Ｎ末端切断型Ｐ４５０還元酵素を有するシトクロムＰ４５０の生成方法
本発明は、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素、および該P450還元酵素をコードする核酸を提供する。このP450還元酵素は、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現と比較して、シトクロムP450の活性および/または発現を増加させる。本発明はまた、シトクロムP450、P450還元酵素、および/またはb5の発現を増加させるための特定のプロモーターの使用、ならびに本発明のタンパク質を発現させるための酵母のプロテアーゼ欠損株の使用も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素コードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子であって、該P450還元酵素が、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現と比較して、シトクロムP450の活性および/または発現を増加させる、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項２】
ヒトP450還元酵素をコードする、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
P450還元酵素が少なくとも24個のN末端アミノ酸を欠く、請求項2記載の核酸分子。
【請求項４】
ヒトP450還元酵素がSEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含む、請求項3記載の核酸分子。
【請求項５】
以下を含むかまたは以下からなる、単離された核酸分子または組換え核酸分子：
a) 請求項1〜4のいずれか一項記載のヌクレオチド配列；
b) SEQ ID NO：34もしくは37のヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつ、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素をコードする、ヌクレオチド配列；
d) a)、b)、もしくはc)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
e) a)、b)、c)、もしくはd)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記核酸分子によってコードされるP450還元酵素が、エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７】
前記アミノ酸配列がP450還元酵素のC末端に連結されている、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
エピトープタグがc-mycエピトープタグである、請求項7記載の核酸分子。
【請求項９】
SEQ ID NO：42の配列を含むか、またはその配列からなる、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項10記載の核酸分子。
【請求項１２】
プロモーターがGALプロモーターである、請求項11記載の核酸分子。
【請求項１３】
プロモーターが切断型GALプロモーターを含む、請求項12記載の核酸分子。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列の発現を制御するために切断型GALプロモーターを含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１５】
切断型GALプロモーターが切断型GAL1プロモーターである、請求項14記載の核酸分子。
【請求項１６】
切断型GAL1プロモーターがヌクレオチド202において切断されたGAL1プロモーターである、請求項15記載の核酸分子。
【請求項１７】
切断型GAL1プロモーターがSEQ ID NO：2の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項16記載の核酸分子。
【請求項１８】
転写終結配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１９】
終結配列がプロモーターの下流にある、請求項18記載の核酸分子。
【請求項２０】
プロモーターの制御下へのヌクレオチド配列の挿入を可能にする、GALプロモーターと終結配列との間の特有の制限部位を含む、請求項19記載の核酸分子。
【請求項２１】
転写終結配列が挿入ヌクレオチド配列のすぐ下流にあるか、または最小距離だけ離れている、請求項20記載の核酸分子。
【請求項２２】
転写終結配列が挿入ヌクレオチド配列から5〜25ヌクレオチドだけ離れている、請求項21記載の核酸分子。
【請求項２３】
終結配列がSUC2(SUC2t)終結配列である、請求項18〜22のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２４】
SUC2終結配列がSEQ ID NO：28の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項23記載の核酸分子。
【請求項２５】
プロモーターが、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する、請求項10〜13または14〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２６】
ヌクレオチド配列が、請求項1〜13のいずれか一項記載の核酸分子である、請求項25記載の核酸分子。
【請求項２７】
プロモーターが、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する、請求項10〜13または14〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項27記載の核酸分子。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項28記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列が、核酸分子のプロモーターと終結配列との間にBamH1-XbaI断片として挿入される、請求項20記載の、または請求項20に従属した場合の請求項21〜29のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３１】
ベクターの形態で提供される、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
標的細胞において前記核酸分子の発現を引き起こす、請求項32記載のベクター。
【請求項３４】
標的細胞が真核細胞である、請求項33記載のベクター。
【請求項３５】
標的細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項34記載のベクター。
【請求項３６】
標的細胞のゲノムに組み込むことが可能な、請求項32〜35のいずれか一項記載のベクター。
【請求項３７】
形質転換細胞の選択を可能にする選択マーカーおよび/またはレポーター遺伝子などの1つまたは複数の発現マーカーを含む、請求項32〜36のいずれか一項記載のベクター。
【請求項３８】
レポーター遺伝子が、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、およびルシフェラーゼ(Luc)から選択される、請求項37記載のベクター。
【請求項３９】
選択マーカーが栄養要求性選択マーカー遺伝子である、請求項38記載のベクター。
【請求項４０】
栄養要求性選択マーカー遺伝子が、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項39記載のベクター。
【請求項４１】
選択可能マーカー遺伝子が、相同組換えにより特定の染色体座において標的細胞のゲノムへの組込みを可能にする、請求項40記載のベクター。
【請求項４２】
酵母細胞に組み込むことが可能な、請求項41記載のベクター。
【請求項４３】
酵母ゲノムに組み込むことが可能な、請求項42記載のベクター。
【請求項４４】
各コピーがそれぞれのプロモーターの制御下にある請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を2コピー含む、請求項32〜43のいずれか一項記載のベクター。
【請求項４５】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項４６】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または該核酸分子の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を細胞内で発現させる方法。
【請求項４７】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで細胞を形質転換する段階を含む、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を細胞内で発現させる方法。
【請求項４８】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項47記載の方法：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４９】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現する酵母株を作製する方法。
【請求項５０】
請求項49記載の方法で作製された、または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項５１】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項45記載の細胞または請求項50記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、該配列が該ヌクレオチド配列の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、ベクター。
【請求項５２】
ヌクレオチド配列が異種シトクロムP450をコードする、請求項51記載のタンパク質発現システム。
【請求項５３】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項52記載のタンパク質発現システム。
【請求項５４】
ヌクレオチド配列がシトクロムb5タンパク質をコードする、請求項51記載のタンパク質発現システム。
【請求項５５】
シトクロムb5タンパク質が異種シトクロムb5タンパク質である、請求項54記載のタンパク質発現システム。
【請求項５６】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項54または55記載のタンパク質発現システム：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項５７】
ベクターが、多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項51〜56のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項５８】
ベクターが、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、前記ヌクレオチド配列または各ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項51〜57のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項５９】
ベクターが請求項32〜44のいずれか一項に定義される通りである、請求項51〜58のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項６０】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項45記載の細胞または請求項50記載の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項６１】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項６２】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞を形質転換する段階をさらに含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
ヌクレオチド配列が異種シトクロムP450をコードする、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向するベクターで、前記細胞を形質転換する段階をさらに含む、請求項60〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
以下を含むかまたは以下からなる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド：
a) N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素であって、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素；
b) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドの相同体；または
c) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドもしくはb)の相同体の断片。
【請求項６６】
P450還元酵素がヒトP450還元酵素である、請求項65記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６７】
P450還元酵素が24個のN末端アミノ酸を欠く、請求項66記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項65〜67のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６９】
エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含む、請求項65〜68のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７０】
前記アミノ酸配列がポリペプチドのC末端に連結されている、請求項69記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７１】
エピトープタグがc-mycである、請求項70記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項65〜71のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７３】
細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項７４】
細胞が真核細胞である、請求項73記載の核酸分子。
【請求項７５】
細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項74記載の核酸分子。
【請求項７６】
標的遺伝子がプロテアーゼ分解酵素をコードする、請求項73〜75のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７７】
プロテアーゼが液胞プロテアーゼまたはプロテアソームプロテアーゼである、請求項76記載の核酸分子。
【請求項７８】
液胞プロテアーゼの欠失を可能にする、請求項77記載の核酸分子。
【請求項７９】
プロテアーゼが、PRA1(PEP4)、プロテアーゼB(PRB1)、カルボキシペプチダーゼY & S(CPY & CPS)、アミノペプチダーゼ、yscI、yscCo、HRD(HRD 1、HRD2、およびHRD3を含む)、UBC(UBC6およびUBC7を含む)、CUE1；およびCdc48p-Ufd1p-Hrd4p複合体から選択される、請求項78記載の核酸分子。
【請求項８０】
相同組換えを介して細胞のゲノムに組み込むことが可能な、請求項73〜79のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８１】
標的化相同組換えによってプロテアーゼの欠失を可能にする、請求項80記載の核酸分子。
【請求項８２】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項73〜81のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８３】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が、両側に隣接した選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項82記載の核酸分子。
【請求項８４】
隣接ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子のコード領域または調節領域と実質的に同一である、請求項82または83記載の核酸分子。
【請求項８５】
隣接ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子の5'断片および3'断片と実質的に同一である、請求項84記載の核酸分子。
【請求項８６】
破壊しようとする遺伝子の5'断片が、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項85記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：51、58、65、または72のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) 請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【請求項８７】
破壊しようとする遺伝子の3'断片が、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項85または86記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：54、61、68、または75のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) 請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【請求項８８】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がPRA1(PEP4)である場合に、選択可能マーカーに隣接するPRA1の5'断片がSEQ ID NO：51のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつPRA1の3'断片がSEQ ID NO：54のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項８９】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD1である場合に、選択可能マーカーに隣接するHRD1の5'断片がSEQ ID NO：58のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつHRD1の3'断片がSEQ ID NO：61のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９０】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD2である場合に、選択可能マーカーに隣接するHRD2の5'断片がSEQ ID NO：65のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつHRD2の3'断片がSEQ ID NO：68のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９１】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がUBC7である場合に、選択可能マーカーに隣接するUBC7の5'断片がSEQ ID NO：72のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつUBC7の3'断片がSEQ ID NO：75のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９２】
選択可能マーカー遺伝子が、TRP1、LEU2、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項83〜91のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９３】
選択可能マーカー遺伝子がTRP1であり、かつSEQ ID NO：47の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項92記載の核酸分子。
【請求項９４】
ベクターの形態である、請求項73〜93のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９５】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子の破壊を可能にするベクターであって、請求項73〜93のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９６】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項９７】
真核細胞である、請求項96記載の細胞。
【請求項９８】
酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項97記載の細胞。
【請求項９９】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子を破壊する方法。
【請求項１００】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、プロテアーゼ欠損酵母株を作製する方法。
【請求項１０１】
請求項100記載の方法によって作製された、または請求項95記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１０２】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１０３】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０５】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株。
【請求項１０８】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１０９】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項108記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１０】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項109記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１１】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項108〜110のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項108〜111のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項108〜112のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１４】
細胞において内因性P450還元酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１１５】
細胞が真核細胞である、請求項114記載の核酸分子。
【請求項１１６】
細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項115記載の核酸分子。
【請求項１１７】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項114〜116のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１８】
前記標的遺伝子と相同なヌクレオチド配列が隣接した選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項117記載の核酸分子。
【請求項１１９】
前記標的遺伝子と相同なヌクレオチド配列が、相同組換えに際して該標的遺伝子が破壊されるように選択される、請求項118記載の核酸分子。
【請求項１２０】
隣接ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項117〜119のいずれか一項記載の核酸分子：
a) i) SEQ ID NO：84のヌクレオチド配列；
ii) ii)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片；および
b) i) SEQ ID NO：85のヌクレオチド配列；
ii) i)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはiii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片。
【請求項１２１】
選択可能マーカー遺伝子が、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項118〜120のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２２】
ベクターの形態である、請求項114〜121のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２３】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の欠失を可能にするベクターであって、請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２４】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の破壊を可能にするベクターであって、該標的細胞のゲノムへの組込みを可能にするためにベクターを線状化できるようにする1つまたは複数の特有の制限部位を含む前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列と、該細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列とを含む、ベクター。
【請求項１２５】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が、以下を含むかまたは以下からなる、請求項124記載のベクター：
a) SEQ ID NO：81のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１２６】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１２７】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、P450還元酵素をコードする内因性遺伝子を破壊する方法。
【請求項１２８】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムP450還元酵素が欠損した細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１２９】
請求項128の方法によって作製された、または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１３０】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１３１】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列とシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列との発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株。
【請求項１３６】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１３７】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、タンパク質発現システム。
【請求項１３８】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、タンパク質発現システム。
【請求項１３９】
ベクターが、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項136〜138のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４０】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項136〜139のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４１】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項136〜140のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４２】
酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項136〜141のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４３】
酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１４４】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項143記載の核酸分子：
a) SEQ ID No: 78のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４５】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項143または144記載の核酸分子。
【請求項１４６】
プロモーターがGALプロモーターである、請求項145記載の核酸分子。
【請求項１４７】
プロモーターが切断型GALプロモーターである、請求項146記載の核酸分子。
【請求項１４８】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４９】
標的細胞において、特定の染色体座で酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合される、請求項148記載のベクター。
【請求項１５０】
特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項149記載のベクター。
【請求項１５１】
選択可能マーカー遺伝子が、LEU2、ADE2、HIS3、TRP1、URA3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項150記載のベクター。
【請求項１５２】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１５３】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、内因性シトクロムP450還元酵素を発現する細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１５４】
請求項153記載の方法によって作製された、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターによって形質転換された、酵母株。
【請求項１５５】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項143〜147のいずれか一項記載の細胞または請求項154記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１５６】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
シトクロムP450がヒトシトクロムP450である、請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５９】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６０】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６１】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項155〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６２】
シトクロムb5タンパク質が異種シトクロムb5タンパク質である、請求項160または161記載の方法。
【請求項１６３】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項152記載の細胞または請求項154記載の酵母株。
【請求項１６４】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項152記載の細胞または請求項154記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１６５】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項164記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６６】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項165記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６７】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項164〜166のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項164〜167のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６９】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項164〜168のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１７０】
プロモーターの制御下にあるシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１７１】
プロモーターが切断型GALプロモーターである、請求項170記載の核酸分子。
【請求項１７２】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、哺乳動物シトクロムb5タンパク質をコードする、請求項170または171記載の核酸分子。
【請求項１７３】
以下から選択される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項172記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７４】
ベクターの形態である、請求項170〜173のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１７５】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７６】
標的細胞において、特定の染色体座でシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合される、請求項175記載のベクター。
【請求項１７７】
特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項176記載のベクター。
【請求項１７８】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１７９】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムb5タンパク質を発現する細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１８０】
請求項179記載の方法によって作製された、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１８１】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１８２】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
シトクロムP450がヒトシトクロムP450である、請求項182記載の方法。
【請求項１８４】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８５】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８６】
内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜185のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８７】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された、請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株。
【請求項１８８】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１８９】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項188記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９０】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項189記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９１】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項188〜190のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項188〜191のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９３】
内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項188〜192のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９４】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された細胞を、以下の1つまたは複数と混和する段階を含む、活性が増加したシトクロムP450を生成する方法：
a) 請求項45記載の1つもしくは複数の細胞；
b) 請求項96〜98のいずれか一項記載の1つもしくは複数の細胞；
c) 請求項126記載の1つもしくは複数の細胞；
d) 請求項152記載の1つもしくは複数の細胞；および/または
e)請求項178記載の1つもしくは複数の細胞。
【請求項１９５】
細胞を混和する前に、培養物から該細胞を単離する段階をさらに含む、請求項194記載の方法。
【請求項１９６】
細胞を混和して均一な細胞混合物を生成する、請求項194または195記載の方法。
【請求項１９７】
以下の段階を含む、候補薬剤化合物の毒性を評価する方法：
a) 化合物を、シトクロムP450を発現する請求項50、107、135、163、および185のいずれか一項記載の細胞または酵母株と反応させる段階；ならびに
b) 阻害に関してIC50濃度を決定する段階。
【請求項１９８】
以下の段階を含む、シトクロムP450の阻害について化合物を評価する方法：
a) 試験化合物を、シトクロムP450を発現する請求項50、107、135、163、187のいずれか一項記載の細胞または酵母株と反応させる段階；および
b) 該化合物がシトクロムP450活性を低下させるかどうかを決定する段階。
【請求項１９９】
前記細胞または酵母株が、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換されている、請求項198記載の方法。
【請求項２００】
決定段階b)が以下の段階を含む、請求項198または199記載の方法：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【請求項２０１】
基質が蛍光基質または発光基質である、請求項200記載の方法。
【請求項２０２】
細胞の培養中に種々の時点で活性を測定する、請求項200または201記載の方法。
【請求項２０３】
細胞内でシトクロムP450の発現を誘導するための試薬を添加した後に、該細胞を取り出すことによって活性を測定する、請求項200〜202のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０４】
前記方法において用いるために、高活性を有するシトクロムP450を発現する細胞または酵母株が選択される、請求項198〜203のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０５】
以下の段階を含むアッセイ法を用いて細胞または酵母細胞が選択される、請求項204記載の方法：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【請求項２０６】
請求項61〜64、102〜106、130〜134、150〜162、および/または181〜186のいずれか一項記載の方法によって生成されたシトクロムP450。
【請求項１】
N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素コードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子であって、該P450還元酵素が、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現と比較して、シトクロムP450の活性および/または発現を増加させる、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項２】
ヒトP450還元酵素をコードする、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
P450還元酵素が少なくとも24個のN末端アミノ酸を欠く、請求項2記載の核酸分子。
【請求項４】
ヒトP450還元酵素がSEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含む、請求項3記載の核酸分子。
【請求項５】
以下を含むかまたは以下からなる、単離された核酸分子または組換え核酸分子：
a) 請求項1〜4のいずれか一項記載のヌクレオチド配列；
b) SEQ ID NO：34もしくは37のヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつ、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素をコードする、ヌクレオチド配列；
d) a)、b)、もしくはc)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
e) a)、b)、c)、もしくはd)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記核酸分子によってコードされるP450還元酵素が、エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７】
前記アミノ酸配列がP450還元酵素のC末端に連結されている、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
エピトープタグがc-mycエピトープタグである、請求項7記載の核酸分子。
【請求項９】
SEQ ID NO：42の配列を含むか、またはその配列からなる、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項10記載の核酸分子。
【請求項１２】
プロモーターがGALプロモーターである、請求項11記載の核酸分子。
【請求項１３】
プロモーターが切断型GALプロモーターを含む、請求項12記載の核酸分子。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列の発現を制御するために切断型GALプロモーターを含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１５】
切断型GALプロモーターが切断型GAL1プロモーターである、請求項14記載の核酸分子。
【請求項１６】
切断型GAL1プロモーターがヌクレオチド202において切断されたGAL1プロモーターである、請求項15記載の核酸分子。
【請求項１７】
切断型GAL1プロモーターがSEQ ID NO：2の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項16記載の核酸分子。
【請求項１８】
転写終結配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１９】
終結配列がプロモーターの下流にある、請求項18記載の核酸分子。
【請求項２０】
プロモーターの制御下へのヌクレオチド配列の挿入を可能にする、GALプロモーターと終結配列との間の特有の制限部位を含む、請求項19記載の核酸分子。
【請求項２１】
転写終結配列が挿入ヌクレオチド配列のすぐ下流にあるか、または最小距離だけ離れている、請求項20記載の核酸分子。
【請求項２２】
転写終結配列が挿入ヌクレオチド配列から5〜25ヌクレオチドだけ離れている、請求項21記載の核酸分子。
【請求項２３】
終結配列がSUC2(SUC2t)終結配列である、請求項18〜22のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２４】
SUC2終結配列がSEQ ID NO：28の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項23記載の核酸分子。
【請求項２５】
プロモーターが、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する、請求項10〜13または14〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２６】
ヌクレオチド配列が、請求項1〜13のいずれか一項記載の核酸分子である、請求項25記載の核酸分子。
【請求項２７】
プロモーターが、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する、請求項10〜13または14〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項27記載の核酸分子。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項28記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列が、核酸分子のプロモーターと終結配列との間にBamH1-XbaI断片として挿入される、請求項20記載の、または請求項20に従属した場合の請求項21〜29のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３１】
ベクターの形態で提供される、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
標的細胞において前記核酸分子の発現を引き起こす、請求項32記載のベクター。
【請求項３４】
標的細胞が真核細胞である、請求項33記載のベクター。
【請求項３５】
標的細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項34記載のベクター。
【請求項３６】
標的細胞のゲノムに組み込むことが可能な、請求項32〜35のいずれか一項記載のベクター。
【請求項３７】
形質転換細胞の選択を可能にする選択マーカーおよび/またはレポーター遺伝子などの1つまたは複数の発現マーカーを含む、請求項32〜36のいずれか一項記載のベクター。
【請求項３８】
レポーター遺伝子が、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、およびルシフェラーゼ(Luc)から選択される、請求項37記載のベクター。
【請求項３９】
選択マーカーが栄養要求性選択マーカー遺伝子である、請求項38記載のベクター。
【請求項４０】
栄養要求性選択マーカー遺伝子が、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項39記載のベクター。
【請求項４１】
選択可能マーカー遺伝子が、相同組換えにより特定の染色体座において標的細胞のゲノムへの組込みを可能にする、請求項40記載のベクター。
【請求項４２】
酵母細胞に組み込むことが可能な、請求項41記載のベクター。
【請求項４３】
酵母ゲノムに組み込むことが可能な、請求項42記載のベクター。
【請求項４４】
各コピーがそれぞれのプロモーターの制御下にある請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を2コピー含む、請求項32〜43のいずれか一項記載のベクター。
【請求項４５】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項４６】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または該核酸分子の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を細胞内で発現させる方法。
【請求項４７】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで細胞を形質転換する段階を含む、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を細胞内で発現させる方法。
【請求項４８】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項47記載の方法：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４９】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現する酵母株を作製する方法。
【請求項５０】
請求項49記載の方法で作製された、または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項５１】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項45記載の細胞または請求項50記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、該配列が該ヌクレオチド配列の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、ベクター。
【請求項５２】
ヌクレオチド配列が異種シトクロムP450をコードする、請求項51記載のタンパク質発現システム。
【請求項５３】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項52記載のタンパク質発現システム。
【請求項５４】
ヌクレオチド配列がシトクロムb5タンパク質をコードする、請求項51記載のタンパク質発現システム。
【請求項５５】
シトクロムb5タンパク質が異種シトクロムb5タンパク質である、請求項54記載のタンパク質発現システム。
【請求項５６】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項54または55記載のタンパク質発現システム：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項５７】
ベクターが、多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項51〜56のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項５８】
ベクターが、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、前記ヌクレオチド配列または各ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項51〜57のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項５９】
ベクターが請求項32〜44のいずれか一項に定義される通りである、請求項51〜58のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項６０】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項45記載の細胞または請求項50記載の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項６１】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項６２】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞を形質転換する段階をさらに含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
ヌクレオチド配列が異種シトクロムP450をコードする、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向するベクターで、前記細胞を形質転換する段階をさらに含む、請求項60〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
以下を含むかまたは以下からなる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド：
a) N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素であって、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素；
b) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドの相同体；または
c) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドもしくはb)の相同体の断片。
【請求項６６】
P450還元酵素がヒトP450還元酵素である、請求項65記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６７】
P450還元酵素が24個のN末端アミノ酸を欠く、請求項66記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項65〜67のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６９】
エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含む、請求項65〜68のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７０】
前記アミノ酸配列がポリペプチドのC末端に連結されている、請求項69記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７１】
エピトープタグがc-mycである、請求項70記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項65〜71のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７３】
細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項７４】
細胞が真核細胞である、請求項73記載の核酸分子。
【請求項７５】
細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項74記載の核酸分子。
【請求項７６】
標的遺伝子がプロテアーゼ分解酵素をコードする、請求項73〜75のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７７】
プロテアーゼが液胞プロテアーゼまたはプロテアソームプロテアーゼである、請求項76記載の核酸分子。
【請求項７８】
液胞プロテアーゼの欠失を可能にする、請求項77記載の核酸分子。
【請求項７９】
プロテアーゼが、PRA1(PEP4)、プロテアーゼB(PRB1)、カルボキシペプチダーゼY & S(CPY & CPS)、アミノペプチダーゼ、yscI、yscCo、HRD(HRD 1、HRD2、およびHRD3を含む)、UBC(UBC6およびUBC7を含む)、CUE1；およびCdc48p-Ufd1p-Hrd4p複合体から選択される、請求項78記載の核酸分子。
【請求項８０】
相同組換えを介して細胞のゲノムに組み込むことが可能な、請求項73〜79のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８１】
標的化相同組換えによってプロテアーゼの欠失を可能にする、請求項80記載の核酸分子。
【請求項８２】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項73〜81のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８３】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が、両側に隣接した選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項82記載の核酸分子。
【請求項８４】
隣接ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子のコード領域または調節領域と実質的に同一である、請求項82または83記載の核酸分子。
【請求項８５】
隣接ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子の5'断片および3'断片と実質的に同一である、請求項84記載の核酸分子。
【請求項８６】
破壊しようとする遺伝子の5'断片が、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項85記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：51、58、65、または72のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) 請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【請求項８７】
破壊しようとする遺伝子の3'断片が、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項85または86記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：54、61、68、または75のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) 請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【請求項８８】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がPRA1(PEP4)である場合に、選択可能マーカーに隣接するPRA1の5'断片がSEQ ID NO：51のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつPRA1の3'断片がSEQ ID NO：54のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項８９】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD1である場合に、選択可能マーカーに隣接するHRD1の5'断片がSEQ ID NO：58のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつHRD1の3'断片がSEQ ID NO：61のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９０】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD2である場合に、選択可能マーカーに隣接するHRD2の5'断片がSEQ ID NO：65のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつHRD2の3'断片がSEQ ID NO：68のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９１】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がUBC7である場合に、選択可能マーカーに隣接するUBC7の5'断片がSEQ ID NO：72のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつUBC7の3'断片がSEQ ID NO：75のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９２】
選択可能マーカー遺伝子が、TRP1、LEU2、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項83〜91のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９３】
選択可能マーカー遺伝子がTRP1であり、かつSEQ ID NO：47の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項92記載の核酸分子。
【請求項９４】
ベクターの形態である、請求項73〜93のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９５】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子の破壊を可能にするベクターであって、請求項73〜93のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９６】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項９７】
真核細胞である、請求項96記載の細胞。
【請求項９８】
酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項97記載の細胞。
【請求項９９】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子を破壊する方法。
【請求項１００】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、プロテアーゼ欠損酵母株を作製する方法。
【請求項１０１】
請求項100記載の方法によって作製された、または請求項95記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１０２】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１０３】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０５】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株。
【請求項１０８】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１０９】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項108記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１０】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項109記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１１】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項108〜110のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項108〜111のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項108〜112のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１４】
細胞において内因性P450還元酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１１５】
細胞が真核細胞である、請求項114記載の核酸分子。
【請求項１１６】
細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項115記載の核酸分子。
【請求項１１７】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項114〜116のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１８】
前記標的遺伝子と相同なヌクレオチド配列が隣接した選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項117記載の核酸分子。
【請求項１１９】
前記標的遺伝子と相同なヌクレオチド配列が、相同組換えに際して該標的遺伝子が破壊されるように選択される、請求項118記載の核酸分子。
【請求項１２０】
隣接ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項117〜119のいずれか一項記載の核酸分子：
a) i) SEQ ID NO：84のヌクレオチド配列；
ii) ii)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片；および
b) i) SEQ ID NO：85のヌクレオチド配列；
ii) i)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはiii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片。
【請求項１２１】
選択可能マーカー遺伝子が、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項118〜120のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２２】
ベクターの形態である、請求項114〜121のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２３】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の欠失を可能にするベクターであって、請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２４】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の破壊を可能にするベクターであって、該標的細胞のゲノムへの組込みを可能にするためにベクターを線状化できるようにする1つまたは複数の特有の制限部位を含む前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列と、該細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列とを含む、ベクター。
【請求項１２５】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が、以下を含むかまたは以下からなる、請求項124記載のベクター：
a) SEQ ID NO：81のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１２６】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１２７】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、P450還元酵素をコードする内因性遺伝子を破壊する方法。
【請求項１２８】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムP450還元酵素が欠損した細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１２９】
請求項128の方法によって作製された、または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１３０】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１３１】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列とシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列との発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株。
【請求項１３６】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１３７】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、タンパク質発現システム。
【請求項１３８】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、タンパク質発現システム。
【請求項１３９】
ベクターが、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項136〜138のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４０】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項136〜139のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４１】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項136〜140のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４２】
酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項136〜141のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４３】
酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１４４】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項143記載の核酸分子：
a) SEQ ID No: 78のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４５】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項143または144記載の核酸分子。
【請求項１４６】
プロモーターがGALプロモーターである、請求項145記載の核酸分子。
【請求項１４７】
プロモーターが切断型GALプロモーターである、請求項146記載の核酸分子。
【請求項１４８】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４９】
標的細胞において、特定の染色体座で酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合される、請求項148記載のベクター。
【請求項１５０】
特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項149記載のベクター。
【請求項１５１】
選択可能マーカー遺伝子が、LEU2、ADE2、HIS3、TRP1、URA3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項150記載のベクター。
【請求項１５２】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１５３】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、内因性シトクロムP450還元酵素を発現する細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１５４】
請求項153記載の方法によって作製された、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターによって形質転換された、酵母株。
【請求項１５５】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項143〜147のいずれか一項記載の細胞または請求項154記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１５６】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
シトクロムP450がヒトシトクロムP450である、請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５９】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６０】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６１】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項155〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６２】
シトクロムb5タンパク質が異種シトクロムb5タンパク質である、請求項160または161記載の方法。
【請求項１６３】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項152記載の細胞または請求項154記載の酵母株。
【請求項１６４】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項152記載の細胞または請求項154記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１６５】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項164記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６６】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項165記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６７】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項164〜166のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項164〜167のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６９】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項164〜168のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１７０】
プロモーターの制御下にあるシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１７１】
プロモーターが切断型GALプロモーターである、請求項170記載の核酸分子。
【請求項１７２】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、哺乳動物シトクロムb5タンパク質をコードする、請求項170または171記載の核酸分子。
【請求項１７３】
以下から選択される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項172記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７４】
ベクターの形態である、請求項170〜173のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１７５】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７６】
標的細胞において、特定の染色体座でシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合される、請求項175記載のベクター。
【請求項１７７】
特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項176記載のベクター。
【請求項１７８】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１７９】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムb5タンパク質を発現する細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１８０】
請求項179記載の方法によって作製された、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１８１】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１８２】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
シトクロムP450がヒトシトクロムP450である、請求項182記載の方法。
【請求項１８４】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８５】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８６】
内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜185のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８７】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された、請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株。
【請求項１８８】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１８９】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項188記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９０】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項189記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９１】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項188〜190のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項188〜191のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９３】
内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項188〜192のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９４】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された細胞を、以下の1つまたは複数と混和する段階を含む、活性が増加したシトクロムP450を生成する方法：
a) 請求項45記載の1つもしくは複数の細胞；
b) 請求項96〜98のいずれか一項記載の1つもしくは複数の細胞；
c) 請求項126記載の1つもしくは複数の細胞；
d) 請求項152記載の1つもしくは複数の細胞；および/または
e)請求項178記載の1つもしくは複数の細胞。
【請求項１９５】
細胞を混和する前に、培養物から該細胞を単離する段階をさらに含む、請求項194記載の方法。
【請求項１９６】
細胞を混和して均一な細胞混合物を生成する、請求項194または195記載の方法。
【請求項１９７】
以下の段階を含む、候補薬剤化合物の毒性を評価する方法：
a) 化合物を、シトクロムP450を発現する請求項50、107、135、163、および185のいずれか一項記載の細胞または酵母株と反応させる段階；ならびに
b) 阻害に関してIC50濃度を決定する段階。
【請求項１９８】
以下の段階を含む、シトクロムP450の阻害について化合物を評価する方法：
a) 試験化合物を、シトクロムP450を発現する請求項50、107、135、163、187のいずれか一項記載の細胞または酵母株と反応させる段階；および
b) 該化合物がシトクロムP450活性を低下させるかどうかを決定する段階。
【請求項１９９】
前記細胞または酵母株が、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換されている、請求項198記載の方法。
【請求項２００】
決定段階b)が以下の段階を含む、請求項198または199記載の方法：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【請求項２０１】
基質が蛍光基質または発光基質である、請求項200記載の方法。
【請求項２０２】
細胞の培養中に種々の時点で活性を測定する、請求項200または201記載の方法。
【請求項２０３】
細胞内でシトクロムP450の発現を誘導するための試薬を添加した後に、該細胞を取り出すことによって活性を測定する、請求項200〜202のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０４】
前記方法において用いるために、高活性を有するシトクロムP450を発現する細胞または酵母株が選択される、請求項198〜203のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０５】
以下の段階を含むアッセイ法を用いて細胞または酵母細胞が選択される、請求項204記載の方法：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【請求項２０６】
請求項61〜64、102〜106、130〜134、150〜162、および/または181〜186のいずれか一項記載の方法によって生成されたシトクロムP450。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０１】
【図１０２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９２】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９６】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０１】
【図１０２】
【公表番号】特表２００９−５３６０２６（Ｐ２００９−５３６０２６Ａ）
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０８４５９（Ｐ２００９−５０８４５９）
【出願日】平成１９年５月２日（２００７．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１６１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２９０５０
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０８３２８４７５）デ モンフォート ユニバーシティー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２日（２００７．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１６１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２９０５０
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０８３２８４７５）デ モンフォート ユニバーシティー (1)
【Ｆターム（参考）】
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