Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新しい突然変異菌株及びその変異株、その生産方法及びアルギネート生産におけるその使用
【課題】規定された構造及び所望の分子量を有する高品質なアルギネート、特に多量の生物学的に活性なアルギネートを多量に生産する安定な源の提供。
【解決手段】培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株中において、アルギネート生合成オペロンが、天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導可能なプロモーターにより調節され、そして任意に１つ以上のエフェクター遺伝子を含む、前記突然変異菌株。
【解決手段】培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株中において、アルギネート生合成オペロンが、天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導可能なプロモーターにより調節され、そして任意に１つ以上のエフェクター遺伝子を含む、前記突然変異菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多量のアルギネートを生産できるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新しい突然変異菌株及びその変異株に関する。アルギネートは、多量に生産されるばかりか、或る確定した含量のマンヌロネート及びグルロネート残基、アルギネート中のアセチル基の可能な存在及び確定したレベル及びアルギネートの所望の分子量で生産される。また、アルギネート生産の調節による高収率の突然変異体が記述される。本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新しい突然変異菌株及びその変異株を生産する方法、並びにアルギネート生産における得られた菌株の
使用をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの微生物がアルギネートを生産することは周知であり、最も研究されている
細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。しかし、それが栄養物または薬品に使用するためにアルギネートの生産に使用されるとき、使用が制限される。それは、それが哺乳動物またはヒトにおいて一次及び二次の感染を伴うからである。より安全な源であるかもしれない他の種は、顕著な量のアルギネート、または充分な分子量のアルギネートを通常生産せず、この理由で使用することができない。
【０００３】
Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓの非病原種例えばＰ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓが、アセチル化アルギネートに似たエキソ多糖類を生産することは周知である（非特許文献１）。また非特許文献２は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＰ．ｐｕｔｉｄａからのアルギネートの生産を記載している。しかし、これらの菌株のなかでアルギネートの安定なしかも過剰に生産する菌は知られていない。
【０００４】
特許文献１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａの新規な菌株を使用する多糖類の生産を記載している。菌株は、所望の多糖類を良好な収率で生産し、そして連続発酵に比較的安定である。菌株は、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａの野生型培養をカルベニシリンと接触させ、そして突然変異誘発因子により選択された抵抗ムコイドクローンを突然変異誘発することにより生産される。最も安定で従って最も好ましいのは、ＮＣＩＢ １１６８７として寄託されている。高濃度すなわち約２０ｇ／Ｌのアルギネートが、最小のグルコース培地での窒素限定連続培養で得られた。アルギネートリアーゼ活性は、培養に存在し、そしてプリンティンググレードのアルギネートと同様のレオロジーを有する低分子量かつ低粘度のポリマーを生じた。リアーゼ酵素による劣化は、培地への蛋白溶解酵素の添加により修復された（非特許文献３）。連続培養の１０世代後、非ムコイド変異株が生じた（非特許文献４）。
【０００５】
日和見病原菌Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのエピメラーゼマイナス突然変異体は、非特許文献５に報告されている。ムコイドＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＦＲＤ１は、化学的に突然変異誘発され、そしてアルギネート中にグルロン酸（Ｇ）残基を組み込むことのできない突然変異体が独立して単離された。Ｇ特異性アルギネートリアーゼ及び１Ｈ核磁気共鳴分析は、Ｇ残基がこれらの突然変異体により分泌されるアルギネートに存在しなかったことを示した。非特許文献５は、１．７ｇ／ＬのアルギネートをＦＲＤ１から振盪フラスコ中で生産した。自発的アルギネート生産菌において普通生ずるように、非ムコイド復帰突然変異体がしばしば生ずる（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許４４９０４６７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｏｖａｎ Ｊ．Ｒ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８１），１２５，ｐ．２１７−２２０
【非特許文献２】Ｃｏｎｔｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），１４０，ｐ．１１２５−１１３２
【非特許文献３】Ｈａｃｋｉｎｇ Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９，ｐ．３４７３−３４８０
【非特許文献４】Ｓｅｎｇｈａ Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３５，ｐ．７９５−８０４，ｐａｇｅ ７９９，ｓｅｃｏｎｄ ｐａｒａｇｒａｐｈ
【非特許文献５】Ｃｈｉｔｎｉｓ ｅｔ．ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，ｐ．２８９４−２９００
【非特許文献６】Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｏｈｍａｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，ｐ．１５９３−１６０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、多量に信頼できるアルギネートを生産できる好適な源が、市場において求められている。特に、規定された構造及び所望の分子量を有する高品質なアルギネートを多量に生産する安定な源が求められ、特に多量の生物学的に活性なアルギネートを生産する源が求められている。その上、また予定されたグルロネート残基（Ｇ）含量を有するアルギネートを得るために、ｉｎ ｖｉｔｒｏエピマー化されうる純粋なマンヌロナンを生産することも求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、安定でありしかも多量のアルギネートを生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新規な突然変異菌株を提供する。本発明のいくつかの態様は、その変異株を提供し、それらは、マンヌロネート及びグルロネートの残基の含量に関して規定された構造、Ｏ−アセチル基の可能な存在及び確定したレベル並びにアルギネート分子の所望の分子量を有するアルギネートを生産する。また、調節されたアルギネート生産を伴う高収率の突然変異体及びそれらを生産する方法が記述される。本発明の他の構成は、以下の通りである。その変異株を含むＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新規な突然変異菌株、並びにアルギネートの生産における得られた突然変異体の使用、特にアルギネートの中間スケールまたは大規模な発酵生産そしてさらに特に生物学的に活性なアルギネートまたは純粋なマンヌロナンの生産。得られるアルギネートは、種々の食品及び工業用製品、例えば栄養物、動物飼料、化粧品及び薬品に応用可能であり、それらはまた例えば米国特許５９３９２８９のエピメラーゼにより、マンヌロナン−Ｃ５エピメラーゼによるさらなる改変に好適な中間体を構成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】自殺ベクターｐＨＥ５５及びｐＭＧ４８の制限エンドヌクレアーゼマップ。表１参照。ユニーク制限酵素部位のみが示される。
【図２】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＮＣＩＭＢ １０５２５の突然変異菌株による発酵における成長及びアルギネートの生産。
【図３】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ突然変異菌株Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８により生産されるアルギネートの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。他のエピメラーゼマイナス突然変異体（表３）からのマンヌロナンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｐｆ２０１１８に関するものと同じであった。
【図４】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのアルギネート生合成オペロン及び上流開放読み枠が示される。クローンされたフラグメントは、マップラインの箱としてマークされている。クローニングについて使用される制限部位のみが示される。全長は１８ｋｂである。
【図５】プラスミドｐＭＣ１の制限エンドヌクレアーゼのマップ。ユニーク制限酵素のみが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養を提供し、該菌株は多量のアルギネートを生産する。本発明の第一の構成では、該菌株は、培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産する。好ましい態様では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養は、培地１Ｌあたり４０−５５ｇの炭素源あたりそしてさらに好ましくは培地１Ｌあたり５０−５５ｇの炭素源あたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し、そして最も好ましくはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養は、培地１Ｌあたり４０ｇの炭素源あたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産する。
【００１２】
本発明により包含されるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細菌の純粋な突然変異菌株及びその変異株は、突然変異菌株Ｐｆ２０１、Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８、Ｐｆ２０１３７、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△、Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒ及びＰｆ２０１ＭＣからなる群から選ばれる突然変異菌株により例示される。いくつかの態様では、本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの菌株の生物学的に純粋な細菌培養に関し、その菌株は、Ｐｆ２０１のアルギネート生産特徴及びこれらの特徴を保持するその変異株によりアルギネートを生産する。この「アルギネート生産特徴」は、以下の１つ以上である。アルギネートｇ／培地（ｇ／Ｌ）及びアルギネートｇ／炭素源ｇ（ｇ／炭素源ｇ）による収量、平均分子質量、アセチル化度及び生産されたアルギネートのＧ−含量。
【００１３】
第二の構成では、本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株に関し、該突然変異体は、マンヌロネート残基のみからなるアルギネートを多量に生産できる。好ましい変異株は、Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８及びＰｆ２０１３７から選択される。
【００１４】
第三の構成では、本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株に関し、該突然変異体は、０−３０％の規定されたグルロネート残基（Ｇ）含量を有するアルギネートを多量に生産できる。これらの態様は、野生型ａｌｇＧ遺伝子を突然変異体遺伝子により交換することにより、またはａｌｇＧ遺伝子を交替して野生型酵素より低い特異的活性を有するマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ酵素をエンコードすることにより、本発明の方法によって生成できる。
【００１５】
本発明の第四の構成では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株は、減少した数のＯ−アセチル基を有するかまたは有しないアルギネートを多量に生産できる。これらの態様は、遺伝子ａｌｇＩ、ａｌｇＪ及び／またはａｌｇＦの一部または全部を欠失することにより生成できる。突然変異菌株Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇＦ△は、減少した数のＯ−アセチル基を有するかまたは有しないアルギネートを多量に生産でき、そして本発明のこの構成の好ましい態様を示す。
【００１６】
本発明の第五の構成では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株は、所望の分子量を有するアルギネートを多量に生産できる。アルギネートの分子量は、好ましくは５００００−３００００００ダルトンである。これらの態様は、野生型リアーゼ酵素より低い特異的活性を有するアルギネートリアーゼ酵素をエンコードする突然変異体遺伝子により野生型ａｌｇＬを交換することによって生成できる。純粋な突然変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒは、該突然変異体の好ましい態様を示し、それは所望の高分子量を有するアルギネートを多量に生産できる。
【００１７】
本発明の第六の構成では、アルギネートを多量に生産できるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株は、天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導プロモーターにより調節されるアルギネート生合成オペロン、並びに所望により１つ以上のエフェクター遺伝子からなる。誘導プロモーターは、好ましくはＰｍプロモーターであり、そしてエフェクター遺伝子はｘｙｌＳである。１つの好ましい態様によれば、該突然変異菌株は、Ｐｆ２０１ＭＣである。
【００１８】
本発明の第七の構成は、本発明のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新規な突然変異菌株を生産する方法を提供し、それは
（ａ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓの野生型菌株を突然変異誘発因子と接触させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の処理された細菌を１つ以上の抗生物質の存在下成長させ、そして
（ｃ）抗生物質抵抗性ムコイド突然変異体を選択により単離し、そして
（ｄ）工程（ｃ）の単離されたムコイド突然変異体のアルギネート生産性を測定する。
【００１９】
この方法の工程（ａ）の突然変異誘発因子は、好ましくはニトロソグアニジンであり、そして工程（ｂ）で適用される抗生物質は、β−ラクタム及び／またはアミノグリコシド抗生物質であり、好ましくは抗生物質はカルベニシリンである。抗生物質は、８００−１０００μｇ／培地１ｍＬの範囲で、そしてさらに好ましくは９００μｇ／培地１ｍＬの量で存在できる。
【００２０】
なお他の構成では、本発明は、アルギネート生合成オペロンが天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導プロモーターそして所望により１つ以上のエフェクター遺伝子により調節される、アルギネートを多量に生産できるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株を生成する方法であって、
（ｉ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓの野生型菌株のアルギネート生合成オペロンプロモーターを相同的組み換えにより誘導プロモーターと交換し、そして
（ｉｉ）所望のエフェクター遺伝子を、相同的組み換え、トランスポゾン突然変異誘発によりまたはプラスミドによって（ｉ）の細菌中に誘導し、そして
（ｉｉｉ）突然変異体を成長させ、次に選択により単離し、そして
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の単離された突然変異体のアルギネート生産性を測定する。本発明による方法の１つの態様では、誘導プロモーターは、例えば実施例９に例示されるＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｔｏｌ−プラスミドからのＰｍまたは突然変異されたＰｍプロモーターである。
【００２１】
さらに他の構成では、本発明は、請求項８のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株を生成する方法であって、
ａ）Ｃ−５エピメラーゼをエンコードする野生型ａｌｇＧ−遺伝子を、プラスミドまたはミニトランスポゾンにクローンし、そして化学的突然変異誘発によりまたはＰＣＲにより突然変異誘発し、
ｂ）ａｌｇＧ遺伝子（△ａｌｇＧ菌株）を欠くＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのアルギネート生産菌株の誘導体を構築し、そして
ｃ）工程（ａ）の突然変異を誘発されたａｌｇＧのライブラリーをＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの△ａｌｇＧ菌株に転移し、そしてプラスミドまたはトランスポゾン含有菌株をアルギネート生産及びエピメラーゼ活性について同定かつアッセイし、そして
ｄ）０−３０％のグルロン酸残基を含むアルギネートをもたらすエピメラーゼをエンコードする突然変異体ａｌｇＧを含有するプラスミドまたはトランスポゾン含有菌株を、工程（ｃ）のアッセイによって同定し、そして
ｅ）突然変異体ａｌｇＧを遺伝子置換ベクター中にクローンし、そして
ｆ）工程（ｅ）の遺伝子置換ベクターを次に突然変異体ａｌｇＧ遺伝子によりそのａｌｇＧ遺伝子を置換するためにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのアルギネート生産菌株に転移しそしてそれを突然変異遺伝子を発現させうるようにする。
【００２２】
本発明の他の構成は、請求項８のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株を生成する方法に関し、その方法は、
ａ）エピマー化に重要であることを突然変異誘発及び次のスクリーニングにより同定する１つ以上のアミノ酸を、突然変異体及び野生型ＡｌｇＧ蛋白の両者に生ずるものとは異なるアミノ酸へ、遺伝子レベルで部位特異的突然変異誘発により交換し、そして
ｂ）突然変異遺伝子を遺伝子置換ベクター中にクローンし、そしてこのベクターをＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのアルギネート生産菌株に転移して、それが野生型ａｌｇＧ遺伝子を置換しそして発現されうる。
【００２３】
他の構成では、本発明は、アルギネートの生産に関し本明細書で記述されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養の使用、並びに薬品、化粧品、動物飼料または栄養剤、またはｉｎ ｖｉｔｒｏＣ−５エピマー化用の中間体のような工業製品または食品の製造における生産されたアルギネートの使用を提供する。
【００２４】
本発明の突然変異菌株Ｐｆ２０１、Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８、Ｐｆ２０１３７、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△、Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒ及びＰｆ２０１ＭＣは、それぞれ以下の受け付け番号４１１３７、４１１３８、４１１３９、４１１４０、４１１４１、４１１４２、４１１４３、４１１４４及び４１１４５の下、２００２年７月１６日にＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ）に寄託されている。寄託は、ブカレスト条約に従って行われた。
【００２５】
定義
本発明の新規な突然変異菌株及びその変異株は、アルギネートを多量に生産するが、「多量」は、本明細書で使用されるとき、１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを意味する。培地１Ｌあたり１０ｇのアルギネートの量は、好ましくは、培地１Ｌあたり４０−５５ｇの炭素源、さらに好ましくは培地１Ｌあたり５０−５５ｇの炭素源または最も好ましくは培地１Ｌあたり４０ｇの炭素源により達成される。アルギネートの収量は、１Ｌあたり３５ｇのアルギネートに達することができるが、使用される炭素源の約２０−５０重量％の量がさらにしばしば達成される。
【００２６】
好適な「炭素源」は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、アルコール、有機酸から選択されるがこれらに限定されず、そして例えばフルクトース、グルコース、ガラクトース、砂糖、乳糖、グリセロール、澱粉、ホエイ、糖蜜、砂糖シロップ、または乳酸（ラクテート）であるが、標準の教科書例えばＢｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ及びＪｏｈｎ Ｇ．Ｈｏｌｔ編集、１９８４、バルチモア、米国に記載されているような他のＣ源も等しく使用できる。それらが突然変異細菌によるアルギネート生産に利用できる前に、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路を経てそれらの対応するトリオースホスフェートに転換されない炭素源の使用は、通常、最高の収率を生ずるだろうことを理解されねばならない（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，ｐ．２３８−２４５）。好ましくは、本発明のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株による培地１Ｌあたり１０ｇより多いアルギネートの生産は、もし培地１Ｌあたり４０ｇのフルクトースまたはグリセロールが炭素源として使用されるならば、得られる。アルギネートの大量生産は、当業者に周知の任意の好適な方法で実施できるが、好ましくは発酵槽で生ずる。発酵は、恐らく炭素源及び他の適切な成分の供給とともに、バッチ、供給バッチまたは連続で行われる。発酵は、５−３５℃の以内の温度で実施される。この範囲の下方の温度は、或る場合には選択できるだろうが、好ましくは発酵は２０−３０℃で実施される。
【００２７】
発酵の培地、酸素化、ｐＨ、発酵時間、撹拌及び他の可能な条件は、当業者の一般的な知識内にあると思われ、そして２つ以上の条件の多数の組み合わせが、同じ多量のアルギネートの収量を導くこと、そして本発明がこれらの条件の特定の組み合わせに制限されないことを理解すべきである。
【００２８】
突然変異菌株及びその変異株は、本発明によれば、「安定」である、すなわち、それらは、それらが６０世代以上生育したとき、アルギネートを生産しない菌株に復帰しない。突然変異体は、「材料及び方法」に示されたような標準の培養条件下で振盪フラスコ中のＰＩＡ培地で生育された。ただし、培地は２４時間毎に新鮮なＰＩＡ培地により置換した（連続培養）。
【００２９】
「突然変異菌株」は、本明細書で使用されるとき、すべてアルギネートを多量に生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ２０１の突然変異菌株並びに突然変異菌株の変異株からなる。好ましい態様では、「突然変異菌株」は、すべてアルギネートを多量に生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ２０１の突然変異菌株をいう。変異株は、Ｐｆ２０１突然変異菌株のさらなる突然変異誘発及び／またはさらなる遺伝子工学の結果、または野生型Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株の遺伝子工学または突然変異誘発の結果であろう。変異株は、或る確定された構造のアルギネートを多量に生産するだろう。また、本明細書で規定された突然変異の任意の組み合わせを含む変異株は、この表現により包含されるものと考えられる。
【００３０】
本発明に従って生産されるアルギネートは、「所望の分子量」を有するだろう。好ましくは、５００００−３００００００ダルトン、さらに好ましくは２０００００−２００００００ダルトンそして最も好ましくは３０００００ダルトン以上の範囲の分子量（Ｍｗ）を有するアルギネートが生産される。
【００３１】
本明細書で使用される表現「生物学的に活性なアルギネート」により、生物学的系に影響を有するアルギネートを意味し、すなわち、或る生物活性のアルギネートの分子構造は、或る細胞系で生物学的応答を誘導することが知られている。これらの生物学的なアルギネートは、全ウロン酸含量の０−３０％のグルロン酸（グルロネート）残基を低い含量で有し、そして好ましくはグルロン酸残基含量は１−１５％、そしてさらに好ましくは１−１０％である。
【００３２】
材料及び方法の一般的な記述
細菌の成長のために使用される原料及び培地
本発明で使用される細菌の菌株、ファージ及びプラスミドは、以下の表１にリストされる。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの菌株は、通常、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、及び５ｇ／ＬのＮａＣｌ）または１５ｇ／Ｌのアガーを含むＬＢ培地であるＬＡ培地に、それぞれ３７℃及び３０℃で培養された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ単離アガー（ＰＩＡ、Ｄｉｆｃｏ）は、またＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの増殖に使用された。λファージの増殖に使用されるＥ．ｃｏｌｉは、マルトース（０．２％）及びＭｇＳＯ４（１０ｍＭ）を補給されたＬＢ培地で培養された。抗生物質は、通常の成長実験に使用されるとき、以下の濃度で存在した。アンピシリン１００−２００μｇ／ｍＬ、カナマイシン４０μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍＬ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び３０μｇ／ｍＬ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）。
【００３３】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルギネートの生産；培地及び培養条件
培地
振盪フラスコ中のアルギネートの生産の実験は、細菌用ペプトン（２０ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（１．４ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＳＯ４（１０ｇ／Ｌ）及び８７％グリセロール（２０ｍＬ／Ｌ）を含むＰＩＡ培地、または減少した塩を含むＰＩＡ培地（Ｋ２ＳＯ４なしのＰＩＡ培地）で行われた。他に述べられていないならば、プロテアーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ２．４Ｌ（０．１５ｍＬ／Ｌ）及びＮｅｕｔｒａｓｅ０．５Ｌ（０．１５ｍＬ／Ｌ））を添加して細胞外アルギネートリアーゼ活性を低下させた。Ａｌｋａｌａｓｅ及びＮｅｕｔｒａｓｅは、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから購入した。
【００３４】
発酵槽中のアルギネートの生産は、フルクトース（４０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（１２ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．６ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１１．７ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ（０．３ｇ／Ｌ）及びクレロール（ｃｌｅｒｏｌ）ＦＢＡ６２２（消泡剤）（０．ｇ／Ｌ）を含むＰＭ５培地で行われた。プロテアーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ２．４Ｌ（０．２５ｍＬ／Ｌ）及びＮｅｕｔｒａｓｅ０．５Ｌ（０．２５ｍＬ／Ｌ））を添加して細胞外アルギネートリアーゼ活性を低下させた。
【００３５】
標準接種物（凍結保護剤としてのグリセロールを有する凍結培養）の製造
アガープレートからのコロニー（２−３日間３０℃でインキュベート、ＰＩＡ培地）は、１００ｍＬのＬＢ培地を有する振盪フラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）に移される。振盪フラスコを、回転式振盪器（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で１６−２０時間３０℃でインキュベートする。保存のために、滅菌グリセロールを１５％の濃度で培養液に添加する。混合物を滅菌凍結バイアル（Ｎｕｎｃ）に移し、そして−８０℃で貯蔵する。
【００３６】
振盪フラスコ及び発酵槽の生産実験用の接種物の製造
１ｍＬの標準接種物を、１００ｍＬのＬＢ培地を有する振盪フラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）に移す。振盪フラスコを、回転式振盪器（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で１６−２０時間３０℃でインキュベートする。
【００３７】
振盪フラスコにおけるアルギネートの生産
１−２容量％の接種物（上記参照）を、１００ｍＬのＰＩＡ培地または塩の減少したＰＩＡ培地を含む振盪フラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）に移す。振盪フラスコを、回転式振盪器（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で４８時間２５℃でインキュベートする。
【００３８】
発酵槽中のアルギネートの生産
振盪フラスコからの２−３容量％の接種物を、１ＬのＰＭ５培地を含む３Ｌ発酵槽（Ａｐｐｌｉｃｏｎ）に移す。発酵を２５℃で行う。開始からのｐＨを７．０−７．２に調節する。ｐＨをＮａＯＨ（２Ｍ）により７．０にコントロールし、そしてｐＨのコントロールを、ｐＨがこの値に達するとき、作動する。培地を通る空気流は、初めの８−１０時間０．２５Ｌ／Ｌ培地（ｖｖｍ）であり、その後それは段階的に上昇して０．９−１．０ｖｖｍにする。溶解した酸素は、撹拌速度の自動的なコントロールによって飽和の２０％にコントロールされる。
【００３９】
適用される標準の技術
プラスミドの単離、ＤＮＡの酵素的操作及びゲル電気泳動は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第三版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓの方法により行われた。Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を、それぞれアガロースゲル及び酵素的反応からのＤＮＡ精製に使用した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質変換は、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６、ｐ．２１７２−２１７５により記載されたように行われたか、または加熱ショック感応塩化ルビジウム細胞の使用により行われた。クローニングのためのＰＣＲ及び対立遺伝子の同定は、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ−ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して行われた。テンプレートとして、プラスミドＤＮＡまたは１μＬのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの一晩の培養の何れかを使用した。第一の変性段階において、反応混合物を３分間９６℃で加熱して、細胞の溶解及びＤＮＡの完全な変性の両者を確実なものにした。部位特異的突然変異誘発をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。表２に示されるプライマーは、ＭｅｄｐｒｏｂｅからまたはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧから購入した。野生型配列のものとは異なるプライマー中のヌクレオチドは、太字で記載され、そして制限酵素部位はアンダーラインされる。ＤＮＡ配列決定は、Ｂｉｇ−Ｄｙｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。
【００４０】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに使用される自殺ベクターの構築
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける相同的組み換えを達成するために、２つの異なる自殺ベクター、ｐＨＥ５５及びｐＭＧ４８を構築した（図１参照）。ｐＨＥ５５の構築は、表１に記述される。それは、ＴｒｆＡをエンコードする遺伝子を欠くＲＫ２に基づくベクターであり、それはプラスミドの複製に必要である。それは、さらにアンピシリン及びテトラサイクリンへの抵抗性を付与し、それは必須要素を選択するのに使用できる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓからのレバンスクラーゼをエンコードするｓａｃＢの発現は、５％スクロースで培養したとき、多くのグラム陰性細菌にとり致命的であることが示されている（Ｇａｙ ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４、ｐ．９１８−９２１）。しかし、スクロース上に非ムコイド及びテトラサイクリン抵抗性トランス複合物（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を成長するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの菌株ＮＣＩＭＢ １０５２５は、あたかも菌株がスクロースを使用してポリマーを生産するかのように、ガラス状のコロニーを生じた。ｓａｃＢ及びスクロース選択は、従ってこの菌株に使用して二重クロスオーバーを明確に選択することはできなかった。ｐＨＥ５５は、いくつかの実験で自殺ベクターとして使用し、その場合アルギネートの生産はマーカーとして使用できた。
【００４１】
プラスミドｐＭＧ４８は、別の組み換えベクターとして構築だれた。ｐＨＥ５５のｓａｃＢ遺伝子は、表１に記載されたようにＴｒｆＡ−ＬａｃＺ融合蛋白をエンコードする遺伝子により置換された。この蛋白は、β−ガラクトシダーゼ活性をしめすが、ＴｒｆＡの本質的な部分を失っている。ＸＧａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むプレートを使用して、６０μＬの２０ｍｇ／ｍＬの原料溶液を、スクリーニングに使用されるそれぞれのアガープレートに添加された。β−ガラクトシダーゼ活性は、必須要素（青色コロニー）についてそして後に第二の組み換え事象（白色コロニー）についての両者の青／白のスクリーニングを可能にする。
【００４２】
相同的組み換え
各端の少なくとも０．５ｋｂのフランキングＤＮＡとともに点突然変異、挿入または欠失の何れかの関心のある突然変異を含むＤＮＡ配列は、ｐＨＥ５５またはｐＭＧ４８の何れかの自殺ベクター中にクローンされた。関心のあるプラスミドにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７．１及び突然変異されるべきＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを、１晩ＬＢ培地でインキュベートした。次に、それらは、新しいＬＢ培地にインキュベートされ、１％の接種物を使用した。接合前に、Ｅ．ｃｏｌｉは２時間培養され、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは４時間培養された。それぞれの培養の１ｍＬを次に混合し、そして３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清のほとんどを取り出し、細胞を残りの液体に再懸濁した。細胞を含む小滴をＬＡ培地に移し、そして１晩３０℃でインキュベートした。細胞を滅菌へらにより取り出し、ＬＢ培地に再懸濁し、そしてベクターが青／白の選択に可能なとき、希釈物を適切な抗生物質及びＸ−Ｇａｌを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ単離アガー（ＰＩＡ、Ｄｉｆｃｏ）に植えた。それぞれのマンヌロナン生産菌株の非ムコイドトランス複合物のコロニーを、テトラサイクリンの不存在下の２−６逐次の液体の一晩の培養でインキュベートして、組み込まれたプラスミドを失わせた。指数的成長培養を１０４−１０９倍に希釈し、適切な培地に植えて異なる菌株についてスクリーニングした。
【００４３】
ＮＭＲスペクトル分析によるアルギネートのＧ含量及びＯ−アセチル化度の測定
発酵からのサンプルを０．２Ｍ ＮａＣｌで希釈し、そして遠心分離して細菌細胞を除いた。アセチル化度の測定のためのサンプルの製造のために、アルギネートを１容積のイソプロパノール（４℃）の添加により細胞のない上清から沈澱し、その後遠心分離により集めた。沈澱したアルギネートを次に７０％エタノールで２回、９６％エタノールで１回洗い、そしてさらに処理する前に蒸留水に再溶解した。Ｇ含量の測定のためのサンプルの製造のために、細胞のない上清中のアルギネートを、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｂｕｃｋｅ，ｐｐ ７１−７８，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．においてＥｒｔｅｓｖａｇ及びＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、１９９９に記述されたように、緩和なアルカリ性処理により脱アセチル化された。脱アセチル化されたアルギネートは、ｐＨ２へＨＣｌを添加することによる酸沈澱により細胞のない上清から単離された。沈澱したアルギネートを遠心分離により集め、蒸留水に再溶解し、そしてアルカリにより中和した。ＮＭＲ分析のためにポリマーの粘度を低下させるために、サンプルを緩和な酸加水分解により分解して約３５の最終の平均重量度（ＤＰｎ）（すなわちポリマー鎖中３５の残基である）にし、中和し、そして凍結乾燥した（Ｅｒｔｅｓｖａｇ及びＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、１９９９、同上）。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ３００−ＭＨｚ分光計を使用して得られた。スペクトルを集積し、そしてグルロネート残基（ＦＧ）、マンヌロネートブロック残基（ＦＭＭ）及び交互のブロック残基（ＦＭＧ＝ＧＭ）のフラクション並びにアセチル化度は、Ｇｒａｓｄａｌｅｎ、１９８３、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１１８、ｐ．２５５−２６０、並びにＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、Ｇｒａｓｄａｌｅｎ及びＬａｒｓｅｎ、１９８６、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１５４、ｐ．２３９−２５０に記述されたように計算された。
【００４４】
アルギネートの固有粘度の測定及び発酵サンプル中のアルギネート含量の直接測定
生産されたアルギネートを、上記のように、単離し、脱アセチル化し、そして沈澱し、再溶解し、そして中和した。中和したアルギネート溶液にイソプロパノールを添加して再びアルギネートを沈澱させた。沈澱したアルギネートをエタノール（初めに７０％エタノール次に９６％エタノール）により２回洗い、蒸留水に再溶解しそして４８時間蒸留水に対して透析した。透析後、サンプルを凍結乾燥しそして秤量した。アルギネートの固有粘度を、２０℃でＵｂｂｅｌｏｄｈｅ毛管（直径＝０．５３ｍｍ）そして０．１Ｍ ＮａＣｌの添加した塩の濃度を使用して、自動希釈を備えたＳｃｏｔｔ−Ｇｅｒａｅｔｅ装置で測定した。方法の原理は、Ｈａｕｇ及びＳｍｉｄｓｒｏｄ、１９６２、Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．、１６、ｐ．１５６９−１５７８に記述されたものである。
【００４５】
発酵サンプル中のアルギネート含量の酵素的測定
アルギネートの含量は、Ｏｓｔｇａａｒｄ、１９９２、１９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｐ．５１−５９により記述されているように、アバロンからのＭ特異性リアーゼ並びにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓからのＧ−リアーゼを使用して測定された。
【００４６】
発酵からのサンプルは、０．２Ｍ ＮａＣｌで希釈され（２−２０倍）、遠心分離して細菌細胞を除き、そして脱アセチル化した（上記の通り）。脱アセチル化サンプルを次に希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）、ｐＨ７．５）で希釈してアルギネート０．００５−０．０５％の最終濃度にした。本明細書で記載したように生成し測定されたＬＦ１０／６０（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ＡＳ）またはマンヌロナンを、アッセイのアルギネート標品として使用した。アッセイのために、１容積のサンプルまたは標品及び０．０６容積のアルギネートリアーゼ溶液（約１ｕ／ｍＬ）を２容積の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）、ｐＨ７．５）に添加し、そして２５℃で３時間インキュベートした。２３０ｎｍでの吸収度を、インキュベーションの前後に記録する。インキュベーション前後のＡ２３０ｎｍにおける相違をサンプル中のアルギネート含量の計算に使用する。このアッセイに使用される結果は、上記のアルギネート含量の直接的な測定と非常に良く相関する。
【００４７】
リアーゼ活性の測定
発酵からの細菌細胞を遠心分離により集め、緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）、ｐＨ７．５）に再懸濁して６６０ｎｍで３−１０の光学密度にしそして超音波処理した。超音波処理後の抽出物をリアーゼ活性について検討した。アバロンからのＭ特異性リアーゼ（Ｏｓｔｇａａｒｄ、１９９２、１９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｐ．５１−５９により記述された）を標品として使用した。サンプル中のリアーゼ活性は、Ｓｃｏｔｔ−Ｇｅｒａｅｔｅ Ｕｂｂｅｌｏｄｈｅ（装置番号５３６２０／ｌｌ）を使用してマンヌロナンの分解速度を測定することによって決定された。マンヌロナン（１ｍｇ／ｍＬ）を緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１２．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（６２．５ｍＭ）、ｐＨ７．５）、４ｍＬのマンヌロナン基質溶液及び０．４ｍＬの希釈された標準溶液に溶解したか、またはサンプルをＵｂｂｅｌｏｄｈｅ毛管に添加した。溶液がＵｂｂｅｌｏｄｈｅの毛管を通過する時間を、１時間の間２分毎に測定した。分析は２５℃で行われた。分析からのデータに基づいて、マンヌロナンの分解速度を計算し、そしてサンプルのリアーゼ活性に相関させた。標準曲線は、標品（０．００５−０．０５ｕ／ｍＬ）としてアバロンＭ−リアーゼを使用して得られた。１単位のリアーゼ活性は、Ｅｒｔｅｓｖａｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８、１８０、ｐ．３７７９−３７８４により記述されたように規定される。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
【表５】
【００５３】
【表６】
【実施例１】
【００５４】
突然変異菌株Ｐｆ２０１の製造
野生型Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ １０５２５を、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ）から購入した。野生型は、アルギネートを顕著な量で生産しない。アルギネートを過剰に生産する突然変異体を単離するために、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ １０５２５の指数的に成長する細胞にニトロソグアニジン（ＮＧ）突然変異誘発を行った。菌株を、０．５％の酵母抽出物を含む栄養ブロス（ＣＭ６７、Ｏｘｏｉｄ）で培養し、そしてクエン酸塩緩衝液中の２５ｕｇ／ｍＬのニトロソグアニジン（ＮＧ）により３０℃で１時間細胞を処理する前に、０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）で２回洗った。突然変異誘発された細胞を、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ／Ｌ）及びＮａＯＨ（〜２．３２ｇ／Ｌ）を含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７．０により洗い、そして酵母抽出物を含む栄養ブロス中に接種（２％）した。細胞は１晩で成長しそして次にＮＧ−ストックを１ｍＬづつ凍結した。
【００５５】
培養の希釈物を、カルベニシリン（９００μｇ／ｍＬ）を含むＰＩＡ培地に植え、３０℃でインキュベートした。二、三のムコイド突然変異体を観察した。４＊１０５より多いコロニーの調査を含むスクリーニングから、２つの最もムコイドの多い突然変異体を、発酵槽の研究におけるさらなる評価に選択した。良い突然変異体Ｐｆ２０１は、発酵で、図２に画かれているように、１Ｌあたりの炭素源として４０ｇのフルクトースを含むＰＭ５培地１Ｌあたり１１−１３ｇのアルギネートを生ずる。成長条件及び培地組成については、「材料及び方法」を参照すること。フルクトースを含むＰＭ５培地を使用し標準の成長条件下でＰｆ２０１によって生産されるアルギネートは、図３から分かるように、Ｇ−ブロックの完全な不存在とともに約３０％Ｇ（グルロネート残基）を含む。独特なアルギネート生産性に基づいて、Ｐｆ２０１菌株は、さらなる菌株の開発について選択された。実施例１のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ突然変異体Ｐｆ２０１は、寄託番号４１１３７でＮＣＩＭＢで寄託されている。
【実施例２】
【００５６】
アルギネート生合成オペロンの部分のクローニング及び配列決定
野生型菌株ＮＣＩＭＢ １０５２５の遺伝子ライブリーを、λＤＡＳＨＩＩ（ラムダＤａｓｈ ＩＩ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入）で構築した。染色体ＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより記述されたように単離した。遺伝子ライブラリーを、次に製造業者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＢａｍＨｌ／Ｇｉｇａｐａｃｋ ｌｌｌ Ｇｏｌｄ Ｅｘｔｒａｃｔ）に従って、ＮＣＩＭＢ １０５２５からの部分的にＳａｕ３Ａｌ消化した染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ消化したラムダＤＡＳＨ ＩＩ中に挿入し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージしたファージによりＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）を感染させることにより構築した。ＤＮＡプローブのラベル化及びハイブリッド化λクローンの検出は、製造業者の指示に従ってＤＩＧ ＤＮＡラベル化及び検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の使用によってなされた。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのａｌｇＥ及びａｌｇＸの部分によりフランキングされたａｌｇＧを含むｐＢＢｇ１０からの３．８Ｍｆｅｌ−Ｎｃｏｌ ＤＮＡフラグメントをラベルしそしてＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓライブラリーをスクリーニングするのに使用した。Ｐｆλ１と呼ばれる１つのハイブリッド化ファージをこの系を使用して検出し、そしてλＤＮＡをＬａｍｂｄａ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。挿入断片をｐＧＥＭ１１中へＳａ／Ｉ消化ＤＮＡフラグメントとしてサブクローンして、４つのサブクローンｐＭＧ２４−２７を得た。サブクローンの末端の配列決定及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのアルギネート生合成オペロンとの比較は、Ｐｆλ１がａｌｇＥの３´部分からのアルギネート生合成オペロンの下流部分を含むことを明らかにした（図４）。
【００５７】
ｐＭＧ２６及びｐＭＧ２７は、Ｑｕｉａｇｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより配列決定されて、ａｌｇＧＸＬＩＪＦＡの完全な配列を得た。この遺伝子の体制は、Ｍａｙ及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２、ｐ．１５１−１５７、Ｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８、ｐ．５８８４−５８８９、Ｐｅｎａｌｏｚａ−Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９、ｐ．４４６４−４４７２、Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｇｅｎｅ、２３２、ｐ．２１７−２２２における既に報告されたアルギネート生合成クラスターに類似しているようにみえる。配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託され、そして寄託番号ＡＦ５２７７９０を与えられている。
【実施例３】
【００５８】
エピメラーゼマイナス変異菌株の製造
実施例１の突然変異菌株Ｐｆ２０１に、実施例１に記述した方法の変法を使用して、ニトロソグアニジンを用いてさらなる突然変異誘発を行った。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ １０５２５の指数的に成長する細胞に、ニトロソグアニジン（ＮＧ）突然変異誘発を行った。細菌細胞を、ＮＨ４ＳＯ４（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（４．４ｍｇ／Ｌ）、ＫＮＯ３（６．１ｍｇ／Ｌ）、マレイン酸（５．８ｇ／Ｌ）、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（６．０５ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（０．２５ｍｇ／Ｌ）及びＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／Ｌ）を含む同じ容積のトリス／マレイン酸（ＴＭ）緩衝液ｐＨ６．０により２回洗った。細胞を、初めの培養容積の８０％のＴＭ緩衝液に再懸濁し、３０℃で１時間ＮＧ（５０μｇ／ｍＬ）に曝した。突然変異誘発された細胞を、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ／Ｌ）及びＮａＯＨ（〜２．３２ｇ／Ｌ）を含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７．０により洗い、そしてＬＢ培地中に接種し（２％接種物）、そして１晩インキュベートした。突然変異誘発工程の致死率は、コントロールとして非突然変異誘発物を使用して約９０％と計算された。突然変異誘発後、培養を１晩ＬＢ培地で成長させ、そして細胞の希釈物を、Ｃｈｉｔｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、ｐ．２８９４−２９００により記述されたように、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓからのＧ−リアーゼ（約０．１ｕ／プレート）を含むＬＡ培地に植えた。このＧ−リアーゼは、アルギネートにおけるＧ−Ｍ（グルロネート−マンヌロネート残基）及びＧ−Ｇ（グルロネート−グルロネート残基）の結合のみを開裂する（Ｈａｕｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１９８、ｐ．１０１−１０９）。
【００５９】
ムコイド突然変異体は、これらの選択的プレートで７５００中約１の頻度で生じた。１つのムコイド突然変異体は単離され、そしてＰｆ２０１１８と命名された。Ｐｆ２０１１８を、ＰＭ５培地を使用して標準の成長条件下で発酵槽で成長させた（「材料及び方法」を参照）。生産されたポリマーは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析により分析された。この分析の結果は、突然変異体が純粋なマンヌロナンを生産したことを示した（図３参照）。いくつかの発酵は、標準の成長条件及びＰＭ５培地を使用してＰｆ２０１１８により行われた。容積の収量は、約３５時間の発酵で、培地１Ｌあたり４０ｇのフルクトースから１Ｌあたり１４−１６ｇの範囲のマンヌロナンであった。Ｐｆ２０１から由来するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ突然変異体Ｐｆ２０１１８に、発酵槽で７０より多い異なる実験を行ったが、それらのどれもマンヌロナン生産性に不安定さを示さなかった。Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８の両者は、非ムコイドコロニーの出現なしに６０世代について成長した。Ｐｆ２０１１８がマンヌロナンＣ−５−エピメラーゼ遺伝子ａｌｇＧに欠点を有するようにみえるが、突然変異がいくらかエピマー化に必要な他の蛋白に影響することを排除できなかった。マンヌロナン生産表現型に関係のある突然変異の予備的局在化は、野生型ａｌｇＧによる突然変異体のそれぞれのａｌｇＧ対立遺伝子の遺伝子置換によって行われた。野生型ａｌｇＧ及び下流ａｌｇＸの初めの１３５ｂｐをエンコードする遺伝子置換ベクターｐＭＧ３１を、表１に記述したように構築した。プラスミドを、選択培地としてテトラサイクリンを含むＰＩＡを使用して、「材料及び方法」に記述したようにＰｆ２０１１８中に接合した。非ムコイドコロニーは、ａｌｇＧ中に組み換えられたｐＭＧ３１としてアルギネートの生合成オペロンの分裂により生じた。非ムコイドトランス接合コロニーは、組み込まれたプラスミドを失わせるために、テトラサイクリンなしの２−６逐次の一晩の液培養でインキュベートされた。指数的に成長する培養を１０４−１０９倍に希釈し、そしてＰＩＡアガープレートに植え付けてムコイド復帰突然変異体についてスクリーニングした。ムコイドコロニーを次にＧ−リアーゼを含むＬ−アガー上に線状に塗って、それらがエピマー化したアルギネートを生産するかどうかをテストした。これらの非ムコイド復帰突然変異体が見いだされ、突然変異がｐＭＧ３１のａｌｇＧＸ´フラグメントに相当するＤＮＡフラグメントにあるべきであったことを確証した。ａｌｇＧ遺伝子は、プライマーＰｆａｌｇＧ３ｒ及びＰｆａｌｇＧ４ｆを使用するＰＣＲにより増幅され、配列決定され、そして突然変異が同定された（表３参照）。
【００６０】
３つの他のエピメラーゼマイナス突然変異体誘導菌株は、上記の方法に従って製造され、そしてそれぞれＰｆ２０１２、Ｐｆ２０１１３及びＰｆ２０１３７と命名された。それらはすべてそれらのａｌｇＧ遺伝子における同定された突然変異を有し、以下の表３に記述されたようにそれらのＡｌｇＧ遺伝子生成物において異なるアミノ酸を生じ、そしてこのアミノ酸の変化は蛋白を不活性化するのに充分である。同じ条件下で成長したとき、突然変異体は、Ｐｆ２０１１８とほぼ同じレベルの純粋なマンヌロナンを生成した。突然変異体のエピマー化の欠点は、ｐＭＧ３１における野生型遺伝子との組み換えにより復帰できた。
【００６１】
【表７】
【００６２】
表３の突然変異菌株は、寄託番号を付されてＮＣＩＭＢに寄託された。Ｐｆ２０１２はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１３８を有し、Ｐｆ２０１３はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１３９を有し、Ｐｆ２０１１８はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１４０を有し、そしてＰｆ２０１３７はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１４１を有する。
【実施例４】
【００６３】
アセチラーゼマイナス及び変性突然変異菌株、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△の製造
Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ欠失突然変異体は、ａｌｇＦの部分の枠内欠失のフランキング配列を含む突然変異体ＤＮＡフラグメントを構築することにより先ず作られ、そして次に表１に記述したように、自殺ベクターｐＭＧ４８中にフラグメントを連結した。ｐＭＧ７９と呼ばれる得られたプラスミドは、「材料及び方法」に記載されたように、接合によってＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株Ｐｆ２０１１８に転移され、そしてトランス接合物は、ＸＧａｌ及びテトラサイクリンを含むＰＩＡプレート上の青色のコロニーとして選択された。二重組み換え物を、ＸＧａｌを含むＰＩＡプレート上に白色及びムコイドのコロニーとして選択された。これらの候補物を、テトラサイクリンに対する感受性についてさらにテストした。２４の白色のテトラサイクリン感受性候補物を、表２に示されたように、プライマー対ａｌｇＦ−１−ｆｗ及びａｌｇＦ−２−Ｒｅｖを使用してＰＣＲによってテストし、そして生成物をゲル電気泳動により分析した。候補物の２２からのＰＣＲ生成物は、野生型ａｌｇＦ対立遺伝子（１．０ｋｂ）について予想される長さを有した。しかし、他の２つは、突然変異体△ａｌｇＦ対立遺伝子（０．７ｋｂ）に関する予想された長さを有した。これらの１つは、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△と命名された。
【００６４】
ａｌｇｌＪの欠失突然変異体は、ａｌｇＩの２６１３´ヌクレオチド及びａｌｇＪの５´１１４０ヌクレオチドを含む１．４ｋｂ Ｎｒｕｌ−Ｈｐａｌ ＤＮＡフラグメントが除かれたｐＭＧ２７の誘導体（ｐＭＧ４９）を先ず生成することにより作られた。欠失構築物は、Ａｌｇｌ及びＡｌｇＪの枠内融合をエンコードして、ＡｌｇＦ及びＡｌｇＡが通常通り翻訳されるべきことを確実にした。ＭＧ４９からの３．４ｋｂ Ｓａｃｉ−Ｘｂａｌ ＤＮＡフラグメントは、次に同じ酵素により消化された自殺ベクターｐＨＥ５５中に連結されて、ｐＭＧ５０を生成した。欠失をフランキングする配列を含むこのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉＳ１７．１からの接合によりＰｆ２０１１８に導入され、そして非ムコイドトランス接合物がテトラサイクリンを含むＰＩＡ培地で選択された。トランス接合物復帰突然変異体は、ＬＡ培地でムコイドテトラサイクリン感受性コロニーとして同定された。４つのａｌｇｌＪ△突然変異体候補物を、プライマー対ＰｆａｃｅｔｙｌＦｗ及びＰｆａｃｅｔｙｌＲｅｖを使用して欠失した領域を含む領域のＰＣＲ増幅によりテストし（図２）、そしてＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。コロニーの２つは野生型フラグメント（１．８ｋｂ）を含んだが、他の２つは突然変異体セグメント（０．４ｋｂ）を含んだ。これらの１つは、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△と命名された。Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△は、「材料及び方法」に記載されたＰＭ５培地及び標準の成長条件を使用して発酵槽で培養され、そして生産されたアルギネートを収穫し、そして前記のように測定した。結果は、以下の表４に示される。両方の変異株は、培地１Ｌあたり１６−１７ｇのアルギネートの収量でマンヌロナンアルギネートを生成した。アセチル基の存在は、「材料及び方法」に記載されたように１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析により決定された。Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△は、アセチル化アルギネートを生成せず、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△は、少量のＯ−アセチル基を含むアルギネートを生成した。
【００６５】
【表８】
【００６６】
発酵は、ＰＭ５培地及び標準の成長条件を使用して３Ｌ発酵槽で行われた。分析は、「材料及び方法」で記述された通りになされた。Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△は、寄託番号４１１４１及び４１１４３の下ＮＣＩＭＢに寄託されている。
【実施例５】
【００６７】
低いアルギネートリアーゼ活性を示す変性誘導突然変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒの製造
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、最近の知識によれば、遺伝子ａｌｇＬによりエンコードされた唯一のアルギネートリアーゼ（ＡｌｇＬ）を有する。この細菌により生成されるアルギネートの分子量をコントロールするための選択肢は、それゆえ、同時に生成されるＡｌｇＬ遺伝子生成物を変性することである。
【００６８】
突然変異プライマー対ａｌｇＬＨ２０３Ｒ１／ａｌｇＬＨ２０３Ｒ２を使用して、Ｐｆ２０１１８のａｌｇＬ遺伝子中にＨｉｓ２０３Ａｒｇ（Ｈ２０３Ｒ）突然変異を発生させた。プライマーは、また対立遺伝子の同定のためにＡｇｅｌ部位を生ずるサイレント突然変異を含む。突然変異プラスミドｐＭＧ７０を表１に述べたように構築し、そして接合によりＰｆ２０１１８染色体に誘導し、そしてトランス接合物をテトラサイクリン及びＸＧａｌを含むＰＩＡ培地で選択した。トランス接合物は、テトラサイクリンのない一連の一晩の培養で成長し、そしてＸＧａｌを有するＰＩＡ培地に接種してＡｌｇＬ突然変異体を単離した。テトラサイクリン感受性突然変異体候補物を、プライマーＰｆａｌｇＬ−ＢｓｐＨｌ−ｐＭＧ２６及びＰｆａｌｇＬＲｅｖ１を使用してａｌｇＬ対立遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングし（表２）、そして対立遺伝子を、ＡｇｅｌによりＰＣＲフラグメントを消化することによって同定した。選ばれた突然変異菌株は、Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒと命名された。
【００６９】
変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒを、塩を少なくしたＰＩＡ培地を使用して振盪フラスコで培養するとき、それは、変異菌株Ｐｆ２０１１８とほぼ同じレベルの量のマンヌロナンを生成する。また、発酵槽中の培養は、２つの変異菌株から生成したのとほぼ同じ量のマンヌロナンを生じた（Ｈ２０３Ｒは１Ｌあたり１２ｇのマンヌロナンアルギネートを生産した）。振盪フラスコ（塩の少ないそしてプロテアーゼ無添加のＰＩＡ培地を使用する）中のＰｆ２０１１８（１５ｄｌ／ｇの固有粘度）及びＰｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒ（３７ｄｌ／ｇの固有粘度）により生産されるマンヌロナンの固有粘度の測定は、後者が分子量が高くなったマンヌロナンを生成することを示す。Ｐｆ２０１は、Ｐｆ２０１１８と同様な固有粘度（１４ｄｌ／ｇ）でアルギネートを生産した。
【００７０】
Ｐｆ２０１、Ｐｆ２０１１８及びＰｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒの細菌細胞を、振盪フラスコの発酵の終わりで収穫しそして超音波処理した。超音波処理後、抽出物をアルギネートリアーゼ活性について調査し、それは「材料及び方法」に示された方法によって測定された。Ｐｆ２０１のリアーゼ活性を１００％と定義して、この方法を使用して２％に低下する活性を検出することができる。Ｐｆ２０１１８は９３％の活性を示した。どんな活性もＰｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒについて検出されず、それが菌株Ｐｆ２０１のそれの２％より小さいことを示した。さらに、プロテアーゼＡｌｋａｌａｓｅ及びＮｅｕｔｒａｓｅが０．１５ｍＬ／Ｌ添加されたとき、固有粘度は、Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８について約５０ｄｌ／ｇに、 Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒについて７０ｄｌ／ｇに増大し、突然変異体リアーゼがいくらかの残存活性を有することを示す。変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒは、寄託番号４１１４４でんＣＩＭＢに寄託されている。
【実施例６】
【００７１】
エピメラーゼ活性の低い突然変異菌株の変異株の製造
突然変異菌株Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８は、それぞれ約３０％のグルロネート残基含量及び純粋なマンヌロナンを有するｉｎ ｖｉｖｏアルギネートを作る手段をもたらす。０−３０％の中間の量のグルロン酸（グルロネート残基）含量を有するアルギネートは、しかし、また作ることができる。このような菌株を得る１つの方法は、オペロンからエピメラーゼ遺伝子を欠失し、次にプラスミドまたはトランスポゾンの何れかのプロモーターによりコントロールされる遺伝子を導入することである。プラスミドｐＭＧ５３は、表１に記述されたように構築され、このプラスミドは、遺伝子の内部４０％が除かれているａｌｇＧの変異株を含む。このプラスミドは、次にＰｆ２０１に転移され、Ｐｆ２０１△ａｌｇＧと呼ばれるこの欠失を含む菌株は、相同的組み換えにより作られた。この菌株は、非還元末端で不飽和残基を含む小さいリオゴウロナイドを作るが、それはアルギネートを作らない。プラスミドｐＣＮＢ１１１は、自殺プラスミドであり、それはＴｎ５に基づくミニ−トランスポゾンを含む。遺伝子は、それらの発現が誘導Ｐｍプロモーターによりコントロールされるやり方でこのミニトランスポゾン中にクローンできる。野生型ａｌｇＧ遺伝子は、表１に記載したようにこのプラスミドに転移され、プラスミドｐＫＢ１０を生じた。プラスミドは、相同的組み換えの下で「材料及び方法」の一般的な記述に記載されたように、Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ中に接合された。しかし、染色体の組み込みは、この場合トランスポゾンに依存し、相同に依存しない。得られた菌株は、Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ：：ＴｎＫＢ１０と命名された。この菌株は、誘導物質がなくてもアルギネートを生産するが、ポリマーの量は、誘導物質の濃度が高くなるにつれ増加する（示されず）。生成物がＮＭＲによりそして質量スペクトルにより分析されたとき、菌株がアルギネート及びオリゴマーの混合物を生産することが分かった。ｐＫＢ１０は、またＰｆ２０１１８に転移され、菌株Ｐｆ２０１１８：：ＴｎＫＢ１０を生じた。この菌株は、３０％Ｇを含む野生型アルギネート及びマンヌロナンの混合物を生産する（結果は示されず）。これらの結果は、アルギネートの生産に必要なエピメラーゼであるばかりでなく、それはまた蛋白複合体の一部としてエピマー化されることを示す。相同的アルギネートを得るために、エピメラーゼの唯一の形が存在できる。
【００７２】
エピメラーゼ活性の低下した変異菌株を製造する方法は、活性の低下した突然変異体蛋白をエンコードする突然変異体遺伝子により野生型ａｌｇＧを交換する方法である。Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ及びｐＫＢ１０の性質を使用してこれらの突然変異体を得る方法が確立された。Ｅ．ｃｏｌｉＳ１７．１λ−ｐｉｒ（ｐＫＢ１０）の指数的に成長する細胞（ＯＤ６００ｎｍ：０．５）を、ニトロソグアニジンにより突然変異誘発した。５ｍＬの培養からの細胞を、５ｍＬのＴＭ緩衝液（１．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ＳＯ４、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ／ＬのＣａ（ＮＯ３）２、０．２５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、５．８ｇ／Ｌのマレイン酸、６．０５ｇ／Ｌのトリス、ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調節）で２回洗った。細胞を２．８５ｍＬのＴＭ緩衝液に再懸濁し、３０分間３７℃で１００μｇ／ｍＬのニトロソグアニジンにより処理した。懸濁物を３分間氷で冷却し、細胞を遠心分離によりペレットとし、５ｍＬのＬＢで３回洗った。グリセロールを添加して最終濃度を１０％にし、そして再懸濁物を−８０℃で冷凍した。細胞の０．００７％のみが突然変異誘発で生存した。プラスミドを解凍した細胞から単離し、表１のＥ．ｃｏｌｉＳ１７．１λ−ｐｉｒ中に転移した。プラスミドは、ｐＫＢ１０−Ｍ＊と命名されて、それらがｐＫＢ１０の突然変異されたバージョンのライブラリーを構成することを強調した。
【００７３】
ｐＫＢ１０−Ｍ＊を次に「材料及び方法」のセクション（「相同的組み換え」の下）に記載されたようにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ中に接合したが、但し１００μＬの凍結したＥ．ｃｏｌｉλ−ｐｉｒ（ｐＫＢ１０−Ｍ＊）は１０ｍＬのＬＢ培地中に直接接種され、そしてＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株と混合される前に２時間培養した。両者の培養のＯＤ６００ｎｍは０．４であった。３６時間３０℃でＬＡ培地でのインキュベーション後、接合混合物を、４０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＰＩＡ培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した。トランスポゾンＴｎＫＢ１０−Ｍ＊が染色体中に組み込まれているこれらのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞のみが、ｐＫＢ１０及びその誘導体がＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに複製できないために、この培地に成長するだろう。誘導物質がたとえなくても、あるＡｌｇＧがＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＰｍプロモーターから発現され、そしてこのレベルは、菌株Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ：：ＴｎＫＢ１０においてムコイドコロニーを生ずるのに充分である。約０．５％のコロニーは非ムコイドであり、これらの細胞のａｌｇＧ遺伝子がＰｍプロモーターまたはｍＲＮＡリーダー配列の何れかの突然変異体により発現しないか、またはＡｌｇＧ蛋白が非機能的であることを示す。
【００７４】
それぞれのプレート（２４５×２４５ｍｍ）は４−５０００コロニーを含み、そしてこれらの１２００−１４００は、自動コロニーピッカー、Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｑ−ｐｉｘｌｌ、Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国を使用して各プレートから拾い上げることができた。小さい（非ムコイド）コロニーを拾い上げないように、パラメーターを調節した。突然変異したライブラリーを含む菌株をスクリーニングする方法を開発した。このスクリーンでは、パラメーター細胞成長、アルギネートの生産（Ｍ−リアーゼ及びＧ−リアーゼの混合物を使用して測定）、及びＧ含量（Ｇ−リアーゼのみを使用することにより測定）は、それぞれ測定された。
【００７５】
細菌の成長
コロニーを、Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｑ−ｐｉｘｌｌコロニーピッカーを使用して９６穴プレートで２つの異なる液体培地に複製した。コロニーを保存するために、１つの複製は、トリクロサン（０．０２５ｇ／Ｌ）及びカナマイシン（Ｋｍ）（４０ｍｇ／Ｌ）を含む１１０μＬのＬＢ培地で培養し、２５℃で４８時間インキュベートした。グリセロール（６０％、４０μＬ）をそれぞれの穴に添加し、溶液を混合しそしてプレートを−８０℃で冷凍した。
【００７６】
他の複製は、０．５×ＰＩＡ（細菌用ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（０．７ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＳＯ４（５ｇ／Ｌ）、グリセロール（５ｇ／Ｌ）、トリクロサン（０．０２５ｇ／Ｌ）及びＫｍ（４０ｍｇ／Ｌ））で培養された。ｍ−トルエート（誘導物質）を添加して０．１ｍＭにした。細菌を１１０μＬの培地／穴を含む滅菌Ｎｕｎｃ ９６−Ｖ−穴プレートで培養し、そして９００ｒｐｍの回転運動（３ｍｍの振幅）を使用して２５℃で７２時間インキュベートした。
【００７７】
アルギネート生産の測定
ＮａＣｌ（０．２Ｍ、１２０μＬ）をそれぞれの穴に添加し、そして細胞を遠心分離（３９００ｇ、２０℃、３０分間）によってペレットにした。各穴からの５０μＬの上清をＮｕｎｃの９６平穴プレートに移した。アルギネートを、各穴にＮａＯＨ（０．５Ｍ、１０μＬ）に添加し、２５秒間混合し、そして１時間室温でインキュベートすることにより脱アセチル化した。１００μＬのリアーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１．５％ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））を次に添加し、そして溶液を６０秒間混合した。
【００７８】
各穴からの７５μＬをＣｏｓｔａｒ−ＵＶの９６穴プレートに移した。他の１５０μＬのリアーゼ反応緩衝液を添加し、そして溶液を２５秒間混合した。２３０ｎｍでの吸光度（Ａ１）を読み取り、次に８μＬのＧ特異性アルギネートリアーゼ（０．２ｕ／ｍＬ）を各穴に添加した。溶液を２５秒間混合し、そして６０分間室温でインキュベートした。それらを２５秒間混合し、そしてＡ２３０ｎｍで読みとった（Ａ２）。次に、８μＬのＭ特異性アルギネートリアーゼ（１ｕ／ｍＬ）を各穴に加え、溶液を２５秒間混合し、そして６０分間室温でインキュベートした。溶液を再び２５秒間混合し、そしてＡ２３０ｎｍで読みとった（Ａ３）。添加したリアーゼの吸光度を、Ａ２及びＡ３の読み取りから引いた。周知の組成のアルギネート（Ｐｆ２０１１８により生産されたポリマンヌロン酸及びＰｆ２０１により生産された３０％のＧ含量を有するアルギネート）をアッセイにおいて標準として使用した。
【００７９】
アルギネートの全量を式に基づいて計算する。
Ａａｌｇ＝Ａ３−Ａ１
サンプルからのＡａｌｇを既知のアルギネート濃度を有する標準からのＡａｌｇと比較することによって、サンプル中のアルギネートの濃度を計算する。
【００８０】
グルロン酸（Ｇ）含量の測定
サンプル中の相対的Ｇ含量（Ｇｒ）は、式
Ｇｒ＝（Ａ２−Ａ１）／（Ａ３−Ａ１）
サンプルからのＧｒを標準のＧｒと比較することによって、サンプル中のＧ含量を計算した。
【００８１】
１万のコロニーをこの方法でスクリーニングし、そして変更したが零ではない活性を有する二、三の候補物を拾い上げた。これらの突然変異体を次に「材料及び方法」において記述されたように振盪フラスコで培養した。使用したＰＩＡ培地にトリクロサン（０．０２５ｇ／Ｌ）、カナマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）及びｍ−トルエート（０．１ｍＭ）を添加し、そして生成したアルギネートを、「材料及び方法」に記述したようにＮＭＲにより分析した。１つの突然変異体は、１３％のグルロン酸残基のみを含むアルギネートを生産したが、野生型は、約３０％のグルロン酸残基を含むアルギネートを生産した（表４）。純粋のマンヌロナンを生産するいくつかの他の菌株も見いだした。方法は、野生型酵素よりもグルロン酸を少なく誘導するＡｌｇＧの突然変異体形をスクリーニングすることを可能にする。
【００８２】
所望のアルギネート生成物を生産するさらなる突然変異菌株の変異株を生成するために、突然変異体の遺伝子は、本明細書に既述されたように、周知のＰＣＲ技術により回収され、ｐＭＧ４８中にクローンされ、そして相同的組み換えによりＰｆ２０１または実際に過剰に生産する菌株の任意のもの中に転移できる。マンヌロナン生産菌株Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８及びＰｆ２０１３７と同様に、エピマー化に影響するａｌｇＧの点突然変異は、生産されるアルギネートの量に影響しないようである。
【実施例７】
【００８３】
エピメラーゼ活性の低下した突然変異菌株の変異株の製造
エピメラーゼ活性の低下した変異菌株の別の製法は、野生型ａｌｇＧを活性の低い突然変異体蛋白をエンコードする突然変異体遺伝子により交換する方法である。４つの異なるアミノ酸置換は、表３に示されて、ＡｌｇＧのエピメラーゼマイナス突然変異体を生ずる。これらの４つの場合では、アミノ酸の変化は、アミノ酸のサイズまたは電荷の何れかに影響し、それらの２つでは、両方の性質が変化している。可能な追加のアミノ酸は、また実施例６に記述された方法によって見いだされる突然変異体の配列決定により同定できる。これらのアミノ酸におけるさらなる同類変化をエンコードするａｌｇＧの別の対立遺伝子は、テンプレートとしてｐＭＧ２６を使用して部位特異的突然変異誘発によりつくられる。周知の配列に等しい約１０−１５ヌクレオチドによりフランキングした新しいアミノ酸に関するコドンを含む突然変異プライマーがつくられる。Ｓｅｒ３３７における突然変異は、ＳｍａＩ部位を破壊し、他のアミノ酸に関するプライマーは、好ましくは、サイレント突然変異を含み、制限酵素部位を導入して新しい突然変異菌株を同定するのに助けになる。両方の鎖に関するプライマーは合成されるべきであり、そして突然変異誘発は、「材料及び方法」に記述されたように行われる。突然変異されたａｌｇＧ対立遺伝子を次に２．７ｋｂ ＢｓｐＨｌ−ＰｓｔＩ−消化ＤＮＡフラグメントとしてＮｓｉＩ−ＮｃｏＩにより消化されたｐＭＧ４８に転移する。得られたプラスミドは、Ｐｆ２０１そして非ムコイド、テトラサイクリン抵抗性及びＸＧａｌを含むアガープレートで青色であるとして選択されたトランス接合物に転移される。ＬＢ培地でのいくつかの連続する転移について選択されたコロニーを培養後、二重組み換え体を、白色でありＸＧａｌを含むアガープレート上のムコイドコロニーを有しそしてテトラサイクリンに対して感受性を有するものとして選択される。これらの候補物からのａｌＧは、プライマー対ＰｆａｌｇＧ５ｆ及びＰｆａｌｇＧ３ｒを使用して増幅できる。増幅された生成物は長さ１．７ｋｂである。もし制限部位が除かれるかまたはプライマーにより導入されるならば、正確な突然変異体は、対応する制限酵素を使用することにより同定される。別に、候補物は、ＤＮＡ配列決定により確定される。
【００８４】
突然変異菌株を振盪フラスコで培養し、そして生産されたアルギネートを「材料及び方法」に記述されたように単離される。アルギネートの量及びＧ−含量は、「材料及び方法」に記述されたようにＭリアーゼ及びＧリアーゼを使用して測定される。興味のある菌株からの結果は、ＮＭＲスペクトルにより確定される。
【実施例８】
【００８５】
アルギネート生産の調節のための誘導可能なＰｍプロモーターを有する突然変異菌株Ｐｆ２０１ＭＣの製造
そのエフェクターＸｙｌＳとともにＰｍプロモーターは、多くのグラム陰性種で使用できる強い誘導可能なプロモーターであることが知られている。Ｂｌａｔｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、６３、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｐ．３７０−３７９。使用される誘導体は、しばしば、トルエートであり、それは、細菌膜の上に自由に拡散する。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株Ｐｆ０−１は、ＪＧＩ（Ｔｈｅ ＤＯＥ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｉｇｉｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ／ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ／ｐｓｅｕｄｏ ｈｏｍｅｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）で配列決定された。この菌株のアルギネートオペロンを他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からの周知のアルギネートオペロン配列と比較したとき、本発明者は、体制が同様であることを見いだした。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのすべて配列決定されたアルギネート生産種は、またアルギネートプロモーターの同じ保存オペロン読み枠上流を有する。それは、その機能が知られていない蛋白を潜在的にエンコードする。この実験の目的は、この読み枠に関する停止コドンの下流及びアルギネートオペロンの第一の遺伝子であるａｌｇＤの開始コドンの下流の配列を、Ｂｌａｔｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、３８、ｐ．３５−５１に記述されたベクターｐＪＢ６５８からのＸｙｌＳをエンコードする配列、Ｐｍプロモーター及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列により置換することであった。ｐＪＢ６５８のｘｙｌＳ及びＰｍプロモーターを分離するＤＮＡセグメントのほとんどは、除かれた。
【００８６】
第一の段階は、挿入のためのフランキング配列を得るために、仮説的（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）蛋白（ｈｙｐと略称）の３´部分及びａｌｇＤの５´部分をクローンすることであった。菌株Ｐｆ０−１のａｌｇＥＧＸＬＩＪＦＡの配列をＮＣＩＭＢ １０５２５の配列と比較したとき、２つの配列が同じでないことが分かった。そのため、プライマーを、いくつかの種で非常に保存されているｈｙｐ及びａｌｇＤ遺伝子の部分を使用して構築した。ｈｙｐの３´部分を、０．７ｋｂＢｓｐＬＵ１１Ｉ−ＳｐｅＩ消化ＰＣＲフラグメントとして表２のプライマーＨｙｐＢｓｐＬＵ１１ｌ及びＨｙｐＳｐｅｌを使用して自殺ベクターｐＭＧ４８中にクローンして、ｐＨＥ１３９を得た。ａｌｇＤの５´部分を０．８ｋｂＮｄｅｌ−Ｎｓｉｌ制限ＰＣＲフラグメントとしてＮｄｅｌ−Ｐｓｔｌ制限ｐＪＢ６５８ｃｅｌＢ中にクローンしてｐＨＥ１３８を得た。置換ベクターｐＭＣ１（図５参照）を次に一連のクローニング段階を経て構築した（表１）。
【００８７】
プラスミドを、「材料及び方法」に記述したように、接合により菌株Ｐｆ２０１に転移し、組み換え体及び以後の二重組み換え体についてスクリーンするためにＸＧａｌ及びテトラサイクリン抵抗性／感受性を選択した。トルエートを含まないＰＩＡ培地より１ｍＭのトルエートを含むＰＩＡ培地でさらにムコイドであるように思われるコロニーを、ＰＣＲによるさらなる分析について選んだ。プライマー対ＨｙｐＢｓｐＬＵ１１Ｉ及びＡｌｇＤＮｓｉｌ（表２）を使用して、野生型菌株からの予想されたＰＣＲ生成物は長さ２．３ｋｂであろうが、突然変異菌株のそれは３．０ｋｂであろう。選ばれた突然変異体をＰｆ２０１ＭＣと命名した。この菌株を次に誘導物質としてトルエート（０．０２５ｍＭ）の存在及び不存在下で発酵させた。ＰＭ５培地及び標準の条件を、「材料及び方法」に記述したように、発酵中使用した。誘導されない培養は、培地１Ｌあたり３．５ｇのアルギネートを生産したが、誘導された培養は、培地１Ｌあたり１３ｇのアルギネートを生産した。突然変異菌株Ｐｆ２０１ＭＣは、寄託番号４１１４５としてＮＣＩＭＢに寄託された。
【実施例９】
【００８８】
アルギネート生産の調節のための誘導可能な突然変異したＰｍプロモーターの使用
野生型Ｐｍプロモーターは機能するが、しかし発現の未誘導レベルはかなり高い。Ｗｉｎｔｈｅｒ−Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．２０００，２，ｐ．９２−１０３の検討に基づいて、該プロモーターの突然変異についてスクリーニングする方法が開発された。最初のｐＪＴ１９−ｂｌａは、ターミネーター配列を挿入することによって変化され、そしてＰｍプロモーターの上流Ａｆ／ＩＩＩ部位及びプロモーターの下流ＳｐｅＩ部位をＢｓｐＬＵ１１Ｉ部位に変化させた。新しいプラスミドは、ｐｌＢ１１と命名された。このプラスミドでは、Ｐｍプロモーターは、ユニークＸｂａｌ及びＢｓｐＬＵ１１Ｉ制限部位によりフランキングされる。このＤＮＡフラグメントをカバーする２つの相補性５０ｂｐＤＮＡオリゴマーを次に合成した。条件を選んでこれらの制限部位によりフランキングされるヌクレオチドにわたって約１２％の誤差率を生じた。対応する野生型鎖も合成された。二本鎖オリゴヌクレオチドのライブラリーを、次に相補性野生型オリゴヌクレオチドにより突然変異を含むオリゴヌクレオチドのそれぞれをアニーリングすることにより作られた。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｘｂａｌ及びＢｓｐＬＵ１１Ｉにより制限されるｐｌＢ１１に相補的であるように構築された。アニーリングされたオリゴヌクレオチドを次にＸｂａｌ及びＢｓｐＬＵ１１ｌにより制限されたｐｌＢ１１中に連結され、そして５００００個の形質転換細胞を得た。Ｅ．ｃｏｌｉでは、このライブラリーは、マーカーとしてアンピシリンに関する抵抗性を使用してスクリーニングされるだろう。しかし、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、既に、β−ラクタムに対してかなり高い抵抗性を有する。β−ラクタムに関する遺伝子は、表１に記述したようにルシフェラーゼをエンコードする遺伝子により置換されて、野生型プロモーターを含むベクターｐＨＨ１００及びプロモーターのライブラリーを含むｐＨＨ１００−ライブラリーを生じた。ｐＨＨ１００−ライブラリーは、８０００個の独立した形質転換細胞を含む。それは次に「材料及び方法」に記述されたように、接合によりＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに転移された。
【００８９】
突然変異されたＰｍプロモーターのライブラリーを、Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．及びＤｅＬｕｃａ，Ｍ．（１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１，５０１−５０７）により記述されたアッセイを使用してルシフェラーゼ活性についてスクリーニングした。再現できる結果を得るために、細菌は、まず４０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋｍ）を含有する１１０μＬの液状ＰＩＡ培地を含むミクロタイタープレート中で培養しなければならないことが分かった（２５℃、４８時間、９００ｒｐｍで振盪）。いくつかの細菌を次に新しい培地で希釈し、転移のための無菌スタンプを使用し次に２枚のナイロンフィルター上に押した。フィルターを、誘導物質（１ｍＭのｍ−トルエート）を含むかまたは含まないＰＩＡプレートに置き、細菌面を上にし、そして３０℃で１４時間インキュベートした。フィルターを次に３ｍＬのルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むペトリ皿に置き（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム中１ｍＭ、ｐＨ５．０）、液体が均一に分布するまで振盪し、そして１０分間インキュベートした。それをフィルターペーパー上に置いて液体を除き、そして透明なプラスッチクフィルム上に表面を下にして置いた。乾燥したフィルターペーパーをフィルムの表面上に置いて残存する湿気を除いた。ナイロンフィルターを次にＫｏｄａｋ ２０００ＩＲカメラを使用して１０分間露出した。１２００個のコロニーをこの方法によってスクリーニングし、そして誘導物質なしで成長したコロニーから活性を示さないかまたはわずかに弱い活性を示し、そして誘導物質の存在下成長したコロニーから容易に検出できる活性を示した８４個を同定した。これらのコロニーの７９個を再びスクリーニングし、そしてそれらの７５個は、野生型ｐＨＨ１００に比べて誘導物質の不存在下顕著に低い活性を示した。
【００９０】
これらのコロニーの６個を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む１０ｍＬのＬＢで培養した。誘導物質なしのそれらの発現レベルが非常に低いたため、５個を選び、第６番目（Ｐｆ２０１（ｐＨＨ１００−Ｅ１））は、中間のレベルの誘導物質なしの発現を有するばかりでなく、誘導物質の存在下顕著に高い発現レベルを有した。定常期の培養（１００μＬ）を次に１０ｍＬの新しいＬＢ培地を含む２つの振盪フラスコに移し、そして１ｍＭの最終濃度へｍ−トルエートを加える前に２時間インキュベートした。培養を誘導１４時間後収穫した。９０μＬの培養を次に１０μＬの緩衝液（１ＭのＫ２ＨＰＯ４、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）を含む１．５ｍＬの管に添加し、そして−８０℃で冷凍した。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５００）からのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ系を使用して測定した（表５）。この方法は、野生型に比べて、非常に低い未誘導発現レベルを達成するのみならず、低い未誘導発現レベルさらに高い誘導された発現レベルを有する突然変異プロモーターを見いだすのに有用であることを証明した。結果は以下の表に示される。
【００９１】
【表９】
【００９２】
菌株ＮＣＩＭＢ １０５２５をブランクとして使用し、そして測定できる活性を有しなかった。各菌株の２つの独立した接種からの平均の結果が示される。ａ：活性は、任意の単位で示される（値は装置の設定に依存する）。ｂ：野生型レベルの％における活性。ｃ：誘導された値／誘導されていない値。
【実施例１０】
【００９３】
マンヌロナンアルギネート生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏエピマー化
実施例４に記述されたマンヌロナン生成物を、緩衝液（Ｍｏｐｓ（５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ６．９）に溶解して０．２５％のマンヌロナンアルギネートの濃度にした。マンヌロナンＣ５−エピメラーゼＡｌｇＥ４は、Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，２４，ｐ．６３６−６４６により記述されたように生産かつ精製され、１ｍｇ酵素／２００ｍｇマンヌロナンの濃度に添加した。溶液を２３時間３７℃でインキュベートした。エピマー化は、アルギネートの酸沈澱により停止された。アルギネートを次に蒸留水に再溶解し、そしてアルカリにより中和した。アルギネート溶液に０．２％の濃度にＮａＣｌを加え、そして１容積のエタノール（９６％）を添加してアルギネートを沈澱させた。沈澱したアルギネートを７０％エタノールで３回、９６％エタノールで２回洗い、凍結乾燥した。凍結乾燥したアルギネートを、「材料及び方法」に記述したように、さらに処理し、そしてＮＭＲにより分析した。このインキュベート後の生成物は、ほとんど完全にポリ交互アルギネート（ＰｏｌｙＭＧ、表６）であった。
【００９４】
ポリＭＧを緩衝液（Ｍｏｐｓ（５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ６．９）に再溶解した。マンヌロナンＣ５−エピメラーゼＡｌｇＥ１を、Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，２４，ｐ．６３６−６４６により記述されたように生産し精製したが、但しそれはイオン交換クロマトグラフィーによってのみ精製された。それは、１ｍｇ酵素／２００ｍｇマンヌロナンの濃度に添加された。溶液を４日間３７℃でインキュベートした。追加のＡｌｇＥ１（１ｍｇ酵素／２００ｍｇマンヌロナン）を、１、２及び３日間のインキュベート後添加した。エピマー化を上述のように停止した。アルギネートを、上記のように単離しそしてＮＭＲにより分析した。エピマー化の結果は、＞９５％のＧ含量を有するアルギネートであった（表６）。
【００９５】
【表１０】
【実施例１１】
【００９６】
異なる炭素源を利用するアルギネートの生産
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅｓは、成長のために多数の化合物を利用する能力を有することが知られている。この実施例では、アルギネートへ異なる炭素源を代謝する能力は、フルクトースを実際の炭素源により置換したＰＭ５培地を使用して立証される。これらの発酵実験の培地の組成、成長条件及びアルギネートの濃度の分析は、特に述べられていない限り、「材料及び方法の一般的な記述」に記載されたように行われた。
【００９７】
アルギネートを生産する能力は、アルコール（グリセロール）、単糖（フルクトース、グルコース）及び二糖（ラクトース）について立証される（表７参照）。
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、β−ガラクトシダーゼをエンコードせず、そのため、たとえそれがグルコース及びガラクトースの両者で成長できるとしても、炭素源としてラクトースを使用することができない。本発明者は、Ｍｏｓｔａｆａ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｅｉｓ，Ａ．，２００２，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２６１９−２６２３に記載されたようにＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）及びラクトースパーマーゼ（ＬａｃＹ）をエンコードするプラスミドｐＨＭ２を、本明細書の相同的組み換えの章で記述されたように接合により、菌株Ｐｆ２０１に転移した。得られる菌株は、Ｐｆ２０１（ｐＨＭ２）とよばれる。プラスミドの損失の問題を避けるために、ｌａｃＺ及びｌａｃＹは、好ましくは、プラスミドｐＣＮＢ１１１の誘導体を使用して染色体中に挿入できるだろう。チーズの製造からの廃棄生成物であるホエイは、ラクトースを多量に含む。Ｐｆ２０１（ｐＨＭ２）を２７．５％の限外濾過したホエイ（培地中５０．９ｇ／Ｌのラクトースに相当する）で培養したとき、１３．３ｇ／Ｌのアルギネートが生産された。
【００９８】
得られた結果は、表７に示され、そして多数の炭素源が、アルギネートを過剰に生産する突然変異菌株によって多量のアルギネートを生ずるのに利用できることを示す。
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多量のアルギネートを生産できるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新しい突然変異菌株及びその変異株に関する。アルギネートは、多量に生産されるばかりか、或る確定した含量のマンヌロネート及びグルロネート残基、アルギネート中のアセチル基の可能な存在及び確定したレベル及びアルギネートの所望の分子量で生産される。また、アルギネート生産の調節による高収率の突然変異体が記述される。本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新しい突然変異菌株及びその変異株を生産する方法、並びにアルギネート生産における得られた菌株の
使用をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの微生物がアルギネートを生産することは周知であり、最も研究されている
細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。しかし、それが栄養物または薬品に使用するためにアルギネートの生産に使用されるとき、使用が制限される。それは、それが哺乳動物またはヒトにおいて一次及び二次の感染を伴うからである。より安全な源であるかもしれない他の種は、顕著な量のアルギネート、または充分な分子量のアルギネートを通常生産せず、この理由で使用することができない。
【０００３】
Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓの非病原種例えばＰ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓが、アセチル化アルギネートに似たエキソ多糖類を生産することは周知である（非特許文献１）。また非特許文献２は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＰ．ｐｕｔｉｄａからのアルギネートの生産を記載している。しかし、これらの菌株のなかでアルギネートの安定なしかも過剰に生産する菌は知られていない。
【０００４】
特許文献１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａの新規な菌株を使用する多糖類の生産を記載している。菌株は、所望の多糖類を良好な収率で生産し、そして連続発酵に比較的安定である。菌株は、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａの野生型培養をカルベニシリンと接触させ、そして突然変異誘発因子により選択された抵抗ムコイドクローンを突然変異誘発することにより生産される。最も安定で従って最も好ましいのは、ＮＣＩＢ １１６８７として寄託されている。高濃度すなわち約２０ｇ／Ｌのアルギネートが、最小のグルコース培地での窒素限定連続培養で得られた。アルギネートリアーゼ活性は、培養に存在し、そしてプリンティンググレードのアルギネートと同様のレオロジーを有する低分子量かつ低粘度のポリマーを生じた。リアーゼ酵素による劣化は、培地への蛋白溶解酵素の添加により修復された（非特許文献３）。連続培養の１０世代後、非ムコイド変異株が生じた（非特許文献４）。
【０００５】
日和見病原菌Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのエピメラーゼマイナス突然変異体は、非特許文献５に報告されている。ムコイドＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＦＲＤ１は、化学的に突然変異誘発され、そしてアルギネート中にグルロン酸（Ｇ）残基を組み込むことのできない突然変異体が独立して単離された。Ｇ特異性アルギネートリアーゼ及び１Ｈ核磁気共鳴分析は、Ｇ残基がこれらの突然変異体により分泌されるアルギネートに存在しなかったことを示した。非特許文献５は、１．７ｇ／ＬのアルギネートをＦＲＤ１から振盪フラスコ中で生産した。自発的アルギネート生産菌において普通生ずるように、非ムコイド復帰突然変異体がしばしば生ずる（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許４４９０４６７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｏｖａｎ Ｊ．Ｒ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８１），１２５，ｐ．２１７−２２０
【非特許文献２】Ｃｏｎｔｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），１４０，ｐ．１１２５−１１３２
【非特許文献３】Ｈａｃｋｉｎｇ Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９，ｐ．３４７３−３４８０
【非特許文献４】Ｓｅｎｇｈａ Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３５，ｐ．７９５−８０４，ｐａｇｅ ７９９，ｓｅｃｏｎｄ ｐａｒａｇｒａｐｈ
【非特許文献５】Ｃｈｉｔｎｉｓ ｅｔ．ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，ｐ．２８９４−２９００
【非特許文献６】Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｏｈｍａｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，ｐ．１５９３−１６０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、多量に信頼できるアルギネートを生産できる好適な源が、市場において求められている。特に、規定された構造及び所望の分子量を有する高品質なアルギネートを多量に生産する安定な源が求められ、特に多量の生物学的に活性なアルギネートを生産する源が求められている。その上、また予定されたグルロネート残基（Ｇ）含量を有するアルギネートを得るために、ｉｎ ｖｉｔｒｏエピマー化されうる純粋なマンヌロナンを生産することも求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、安定でありしかも多量のアルギネートを生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新規な突然変異菌株を提供する。本発明のいくつかの態様は、その変異株を提供し、それらは、マンヌロネート及びグルロネートの残基の含量に関して規定された構造、Ｏ−アセチル基の可能な存在及び確定したレベル並びにアルギネート分子の所望の分子量を有するアルギネートを生産する。また、調節されたアルギネート生産を伴う高収率の突然変異体及びそれらを生産する方法が記述される。本発明の他の構成は、以下の通りである。その変異株を含むＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新規な突然変異菌株、並びにアルギネートの生産における得られた突然変異体の使用、特にアルギネートの中間スケールまたは大規模な発酵生産そしてさらに特に生物学的に活性なアルギネートまたは純粋なマンヌロナンの生産。得られるアルギネートは、種々の食品及び工業用製品、例えば栄養物、動物飼料、化粧品及び薬品に応用可能であり、それらはまた例えば米国特許５９３９２８９のエピメラーゼにより、マンヌロナン−Ｃ５エピメラーゼによるさらなる改変に好適な中間体を構成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】自殺ベクターｐＨＥ５５及びｐＭＧ４８の制限エンドヌクレアーゼマップ。表１参照。ユニーク制限酵素部位のみが示される。
【図２】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＮＣＩＭＢ １０５２５の突然変異菌株による発酵における成長及びアルギネートの生産。
【図３】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ突然変異菌株Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８により生産されるアルギネートの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。他のエピメラーゼマイナス突然変異体（表３）からのマンヌロナンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｐｆ２０１１８に関するものと同じであった。
【図４】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのアルギネート生合成オペロン及び上流開放読み枠が示される。クローンされたフラグメントは、マップラインの箱としてマークされている。クローニングについて使用される制限部位のみが示される。全長は１８ｋｂである。
【図５】プラスミドｐＭＣ１の制限エンドヌクレアーゼのマップ。ユニーク制限酵素のみが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養を提供し、該菌株は多量のアルギネートを生産する。本発明の第一の構成では、該菌株は、培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産する。好ましい態様では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養は、培地１Ｌあたり４０−５５ｇの炭素源あたりそしてさらに好ましくは培地１Ｌあたり５０−５５ｇの炭素源あたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し、そして最も好ましくはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養は、培地１Ｌあたり４０ｇの炭素源あたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産する。
【００１２】
本発明により包含されるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細菌の純粋な突然変異菌株及びその変異株は、突然変異菌株Ｐｆ２０１、Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８、Ｐｆ２０１３７、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△、Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒ及びＰｆ２０１ＭＣからなる群から選ばれる突然変異菌株により例示される。いくつかの態様では、本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの菌株の生物学的に純粋な細菌培養に関し、その菌株は、Ｐｆ２０１のアルギネート生産特徴及びこれらの特徴を保持するその変異株によりアルギネートを生産する。この「アルギネート生産特徴」は、以下の１つ以上である。アルギネートｇ／培地（ｇ／Ｌ）及びアルギネートｇ／炭素源ｇ（ｇ／炭素源ｇ）による収量、平均分子質量、アセチル化度及び生産されたアルギネートのＧ−含量。
【００１３】
第二の構成では、本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株に関し、該突然変異体は、マンヌロネート残基のみからなるアルギネートを多量に生産できる。好ましい変異株は、Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８及びＰｆ２０１３７から選択される。
【００１４】
第三の構成では、本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株に関し、該突然変異体は、０−３０％の規定されたグルロネート残基（Ｇ）含量を有するアルギネートを多量に生産できる。これらの態様は、野生型ａｌｇＧ遺伝子を突然変異体遺伝子により交換することにより、またはａｌｇＧ遺伝子を交替して野生型酵素より低い特異的活性を有するマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ酵素をエンコードすることにより、本発明の方法によって生成できる。
【００１５】
本発明の第四の構成では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株は、減少した数のＯ−アセチル基を有するかまたは有しないアルギネートを多量に生産できる。これらの態様は、遺伝子ａｌｇＩ、ａｌｇＪ及び／またはａｌｇＦの一部または全部を欠失することにより生成できる。突然変異菌株Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇＦ△は、減少した数のＯ−アセチル基を有するかまたは有しないアルギネートを多量に生産でき、そして本発明のこの構成の好ましい態様を示す。
【００１６】
本発明の第五の構成では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株は、所望の分子量を有するアルギネートを多量に生産できる。アルギネートの分子量は、好ましくは５００００−３００００００ダルトンである。これらの態様は、野生型リアーゼ酵素より低い特異的活性を有するアルギネートリアーゼ酵素をエンコードする突然変異体遺伝子により野生型ａｌｇＬを交換することによって生成できる。純粋な突然変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒは、該突然変異体の好ましい態様を示し、それは所望の高分子量を有するアルギネートを多量に生産できる。
【００１７】
本発明の第六の構成では、アルギネートを多量に生産できるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの純粋な突然変異菌株は、天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導プロモーターにより調節されるアルギネート生合成オペロン、並びに所望により１つ以上のエフェクター遺伝子からなる。誘導プロモーターは、好ましくはＰｍプロモーターであり、そしてエフェクター遺伝子はｘｙｌＳである。１つの好ましい態様によれば、該突然変異菌株は、Ｐｆ２０１ＭＣである。
【００１８】
本発明の第七の構成は、本発明のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの新規な突然変異菌株を生産する方法を提供し、それは
（ａ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓの野生型菌株を突然変異誘発因子と接触させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の処理された細菌を１つ以上の抗生物質の存在下成長させ、そして
（ｃ）抗生物質抵抗性ムコイド突然変異体を選択により単離し、そして
（ｄ）工程（ｃ）の単離されたムコイド突然変異体のアルギネート生産性を測定する。
【００１９】
この方法の工程（ａ）の突然変異誘発因子は、好ましくはニトロソグアニジンであり、そして工程（ｂ）で適用される抗生物質は、β−ラクタム及び／またはアミノグリコシド抗生物質であり、好ましくは抗生物質はカルベニシリンである。抗生物質は、８００−１０００μｇ／培地１ｍＬの範囲で、そしてさらに好ましくは９００μｇ／培地１ｍＬの量で存在できる。
【００２０】
なお他の構成では、本発明は、アルギネート生合成オペロンが天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導プロモーターそして所望により１つ以上のエフェクター遺伝子により調節される、アルギネートを多量に生産できるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株を生成する方法であって、
（ｉ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓの野生型菌株のアルギネート生合成オペロンプロモーターを相同的組み換えにより誘導プロモーターと交換し、そして
（ｉｉ）所望のエフェクター遺伝子を、相同的組み換え、トランスポゾン突然変異誘発によりまたはプラスミドによって（ｉ）の細菌中に誘導し、そして
（ｉｉｉ）突然変異体を成長させ、次に選択により単離し、そして
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の単離された突然変異体のアルギネート生産性を測定する。本発明による方法の１つの態様では、誘導プロモーターは、例えば実施例９に例示されるＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｔｏｌ−プラスミドからのＰｍまたは突然変異されたＰｍプロモーターである。
【００２１】
さらに他の構成では、本発明は、請求項８のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株を生成する方法であって、
ａ）Ｃ−５エピメラーゼをエンコードする野生型ａｌｇＧ−遺伝子を、プラスミドまたはミニトランスポゾンにクローンし、そして化学的突然変異誘発によりまたはＰＣＲにより突然変異誘発し、
ｂ）ａｌｇＧ遺伝子（△ａｌｇＧ菌株）を欠くＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのアルギネート生産菌株の誘導体を構築し、そして
ｃ）工程（ａ）の突然変異を誘発されたａｌｇＧのライブラリーをＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの△ａｌｇＧ菌株に転移し、そしてプラスミドまたはトランスポゾン含有菌株をアルギネート生産及びエピメラーゼ活性について同定かつアッセイし、そして
ｄ）０−３０％のグルロン酸残基を含むアルギネートをもたらすエピメラーゼをエンコードする突然変異体ａｌｇＧを含有するプラスミドまたはトランスポゾン含有菌株を、工程（ｃ）のアッセイによって同定し、そして
ｅ）突然変異体ａｌｇＧを遺伝子置換ベクター中にクローンし、そして
ｆ）工程（ｅ）の遺伝子置換ベクターを次に突然変異体ａｌｇＧ遺伝子によりそのａｌｇＧ遺伝子を置換するためにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのアルギネート生産菌株に転移しそしてそれを突然変異遺伝子を発現させうるようにする。
【００２２】
本発明の他の構成は、請求項８のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株を生成する方法に関し、その方法は、
ａ）エピマー化に重要であることを突然変異誘発及び次のスクリーニングにより同定する１つ以上のアミノ酸を、突然変異体及び野生型ＡｌｇＧ蛋白の両者に生ずるものとは異なるアミノ酸へ、遺伝子レベルで部位特異的突然変異誘発により交換し、そして
ｂ）突然変異遺伝子を遺伝子置換ベクター中にクローンし、そしてこのベクターをＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのアルギネート生産菌株に転移して、それが野生型ａｌｇＧ遺伝子を置換しそして発現されうる。
【００２３】
他の構成では、本発明は、アルギネートの生産に関し本明細書で記述されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの少なくとも１つの突然変異菌株の生物学的に純粋な細菌培養の使用、並びに薬品、化粧品、動物飼料または栄養剤、またはｉｎ ｖｉｔｒｏＣ−５エピマー化用の中間体のような工業製品または食品の製造における生産されたアルギネートの使用を提供する。
【００２４】
本発明の突然変異菌株Ｐｆ２０１、Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８、Ｐｆ２０１３７、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△、Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒ及びＰｆ２０１ＭＣは、それぞれ以下の受け付け番号４１１３７、４１１３８、４１１３９、４１１４０、４１１４１、４１１４２、４１１４３、４１１４４及び４１１４５の下、２００２年７月１６日にＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ）に寄託されている。寄託は、ブカレスト条約に従って行われた。
【００２５】
定義
本発明の新規な突然変異菌株及びその変異株は、アルギネートを多量に生産するが、「多量」は、本明細書で使用されるとき、１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを意味する。培地１Ｌあたり１０ｇのアルギネートの量は、好ましくは、培地１Ｌあたり４０−５５ｇの炭素源、さらに好ましくは培地１Ｌあたり５０−５５ｇの炭素源または最も好ましくは培地１Ｌあたり４０ｇの炭素源により達成される。アルギネートの収量は、１Ｌあたり３５ｇのアルギネートに達することができるが、使用される炭素源の約２０−５０重量％の量がさらにしばしば達成される。
【００２６】
好適な「炭素源」は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、アルコール、有機酸から選択されるがこれらに限定されず、そして例えばフルクトース、グルコース、ガラクトース、砂糖、乳糖、グリセロール、澱粉、ホエイ、糖蜜、砂糖シロップ、または乳酸（ラクテート）であるが、標準の教科書例えばＢｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ及びＪｏｈｎ Ｇ．Ｈｏｌｔ編集、１９８４、バルチモア、米国に記載されているような他のＣ源も等しく使用できる。それらが突然変異細菌によるアルギネート生産に利用できる前に、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路を経てそれらの対応するトリオースホスフェートに転換されない炭素源の使用は、通常、最高の収率を生ずるだろうことを理解されねばならない（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，ｐ．２３８−２４５）。好ましくは、本発明のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株による培地１Ｌあたり１０ｇより多いアルギネートの生産は、もし培地１Ｌあたり４０ｇのフルクトースまたはグリセロールが炭素源として使用されるならば、得られる。アルギネートの大量生産は、当業者に周知の任意の好適な方法で実施できるが、好ましくは発酵槽で生ずる。発酵は、恐らく炭素源及び他の適切な成分の供給とともに、バッチ、供給バッチまたは連続で行われる。発酵は、５−３５℃の以内の温度で実施される。この範囲の下方の温度は、或る場合には選択できるだろうが、好ましくは発酵は２０−３０℃で実施される。
【００２７】
発酵の培地、酸素化、ｐＨ、発酵時間、撹拌及び他の可能な条件は、当業者の一般的な知識内にあると思われ、そして２つ以上の条件の多数の組み合わせが、同じ多量のアルギネートの収量を導くこと、そして本発明がこれらの条件の特定の組み合わせに制限されないことを理解すべきである。
【００２８】
突然変異菌株及びその変異株は、本発明によれば、「安定」である、すなわち、それらは、それらが６０世代以上生育したとき、アルギネートを生産しない菌株に復帰しない。突然変異体は、「材料及び方法」に示されたような標準の培養条件下で振盪フラスコ中のＰＩＡ培地で生育された。ただし、培地は２４時間毎に新鮮なＰＩＡ培地により置換した（連続培養）。
【００２９】
「突然変異菌株」は、本明細書で使用されるとき、すべてアルギネートを多量に生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ２０１の突然変異菌株並びに突然変異菌株の変異株からなる。好ましい態様では、「突然変異菌株」は、すべてアルギネートを多量に生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ２０１の突然変異菌株をいう。変異株は、Ｐｆ２０１突然変異菌株のさらなる突然変異誘発及び／またはさらなる遺伝子工学の結果、または野生型Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株の遺伝子工学または突然変異誘発の結果であろう。変異株は、或る確定された構造のアルギネートを多量に生産するだろう。また、本明細書で規定された突然変異の任意の組み合わせを含む変異株は、この表現により包含されるものと考えられる。
【００３０】
本発明に従って生産されるアルギネートは、「所望の分子量」を有するだろう。好ましくは、５００００−３００００００ダルトン、さらに好ましくは２０００００−２００００００ダルトンそして最も好ましくは３０００００ダルトン以上の範囲の分子量（Ｍｗ）を有するアルギネートが生産される。
【００３１】
本明細書で使用される表現「生物学的に活性なアルギネート」により、生物学的系に影響を有するアルギネートを意味し、すなわち、或る生物活性のアルギネートの分子構造は、或る細胞系で生物学的応答を誘導することが知られている。これらの生物学的なアルギネートは、全ウロン酸含量の０−３０％のグルロン酸（グルロネート）残基を低い含量で有し、そして好ましくはグルロン酸残基含量は１−１５％、そしてさらに好ましくは１−１０％である。
【００３２】
材料及び方法の一般的な記述
細菌の成長のために使用される原料及び培地
本発明で使用される細菌の菌株、ファージ及びプラスミドは、以下の表１にリストされる。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの菌株は、通常、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、及び５ｇ／ＬのＮａＣｌ）または１５ｇ／Ｌのアガーを含むＬＢ培地であるＬＡ培地に、それぞれ３７℃及び３０℃で培養された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ単離アガー（ＰＩＡ、Ｄｉｆｃｏ）は、またＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの増殖に使用された。λファージの増殖に使用されるＥ．ｃｏｌｉは、マルトース（０．２％）及びＭｇＳＯ４（１０ｍＭ）を補給されたＬＢ培地で培養された。抗生物質は、通常の成長実験に使用されるとき、以下の濃度で存在した。アンピシリン１００−２００μｇ／ｍＬ、カナマイシン４０μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍＬ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び３０μｇ／ｍＬ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）。
【００３３】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルギネートの生産；培地及び培養条件
培地
振盪フラスコ中のアルギネートの生産の実験は、細菌用ペプトン（２０ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（１．４ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＳＯ４（１０ｇ／Ｌ）及び８７％グリセロール（２０ｍＬ／Ｌ）を含むＰＩＡ培地、または減少した塩を含むＰＩＡ培地（Ｋ２ＳＯ４なしのＰＩＡ培地）で行われた。他に述べられていないならば、プロテアーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ２．４Ｌ（０．１５ｍＬ／Ｌ）及びＮｅｕｔｒａｓｅ０．５Ｌ（０．１５ｍＬ／Ｌ））を添加して細胞外アルギネートリアーゼ活性を低下させた。Ａｌｋａｌａｓｅ及びＮｅｕｔｒａｓｅは、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから購入した。
【００３４】
発酵槽中のアルギネートの生産は、フルクトース（４０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（１２ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．６ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１１．７ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ（０．３ｇ／Ｌ）及びクレロール（ｃｌｅｒｏｌ）ＦＢＡ６２２（消泡剤）（０．ｇ／Ｌ）を含むＰＭ５培地で行われた。プロテアーゼ（Ａｌｋａｌａｓｅ２．４Ｌ（０．２５ｍＬ／Ｌ）及びＮｅｕｔｒａｓｅ０．５Ｌ（０．２５ｍＬ／Ｌ））を添加して細胞外アルギネートリアーゼ活性を低下させた。
【００３５】
標準接種物（凍結保護剤としてのグリセロールを有する凍結培養）の製造
アガープレートからのコロニー（２−３日間３０℃でインキュベート、ＰＩＡ培地）は、１００ｍＬのＬＢ培地を有する振盪フラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）に移される。振盪フラスコを、回転式振盪器（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で１６−２０時間３０℃でインキュベートする。保存のために、滅菌グリセロールを１５％の濃度で培養液に添加する。混合物を滅菌凍結バイアル（Ｎｕｎｃ）に移し、そして−８０℃で貯蔵する。
【００３６】
振盪フラスコ及び発酵槽の生産実験用の接種物の製造
１ｍＬの標準接種物を、１００ｍＬのＬＢ培地を有する振盪フラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）に移す。振盪フラスコを、回転式振盪器（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で１６−２０時間３０℃でインキュベートする。
【００３７】
振盪フラスコにおけるアルギネートの生産
１−２容量％の接種物（上記参照）を、１００ｍＬのＰＩＡ培地または塩の減少したＰＩＡ培地を含む振盪フラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）に移す。振盪フラスコを、回転式振盪器（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で４８時間２５℃でインキュベートする。
【００３８】
発酵槽中のアルギネートの生産
振盪フラスコからの２−３容量％の接種物を、１ＬのＰＭ５培地を含む３Ｌ発酵槽（Ａｐｐｌｉｃｏｎ）に移す。発酵を２５℃で行う。開始からのｐＨを７．０−７．２に調節する。ｐＨをＮａＯＨ（２Ｍ）により７．０にコントロールし、そしてｐＨのコントロールを、ｐＨがこの値に達するとき、作動する。培地を通る空気流は、初めの８−１０時間０．２５Ｌ／Ｌ培地（ｖｖｍ）であり、その後それは段階的に上昇して０．９−１．０ｖｖｍにする。溶解した酸素は、撹拌速度の自動的なコントロールによって飽和の２０％にコントロールされる。
【００３９】
適用される標準の技術
プラスミドの単離、ＤＮＡの酵素的操作及びゲル電気泳動は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第三版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓの方法により行われた。Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を、それぞれアガロースゲル及び酵素的反応からのＤＮＡ精製に使用した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質変換は、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６、ｐ．２１７２−２１７５により記載されたように行われたか、または加熱ショック感応塩化ルビジウム細胞の使用により行われた。クローニングのためのＰＣＲ及び対立遺伝子の同定は、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ−ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して行われた。テンプレートとして、プラスミドＤＮＡまたは１μＬのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの一晩の培養の何れかを使用した。第一の変性段階において、反応混合物を３分間９６℃で加熱して、細胞の溶解及びＤＮＡの完全な変性の両者を確実なものにした。部位特異的突然変異誘発をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。表２に示されるプライマーは、ＭｅｄｐｒｏｂｅからまたはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧから購入した。野生型配列のものとは異なるプライマー中のヌクレオチドは、太字で記載され、そして制限酵素部位はアンダーラインされる。ＤＮＡ配列決定は、Ｂｉｇ−Ｄｙｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。
【００４０】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに使用される自殺ベクターの構築
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける相同的組み換えを達成するために、２つの異なる自殺ベクター、ｐＨＥ５５及びｐＭＧ４８を構築した（図１参照）。ｐＨＥ５５の構築は、表１に記述される。それは、ＴｒｆＡをエンコードする遺伝子を欠くＲＫ２に基づくベクターであり、それはプラスミドの複製に必要である。それは、さらにアンピシリン及びテトラサイクリンへの抵抗性を付与し、それは必須要素を選択するのに使用できる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓからのレバンスクラーゼをエンコードするｓａｃＢの発現は、５％スクロースで培養したとき、多くのグラム陰性細菌にとり致命的であることが示されている（Ｇａｙ ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４、ｐ．９１８−９２１）。しかし、スクロース上に非ムコイド及びテトラサイクリン抵抗性トランス複合物（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を成長するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの菌株ＮＣＩＭＢ １０５２５は、あたかも菌株がスクロースを使用してポリマーを生産するかのように、ガラス状のコロニーを生じた。ｓａｃＢ及びスクロース選択は、従ってこの菌株に使用して二重クロスオーバーを明確に選択することはできなかった。ｐＨＥ５５は、いくつかの実験で自殺ベクターとして使用し、その場合アルギネートの生産はマーカーとして使用できた。
【００４１】
プラスミドｐＭＧ４８は、別の組み換えベクターとして構築だれた。ｐＨＥ５５のｓａｃＢ遺伝子は、表１に記載されたようにＴｒｆＡ−ＬａｃＺ融合蛋白をエンコードする遺伝子により置換された。この蛋白は、β−ガラクトシダーゼ活性をしめすが、ＴｒｆＡの本質的な部分を失っている。ＸＧａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むプレートを使用して、６０μＬの２０ｍｇ／ｍＬの原料溶液を、スクリーニングに使用されるそれぞれのアガープレートに添加された。β−ガラクトシダーゼ活性は、必須要素（青色コロニー）についてそして後に第二の組み換え事象（白色コロニー）についての両者の青／白のスクリーニングを可能にする。
【００４２】
相同的組み換え
各端の少なくとも０．５ｋｂのフランキングＤＮＡとともに点突然変異、挿入または欠失の何れかの関心のある突然変異を含むＤＮＡ配列は、ｐＨＥ５５またはｐＭＧ４８の何れかの自殺ベクター中にクローンされた。関心のあるプラスミドにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７．１及び突然変異されるべきＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを、１晩ＬＢ培地でインキュベートした。次に、それらは、新しいＬＢ培地にインキュベートされ、１％の接種物を使用した。接合前に、Ｅ．ｃｏｌｉは２時間培養され、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは４時間培養された。それぞれの培養の１ｍＬを次に混合し、そして３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清のほとんどを取り出し、細胞を残りの液体に再懸濁した。細胞を含む小滴をＬＡ培地に移し、そして１晩３０℃でインキュベートした。細胞を滅菌へらにより取り出し、ＬＢ培地に再懸濁し、そしてベクターが青／白の選択に可能なとき、希釈物を適切な抗生物質及びＸ−Ｇａｌを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ単離アガー（ＰＩＡ、Ｄｉｆｃｏ）に植えた。それぞれのマンヌロナン生産菌株の非ムコイドトランス複合物のコロニーを、テトラサイクリンの不存在下の２−６逐次の液体の一晩の培養でインキュベートして、組み込まれたプラスミドを失わせた。指数的成長培養を１０４−１０９倍に希釈し、適切な培地に植えて異なる菌株についてスクリーニングした。
【００４３】
ＮＭＲスペクトル分析によるアルギネートのＧ含量及びＯ−アセチル化度の測定
発酵からのサンプルを０．２Ｍ ＮａＣｌで希釈し、そして遠心分離して細菌細胞を除いた。アセチル化度の測定のためのサンプルの製造のために、アルギネートを１容積のイソプロパノール（４℃）の添加により細胞のない上清から沈澱し、その後遠心分離により集めた。沈澱したアルギネートを次に７０％エタノールで２回、９６％エタノールで１回洗い、そしてさらに処理する前に蒸留水に再溶解した。Ｇ含量の測定のためのサンプルの製造のために、細胞のない上清中のアルギネートを、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｂｕｃｋｅ，ｐｐ ７１−７８，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．においてＥｒｔｅｓｖａｇ及びＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、１９９９に記述されたように、緩和なアルカリ性処理により脱アセチル化された。脱アセチル化されたアルギネートは、ｐＨ２へＨＣｌを添加することによる酸沈澱により細胞のない上清から単離された。沈澱したアルギネートを遠心分離により集め、蒸留水に再溶解し、そしてアルカリにより中和した。ＮＭＲ分析のためにポリマーの粘度を低下させるために、サンプルを緩和な酸加水分解により分解して約３５の最終の平均重量度（ＤＰｎ）（すなわちポリマー鎖中３５の残基である）にし、中和し、そして凍結乾燥した（Ｅｒｔｅｓｖａｇ及びＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、１９９９、同上）。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ３００−ＭＨｚ分光計を使用して得られた。スペクトルを集積し、そしてグルロネート残基（ＦＧ）、マンヌロネートブロック残基（ＦＭＭ）及び交互のブロック残基（ＦＭＧ＝ＧＭ）のフラクション並びにアセチル化度は、Ｇｒａｓｄａｌｅｎ、１９８３、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１１８、ｐ．２５５−２６０、並びにＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ、Ｇｒａｓｄａｌｅｎ及びＬａｒｓｅｎ、１９８６、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１５４、ｐ．２３９−２５０に記述されたように計算された。
【００４４】
アルギネートの固有粘度の測定及び発酵サンプル中のアルギネート含量の直接測定
生産されたアルギネートを、上記のように、単離し、脱アセチル化し、そして沈澱し、再溶解し、そして中和した。中和したアルギネート溶液にイソプロパノールを添加して再びアルギネートを沈澱させた。沈澱したアルギネートをエタノール（初めに７０％エタノール次に９６％エタノール）により２回洗い、蒸留水に再溶解しそして４８時間蒸留水に対して透析した。透析後、サンプルを凍結乾燥しそして秤量した。アルギネートの固有粘度を、２０℃でＵｂｂｅｌｏｄｈｅ毛管（直径＝０．５３ｍｍ）そして０．１Ｍ ＮａＣｌの添加した塩の濃度を使用して、自動希釈を備えたＳｃｏｔｔ−Ｇｅｒａｅｔｅ装置で測定した。方法の原理は、Ｈａｕｇ及びＳｍｉｄｓｒｏｄ、１９６２、Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．、１６、ｐ．１５６９−１５７８に記述されたものである。
【００４５】
発酵サンプル中のアルギネート含量の酵素的測定
アルギネートの含量は、Ｏｓｔｇａａｒｄ、１９９２、１９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｐ．５１−５９により記述されているように、アバロンからのＭ特異性リアーゼ並びにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓからのＧ−リアーゼを使用して測定された。
【００４６】
発酵からのサンプルは、０．２Ｍ ＮａＣｌで希釈され（２−２０倍）、遠心分離して細菌細胞を除き、そして脱アセチル化した（上記の通り）。脱アセチル化サンプルを次に希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）、ｐＨ７．５）で希釈してアルギネート０．００５−０．０５％の最終濃度にした。本明細書で記載したように生成し測定されたＬＦ１０／６０（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ＡＳ）またはマンヌロナンを、アッセイのアルギネート標品として使用した。アッセイのために、１容積のサンプルまたは標品及び０．０６容積のアルギネートリアーゼ溶液（約１ｕ／ｍＬ）を２容積の緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）、ｐＨ７．５）に添加し、そして２５℃で３時間インキュベートした。２３０ｎｍでの吸収度を、インキュベーションの前後に記録する。インキュベーション前後のＡ２３０ｎｍにおける相違をサンプル中のアルギネート含量の計算に使用する。このアッセイに使用される結果は、上記のアルギネート含量の直接的な測定と非常に良く相関する。
【００４７】
リアーゼ活性の測定
発酵からの細菌細胞を遠心分離により集め、緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）、ｐＨ７．５）に再懸濁して６６０ｎｍで３−１０の光学密度にしそして超音波処理した。超音波処理後の抽出物をリアーゼ活性について検討した。アバロンからのＭ特異性リアーゼ（Ｏｓｔｇａａｒｄ、１９９２、１９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｐ．５１−５９により記述された）を標品として使用した。サンプル中のリアーゼ活性は、Ｓｃｏｔｔ−Ｇｅｒａｅｔｅ Ｕｂｂｅｌｏｄｈｅ（装置番号５３６２０／ｌｌ）を使用してマンヌロナンの分解速度を測定することによって決定された。マンヌロナン（１ｍｇ／ｍＬ）を緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１２．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（６２．５ｍＭ）、ｐＨ７．５）、４ｍＬのマンヌロナン基質溶液及び０．４ｍＬの希釈された標準溶液に溶解したか、またはサンプルをＵｂｂｅｌｏｄｈｅ毛管に添加した。溶液がＵｂｂｅｌｏｄｈｅの毛管を通過する時間を、１時間の間２分毎に測定した。分析は２５℃で行われた。分析からのデータに基づいて、マンヌロナンの分解速度を計算し、そしてサンプルのリアーゼ活性に相関させた。標準曲線は、標品（０．００５−０．０５ｕ／ｍＬ）としてアバロンＭ−リアーゼを使用して得られた。１単位のリアーゼ活性は、Ｅｒｔｅｓｖａｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８、１８０、ｐ．３７７９−３７８４により記述されたように規定される。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
【表５】
【００５３】
【表６】
【実施例１】
【００５４】
突然変異菌株Ｐｆ２０１の製造
野生型Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ １０５２５を、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｔｄ．（ＮＣＩＭＢ）から購入した。野生型は、アルギネートを顕著な量で生産しない。アルギネートを過剰に生産する突然変異体を単離するために、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ １０５２５の指数的に成長する細胞にニトロソグアニジン（ＮＧ）突然変異誘発を行った。菌株を、０．５％の酵母抽出物を含む栄養ブロス（ＣＭ６７、Ｏｘｏｉｄ）で培養し、そしてクエン酸塩緩衝液中の２５ｕｇ／ｍＬのニトロソグアニジン（ＮＧ）により３０℃で１時間細胞を処理する前に、０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）で２回洗った。突然変異誘発された細胞を、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ／Ｌ）及びＮａＯＨ（〜２．３２ｇ／Ｌ）を含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７．０により洗い、そして酵母抽出物を含む栄養ブロス中に接種（２％）した。細胞は１晩で成長しそして次にＮＧ−ストックを１ｍＬづつ凍結した。
【００５５】
培養の希釈物を、カルベニシリン（９００μｇ／ｍＬ）を含むＰＩＡ培地に植え、３０℃でインキュベートした。二、三のムコイド突然変異体を観察した。４＊１０５より多いコロニーの調査を含むスクリーニングから、２つの最もムコイドの多い突然変異体を、発酵槽の研究におけるさらなる評価に選択した。良い突然変異体Ｐｆ２０１は、発酵で、図２に画かれているように、１Ｌあたりの炭素源として４０ｇのフルクトースを含むＰＭ５培地１Ｌあたり１１−１３ｇのアルギネートを生ずる。成長条件及び培地組成については、「材料及び方法」を参照すること。フルクトースを含むＰＭ５培地を使用し標準の成長条件下でＰｆ２０１によって生産されるアルギネートは、図３から分かるように、Ｇ−ブロックの完全な不存在とともに約３０％Ｇ（グルロネート残基）を含む。独特なアルギネート生産性に基づいて、Ｐｆ２０１菌株は、さらなる菌株の開発について選択された。実施例１のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ突然変異体Ｐｆ２０１は、寄託番号４１１３７でＮＣＩＭＢで寄託されている。
【実施例２】
【００５６】
アルギネート生合成オペロンの部分のクローニング及び配列決定
野生型菌株ＮＣＩＭＢ １０５２５の遺伝子ライブリーを、λＤＡＳＨＩＩ（ラムダＤａｓｈ ＩＩ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入）で構築した。染色体ＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより記述されたように単離した。遺伝子ライブラリーを、次に製造業者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＢａｍＨｌ／Ｇｉｇａｐａｃｋ ｌｌｌ Ｇｏｌｄ Ｅｘｔｒａｃｔ）に従って、ＮＣＩＭＢ １０５２５からの部分的にＳａｕ３Ａｌ消化した染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ消化したラムダＤＡＳＨ ＩＩ中に挿入し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージしたファージによりＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）を感染させることにより構築した。ＤＮＡプローブのラベル化及びハイブリッド化λクローンの検出は、製造業者の指示に従ってＤＩＧ ＤＮＡラベル化及び検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の使用によってなされた。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのａｌｇＥ及びａｌｇＸの部分によりフランキングされたａｌｇＧを含むｐＢＢｇ１０からの３．８Ｍｆｅｌ−Ｎｃｏｌ ＤＮＡフラグメントをラベルしそしてＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓライブラリーをスクリーニングするのに使用した。Ｐｆλ１と呼ばれる１つのハイブリッド化ファージをこの系を使用して検出し、そしてλＤＮＡをＬａｍｂｄａ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。挿入断片をｐＧＥＭ１１中へＳａ／Ｉ消化ＤＮＡフラグメントとしてサブクローンして、４つのサブクローンｐＭＧ２４−２７を得た。サブクローンの末端の配列決定及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのアルギネート生合成オペロンとの比較は、Ｐｆλ１がａｌｇＥの３´部分からのアルギネート生合成オペロンの下流部分を含むことを明らかにした（図４）。
【００５７】
ｐＭＧ２６及びｐＭＧ２７は、Ｑｕｉａｇｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより配列決定されて、ａｌｇＧＸＬＩＪＦＡの完全な配列を得た。この遺伝子の体制は、Ｍａｙ及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２、ｐ．１５１−１５７、Ｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８、ｐ．５８８４−５８８９、Ｐｅｎａｌｏｚａ−Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９、ｐ．４４６４−４４７２、Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｇｅｎｅ、２３２、ｐ．２１７−２２２における既に報告されたアルギネート生合成クラスターに類似しているようにみえる。配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託され、そして寄託番号ＡＦ５２７７９０を与えられている。
【実施例３】
【００５８】
エピメラーゼマイナス変異菌株の製造
実施例１の突然変異菌株Ｐｆ２０１に、実施例１に記述した方法の変法を使用して、ニトロソグアニジンを用いてさらなる突然変異誘発を行った。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ １０５２５の指数的に成長する細胞に、ニトロソグアニジン（ＮＧ）突然変異誘発を行った。細菌細胞を、ＮＨ４ＳＯ４（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（４．４ｍｇ／Ｌ）、ＫＮＯ３（６．１ｍｇ／Ｌ）、マレイン酸（５．８ｇ／Ｌ）、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（６．０５ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（０．２５ｍｇ／Ｌ）及びＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／Ｌ）を含む同じ容積のトリス／マレイン酸（ＴＭ）緩衝液ｐＨ６．０により２回洗った。細胞を、初めの培養容積の８０％のＴＭ緩衝液に再懸濁し、３０℃で１時間ＮＧ（５０μｇ／ｍＬ）に曝した。突然変異誘発された細胞を、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ／Ｌ）及びＮａＯＨ（〜２．３２ｇ／Ｌ）を含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７．０により洗い、そしてＬＢ培地中に接種し（２％接種物）、そして１晩インキュベートした。突然変異誘発工程の致死率は、コントロールとして非突然変異誘発物を使用して約９０％と計算された。突然変異誘発後、培養を１晩ＬＢ培地で成長させ、そして細胞の希釈物を、Ｃｈｉｔｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、ｐ．２８９４−２９００により記述されたように、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓからのＧ−リアーゼ（約０．１ｕ／プレート）を含むＬＡ培地に植えた。このＧ−リアーゼは、アルギネートにおけるＧ−Ｍ（グルロネート−マンヌロネート残基）及びＧ−Ｇ（グルロネート−グルロネート残基）の結合のみを開裂する（Ｈａｕｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１９８、ｐ．１０１−１０９）。
【００５９】
ムコイド突然変異体は、これらの選択的プレートで７５００中約１の頻度で生じた。１つのムコイド突然変異体は単離され、そしてＰｆ２０１１８と命名された。Ｐｆ２０１１８を、ＰＭ５培地を使用して標準の成長条件下で発酵槽で成長させた（「材料及び方法」を参照）。生産されたポリマーは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析により分析された。この分析の結果は、突然変異体が純粋なマンヌロナンを生産したことを示した（図３参照）。いくつかの発酵は、標準の成長条件及びＰＭ５培地を使用してＰｆ２０１１８により行われた。容積の収量は、約３５時間の発酵で、培地１Ｌあたり４０ｇのフルクトースから１Ｌあたり１４−１６ｇの範囲のマンヌロナンであった。Ｐｆ２０１から由来するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ突然変異体Ｐｆ２０１１８に、発酵槽で７０より多い異なる実験を行ったが、それらのどれもマンヌロナン生産性に不安定さを示さなかった。Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８の両者は、非ムコイドコロニーの出現なしに６０世代について成長した。Ｐｆ２０１１８がマンヌロナンＣ−５−エピメラーゼ遺伝子ａｌｇＧに欠点を有するようにみえるが、突然変異がいくらかエピマー化に必要な他の蛋白に影響することを排除できなかった。マンヌロナン生産表現型に関係のある突然変異の予備的局在化は、野生型ａｌｇＧによる突然変異体のそれぞれのａｌｇＧ対立遺伝子の遺伝子置換によって行われた。野生型ａｌｇＧ及び下流ａｌｇＸの初めの１３５ｂｐをエンコードする遺伝子置換ベクターｐＭＧ３１を、表１に記述したように構築した。プラスミドを、選択培地としてテトラサイクリンを含むＰＩＡを使用して、「材料及び方法」に記述したようにＰｆ２０１１８中に接合した。非ムコイドコロニーは、ａｌｇＧ中に組み換えられたｐＭＧ３１としてアルギネートの生合成オペロンの分裂により生じた。非ムコイドトランス接合コロニーは、組み込まれたプラスミドを失わせるために、テトラサイクリンなしの２−６逐次の一晩の液培養でインキュベートされた。指数的に成長する培養を１０４−１０９倍に希釈し、そしてＰＩＡアガープレートに植え付けてムコイド復帰突然変異体についてスクリーニングした。ムコイドコロニーを次にＧ−リアーゼを含むＬ−アガー上に線状に塗って、それらがエピマー化したアルギネートを生産するかどうかをテストした。これらの非ムコイド復帰突然変異体が見いだされ、突然変異がｐＭＧ３１のａｌｇＧＸ´フラグメントに相当するＤＮＡフラグメントにあるべきであったことを確証した。ａｌｇＧ遺伝子は、プライマーＰｆａｌｇＧ３ｒ及びＰｆａｌｇＧ４ｆを使用するＰＣＲにより増幅され、配列決定され、そして突然変異が同定された（表３参照）。
【００６０】
３つの他のエピメラーゼマイナス突然変異体誘導菌株は、上記の方法に従って製造され、そしてそれぞれＰｆ２０１２、Ｐｆ２０１１３及びＰｆ２０１３７と命名された。それらはすべてそれらのａｌｇＧ遺伝子における同定された突然変異を有し、以下の表３に記述されたようにそれらのＡｌｇＧ遺伝子生成物において異なるアミノ酸を生じ、そしてこのアミノ酸の変化は蛋白を不活性化するのに充分である。同じ条件下で成長したとき、突然変異体は、Ｐｆ２０１１８とほぼ同じレベルの純粋なマンヌロナンを生成した。突然変異体のエピマー化の欠点は、ｐＭＧ３１における野生型遺伝子との組み換えにより復帰できた。
【００６１】
【表７】
【００６２】
表３の突然変異菌株は、寄託番号を付されてＮＣＩＭＢに寄託された。Ｐｆ２０１２はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１３８を有し、Ｐｆ２０１３はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１３９を有し、Ｐｆ２０１１８はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１４０を有し、そしてＰｆ２０１３７はＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１１４１を有する。
【実施例４】
【００６３】
アセチラーゼマイナス及び変性突然変異菌株、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△の製造
Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ欠失突然変異体は、ａｌｇＦの部分の枠内欠失のフランキング配列を含む突然変異体ＤＮＡフラグメントを構築することにより先ず作られ、そして次に表１に記述したように、自殺ベクターｐＭＧ４８中にフラグメントを連結した。ｐＭＧ７９と呼ばれる得られたプラスミドは、「材料及び方法」に記載されたように、接合によってＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株Ｐｆ２０１１８に転移され、そしてトランス接合物は、ＸＧａｌ及びテトラサイクリンを含むＰＩＡプレート上の青色のコロニーとして選択された。二重組み換え物を、ＸＧａｌを含むＰＩＡプレート上に白色及びムコイドのコロニーとして選択された。これらの候補物を、テトラサイクリンに対する感受性についてさらにテストした。２４の白色のテトラサイクリン感受性候補物を、表２に示されたように、プライマー対ａｌｇＦ−１−ｆｗ及びａｌｇＦ−２−Ｒｅｖを使用してＰＣＲによってテストし、そして生成物をゲル電気泳動により分析した。候補物の２２からのＰＣＲ生成物は、野生型ａｌｇＦ対立遺伝子（１．０ｋｂ）について予想される長さを有した。しかし、他の２つは、突然変異体△ａｌｇＦ対立遺伝子（０．７ｋｂ）に関する予想された長さを有した。これらの１つは、Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△と命名された。
【００６４】
ａｌｇｌＪの欠失突然変異体は、ａｌｇＩの２６１３´ヌクレオチド及びａｌｇＪの５´１１４０ヌクレオチドを含む１．４ｋｂ Ｎｒｕｌ−Ｈｐａｌ ＤＮＡフラグメントが除かれたｐＭＧ２７の誘導体（ｐＭＧ４９）を先ず生成することにより作られた。欠失構築物は、Ａｌｇｌ及びＡｌｇＪの枠内融合をエンコードして、ＡｌｇＦ及びＡｌｇＡが通常通り翻訳されるべきことを確実にした。ＭＧ４９からの３．４ｋｂ Ｓａｃｉ−Ｘｂａｌ ＤＮＡフラグメントは、次に同じ酵素により消化された自殺ベクターｐＨＥ５５中に連結されて、ｐＭＧ５０を生成した。欠失をフランキングする配列を含むこのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉＳ１７．１からの接合によりＰｆ２０１１８に導入され、そして非ムコイドトランス接合物がテトラサイクリンを含むＰＩＡ培地で選択された。トランス接合物復帰突然変異体は、ＬＡ培地でムコイドテトラサイクリン感受性コロニーとして同定された。４つのａｌｇｌＪ△突然変異体候補物を、プライマー対ＰｆａｃｅｔｙｌＦｗ及びＰｆａｃｅｔｙｌＲｅｖを使用して欠失した領域を含む領域のＰＣＲ増幅によりテストし（図２）、そしてＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。コロニーの２つは野生型フラグメント（１．８ｋｂ）を含んだが、他の２つは突然変異体セグメント（０．４ｋｂ）を含んだ。これらの１つは、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△と命名された。Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△は、「材料及び方法」に記載されたＰＭ５培地及び標準の成長条件を使用して発酵槽で培養され、そして生産されたアルギネートを収穫し、そして前記のように測定した。結果は、以下の表４に示される。両方の変異株は、培地１Ｌあたり１６−１７ｇのアルギネートの収量でマンヌロナンアルギネートを生成した。アセチル基の存在は、「材料及び方法」に記載されたように１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析により決定された。Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△は、アセチル化アルギネートを生成せず、Ｐｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△は、少量のＯ−アセチル基を含むアルギネートを生成した。
【００６５】
【表８】
【００６６】
発酵は、ＰＭ５培地及び標準の成長条件を使用して３Ｌ発酵槽で行われた。分析は、「材料及び方法」で記述された通りになされた。Ｐｆ２０１１８ａｌｇＦ△及びＰｆ２０１１８ａｌｇｌＪ△は、寄託番号４１１４１及び４１１４３の下ＮＣＩＭＢに寄託されている。
【実施例５】
【００６７】
低いアルギネートリアーゼ活性を示す変性誘導突然変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒの製造
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、最近の知識によれば、遺伝子ａｌｇＬによりエンコードされた唯一のアルギネートリアーゼ（ＡｌｇＬ）を有する。この細菌により生成されるアルギネートの分子量をコントロールするための選択肢は、それゆえ、同時に生成されるＡｌｇＬ遺伝子生成物を変性することである。
【００６８】
突然変異プライマー対ａｌｇＬＨ２０３Ｒ１／ａｌｇＬＨ２０３Ｒ２を使用して、Ｐｆ２０１１８のａｌｇＬ遺伝子中にＨｉｓ２０３Ａｒｇ（Ｈ２０３Ｒ）突然変異を発生させた。プライマーは、また対立遺伝子の同定のためにＡｇｅｌ部位を生ずるサイレント突然変異を含む。突然変異プラスミドｐＭＧ７０を表１に述べたように構築し、そして接合によりＰｆ２０１１８染色体に誘導し、そしてトランス接合物をテトラサイクリン及びＸＧａｌを含むＰＩＡ培地で選択した。トランス接合物は、テトラサイクリンのない一連の一晩の培養で成長し、そしてＸＧａｌを有するＰＩＡ培地に接種してＡｌｇＬ突然変異体を単離した。テトラサイクリン感受性突然変異体候補物を、プライマーＰｆａｌｇＬ−ＢｓｐＨｌ−ｐＭＧ２６及びＰｆａｌｇＬＲｅｖ１を使用してａｌｇＬ対立遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングし（表２）、そして対立遺伝子を、ＡｇｅｌによりＰＣＲフラグメントを消化することによって同定した。選ばれた突然変異菌株は、Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒと命名された。
【００６９】
変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒを、塩を少なくしたＰＩＡ培地を使用して振盪フラスコで培養するとき、それは、変異菌株Ｐｆ２０１１８とほぼ同じレベルの量のマンヌロナンを生成する。また、発酵槽中の培養は、２つの変異菌株から生成したのとほぼ同じ量のマンヌロナンを生じた（Ｈ２０３Ｒは１Ｌあたり１２ｇのマンヌロナンアルギネートを生産した）。振盪フラスコ（塩の少ないそしてプロテアーゼ無添加のＰＩＡ培地を使用する）中のＰｆ２０１１８（１５ｄｌ／ｇの固有粘度）及びＰｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒ（３７ｄｌ／ｇの固有粘度）により生産されるマンヌロナンの固有粘度の測定は、後者が分子量が高くなったマンヌロナンを生成することを示す。Ｐｆ２０１は、Ｐｆ２０１１８と同様な固有粘度（１４ｄｌ／ｇ）でアルギネートを生産した。
【００７０】
Ｐｆ２０１、Ｐｆ２０１１８及びＰｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒの細菌細胞を、振盪フラスコの発酵の終わりで収穫しそして超音波処理した。超音波処理後、抽出物をアルギネートリアーゼ活性について調査し、それは「材料及び方法」に示された方法によって測定された。Ｐｆ２０１のリアーゼ活性を１００％と定義して、この方法を使用して２％に低下する活性を検出することができる。Ｐｆ２０１１８は９３％の活性を示した。どんな活性もＰｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒについて検出されず、それが菌株Ｐｆ２０１のそれの２％より小さいことを示した。さらに、プロテアーゼＡｌｋａｌａｓｅ及びＮｅｕｔｒａｓｅが０．１５ｍＬ／Ｌ添加されたとき、固有粘度は、Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８について約５０ｄｌ／ｇに、 Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒについて７０ｄｌ／ｇに増大し、突然変異体リアーゼがいくらかの残存活性を有することを示す。変異菌株Ｐｆ２０１１８ＡｌｇＬＨ２０３Ｒは、寄託番号４１１４４でんＣＩＭＢに寄託されている。
【実施例６】
【００７１】
エピメラーゼ活性の低い突然変異菌株の変異株の製造
突然変異菌株Ｐｆ２０１及びＰｆ２０１１８は、それぞれ約３０％のグルロネート残基含量及び純粋なマンヌロナンを有するｉｎ ｖｉｖｏアルギネートを作る手段をもたらす。０−３０％の中間の量のグルロン酸（グルロネート残基）含量を有するアルギネートは、しかし、また作ることができる。このような菌株を得る１つの方法は、オペロンからエピメラーゼ遺伝子を欠失し、次にプラスミドまたはトランスポゾンの何れかのプロモーターによりコントロールされる遺伝子を導入することである。プラスミドｐＭＧ５３は、表１に記述されたように構築され、このプラスミドは、遺伝子の内部４０％が除かれているａｌｇＧの変異株を含む。このプラスミドは、次にＰｆ２０１に転移され、Ｐｆ２０１△ａｌｇＧと呼ばれるこの欠失を含む菌株は、相同的組み換えにより作られた。この菌株は、非還元末端で不飽和残基を含む小さいリオゴウロナイドを作るが、それはアルギネートを作らない。プラスミドｐＣＮＢ１１１は、自殺プラスミドであり、それはＴｎ５に基づくミニ−トランスポゾンを含む。遺伝子は、それらの発現が誘導Ｐｍプロモーターによりコントロールされるやり方でこのミニトランスポゾン中にクローンできる。野生型ａｌｇＧ遺伝子は、表１に記載したようにこのプラスミドに転移され、プラスミドｐＫＢ１０を生じた。プラスミドは、相同的組み換えの下で「材料及び方法」の一般的な記述に記載されたように、Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ中に接合された。しかし、染色体の組み込みは、この場合トランスポゾンに依存し、相同に依存しない。得られた菌株は、Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ：：ＴｎＫＢ１０と命名された。この菌株は、誘導物質がなくてもアルギネートを生産するが、ポリマーの量は、誘導物質の濃度が高くなるにつれ増加する（示されず）。生成物がＮＭＲによりそして質量スペクトルにより分析されたとき、菌株がアルギネート及びオリゴマーの混合物を生産することが分かった。ｐＫＢ１０は、またＰｆ２０１１８に転移され、菌株Ｐｆ２０１１８：：ＴｎＫＢ１０を生じた。この菌株は、３０％Ｇを含む野生型アルギネート及びマンヌロナンの混合物を生産する（結果は示されず）。これらの結果は、アルギネートの生産に必要なエピメラーゼであるばかりでなく、それはまた蛋白複合体の一部としてエピマー化されることを示す。相同的アルギネートを得るために、エピメラーゼの唯一の形が存在できる。
【００７２】
エピメラーゼ活性の低下した変異菌株を製造する方法は、活性の低下した突然変異体蛋白をエンコードする突然変異体遺伝子により野生型ａｌｇＧを交換する方法である。Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ及びｐＫＢ１０の性質を使用してこれらの突然変異体を得る方法が確立された。Ｅ．ｃｏｌｉＳ１７．１λ−ｐｉｒ（ｐＫＢ１０）の指数的に成長する細胞（ＯＤ６００ｎｍ：０．５）を、ニトロソグアニジンにより突然変異誘発した。５ｍＬの培養からの細胞を、５ｍＬのＴＭ緩衝液（１．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ＳＯ４、０．１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ／ＬのＣａ（ＮＯ３）２、０．２５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、５．８ｇ／Ｌのマレイン酸、６．０５ｇ／Ｌのトリス、ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調節）で２回洗った。細胞を２．８５ｍＬのＴＭ緩衝液に再懸濁し、３０分間３７℃で１００μｇ／ｍＬのニトロソグアニジンにより処理した。懸濁物を３分間氷で冷却し、細胞を遠心分離によりペレットとし、５ｍＬのＬＢで３回洗った。グリセロールを添加して最終濃度を１０％にし、そして再懸濁物を−８０℃で冷凍した。細胞の０．００７％のみが突然変異誘発で生存した。プラスミドを解凍した細胞から単離し、表１のＥ．ｃｏｌｉＳ１７．１λ−ｐｉｒ中に転移した。プラスミドは、ｐＫＢ１０−Ｍ＊と命名されて、それらがｐＫＢ１０の突然変異されたバージョンのライブラリーを構成することを強調した。
【００７３】
ｐＫＢ１０−Ｍ＊を次に「材料及び方法」のセクション（「相同的組み換え」の下）に記載されたようにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ中に接合したが、但し１００μＬの凍結したＥ．ｃｏｌｉλ−ｐｉｒ（ｐＫＢ１０−Ｍ＊）は１０ｍＬのＬＢ培地中に直接接種され、そしてＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株と混合される前に２時間培養した。両者の培養のＯＤ６００ｎｍは０．４であった。３６時間３０℃でＬＡ培地でのインキュベーション後、接合混合物を、４０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＰＩＡ培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した。トランスポゾンＴｎＫＢ１０−Ｍ＊が染色体中に組み込まれているこれらのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞のみが、ｐＫＢ１０及びその誘導体がＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに複製できないために、この培地に成長するだろう。誘導物質がたとえなくても、あるＡｌｇＧがＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＰｍプロモーターから発現され、そしてこのレベルは、菌株Ｐｆ２０１△ａｌｇＧ：：ＴｎＫＢ１０においてムコイドコロニーを生ずるのに充分である。約０．５％のコロニーは非ムコイドであり、これらの細胞のａｌｇＧ遺伝子がＰｍプロモーターまたはｍＲＮＡリーダー配列の何れかの突然変異体により発現しないか、またはＡｌｇＧ蛋白が非機能的であることを示す。
【００７４】
それぞれのプレート（２４５×２４５ｍｍ）は４−５０００コロニーを含み、そしてこれらの１２００−１４００は、自動コロニーピッカー、Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｑ−ｐｉｘｌｌ、Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国を使用して各プレートから拾い上げることができた。小さい（非ムコイド）コロニーを拾い上げないように、パラメーターを調節した。突然変異したライブラリーを含む菌株をスクリーニングする方法を開発した。このスクリーンでは、パラメーター細胞成長、アルギネートの生産（Ｍ−リアーゼ及びＧ−リアーゼの混合物を使用して測定）、及びＧ含量（Ｇ−リアーゼのみを使用することにより測定）は、それぞれ測定された。
【００７５】
細菌の成長
コロニーを、Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｑ−ｐｉｘｌｌコロニーピッカーを使用して９６穴プレートで２つの異なる液体培地に複製した。コロニーを保存するために、１つの複製は、トリクロサン（０．０２５ｇ／Ｌ）及びカナマイシン（Ｋｍ）（４０ｍｇ／Ｌ）を含む１１０μＬのＬＢ培地で培養し、２５℃で４８時間インキュベートした。グリセロール（６０％、４０μＬ）をそれぞれの穴に添加し、溶液を混合しそしてプレートを−８０℃で冷凍した。
【００７６】
他の複製は、０．５×ＰＩＡ（細菌用ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２（０．７ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＳＯ４（５ｇ／Ｌ）、グリセロール（５ｇ／Ｌ）、トリクロサン（０．０２５ｇ／Ｌ）及びＫｍ（４０ｍｇ／Ｌ））で培養された。ｍ−トルエート（誘導物質）を添加して０．１ｍＭにした。細菌を１１０μＬの培地／穴を含む滅菌Ｎｕｎｃ ９６−Ｖ−穴プレートで培養し、そして９００ｒｐｍの回転運動（３ｍｍの振幅）を使用して２５℃で７２時間インキュベートした。
【００７７】
アルギネート生産の測定
ＮａＣｌ（０．２Ｍ、１２０μＬ）をそれぞれの穴に添加し、そして細胞を遠心分離（３９００ｇ、２０℃、３０分間）によってペレットにした。各穴からの５０μＬの上清をＮｕｎｃの９６平穴プレートに移した。アルギネートを、各穴にＮａＯＨ（０．５Ｍ、１０μＬ）に添加し、２５秒間混合し、そして１時間室温でインキュベートすることにより脱アセチル化した。１００μＬのリアーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１．５％ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））を次に添加し、そして溶液を６０秒間混合した。
【００７８】
各穴からの７５μＬをＣｏｓｔａｒ−ＵＶの９６穴プレートに移した。他の１５０μＬのリアーゼ反応緩衝液を添加し、そして溶液を２５秒間混合した。２３０ｎｍでの吸光度（Ａ１）を読み取り、次に８μＬのＧ特異性アルギネートリアーゼ（０．２ｕ／ｍＬ）を各穴に添加した。溶液を２５秒間混合し、そして６０分間室温でインキュベートした。それらを２５秒間混合し、そしてＡ２３０ｎｍで読みとった（Ａ２）。次に、８μＬのＭ特異性アルギネートリアーゼ（１ｕ／ｍＬ）を各穴に加え、溶液を２５秒間混合し、そして６０分間室温でインキュベートした。溶液を再び２５秒間混合し、そしてＡ２３０ｎｍで読みとった（Ａ３）。添加したリアーゼの吸光度を、Ａ２及びＡ３の読み取りから引いた。周知の組成のアルギネート（Ｐｆ２０１１８により生産されたポリマンヌロン酸及びＰｆ２０１により生産された３０％のＧ含量を有するアルギネート）をアッセイにおいて標準として使用した。
【００７９】
アルギネートの全量を式に基づいて計算する。
Ａａｌｇ＝Ａ３−Ａ１
サンプルからのＡａｌｇを既知のアルギネート濃度を有する標準からのＡａｌｇと比較することによって、サンプル中のアルギネートの濃度を計算する。
【００８０】
グルロン酸（Ｇ）含量の測定
サンプル中の相対的Ｇ含量（Ｇｒ）は、式
Ｇｒ＝（Ａ２−Ａ１）／（Ａ３−Ａ１）
サンプルからのＧｒを標準のＧｒと比較することによって、サンプル中のＧ含量を計算した。
【００８１】
１万のコロニーをこの方法でスクリーニングし、そして変更したが零ではない活性を有する二、三の候補物を拾い上げた。これらの突然変異体を次に「材料及び方法」において記述されたように振盪フラスコで培養した。使用したＰＩＡ培地にトリクロサン（０．０２５ｇ／Ｌ）、カナマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）及びｍ−トルエート（０．１ｍＭ）を添加し、そして生成したアルギネートを、「材料及び方法」に記述したようにＮＭＲにより分析した。１つの突然変異体は、１３％のグルロン酸残基のみを含むアルギネートを生産したが、野生型は、約３０％のグルロン酸残基を含むアルギネートを生産した（表４）。純粋のマンヌロナンを生産するいくつかの他の菌株も見いだした。方法は、野生型酵素よりもグルロン酸を少なく誘導するＡｌｇＧの突然変異体形をスクリーニングすることを可能にする。
【００８２】
所望のアルギネート生成物を生産するさらなる突然変異菌株の変異株を生成するために、突然変異体の遺伝子は、本明細書に既述されたように、周知のＰＣＲ技術により回収され、ｐＭＧ４８中にクローンされ、そして相同的組み換えによりＰｆ２０１または実際に過剰に生産する菌株の任意のもの中に転移できる。マンヌロナン生産菌株Ｐｆ２０１２、Ｐｆ２０１３、Ｐｆ２０１１８及びＰｆ２０１３７と同様に、エピマー化に影響するａｌｇＧの点突然変異は、生産されるアルギネートの量に影響しないようである。
【実施例７】
【００８３】
エピメラーゼ活性の低下した突然変異菌株の変異株の製造
エピメラーゼ活性の低下した変異菌株の別の製法は、野生型ａｌｇＧを活性の低い突然変異体蛋白をエンコードする突然変異体遺伝子により交換する方法である。４つの異なるアミノ酸置換は、表３に示されて、ＡｌｇＧのエピメラーゼマイナス突然変異体を生ずる。これらの４つの場合では、アミノ酸の変化は、アミノ酸のサイズまたは電荷の何れかに影響し、それらの２つでは、両方の性質が変化している。可能な追加のアミノ酸は、また実施例６に記述された方法によって見いだされる突然変異体の配列決定により同定できる。これらのアミノ酸におけるさらなる同類変化をエンコードするａｌｇＧの別の対立遺伝子は、テンプレートとしてｐＭＧ２６を使用して部位特異的突然変異誘発によりつくられる。周知の配列に等しい約１０−１５ヌクレオチドによりフランキングした新しいアミノ酸に関するコドンを含む突然変異プライマーがつくられる。Ｓｅｒ３３７における突然変異は、ＳｍａＩ部位を破壊し、他のアミノ酸に関するプライマーは、好ましくは、サイレント突然変異を含み、制限酵素部位を導入して新しい突然変異菌株を同定するのに助けになる。両方の鎖に関するプライマーは合成されるべきであり、そして突然変異誘発は、「材料及び方法」に記述されたように行われる。突然変異されたａｌｇＧ対立遺伝子を次に２．７ｋｂ ＢｓｐＨｌ−ＰｓｔＩ−消化ＤＮＡフラグメントとしてＮｓｉＩ−ＮｃｏＩにより消化されたｐＭＧ４８に転移する。得られたプラスミドは、Ｐｆ２０１そして非ムコイド、テトラサイクリン抵抗性及びＸＧａｌを含むアガープレートで青色であるとして選択されたトランス接合物に転移される。ＬＢ培地でのいくつかの連続する転移について選択されたコロニーを培養後、二重組み換え体を、白色でありＸＧａｌを含むアガープレート上のムコイドコロニーを有しそしてテトラサイクリンに対して感受性を有するものとして選択される。これらの候補物からのａｌＧは、プライマー対ＰｆａｌｇＧ５ｆ及びＰｆａｌｇＧ３ｒを使用して増幅できる。増幅された生成物は長さ１．７ｋｂである。もし制限部位が除かれるかまたはプライマーにより導入されるならば、正確な突然変異体は、対応する制限酵素を使用することにより同定される。別に、候補物は、ＤＮＡ配列決定により確定される。
【００８４】
突然変異菌株を振盪フラスコで培養し、そして生産されたアルギネートを「材料及び方法」に記述されたように単離される。アルギネートの量及びＧ−含量は、「材料及び方法」に記述されたようにＭリアーゼ及びＧリアーゼを使用して測定される。興味のある菌株からの結果は、ＮＭＲスペクトルにより確定される。
【実施例８】
【００８５】
アルギネート生産の調節のための誘導可能なＰｍプロモーターを有する突然変異菌株Ｐｆ２０１ＭＣの製造
そのエフェクターＸｙｌＳとともにＰｍプロモーターは、多くのグラム陰性種で使用できる強い誘導可能なプロモーターであることが知られている。Ｂｌａｔｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、６３、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｐ．３７０−３７９。使用される誘導体は、しばしば、トルエートであり、それは、細菌膜の上に自由に拡散する。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株Ｐｆ０−１は、ＪＧＩ（Ｔｈｅ ＤＯＥ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｉｇｉｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ／ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ／ｐｓｅｕｄｏ ｈｏｍｅｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）で配列決定された。この菌株のアルギネートオペロンを他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からの周知のアルギネートオペロン配列と比較したとき、本発明者は、体制が同様であることを見いだした。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのすべて配列決定されたアルギネート生産種は、またアルギネートプロモーターの同じ保存オペロン読み枠上流を有する。それは、その機能が知られていない蛋白を潜在的にエンコードする。この実験の目的は、この読み枠に関する停止コドンの下流及びアルギネートオペロンの第一の遺伝子であるａｌｇＤの開始コドンの下流の配列を、Ｂｌａｔｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９７、３８、ｐ．３５−５１に記述されたベクターｐＪＢ６５８からのＸｙｌＳをエンコードする配列、Ｐｍプロモーター及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列により置換することであった。ｐＪＢ６５８のｘｙｌＳ及びＰｍプロモーターを分離するＤＮＡセグメントのほとんどは、除かれた。
【００８６】
第一の段階は、挿入のためのフランキング配列を得るために、仮説的（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）蛋白（ｈｙｐと略称）の３´部分及びａｌｇＤの５´部分をクローンすることであった。菌株Ｐｆ０−１のａｌｇＥＧＸＬＩＪＦＡの配列をＮＣＩＭＢ １０５２５の配列と比較したとき、２つの配列が同じでないことが分かった。そのため、プライマーを、いくつかの種で非常に保存されているｈｙｐ及びａｌｇＤ遺伝子の部分を使用して構築した。ｈｙｐの３´部分を、０．７ｋｂＢｓｐＬＵ１１Ｉ−ＳｐｅＩ消化ＰＣＲフラグメントとして表２のプライマーＨｙｐＢｓｐＬＵ１１ｌ及びＨｙｐＳｐｅｌを使用して自殺ベクターｐＭＧ４８中にクローンして、ｐＨＥ１３９を得た。ａｌｇＤの５´部分を０．８ｋｂＮｄｅｌ−Ｎｓｉｌ制限ＰＣＲフラグメントとしてＮｄｅｌ−Ｐｓｔｌ制限ｐＪＢ６５８ｃｅｌＢ中にクローンしてｐＨＥ１３８を得た。置換ベクターｐＭＣ１（図５参照）を次に一連のクローニング段階を経て構築した（表１）。
【００８７】
プラスミドを、「材料及び方法」に記述したように、接合により菌株Ｐｆ２０１に転移し、組み換え体及び以後の二重組み換え体についてスクリーンするためにＸＧａｌ及びテトラサイクリン抵抗性／感受性を選択した。トルエートを含まないＰＩＡ培地より１ｍＭのトルエートを含むＰＩＡ培地でさらにムコイドであるように思われるコロニーを、ＰＣＲによるさらなる分析について選んだ。プライマー対ＨｙｐＢｓｐＬＵ１１Ｉ及びＡｌｇＤＮｓｉｌ（表２）を使用して、野生型菌株からの予想されたＰＣＲ生成物は長さ２．３ｋｂであろうが、突然変異菌株のそれは３．０ｋｂであろう。選ばれた突然変異体をＰｆ２０１ＭＣと命名した。この菌株を次に誘導物質としてトルエート（０．０２５ｍＭ）の存在及び不存在下で発酵させた。ＰＭ５培地及び標準の条件を、「材料及び方法」に記述したように、発酵中使用した。誘導されない培養は、培地１Ｌあたり３．５ｇのアルギネートを生産したが、誘導された培養は、培地１Ｌあたり１３ｇのアルギネートを生産した。突然変異菌株Ｐｆ２０１ＭＣは、寄託番号４１１４５としてＮＣＩＭＢに寄託された。
【実施例９】
【００８８】
アルギネート生産の調節のための誘導可能な突然変異したＰｍプロモーターの使用
野生型Ｐｍプロモーターは機能するが、しかし発現の未誘導レベルはかなり高い。Ｗｉｎｔｈｅｒ−Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．２０００，２，ｐ．９２−１０３の検討に基づいて、該プロモーターの突然変異についてスクリーニングする方法が開発された。最初のｐＪＴ１９−ｂｌａは、ターミネーター配列を挿入することによって変化され、そしてＰｍプロモーターの上流Ａｆ／ＩＩＩ部位及びプロモーターの下流ＳｐｅＩ部位をＢｓｐＬＵ１１Ｉ部位に変化させた。新しいプラスミドは、ｐｌＢ１１と命名された。このプラスミドでは、Ｐｍプロモーターは、ユニークＸｂａｌ及びＢｓｐＬＵ１１Ｉ制限部位によりフランキングされる。このＤＮＡフラグメントをカバーする２つの相補性５０ｂｐＤＮＡオリゴマーを次に合成した。条件を選んでこれらの制限部位によりフランキングされるヌクレオチドにわたって約１２％の誤差率を生じた。対応する野生型鎖も合成された。二本鎖オリゴヌクレオチドのライブラリーを、次に相補性野生型オリゴヌクレオチドにより突然変異を含むオリゴヌクレオチドのそれぞれをアニーリングすることにより作られた。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｘｂａｌ及びＢｓｐＬＵ１１Ｉにより制限されるｐｌＢ１１に相補的であるように構築された。アニーリングされたオリゴヌクレオチドを次にＸｂａｌ及びＢｓｐＬＵ１１ｌにより制限されたｐｌＢ１１中に連結され、そして５００００個の形質転換細胞を得た。Ｅ．ｃｏｌｉでは、このライブラリーは、マーカーとしてアンピシリンに関する抵抗性を使用してスクリーニングされるだろう。しかし、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、既に、β−ラクタムに対してかなり高い抵抗性を有する。β−ラクタムに関する遺伝子は、表１に記述したようにルシフェラーゼをエンコードする遺伝子により置換されて、野生型プロモーターを含むベクターｐＨＨ１００及びプロモーターのライブラリーを含むｐＨＨ１００−ライブラリーを生じた。ｐＨＨ１００−ライブラリーは、８０００個の独立した形質転換細胞を含む。それは次に「材料及び方法」に記述されたように、接合によりＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに転移された。
【００８９】
突然変異されたＰｍプロモーターのライブラリーを、Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．及びＤｅＬｕｃａ，Ｍ．（１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１，５０１−５０７）により記述されたアッセイを使用してルシフェラーゼ活性についてスクリーニングした。再現できる結果を得るために、細菌は、まず４０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋｍ）を含有する１１０μＬの液状ＰＩＡ培地を含むミクロタイタープレート中で培養しなければならないことが分かった（２５℃、４８時間、９００ｒｐｍで振盪）。いくつかの細菌を次に新しい培地で希釈し、転移のための無菌スタンプを使用し次に２枚のナイロンフィルター上に押した。フィルターを、誘導物質（１ｍＭのｍ−トルエート）を含むかまたは含まないＰＩＡプレートに置き、細菌面を上にし、そして３０℃で１４時間インキュベートした。フィルターを次に３ｍＬのルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むペトリ皿に置き（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム中１ｍＭ、ｐＨ５．０）、液体が均一に分布するまで振盪し、そして１０分間インキュベートした。それをフィルターペーパー上に置いて液体を除き、そして透明なプラスッチクフィルム上に表面を下にして置いた。乾燥したフィルターペーパーをフィルムの表面上に置いて残存する湿気を除いた。ナイロンフィルターを次にＫｏｄａｋ ２０００ＩＲカメラを使用して１０分間露出した。１２００個のコロニーをこの方法によってスクリーニングし、そして誘導物質なしで成長したコロニーから活性を示さないかまたはわずかに弱い活性を示し、そして誘導物質の存在下成長したコロニーから容易に検出できる活性を示した８４個を同定した。これらのコロニーの７９個を再びスクリーニングし、そしてそれらの７５個は、野生型ｐＨＨ１００に比べて誘導物質の不存在下顕著に低い活性を示した。
【００９０】
これらのコロニーの６個を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む１０ｍＬのＬＢで培養した。誘導物質なしのそれらの発現レベルが非常に低いたため、５個を選び、第６番目（Ｐｆ２０１（ｐＨＨ１００−Ｅ１））は、中間のレベルの誘導物質なしの発現を有するばかりでなく、誘導物質の存在下顕著に高い発現レベルを有した。定常期の培養（１００μＬ）を次に１０ｍＬの新しいＬＢ培地を含む２つの振盪フラスコに移し、そして１ｍＭの最終濃度へｍ−トルエートを加える前に２時間インキュベートした。培養を誘導１４時間後収穫した。９０μＬの培養を次に１０μＬの緩衝液（１ＭのＫ２ＨＰＯ４、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）を含む１．５ｍＬの管に添加し、そして−８０℃で冷凍した。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５００）からのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ系を使用して測定した（表５）。この方法は、野生型に比べて、非常に低い未誘導発現レベルを達成するのみならず、低い未誘導発現レベルさらに高い誘導された発現レベルを有する突然変異プロモーターを見いだすのに有用であることを証明した。結果は以下の表に示される。
【００９１】
【表９】
【００９２】
菌株ＮＣＩＭＢ １０５２５をブランクとして使用し、そして測定できる活性を有しなかった。各菌株の２つの独立した接種からの平均の結果が示される。ａ：活性は、任意の単位で示される（値は装置の設定に依存する）。ｂ：野生型レベルの％における活性。ｃ：誘導された値／誘導されていない値。
【実施例１０】
【００９３】
マンヌロナンアルギネート生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏエピマー化
実施例４に記述されたマンヌロナン生成物を、緩衝液（Ｍｏｐｓ（５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ６．９）に溶解して０．２５％のマンヌロナンアルギネートの濃度にした。マンヌロナンＣ５−エピメラーゼＡｌｇＥ４は、Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，２４，ｐ．６３６−６４６により記述されたように生産かつ精製され、１ｍｇ酵素／２００ｍｇマンヌロナンの濃度に添加した。溶液を２３時間３７℃でインキュベートした。エピマー化は、アルギネートの酸沈澱により停止された。アルギネートを次に蒸留水に再溶解し、そしてアルカリにより中和した。アルギネート溶液に０．２％の濃度にＮａＣｌを加え、そして１容積のエタノール（９６％）を添加してアルギネートを沈澱させた。沈澱したアルギネートを７０％エタノールで３回、９６％エタノールで２回洗い、凍結乾燥した。凍結乾燥したアルギネートを、「材料及び方法」に記述したように、さらに処理し、そしてＮＭＲにより分析した。このインキュベート後の生成物は、ほとんど完全にポリ交互アルギネート（ＰｏｌｙＭＧ、表６）であった。
【００９４】
ポリＭＧを緩衝液（Ｍｏｐｓ（５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ６．９）に再溶解した。マンヌロナンＣ５−エピメラーゼＡｌｇＥ１を、Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，２４，ｐ．６３６−６４６により記述されたように生産し精製したが、但しそれはイオン交換クロマトグラフィーによってのみ精製された。それは、１ｍｇ酵素／２００ｍｇマンヌロナンの濃度に添加された。溶液を４日間３７℃でインキュベートした。追加のＡｌｇＥ１（１ｍｇ酵素／２００ｍｇマンヌロナン）を、１、２及び３日間のインキュベート後添加した。エピマー化を上述のように停止した。アルギネートを、上記のように単離しそしてＮＭＲにより分析した。エピマー化の結果は、＞９５％のＧ含量を有するアルギネートであった（表６）。
【００９５】
【表１０】
【実施例１１】
【００９６】
異なる炭素源を利用するアルギネートの生産
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅｓは、成長のために多数の化合物を利用する能力を有することが知られている。この実施例では、アルギネートへ異なる炭素源を代謝する能力は、フルクトースを実際の炭素源により置換したＰＭ５培地を使用して立証される。これらの発酵実験の培地の組成、成長条件及びアルギネートの濃度の分析は、特に述べられていない限り、「材料及び方法の一般的な記述」に記載されたように行われた。
【００９７】
アルギネートを生産する能力は、アルコール（グリセロール）、単糖（フルクトース、グルコース）及び二糖（ラクトース）について立証される（表７参照）。
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、β−ガラクトシダーゼをエンコードせず、そのため、たとえそれがグルコース及びガラクトースの両者で成長できるとしても、炭素源としてラクトースを使用することができない。本発明者は、Ｍｏｓｔａｆａ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｅｉｓ，Ａ．，２００２，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２６１９−２６２３に記載されたようにＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）及びラクトースパーマーゼ（ＬａｃＹ）をエンコードするプラスミドｐＨＭ２を、本明細書の相同的組み換えの章で記述されたように接合により、菌株Ｐｆ２０１に転移した。得られる菌株は、Ｐｆ２０１（ｐＨＭ２）とよばれる。プラスミドの損失の問題を避けるために、ｌａｃＺ及びｌａｃＹは、好ましくは、プラスミドｐＣＮＢ１１１の誘導体を使用して染色体中に挿入できるだろう。チーズの製造からの廃棄生成物であるホエイは、ラクトースを多量に含む。Ｐｆ２０１（ｐＨＭ２）を２７．５％の限外濾過したホエイ（培地中５０．９ｇ／Ｌのラクトースに相当する）で培養したとき、１３．３ｇ／Ｌのアルギネートが生産された。
【００９８】
得られた結果は、表７に示され、そして多数の炭素源が、アルギネートを過剰に生産する突然変異菌株によって多量のアルギネートを生ずるのに利用できることを示す。
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
不活性化されている突然変異体ａｌｇＧ遺伝子をさらに有することによってマンヌロネート残基のみからなるアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項２】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
低いエピメラーゼ活性を有するエピメラーゼ酵素をコードする突然変異体ａｌｇＧ遺伝子をさらに有することによって０−３０％の規定されたグルロネート残基（Ｇ）含量を有するアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項３】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
突然変異体ａｌｇＧ遺伝子、突然変異体ａｌｇＩ遺伝子、突然変異体ａｌｇＪ遺伝子、突然変異体ａｌｇＬ遺伝子及び突然変異体ａｌｇＦ遺伝子からなる群から選ばれる突然変異体遺伝子をさらに有することによってＯ−アセチル基を有しない、又は減少した数のＯ−アセチル基を有するアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項４】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
突然変異体ａｌｇＧ遺伝子、突然変異体ａｌｇＩ遺伝子、突然変異体ａｌｇＪ遺伝子、突然変異体ａｌｇＬ遺伝子及び突然変異体ａｌｇＦ遺伝子からなる群から選ばれる突然変異体遺伝子をさらに有することによって５０，０００−３，０００，０００ダルトンの分子量を有するアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項５】
培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株であって、
該突然変異菌株中において、アルギネート生合成オペロンが天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導可能なプロモーターにより調節され、そして任意に１つ以上のエフェクター遺伝子を含む、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項６】
該誘導可能なプロモーターがＰｍプロモーター又はその突然変異体である、
請求項５記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項７】
該誘導可能なプロモーターがＰｍプロモーターであり、エフェクター遺伝子ｘｙｌＳをさらに含む、
請求項５又は６記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項８】
該突然変異菌株は受託番号４１１４５としてＮＣＩＭＢに寄託されている、
請求項５〜７のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に定義されている突然変異遺伝子をさらに含むことによって、請求項１〜４のいずれか１項に定義されているアルギネートのうち対応するものを生産する、
請求項５〜８のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項１０】
（ｉ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの野生型菌株のアルギネート生合成オペロンプロモーターを相同的組換えにより誘導可能なプロモーターと交換し、そして
（ｉｉ）任意のエフェクター遺伝子を、相同的組換え、トランスポゾン突然変異誘発により又はプラスミドの手段によって（ｉ）の細菌中に誘導し、そして
（ｉｉｉ）突然変異体を成長させ、次いで選択により単離し、そして
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の単離された突然変異体のアルギネート生産特性を測定する
請求項５記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の生産方法。
【請求項１１】
該誘導可能なプロモーターはＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｔｏｌ−プラスミドからのＰｍ又は突然変異されたＰｍプロモーターである、
請求項１０記載の生産方法。
【請求項１２】
アルギネートの生産のための、請求項１〜９のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の少なくとも１つの使用。
【請求項１３】
アルギネートの大規模発酵槽生産のための、前記請求項１〜９のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の少なくとも１つの使用。
【請求項１４】
食品、または薬品、化粧品、動物飼料もしくは栄養剤のような工業製品、またはｉｎ ｖｉｔｒｏＣ−５エピマー化用の中間体の製造における、請求項１記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の少なくとも１つにより生産されるアルギネートの使用。
【請求項１】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
不活性化されている突然変異体ａｌｇＧ遺伝子をさらに有することによってマンヌロネート残基のみからなるアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項２】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
低いエピメラーゼ活性を有するエピメラーゼ酵素をコードする突然変異体ａｌｇＧ遺伝子をさらに有することによって０−３０％の規定されたグルロネート残基（Ｇ）含量を有するアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項３】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
突然変異体ａｌｇＧ遺伝子、突然変異体ａｌｇＩ遺伝子、突然変異体ａｌｇＪ遺伝子、突然変異体ａｌｇＬ遺伝子及び突然変異体ａｌｇＦ遺伝子からなる群から選ばれる突然変異体遺伝子をさらに有することによってＯ−アセチル基を有しない、又は減少した数のＯ−アセチル基を有するアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項４】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１１３７としてＮＣＩＭＢに寄託されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体であって、
該突然変異菌株は培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産し且つ少なくとも６０世代を超えて安定であり、
突然変異体ａｌｇＧ遺伝子、突然変異体ａｌｇＩ遺伝子、突然変異体ａｌｇＪ遺伝子、突然変異体ａｌｇＬ遺伝子及び突然変異体ａｌｇＦ遺伝子からなる群から選ばれる突然変異体遺伝子をさらに有することによって５０，０００−３，０００，０００ダルトンの分子量を有するアルギネートを生産する、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株又はその突然変異体。
【請求項５】
培地１Ｌあたり少なくとも１０ｇのアルギネートを生産するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株であって、
該突然変異菌株中において、アルギネート生合成オペロンが天然に生ずるプロモーターとは異なる誘導可能なプロモーターにより調節され、そして任意に１つ以上のエフェクター遺伝子を含む、
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項６】
該誘導可能なプロモーターがＰｍプロモーター又はその突然変異体である、
請求項５記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項７】
該誘導可能なプロモーターがＰｍプロモーターであり、エフェクター遺伝子ｘｙｌＳをさらに含む、
請求項５又は６記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項８】
該突然変異菌株は受託番号４１１４５としてＮＣＩＭＢに寄託されている、
請求項５〜７のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に定義されている突然変異遺伝子をさらに含むことによって、請求項１〜４のいずれか１項に定義されているアルギネートのうち対応するものを生産する、
請求項５〜８のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株。
【請求項１０】
（ｉ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの野生型菌株のアルギネート生合成オペロンプロモーターを相同的組換えにより誘導可能なプロモーターと交換し、そして
（ｉｉ）任意のエフェクター遺伝子を、相同的組換え、トランスポゾン突然変異誘発により又はプラスミドの手段によって（ｉ）の細菌中に誘導し、そして
（ｉｉｉ）突然変異体を成長させ、次いで選択により単離し、そして
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の単離された突然変異体のアルギネート生産特性を測定する
請求項５記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の生産方法。
【請求項１１】
該誘導可能なプロモーターはＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｔｏｌ−プラスミドからのＰｍ又は突然変異されたＰｍプロモーターである、
請求項１０記載の生産方法。
【請求項１２】
アルギネートの生産のための、請求項１〜９のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の少なくとも１つの使用。
【請求項１３】
アルギネートの大規模発酵槽生産のための、前記請求項１〜９のいずれか１項記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の少なくとも１つの使用。
【請求項１４】
食品、または薬品、化粧品、動物飼料もしくは栄養剤のような工業製品、またはｉｎ ｖｉｔｒｏＣ−５エピマー化用の中間体の製造における、請求項１記載のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの突然変異菌株の少なくとも１つにより生産されるアルギネートの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２２７１００（Ｐ２０１０−２２７１００Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９８５２８（Ｐ２０１０−９８５２８）
【出願日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【分割の表示】特願２００４−５２４４０４（Ｐ２００４−５２４４０４）の分割
【原出願日】平成１５年７月２４日（２００３．７．２４）
【出願人】（５０４３６９６６１）エフエムシー バイオポリマー エイエス (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【分割の表示】特願２００４−５２４４０４（Ｐ２００４−５２４４０４）の分割
【原出願日】平成１５年７月２４日（２００３．７．２４）
【出願人】（５０４３６９６６１）エフエムシー バイオポリマー エイエス (14)
【Ｆターム（参考）】
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