その結果、図１０で示した結果と同様に、対数増殖期細胞（exp）では、野生型（WT）、及び非リン酸化型(SAKI-SA)ではrRNAメチル化酵素活性の増加が認められた。しかし、恒常的リン酸化型(SAKI-SE)ではrRNAメチル化酵素活性の抑制が観察された。
一方、Ｍ期（noc）の細胞では、空のベクターのみ（E）と、恒常的リン酸化型（SAKI-SE）とのrRNAメチル化酵素活性はほとんど同じであった。また、野生型（WT）ではrRNAメチル化酵素活性の増加が少し認められた。これらに対して、SAKI-SAでは、対数増殖期レベルと同様、rRNAメチル化酵素活性が増加していた。
以上の結果から、SAKIはDNAメチル化酵素活性を備えていないが、rRNAメチル化能を有し、そのrRNAメチル化酵素活性は、リン酸化制御によりＭ期で抑制されることが分った。
【実施例４】
【００６４】
４. SAKIのリン酸化酵素
４−１．実験結果からの考察
さて、SAKI はH3 ヒストンの10 番目セリンをリン酸化させた配列を認識するポリクローナル抗体を用いて同定した蛋白であり、H3 ヒストンと同様、SAKI も細胞周期のＭ期でリン酸化される。H3 ヒストンの10番目セリンをＭ期でリン酸化する酵素は、発明者らが動物細胞から初めて単離同定したAIM-1/Aurora-B である。そのため、SAKI はAIM-1 によってリン酸化されるものと考えていた。
また、図２と図６に示す実験データから、「AIM-1/Aurora-B ではそのキナーゼ欠失型であるK/R 型遺伝子を発現させると、H3ヒストンのリン酸化と共にSAKI のリン酸化も抑制される。」という結果が得られており、この結果からも「SAKI もH3 ヒストンと同様にAIM-1/Aurora-B によってＭ期でリン酸化される基質である。」ことを示していると考えていた。
しかし、以下の理由から、Ｍ期にSAKIをリン酸化するのはAIM-1/Aurora-Bではない可能性があると考えられた。
（１）AIM-1(Aurora-B) はノコダゾールなどのスピンドル崩壊因子によるＭ期停止（スピンドル・チェックポイントと言う）の根幹的な制御因子である。そのため、AIM-1がキナーゼ活性を欠失（キナーゼ欠失型であるK/R 型遺伝子を発現）すると、ノコダゾールによるＭ期停止は起こらなくなり、その結果、K/R 型遺伝子の発現細胞はＭ期を脱出する。そして、Ｍ期を脱出してしまえば、前記発現細胞中でH3 ヒストンのリン酸化低下と同時にSAKI リン酸化の低下が観察されるのは当然である。したがって、図２と図６に示す実験データは、SAKIがＭ期にリン酸化されることは示しているものの、そのリン酸化酵素がAIM-1/Aurora-Bであることを確定するものではない。
（２）図９に示す実験結果から、SAKIは、核小体タンパク質として知られるC23と同様、間期においては、核小体に局在しているとの知見が得られた。一方、H3 ヒストンとAIM-1/Aurora-Bとはその細胞内での局在の仕方が同一であり、間期においては核小体に局在していないことが確認されている。すなわち、SAKIとAIM-1/Aurora-Bとはその細胞内での局在の仕方が異なっている。
そのため、以下に示すようにして、AIM-1/Aurora-B が、SAKIのリン酸化酵素であるか否かを、（１）SAKIの細胞内局在性を調べること、及び（２）細胞中でAIM-1/Aurora-Bを強制発現させることによって確認した。
４−２．AIM-1/Aurora-B が、SAKIのリン酸化酵素であるか否かの確認
（１）SAKIの細胞内局在性
HeLa細胞の対数増殖期(Exp.)とノコダゾール処理（200 ng/ml、18時間）してＭ期に停止させた細胞から、界面活性剤（ActiveMotif社製のNuclear ExtractionKit）を用いて、各細胞のタンパク質を抽出し、細胞質画分、核画分、不溶性画分の３つに分画した。分画したタンパク質は、チュブリン（α-tubulin）、H3ヒストン、Aik /Aurora-A、AIM-1/Aurora-B、H3ヒストンのリン酸化された１０番目のセリン、をそれぞれ認識する抗体を用いた免疫ブロットにより検出した。その結果を図１４（ａ）に示す。
この図からも明らかなように、リン酸化SAKI（SAKI-P）はＭ期細胞の細胞質（Cyt）と核画分（Nuc）に存在しているのに対し、リン酸化H3ヒストン（H3 histone-P）は不溶性画分（Ins）に存在した。また、AIM-1/Aurora-Bも不溶性画分にその多くが存在した。
このように、細胞タンパク質を分画すると、AIM-1/Aurora-B とH3 ヒストンとが不溶性画分（Ins）に分画されるのに対して、SAKI タンパク質は可溶性画分にも分画され、且つ、リン酸化SAKIは不溶性画分には分画されないことが分った。すなわち、AIM-1/Aurora-BとSAKI タンパク質とは、タンパク分画法によるタンパク分布が大きく異なっている。
（２）AIM-1/Aurora-Bの強制発現
まず、pcDNA3ベクター（Invitrogen）にFLAGエピトープ・タグ（DYKDDDDK）を付加したAIM-1/Aurora-B 遺伝子を挿入した組換ベクター（以下、FLAG -Aurora-B）と、FLAGエピトープ・タグを付加したAik/Aurora-A遺伝子を挿入した組換ベクター（以下、FLAG -Aurora-A）とを作製し、これらのベクターをHeLa細胞に移入し発現実験を行なった。ここで、細胞の移入及び発現実験については、図１、図２、図６の実験と基本的に同じように行ったが、トランスフェショション試薬により効率の高いLipofectamine2000（Invitrogen）を用いた。そのため、FLAG-AIM-1の発現量は高かった。つぎに、強制発現させた形質転換細胞からタンパク質を抽出し、抗H3-P抗体、抗FLAG抗体を用いた免疫ブロットを行なった。その結果を図１４（ｂ）に示す。なお、抗FLAG抗体を用いた免疫ブロットの結果から、外から発現させたFLAG-Aurora-AあるいはFLAG-Aurora-Bは、予定したように強制発現していることを示している。
この図からも明らかなように、AIM-1/Aurora-Bを強制発現することにより、H3 ヒストンのリン酸化量は増加したが、SAKI のリン酸化量は増加していなかった。また、Aik（Aurora-A ）を強制発現しても、H3ヒストン及びSAKI 双方のリン酸化状態は増加しなかった。このことから、Ｍ期でSAKI をリン酸化する酵素はAIM-1 とは異なると考えられる。
以上の結果から、SAKI リン酸化酵素は未同定であり、このリン酸化酵素はＭ期で活性を持つセリン／スレオニン・キナーゼであり、Ｇ２期で核小体に局在性を示す可能性があり、リン酸化部位はH3ヒストンと共通のエピトープ（RKS-P）を持つと考えられる。
【実施例５】
【００６５】
５． SAKIの各種ヒト癌における発現とその応用
５−１．抗SAKI抗体を用いた免疫ブロットによる癌細胞と正常細胞における発現の比較
（１）ヒト正常臓器組織での発現
各臓器のタンパク質抽出サンプルを作製し、ヒトの各臓器でのSAKIの発現を免疫ブロット法で調べた。その結果、性巣、甲状腺、唾液腺、気管、肺、十二指腸、歯肉上皮、舌上皮に発現が認められ、腎臓、小腸、脾臓、膀胱、副腎、舌筋肉に痕跡程度の発現が見られたが、動脈、肝臓、大腸、胃、食道、心臓での発現は検出限界以下であった（図１５）。
（２）細胞株における発現パターン
NHDFに比べてHeLa細胞ではSAKIの高発現が観察された（図１６）。また、各種大腸癌細胞株ならびに口腔扁平上皮癌細胞株の全例においてSAKIの高発現が観察された（データ示さず）。
【００６６】
５−２．臨床症例におけるゲノム・サザンでの解析（5p15.32SAKI遺伝子増幅が一部の癌症例で観察されている）
SAKI遺伝子はヒト染色体5p15.32にマッピングされることがヒト・ゲノム情報の検索からわかった。5p15.3付近は遺伝子増幅が広くヒト癌で観察されている領域である。SAKIタンパク質の高発現が癌細胞株で認められたので、ゲノム・サザンでSAKI遺伝子のコピー数を調べた。その結果、SAKIの高発現が認められるHeLaで遺伝子増幅が観察された（図１７）。また、ヒトの口腔癌臨床剖検組織を調べた結果、遺伝子増幅している症例を観察した（図１７）。癌に関連するSAKIの高発現は遺伝子増幅を伴う場合のあることが明らかとなった。
【００６７】
５−３．抗SAKI抗体を用いた免疫染色によるヒト癌組織と正常組織における発現の比較
抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色により、ヒト癌患者の癌組織部分の病理標本を観察した。免疫組織染色（高感度法(CSA法)）は以下の手順で行った。
(1)固定、パラフィン包埋、薄切
外科的に切除された組織を10%中性緩衝ホルマリン溶液中で、１昼夜から数日固定し、脱水後、パラフィン包埋する。約5μm厚に薄切し、シランコートスライドガラス上に伸展させる。
(2)脱パラフィン
キシレンと下降系列のエタノールでパラフィンを除去する。
(3)内因性ペルオキシダーゼのブロッキング
0.3%H2O2/100%メチルアルコール中に30分浸漬し、内因性パーオキシダーゼの活性を阻害する。
(4)抗原賦活化
クエン酸緩衝液pH6.0中に浸漬し、マイクロウエーブ照射（5分×3回）を行い、切片内の抗原を賦活化する。
(5)非特異的反応のブロッキング
切片を水洗、PBSに浸漬後、カゼイン含有非特異的反応ブロッキング試薬を切片上に滴下する（室温、10分）。
(6)一次抗体反応
抗SAKI C末ポリクローナル抗体をPBSで400〜1,600倍に希釈したものを切片上に滴下し、反応させる（4℃、overnight）。その後、Tween20含有トリス塩酸緩衝液(TBST)で洗浄する。
(7)ビオチン標識二次抗体の反応
ビオチン標識抗ウサギ免疫グロブリンを切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(8)ストレプトアビジン・ビオチン複合体の反応
ストレプトアビジン・ビオチン複合体を切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(9)増幅試薬の反応
増幅試薬（ビオチン標識タイラマイド）を切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(10)パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの反応
パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(11)発色
DABで発色（5〜20分）後、水洗する。
(12)対比染色
ヘマトキシリンで核を染色（1分）後、水洗する。
(13)封入
切片を上昇系列のエタノールで脱水、キシレンで透徹後、封入する。
その結果、癌組織において明瞭なSAKI染色が観察（図１８）され、診断に応用可能であると判断された。
【００６８】
５−４．抗SAKI抗体のヒト癌診断における有用性とその意義の評価
抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によってSAKIの発現を種々の癌症例で検討した結果、口腔癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、尿管癌、子宮頚部癌、皮膚癌、乳腺癌のいずれの症例においても、癌組織においてSAKIの高発現が観察された。このことから、SAKIはヒト癌診断における病理学的な検索のマーカーとして有用であると判断された（図１９、図２０）。
【００６９】
また、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によって、口腔癌（扁平上皮癌）、大腸癌（腺癌）、肝臓癌（肝細胞癌）、肺癌（扁平上皮癌、腺癌） 前立腺（腺癌）と、これらの癌組織と隣接する正常組織（非癌組織）との間の染色性の違いを調べることにより、抗Ｃ末SAKI抗体の癌診断マーカーとしての有用性を検討した。その結果を癌ごとに以下に示す。なお、なお、口腔癌と肺癌については免疫組織染色の結果を図２１及び図２２示す。
（１）口腔癌（27 例）
図２１に示すように、（ａ）口腔扁平上皮癌組織では100.0％(27/27)の症例で強い陽性反応が観察された。一方、（ｂ）正常組織は全例陰性であった。
（２）大腸癌（19 例）
大腸では結合組織に弱陽性、平滑筋組織では極軽度のSAKI 反応しか観察されなかったのに対して、大腸腺癌においては84.2％(16/19)に、強いSAKI 陽性反応が見られた。
（３）肝臓癌（25 例）
胆管上皮、偽胆管などの正常肝臓組織では極軽度の反応がみられただけであるのに対して、肝細胞癌組織では72.0％(18/25)に陽性反応が認められた。
（４）肺癌 （扁平上皮癌 8 例，腺癌13 例）
図２２に示すように、（ａ）癌組織では腺癌、扁平上皮癌を問わず、１例をのぞいて95.2％（20/21）に明らかな陽性反応がみられたが、（ｂ）周囲の肺胞や気管支は陰性であった。
（５）前立腺（腺癌、18 例）
平滑筋、骨格筋、神経節組織などの正常組織において極軽度のSAKI 陽性反応が観察されたのみであったのに対し、癌組織では、すべての症例で腺癌細胞の核に中等度〜高度のSAKI 陽性反応が認められた。
これらの結果から、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色法は、癌細胞を高い確率で染色するとともに、正常細胞はほとんど染色しなかった。これは、抗Ｃ末SAKI抗体が優れた癌診断マーカーであることを示している。
【００７０】
５−５．従来からある癌診断マーカーとの比較
周辺に正常組織を含む癌組織剖検病理切片を免疫組織染色して、SAKI の発現状況と、病理診断学的な増殖マーカーとして一般的に用いられているKi-67 の発現状況とを比較検討した。その結果，Ki-67 は増殖期にある細胞のみに散在性の発現を示した（図２３（ａ））のに対して、SAKIはほとんどの癌細胞に発現した（図２３（ｂ））。この結果から、SAKI は癌化（悪性化）の指標として使える可能性があること、及びKi-67 やPCNA などの従来から増殖活性の指数として応用されてきた癌マーカーとは異なる応用が可能であることが示めされた。
【００７１】
５−５．免疫ブロット法による癌診断への応用可能性
免疫染色では、SAKI は良好な癌マーカーになる可能性があることが分った。そこで、SAKI 検出が実際の癌診断に応用可能であるかどうかを検討するために、ウエスタン・ブロット法（免疫ブロット法）によるSAKIの検出を試みた。
なお、免疫ブロット法はELISA 法（酵素免疫法）と比較して検出感度は数十分の１〜数百分の１と低く、MASS スペクトロメトリー解析の数千分の１〜数万分の１と検出感度が低い。しかし、免疫ブロット法は、実験室レベルで簡便に行なうことができ、ELISA 法のようにシステムを組み立てなくても、免疫反応したタンパク質の分子量を確認しながら、その検出を行うことができる。
（１）免疫ブロット法による検出感度の検討
免疫ブロットによる検出感度について検討するため、ヒト子宮頸部癌細胞株であるHeLa 細胞とマウスBALB/c 3T3A31-1-1 細胞を種々の細胞数ずつ混合して、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫ブロットを行なった。その結果を図２４に示す。なお、SAKIＣ末領域のアミノ酸配列は動物種間で異なるため、A31-1-1 細胞のSAKI は理論的にクロスすることはない。
図２４から、105 個細胞中に103〜102 個以上の癌細胞が混入していれば、すなわち、癌細胞がサンプル細胞中に100〜1000 個に１個存在していれば、当該癌細胞の混入を検出できることが分った。
（２）患者サンプルによる検出の検討
子宮癌患者の膣内スワッブ（患者サンプル）を取った綿棒からタンパク質を抽出し、このタンパク質中のSAKIを、抗Ｃ末SAKI抗体を用いる免疫ブロット法により検出した。その結果を図２５に示す。なお、患者サンプルは、日本母性保護産婦人科医会の分類による子宮癌分類のグレード２（異常細胞を認めるが良性）８例、グレード５（異型細胞を認め、周辺組織に移行性の可能性のある悪性）１例を用いた。また、免疫ブロット法を行った際のタンパク質量は、１レーン当り10μg相当であった。
その結果、グレード５の１例のみにおいて、SAKI を検出することができた。このことは、抗Ｃ末SAKI抗体が重篤な癌細胞を少ないタンパク質量で検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、Ｍ期キナーゼによりリン酸化される新規基質タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれらの利用形態が提供される。本発明の基質タンパク質は、様々な癌細胞において高発現していることが認められたことから、癌の診断マーカーとして有用である。また、癌の治療法ないし治療薬の開発にも有用である。一方、本発明が提供する基質タンパク質等又はその情報（アミノ酸配列や塩基配列等）は、生体においてＭ期キナーゼが関与する事象の研究にも有用である。即ち、本発明の開示事項によって、Ｍ期キナーゼが関与する生体内機構の解明、さらにはAIM-1が関与する疾患の治療方法や診断方法などの開発も期待される。
【００７３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】FLAGでタグされた野生型のAIM-1発現ベクター、Alk発現ベクター、及びATP結合部位リジンをアラニンに置換したキナーゼ欠失変異型タンパク質発現ベクターをHeLa細胞に導入した後、抗FLAG抗体、DNA染色、及び抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体で免疫した結果を示す。AIM-1が、動物細胞におけるH3ヒストンのリン酸化酵素として機能することがわかる。
【図２】AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体による免疫ブロットの結果である。empty：pcDNA3、WT：pcDNA3 FLAG-AZM-1、K/R：pcDNA3 FLAG-AIM-1-K/R、exp：対数増殖期細胞、Noc：ノコダゾール処理１８時間のＭ期細胞である。（WT,K/Rの例に関してはEMBJ. 17, 667, 1998にも記載あり）。15 kDaのH3ヒストン・リン酸化バンドはAIM-1-K/R（AIM-1キナーゼ欠失型変異体タンパク質）の発現によって抑制される。同時に100 kDaタンパク質の発現も抑制される。
【図３】HeLa細胞をダブル・チミジン法で同調後、リリースした細胞を経時的にサンプリングし、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫ブロットを行なった結果である。左から順に、同調培養開始後６時間、同７時間、同８時間、同９時間、同１０間、同１１時間、同１２時間、同１３時間、及び同１４時間のサンプルを流したレーンである。15 kDのヒストンH3のリン酸化バンドとほぼ同時期に100 kDaのリン酸化バンドが出現している。
【図４】同調後のHeLa細胞からリリースした細胞（リリース後６時間目及び１０時間目）を用いた免疫沈降実験の結果を示す。左欄は、免疫沈降産物を電気泳動した後、CBB染色した結果である。リリース後10時間目に100 kDaバンドが見られるが、リリース後6時間目には見られない。右欄は電気泳動後のゲルを、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫ブロットした結果である。Sup：培養上清、I.P.：免疫沈降産物を表す。
【図５−１】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の中で斜体のアミノ酸は、アミノ酸配列分析によって明らかとなったペプチド配列を示す。また、塩基配列の中で下線部は、5'-RACE法による解析に用いたプライマー部分を示す。
【図５−２】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す（図５−１の続き）。アミノ酸配列の中で斜体によって示したペプチドは、アミノ酸配列分析によって明らかとなったペプチド配列を示す。
【図５−３】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す（図５−２の続き）。アミノ酸配列の中で斜体によって示したペプチドは、アミノ酸配列分析によって明らかとなったペプチド配列を示す。
【図５−４】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す（図５−３の続き）。
【図６】SAKIの139番目セリン残基をアラニンに置換した変異体遺伝子（SAKI-SA）をHeLa細胞で発現させ、ノコダゾール処理した後、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫ブロットを実施した結果である。139番目セリンの置換によってSAKIのリン酸化が抑制されることが分かる。
【図７】HeLa細胞の同調系を用いたSAKIタンパク質の発現パターンを示す。同調細胞のサンプルは、図３で用いたものと同様である。本結果は抗Ｃ末SAKI抗体を用いたものであるが、抗全長SAKI抗体においても同様の結果が得られている。
【図８】同調したHeLa細胞（６時間目：間期、10時間目：Ｍ期）から得たサンプルの免疫沈降実験の結果を示す。左図は抗Ｃ末SAKI抗体で免疫沈降後、抗リン酸化Ser10抗体で免疫ブロットを行なった結果、中央図は抗リン酸化Ser10抗体で免疫沈降後、抗Ｃ末SAKI抗体で免疫ブロットを行なった結果、右図は抗Ｃ末SAKI抗体で免疫沈降後、抗Ｃ末SAKI抗体で免疫ブロットを行なった結果である。
【図９】SAKIタンパク質の細胞内局在性を示す。NHDF細胞をメタノール固定後、抗SAKI抗体で免疫染色をした。C23は核小体タンパク質として知られる。また、B23核小体タンパク質とSAKIとの多重染色でも同様のSAKIの間期細胞における核小体局在性を確認している（データ示さず）。
【図１０】HeLa細胞でのSAKIの強制発現によるrRNAメチル化促進効果を示す。レーン１は実験操作のみ（MOCK）、レーン２はEmpty（空）のベクター、レーン３はpcDNA3.1-SAKIを導入した。
【図１１】SAKIのDNAメチル化酵素活性を検討した結果を示す。λDNA１μｇをDNAメチル化酵素（Sss1メチレース、ヒトのヘミメチレースDnmt1）およびSAKIタンパク質（MOCK：SAKIが入っていない、6 hr：同調した間期HeLa細胞のSAKI免疫沈降物、10 hr：同調したＭ期HeLa細胞のSAKI免疫沈降物、non：大腸菌産生His-SAKI タンパク質のみ、GST-AIM-1-WT：大腸菌産生His-SAKI タンパク質を大腸菌産生活性型GST-AIM-1-WTにより in vitroでリン酸化したサンプル、AIM-1KR：大腸菌産生His-SAKI タンパク質を大腸菌産キナーゼ活性欠失型GST-AIM-1-KRによりin vitroでリン酸化したサンプル、Sss1：大腸菌CpGメチレース、Dnmt1：ヒトのヘミメチレース）で処理後、10unitの制限酵素BstU1で１時間消化を行ない、アガロース・ゲルで電気泳動した。大腸菌のメチレースであるSss1のみにBstU1非切断サイト（DNAメチル化活性）がある。このことより、SAKIには、２本鎖DNAの両方にメチル基を転移する酵素活性は無いと考えられた。
【図１２】SAKIのDNAメチル化酵素活性を検討した結果を示す。Poly-dI:dCを基質としたDNAメチル化酵素活性を測定した。レーン１：MOCK、レーン２：Dnmt1、レーン３：GST-AIM-1-WT、レーン４：GST-AIM-1-KR、レーン5：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (0.1 μｇ) + キナーゼ反応、レーン6：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (0.5 μｇ) + キナーゼ反応、レーン7：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (1.0 μｇ) + キナーゼ反応、レーン8：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (2.0 μｇ) + キナーゼ反応。GST-AIM-1-WTには、Dnmt1と同程度のDNAメチル化活性が存在した。しかしながら、His-SAKIには、DNAメチル化活性は無かった。GST-AIM-1-KRにDNAメチル化活性がなかったことから、AIM-1のキナーゼ活性に伴ってSAKIのDNAメチル化活性が発揮されると推察される。
【図１３】SAKIのrRNAメチレース活性を検討した結果を示す。SAKIは図１０で示したように、rRNAのメチル化を促進するが、139番目のリン酸化型にはメチル化酵素活性は無い。一方、非リン酸化型では、Ｍ期においても、メチル化酵素活性の抑制がかかりにくい。すなわり、SAKIは139番目セリンのリン酸化によって、その活性が負に制御されている。
【図１４】（ａ）は、対数増殖期（Exp.）とノコダゾール処理したＭ期（Mitosis）のHeLa細胞から、タンパク質を、細胞質画分（Cyt）、核抽出画分（Nuc）、そして、その他の細胞骨格を含む不溶性画分（Ins）に分画して、αチュブリン、Aik/Aurora-A、AIM-1/Aurora-B、H3ヒストン、セリン１０番のリン酸化H3ヒストン（16-kDa付近はリン酸化H3ヒストンを検出することができて、100-kDa付近はリン酸化SAKIを検出できる）、SAKIのＣ末抗体で免疫ブロット法により検出した結果である。この図にもあるように、AIM-1はその大部分が不溶性画分に検出された。これに対して、非リン酸化SAKIは、細胞質、核、不溶性画分に存在した。また、リン酸化SAKIの大部分は、細胞質と核画分にあり、不溶性画分では殆んど検出されなかった。この結果は、SAKIがAIM-1と細胞内分画において挙動を共にせず、SAKIがAIM-1の基質ではない可能性を示唆する。（ｂ）は、タンパク質を強制発現させた形質転換細胞からタンパク質を抽出し、抗H3-P抗体、抗FLAG抗体を用いた免疫ブロットを行った結果を示す。AIM-1/Aurora-Bを強制発現することにより、H3 ヒストンのリン酸化量は増加したが、SAKI のリン酸化量は増加していなかった。また、Aik（図中にはAurora-A と表示）を強制発現しても、H3ヒストン及びSAKI 双方のリン酸化状態は増加しなかった。このことから、Ｍ期でSAKI をリン酸化する酵素はAIM-1 とは異なると考えられる。
【図１５】各種ヒト臓器でのSAKI発現パターンを示す。各臓器からSAKIタンパク質を抽出し、抗全長SAKI抗体で免疫ブロットを行った。尚、抗Ｃ末SAKI抗体での免疫ブロットは感度が低いため、正常組織では検出されにくい。
【図１６】HeLa細胞と正常ヒト線維芽細胞でSAKIの発現を比較した図である。精巣の発現を図１５の結果との相対的な比較のためのコントロールとして泳動した。免疫ブロットは抗Ｃ末SAKI抗体で行なった。
【図１７】ゲノムDNAを用いてSAKI遺伝子をサザンブロット法で解析した結果を示す。SAKIの全長cDNAをプローブとして用いた。HeLa細胞ならびに、口腔癌細胞株と口腔癌患者組織において、遺伝子増幅が観察される。レーン1〜6：口腔癌細胞株、レーン7〜20：口腔癌患者組織、レーン21：NHDF、レーン22：HeLa細胞
【図１８】各種癌組織におけるSAKIの発現状態（免疫染色像）を示す。抗SAKIＣ末抗体を用いたABC発色を行った。皮膚癌、口腔癌、乳癌、及び腎癌組織においてSAKIの高発現が観察される。
【図１９】各種ヒト癌組織を用いた、SAKIの免疫組織学的検索結果をまとめた表である。
【図２０】前立腺腫瘍におけるSAKIの染色像を示す。ヘマトキシリン染色（右）とSAKI染色（左）を対比して示した。ヘマトキシリン染色により前立腺癌病変と識別される部分が、SAKIによって明瞭に染色されている。 （ｂ）は肺癌の免疫組織染色の結果である。
【図２１】抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によって、（ａ）口腔癌と、隣接する（ｂ）正常組織との間の染色性の違いを調べた結果を示している。
【図２２】抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によって、（ａ）肺癌と、隣接する正常組織との間の染色性の違いを調べた結果を示している。
【図２３】免疫組織染色により、SAKI の発現状況と、病理診断学的な代表的増殖マーカーとして一般的に用いられているKi-67 の発現状況とを比較検討した結果を示す。（ａ）Ki-67 は増殖期にある細胞でのみ散在性の発現を示したのに対して、（ｂ）SAKIはほとんどの癌細胞で発現した。
【図２４】種々の細胞数のHeLa 細胞をマウスBALB/c 3T3 A31-1-1 細胞（105 個）と混合し、その細胞溶解液をウエスタン・ブロット（免疫ブロット）した結果を示す。この結果からSAKI 検出限界は、105 個のA31-1-1 細胞中に100〜1000 個以上であることが分った
【図２５】子宮癌患者の膣内スワッブ（患者サンプル）から抽出したタンパク質を、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫ブロット法により検出した結果を示す。この図に示すように、グレード５の患者サンプル（レーン１）のみ、100-kDa 付近で抗Ｃ末SAKI抗体に対する陽性反応を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期の有糸分裂期（Ｍ期）の開始と共にリン酸化され、Ｍ期の終了と共に脱リン酸化されるＭ期キナーゼ基質タンパク質（SAKI：Substrate of an unknown mitotic kinase）及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
AIM-1（Aurora and Ipl1-like midbody-associated protein）は、染色体分配に関する変異体相補遺伝子である酵母Ipl1及びハエAuroraの類似遺伝子として動物細胞から発見された遺伝子である。AIM-1は発癌過程における染色体の異数化原因を解明するためその機能解析が行われてきた（非特許文献１、２）。一方、ヒトにはAIM-1以外に少なくとも２種類の類縁キナーゼ遺伝子（AIM-2及びAIM-3）が存在することが判明している（非特許文献３）。現在、AIM-1はオーロラB（Aurora-B）にクラス分けされており、AIM-2はオーロラA（Aurora-A）に、AIM-3はオーロラC（Aurora-C）にそれぞれ分類されている。
AIM-1は、動物細胞のＭ期進行過程での局在の解析から、Ｍ期パッセンジャータンパク質であることがわかっている。すなわちAIM-1はＭ期前期に染色体動原体部分に集まり、その後、赤道面に染色体が整列した時点で染色体動原体と共に赤道面に整列する。そして姉妹染色体分配後、姉妹染色体と共に両極に随伴するが、姉妹染色体が両極に引っ張られてしまう以前に染色体を降車し、再びＭ期細胞中央部分に集まり、細胞質の収縮のための構造体形成にかかわる（非特許文献４）。一方AIM-1は、Ｍ期進行過程におけるＭ期パッセンジャータンパク質の一つであり、Ｍ期アポトーシスを抑制することで知られるSurvivinや、動原体タンパク質として知られるInner Centromere Protein (INCEP)と複合体を形成して挙動を共にする（非特許文献５）。また、AIM-1は、姉妹染色体分離後、細胞質分離のための収縮開始の重要なシグナルとしても機能しており（非特許文献１〜３、６）、ミオシン、デスミンやビメンチンなどの中間径フィラメント、或いはMgcRacGAPなどをリン酸化することにより、細胞質分離と密接にかかわっている（非特許文献７〜１０）。
一方、AIM-1は、他の２種類のオーロラキナーゼと共に癌細胞において高発現している。これらのキナーゼの高発現は、癌発症進展過程における染色体分配過程の異常生成機構と深い関係があると考えられる（非特許文献２、１１〜１３）。
尚、AIM-1に関する更なる情報については特開平１１−１６４６９４号公報（特許文献１）を参照されたい。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１６４６９４号公報
【非特許文献１】Terada, Y., Tatsuka, M., Suzuki, F., Yasuda, Y., Fujita, S., and Otsu, M.: AIM1: a mammalian midbody-associated protein required for cytokinesis. EMBO J., 17: 667-676, 1998
【非特許文献２】Tatsuka, M., Katayama, H., Ota, T., Tanaka, T., Odashima, S., Suzuki, F., and Terada, Y.: Multinuclearity and increased ploidy caused by overexpression of the aurora- and Ipl1-like midbody-associated protein mitotic kinase in human cancer cells. Cancer Res., 58: 4811-4816, 1998
【非特許文献３】Katayama, H., Ota, T., Morita, K., Terada, Y., Suzuki, F., Katoh, O., and Tatsuka, M.: Human AIM-1: cDNA cloning and reduced expression during endomitosis in megakaryocyte-lineage cells. Gene, 224: 1-7, 1998
【非特許文献４】Murata-Hori, M., Tatsuka, M,, and Wang, Y.L.: Probing the Dynamics and Functions of Aurora B Kinase in Living Cells during Mitosis and Cytokinesis. Mol. Biol. Cell. 13: 1099-1108, 2002.
【非特許文献５】Temme, A., Rieger, M., Reber,F., Lindemann, D., Weigle, B., Diestelktter-Bachert, P., Ehninger, G., Tatsuka, M., Terada, Y., and Rieber, E. P.: Localization, Dynamics and Function of Survivin Revealed by Expression of Functional SurvivinDsRed Fusion Proteins in the Living Cell. Mol. Biol. Cell 14: 78-79, 2003.
【非特許文献６】Kawasaki, A., Matsumura I., Miyagawa, J., Tanaka, H., Terada, Y., Tatsuka, M., Machii, T., Furukawa, Y., and Kanakura Y.: Down-regulation of an AIM-1 kinase couples with megakaryocytic endomitosis of human hematopoietic cells. J. Cell Biol. 152: 257-287, 2001
【非特許文献７】Murata-Hori, M., Tatsuka, M,, and Wang, Y.L.: Probing the Dynamics and Functions of Aurora B Kinase in Living Cells during Mitosis and Cytokinesis. Mol. Biol. Cell. 13: 1099-1108, 2002.
【非特許文献８】Goto, H., Yasui, Y., Kawajiri, A., Nigg, E.A., Terada, Y., Tatsuka, M., Nagata, K., and Inagaki, M..: Aurora-B regulates the cleavage furrow-specific vimentin phosphorylation in the cytokinetic process. J. Biol. Chem. 278: 8526-8530, 2003.
【非特許文献９】Kawajiri, A., Yasui, Y., Goto, H., Tatsuka, M., Takahashi, M., Nagata, K., and Inagaki, M.: Functional Significance of the Specific Sites Phosphorylated in Desmin at Cleavage Furrow: Aurora-B May Phosphorylate and Regulate Type III Intermediate Filaments during Cytokinesis Coordinatedly with Rho-kinase. Mol. Biol. Cell 14: 1489-1500, 2003.
【非特許文献１０】Minoshima, Y., Kawashima, T., Hirose, K., Tonozuka, Y., Kawajiri, A., Bao, Y.C., Deng, X., Tatsuka, M., Narumiya, S., May, W.S., Nosaka, T., Semba, K., Inoue, T., Satoh, T., Inagaki, M., and Kitamura, T.: Phosphorylation by Aurora B Converts MgcRacGAP to a RhoGAP during Cytokinesis. Dev. Cell 4: 549-560, 2003.
【非特許文献１１】Katayama, H., Ota, T., Jisaki, F., Ueda, Y., Tanaka, T., Odashima, S., Suzuki, F., Terada, Y. and Tatsuka, M.: Mitotic kinase expression and colorectal cancer progression. J. Natl. Cancer Inst. 91: 1160-1162, 1999.
【非特許文献１２】Katayama H., Zhou H., Li Q., Tatsuka M., and Sen S.: Interaction and feedback regulation between STK15/BTAK/Aurora-A kinase and protein phosphatase 1 through mitotic cell division cycle. J. Biol. Chem. 276: 46219-46224, 2001.
【非特許文献１３】Ota, T., Suto, S., Katayama, H., Han, Z-B., Suzuki, F., Maeda, M., Tanino, M., Terada, Y., and Tatsuka M.: Increased mitotic phosphorylation of histone H3 due to AIM-1/Aurora-B overexpression contributes to chromosome number instability. Cancer Res. 62: 5168-5177, 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、AIM-1等に代表されるＭ期で活性を持つＭ期キナーゼの基質となるタンパク質を同定することを目的とする。また、当該基質の生体での役割を明らかにし、その利用を図ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の目的を達成すべく本発明者らは鋭意検討した。即ち本発明者らは、AIM-1の基質を同定すること、及び生体におけるその機能ないし役割を明らかにすることを目指して研究を進めた。また、当該基質に関して研究分野及び医療分野でも応用の可能性を模索した。
まず本発明者らは、細胞内におけるH3ヒストンのリン酸化酵素を同定することを試みた。その結果、AIM-1がＭ期リン酸化酵素であることが判明した。一方でH3ヒストン以外にAIM-1によってリン酸化を受ける基質タンパク質の存在が確認された。本発明者らはこの基質タンパク質に注目し、その同定を試みた。その結果、当該タンパク質をコードするcDNA（配列番号１）のクローニングに成功した。そして、得られたcDNAのORF（open reading frame）には推定767残基のアミノ酸（配列番号２）からなるタンパク質がコードされていることが判明した。このタンパク質をSAKI（Substrate of an unknown mitotic kinase）と命名した。
さらに検討を進めた結果、キナーゼによるSAKIのリン酸化部位が明らかになるとともに、SAKIの発現分布及び細胞内局在に関する有益な知見が得られた。一方、SAKIの過剰発現によってｒRNAへのメチル基の取り込みが増加する現象が観察され、SAKIが細胞内でrRNAをメチル化させる活性を有することが予測された。即ち、SAKIがrRNAの成熟過程に関わるメチル化酵素であると考えられた。また、SAKIが試験管内核酸メチル化アッセイによって、DNAを基質にはしないことから、SAKIがDNAメチル化酵素活性を持たず、RNAメチル化酵素であるという可能性を示唆する。さらに、キナーゼによるリン酸化を受けてSAKIは不活性型（リン酸化SAKI）となり、メチル化作用が抑制されるが判明した。ただ、AIM-1等を強制発現させた実験の実験結果は、AIM-1がSAKIリン酸化酵素ではないことを強く示唆している。
続いてSAKIの医療面での応用に関して検討を重ねた結果、各種大腸癌細胞株及び口腔扁平上皮癌細胞株の全例においてSAKIの高発現が観察された。また、SAKIの高発現が認められるHeLa細胞においてSAKI遺伝子の増幅が観察された。臨床解剖組織においてもSAKI遺伝子の増幅が認められた。一方、抗SAKI抗体を用いた免疫染色をヒト癌組織に対して実施したところ、従来からある抗体よりも明瞭な染色性が観察された。そこで、さらに種々の癌組織においてもSAKIの発現状態を検索した結果、検索対象全ての症例においてSAKIの高発現が観察された。これらの結果からSAKIがヒト癌診断における指標として有用であると判断された。加えて、SAKI抗体を利用した免疫ブロット法の結果から、癌細胞がサンプル中に100〜1000個に1個存在する状態でも検出できることが判明した。すなわち、SAKIの検出は癌細胞の同定に極めて有用であり、SAKIの過剰発現による活性亢進は癌形質の発現と密接に関連していることがわかった。そして、これらの知見を総合的に考慮した結果、SAKI過剰発現を抑制することや、また、活性化型である脱リン酸化SAKIをリン酸化状態に維持することによって、SAKIの活性は制御可能であり、そういったSAKI活性の抑制や阻害は、細胞の癌化及びその進行の抑止に有効であると考えられた。
【０００６】
本発明は以上の成果に基づくものであって、以下の各構成を提供する。
本発明の一局面は、以下のa及びbからなる群より選択される、単離されたタンパク質に関する：a)配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びb)配列番号２のアミノ酸配列と一部において相違するアミノ酸配列を有し、Ｍ期キナーゼの基質となり且つ核酸メチル化活性を有するタンパク質。
本発明の他の局面は以下のA及びBからなる群より選択される、単離された核酸に関する：A）上記a又はbのタンパク質をコードする核酸、及びB）A）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
また、本発明の一態様は上記本発明の核酸を保持するベクターに関する。好ましくは発現ベクターの形態に構成される。
また、本発明の一態様は上記本発明の核酸が外来的に導入されている細胞に関する。典型的には、上記ベクターをその宿主細胞に導入することによって当該細胞が構築される。
本発明のさらに他の態様は、以下のa及びbのステップを含む、Ｍ期キナーゼの基質として機能するタンパク質の生産方法に関する：a)上記本発明の細胞を、前記核酸がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ、及びb)産生されたタンパク質を回収するステップ。
本発明はまた、本発明のタンパク質（配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同タンパク質）に特異的に結合する抗体を提供する。
本発明の更に他の局面は、被験細胞の悪性度を判定する方法（悪性度判定法）に関する。本発明の悪性度判定法は、生体から分離された被験細胞内における、本発明のタンパク質の量を検出するステップを含む。ここでのタンパク質量の検出は好適には免疫学的染色法を利用して実施される。本発明はまた、前記ステップに代えて、生体から分離された被験細胞内における本発明の核酸の量を検出するステップを実施することで被験細胞の悪性度を判定する方法も提供する。
本発明はまた、上記方法の実施に使用可能な試薬を提供する。当該試薬は、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、又は本発明の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む。更に本発明は、当該試薬を含むキット（被験細胞の悪性度判定用キット）を提供する。当該キットは使用説明書を含む。
本発明の更に他の態様は、上記本発明のタンパク質の発現量の異常、又は本発明の核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患に対して有効な化合物をスクリーニングする方法に関し、本発明のタンパク質とＭ期キナーゼとの結合を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップを含んで構成される。他の態様では、上記ステップに代えて、本発明のタンパク質の核酸メチル化活性を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップを含んでスクリーニング方法が構築される。
【０００７】
後述の実施例に詳説されるように、本発明者らが新たに同定したＭ期キナーゼ基質タンパク質（以下、SAKI（Substrate of an unknown mitotic kinase）とも呼ぶ）は、Ｍ期にリン酸化され、通常は間期において脱リン酸化状態において核酸メチル化活性を発揮する。この核酸メチル化活性によってrRNAの成熟に関与する。また、リン酸化SAKIはＭ期特異的にリン酸化されて、そのメチル化活性を失う。これらの事実からSAKI又はそれをコードする核酸等はrRNAの成熟活性化やメチル化に関連した疾患ないし病態の治療薬又は診断薬の探索や、治療方法又は診断方法の開発に有用である。また、様々な癌細胞においてSAKIをコードする核酸の量が増大していること及びSAKIが高発現していることが認められたことから、SAKI又はそれをコードする核酸等は、細胞の悪性度を測るための検出対象（指標ないしマーカー）として有用である。
尚、本明細書において用語「〜を含む」又「〜含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。
以下、本発明の具体的構成を詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第一の局面は、Ｍ期キナーゼによってリン酸化され、且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制される新たに同定されたタンパク質に関する。即ち、単離されたＭ期キナーゼ基質タンパク質（SAKI）、及びその生物学的活性部分（以下、これらをまとめて「SAKI等」又は「本発明のタンパク質等」ともいう）に関する。
本発明のタンパク質等はそれが天然に由来する場合には細胞や組織或いは体液など、それが存在する天然材料から標準的な手法を用いて分離・調製することができる。また、本発明のタンパク質等を組換えDNA技術を用いて生産してもよい。さらには本発明のタンパク質等を化学合成によって生産してもよい。数多くのペプチド合成装置が市販されており、それらの中から適当なものを選択して用い、本発明のタンパク質等を得てもよい。
【０００９】
本発明のタンパク質等に関して使用する用語「単離された」とは、本発明のタンパク質等が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該タンパク質等以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたタンパク質等では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
一方、本発明のタンパク質等が組換えDNA技術によって生産されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたタンパク質等では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
また、本発明のタンパク質等が化学合成によって生産されたものである場合の用語「単離された」とは、前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたタンパク質等では前駆体の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。
尚、本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。
【００１０】
本明細書において「生物学的活性部分」とは、本発明のSAKIにおいて核酸メチル化活性に関与する部分をいう。従って、その部分が改変（アミノ酸の欠失、置換、挿入、付加など）されると核酸メチル化活性が発揮されなくなるか又は低下する部分をいう。後述の実施例に示されるようにSAKIのメチル化活性は特定のアミノ酸（139番セリン）がリン酸化されることによって発揮されることが認められた。即ち、SAKIのメチル化活性には当該アミノ酸部分が重要であることが判明した。従って、当該生物学活性部分の具体例として、当該アミノ酸部分を含む連続した一部を挙げることができる。
生物学的活性部分は、本発明のタンパク質の部分分解や組換えDNA技術によって調製することができる。
【００１１】
本発明のタンパク質等の一態様は配列番号２のアミノ酸配列を有する。一方、本発明の他の態様は、このタンパク質と比較した場合にその機能は同等であるものの一部においてアミノ酸配列が相違するタンパク質（以下、「相同タンパク質」ともいう）を提供する。「一部においてアミノ酸配列が相違する」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違は、Ｍ期キナーゼの基質であること、及び核酸メチル化活性が保持される限り許容される。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち相同タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。
好ましくは、保存的アミノ酸置換を非必須アミノ酸残基（Ｍ期キナーゼの基質タンパク質であること、及び核酸のメチル化活性を有することに関与しないアミノ酸残基）に生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１２】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本発明のポリペプチド分子に相同的なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
【００１３】
本発明は他の態様として、上記本発明のタンパク質等が他の分子と結合して形成される融合タンパク質を提供する。ここでの他の分子は例えばポリペプチド（シグナルペプチドを含む）又は標識物質（例えばGST）である。このような他の分子を結合させることによって本発明のポリペプチド等の機能の増強や補助、他の機能の付与、組換え生産する場合の発現・分泌の促進（シグナルペプチドの場合）、精製の容易化等を行える。
上記融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって調製することができる。例えば、まず本発明のタンパク質等をコードするDNA断片と他の分子をコードするDNA断片とをそれぞれ調製した後、これらをインフレームで連結する。このようにして得られた融合タンパク質をコードするDNAを適当な細胞内で発現させ、その後、標準的な生化学的手法などを用いて分離・精製する。
【００１４】
SAKI等又はその一部は、SAKI等に対する抗体（以下、「抗SAKI抗体」ともいう）を得るための免疫原として使用することができる。即ち、本発明は抗SAKI抗体を惹起可能なタンパク質ないしペプチド（免疫原）を提供する。
【００１５】
本発明は他の局面としてSAKI又はその相同タンパク質（SAKI等）に特異的に結合する抗体（抗SAKI抗体）に関する。ここでの用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれらの断片（但し、SAKI等に対する特異的結合能を有するもの）等を含む。本発明の抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
【００１６】
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（SAKI等）を調製し、これを用いてマウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物に免疫を施す。抗原としてはSAKI又はその相同タンパク質、或いはその一部を使用することができる。低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としてはKLM（Keyhole Light Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。また、キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製する。このようにしてポリクローナル抗体を得ることができる。一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。尚、抗体の作製方法に関してKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497;Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75; Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72; Kenneth, R.H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E.A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387402; Gefter, M.L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:23136等を参照することができる。
【００１７】
ファージディスプレイ法に関しては種々の文献、例えばHuse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; PCT国際公開第 WO 90/02809号; PCT国際公開第 WO 92/20791号; PCT国際公開第 WO 92/15679号; PCT国際公開第 WO 92/09690号等を参照することができる。また、ファージディスプレイライブラリの作製及びスクリーニング用のキットが市販されており、それらを好適に利用することができる。
【００１８】
本発明の一態様では、Ｍ期キナーゼによるリン酸化を受けた後のSAKI（即ち、139番目セリン残基がリン酸化された状態のSAKI）に対して特異的結合性を有する抗体が提供される。当該抗体を用いれば、リン酸化状態のSAKIを選択的に検出し、Ｍ期キナーゼの活性化の程度（換言すれば活性化Ｍ期キナーゼの量）やSAKIの活性の抑制化の程度（換言すれば活性化SAKIの量）などを把握することができる。これによって得られる情報はＭ期キナーゼないしSAKIが関与する事象の把握、予測等に有用である。例えば、後述の実施例に示されるように癌の診断に有用である。尚、リン酸化SAKIに対して特異的結合性を有する抗体は例えば、リン酸化された139番目セリン残基を含む、SAKIの部分ペプチドを抗原として上記手順で免疫操作を行うことによって得ることができる。
【００１９】
本発明のタンパク質等への特異的結合能を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。このような改変抗体も本発明に含まれる。ここでの改変抗体にはキメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。
【００２０】
本発明の抗SAKI抗体は例えばSAKI等（SAKI又はその相同体）の検出、SAKI等の分離・精製などに用いられる。標識化した抗体を用いることにより、上記の検出等を容易に実施することが可能である。抗体の標識化には例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、125I等の放射性同位体、及びビオチン等を用いることができる。
【００２１】
本発明の抗SAKI抗体はまた、SAKI等が関与する疾患に対する薬剤としても利用され得る。例えば、Ｍ期キナーゼによるリン酸化を受ける部位を認識し、これに特異的に結合する抗SAKI抗体であれば、当該部位を変化させることによって、アスパラギン酸（D）やグルタミン酸（E）にアミノ酸置換したのと同様の恒常的なリン酸化型のSAKI状態を作り、これによって治療効果を奏することが可能と考えられる。また、脱リン酸化SAKIに対して特異的結合能を有する抗SAKI抗体であれば、活性化型SAKIをトラップすることによって脱リン酸化SAKIが核酸メチル化作用を発揮することを阻害し、これによって治療効果を奏することが可能と考えられる。特に、メチル化に関与する部位に対して結合能を有する抗SAKI抗体であれば脱リン酸化SAKIのメチル化作用を直接的に阻害することができ、高い治療効果が期待できる。尚、本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す言葉と交換可能に用いられる。
【００２２】
本発明の他の局面はSAKIに関連する単離された核酸に関する。当該局面では例えば、SAKI等（SAKI又はその相同体）をコードする単離された核酸、SAKI等をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、SAKI等をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
本明細書における用語「核酸」は、DNA（cDNA及びゲノムDNAを含む）、RNA（mRNAを含む）、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合にはその発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。
【００２３】
本明細書において例えば「SAKIをコードする核酸」とは、それを発現させた場合にSAKIが得られる核酸のことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸（例えば１又は複数個のイントロンを含むDNA）をも含む。
【００２４】
本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸（例えばヒト生体内の核酸）の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分（天然状態において隣接するDＮＡ配列を含む）を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組換技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dDNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には単離された状態の核酸を意味する。
【００２５】
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。
例えば、配列番号１の塩基配列を有する本発明の核酸は当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。尚、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。
【００２６】
本発明の核酸は好ましい態様として配列番号１又は３の塩基配列を有する。配列番号１の塩基配列を有する核酸はHeLa細胞完全長cDNAライブラリーからSAKIをコードするものとしてクローニングされた全長cDNAである。一方、配列番号３の塩基配列を有する核酸はこの全長cDNAに対応するゲノムDNA（Entrez Genome、NCBI提供、http://www.ncbi.nlm.nih.gov、Accession No. NC_000005、Homo sapiens chromosome 5, complete sequence.）である。
本発明の他の態様は、配列番号１の塩基配列からその5'非翻訳領域又はその一部、及び3'非翻訳領域又はその一部のいずれか一つ以上を欠失したDNA分子（例えばコード領域（配列番号４）のみからなるDNA）を提供する。尚、コード領域の翻訳に悪影響を与えないことを条件として、本来の非翻訳領域とは異なる非翻訳領域をコード領域に組み合わせたDNAも本発明に含まれる。
【００２７】
本発明の他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう）を提供する。相同核酸の例として、配列番号１、３、又は４の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、Ｍ期キナーゼの基質となり、且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制されるタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような相同核酸は例えば部位特異的変異法を用いて特定の部位において塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように配列番号１、３、又は４の配列を有する核酸を遺伝子工学的に改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
相同核酸の他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められる核酸を挙げることができる。
【００２８】
本発明の他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
【００２９】
本発明の更に別の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアルデヒド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアルデヒド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００３０】
本発明の更に他の態様は、配列番号１、３、又は４の塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、配列番号１、３、又は４の塩基配列を有する核酸など、本発明の核酸を検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、配列番号１、３、又は４の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。
プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
【００３１】
本発明のさらに他の局面は本発明の核酸（即ちSAKI又はその一部或いはそれらの相同体をコードする核酸）を含有するベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）を含む。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。例えば大腸菌を宿主とするベクター（M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（pCDM8、pMT2PCなど)を用いることができる。
【００３２】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００３３】
宿主細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット等の哺乳類細胞（COS細胞、CHO細胞など）、大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。
【００３４】
本発明の他の局面は、本発明の核酸が導入された宿主細胞（即ち形質転換体）に関する。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得られる。トランスフェクション等はリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann,M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))等によって実施することができる。
【００３５】
本発明の形質転換体は、SAKI等を生産することに利用することができる。即ち、本発明の他の局面は、上記形質転換体を用いたSAKI等の生産方法を提供する。本発明の生産方法は、SAKI等が産生される条件下で上記形質転換体を培養するステップを少なくとも含む。通常はこのステップに加えて、産生されたタンパク質を回収（分離及び精製）するステップが実施される。
本発明のSAKI等を生産する目的ではなく、例えば特定の細胞内においてSAKI等を発現させた場合の挙動を調べる目的や、特定の細胞内でSAKI等を発現させることによって当該細胞の状態を変化させる目的（例えば治療目的）で形質転換体を得ることもできる。また、トランスジェニック動物（ヒトを含まない）を作製する目的で形質転換体を得ることもできる。即ち、本発明の形質転換体を非ヒトトランスジェニック動物の作製に利用することも可能である。例えば、形質転換体として本発明のSAKI等をコードする核酸を導入した受精卵母細胞又は胚性幹細胞を作製し、これからトランスジェニック動物を発生させることができる。本発明の非トランスジェニック動物はSAKIの生体内での機能の研究に有用である。トランスジェニック動物は、受精卵の前核に直接DNAの注入を行うマイクロインジェクション法、レトロウイルスベクターを利用する方法、ES細胞を利用する方法などを用いて作製することができる。以下、トランスジェニック動物の作製方法の一例としてマイクロインジェクション法を利用した方法を説明する。
マイクロインジェクション法ではまず、交尾が確認された雌マウスの卵管より受精卵を採取し、そして培養した後にその前核にDNAコンストラクト（本発明のタンパク質等をコードしたDNA）の注入を行う。使用するDNAコンストラクトには導入遺伝子の効率的な発現を可能とするプロモーター配列が含まれていることが好ましい。このようなプロモーターとしては例えばチキンβ−アクチンプロモータ、プリオンタンパク質プロモーター、ヒトARプロモーター、ニューロフィラメントL鎖プロモーター、L7プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターなどを用いることができる。注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、移植後のマウスを所定期間飼育して仔マウス（F0）を得る。仔マウスの染色体に導入遺伝子が適切に組込まれていることを確認するため、仔マウスの尾などからDNAを抽出し、導入遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCR法や導入遺伝子に特異的なプローブを用いたドットハイブリダイゼーション法等を行う。
本明細書における「トランスジェニック動物」の種は特に限定されないが、好ましくは哺乳類であって、より好ましくはマウス、ラットなどの齧歯類である。
【００３６】
本発明の更に他の局面は、SAKI又はそれに関連する核酸等の用途又は利用に関する。当該局面ではまず、細胞の悪性度を判定する方法（悪性度判定法）が提供される。本発明の悪性度判定法の一態様では、生体から分離された被験細胞内におけるSAKI又はその相同体（SAKI等）の量を検出するステップが実施される。本発明の他の態様では、生体から分離された被験細胞内における、SAKI等をコードする核酸の量を検出するステップが実施される。
ここで本明細書において「細胞の悪性度」とは、細胞の癌化の程度をいう。即ち、悪性度が高い細胞を癌細胞と呼ぶことができ、これとは逆に悪性度が極めて低い細胞を正常細胞と呼ぶことができる。また、「被験細胞」とは、本発明の方法において悪性度を判定する対象の細胞である。被験細胞は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態の被験細胞に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被験細胞が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被験細胞がその由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。被験細胞は通常、生体で存在していた状態、即ち周囲の細胞と結合した状態で調製され、本発明の方法に使用される。尚、被験細胞を周囲の細胞から分離（単離）した後に本発明の方法に使用してもよい。
被験細胞は例えば被疑癌組織から採取することができる。具体的には、被疑癌組織の一部をバイオプシーで採取し、被験細胞を含む試料としてそれを本発明の方法に供することができる。
【００３７】
本明細書において「癌」は広義に解釈することとし、癌腫及び肉腫を含む。また、本発明において、用語「癌」は「腫瘍」と交換可能に使用される。
一方、「SAKI等の量を検出する」とは、SAKI等の存在量を絶対量として又は相対量として把握することをいう。ここでの相対量の基準は例えば、癌化の程度に応じて用意した標準試料のSAKI等の量とすることができる。尚、「SAKI等の量を検出する」は、SAKI等が存在するか否かを調べることも含む。通常は、SAKI等の存否と、存在する場合にはその量が調べられることになる。厳密にSAKI等を定量することは必須でない。例えば、悪性度の指標となる対照のSAKI等の量と比較することによって被験細胞の悪性度を判定することが可能な程度にSAKI等の量を測定できればよい。尚、用語「SAKI等をコードする核酸の量を検出する」についても、上記と同様に解釈するものとする。
【００３８】
本発明の悪性度判定法では、上記のステップによって得られたSAKI等の検出量、又はSAKI等をコードする核酸の検出量に基づいて被験細胞の悪性度を判定する。具体的には例えば、検出量が多い場合に被験細胞の悪性度が高い（具体的には例えば癌細胞である）と判定できる。検出量に対応させて悪性度を予め区分しておき、前記ステップによって得られた検出量がどの区分に入るかを調べてもよい。このようにすれば、被験細胞の悪性度を統一的なランクによって表すことが可能となる。
【００３９】
本発明の悪性度判定法が対象とする癌の種類は特に限定されない。例えば大腸癌、口腔癌、肺癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、尿管癌、前立腺癌、子宮頚部癌、皮膚癌、乳腺癌の判定に本発明を適用することができる。
【００４０】
上記ステップにおける「SAKI等の量の検出」は、これに限定されるものではないが、好ましくは免疫学的染色法を利用して行う。免疫学的染色法によれば迅速に且つ感度よくSAKI等の量を検出できる。また、操作も簡便である。従って、SAKI等の量の検出に伴う被検者（患者）への負担も小さくなる。
免疫学的染色法では抗SAKI抗体が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標としてSAKI等の量が検出される。具体的には、被験細胞に抗SAKI抗体を接触させるステップを実施した後、抗SAKI抗体の結合量を測定する。そして測定結果から被験細胞内のSAKI等の検出量を算出する。具体的には、以下に示す免疫学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。
【００４１】
生体組織の免疫学的染色は一般に以下の手順(1)〜(9)で実施される。尚、生体組織の免疫学的染色法については様々な文献及び成書を参照することができる（例えば、Sternberger LA, Hardy PH, Cuculis JJ, et al.: The unlabeled antibody enzyme method of immunochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase anti horseradish peroxidase) and its use in identification of spirochates. J Histochem Cytochem 18: 315-333, 1970; Nakane PK and Kawaoi A: Peroxidasde-labeled antibodies. A new method of conjugation. J Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974.; Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S: The use of avidin-biotin inreraction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 27: 1131-1139, 1979.; 堤 寛：免疫組織化学−生検診断．臨床検査31（増刊）:1330-1342, 1987.; 渡辺慶一，中根一穂編：酵素抗体法，学際企画，1992.）。
(1)固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば3〜5μm厚）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理（抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために加熱処理及び／又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液（例えば1%溶液）で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液にDAB（3,3'-diaminobenzidine）を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間（例えば5分間）切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする（通常、数分間）。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
【００４２】
免疫学的染色法に使用する抗SAKI抗体は、SAKI等に対する特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。抗SAKI抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗SAKI抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。
【００４３】
抗SAKI抗体として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を直接検出することが可能である。従って、より簡易な方法となる。その反面、標識物質を結合させた抗SAKI抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは抗SAKI抗体に特異的結合性を有する抗体であって、例えばウサギ抗体として抗SAKI抗体を調製した場合には抗ウサギ抗体が使用される。ウサギやヤギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ・バイオ株式会社など）、本発明で使用する抗SAKI抗体に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。
【００４４】
一方、SAKI等をコードする核酸の量を指標として被験細胞の悪性度を判定する場合には、SAKI等をコードする核酸に対してハイブリダイズする核酸（即ち、配列番号１、３、又は４の塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（上記参照）が利用される。
本発明の悪性度判定法に使用するプローブ、プライマーには、検出方法に応じて適宜DNA断片又はRNA断片が用いられる。プローブ、プライマーの塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、選択性や検出感度及び再現性を考慮すればプライマーの塩基長としては例えば10bp以上、好ましくは15bp以上、具体的には10〜30bp程度、好ましくは15〜25bp程度である。尚、プライマーの場合には増幅対象に特異的にハイブリダイズし、目的の核酸フラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列と多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては例えば１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。プローブの場合も同様に、検出に影響のない範囲で検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。
【００４５】
尚、特定の核酸の量を測定する方法は当該分野で公知であって、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション法、RT-PCT法等を用いることができる。
【００４６】
本発明は他の態様として、上記方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットを用いることによって上記方法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。本発明のキットは、それが対象とする方法に応じた必要な試薬を含む。具体的には、SAKI等を検出対象とする方法（即ちタンパク質を検出する方法）の場合にはSAKI等に特異的結合性を有する試薬が使用される。当該試薬の好適な例は抗SAKI抗体であるがこれに限られるものではない。抗SAKI抗体の結合量を直接検出する方法用のキットの場合には標識された抗SAKI抗体が用いられる。一方、間接的検出方法用のキットの場合には未標識の抗SAKI抗体が用いられる。この場合には標識物質で標識化された二次抗体（標識二次抗体）をキットに含めてもよい。二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用した検出法用のキットとする場合には当該ポリマーをキットに含めてもよい。また、本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要な一以上の試薬（例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など）や器具などを更に含めてもよい。
他方、SAKI等をコードする核酸を検出対象とする方法（即ち核酸を検出する方法）の場合には当該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（プローブ及び／又はプライマー）が用いられる。この場合にはハイブリダイゼーションの実施に必要な一以上の試薬（例えば緩衝液、pH調製用試薬など）や器具などを更に含めてもよい。
尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【００４７】
本発明は更に、SAKIに関連する疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供する。本明細書において「SAKIに関連する疾患」とは、SAKI（又はその相同体）の異常な発現に起因する疾患、より具体的には配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質（又はその相同体）の発現量の異常、又は配列番号１若しくは３の塩基配列を有する核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患をいう。ここでの「異常」とは、正常な状態の範囲を超えて増加又は減少した状態をいう。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法の一態様では、被験化合物が、SAKI等とそのリン酸化酵素であるＭ期キナーゼとの結合を阻害する能力を有するか否か（阻害能の有無）及び／又は阻害能の程度を調べるステップを実施する。このステップの結果、被験化合物に阻害能の存在が認められれば、当該化合物を有効な薬剤候補として選択することができる。特に、高い阻害能が認められれば当該化合物は有力な薬剤候補と考えられる。
例えば、上記ステップを以下の手順で実施することができる。まず、被験化合物の存在下、SAKI等とそのリン酸化酵素であるＭ期キナーゼとを接触させる（ステップ１）。その後、SAKI等とＭ期キナーゼの結合量を、被験化合物の非存在下で上記と同様にSAKI等とＭ期キナーゼとを接触させた場合の結合量と比較する（ステップ２）。その結果、後者の結合量の方が多いようであれば、SAKI等とＭ期キナーゼとの結合を阻害する能力を被験化合物が有すると判定することができる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様では、被験化合物が、SAKI等の核酸メチル化活性、リン酸化SAKIの核酸メチル化活性の抑制を阻害する能力を有するか否か（阻害能の有無）及び／又は阻害能の程度を調べるステップを実施する。例えば、このステップを以下の手順で実施することができる。まず、被験化合物及びメチル基供給源の存在下、リン酸化SAKIと基質核酸とを接触させる（ステップ１）。その後、基質核酸のメチル化の程度を、被験化合物の非存在下で上記と同様にリン酸化SAKIと基質核酸とを接触させた場合のメチル化の程度と比較する（ステップ２）。その結果、後者のメチル化の程度の方が高いようであれば、SAKI等の核酸メチル化活性を阻害する能力を被験化合物が有すると判定することができる。
ここでのステップ１は例えば以下の手順で実施される。まず、リン酸化SAKIを生成させる（リン酸化反応：ステップ１−１）。次に、被験化合物、メチル基供給源、リン酸化SAKI、及び基質核酸を混合し反応させる（メチル化反応：ステップ１−２）。この態様ではSAKIのリン酸化とリン酸化SAKIによるメチル化反応とを互いに独立した工程として実施する。尚、メチル化反応は例えば以下の条件で行うことができる。
温度：約37℃、pH：約7.8、反応時間：約30分
【００５０】
一方、以下の手順でステップ１を実施してもよい。即ち、被験化合物、メチル基供給源、SAKI、キナーゼ、及び基質核酸を混合し反応させる（リン酸化反応及びメチル化反応）。この態様ではリン酸化SAKIの生成とリン酸化SAKIによるメチル化反応とを一つの工程として実施する。これによって操作が容易化されるとともに反応時間も短縮化される。また、生体内の環境により近い条件下で反応が進むこととから検出結果は被験化合物の生体における作用をより良好に反映したものとなり、有効性のより高い化合物を選択できると考えられる。
【００５１】
上記の方法においてSAKIのリン酸化に使用するキナーゼとしてはＭ期キナーゼが好適に用いられる。また、メチル基供給源としてはメチオニン又はメチオニン誘導体が好適に用いられるが、これらに限定されない。また、メチル基供給源は標識化されていてもよい（例えば放射性標識）。
基質核酸としては、メチル化活性の検出を容易に且つ高感度で行うため、シトシンを豊富に含有するものが好適に用いられる。具体的には例えばPoly-dI:dCを好適に用いることができる。このような核酸試薬は市販されており（例えばロッシュ社）、容易に入手可能である。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法における被験化合物としては様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。被験化合物は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを被験化合物として用いてもよい。
以下、実施例（実験例を含む）を用いて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００５３】
１．SAKIの同定
１−１．AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体の作製と分子量約100 kDaタンパク質の発見
酵母および線虫のIpl1がH3ヒストンのＭ期リン酸化酵素であるという報告をC.D. Allisたちの研究グループは2000年に発表した（Hsu, J.Y. et al.: Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipl1/aurora kinase and Glc7/PP1 phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell102: 279-291, 2000.）。本発明者らは、AIM-1発見当初の1996年の時点において、ほぼ同時期に岐阜大学の岡野らによって発見されていた類縁キナーゼであるAik（現在、Aurora-Aと呼称）との構造上の比較や、酵母への移入実験結果、抗体を用いた細胞内のタンパク質局在性の比較などから、AIM-1が、酵母で１種類しかない存在しないIpl1の動物細胞における機能的な類縁キナーゼであることを確信し、C.D. Allisたちの報告を受けて間も無く、Ｍ期H3ヒストンの動物細胞におけるキナーゼはAIM-1であることを証明した。AIM-1の存在は、酵母で１種類しか存在しないCdc2が動物細胞には複数個あり、その中でG2期HuCdc2がCdk1として認識されるという状況に似ていると考えられた。しかしながら、E.A. Niggの総説には、全く異なる解釈がなされていた（Nigg, E. A.: Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 21-32, 2001.）。
【００５４】
本発明者らが行った予備的な実験（試験管内リン酸化実験）において、AIM-1もAikもH3ヒストンをリン酸化した。この結果を受けて本発明者らは、細胞内における責任酵素の同定を以下の方法で試みた。まず、H3ヒストンのリン酸化部位（Ser10）を特異的に認識するポリクローナル抗体を作製した。具体的には、H3ヒストンの７〜２０番目の合成ペプチドにおいて１０番セリンをリン酸化させた牛アルブミン結合複合体（ARKS*TGGKAPRKQL (S*=phosphorylated serine)：配列番号５）を抗原としてウサギに免疫し、H3ヒストンのＭ期リン酸部位特異的抗体を得た。細胞内におけるリン酸化状態を知るために、FLAGでタグされた野生型のAIM-1及びAikの発現ベクター、並びにATP結合部位リジンをアラニンに置換したキナーゼ欠失型変異タンパク質の発現ベクターをHeLa細胞に導入し、抗FLAG抗体、DNA染色（DAPIにより、染色体凝縮しているＭ期細胞を識別）、及び抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体で免疫染色を行なった。その結果、AIM-1がH3ヒストンのＭ期リン酸化酵素であることが判明した（図１）。また、免疫蛍光抗体法による観察実験と同時に、抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体による免疫ブロットによる解析を行なった。その結果、約16 kDa付近のH3ヒストンのリン酸化はAIM-1のキナーゼ欠失型変異タンパク質発現により抑制されていることが確認されるとともに、100 kDa付近にもAIM-1によりリン酸化を受けていると考えられているタンパク質の存在が認められた（図２）。
【００５５】
１−２．AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体を用いたプロイテオミクスによる100 kDaタンパク質の同定
約100 kDaの分子量を有し、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体によって検出されるタンパク質の同定を行なうために、このリン酸化セリン部位を認識する抗体を用いた免疫沈降を試みた。まず、HeLa細胞をダブル・チミジン処理法によって同調し、目的とする約100 kDaタンパク質のリン酸化と、H3ヒストンのリン酸化の細胞周期依存的な動態を調べた（図３）。その結果から、同調細胞の培養開始後、10時間目の細胞をリン酸化タンパク質の回収時期とし、また、6時間目をリン酸化されていない時期とした。それぞれの時間での細胞からタンパク質を回収して、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体での免疫沈降実験を行なった。その結果、同調培養開始後10時間目のサンプルに存在する約100 kDa のタンパク質が免疫沈降されてくることが確認された（図４左欄）。このタンパク質は、BPB染色により肉眼で確認できた（図４右欄）。そこで、HeLa細胞（10cmシャーレ100枚分）を出発材料とし、同調リリース後10時間目の細胞を、リン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫沈降し、免疫沈降されてきた約100 kDaタンパク質をゲルから切り出し、エドマン分解法にて部分アミノ酸配列を分析した。
【００５６】
１−３．100 kDaタンパク質（SAKI:Substrate of an unknown mitotic kinase）の遺伝子クローニング
免疫沈降されてきた約100 kDaタンパク質から４つのペプチド断片の部分アミノ酸配列を決定した（lep56: LFEHYYQELK（配列番号６）, lep77-1: VPQPLSWYPE（配列番号７）, lep77-2: LIEMLHADM（配列番号８）, lep60: LESPSFTGTG（配列番号９））。BLASTによる相同性検索の結果、BC001041のcDNA配列をコードするアミノ酸とlep60の部分のみ完全一致したが、その他３断片と一致するコーディング配列が見当たらなかった。そこで、lep56およびlep77-1に対応するmRNA配列をdbESTより探し出し、それぞれのアミノ酸配列に対応する部分を持つ5'-RACEのためのプライマー（lep56に対応するアンチセンス配列5'-CTGGTAGTAGTGCTCGAACAG-3'（配列番号１０）、lep77-1に対応するアンチセンス配列5'-ATACCAACTCAGTGGCTGTGGAAC-3'（配列番号１１））を作製後、HeLa細胞のmRNAを用いて5'-RACEを行なった。その後、得られた5'-RACEの産物cDNA断片の配列を決定すると共に、この断片を用いてHeLa完全長cDNAライブラリーよりコロニー・ハイブリダイゼーション法で全長cDNAをクローニングした。得られた約3380-bpのcDNA（配列番号１）のオープンリーディングフレーム（配列番号４））には、推定767残基のアミノ酸（配列番号２）がコードされていた（図５−１〜図５−４）。このコーディング配列から予想されるタンパク質をSAKI（Substrate of an unknown mitotic kinase）と命名した。
【００５７】
１−４．SAKIタンパク質のリン酸化部位の同定
抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体（AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体）のエピトープ部分（セリン10番付近）のアミノ酸配列（RKS）がSAKIの想定アミノ酸配列中に存在した（SAKIの137-139アミノ酸残基部分）。また、予備実験により、Ｎ末1-157アミノ酸残基を欠いたSAKI遺伝子産物（Δ1-157-SAKI）、ならびに、Ｃ末541-767アミノ酸残基を欠いたSAKI遺伝子産物（Δ541-767-SAKI）をHeLa強制発現後、ノコダゾール処理をしてＭ期回収した細胞の免疫ブロット実験から、リン酸化部位がＮ末1-157アミノ酸残基内に存在することが判明した。そこで、SAKIの139番目セリン残基をアラニンに置換した変異体遺伝子（SAKI-SA）を作製してHeLa細胞で発現させ、ノコダゾール処理してＭ期リン酸化状態をAIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体の免疫ブロットで調べたところ、SAKI-SA発現細胞におけるSAKIリン酸化は抑制された（図６）。このことより、AIM-1によるSAKIのリン酸化サイトは139番目セリン残基であると考えられた。
【００５８】
１−５．SAKIタンパク質のホモロジー・サーチ
推定アミノ酸配列の全長から、SAKIはNOL1/NOP2/sunファミリーに属する核小体タンパク質と構造的な類似性のあることがわかった。しかしながら、ヒトですでに知られているHuman NOL1 120-kDaタンパク質とは異なる新規なタンパク質であった。最新のデータベース・サーチでは、ゲノムから予想される理論的なコーディングタンパク質として、2003年12月23日にデータベース(Entrez Protein、NCBI提供、http://www.ncbi.nlm.nih.gov)に登録されていることがわかった（hypothetical protein FLJ20303, Accession: NP_060225）。
【実施例２】
【００５９】
２．SAKIの発現分布
２−１．抗SAKI抗体の作製
（１）Ｃ末合成ペプチドによる抗体（抗Ｃ末SAKI抗体）の作製
Ｃ末部分のアミノ酸配列に相当する合成ペプチド（GCDPAGVHPPR：配列番号１２）を作製し、これを抗原としてウサギに免疫を行ない、ポリクローナル抗体を得た。
（２）全長SAKIの抗原とした抗体の作製
Ｃ末認識抗体とは別に、pRSETにより大腸菌にてHisタグＮ末標識したSAKI全長タンパク質をHis精製し、これをウサギに免疫し、SAKIの全長に対する抗体も作製した（抗全長SAKI抗体）。
【００６０】
２−２．SAKIの発現プロファイル（細胞周期依存性と発現の臓器特異的な分布）
SAKI発現の細胞周期依存性に関して以下の知見が得られた。即ち、Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫ブロットにより、同調したHeLa細胞（図３参照）のSAKI発現パターンを調べた結果、SAKIはHeLa細胞において、細胞周期の全期を通じて発現レベルが変化しないことがわかった（図７）。また、リリース後６時間目（間期）と10時間目（Ｍ期）の同調HeLa細胞の免疫沈降実験を行ない、SAKI抗体での免疫沈降物100-kDaタンパク質がＭ期特異的にリン酸化されていることを確認した（図８）。
【００６１】
２−３．免疫染色による細胞内局在
SAKIの細胞内局在を調べるために免疫染色を行った。その結果、SAKIの染色性は間期細胞において、位相差細胞像の核小体部分及び核小体タンパク質C23の染色性と一致しており、SAKIは核小体に局在することが明らかとなった（図９）。Ｍ期細胞ではSAKIは染色体外に多く観察された（データ示さず）。核小体の構造はＭ期に入ると消失するが、それに伴いSAKIタンパク質も核外に移行すると考えられた。尚、図９では正常ヒト線維芽細胞（以下、NHDF）の染色試験の結果を示したが、HeLa細胞においても核小体部分におけるSAKIの染色が確認されている。但し、HeLa細胞ではNHDF細胞のような明瞭な局在性は観察されなかった。これは、HeLa細胞ではSAKIが高発現しているためであると考えられる。
【実施例３】
【００６２】
３．SAKIの細胞内での想定される機能
３−１．SAKIタンパク質のrRNA成熟活性化活性（SAKIはRNA代謝の律速酵素である）
構造上の類似性、及び細胞内での核小体への局在性から、SAKIはrRNAの成熟過程にかかわるメチル化酵素であることが予想された。そこでHeLa細胞にSAKI遺伝子発現ベクターをトランスフェクション後、L-[mehyl-14C]methionineをメチル基供給源として加えた培地で18時間培養し、全RNAを回収してRNAゲルで泳動後、RNAブロットを行ない、14C標識メチル基の取り込みをオートラジオグラフィーで調べた。その結果、SAKIの過剰発現は、rRNAへの14C標識メチル基の取り込みを増加させることがわかった（図１０）。即ち、SAKIが細胞内でrRNAをメチル化させる活性を持つことが予測された。
【００６３】
３−２．Ｍ期リン酸化SAKIタンパク質の生理的意義
SAKIは、間期核小体において核小体タンパク質B23やC23と共局在し（図９）、免疫沈降によりこれらのタンパク質と共沈されてくることから、複合体を形成していると考えられる。一方、Ｍ期に入る時に、SAKIはリン酸化を受けている。この時期、B23やC23もリン酸化されることが知られている。Ｇ２／Ｍ移行の過程で核膜消失と同時に核小体構造も消失するが、核小体構造が崩壊したＭ期において、リン酸化C23とリン酸化B23の挙動が異なることが知られている。ノコダゾール処理した細胞のSAKI、C23、B23のタンパク質発現量は間期の発現量と変化は無い。しかし、間期とは異なりB23もC23もSAKIタンパク質と免疫沈降されにくくなっている。また、Ｍ期でのこれらの細胞内局在を観察すると、それぞれ異なった局在性を持つ。SAKIタンパク質の局在性は一部においてC23とオーバーラップする部分があり、同様に免疫沈降実験においてもSAKIはC23とＭ期で部分的に相互作用しているようである。尚、Ｍ期では、SAKIはC23と同様、染色体外に局在している。
一方、大腸菌で産生させた活性型AIM-1を酵素として用いて、試験管内でのDNAメチル化活性を調べた。その結果、λDNAを用いたホモ・メチル化活性はSAKIには検出できなかった（通常、真核生物にはこの活性は存在しない）（図１１）。更に、polydI:dCを基質に用いたヘミ・メチル化活性を調べた結果、大腸菌で産生させたAIM-1-WTタンパクでヒトDnmt1と同程度のヘミ・メチル化活性を認めたが、SAKIタンパクを添加してもヘミ・メチル化活性の増加は認められず（図１２）、SAKIタンパク単独でのヘミ・メチル化活性も認めなかった（データは示していない）。すなわち、SAKIには、DNAメチル化酵素活性は認められなかった。
一方、SAKIのリン酸化の意義を調べるために、HeLa細胞にSAKI-WT、SAKI-SA（139番目セリンをアラニンに置換）、SAKI-SE（139番目セリンをグルタミン酸に置換）の発現ベクターを移入して後、細胞を1 μCi/mlのL-[methyl-14C]methionineで18時間ラベルした。ラベルの期間中に対数増殖にあった群（exp）と200ng/mlのノコダゾール処理群（noc）について、rRNAを分離してRNAゲルに泳動後、BAS2000によってRI検出を行なった。その結果を図１３に示す。なお、図の上段はBAS2000の結果、下段はメチル化された量の定量値である。また、レーンEはempty vector（ベクターのみ）、レーンWTはSAKI-WT、レーンSAはSAKI-SA、レーンSEはSAKI-SEをそれぞれ意味している。
その結果、図１０で示した結果と同様に、対数増殖期細胞（exp）では、野生型（WT）、及び非リン酸化型(SAKI-SA)ではrRNAメチル化酵素活性の増加が認められた。しかし、恒常的リン酸化型(SAKI-SE)ではrRNAメチル化酵素活性の抑制が観察された。
一方、Ｍ期（noc）の細胞では、空のベクターのみ（E）と、恒常的リン酸化型（SAKI-SE）とのrRNAメチル化酵素活性はほとんど同じであった。また、野生型（WT）ではrRNAメチル化酵素活性の増加が少し認められた。これらに対して、SAKI-SAでは、対数増殖期レベルと同様、rRNAメチル化酵素活性が増加していた。
以上の結果から、SAKIはDNAメチル化酵素活性を備えていないが、rRNAメチル化能を有し、そのrRNAメチル化酵素活性は、リン酸化制御によりＭ期で抑制されることが分った。
【実施例４】
【００６４】
４. SAKIのリン酸化酵素
４−１．実験結果からの考察
さて、SAKI はH3 ヒストンの10 番目セリンをリン酸化させた配列を認識するポリクローナル抗体を用いて同定した蛋白であり、H3 ヒストンと同様、SAKI も細胞周期のＭ期でリン酸化される。H3 ヒストンの10番目セリンをＭ期でリン酸化する酵素は、発明者らが動物細胞から初めて単離同定したAIM-1/Aurora-B である。そのため、SAKI はAIM-1 によってリン酸化されるものと考えていた。
また、図２と図６に示す実験データから、「AIM-1/Aurora-B ではそのキナーゼ欠失型であるK/R 型遺伝子を発現させると、H3ヒストンのリン酸化と共にSAKI のリン酸化も抑制される。」という結果が得られており、この結果からも「SAKI もH3 ヒストンと同様にAIM-1/Aurora-B によってＭ期でリン酸化される基質である。」ことを示していると考えていた。
しかし、以下の理由から、Ｍ期にSAKIをリン酸化するのはAIM-1/Aurora-Bではない可能性があると考えられた。
（１）AIM-1(Aurora-B) はノコダゾールなどのスピンドル崩壊因子によるＭ期停止（スピンドル・チェックポイントと言う）の根幹的な制御因子である。そのため、AIM-1がキナーゼ活性を欠失（キナーゼ欠失型であるK/R 型遺伝子を発現）すると、ノコダゾールによるＭ期停止は起こらなくなり、その結果、K/R 型遺伝子の発現細胞はＭ期を脱出する。そして、Ｍ期を脱出してしまえば、前記発現細胞中でH3 ヒストンのリン酸化低下と同時にSAKI リン酸化の低下が観察されるのは当然である。したがって、図２と図６に示す実験データは、SAKIがＭ期にリン酸化されることは示しているものの、そのリン酸化酵素がAIM-1/Aurora-Bであることを確定するものではない。
（２）図９に示す実験結果から、SAKIは、核小体タンパク質として知られるC23と同様、間期においては、核小体に局在しているとの知見が得られた。一方、H3 ヒストンとAIM-1/Aurora-Bとはその細胞内での局在の仕方が同一であり、間期においては核小体に局在していないことが確認されている。すなわち、SAKIとAIM-1/Aurora-Bとはその細胞内での局在の仕方が異なっている。
そのため、以下に示すようにして、AIM-1/Aurora-B が、SAKIのリン酸化酵素であるか否かを、（１）SAKIの細胞内局在性を調べること、及び（２）細胞中でAIM-1/Aurora-Bを強制発現させることによって確認した。
４−２．AIM-1/Aurora-B が、SAKIのリン酸化酵素であるか否かの確認
（１）SAKIの細胞内局在性
HeLa細胞の対数増殖期(Exp.)とノコダゾール処理（200 ng/ml、18時間）してＭ期に停止させた細胞から、界面活性剤（ActiveMotif社製のNuclear ExtractionKit）を用いて、各細胞のタンパク質を抽出し、細胞質画分、核画分、不溶性画分の３つに分画した。分画したタンパク質は、チュブリン（α-tubulin）、H3ヒストン、Aik /Aurora-A、AIM-1/Aurora-B、H3ヒストンのリン酸化された１０番目のセリン、をそれぞれ認識する抗体を用いた免疫ブロットにより検出した。その結果を図１４（ａ）に示す。
この図からも明らかなように、リン酸化SAKI（SAKI-P）はＭ期細胞の細胞質（Cyt）と核画分（Nuc）に存在しているのに対し、リン酸化H3ヒストン（H3 histone-P）は不溶性画分（Ins）に存在した。また、AIM-1/Aurora-Bも不溶性画分にその多くが存在した。
このように、細胞タンパク質を分画すると、AIM-1/Aurora-B とH3 ヒストンとが不溶性画分（Ins）に分画されるのに対して、SAKI タンパク質は可溶性画分にも分画され、且つ、リン酸化SAKIは不溶性画分には分画されないことが分った。すなわち、AIM-1/Aurora-BとSAKI タンパク質とは、タンパク分画法によるタンパク分布が大きく異なっている。
（２）AIM-1/Aurora-Bの強制発現
まず、pcDNA3ベクター（Invitrogen）にFLAGエピトープ・タグ（DYKDDDDK）を付加したAIM-1/Aurora-B 遺伝子を挿入した組換ベクター（以下、FLAG -Aurora-B）と、FLAGエピトープ・タグを付加したAik/Aurora-A遺伝子を挿入した組換ベクター（以下、FLAG -Aurora-A）とを作製し、これらのベクターをHeLa細胞に移入し発現実験を行なった。ここで、細胞の移入及び発現実験については、図１、図２、図６の実験と基本的に同じように行ったが、トランスフェショション試薬により効率の高いLipofectamine2000（Invitrogen）を用いた。そのため、FLAG-AIM-1の発現量は高かった。つぎに、強制発現させた形質転換細胞からタンパク質を抽出し、抗H3-P抗体、抗FLAG抗体を用いた免疫ブロットを行なった。その結果を図１４（ｂ）に示す。なお、抗FLAG抗体を用いた免疫ブロットの結果から、外から発現させたFLAG-Aurora-AあるいはFLAG-Aurora-Bは、予定したように強制発現していることを示している。
この図からも明らかなように、AIM-1/Aurora-Bを強制発現することにより、H3 ヒストンのリン酸化量は増加したが、SAKI のリン酸化量は増加していなかった。また、Aik（Aurora-A ）を強制発現しても、H3ヒストン及びSAKI 双方のリン酸化状態は増加しなかった。このことから、Ｍ期でSAKI をリン酸化する酵素はAIM-1 とは異なると考えられる。
以上の結果から、SAKI リン酸化酵素は未同定であり、このリン酸化酵素はＭ期で活性を持つセリン／スレオニン・キナーゼであり、Ｇ２期で核小体に局在性を示す可能性があり、リン酸化部位はH3ヒストンと共通のエピトープ（RKS-P）を持つと考えられる。
【実施例５】
【００６５】
５． SAKIの各種ヒト癌における発現とその応用
５−１．抗SAKI抗体を用いた免疫ブロットによる癌細胞と正常細胞における発現の比較
（１）ヒト正常臓器組織での発現
各臓器のタンパク質抽出サンプルを作製し、ヒトの各臓器でのSAKIの発現を免疫ブロット法で調べた。その結果、性巣、甲状腺、唾液腺、気管、肺、十二指腸、歯肉上皮、舌上皮に発現が認められ、腎臓、小腸、脾臓、膀胱、副腎、舌筋肉に痕跡程度の発現が見られたが、動脈、肝臓、大腸、胃、食道、心臓での発現は検出限界以下であった（図１５）。
（２）細胞株における発現パターン
NHDFに比べてHeLa細胞ではSAKIの高発現が観察された（図１６）。また、各種大腸癌細胞株ならびに口腔扁平上皮癌細胞株の全例においてSAKIの高発現が観察された（データ示さず）。
【００６６】
５−２．臨床症例におけるゲノム・サザンでの解析（5p15.32SAKI遺伝子増幅が一部の癌症例で観察されている）
SAKI遺伝子はヒト染色体5p15.32にマッピングされることがヒト・ゲノム情報の検索からわかった。5p15.3付近は遺伝子増幅が広くヒト癌で観察されている領域である。SAKIタンパク質の高発現が癌細胞株で認められたので、ゲノム・サザンでSAKI遺伝子のコピー数を調べた。その結果、SAKIの高発現が認められるHeLaで遺伝子増幅が観察された（図１７）。また、ヒトの口腔癌臨床剖検組織を調べた結果、遺伝子増幅している症例を観察した（図１７）。癌に関連するSAKIの高発現は遺伝子増幅を伴う場合のあることが明らかとなった。
【００６７】
５−３．抗SAKI抗体を用いた免疫染色によるヒト癌組織と正常組織における発現の比較
抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色により、ヒト癌患者の癌組織部分の病理標本を観察した。免疫組織染色（高感度法(CSA法)）は以下の手順で行った。
(1)固定、パラフィン包埋、薄切
外科的に切除された組織を10%中性緩衝ホルマリン溶液中で、１昼夜から数日固定し、脱水後、パラフィン包埋する。約5μm厚に薄切し、シランコートスライドガラス上に伸展させる。
(2)脱パラフィン
キシレンと下降系列のエタノールでパラフィンを除去する。
(3)内因性ペルオキシダーゼのブロッキング
0.3%H2O2/100%メチルアルコール中に30分浸漬し、内因性パーオキシダーゼの活性を阻害する。
(4)抗原賦活化
クエン酸緩衝液pH6.0中に浸漬し、マイクロウエーブ照射（5分×3回）を行い、切片内の抗原を賦活化する。
(5)非特異的反応のブロッキング
切片を水洗、PBSに浸漬後、カゼイン含有非特異的反応ブロッキング試薬を切片上に滴下する（室温、10分）。
(6)一次抗体反応
抗SAKI C末ポリクローナル抗体をPBSで400〜1,600倍に希釈したものを切片上に滴下し、反応させる（4℃、overnight）。その後、Tween20含有トリス塩酸緩衝液(TBST)で洗浄する。
(7)ビオチン標識二次抗体の反応
ビオチン標識抗ウサギ免疫グロブリンを切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(8)ストレプトアビジン・ビオチン複合体の反応
ストレプトアビジン・ビオチン複合体を切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(9)増幅試薬の反応
増幅試薬（ビオチン標識タイラマイド）を切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(10)パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの反応
パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを切片上に滴下し、反応させる（室温、15分）。その後、TBSTで洗浄する。
(11)発色
DABで発色（5〜20分）後、水洗する。
(12)対比染色
ヘマトキシリンで核を染色（1分）後、水洗する。
(13)封入
切片を上昇系列のエタノールで脱水、キシレンで透徹後、封入する。
その結果、癌組織において明瞭なSAKI染色が観察（図１８）され、診断に応用可能であると判断された。
【００６８】
５−４．抗SAKI抗体のヒト癌診断における有用性とその意義の評価
抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によってSAKIの発現を種々の癌症例で検討した結果、口腔癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、尿管癌、子宮頚部癌、皮膚癌、乳腺癌のいずれの症例においても、癌組織においてSAKIの高発現が観察された。このことから、SAKIはヒト癌診断における病理学的な検索のマーカーとして有用であると判断された（図１９、図２０）。
【００６９】
また、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によって、口腔癌（扁平上皮癌）、大腸癌（腺癌）、肝臓癌（肝細胞癌）、肺癌（扁平上皮癌、腺癌） 前立腺（腺癌）と、これらの癌組織と隣接する正常組織（非癌組織）との間の染色性の違いを調べることにより、抗Ｃ末SAKI抗体の癌診断マーカーとしての有用性を検討した。その結果を癌ごとに以下に示す。なお、なお、口腔癌と肺癌については免疫組織染色の結果を図２１及び図２２示す。
（１）口腔癌（27 例）
図２１に示すように、（ａ）口腔扁平上皮癌組織では100.0％(27/27)の症例で強い陽性反応が観察された。一方、（ｂ）正常組織は全例陰性であった。
（２）大腸癌（19 例）
大腸では結合組織に弱陽性、平滑筋組織では極軽度のSAKI 反応しか観察されなかったのに対して、大腸腺癌においては84.2％(16/19)に、強いSAKI 陽性反応が見られた。
（３）肝臓癌（25 例）
胆管上皮、偽胆管などの正常肝臓組織では極軽度の反応がみられただけであるのに対して、肝細胞癌組織では72.0％(18/25)に陽性反応が認められた。
（４）肺癌 （扁平上皮癌 8 例，腺癌13 例）
図２２に示すように、（ａ）癌組織では腺癌、扁平上皮癌を問わず、１例をのぞいて95.2％（20/21）に明らかな陽性反応がみられたが、（ｂ）周囲の肺胞や気管支は陰性であった。
（５）前立腺（腺癌、18 例）
平滑筋、骨格筋、神経節組織などの正常組織において極軽度のSAKI 陽性反応が観察されたのみであったのに対し、癌組織では、すべての症例で腺癌細胞の核に中等度〜高度のSAKI 陽性反応が認められた。
これらの結果から、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色法は、癌細胞を高い確率で染色するとともに、正常細胞はほとんど染色しなかった。これは、抗Ｃ末SAKI抗体が優れた癌診断マーカーであることを示している。
【００７０】
５−５．従来からある癌診断マーカーとの比較
周辺に正常組織を含む癌組織剖検病理切片を免疫組織染色して、SAKI の発現状況と、病理診断学的な増殖マーカーとして一般的に用いられているKi-67 の発現状況とを比較検討した。その結果，Ki-67 は増殖期にある細胞のみに散在性の発現を示した（図２３（ａ））のに対して、SAKIはほとんどの癌細胞に発現した（図２３（ｂ））。この結果から、SAKI は癌化（悪性化）の指標として使える可能性があること、及びKi-67 やPCNA などの従来から増殖活性の指数として応用されてきた癌マーカーとは異なる応用が可能であることが示めされた。
【００７１】
５−５．免疫ブロット法による癌診断への応用可能性
免疫染色では、SAKI は良好な癌マーカーになる可能性があることが分った。そこで、SAKI 検出が実際の癌診断に応用可能であるかどうかを検討するために、ウエスタン・ブロット法（免疫ブロット法）によるSAKIの検出を試みた。
なお、免疫ブロット法はELISA 法（酵素免疫法）と比較して検出感度は数十分の１〜数百分の１と低く、MASS スペクトロメトリー解析の数千分の１〜数万分の１と検出感度が低い。しかし、免疫ブロット法は、実験室レベルで簡便に行なうことができ、ELISA 法のようにシステムを組み立てなくても、免疫反応したタンパク質の分子量を確認しながら、その検出を行うことができる。
（１）免疫ブロット法による検出感度の検討
免疫ブロットによる検出感度について検討するため、ヒト子宮頸部癌細胞株であるHeLa 細胞とマウスBALB/c 3T3A31-1-1 細胞を種々の細胞数ずつ混合して、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫ブロットを行なった。その結果を図２４に示す。なお、SAKIＣ末領域のアミノ酸配列は動物種間で異なるため、A31-1-1 細胞のSAKI は理論的にクロスすることはない。
図２４から、105 個細胞中に103〜102 個以上の癌細胞が混入していれば、すなわち、癌細胞がサンプル細胞中に100〜1000 個に１個存在していれば、当該癌細胞の混入を検出できることが分った。
（２）患者サンプルによる検出の検討
子宮癌患者の膣内スワッブ（患者サンプル）を取った綿棒からタンパク質を抽出し、このタンパク質中のSAKIを、抗Ｃ末SAKI抗体を用いる免疫ブロット法により検出した。その結果を図２５に示す。なお、患者サンプルは、日本母性保護産婦人科医会の分類による子宮癌分類のグレード２（異常細胞を認めるが良性）８例、グレード５（異型細胞を認め、周辺組織に移行性の可能性のある悪性）１例を用いた。また、免疫ブロット法を行った際のタンパク質量は、１レーン当り10μg相当であった。
その結果、グレード５の１例のみにおいて、SAKI を検出することができた。このことは、抗Ｃ末SAKI抗体が重篤な癌細胞を少ないタンパク質量で検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、Ｍ期キナーゼによりリン酸化される新規基質タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれらの利用形態が提供される。本発明の基質タンパク質は、様々な癌細胞において高発現していることが認められたことから、癌の診断マーカーとして有用である。また、癌の治療法ないし治療薬の開発にも有用である。一方、本発明が提供する基質タンパク質等又はその情報（アミノ酸配列や塩基配列等）は、生体においてＭ期キナーゼが関与する事象の研究にも有用である。即ち、本発明の開示事項によって、Ｍ期キナーゼが関与する生体内機構の解明、さらにはAIM-1が関与する疾患の治療方法や診断方法などの開発も期待される。
【００７３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】FLAGでタグされた野生型のAIM-1発現ベクター、Alk発現ベクター、及びATP結合部位リジンをアラニンに置換したキナーゼ欠失変異型タンパク質発現ベクターをHeLa細胞に導入した後、抗FLAG抗体、DNA染色、及び抗H3ヒストンSer10リン酸化部位抗体で免疫した結果を示す。AIM-1が、動物細胞におけるH3ヒストンのリン酸化酵素として機能することがわかる。
【図２】AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体による免疫ブロットの結果である。empty：pcDNA3、WT：pcDNA3 FLAG-AZM-1、K/R：pcDNA3 FLAG-AIM-1-K/R、exp：対数増殖期細胞、Noc：ノコダゾール処理１８時間のＭ期細胞である。（WT,K/Rの例に関してはEMBJ. 17, 667, 1998にも記載あり）。15 kDaのH3ヒストン・リン酸化バンドはAIM-1-K/R（AIM-1キナーゼ欠失型変異体タンパク質）の発現によって抑制される。同時に100 kDaタンパク質の発現も抑制される。
【図３】HeLa細胞をダブル・チミジン法で同調後、リリースした細胞を経時的にサンプリングし、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫ブロットを行なった結果である。左から順に、同調培養開始後６時間、同７時間、同８時間、同９時間、同１０間、同１１時間、同１２時間、同１３時間、及び同１４時間のサンプルを流したレーンである。15 kDのヒストンH3のリン酸化バンドとほぼ同時期に100 kDaのリン酸化バンドが出現している。
【図４】同調後のHeLa細胞からリリースした細胞（リリース後６時間目及び１０時間目）を用いた免疫沈降実験の結果を示す。左欄は、免疫沈降産物を電気泳動した後、CBB染色した結果である。リリース後10時間目に100 kDaバンドが見られるが、リリース後6時間目には見られない。右欄は電気泳動後のゲルを、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫ブロットした結果である。Sup：培養上清、I.P.：免疫沈降産物を表す。
【図５−１】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の中で斜体のアミノ酸は、アミノ酸配列分析によって明らかとなったペプチド配列を示す。また、塩基配列の中で下線部は、5'-RACE法による解析に用いたプライマー部分を示す。
【図５−２】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す（図５−１の続き）。アミノ酸配列の中で斜体によって示したペプチドは、アミノ酸配列分析によって明らかとなったペプチド配列を示す。
【図５−３】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す（図５−２の続き）。アミノ酸配列の中で斜体によって示したペプチドは、アミノ酸配列分析によって明らかとなったペプチド配列を示す。
【図５−４】SAKIの全長cDNA、及び推定コーディング領域のアミノ酸配列を示す（図５−３の続き）。
【図６】SAKIの139番目セリン残基をアラニンに置換した変異体遺伝子（SAKI-SA）をHeLa細胞で発現させ、ノコダゾール処理した後、AIM-1によるリン酸化セリン部位を認識する抗体で免疫ブロットを実施した結果である。139番目セリンの置換によってSAKIのリン酸化が抑制されることが分かる。
【図７】HeLa細胞の同調系を用いたSAKIタンパク質の発現パターンを示す。同調細胞のサンプルは、図３で用いたものと同様である。本結果は抗Ｃ末SAKI抗体を用いたものであるが、抗全長SAKI抗体においても同様の結果が得られている。
【図８】同調したHeLa細胞（６時間目：間期、10時間目：Ｍ期）から得たサンプルの免疫沈降実験の結果を示す。左図は抗Ｃ末SAKI抗体で免疫沈降後、抗リン酸化Ser10抗体で免疫ブロットを行なった結果、中央図は抗リン酸化Ser10抗体で免疫沈降後、抗Ｃ末SAKI抗体で免疫ブロットを行なった結果、右図は抗Ｃ末SAKI抗体で免疫沈降後、抗Ｃ末SAKI抗体で免疫ブロットを行なった結果である。
【図９】SAKIタンパク質の細胞内局在性を示す。NHDF細胞をメタノール固定後、抗SAKI抗体で免疫染色をした。C23は核小体タンパク質として知られる。また、B23核小体タンパク質とSAKIとの多重染色でも同様のSAKIの間期細胞における核小体局在性を確認している（データ示さず）。
【図１０】HeLa細胞でのSAKIの強制発現によるrRNAメチル化促進効果を示す。レーン１は実験操作のみ（MOCK）、レーン２はEmpty（空）のベクター、レーン３はpcDNA3.1-SAKIを導入した。
【図１１】SAKIのDNAメチル化酵素活性を検討した結果を示す。λDNA１μｇをDNAメチル化酵素（Sss1メチレース、ヒトのヘミメチレースDnmt1）およびSAKIタンパク質（MOCK：SAKIが入っていない、6 hr：同調した間期HeLa細胞のSAKI免疫沈降物、10 hr：同調したＭ期HeLa細胞のSAKI免疫沈降物、non：大腸菌産生His-SAKI タンパク質のみ、GST-AIM-1-WT：大腸菌産生His-SAKI タンパク質を大腸菌産生活性型GST-AIM-1-WTにより in vitroでリン酸化したサンプル、AIM-1KR：大腸菌産生His-SAKI タンパク質を大腸菌産キナーゼ活性欠失型GST-AIM-1-KRによりin vitroでリン酸化したサンプル、Sss1：大腸菌CpGメチレース、Dnmt1：ヒトのヘミメチレース）で処理後、10unitの制限酵素BstU1で１時間消化を行ない、アガロース・ゲルで電気泳動した。大腸菌のメチレースであるSss1のみにBstU1非切断サイト（DNAメチル化活性）がある。このことより、SAKIには、２本鎖DNAの両方にメチル基を転移する酵素活性は無いと考えられた。
【図１２】SAKIのDNAメチル化酵素活性を検討した結果を示す。Poly-dI:dCを基質としたDNAメチル化酵素活性を測定した。レーン１：MOCK、レーン２：Dnmt1、レーン３：GST-AIM-1-WT、レーン４：GST-AIM-1-KR、レーン5：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (0.1 μｇ) + キナーゼ反応、レーン6：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (0.5 μｇ) + キナーゼ反応、レーン7：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (1.0 μｇ) + キナーゼ反応、レーン8：GST-AIM-1-WT + His-SAKI-WT (2.0 μｇ) + キナーゼ反応。GST-AIM-1-WTには、Dnmt1と同程度のDNAメチル化活性が存在した。しかしながら、His-SAKIには、DNAメチル化活性は無かった。GST-AIM-1-KRにDNAメチル化活性がなかったことから、AIM-1のキナーゼ活性に伴ってSAKIのDNAメチル化活性が発揮されると推察される。
【図１３】SAKIのrRNAメチレース活性を検討した結果を示す。SAKIは図１０で示したように、rRNAのメチル化を促進するが、139番目のリン酸化型にはメチル化酵素活性は無い。一方、非リン酸化型では、Ｍ期においても、メチル化酵素活性の抑制がかかりにくい。すなわり、SAKIは139番目セリンのリン酸化によって、その活性が負に制御されている。
【図１４】（ａ）は、対数増殖期（Exp.）とノコダゾール処理したＭ期（Mitosis）のHeLa細胞から、タンパク質を、細胞質画分（Cyt）、核抽出画分（Nuc）、そして、その他の細胞骨格を含む不溶性画分（Ins）に分画して、αチュブリン、Aik/Aurora-A、AIM-1/Aurora-B、H3ヒストン、セリン１０番のリン酸化H3ヒストン（16-kDa付近はリン酸化H3ヒストンを検出することができて、100-kDa付近はリン酸化SAKIを検出できる）、SAKIのＣ末抗体で免疫ブロット法により検出した結果である。この図にもあるように、AIM-1はその大部分が不溶性画分に検出された。これに対して、非リン酸化SAKIは、細胞質、核、不溶性画分に存在した。また、リン酸化SAKIの大部分は、細胞質と核画分にあり、不溶性画分では殆んど検出されなかった。この結果は、SAKIがAIM-1と細胞内分画において挙動を共にせず、SAKIがAIM-1の基質ではない可能性を示唆する。（ｂ）は、タンパク質を強制発現させた形質転換細胞からタンパク質を抽出し、抗H3-P抗体、抗FLAG抗体を用いた免疫ブロットを行った結果を示す。AIM-1/Aurora-Bを強制発現することにより、H3 ヒストンのリン酸化量は増加したが、SAKI のリン酸化量は増加していなかった。また、Aik（図中にはAurora-A と表示）を強制発現しても、H3ヒストン及びSAKI 双方のリン酸化状態は増加しなかった。このことから、Ｍ期でSAKI をリン酸化する酵素はAIM-1 とは異なると考えられる。
【図１５】各種ヒト臓器でのSAKI発現パターンを示す。各臓器からSAKIタンパク質を抽出し、抗全長SAKI抗体で免疫ブロットを行った。尚、抗Ｃ末SAKI抗体での免疫ブロットは感度が低いため、正常組織では検出されにくい。
【図１６】HeLa細胞と正常ヒト線維芽細胞でSAKIの発現を比較した図である。精巣の発現を図１５の結果との相対的な比較のためのコントロールとして泳動した。免疫ブロットは抗Ｃ末SAKI抗体で行なった。
【図１７】ゲノムDNAを用いてSAKI遺伝子をサザンブロット法で解析した結果を示す。SAKIの全長cDNAをプローブとして用いた。HeLa細胞ならびに、口腔癌細胞株と口腔癌患者組織において、遺伝子増幅が観察される。レーン1〜6：口腔癌細胞株、レーン7〜20：口腔癌患者組織、レーン21：NHDF、レーン22：HeLa細胞
【図１８】各種癌組織におけるSAKIの発現状態（免疫染色像）を示す。抗SAKIＣ末抗体を用いたABC発色を行った。皮膚癌、口腔癌、乳癌、及び腎癌組織においてSAKIの高発現が観察される。
【図１９】各種ヒト癌組織を用いた、SAKIの免疫組織学的検索結果をまとめた表である。
【図２０】前立腺腫瘍におけるSAKIの染色像を示す。ヘマトキシリン染色（右）とSAKI染色（左）を対比して示した。ヘマトキシリン染色により前立腺癌病変と識別される部分が、SAKIによって明瞭に染色されている。 （ｂ）は肺癌の免疫組織染色の結果である。
【図２１】抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によって、（ａ）口腔癌と、隣接する（ｂ）正常組織との間の染色性の違いを調べた結果を示している。
【図２２】抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫組織染色によって、（ａ）肺癌と、隣接する正常組織との間の染色性の違いを調べた結果を示している。
【図２３】免疫組織染色により、SAKI の発現状況と、病理診断学的な代表的増殖マーカーとして一般的に用いられているKi-67 の発現状況とを比較検討した結果を示す。（ａ）Ki-67 は増殖期にある細胞でのみ散在性の発現を示したのに対して、（ｂ）SAKIはほとんどの癌細胞で発現した。
【図２４】種々の細胞数のHeLa 細胞をマウスBALB/c 3T3 A31-1-1 細胞（105 個）と混合し、その細胞溶解液をウエスタン・ブロット（免疫ブロット）した結果を示す。この結果からSAKI 検出限界は、105 個のA31-1-1 細胞中に100〜1000 個以上であることが分った
【図２５】子宮癌患者の膣内スワッブ（患者サンプル）から抽出したタンパク質を、抗Ｃ末SAKI抗体を用いた免疫ブロット法により検出した結果を示す。この図に示すように、グレード５の患者サンプル（レーン１）のみ、100-kDa 付近で抗Ｃ末SAKI抗体に対する陽性反応を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のa及びbからなる群より選択される、単離されたタンパク質：
a)配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質；及び
b)配列番号２のアミノ酸配列と一部において相違するアミノ酸配列を有し、Ｍ期キナーゼの基質となり、且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制されるタンパク質。
【請求項２】
以下のA及びBからなる群より選択される、単離された核酸：
A）請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸；及び
B）A）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を保持するベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸が外来的に導入されている細胞。
【請求項５】
以下のa及びbのステップを含む、Ｍ期キナーゼの基質として機能するタンパク質の生産方法：
a)請求項４に記載の細胞を、前記核酸がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；及び
b)産生されたタンパク質を回収するステップ。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項７】
生体から分離された被験細胞内における、請求項１に記載のタンパク質の量を検出するステップを含んでなる、被験細胞の悪性度判定法。
【請求項８】
タンパク質量の検出が免疫学的染色法を利用して実施される、請求項７に記載の悪性度判定法。
【請求項９】
生体から分離された被験細胞内における、請求項２に記載の核酸の量を検出するステップを含んでなる、被験細胞の悪性度判定方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の抗体を含んでなる、被験細胞の悪性度判定用試薬。
【請求項１１】
請求項２に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含んでなる、被検細胞の悪性度判定用試薬。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の試薬と、使用説明書とを含んでなる、被験細胞の悪性度判定用キット。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現量の異常、又は配列番号１若しくは３の塩基配列を有する核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患に対して有効な化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１のタンパク質とＭ期キナーゼとの結合を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップ、
を含む方法。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現量の異常、又は配列番号１若しくは３の塩基配列を有する核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患に対して有効な化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１のタンパク質の核酸メチル化活性を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップ、
を含む方法。
【請求項１】
以下のa及びbからなる群より選択される、単離されたタンパク質：
a)配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質；及び
b)配列番号２のアミノ酸配列と一部において相違するアミノ酸配列を有し、Ｍ期キナーゼの基質となり、且つ核酸メチル化活性を有するとともに、リン酸化されると核酸メチル化活性が抑制されるタンパク質。
【請求項２】
以下のA及びBからなる群より選択される、単離された核酸：
A）請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸；及び
B）A）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を保持するベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸が外来的に導入されている細胞。
【請求項５】
以下のa及びbのステップを含む、Ｍ期キナーゼの基質として機能するタンパク質の生産方法：
a)請求項４に記載の細胞を、前記核酸がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；及び
b)産生されたタンパク質を回収するステップ。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項７】
生体から分離された被験細胞内における、請求項１に記載のタンパク質の量を検出するステップを含んでなる、被験細胞の悪性度判定法。
【請求項８】
タンパク質量の検出が免疫学的染色法を利用して実施される、請求項７に記載の悪性度判定法。
【請求項９】
生体から分離された被験細胞内における、請求項２に記載の核酸の量を検出するステップを含んでなる、被験細胞の悪性度判定方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の抗体を含んでなる、被験細胞の悪性度判定用試薬。
【請求項１１】
請求項２に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含んでなる、被検細胞の悪性度判定用試薬。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の試薬と、使用説明書とを含んでなる、被験細胞の悪性度判定用キット。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現量の異常、又は配列番号１若しくは３の塩基配列を有する核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患に対して有効な化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１のタンパク質とＭ期キナーゼとの結合を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップ、
を含む方法。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現量の異常、又は配列番号１若しくは３の塩基配列を有する核酸の存在量の異常によって特徴づけられる疾患に対して有効な化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１のタンパク質の核酸メチル化活性を阻害する、被験化合物の能力の有無又はその程度を調べるステップ、
を含む方法。
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２００６−８１５４５（Ｐ２００６−８１５４５Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３８７２７（Ｐ２００５−２３８７２７）
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０３３２８１９３）株式会社ツーセル (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０３３２８１９３）株式会社ツーセル (24)
【Ｆターム（参考）】
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