ＰＰＡＲ活性化剤
【課題】ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体活性化剤を提供すること。
【解決手段】大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
【解決手段】大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等に有効なペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator Activated Receptor、ＰＰＡＲと記載する）活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドなどの低分子脂溶性リガンドはリガンド特異的な核内受容体を介して、個体発生における形態形成、細胞の増殖、分化、生体の恒常性の維持など多様な生理機能の調節に関与している。ＰＰＡＲは核内受容体の１種であり、１９９０年に脂肪分解に関与する細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を仲介する蛋白として同定され、ペルオキシソーム増殖剤により活性化を受けるレセプターという意味でPeroxisome Proliferator Activated Receptorα（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体：ＰＰＡＲα）と名付けられた。その後α型と構造上類似したアイソフォーム遺伝子としてδ型及びγ型が同定され、合計３つのサブタイプから成ることが知られている。
【０００３】
ＰＰＡＲの各サブタイプはリガンド依存的に活性化され、９−シスレチノイン酸をリガンドとするＲＸＲ（Retinoid X Receptor）とヘテロ２量体を形成することで、プロモーター領域にＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＡＲ responsivelement；ＰＰＲＥ）を有する種々の遺伝子の発現を制御している（非特許文献１及び２）。
例えば、脂肪酸β酸化の鍵酵素として知られるＡＣＯ（Acyl-CoA oxidase）のＰＰＲＥを用いたレポーターアッセイがなされており、それによると、ＰＰＡＲリガンドとして知られるリノール酸は、ＰＰＡＲα、δ、γのそれぞれを介してＡＣＯ転写活性を亢進することが報告されている（非特許文献３）。
以下で述べるように、近年、ＰＰＡＲは非常に多くの生理、病理現象に関わっていることが明らかになってきた。
【０００４】
具体的には、ＰＰＡＲαの機能は脂肪酸の合成・輸送・分泌、脂肪消費臓器におけるＡＴＰ産生等幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。特に脂肪酸代謝に重要なβ酸化関連酵素 （ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲαの活性化に強く依存していることが明らかになっている。ＰＰＡＲαは肝臓、心臓、腎臓等での発現が高く、ＰＰＡＲα活性化剤はこれらの臓器の脂質代謝の活性化に有効であると広く認識されている。
【０００５】
ＰＰＡＲαの活性化に伴う脂肪酸代謝の活性化は、肝臓脂肪の分解、脂肪肝の改善、内臓脂肪や皮下脂肪等の体脂肪の分解・燃焼の促進、肥満の抑制につながると考えられる。ＰＰＡＲα活性化剤として知られるフィブラート系の薬剤は、脂肪酸燃焼の促進作用、ＨＤＬコレステロール増加作用、そして最近ではアディポネクチン受容体発現増加作用等を持つことが明らかとなってきており、インスリン非依存性糖尿病の高血糖症、脂質異常症、高血糖症、アテローム性動脈硬化症等の治療薬として広く用いられている（非特許文献４、特許文献１及び２）。また、ＰＰＡＲα活性化剤が心肥大や虚血性心疾患に効果があることが報告されている（非特許文献５、６）。
【０００６】
従って、ＰＰＡＲα活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効であると考えられており、近年、ＰＰＡＲα活性化剤の探索、開発も盛んに行われている（特許文献３〜５）。
【０００７】
ＰＰＡＲδ（別名：ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ１、ＦＡＡＲ）は１９９２年にクローニングされて以来、長らく機能が明らかにされていなかったが、近年、遺伝子改変動物を用いた研究やＰＰＡＲδ選択的な作動薬の開発などにより様々な生理機能を持つことが明らかになってきた。ＰＰＡＲδを過剰発現させたマウスを用いた検討では、高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制が認められている（非特許文献７）。ＰＰＡＲδ選択的な作動薬であるＧＷ５０１５１６を肥満アカゲザルに投与した実験では、ＨＤＬコレステロールを上昇させ、中性脂肪、ＬＤＬコレステロールを低下させた（非特許文献８）。
【０００８】
また、ＧＷ５０１５１６を骨格筋由来細胞に作用させ、細胞の遺伝子発現への影響を検討した結果では、脂肪酸の取り込みや輸送、ミトコンドリアのβ酸化系酵素、脱共役タンパク質等の脂肪酸代謝関連遺伝子の発現を誘導することが示されている。さらにＧＷ５０１５１６を投与したマウスにおいては、脂肪組織特異的ＰＰＡＲδ過剰発現マウスと同様に高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少が認められ、インスリン抵抗性改善効果を示すことも明らかにされている。このマウスの骨格筋においては脂肪酸代謝関連遺伝子および脂肪酸β酸化の誘導が確認されていることから、ＰＰＡＲδの活性化によって、骨格筋のエネルギー消費が増大することにより末梢組織中の脂肪蓄積が抑制され、それによりインスリン抵抗性が改善されるのではないかと考えられている（非特許文献９）。また、遺伝的肥満マウスにＧＷ５０１５１６を投与することにより、膵島の肥大が抑制されたことから、膵島の保護作用があると考えられている（非特許文献９）。
【０００９】
また、骨格筋特異的にＰＰＡＲδを過剰発現することにより、肥満やインスリン抵抗性が抑制されることが報告されている。さらに驚くことに、このマウスの骨格筋では一般的に赤筋と呼ばれるミトコンドリアを多く含む持久性の高い筋繊維の割合が非常に高くなっており、その結果、このマウスは、コントロールマウスの約２倍の距離を走ることができるという大変優れた持久力を持つマウスであることが示されている（非特許文献１０）。従って、ＰＰＡＲδの活性化は、運動持久力の向上に有効であると考えられるようになった。
【００１０】
また最近では、肝臓においてＰＰＡＲδがインスリン感受性を制御しているという報告もなされており、そのメカニズムとして、ＰＰＡＲδの活性化が肝臓の解糖系およびペントースリン酸回路の活性化を介して肝臓からのグルコースの供給を減少させ、インスリン感受性を増加することが示唆されている（非特許文献１１）。
【００１１】
このように、ＰＰＡＲδの活性化は、ＨＤＬコレステロールの上昇、ＬＤＬコレステロールの低下、肥満の抑制、インスリン抵抗性の改善／インスリン感受性の向上、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制、持久力の向上等につながる事から、ＰＰＡＲδの活性化剤は、動脈硬化の予防・改善剤、肥満の予防・改善剤、インスリン抵抗性の予防・改善剤、脂肪酸酸化活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、持久力向上剤として有効であると考えられている。
そのため、このような目的でＰＰＡＲδ活性化剤の探索、開発も盛んに行われ、これまでにフラボン類、フェノキシ酢酸誘導体等が報告されている（特許文献６及び７）。
【００１２】
ＰＰＡＲγは栄養が十分にある状態でエネルギー貯蔵に作用し、いわゆる倹約遺伝子として働く分子である。特にＰＰＡＲγ２は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。ＰＰＡＲγのリガンドとして知られるチアゾリジン誘導体は脂肪細胞分化を強力に誘導することにより、脂肪細胞を小型化してインスリン感受性を高めることが知られており、インスリン抵抗性改善剤、糖尿病治療薬として広く使用されている（非特許文献１２）。
【００１３】
このように、ＰＰＡＲ活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善などに広く有効であり、いわゆる生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）の予防・改善にも有効であると考えられる。
【００１４】
トウチは、大豆をコウジ菌（Aspergillus属菌）等で発酵させて製造される中国の伝統的な大豆発酵食品である。同様の発酵食品に日本で食される浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆等がある。トウチの水抽出物が、αグルコシダーゼ阻害活性を有し、それによって、炭水化物の分解を抑制、又はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）の血漿濃度を増加させ、さらに血糖コントロール、満腹感の改善、胃内容排出の遅延、メタボリック症候群の軽減、血中脂質、炎症、血栓因子、血圧及び腹部肥満の低下、インスリン感受性若しくはインスリン抵抗性の改善、肝臓内での脂肪の蓄積制御、持久力向上等に有用であることが知られている（特許文献８）。
【００１５】
しかしながら、トウチや浜納豆のような大豆発酵食品がＰＰＡＲ活性化に関与し、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進等に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表2002-502869号公報
【特許文献２】特表2002-533410号公報
【特許文献３】特開2001-354558号公報
【特許文献４】特開2002-80362号公報
【特許文献５】特開2003-34636号公報
【特許文献６】特開2007-119429号公報
【特許文献７】特表2007-536343号公報
【特許文献８】特表2009-538342号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】細胞:31(6)218-234, 1999
【非特許文献２】J Lipid Res. 37, 907-925, 1996
【非特許文献３】J Biol Chem. 274, 23368-23377, 1999
【非特許文献４】Curr Opin Lipidol. 10, 151-159, 1999
【非特許文献５】Endcrinology 144, 4187-4194, 2003
【非特許文献６】Circulation 108, 2393-2399, 2003
【非特許文献７】Cell. 113, 159-170, 2003
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5306-5311, 2001
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 15924-15929, 2003
【非特許文献１０】PloS Biol. 2, e294, 2004
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 3444-3449, 2006
【非特許文献１２】Diabetes. 49, 759-767, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、且つ安全性の高い食品、医薬品又は医薬部外品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、食経験が豊富な天然物素材の中から、トウチや浜納豆のような大豆のAspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに対する活性化作用があり、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等の効果を発揮する食品、医薬品又は医薬部外品の有効成分として配合する素材として有用であることを見出した。
【００２０】
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
〔１〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
〔２〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
〔３〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
〔４〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤。
〔５〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする肥満予防・改善剤。
〔６〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
〔７〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
〔８〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂質異常症予防・改善剤。
〔９〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪肝予防・改善剤。
〔１０〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする動脈硬化予防・改善剤。
〔１１〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
〔１２〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする心肥大の予防・改善剤。
〔１３〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする虚血性心疾患の予防・改善剤。
〔１４〕大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、かつ長期間摂取しても安全性も高いことから、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等の効果を発揮する飲食品、医薬品又は医薬部外品に有効成分として配合する素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＰＡＲα活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＷｙはＷｙ14643を示す。*は溶媒対照に対する有意差Ｐ＜０．０５を示す。
【図２】ＰＰＡＲδ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＧＷはＧＷ501516を示す。*は溶媒対照に対する有意差Ｐ＜０．０５を示す。
【図３】ＰＰＡＲγ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、Ｐｉｏはピオグリタゾンを示す。*は溶媒対照に対する有意差Ｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明において、大豆Aspergillus属菌発酵物とは、大豆をAspergillus属菌で発酵させたものの総称であり、例えば、中国の伝統的な大豆発酵食品であるトウチ及び日本の伝統的な大豆発酵食品である浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆などが挙げられる。大豆Aspergillus属菌発酵物は、例えば、下記に記載されている手順に従って大豆をAspergillus属菌を用いて発酵させることにより製造してもよく、あるいは市販の大豆Aspergillus属菌発酵物、例えば、トウチや浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆などを購入してもよい。
【００２４】
ここで、Aspergillus属菌としては、トウチや浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆などの製造に一般的に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、Aspergillus oryzae、Aspergillus egypticusなどを用いることができる。
【００２５】
本発明において、大豆とは、マメ科（Fabaceae）ダイズ属（Glycine）の一年草であるダイズの種子をいう。原料とする大豆は、食用、加工食品の原料用に用いられるものであれば、品種や産地はいずれのものでもよいが、黒大豆が好ましい。
【００２６】
大豆は通常のトウチや浜納豆などの製造法と同様に、水への浸漬、及び水又は水蒸気と共に加熱処理をおこなっておくことが好ましい。また、大豆は脱皮処理を行い、原料中に大豆の外皮が残存しないことが望ましい。脱皮は、原料大豆に脱皮大豆を用いることでおこなっても、浸漬又は加熱処理後に行ってもよい。
大豆の水への浸漬の時間は特に限定されないが、通常、３０分〜１２時間であり、好ましくは、２〜６時間である。
また、大豆の加熱処理時間は特に限定されないが、通常、煮沸処理の場合３０〜９０分であり、好ましくは、３０〜６０分である。
【００２７】
次いで、この大豆をAspergillus属菌とともに発酵させる。発酵のために大豆に添加されるAspergillus属菌の量は特に限定されないが、加熱処理後に冷却した大豆に対し、通常０．１〜３．０質量％、好ましくは０．２〜０．５質量％の種菌を接種する。好ましくは、Aspergillus属菌は、培養物（例えば、麹）の状態で大豆に添加される。
発酵時の温度は特に限定されないが、２８〜３５℃とするのが好ましく２８〜３０℃とするのがより好ましい。発酵時の湿度は、６０％〜９９％であるのが好ましく、８０〜９８％であるのがより好ましい。
発酵時間は、温度、Aspergillus属菌の接種量などにより異なるが、２４時間〜６ヶ月間とするのが好ましく、４８時間〜１ヶ月間とするのがより好ましい。
【００２８】
上述の条件で、発酵を行うことにより本発明の大豆Aspergillus属菌発酵物を得ることができる。当該大豆Aspergillus属菌発酵物は、そのまま又は乾燥して抽出に用いることができる。
【００２９】
本発明で用いる大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、大豆Aspergillus属菌発酵物より疎水性溶媒を用いて常温（０〜３０℃）又は加温下で抽出することにより得られるものである。
大豆Aspergillus属菌発酵物１質量部に対して、１／２〜１０質量部の疎水性溶媒を用いるのが好ましく、このときの抽出温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、また抽出時間は１／１０〜１２時間が好ましく、１／２〜５時間がより好ましい。
当該抽出としては、固液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができ、好ましくは攪拌を伴う固液抽出である。
【００３０】
斯くして得られる抽出物は、溶媒を除去した後そのまま使用できるが、公知の分離精製手段、例えば、活性炭処理、液々分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲルろ過、精密蒸留等を行った後、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製してもよい。
当該疎水性有機溶媒としては、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、石油エーテル、ベンゼン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン（本明細書中ではヘキサンともいう）等が挙げられ、２種以上組み合わせてもよく、好ましくはｎ−ヘキサンである。
【００３１】
後記実施例に示すように、大豆をAspergillus属菌で発酵させて得られた発酵物を疎水性有機溶媒で抽出することにより調製された大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに依存的な遺伝子の転写活性を亢進する作用を有する。前述のとおり、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγは、広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わっており、特に脂質代謝に重要なβ酸化関連酵素（ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδの活性化に強く依存しており（非特許文献１〜１０、特許文献１〜７）、またＰＰＡＲγのリガンドによる脂肪細胞分化誘導によってインスリン抵抗性や糖尿病が改善できることが知られていることから（非特許文献１２）、大豆のAspergillus属菌発酵物又はその抽出物は、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効である。
【００３２】
従って、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに対する活性化作用を有するので、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上に対する活性化剤、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂肪細胞分化促進剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、糖尿病予防・改善剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、動脈硬化予防・改善剤、持久力向上剤、心肥大の予防・改善剤、虚血性心疾患の予防・改善剤、等（以下、「ＰＰＡＲ活性化剤等」とする。）として使用することができ、ＰＰＡＲ活性化剤等の製造のために使用することができる。ＰＰＡＲ活性化剤等は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ若しくはＰＰＡＲγ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品の有効成分として使用可能である。また、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ若しくはＰＰＡＲγ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００３３】
さらに、本発明によれば、大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによる、ＰＰＡＲ活性化剤の製造方法が提供される。好ましくは、当該ＰＰＡＲ活性化剤は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上に対する活性化剤である。さらに本発明によれば、大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによる、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂肪細胞分化促進剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、糖尿病予防・改善剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、動脈硬化予防・改善剤、持久力向上剤、心肥大の予防・改善剤、虚血性心疾患の予防・改善剤等の製造方法が提供される。
【００３４】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を医薬品、医薬部外品の有効成分として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。
また、このような種々の剤型の製剤を調製するには、本発明の大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口用液体製剤を調製する場合は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により製造することができる。
【００３５】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を化粧品の有効成分として用いる場合には、皮膚外用剤、洗浄剤、入浴剤、又はメイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、これらを、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末剤、パック、パップ剤、顆粒剤、ファンデーション、口紅、シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧品を調製するには、本発明の大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を単独で、又は化粧料に配合される、外用基材、油又は油状物質、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類、キレート類、無機酸、有機酸、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３６】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を食品の有効成分として用いる場合の形態としては、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料、スープ類等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
飲料は、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、ニアウオーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等が挙げられる。また、飲料は、容器に充填した容器詰飲料とすることができる。
食用油としては、調理用油、調味料、マヨネーズ、ドレッシング、マーガリン等の油脂加工品類、パスタソース類等が挙げられる。
また、このような種々の形態の食品を調製するには、本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ若しくはＰＰＡＲγの活性化用食品、脂肪酸代謝活性化用食品、体脂肪燃焼促進用食品、脂肪細胞分化促進用食品、肥満予防・改善用食品、インスリン抵抗性予防・改善用食品、糖尿病予防・改善用食品、脂質異常症予防・改善用食品、脂肪肝予防・改善用食品、動脈硬化予防・改善用食品、持久力向上用食品、心肥大の予防・改善用食品、虚血性心疾患の予防・改善用食品、ペットフード等として用いることが可能である。
【００３７】
これらのものに対するＰＰＡＲ活性化剤等の配合量はその使用形態により異なるが、食品の形態では、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０００１〜１０質量％、さらに０．００１〜５質量％、さらになお０．００２〜２質量％とするのが好ましい。
例えば飲料の場合では、飲料中にＰＰＡＲ活性化剤等は、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．００１〜０．５質量％、さらに０．００５〜０．２５質量％、さらになお０．０１〜０．１質量％とするのが好ましい。タブレット等の食品錠剤及び／またはカプセル剤の場合では、ＰＰＡＲ活性化剤等が、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．１〜９５質量％、さらに1〜９０質量％、さらになお５〜５０質量％含有しているものが好ましい。
上記以外の医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合には、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０１〜９５質量％、さらに５〜９０質量％、さらになお１０〜５０質量％とするのが好ましい。
【００３８】
ＰＰＡＲ活性化剤等の投与量（有効摂取量）は、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で一日あたり１〜５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのが好ましい。更に好ましくは５〜３０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、なお好ましくは１０〜２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、１００〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのがさらになお好ましい。
【００３９】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を投与又は摂取することによりＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδを活性化し、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等を促すことができる。従って、そのための方法に本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を使用することができる。投与又は摂取対象としては、それを必要としているヒトまたは動物であれば特に限定されないが、肥満、脂質異常症、脂肪肝、インスリン抵抗性、糖尿病、動脈硬化、心肥大や虚血性心疾患の患者やその予備軍、持久力の低下した者などが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
（製造例１）浜納豆のヘキサン抽出物の調製
浜納豆（（株）鈴木醸造、市販品を購入）２０ｇを細かく砕き、ヘキサン１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し、０．１２ｇの抽出物を得た。次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４１】
（製造例２）陽江トウチのヘキサン抽出物の調製
陽江トウチ（広東省、食品進出口集団公司、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、ヘキサン１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し、１．４ｇの抽出物を得た。次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４２】
（比較製造例１）浜納豆の水抽出物の調製
浜納豆（（株）鈴木醸造、市販品を購入）２０ｇを細かく砕き、水１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、７．８９ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例２）陽江トウチの水抽出物の調製
陽江トウチ（広東省、食品進出口集団公司、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、水１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、９．２６ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例３）大豆のヘキサン抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇにヘキサン５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し０．１０ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例４）大豆の水抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇに水５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、０．６８ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４３】
製造例１〜２及び比較製造例１〜４の抽出物を以下の実施例１〜３の被検物質として用いた。
【００４４】
実施例１：ＰＰＡＲα活性化試験
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲαリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_001001928, nt183-1586、配列番号１）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを得た。本ベクターは細胞に導入するとＰＰＡＲαリガンド結合部位とＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位の融合蛋白質を発現し、当該融合蛋白質はＰＰＡＲαリガンドと結合することによりＧＡＬ４結合配列に結合し、その下流の遺伝子の転写を活性化するものである。また本ベクターには別途ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、ベクターの導入効率を求めることができる。
アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ-１を２４穴プレートにまき、ＤＭＥＭ（５％ チャコール処理ウシ胎児血清）中で１日培養した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列を含むレポータープラスミド(ｐＧ５−Ｌｕｃ；Promega)、およびｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを同時に各々０．２μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（Superfect transfection reagent；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて導入した。その後、培養液を、被験物質を０．００５％（ｗ／ｖ）含むＤＭＥＭ（-ウシ胎児血清）培地に交換し、さらに１日培養した。被験物質としては、製造例１〜２、ならびに比較製造例１〜４で得た抽出物を用い、対照（Control）として同量の溶媒（エタノール）を用いた。陽性対照として、Ｗｙ１４６４３（BIOMOL （Plymouth Meeting DA）より入手したもの）１０μＭを用いた。
ＰＢＳにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。
本実験系でＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を測定することにより、ＰＰＡＲα活性化物質の探索を行った。尚、ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００４５】
ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００４６】
各被験物質によるＰＰＡＲα活性化能を図１に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲα依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００４７】
図１より、大豆のAspergillus属菌発酵物である浜納豆やトウチのヘキサン抽出物にＰＰＡＲα活性化能があることがわかる。また、大豆の抽出物には活性がなく、Aspergillus属菌による発酵が必要であることがわかる。
【００４８】
実施例２：ＰＰＡＲδ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲδ活性化試験を行なった。
Ｒａｔ ＩＥＣ−６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲδリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_011145, nt690-1595、配列番号２）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＰＰＡＲδ活性化物質の探索を行った。陽性対照としては、ＧＷ５０１５１６（ALEXIS BIOCHEMICALS）１ｎＭを用いた。ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００４９】
ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５０】
各被験物質によるＰＰＡＲδ活性化能を図２に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲδ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５１】
図２より、大豆Aspergillus属菌発酵物である浜納豆やトウチのヘキサン抽出物にＰＰＡＲδ活性化能があることがわかる。
【００５２】
実施例３：ＰＰＡＲγ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲγ活性化試験を行なった。
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲγ２リガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_015869, nt703-1606、配列番号３）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＰＰＡＲγ活性化物質の探索を行った。陽性対照としては、ピオグリタゾン（CAYMAN）１０μＭを用いた。ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００５３】
ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５４】
各被験物質によるＰＰＡＲγ活性化能を図３に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲγ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５５】
図３より、大豆Aspergillus属菌発酵物である浜納豆やトウチのヘキサン抽出物にＰＰＡＲγ活性化能があることがわかる。
【００５６】
以上のように、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに対する活性化作用を有することがわかる。すなわち、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上に対する活性化剤として用いることができる。
更に、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、又はＰＰＡＲγ活性化作用を有するので、前述のとおり、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、脂肪細胞分化促進、脂質異常症の予防・改善、肥満の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等に有効であると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等に有効なペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator Activated Receptor、ＰＰＡＲと記載する）活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドなどの低分子脂溶性リガンドはリガンド特異的な核内受容体を介して、個体発生における形態形成、細胞の増殖、分化、生体の恒常性の維持など多様な生理機能の調節に関与している。ＰＰＡＲは核内受容体の１種であり、１９９０年に脂肪分解に関与する細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を仲介する蛋白として同定され、ペルオキシソーム増殖剤により活性化を受けるレセプターという意味でPeroxisome Proliferator Activated Receptorα（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体：ＰＰＡＲα）と名付けられた。その後α型と構造上類似したアイソフォーム遺伝子としてδ型及びγ型が同定され、合計３つのサブタイプから成ることが知られている。
【０００３】
ＰＰＡＲの各サブタイプはリガンド依存的に活性化され、９−シスレチノイン酸をリガンドとするＲＸＲ（Retinoid X Receptor）とヘテロ２量体を形成することで、プロモーター領域にＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＡＲ responsivelement；ＰＰＲＥ）を有する種々の遺伝子の発現を制御している（非特許文献１及び２）。
例えば、脂肪酸β酸化の鍵酵素として知られるＡＣＯ（Acyl-CoA oxidase）のＰＰＲＥを用いたレポーターアッセイがなされており、それによると、ＰＰＡＲリガンドとして知られるリノール酸は、ＰＰＡＲα、δ、γのそれぞれを介してＡＣＯ転写活性を亢進することが報告されている（非特許文献３）。
以下で述べるように、近年、ＰＰＡＲは非常に多くの生理、病理現象に関わっていることが明らかになってきた。
【０００４】
具体的には、ＰＰＡＲαの機能は脂肪酸の合成・輸送・分泌、脂肪消費臓器におけるＡＴＰ産生等幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。特に脂肪酸代謝に重要なβ酸化関連酵素 （ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲαの活性化に強く依存していることが明らかになっている。ＰＰＡＲαは肝臓、心臓、腎臓等での発現が高く、ＰＰＡＲα活性化剤はこれらの臓器の脂質代謝の活性化に有効であると広く認識されている。
【０００５】
ＰＰＡＲαの活性化に伴う脂肪酸代謝の活性化は、肝臓脂肪の分解、脂肪肝の改善、内臓脂肪や皮下脂肪等の体脂肪の分解・燃焼の促進、肥満の抑制につながると考えられる。ＰＰＡＲα活性化剤として知られるフィブラート系の薬剤は、脂肪酸燃焼の促進作用、ＨＤＬコレステロール増加作用、そして最近ではアディポネクチン受容体発現増加作用等を持つことが明らかとなってきており、インスリン非依存性糖尿病の高血糖症、脂質異常症、高血糖症、アテローム性動脈硬化症等の治療薬として広く用いられている（非特許文献４、特許文献１及び２）。また、ＰＰＡＲα活性化剤が心肥大や虚血性心疾患に効果があることが報告されている（非特許文献５、６）。
【０００６】
従って、ＰＰＡＲα活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効であると考えられており、近年、ＰＰＡＲα活性化剤の探索、開発も盛んに行われている（特許文献３〜５）。
【０００７】
ＰＰＡＲδ（別名：ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ１、ＦＡＡＲ）は１９９２年にクローニングされて以来、長らく機能が明らかにされていなかったが、近年、遺伝子改変動物を用いた研究やＰＰＡＲδ選択的な作動薬の開発などにより様々な生理機能を持つことが明らかになってきた。ＰＰＡＲδを過剰発現させたマウスを用いた検討では、高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制が認められている（非特許文献７）。ＰＰＡＲδ選択的な作動薬であるＧＷ５０１５１６を肥満アカゲザルに投与した実験では、ＨＤＬコレステロールを上昇させ、中性脂肪、ＬＤＬコレステロールを低下させた（非特許文献８）。
【０００８】
また、ＧＷ５０１５１６を骨格筋由来細胞に作用させ、細胞の遺伝子発現への影響を検討した結果では、脂肪酸の取り込みや輸送、ミトコンドリアのβ酸化系酵素、脱共役タンパク質等の脂肪酸代謝関連遺伝子の発現を誘導することが示されている。さらにＧＷ５０１５１６を投与したマウスにおいては、脂肪組織特異的ＰＰＡＲδ過剰発現マウスと同様に高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少が認められ、インスリン抵抗性改善効果を示すことも明らかにされている。このマウスの骨格筋においては脂肪酸代謝関連遺伝子および脂肪酸β酸化の誘導が確認されていることから、ＰＰＡＲδの活性化によって、骨格筋のエネルギー消費が増大することにより末梢組織中の脂肪蓄積が抑制され、それによりインスリン抵抗性が改善されるのではないかと考えられている（非特許文献９）。また、遺伝的肥満マウスにＧＷ５０１５１６を投与することにより、膵島の肥大が抑制されたことから、膵島の保護作用があると考えられている（非特許文献９）。
【０００９】
また、骨格筋特異的にＰＰＡＲδを過剰発現することにより、肥満やインスリン抵抗性が抑制されることが報告されている。さらに驚くことに、このマウスの骨格筋では一般的に赤筋と呼ばれるミトコンドリアを多く含む持久性の高い筋繊維の割合が非常に高くなっており、その結果、このマウスは、コントロールマウスの約２倍の距離を走ることができるという大変優れた持久力を持つマウスであることが示されている（非特許文献１０）。従って、ＰＰＡＲδの活性化は、運動持久力の向上に有効であると考えられるようになった。
【００１０】
また最近では、肝臓においてＰＰＡＲδがインスリン感受性を制御しているという報告もなされており、そのメカニズムとして、ＰＰＡＲδの活性化が肝臓の解糖系およびペントースリン酸回路の活性化を介して肝臓からのグルコースの供給を減少させ、インスリン感受性を増加することが示唆されている（非特許文献１１）。
【００１１】
このように、ＰＰＡＲδの活性化は、ＨＤＬコレステロールの上昇、ＬＤＬコレステロールの低下、肥満の抑制、インスリン抵抗性の改善／インスリン感受性の向上、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制、持久力の向上等につながる事から、ＰＰＡＲδの活性化剤は、動脈硬化の予防・改善剤、肥満の予防・改善剤、インスリン抵抗性の予防・改善剤、脂肪酸酸化活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、持久力向上剤として有効であると考えられている。
そのため、このような目的でＰＰＡＲδ活性化剤の探索、開発も盛んに行われ、これまでにフラボン類、フェノキシ酢酸誘導体等が報告されている（特許文献６及び７）。
【００１２】
ＰＰＡＲγは栄養が十分にある状態でエネルギー貯蔵に作用し、いわゆる倹約遺伝子として働く分子である。特にＰＰＡＲγ２は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。ＰＰＡＲγのリガンドとして知られるチアゾリジン誘導体は脂肪細胞分化を強力に誘導することにより、脂肪細胞を小型化してインスリン感受性を高めることが知られており、インスリン抵抗性改善剤、糖尿病治療薬として広く使用されている（非特許文献１２）。
【００１３】
このように、ＰＰＡＲ活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善などに広く有効であり、いわゆる生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）の予防・改善にも有効であると考えられる。
【００１４】
トウチは、大豆をコウジ菌（Aspergillus属菌）等で発酵させて製造される中国の伝統的な大豆発酵食品である。同様の発酵食品に日本で食される浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆等がある。トウチの水抽出物が、αグルコシダーゼ阻害活性を有し、それによって、炭水化物の分解を抑制、又はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）の血漿濃度を増加させ、さらに血糖コントロール、満腹感の改善、胃内容排出の遅延、メタボリック症候群の軽減、血中脂質、炎症、血栓因子、血圧及び腹部肥満の低下、インスリン感受性若しくはインスリン抵抗性の改善、肝臓内での脂肪の蓄積制御、持久力向上等に有用であることが知られている（特許文献８）。
【００１５】
しかしながら、トウチや浜納豆のような大豆発酵食品がＰＰＡＲ活性化に関与し、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進等に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表2002-502869号公報
【特許文献２】特表2002-533410号公報
【特許文献３】特開2001-354558号公報
【特許文献４】特開2002-80362号公報
【特許文献５】特開2003-34636号公報
【特許文献６】特開2007-119429号公報
【特許文献７】特表2007-536343号公報
【特許文献８】特表2009-538342号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】細胞:31(6)218-234, 1999
【非特許文献２】J Lipid Res. 37, 907-925, 1996
【非特許文献３】J Biol Chem. 274, 23368-23377, 1999
【非特許文献４】Curr Opin Lipidol. 10, 151-159, 1999
【非特許文献５】Endcrinology 144, 4187-4194, 2003
【非特許文献６】Circulation 108, 2393-2399, 2003
【非特許文献７】Cell. 113, 159-170, 2003
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5306-5311, 2001
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 15924-15929, 2003
【非特許文献１０】PloS Biol. 2, e294, 2004
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 3444-3449, 2006
【非特許文献１２】Diabetes. 49, 759-767, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、且つ安全性の高い食品、医薬品又は医薬部外品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、食経験が豊富な天然物素材の中から、トウチや浜納豆のような大豆のAspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに対する活性化作用があり、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等の効果を発揮する食品、医薬品又は医薬部外品の有効成分として配合する素材として有用であることを見出した。
【００２０】
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
〔１〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
〔２〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
〔３〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
〔４〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤。
〔５〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする肥満予防・改善剤。
〔６〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
〔７〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
〔８〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂質異常症予防・改善剤。
〔９〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪肝予防・改善剤。
〔１０〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする動脈硬化予防・改善剤。
〔１１〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
〔１２〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする心肥大の予防・改善剤。
〔１３〕大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする虚血性心疾患の予防・改善剤。
〔１４〕大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、かつ長期間摂取しても安全性も高いことから、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等の効果を発揮する飲食品、医薬品又は医薬部外品に有効成分として配合する素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＰＡＲα活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＷｙはＷｙ14643を示す。*は溶媒対照に対する有意差Ｐ＜０．０５を示す。
【図２】ＰＰＡＲδ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＧＷはＧＷ501516を示す。*は溶媒対照に対する有意差Ｐ＜０．０５を示す。
【図３】ＰＰＡＲγ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、Ｐｉｏはピオグリタゾンを示す。*は溶媒対照に対する有意差Ｐ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明において、大豆Aspergillus属菌発酵物とは、大豆をAspergillus属菌で発酵させたものの総称であり、例えば、中国の伝統的な大豆発酵食品であるトウチ及び日本の伝統的な大豆発酵食品である浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆などが挙げられる。大豆Aspergillus属菌発酵物は、例えば、下記に記載されている手順に従って大豆をAspergillus属菌を用いて発酵させることにより製造してもよく、あるいは市販の大豆Aspergillus属菌発酵物、例えば、トウチや浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆などを購入してもよい。
【００２４】
ここで、Aspergillus属菌としては、トウチや浜納豆、寺納豆、大黒寺納豆などの製造に一般的に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、Aspergillus oryzae、Aspergillus egypticusなどを用いることができる。
【００２５】
本発明において、大豆とは、マメ科（Fabaceae）ダイズ属（Glycine）の一年草であるダイズの種子をいう。原料とする大豆は、食用、加工食品の原料用に用いられるものであれば、品種や産地はいずれのものでもよいが、黒大豆が好ましい。
【００２６】
大豆は通常のトウチや浜納豆などの製造法と同様に、水への浸漬、及び水又は水蒸気と共に加熱処理をおこなっておくことが好ましい。また、大豆は脱皮処理を行い、原料中に大豆の外皮が残存しないことが望ましい。脱皮は、原料大豆に脱皮大豆を用いることでおこなっても、浸漬又は加熱処理後に行ってもよい。
大豆の水への浸漬の時間は特に限定されないが、通常、３０分〜１２時間であり、好ましくは、２〜６時間である。
また、大豆の加熱処理時間は特に限定されないが、通常、煮沸処理の場合３０〜９０分であり、好ましくは、３０〜６０分である。
【００２７】
次いで、この大豆をAspergillus属菌とともに発酵させる。発酵のために大豆に添加されるAspergillus属菌の量は特に限定されないが、加熱処理後に冷却した大豆に対し、通常０．１〜３．０質量％、好ましくは０．２〜０．５質量％の種菌を接種する。好ましくは、Aspergillus属菌は、培養物（例えば、麹）の状態で大豆に添加される。
発酵時の温度は特に限定されないが、２８〜３５℃とするのが好ましく２８〜３０℃とするのがより好ましい。発酵時の湿度は、６０％〜９９％であるのが好ましく、８０〜９８％であるのがより好ましい。
発酵時間は、温度、Aspergillus属菌の接種量などにより異なるが、２４時間〜６ヶ月間とするのが好ましく、４８時間〜１ヶ月間とするのがより好ましい。
【００２８】
上述の条件で、発酵を行うことにより本発明の大豆Aspergillus属菌発酵物を得ることができる。当該大豆Aspergillus属菌発酵物は、そのまま又は乾燥して抽出に用いることができる。
【００２９】
本発明で用いる大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、大豆Aspergillus属菌発酵物より疎水性溶媒を用いて常温（０〜３０℃）又は加温下で抽出することにより得られるものである。
大豆Aspergillus属菌発酵物１質量部に対して、１／２〜１０質量部の疎水性溶媒を用いるのが好ましく、このときの抽出温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、また抽出時間は１／１０〜１２時間が好ましく、１／２〜５時間がより好ましい。
当該抽出としては、固液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができ、好ましくは攪拌を伴う固液抽出である。
【００３０】
斯くして得られる抽出物は、溶媒を除去した後そのまま使用できるが、公知の分離精製手段、例えば、活性炭処理、液々分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲルろ過、精密蒸留等を行った後、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製してもよい。
当該疎水性有機溶媒としては、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、石油エーテル、ベンゼン、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン（本明細書中ではヘキサンともいう）等が挙げられ、２種以上組み合わせてもよく、好ましくはｎ−ヘキサンである。
【００３１】
後記実施例に示すように、大豆をAspergillus属菌で発酵させて得られた発酵物を疎水性有機溶媒で抽出することにより調製された大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに依存的な遺伝子の転写活性を亢進する作用を有する。前述のとおり、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγは、広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わっており、特に脂質代謝に重要なβ酸化関連酵素（ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδの活性化に強く依存しており（非特許文献１〜１０、特許文献１〜７）、またＰＰＡＲγのリガンドによる脂肪細胞分化誘導によってインスリン抵抗性や糖尿病が改善できることが知られていることから（非特許文献１２）、大豆のAspergillus属菌発酵物又はその抽出物は、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効である。
【００３２】
従って、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに対する活性化作用を有するので、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上に対する活性化剤、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂肪細胞分化促進剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、糖尿病予防・改善剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、動脈硬化予防・改善剤、持久力向上剤、心肥大の予防・改善剤、虚血性心疾患の予防・改善剤、等（以下、「ＰＰＡＲ活性化剤等」とする。）として使用することができ、ＰＰＡＲ活性化剤等の製造のために使用することができる。ＰＰＡＲ活性化剤等は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ若しくはＰＰＡＲγ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品の有効成分として使用可能である。また、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ若しくはＰＰＡＲγ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００３３】
さらに、本発明によれば、大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによる、ＰＰＡＲ活性化剤の製造方法が提供される。好ましくは、当該ＰＰＡＲ活性化剤は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上に対する活性化剤である。さらに本発明によれば、大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによる、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂肪細胞分化促進剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、糖尿病予防・改善剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、動脈硬化予防・改善剤、持久力向上剤、心肥大の予防・改善剤、虚血性心疾患の予防・改善剤等の製造方法が提供される。
【００３４】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を医薬品、医薬部外品の有効成分として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。
また、このような種々の剤型の製剤を調製するには、本発明の大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口用液体製剤を調製する場合は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により製造することができる。
【００３５】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を化粧品の有効成分として用いる場合には、皮膚外用剤、洗浄剤、入浴剤、又はメイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、これらを、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末剤、パック、パップ剤、顆粒剤、ファンデーション、口紅、シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧品を調製するには、本発明の大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を単独で、又は化粧料に配合される、外用基材、油又は油状物質、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類、キレート類、無機酸、有機酸、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３６】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を食品の有効成分として用いる場合の形態としては、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料、スープ類等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
飲料は、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、ニアウオーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等が挙げられる。また、飲料は、容器に充填した容器詰飲料とすることができる。
食用油としては、調理用油、調味料、マヨネーズ、ドレッシング、マーガリン等の油脂加工品類、パスタソース類等が挙げられる。
また、このような種々の形態の食品を調製するには、本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ若しくはＰＰＡＲγの活性化用食品、脂肪酸代謝活性化用食品、体脂肪燃焼促進用食品、脂肪細胞分化促進用食品、肥満予防・改善用食品、インスリン抵抗性予防・改善用食品、糖尿病予防・改善用食品、脂質異常症予防・改善用食品、脂肪肝予防・改善用食品、動脈硬化予防・改善用食品、持久力向上用食品、心肥大の予防・改善用食品、虚血性心疾患の予防・改善用食品、ペットフード等として用いることが可能である。
【００３７】
これらのものに対するＰＰＡＲ活性化剤等の配合量はその使用形態により異なるが、食品の形態では、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０００１〜１０質量％、さらに０．００１〜５質量％、さらになお０．００２〜２質量％とするのが好ましい。
例えば飲料の場合では、飲料中にＰＰＡＲ活性化剤等は、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．００１〜０．５質量％、さらに０．００５〜０．２５質量％、さらになお０．０１〜０．１質量％とするのが好ましい。タブレット等の食品錠剤及び／またはカプセル剤の場合では、ＰＰＡＲ活性化剤等が、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．１〜９５質量％、さらに1〜９０質量％、さらになお５〜５０質量％含有しているものが好ましい。
上記以外の医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合には、全組成中、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０１〜９５質量％、さらに５〜９０質量％、さらになお１０〜５０質量％とするのが好ましい。
【００３８】
ＰＰＡＲ活性化剤等の投与量（有効摂取量）は、大豆Aspergillus属菌発酵物抽出物の乾燥物換算で一日あたり１〜５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのが好ましい。更に好ましくは５〜３０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、なお好ましくは１０〜２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、１００〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのがさらになお好ましい。
【００３９】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を投与又は摂取することによりＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδを活性化し、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪細胞分化促進、肥満予防・改善、インスリン抵抗性予防・改善、糖尿病予防・改善、脂質異常症予防・改善、脂肪肝予防・改善、動脈硬化予防・改善、持久力向上、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等を促すことができる。従って、そのための方法に本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を使用することができる。投与又は摂取対象としては、それを必要としているヒトまたは動物であれば特に限定されないが、肥満、脂質異常症、脂肪肝、インスリン抵抗性、糖尿病、動脈硬化、心肥大や虚血性心疾患の患者やその予備軍、持久力の低下した者などが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
（製造例１）浜納豆のヘキサン抽出物の調製
浜納豆（（株）鈴木醸造、市販品を購入）２０ｇを細かく砕き、ヘキサン１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し、０．１２ｇの抽出物を得た。次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４１】
（製造例２）陽江トウチのヘキサン抽出物の調製
陽江トウチ（広東省、食品進出口集団公司、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、ヘキサン１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し、１．４ｇの抽出物を得た。次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４２】
（比較製造例１）浜納豆の水抽出物の調製
浜納豆（（株）鈴木醸造、市販品を購入）２０ｇを細かく砕き、水１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、７．８９ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例２）陽江トウチの水抽出物の調製
陽江トウチ（広東省、食品進出口集団公司、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、水１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、９．２６ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例３）大豆のヘキサン抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇにヘキサン５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し０．１０ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例４）大豆の水抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇに水５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、０．６８ｇの抽出物を得た。得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４３】
製造例１〜２及び比較製造例１〜４の抽出物を以下の実施例１〜３の被検物質として用いた。
【００４４】
実施例１：ＰＰＡＲα活性化試験
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲαリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_001001928, nt183-1586、配列番号１）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを得た。本ベクターは細胞に導入するとＰＰＡＲαリガンド結合部位とＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位の融合蛋白質を発現し、当該融合蛋白質はＰＰＡＲαリガンドと結合することによりＧＡＬ４結合配列に結合し、その下流の遺伝子の転写を活性化するものである。また本ベクターには別途ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、ベクターの導入効率を求めることができる。
アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ-１を２４穴プレートにまき、ＤＭＥＭ（５％ チャコール処理ウシ胎児血清）中で１日培養した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列を含むレポータープラスミド(ｐＧ５−Ｌｕｃ；Promega)、およびｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを同時に各々０．２μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（Superfect transfection reagent；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて導入した。その後、培養液を、被験物質を０．００５％（ｗ／ｖ）含むＤＭＥＭ（-ウシ胎児血清）培地に交換し、さらに１日培養した。被験物質としては、製造例１〜２、ならびに比較製造例１〜４で得た抽出物を用い、対照（Control）として同量の溶媒（エタノール）を用いた。陽性対照として、Ｗｙ１４６４３（BIOMOL （Plymouth Meeting DA）より入手したもの）１０μＭを用いた。
ＰＢＳにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。
本実験系でＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を測定することにより、ＰＰＡＲα活性化物質の探索を行った。尚、ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００４５】
ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００４６】
各被験物質によるＰＰＡＲα活性化能を図１に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲα依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００４７】
図１より、大豆のAspergillus属菌発酵物である浜納豆やトウチのヘキサン抽出物にＰＰＡＲα活性化能があることがわかる。また、大豆の抽出物には活性がなく、Aspergillus属菌による発酵が必要であることがわかる。
【００４８】
実施例２：ＰＰＡＲδ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲδ活性化試験を行なった。
Ｒａｔ ＩＥＣ−６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲδリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_011145, nt690-1595、配列番号２）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＰＰＡＲδ活性化物質の探索を行った。陽性対照としては、ＧＷ５０１５１６（ALEXIS BIOCHEMICALS）１ｎＭを用いた。ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００４９】
ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５０】
各被験物質によるＰＰＡＲδ活性化能を図２に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲδ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５１】
図２より、大豆Aspergillus属菌発酵物である浜納豆やトウチのヘキサン抽出物にＰＰＡＲδ活性化能があることがわかる。
【００５２】
実施例３：ＰＰＡＲγ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲγ活性化試験を行なった。
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲγ２リガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_015869, nt703-1606、配列番号３）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＰＰＡＲγ活性化物質の探索を行った。陽性対照としては、ピオグリタゾン（CAYMAN）１０μＭを用いた。ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００５３】
ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５４】
各被験物質によるＰＰＡＲγ活性化能を図３に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲγ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５５】
図３より、大豆Aspergillus属菌発酵物である浜納豆やトウチのヘキサン抽出物にＰＰＡＲγ活性化能があることがわかる。
【００５６】
以上のように、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγに対する活性化作用を有することがわかる。すなわち、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上に対する活性化剤として用いることができる。
更に、大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、又はＰＰＡＲγ活性化作用を有するので、前述のとおり、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、脂肪細胞分化促進、脂質異常症の予防・改善、肥満の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大の予防・改善、虚血性心疾患の予防・改善等に有効であると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項２】
ＰＰＡＲがＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上である請求項１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項３】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
【請求項４】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
【請求項５】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤。
【請求項６】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする肥満予防・改善剤。
【請求項７】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
【請求項８】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
【請求項９】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂質異常症予防・改善剤。
【請求項１０】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪肝予防・改善剤。
【請求項１１】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする動脈硬化予防・改善剤。
【請求項１２】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
【請求項１３】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする心肥大の予防・改善剤。
【請求項１４】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする虚血性心疾患の予防・改善剤。
【請求項１５】
大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
【請求項１】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項２】
ＰＰＡＲがＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγのいずれか１以上である請求項１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項３】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
【請求項４】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
【請求項５】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤。
【請求項６】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする肥満予防・改善剤。
【請求項７】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
【請求項８】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
【請求項９】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂質異常症予防・改善剤。
【請求項１０】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする脂肪肝予防・改善剤。
【請求項１１】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする動脈硬化予防・改善剤。
【請求項１２】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
【請求項１３】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする心肥大の予防・改善剤。
【請求項１４】
大豆Aspergillus属菌発酵物の疎水性溶媒抽出物を有効成分とする虚血性心疾患の予防・改善剤。
【請求項１５】
大豆をAspergillus属菌で発酵させ、得られた発酵物から疎水性有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１７１９２３（Ｐ２０１２−１７１９２３Ａ）
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３５６９７（Ｐ２０１１−３５６９７）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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