ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するための分子およびその使用方法
ＣＣＲ２／ＭＣＰ−１関連疾患の治療およびＭＣＰ−１の単離のための分子及びそれを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な分子に関し、より具体的には、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患（例えば、炎症性疾患およびガンなど）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数年間にわたって、より多くの白血球走化性因子／活性化因子（ケモカイン）が記載された［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６１７〜６４８（１９９１）；ＳｃｈａｌｌおよびＢａｃｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：８６５〜８７３（１９９４）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５：９７−１−７９（１９９４）］。ケモカインは初期の炎症性メディエータ（例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αなど）に対する応答において様々な細胞型によって産生および分泌される。
【０００３】
ケモカインスーパーファミリーは、α−ケモカイン（ＣＸＣケモカインとしても知られている）およびβ−ケモカイン（ＣＣケモカインとしても知られている）の２つの大きな部類を含む。この分類は、アミノ酸配列における最初の２つのシステインが１つのアミノ酸によって隔てられる（ＣＸＣ）か、または、隣接する（ＣＣ）かに基づいている。α−ケモカイン部類には、例えば、ＩＬ−８、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、メラノーマ増殖刺激活性（ＭＧＳＡ／ｇｒｏまたはＧＲＯα）およびＥＮＡ−７８（それぞれが、主に好中球およびＴリンパ球に対する誘引作用および活性化作用の両方を有する）などのタンパク質が含まれる。β−ケモカイン部類のメンバーは他の血液細胞型（例えば、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球など）に影響を及ぼし［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６１７〜６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５：９７〜１７９（１９９４）；ＭｉｌｌｅｒおよびＫｒａｎｇｅｌ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：１７〜４６（１９９２）；Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：８８１〜１１８（１９９４）；Ｐｏｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７：６０４〜６１２（１９９６）］、例えば、単球走化性タンパク質１〜４（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４）、ＲＡＮＴＥＳおよびマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）などのタンパク質が含まれる。
【０００４】
ケモカインスーパーファミリーの第３のより小さい部類は膜結合ケモカインを含む。このクラスのメンバーはＣＸ３Ｃケモカインと称される［Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．、他、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：６４０〜６４４（１９９７）］。
【０００５】
ケモカインは、白血球に対する一連の前炎症性作用、例えば、走化性の開始、脱顆粒、脂質メディエータの合成、および、インテグリン活性化などを媒介することができる［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６１７〜６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５：９７〜１７９（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．およびＫｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：１７〜４６（１９９２）］。
【０００６】
これらのケモカインは、「ケモカイン受容体」と呼ばれるＧ−タンパク質結合型の７回膜貫通ドメインタンパク質からなるファミリーに属する特異的な細胞表面受容体に結合する［Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｍ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：５９３〜６３３（１９９４）］。その同族リガンドと結合したとき、ケモカイン受容体は会合した三量体Ｇタンパク質を介して細胞内シグナルを伝達し、これにより、様々な応答、特に、細胞内カルシウム濃度における迅速な増大、細胞形状における変化、細胞接着分子の発現の増大、脱顆粒、および、細胞遊走の促進を生じさせる。
【０００７】
ケモカインは、アレルギー性、炎症性および自己免疫性の障害および疾患（例えば、喘息、アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、膵炎、再狭窄、リウマチ様関節炎、糖尿病性腎症、肺線維症および移植片拒絶反応など）の重要なメディエータとして関係づけられている。
【０００８】
特に、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）は、その受容体のＣＣケモカイン受容体２（ＣＣＲ−２）に作用する一方で、様々な徴候において役割を果たしている。その受容体に結合したとき、ＭＣＰ−１は細胞内カルシウム濃度における迅速な増大を誘導し、これにより、細胞接着分子の発現の増大をもたらし、また、最終的には、細胞の脱顆粒および白血球遊走の促進をもたらす。
【０００９】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の重要性の立証が、遺伝子改変マウスを用いた実験によって示されている。ＭＣＰ−１の−／−型マウスは正常な数の白血球およびマクロファージを有したが、単球をいくつかの異なるタイプの抗原攻撃の後で炎症部位に動員することができなかった［Ｂａｏ Ｌｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８７、６０１］。同様に、ＣＣＲ−２の−／−型マウスは、様々な外因性薬剤による抗原攻撃を受けたとき、単球を動員すること、または、インターフェロンγを産生することができなかった；そのうえ、ＣＣＲ−２ヌルマウスの白血球はＭＣＰ−１に対する応答において遊走せず［Ｌａｎｄｉｎ Ｂｏｒｉｎｇ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９７、１００、２５５２］、これによってＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の特異性が明らかとなった。他の２つのグループにより独立して、同等な結果が、ＣＣＲ−２の−／−型マウスの異なる系統を用いて報告されている［Ｗｉｌｌｉａｍ Ａ．Ｋｕｚｉｅｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１２０５３、および、Ｔａｋａｏ Ｋｕｒｉｈａｒａ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１７５７］。ＭＣＰ−１の−／−型動物およびＣＣＲ−２の−／−型動物の生存能力および全般的に正常な健康状態は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の破壊が生理学的危機を誘導しないという点で注目すべきことである。まとめると、これらのデータは、ＭＣＰ−１の作用を遮断する分子は、様々な炎症性障害および自己免疫障害を治療することにおいて有用であることを示唆している。
【００１０】
ＭＣＰ−１はリウマチ様関節炎の患者においてアップレギュレーションされることが知られている［Ａｌｉｓａ Ｋｏｃｈ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９２、９０、７７２〜７７９］。さらに、いくつかの研究では、リウマチ様関節炎を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治療的価値が明らかにされている。ＭＣＰ−１をコードするＤＮＡワクチンは近年、ラットにおける慢性的なポリアジュバント誘発関節炎を改善することが示された［Ｓａｗｓａｎ Ｙｏｕｓｓｅｆ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０６、３６１］。同様に、炎症性疾患の症状が、コラーゲン誘発関節炎のラット［Ｈｉｒｏｏｍｉ Ｏｇａｔａ他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９７、１８２、１０６］または連鎖球菌細胞壁誘発関節炎のラット［Ｒａｌｐｈ Ｃ．Ｓｃｈｉｍｍｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、１４６６］に対するＭＣＰ−１についての抗体の直接的な投与により抑制され得る。おそらくは最も重要なことではあるが、ＭＣＰ−１のペプチドアンタゴニストであるＭＣＰ−１（９−７６）により、（投与時期に依存して）疾患の発症を防止すること、および疾患の症状を軽減することの両方が関節炎のＭＲＬ−１ｐｒマウスモデルにおいて示された［Ｊｉａｎｇ−Ｈｏｎｇ Ｇｏｎｇ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１３１］。
【００１１】
ＭＣＰ−１はまた、アテローム硬化性病変部においてアップレギュレーションされており、ＭＣＰ−１の循環レベルが疾患の進行において役割を果たすことが示されている［Ａｂｄｏｌｒｅｚａ Ｒｅｚａｉｅ−Ｍａｊｄ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００２、２２、１１９４〜１１９９］。ＭＣＰ−１は、マクロファージが多い動脈壁の免疫組織化学［Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：５２５２〜５２５６（１９９１）；Ｎｅｌｋｅｎ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、８８：１１２１〜１１２７（１９９１）］および抗ＭＣＰ−１抗体の検出［Ｔａｋｅｙａ他、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ、２４：５３４〜５３９（１９９３）］によって示されるように、アテローム硬化性領域内への単球の動員に関わっている。ＬＤＬ受容体／ＭＣＰ−１欠損マウスおよびａｐｏＢ遺伝子組換え／ＭＣＰ−１欠損マウスは、野生型ＭＣＰ−１系統と比較して、それらの大動脈の全域での著しく少ない脂肪沈着およびマクロファージ蓄積を示す［Ａｌｃａｍｉ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６０：６２４〜６３３（１９９８）；Ｇｏｓｌｉｎｇ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１０３：７７３〜７７８（１９９９）；Ｇｕ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、２：２７５〜２８１（１９９８）；Ｂｏｒｉｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３９４：８９４〜８９７（１９９８）］。
【００１２】
ＭＣＰ−１がヒトの多発性硬化症においてアップレギュレーションされることが知られており、また、インターフェロンβ−１βによる効果的な治療は末梢血単核細胞におけるＭＣＰ−１の発現を低下させることが示されており、これらは、ＭＣＰ−１が疾患の進行において役割を果たすことを示唆している［Ｃａｒｌａ Ｉａｒｌｏｒｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１２３、１７０〜１７９］。他の研究では、多発性硬化症を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値が明らかにされている；これらの研究のすべてが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（多発性硬化症についての従来の動物モデル）において明らかにされている。ＥＡＥを有する動物に対するＭＣＰ−１についての抗体の投与は疾患の再発を著しく減らした［Ｋ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、９２、９８］。さらに、２つのより最近の報告では、ＣＣＲ−２の−／−型マウスがＥＡＥに対して抵抗性があることが現在まで示されている［Ｂｒｉａｎ Ｔ．Ｆｉｆｅ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９２、８９９；Ｌｅｏｎｉｄ Ｉｚｉｋｓｏｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９２、１０７５］。
【００１３】
ＭＣＰ−１が、閉塞性細気管支炎症候群を肺移植後に発症する患者においてアップレギュレーションされることが知られている［Ｍａｒｔｉｎ Ｒｅｙｎａｕｄ−Ｇａｕｂｅｒｔ他、Ｊ．ｏｆ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００２、２１、７２１〜７３０；Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｐｅｒｉｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００１、１０８、５４７〜５５６］。閉塞性細気管支炎症候群のマウスモデルにおいて、ＭＣＰ−１に対する抗体の投与は気道閉塞の減衰をもたらした；同様に、ＣＣＲ２の−／−型マウスはこの同じモデルにおいて気道の閉塞に対して抵抗性があった［Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｐｅｒｉｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００１、１０８、５４７〜５５６］。これらのデータは、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２の拮抗作用が移植後の器官の拒絶を治療することにおいて有益であり得ることを示唆している。
【００１４】
他の研究では、喘息を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値が明らかにされている。オボアルブミンによる抗原攻撃を受けたマウスにおける中和抗体によるＭＣＰ−１の封鎖は、気管支の過剰応答および炎症における顕著な低下をもたらした［Ｊｏｓｅ−Ａｎｇｅｌ Ｇｏｎｚａｌｏ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８８、１５７］。マンソン住血吸虫の卵による抗原攻撃を受けたマウスにおけるアレルギー性の気道の炎症をＭＣＰ−１についての抗体の投与により軽減させることが可能であることが判明した［Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｗ．Ｌｕｋａｃｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、１５８、４３９８］。これと一致して、ＭＣＰ−１の−／−型マウスは、マンソン住血吸虫の卵による抗原攻撃に対する低下した応答を示した［Ｂａｏ Ｌｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８７、６０１］。
【００１５】
他の研究では、腎臓疾患を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値が明らかにされている。糸球体腎炎のマウスモデルにおけるＭＣＰ−１についての抗体の投与は糸球体半月形成およびＩ型コラーゲンの沈着における顕著な減少をもたらした［Ｃｌａｒｅ Ｍ．Ｌｌｏｙｄ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５、１３７１］。加えて、腎毒性血清腎炎が誘導されたＭＣＰ−１の−／−型マウスは、そのＭＣＰ−１の＋／＋型対応体よりも著しく少ない尿細管損傷を示した［Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｈ．Ｔｅｓｃｈ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０３、７３］。
【００１６】
１つの研究が、全身性エリテマトーデスを治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値を明らかにしている。ＭＣＰ−１の−／−型マウスのＭＲＬ−ＦＡＳ．ｓｕｐ．１ｐｒマウスとの交雑（後者は、ヒトの全身性エリテマトーデスと類似する致命的な自己免疫疾患を有する）は、野生型のＭＲＬ−ＦＡＳ．ｓｕｐ．１ｐｒマウスよりも少ない疾患および長い生存を有するマウスをもたらした［Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｈ．Ｔｅｓｃｈ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１９０、１８１３］。
【００１７】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用はまた、ＣＣＲ−２の−／−型マウスがデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎の影響から保護されたので、大腸炎の病理学にも関係している［Ｐｉｅｔｒｏ Ｇ．Ａｎｄｒｅｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６４、６３０３］。
【００１８】
１つの研究が、肺胞炎を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値を明らかにしている。ＩｇＡ免疫複合体肺傷害のラットが、ラットＭＣＰ−１（ＪＥ）に対して惹起された抗体により静脈内投与で治療されたとき、肺胞炎の症状が部分的に緩和された［Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．Ｊｏｎｅｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、１４９、２１４７］。
【００１９】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用はまた、ガンにも関係している。ヒトの乳ガン細胞を有する免疫不全マウスが抗ＭＣＰ−１抗体により治療されたとき、肺微小転移物の阻害および生存における増大が観測された［Ｒｏｓａｌｂａ Ｓａｌｃｅｄｏ他、Ｂｌｏｏｄ、２０００、９６、３４〜４０］。特に、ＭＣＰ−１が、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００４／０８０２７３（本発明者ら）に詳しく記載されるように、前立腺ガンにおいて適応される。
【００２０】
再狭窄は、ＭＣＰ−１が関与するさらにもう１つの適応である。ＣＣＲ２が欠損したマウスは、大腿動脈の傷害の後、（野生型同腹子に対して）血管内膜面積および血管内膜／中膜比における減少を示した［Ｍｅｒｃｅ Ｒｏｑｕｅ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２００２、２２、５５４〜５５９］。
【００２１】
他の研究では、ＭＣＰ−１が、上記で述べられていない様々な疾患状態において過剰発現するという証拠が示されている。これらの報告では、ＭＣＰ−１アンタゴニストがそのような疾患のための有用な治療剤であり得るという相関的な証拠が提供される。ＭＣＰ−１が、炎症性腸疾患の患者の腸上皮細胞および腸粘膜において過剰発現することが示されている［Ｈ．Ｃ．Ｒｅｉｎｅｃｋｅｒ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９５、１０８、４０；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｇｒｉｍｍ他、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、５９、８０４］。２つの報告において、脳外傷が誘導されたラットにおけるＭＣＰ−１の過剰発現を記載する［Ｊ．Ｓ．Ｋｉｎｇ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、５６、１２７；Ｊｏａｎ Ｗ．Ｂｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、３０１７］。ＭＣＰ−１はまた、齧歯類の心臓同種移植片において過剰発現することが示されており、これは、移植片の動脈硬化の病理発生におけるＭＣＰ−１の役割を示唆している［Ｍａｒｙ Ｅ．Ｒｕｓｓｅｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、６０８６］。ＭＣＰ−１の過剰発現は特発性肺線維症患者の肺の内皮細胞において認められている［Ｈａｒｒｙ Ｎ．Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５３７１］。同様に、ＭＣＰ−１の過剰発現が乾癬患者由来の皮膚において認められている［Ｍ．Ｄｅｌｅｕｒａｎ他、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９６、１３、２２８；Ｒ．Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９３、１０１、１２７］。最後に、最近の報告では、ＭＣＰ−１がＨＩＶ−１関連認知症の患者の脳および脳脊髄液において過剰発現することが示されている［Ａｌｆｒｅｄｏ Ｇａｒｚｉｎｏ−Ｄｅｍｏ、国際特許出願公開ＷＯ９９／４６９９１］。
【００２２】
今日までに報告されたほとんどのケモカインアンタゴニストは、特定のケモカインに対する中和抗体、または、小分子アンタゴニストのいずれかである［Ｈｏｗａｒｄ他、Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４：４６〜５１（１９９６）］。
【００２３】
抗ＭＣＰ−１抗体は、上記で記載されたように数多くのマウス疾患モデルにおいて効果的に使用されている。しかしながら、ケモカインの機能を中和するために抗体を使用することに伴う大きな問題は、そのような抗体は慢性的なヒト疾患における使用の前にヒト化されなければならないことである。さらに、多数のケモカインが１つの受容体と結合し、その受容体を活性化し得ることは、病理学的状態を完全に阻止または防止するために、多抗体法の開発または交差反応性抗体の使用を余儀なくしている。
【００２４】
ケモカイン受容体機能のいくつかの小分子アンタゴニストが科学文献および特許文献に報告されている［Ｗｈｉｔｅ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：１００９５〜１００９８（１９９８）；Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：１５６８７〜１５６９２（１９９８）；Ｂｒｉｇｈｔ他、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、８：７７１〜７７４（１９９８）；Ｌａｐｉｅｒｒｅ、２６ｔｈ Ｎａｔｌ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、６月１４日〜１８日、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ（Ｖａ．）、米国（１９９８）；Ｆｏｒｂｅｓ他、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１０：１８０３〜１８０６４（２０００）；Ｋａｔｏ他、国際特許出願公開ＷＯ９７／２４３２５；Ｓｈｉｏｔａ他、国際特許出願公開ＷＯ９７／４４３２９；Ｎａｙａ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／０４５５４；Ｔａｋｅｄａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＪＰ０９−５５５７２（１９９８）；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／０２１５１；Ｈａｇｍａｎｎ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／２７８１５；Ｃｏｎｎｏｒ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／０６７０３；Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ他、米国特許第６２８８１０３号］。しかしながら、これらのケモカイン受容体アンタゴニストの特異性は、多様または冗長的なケモカイン発現プロフィルによって特徴づけられる炎症性障害がこれらの薬剤による治療に対して比較的より不応性であることを示唆している。
【００２５】
従って、上記の制限を有さない、ＣＣＲ−２関連疾患を治療するための組成物およびその使用方法が必要であることが広く認識されており、また、そのような組成物および方法を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２６】
本発明の１つの態様によれば、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）異種アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が非免疫原性である分子が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子が提供される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様によれば、それぞれがＭＣＰ−１と結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができる分子が提供される。
【００２９】
本発明のなおさらに別の態様によれば、ＭＣＰ−１と結合することができる、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列に結合したタグを含む分子が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、配列番号１４または配列番号１５に示されるような分子が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００３２】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含み、非免疫原性である医薬組成物が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、その必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、本発明の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための本発明の分子の使用が提供される。
【００３５】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）ＭＣＰ−１および請求項４に記載される分子が複合体を形成するように、生物学的サンプルを請求項４に記載される分子と接触させること；および（ｂ）複合体を単離し、それにより、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離することを含む。
【００３６】
本発明のなおさらなる態様によれば、その必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む。
【００３７】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の使用が提供される。
【００３８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、異種アミノ酸配列は免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患は、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化からなる群から選択される。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、タグはエピトープタグである。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の分子は固体担体に結合される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の分子は非タンパク質性成分に結合される。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非タンパク質性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群から選択される。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは非経口投与のために配合される。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは実質的に非免疫原性である。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含む。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは炭水化物を含む。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはミクロスフェアを含む。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはリポソームを含む。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはポリマーのミクロスフェアを含む。
【００５２】
本発明は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するための新規な分子およびその使用方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００５３】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似のまたは等価な方法と材料は本発明を実施または試験するのに使用できるが、好適な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法および実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００５４】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ−１ｂは、前立腺ガン患者がＭＣＰ−１に対する非常に著しい自己抗体力価を選択的に発達させていることを示すグラフである。図１ａ−２３名の前立腺ガン患者、２１名の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）患者、および、１０名のコントロール被験者（すべてが年齢一致の男性である）からのヒト血清を、下記の１３のケモカインに対する自己抗体の生じ得る出現についてモニターした：ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ１９９１６８）、ＭＩＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ１９６８６）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８４）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ２８１３）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００１５６５）、ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＣ０２０６９８）、ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ−１９、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＣ０２７９６８）、リンホタクチン（ＸＣＬ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９９５）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２４１６）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００６２７３）およびＭＣＰ−１（ＣＣＬ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８２）。著しい抗体力価（ｐ＜０．０１）が上記ケモカインの１つだけ（ＭＣＰ−１）に対して大多数の前立腺ガン患者において観測された。図１ｂ−図１ａで記載された臨床サンプル（上記）のそれぞれにおけるＭＣＰ−１に対するＬｏｇ２Ａｂ力価。約８２％の前立腺ガン患者（１９／２３）および約４．７％（１／２１）のみのＢＰＨ患者がＭＣＰ−１に対する著しい応答（１０を超えるｌｏｇ２Ａｂ力価）を示した。
図２は、本発明のヒトＩｇ−ＣＣＲ２ペプチド（Ｉｇ−Ｅ３）をコードする発現構築物の作製を示す概略的例示である。
図３は、ＣＣＲ２のＥ３ドメインがＭＣＰ−１に特異的に結合することを示す棒グラフである。
図４は、ヒトＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧがＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣアクセション番号ＴＩＢ−２０２）のＭＣＰ−１誘発遊走を阻害することができることを示す棒グラフである。インビトロトランスウエル遊走アッセイを行った。簡単に記載すると、ＴＨＰ−１細胞（１０６個／ウエル）をトランスウエルの上部チャンバーに加え、ＣＣＬ２（組換えヒトＭＣＰ−１（ＲＨＭＣＰ−１）；（２０ｎｇ／ｍｌ））を、図に示されるように異なる濃度のＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧもまた補充された下部ウエルに加えた。３７℃での２時間のインキュベーションの後、遊走しているＴＨＰ−１細胞をＦＡＣＳによって計数した。結果が三連の平均±ＳＥとして示される。
図５ａ−５ｄは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフである。図５ａ〜図５ｂは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの投与がＰＣ−３細胞の投与と同時に開始されたとき（図５ａ）、または、ＰＣ−３細胞の投与後の１８日で開始されたとき（図５ｂ）のいずれでも、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧは腫瘍の成長を時間とともに減少させることができることを示すグラフである。ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与マウス（青色で示される）、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧが投与されたマウス（緑色で示される）、または、ＰＢＳ投与マウス（褐色または黄色で示される）からの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）を、示されるような様々な時間で繰り返して測定した。図５ｃは、ＰＣ３細胞投与後８日で注射されたＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの抗腫瘍活性を示すグラフである。ＰＣ−３細胞がＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧと一緒に投与されたマウス（青色で示される）、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧと一緒に投与されたマウス（緑色で示される）、または、ＰＢＳと一緒に投与されたマウス（ピンク色で示される）からの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）を、示されるような様々な時間で繰り返して測定した。これらの結果は、図５ａ〜図５ｂに示されるＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの防止的および治療的な活性を裏付けている。図５ｄは、示されるようなＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるルシフェラーゼ発現ＰＣ−３細胞の骨転移および肺転移の阻害を、コントロール細胞に対する比較とともに示す棒グラフである。
図６ａ−ｆは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるＣＣＬ−２の遮断により、ＶＥＧＦ産生が腫瘍部位において完全に抑制されることを示す写真である（図６ａ〜図６ｆ）。ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療（図６ａ、図６ｄ）、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧによる治療（図６ｂ、図６ｅ）、または、ＰＢＳによる治療（コントロール細胞；図６ｃ、図６ｆ）が示される。動物を屠殺し、腫瘍／組織を取り出した。組織を洗浄し、固定処理し、透過処理し、ＶＥＧＦを、共焦点顕微鏡観察を使用して免疫染色によって検出した。顕微鏡写真はＸ１０の倍率（図６ａ〜図６ｃ）またはＸ４０の倍率（図６ｄ〜図６ｆ）のいずれかで示される。
図７は、光学密度によって決定されたときの、ＣＣＬ２処理されたＰＣ３細胞の細胞遊走を示す棒グラフである。ＰＣ３細胞を、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ２に対する抗体と一緒でのＣＣＬ２（ＭＣＰ−１＋抗ＭＣＰ−１）、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧと一緒でのＣＣＬ２（ＭＣＰ−１＋ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ）、および、リガンド処理されていないコントロール細胞のいずれかにより処理した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２関連疾患（例えば、ガンなど）を治療するための分子、該分子を含む組成物、および、該分子を使用する方法に関する。
【００５６】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００５７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００５８】
単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）（これはＣＣＬ２とも呼ばれる）は単球および記憶Ｔ細胞を特異的に引き寄せる。その発現が、細胞遊走によって特徴づけられる様々な疾患において生じており、また、ガン、心臓血管疾患および炎症性疾患におけるその本質的役割についての実質的な生物学的証拠および遺伝学的証拠が存在する。精力的なスクリーニングにもかかわらず、今までのところ、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の受容体（ＣＣＲ２）のアンタゴニストは１つも見出されていない。
【００５９】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＣＣＲ２に対するＭＣＰ−１の結合がＣＣＲ２の３番目の細胞外領域（Ｅ３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６３９．１のアミノ酸座標２７３〜２９２）によって排他的に媒介されることを発見した。これは、ＣＣＲ２に対するＭＣＰ−１結合がＣＣＲ２のＮ末端領域（Ｎ−ｔｅｒ）および３番目の細胞外ループ（Ｅ３）の両方に依存することを示したＤａｔｔａ ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ［Ｄａｔｔａ−ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ（２００４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３：１４６０２〜１１］による以前の報告とは際立って対照的である。これらの結果は、ＣＣＲ２のＥ３領域を含むペプチドが、本質的にはＭＣＰ−１を封鎖することによって阻害剤として使用され得ることを示唆している。
【００６０】
従って、本発明では、ＣＣＲ２のＥ３ドメインを含み、かつ、好ましくは、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さない任意のＣＣＲ２アミノ酸配列の使用、および／または、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患（例えば、ガンなど）を治療するための、そのような配列を含む組成物が想定される。重要なことには、本発明の組成物は、最大の治癒的効力を達成するために非免疫原性である。従って、本発明では、例えば、ＣＣＲ２配列を、ＣＣＲ２配列がタンパク質性成分（例えば、異種アミノ酸配列）または非タンパク質性成分（例えば、ＰＥＧ）（これらのそれぞれが循環における組成物の半減期を延ばすことができる）に結合される複合体で含むことが想定される。
【００６１】
従って、本発明の１つの態様によれば、ＭＣＰ−１と結合することができる、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを好ましくは有さないＣＣＲ２アミノ酸配列（例えば、翻訳されたＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４７／ＮＰ＿０００６３８のアミノ酸座標１〜４１、または、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４８／ＮＰ＿０００６３９の対応するアミノ酸座標）にコンジュゲート化された少なくとも１つの異種アミノ酸配列を含む非免疫原性分子が提供される。
【００６２】
下記の実施例の節において示されるように、新しく発見されたＭＣＰ−１結合ドメインを含む本発明のこの態様のキメラ分子（Ｅ３−ＩｇＧ）は、腫瘍細胞投与後１８日後であっても腫瘍の発達を阻害した。驚くべきことに、この同じキメラ分子は骨組織および肺組織への腫瘍転移を一層劇的に阻害した。まとめると、本発明の知見は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患（例えば、ガンなど）の治療における本発明の分子の使用を裏付けている。
【００６３】
本発明のこの態様のキメラ分子は、ＣＣＲ２のＥ３領域に向けられた抗体を産生させるためのキメラなＥ３（すなわち、ＫＬＨ−Ｅ３）の使用、それにより、ＣＣＲ２受容体をリガンド結合から阻害することを教示する国際特許出願公開ＷＯ９７／３１９４９に記載されるキメラ分子とは顕著に異なることに留意しなければならない。本発明の非免疫原性ペプチドは、ＣＣＲ２のリガンド（ＭＣＰ−１）を標的化し、それにより、リガンドを受容体結合から阻害するために使用される。従って、本発明の分子は非常に優れた治癒的抑制および特異性を可能にし、本発明の分子は容易に合成および投与することができ、また、大きい生物利用能によって特徴づけられる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、ＭＣＰ−１はＣＣＬ２と交換可能に示され、哺乳動物（例えば、ヒト）のＭＣＰ−１タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００２９８２または同ＮＰ＿００２９７３で示されるタンパク質など）を示す。
【００６５】
本明細書中で使用される用語「非免疫原性」は、そのような物質が投与された対象において免疫応答を実質的に生じさせることができない物質を示す。例えば、ヒトにおいて非免疫原性であるとは、本発明のこの態様のキメラ分子をヒトの適切な組織と接触させたとき、キメラ分子に対する感受性または抵抗性の何らかの状態が、適切な潜伏期間（例えば、８日〜１４日）の後でのキメラ分子の２回目の投与のときにはっきり現れないことを意味する。
【００６６】
本明細書中で使用される「ＣＣＲ２アミノ酸配列」は、ＭＣＰ−１についての親和性結合を有する、哺乳動物（例えば、ヒト）のケモカインＣ−Ｃ受容体２タンパク質のペプチド部分を示す。１つだけのＣＣＲ２アミノ酸配列が本発明の分子に含まれ得ること、しかし、それぞれがＣＣＲ２と（好ましくは、大きい親和性で）結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ２アミノ酸配列（例えば、配列番号９）を含むことが好ましい場合があることに留意しなければならない。増大した結合活性のために、これらのポリペプチドはＭＣＰ−１活性の強力な阻害剤として使用することができ、また、より少ない投薬量を投与することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される「親和性結合」は、少なくとも１０−６Ｍの最小ＫＤ値を示す。
【００６８】
ＣＣＲ２タンパク質の例がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４７および同ＮＰ＿０００６３９．１において提供される。述べられたように、本発明のこの態様のＣＣＲ２は、好ましくはＮ末端ドメインを有していないが、Ｅ３ドメイン（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４７のアミノ酸座標２７３〜２９２、配列番号２）またはその模倣体を保持する。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「模倣体」は、ペプチドに関連して作製されるとき、ＭＣＰ−１との相互作用において本発明のペプチドに対する代用物として役立つ分子構造体を示す［ペプチド模倣体の総説については、Ｍｏｒｇａｎ他（１９８９）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２４：２４３〜２５２］。
【００７０】
ペプチド模倣体は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸および／またはペプチド結合を含有してもしなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造的特徴および機能的特徴を保持する合成された構造体（既知および未だ知られていないもの）を含む。模倣体を作製するために利用することができるアミノ酸のタイプが本明細書中下記においてさらに記載される。用語「ペプチド模倣体」にはまた、Ｎ置換アミノ酸のペプチドまたはオリゴマーであるペプトイドおよびオリゴペプトイドが含まれる［Ｓｉｍｏｎ（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７〜９３７１］。ペプチド模倣体としてさらに含まれるものがペプチドライブラリーであり、これは、所与のアミノ酸長であるように設計され、かつ、それに対応するアミノ酸のすべての考えられる配列を表すペプチドの集団である。ペプチド模倣体を製造するための方法が本明細書中下記に記載される。
【００７１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、ＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列を含み、配列番号１によって示される核酸配列によってコードされ得る。
【００７２】
本発明のこの態様の別の好ましい実施形態によれば、本発明のこの態様の分子は配列番号１４または配列番号１５に示される通りである。
【００７３】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、上で言及されたような、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細は本明細書中下記に示される。
【００７４】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００７５】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００７６】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００７７】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００７８】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００７９】
下記の表１および表２には、本発明で使用される天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば合成アミノ酸、表２）が示される。
【００８０】
本発明のペプチドは、好ましくは、ペプチドが可溶性形態であることを要求する治癒剤または診断剤において利用されるので、本発明のペプチドは、好ましくは、ペプチド溶解性をそれらのヒドロキシル含有側鎖のために増大させることができるセリンおよびトレオニン（これらに限定されない）をはじめとする、１つ以上の非天然型または天然型の極性アミノ酸を含む。
【００８１】
本発明のペプチドは好ましくは線状形態で利用されるが、環化がペプチドの特性を大きく妨害しない場合には、ペプチドの環状形態もまた利用され得ることが理解される。
【００８２】
本明細書中上記で記載されるようなペプチド模倣体の作製は、例えば、ディスプレー技術を含めて、様々な方法を使用して達成することができる。
【００８３】
従って、本発明では、ＣＣＲ２のＥ３のポリペプチド配列（例えば、配列番号２）に由来する少なくとも２個の連続するアミノ酸、少なくとも３個の連続するアミノ酸、少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも７個の連続するアミノ酸、少なくとも１１個の連続するアミノ酸、少なくとも１５個の連続するアミノ酸をそれぞれが呈示する多数のディスプレービヒクル（例えば、ファージ、ウイルスまたは細菌など）を含むディスプレーライブラリーが意図される。
【００８４】
そのようなファージライブラリーを構築する様々な方法が当該技術分野では広く知られている。そのような方法が、例えば、Ｙｏｕｎｇ ＡＣ他、「クリプトコッカス・ネオフォルマンスに対する多糖結合抗体およびファージディスプレーライブラリー由来ペプチドとのその複合体の三次元構造：ペプチドミモトープを特定するための密接な関係」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９７（１２月１２日）、２７４（４）：６２２〜３４；Ｇｉｅｂｅｌ ＬＢ他、「環状ペプチドファージライブラリーのスクリーニングによるストレプトアビジンと大きい親和性で結合するリガンドの特定」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５（１１月２８日）、３４（４７）：１５４３０〜５；Ｄａｖｉｅｓ ＥＬ他、「ニワトリの免疫グロブリン遺伝子に由来するライブラリーを使用する特異的なファージディスプレー抗体の選択」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５（１０月１２日）、１８６（ｌ）：１２５〜３５；Ｊｏｎｅｓ Ｃ ＲＴ他、「分子認識およびバイオセパレーションにおける現在の傾向」、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ、１９９５（７月１４日）、７０７（１）：３〜２２；Ｄｅｎｇ ＳＪ他、「合成遺伝子ライブラリーに由来する改善された炭水化物結合性単鎖抗体を選択するための基礎」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９５（５月２３日）、９２（１１）：４９９２〜６；Ｄｅｎｇ ＳＪ他、「ファージディスプレーによる改善された炭水化物結合性の抗体単鎖可変フラグメントの選択」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９４（４月１日）、２６９（１３）：９５３３〜８に記載される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００８５】
ペプチド模倣体はまた、コンピュータを利用した生物学を使用して発見することができる。三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラム、例えば、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡ．他、１９９１、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）、ならびに、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＲＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２４、９４６において総説される）などを、ＭＣＰ−１と、予想されるペプチド模倣体との間での相互作用をモデル化し、それにより、特異的なＭＣＰ−１領域に結合する最大の確率を示すペプチドを特定するために利用することができる。タンパク質−ペプチド相互作用のコンピュータを利用したモデル化が合理的薬物設計において使用され、成功している。さらに詳しくは、Ｌａｍ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０；Ｗｌｏｄａｗｅｒ他、１９９３、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２、５４３；Ａｐｐｅｌｔ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、１、２３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、１、１０９；およびＭａｕｒｏ ＭＪ．他、２００２、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２０、３２５〜３４を参照のこと。
【００８６】
述べられたように、本発明のこの態様のキメラ分子は異種アミノ酸配列を含む。
【００８７】
本明細書中で使用される表現「異種アミノ酸配列」は、ＣＣＲ２アミノ酸配列の一部分を形成しない非免疫原性のアミノ酸配列を示す。この配列は、好ましくは、溶解性を本発明のこの態様のキメラ分子にもたらし、これにより、好ましくは、血清中におけるキメラ分子の半減期を増大させる。
【００８８】
異種アミノ酸配列は一般には、本発明のＣＣＲ２ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に局在化される。
【００８９】
述べられたように、少なくとも１つの異種アミノ酸配列を本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化することができる。例えば、少なくとも１つのＣＣＲ２アミノ酸配列を、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：１０２７〜１０３７などによって記載されるように、２つの異種配列の間に埋め込むことができる。異種アミノ酸配列はペプチド結合または非ペプチド結合のいずれによってもＣＣＲ２アミノ酸配列に結合することができる。異種アミノ酸配列に対するＣＣＲ２アミノ酸配列の結合は、直接的な共有結合性の結合（ペプチド結合または置換されたペプチド結合）によって、または、例えば、官能基を有するリンカーの使用などによる間接的な結合によって達成することができる。官能基には、限定されないが、遊離カルボン酸基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、遊離アミノ基（ＮＨ２）、エステル基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、ハロゲン化アシル基（（Ｃ（＝Ｏ）Ａ、式中、Ａは、フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージドである）、ハロゲン化物（フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージド）、ヒドロキシル基（ＯＨ）、チオール基（ＳＨ）、ニトリル基（Ｃ≡Ｎ）、遊離Ｃ−カルバミン酸基（ＮＲ”−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれは独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）が含まれる。
【００９０】
本発明のこの態様に従って使用することができる異種アミノ酸配列の一例が免疫グロブリンの配列であり、例えば、免疫グロブリン重鎖ドメインのヒンジ領域およびＦｃ領域などである（米国特許第６７７７１９６号を参照のこと）。本発明のこの態様のキメラ体における免疫グロブリン成分は、本明細書中下記でさらに議論されるように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇ４のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。
【００９１】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結された受容体配列から構築された様々なキメラ体（イムノアドヘシン）が当該技術分野で知られている。文献に報告されるイムノアドヘシンには、Ｔ細胞受容体の融合体［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：２９３６〜２９４０（１９８７）］、ＣＤ４の融合体［Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５〜５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：６８〜７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ、９：３４７〜３５３（１９９０）；Ｂｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：６６７〜６７０（１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）の融合体［（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１０：２２２１〜２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：１６４〜１６７（１９９１）］；ＣＤ４４の融合体［Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３〜１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８およびＢ７の融合体（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３：７２１〜７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４の融合体［Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：５６１〜５６９（１９９１）］；ＣＤ２２の融合体［Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ、６６：１１３３〜１１４４（１９９１）］；ＴＮＦ受容体の融合体［Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：１４８３〜１４８９（１９９１）］；ＮＰ受容体の融合体［Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２３０６０〜２３０６７（１９９１）］；および、ＩｇＥ受容体αの融合体［Ｒｉｄｇｗａｙ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１ １５：ａｂｓｔｒ、１４４８（１９９１）］が含まれる。
【００９２】
典型的には、そのような融合体において、キメラ分子は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。融合体はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対して、あるいは、重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域のすぐＮ末端側に対して作製することができる。
【００９３】
異種配列とＣＣＲ２アミノ酸配列との間での融合（コンジュゲート化）が行われる正確な部位は重要でない。具体的な部位が当該技術分野では広く知られており、そのような部位を、本発明のこの態様のキメラ分子の生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択することができる（下記の実施例の節の実施例３を参照のこと）。
【００９４】
重鎖の定常領域全体を本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化することが可能であり得るが、より短い配列を融合することが好ましい。例えば、重鎖定常領域の最初の残基が１１４であることを考えると、パパイン切断部位（これは化学的にはＩｇＧのＦｃを規定する；残基２１６）、または、他の免疫グロブリンの類似する部位の直ぐ上流側のヒンジ領域において始まる配列が融合体において使用される。特に好ましい実施形態において、ＣＣＲ２アミノ酸配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３の重鎖のヒンジ領域ならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに融合される（米国特許第６７７７１９６号を参照のこと）。融合が行われる正確な部位は重要でなく、最適な部位を日常的な実験によって決定することができる。
【００９５】
述べられたように、本発明のこの態様のキメラ分子の構築において使用される免疫グロブリン配列はＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖定常ドメインに由来し得る。ヒトのＩｇＧ１免疫グロブリン配列およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用することの大きな利点は、ＩｇＧ１が固定化プロテインＡにおいて効率的に精製できることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製では、著しく好都合な媒体ではないが、プロテインＧが要求される。しかしながら、免疫グロブリンの他の構造的性質および機能的性質を、具体的なキメラ構築物のためのＩｇＧ融合パートナーを選ぶときには考慮しなければならない。例えば、ＩｇＧ３のヒンジはより長く、より柔軟であり、従って、ＩｇＧ３のヒンジは、ＩｇＧ１に融合されたときには正しく折り畳まれ得ないか、または、正しく機能しないことがあるより大きいＣＣＲ２アミノ酸配列を受け入れることができる。別の検討事項は価数である場合がある：ＩｇＧは二価のホモ二量体であり、これに対して、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体構造または五量体構造をそれぞれ生じさせ得る。本発明のこの態様のキメラ分子の免疫グロブリン部分を選択することにおける他の検討事項が米国特許第６７７７１９６号に記載される。
【００９６】
従って、本発明のこの態様のキメラ分子は、上記で記載されたように、異種アミノ酸配列を含むことができる。
【００９７】
加えて、または、代替として、本明細書中上記で述べられたように、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列（これはＭＣＰ−１と結合することができる）は非タンパク質性成分に結合させることができ、そのような分子は対象において特定の非免疫原性である。そのような分子は非常に安定であり（おそらくは非タンパク質性成分によってもたらされる立体的障害のためにインビボでのタンパク質分解活性に対して抵抗性であり）、また、本明細書中下記においてさらに記載されるように、安価であり、かつ、非常に効率的である一般的な固相合成法を使用して製造することができる。しかしながら、組換え技術を依然として使用することができ、従って、組換えペプチド生成物はインビトロ修飾（例えば、本明細書中下記においてさらに記載されるようなＰＥＧ化）に供されることが理解される。
【００９８】
述べられたように、ＣＣＲ２アミノ酸配列は非タンパク質性成分に結合される。本明細書中で使用される表現「非タンパク質性成分」は、上記のＣＣＲ２アミノ酸配列に結合される、（ペプチド結合した）アミノ酸を含まない分子を示す。現時点で好ましい実施形態によれば、本発明のこの態様の非タンパク質性成分はポリマーまたはコポリマー（合成または天然）である。本発明の非タンパク質性成分の限定されない例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ジビニルエーテルおよびマレイン酸無水物のコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ；例えば、Ｋａｎｅｄａ Ｙ他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２３９：１６０〜５を参照のこと）、および、ポリ（スチレンｃｏマレイン酸無水物）（ＳＭＡ；例えば、Ｍｕ Ｙ他、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、２５５：７５〜９を参照のこと）が含まれる。
【００９９】
そのような非タンパク質性成分のバイオコンジュゲート化は、その生物学的活性を保持し、かつ、その半減期を延ばしながら、安定性（例えば、プロテアーゼ活性に対して）および／または溶解性（例えば、生物学的流体（例えば、血液、消化液など）において）を有するＣＣＲ２アミノ酸配列をもたらす。バイオコンジュゲート化は、短い半減期および血液からの迅速なクリアランスを示す治癒的タンパク質の場合には特に好都合である。バイオコンジュゲート化されたタンパク質の血漿中の増大した半減期は、タンパク質コンジュゲートの増大したサイズ（これにより、その腎糸球体ろ過が制限される）およびポリマーの立体的障害による低下したタンパク質分解から生じている。一般には、ペプチドあたりの結合したポリマー鎖が多くなるほど、半減期の延長が大きくなる。しかしながら、様々な対策が、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列の特異的な活性（すなわち、ＭＣＰ−１結合）を低下させないために取られる。
【０１００】
ＰＥＧによるＣＣＲ２アミノ酸配列のバイオコンジュゲート化（すなわち、ＰＥＧ化）を、ＰＥＧ誘導体を使用して、例えば、ＰＥＧカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、モノメトキシＰＥＧ２−ＮＨＳ、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボナート誘導体、ＰＥＧのグリシジルエーテル、ＰＥＧのｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＰＥＧ−ＮＰＣ、例えば、メトキシＰＥＧ−ＮＰＣなど）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、カルボニルジイミダゾール活性化ＰＥＧ、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−マレイミドなどを使用して達成することができる。そのようなＰＥＧ誘導体が様々な分子量で市販されている［例えば、カタログ（ポリエチレングリコールおよび誘導体、２０００）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｌｌｅ、Ａｌａ．）を参照のこと］。所望であれば、上記誘導体の多くがモノ官能性のモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）形態で入手可能である。一般には、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列に付加されるＰＥＧは、分子量（ＭＷ）が数百ダルトン〜約１００ｋＤａの範囲でなければならない（例えば、３ｋＤａ〜３０ｋＤａ）。より小さいＭＷのＰＥＧを使用することができるが、より低分量のＰＥＧはＰＥＧ化ペプチドの収率のいくらかの喪失をもたらし得る。より小さいＭＷのＰＥＧについて得ることができる純度と同じくらい高い純度のより大きいＭＷのＰＥＧを得ることは困難である場合があるので、より大きいＰＥＧ分子の純度にも気をつけなければならない。少なくとも８５％の純度のＰＥＧ、より好ましくは、少なくとも９０％の純度、９５％の純度またはそれ以上の純度のＰＥＧを使用することが好ましい。分子のＰＥＧ化が、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９６））において第１５章に、また、Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、「ポリエチレングリコールのスクシンイミジルカルボナート」（ＤｕｎｎおよびＯｔｔｅｎｂｒｉｔｅ編、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９９１））においてさらに記載される。
【０１０１】
好都合には、ＰＥＧは、コンジュゲートの活性（すなわち、ＭＣＰ−１結合）が保持される限り、部位特異的変異誘発によってＣＣＲ２アミノ酸配列における選ばれた位置に結合させることができる。例えば、配列番号１に示されるようなＣＣＲ２アミノ酸配列の５位におけるシステイン残基がＰＥＧ化のために標的であり得る。加えて、または、代替として、他のシステイン残基をＣＣＲ２アミノ酸配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）付加することができ、それにより、ＰＥＧ化のために標的として役立たせることができる。コンピュータ分析を、活性を損なうことを伴わない変異誘発のための好ましい位置を選択するために行うことができる。
【０１０２】
活性化ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＶＳ）、ＰＥＧ−アクリラート（ＡＣ）、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドなど）の様々なコンジュゲート化化学を用いることができる。活性化ＰＥＧ分子を調製する様々な方法が当該技術分野では知られている。例えば、ＰＥＧ−ＶＳは、ＰＥＧ−ＯＨのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液をＮａＨと反応し、次いで、ジビニルスルホンと反応することによってアルゴン下で調製することができる（モル比；ＯＨ １：ＮａＨ ５：ジビニルスルホン ５０、０．２グラムＰＥＧ／ｍＬ（ＤＣＭ））。ＰＥＧ−ＡＣが、ＰＥＧ―ＯＨのＤＣＭ溶液をアクリロイルクロリドおよびトリエチルアミンと反応することによってアルゴン下で作製される（モル比；ＯＨ １：アクリロイルクロリド １．５：トリエチルアミン ２、０．２グラムＰＥＧ／ｍＬ（ＤＣＭ）で）。そのような化学基を、線状化された２アームＰＥＧ分子、４アームＰＥＧ分子または８アームＰＥＧ分子に結合することができる。
【０１０３】
システイン残基へのコンジュゲート化は、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列がＰＥＧ化され得る１つの好都合な方法ではあるが、他の残基もまた、所望であれば、使用することができる。例えば、無水酢酸を、ＣＯＯＨ基、Ｓ−−Ｓ基または−−ＳＣＨ３基とではなく、ＮＨ２基およびＳＨ基と反応させるために使用することができ、一方、過酸化水素を、ＮＨ２基とではなく、ＳＨ基および−−ＳＣＨ３基と反応させるために使用することができる。反応を、十分に確立された反応性を利用する化学反応を用いて、ペプチドにおける所望される残基に対するコンジュゲート化のために適切である条件のもとで行うことができる。
【０１０４】
ＰＶＰとの本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列のバイオコンジュゲート化のために、末端ＣＯＯＨを有するＰＶＰが、ラジカル開始剤としての４，４’−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）および連鎖移動剤としての３−メルカプトプロピオン酸の助けをかりたジメチルホルアミド中でのラジカル重合によってＮ−ビニル−２−ピロリドンから合成される。平均分子量Ｍｒが６０００である得られたＰＶＰを高速液体クロマトグラフィーによって分離および精製することができ、合成ＰＶＰの末端ＣＯＯＨがＮ−ヒドロキシスクシンイミド／ジシクロヘキシルカルボジイミド法によって活性化される。ＣＣＲ２アミノ酸配列が６０倍モル過剰の活性化ＰＶＰと反応させられ、反応がアミノカプロン酸（活性化ＰＶＰに対して５倍モル過剰）により停止される（これは本質的には、Ｈａｒｕｈｉｋｏ Ｋａｍａｄａ他、２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０：６４１６〜６４２０（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される通りである）。
【０１０５】
得られるコンジュゲート化されたＣＣＲ２分子（例えば、ＰＥＧ化ＣＣＲ２またはＰＶＰ−コンジュゲート化ＣＣＲ２）は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、分離、精製および定量される。加えて、本発明のこの態様の精製されたコンジュゲート化分子は、本質的には他のケモカインについて記載されるように［例えば、ＭＩＰ−１α、例えば、Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ Ｊ、１９９８（上掲）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）を参照のこと］、例えば、ＭＣＰ−１のその受容体（例えば、ＣＣＲ２）に対する結合特異性が本発明のＣＣＲ２コンジュゲートの存在下または非存在下で試験されるインビトロアッセイを使用してさらに定量することができる。
【０１０６】
本発明のこの態様の分子は、例えば、様々な標準的な固相技術を使用することなどによって生化学的に合成することができる。これらの方法には、完全固相合成、部分固相合成法、フラグメント縮合および古典的溶液合成が含まれる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａである）とき、および／または、ペプチドが組換え技術によって産生できないとき（すなわち、核酸配列によってコードされないとき、例えば、本明細書中下記においてさらに記載される「タグ」など）に使用され、従って、異なる化学を伴う。
【０１０７】
様々な固相ペプチド合成手法が当該技術分野では広く知られており、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）によってさらに記載される。
【０１０８】
合成ペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【０１０９】
多量の本発明のペプチドが所望される場合、本発明のペプチドは、例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁などによって記載される組換え技術を使用して作製することができる。
【０１１０】
簡単に記載すると、本発明の（場合により、異種アミノ酸配列をコードする核酸配列に読み枠を合わせて融合された）ＣＣＲ２アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド（すなわち、その天然に存在する供給源から単離されたポリヌクレオチド、例えば、配列番号１０）を調節エレメント（例えば、プロモーターなど）の転写制御下に設置されて含む発現構築物（すなわち、発現ベクター）が宿主細胞に導入される。
【０１１１】
例えば、本発明のＣＣＲ２ペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号１）が、免疫グロブリンのｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号３および配列番号５）に読み枠を合わせて連結される。ゲノムの免疫グロブリンフラグメントの連結もまた使用され得ることが理解される。この場合、融合は、発現のために免疫グロブリン調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションによって、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、脾臓または末梢血リンパ球に由来するｃＤＮＡライブラリーから、発表された配列に基づいて単離することができる。ＣＣＲ２アミノ酸配列および免疫グロブリンをコードする核酸を、選択された宿主細胞における効率的な発現（これは本明細書中下記でさらに記載される）を導く発現構築物（ベクター）にタンデムで連結することができる。哺乳動物細胞における発現のために、ｐＲＫ５に基づくベクター［Ｓｃｈａｌｌ他、Ｃｅｌｌ、６１：３６１〜３７０（１９９０）］、および、ＣＤＭ８に基づくベクター［Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０（１９８９）］を使用することができる。正確な接合を、オリゴヌクレオチド特異的欠失変異誘発［Ｚｏｌｌｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８２）；Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５〜５３１（１９８９）］を使用して、設計された接合部コドンの間の余分な配列を除くことによって生じさせることができる。それぞれの半分が所望の接合部の両側での配列に対して相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができる；理想的には、これらは１１ｍｅｒ〜４８ｍｅｒである。あるいは、ＰＣＲ技術を、適切なベクターと読み枠を合わせて分子の２つの部分をつなぐために使用することができる。
【０１１２】
発現構築物を宿主細胞に導入する様々な方法が当該技術分野で広く知られており、これらには、エレクトロポレーション、リポフェクションおよび化学的形質転換（例えば、リン酸カルシウム）が含まれる。下記の実施例の節の実施例２もまた参照のこと。
【０１１３】
「形質転換された」細胞は、核酸配列によってコードされるキメラ分子の発現を可能にする好適な条件のもとで培養される。
【０１１４】
所定の期間の後、発現したキメラ分子が細胞または細胞培養物から回収され、精製が組換えポリペプチドの最終的な使用に従って行われる。
【０１１５】
利用された宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー配列、転写ターミネーターなどを含めて、数多くの好適な転写エレメントおよび翻訳エレメントはどれも、発現ベクターにおいて使用することができる［例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４を参照のこと］。
【０１１６】
（キメラ体をコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現した融合タンパク質の安定性、産生、精製、収率または毒性を最適化するために操作された配列を含むことができる。
【０１１７】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、融合タンパク質をコードする配列を発現させるための宿主−発現系として使用することができる。これらには、微生物、例えば、キメラ体をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；キメラ体をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母など；キメラ体をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させた植物細胞系、または、キメラ体をコードする配列を含有する組換え植物発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムが、好ましくは、本発明のキメラ体を発現させるために使用される。
【０１１８】
本発明の分子を発現させるための宿主細胞株の選択は、主として、発現ベクターに依存する。真核生物発現システムが、これらは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を可能にするので好ましい（例えば、哺乳動物および昆虫）。別の検討事項は、要求されるタンパク質の量である。ミリグラム量を、多くの場合、一過性トランスフェクションによって産生させることができる。例えば、アデノウイルスＥＩＡにより形質転換された２９３ヒト胚性腎臓細胞株は、効率的な発現を可能にするためにリン酸カルシウム法の改変によってｐＲＫ５系ベクターにより一過性にトランスフェクションすることができる。ＣＤＭ８系ベクターを、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってＣＯＳ細胞をトランスフェクションするために使用することができる［Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３〜１３１３（１９９０）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳ、９：３４７〜３５３（１９９０）］。より多量のタンパク質が所望であれば、分子は宿主細胞株の安定的な形質転換の後で発現させることができる（実施例の節の実施例２を参照のこと）。分子のＮ末端における疎水性のリーダー配列の存在はトランスフェクション細胞による分子のプロセシングおよび分泌を確実にすることが理解される。
【０１１９】
細菌宿主系または酵母宿主系の使用は、製造コストを軽減するために好ましい場合があることが理解される。しかしながら、細菌宿主系はタンパク質グリコシル化機構を有していないので、産生後のグリコシル化が必要となる場合がある。
【０１２０】
いずれの場合でも、形質転換された細胞は、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えキメラ分子を産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には、典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養は、組換え細胞のために適切である温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１２１】
製造のために使用されたベクターおよび宿主の系に依存して、本発明の生じたタンパク質は組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、大腸菌における細胞周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外膜に保持され得る。
【０１２２】
培養での所定の時間の後、組換えタンパク質の回収が行われる。表現「組換えタンパク質を回収すること」は、タンパク質を含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を伴う必要はない。本発明のタンパク質は、様々な標準的なタンパク質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマト分画および示差的可溶化（これらに限定されない）など）を使用して精製することができる。
【０１２３】
本発明の分子は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」は、本明細書中下記で記載される種々の適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【０１２４】
免疫グロブリンのアミノ酸配列を含むキメラ分子はアフィニティークロマトグラフィーによって都合良く精製することができる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの好適性は、キメラ体において使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを、ヒトのγ１重鎖、γ２重鎖またはγ４重鎖に基づくキメラ分子を精製するために使用することができる［Ｌｉｎｄｍａｒｋ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２：１〜１３（１９８３）］。プロテインＧが、好ましくは、すべてのマウスイソタイプについて、また、ヒトγ３について使用される［Ｇｕｓｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：１５６７〜１５７５（１９８６）］。アフィニティーリガンドが結合される固体担体は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の固体担体もまた利用可能である。機械的に安定な固体担体（例えば、制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど）は、アガロースを用いて達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。キメラ分子をプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティーカラムに結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴、すなわち、その種およびイソタイプによって完全に決定される。一般には、適切なリガンドが選ばれるとき、効率的な結合が未調整の培養液から直接に生じる。本発明のこの態様のキメラ分子の１つの特徴的な特徴が、ヒトγ１分子については、プロテインＡについての結合能が、同じＦｃタイプの抗体と比較して若干低下することである。本発明のこの態様の結合したキメラ分子は、酸性ｐＨ（約３．０以上）において、または、穏和なカオトロピック塩を含有する中性ｐＨ緩衝液で、そのどちらでも効率よく溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により、９５％を超える純度のキメラ分子調製物を得ることができる。医療用規格の純度が治癒的適用のためには不可欠である。
【０１２５】
当該技術分野で知られている他の方法を、免疫グロブリンの一部分を含むキメラ分子を精製するために、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーに加えて使用することができる。そのようなキメラ分子はイオウ親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー［Ｈｕｔｃｈｅｎｓ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５９：２１７〜２２６（１９８６）］および固定化金属キレートクロマトグラフィー［Ａｌ−Ｍａｓｈｉｋｈｉ他、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、７１：１７５６〜１７６３（１９８８）］において抗体と同様に挙動する。しかしながら、抗体とは対照的に、イオン交換カラムでのその挙動は、その等電点によってだけではなく、そのキメラ性のために分子に存在し得る電荷双極子によってもまた決定される。
【０１２６】
本発明の分子は、ＣＣＲ２と、例えば、そのＥ３ドメインを介して結合する任意のリガンドと結合させるために使用され得ることが理解される。これらには、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８およびＣＣＬ１３が含まれ得る［Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ（２００３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２７３：３〜１３］。
【０１２７】
本発明のこの態様の分子は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために使用することができる。
【０１２８】
従って、本発明の別の態様によれば、その必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法が提供される。この方法は、本発明の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む。
【０１２９】
本明細書中で使用される用語「対象」は哺乳動物対象を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。
【０１３０】
本明細書中で使用される用語「治療すること」は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の有害な作用を防止すること、治癒すること、逆戻りさせること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、または、停止させることを示す。
【０１３１】
本明細書中で使用される表現「ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患」は、発症または進行についてＭＣＰ−１とその受容体（ＣＣＲ２）との間での相互作用に依存する疾患を示す。
【０１３２】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の例には、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン（例えば、前立腺ガン、乳房のガン腫、乳ガン、神経膠芽細胞腫、食道ガン、神経芽細胞腫）、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明の分子は、それ自体で、あるいは、本発明の分子が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物において対象に投与することができる。
【０１３４】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。好ましくは、医薬組成物は免疫原性ではない。
【０１３５】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を担うことができる本発明の分子を示す。
【０１３６】
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【０１３７】
従って、例えば、本発明の医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含むことができる。
【０１３８】
あるいは、本発明によって使用される医薬的に許容され得るキャリアは埋め込み用物質（例えば、ポリオール（すなわち、炭水化物）など）を含むことができる。賦形剤としての使用に好適である炭水化物の限定されない例には、マルトデキストリン（例えば、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、トレハロース（例えば、Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、Ｍｅｒｃｋ）、セロビオース、グルコース、フルクトース、マルツロース、ｉｓｏ−マルツロース、ラクツロース、マルトース、ゲントビオース、ラクトース、イソマルトース、マルチトール（例えば、Ｍａｌｔｉｓｏｒｂ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、ラクチトール、エリトリトール、パラチニトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ズルシトールおよびリビトール、スクロース、ラフィノース、ゲンチアノース、プランテオース、ベルバスコース、スタキオース、メレジトース、デキストランおよびイノシトールが含まれる。
【０１３９】
さらに代替として、本発明によって使用される医薬的に許容され得るキャリアは、経口投与に好適なミクロスフェアである。例えば、ミクロスフェアは、本質的には米国特許第６８４９２７１号（Ｖａｇｈｅｆｉ他）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、胃において見出されるｐＨレベル（４未満のｐＨレベル）での溶解または酸分解に対して抵抗性がある有機物質の水不溶性マトリックスを含むことができる。そのような有機マトリックス物質は、例えば、トリグリセリド、水素化植物油、ワックスまたはワックスの混合物、ポリアルコキシアルキルエーテル、ポリアルコキシアルキルエステル、および、水不溶性の部分的に分解されたタンパク質が可能である。
【０１４０】
バイオコンジュゲート化ポリマー（例えば、本発明のＰＥＧ化ＣＣＲ２ペプチド）は、医薬的に許容され得るキャリアにおいて、または、医薬的に許容され得るキャリアの一部として使用することができ、従って、ＣＣＲ２アミノ酸配列を送達するためのキャリア分子として役立ち、一方で、同時に送達ビヒクルの成分として役立つことが理解される。この二重使用の好ましい実施形態が、例えば、米国特許出願公開第２００３０１８６８６９号（Ｐｏｉａｎｉ，Ｇｅｏｒｇｅ他）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、リポソームビヒクル（例えば、ＰＥＧコンジュゲート化リポソーム）である。
【０１４１】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１４２】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４３】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１４４】
あるいは、例えば、患者の身体の特定部位に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与しうる。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１４６】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１４７】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１４８】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１４９】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１５０】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１５１】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１５２】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１５３】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１５４】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１５５】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１５６】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１５７】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療効果的な量（治癒効果的な量）」は、治療されている対象の病状（例えば、虚血）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（例えば、核酸構築物）の量を意味する。
【０１５８】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５９】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、用量または治療効果的な量は、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は所望の濃度または力価を得るために動物モデルにおいて配合することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１６０】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ，（１９７５年）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
【０１６１】
投薬量および投薬間隔は、生物学的作用を誘導または抑制するための有効成分の十分な血漿中レベルまたは脳内レベル（すなわち、最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０１６２】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１６３】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１６４】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。医薬的に許容され得るキャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上で詳細に記載されたように、適応される状態の治療のために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１６５】
本発明のこの態様の分子（例えば、キメラのタンパク質性分子）は遺伝子療法によって対象に提供され得ることが理解される。従って、上記の哺乳動物発現構築物を、本明細書中上記で記載される任意の好適な投与様式を用いて対象に投与することができる（すなわち、インビボ遺伝子療法）。あるいは、核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および必要とされるような発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、対象に戻される（すなわち、エクスビボ遺伝子療法）。
【０１６６】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）など）によるトランスフェクション、および、脂質に基づくシステムが含まれる。遺伝子の脂質媒介による移入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌなどである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子療法において使用される最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー、または、遺伝子座を規定するエレメント、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、メッセンジャーの選択スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾など）によって制御する他のエレメントを含む。そのようなウイルス構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されたウイルスに対して適切なプラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、構築物が置かれている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列であり、例えば、Ｉｇκのリーダー配列（例えば、配列番号７および配列番号８など）である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を導くシグナル、ならびに、１つ以上の制限部位、および、翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。非ウイルスである他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなど）。
【０１６７】
ＭＣＰ−１に対する本発明のＣＣＲ２ペプチドの親和性はＭＣＰ−１の精製および検出におけるその使用を可能にする。
【０１６８】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、タグおよび本発明のＣＣＲ２ペプチドを含む分子が提供される。
【０１６９】
本明細書中で使用される用語「タグ」は、結合性パートナー（例えば、抗体分子、キレーター分子またはアビジン（ビオチン）分子など）によって特異的に認識される成分を示す。タグは、その生物学的活性（例えば、ＭＣＰ−１結合）を妨害しない限り、ＣＣＲ２ペプチドのＣ末端またはＮ末端に設置することができる。
【０１７０】
例えば、タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープを提供するための十分な残基を有するが（すなわち、エピトープタグ）、ＣＣＲ２ペプチドの生物学的活性を妨害しないように十分に短い。エピトープタグは好ましくはまた、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり特有である。好適なタグポリペプチドは一般には少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常的には約８個〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは、約９個〜３０個の残基）を有する。例えば、ポリヒスチジン配列が好ましく、この配列はニッケルと結合し、これにより、記載されたように［Ｌｉｎｄｓａｙ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１７：５７１〜５７４（１９９６）］、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによるタグ化タンパク質の単離を可能にする。
【０１７１】
ＣＣＲ２のかかるエピトープタグ化形態が望ましい。これは、その存在がタグポリペプチドに対する標識化抗体を使用して検出され得るからである。また、エピトープタグの提供は、本発明のＣＣＲ２ペプチドが、抗タグ抗体を使用するアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。抗体を伴うアフィニティー精製技術および診断アッセイが本明細書中下記に記載される。
【０１７２】
様々なタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体が当該技術分野では広く知られている。例には、インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９〜２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する抗体の８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Ｅｖａｎ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０〜３６１６（１９８５））；および、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）およびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドが開示されている。例には、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４〜１２１０（１９８８）］、ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２〜１９４（１９９２）、α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３〜１５１６６（１９９１）］、および、Ｔ７の遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３〜６３９７（１９９０）］が挙げられる。タグポリペプチドが選択されると、それに対する抗体を、当該技術分野で広く知られている方法を使用して作製することができる。そのような抗体が、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）などから市販されている。
【０１７３】
本発明のこの態様の分子は、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離するために、または、生物学的サンプルにおけるＭＣＰ−１の存在を検出するために使用することができる。
【０１７４】
本明細書中で使用される表現「生物学的サンプル」は、ＭＣＰ−１が存在する生物学的流体を示し、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、涙液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、腹水、膿および馴化培地などを示す。
【０１７５】
本発明のこの態様によるＭＣＰ−１の単離は、生物学的サンプルを本発明のこの態様の分子と接触させ、その結果、ＭＣＰ−１および分子が（分子がＭＣＰ−１に結合することを可能にする緩衝液、温度条件を使用して）複合体を形成するようにすること（例えば、Ｄａｔｔａ−ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ（２００４、上掲）を参照のこと）、および、複合体を単離し、それにより、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離することによって行われる。
【０１７６】
複合体を単離するために、分子は、好ましくは、固体担体に固定化される。本明細書中で使用される表現「固体担体」は、目的とする試薬（例えば、本発明のこの態様の分子）が接着することができる非水性マトリックスを示す。固体担体の例には、一部または全体がガラス（例えば、制御細孔ガラス）から形成される固体担体、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、状況に依存して、固体担体はアッセイプレートの壁を含むことができる。他の実施形態では、固体担体は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、ばらばらの粒子（例えば、米国特許第４２７５１４９号に記載される粒子など）の不連続な固相を包含する。
【０１７７】
あるいは、そのような分子は、生物学的サンプルにおけるＭＣＰ−１のレベルを検出するために使用することができる。診断適用のために、分子は典型的には、検出可能な成分により標識される。検出可能な成分は、検出可能シグナルを直接的または間接的のどちらかで生じさせることができる任意の成分が可能である。例えば、検出可能な成分は、放射性同位体、蛍光性化合物もしくは化学発光性化合物、または、タグ（例えば、標識された抗体が結合することができる本明細書中上記で記載されるタグなど）であり得る。本発明の分子は、任意の知られているアッセイ方法（例えば、競合的結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、ならびに、免疫沈殿アッセイなど）において用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７頁〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）。
【０１７８】
本発明のこの態様の分子は、本発明のこの態様の分子、ならびに、場合により、固体担体および画像化試薬（例えば、抗体、発色性基質など）が、適切な緩衝液および保存剤とともに好適な容器に包装され、診断のために使用され得る診断キットにおいて含むことができる。
【０１７９】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１８０】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１８１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１８２】
（実施例１）
前立腺ガン患者はＭＣＰ−１に対する特異的な選択的抗体応答を示す
ＣＣＬ２と前立腺ガンとの関係が、前立腺ガン患者における、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）をはじめとする様々なケモカインに対する自己抗体の存在についてのＥＬＩＳＡ試験を使用して明らかにされた。
【０１８３】
材料および実験手順
患者標本−ヒトでの実験研究を、Ｈａｉｆａ（イスラエル）にあるＣＡＲＭＥＬ医療センターおよびＲＡＭＢＡＭ医療センターの泌尿器科との共同で行った。すべての血清サンプルおよび組織サンプルを、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ委員会承認番号１８２２（２００３年１１月１１日付け）のもと、ＲＡＭＢＡＭ病院の患者から得た。病理学的分析がＣＡＲＭＥＬ医療センターの泌尿器科のＡｖｉ Ｓｔｅｉｎ教授によって行われた。患者の臨床データが下記の表１に要約される。
【０１８４】
抗体（Ａｂ）力価の測定―それぞれ試験されたケモカインに対するＡｂ力価を、詳細が前述されたように、ＥＬＩＳＡ試験を使用して検出した（Ｗｉｌｄｂａｕｍ，Ｇ．、Ｍ．ＮａｈｉｒおよびＮ．Ｋａｒｉｎ、２００３、前炎症性メディエータに対する有益な自己免疫性は自己破壊性免疫の結果を抑制する、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９：６７９）。組換えヒトケモカイン：ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ−１９）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）およびＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）はすべてＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から購入した。ヒトＭＩＦをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭ）から購入した。
【０１８５】
結果
前立腺ガン患者はＭＣＰ−１に対する著しい自己抗体力価を示す
２３名の前立腺ガン患者、２１名の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）者および１１名のコントロール被験者（表３、下記）からの血清を、ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）、ＭＩＦ、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ−１９）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）およびＭＣＰ−１（ＭＣＰ−１）を含めて、様々なケモカイン（特に、ガンに関係しているケモカイン）に対する自己抗体の存在について試験した。
【０１８６】
試験されたすべてのケモカインの中で、前立腺ガン患者は、ＭＣＰ−１に対してのみ非常に著しい抗体力価を有した（図１ａ、１１．８５±０．８のｌｏｇ２Ａｂ力価）。健常者およびＢＰＨ患者における抗ＭＣＰ−１抗体のベースライン力価（ｌｏｇ２）は５〜６であり、それ以外のケモカインのいずれかに対する応答において観測された力価とは異なっていなかった。従って、前立腺ガン患者はＭＣＰ−１に対する非常に特異的かつ選択的な抗体応答を示す（図１ａ、ｐ＜０．０１）。統計学的分析では、前立腺ガン患者の約８２％（１９／２３）および非悪性ＢＰＨ患者の４．７％（１／２１）のみがＭＣＰ−１に対する著しい応答（１０を超えるｌｏｇ２Ａｂ力価、ｐ＜０．０１）を示したことが明らかにされた。
【０１８７】
これらの結果は、ＭＣＰ−１とＣＣＲ２との相互作用の阻害が、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２によって調節されるガンおよび他の疾患を抑制するために使用され得ることを示唆している。
【０１８８】
（実施例２）
ＣＣＲ２キメラペプチド（Ｅ３−Ｉｇ）の作製および細胞株における安定的発現
材料および実験手順
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ構築物の作製
図２は、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧキメラ体を発現させるための構築物の例示を示す。このＩｇＧ１構築物を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの作製のために以前に利用した基本的プロトコル（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．、Ｃ．Ｌ．Ｈｏｆｓｔｒａ、Ｒ．Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｂ．Ｃｈａｎ、Ｉ．Ｖａｎ Ａｒｋ、Ｐ．Ｍ．ＪａｒｄｉｅｕおよびＦ．Ｐ．Ｎｉｊｋａｍｐ、１９９７、マウスＣＴＬＡ４−ＩｇＧ治療はアレルギー性喘息のマウスモデルにおいて気道の好酸球増加症および過剰応答を阻害し、ＩｇＥのアップレギュレーションを弱める、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１７：３８６）に従って、改変を伴いながら作製した：ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードするｃＤＮＡを、ＬＰＳおよびＩＬ−４により活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化した。ヒトＣＣＲ２−Ｅ３を、下記のような、ＣＣＲ２の６ドメイン（Ｅ３、それぞれ、配列番号１および配列番号２）の一部をコードするプライマーを使用して、ＬＰＳ活性化のヒトＰＢＭＣからサブクローン化した：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔｇｇｃｃｔｇａｇｔａａｃｔｇｔｇａａａｇ（配列番号１２）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｇｔｃｔｃｔｇｔｃａｃｃｔｇｃｇｔｇｇ（配列番号１３）。配列を確認した後、増幅されたＰＣＲ生成物をｐＳｅｃ−Ｔａｇ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化した。ヒトＩｇＧのＦｃγのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をＣＣＲ２（Ｅ３）の下流側においてプラスミド（ｐＳｅｃ−ＣＣＲ２）に連結して、融合タンパク質ＣＣＲ２−ＩｇＧを作製した。
【０１８９】
安定的なｐＳｅｃ−ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ発現細胞株の作製
ｐＳｅｃ−ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧプラスミドを、ジェットＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓｅトランスフェクション、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、フランス）を製造者のプロトコルに従って使用して、ＣＨＯ ＤＨＦＲミニ遺伝子ベクターとともに、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−／−）（これはＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士（コロンビア大学、米国）によって提供された）に同時トランスフェクションした。安定的なトランスフェクタント細胞を、ヒグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する培地で選択した。ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ融合タンパク質を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓｉａ、スウェーデン）から得られるプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムによって上清から精製し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用してウエスタンブロット分析によって確認した。
【０１９０】
（実施例３）
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧはＭＣＰ−１に特異的に結合する
ＭＣＰ−１と結合するＣＣＲ２のＥ３ドメインの能力をＥＬＩＳＡアッセイによって検討した。
【０１９１】
材料および実験手法
ＥＬＩＳＡ−様々な市販のヒトケモカイン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）に対するＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの結合特異性を下記のように直接ＥＬＩＳＡによって明らかにした：９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を１００ｎｇ／ｍｌの各ケモカインにより被覆し、洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳによりブロッキング処理した。その後、５μｇ／ｍｌの濃度でのＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧを加えた。ＨＲＰ標識されたマウス抗ヒトＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を二次抗体として加えた。結果が４５０ｎｍでの吸光度読み取りとして示される。抗ＣＣＬ２モノクローナル抗体（ＭＡＢ６７９；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭ）を陽性コントロール（１μｇ／ｍｌ）として使用した。
【０１９２】
結果
様々なケモカインに対するＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの結合をＥＬＩＳＡによって明らかにした。図３に示されるように、ＣＣＲ２のＥ３ドメインは、ＭＣＰ−１と結合するために十分であり、試験された他の因子と比較して、このケモカインに対するほぼ４倍大きい結合を示した。
【０１９３】
（実施例４）
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧはＭＣＰ−１誘導の細胞遊走を阻害する
材料および実験手順
細胞株
ＴＨＰ−１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ；ＡＴＣＣアクセション番号ＴＩＢ−２０２）から得て、製造者のプロトコルに従って成長させた。
【０１９４】
細胞遊走アッセイ―ＴＨＰ−１細胞のＭＣＰ−１誘発遊走を阻害するＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの能力を試験した。走化性アッセイを、ＴｒａｎｓＷｅｌｌチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔｅｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して行った。培地を伴うＴＨＰ−１細胞（１Ｘ１０６細胞／ウエル）を、可溶性ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが補充された、または、補充されなかった培地（組換えヒトＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭ））による下部チャンバーの平衡化の後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部チャンバーに加えた。その後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、７．５％ＣＯ２を含有する加湿空気において３７℃で３時間インキュベーションした。遊走している単球を下部チャンバーから集め、計数した。
【０１９５】
結果
図４は、可溶性ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが、用量依存的様式で、ＴＨＰ−１細胞のＭＣＰ−１誘発遊走を著しく、顕著に（９０％）阻止したことを示す。
【０１９６】
（実施例４）
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧは根本的にＰＣ−３腫瘍成長を低下させ、ＶＥＧＦ発現を減少させる
材料および実験手順
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるマウスの治療―６匹のＳＣＩＤ／Ｂｇマウスからなる３つの群に５ｘ１０６個／マウスのＰＣ−３Ｌｕｃ細胞を皮下投与した（Ｅｌ Ｈｉｌａｌｉ他、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５（Ｆｅｂ １）、１１（３）：１２５３〜８）。
【０１９７】
第１群はＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの反復投与（２００ｕｇ／マウス、ｉ．ｖ．、４日間隔）を受けた。第２群には、一致する量のＰＢＳが投与され、第３群には、イソタイプが一致したコントロールＩｇＧが投与された。後治療（すなわち、確立された腫瘍の治療）のために、投与をＰＣ−３細胞投与後１８日で開始した。
【０１９８】
ＶＥＧＦの検出−ｄｅ Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．、Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、Ｍ．ＤｅＬｕｃａ、Ｄ．Ｒ．ＨｅｌｉｎｓｋｉおよびＳ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、１９８７、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子：構造および哺乳動物細胞における発現、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、７：７２５；Ｒｕｂｉｏ，Ｎ．、Ｍ．Ｍ．ＶｉｌｌａｃａｍｐａおよびＪ．Ｂｌａｎｃｏ、１９９８、ルシフェラーゼ遺伝子を腫瘍細胞マーカーとして使用して可視化されたヌードマウスにおけるＰＣ−３前立腺腫瘍細胞のリンパ節への移動、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、７８：１３１５；Ｒｕｂｉｏ，Ｎ．、Ｍ．Ｌｏｒｇａｎｓは、ルシフェラーゼ遺伝子を定量可能な腫瘍細胞マーカーとして発現する前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞を使用して測定した（Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４４：１３３）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。動物を３０日目で屠殺し、腫瘍を回収し、切片化した。ＶＥＧＦを、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号が必要ならば、後日提供することが可能である）から得られるウサギ抗ＶＥＧＦを使用して検出した。
【０１９９】
ルシフェラーゼ活性−以前に記載されたように測定した。Ｅｌ Ｈｉｌａｌｉ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５（Ｆｅｂ １）、１１（３）：１２５３〜８を参照のこと。簡単に記載すると、動物を、ＣＯ２を使用して３０日目に屠殺した。肺および骨を回収し、液体窒素で凍結した。その後、凍結組織を粉末に粉砕し、溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。サンプルを数秒間ボルテックス処理し、混合物を２０分間遠心分離した（１３０００ｒｐｍ）。その後、ルシフェラーゼ基質を加えた。
【０２００】
結果
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療は根本的にＰＣ−３腫瘍成長を低下させる−図５ａに示されるように、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの反復投与は、ＰＣ−３腫瘍成長を、ＰＢＳまたはコントロールＩｇＧが投与されたマウスにおいて発達した腫瘍と比較して、完全に阻害した。
【０２０１】
ＣＣＲ２−Ｉｇによる後治療（１８日目）は、事前に確立された原発性腫瘍の発達、および、転移物を形成するその能力を阻止する−図５ｂは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが腫瘍発達後（細胞注入の１８日目）に投与されたときでさえ、ＣＣＬ２の阻止は、原発性腫瘍の発達、および、転移を形成するその能力を劇的に低下させたことを明瞭に示す。腫瘍細胞投与後の中間日時（８日）の後でさえ、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧは腫瘍の発達を阻害することができた。
【０２０２】
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療は腫瘍転移を減少させる−図５ｃに示されるように、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるマウスの治療は、ルシフェラーゼ活性の減少によって示されるように肺組織および骨組織への腫瘍転移を著しく阻害した。両方の組織におけるルシフェラーゼ活性は、非治療動物と比較して１／４〜１／１０に低下し、全体的には、同じ最小レベル（すなわち、約０．５）に達した。
【０２０３】
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療は根本的にＶＥＧＦ発現を減少させる−図６ａ〜図６ｆに示されるように、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの投与（図６ａ、図６ｆ）は、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧ（図６ｂ、図６ｅ）およびＰＢＳ（図６ｃ、図６ｆ）と比較して、腫瘍部位におけるＶＥＧＦ発現を劇的に減少させた。これは、ＣＣＲ２経路の遮断はＶＥＧＦの腫瘍誘導活性を阻害することを示唆している。
【０２０４】
（実施例５）
ＰＣ−３細胞のＣＣＬ２誘発遊走がＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによって阻害される
材料および実験手順
細胞遊走アッセイ−細胞遊走を、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して明らかにした。抗ＣＣＬ２をＭａｒｔｉｎｅｚ博士およびＭｅｌａｄｏ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｃｅｎｔｒｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ、ＵＡＭ Ｃａｍｐｕｓ ｄｅ Ｃａｎｔｏｂｌａｎｃｏ、Ｍａｄｒｉｄ、スペイン）から得た。簡単に記載すると、ＰＣ−３細胞（１０６個／ウエル）をトランスウエルプレートの上部チャンバーに加え、ＣＣＬ２（組換えヒトＭＣＰ−１、ＲＨＭＣＰ−１；２０ｎｇ／ｍｌ）を、図７に示されるように抗ＣＣＬ２（５０μｇ）および／またはＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ（２００μｇ）もまた補充された下部ウエルに加えた。３７℃での２時間のインキュベーションの後、遊走しているＰＣ−３細胞をＦＡＣＳによって集めた。結果が三連の平均±ＳＥとして示される。
【０２０５】
結果
前立腺ガン細胞に対するＣＣＬ２の可能性のある作用機構の１つが、ＣＣＬ２が腫瘍細胞を引き寄せることである。図７において認められ得るように、ＣＣＲ２−Ｉｇと一緒でのＣＣＬ２はＰＣ３細胞の遊走を抗ＣＣＬ２ｍＡｂよりも良好に阻害する。
【０２０６】
（実施例６）
ＣＣＲ２アミノ酸配列のＰＥＧ化
本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列を安定化するために、また、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列を経口投与および／または非経口投与のために好適にするために、下記の配列：ＬｙｓＧｌｙＬｅｕＳｅｒＡｓｎＣｙｓＧｌｕＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｎＬｅｕＡｓｐＧｌｎＡｌａＴｈｒＧｌｎＶａｌＴｈｒＧｌｕＴｈｒ（配列番号１１）（これは、リシン残基がそのＮ末端において付加されていることを除いて、配列番号１と同一である）を有するペプチドは、当該技術分野で知られている方法を使用してＰＥＧ化することができる（例えば、Ｃｒｏｙｌｅ、Ｍ．Ａ．他、２０００、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１１：１７２１〜１７３０；Ｃｒｏｙｌｅ、Ｍ．Ａ．他、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：９１２〜９２１）。例えば、モノメトキシポリ（エチレン）グリコールをスクシンイミジルスクシナート（これはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得ることができる）によって活性化することができる。活性化されると、このポリマーは約１０：１（ポリマー：ペプチド）の重量比でＣＣＲ２ペプチドに加えることができ、ＰＥＧ化反応が、穏やかな撹拌とともに２５℃でさらに行われる。反応を、加えられたＰＥＧの量に対して過剰（例えば、１０倍）のリシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の添加によって停止させることができる。未反応のＰＥＧ、過剰なリシン、および、反応副生成物が、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７．４）により平衡化されたＭｉｃｒｏ−Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ Ｐ−３０クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）での緩衝液交換によって除かれる。
【０２０７】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０８】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】前立腺ガン患者がＭＣＰ−１に対する非常に著しい自己抗体力価を選択的に発達させていることを示すグラフである。
【図２】本発明のヒトＩｇ−ＣＣＲ２ペプチド（Ｉｇ−Ｅ３）をコードする発現構築物の作製を示す概略的例示である。
【図３】ＣＣＲ２のＥ３ドメインがＭＣＰ−１に特異的に結合することを示す棒グラフである。
【図４】ヒトＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧがＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣアクセション番号ＴＩＢ−２０２）のＭＣＰ−１誘発遊走を阻害することができることを示す棒グラフである。
【図５ａ】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフであり、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの投与がＰＣ−３細胞の投与と同時に開始されたとき、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが腫瘍の成長を時間とともに減少させることができることを示すグラフである。
【図５ｂ−ｄ】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフであり、図５ｂは、ＰＣ−３細胞の投与後の１８日で開始されたとき（図５ｂ）、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが腫瘍の成長を時間とともに減少させることができることを示すグラフであり、図５ｄは、示されるようなＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるルシフェラーゼ発現ＰＣ−３細胞の骨転移および肺転移の阻害を、コントロール細胞に対する比較とともに示す棒グラフである。
【図５ｃ】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフであり、ＰＣ３細胞投与後８日で注射されたＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図６】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるＣＣＬ−２の遮断により、ＶＥＧＦ産生が腫瘍部位において完全に抑制されることを示す写真である。
【図７】光学密度によって決定されたときの、ＣＣＬ２処理されたＰＣ３細胞の細胞遊走を示す棒グラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０２１０】
配列番号１は、ヒトのＣＣＲ２ Ｅ３ドメインのコード配列である。
配列番号２は、ヒトのＣＣＲ２ Ｅ３ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｉｇカッパリーダーのコード配列である。
配列番号８は、Ｉｇカッパリーダーのアミノ酸配列である。
配列番号９は、二つのタンデムＣＣＲ２ Ｅ３ドメインを含むポリペプチドである。
配列番号１０は、二つのタンデムＣＣＲ２ Ｅ３ドメインを発現するポリヌクレオチドである。
配列番号１１は、ＰＥＧ化のためのＮ’ Ｌｙｓ残基を付加されたＣＣＲ２ Ｅ３ドメインを含むペプチドである。
配列番号１２及び１３は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号１４は、Ｉｇカッパリーダー、ＣＣＲ２ Ｅ３ドメイン、免疫グロブリン重鎖定常領域及び６ＸＨｉｓタグからなるポリペプチドである。
配列番号１５は、Ｉｇカッパリーダー、ＣＣＲ２ Ｅ３ドメイン及び免疫グロブリン重鎖定常領域からなるポリペプチドである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な分子に関し、より具体的には、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患（例えば、炎症性疾患およびガンなど）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数年間にわたって、より多くの白血球走化性因子／活性化因子（ケモカイン）が記載された［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６１７〜６４８（１９９１）；ＳｃｈａｌｌおよびＢａｃｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：８６５〜８７３（１９９４）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５：９７−１−７９（１９９４）］。ケモカインは初期の炎症性メディエータ（例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αなど）に対する応答において様々な細胞型によって産生および分泌される。
【０００３】
ケモカインスーパーファミリーは、α−ケモカイン（ＣＸＣケモカインとしても知られている）およびβ−ケモカイン（ＣＣケモカインとしても知られている）の２つの大きな部類を含む。この分類は、アミノ酸配列における最初の２つのシステインが１つのアミノ酸によって隔てられる（ＣＸＣ）か、または、隣接する（ＣＣ）かに基づいている。α−ケモカイン部類には、例えば、ＩＬ−８、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、メラノーマ増殖刺激活性（ＭＧＳＡ／ｇｒｏまたはＧＲＯα）およびＥＮＡ−７８（それぞれが、主に好中球およびＴリンパ球に対する誘引作用および活性化作用の両方を有する）などのタンパク質が含まれる。β−ケモカイン部類のメンバーは他の血液細胞型（例えば、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球など）に影響を及ぼし［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６１７〜６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５：９７〜１７９（１９９４）；ＭｉｌｌｅｒおよびＫｒａｎｇｅｌ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：１７〜４６（１９９２）；Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：８８１〜１１８（１９９４）；Ｐｏｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７：６０４〜６１２（１９９６）］、例えば、単球走化性タンパク質１〜４（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４）、ＲＡＮＴＥＳおよびマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）などのタンパク質が含まれる。
【０００４】
ケモカインスーパーファミリーの第３のより小さい部類は膜結合ケモカインを含む。このクラスのメンバーはＣＸ３Ｃケモカインと称される［Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．、他、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：６４０〜６４４（１９９７）］。
【０００５】
ケモカインは、白血球に対する一連の前炎症性作用、例えば、走化性の開始、脱顆粒、脂質メディエータの合成、および、インテグリン活性化などを媒介することができる［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：６１７〜６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５：９７〜１７９（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．およびＫｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：１７〜４６（１９９２）］。
【０００６】
これらのケモカインは、「ケモカイン受容体」と呼ばれるＧ−タンパク質結合型の７回膜貫通ドメインタンパク質からなるファミリーに属する特異的な細胞表面受容体に結合する［Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｍ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：５９３〜６３３（１９９４）］。その同族リガンドと結合したとき、ケモカイン受容体は会合した三量体Ｇタンパク質を介して細胞内シグナルを伝達し、これにより、様々な応答、特に、細胞内カルシウム濃度における迅速な増大、細胞形状における変化、細胞接着分子の発現の増大、脱顆粒、および、細胞遊走の促進を生じさせる。
【０００７】
ケモカインは、アレルギー性、炎症性および自己免疫性の障害および疾患（例えば、喘息、アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、膵炎、再狭窄、リウマチ様関節炎、糖尿病性腎症、肺線維症および移植片拒絶反応など）の重要なメディエータとして関係づけられている。
【０００８】
特に、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）は、その受容体のＣＣケモカイン受容体２（ＣＣＲ−２）に作用する一方で、様々な徴候において役割を果たしている。その受容体に結合したとき、ＭＣＰ−１は細胞内カルシウム濃度における迅速な増大を誘導し、これにより、細胞接着分子の発現の増大をもたらし、また、最終的には、細胞の脱顆粒および白血球遊走の促進をもたらす。
【０００９】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の重要性の立証が、遺伝子改変マウスを用いた実験によって示されている。ＭＣＰ−１の−／−型マウスは正常な数の白血球およびマクロファージを有したが、単球をいくつかの異なるタイプの抗原攻撃の後で炎症部位に動員することができなかった［Ｂａｏ Ｌｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８７、６０１］。同様に、ＣＣＲ−２の−／−型マウスは、様々な外因性薬剤による抗原攻撃を受けたとき、単球を動員すること、または、インターフェロンγを産生することができなかった；そのうえ、ＣＣＲ−２ヌルマウスの白血球はＭＣＰ−１に対する応答において遊走せず［Ｌａｎｄｉｎ Ｂｏｒｉｎｇ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９７、１００、２５５２］、これによってＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の特異性が明らかとなった。他の２つのグループにより独立して、同等な結果が、ＣＣＲ−２の−／−型マウスの異なる系統を用いて報告されている［Ｗｉｌｌｉａｍ Ａ．Ｋｕｚｉｅｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１２０５３、および、Ｔａｋａｏ Ｋｕｒｉｈａｒａ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１７５７］。ＭＣＰ−１の−／−型動物およびＣＣＲ−２の−／−型動物の生存能力および全般的に正常な健康状態は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の破壊が生理学的危機を誘導しないという点で注目すべきことである。まとめると、これらのデータは、ＭＣＰ−１の作用を遮断する分子は、様々な炎症性障害および自己免疫障害を治療することにおいて有用であることを示唆している。
【００１０】
ＭＣＰ−１はリウマチ様関節炎の患者においてアップレギュレーションされることが知られている［Ａｌｉｓａ Ｋｏｃｈ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９２、９０、７７２〜７７９］。さらに、いくつかの研究では、リウマチ様関節炎を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治療的価値が明らかにされている。ＭＣＰ−１をコードするＤＮＡワクチンは近年、ラットにおける慢性的なポリアジュバント誘発関節炎を改善することが示された［Ｓａｗｓａｎ Ｙｏｕｓｓｅｆ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０６、３６１］。同様に、炎症性疾患の症状が、コラーゲン誘発関節炎のラット［Ｈｉｒｏｏｍｉ Ｏｇａｔａ他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９７、１８２、１０６］または連鎖球菌細胞壁誘発関節炎のラット［Ｒａｌｐｈ Ｃ．Ｓｃｈｉｍｍｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、１４６６］に対するＭＣＰ−１についての抗体の直接的な投与により抑制され得る。おそらくは最も重要なことではあるが、ＭＣＰ−１のペプチドアンタゴニストであるＭＣＰ−１（９−７６）により、（投与時期に依存して）疾患の発症を防止すること、および疾患の症状を軽減することの両方が関節炎のＭＲＬ−１ｐｒマウスモデルにおいて示された［Ｊｉａｎｇ−Ｈｏｎｇ Ｇｏｎｇ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１３１］。
【００１１】
ＭＣＰ−１はまた、アテローム硬化性病変部においてアップレギュレーションされており、ＭＣＰ−１の循環レベルが疾患の進行において役割を果たすことが示されている［Ａｂｄｏｌｒｅｚａ Ｒｅｚａｉｅ−Ｍａｊｄ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００２、２２、１１９４〜１１９９］。ＭＣＰ−１は、マクロファージが多い動脈壁の免疫組織化学［Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：５２５２〜５２５６（１９９１）；Ｎｅｌｋｅｎ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、８８：１１２１〜１１２７（１９９１）］および抗ＭＣＰ−１抗体の検出［Ｔａｋｅｙａ他、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ、２４：５３４〜５３９（１９９３）］によって示されるように、アテローム硬化性領域内への単球の動員に関わっている。ＬＤＬ受容体／ＭＣＰ−１欠損マウスおよびａｐｏＢ遺伝子組換え／ＭＣＰ−１欠損マウスは、野生型ＭＣＰ−１系統と比較して、それらの大動脈の全域での著しく少ない脂肪沈着およびマクロファージ蓄積を示す［Ａｌｃａｍｉ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６０：６２４〜６３３（１９９８）；Ｇｏｓｌｉｎｇ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１０３：７７３〜７７８（１９９９）；Ｇｕ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、２：２７５〜２８１（１９９８）；Ｂｏｒｉｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３９４：８９４〜８９７（１９９８）］。
【００１２】
ＭＣＰ−１がヒトの多発性硬化症においてアップレギュレーションされることが知られており、また、インターフェロンβ−１βによる効果的な治療は末梢血単核細胞におけるＭＣＰ−１の発現を低下させることが示されており、これらは、ＭＣＰ−１が疾患の進行において役割を果たすことを示唆している［Ｃａｒｌａ Ｉａｒｌｏｒｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１２３、１７０〜１７９］。他の研究では、多発性硬化症を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値が明らかにされている；これらの研究のすべてが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（多発性硬化症についての従来の動物モデル）において明らかにされている。ＥＡＥを有する動物に対するＭＣＰ−１についての抗体の投与は疾患の再発を著しく減らした［Ｋ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、９２、９８］。さらに、２つのより最近の報告では、ＣＣＲ−２の−／−型マウスがＥＡＥに対して抵抗性があることが現在まで示されている［Ｂｒｉａｎ Ｔ．Ｆｉｆｅ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９２、８９９；Ｌｅｏｎｉｄ Ｉｚｉｋｓｏｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９２、１０７５］。
【００１３】
ＭＣＰ−１が、閉塞性細気管支炎症候群を肺移植後に発症する患者においてアップレギュレーションされることが知られている［Ｍａｒｔｉｎ Ｒｅｙｎａｕｄ−Ｇａｕｂｅｒｔ他、Ｊ．ｏｆ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００２、２１、７２１〜７３０；Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｐｅｒｉｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００１、１０８、５４７〜５５６］。閉塞性細気管支炎症候群のマウスモデルにおいて、ＭＣＰ−１に対する抗体の投与は気道閉塞の減衰をもたらした；同様に、ＣＣＲ２の−／−型マウスはこの同じモデルにおいて気道の閉塞に対して抵抗性があった［Ｊｏｈｎ Ｂｅｌｐｅｒｉｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００１、１０８、５４７〜５５６］。これらのデータは、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２の拮抗作用が移植後の器官の拒絶を治療することにおいて有益であり得ることを示唆している。
【００１４】
他の研究では、喘息を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値が明らかにされている。オボアルブミンによる抗原攻撃を受けたマウスにおける中和抗体によるＭＣＰ−１の封鎖は、気管支の過剰応答および炎症における顕著な低下をもたらした［Ｊｏｓｅ−Ａｎｇｅｌ Ｇｏｎｚａｌｏ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８８、１５７］。マンソン住血吸虫の卵による抗原攻撃を受けたマウスにおけるアレルギー性の気道の炎症をＭＣＰ−１についての抗体の投与により軽減させることが可能であることが判明した［Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｗ．Ｌｕｋａｃｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、１５８、４３９８］。これと一致して、ＭＣＰ−１の−／−型マウスは、マンソン住血吸虫の卵による抗原攻撃に対する低下した応答を示した［Ｂａｏ Ｌｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８７、６０１］。
【００１５】
他の研究では、腎臓疾患を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値が明らかにされている。糸球体腎炎のマウスモデルにおけるＭＣＰ−１についての抗体の投与は糸球体半月形成およびＩ型コラーゲンの沈着における顕著な減少をもたらした［Ｃｌａｒｅ Ｍ．Ｌｌｏｙｄ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５、１３７１］。加えて、腎毒性血清腎炎が誘導されたＭＣＰ−１の−／−型マウスは、そのＭＣＰ−１の＋／＋型対応体よりも著しく少ない尿細管損傷を示した［Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｈ．Ｔｅｓｃｈ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０３、７３］。
【００１６】
１つの研究が、全身性エリテマトーデスを治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値を明らかにしている。ＭＣＰ−１の−／−型マウスのＭＲＬ−ＦＡＳ．ｓｕｐ．１ｐｒマウスとの交雑（後者は、ヒトの全身性エリテマトーデスと類似する致命的な自己免疫疾患を有する）は、野生型のＭＲＬ−ＦＡＳ．ｓｕｐ．１ｐｒマウスよりも少ない疾患および長い生存を有するマウスをもたらした［Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｈ．Ｔｅｓｃｈ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１９０、１８１３］。
【００１７】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用はまた、ＣＣＲ−２の−／−型マウスがデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎の影響から保護されたので、大腸炎の病理学にも関係している［Ｐｉｅｔｒｏ Ｇ．Ａｎｄｒｅｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６４、６３０３］。
【００１８】
１つの研究が、肺胞炎を治療することにおけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用の拮抗作用の潜在的な治癒的価値を明らかにしている。ＩｇＡ免疫複合体肺傷害のラットが、ラットＭＣＰ−１（ＪＥ）に対して惹起された抗体により静脈内投与で治療されたとき、肺胞炎の症状が部分的に緩和された［Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．Ｊｏｎｅｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、１４９、２１４７］。
【００１９】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２相互作用はまた、ガンにも関係している。ヒトの乳ガン細胞を有する免疫不全マウスが抗ＭＣＰ−１抗体により治療されたとき、肺微小転移物の阻害および生存における増大が観測された［Ｒｏｓａｌｂａ Ｓａｌｃｅｄｏ他、Ｂｌｏｏｄ、２０００、９６、３４〜４０］。特に、ＭＣＰ−１が、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００４／０８０２７３（本発明者ら）に詳しく記載されるように、前立腺ガンにおいて適応される。
【００２０】
再狭窄は、ＭＣＰ−１が関与するさらにもう１つの適応である。ＣＣＲ２が欠損したマウスは、大腿動脈の傷害の後、（野生型同腹子に対して）血管内膜面積および血管内膜／中膜比における減少を示した［Ｍｅｒｃｅ Ｒｏｑｕｅ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２００２、２２、５５４〜５５９］。
【００２１】
他の研究では、ＭＣＰ−１が、上記で述べられていない様々な疾患状態において過剰発現するという証拠が示されている。これらの報告では、ＭＣＰ−１アンタゴニストがそのような疾患のための有用な治療剤であり得るという相関的な証拠が提供される。ＭＣＰ−１が、炎症性腸疾患の患者の腸上皮細胞および腸粘膜において過剰発現することが示されている［Ｈ．Ｃ．Ｒｅｉｎｅｃｋｅｒ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９９５、１０８、４０；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｇｒｉｍｍ他、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、５９、８０４］。２つの報告において、脳外傷が誘導されたラットにおけるＭＣＰ−１の過剰発現を記載する［Ｊ．Ｓ．Ｋｉｎｇ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、５６、１２７；Ｊｏａｎ Ｗ．Ｂｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、３０１７］。ＭＣＰ−１はまた、齧歯類の心臓同種移植片において過剰発現することが示されており、これは、移植片の動脈硬化の病理発生におけるＭＣＰ−１の役割を示唆している［Ｍａｒｙ Ｅ．Ｒｕｓｓｅｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、６０８６］。ＭＣＰ−１の過剰発現は特発性肺線維症患者の肺の内皮細胞において認められている［Ｈａｒｒｙ Ｎ．Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５３７１］。同様に、ＭＣＰ−１の過剰発現が乾癬患者由来の皮膚において認められている［Ｍ．Ｄｅｌｅｕｒａｎ他、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９６、１３、２２８；Ｒ．Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９３、１０１、１２７］。最後に、最近の報告では、ＭＣＰ−１がＨＩＶ−１関連認知症の患者の脳および脳脊髄液において過剰発現することが示されている［Ａｌｆｒｅｄｏ Ｇａｒｚｉｎｏ−Ｄｅｍｏ、国際特許出願公開ＷＯ９９／４６９９１］。
【００２２】
今日までに報告されたほとんどのケモカインアンタゴニストは、特定のケモカインに対する中和抗体、または、小分子アンタゴニストのいずれかである［Ｈｏｗａｒｄ他、Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４：４６〜５１（１９９６）］。
【００２３】
抗ＭＣＰ−１抗体は、上記で記載されたように数多くのマウス疾患モデルにおいて効果的に使用されている。しかしながら、ケモカインの機能を中和するために抗体を使用することに伴う大きな問題は、そのような抗体は慢性的なヒト疾患における使用の前にヒト化されなければならないことである。さらに、多数のケモカインが１つの受容体と結合し、その受容体を活性化し得ることは、病理学的状態を完全に阻止または防止するために、多抗体法の開発または交差反応性抗体の使用を余儀なくしている。
【００２４】
ケモカイン受容体機能のいくつかの小分子アンタゴニストが科学文献および特許文献に報告されている［Ｗｈｉｔｅ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：１００９５〜１００９８（１９９８）；Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３：１５６８７〜１５６９２（１９９８）；Ｂｒｉｇｈｔ他、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、８：７７１〜７７４（１９９８）；Ｌａｐｉｅｒｒｅ、２６ｔｈ Ｎａｔｌ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、６月１４日〜１８日、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ（Ｖａ．）、米国（１９９８）；Ｆｏｒｂｅｓ他、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１０：１８０３〜１８０６４（２０００）；Ｋａｔｏ他、国際特許出願公開ＷＯ９７／２４３２５；Ｓｈｉｏｔａ他、国際特許出願公開ＷＯ９７／４４３２９；Ｎａｙａ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／０４５５４；Ｔａｋｅｄａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＪＰ０９−５５５７２（１９９８）；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／０２１５１；Ｈａｇｍａｎｎ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／２７８１５；Ｃｏｎｎｏｒ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／０６７０３；Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ他、米国特許第６２８８１０３号］。しかしながら、これらのケモカイン受容体アンタゴニストの特異性は、多様または冗長的なケモカイン発現プロフィルによって特徴づけられる炎症性障害がこれらの薬剤による治療に対して比較的より不応性であることを示唆している。
【００２５】
従って、上記の制限を有さない、ＣＣＲ−２関連疾患を治療するための組成物およびその使用方法が必要であることが広く認識されており、また、そのような組成物および方法を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２６】
本発明の１つの態様によれば、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）異種アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が非免疫原性である分子が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子が提供される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様によれば、それぞれがＭＣＰ−１と結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができる分子が提供される。
【００２９】
本発明のなおさらに別の態様によれば、ＭＣＰ−１と結合することができる、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列に結合したタグを含む分子が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、配列番号１４または配列番号１５に示されるような分子が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００３２】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含み、非免疫原性である医薬組成物が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、その必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、本発明の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための本発明の分子の使用が提供される。
【００３５】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）ＭＣＰ−１および請求項４に記載される分子が複合体を形成するように、生物学的サンプルを請求項４に記載される分子と接触させること；および（ｂ）複合体を単離し、それにより、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離することを含む。
【００３６】
本発明のなおさらなる態様によれば、その必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む。
【００３７】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の使用が提供される。
【００３８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、異種アミノ酸配列は免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患は、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化からなる群から選択される。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、タグはエピトープタグである。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の分子は固体担体に結合される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の分子は非タンパク質性成分に結合される。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非タンパク質性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群から選択される。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは非経口投与のために配合される。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは実質的に非免疫原性である。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含む。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは炭水化物を含む。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはミクロスフェアを含む。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはリポソームを含む。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはポリマーのミクロスフェアを含む。
【００５２】
本発明は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するための新規な分子およびその使用方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００５３】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似のまたは等価な方法と材料は本発明を実施または試験するのに使用できるが、好適な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法および実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００５４】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ−１ｂは、前立腺ガン患者がＭＣＰ−１に対する非常に著しい自己抗体力価を選択的に発達させていることを示すグラフである。図１ａ−２３名の前立腺ガン患者、２１名の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）患者、および、１０名のコントロール被験者（すべてが年齢一致の男性である）からのヒト血清を、下記の１３のケモカインに対する自己抗体の生じ得る出現についてモニターした：ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ１９９１６８）、ＭＩＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ１９６８６）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８４）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ２８１３）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００１５６５）、ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＣ０２０６９８）、ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ−１９、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＣ０２７９６８）、リンホタクチン（ＸＣＬ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９９５）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２４１６）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００６２７３）およびＭＣＰ−１（ＣＣＬ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００２９８２）。著しい抗体力価（ｐ＜０．０１）が上記ケモカインの１つだけ（ＭＣＰ−１）に対して大多数の前立腺ガン患者において観測された。図１ｂ−図１ａで記載された臨床サンプル（上記）のそれぞれにおけるＭＣＰ−１に対するＬｏｇ２Ａｂ力価。約８２％の前立腺ガン患者（１９／２３）および約４．７％（１／２１）のみのＢＰＨ患者がＭＣＰ−１に対する著しい応答（１０を超えるｌｏｇ２Ａｂ力価）を示した。
図２は、本発明のヒトＩｇ−ＣＣＲ２ペプチド（Ｉｇ−Ｅ３）をコードする発現構築物の作製を示す概略的例示である。
図３は、ＣＣＲ２のＥ３ドメインがＭＣＰ−１に特異的に結合することを示す棒グラフである。
図４は、ヒトＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧがＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣアクセション番号ＴＩＢ−２０２）のＭＣＰ−１誘発遊走を阻害することができることを示す棒グラフである。インビトロトランスウエル遊走アッセイを行った。簡単に記載すると、ＴＨＰ−１細胞（１０６個／ウエル）をトランスウエルの上部チャンバーに加え、ＣＣＬ２（組換えヒトＭＣＰ−１（ＲＨＭＣＰ−１）；（２０ｎｇ／ｍｌ））を、図に示されるように異なる濃度のＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧもまた補充された下部ウエルに加えた。３７℃での２時間のインキュベーションの後、遊走しているＴＨＰ−１細胞をＦＡＣＳによって計数した。結果が三連の平均±ＳＥとして示される。
図５ａ−５ｄは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフである。図５ａ〜図５ｂは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの投与がＰＣ−３細胞の投与と同時に開始されたとき（図５ａ）、または、ＰＣ−３細胞の投与後の１８日で開始されたとき（図５ｂ）のいずれでも、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧは腫瘍の成長を時間とともに減少させることができることを示すグラフである。ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与マウス（青色で示される）、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧが投与されたマウス（緑色で示される）、または、ＰＢＳ投与マウス（褐色または黄色で示される）からの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）を、示されるような様々な時間で繰り返して測定した。図５ｃは、ＰＣ３細胞投与後８日で注射されたＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの抗腫瘍活性を示すグラフである。ＰＣ−３細胞がＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧと一緒に投与されたマウス（青色で示される）、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧと一緒に投与されたマウス（緑色で示される）、または、ＰＢＳと一緒に投与されたマウス（ピンク色で示される）からの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）を、示されるような様々な時間で繰り返して測定した。これらの結果は、図５ａ〜図５ｂに示されるＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの防止的および治療的な活性を裏付けている。図５ｄは、示されるようなＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるルシフェラーゼ発現ＰＣ−３細胞の骨転移および肺転移の阻害を、コントロール細胞に対する比較とともに示す棒グラフである。
図６ａ−ｆは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるＣＣＬ−２の遮断により、ＶＥＧＦ産生が腫瘍部位において完全に抑制されることを示す写真である（図６ａ〜図６ｆ）。ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療（図６ａ、図６ｄ）、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧによる治療（図６ｂ、図６ｅ）、または、ＰＢＳによる治療（コントロール細胞；図６ｃ、図６ｆ）が示される。動物を屠殺し、腫瘍／組織を取り出した。組織を洗浄し、固定処理し、透過処理し、ＶＥＧＦを、共焦点顕微鏡観察を使用して免疫染色によって検出した。顕微鏡写真はＸ１０の倍率（図６ａ〜図６ｃ）またはＸ４０の倍率（図６ｄ〜図６ｆ）のいずれかで示される。
図７は、光学密度によって決定されたときの、ＣＣＬ２処理されたＰＣ３細胞の細胞遊走を示す棒グラフである。ＰＣ３細胞を、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ２に対する抗体と一緒でのＣＣＬ２（ＭＣＰ−１＋抗ＭＣＰ−１）、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧと一緒でのＣＣＬ２（ＭＣＰ−１＋ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ）、および、リガンド処理されていないコントロール細胞のいずれかにより処理した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２関連疾患（例えば、ガンなど）を治療するための分子、該分子を含む組成物、および、該分子を使用する方法に関する。
【００５６】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００５７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００５８】
単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）（これはＣＣＬ２とも呼ばれる）は単球および記憶Ｔ細胞を特異的に引き寄せる。その発現が、細胞遊走によって特徴づけられる様々な疾患において生じており、また、ガン、心臓血管疾患および炎症性疾患におけるその本質的役割についての実質的な生物学的証拠および遺伝学的証拠が存在する。精力的なスクリーニングにもかかわらず、今までのところ、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の受容体（ＣＣＲ２）のアンタゴニストは１つも見出されていない。
【００５９】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＣＣＲ２に対するＭＣＰ−１の結合がＣＣＲ２の３番目の細胞外領域（Ｅ３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６３９．１のアミノ酸座標２７３〜２９２）によって排他的に媒介されることを発見した。これは、ＣＣＲ２に対するＭＣＰ−１結合がＣＣＲ２のＮ末端領域（Ｎ−ｔｅｒ）および３番目の細胞外ループ（Ｅ３）の両方に依存することを示したＤａｔｔａ ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ［Ｄａｔｔａ−ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ（２００４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３：１４６０２〜１１］による以前の報告とは際立って対照的である。これらの結果は、ＣＣＲ２のＥ３領域を含むペプチドが、本質的にはＭＣＰ−１を封鎖することによって阻害剤として使用され得ることを示唆している。
【００６０】
従って、本発明では、ＣＣＲ２のＥ３ドメインを含み、かつ、好ましくは、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さない任意のＣＣＲ２アミノ酸配列の使用、および／または、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患（例えば、ガンなど）を治療するための、そのような配列を含む組成物が想定される。重要なことには、本発明の組成物は、最大の治癒的効力を達成するために非免疫原性である。従って、本発明では、例えば、ＣＣＲ２配列を、ＣＣＲ２配列がタンパク質性成分（例えば、異種アミノ酸配列）または非タンパク質性成分（例えば、ＰＥＧ）（これらのそれぞれが循環における組成物の半減期を延ばすことができる）に結合される複合体で含むことが想定される。
【００６１】
従って、本発明の１つの態様によれば、ＭＣＰ−１と結合することができる、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを好ましくは有さないＣＣＲ２アミノ酸配列（例えば、翻訳されたＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４７／ＮＰ＿０００６３８のアミノ酸座標１〜４１、または、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４８／ＮＰ＿０００６３９の対応するアミノ酸座標）にコンジュゲート化された少なくとも１つの異種アミノ酸配列を含む非免疫原性分子が提供される。
【００６２】
下記の実施例の節において示されるように、新しく発見されたＭＣＰ−１結合ドメインを含む本発明のこの態様のキメラ分子（Ｅ３−ＩｇＧ）は、腫瘍細胞投与後１８日後であっても腫瘍の発達を阻害した。驚くべきことに、この同じキメラ分子は骨組織および肺組織への腫瘍転移を一層劇的に阻害した。まとめると、本発明の知見は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患（例えば、ガンなど）の治療における本発明の分子の使用を裏付けている。
【００６３】
本発明のこの態様のキメラ分子は、ＣＣＲ２のＥ３領域に向けられた抗体を産生させるためのキメラなＥ３（すなわち、ＫＬＨ−Ｅ３）の使用、それにより、ＣＣＲ２受容体をリガンド結合から阻害することを教示する国際特許出願公開ＷＯ９７／３１９４９に記載されるキメラ分子とは顕著に異なることに留意しなければならない。本発明の非免疫原性ペプチドは、ＣＣＲ２のリガンド（ＭＣＰ−１）を標的化し、それにより、リガンドを受容体結合から阻害するために使用される。従って、本発明の分子は非常に優れた治癒的抑制および特異性を可能にし、本発明の分子は容易に合成および投与することができ、また、大きい生物利用能によって特徴づけられる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、ＭＣＰ−１はＣＣＬ２と交換可能に示され、哺乳動物（例えば、ヒト）のＭＣＰ−１タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００２９８２または同ＮＰ＿００２９７３で示されるタンパク質など）を示す。
【００６５】
本明細書中で使用される用語「非免疫原性」は、そのような物質が投与された対象において免疫応答を実質的に生じさせることができない物質を示す。例えば、ヒトにおいて非免疫原性であるとは、本発明のこの態様のキメラ分子をヒトの適切な組織と接触させたとき、キメラ分子に対する感受性または抵抗性の何らかの状態が、適切な潜伏期間（例えば、８日〜１４日）の後でのキメラ分子の２回目の投与のときにはっきり現れないことを意味する。
【００６６】
本明細書中で使用される「ＣＣＲ２アミノ酸配列」は、ＭＣＰ−１についての親和性結合を有する、哺乳動物（例えば、ヒト）のケモカインＣ−Ｃ受容体２タンパク質のペプチド部分を示す。１つだけのＣＣＲ２アミノ酸配列が本発明の分子に含まれ得ること、しかし、それぞれがＣＣＲ２と（好ましくは、大きい親和性で）結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ２アミノ酸配列（例えば、配列番号９）を含むことが好ましい場合があることに留意しなければならない。増大した結合活性のために、これらのポリペプチドはＭＣＰ−１活性の強力な阻害剤として使用することができ、また、より少ない投薬量を投与することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される「親和性結合」は、少なくとも１０−６Ｍの最小ＫＤ値を示す。
【００６８】
ＣＣＲ２タンパク質の例がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４７および同ＮＰ＿０００６３９．１において提供される。述べられたように、本発明のこの態様のＣＣＲ２は、好ましくはＮ末端ドメインを有していないが、Ｅ３ドメイン（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４７のアミノ酸座標２７３〜２９２、配列番号２）またはその模倣体を保持する。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「模倣体」は、ペプチドに関連して作製されるとき、ＭＣＰ−１との相互作用において本発明のペプチドに対する代用物として役立つ分子構造体を示す［ペプチド模倣体の総説については、Ｍｏｒｇａｎ他（１９８９）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２４：２４３〜２５２］。
【００７０】
ペプチド模倣体は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸および／またはペプチド結合を含有してもしなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造的特徴および機能的特徴を保持する合成された構造体（既知および未だ知られていないもの）を含む。模倣体を作製するために利用することができるアミノ酸のタイプが本明細書中下記においてさらに記載される。用語「ペプチド模倣体」にはまた、Ｎ置換アミノ酸のペプチドまたはオリゴマーであるペプトイドおよびオリゴペプトイドが含まれる［Ｓｉｍｏｎ（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７〜９３７１］。ペプチド模倣体としてさらに含まれるものがペプチドライブラリーであり、これは、所与のアミノ酸長であるように設計され、かつ、それに対応するアミノ酸のすべての考えられる配列を表すペプチドの集団である。ペプチド模倣体を製造するための方法が本明細書中下記に記載される。
【００７１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、ＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列を含み、配列番号１によって示される核酸配列によってコードされ得る。
【００７２】
本発明のこの態様の別の好ましい実施形態によれば、本発明のこの態様の分子は配列番号１４または配列番号１５に示される通りである。
【００７３】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、上で言及されたような、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細は本明細書中下記に示される。
【００７４】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００７５】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００７６】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００７７】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００７８】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００７９】
下記の表１および表２には、本発明で使用される天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば合成アミノ酸、表２）が示される。
【００８０】
本発明のペプチドは、好ましくは、ペプチドが可溶性形態であることを要求する治癒剤または診断剤において利用されるので、本発明のペプチドは、好ましくは、ペプチド溶解性をそれらのヒドロキシル含有側鎖のために増大させることができるセリンおよびトレオニン（これらに限定されない）をはじめとする、１つ以上の非天然型または天然型の極性アミノ酸を含む。
【００８１】
本発明のペプチドは好ましくは線状形態で利用されるが、環化がペプチドの特性を大きく妨害しない場合には、ペプチドの環状形態もまた利用され得ることが理解される。
【００８２】
本明細書中上記で記載されるようなペプチド模倣体の作製は、例えば、ディスプレー技術を含めて、様々な方法を使用して達成することができる。
【００８３】
従って、本発明では、ＣＣＲ２のＥ３のポリペプチド配列（例えば、配列番号２）に由来する少なくとも２個の連続するアミノ酸、少なくとも３個の連続するアミノ酸、少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも７個の連続するアミノ酸、少なくとも１１個の連続するアミノ酸、少なくとも１５個の連続するアミノ酸をそれぞれが呈示する多数のディスプレービヒクル（例えば、ファージ、ウイルスまたは細菌など）を含むディスプレーライブラリーが意図される。
【００８４】
そのようなファージライブラリーを構築する様々な方法が当該技術分野では広く知られている。そのような方法が、例えば、Ｙｏｕｎｇ ＡＣ他、「クリプトコッカス・ネオフォルマンスに対する多糖結合抗体およびファージディスプレーライブラリー由来ペプチドとのその複合体の三次元構造：ペプチドミモトープを特定するための密接な関係」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９７（１２月１２日）、２７４（４）：６２２〜３４；Ｇｉｅｂｅｌ ＬＢ他、「環状ペプチドファージライブラリーのスクリーニングによるストレプトアビジンと大きい親和性で結合するリガンドの特定」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５（１１月２８日）、３４（４７）：１５４３０〜５；Ｄａｖｉｅｓ ＥＬ他、「ニワトリの免疫グロブリン遺伝子に由来するライブラリーを使用する特異的なファージディスプレー抗体の選択」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５（１０月１２日）、１８６（ｌ）：１２５〜３５；Ｊｏｎｅｓ Ｃ ＲＴ他、「分子認識およびバイオセパレーションにおける現在の傾向」、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ、１９９５（７月１４日）、７０７（１）：３〜２２；Ｄｅｎｇ ＳＪ他、「合成遺伝子ライブラリーに由来する改善された炭水化物結合性単鎖抗体を選択するための基礎」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９５（５月２３日）、９２（１１）：４９９２〜６；Ｄｅｎｇ ＳＪ他、「ファージディスプレーによる改善された炭水化物結合性の抗体単鎖可変フラグメントの選択」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９４（４月１日）、２６９（１３）：９５３３〜８に記載される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００８５】
ペプチド模倣体はまた、コンピュータを利用した生物学を使用して発見することができる。三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラム、例えば、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡ．他、１９９１、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）、ならびに、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＲＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２４、９４６において総説される）などを、ＭＣＰ−１と、予想されるペプチド模倣体との間での相互作用をモデル化し、それにより、特異的なＭＣＰ−１領域に結合する最大の確率を示すペプチドを特定するために利用することができる。タンパク質−ペプチド相互作用のコンピュータを利用したモデル化が合理的薬物設計において使用され、成功している。さらに詳しくは、Ｌａｍ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０；Ｗｌｏｄａｗｅｒ他、１９９３、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２、５４３；Ａｐｐｅｌｔ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、１、２３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、１、１０９；およびＭａｕｒｏ ＭＪ．他、２００２、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２０、３２５〜３４を参照のこと。
【００８６】
述べられたように、本発明のこの態様のキメラ分子は異種アミノ酸配列を含む。
【００８７】
本明細書中で使用される表現「異種アミノ酸配列」は、ＣＣＲ２アミノ酸配列の一部分を形成しない非免疫原性のアミノ酸配列を示す。この配列は、好ましくは、溶解性を本発明のこの態様のキメラ分子にもたらし、これにより、好ましくは、血清中におけるキメラ分子の半減期を増大させる。
【００８８】
異種アミノ酸配列は一般には、本発明のＣＣＲ２ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に局在化される。
【００８９】
述べられたように、少なくとも１つの異種アミノ酸配列を本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化することができる。例えば、少なくとも１つのＣＣＲ２アミノ酸配列を、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：１０２７〜１０３７などによって記載されるように、２つの異種配列の間に埋め込むことができる。異種アミノ酸配列はペプチド結合または非ペプチド結合のいずれによってもＣＣＲ２アミノ酸配列に結合することができる。異種アミノ酸配列に対するＣＣＲ２アミノ酸配列の結合は、直接的な共有結合性の結合（ペプチド結合または置換されたペプチド結合）によって、または、例えば、官能基を有するリンカーの使用などによる間接的な結合によって達成することができる。官能基には、限定されないが、遊離カルボン酸基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、遊離アミノ基（ＮＨ２）、エステル基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、ハロゲン化アシル基（（Ｃ（＝Ｏ）Ａ、式中、Ａは、フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージドである）、ハロゲン化物（フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージド）、ヒドロキシル基（ＯＨ）、チオール基（ＳＨ）、ニトリル基（Ｃ≡Ｎ）、遊離Ｃ−カルバミン酸基（ＮＲ”−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれは独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）が含まれる。
【００９０】
本発明のこの態様に従って使用することができる異種アミノ酸配列の一例が免疫グロブリンの配列であり、例えば、免疫グロブリン重鎖ドメインのヒンジ領域およびＦｃ領域などである（米国特許第６７７７１９６号を参照のこと）。本発明のこの態様のキメラ体における免疫グロブリン成分は、本明細書中下記でさらに議論されるように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇ４のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。
【００９１】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結された受容体配列から構築された様々なキメラ体（イムノアドヘシン）が当該技術分野で知られている。文献に報告されるイムノアドヘシンには、Ｔ細胞受容体の融合体［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：２９３６〜２９４０（１９８７）］、ＣＤ４の融合体［Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５〜５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：６８〜７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ、９：３４７〜３５３（１９９０）；Ｂｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：６６７〜６７０（１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）の融合体［（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１０：２２２１〜２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：１６４〜１６７（１９９１）］；ＣＤ４４の融合体［Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３〜１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８およびＢ７の融合体（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３：７２１〜７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４の融合体［Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：５６１〜５６９（１９９１）］；ＣＤ２２の融合体［Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ、６６：１１３３〜１１４４（１９９１）］；ＴＮＦ受容体の融合体［Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：１４８３〜１４８９（１９９１）］；ＮＰ受容体の融合体［Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２３０６０〜２３０６７（１９９１）］；および、ＩｇＥ受容体αの融合体［Ｒｉｄｇｗａｙ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１ １５：ａｂｓｔｒ、１４４８（１９９１）］が含まれる。
【００９２】
典型的には、そのような融合体において、キメラ分子は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。融合体はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対して、あるいは、重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域のすぐＮ末端側に対して作製することができる。
【００９３】
異種配列とＣＣＲ２アミノ酸配列との間での融合（コンジュゲート化）が行われる正確な部位は重要でない。具体的な部位が当該技術分野では広く知られており、そのような部位を、本発明のこの態様のキメラ分子の生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択することができる（下記の実施例の節の実施例３を参照のこと）。
【００９４】
重鎖の定常領域全体を本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化することが可能であり得るが、より短い配列を融合することが好ましい。例えば、重鎖定常領域の最初の残基が１１４であることを考えると、パパイン切断部位（これは化学的にはＩｇＧのＦｃを規定する；残基２１６）、または、他の免疫グロブリンの類似する部位の直ぐ上流側のヒンジ領域において始まる配列が融合体において使用される。特に好ましい実施形態において、ＣＣＲ２アミノ酸配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３の重鎖のヒンジ領域ならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに融合される（米国特許第６７７７１９６号を参照のこと）。融合が行われる正確な部位は重要でなく、最適な部位を日常的な実験によって決定することができる。
【００９５】
述べられたように、本発明のこの態様のキメラ分子の構築において使用される免疫グロブリン配列はＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖定常ドメインに由来し得る。ヒトのＩｇＧ１免疫グロブリン配列およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用することの大きな利点は、ＩｇＧ１が固定化プロテインＡにおいて効率的に精製できることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製では、著しく好都合な媒体ではないが、プロテインＧが要求される。しかしながら、免疫グロブリンの他の構造的性質および機能的性質を、具体的なキメラ構築物のためのＩｇＧ融合パートナーを選ぶときには考慮しなければならない。例えば、ＩｇＧ３のヒンジはより長く、より柔軟であり、従って、ＩｇＧ３のヒンジは、ＩｇＧ１に融合されたときには正しく折り畳まれ得ないか、または、正しく機能しないことがあるより大きいＣＣＲ２アミノ酸配列を受け入れることができる。別の検討事項は価数である場合がある：ＩｇＧは二価のホモ二量体であり、これに対して、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体構造または五量体構造をそれぞれ生じさせ得る。本発明のこの態様のキメラ分子の免疫グロブリン部分を選択することにおける他の検討事項が米国特許第６７７７１９６号に記載される。
【００９６】
従って、本発明のこの態様のキメラ分子は、上記で記載されたように、異種アミノ酸配列を含むことができる。
【００９７】
加えて、または、代替として、本明細書中上記で述べられたように、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列（これはＭＣＰ−１と結合することができる）は非タンパク質性成分に結合させることができ、そのような分子は対象において特定の非免疫原性である。そのような分子は非常に安定であり（おそらくは非タンパク質性成分によってもたらされる立体的障害のためにインビボでのタンパク質分解活性に対して抵抗性であり）、また、本明細書中下記においてさらに記載されるように、安価であり、かつ、非常に効率的である一般的な固相合成法を使用して製造することができる。しかしながら、組換え技術を依然として使用することができ、従って、組換えペプチド生成物はインビトロ修飾（例えば、本明細書中下記においてさらに記載されるようなＰＥＧ化）に供されることが理解される。
【００９８】
述べられたように、ＣＣＲ２アミノ酸配列は非タンパク質性成分に結合される。本明細書中で使用される表現「非タンパク質性成分」は、上記のＣＣＲ２アミノ酸配列に結合される、（ペプチド結合した）アミノ酸を含まない分子を示す。現時点で好ましい実施形態によれば、本発明のこの態様の非タンパク質性成分はポリマーまたはコポリマー（合成または天然）である。本発明の非タンパク質性成分の限定されない例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ジビニルエーテルおよびマレイン酸無水物のコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ；例えば、Ｋａｎｅｄａ Ｙ他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２３９：１６０〜５を参照のこと）、および、ポリ（スチレンｃｏマレイン酸無水物）（ＳＭＡ；例えば、Ｍｕ Ｙ他、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、２５５：７５〜９を参照のこと）が含まれる。
【００９９】
そのような非タンパク質性成分のバイオコンジュゲート化は、その生物学的活性を保持し、かつ、その半減期を延ばしながら、安定性（例えば、プロテアーゼ活性に対して）および／または溶解性（例えば、生物学的流体（例えば、血液、消化液など）において）を有するＣＣＲ２アミノ酸配列をもたらす。バイオコンジュゲート化は、短い半減期および血液からの迅速なクリアランスを示す治癒的タンパク質の場合には特に好都合である。バイオコンジュゲート化されたタンパク質の血漿中の増大した半減期は、タンパク質コンジュゲートの増大したサイズ（これにより、その腎糸球体ろ過が制限される）およびポリマーの立体的障害による低下したタンパク質分解から生じている。一般には、ペプチドあたりの結合したポリマー鎖が多くなるほど、半減期の延長が大きくなる。しかしながら、様々な対策が、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列の特異的な活性（すなわち、ＭＣＰ−１結合）を低下させないために取られる。
【０１００】
ＰＥＧによるＣＣＲ２アミノ酸配列のバイオコンジュゲート化（すなわち、ＰＥＧ化）を、ＰＥＧ誘導体を使用して、例えば、ＰＥＧカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、モノメトキシＰＥＧ２−ＮＨＳ、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボナート誘導体、ＰＥＧのグリシジルエーテル、ＰＥＧのｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＰＥＧ−ＮＰＣ、例えば、メトキシＰＥＧ−ＮＰＣなど）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、カルボニルジイミダゾール活性化ＰＥＧ、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−マレイミドなどを使用して達成することができる。そのようなＰＥＧ誘導体が様々な分子量で市販されている［例えば、カタログ（ポリエチレングリコールおよび誘導体、２０００）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｌｌｅ、Ａｌａ．）を参照のこと］。所望であれば、上記誘導体の多くがモノ官能性のモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）形態で入手可能である。一般には、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列に付加されるＰＥＧは、分子量（ＭＷ）が数百ダルトン〜約１００ｋＤａの範囲でなければならない（例えば、３ｋＤａ〜３０ｋＤａ）。より小さいＭＷのＰＥＧを使用することができるが、より低分量のＰＥＧはＰＥＧ化ペプチドの収率のいくらかの喪失をもたらし得る。より小さいＭＷのＰＥＧについて得ることができる純度と同じくらい高い純度のより大きいＭＷのＰＥＧを得ることは困難である場合があるので、より大きいＰＥＧ分子の純度にも気をつけなければならない。少なくとも８５％の純度のＰＥＧ、より好ましくは、少なくとも９０％の純度、９５％の純度またはそれ以上の純度のＰＥＧを使用することが好ましい。分子のＰＥＧ化が、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９６））において第１５章に、また、Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、「ポリエチレングリコールのスクシンイミジルカルボナート」（ＤｕｎｎおよびＯｔｔｅｎｂｒｉｔｅ編、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９９１））においてさらに記載される。
【０１０１】
好都合には、ＰＥＧは、コンジュゲートの活性（すなわち、ＭＣＰ−１結合）が保持される限り、部位特異的変異誘発によってＣＣＲ２アミノ酸配列における選ばれた位置に結合させることができる。例えば、配列番号１に示されるようなＣＣＲ２アミノ酸配列の５位におけるシステイン残基がＰＥＧ化のために標的であり得る。加えて、または、代替として、他のシステイン残基をＣＣＲ２アミノ酸配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）付加することができ、それにより、ＰＥＧ化のために標的として役立たせることができる。コンピュータ分析を、活性を損なうことを伴わない変異誘発のための好ましい位置を選択するために行うことができる。
【０１０２】
活性化ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＶＳ）、ＰＥＧ−アクリラート（ＡＣ）、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドなど）の様々なコンジュゲート化化学を用いることができる。活性化ＰＥＧ分子を調製する様々な方法が当該技術分野では知られている。例えば、ＰＥＧ−ＶＳは、ＰＥＧ−ＯＨのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液をＮａＨと反応し、次いで、ジビニルスルホンと反応することによってアルゴン下で調製することができる（モル比；ＯＨ １：ＮａＨ ５：ジビニルスルホン ５０、０．２グラムＰＥＧ／ｍＬ（ＤＣＭ））。ＰＥＧ−ＡＣが、ＰＥＧ―ＯＨのＤＣＭ溶液をアクリロイルクロリドおよびトリエチルアミンと反応することによってアルゴン下で作製される（モル比；ＯＨ １：アクリロイルクロリド １．５：トリエチルアミン ２、０．２グラムＰＥＧ／ｍＬ（ＤＣＭ）で）。そのような化学基を、線状化された２アームＰＥＧ分子、４アームＰＥＧ分子または８アームＰＥＧ分子に結合することができる。
【０１０３】
システイン残基へのコンジュゲート化は、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列がＰＥＧ化され得る１つの好都合な方法ではあるが、他の残基もまた、所望であれば、使用することができる。例えば、無水酢酸を、ＣＯＯＨ基、Ｓ−−Ｓ基または−−ＳＣＨ３基とではなく、ＮＨ２基およびＳＨ基と反応させるために使用することができ、一方、過酸化水素を、ＮＨ２基とではなく、ＳＨ基および−−ＳＣＨ３基と反応させるために使用することができる。反応を、十分に確立された反応性を利用する化学反応を用いて、ペプチドにおける所望される残基に対するコンジュゲート化のために適切である条件のもとで行うことができる。
【０１０４】
ＰＶＰとの本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列のバイオコンジュゲート化のために、末端ＣＯＯＨを有するＰＶＰが、ラジカル開始剤としての４，４’−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）および連鎖移動剤としての３−メルカプトプロピオン酸の助けをかりたジメチルホルアミド中でのラジカル重合によってＮ−ビニル−２−ピロリドンから合成される。平均分子量Ｍｒが６０００である得られたＰＶＰを高速液体クロマトグラフィーによって分離および精製することができ、合成ＰＶＰの末端ＣＯＯＨがＮ−ヒドロキシスクシンイミド／ジシクロヘキシルカルボジイミド法によって活性化される。ＣＣＲ２アミノ酸配列が６０倍モル過剰の活性化ＰＶＰと反応させられ、反応がアミノカプロン酸（活性化ＰＶＰに対して５倍モル過剰）により停止される（これは本質的には、Ｈａｒｕｈｉｋｏ Ｋａｍａｄａ他、２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０：６４１６〜６４２０（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される通りである）。
【０１０５】
得られるコンジュゲート化されたＣＣＲ２分子（例えば、ＰＥＧ化ＣＣＲ２またはＰＶＰ−コンジュゲート化ＣＣＲ２）は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、分離、精製および定量される。加えて、本発明のこの態様の精製されたコンジュゲート化分子は、本質的には他のケモカインについて記載されるように［例えば、ＭＩＰ−１α、例えば、Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ Ｊ、１９９８（上掲）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）を参照のこと］、例えば、ＭＣＰ−１のその受容体（例えば、ＣＣＲ２）に対する結合特異性が本発明のＣＣＲ２コンジュゲートの存在下または非存在下で試験されるインビトロアッセイを使用してさらに定量することができる。
【０１０６】
本発明のこの態様の分子は、例えば、様々な標準的な固相技術を使用することなどによって生化学的に合成することができる。これらの方法には、完全固相合成、部分固相合成法、フラグメント縮合および古典的溶液合成が含まれる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａである）とき、および／または、ペプチドが組換え技術によって産生できないとき（すなわち、核酸配列によってコードされないとき、例えば、本明細書中下記においてさらに記載される「タグ」など）に使用され、従って、異なる化学を伴う。
【０１０７】
様々な固相ペプチド合成手法が当該技術分野では広く知られており、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）によってさらに記載される。
【０１０８】
合成ペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【０１０９】
多量の本発明のペプチドが所望される場合、本発明のペプチドは、例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁などによって記載される組換え技術を使用して作製することができる。
【０１１０】
簡単に記載すると、本発明の（場合により、異種アミノ酸配列をコードする核酸配列に読み枠を合わせて融合された）ＣＣＲ２アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド（すなわち、その天然に存在する供給源から単離されたポリヌクレオチド、例えば、配列番号１０）を調節エレメント（例えば、プロモーターなど）の転写制御下に設置されて含む発現構築物（すなわち、発現ベクター）が宿主細胞に導入される。
【０１１１】
例えば、本発明のＣＣＲ２ペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号１）が、免疫グロブリンのｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号３および配列番号５）に読み枠を合わせて連結される。ゲノムの免疫グロブリンフラグメントの連結もまた使用され得ることが理解される。この場合、融合は、発現のために免疫グロブリン調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションによって、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、脾臓または末梢血リンパ球に由来するｃＤＮＡライブラリーから、発表された配列に基づいて単離することができる。ＣＣＲ２アミノ酸配列および免疫グロブリンをコードする核酸を、選択された宿主細胞における効率的な発現（これは本明細書中下記でさらに記載される）を導く発現構築物（ベクター）にタンデムで連結することができる。哺乳動物細胞における発現のために、ｐＲＫ５に基づくベクター［Ｓｃｈａｌｌ他、Ｃｅｌｌ、６１：３６１〜３７０（１９９０）］、および、ＣＤＭ８に基づくベクター［Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０（１９８９）］を使用することができる。正確な接合を、オリゴヌクレオチド特異的欠失変異誘発［Ｚｏｌｌｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８２）；Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５〜５３１（１９８９）］を使用して、設計された接合部コドンの間の余分な配列を除くことによって生じさせることができる。それぞれの半分が所望の接合部の両側での配列に対して相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができる；理想的には、これらは１１ｍｅｒ〜４８ｍｅｒである。あるいは、ＰＣＲ技術を、適切なベクターと読み枠を合わせて分子の２つの部分をつなぐために使用することができる。
【０１１２】
発現構築物を宿主細胞に導入する様々な方法が当該技術分野で広く知られており、これらには、エレクトロポレーション、リポフェクションおよび化学的形質転換（例えば、リン酸カルシウム）が含まれる。下記の実施例の節の実施例２もまた参照のこと。
【０１１３】
「形質転換された」細胞は、核酸配列によってコードされるキメラ分子の発現を可能にする好適な条件のもとで培養される。
【０１１４】
所定の期間の後、発現したキメラ分子が細胞または細胞培養物から回収され、精製が組換えポリペプチドの最終的な使用に従って行われる。
【０１１５】
利用された宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー配列、転写ターミネーターなどを含めて、数多くの好適な転写エレメントおよび翻訳エレメントはどれも、発現ベクターにおいて使用することができる［例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４を参照のこと］。
【０１１６】
（キメラ体をコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現した融合タンパク質の安定性、産生、精製、収率または毒性を最適化するために操作された配列を含むことができる。
【０１１７】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、融合タンパク質をコードする配列を発現させるための宿主−発現系として使用することができる。これらには、微生物、例えば、キメラ体をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；キメラ体をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母など；キメラ体をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させた植物細胞系、または、キメラ体をコードする配列を含有する組換え植物発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムが、好ましくは、本発明のキメラ体を発現させるために使用される。
【０１１８】
本発明の分子を発現させるための宿主細胞株の選択は、主として、発現ベクターに依存する。真核生物発現システムが、これらは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を可能にするので好ましい（例えば、哺乳動物および昆虫）。別の検討事項は、要求されるタンパク質の量である。ミリグラム量を、多くの場合、一過性トランスフェクションによって産生させることができる。例えば、アデノウイルスＥＩＡにより形質転換された２９３ヒト胚性腎臓細胞株は、効率的な発現を可能にするためにリン酸カルシウム法の改変によってｐＲＫ５系ベクターにより一過性にトランスフェクションすることができる。ＣＤＭ８系ベクターを、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってＣＯＳ細胞をトランスフェクションするために使用することができる［Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３〜１３１３（１９９０）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳ、９：３４７〜３５３（１９９０）］。より多量のタンパク質が所望であれば、分子は宿主細胞株の安定的な形質転換の後で発現させることができる（実施例の節の実施例２を参照のこと）。分子のＮ末端における疎水性のリーダー配列の存在はトランスフェクション細胞による分子のプロセシングおよび分泌を確実にすることが理解される。
【０１１９】
細菌宿主系または酵母宿主系の使用は、製造コストを軽減するために好ましい場合があることが理解される。しかしながら、細菌宿主系はタンパク質グリコシル化機構を有していないので、産生後のグリコシル化が必要となる場合がある。
【０１２０】
いずれの場合でも、形質転換された細胞は、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えキメラ分子を産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には、典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養は、組換え細胞のために適切である温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１２１】
製造のために使用されたベクターおよび宿主の系に依存して、本発明の生じたタンパク質は組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、大腸菌における細胞周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外膜に保持され得る。
【０１２２】
培養での所定の時間の後、組換えタンパク質の回収が行われる。表現「組換えタンパク質を回収すること」は、タンパク質を含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を伴う必要はない。本発明のタンパク質は、様々な標準的なタンパク質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマト分画および示差的可溶化（これらに限定されない）など）を使用して精製することができる。
【０１２３】
本発明の分子は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」は、本明細書中下記で記載される種々の適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【０１２４】
免疫グロブリンのアミノ酸配列を含むキメラ分子はアフィニティークロマトグラフィーによって都合良く精製することができる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの好適性は、キメラ体において使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを、ヒトのγ１重鎖、γ２重鎖またはγ４重鎖に基づくキメラ分子を精製するために使用することができる［Ｌｉｎｄｍａｒｋ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２：１〜１３（１９８３）］。プロテインＧが、好ましくは、すべてのマウスイソタイプについて、また、ヒトγ３について使用される［Ｇｕｓｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：１５６７〜１５７５（１９８６）］。アフィニティーリガンドが結合される固体担体は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の固体担体もまた利用可能である。機械的に安定な固体担体（例えば、制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど）は、アガロースを用いて達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。キメラ分子をプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティーカラムに結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴、すなわち、その種およびイソタイプによって完全に決定される。一般には、適切なリガンドが選ばれるとき、効率的な結合が未調整の培養液から直接に生じる。本発明のこの態様のキメラ分子の１つの特徴的な特徴が、ヒトγ１分子については、プロテインＡについての結合能が、同じＦｃタイプの抗体と比較して若干低下することである。本発明のこの態様の結合したキメラ分子は、酸性ｐＨ（約３．０以上）において、または、穏和なカオトロピック塩を含有する中性ｐＨ緩衝液で、そのどちらでも効率よく溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により、９５％を超える純度のキメラ分子調製物を得ることができる。医療用規格の純度が治癒的適用のためには不可欠である。
【０１２５】
当該技術分野で知られている他の方法を、免疫グロブリンの一部分を含むキメラ分子を精製するために、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーに加えて使用することができる。そのようなキメラ分子はイオウ親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー［Ｈｕｔｃｈｅｎｓ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５９：２１７〜２２６（１９８６）］および固定化金属キレートクロマトグラフィー［Ａｌ−Ｍａｓｈｉｋｈｉ他、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、７１：１７５６〜１７６３（１９８８）］において抗体と同様に挙動する。しかしながら、抗体とは対照的に、イオン交換カラムでのその挙動は、その等電点によってだけではなく、そのキメラ性のために分子に存在し得る電荷双極子によってもまた決定される。
【０１２６】
本発明の分子は、ＣＣＲ２と、例えば、そのＥ３ドメインを介して結合する任意のリガンドと結合させるために使用され得ることが理解される。これらには、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８およびＣＣＬ１３が含まれ得る［Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ（２００３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２７３：３〜１３］。
【０１２７】
本発明のこの態様の分子は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために使用することができる。
【０１２８】
従って、本発明の別の態様によれば、その必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法が提供される。この方法は、本発明の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む。
【０１２９】
本明細書中で使用される用語「対象」は哺乳動物対象を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。
【０１３０】
本明細書中で使用される用語「治療すること」は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の有害な作用を防止すること、治癒すること、逆戻りさせること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、または、停止させることを示す。
【０１３１】
本明細書中で使用される表現「ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患」は、発症または進行についてＭＣＰ−１とその受容体（ＣＣＲ２）との間での相互作用に依存する疾患を示す。
【０１３２】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の例には、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン（例えば、前立腺ガン、乳房のガン腫、乳ガン、神経膠芽細胞腫、食道ガン、神経芽細胞腫）、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明の分子は、それ自体で、あるいは、本発明の分子が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物において対象に投与することができる。
【０１３４】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。好ましくは、医薬組成物は免疫原性ではない。
【０１３５】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を担うことができる本発明の分子を示す。
【０１３６】
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【０１３７】
従って、例えば、本発明の医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含むことができる。
【０１３８】
あるいは、本発明によって使用される医薬的に許容され得るキャリアは埋め込み用物質（例えば、ポリオール（すなわち、炭水化物）など）を含むことができる。賦形剤としての使用に好適である炭水化物の限定されない例には、マルトデキストリン（例えば、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、トレハロース（例えば、Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、Ｍｅｒｃｋ）、セロビオース、グルコース、フルクトース、マルツロース、ｉｓｏ−マルツロース、ラクツロース、マルトース、ゲントビオース、ラクトース、イソマルトース、マルチトール（例えば、Ｍａｌｔｉｓｏｒｂ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、ラクチトール、エリトリトール、パラチニトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ズルシトールおよびリビトール、スクロース、ラフィノース、ゲンチアノース、プランテオース、ベルバスコース、スタキオース、メレジトース、デキストランおよびイノシトールが含まれる。
【０１３９】
さらに代替として、本発明によって使用される医薬的に許容され得るキャリアは、経口投与に好適なミクロスフェアである。例えば、ミクロスフェアは、本質的には米国特許第６８４９２７１号（Ｖａｇｈｅｆｉ他）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、胃において見出されるｐＨレベル（４未満のｐＨレベル）での溶解または酸分解に対して抵抗性がある有機物質の水不溶性マトリックスを含むことができる。そのような有機マトリックス物質は、例えば、トリグリセリド、水素化植物油、ワックスまたはワックスの混合物、ポリアルコキシアルキルエーテル、ポリアルコキシアルキルエステル、および、水不溶性の部分的に分解されたタンパク質が可能である。
【０１４０】
バイオコンジュゲート化ポリマー（例えば、本発明のＰＥＧ化ＣＣＲ２ペプチド）は、医薬的に許容され得るキャリアにおいて、または、医薬的に許容され得るキャリアの一部として使用することができ、従って、ＣＣＲ２アミノ酸配列を送達するためのキャリア分子として役立ち、一方で、同時に送達ビヒクルの成分として役立つことが理解される。この二重使用の好ましい実施形態が、例えば、米国特許出願公開第２００３０１８６８６９号（Ｐｏｉａｎｉ，Ｇｅｏｒｇｅ他）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、リポソームビヒクル（例えば、ＰＥＧコンジュゲート化リポソーム）である。
【０１４１】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１４２】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４３】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１４４】
あるいは、例えば、患者の身体の特定部位に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与しうる。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１４６】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１４７】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１４８】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１４９】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１５０】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１５１】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１５２】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１５３】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１５４】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１５５】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１５６】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１５７】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療効果的な量（治癒効果的な量）」は、治療されている対象の病状（例えば、虚血）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（例えば、核酸構築物）の量を意味する。
【０１５８】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５９】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、用量または治療効果的な量は、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は所望の濃度または力価を得るために動物モデルにおいて配合することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１６０】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ，（１９７５年）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
【０１６１】
投薬量および投薬間隔は、生物学的作用を誘導または抑制するための有効成分の十分な血漿中レベルまたは脳内レベル（すなわち、最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０１６２】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１６３】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１６４】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。医薬的に許容され得るキャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上で詳細に記載されたように、適応される状態の治療のために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１６５】
本発明のこの態様の分子（例えば、キメラのタンパク質性分子）は遺伝子療法によって対象に提供され得ることが理解される。従って、上記の哺乳動物発現構築物を、本明細書中上記で記載される任意の好適な投与様式を用いて対象に投与することができる（すなわち、インビボ遺伝子療法）。あるいは、核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および必要とされるような発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、対象に戻される（すなわち、エクスビボ遺伝子療法）。
【０１６６】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）など）によるトランスフェクション、および、脂質に基づくシステムが含まれる。遺伝子の脂質媒介による移入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌなどである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子療法において使用される最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー、または、遺伝子座を規定するエレメント、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、メッセンジャーの選択スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾など）によって制御する他のエレメントを含む。そのようなウイルス構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されたウイルスに対して適切なプラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、構築物が置かれている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列であり、例えば、Ｉｇκのリーダー配列（例えば、配列番号７および配列番号８など）である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を導くシグナル、ならびに、１つ以上の制限部位、および、翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。非ウイルスである他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなど）。
【０１６７】
ＭＣＰ−１に対する本発明のＣＣＲ２ペプチドの親和性はＭＣＰ−１の精製および検出におけるその使用を可能にする。
【０１６８】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、タグおよび本発明のＣＣＲ２ペプチドを含む分子が提供される。
【０１６９】
本明細書中で使用される用語「タグ」は、結合性パートナー（例えば、抗体分子、キレーター分子またはアビジン（ビオチン）分子など）によって特異的に認識される成分を示す。タグは、その生物学的活性（例えば、ＭＣＰ−１結合）を妨害しない限り、ＣＣＲ２ペプチドのＣ末端またはＮ末端に設置することができる。
【０１７０】
例えば、タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープを提供するための十分な残基を有するが（すなわち、エピトープタグ）、ＣＣＲ２ペプチドの生物学的活性を妨害しないように十分に短い。エピトープタグは好ましくはまた、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり特有である。好適なタグポリペプチドは一般には少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常的には約８個〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは、約９個〜３０個の残基）を有する。例えば、ポリヒスチジン配列が好ましく、この配列はニッケルと結合し、これにより、記載されたように［Ｌｉｎｄｓａｙ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１７：５７１〜５７４（１９９６）］、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによるタグ化タンパク質の単離を可能にする。
【０１７１】
ＣＣＲ２のかかるエピトープタグ化形態が望ましい。これは、その存在がタグポリペプチドに対する標識化抗体を使用して検出され得るからである。また、エピトープタグの提供は、本発明のＣＣＲ２ペプチドが、抗タグ抗体を使用するアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。抗体を伴うアフィニティー精製技術および診断アッセイが本明細書中下記に記載される。
【０１７２】
様々なタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体が当該技術分野では広く知られている。例には、インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９〜２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する抗体の８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Ｅｖａｎ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０〜３６１６（１９８５））；および、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）およびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドが開示されている。例には、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４〜１２１０（１９８８）］、ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２〜１９４（１９９２）、α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３〜１５１６６（１９９１）］、および、Ｔ７の遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３〜６３９７（１９９０）］が挙げられる。タグポリペプチドが選択されると、それに対する抗体を、当該技術分野で広く知られている方法を使用して作製することができる。そのような抗体が、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）などから市販されている。
【０１７３】
本発明のこの態様の分子は、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離するために、または、生物学的サンプルにおけるＭＣＰ−１の存在を検出するために使用することができる。
【０１７４】
本明細書中で使用される表現「生物学的サンプル」は、ＭＣＰ−１が存在する生物学的流体を示し、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、涙液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、腹水、膿および馴化培地などを示す。
【０１７５】
本発明のこの態様によるＭＣＰ−１の単離は、生物学的サンプルを本発明のこの態様の分子と接触させ、その結果、ＭＣＰ−１および分子が（分子がＭＣＰ−１に結合することを可能にする緩衝液、温度条件を使用して）複合体を形成するようにすること（例えば、Ｄａｔｔａ−ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ（２００４、上掲）を参照のこと）、および、複合体を単離し、それにより、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離することによって行われる。
【０１７６】
複合体を単離するために、分子は、好ましくは、固体担体に固定化される。本明細書中で使用される表現「固体担体」は、目的とする試薬（例えば、本発明のこの態様の分子）が接着することができる非水性マトリックスを示す。固体担体の例には、一部または全体がガラス（例えば、制御細孔ガラス）から形成される固体担体、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、状況に依存して、固体担体はアッセイプレートの壁を含むことができる。他の実施形態では、固体担体は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、ばらばらの粒子（例えば、米国特許第４２７５１４９号に記載される粒子など）の不連続な固相を包含する。
【０１７７】
あるいは、そのような分子は、生物学的サンプルにおけるＭＣＰ−１のレベルを検出するために使用することができる。診断適用のために、分子は典型的には、検出可能な成分により標識される。検出可能な成分は、検出可能シグナルを直接的または間接的のどちらかで生じさせることができる任意の成分が可能である。例えば、検出可能な成分は、放射性同位体、蛍光性化合物もしくは化学発光性化合物、または、タグ（例えば、標識された抗体が結合することができる本明細書中上記で記載されるタグなど）であり得る。本発明の分子は、任意の知られているアッセイ方法（例えば、競合的結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、ならびに、免疫沈殿アッセイなど）において用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７頁〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）。
【０１７８】
本発明のこの態様の分子は、本発明のこの態様の分子、ならびに、場合により、固体担体および画像化試薬（例えば、抗体、発色性基質など）が、適切な緩衝液および保存剤とともに好適な容器に包装され、診断のために使用され得る診断キットにおいて含むことができる。
【０１７９】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１８０】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１８１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１８２】
（実施例１）
前立腺ガン患者はＭＣＰ−１に対する特異的な選択的抗体応答を示す
ＣＣＬ２と前立腺ガンとの関係が、前立腺ガン患者における、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）をはじめとする様々なケモカインに対する自己抗体の存在についてのＥＬＩＳＡ試験を使用して明らかにされた。
【０１８３】
材料および実験手順
患者標本−ヒトでの実験研究を、Ｈａｉｆａ（イスラエル）にあるＣＡＲＭＥＬ医療センターおよびＲＡＭＢＡＭ医療センターの泌尿器科との共同で行った。すべての血清サンプルおよび組織サンプルを、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ委員会承認番号１８２２（２００３年１１月１１日付け）のもと、ＲＡＭＢＡＭ病院の患者から得た。病理学的分析がＣＡＲＭＥＬ医療センターの泌尿器科のＡｖｉ Ｓｔｅｉｎ教授によって行われた。患者の臨床データが下記の表１に要約される。
【０１８４】
抗体（Ａｂ）力価の測定―それぞれ試験されたケモカインに対するＡｂ力価を、詳細が前述されたように、ＥＬＩＳＡ試験を使用して検出した（Ｗｉｌｄｂａｕｍ，Ｇ．、Ｍ．ＮａｈｉｒおよびＮ．Ｋａｒｉｎ、２００３、前炎症性メディエータに対する有益な自己免疫性は自己破壊性免疫の結果を抑制する、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９：６７９）。組換えヒトケモカイン：ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ−１９）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）およびＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）はすべてＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から購入した。ヒトＭＩＦをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭ）から購入した。
【０１８５】
結果
前立腺ガン患者はＭＣＰ−１に対する著しい自己抗体力価を示す
２３名の前立腺ガン患者、２１名の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）者および１１名のコントロール被験者（表３、下記）からの血清を、ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）、ＭＩＦ、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−３β（ＣＣＬ−１９）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）およびＭＣＰ−１（ＭＣＰ−１）を含めて、様々なケモカイン（特に、ガンに関係しているケモカイン）に対する自己抗体の存在について試験した。
【０１８６】
試験されたすべてのケモカインの中で、前立腺ガン患者は、ＭＣＰ−１に対してのみ非常に著しい抗体力価を有した（図１ａ、１１．８５±０．８のｌｏｇ２Ａｂ力価）。健常者およびＢＰＨ患者における抗ＭＣＰ−１抗体のベースライン力価（ｌｏｇ２）は５〜６であり、それ以外のケモカインのいずれかに対する応答において観測された力価とは異なっていなかった。従って、前立腺ガン患者はＭＣＰ−１に対する非常に特異的かつ選択的な抗体応答を示す（図１ａ、ｐ＜０．０１）。統計学的分析では、前立腺ガン患者の約８２％（１９／２３）および非悪性ＢＰＨ患者の４．７％（１／２１）のみがＭＣＰ−１に対する著しい応答（１０を超えるｌｏｇ２Ａｂ力価、ｐ＜０．０１）を示したことが明らかにされた。
【０１８７】
これらの結果は、ＭＣＰ−１とＣＣＲ２との相互作用の阻害が、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２によって調節されるガンおよび他の疾患を抑制するために使用され得ることを示唆している。
【０１８８】
（実施例２）
ＣＣＲ２キメラペプチド（Ｅ３−Ｉｇ）の作製および細胞株における安定的発現
材料および実験手順
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ構築物の作製
図２は、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧキメラ体を発現させるための構築物の例示を示す。このＩｇＧ１構築物を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの作製のために以前に利用した基本的プロトコル（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．、Ｃ．Ｌ．Ｈｏｆｓｔｒａ、Ｒ．Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｂ．Ｃｈａｎ、Ｉ．Ｖａｎ Ａｒｋ、Ｐ．Ｍ．ＪａｒｄｉｅｕおよびＦ．Ｐ．Ｎｉｊｋａｍｐ、１９９７、マウスＣＴＬＡ４−ＩｇＧ治療はアレルギー性喘息のマウスモデルにおいて気道の好酸球増加症および過剰応答を阻害し、ＩｇＥのアップレギュレーションを弱める、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１７：３８６）に従って、改変を伴いながら作製した：ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードするｃＤＮＡを、ＬＰＳおよびＩＬ−４により活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化した。ヒトＣＣＲ２−Ｅ３を、下記のような、ＣＣＲ２の６ドメイン（Ｅ３、それぞれ、配列番号１および配列番号２）の一部をコードするプライマーを使用して、ＬＰＳ活性化のヒトＰＢＭＣからサブクローン化した：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔｇｇｃｃｔｇａｇｔａａｃｔｇｔｇａａａｇ（配列番号１２）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｇｔｃｔｃｔｇｔｃａｃｃｔｇｃｇｔｇｇ（配列番号１３）。配列を確認した後、増幅されたＰＣＲ生成物をｐＳｅｃ−Ｔａｇ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化した。ヒトＩｇＧのＦｃγのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をＣＣＲ２（Ｅ３）の下流側においてプラスミド（ｐＳｅｃ−ＣＣＲ２）に連結して、融合タンパク質ＣＣＲ２−ＩｇＧを作製した。
【０１８９】
安定的なｐＳｅｃ−ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ発現細胞株の作製
ｐＳｅｃ−ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧプラスミドを、ジェットＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓｅトランスフェクション、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、フランス）を製造者のプロトコルに従って使用して、ＣＨＯ ＤＨＦＲミニ遺伝子ベクターとともに、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−／−）（これはＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士（コロンビア大学、米国）によって提供された）に同時トランスフェクションした。安定的なトランスフェクタント細胞を、ヒグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する培地で選択した。ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ融合タンパク質を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓｉａ、スウェーデン）から得られるプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムによって上清から精製し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用してウエスタンブロット分析によって確認した。
【０１９０】
（実施例３）
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧはＭＣＰ−１に特異的に結合する
ＭＣＰ−１と結合するＣＣＲ２のＥ３ドメインの能力をＥＬＩＳＡアッセイによって検討した。
【０１９１】
材料および実験手法
ＥＬＩＳＡ−様々な市販のヒトケモカイン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）に対するＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの結合特異性を下記のように直接ＥＬＩＳＡによって明らかにした：９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を１００ｎｇ／ｍｌの各ケモカインにより被覆し、洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳによりブロッキング処理した。その後、５μｇ／ｍｌの濃度でのＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧを加えた。ＨＲＰ標識されたマウス抗ヒトＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を二次抗体として加えた。結果が４５０ｎｍでの吸光度読み取りとして示される。抗ＣＣＬ２モノクローナル抗体（ＭＡＢ６７９；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭ）を陽性コントロール（１μｇ／ｍｌ）として使用した。
【０１９２】
結果
様々なケモカインに対するＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの結合をＥＬＩＳＡによって明らかにした。図３に示されるように、ＣＣＲ２のＥ３ドメインは、ＭＣＰ−１と結合するために十分であり、試験された他の因子と比較して、このケモカインに対するほぼ４倍大きい結合を示した。
【０１９３】
（実施例４）
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧはＭＣＰ−１誘導の細胞遊走を阻害する
材料および実験手順
細胞株
ＴＨＰ−１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ；ＡＴＣＣアクセション番号ＴＩＢ−２０２）から得て、製造者のプロトコルに従って成長させた。
【０１９４】
細胞遊走アッセイ―ＴＨＰ−１細胞のＭＣＰ−１誘発遊走を阻害するＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの能力を試験した。走化性アッセイを、ＴｒａｎｓＷｅｌｌチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔｅｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して行った。培地を伴うＴＨＰ−１細胞（１Ｘ１０６細胞／ウエル）を、可溶性ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが補充された、または、補充されなかった培地（組換えヒトＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭ））による下部チャンバーの平衡化の後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部チャンバーに加えた。その後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、７．５％ＣＯ２を含有する加湿空気において３７℃で３時間インキュベーションした。遊走している単球を下部チャンバーから集め、計数した。
【０１９５】
結果
図４は、可溶性ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが、用量依存的様式で、ＴＨＰ−１細胞のＭＣＰ−１誘発遊走を著しく、顕著に（９０％）阻止したことを示す。
【０１９６】
（実施例４）
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧは根本的にＰＣ−３腫瘍成長を低下させ、ＶＥＧＦ発現を減少させる
材料および実験手順
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるマウスの治療―６匹のＳＣＩＤ／Ｂｇマウスからなる３つの群に５ｘ１０６個／マウスのＰＣ−３Ｌｕｃ細胞を皮下投与した（Ｅｌ Ｈｉｌａｌｉ他、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５（Ｆｅｂ １）、１１（３）：１２５３〜８）。
【０１９７】
第１群はＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの反復投与（２００ｕｇ／マウス、ｉ．ｖ．、４日間隔）を受けた。第２群には、一致する量のＰＢＳが投与され、第３群には、イソタイプが一致したコントロールＩｇＧが投与された。後治療（すなわち、確立された腫瘍の治療）のために、投与をＰＣ−３細胞投与後１８日で開始した。
【０１９８】
ＶＥＧＦの検出−ｄｅ Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．、Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、Ｍ．ＤｅＬｕｃａ、Ｄ．Ｒ．ＨｅｌｉｎｓｋｉおよびＳ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、１９８７、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子：構造および哺乳動物細胞における発現、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、７：７２５；Ｒｕｂｉｏ，Ｎ．、Ｍ．Ｍ．ＶｉｌｌａｃａｍｐａおよびＪ．Ｂｌａｎｃｏ、１９９８、ルシフェラーゼ遺伝子を腫瘍細胞マーカーとして使用して可視化されたヌードマウスにおけるＰＣ−３前立腺腫瘍細胞のリンパ節への移動、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、７８：１３１５；Ｒｕｂｉｏ，Ｎ．、Ｍ．Ｌｏｒｇａｎｓは、ルシフェラーゼ遺伝子を定量可能な腫瘍細胞マーカーとして発現する前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞を使用して測定した（Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４４：１３３）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。動物を３０日目で屠殺し、腫瘍を回収し、切片化した。ＶＥＧＦを、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号が必要ならば、後日提供することが可能である）から得られるウサギ抗ＶＥＧＦを使用して検出した。
【０１９９】
ルシフェラーゼ活性−以前に記載されたように測定した。Ｅｌ Ｈｉｌａｌｉ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５（Ｆｅｂ １）、１１（３）：１２５３〜８を参照のこと。簡単に記載すると、動物を、ＣＯ２を使用して３０日目に屠殺した。肺および骨を回収し、液体窒素で凍結した。その後、凍結組織を粉末に粉砕し、溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。サンプルを数秒間ボルテックス処理し、混合物を２０分間遠心分離した（１３０００ｒｐｍ）。その後、ルシフェラーゼ基質を加えた。
【０２００】
結果
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療は根本的にＰＣ−３腫瘍成長を低下させる−図５ａに示されるように、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの反復投与は、ＰＣ−３腫瘍成長を、ＰＢＳまたはコントロールＩｇＧが投与されたマウスにおいて発達した腫瘍と比較して、完全に阻害した。
【０２０１】
ＣＣＲ２−Ｉｇによる後治療（１８日目）は、事前に確立された原発性腫瘍の発達、および、転移物を形成するその能力を阻止する−図５ｂは、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが腫瘍発達後（細胞注入の１８日目）に投与されたときでさえ、ＣＣＬ２の阻止は、原発性腫瘍の発達、および、転移を形成するその能力を劇的に低下させたことを明瞭に示す。腫瘍細胞投与後の中間日時（８日）の後でさえ、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧは腫瘍の発達を阻害することができた。
【０２０２】
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療は腫瘍転移を減少させる−図５ｃに示されるように、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるマウスの治療は、ルシフェラーゼ活性の減少によって示されるように肺組織および骨組織への腫瘍転移を著しく阻害した。両方の組織におけるルシフェラーゼ活性は、非治療動物と比較して１／４〜１／１０に低下し、全体的には、同じ最小レベル（すなわち、約０．５）に達した。
【０２０３】
ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによる治療は根本的にＶＥＧＦ発現を減少させる−図６ａ〜図６ｆに示されるように、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの投与（図６ａ、図６ｆ）は、イソタイプが一致するコントロールＩｇＧ（図６ｂ、図６ｅ）およびＰＢＳ（図６ｃ、図６ｆ）と比較して、腫瘍部位におけるＶＥＧＦ発現を劇的に減少させた。これは、ＣＣＲ２経路の遮断はＶＥＧＦの腫瘍誘導活性を阻害することを示唆している。
【０２０４】
（実施例５）
ＰＣ−３細胞のＣＣＬ２誘発遊走がＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによって阻害される
材料および実験手順
細胞遊走アッセイ−細胞遊走を、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して明らかにした。抗ＣＣＬ２をＭａｒｔｉｎｅｚ博士およびＭｅｌａｄｏ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｃｅｎｔｒｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ、ＵＡＭ Ｃａｍｐｕｓ ｄｅ Ｃａｎｔｏｂｌａｎｃｏ、Ｍａｄｒｉｄ、スペイン）から得た。簡単に記載すると、ＰＣ−３細胞（１０６個／ウエル）をトランスウエルプレートの上部チャンバーに加え、ＣＣＬ２（組換えヒトＭＣＰ−１、ＲＨＭＣＰ−１；２０ｎｇ／ｍｌ）を、図７に示されるように抗ＣＣＬ２（５０μｇ）および／またはＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ（２００μｇ）もまた補充された下部ウエルに加えた。３７℃での２時間のインキュベーションの後、遊走しているＰＣ−３細胞をＦＡＣＳによって集めた。結果が三連の平均±ＳＥとして示される。
【０２０５】
結果
前立腺ガン細胞に対するＣＣＬ２の可能性のある作用機構の１つが、ＣＣＬ２が腫瘍細胞を引き寄せることである。図７において認められ得るように、ＣＣＲ２−Ｉｇと一緒でのＣＣＬ２はＰＣ３細胞の遊走を抗ＣＣＬ２ｍＡｂよりも良好に阻害する。
【０２０６】
（実施例６）
ＣＣＲ２アミノ酸配列のＰＥＧ化
本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列を安定化するために、また、本発明のＣＣＲ２アミノ酸配列を経口投与および／または非経口投与のために好適にするために、下記の配列：ＬｙｓＧｌｙＬｅｕＳｅｒＡｓｎＣｙｓＧｌｕＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｎＬｅｕＡｓｐＧｌｎＡｌａＴｈｒＧｌｎＶａｌＴｈｒＧｌｕＴｈｒ（配列番号１１）（これは、リシン残基がそのＮ末端において付加されていることを除いて、配列番号１と同一である）を有するペプチドは、当該技術分野で知られている方法を使用してＰＥＧ化することができる（例えば、Ｃｒｏｙｌｅ、Ｍ．Ａ．他、２０００、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１１：１７２１〜１７３０；Ｃｒｏｙｌｅ、Ｍ．Ａ．他、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：９１２〜９２１）。例えば、モノメトキシポリ（エチレン）グリコールをスクシンイミジルスクシナート（これはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得ることができる）によって活性化することができる。活性化されると、このポリマーは約１０：１（ポリマー：ペプチド）の重量比でＣＣＲ２ペプチドに加えることができ、ＰＥＧ化反応が、穏やかな撹拌とともに２５℃でさらに行われる。反応を、加えられたＰＥＧの量に対して過剰（例えば、１０倍）のリシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の添加によって停止させることができる。未反応のＰＥＧ、過剰なリシン、および、反応副生成物が、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７．４）により平衡化されたＭｉｃｒｏ−Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ Ｐ−３０クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）での緩衝液交換によって除かれる。
【０２０７】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０８】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】前立腺ガン患者がＭＣＰ−１に対する非常に著しい自己抗体力価を選択的に発達させていることを示すグラフである。
【図２】本発明のヒトＩｇ−ＣＣＲ２ペプチド（Ｉｇ−Ｅ３）をコードする発現構築物の作製を示す概略的例示である。
【図３】ＣＣＲ２のＥ３ドメインがＭＣＰ−１に特異的に結合することを示す棒グラフである。
【図４】ヒトＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧがＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣアクセション番号ＴＩＢ−２０２）のＭＣＰ−１誘発遊走を阻害することができることを示す棒グラフである。
【図５ａ】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフであり、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの投与がＰＣ−３細胞の投与と同時に開始されたとき、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが腫瘍の成長を時間とともに減少させることができることを示すグラフである。
【図５ｂ−ｄ】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフであり、図５ｂは、ＰＣ−３細胞の投与後の１８日で開始されたとき（図５ｂ）、ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧが腫瘍の成長を時間とともに減少させることができることを示すグラフであり、図５ｄは、示されるようなＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるルシフェラーゼ発現ＰＣ−３細胞の骨転移および肺転移の阻害を、コントロール細胞に対する比較とともに示す棒グラフである。
【図５ｃ】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧ投与細胞とコントロールの（ＩｇＧ投与またはＰＢＳ治療）細胞との間で比較されたときの、原発性腫瘍およびその転移拡大物の発達を示すグラフであり、ＰＣ３細胞投与後８日で注射されたＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧの抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図６】ＣＣＲ２（Ｅ３）−ＩｇＧによるＣＣＬ−２の遮断により、ＶＥＧＦ産生が腫瘍部位において完全に抑制されることを示す写真である。
【図７】光学密度によって決定されたときの、ＣＣＬ２処理されたＰＣ３細胞の細胞遊走を示す棒グラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０２１０】
配列番号１は、ヒトのＣＣＲ２ Ｅ３ドメインのコード配列である。
配列番号２は、ヒトのＣＣＲ２ Ｅ３ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｉｇカッパリーダーのコード配列である。
配列番号８は、Ｉｇカッパリーダーのアミノ酸配列である。
配列番号９は、二つのタンデムＣＣＲ２ Ｅ３ドメインを含むポリペプチドである。
配列番号１０は、二つのタンデムＣＣＲ２ Ｅ３ドメインを発現するポリヌクレオチドである。
配列番号１１は、ＰＥＧ化のためのＮ’ Ｌｙｓ残基を付加されたＣＣＲ２ Ｅ３ドメインを含むペプチドである。
配列番号１２及び１３は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号１４は、Ｉｇカッパリーダー、ＣＣＲ２ Ｅ３ドメイン、免疫グロブリン重鎖定常領域及び６ＸＨｉｓタグからなるポリペプチドである。
配列番号１５は、Ｉｇカッパリーダー、ＣＣＲ２ Ｅ３ドメイン及び免疫グロブリン重鎖定常領域からなるポリペプチドである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化された異種アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が非免疫原性である分子。
【請求項２】
非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子。
【請求項３】
それぞれがＭＣＰ−１と結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子。
【請求項４】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列に結合したタグを含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができる分子。
【請求項５】
配列番号１４または配列番号１５に示される分子。
【請求項６】
請求項１、２、または３に記載の分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項７】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含み、非免疫原性である医薬組成物。
【請求項８】
請求項１、２、３、５、または７に記載の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の治療の必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法。
【請求項９】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための請求項１、２、３、５、または７に記載の分子の使用。
【請求項１０】
（ａ）ＭＣＰ−１および請求項４に記載の分子が複合体を形成するように、生物学的サンプルを請求項４に記載の分子と接触させること；および
（ｂ）前記複合体を単離し、それにより、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離すること
を含む、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離する方法。
【請求項１１】
前記異種アミノ酸配列は免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む、請求項１、６、８、または９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１２】
前記ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２に示される、請求項１、４、６、８、９、または１０に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１３】
前記ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患は、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記タグはエピトープタグである、請求項４または１０に記載の分子または方法。
【請求項１５】
請求項４の分子は固体担体に結合される、請求項４または１０に記載の分子または方法。
【請求項１６】
非タンパク質性成分に結合される、請求項１、２、３、５、または７に記載の分子。
【請求項１７】
前記非タンパク質性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群から選択される、請求項２、６、８、または９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１８】
前記医薬的に許容され得るキャリアは非経口投与のために配合される、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬的に許容され得るキャリアは実質的に非免疫原性である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記医薬的に許容され得るキャリアは炭水化物を含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記医薬的に許容され得るキャリアはミクロスフェアを含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記医薬的に許容され得るキャリアはリポソームを含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記医薬的に許容され得るキャリアはポリマーのミクロスフェアを含む請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の治療の必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法。
【請求項２６】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の使用。
【請求項２７】
前記ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２に示される、請求項２５または２６に記載の方法または使用。
【請求項２８】
前記ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患は、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法または使用。
【請求項２９】
前記分子は配列番号１４または配列番号１５に示される、請求項２５または２６に記載の方法または使用。
【請求項１】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列にコンジュゲート化された異種アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が非免疫原性である分子。
【請求項２】
非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子。
【請求項３】
それぞれがＭＣＰ−１と結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子。
【請求項４】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列に結合したタグを含む分子であって、前記ＣＣＲ２アミノ酸配列がＭＣＰ−１と結合することができる分子。
【請求項５】
配列番号１４または配列番号１５に示される分子。
【請求項６】
請求項１、２、または３に記載の分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項７】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含み、非免疫原性である医薬組成物。
【請求項８】
請求項１、２、３、５、または７に記載の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の治療の必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法。
【請求項９】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための請求項１、２、３、５、または７に記載の分子の使用。
【請求項１０】
（ａ）ＭＣＰ−１および請求項４に記載の分子が複合体を形成するように、生物学的サンプルを請求項４に記載の分子と接触させること；および
（ｂ）前記複合体を単離し、それにより、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離すること
を含む、ＭＣＰ−１を生物学的サンプルから単離する方法。
【請求項１１】
前記異種アミノ酸配列は免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む、請求項１、６、８、または９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１２】
前記ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２に示される、請求項１、４、６、８、９、または１０に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１３】
前記ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患は、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記タグはエピトープタグである、請求項４または１０に記載の分子または方法。
【請求項１５】
請求項４の分子は固体担体に結合される、請求項４または１０に記載の分子または方法。
【請求項１６】
非タンパク質性成分に結合される、請求項１、２、３、５、または７に記載の分子。
【請求項１７】
前記非タンパク質性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群から選択される、請求項２、６、８、または９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１８】
前記医薬的に許容され得るキャリアは非経口投与のために配合される、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬的に許容され得るキャリアは実質的に非免疫原性である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記医薬的に許容され得るキャリアは炭水化物を含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記医薬的に許容され得るキャリアはミクロスフェアを含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記医薬的に許容され得るキャリアはリポソームを含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記医薬的に許容され得るキャリアはポリマーのミクロスフェアを含む請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療することを含む、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の治療の必要性のある対象におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療する方法。
【請求項２６】
ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さず、かつ、ＭＣＰ−１と結合することができるＣＣＲ２アミノ酸配列を含む分子の使用。
【請求項２７】
前記ＣＣＲ２のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ２アミノ酸配列は配列番号２に示される、請求項２５または２６に記載の方法または使用。
【請求項２８】
前記ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患は、炎症性疾患、壊死、アテローム性動脈硬化、ガン、多発性硬化症、アテローム、単球性白血病、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎）、ハンマン−リッチ症候群、子宮内膜症、リウマチ様関節炎、細気管支炎、喘息、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、大腸炎）、肺胞炎、再狭窄、脳外傷、乾癬、特発性肺線維症および移植片動脈硬化からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法または使用。
【請求項２９】
前記分子は配列番号１４または配列番号１５に示される、請求項２５または２６に記載の方法または使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ−ｄ】
【図５ｃ】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ−ｄ】
【図５ｃ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５３５９０９（Ｐ２００８−５３５９０９Ａ）
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０６０５１（Ｐ２００８−５０６０５１）
【出願日】平成１８年４月１０日（２００６．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０９３０１
【国際公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（５０７３４２３５３）ラパポート ファミリー インスティテュート フォー リサーチ イン ザ メディカル サイエンシーズ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１０日（２００６．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０９３０１
【国際公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（５０７３４２３５３）ラパポート ファミリー インスティテュート フォー リサーチ イン ザ メディカル サイエンシーズ (6)
【Ｆターム（参考）】
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