ＮＦ−κＢの活性化特異的阻害剤及び心臓血管疾患における炎症プロセスを治療するための方法
【課題】 粥腫進行における炎症プロセスの治療のために、ＮＦ−κＢの活性化形態をその基本的活性を害することなく阻害する特異的能力がある化合物の提供。
【解決手段】 化合物（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）及びその医薬用途の提供。
【化１】
【解決手段】 化合物（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）及びその医薬用途の提供。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＮＦ−κＢの活性化特異的阻害のための化合物、該化合物を活性剤として含有する医薬組成物、及び、心臓血管疾患、特に粥状動脈硬化症の治療又は予防のための医薬品の製造のための該化合物の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
一定のチアゾロ［２,３−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸は、データベース CHEMCATS [online] Chemical Abstracts Service, Columbus, Ohio, US；XP002247262 及び INTERCHIM, Montlucon, Cedex, France, 公表日：２００２年９月７日；カタログ名：INTERCHIM INTERMEDIATES から知られている。これら化合物の医薬用途はこの文献からは分からない。
【０００３】
一定のフラン−２−カルボン酸ベンジリデンヒドラジド誘導体は、Beilstein 登録番号１３２８１−５６−６、１２５２７４−０１−３（本化合物６８）、７６４００４６、６８０６５１５、及び２１１９４２で知られている。一定のチオフェン−２−カルボン酸ベンジリデンヒドラジド誘導体は、Beilstein 登録番号９１４３５、５８７２８６６で知られている。
【０００４】
Tozkoparan B.らは、Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 331, 201-206 (1998) において、一定のチアゾロ［２,３−ａ］ピリミジン類の合成と抗炎症活性を開示している。しかしながら、この文献は、これら抗炎症性化合物の作用の可能ないずれのメカニズムも挙げていない。Ertan M.らは、Arch. Pharm. (Weinheim) 324, 135-139 (1991) において、チアゾロ［２,３−ａ］ピリミジン類の合成に中間体化合物として有用である２−チオキソ−１,２,３,４−テトラヒドロピリミジン誘導体の合成を開示している。
【０００５】
ＷＯ０１／３０７７４及び Hehner, S. P.ら. Journal of Immunology 163 (10), 5617-5623 は、本発明の化合物と構造的に関連しない化合物によるＮＦ−κＢ活性の阻害に関する。
【０００６】
異なる毒性プロセスが粥状動脈硬化症の開始にある役割を果たしており、コレステロール及び他の脂質がその最も重要な因子である。しかしながら、これらプロセスは、思春期の頃に起こり、粥状動脈硬化症の複雑さについての限られた病因的関連性を有するに過ぎない。この疾患の予測及び顕現についてより重要なものは、中年及び老年患者における粥状動脈硬化症性変化の進行である。粥腫進行は、主に内皮における炎症プロセスにより推進され、それが、喫煙、高血圧症、高脂血症及び糖尿病などの粥状動脈硬化症の異なる危険因子により維持される。粥状動脈硬化症における慢性炎症は、病巣に白血球を差し向ける特定のサイトカインにより永久化され、かくして動脈壁内での炎症状態の悪循環を誘発する [Ross, R, N. Engl J. Med. 340:115-126, 1999]。
【０００７】
この慢性炎症プロセスが起こるメカニズムは、まず、血小板内皮相互作用により引き起こされる [Ross, R, N. Engl. J. Med. 340:115-126, 1999]。血小板が活性化されると、それらがそれらの周辺環境のサイトカイン及び増殖因子を放出することが知られている [Gawaz M, Circulation. 96:1809-1818; 1997]。内皮表面への血小板の接着は、粥腫形成プロセスの初期に観察され、生物活性分子、例えばＩＬ−１β [Gawaz M, Atherosclerosis. 148:75-85; 2000] 又はＣＤ４０リガンド [Henn V; Nature. 391:591-594; 1998] の放出と関連している。初期の粥状動脈硬化症は、更に、単球の内皮への接着及び泡沫細胞形成を伴う内膜層における蓄積により特徴付けられる。これら活性化された血小板は、培養内皮細胞において転写因子ＮＦ−κＢの活性化を誘発する [Gawaz, M; Circulation. 98:1164-1171; 1998]。血小板に加えて、粥状動脈硬化症の悪化について決定的な役割を有する他の重要な諸内皮表面レセプター、例えば、ＬＯＸ−１レセプター又はトール様 (toll-like) レセプターが、共通のシグナリング経路としてＮＦ−κＢシステムを有する [Metha JL & L; D,J. Am. Coll. Cardiol. 39:1429-1435; 2002; Dunne; A & O'Neill LA; Science STKE 2003 (171):re 37]。
【０００８】
ＮＦ−κＢは、ＭＣＰ−１ [Bauerle, P; Cell. 87:13-20; 1996]、単球についての強力な化学的攻撃体であって粥状動脈硬化症組織に豊富にあるＣ−Ｃケモカイン [Neiken; J. Clin. Invest 88:1121-1127; 1991] などの初期炎症応答遺伝子を媒介するのに特に重要な偏在性転写因子である。刺激されていない細胞では、ＮＦ−κＢは、二量体として、最も高頻度では、それが核に入るのを阻止する阻害性ＩｋＢタンパク質、例えば、ＩＢ−α、−β及び−εに結合したｐ５０／ｐ６５として、細胞質において見られる。細胞がサイトカイン、細菌産物又は酸化ストレスにより刺激されると、特定のキナーゼがＩｋＢをリン酸化して、プロテアソームによりその急速なユビキチン依存性タンパク質分解性劣化を起こす。ＮＦ−κＢのＩｋＢからの放出は、ＮＦ−κＢの核への通過をもたらし、そこで、それは、プロモーター又はエンハンサー領域の特異的ｋＢ配列に結合することにより、炎症、免疫学的、増殖及び細胞自滅プロセスに関与する標的遺伝子の転写を活性化する [Bauerle, P; Cell. 87:13-20; 1996]。
【０００９】
ＩｋＢのリン酸化をもたらすシグナリング事象についての鍵となる役割は、最近同定されたＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）コンプレックスが果たす [Karin; Annu. Rev. Immunol 18:621-663; 1996]。原型的には、このコンプレックスは、２のキナーゼ活性成分、即ちＩＫＫ−αとＩＫＫ−β、並びに、ＩＫＫ−γと呼ばれる、そのコンプレックスの安定化に関与するか又はその調節を助けることができるキナーゼ不活性アダプタータンパク質を含有する。ＩＫＫ−αの機能は未だ不明であるが、それは分化及び増殖にある役割を果たすことが提案されてきたのに対し、ＩＫＫ−βは主要なＩｋＢリン酸化キナーゼとして見做され、前炎症及び細胞自滅プロセスに関与している [Karin ; Annu. Rev. Immunol. 18:621-663; 1996]。
【００１０】
活性化された血小板は、ＩＬ−１β刺激の後に見られる効果と類似の、ＩｋＢ−α及び−εのタンパク質分解をもたらす内皮Ｉコンプレックスの一時的活性化を誘発する。ＩＫＫ−βは、ＩＫＫコンプレックスからの最も重要なキナーゼとして同定され、ＩＫＫ−βの優勢ネガティブ突然変異体の過剰発現が、内皮細胞において、血小板誘発ＩｋＢ−及びＭＣＰ−１プロモーター依存性転写、並びに、ＭＣＰ−１分泌を実質的に低下させた [Gawaz, M; Thromb Haemost. 2002 Aug;88(2):307-14; 2002]。これは、内皮細胞において、接着タンパク質ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭの顕著な減少をもたらした。これら接着タンパク質の表面発現は、粥状動脈硬化症動物モデル及びヒトの内皮上で増加する。更には、これら接着タンパク質は、炎症細胞の内皮への粘着を増加させるのに、及び更に単球の内皮内への侵入に重要な役割を果たしている。これら単球は、更にマクロファージへと分化して、粥腫進行における炎症を更に悪化させる。かくして、ＩＫＫ−βの阻害によるこのシグナリングの阻害は、粥腫進行における炎症経路の鍵となる段階を崩壊させる。
【００１１】
ＮＦ−κＢ活性を阻害する異なるアプローチが記載されている。一例は、ＩＫＫ−γ／ＮＥＭＯシグナルソームコンプレックス（signalsome complex）の成立の阻害である [May, M.J; Science 289:1550-1554; 2000]。このシグナルソームコンプレックスの組み立ては、ＩｋＢの効率的なリン酸化及び引き続いて起こるＮＦ−κＢの阻害のために必須である。別のアプローチは、ＮＦ−κＢ阻害のためにキナーゼの触媒ドメインを阻害することである。ＮＦ−κＢシステムは、偏在しておりかつ種々の細胞プロセスの一因であるので、炎症プロセスにおける度を越したＮＦ−κＢ活性をその基本的活性を害さないで特異的に阻害することが望ましい。
【発明の要旨】
【００１２】
本発明の課題は、粥腫進行における炎症プロセスの治療のために、ＮＦ−κＢの活性化形態をその基本的活性を害することなく阻害する特異的能力がある化合物を提供することである。医薬品、特に上記種類の急性及び／又は慢性心臓血管障害の制御又は予防のための医薬品の製造のためのそのような化合物の使用も本発明の目的である。
【００１３】
この課題は、特許請求の範囲に従えば解決される。本発明は、粥腫進行におけるＮＦ−κＢ媒介炎症（具体的には、ＮＦ−κＢシステムの活性化形態）を完全なＮＦ−κＢ阻害という有害な副作用なしに阻害するという格別な技術的特徴に基づく単一の一般的発明概念により関連付けられる化合物を提供する。本発明は、粥状動脈硬化症を治療するための重要な課題を解決する。本発明の化合物は、ＮＦ−κＢ経路を阻害することにより、粥状動脈硬化症の動脈における慢性炎症プロセスを治療又は予防する。そのクラスの化合物は、粥状動脈硬化症において優勢的に見出されるＮＦ−κＢシステムの活性化形態 [Brand K ら; J Clin Invest. 1996;97(7):1715-22] を基本的なＮＦ−κＢ活性を害することなく特異的に阻害する。この新規な原理は、ＮＦ−κＢ調節キナーゼの活性ドメインを標的にせずに、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βとＮＥＭＯとのシグナルソームコンプレックスの安定性を標的にする。このコンプレックスの一体性は、十分なＩｋＢリン酸化とそれに引き続いて起こるＮＦ−κＢの活性化に必須である [May M. et al.; Science 289: 1550-1553; 2000]。更には、本化合物は、シグナルソームコンプレックスについて特異的なタンパク質分解活性を、ＮＥＭＯについては最高でありＩＫＫ−αとＩＫＫ−βについてはより弱いタンパク質分解活性と併せて有している。ＮＦ−κＢシグナルソームコンプレックスから独立の他のタンパク質がこのタンパク質分解活性によって害されることはない。キナーゼＩＫＫ−β又はＩＫＫ−αの直接阻害は、重篤な肝臓不全を伴う細胞自滅（Li ら; Science 284: 321-325; 1999）又は免疫抑制的副作用 [Lavon I ら; Nature Medicine 6 (5); 573-577; 2000] の誘発などの重篤な有害作用を有している。従って、ＮＦ−κＢ関連キナーゼの触媒ドメインの阻害により粥状動脈硬化症の炎症プロセスを治療するという考え方は、有害な副作用により欠陥があり、患者における全身適用を可能にしない。
【００１４】
本発明の第１の一般的側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ａ）：
【００１５】
【化１】
【００１６】
により表され、
式中、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００１７】
本発明の第２の一般的側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ｂ）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
により表され、
式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、又はＮＨを表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００２０】
第１の好ましい態様においては、式（Ｂ）の点線は両方とも二重結合である。
第２の好ましい態様においては、特に第１の好ましい態様に従い、Ｒが置換フェニル基を表す。
【００２１】
第３の好ましい態様においては、特に第１又は第２の好ましい態様に従い、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す。
第４の好ましい態様においては、特に第１〜３のいずれか１の好ましい態様に従い、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す。
【００２２】
第５の好ましい態様においては、特に第１〜４のいずれか１の好ましい態様に従い、Ｘ1はＯを表す。
第６の好ましい態様においては、特に第１〜４のいずれか１の好ましい態様に従い、Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、水素原子又はカルボニル基又はその塩を表す。
【００２３】
最も好ましい態様においては、式（Ｂ）の化合物は、環外二重結合に関してのあらゆる幾何異性体と該ピリミジン環のキラル中心に関してのエナンチオマーを包含する図７のＣＯＭ５６である。
【００２４】
式（Ａ）及び（Ｂ）（好ましい態様を含む）において、Ｒにより表されるフェニル又はピリジル基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されていてもよい。そのフェニル又はピリジル基は、ジオキシメチレン、ジオキシエチレン、又はジオキシプロピレン基などのアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい。式（Ａ）及び（Ｂ）において、環外二重結合は、ＥでもＺ配置でもよい。本発明は、両方の異性体形態並びにそれらの混合物に関する。式（Ａ）及び（Ｂ）において、ピリミジン環は、キラル中心を含有することができる。本発明は、あらゆるエナンチオマー形態並びにそれらの混合物に関する。
【００２５】
式（Ｂ）において、点線は好ましくは両方とも二重結合である。
本発明の第３の一般的側面は、医薬として使用するための次式（Ｃ）：
【００２６】
【化３】
【００２７】
により表される化合物であって、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、又は直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基であるか、又は、次式（１−１）
【００２８】
【化４】
【００２９】
［式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'及びＸ"は、独立に、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ヒドロキシ基、
アルキル基、
アルコキシ基、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
アルキルカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、
アミノ基、
アルキルアミノ基、又は
ジアルキルアミノ基
を表し、但し、Ａ及びＢの少なくとも１が式（１−１）により表される、化合物に関する。
【００３０】
式（Ｃ）の化合物の更なる態様においては、Ａ又はＢは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素から選択されるハロゲン原子であることもできる。
式（Ｃ）の化合物の更なる態様においては、Ａ又はＢは、水素原子であることもできる。
【００３１】
好ましいクラスの化合物では、Ａは水素又はヒドロキシル基である。好ましいクラスでは、Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表す。更に好ましいクラスの化合物では、Ａは水素であり、Ｌ、Ｌ'及びＬ"の少なくとも１がヒドロキシル基である。Ｘ'及びＸ"は、好ましくは酸素原子である。更には、Ｗは、好ましくはニトロ基又は水素原子である。好ましいクラスの化合物では、点線は、両方とも二重結合を表す。
【００３２】
本発明の第１の側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ｉ）：
【００３３】
【化５】
【００３４】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
アルキル基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００３５】
本発明の第２の側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（II）：
【００３６】
【化６】
【００３７】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
カルボキシル基、
ハロゲン原子、
ニトロ基、
シアノ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００３８】
本発明の第３の側面は、医薬として使用するための化合物又はその塩又はそのエステルであって、該化合物が、次式（III）：
【００３９】
【化７】
【００４０】
により表され、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、次式
【００４１】
【化８】
【００４２】
［式中、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'は、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌは、
水素原子、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
ハロゲン原子
を表す、化合物又はその塩又はそのエステルに関する。
【００４３】
本発明の更なる側面に従う化合物は、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための無細胞スクリーニング方法における阻害剤として正の結果を与えるものであり、該方法が、次の段階：
（ａ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを含有する組成物を提供する段階；
（ｂ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、該化合物の存在下、予め決められた条件下で、段階（ａ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の該リン酸化された基質ペプチドを、予め決められた条件下で、該基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｄ）特異的に結合した抗体の量が、該化合物の存在に起因して、該化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなる。
【００４４】
好ましい態様においては、この無細胞スクリーニング方法において阻害剤として正の結果を与える化合物は、特異的に結合した抗体の量を該化合物が存在しない場合に比較して低下させることに、少なくとも同じ濃度かつ同じ条件下で測定されたとき、少なくともＣＯＭ５６又はＣＯＭ６８と同じほど活性である。
【００４５】
本発明の更なる側面に従う化合物は、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための細胞アッセイにおける阻害剤として正の結果を与えるものであり、該アッセイが、次の段階：
（ａ）細胞培養物を提供する段階；
（ｂ）該細胞培養物中の細胞を、試験化合物の存在下、ＴＮＦαに曝す段階；
（ｃ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを、抗ＩＫＫ−ＮＥＭＯ抗体を使用する免疫沈降により単離する段階；
（ｄ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、予め決められた条件下で、段階（ｃ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｅ）段階（ｄ）の該リン酸化された基質ペプチドを、該基質ペプチドのリン酸化されたドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｆ）特異的に結合した抗体の量が、該試験化合物の存在に起因して、該試験化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該試験化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなる。
【００４６】
好ましい態様においては、この細胞アッセイにおいて阻害剤として正の結果を与える化合物は、特異的に結合した抗体の量を該化合物が存在しない場合に比較して低下させることに、少なくとも同じ濃度かつ同じ条件下で測定されたとき、少なくともＣＯＭ５６又はＣＯＭ６８と同じほど活性である。
【００４７】
本発明は、活性成分として、ＮＦ−κＢの活性を低下させるための活性成分としての化合物を含んでなる医薬組成物も提供する。
【好ましい態様の説明】
【００４８】
番号を伴ったＣＯＭ及びｃｏｍは、この明細書においてその化学構造で示された化合物を指す。
本発明の化合物は、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）、及び（III）により表される。これら式において、アルキル基は、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｎ−ヘキシルを含むことができる。アルケニル基の例には、２〜６の炭素原子、好ましくは２〜４の炭素原子と、１〜２の二重結合とを有する直鎖状又は分枝状アルケニル基、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、イソブテニル及びブタジエニルが含まれることができる。シクロアルキル基の例には、３〜６の炭素原子を有するもの、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが含まれることができる。アルコキシ基の例には、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、tert−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ及びｎ−ヘキソキシが含まれることができる。シクロアルキルオキシ基の例には、３〜６の炭素原子を有するもの、例えば、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ及びシクロヘキシルオキシが含まれることができる。ハロゲン原子の例には、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が含まれる。上記式において、アリール基の例は、フェニル、ナフチル及びピリジルであることができ、フェニル及びピリジルが特に好ましい。アルキレン基の例は、１〜６の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状のものであることができ、１〜４の炭素原子を有するものが好ましい。例は、メチレン、エチレン及びトリメチレンである。アルキルアミノ基についての例には、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｎ−ヘキシルから選択される１又は２の置換基を有するアミノ基が含まれることができる。ジアルキルアミノ基についての例には、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｎ−ヘキシルから選択される２の置換基を有するアミノ基が含まれることができる。シクロアルキルアミノ基の例には、３〜６の炭素原子を有するもの、例えば、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ及びシクロヘキシルアミノが含まれることができる。アシル基の例には、２〜７の炭素原子、好ましくは２〜５の炭素原子を有するアシル基が含まれることができる。カルボキシル基は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩などの薬学的に許容できる金属塩の形態であることができる。
【００４９】
上記の基、特にアリール基は１〜３の置換基を含有することができる。そのような置換基の例には、ハロゲン原子、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4アルコキシ基、Ｃ1-4アルキルチオ基、Ｃ1-4アルキルスルフィニル基、Ｃ1-4アルキルスルホニル基、カルボキシル基、Ｃ2-5アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アミノ基、及びＣ1-4アルキルアミノ基が含まれる。ここで、ハロゲン原子の例は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素であることができる。Ｃ1-4アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、及びｎ−ブチルである。Ｃ1-4アルコキシ基の例は、例えば、メトキシ、エトキシ及びプロポキシである。Ｃ1-4Ｃアルキルチオ基の例は、例えば、メチルチオ、エチルチオ及びプロピルチオである。Ｃ1-4アルキルスルフィニル基の例は、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル及びプロピルスルフィニルである。Ｃ1-4アルキルスルホニル基の例は、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル及びプロピルスルホニルである。Ｃ2-5アルコキシカルボニル基の例は、各々が１〜４の炭素原子を含有するアルコキシ基を有するもの、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニルであることができる。Ｃ1-8アルキルアミノ基の例は、各々が１〜４の炭素原子を含有する１又は２のアルキル基を有するもの、例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ及びプロピルアミノであることができる。これら置換基におけるアルキル部分は、直鎖状であも分枝状でも環状でもよい。
【００５０】
本発明の化合物は、カルボキシル基などの官能基のための通常の保護基を含有することもできる。更には、本発明の化合物は、生理学的条件下で活性物質に転化されることができるプロドラッグの形態であることもできる。
【００５１】
好ましいＲ1及びＲ2は、アルキル基、特にメチル若しくはエチル基、又はアルキレン基、好ましくはメチレン若しくはエチレン基である。Ｒ3として好ましいのは、水素原子又はハロゲン原子、特に、芳香環の２位におけるものである。Ｒ4として好ましいのは、アルコキシ基、特に、メトキシ、エトキシ又はプロポキシである。Ｒ5として好ましいのは、アルキル基、特に、メチル、エチル又はプロピル基である。Ｒ6及びＲ7として好ましいのは、アルキル基、特に、メトキシ若しくはエトキシ、又はハロゲン原子、特にヨウ素である。Ｘ、Ｙ、又はＺとして好ましいのは、水素原子又はハロゲン原子である。
【００５２】
一般式（Ｉ）の好ましいクラスの化合物は、Ｒ1及びＲ2が一緒になってアルキレン基、特に、メチレン又はエチレン基を形成し；Ｒ3が水素原子であり；Ｒ4がアルコキシ基、特に、メトキシ、エトキシ又はプロポキシ基であり、Ｒ5がアルキル基、特に、メチル、エチル又はプロピル基であり、Ｒ6及びＲ7がアルキル基、特に、メトキシ若しくはエトキシ、又はハロゲン原子、特にヨウ素であり、Ｘ及びＹが水素原子であり、そして、Ｚがハロゲン原子である化合物である。
【００５３】
一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物は、次式：
【００５４】
【化９】
【００５５】
により表されることができる。
一般式（Ｂ）の好ましいクラスの化合物は、Ｒが置換フェニル基である化合物である。その置換基は、好ましくはハロゲン原子、特に塩素原子である。更に好ましいクラスの式（Ｂ）又は（II）の化合物は、Ｘがメタ位にある置換基であり、好ましくはカルボキシル基である化合物からなる。
【００５６】
一般式（II）の好ましいクラスの化合物は、Ｒ1及びＲ2がアルキル基、特にメチル又はエチルであり；Ｒ3が水素原子、特に、芳香環の２位におけるものであり；Ｒ4がアルコキシ基、特に、メトキシ、エトキシ又はプロポキシ基であり、Ｒ5がアルキル基、特に、メチル、エチル又はプロピル基であり、Ｘ及びＹが水素原子であり、そして、Ｚがカルボキシル基、特に、芳香環の３又は４位におけるものである。
【００５７】
一般式（Ｂ）及び（II）の最も好ましい化合物は、次式：
【００５８】
【化１０】
【００５９】
により表されることができる。
一般式（Ｂ）の化合物の更に好ましい態様が図７に示される。
一般式（Ｃ）の好ましいクラスの化合物は、Ａが水素である化合物である。このグループでは、Ｘ'及びＸ"が好ましくは酸素原子であり、Ｌがヒドロキシル基であり、そして、Ｗがニトロ基である。更なるグループの化合物では、Ｂがアルキル又はアルコキシ基、好ましくはアルコキシ基であり、そしてＬ及びＷが水素である。
【００６０】
一般式（III）の好ましいクラスの化合物は、Ａ及びＢが同じ基であり、Ｒ8及びＲ9が同じか異なっていてアルキル基、特に、メチル若しくはエチル、又は水素原子を表し、Ｘ'が酸素原子であり、Ｌが水素原子であり、そして、Ｗがニトロ基である。
【００６１】
式（Ｃ）及び式（III）の最も好ましい化合物は、次式：
【００６２】
【化１１】
【００６３】
により表されることができる。
式（Ｃ）の更に好ましい化合物は、図１４に示されており、ＣＯＭ６８が特に好ましい。
【００６４】
好ましくない態様では、化合物のクラスから、Beilstein 登録番号１３２８１−５６−６、１２５２７４−０１−３、７６４００４６、６８０５５１５、２１１９４２、１９１４３５、及び５８７２８６６が除かれるが、粥状動脈硬化症の治療又は予防用の医薬品の製造のためのそれらの使用に関する先入観がある訳ではない。
【００６５】
本発明の化合物の塩に特別な制限が課されることはないので、前記塩も、それが薬学的に許容できる塩である限り本発明に含まれる。例は、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、硫酸塩、硝酸塩及びリン酸塩などの無機酸の酸付加塩；及び、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩及びクエン酸塩などの有機酸の酸付加塩であることができる。
【００６６】
更に、本発明の化合物は、水和物により代表される溶媒和物の形態で存在することができる。更に、本発明の化合物は、幾何異性体として存在することができる。そのような幾何異性体も本発明に包含されることができる。更に、式（Ｉ）及び（II）の化合物は光学活性であるので、エナンチオマーの形態で存在することができる。そのようなエナンチオマーは、慣用的な分割方法に従って純粋な形態で得られ、やはり本発明により包含される。
【００６７】
本発明によりカバーされる幾つかの化合物は、異なる供給業者から商業的に入手可能であり、［３０５８７０−４８−８］などの登録番号を有する。
本発明の化合物は、例えば、次の方法により調製されることができる。
【００６８】
一般式（Ａ）の化合物は、次のスキーム（Ａ）：
【００６９】
【化１２】
【００７０】
（式中、Ｒ、Ｒ4〜Ｒ7、Ｘ、Ｙ、及びＺは、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ｂ）の化合物は、次のスキーム（Ｂ）：
【００７１】
【化１３】
【００７２】
（式中、Ｒ、Ｒ4、Ｒ5、Ｘ1、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及び点線は、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ａ）及び（Ｉ）の化合物は、次のスキーム１：
【００７３】
【化１４】
【００７４】
（式中、Ｒ1〜Ｒ7、Ｘ、Ｙ、及びＺは、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ｂ）及び（II）の化合物は、次のスキーム２：
【００７５】
【化１５】
【００７６】
に従って調製されることができる。
出発化合物（IV）の、スキーム（Ａ）、（Ｂ）、１及び２に示された式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｉ）及び（II）の本発明の化合物への転化は、Ultra Scientist of Physical Sciences, 12(3), 277-280 (2000)；Oriental Journal of Chemistry, 16(3), 427-430, (2000) に開示された操作に従って行われることができる。従って、化合物（IV）が、塩化クロロアセチルと適当に置換されたアルデヒド（Ｖ）又は（VI）とで、無水酢酸中、酢酸ナトリウムなどの塩基の存在下で−３０℃からその混合液の沸点までの温度で処理される。一般的な調製方法は、Birsen Tozkoparan ら, Arch Pharm. Pharm. Med. Chem. 331, 201-206 (1998) から分かる。
【００７７】
出発化合物（IV-1）は、次の反応スキーム：
【００７８】
【化１６】
【００７９】
に従う Biginelli 型反応により調製されることができる。
出発化合物（IV）は、次の反応スキーム３：
【００８０】
【化１７】
【００８１】
（式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｘ、Ｙ、及びＺは、上で定義した通りである。)
に従う Biginelli 型反応により調製されることができる。
出発化合物（IV-1）又は（IV）の調製において、適当に置換されたアルデヒド化合物（VII-1）又は（VII）が、適当に置換された等モル量のβ−ケトエステル（VIIIａ）又は１,３−ジケトン（VIIIｂ）及び僅かに過剰のチオ尿素と、アルコールなどの適する溶媒中で０℃から反応混合液の沸点までの温度で反応させられる。P. Biginelli, Ber. 24, 1317, 2962 (1896); 26 447 (1893)；Martin Zaug, Organic Reactions, 14, 88, (1965)；D.J. Brown, The Pyrimidines, (Wiley, New York, 1962), p. 440；前掲., Supplement 1, 1970, p. 326；F. Sweet, Y. Fissekis, J. Am. Chem Soc., 95, 8741 (1973), Tetrahedron, 58, 4801-4807 (2002), J. Chem. Soc. Perkin Transactions, 1, 1845-1846, (2002), 及び US-A 5,958,931 を参照のこと。一般的な調製方法は、Mevlut Ertan ら, Arch Pharm. (Weinhelm) 324,135-139 (1991) から分かる。
【００８２】
一般式（Ｃ）の化合物は、次の反応スキーム：
【００８３】
【化１８】
【００８４】
（式中、Ｌ、Ｌ’、Ｌ”、Ｘ’、Ｘ”、Ｒ9、Ｗ及び点線は、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ｃ）及び（III）の化合物は、次の反応スキーム４：
【００８５】
【化１９】
【００８６】
（式中、Ｌ、Ｘ’、Ｒ9及びＷは、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
従って、式（IX）又は（IX-1）が、例えば、Synthesis, 5, 411-413, (1986) に開示された通りの操作に従って、それぞれ、出発原料（Ｘ）又は（X-1）と縮合される。出発原料（Ｘ）は、Paulsen, Stoy, The Chemistry of Amides, Wiley, New York, 1970, pp. 515-600 により記載された通りに、５−ニトロフラン−２−カルボン酸［６４５−１２−５］を対応する酸塩化物に転化してその酸塩化物をヒドラジンと反応させることにより、調製されることができる。
【００８７】
一般式（Ｃ）の化合物も、次の反応スキーム：
【００８８】
【化２０】
【００８９】
に従って調製されることができる。
従って、式（XI）の化合物が対応する対称無水物（XII）に転化され、次いで、式（XIII）の化合物と反応させられて、式（Ｃ）の化合物を与える（Wang, J.-X. (Wang, C.-H.)；Hu, Y.-L.; Cui, W.-F. (1990) Synthesis of Anhydrides from Acyl Chlorides under Solid-Liquid Phase-transfer Catalysis. J. Chem. Research (S), 84-85）。
【００９０】
式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）及び（III）の化合物及び薬学的に許容できるそれらの塩又はエステルは、例えば、医薬製剤の形態で、医薬品として使用されることができる。医薬製剤は、好ましくは、経口で、例えば、錠剤、コーテッド錠剤、糖衣錠、ハード及びソフトゼラチンカプセル剤、溶液剤、乳濁液剤又は懸濁液剤の形態で投与されることができる。しかしながら、投与は、経直腸で、例えば、坐剤の形態で行われても、非経口で、例えば、注射溶液剤の形態で行われてもよい。
【００９１】
本発明は、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物、特に上記の好ましい化合物と薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物及び薬学的に許容できるそれらの塩又はエステルが、薬学的に許容できる担体、例えば、医薬製剤を製造するための不活性な無機又は有機の担体と一緒に加工される。ラクトース、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩等が、例えば、錠剤、コーテッド錠剤、糖衣錠及びハードゼラチンカプセル剤用のそのような担体として使用されることができる。ソフトゼラチンカプセル剤用に適する担体は、例えば、活性物質の性質に依存して、植物油、ワックス、脂肪、半固体及び液体ポリオール等であるが、ソフトゼラチンカプセル剤の場合には、通常、担体は必要とされない。溶液剤及びシロップ剤の製造に適する担体は、例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース等である。アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等のアジュバントが、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物の水溶性塩の注射水溶液剤に使用されることができるが一般に必要ではない。坐剤用の適する担体は、例えば、天然油若しくは硬化油、ワックス、脂肪、半液体若しくは液体のポリオール等である。
【００９２】
加えて、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物又は薬学的に許容できるその塩又はエステルと治療的に不活性な賦形剤とを含有する医薬品も、１又はそれを越える式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物又は薬学的に許容できるその塩又はエステルと、望まれるなら１又はそれを越える他の治療的に価値のある物質とを、１又はそれを越える治療的に不活性な担体と一緒に、ガレン剤形にすることを含んでなるそのような医薬品の製造方法と同じく、本発明の目的である。
【００９３】
従って、粥状動脈硬化症などの心臓血管疾患を治療する方法もこの発明の一部であり、それによって、その方法は、上記状態のいずれかを有する患者に前記状態を治療するのに有効である量のこの発明の医薬組成物を投与することを含んでなる。
【００９４】
もちろん、用量は広い範囲で変動してもよく、各々の特定の場合に個々の必要性に合わされることができる。一般に、経口又は非経口投与のための有効量は、０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であり、全てについて０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。従って、体重が７０ｋｇである成人についての日量は、０.７〜１４００ｍｇ／日、好ましくは７〜７００ｍｇ／日である。
【００９５】
本発明に従う化合物は、抗−ＩＫＫ−ＮＥＭＯ抗体を含む免疫沈降されたＩＫＫ−コンプレックスであるＩＫＫ−コンプレックスが使用される細胞アッセイ及び無細胞アッセイにおいて、阻害剤としての正の結果を与える。無細胞アッセイでは、段階（ａ）は、好ましくは、細胞をＴＮＦαに接触させた後、プロテインＡ及び抗−ＩＫＫ−ＮＥＭＯ抗体を使用する免疫沈降によりＩＫＫ−コンプレックスを単離することを含んでなる。無細胞方法では、試験化合物は、好ましくは、段階（ａ）の後に加えられる。細胞アッセイでは、諸化合物は、段階（ａ）の前に加えられる。このアッセイでは、同定は、好ましくは、増幅された発光近接均一アッセイ（amplified luminescent proximity homogeneous assay）に基づいており、そこでは、好ましくは、基質ペプチドがビオチンニル化されてストレプトアビジンドナービーズ上に固定される。抗体は、好ましくは、プロテインＡ−アクセプタービーズ上に不動化される。アッセイの基質ペプチドは、好ましくは、ＩｋＢα又はＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥである。好ましくは、基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体は、抗−ホスホ−ＩκＢα−抗体である。本発明による化合物は、好ましくは１５００ダルトン未満、より好ましくは１０００ダルトン未満の分子量を有する非ペプチド分子から選択される。本化合物は、好ましくは、置換されていてもよい少なくとも３又は４の炭素環又はヘテロ環の非分岐鎖を含有する化合物であって、置換されていてもよい４以下の炭素又は窒素原子の長さを有するスペーサーにより隔てられていてもよい化合物である。
【００９６】
以下の実施例は、例示のために提供されるもので、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９７】
調製例Ｉ
２−［５−（３−カルボキシフェニル）−フラン−２−イルメチレン］−５−（４−クロロフェニル）−７−メチル−３−オキソ−２,３−ジヒドロ−５Ｈ−チアゾロ［３,２−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸エチルエステル（ＣＯＭ５６）
【００９８】
【化２１】
【００９９】
（１）： ３.４２６ｇ（４５ｍｍｏｌ）
（２）： ３,８２ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）
（３）： ４,２１７ｇ（３０ｍｍｏｌ）
ＰＰＥa： ４.５ｇ
ＴＨＦ： ４５ｍｌ
（aＰＰＥ＝ポリリン酸エチルエステル，Synlett 1988, 718-720 に従って調製された）
１００ｍｌのＲＢフラスコで、上記試薬をＴＨＦ中に溶解させ、そして窒素気流下で８時間還流した。進行は、ＴＬＣ（プレート：Ｍｅｒｃｋ５５５４，溶離液：クロロホルム−メタノール１０：１，生成物Ｒｆ＝０.７）により追跡された。半分の溶媒がロータリーエバポレーターで留去され、そして残渣が水に注がれて生成物が白色結晶として析出した。それは濾取され、そして蒸留水とジエチルエーテルで逐次的に洗浄された。
収率：６.３ｇ（６７.５％）。ＮＭＲ：構造
【０１００】
【化２２】
【０１０１】
に一致する。
量：
（４）： １.２７４ｇ（４,１ｍｍｏｌ）
（５）： ０.３９７ｇ（４.２ｍｍｏｌ）
（６）： ０.８８４ｇ（４,１ｍｍｏｌ）
無水酢酸ナトリウム：０.３３６ｇ（４,１ｍｍｏｌ）
無水酢酸： ６ｍｌ
酢酸： ８ｍｌ
上記の物質の混合物が混合されて５時間還流される。反応の進行がＴＬＣ（プレート：Ｍｅｒｃｋ５５５４，溶離液：クロロホルム−メタノール１０：１，生成物Ｒｆ＝０.４）により追跡された。冷却後、その混合液は水に注がれ、析出した生成物がジクロロメタンで抽出される。有機相が１０％Ｎａ2ＣＯ3溶液で２回洗浄され、無水ＭｇＳＯ4で乾燥され、そしてロータリーエバポレーターで濃縮される。得られた残渣は、ジエチルエーテル−ｎ−ヘキサン混合液で結晶化される。
収率：２.０ｇ（８８％）
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）：8.37 bs, 1H; 8.06 d, 1H; 7.96 d, 1H 及び 7.66 t, 1H (Ph /COOH/); 7.64 s, 1H (Ph-CH=フラン); 7.41 d, 2H 及び 7.33 d, 2H (Ph/Cl/); 7.40 d, 1H 及び 7.26 d, 1H (フラン); 6.01 s, 1H (ピリミジン-4); 4.1 q, 2H 及び 1.14 t, 3H (OCH2CH3); 2.49 s, 3H (CH3)。
【０１０２】
調製例２：
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（ＣＯＭ６８）
【０１０３】
【化２３】
【０１０４】
反応条件：ａ）ＫＨＣＯ3，ｎ−Ｂｕ4ＮＩ触媒，トルエン，０℃→室温，２時間；ｂ）ＣＨ2Ｃｌ2，０℃→室温，２.５時間。
一般
使用した全ての溶媒は、使用前に乾燥するか蒸留するかされた。塩化５−ニトロ−２−フロイル（１）は Lancaster から購入され、そしてサリチルアルデヒドヒドラゾン（３）は Sigma-Aldrich から購入された。
【０１０５】
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸無水物（２）
７５０ｍｇ（４.２７ｍｍｏｌ）の塩化５−ニトロ−２−フロイル（１）の１２０ｍｌのトルエン中の溶液に、４７１ｍｇ（４.７０ｍｍｏｌ）のＫＨＣＯ3及び１５８ｍｇ（０.４２７ｍｍｏｌ）のヨウ化テトラｎ−ブチルアンモニウムが０℃らで加えられる。この温度で５分後に、この混合液は、周囲温度で２時間激しく攪拌される。次いで、少量の析出物が濾去され、その混合液は１２０ｍｌの氷冷水中に注がれる。層分離後、水相が６０ｍｌのジクロロメタンで２回抽出される。合わされた有機相が硫酸ナトリウムで乾燥され、そして溶媒が減圧留去される。粗生成物がジクロロメタンから再結晶されて、１１７ｍｇ（０.３９５ｍｍｏｌ，１９％）の灰色粉末の５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸無水物（２）を生成する。
【０１０６】
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（４）
３５.０ｍｇ（０.１１８ｍｍｏｌ）の５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸無水物（２）が１０ｍｌのジクロロメタン中に殆ど溶解される。この混合液に１６.９ｍｇ（０.１２４ｍｍｏｌ）のサリチルアルデヒドヒドラゾン（３）の３.５ｍｌのジクロロメタン中の溶液が０℃で加えられる。その溶液はゆっくり明るい黄色に変色する。０℃で３０分経過した後、冷却を止めてその混合液が周囲温度で更に２時間攪拌される。次いで、その反応混合液は、１０ｍｌのＮａＨＣＯ3の飽和溶液で２回及び１０ｍｌのＮａＣｌの飽和溶液で２回抽出される。合わされた水相は、５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出される。有機相が硫酸ナトリウムで乾燥され、そして溶媒が減圧留去される。粗生成物がジクロロメタンから再結晶されて、１２.０ｍｇ（０.０４３６ｍｍｏｌ，３７％）の明黄色粉末の５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（４）を生成する。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（４）の特性
溶解性
溶解性試験は、化合物４（１.２ｍｇ）及び５００μｌの各々の溶媒のアリコートで行われた。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
異性化
化合物４をＤＭＳＯ−ｄ6中に溶解させたときに、第２組のＮＭＲシグナルが数分内に室温で観察された。これらシグナルは、暫定的に化合物４のシス／トランス異性体に帰属された。この異性体のシグナル強度は、主生成物に起因するシグナルの約１０％に相当した。アセトン−ｄ6中では、この異性化は遅くて数日内に起こったに過ぎなかった。
【０１１２】
実施例１：ＮＦ−κＢ依存性ＩκＢペプチドリン酸化の阻害
（Ａ）方法：
キナーゼアッセイプロトコル：ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。異なる化合物での処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１００ｍｍ細胞培養皿中に５×１０6／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１１３】
細胞は、示された濃度の異なる化合物と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である上澄み液が、２００μｌのＴＮＴ−緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えられた。３μｇの正常ウサギＩｇＧ（Sigma）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）との３０分間４℃でのインキュベーションにより非特異性結合が遮断されてから、２μｇの抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）で４℃で１.５時間免疫沈降された。ＴＮＴ緩衝液で３回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma））で３回洗浄した後、キナーゼ反応が、２５μｌのキナーゼ緩衝液中で、３０℃で６０分間、１ｍＭのＡＴＰ（Sigma）及び１μＭの基質ペプチドＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミド（Blosyntan）の存在下で行われた。１６０００ｇで１分間遠心分離した後、１０μｌの上澄み液が白色３８４ｐｒｏｘｉ−プレート（Packard）に加えられた。６.６μｌの検出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ，０.１ｍＭ ＢＳＡ，５０μｇ／ｍｌプロテインＡ−アクセプタービーズ，２５０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ドナービーズ（両方とも Perkin-Elmer），４ｎＭ抗−ホスホ−ＩＫＢ抗体（Santa Cruz Biotechnology)）が各々のウェルに分注された。１.５時間のインキュベーション後に、そのプレートはαスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により読み取られた。
【０１１４】
結果：
ＩκＢ−タンパク質は、サイトカイン誘発性リン酸化により、Ｓｅｒ−３２及びＳｅｒ−３６上で調節される。幾つかの化合物がＩｋＢタンパク質のＴＮＦα誘発性リン酸化を阻害したかどうかを確認するために、ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ細胞がこれら化合物で処理された。特異的ＩｋＢ−キナーゼ−コンプレックス（ＩＫＫ）が抗−ＮＥＭＯ−抗体で免疫沈降され、そしてＩＫＢの特異的リン酸化サイドに相当するペプチドと共にインキュベートされた。リン酸化ペプチドの収率がαスクリーン（Perkin Elmer）により分析された。３つの異なる化合物、即ち、４１、４８及び７３がＩＫＫ−活性への効果を有する。化合物７３がより詳細に試験された。化合物７３は、約８μＭのＩＣ50でＩＫＫ−活性を用量依存的に阻害し、（図１ａ）。化合物４１及び４８は、１０μＭ〜１００μＭの範囲のＩＣ50値でＩＫＫ−活性を用量依存的に阻害した（図１ｂ）。化合物４１は、ＰＢＳに部分的に溶解性であるに過ぎず、実際の処理濃度が不明である。
【０１１５】
化合物７３ファミリーの構造的類似体である化合物５６が、更に、ＨｅＬａ細胞での細胞アッセイで、ＩκＢリン酸化について、αスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により上記のように試験された。ＨｅＬａ細胞に加えられた漸増する濃度の化合物５６が、ＩκＢ Ｂｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミドについての基質ペプチドのリン酸化を用量依存的に阻害した。化合物５６のＩＫＫ活性を阻害する強さは、他の７３ファミリーメンバーより１０倍高く、〜８５０ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ50を有すると計算された（図８ａ）。
【０１１６】
（Ｂ）方法：
in vitro／無細胞アッセイプロトコル：ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。ＴＮＦαでの処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１７５−ｍｍ細胞培養皿中に１×１０7／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１１７】
細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で薬剤なしで刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、４００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である上澄み液が、４００μｌのＴＮＴ−緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えられた。３μｇの正常ウサギＩｇＧ（Sigma）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）との３０分間４℃でのインキュベーションにより非特異性結合が遮断されてから、４μｇの抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology）と１２ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）で４℃で１.５時間免疫沈降された。ＴＮＴ緩衝液で３回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma））で３回洗浄した後、そのプロテインＡセファロースペレットは、４つの同一アリコートに分けられた。上澄み液が除去されて、キナーゼ反応が、２５μｌのキナーゼ緩衝液中で、３０℃で６０分間、１ｍＭのＡＴＰ（Sigma）、１μＭの基質ペプチドＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミド（Blosyntan）の存在下で行われた。次いで、異なる濃度の薬剤が、ＩκＢリン酸化に必要な単離された成分の無細胞成分に加えられた。１６０００ｇで１分間遠心分離した後、１０μｌの上澄み液が白色３８４ｐｒｏｘｉ−プレート（Packard）に加えられた。６.６μｌの検出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ，０.１ｍＭ ＢＳＡ，５０μｇ／ｍｌプロテインＡ−アクセプタービーズ，２５０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ドナービーズ（両方とも Perkin-Elmer），４ｎＭ抗−ホスホ−ＩＫＢα−抗体（Santa Cruz Biotechnology)）が各々のウェルに分注された。１.５時間のインキュベーション後に、そのプレートはαスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により読み取られた。
【０１１８】
結果：
ＣＯＭ７３及びＣＯＭ５６のＩＫＫ活性への阻害効果が、無細胞アッセイで比較された。ＨｅＬａ細胞のＴＮＦα刺激及びＩＫＫコンプレックスの免疫沈降後に、漸増する濃度の薬剤がその単離されたＩＫＫコンプレックスと共にインキュベートされた。ＣＯＭ７３及び５６は、この無細胞アッセイにおいてＩＫＫ活性を用量依存的に阻害した。ＣＯＭ５６の強さは、ＩＫＫ活性の阻害において、ＣＯＭ７３に比較して有意により高かった。これら結果は、ＩＫＫコンプレックスの形成がＴＮＦα刺激に起因して完結した後にそのキナーゼコンプレックスを崩壊させる、それらＩＫＫ阻害性薬剤の能力を確認するものである。かくして、ＣＯＭ７３及び５６は、粥状動脈硬化症などの炎症性疾患の治療に適する治療剤であるばかりか、ＩＫＫコンプレックス形成を阻止する予防剤でもある（図８ｂ）。
【０１１９】
（Ｃ）方法：
ウェスタンブロットプロトコルでのＰ−ＩｋＢα検出：ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。異なる化合物での処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１００ｍｍ細胞培養皿中に５×１０6／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１２０】
細胞は、示された濃度の異なる薬剤と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である３０μｌの上澄み液が、Laemmli−緩衝液（２％ＳＤＳ，２％２−メルカプトエタノール，０.０１％ブロモフェノールブルー，８％グリセリン）で稀釈され、６０℃で１０分間加熱され、そして４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad）にかけられた。電気泳動後、ウェットブロッティング法を用いて、諸タンパク質がニトロセルロースメンブランに移された。まず、そのメンブランは、Roti-Block（Roth）でブロックされてから、Ｐ−ＩｋＢαに対するモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology，１：２００希釈率で使用された）と共にインキュベートされた。このインキュベーションに続いて、１：１００００稀釈率の適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化第２抗体（Dianova）と共にインキュベートされた。抗体結合は、ウェスタンブロット化学発光試薬検出キット（Santa Cruz）を使用して、Ｘ線フィルム上に可視化された。
【０１２１】
結果：
化合物７３の、ＩκＢリン酸化を阻害する能力が、Ｐ−ＩκＢαに特異的な抗リン酸化抗体及びウェスタンブロットにより直接に測定された。漸増する濃度のＣＯＭ７３が、ＩκＢのリン酸化を用量依存的に阻害した（図９）。
【０１２２】
結果：
ＣＯＭ７３及びＣＯＭ５４ファミリーの異なる化合物の、ＩκＢリン酸化を阻害する能力が比較された。ＩκＢリン酸化が、抗リン酸化抗体及びウェスタンブロットにより直接に測定された。ＣＯＭ７３及びＣＯＭ５６は用量依存的にＩκＢのリン酸化を阻害したのに対し、ＣＯＭ５４、ＣＯＭ６８及び６９はＩκＢリン酸化に何の効果もなかった。かくして、このクラスのＮＦ−κＢ−阻害剤の阻害効果は、ＩκＢリン酸化とは独立している（図１５）。
【０１２３】
実施例２：ＮＦ−κＢヌクレオチド結合活性の阻害：
方法：
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：ＴＨＰ−１単球（DSM, Braunschweig, Germany）が、７％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Myoclone super plus，低エンドトキシン）、１００ユニット／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Life Technologies, Inc., Eggenstein, Germany)を含有するＲＰＭＩ １６４０（Glutamax-1，低エンドトキシン）中に懸濁して維持された。実験のために、それら細胞は６ウェル培養皿中に３×１０6／ウェルの密度でプレートされた。４℃で１２００ｒｐｍで７分間遠心分離することで細胞を採取することによって核抽出物が調製された。それら細胞は、１ｍｌの氷冷ＰＢＳを加えることにより再懸濁され、そして微小遠心分離管に移された。４℃で２０００ｇで２分間遠心分離した後、ペレットは、５０μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）中で細胞溶解された。氷上で５分間インキュベートして１６０００ｇで５秒間遠心分離した後、それら核ペレットは１００μｌの緩衝液Ａで洗浄された。それら核ペレットは、１００μｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，２０％グリセロール，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）で再懸濁されて、１０秒間超音波処理された。プローブが、１６０００ｇで５秒間パルス遠心分離された。この核抽出物は、アリコートに分けられて液体Ｎ2で瞬間冷凍された。核抽出物（５ｍｇのタンパク質）は、放射性標識されたＤＮＡプローブ（１０ｎｇ；１０5ｃｐｍ）と共に３０分間室温で、２０ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.９，５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０.５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，０.２％ Nonidet Ｐ−４０，５０ｎｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ）／ｍｌ）中でインキュベートされた。プロトタイプのイムノグロブリンｋ−鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして使用され、相補的プライマーのアニーリングにより標識されてから、［γ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（＞３,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products, Brussels, Belgium）及びデオキシヌクレオシド・トリホスフェート（Boehringer Mannheim）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩの Klenow フラグメント（Boehringer Mannheim）でのプライマー伸長が行われた。諸サンプルは、未変性４％ポリアクリルアミドゲル上、０.２５３ＴＢＥ緩衝液（１０×ＴＢＥは次の通り：８９０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８９０ｍＭ ホウ酸，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中で展開された。ＳＰ−１及びＡＰ−１の結合も、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（＞５,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim）で標識された特異的コンセンサスオリゴヌクレオチド（Promega, Heidelberg, Germany）を使用して、ＥＭＳＡにより分析された。ゲルは乾燥されてオートラジオグラフィーにより分析された。
【０１２４】
結果：
このＥＭＳＡ実験は、４０の数の化合物がＮＦ−κＢの活性化に影響するかどうかを検査するために行われた。ＴＨＰ−１単球が、異なる物質と共に予備インキュベートされてからＬＰＳで刺激された。ＮＦ−の活性化及び放出はＥＭＳＡにより確認された。同じ核抽出物で、別の転写アクチベーター因子であるＳＰ−１が、ＳＰ−１コンセンサス配列を含んでなるオリゴヌクレオチドに結合するタンパク質について検査された（負荷コントロール）。これら化合物の不存在下では、予想通りの劇的なＮＦ−κＢの活性化が観察されることができる。１００μＭのこれら化合物で処理することにより、２つの物質がＮＦ−κＢ−放出を有意に減少させた。詳細には、化合物５４については９５％までであり化合物７３については８０％までであった（図２ａ）。更に、本発明者らは、化合物５４を１２,５μＭ〜１００μＭの範囲の異なる濃度で試験した。そのＮＦ−κＢ活性化は、１２,５μＭ及び２５μＭの化合物５４での処理により有意に影響を受け、そして、５０μＭ及び１００μＭにより殆ど完全に無くなった（図２ｂを参照のこと）。コントロールとして役立つ別の転写アクチベーター因子であるＳＰ−１の、この特異的オリゴヌクレオチドへの結合は、同じ核抽出物中で変化しなかった。
【０１２５】
実施例３：ＩＫＫ−βへのＮＥＭＯ結合の阻害
（Ａ）方法：
３×１０6のＨｅＬａ細胞が漸増する濃度の異なる薬剤と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦα（Roche）で刺された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。（２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。）
細胞質ゾル抽出物が先に記載した通りに単離された。
【０１２６】
凡そ４×１０5の細胞からの抽出物である３０μｌの細胞質ゾル抽出物が４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad）にかけられた。電気泳動後、ウェットブロッティング法を用いて、諸タンパク質がニトロセルロースメンブランに移された。まず、そのメンブランは、Roti-Block（Roth）でブロックされてから、ＩＫＫα／β又はＮＥＭＯに対するモノクローナル抗体（両方とも、Santa Cruz Biotechnology，１：２００希釈率で使用された）と共にインキュベートされた。このインキュベーションに続いて、１：１００００稀釈率の適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化第２抗体（Dianova）と共にインキュベートされた。抗体結合は、ウェスタンブロット化学発光試薬検出キット（Santa Cruz）を使用して、Ｘ線フィルム上に可視化された。
【０１２７】
結果：
化合物７３がＮＥＭＯのＩＫＫα／βへの結合を選択的に阻害してコンプレックスの不安定性と劣化をもたらすかごうかを検査するために、ＨｅＬａ細胞が種々の濃度の化合物７３で処理されて、タンパク質安定性が測定された（図３ａを参照のこと）。その細胞質ゾル抽出物は、ウェスタンブロット分析により分析された。ＮＥＭＯ及びＩＫＫα／βのレベルは、これら実験条件下で用量依存的に減少した（図３ａ）。ＮＥＭＯタンパク質の場合には、化合物７３によりタンパク質劣化を高度に受け易いことが観察され得る。ＮＥＭＯタンパク質の量の減少が３.３μＭで観察されることができ、２０μＭにより有意な劣化があり、３３μＭ及び１００μＭにより殆ど完全に無くなった。対照的に、ＩＫＫα／β劣化は、高濃度の３３μＭと１００μＭの化合物７３でのみ明らかであった。使用された最高の濃度でも完全な分解は検出されなかった。ＴＮＦα刺激のコンプレックス組成又はコンプレックス劣化への効果は観察されなかった。
【０１２８】
ＩＫＫコンプレックスの崩壊を詳しく検査するために、本発明者らは、抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology)での免疫沈降後のＩＫＫ−α／βのタンパク質発現を分析した（図３ｂ）。免疫沈降前後にＩＫＫα／βの量の明らかな相関関係が見られた。ＮＥＭＯタンパク質の検出は不変でも、ＩＫＫα／βタンパク質のレベルは、化合物７３により用量依存的に減少した。化合物７３無しのコントロールと比較して、ＩＫＫ−α／ＩＫＫ−βは、ＮＥＭＯとの同時沈降コンプレックスにおいて、１０μＭで２７％に減少し、１００μＭで９１％に減少した。
【０１２９】
結果：
ＴＮＦα刺激後のＩＫＫコンプレックスの劣化が、ウェスタンブロット及びＩＫＫα／βとＮＥＭＯに対する特異的抗体で評価された。ＣＯＭ７３は、無傷細胞とのインキュベーション後に、用量依存的にＩＫＫα／βとＮＥＭＯを劣化させた。ＮＥＭＯは、ＣＯＭ７３によるタンパク質劣化に対して、ＩＫＫα／βコンプレックスに比較してより感受性であった（図１０）。
【０１３０】
（Ｂ）方法：
in vitro での薬剤処理後のＩＫＫ−コンプレックスの劣化：先に記載した通りの抗−ＮＥＭＯ抗体（Santa Cruz)での免疫沈降後に、免疫沈降し洗浄されたＩＫＫ−コンプレックスが、異なる濃度のＩＫＫ阻害剤と共に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma）中でインキュベートされた。１時間処理後、プローブが１６０００ｇで１分間遠心分離され、上澄み液が完全に除去され、プロテインＡペレットが、１×Laemmli−緩衝液（２％ＳＤＳ，２％２−メルカプトエタノール，０.０１％ブロモフェノールブルー，８％グリセリン）中に再懸濁され、６０℃で１０分間加熱され、そして４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad）にかけられた。電気泳動後、ウェットブロッティング法を用いて、諸タンパク質がニトロセルロースメンブランに移された。まず、そのメンブランは、Roti-Block（Roth）でブロックされてから、ＩＫＫαに対するモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology，１：２００希釈率で使用された）と共にインキュベートされた。このインキュベーションに続いて、１：１００００稀釈率の適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化第２抗体（Dianova）と共にインキュベートされた。抗体結合は、ウェスタンブロット化学発光試薬検出キット（Santa Cruz）を使用して、Ｘ線フィルム上に可視化された。そのＸ線フィルムは走査されて、その結果がソフトウェアＡＩＤＡにより濃度計により分析された。
【０１３１】
結果：
化合物５６によるＩＫＫ−α／βへのＮＥＭＯ結合の阻害が、ＩＫＫコンプレックスの免疫沈降後に評価された。ＣＯＭ５６は、この in vitro アッセイにおいてそのコンプレックスを用量依存的に崩壊させた（図１１）。
【０１３２】
実施例４：ＮＦ−κＢ阻害剤の細胞透過性
方法：
３×１０6ＨｅＬａ細胞が１００μＭの化合物７３と共に１時間インキュベートされた。ＰＢＳで３回洗浄した後、１２０μｌの低張性緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐｈ７.５）が細胞ペレットに加えられ、細胞溶解のために液体Ｎ2中で凍結された。１６０００ｇで５分間遠心分離した後、上澄み液がＥＬＩＳＡで４５０ｎｍにより測定され、化合物７３の量がこの物質の標準濃度と比較された。
【０１３３】
結果：
化合物７３の細胞透過性が、ＥＬＩＳＡリーダーでのその特性シグナルにより、細胞質ゾル中のその化合物濃度を測定することにより追跡された。１００μＭの化合物７３と共に１時間インキュベートした後、高レベルのその化合物が検出されることができた。１００ｍＭ化合物のシグナルと比較して、約９０μＭの濃度が細胞内部に見出された（図４）。この結果は、化合物７３の優れた細胞透過性を示すものである。
【０１３４】
実施例５：ＮＦ−κＢ阻害剤での処理後の細胞生存度
方法：
９６ウェル中の３×１０4ＨｅＬａ細胞が、１００μＭの化合物５４及び７３と共に３時間インキュベートされた。培地が変えられ、そして１０μｌのＷＳＴ−１試薬が各々のウェルに加えられた。２時間後、４５０ｎｍの吸収がＥｌｉｓａリーダーで測定された。
【０１３５】
結果：
化合物７３及び５４の潜在的毒性が、ＷＳＴ−１生存度試験アッセイ（Boehringer Mannheim)により追跡された。化合物５４及び７３は、記載されたアッセイで適用された濃度及び条件ではＨｅＬａ細胞に毒性であるとは認められなかった。３０μＭの各々の化合物で３時間インキュベートした後、未処理コントロールと比較して有意な代謝活性の減少が検出されることはなかった。
【０１３６】
結果：
ＣＯＭ５４ファミリーの化合物についての細胞生存度がＨｅＬａ細胞で試験された。ＨｅＬａ細胞を漸増する濃度のＣＯＭ５４及び６９（０.３〜１００μｍｏｌ／Ｌ）で１日インキュベートしても、細胞生存度への負の影響はなかった（ＷＳＴ染色により評価された）。３３及び１００μｍｏｌ／Ｌの濃度の化合物６８が、１日インキュベーション時間後に細胞生存度を低下させた（図１６）。
【０１３７】
実施例６：キナーゼアッセイプロトコル
ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。異なる化合物での処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１００−ｍｍ細胞培養皿中に５×１０6／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１３８】
細胞は、示された濃度の異なる薬剤と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である上澄み液が、２００μｌのＴＮＴ−緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えられた。３μｇの正常ウサギＩｇＧ（Sigma）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）との３０分間４℃でのインキュベーションにより非特異性結合が遮断されてから、２μｇの抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）で４℃で１.５時間免疫沈降された。ＴＮＴ緩衝液で３回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma））で３回洗浄した後、キナーゼ反応が、２５μｌのキナーゼ緩衝液中で、３０℃で６０分間、１ｍＭのＡＴＰ（Sigma）及び１μＭの基質ペプチドＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミド（Blosyntan）の存在下で行われた。１６０００ｇで１分間遠心分離した後、１０μｌの上澄み液が白色３８４ｐｒｏｘｉ−プレート（Packard）に加えられた。６.６μｌの検出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ，０.１ｍＭ ＢＳＡ，５０μｇ／ｍｌプロテインＡ−アクセプタービーズ，２５０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ドナービーズ（両方とも Perkin-Elmer），４ｎＭ抗−ホスホ−ＩＫＢα−抗体（Santa Cruz Biotechnology)）が各々のウェルに分注された。１.５時間のインキュベーション後に、そのプレートはαスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により読み取られた。
【０１３９】
実施例７：電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＴＨＰ−１単球（DSM, Braunschweig, Germany）が、記載された通りに（４１）、７％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Myoclone super plus，低エンドトキシン）、１００ユニット／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Life Technologies, Inc., Eggenstein, Germany)を含有するＲＰＭＩ １６４０（Glutamax-1，低エンドトキシン）中に懸濁して維持された。実験のために、それら細胞は６ウェル培養皿中に３×１０6／ウェルの密度でプレートされた。４℃で１２００ｒｐｍで７分間遠心分離することで細胞を採取することによって核抽出物が調製された。それら細胞は、１ｍｌの氷冷ＰＢＳを加えることにより再懸濁され、そして微小遠心分離管に移された。４℃で２０００ｇで２分間遠心分離した後、ペレットは、５０μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）中で細胞溶解された。氷上で５分間インキュベートして１６０００ｇで５秒間遠心分離した後、それら核ペレットは１００μｌの緩衝液Ａで洗浄された。それら核ペレットは、１００μｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，２０％グリセロール，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）で再懸濁されて、１０秒間超音波処理された。プローブが、１６０００ｇで５秒間パルス遠心分離された。この核抽出物は、アリコートに分けられて液体Ｎ2で瞬間冷凍された。核抽出物（５ｍｇのタンパク質）は、放射性標識されたＤＮＡプローブ（１０ｎｇ；１０5ｃｐｍ）と共に３０分間室温で、２０ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.９，５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０.５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，０.２％ Nonidet Ｐ−４０，５０ｎｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ）／ｍｌ）中でインキュベートされた。プロトタイプのイムノグロブリンｋ−鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして使用され、相補的プライマーのアニーリングにより標識されてから、［ａ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（＞３,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products, Brussels, Belgium）及びデオキシヌクレオシド・トリホスフェート（Boehringer Mannheim）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩの Klenow フラグメント（Boehringer Mannheim）でのプライマー伸長が行われた。諸サンプルは、未変性４％ポリアクリルアミドゲル上、ＴＢＥ緩衝液（１０×ＴＢＥは次の通り：８９０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８９０ｍＭ ホウ酸，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中で展開された。ＳＰ−１及びＡＰ−１の結合も、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（５,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim）で標識された特異的コンセンサスオリゴヌクレオチド（Promega, Heidelberg, Germany）を使用して、ＥＭＳＡにより分析された。ゲルは乾燥されてオートラジオグラフィーにより分析された。
【０１４０】
実施例８：一回用量ＩＶ投与後のＩＫＫ阻害剤の薬物動態学
方法：
ラットにおける in vivo ＩＶ適用：
ＣＯＭ５６が、生理食塩水緩衝液で２００μＬの容量中１００μＭ及び２００μＭに稀釈された。このプローブがラットに静脈内投与された。２分後と２０分後に、血液プローブが右頸動脈から採取された。それら血液プローブは、２５００ｇで３分間遠心分離されて、血清成分である上澄み液が質量分析法により分析された。
【０１４１】
結果：
ラットにおける５５及び２７.５μｇ化合物５６の一回ＩＶ適用後、正の血清プローブが、投与２分後及び２０分後に測定された（図１２）。
【０１４２】
実施例９：全身炎症の阻害
方法：
ラットにおいて全身炎症応答が、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）ショック（ＬＰＳ０.３３μｇ／ｇのＩＶ投与）により誘発された。ラットへの化合物５６のＩＶ投与（１μｇ／ｇ）による炎症の阻害が、マウス血清中のＴＮＦα定量により測定された。ＴＮＦαは、ＥＬＩＳＡキット（Pierce）でその製造業者の指示書に従って検出された。
【０１４３】
結果：
ラットにおいてＬＰＳにより in vivo で誘発された全身炎症が化合物５６により阻害された。ラット血清におけるＴＮＦα濃度が、化合物５６予備処理後に有意に阻害された（図１３）。
【０１４４】
実施例１０：薬剤処理によるヒト内皮細胞中の粥状動脈硬化症の阻害
方法：
蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析によるＩＣＡＭ発現の測定：
ＨＵＶＥＣ細胞が６ウェルプレートに１×１０6細胞／ウェルで播かれた。２４時間後、細胞は異なる濃度の化合物６８で処理された。１時間後、培地が除去されて、それら細胞はＩＬ−１（１００ｐｇ／ｍｌ）又はＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）のいずれかと共に合計４時間インキュベートされた。その後、それら細胞は、トリプシンで採取され、ＰＢＳで洗浄され、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。ペレットが５０μｌのＰＢＳと５μｌのＣＤ５４−ＰＥ抗体（Beckman/Coulter/Immunotech からの抗−ＩＣＡＭ抗体）中に再懸濁された。ＰＢＳで二回洗浄した後、ＩＣＡＭ細胞表面発現がＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）により分析された。
【０１４５】
結果：
ＣＯＭ６８がヒト内皮細胞における粥状動脈硬化症マーカーを濃度依存的に阻害した。ＣＯＭ６８のＨＵＶＥＣ細胞とのインキュベーションで、ＩＣＡＭ発現が有意に阻害された。ＩＬ−１刺激後はＣＯＭ６８についてのＩＣ50は７.８μｍｏｌ／Ｌであり、ＴＮＦα刺激後はＩＣＡＭ発現の阻害について４.５μｍｏｌ／Ｌであった（図１７）。
【０１４６】
製剤例Ａ
次の組成の錠剤が慣用的なやり方で製造される：
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
製剤例Ｂ
次の組成の錠剤が慣用的なやり方で製造される：
【０１４９】
【表５】
【０１５０】
製剤例Ｃ
次の組成のカプセル剤が慣用的なやり方で製造される：
【０１５１】
【表６】
【０１５２】
適する粒子サイズを有する活性成分、結晶ラクトース及び微結晶性セルロースが相互に均一に混合され、篩分けされ、その後にタルクとステアリン酸マグネシウムが混和される。最終混合物が適するサイズのハードゼラチンカプセル内に充填される。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１ａ】化合物７３の、ＴＮＡα刺激後のＩＫＫ−コンプレックスの活性への効果。ＩκＢペプチドリン酸化の阻害についての化合物７３の用量−応答曲線が示される。ＨｅＬａ細胞がＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激され、免疫沈降されたＩＫＫ−コンプレックスの活性が、αスクリーンアッセイ（Perkin Elmer）で測定された。活性の相対的減少率が最大蛍光計数値の％で出される。ｎ＝３の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図１ｂ】化合物４１、４８及び７３のＩＫＫ−コンプレックスへの分化阻害。ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）刺激後のＨｅＬａ細胞を種々の濃度の阻害剤（＃４１；＃４８及び＃７３）で処理した後に二重ＩＫＫ−活性測定が行われた。ＩＫＫ−コンプレックスは、抗−ＮＥＭＯ−抗体で又は非特異的ＩｇＧでの制御下で免疫沈降された。ＩκＢペプチドリン酸化についてのキナーゼ活性の減少率が出され、蛍光計数値がαスクリーンシステム（Perkin Elmer）により測定された。
【図２ａ】異なる化合物の、ＮＦ−κＢ活性への効果。ＴＨＰ−１細胞が、１００μＭの異なる化合物で１時間処理されてから、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激された。ＮＦ−κＢについての電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）が行われた。核抽出物が、ＮＦ−κＢについて特異的な配列を有する放射性標識ＤＮＡプローブと共にインキュベートされた。Ｘ線フィルム曝露により検出された標識ＮＦ−κＢについてのシグナル強度が濃度計により分析された。１０試験化合物のＮＦ−κＢ活性への阻害効果が、ＬＩＰＳコントロールの１００％と比較したＳＰ−１結合へと標準化される。ＬＰＳ刺激なしの細胞は、有意なＮＦ−κＢ活性を示さなかった。
【図２ｂ】化合物５４での、ＮＦ−κＢ放出の用量依存的阻害。異なる濃度の化合物５４が、ＴＨＰ−１細胞に１時間加えられた。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）での１時間の刺激後、ＥＭＳＡアッセイでＮＦ−κＢ活性を分析するための核抽出物が調製された。最上段のフレームでは、ＥＭＳＡゲルへの曝露後の代表的Ｘ線フィルムが示される。ダイヤグラムは、ＬＩＰＳコントロールの１００％と比較してＳＰ−１結合へ標準化させたＮＦ−κＢ活性の用量依存的阻害を纏めたものである。最下段のフレームでは、ＳＰ１へのオリゴヌクレオチド結合がコントロールとして示される。
【図３ａ】ＩＫＫ−コンプレックスの劣化が化合物７３により起こる。ＨｅＬａ細胞が、種々の濃度の化合物７３と共にインキュベートされてから、ＴＮＦα刺激（２０ｎｇ／ｍｌ）された。ＴＮＦα刺激有り又は無しの追加の２つのコントロールが分析された。細胞溶解産物中のＮＥＭＯの量が、特異的抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）でのウェスタンブロット分析により測定された。Ｂ．同じ抽出物において、ＩＫＫα／βのレベルが、特異的抗−ＩＫＫα／β−抗体（Santa Cruz）で調べられた。代表的ウェスタンブロットは、ＮＥＭＯの用量依存的タンパク質分解と高い化合物７３濃度でのＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βのタンパク質分解を示す。
【図３ｂ】化合物７３によるＩＫＫα／βのＮＥＭＯ結合へのコンプレックスの崩壊。ＨｅＬａ細胞が１０μＭ及び１００μＭの化合物７３で処理されてから、ＴＮＦα刺激（２０ｎｇ／ｍｌ）された。ＩＫＫ−コンプレックスが、抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）とプロテインＡ−セファロースで、細胞質ゾル抽出物から同時沈降された。その沈降物は、特異的抗−ＩＫＫα／β−抗体で、ＩＫＫα／βタンパク質について、ウェスタンブロットで分析された。コントロールでは、免疫沈降用の非特異的ウサギ抗体で、ＩＫＫα／βとの同時沈降物は検出されなかった。化合物７３は、活性化されたＨｅＬａ細胞において、ＩＫＫα／βのＮＥＭＯへの結合を用量依存的に阻害した。
【図４】化合物７３の細胞透過性。細胞質ゾル抽出物が調製されて、Ｅｌｉｓａにより分析された。化合物７３は、ＥＬＩＳＡリーダーで、４５０ｎｍの波長で特性シグナルを与える。無傷ＨｅＬａ細胞が１００μＭの化合物７３で１時間処理された。ダイヤグラムは、化合物７３と共にインキュベートした後の細胞質ゾル抽出物からの特性シグナルを、緩衝液中の１００μＭサンプルと比較して示す。未処理細胞からの細胞質ゾル抽出物がコントロールに示される。
【図５】化合物７３及び５４の、細胞生存度への影響。ＨｅＬａ細胞が化合物７３（１００μＭ）又は化合物５４（１００μＭ）と共に３時間インキュベートされた。細胞の完全性と活性な代謝のために、ＷＳＴ−１試薬が加えられた。Ｅｌｉｓａリーダーでの特性波長で吸光度が測定された。
【図６】阻害剤としての正の結果により本発明の化合物を特性決定する細胞アッセイ及び無細胞アッセイの図式的表示。
【図７】一般式（Ｂ）のＩＫＫ−阻害剤（ＣＯＭ７３ファミリー）の化学構造。化合物ＣＯＭ７３への構造的類似性を有するＩＫＫ−阻害剤の化学構造が比較しながら示されている。これら８化合物についてのＩＫＫ−活性阻害の効力が、方法の項で説明した通りにＮＥＭＯ劣化により測定されたＩＫＫ活性の阻害率（％）で与えられている。
【図８ａ】ＣＯＭ５６の、細胞性ＩＫＫ−活性への阻害効果。細胞アッセイにおけるＩＫＫ活性の阻害についての化合物５６の用量−応答曲線が示される。漸増する濃度のＣＯＭ５６の存在下で、ＨｅＬａがＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。ＩＫＫ−コンプレックスが免疫沈降され、そして、ＩＫＫの活性が、方法の項に記載した通りに、αスクリーンアッセイ（Perkin Elmer）で測定された。その活性の相対的減少率は、最大蛍光計数値の％で出される。ｎ＝４の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図８ｂ】ＣＯＭ７３及び５６の、無細胞ＩＫＫ−活性への阻害効果。無細胞アッセイにおけるＩＫＫ活性の阻害についての化合物７３及び５６の用量−応答曲線が直接比較しながら示される。ＨｅＬａ細胞がＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されて、ＩＫＫ−コンプレックスが連続的に免疫沈降した。漸増する濃度の化合物７３及び５６の存在下で、無細胞アッセイ条件下、方法の項に記載した通りに、αスクリーンアッセイ（Perkin Elmer）で測定された。その活性の相対的減少率は、最大蛍光計数値の％で出される。ｎ＝２の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図９】ＣＯＭ７３の、ＩκＢαリン酸化への阻害効果。漸増する濃度のＣＯＭ７３がＩκＢαのリン酸化を用量依存的に阻害する。ＨｅＬａ細胞が、漸増する濃度の化合物７３の存在下でＴＮＦαで予備刺激された。細胞溶解産物のＩκＢリン酸化が、特異的抗リン酸化抗体及びウェスタンブロットで分析された。代表的ウェスタンブロットが示される。
【図１０】化合物７３の、ＩＫＫ−コンプレックスの劣化への効果。ＩＫＫ−コンプレックスの劣化についての化合物７３の用量−応答曲線が示される。ＨｅＬａ細胞が、種々の濃度の化合物７３と共にインキュベートされてから、ＴＮＦα刺激された（２０ｎｇ／ｍｌ）。細胞の溶解後、ＮＥＭＯタンパク質の量が、特異的抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）でのウェスタンブロット分析により測定された。ＩＫＫα／βの量が、特異的抗−ＩＫＫα／β−抗体（Santa Cruz）とウェスタンブロットとで調べられた。タンパク質量が定量され、漸増する濃度のＣＯＭ７３によるタンパク質の量の相対的減少率がコントロールの％で出された。ｎ＝２の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図１１】ＣＯＭ５６は、ＮＥＭＯへのＩＫＫα／β結合を in vitro で崩壊させる。ＨｅＬａ細胞がＴＮＦα刺激（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理された。ＩＫＫコンプレックスが、抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）とプロテインＡ−セファロースで、細胞質ゾル抽出物から同時沈降された。その沈降物は化合物５６と共にインキュベートされ、そのコンプレックス完全性がＩＫＫα／βタンパク質について特異的抗体でのウェスタンブロットで分析された。化合物５６は、ＮＥＭＯへのＩＫＫα／βの結合を in vitro で崩壊させた。ＩＫＫα／βタンパク質の量が未処理ＨｅＬａ細胞の％で表される。
【図１２】ＩＶ施与後のＣＯＭ５６の血清濃度。一回ＩＶ施与後のＣＯＭ５６の血清レベルが質量分析法により分析された。ＣＯＭ５６の２７.５及び５５μｇＩＶ注射で、２及び２０分後にかなりの血清レベルがラットにおいて測定されることができた。２つの実験の一回値が与えられている。
【図１３】ＣＯＭ５６による全身性炎症の阻害。ＬＰＳ刺激前後の全身性ＴＮＦα放出が、特異的ＥＬＩＳＡアッセイで、ラットで測定された。ＣＯＭ５６でのラットの予備処理は、全身性ＴＮＦα放出を阻害する。ｎ＝４の実験の平均値±ＳＥＭが示される。
【図１４】ＣＯＭ５４ファミリーのＩＫＫ阻害剤の化学構造。化合物ＣＯＭ５４と高い構造的類似性を有するＩＫＫ−阻害剤の化学構造が比較しながら示される。
【図１５】ＩｋＢα−リン酸化への阻害活性の測定。異なるＩＫＫ阻害剤のＩκＢαリン酸化への効果が比較しながら示される。ＨｅＬａ細胞が、１０及び１００μＭの異なるＩＫＫ阻害剤の存在下でＴＮＦαで予備刺激された。細胞溶解産物のＩκＢαリン酸化が、特異的抗リン酸化抗体とウェスタンブロットとで分析された。代表的ウェスタンブロットが示される。
【図１６】ＣＯＭ５４及び類似物での処理後の細胞生存度。ＨｅＬａ細胞が、漸増する濃度の化合物５４とその類似物と共に１日インキュベートされた。細胞完全性と活性な代謝のために、ＷＳＴ−１試薬が加えられた。Ｅｌｉｓａリーダーでの特性波長で吸光度が測定され、そしてコントロールの％で出された。ｎ＝４の実験の平均値±ＳＥＭが示される。
【図１７】ＣＯＭ６８によるヒト内皮細胞における粥状動脈硬化症の阻害。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＣＯＭ６８によるＩＣＡＭ発現の阻害が、ＩＬ−１及びＴＮＦα刺激後の両方で示される。ＩＣＡＭ発現は、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ測定により測定された。ｎ＝３の実験の平均値±ＳＥＭが示される。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＮＦ−κＢの活性化特異的阻害のための化合物、該化合物を活性剤として含有する医薬組成物、及び、心臓血管疾患、特に粥状動脈硬化症の治療又は予防のための医薬品の製造のための該化合物の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
一定のチアゾロ［２,３−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸は、データベース CHEMCATS [online] Chemical Abstracts Service, Columbus, Ohio, US；XP002247262 及び INTERCHIM, Montlucon, Cedex, France, 公表日：２００２年９月７日；カタログ名：INTERCHIM INTERMEDIATES から知られている。これら化合物の医薬用途はこの文献からは分からない。
【０００３】
一定のフラン−２−カルボン酸ベンジリデンヒドラジド誘導体は、Beilstein 登録番号１３２８１−５６−６、１２５２７４−０１−３（本化合物６８）、７６４００４６、６８０６５１５、及び２１１９４２で知られている。一定のチオフェン−２−カルボン酸ベンジリデンヒドラジド誘導体は、Beilstein 登録番号９１４３５、５８７２８６６で知られている。
【０００４】
Tozkoparan B.らは、Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 331, 201-206 (1998) において、一定のチアゾロ［２,３−ａ］ピリミジン類の合成と抗炎症活性を開示している。しかしながら、この文献は、これら抗炎症性化合物の作用の可能ないずれのメカニズムも挙げていない。Ertan M.らは、Arch. Pharm. (Weinheim) 324, 135-139 (1991) において、チアゾロ［２,３−ａ］ピリミジン類の合成に中間体化合物として有用である２−チオキソ−１,２,３,４−テトラヒドロピリミジン誘導体の合成を開示している。
【０００５】
ＷＯ０１／３０７７４及び Hehner, S. P.ら. Journal of Immunology 163 (10), 5617-5623 は、本発明の化合物と構造的に関連しない化合物によるＮＦ−κＢ活性の阻害に関する。
【０００６】
異なる毒性プロセスが粥状動脈硬化症の開始にある役割を果たしており、コレステロール及び他の脂質がその最も重要な因子である。しかしながら、これらプロセスは、思春期の頃に起こり、粥状動脈硬化症の複雑さについての限られた病因的関連性を有するに過ぎない。この疾患の予測及び顕現についてより重要なものは、中年及び老年患者における粥状動脈硬化症性変化の進行である。粥腫進行は、主に内皮における炎症プロセスにより推進され、それが、喫煙、高血圧症、高脂血症及び糖尿病などの粥状動脈硬化症の異なる危険因子により維持される。粥状動脈硬化症における慢性炎症は、病巣に白血球を差し向ける特定のサイトカインにより永久化され、かくして動脈壁内での炎症状態の悪循環を誘発する [Ross, R, N. Engl J. Med. 340:115-126, 1999]。
【０００７】
この慢性炎症プロセスが起こるメカニズムは、まず、血小板内皮相互作用により引き起こされる [Ross, R, N. Engl. J. Med. 340:115-126, 1999]。血小板が活性化されると、それらがそれらの周辺環境のサイトカイン及び増殖因子を放出することが知られている [Gawaz M, Circulation. 96:1809-1818; 1997]。内皮表面への血小板の接着は、粥腫形成プロセスの初期に観察され、生物活性分子、例えばＩＬ−１β [Gawaz M, Atherosclerosis. 148:75-85; 2000] 又はＣＤ４０リガンド [Henn V; Nature. 391:591-594; 1998] の放出と関連している。初期の粥状動脈硬化症は、更に、単球の内皮への接着及び泡沫細胞形成を伴う内膜層における蓄積により特徴付けられる。これら活性化された血小板は、培養内皮細胞において転写因子ＮＦ−κＢの活性化を誘発する [Gawaz, M; Circulation. 98:1164-1171; 1998]。血小板に加えて、粥状動脈硬化症の悪化について決定的な役割を有する他の重要な諸内皮表面レセプター、例えば、ＬＯＸ−１レセプター又はトール様 (toll-like) レセプターが、共通のシグナリング経路としてＮＦ−κＢシステムを有する [Metha JL & L; D,J. Am. Coll. Cardiol. 39:1429-1435; 2002; Dunne; A & O'Neill LA; Science STKE 2003 (171):re 37]。
【０００８】
ＮＦ−κＢは、ＭＣＰ−１ [Bauerle, P; Cell. 87:13-20; 1996]、単球についての強力な化学的攻撃体であって粥状動脈硬化症組織に豊富にあるＣ−Ｃケモカイン [Neiken; J. Clin. Invest 88:1121-1127; 1991] などの初期炎症応答遺伝子を媒介するのに特に重要な偏在性転写因子である。刺激されていない細胞では、ＮＦ−κＢは、二量体として、最も高頻度では、それが核に入るのを阻止する阻害性ＩｋＢタンパク質、例えば、ＩＢ−α、−β及び−εに結合したｐ５０／ｐ６５として、細胞質において見られる。細胞がサイトカイン、細菌産物又は酸化ストレスにより刺激されると、特定のキナーゼがＩｋＢをリン酸化して、プロテアソームによりその急速なユビキチン依存性タンパク質分解性劣化を起こす。ＮＦ−κＢのＩｋＢからの放出は、ＮＦ−κＢの核への通過をもたらし、そこで、それは、プロモーター又はエンハンサー領域の特異的ｋＢ配列に結合することにより、炎症、免疫学的、増殖及び細胞自滅プロセスに関与する標的遺伝子の転写を活性化する [Bauerle, P; Cell. 87:13-20; 1996]。
【０００９】
ＩｋＢのリン酸化をもたらすシグナリング事象についての鍵となる役割は、最近同定されたＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）コンプレックスが果たす [Karin; Annu. Rev. Immunol 18:621-663; 1996]。原型的には、このコンプレックスは、２のキナーゼ活性成分、即ちＩＫＫ−αとＩＫＫ−β、並びに、ＩＫＫ−γと呼ばれる、そのコンプレックスの安定化に関与するか又はその調節を助けることができるキナーゼ不活性アダプタータンパク質を含有する。ＩＫＫ−αの機能は未だ不明であるが、それは分化及び増殖にある役割を果たすことが提案されてきたのに対し、ＩＫＫ−βは主要なＩｋＢリン酸化キナーゼとして見做され、前炎症及び細胞自滅プロセスに関与している [Karin ; Annu. Rev. Immunol. 18:621-663; 1996]。
【００１０】
活性化された血小板は、ＩＬ−１β刺激の後に見られる効果と類似の、ＩｋＢ−α及び−εのタンパク質分解をもたらす内皮Ｉコンプレックスの一時的活性化を誘発する。ＩＫＫ−βは、ＩＫＫコンプレックスからの最も重要なキナーゼとして同定され、ＩＫＫ−βの優勢ネガティブ突然変異体の過剰発現が、内皮細胞において、血小板誘発ＩｋＢ−及びＭＣＰ−１プロモーター依存性転写、並びに、ＭＣＰ−１分泌を実質的に低下させた [Gawaz, M; Thromb Haemost. 2002 Aug;88(2):307-14; 2002]。これは、内皮細胞において、接着タンパク質ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭの顕著な減少をもたらした。これら接着タンパク質の表面発現は、粥状動脈硬化症動物モデル及びヒトの内皮上で増加する。更には、これら接着タンパク質は、炎症細胞の内皮への粘着を増加させるのに、及び更に単球の内皮内への侵入に重要な役割を果たしている。これら単球は、更にマクロファージへと分化して、粥腫進行における炎症を更に悪化させる。かくして、ＩＫＫ−βの阻害によるこのシグナリングの阻害は、粥腫進行における炎症経路の鍵となる段階を崩壊させる。
【００１１】
ＮＦ−κＢ活性を阻害する異なるアプローチが記載されている。一例は、ＩＫＫ−γ／ＮＥＭＯシグナルソームコンプレックス（signalsome complex）の成立の阻害である [May, M.J; Science 289:1550-1554; 2000]。このシグナルソームコンプレックスの組み立ては、ＩｋＢの効率的なリン酸化及び引き続いて起こるＮＦ−κＢの阻害のために必須である。別のアプローチは、ＮＦ−κＢ阻害のためにキナーゼの触媒ドメインを阻害することである。ＮＦ−κＢシステムは、偏在しておりかつ種々の細胞プロセスの一因であるので、炎症プロセスにおける度を越したＮＦ−κＢ活性をその基本的活性を害さないで特異的に阻害することが望ましい。
【発明の要旨】
【００１２】
本発明の課題は、粥腫進行における炎症プロセスの治療のために、ＮＦ−κＢの活性化形態をその基本的活性を害することなく阻害する特異的能力がある化合物を提供することである。医薬品、特に上記種類の急性及び／又は慢性心臓血管障害の制御又は予防のための医薬品の製造のためのそのような化合物の使用も本発明の目的である。
【００１３】
この課題は、特許請求の範囲に従えば解決される。本発明は、粥腫進行におけるＮＦ−κＢ媒介炎症（具体的には、ＮＦ−κＢシステムの活性化形態）を完全なＮＦ−κＢ阻害という有害な副作用なしに阻害するという格別な技術的特徴に基づく単一の一般的発明概念により関連付けられる化合物を提供する。本発明は、粥状動脈硬化症を治療するための重要な課題を解決する。本発明の化合物は、ＮＦ−κＢ経路を阻害することにより、粥状動脈硬化症の動脈における慢性炎症プロセスを治療又は予防する。そのクラスの化合物は、粥状動脈硬化症において優勢的に見出されるＮＦ−κＢシステムの活性化形態 [Brand K ら; J Clin Invest. 1996;97(7):1715-22] を基本的なＮＦ−κＢ活性を害することなく特異的に阻害する。この新規な原理は、ＮＦ−κＢ調節キナーゼの活性ドメインを標的にせずに、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βとＮＥＭＯとのシグナルソームコンプレックスの安定性を標的にする。このコンプレックスの一体性は、十分なＩｋＢリン酸化とそれに引き続いて起こるＮＦ−κＢの活性化に必須である [May M. et al.; Science 289: 1550-1553; 2000]。更には、本化合物は、シグナルソームコンプレックスについて特異的なタンパク質分解活性を、ＮＥＭＯについては最高でありＩＫＫ−αとＩＫＫ−βについてはより弱いタンパク質分解活性と併せて有している。ＮＦ−κＢシグナルソームコンプレックスから独立の他のタンパク質がこのタンパク質分解活性によって害されることはない。キナーゼＩＫＫ−β又はＩＫＫ−αの直接阻害は、重篤な肝臓不全を伴う細胞自滅（Li ら; Science 284: 321-325; 1999）又は免疫抑制的副作用 [Lavon I ら; Nature Medicine 6 (5); 573-577; 2000] の誘発などの重篤な有害作用を有している。従って、ＮＦ−κＢ関連キナーゼの触媒ドメインの阻害により粥状動脈硬化症の炎症プロセスを治療するという考え方は、有害な副作用により欠陥があり、患者における全身適用を可能にしない。
【００１４】
本発明の第１の一般的側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ａ）：
【００１５】
【化１】
【００１６】
により表され、
式中、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００１７】
本発明の第２の一般的側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ｂ）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
により表され、
式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、又はＮＨを表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００２０】
第１の好ましい態様においては、式（Ｂ）の点線は両方とも二重結合である。
第２の好ましい態様においては、特に第１の好ましい態様に従い、Ｒが置換フェニル基を表す。
【００２１】
第３の好ましい態様においては、特に第１又は第２の好ましい態様に従い、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す。
第４の好ましい態様においては、特に第１〜３のいずれか１の好ましい態様に従い、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す。
【００２２】
第５の好ましい態様においては、特に第１〜４のいずれか１の好ましい態様に従い、Ｘ1はＯを表す。
第６の好ましい態様においては、特に第１〜４のいずれか１の好ましい態様に従い、Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、水素原子又はカルボニル基又はその塩を表す。
【００２３】
最も好ましい態様においては、式（Ｂ）の化合物は、環外二重結合に関してのあらゆる幾何異性体と該ピリミジン環のキラル中心に関してのエナンチオマーを包含する図７のＣＯＭ５６である。
【００２４】
式（Ａ）及び（Ｂ）（好ましい態様を含む）において、Ｒにより表されるフェニル又はピリジル基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されていてもよい。そのフェニル又はピリジル基は、ジオキシメチレン、ジオキシエチレン、又はジオキシプロピレン基などのアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい。式（Ａ）及び（Ｂ）において、環外二重結合は、ＥでもＺ配置でもよい。本発明は、両方の異性体形態並びにそれらの混合物に関する。式（Ａ）及び（Ｂ）において、ピリミジン環は、キラル中心を含有することができる。本発明は、あらゆるエナンチオマー形態並びにそれらの混合物に関する。
【００２５】
式（Ｂ）において、点線は好ましくは両方とも二重結合である。
本発明の第３の一般的側面は、医薬として使用するための次式（Ｃ）：
【００２６】
【化３】
【００２７】
により表される化合物であって、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、又は直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基であるか、又は、次式（１−１）
【００２８】
【化４】
【００２９】
［式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'及びＸ"は、独立に、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ヒドロキシ基、
アルキル基、
アルコキシ基、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
アルキルカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、
アミノ基、
アルキルアミノ基、又は
ジアルキルアミノ基
を表し、但し、Ａ及びＢの少なくとも１が式（１−１）により表される、化合物に関する。
【００３０】
式（Ｃ）の化合物の更なる態様においては、Ａ又はＢは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素から選択されるハロゲン原子であることもできる。
式（Ｃ）の化合物の更なる態様においては、Ａ又はＢは、水素原子であることもできる。
【００３１】
好ましいクラスの化合物では、Ａは水素又はヒドロキシル基である。好ましいクラスでは、Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表す。更に好ましいクラスの化合物では、Ａは水素であり、Ｌ、Ｌ'及びＬ"の少なくとも１がヒドロキシル基である。Ｘ'及びＸ"は、好ましくは酸素原子である。更には、Ｗは、好ましくはニトロ基又は水素原子である。好ましいクラスの化合物では、点線は、両方とも二重結合を表す。
【００３２】
本発明の第１の側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ｉ）：
【００３３】
【化５】
【００３４】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
アルキル基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００３５】
本発明の第２の側面は、医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（II）：
【００３６】
【化６】
【００３７】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
カルボキシル基、
ハロゲン原子、
ニトロ基、
シアノ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステルに関する。
【００３８】
本発明の第３の側面は、医薬として使用するための化合物又はその塩又はそのエステルであって、該化合物が、次式（III）：
【００３９】
【化７】
【００４０】
により表され、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、次式
【００４１】
【化８】
【００４２】
［式中、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'は、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌは、
水素原子、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
ハロゲン原子
を表す、化合物又はその塩又はそのエステルに関する。
【００４３】
本発明の更なる側面に従う化合物は、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための無細胞スクリーニング方法における阻害剤として正の結果を与えるものであり、該方法が、次の段階：
（ａ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを含有する組成物を提供する段階；
（ｂ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、該化合物の存在下、予め決められた条件下で、段階（ａ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の該リン酸化された基質ペプチドを、予め決められた条件下で、該基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｄ）特異的に結合した抗体の量が、該化合物の存在に起因して、該化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなる。
【００４４】
好ましい態様においては、この無細胞スクリーニング方法において阻害剤として正の結果を与える化合物は、特異的に結合した抗体の量を該化合物が存在しない場合に比較して低下させることに、少なくとも同じ濃度かつ同じ条件下で測定されたとき、少なくともＣＯＭ５６又はＣＯＭ６８と同じほど活性である。
【００４５】
本発明の更なる側面に従う化合物は、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための細胞アッセイにおける阻害剤として正の結果を与えるものであり、該アッセイが、次の段階：
（ａ）細胞培養物を提供する段階；
（ｂ）該細胞培養物中の細胞を、試験化合物の存在下、ＴＮＦαに曝す段階；
（ｃ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを、抗ＩＫＫ−ＮＥＭＯ抗体を使用する免疫沈降により単離する段階；
（ｄ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、予め決められた条件下で、段階（ｃ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｅ）段階（ｄ）の該リン酸化された基質ペプチドを、該基質ペプチドのリン酸化されたドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｆ）特異的に結合した抗体の量が、該試験化合物の存在に起因して、該試験化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該試験化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなる。
【００４６】
好ましい態様においては、この細胞アッセイにおいて阻害剤として正の結果を与える化合物は、特異的に結合した抗体の量を該化合物が存在しない場合に比較して低下させることに、少なくとも同じ濃度かつ同じ条件下で測定されたとき、少なくともＣＯＭ５６又はＣＯＭ６８と同じほど活性である。
【００４７】
本発明は、活性成分として、ＮＦ−κＢの活性を低下させるための活性成分としての化合物を含んでなる医薬組成物も提供する。
【好ましい態様の説明】
【００４８】
番号を伴ったＣＯＭ及びｃｏｍは、この明細書においてその化学構造で示された化合物を指す。
本発明の化合物は、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）、及び（III）により表される。これら式において、アルキル基は、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｎ−ヘキシルを含むことができる。アルケニル基の例には、２〜６の炭素原子、好ましくは２〜４の炭素原子と、１〜２の二重結合とを有する直鎖状又は分枝状アルケニル基、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、イソブテニル及びブタジエニルが含まれることができる。シクロアルキル基の例には、３〜６の炭素原子を有するもの、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが含まれることができる。アルコキシ基の例には、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、tert−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ及びｎ−ヘキソキシが含まれることができる。シクロアルキルオキシ基の例には、３〜６の炭素原子を有するもの、例えば、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ及びシクロヘキシルオキシが含まれることができる。ハロゲン原子の例には、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が含まれる。上記式において、アリール基の例は、フェニル、ナフチル及びピリジルであることができ、フェニル及びピリジルが特に好ましい。アルキレン基の例は、１〜６の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状のものであることができ、１〜４の炭素原子を有するものが好ましい。例は、メチレン、エチレン及びトリメチレンである。アルキルアミノ基についての例には、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｎ−ヘキシルから選択される１又は２の置換基を有するアミノ基が含まれることができる。ジアルキルアミノ基についての例には、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｎ−ヘキシルから選択される２の置換基を有するアミノ基が含まれることができる。シクロアルキルアミノ基の例には、３〜６の炭素原子を有するもの、例えば、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ及びシクロヘキシルアミノが含まれることができる。アシル基の例には、２〜７の炭素原子、好ましくは２〜５の炭素原子を有するアシル基が含まれることができる。カルボキシル基は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩などの薬学的に許容できる金属塩の形態であることができる。
【００４９】
上記の基、特にアリール基は１〜３の置換基を含有することができる。そのような置換基の例には、ハロゲン原子、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4アルコキシ基、Ｃ1-4アルキルチオ基、Ｃ1-4アルキルスルフィニル基、Ｃ1-4アルキルスルホニル基、カルボキシル基、Ｃ2-5アルコキシカルボニル基、ニトロ基、アミノ基、及びＣ1-4アルキルアミノ基が含まれる。ここで、ハロゲン原子の例は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素であることができる。Ｃ1-4アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、及びｎ−ブチルである。Ｃ1-4アルコキシ基の例は、例えば、メトキシ、エトキシ及びプロポキシである。Ｃ1-4Ｃアルキルチオ基の例は、例えば、メチルチオ、エチルチオ及びプロピルチオである。Ｃ1-4アルキルスルフィニル基の例は、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル及びプロピルスルフィニルである。Ｃ1-4アルキルスルホニル基の例は、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル及びプロピルスルホニルである。Ｃ2-5アルコキシカルボニル基の例は、各々が１〜４の炭素原子を含有するアルコキシ基を有するもの、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニルであることができる。Ｃ1-8アルキルアミノ基の例は、各々が１〜４の炭素原子を含有する１又は２のアルキル基を有するもの、例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ及びプロピルアミノであることができる。これら置換基におけるアルキル部分は、直鎖状であも分枝状でも環状でもよい。
【００５０】
本発明の化合物は、カルボキシル基などの官能基のための通常の保護基を含有することもできる。更には、本発明の化合物は、生理学的条件下で活性物質に転化されることができるプロドラッグの形態であることもできる。
【００５１】
好ましいＲ1及びＲ2は、アルキル基、特にメチル若しくはエチル基、又はアルキレン基、好ましくはメチレン若しくはエチレン基である。Ｒ3として好ましいのは、水素原子又はハロゲン原子、特に、芳香環の２位におけるものである。Ｒ4として好ましいのは、アルコキシ基、特に、メトキシ、エトキシ又はプロポキシである。Ｒ5として好ましいのは、アルキル基、特に、メチル、エチル又はプロピル基である。Ｒ6及びＲ7として好ましいのは、アルキル基、特に、メトキシ若しくはエトキシ、又はハロゲン原子、特にヨウ素である。Ｘ、Ｙ、又はＺとして好ましいのは、水素原子又はハロゲン原子である。
【００５２】
一般式（Ｉ）の好ましいクラスの化合物は、Ｒ1及びＲ2が一緒になってアルキレン基、特に、メチレン又はエチレン基を形成し；Ｒ3が水素原子であり；Ｒ4がアルコキシ基、特に、メトキシ、エトキシ又はプロポキシ基であり、Ｒ5がアルキル基、特に、メチル、エチル又はプロピル基であり、Ｒ6及びＲ7がアルキル基、特に、メトキシ若しくはエトキシ、又はハロゲン原子、特にヨウ素であり、Ｘ及びＹが水素原子であり、そして、Ｚがハロゲン原子である化合物である。
【００５３】
一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物は、次式：
【００５４】
【化９】
【００５５】
により表されることができる。
一般式（Ｂ）の好ましいクラスの化合物は、Ｒが置換フェニル基である化合物である。その置換基は、好ましくはハロゲン原子、特に塩素原子である。更に好ましいクラスの式（Ｂ）又は（II）の化合物は、Ｘがメタ位にある置換基であり、好ましくはカルボキシル基である化合物からなる。
【００５６】
一般式（II）の好ましいクラスの化合物は、Ｒ1及びＲ2がアルキル基、特にメチル又はエチルであり；Ｒ3が水素原子、特に、芳香環の２位におけるものであり；Ｒ4がアルコキシ基、特に、メトキシ、エトキシ又はプロポキシ基であり、Ｒ5がアルキル基、特に、メチル、エチル又はプロピル基であり、Ｘ及びＹが水素原子であり、そして、Ｚがカルボキシル基、特に、芳香環の３又は４位におけるものである。
【００５７】
一般式（Ｂ）及び（II）の最も好ましい化合物は、次式：
【００５８】
【化１０】
【００５９】
により表されることができる。
一般式（Ｂ）の化合物の更に好ましい態様が図７に示される。
一般式（Ｃ）の好ましいクラスの化合物は、Ａが水素である化合物である。このグループでは、Ｘ'及びＸ"が好ましくは酸素原子であり、Ｌがヒドロキシル基であり、そして、Ｗがニトロ基である。更なるグループの化合物では、Ｂがアルキル又はアルコキシ基、好ましくはアルコキシ基であり、そしてＬ及びＷが水素である。
【００６０】
一般式（III）の好ましいクラスの化合物は、Ａ及びＢが同じ基であり、Ｒ8及びＲ9が同じか異なっていてアルキル基、特に、メチル若しくはエチル、又は水素原子を表し、Ｘ'が酸素原子であり、Ｌが水素原子であり、そして、Ｗがニトロ基である。
【００６１】
式（Ｃ）及び式（III）の最も好ましい化合物は、次式：
【００６２】
【化１１】
【００６３】
により表されることができる。
式（Ｃ）の更に好ましい化合物は、図１４に示されており、ＣＯＭ６８が特に好ましい。
【００６４】
好ましくない態様では、化合物のクラスから、Beilstein 登録番号１３２８１−５６−６、１２５２７４−０１−３、７６４００４６、６８０５５１５、２１１９４２、１９１４３５、及び５８７２８６６が除かれるが、粥状動脈硬化症の治療又は予防用の医薬品の製造のためのそれらの使用に関する先入観がある訳ではない。
【００６５】
本発明の化合物の塩に特別な制限が課されることはないので、前記塩も、それが薬学的に許容できる塩である限り本発明に含まれる。例は、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、硫酸塩、硝酸塩及びリン酸塩などの無機酸の酸付加塩；及び、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩及びクエン酸塩などの有機酸の酸付加塩であることができる。
【００６６】
更に、本発明の化合物は、水和物により代表される溶媒和物の形態で存在することができる。更に、本発明の化合物は、幾何異性体として存在することができる。そのような幾何異性体も本発明に包含されることができる。更に、式（Ｉ）及び（II）の化合物は光学活性であるので、エナンチオマーの形態で存在することができる。そのようなエナンチオマーは、慣用的な分割方法に従って純粋な形態で得られ、やはり本発明により包含される。
【００６７】
本発明によりカバーされる幾つかの化合物は、異なる供給業者から商業的に入手可能であり、［３０５８７０−４８−８］などの登録番号を有する。
本発明の化合物は、例えば、次の方法により調製されることができる。
【００６８】
一般式（Ａ）の化合物は、次のスキーム（Ａ）：
【００６９】
【化１２】
【００７０】
（式中、Ｒ、Ｒ4〜Ｒ7、Ｘ、Ｙ、及びＺは、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ｂ）の化合物は、次のスキーム（Ｂ）：
【００７１】
【化１３】
【００７２】
（式中、Ｒ、Ｒ4、Ｒ5、Ｘ1、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及び点線は、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ａ）及び（Ｉ）の化合物は、次のスキーム１：
【００７３】
【化１４】
【００７４】
（式中、Ｒ1〜Ｒ7、Ｘ、Ｙ、及びＺは、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ｂ）及び（II）の化合物は、次のスキーム２：
【００７５】
【化１５】
【００７６】
に従って調製されることができる。
出発化合物（IV）の、スキーム（Ａ）、（Ｂ）、１及び２に示された式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｉ）及び（II）の本発明の化合物への転化は、Ultra Scientist of Physical Sciences, 12(3), 277-280 (2000)；Oriental Journal of Chemistry, 16(3), 427-430, (2000) に開示された操作に従って行われることができる。従って、化合物（IV）が、塩化クロロアセチルと適当に置換されたアルデヒド（Ｖ）又は（VI）とで、無水酢酸中、酢酸ナトリウムなどの塩基の存在下で−３０℃からその混合液の沸点までの温度で処理される。一般的な調製方法は、Birsen Tozkoparan ら, Arch Pharm. Pharm. Med. Chem. 331, 201-206 (1998) から分かる。
【００７７】
出発化合物（IV-1）は、次の反応スキーム：
【００７８】
【化１６】
【００７９】
に従う Biginelli 型反応により調製されることができる。
出発化合物（IV）は、次の反応スキーム３：
【００８０】
【化１７】
【００８１】
（式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｘ、Ｙ、及びＺは、上で定義した通りである。)
に従う Biginelli 型反応により調製されることができる。
出発化合物（IV-1）又は（IV）の調製において、適当に置換されたアルデヒド化合物（VII-1）又は（VII）が、適当に置換された等モル量のβ−ケトエステル（VIIIａ）又は１,３−ジケトン（VIIIｂ）及び僅かに過剰のチオ尿素と、アルコールなどの適する溶媒中で０℃から反応混合液の沸点までの温度で反応させられる。P. Biginelli, Ber. 24, 1317, 2962 (1896); 26 447 (1893)；Martin Zaug, Organic Reactions, 14, 88, (1965)；D.J. Brown, The Pyrimidines, (Wiley, New York, 1962), p. 440；前掲., Supplement 1, 1970, p. 326；F. Sweet, Y. Fissekis, J. Am. Chem Soc., 95, 8741 (1973), Tetrahedron, 58, 4801-4807 (2002), J. Chem. Soc. Perkin Transactions, 1, 1845-1846, (2002), 及び US-A 5,958,931 を参照のこと。一般的な調製方法は、Mevlut Ertan ら, Arch Pharm. (Weinhelm) 324,135-139 (1991) から分かる。
【００８２】
一般式（Ｃ）の化合物は、次の反応スキーム：
【００８３】
【化１８】
【００８４】
（式中、Ｌ、Ｌ’、Ｌ”、Ｘ’、Ｘ”、Ｒ9、Ｗ及び点線は、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
一般式（Ｃ）及び（III）の化合物は、次の反応スキーム４：
【００８５】
【化１９】
【００８６】
（式中、Ｌ、Ｘ’、Ｒ9及びＷは、上で定義した通りである。)
に従って調製されることができる。
従って、式（IX）又は（IX-1）が、例えば、Synthesis, 5, 411-413, (1986) に開示された通りの操作に従って、それぞれ、出発原料（Ｘ）又は（X-1）と縮合される。出発原料（Ｘ）は、Paulsen, Stoy, The Chemistry of Amides, Wiley, New York, 1970, pp. 515-600 により記載された通りに、５−ニトロフラン−２−カルボン酸［６４５−１２−５］を対応する酸塩化物に転化してその酸塩化物をヒドラジンと反応させることにより、調製されることができる。
【００８７】
一般式（Ｃ）の化合物も、次の反応スキーム：
【００８８】
【化２０】
【００８９】
に従って調製されることができる。
従って、式（XI）の化合物が対応する対称無水物（XII）に転化され、次いで、式（XIII）の化合物と反応させられて、式（Ｃ）の化合物を与える（Wang, J.-X. (Wang, C.-H.)；Hu, Y.-L.; Cui, W.-F. (1990) Synthesis of Anhydrides from Acyl Chlorides under Solid-Liquid Phase-transfer Catalysis. J. Chem. Research (S), 84-85）。
【００９０】
式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）及び（III）の化合物及び薬学的に許容できるそれらの塩又はエステルは、例えば、医薬製剤の形態で、医薬品として使用されることができる。医薬製剤は、好ましくは、経口で、例えば、錠剤、コーテッド錠剤、糖衣錠、ハード及びソフトゼラチンカプセル剤、溶液剤、乳濁液剤又は懸濁液剤の形態で投与されることができる。しかしながら、投与は、経直腸で、例えば、坐剤の形態で行われても、非経口で、例えば、注射溶液剤の形態で行われてもよい。
【００９１】
本発明は、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物、特に上記の好ましい化合物と薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物及び薬学的に許容できるそれらの塩又はエステルが、薬学的に許容できる担体、例えば、医薬製剤を製造するための不活性な無機又は有機の担体と一緒に加工される。ラクトース、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩等が、例えば、錠剤、コーテッド錠剤、糖衣錠及びハードゼラチンカプセル剤用のそのような担体として使用されることができる。ソフトゼラチンカプセル剤用に適する担体は、例えば、活性物質の性質に依存して、植物油、ワックス、脂肪、半固体及び液体ポリオール等であるが、ソフトゼラチンカプセル剤の場合には、通常、担体は必要とされない。溶液剤及びシロップ剤の製造に適する担体は、例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース等である。アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等のアジュバントが、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物の水溶性塩の注射水溶液剤に使用されることができるが一般に必要ではない。坐剤用の適する担体は、例えば、天然油若しくは硬化油、ワックス、脂肪、半液体若しくは液体のポリオール等である。
【００９２】
加えて、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物又は薬学的に許容できるその塩又はエステルと治療的に不活性な賦形剤とを含有する医薬品も、１又はそれを越える式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｉ）、（II）又は（III）の化合物又は薬学的に許容できるその塩又はエステルと、望まれるなら１又はそれを越える他の治療的に価値のある物質とを、１又はそれを越える治療的に不活性な担体と一緒に、ガレン剤形にすることを含んでなるそのような医薬品の製造方法と同じく、本発明の目的である。
【００９３】
従って、粥状動脈硬化症などの心臓血管疾患を治療する方法もこの発明の一部であり、それによって、その方法は、上記状態のいずれかを有する患者に前記状態を治療するのに有効である量のこの発明の医薬組成物を投与することを含んでなる。
【００９４】
もちろん、用量は広い範囲で変動してもよく、各々の特定の場合に個々の必要性に合わされることができる。一般に、経口又は非経口投与のための有効量は、０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であり、全てについて０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。従って、体重が７０ｋｇである成人についての日量は、０.７〜１４００ｍｇ／日、好ましくは７〜７００ｍｇ／日である。
【００９５】
本発明に従う化合物は、抗−ＩＫＫ−ＮＥＭＯ抗体を含む免疫沈降されたＩＫＫ−コンプレックスであるＩＫＫ−コンプレックスが使用される細胞アッセイ及び無細胞アッセイにおいて、阻害剤としての正の結果を与える。無細胞アッセイでは、段階（ａ）は、好ましくは、細胞をＴＮＦαに接触させた後、プロテインＡ及び抗−ＩＫＫ−ＮＥＭＯ抗体を使用する免疫沈降によりＩＫＫ−コンプレックスを単離することを含んでなる。無細胞方法では、試験化合物は、好ましくは、段階（ａ）の後に加えられる。細胞アッセイでは、諸化合物は、段階（ａ）の前に加えられる。このアッセイでは、同定は、好ましくは、増幅された発光近接均一アッセイ（amplified luminescent proximity homogeneous assay）に基づいており、そこでは、好ましくは、基質ペプチドがビオチンニル化されてストレプトアビジンドナービーズ上に固定される。抗体は、好ましくは、プロテインＡ−アクセプタービーズ上に不動化される。アッセイの基質ペプチドは、好ましくは、ＩｋＢα又はＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥである。好ましくは、基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体は、抗−ホスホ−ＩκＢα−抗体である。本発明による化合物は、好ましくは１５００ダルトン未満、より好ましくは１０００ダルトン未満の分子量を有する非ペプチド分子から選択される。本化合物は、好ましくは、置換されていてもよい少なくとも３又は４の炭素環又はヘテロ環の非分岐鎖を含有する化合物であって、置換されていてもよい４以下の炭素又は窒素原子の長さを有するスペーサーにより隔てられていてもよい化合物である。
【００９６】
以下の実施例は、例示のために提供されるもので、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９７】
調製例Ｉ
２−［５−（３−カルボキシフェニル）−フラン−２−イルメチレン］−５−（４−クロロフェニル）−７−メチル−３−オキソ−２,３−ジヒドロ−５Ｈ−チアゾロ［３,２−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸エチルエステル（ＣＯＭ５６）
【００９８】
【化２１】
【００９９】
（１）： ３.４２６ｇ（４５ｍｍｏｌ）
（２）： ３,８２ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）
（３）： ４,２１７ｇ（３０ｍｍｏｌ）
ＰＰＥa： ４.５ｇ
ＴＨＦ： ４５ｍｌ
（aＰＰＥ＝ポリリン酸エチルエステル，Synlett 1988, 718-720 に従って調製された）
１００ｍｌのＲＢフラスコで、上記試薬をＴＨＦ中に溶解させ、そして窒素気流下で８時間還流した。進行は、ＴＬＣ（プレート：Ｍｅｒｃｋ５５５４，溶離液：クロロホルム−メタノール１０：１，生成物Ｒｆ＝０.７）により追跡された。半分の溶媒がロータリーエバポレーターで留去され、そして残渣が水に注がれて生成物が白色結晶として析出した。それは濾取され、そして蒸留水とジエチルエーテルで逐次的に洗浄された。
収率：６.３ｇ（６７.５％）。ＮＭＲ：構造
【０１００】
【化２２】
【０１０１】
に一致する。
量：
（４）： １.２７４ｇ（４,１ｍｍｏｌ）
（５）： ０.３９７ｇ（４.２ｍｍｏｌ）
（６）： ０.８８４ｇ（４,１ｍｍｏｌ）
無水酢酸ナトリウム：０.３３６ｇ（４,１ｍｍｏｌ）
無水酢酸： ６ｍｌ
酢酸： ８ｍｌ
上記の物質の混合物が混合されて５時間還流される。反応の進行がＴＬＣ（プレート：Ｍｅｒｃｋ５５５４，溶離液：クロロホルム−メタノール１０：１，生成物Ｒｆ＝０.４）により追跡された。冷却後、その混合液は水に注がれ、析出した生成物がジクロロメタンで抽出される。有機相が１０％Ｎａ2ＣＯ3溶液で２回洗浄され、無水ＭｇＳＯ4で乾燥され、そしてロータリーエバポレーターで濃縮される。得られた残渣は、ジエチルエーテル−ｎ−ヘキサン混合液で結晶化される。
収率：２.０ｇ（８８％）
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）：8.37 bs, 1H; 8.06 d, 1H; 7.96 d, 1H 及び 7.66 t, 1H (Ph /COOH/); 7.64 s, 1H (Ph-CH=フラン); 7.41 d, 2H 及び 7.33 d, 2H (Ph/Cl/); 7.40 d, 1H 及び 7.26 d, 1H (フラン); 6.01 s, 1H (ピリミジン-4); 4.1 q, 2H 及び 1.14 t, 3H (OCH2CH3); 2.49 s, 3H (CH3)。
【０１０２】
調製例２：
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（ＣＯＭ６８）
【０１０３】
【化２３】
【０１０４】
反応条件：ａ）ＫＨＣＯ3，ｎ−Ｂｕ4ＮＩ触媒，トルエン，０℃→室温，２時間；ｂ）ＣＨ2Ｃｌ2，０℃→室温，２.５時間。
一般
使用した全ての溶媒は、使用前に乾燥するか蒸留するかされた。塩化５−ニトロ−２−フロイル（１）は Lancaster から購入され、そしてサリチルアルデヒドヒドラゾン（３）は Sigma-Aldrich から購入された。
【０１０５】
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸無水物（２）
７５０ｍｇ（４.２７ｍｍｏｌ）の塩化５−ニトロ−２−フロイル（１）の１２０ｍｌのトルエン中の溶液に、４７１ｍｇ（４.７０ｍｍｏｌ）のＫＨＣＯ3及び１５８ｍｇ（０.４２７ｍｍｏｌ）のヨウ化テトラｎ−ブチルアンモニウムが０℃らで加えられる。この温度で５分後に、この混合液は、周囲温度で２時間激しく攪拌される。次いで、少量の析出物が濾去され、その混合液は１２０ｍｌの氷冷水中に注がれる。層分離後、水相が６０ｍｌのジクロロメタンで２回抽出される。合わされた有機相が硫酸ナトリウムで乾燥され、そして溶媒が減圧留去される。粗生成物がジクロロメタンから再結晶されて、１１７ｍｇ（０.３９５ｍｍｏｌ，１９％）の灰色粉末の５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸無水物（２）を生成する。
【０１０６】
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（４）
３５.０ｍｇ（０.１１８ｍｍｏｌ）の５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸無水物（２）が１０ｍｌのジクロロメタン中に殆ど溶解される。この混合液に１６.９ｍｇ（０.１２４ｍｍｏｌ）のサリチルアルデヒドヒドラゾン（３）の３.５ｍｌのジクロロメタン中の溶液が０℃で加えられる。その溶液はゆっくり明るい黄色に変色する。０℃で３０分経過した後、冷却を止めてその混合液が周囲温度で更に２時間攪拌される。次いで、その反応混合液は、１０ｍｌのＮａＨＣＯ3の飽和溶液で２回及び１０ｍｌのＮａＣｌの飽和溶液で２回抽出される。合わされた水相は、５ｍｌのジクロロメタンで２回抽出される。有機相が硫酸ナトリウムで乾燥され、そして溶媒が減圧留去される。粗生成物がジクロロメタンから再結晶されて、１２.０ｍｇ（０.０４３６ｍｍｏｌ，３７％）の明黄色粉末の５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（４）を生成する。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
５−ニトロ−フラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−ヒドラジド（４）の特性
溶解性
溶解性試験は、化合物４（１.２ｍｇ）及び５００μｌの各々の溶媒のアリコートで行われた。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
異性化
化合物４をＤＭＳＯ−ｄ6中に溶解させたときに、第２組のＮＭＲシグナルが数分内に室温で観察された。これらシグナルは、暫定的に化合物４のシス／トランス異性体に帰属された。この異性体のシグナル強度は、主生成物に起因するシグナルの約１０％に相当した。アセトン−ｄ6中では、この異性化は遅くて数日内に起こったに過ぎなかった。
【０１１２】
実施例１：ＮＦ−κＢ依存性ＩκＢペプチドリン酸化の阻害
（Ａ）方法：
キナーゼアッセイプロトコル：ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。異なる化合物での処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１００ｍｍ細胞培養皿中に５×１０6／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１１３】
細胞は、示された濃度の異なる化合物と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である上澄み液が、２００μｌのＴＮＴ−緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えられた。３μｇの正常ウサギＩｇＧ（Sigma）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）との３０分間４℃でのインキュベーションにより非特異性結合が遮断されてから、２μｇの抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）で４℃で１.５時間免疫沈降された。ＴＮＴ緩衝液で３回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma））で３回洗浄した後、キナーゼ反応が、２５μｌのキナーゼ緩衝液中で、３０℃で６０分間、１ｍＭのＡＴＰ（Sigma）及び１μＭの基質ペプチドＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミド（Blosyntan）の存在下で行われた。１６０００ｇで１分間遠心分離した後、１０μｌの上澄み液が白色３８４ｐｒｏｘｉ−プレート（Packard）に加えられた。６.６μｌの検出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ，０.１ｍＭ ＢＳＡ，５０μｇ／ｍｌプロテインＡ−アクセプタービーズ，２５０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ドナービーズ（両方とも Perkin-Elmer），４ｎＭ抗−ホスホ−ＩＫＢ抗体（Santa Cruz Biotechnology)）が各々のウェルに分注された。１.５時間のインキュベーション後に、そのプレートはαスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により読み取られた。
【０１１４】
結果：
ＩκＢ−タンパク質は、サイトカイン誘発性リン酸化により、Ｓｅｒ−３２及びＳｅｒ−３６上で調節される。幾つかの化合物がＩｋＢタンパク質のＴＮＦα誘発性リン酸化を阻害したかどうかを確認するために、ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ細胞がこれら化合物で処理された。特異的ＩｋＢ−キナーゼ−コンプレックス（ＩＫＫ）が抗−ＮＥＭＯ−抗体で免疫沈降され、そしてＩＫＢの特異的リン酸化サイドに相当するペプチドと共にインキュベートされた。リン酸化ペプチドの収率がαスクリーン（Perkin Elmer）により分析された。３つの異なる化合物、即ち、４１、４８及び７３がＩＫＫ−活性への効果を有する。化合物７３がより詳細に試験された。化合物７３は、約８μＭのＩＣ50でＩＫＫ−活性を用量依存的に阻害し、（図１ａ）。化合物４１及び４８は、１０μＭ〜１００μＭの範囲のＩＣ50値でＩＫＫ−活性を用量依存的に阻害した（図１ｂ）。化合物４１は、ＰＢＳに部分的に溶解性であるに過ぎず、実際の処理濃度が不明である。
【０１１５】
化合物７３ファミリーの構造的類似体である化合物５６が、更に、ＨｅＬａ細胞での細胞アッセイで、ＩκＢリン酸化について、αスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により上記のように試験された。ＨｅＬａ細胞に加えられた漸増する濃度の化合物５６が、ＩκＢ Ｂｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミドについての基質ペプチドのリン酸化を用量依存的に阻害した。化合物５６のＩＫＫ活性を阻害する強さは、他の７３ファミリーメンバーより１０倍高く、〜８５０ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ50を有すると計算された（図８ａ）。
【０１１６】
（Ｂ）方法：
in vitro／無細胞アッセイプロトコル：ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。ＴＮＦαでの処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１７５−ｍｍ細胞培養皿中に１×１０7／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１１７】
細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で薬剤なしで刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、４００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である上澄み液が、４００μｌのＴＮＴ−緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えられた。３μｇの正常ウサギＩｇＧ（Sigma）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）との３０分間４℃でのインキュベーションにより非特異性結合が遮断されてから、４μｇの抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology）と１２ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）で４℃で１.５時間免疫沈降された。ＴＮＴ緩衝液で３回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma））で３回洗浄した後、そのプロテインＡセファロースペレットは、４つの同一アリコートに分けられた。上澄み液が除去されて、キナーゼ反応が、２５μｌのキナーゼ緩衝液中で、３０℃で６０分間、１ｍＭのＡＴＰ（Sigma）、１μＭの基質ペプチドＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミド（Blosyntan）の存在下で行われた。次いで、異なる濃度の薬剤が、ＩκＢリン酸化に必要な単離された成分の無細胞成分に加えられた。１６０００ｇで１分間遠心分離した後、１０μｌの上澄み液が白色３８４ｐｒｏｘｉ−プレート（Packard）に加えられた。６.６μｌの検出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ，０.１ｍＭ ＢＳＡ，５０μｇ／ｍｌプロテインＡ−アクセプタービーズ，２５０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ドナービーズ（両方とも Perkin-Elmer），４ｎＭ抗−ホスホ−ＩＫＢα−抗体（Santa Cruz Biotechnology)）が各々のウェルに分注された。１.５時間のインキュベーション後に、そのプレートはαスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により読み取られた。
【０１１８】
結果：
ＣＯＭ７３及びＣＯＭ５６のＩＫＫ活性への阻害効果が、無細胞アッセイで比較された。ＨｅＬａ細胞のＴＮＦα刺激及びＩＫＫコンプレックスの免疫沈降後に、漸増する濃度の薬剤がその単離されたＩＫＫコンプレックスと共にインキュベートされた。ＣＯＭ７３及び５６は、この無細胞アッセイにおいてＩＫＫ活性を用量依存的に阻害した。ＣＯＭ５６の強さは、ＩＫＫ活性の阻害において、ＣＯＭ７３に比較して有意により高かった。これら結果は、ＩＫＫコンプレックスの形成がＴＮＦα刺激に起因して完結した後にそのキナーゼコンプレックスを崩壊させる、それらＩＫＫ阻害性薬剤の能力を確認するものである。かくして、ＣＯＭ７３及び５６は、粥状動脈硬化症などの炎症性疾患の治療に適する治療剤であるばかりか、ＩＫＫコンプレックス形成を阻止する予防剤でもある（図８ｂ）。
【０１１９】
（Ｃ）方法：
ウェスタンブロットプロトコルでのＰ−ＩｋＢα検出：ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。異なる化合物での処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１００ｍｍ細胞培養皿中に５×１０6／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１２０】
細胞は、示された濃度の異なる薬剤と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である３０μｌの上澄み液が、Laemmli−緩衝液（２％ＳＤＳ，２％２−メルカプトエタノール，０.０１％ブロモフェノールブルー，８％グリセリン）で稀釈され、６０℃で１０分間加熱され、そして４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad）にかけられた。電気泳動後、ウェットブロッティング法を用いて、諸タンパク質がニトロセルロースメンブランに移された。まず、そのメンブランは、Roti-Block（Roth）でブロックされてから、Ｐ−ＩｋＢαに対するモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology，１：２００希釈率で使用された）と共にインキュベートされた。このインキュベーションに続いて、１：１００００稀釈率の適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化第２抗体（Dianova）と共にインキュベートされた。抗体結合は、ウェスタンブロット化学発光試薬検出キット（Santa Cruz）を使用して、Ｘ線フィルム上に可視化された。
【０１２１】
結果：
化合物７３の、ＩκＢリン酸化を阻害する能力が、Ｐ−ＩκＢαに特異的な抗リン酸化抗体及びウェスタンブロットにより直接に測定された。漸増する濃度のＣＯＭ７３が、ＩκＢのリン酸化を用量依存的に阻害した（図９）。
【０１２２】
結果：
ＣＯＭ７３及びＣＯＭ５４ファミリーの異なる化合物の、ＩκＢリン酸化を阻害する能力が比較された。ＩκＢリン酸化が、抗リン酸化抗体及びウェスタンブロットにより直接に測定された。ＣＯＭ７３及びＣＯＭ５６は用量依存的にＩκＢのリン酸化を阻害したのに対し、ＣＯＭ５４、ＣＯＭ６８及び６９はＩκＢリン酸化に何の効果もなかった。かくして、このクラスのＮＦ−κＢ−阻害剤の阻害効果は、ＩκＢリン酸化とは独立している（図１５）。
【０１２３】
実施例２：ＮＦ−κＢヌクレオチド結合活性の阻害：
方法：
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：ＴＨＰ−１単球（DSM, Braunschweig, Germany）が、７％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Myoclone super plus，低エンドトキシン）、１００ユニット／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Life Technologies, Inc., Eggenstein, Germany)を含有するＲＰＭＩ １６４０（Glutamax-1，低エンドトキシン）中に懸濁して維持された。実験のために、それら細胞は６ウェル培養皿中に３×１０6／ウェルの密度でプレートされた。４℃で１２００ｒｐｍで７分間遠心分離することで細胞を採取することによって核抽出物が調製された。それら細胞は、１ｍｌの氷冷ＰＢＳを加えることにより再懸濁され、そして微小遠心分離管に移された。４℃で２０００ｇで２分間遠心分離した後、ペレットは、５０μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）中で細胞溶解された。氷上で５分間インキュベートして１６０００ｇで５秒間遠心分離した後、それら核ペレットは１００μｌの緩衝液Ａで洗浄された。それら核ペレットは、１００μｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，２０％グリセロール，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）で再懸濁されて、１０秒間超音波処理された。プローブが、１６０００ｇで５秒間パルス遠心分離された。この核抽出物は、アリコートに分けられて液体Ｎ2で瞬間冷凍された。核抽出物（５ｍｇのタンパク質）は、放射性標識されたＤＮＡプローブ（１０ｎｇ；１０5ｃｐｍ）と共に３０分間室温で、２０ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.９，５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０.５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，０.２％ Nonidet Ｐ−４０，５０ｎｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ）／ｍｌ）中でインキュベートされた。プロトタイプのイムノグロブリンｋ−鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして使用され、相補的プライマーのアニーリングにより標識されてから、［γ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（＞３,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products, Brussels, Belgium）及びデオキシヌクレオシド・トリホスフェート（Boehringer Mannheim）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩの Klenow フラグメント（Boehringer Mannheim）でのプライマー伸長が行われた。諸サンプルは、未変性４％ポリアクリルアミドゲル上、０.２５３ＴＢＥ緩衝液（１０×ＴＢＥは次の通り：８９０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８９０ｍＭ ホウ酸，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中で展開された。ＳＰ−１及びＡＰ−１の結合も、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（＞５,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim）で標識された特異的コンセンサスオリゴヌクレオチド（Promega, Heidelberg, Germany）を使用して、ＥＭＳＡにより分析された。ゲルは乾燥されてオートラジオグラフィーにより分析された。
【０１２４】
結果：
このＥＭＳＡ実験は、４０の数の化合物がＮＦ−κＢの活性化に影響するかどうかを検査するために行われた。ＴＨＰ−１単球が、異なる物質と共に予備インキュベートされてからＬＰＳで刺激された。ＮＦ−の活性化及び放出はＥＭＳＡにより確認された。同じ核抽出物で、別の転写アクチベーター因子であるＳＰ−１が、ＳＰ−１コンセンサス配列を含んでなるオリゴヌクレオチドに結合するタンパク質について検査された（負荷コントロール）。これら化合物の不存在下では、予想通りの劇的なＮＦ−κＢの活性化が観察されることができる。１００μＭのこれら化合物で処理することにより、２つの物質がＮＦ−κＢ−放出を有意に減少させた。詳細には、化合物５４については９５％までであり化合物７３については８０％までであった（図２ａ）。更に、本発明者らは、化合物５４を１２,５μＭ〜１００μＭの範囲の異なる濃度で試験した。そのＮＦ−κＢ活性化は、１２,５μＭ及び２５μＭの化合物５４での処理により有意に影響を受け、そして、５０μＭ及び１００μＭにより殆ど完全に無くなった（図２ｂを参照のこと）。コントロールとして役立つ別の転写アクチベーター因子であるＳＰ−１の、この特異的オリゴヌクレオチドへの結合は、同じ核抽出物中で変化しなかった。
【０１２５】
実施例３：ＩＫＫ−βへのＮＥＭＯ結合の阻害
（Ａ）方法：
３×１０6のＨｅＬａ細胞が漸増する濃度の異なる薬剤と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦα（Roche）で刺された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。（２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。）
細胞質ゾル抽出物が先に記載した通りに単離された。
【０１２６】
凡そ４×１０5の細胞からの抽出物である３０μｌの細胞質ゾル抽出物が４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad）にかけられた。電気泳動後、ウェットブロッティング法を用いて、諸タンパク質がニトロセルロースメンブランに移された。まず、そのメンブランは、Roti-Block（Roth）でブロックされてから、ＩＫＫα／β又はＮＥＭＯに対するモノクローナル抗体（両方とも、Santa Cruz Biotechnology，１：２００希釈率で使用された）と共にインキュベートされた。このインキュベーションに続いて、１：１００００稀釈率の適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化第２抗体（Dianova）と共にインキュベートされた。抗体結合は、ウェスタンブロット化学発光試薬検出キット（Santa Cruz）を使用して、Ｘ線フィルム上に可視化された。
【０１２７】
結果：
化合物７３がＮＥＭＯのＩＫＫα／βへの結合を選択的に阻害してコンプレックスの不安定性と劣化をもたらすかごうかを検査するために、ＨｅＬａ細胞が種々の濃度の化合物７３で処理されて、タンパク質安定性が測定された（図３ａを参照のこと）。その細胞質ゾル抽出物は、ウェスタンブロット分析により分析された。ＮＥＭＯ及びＩＫＫα／βのレベルは、これら実験条件下で用量依存的に減少した（図３ａ）。ＮＥＭＯタンパク質の場合には、化合物７３によりタンパク質劣化を高度に受け易いことが観察され得る。ＮＥＭＯタンパク質の量の減少が３.３μＭで観察されることができ、２０μＭにより有意な劣化があり、３３μＭ及び１００μＭにより殆ど完全に無くなった。対照的に、ＩＫＫα／β劣化は、高濃度の３３μＭと１００μＭの化合物７３でのみ明らかであった。使用された最高の濃度でも完全な分解は検出されなかった。ＴＮＦα刺激のコンプレックス組成又はコンプレックス劣化への効果は観察されなかった。
【０１２８】
ＩＫＫコンプレックスの崩壊を詳しく検査するために、本発明者らは、抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology)での免疫沈降後のＩＫＫ−α／βのタンパク質発現を分析した（図３ｂ）。免疫沈降前後にＩＫＫα／βの量の明らかな相関関係が見られた。ＮＥＭＯタンパク質の検出は不変でも、ＩＫＫα／βタンパク質のレベルは、化合物７３により用量依存的に減少した。化合物７３無しのコントロールと比較して、ＩＫＫ−α／ＩＫＫ−βは、ＮＥＭＯとの同時沈降コンプレックスにおいて、１０μＭで２７％に減少し、１００μＭで９１％に減少した。
【０１２９】
結果：
ＴＮＦα刺激後のＩＫＫコンプレックスの劣化が、ウェスタンブロット及びＩＫＫα／βとＮＥＭＯに対する特異的抗体で評価された。ＣＯＭ７３は、無傷細胞とのインキュベーション後に、用量依存的にＩＫＫα／βとＮＥＭＯを劣化させた。ＮＥＭＯは、ＣＯＭ７３によるタンパク質劣化に対して、ＩＫＫα／βコンプレックスに比較してより感受性であった（図１０）。
【０１３０】
（Ｂ）方法：
in vitro での薬剤処理後のＩＫＫ−コンプレックスの劣化：先に記載した通りの抗−ＮＥＭＯ抗体（Santa Cruz)での免疫沈降後に、免疫沈降し洗浄されたＩＫＫ−コンプレックスが、異なる濃度のＩＫＫ阻害剤と共に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma）中でインキュベートされた。１時間処理後、プローブが１６０００ｇで１分間遠心分離され、上澄み液が完全に除去され、プロテインＡペレットが、１×Laemmli−緩衝液（２％ＳＤＳ，２％２−メルカプトエタノール，０.０１％ブロモフェノールブルー，８％グリセリン）中に再懸濁され、６０℃で１０分間加熱され、そして４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad）にかけられた。電気泳動後、ウェットブロッティング法を用いて、諸タンパク質がニトロセルロースメンブランに移された。まず、そのメンブランは、Roti-Block（Roth）でブロックされてから、ＩＫＫαに対するモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology，１：２００希釈率で使用された）と共にインキュベートされた。このインキュベーションに続いて、１：１００００稀釈率の適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化第２抗体（Dianova）と共にインキュベートされた。抗体結合は、ウェスタンブロット化学発光試薬検出キット（Santa Cruz）を使用して、Ｘ線フィルム上に可視化された。そのＸ線フィルムは走査されて、その結果がソフトウェアＡＩＤＡにより濃度計により分析された。
【０１３１】
結果：
化合物５６によるＩＫＫ−α／βへのＮＥＭＯ結合の阻害が、ＩＫＫコンプレックスの免疫沈降後に評価された。ＣＯＭ５６は、この in vitro アッセイにおいてそのコンプレックスを用量依存的に崩壊させた（図１１）。
【０１３２】
実施例４：ＮＦ−κＢ阻害剤の細胞透過性
方法：
３×１０6ＨｅＬａ細胞が１００μＭの化合物７３と共に１時間インキュベートされた。ＰＢＳで３回洗浄した後、１２０μｌの低張性緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐｈ７.５）が細胞ペレットに加えられ、細胞溶解のために液体Ｎ2中で凍結された。１６０００ｇで５分間遠心分離した後、上澄み液がＥＬＩＳＡで４５０ｎｍにより測定され、化合物７３の量がこの物質の標準濃度と比較された。
【０１３３】
結果：
化合物７３の細胞透過性が、ＥＬＩＳＡリーダーでのその特性シグナルにより、細胞質ゾル中のその化合物濃度を測定することにより追跡された。１００μＭの化合物７３と共に１時間インキュベートした後、高レベルのその化合物が検出されることができた。１００ｍＭ化合物のシグナルと比較して、約９０μＭの濃度が細胞内部に見出された（図４）。この結果は、化合物７３の優れた細胞透過性を示すものである。
【０１３４】
実施例５：ＮＦ−κＢ阻害剤での処理後の細胞生存度
方法：
９６ウェル中の３×１０4ＨｅＬａ細胞が、１００μＭの化合物５４及び７３と共に３時間インキュベートされた。培地が変えられ、そして１０μｌのＷＳＴ−１試薬が各々のウェルに加えられた。２時間後、４５０ｎｍの吸収がＥｌｉｓａリーダーで測定された。
【０１３５】
結果：
化合物７３及び５４の潜在的毒性が、ＷＳＴ−１生存度試験アッセイ（Boehringer Mannheim)により追跡された。化合物５４及び７３は、記載されたアッセイで適用された濃度及び条件ではＨｅＬａ細胞に毒性であるとは認められなかった。３０μＭの各々の化合物で３時間インキュベートした後、未処理コントロールと比較して有意な代謝活性の減少が検出されることはなかった。
【０１３６】
結果：
ＣＯＭ５４ファミリーの化合物についての細胞生存度がＨｅＬａ細胞で試験された。ＨｅＬａ細胞を漸増する濃度のＣＯＭ５４及び６９（０.３〜１００μｍｏｌ／Ｌ）で１日インキュベートしても、細胞生存度への負の影響はなかった（ＷＳＴ染色により評価された）。３３及び１００μｍｏｌ／Ｌの濃度の化合物６８が、１日インキュベーション時間後に細胞生存度を低下させた（図１６）。
【０１３７】
実施例６：キナーゼアッセイプロトコル
ＨｅＬａ細胞が、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（invitrogen）中に維持された。異なる化合物での処理２４時間前に、ＨｅＬａ細胞が１００−ｍｍ細胞培養皿中に５×１０6／ウェルの密度でプレートされて９０％集密度までにされた。
【０１３８】
細胞は、示された濃度の異なる薬剤と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳで２回洗浄され、そして２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Roche）で刺激された。７分後、細胞は、氷冷ＰＢＳで２回洗浄されてから、かき集められて１.５ｍｌの微小遠心分離管に移された。２０００ｒｐｍで２分間４℃で遠心分離した後、ＰＢＳ上澄み液が除去されて、そのペレットに、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）が加えられた。再懸濁されたペレットは氷上で５分間インキュベートされて１３０００ｇで３０秒間遠心分離された。細胞質ゾル抽出物である上澄み液が、２００μｌのＴＮＴ−緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えられた。３μｇの正常ウサギＩｇＧ（Sigma）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）との３０分間４℃でのインキュベーションにより非特異性結合が遮断されてから、２μｇの抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz Biotechnology）と６ｍｇの再懸濁され予備洗浄されたプロテインＡセファロースＣｌ−４Ｂ（Pharmacia Biotech）で４℃で１.５時間免疫沈降された。ＴＮＴ緩衝液で３回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００μＭ Ｎａ3ＶＯ4，２０ｍＭ−グリセロホスフェート，５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０.５μＭ フッ化フェニルメチルスルホニル，アンチパイン，アプロチニン，ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma））で３回洗浄した後、キナーゼ反応が、２５μｌのキナーゼ緩衝液中で、３０℃で６０分間、１ｍＭのＡＴＰ（Sigma）及び１μＭの基質ペプチドＢｔｎ−Ａｈｘ−ＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ−アミド（Blosyntan）の存在下で行われた。１６０００ｇで１分間遠心分離した後、１０μｌの上澄み液が白色３８４ｐｒｏｘｉ−プレート（Packard）に加えられた。６.６μｌの検出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ，０.１ｍＭ ＢＳＡ，５０μｇ／ｍｌプロテインＡ−アクセプタービーズ，２５０μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ドナービーズ（両方とも Perkin-Elmer），４ｎＭ抗−ホスホ−ＩＫＢα−抗体（Santa Cruz Biotechnology)）が各々のウェルに分注された。１.５時間のインキュベーション後に、そのプレートはαスクリーンリーダー（Perkin Elmer）により読み取られた。
【０１３９】
実施例７：電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＴＨＰ−１単球（DSM, Braunschweig, Germany）が、記載された通りに（４１）、７％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Myoclone super plus，低エンドトキシン）、１００ユニット／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Life Technologies, Inc., Eggenstein, Germany)を含有するＲＰＭＩ １６４０（Glutamax-1，低エンドトキシン）中に懸濁して維持された。実験のために、それら細胞は６ウェル培養皿中に３×１０6／ウェルの密度でプレートされた。４℃で１２００ｒｐｍで７分間遠心分離することで細胞を採取することによって核抽出物が調製された。それら細胞は、１ｍｌの氷冷ＰＢＳを加えることにより再懸濁され、そして微小遠心分離管に移された。４℃で２０００ｇで２分間遠心分離した後、ペレットは、５０μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，０.１％ＮＰ４０，１０ｍＭ，３００ｍＭスクロース，１０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）中で細胞溶解された。氷上で５分間インキュベートして１６０００ｇで５秒間遠心分離した後、それら核ペレットは１００μｌの緩衝液Ａで洗浄された。それら核ペレットは、１００μｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７.９，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，２０％グリセロール，０.５ｍＭ ＰＭＳＦ及び、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン各々０.７５μｇ／ｍｌ（Sigma)）で再懸濁されて、１０秒間超音波処理された。プローブが、１６０００ｇで５秒間パルス遠心分離された。この核抽出物は、アリコートに分けられて液体Ｎ2で瞬間冷凍された。核抽出物（５ｍｇのタンパク質）は、放射性標識されたＤＮＡプローブ（１０ｎｇ；１０5ｃｐｍ）と共に３０分間室温で、２０ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.９，５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０.５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，０.２％ Nonidet Ｐ−４０，５０ｎｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ）／ｍｌ）中でインキュベートされた。プロトタイプのイムノグロブリンｋ−鎖オリゴヌクレオチドがプローブとして使用され、相補的プライマーのアニーリングにより標識されてから、［ａ−32Ｐ］ｄＣＴＰ（＞３,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products, Brussels, Belgium）及びデオキシヌクレオシド・トリホスフェート（Boehringer Mannheim）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩの Klenow フラグメント（Boehringer Mannheim）でのプライマー伸長が行われた。諸サンプルは、未変性４％ポリアクリルアミドゲル上、ＴＢＥ緩衝液（１０×ＴＢＥは次の通り：８９０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８９０ｍＭ ホウ酸，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）中で展開された。ＳＰ−１及びＡＰ−１の結合も、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（５,０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim）で標識された特異的コンセンサスオリゴヌクレオチド（Promega, Heidelberg, Germany）を使用して、ＥＭＳＡにより分析された。ゲルは乾燥されてオートラジオグラフィーにより分析された。
【０１４０】
実施例８：一回用量ＩＶ投与後のＩＫＫ阻害剤の薬物動態学
方法：
ラットにおける in vivo ＩＶ適用：
ＣＯＭ５６が、生理食塩水緩衝液で２００μＬの容量中１００μＭ及び２００μＭに稀釈された。このプローブがラットに静脈内投与された。２分後と２０分後に、血液プローブが右頸動脈から採取された。それら血液プローブは、２５００ｇで３分間遠心分離されて、血清成分である上澄み液が質量分析法により分析された。
【０１４１】
結果：
ラットにおける５５及び２７.５μｇ化合物５６の一回ＩＶ適用後、正の血清プローブが、投与２分後及び２０分後に測定された（図１２）。
【０１４２】
実施例９：全身炎症の阻害
方法：
ラットにおいて全身炎症応答が、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）ショック（ＬＰＳ０.３３μｇ／ｇのＩＶ投与）により誘発された。ラットへの化合物５６のＩＶ投与（１μｇ／ｇ）による炎症の阻害が、マウス血清中のＴＮＦα定量により測定された。ＴＮＦαは、ＥＬＩＳＡキット（Pierce）でその製造業者の指示書に従って検出された。
【０１４３】
結果：
ラットにおいてＬＰＳにより in vivo で誘発された全身炎症が化合物５６により阻害された。ラット血清におけるＴＮＦα濃度が、化合物５６予備処理後に有意に阻害された（図１３）。
【０１４４】
実施例１０：薬剤処理によるヒト内皮細胞中の粥状動脈硬化症の阻害
方法：
蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析によるＩＣＡＭ発現の測定：
ＨＵＶＥＣ細胞が６ウェルプレートに１×１０6細胞／ウェルで播かれた。２４時間後、細胞は異なる濃度の化合物６８で処理された。１時間後、培地が除去されて、それら細胞はＩＬ−１（１００ｐｇ／ｍｌ）又はＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）のいずれかと共に合計４時間インキュベートされた。その後、それら細胞は、トリプシンで採取され、ＰＢＳで洗浄され、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。ペレットが５０μｌのＰＢＳと５μｌのＣＤ５４−ＰＥ抗体（Beckman/Coulter/Immunotech からの抗−ＩＣＡＭ抗体）中に再懸濁された。ＰＢＳで二回洗浄した後、ＩＣＡＭ細胞表面発現がＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）により分析された。
【０１４５】
結果：
ＣＯＭ６８がヒト内皮細胞における粥状動脈硬化症マーカーを濃度依存的に阻害した。ＣＯＭ６８のＨＵＶＥＣ細胞とのインキュベーションで、ＩＣＡＭ発現が有意に阻害された。ＩＬ−１刺激後はＣＯＭ６８についてのＩＣ50は７.８μｍｏｌ／Ｌであり、ＴＮＦα刺激後はＩＣＡＭ発現の阻害について４.５μｍｏｌ／Ｌであった（図１７）。
【０１４６】
製剤例Ａ
次の組成の錠剤が慣用的なやり方で製造される：
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
製剤例Ｂ
次の組成の錠剤が慣用的なやり方で製造される：
【０１４９】
【表５】
【０１５０】
製剤例Ｃ
次の組成のカプセル剤が慣用的なやり方で製造される：
【０１５１】
【表６】
【０１５２】
適する粒子サイズを有する活性成分、結晶ラクトース及び微結晶性セルロースが相互に均一に混合され、篩分けされ、その後にタルクとステアリン酸マグネシウムが混和される。最終混合物が適するサイズのハードゼラチンカプセル内に充填される。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１ａ】化合物７３の、ＴＮＡα刺激後のＩＫＫ−コンプレックスの活性への効果。ＩκＢペプチドリン酸化の阻害についての化合物７３の用量−応答曲線が示される。ＨｅＬａ細胞がＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激され、免疫沈降されたＩＫＫ−コンプレックスの活性が、αスクリーンアッセイ（Perkin Elmer）で測定された。活性の相対的減少率が最大蛍光計数値の％で出される。ｎ＝３の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図１ｂ】化合物４１、４８及び７３のＩＫＫ−コンプレックスへの分化阻害。ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）刺激後のＨｅＬａ細胞を種々の濃度の阻害剤（＃４１；＃４８及び＃７３）で処理した後に二重ＩＫＫ−活性測定が行われた。ＩＫＫ−コンプレックスは、抗−ＮＥＭＯ−抗体で又は非特異的ＩｇＧでの制御下で免疫沈降された。ＩκＢペプチドリン酸化についてのキナーゼ活性の減少率が出され、蛍光計数値がαスクリーンシステム（Perkin Elmer）により測定された。
【図２ａ】異なる化合物の、ＮＦ−κＢ活性への効果。ＴＨＰ−１細胞が、１００μＭの異なる化合物で１時間処理されてから、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激された。ＮＦ−κＢについての電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）が行われた。核抽出物が、ＮＦ−κＢについて特異的な配列を有する放射性標識ＤＮＡプローブと共にインキュベートされた。Ｘ線フィルム曝露により検出された標識ＮＦ−κＢについてのシグナル強度が濃度計により分析された。１０試験化合物のＮＦ−κＢ活性への阻害効果が、ＬＩＰＳコントロールの１００％と比較したＳＰ−１結合へと標準化される。ＬＰＳ刺激なしの細胞は、有意なＮＦ−κＢ活性を示さなかった。
【図２ｂ】化合物５４での、ＮＦ−κＢ放出の用量依存的阻害。異なる濃度の化合物５４が、ＴＨＰ−１細胞に１時間加えられた。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）での１時間の刺激後、ＥＭＳＡアッセイでＮＦ−κＢ活性を分析するための核抽出物が調製された。最上段のフレームでは、ＥＭＳＡゲルへの曝露後の代表的Ｘ線フィルムが示される。ダイヤグラムは、ＬＩＰＳコントロールの１００％と比較してＳＰ−１結合へ標準化させたＮＦ−κＢ活性の用量依存的阻害を纏めたものである。最下段のフレームでは、ＳＰ１へのオリゴヌクレオチド結合がコントロールとして示される。
【図３ａ】ＩＫＫ−コンプレックスの劣化が化合物７３により起こる。ＨｅＬａ細胞が、種々の濃度の化合物７３と共にインキュベートされてから、ＴＮＦα刺激（２０ｎｇ／ｍｌ）された。ＴＮＦα刺激有り又は無しの追加の２つのコントロールが分析された。細胞溶解産物中のＮＥＭＯの量が、特異的抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）でのウェスタンブロット分析により測定された。Ｂ．同じ抽出物において、ＩＫＫα／βのレベルが、特異的抗−ＩＫＫα／β−抗体（Santa Cruz）で調べられた。代表的ウェスタンブロットは、ＮＥＭＯの用量依存的タンパク質分解と高い化合物７３濃度でのＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βのタンパク質分解を示す。
【図３ｂ】化合物７３によるＩＫＫα／βのＮＥＭＯ結合へのコンプレックスの崩壊。ＨｅＬａ細胞が１０μＭ及び１００μＭの化合物７３で処理されてから、ＴＮＦα刺激（２０ｎｇ／ｍｌ）された。ＩＫＫ−コンプレックスが、抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）とプロテインＡ−セファロースで、細胞質ゾル抽出物から同時沈降された。その沈降物は、特異的抗−ＩＫＫα／β−抗体で、ＩＫＫα／βタンパク質について、ウェスタンブロットで分析された。コントロールでは、免疫沈降用の非特異的ウサギ抗体で、ＩＫＫα／βとの同時沈降物は検出されなかった。化合物７３は、活性化されたＨｅＬａ細胞において、ＩＫＫα／βのＮＥＭＯへの結合を用量依存的に阻害した。
【図４】化合物７３の細胞透過性。細胞質ゾル抽出物が調製されて、Ｅｌｉｓａにより分析された。化合物７３は、ＥＬＩＳＡリーダーで、４５０ｎｍの波長で特性シグナルを与える。無傷ＨｅＬａ細胞が１００μＭの化合物７３で１時間処理された。ダイヤグラムは、化合物７３と共にインキュベートした後の細胞質ゾル抽出物からの特性シグナルを、緩衝液中の１００μＭサンプルと比較して示す。未処理細胞からの細胞質ゾル抽出物がコントロールに示される。
【図５】化合物７３及び５４の、細胞生存度への影響。ＨｅＬａ細胞が化合物７３（１００μＭ）又は化合物５４（１００μＭ）と共に３時間インキュベートされた。細胞の完全性と活性な代謝のために、ＷＳＴ−１試薬が加えられた。Ｅｌｉｓａリーダーでの特性波長で吸光度が測定された。
【図６】阻害剤としての正の結果により本発明の化合物を特性決定する細胞アッセイ及び無細胞アッセイの図式的表示。
【図７】一般式（Ｂ）のＩＫＫ−阻害剤（ＣＯＭ７３ファミリー）の化学構造。化合物ＣＯＭ７３への構造的類似性を有するＩＫＫ−阻害剤の化学構造が比較しながら示されている。これら８化合物についてのＩＫＫ−活性阻害の効力が、方法の項で説明した通りにＮＥＭＯ劣化により測定されたＩＫＫ活性の阻害率（％）で与えられている。
【図８ａ】ＣＯＭ５６の、細胞性ＩＫＫ−活性への阻害効果。細胞アッセイにおけるＩＫＫ活性の阻害についての化合物５６の用量−応答曲線が示される。漸増する濃度のＣＯＭ５６の存在下で、ＨｅＬａがＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。ＩＫＫ−コンプレックスが免疫沈降され、そして、ＩＫＫの活性が、方法の項に記載した通りに、αスクリーンアッセイ（Perkin Elmer）で測定された。その活性の相対的減少率は、最大蛍光計数値の％で出される。ｎ＝４の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図８ｂ】ＣＯＭ７３及び５６の、無細胞ＩＫＫ−活性への阻害効果。無細胞アッセイにおけるＩＫＫ活性の阻害についての化合物７３及び５６の用量−応答曲線が直接比較しながら示される。ＨｅＬａ細胞がＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されて、ＩＫＫ−コンプレックスが連続的に免疫沈降した。漸増する濃度の化合物７３及び５６の存在下で、無細胞アッセイ条件下、方法の項に記載した通りに、αスクリーンアッセイ（Perkin Elmer）で測定された。その活性の相対的減少率は、最大蛍光計数値の％で出される。ｎ＝２の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図９】ＣＯＭ７３の、ＩκＢαリン酸化への阻害効果。漸増する濃度のＣＯＭ７３がＩκＢαのリン酸化を用量依存的に阻害する。ＨｅＬａ細胞が、漸増する濃度の化合物７３の存在下でＴＮＦαで予備刺激された。細胞溶解産物のＩκＢリン酸化が、特異的抗リン酸化抗体及びウェスタンブロットで分析された。代表的ウェスタンブロットが示される。
【図１０】化合物７３の、ＩＫＫ−コンプレックスの劣化への効果。ＩＫＫ−コンプレックスの劣化についての化合物７３の用量−応答曲線が示される。ＨｅＬａ細胞が、種々の濃度の化合物７３と共にインキュベートされてから、ＴＮＦα刺激された（２０ｎｇ／ｍｌ）。細胞の溶解後、ＮＥＭＯタンパク質の量が、特異的抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）でのウェスタンブロット分析により測定された。ＩＫＫα／βの量が、特異的抗−ＩＫＫα／β−抗体（Santa Cruz）とウェスタンブロットとで調べられた。タンパク質量が定量され、漸増する濃度のＣＯＭ７３によるタンパク質の量の相対的減少率がコントロールの％で出された。ｎ＝２の実験のまとめが平均値＋／−ＳＥＭとして示される。
【図１１】ＣＯＭ５６は、ＮＥＭＯへのＩＫＫα／β結合を in vitro で崩壊させる。ＨｅＬａ細胞がＴＮＦα刺激（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理された。ＩＫＫコンプレックスが、抗−ＮＥＭＯ−抗体（Santa Cruz）とプロテインＡ−セファロースで、細胞質ゾル抽出物から同時沈降された。その沈降物は化合物５６と共にインキュベートされ、そのコンプレックス完全性がＩＫＫα／βタンパク質について特異的抗体でのウェスタンブロットで分析された。化合物５６は、ＮＥＭＯへのＩＫＫα／βの結合を in vitro で崩壊させた。ＩＫＫα／βタンパク質の量が未処理ＨｅＬａ細胞の％で表される。
【図１２】ＩＶ施与後のＣＯＭ５６の血清濃度。一回ＩＶ施与後のＣＯＭ５６の血清レベルが質量分析法により分析された。ＣＯＭ５６の２７.５及び５５μｇＩＶ注射で、２及び２０分後にかなりの血清レベルがラットにおいて測定されることができた。２つの実験の一回値が与えられている。
【図１３】ＣＯＭ５６による全身性炎症の阻害。ＬＰＳ刺激前後の全身性ＴＮＦα放出が、特異的ＥＬＩＳＡアッセイで、ラットで測定された。ＣＯＭ５６でのラットの予備処理は、全身性ＴＮＦα放出を阻害する。ｎ＝４の実験の平均値±ＳＥＭが示される。
【図１４】ＣＯＭ５４ファミリーのＩＫＫ阻害剤の化学構造。化合物ＣＯＭ５４と高い構造的類似性を有するＩＫＫ−阻害剤の化学構造が比較しながら示される。
【図１５】ＩｋＢα−リン酸化への阻害活性の測定。異なるＩＫＫ阻害剤のＩκＢαリン酸化への効果が比較しながら示される。ＨｅＬａ細胞が、１０及び１００μＭの異なるＩＫＫ阻害剤の存在下でＴＮＦαで予備刺激された。細胞溶解産物のＩκＢαリン酸化が、特異的抗リン酸化抗体とウェスタンブロットとで分析された。代表的ウェスタンブロットが示される。
【図１６】ＣＯＭ５４及び類似物での処理後の細胞生存度。ＨｅＬａ細胞が、漸増する濃度の化合物５４とその類似物と共に１日インキュベートされた。細胞完全性と活性な代謝のために、ＷＳＴ−１試薬が加えられた。Ｅｌｉｓａリーダーでの特性波長で吸光度が測定され、そしてコントロールの％で出された。ｎ＝４の実験の平均値±ＳＥＭが示される。
【図１７】ＣＯＭ６８によるヒト内皮細胞における粥状動脈硬化症の阻害。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＣＯＭ６８によるＩＣＡＭ発現の阻害が、ＩＬ−１及びＴＮＦα刺激後の両方で示される。ＩＣＡＭ発現は、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ測定により測定された。ｎ＝３の実験の平均値±ＳＥＭが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、次式（Ａ）：
【化１】
により表され、
式中、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ｉ）：
【化２】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
アルキル基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３】
請求項２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項４】
請求項２又は３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ3が水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ6及びＲ7が同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子又は直鎖状若しくは分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲンである、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１０】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１１】
請求項１０の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１３】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、次式（Ｂ）：
【化３】
により表され、
式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、又はＮＨを表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１４】
請求項１３の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、式（Ｂ）における点線が両方とも二重結合である、誘導体又はその塩。
【請求項１５】
請求項１３又は１４の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｒが置換フェニル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｘ1がＯを表す、誘導体又はその塩。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｘ、Ｙ、及びＺが同じでも異なっていてもよく、水素原子又はカルボキシル基若しくはその塩を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２０】
環外二重結合に関してのあらゆる幾何異性体を包含する図７のＣＯＭ５６。
【請求項２１】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（II）：
【化４】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
カルボキシル基、
ハロゲン原子、
ニトロ基、
シアノ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２２】
請求項２１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が同じでも異なっていてもよくアルキル基を表すか、又は、一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２３】
請求項２１又は２２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ3がハロゲン原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｘがカルボキシル基であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２７】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２８】
請求項２７の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３０】
医薬として使用するための次式（Ｃ）：
【化５】
により表される化合物又はその塩であって、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、又は直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基であるか、又は、次式（１−１）
【化６】
［式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'及びＸ"は、独立に、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ヒドロキシ基、
アルキル基、
アルコキシ基、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
アルキルカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、
アミノ基、
アルキルアミノ基、又は
ジアルキルアミノ基
を表し、但し、Ａ及びＢの少なくとも１が式（１−１）により表される、化合物又はその塩。
【請求項３１】
請求項３０の医薬として使用するための化合物又はその塩又はそのエステルであって、該化合物が、次式（III）：
【化７】
により表され、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、次式
【化８】
［式中、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'は、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌは、
水素原子、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
ハロゲン原子
を表す、化合物又はその塩又はそのエステル。
【請求項３２】
請求項３１の化合物であって、Ａ及びＢが同じある化合物。
【請求項３３】
請求項３０又は３１の化合物であって、Ｒ8が水素原子である化合物。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項の化合物であって、Ｒ9が水素原子である化合物。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか１項の化合物であって、Ｘ'がＯである化合物。
【請求項３６】
請求項３０〜３５のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項３７】
請求項３０の化合物であって、Ａが水素又はヒドロキシル基である化合物。
【請求項３８】
請求項３０の化合物であって、Ｘ'及びＸ"が酸素原子である化合物。
【請求項３９】
請求項３０、３７又は３８の化合物であって、Ｌがヒドロキシル基である化合物。
【請求項４０】
請求項３０又は３７〜３９のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項４１】
１５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜４０のいずれか１項の医薬として使用するためのヘテロ環化合物であって、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための無細胞スクリーニング方法における阻害剤として該化合物が正の結果を与えるものであり、該方法が、次の段階：
（ａ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを含有する組成物を提供する段階；
（ｂ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、該化合物の存在下、予め決められた条件下で、段階（ａ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の該リン酸化された基質ペプチドを、予め決められた条件下で、該基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｄ）特異的に結合した抗体の量が、該化合物の存在に起因して、該化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなり、特に、化合物００２、０２、３０、３１、５４、５６、６８、６９、７３、７０及び８２の群から選択される化合物。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢの放出を低下させるための請求項４２の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４２又は４３の医薬組成物であって、炎症性疾患を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項の医薬組成物であって、粥状動脈硬化症を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物の、医薬を製造するための使用。
【請求項４７】
請求項３９の使用であって、該医薬が粥状動脈硬化症を治療又は予防するための医薬である使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、次式（Ａ）：
【化１】
により表され、
式中、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、次式（Ｉ）：
【化２】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
アルキル基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３】
請求項２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項４】
請求項２又は３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ3が水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ6及びＲ7が同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子又は直鎖状若しくは分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲンである、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１０】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１１】
請求項１０の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１３】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、次式（Ｂ）：
【化３】
により表され、
式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、又はＮＨを表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１４】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、式（Ｂ）における点線が両方とも二重結合である、誘導体又はその塩。
【請求項１５】
請求項１３又は１４の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｒが置換フェニル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｘ1がＯを表す、誘導体又はその塩。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｘ、Ｙ、及びＺが同じでも異なっていてもよく、水素原子又はカルボキシル基若しくは薬学的に許容できるその塩を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２０】
環外二重結合に関してのあらゆる幾何異性体を包含する図７の医薬として使用するためのＣＯＭ５６。
【請求項２１】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、次式（II）：
【化４】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
カルボキシル基、
ハロゲン原子、
ニトロ基、
シアノ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２２】
請求項２１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が同じでも異なっていてもよくアルキル基を表すか、又は、一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２３】
請求項２１又は２２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ3がハロゲン原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｘがカルボキシル基であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２７】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２８】
請求項２７の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３０】
医薬として使用するための次式（Ｃ）：
【化５】
により表される化合物又は薬学的に許容できるその塩であって、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、又は直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基であるか、又は、次式（１−１）
【化６】
［式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'及びＸ"は、独立に、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ヒドロキシ基、
アルキル基、
アルコキシ基、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
アルキルカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、
アミノ基、
アルキルアミノ基、又は
ジアルキルアミノ基
を表し、但し、Ａ及びＢの少なくとも１が式（１−１）により表される、化合物又はその塩。
【請求項３１】
請求項３０の医薬として使用するための化合物又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、該化合物が、次式（III）：
【化７】
により表され、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、次式
【化８】
［式中、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'は、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌは、
水素原子、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
ハロゲン原子
を表す、化合物又はその塩又はそのエステル。
【請求項３２】
請求項３１の化合物であって、Ａ及びＢが同じある化合物。
【請求項３３】
請求項３０又は３１の化合物であって、Ｒ8が水素原子である化合物。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項の化合物であって、Ｒ9が水素原子である化合物。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか１項の化合物であって、Ｘ'がＯである化合物。
【請求項３６】
請求項３０〜３５のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項３７】
請求項３０の化合物であって、Ａが水素又はヒドロキシル基である化合物。
【請求項３８】
請求項３０の化合物であって、Ｘ'及びＸ"が酸素原子である化合物。
【請求項３９】
請求項３０、３７又は３８の化合物であって、Ｌがヒドロキシル基である化合物。
【請求項４０】
請求項３０又は３７〜３９のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項４１】
１５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜４０のいずれか１項の医薬として使用するためのヘテロ環化合物又は薬学的に許容できるであって、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための無細胞スクリーニング方法における阻害剤として該化合物が正の結果を与えるものであり、該方法が、次の段階：
（ａ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを含有する組成物を提供する段階；
（ｂ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、該化合物の存在下、予め決められた条件下で、段階（ａ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の該リン酸化された基質ペプチドを、予め決められた条件下で、該基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｄ）特異的に結合した抗体の量が、該化合物の存在に起因して、該化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなり、特に、化合物００２、０２、３０、３１、５４、５６、６８、６９、７３、７０及び８２の群から選択される化合物。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢの放出を低下させるための請求項４２の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４２又は４３の医薬組成物であって、炎症性疾患を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項の医薬組成物であって、粥状動脈硬化症を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物の、医薬を製造するための使用。
【請求項４７】
請求項３９の使用であって、該医薬が粥状動脈硬化症を治療又は予防するための医薬である使用。
【請求項１】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、次式（Ａ）：
【化１】
により表され、
式中、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（Ｉ）：
【化２】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
アルキル基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３】
請求項２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項４】
請求項２又は３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ3が水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ6及びＲ7が同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子又は直鎖状若しくは分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲンである、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１０】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１１】
請求項１０の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１３】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、次式（Ｂ）：
【化３】
により表され、
式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、又はＮＨを表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１４】
請求項１３の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、式（Ｂ）における点線が両方とも二重結合である、誘導体又はその塩。
【請求項１５】
請求項１３又は１４の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｒが置換フェニル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｘ1がＯを表す、誘導体又はその塩。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項の５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩であって、Ｘ、Ｙ、及びＺが同じでも異なっていてもよく、水素原子又はカルボキシル基若しくはその塩を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２０】
環外二重結合に関してのあらゆる幾何異性体を包含する図７のＣＯＭ５６。
【請求項２１】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、次式（II）：
【化４】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
カルボキシル基、
ハロゲン原子、
ニトロ基、
シアノ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２２】
請求項２１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が同じでも異なっていてもよくアルキル基を表すか、又は、一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２３】
請求項２１又は２２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ3がハロゲン原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｘがカルボキシル基であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２７】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２８】
請求項２７の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又はその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３０】
医薬として使用するための次式（Ｃ）：
【化５】
により表される化合物又はその塩であって、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、又は直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基であるか、又は、次式（１−１）
【化６】
［式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'及びＸ"は、独立に、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ヒドロキシ基、
アルキル基、
アルコキシ基、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
アルキルカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、
アミノ基、
アルキルアミノ基、又は
ジアルキルアミノ基
を表し、但し、Ａ及びＢの少なくとも１が式（１−１）により表される、化合物又はその塩。
【請求項３１】
請求項３０の医薬として使用するための化合物又はその塩又はそのエステルであって、該化合物が、次式（III）：
【化７】
により表され、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、次式
【化８】
［式中、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'は、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌは、
水素原子、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
ハロゲン原子
を表す、化合物又はその塩又はそのエステル。
【請求項３２】
請求項３１の化合物であって、Ａ及びＢが同じある化合物。
【請求項３３】
請求項３０又は３１の化合物であって、Ｒ8が水素原子である化合物。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項の化合物であって、Ｒ9が水素原子である化合物。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか１項の化合物であって、Ｘ'がＯである化合物。
【請求項３６】
請求項３０〜３５のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項３７】
請求項３０の化合物であって、Ａが水素又はヒドロキシル基である化合物。
【請求項３８】
請求項３０の化合物であって、Ｘ'及びＸ"が酸素原子である化合物。
【請求項３９】
請求項３０、３７又は３８の化合物であって、Ｌがヒドロキシル基である化合物。
【請求項４０】
請求項３０又は３７〜３９のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項４１】
１５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜４０のいずれか１項の医薬として使用するためのヘテロ環化合物であって、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための無細胞スクリーニング方法における阻害剤として該化合物が正の結果を与えるものであり、該方法が、次の段階：
（ａ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを含有する組成物を提供する段階；
（ｂ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、該化合物の存在下、予め決められた条件下で、段階（ａ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の該リン酸化された基質ペプチドを、予め決められた条件下で、該基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｄ）特異的に結合した抗体の量が、該化合物の存在に起因して、該化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなり、特に、化合物００２、０２、３０、３１、５４、５６、６８、６９、７３、７０及び８２の群から選択される化合物。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢの放出を低下させるための請求項４２の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４２又は４３の医薬組成物であって、炎症性疾患を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項の医薬組成物であって、粥状動脈硬化症を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物の、医薬を製造するための使用。
【請求項４７】
請求項３９の使用であって、該医薬が粥状動脈硬化症を治療又は予防するための医薬である使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、次式（Ａ）：
【化１】
により表され、
式中、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、次式（Ｉ）：
【化２】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ6及びＲ7は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
アルキル基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３】
請求項２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項４】
請求項２又は３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ3が水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ6及びＲ7が同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子又は直鎖状若しくは分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｘがハロゲンである、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１０】
請求項１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１１】
請求項１０の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項１３】
医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、次式（Ｂ）：
【化３】
により表され、
式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒは、置換されていてもよいフェニル又はピリジル基を表し；
Ｒ4は、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基、
ジアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、又はＮＨを表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
ニトロ基、
シアノ基、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１４】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、式（Ｂ）における点線が両方とも二重結合である、誘導体又はその塩。
【請求項１５】
請求項１３又は１４の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｒが置換フェニル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｘ1がＯを表す、誘導体又はその塩。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩であって、Ｘ、Ｙ、及びＺが同じでも異なっていてもよく、水素原子又はカルボキシル基若しくは薬学的に許容できるその塩を表す、誘導体又はその塩。
【請求項２０】
環外二重結合に関してのあらゆる幾何異性体を包含する図７の医薬として使用するためのＣＯＭ５６。
【請求項２１】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、次式（II）：
【化４】
により表され、
式中、
Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
直鎖状又は分枝状アルケニル基、
シクロアルキル基、
アリール基
を表すか、又は、Ｒ1及びＲ2は、一緒になってアルキレン基を形成することができ；
Ｒ3は、
水素原子、
ハロゲン原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｒ4は、
直鎖状又は分枝状アルコキシ基、
直鎖状又は分枝状アルキル基、
シクロアルコキシ基、
アルキルアミノ基、
シクロアルキルアミノ基
を表し、
Ｒ5は、
水素原子、
直鎖状又は分枝状アルキル基
を表し、
Ｘ、Ｙ、及びＺは、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
カルボキシル基、
ハロゲン原子、
ニトロ基、
シアノ基、又は
アシル基
を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２２】
請求項２１の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ1及びＲ2が同じでも異なっていてもよくアルキル基を表すか、又は、一緒になってアルキレン基を形成する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２３】
請求項２１又は２２の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ3がハロゲン原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ4が直鎖状又は分枝状アルコキシ基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒ5が直鎖状又は分枝状アルキル基を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか１項の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｘがカルボキシル基であり、Ｙ及びＺが水素原子を表す、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２７】
請求項１３の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒにより表されるフェニル基又はピリジル基が、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルオキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニルアミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルアミノカルボニルオキシ基からなる群から選択される１〜３の置換基により置換されている、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２８】
請求項２７の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、Ｒがフェニル基である、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の医薬として使用するための５Ｈ−チアゾロ［３,２］ピリミジン誘導体又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、ハロゲン原子又はアルコキシ基から選択される１〜３の置換基が存在する、誘導体又はその塩又はそのエステル。
【請求項３０】
医薬として使用するための次式（Ｃ）：
【化５】
により表される化合物又は薬学的に許容できるその塩であって、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルコキシ基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルキルカルボニル基、直鎖状又は分枝状Ｃ1-7アルコキシカルボニル基、又は直鎖状又は分枝状Ｃ1-6アルキルアミノ基であるか、又は、次式（１−１）
【化６】
［式中、
点線は、独立に、単結合又は二重結合を表し、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'及びＸ"は、独立に、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、水素原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌ、Ｌ'及びＬ"は、同じでも異なっていてもよく、
水素原子、
ヒドロキシ基、
アルキル基、
アルコキシ基、
ハロゲン原子、
カルボキシル基、
アルキルカルボニル基、
アルコキシカルボニル基、
アミノ基、
アルキルアミノ基、又は
ジアルキルアミノ基
を表し、但し、Ａ及びＢの少なくとも１が式（１−１）により表される、化合物又はその塩。
【請求項３１】
請求項３０の医薬として使用するための化合物又は薬学的に許容できるその塩又はそのエステルであって、該化合物が、次式（III）：
【化７】
により表され、
式中、
Ａ及びＢは、同じでも異なっていてもよく、次式
【化８】
［式中、
Ｒ8及びＲ9は、独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を表し、
Ｘ'は、Ｏ又はＳを表し、
Ｗは、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、又は式−ＣＯＺ'Ｒ10（Ｚ'はＯ又はＳ又はＮＨであり、そしてＲ10はＣ1-6アルキル基である）の基である。］により表され；そして、
Ｌは、
水素原子、
アルキル基、
アルコキシ基、又は
ハロゲン原子
を表す、化合物又はその塩又はそのエステル。
【請求項３２】
請求項３１の化合物であって、Ａ及びＢが同じある化合物。
【請求項３３】
請求項３０又は３１の化合物であって、Ｒ8が水素原子である化合物。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項の化合物であって、Ｒ9が水素原子である化合物。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか１項の化合物であって、Ｘ'がＯである化合物。
【請求項３６】
請求項３０〜３５のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項３７】
請求項３０の化合物であって、Ａが水素又はヒドロキシル基である化合物。
【請求項３８】
請求項３０の化合物であって、Ｘ'及びＸ"が酸素原子である化合物。
【請求項３９】
請求項３０、３７又は３８の化合物であって、Ｌがヒドロキシル基である化合物。
【請求項４０】
請求項３０又は３７〜３９のいずれか１項の化合物であって、Ｗがニトロ基である化合物。
【請求項４１】
１５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜４０のいずれか１項の医薬として使用するためのヘテロ環化合物又は薬学的に許容できるであって、ＩＫＫ−βによるＩｋＢリン酸化の阻害を同定するための無細胞スクリーニング方法における阻害剤として該化合物が正の結果を与えるものであり、該方法が、次の段階：
（ａ）機能性ＩＫＫ−コンプレックスを含有する組成物を提供する段階；
（ｂ）ＩｋＢのＩＫＫ−βリン酸化ドメインを含んでなる基質ペプチドを、該化合物の存在下、予め決められた条件下で、段階（ａ）の機能性ＩＫＫ−コンプレックスによるリン酸化に付する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の該リン酸化された基質ペプチドを、予め決められた条件下で、該基質ペプチドのＩＫＫ−βリン酸化ドメインに特異的な抗体と反応させる段階；
（ｄ）特異的に結合した抗体の量が、該化合物の存在に起因して、該化合物が存在しない場合に比較して低いときに、該化合物を阻害剤として特定する段階
を含んでなり、特に、化合物００２、０２、３０、３１、５４、５６、６８、６９、７３、７０及び８２の群から選択される化合物。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢの放出を低下させるための請求項４２の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４２又は４３の医薬組成物であって、炎症性疾患を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項の医薬組成物であって、粥状動脈硬化症を予防又は治療するのに有効である医薬組成物。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項の化合物の、医薬を製造するための使用。
【請求項４７】
請求項３９の使用であって、該医薬が粥状動脈硬化症を治療又は予防するための医薬である使用。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００６−５２１３２７（Ｐ２００６−５２１３２７Ａ）
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０４８８０（Ｐ２００６−５０４８８０）
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３２４６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８４９０７
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０２２９４０３５）トリゲン ゲーエムベーハー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３２４６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８４９０７
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０２２９４０３５）トリゲン ゲーエムベーハー (2)
【Ｆターム（参考）】
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