ＲＮＡの生物学的分析
本発明は、被検体の尿における腎臓ＲＮＡマーカーを測定することに関連する、腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法、作用物質を特徴付ける方法、作用物質の腎臓への予防的および治療的な特徴を評価する方法、および被検体の腎臓における医薬作用物質の作用のモニター方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００５年１月２８日付けで出願された米国特許本出願番号１１／０４６,３０１、および、２００４年６月３０日付けで出願された米国特許仮出願番号６０／５８４,４６１の利益を主張し、これらは参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、被検体の尿における腎臓ＲＮＡマーカーを測定することに関連する、腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法、作用物質を特徴付ける方法、作用物質の腎臓への保護的および治療的な特徴を評価する方法、および、被検体の腎臓における薬剤の医薬作用物質のモニター方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
製薬分野において、医薬作用物質の毒物学的な潜在性を最小化する多大な努力がなされている。毒物曝露に関連する危険のなかでも、体細胞に障害または死を引き起こす可能性が挙げられ、それにより、生体の器官へのダメージが生じる可能性がある。
【０００４】
ＭａｎｄｅｌおよびＭｅｔａｉｓ（１９４８）は、ヒト血漿中の細胞外核酸の発見を報告した。
【０００５】
Ｌｏ，Ｋ．Ｗ．等（１９９９）およびＫｏｐｒｅｓｋｉ，Ｍ．等（１９９９）は双方とも、癌患者の血漿中での腫瘍由来のＲＮＡの検出を報告している。
【０００６】
Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．等（２０００）は、乳癌患者の血清中の検出マーカーとしてのテロメラーゼＲＮＡの使用を提唱している。
【０００７】
Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．等（２０００）は、母体血漿中の胎児ＲＮＡの存在を報告している。
【０００８】
米国特許第６,３２９,１７９号は、癌または前癌の状態の検出、モニターまたは評価のための、血液の血漿または血清分画中に循環していることが見出された腫瘍由来または腫瘍関連の細胞外ＲＮＡの使用を開示している。
【０００９】
米国特許第６,１５６,５０４号は、新生物に関連する突然変異を含む、ヒトまたは動物における良性、前癌または悪性新生物の存在、進行または臨床状態を、血漿または血清分画中の新生物の突然変異核酸の検出による検出、同定またはモニターすることを開示している。
【００１０】
米国特許第６,０２０,１２４号は、生体液中での突然変異遺伝子および腫瘍遺伝子に関する可溶性ＤＮＡの検出を開示している。
【００１１】
ＲＮＡは不安定と考えられているため、研究者は、ヒト血漿中のＲＮＡを分解から保護する可能性のあるメカニズムを研究してきた。Ｈａｓｓｅｌｍａｎｎ，Ｄ．Ｏ．等（２００１）は、インビトロでのモデルにおいて、黒色腫細胞によって放出されたアポトーシス小体中のｍＲＮＡは、ヒト血清中でインキュベートすると、分解から保護されたことを報告している。
【００１２】
Ｎｇ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．等（２００２）は、相当部分の血漿ｍＲＮＡは粒子に結合していることを報告している。
【００１３】
同一出願人による米国特許出願番号１０／７４５８２３は、細胞中のメッセンジャーＲＮＡ放出を高める物質の能力を測定することによる、物質の細胞にダメージを与える可能性を評価する方法を開示している。
【００１４】
物質が、腎臓において組織および細胞のダメージを引き起こすかどうかを決定するのに利用可能な従来の方法は、尿の物理的および化学的特徴（例えば、色、透明性、臭気、量、重量オスモル濃度、比重、ｐＨ、ならびに沈渣、タンパク質、グルコース、ビリルビン、血液、ウロビリノーゲン、亜硝酸塩および酵素の存在）を測定すること、腎機能試験を行うこと、血中尿素窒素を測定すること、および血清クレアチンを測定することを含む。しかしながら、早期発見のためにこのような指標を使用するための能力は、酵素放出の速さや検出感度などの多数の因子に依存する。従って、従来の毒性検出方法に比べてより高い特異性と感度を有する毒性のさらなる早期の生物学的指標またはバイオマーカーを見出すことへの関心が高まっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
腎臓特異的アンドロゲン調節タンパク質（ＫＡＰ）は、腎臓の近位尿細管の上皮細胞に発現される。Ｔｏｏｌｅ等（１９７９）；ＭｅｓｅｇｕｅｒおよびＣａｔｔｅｒａｌｌ（１９８７）。近位尿細管の上皮細胞で発現された膜タンパク質、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）は、虚血性障害後にアップレギュレートされ、同様に、腎毒性物質、Ｓ−（１，１，２，２−テトラフルオロエチル）−Ｌ−システイン（ＴＦＥＣ）、葉酸およびシスプラチンでの処理後もアップレギュレートされる。Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９８）；Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（２００４）。ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現は、虚血性障害の後に、および腎毒性物質の塩化第二水銀での処理の後に腎臓で誘導される。Ｈｏｍｍａ等（１９９５）。線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）およびケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）、タンパク質の線維芽細胞増殖因子ファミリーの種類、ならびにＦＧＦ−７受容体、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂは、ＴＦＥＣでの処理の後に腎臓で誘導される。Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９５）；Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９６）。水チャンネルタンパク質のアクアポリン１、２および３は、腎臓で高度に発現される。Ａｇｒｅ等（１９９３）；Ｆｕｓｈｉｍｉ等（１９９３）；および、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等（１９９４）。タム−ホースフォール糖タンパク質は、腎上皮細胞で発現され、腎臓のヘンレのループの太い上行脚、および遠位尿細管に局在している。Ｓｉｋｒｉ等（１９８１）；およびＺｈｕ，Ｘ．等（２００２）。初期の増殖応答遺伝子、Ｅｇｒ−１、癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ、およびストレス応答遺伝子、Ｈｓｐ７０の発現は、腎臓の虚血性障害の後に活性化される。Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ等（１９９０）；ＢａｒｄｅｌｌａおよびＣｏｍｏｌｌｉ（１９９４）。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一つには、被検体の腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法に関し、本方法は、哺乳動物の被検体（好ましくはヒト被検体）からの尿サンプルを採取すること、および前記尿サンプル中の腎臓ＲＮＡマーカーの量を測定することを含む。好ましい実施形態において、前記方法は、前記尿サンプルが、腎臓の病理学的な状態を有さないコントロール被検体で測定される量より少なくとも２倍高い量の前記腎臓ＲＮＡマーカーを含む場合、前記被検体を、腎臓の病理学的な状態を有すると特徴付けることをさらに含む。
【００１７】
本発明のさらなる形態は、作用物質を特徴付ける方法を提供し、本方法は、非ヒト哺乳動物の被検体を作用物質で処理すること、および前記被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への前記物質の作用を測定することを含む。好ましい実施形態において、前記腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される。
【００１８】
本発明のさらなる形態は、作用物質の腎臓への保護的な特徴を評価する方法に関し、本方法は、非ヒト哺乳動物の被検体を第一の作用物質で処理すること（ここにおいて、前記第一の作用物質は、前記被検体の尿に放出される腎臓ＲＮＡマーカーの量を高めることを特徴とする）、前記被検体を第二の作用物質で処理すること、および前記第一の作用物質によって引き起こされた前記被検体の尿に放出された前記腎臓ＲＮＡマーカーの量を減少させることにおける、前記第二の作用物質の作用を測定すること、を含む。
【００１９】
本発明のその他の形態は、被検体の腎臓における医薬作用物質の作用のモニター方法を提供し、本方法は、ヒト被検体を医薬作用物質で処理すること、および前記被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への前記作用物質の作用を測定することを含む。
【００２０】
本発明の全ての方法の好ましい実施形態において、前記腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される。
【００２１】
定義
本明細書で用いられる用語は、当業界におけるそれらの通常の意味を有する。
しかしながら、本発明をさらに明確にするために、便宜上、本明細書（実施例および添付の特許請求の範囲を含む）で用いられる特定の用語および語句の意味を以下に示す。
【００２２】
「作用物質」は、作用をもたらすための化学的、生物学的または物理的な手段を意味する。作用物質は、化学物質または生化学物質、生物学的な病原体または物理的摂動のうち１種または２種もしくはそれ以上の組み合わせであり得る。
【００２３】
「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、一本鎖または二本鎖の形態のいずれでもよい。用語「相補的ヌクレオチド配列」は、グアニジンヌクレオチド（Ｇ）とシチジンヌクレオチド（Ｃ）との対形成、アデノシンヌクレオチド（Ａ）とチミジンヌクレオチド（Ｔ）との対形成（ただ、ＲＮＡの場合Ｔがウリジンヌクレオチド（Ｕ）で置換されているためＵがＡと結合する）により他方のヌクレオチド配列にアニールする（結合する）ヌクレオチド配列を意味する。
【００２４】
「病理学的な状態」は、生物学的に異常な状態を意味し、例えば、器官、組織型または細胞型の異常な状態が挙げられる。この用語は、原因を問わず異常であることを意味し、例えば、生理学的な異常、遺伝学的な異常、または病原性物質、物理的な障害もしくは生体異物によって引き起こされる毒性によって引き起こされる病気が挙げられる。
【００２５】
「ＲＮＡマーカー」は、細胞のＤＮＡ遺伝情報から転写された特定の配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントを意味する。ＲＮＡマーカーという用語は、細胞で、例えば対応するＤＮＡ配列からコピーされた後５’キャッピング、ＲＮＡスプライシングおよび３’ポリアデニル化によってプロセシングされたｍＲＮＡポリヌクレオチド、またはそのフラグメントを含む。「ＲＮＡマーカー」が、器官、組織型または細胞型の名称の後にくる場合（例えば「腎臓ＲＮＡマーカー」）、この用語は、その器官、組織型または細胞型でＲＮＡマーカーが転写されることを意味する。本発明の目的で、このような用語の使用は、好ましくは、指定された器官、組織型または細胞型においてのみ転写されるＲＮＡマーカーを意味する。しかしながら、この用語はまた、本発明に係る対象となる特定の器官、組織型または細胞型を同定するのに用いることができるＲＮＡマーカーも含む。例えば、尿中の腎臓ＲＮＡマーカーを測定することによって腎臓の病理学的な状態を特徴付けることを含む本発明の方法において、特定のＲＮＡマーカーが、例えば第二の器官または組織におけるあらゆる発現が、その第二の器官または組織の病状の結果として尿中で検出される可能性が低いのであれば、もっぱら腎臓でのみで発現されるものでなくてもよい。
【００２６】
略語:
本明細書で用いられる略語は、当業界におけるそれらの通常の意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にするため、便宜上、いくつかの略語の意味を以下に示す：「℃」は、セ氏度を意味し；「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡを意味し；「ＣＴ」は、増幅のサイクル数を意味し；「ｄＬ」は、デシリットルを意味する、「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味し；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミンテトラ酢酸を意味し；「ｇ」は、グラムを意味し；「ｋｇ」は、キログラムを意味し；「ＮａＯＨ」は、水酸化ナトリウムを意味し；「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡを意味し；「ｍｇ」は、ミリグラムを意味し；「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し；「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し；「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味し；「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味し；「ＲＰＭ」は、毎分回転数を意味し；および、「ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００２７】
図１は、ラットＫＩＭ−１およびＫＡＰを増幅し、検出するのに用いることができるＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの配列を示す。
【００２８】
発明の詳細な説明
正常な細胞の代謝回転中、哺乳動物細胞は、血漿中で検出可能なＲＮＡを放出する。本発明は、一つには腎細胞によるＲＮＡの放出が、化学物質によって引き起こされる細胞傷害によって激化するという発見に基づいており、この作用は、哺乳動物の尿中で検出することができ、腎障害の有用な指標である。本発明の一形態は、遺伝子転写の組織型に特異的なおよび細胞型に特異的な性質（すなわち、特定の組織型または細胞型に関して、いくつかの遺伝子は転写可能だが、それ以外の遺伝子は転写されない可能性がある）、および特定の遺伝子転写物の、組織型および細胞型に特異的なスプライシング配列を利用する。特定の組織型または細胞型に特有であるＲＮＡは、特定の器官、組織型または細胞型に関する生物学的、生理学的または毒物学的な障害のバイオマーカーとして使用することができる。
【００２９】
本発明は、潜在的毒性の作用物質の試験方法、治療作用物質の同定方法、治療作用物質の有効性の試験方法、および腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法を提供し、これらの方法は細胞傷害または細胞死の指標として腎細胞による尿へのＲＮＡの放出に基づく。当業者既知の、またはこの開示に基づいて明白となるＲＮＡ検出技術は、本発明の実施において有用である。
【００３０】
一実施形態は、作用物質の腎毒性を早期発見するためのインビボでの非侵襲的方法を提供する。このような方法によれば、被検体の尿を試験して、特定の腎臓ＲＮＡマーカーのＲＮＡレベルを決定することができる。作用物質の毒性は、被検体の尿で測定して、細胞によるＲＮＡ放出を引き起こすそれらの能力に基づいて評価される。このような方法は、例えば試験動物を用いて、試験作用物質の腎毒性を評価するためのインビボアッセイとして有用となる。また、本方法を臨床的に用いて、起こり得る腎毒性を早期に警戒するために、薬物処理後に患者を非侵襲的にモニターしてもよい。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、試験作用物質の腎臓への保護的または治療的な特徴を評価するための非侵襲的な方法を提供する。このような方法によれば、例えば腎臓ＲＮＡマーカーの放出を高めることが既知である作用物質で処理された腎細胞によって放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量の減少は、その試験作用物質が、腎臓に対する望ましい保護的または治療効果を有することを示すことの指標となる。
【００３２】
本発明の方法の実施において、尿は、被検体から、滅菌収集チューブまたはバイアルに収集される。好ましくは、全ての収集器具および容器は、外来のＲＮＡをまったく含まない。次に、この尿は、好ましくは急速凍結され、８０℃で保存される。
【００３３】
一般的に、本発明の方法を実施するためのＲＮＡの検出は、複数の工程段階を伴う：（１）ＲＮＡの抽出；（２）増幅（これは、ＲＮＡからそのｃＤＮＡへの逆転写を含む場合がある）；および（３）検出。いかなる特定の理論またはメカニズムにも拘束されるものではないが、細胞外ＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ、リポタンパク質−ＲＮＡ複合体、脂質−ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡ複合体として細胞外に存在し、さらに、このような複合体化は、ＲＮＡの増幅およびＲＮＡレベルの検出に干渉する可能性があると考えられる。従って、この理論に従って、増幅および検出の前に、ＲＮＡが結合した複合体からＲＮＡを解離するための抽出工程を用いることが好ましい。
【００３４】
本発明の実施において、当業者既知の多数の核酸抽出方法のいずれかを用いることができる。公開されている方法の多くは、細胞内ＲＮＡの抽出を目的としているが、これらは、文献に記載されている通りに用いてもよいし、または本発明の開示に基づいて当業者には明白となる改変を施して用いてもよい。例えば、細胞外ＲＮＡは、Ｂｏｏｍ等（１９９０）またはＣｈｅｕｎｇ等（１９９４）に記載されている方法のように、シリカ粒子、ガラスビーズまたは珪藻類を用いて抽出してもよい。
【００３５】
本発明のインビトロでの方法のために細胞増殖培地からＲＮＡを抽出する典型的な方法において、当技術分野でよく知られた方法（例えば、遠心分離またはろ過）によって細胞から分離した培地を、カオトロピック物質のようなＲＮＡ安定剤（例えば、米国特許第５,２３４,８０９号に記載されているようなグアニジニウム（イソ）チオシアネート）で処理する。次に、ＲＮＡを固体結合剤（例えばシリカ粒子）に結合させる。次に、ＲＮＡ−固相をろ過によって液相から分離することができる。次に、ＲＮＡは、用いてシリカ粒子から溶出してもよいし、ＲＮＡは、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ８.０）を用いて溶出してもよい。
【００３６】
典型的な尿からの抽出方法において、尿約０.１ｍＬ〜約１.０ｍＬを、以下で説明されているように製造された水性シリカ懸濁液４０マイクロリットル、および以下に記載されているように製造された溶解緩衝液約９００マイクロリットルと混合し、室温で約１０分間混合する。次に、この混合物を１２,０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を除去する。次に、得られたシリカ−ＲＮＡペレットを、以下に記載されているように製造された洗浄緩衝液約４５０マイクロリットル、続いて７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール約１ｍｌで２回洗浄する。最後に、このペレットをアセトン１ｍＬで洗浄し、約５６℃で約１０分間乾燥させる。次に、このシリカペレットをジエチルプロカーボネートで処理した水約２０〜５０マイクロリットルに５６℃で約１０分間懸濁し、続いて約１２,０００×重力で約３分間遠心分離することによって、シリカペレットからＲＮＡを溶出する。あるいは、Ｂｏｏｍ等（１９９１）に記載されている方法に従って、ＲＮＡは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）およびＲＮアーゼ阻害剤（例えばＲＮＡｓｉｎ(R)，プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州）からなり、プロテイナーゼ（例えばプロテイナーゼＫ）を含む、または含まない緩衝液を用いて溶出してもよい。得られたＲＮＡを含む上清を、増幅および検出のために回収する。
【００３７】
上述の水性シリカ懸濁液は、二酸化ケイ素（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．），セントルイス，ミズーリ州）６０グラムを脱塩滅菌再蒸留水５００ｍＬに懸濁することによって製造してもよい。次に、この懸濁液を室温で約２４時間静置する。上清を除去し、粒子を、体積５００ミリリットルに等しくなるように添加した脱塩滅菌再蒸留水に懸濁した。この懸濁液を静置したら、上清約４４０ミリリットルを除去し、懸濁液のｐＨを、塩酸を用いて約ｐＨ２に調節する。
【００３８】
上述の溶解緩衝液は、グアニジンチオシアネート１２０グラムを、０.１Ｍトリス塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）（ｐＨ６.４）１００ｍＬ、および０.２ＭのＥＤＴＡ２２ミリリットルに溶解させ、ＮａＯＨとトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（シグマ−アルドリッチ社）２.６グラムで、ｐＨ８.０に調節することによって製造される。
【００３９】
上述の洗浄緩衝液は、グアニジンチオシアネート１２０グラムを、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６.４）１００ミリリットルに溶解させることによって製造される。
【００４０】
ＲＮＡを抽出するその他の方法を用いてもよく、例えば、これらに限定されないが、例えばＣｈｉｒｇｗｉｎ等（１９７９）に記載されているような、塩化セシウム濃度勾配による遠心分離、および例えばＦｏｕｒｎｉｅ等（１９８６）で一般的に記載されているような、ゼラチンを用いた血漿または血清からの細胞外ＲＮＡの共沈殿が挙げられる。その他のＲＮＡ抽出方法は、本発明の開示に基づいて当業者には明らかとなる。
【００４１】
尿からの好ましいＲＮＡ抽出方法としては、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙTM）キット（カタログ番号７４１２４，キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．），バレンシア，カリフォルニア州）、またはＱＩＡアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ウイルスＲＮＡキット（キアゲン社）の使用が挙げられる。
【００４２】
増幅および検出の前に、痕跡ＤＮＡを除去することによってＲＮＡをさらに精製することが望ましい場合がある。さらなる精製は、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．（１９９４）に記載されている方法に従って、ＤＮアーゼを用いて達成してもよい。
【００４３】
上述のようにして抽出され、必要に応じて精製されたＲＮＡは、所望の腎臓ＲＮＡマーカーに関する核酸増幅アッセイを用いて増幅してもよい。本発明の実施において、任意の腎臓ＲＮＡマーカーが使用可能である。好ましい腎臓ＲＮＡマーカーとしては、腎臓特異的アンドロゲン制御タンパク質（ＫＡＰ）（例えば、Ｔｏｏｌｅ等（１９７９）、ならびにＭｅｓｅｇｕｅｒおよびＣａｔｔｅｒａｌｌ（１９８７）に記載されているもの）、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）（例えば、Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９８）およびＩｃｈｉｍｕｒａ等（２００４）に記載されているもの）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（例えば、Ｈｏｍｍａ等（１９９５）に記載されているもの）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）、ＦＧＦ−７受容体、およびＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ（例えば、Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９５）、およびＩｃｈｉｍｕｒａ等（１９９６）に記載されているもの）、水チャンネルタンパク質、アクアポリン１、２および３（例えば、Ａｇｒｅ等（１９９３）、Ｆｕｓｈｉｍｉ等（１９９３）およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ等（１９９４）に記載されているもの）、タム−ホースフォール糖タンパク質（例えば、Ｓｉｋｒｉ等（１９８１）、およびＺｈｕ，Ｘ．等（２００２）に記載されているもの）、Ｅｇｒ−１およびｃ−ｆｏｓ（例えば、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ等（１９９０）；ＢａｒｄｅｌｌａおよびＣｏｍｏｌｌｉ（１９９４）に記載されているもの）、およびストレス応答遺伝子、Ｈｓｐ７０（例えば、Ｂａｒｄｅｌｌａ、およびＣｏｍｏｌｌｉ（１９９４）に記載されているもの）が挙げられる。
【００４４】
本発明の実施において、少数のＲＮＡ分子の検出が可能な任意の核酸増幅アッセイが使用可能である。適用可能なアッセイとしては、これらに限定されないが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．等（１９９５）を参照）、分岐状ＤＮＡシグナル増幅（例えば、Ｊｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．等（１９９３）を参照）、等温の核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（例えば、Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．等（１９９１）を参照）、およびその他の自律性配列複製分析が挙げられる。
【００４５】
本発明に係るＲＮＡ増幅のための好ましい実施形態は、ＲＴ−ＰＣＲの使用によるものである。ＲＴ−ＰＣＲを用いたＲＮＡの増幅方法は当業者周知であり、文献で十分に記載されている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４）、およびＩｎｎｉｓ等（１９９０）を参照）。
【００４６】
当業者であれば本発明の開示に基づいて明白と思われるが、増幅に使用しようとするプライマー、および例えばＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物を検出するためのプローブの選択は、本発明の方法によって評価される細胞型に依存することになる。本発明のインビトロでの方法にとって、このような評価は、１種またはそれ以上の細胞型を含む細胞培養の使用を伴う。インビボでの本方法にとって、このような評価は、被検体の体内の多数の異なる細胞型が必要となる場合がある。
【００４７】
従って、プローブおよびプライマー群は、このような細胞の１種またはそれ以上の転写された遺伝子を標的とすべきであり、それらの転写を用いて上記細胞を同定することが可能になる。好ましくは、このようなプローブおよびプライマーは、ある特定の細胞型に特有のＲＮＡを標的とするものとなる。また、このような遺伝子は、細胞の状態または細胞に影響を与える状態に関係なく、比較的高レベルで転写されていることが好ましく、連続して転写されていることも好ましい。
【００４８】
プローブおよびプライマーの製造および使用方法は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４）およびＩｎｎｉｓ等（１９９０）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、その目的（例えばプライマー）を対象としたコンピュータープログラムを用いることによって、既知の配列から誘導することができる（バージョン０.５，１９９１，ホワイトヘッド・バイオ医療研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），ケンブリッジ，マサチューセッツ州）。
【００４９】
プライマーとしての使用するためのオリゴヌクレオチドは、このような目的のための当技術分野で既知のソフトウェアを用いて選択される。例えば、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ(R)）バージョン６ソフトウェア（モレキュラー・バイオロジー・インサイト社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．），カスケード，コロラド州，www.oligo.net）は、それぞれ１００ヌクレオチド以下のＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、さらに、インプットされた３２キロベース以下のポリヌクレオチド配列からの、５,０００ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドおよびそれより大きいポリヌクレオチドの解析にも有用である。同様のプライマー選択プログラムに、拡張機能に関する追加の特徴が含まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス大学ゲノムセンター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ），サウスウエスト・メディカルセンター（Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ），ダラス，テキサス州から一般公開されている， ftp://ftp.genome.ou.edu/pub/programs/primou src.tar）は、メガベースの配列から特定のプライマーを選択することができ、従って、プライマーをゲノム規模で設計するのに有用である。プライマー３（Ｐｒｉｍｅｒ３）、バージョン０.９、プライマー選択プログラム（ホワイトヘッド研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）／ＭＩＴゲノム研究センター（ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），ケンブリッジ，マサチューセッツ州， http://www-genome.wi.mit.edu/genome software/other/primer3.htmlから一般公開されている）では、使用者が「ミスプライミングライブラリー」をインプットすることが可能になり、この場合、プライマー結合部位として回避すべき配列は、使用者指定である。プライマー３は、特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後者の２種のプライマー選択プログラムに関するソースコードはまた、それらのそれぞれのソースから得てもよいし、使用者の具体的な要求を満たすようにさらに改変してもよい）。ＰｒｉｍｅＧｅｎプログラム（英国ヒトゲノム・マッピングプロジェクト・リソースセンター（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ，ケンブリッジ，英国）から一般公開されている，http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Option/primegen.html）は、複数の配列アライメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、並べられた核酸配列の最も保存された領域、または最も保存されていない領域のいずれかにハイブリダイゼーションするプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、特有のオリゴヌクレオチド、および保存されたオリゴヌクレオチドの両方、ならびにポリヌクレオチドフラグメントの同定に有用である。その他のオリゴヌクレオチド選択方法は、本発明の記載に基づけば当業者には明白であろう。
【００５０】
上述のようにして抽出および／または増幅したＲＮＡは、検出方法を用いて検出することができる。ＲＮＡ検出方法は当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４）およびＩｎｎｉｓ等（１９９０）に記載されている。
【００５１】
好ましい検出システムは、統合型のサーマルサイクラー、蛍光を誘起する光源および検出器を用いた、ＰＣＲサイクル中のＲＮＡのリアルタイム検出を用いるものである。このような検出を行うための典型的な機器は、ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(R)）７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，カリフォルニア州）である。
【００５２】
ＲＮＡを検出するための別の方法は、本発明の説明に基づけば当業者には明白となる。このような方法としては、例えばゲル電気泳動、続いて サザンブロット分析（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｄ．（１９８９）を参照）、ＥＬＩＳＡ検出方法（例えば、Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ａ．等（１９９１）、Ｃｏｕｔｌｅｅ，Ｆ．等（１９８９）、およびＢｏｂｏ，Ｌ．等（１９９０）を参照）、および電気化学発光検出を用いた方法（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｆ．（１９９１）、およびＤｉＣｅｓａｒｅ，Ｊ．等（１９９３）を参照）が挙げられる。電気泳動による検出方法は、２種またはそれ以上のＲＮＡ群のバンドの比較を含んでいてもよい。一方のＲＮＡ群から得られた１つのゲルのオートラジオグラフに存在するバンドと、他方のオートラジオグラフに存在しないバンドとは、一方の群にある特定のＲＮＡの存在と、他方の群にないＲＮＡの存在とに相当するため、差異的に発現される可能性が高い遺伝子を示す（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．等（１９９０）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｓ．Ｒ．（１９９２）、Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．等（１９９２）、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．等（１９９２）、およびＬｉａｎｇ，Ｐ．等（１９９３）を参照）。
【００５３】
最後に、本発明に係る検出方法は、アレイまたはマイクロアレイの使用を含んでいてもよい。アレイおよびマイクロアレイは、基質上に合成された別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド群であり、基質としては、例えば、紙、ナイロンまたはその他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、スライドガラス、またはその他のあらゆる適切な固体支持体が挙げられる。好ましい実施形態において、アレイおよびマイクロアレイは、米国特許第５,８３７,８３２号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／１１９９５、Ｌｏｃｋｈａｒｔ等（１９９６）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．等（１９９６）に記載されている方法に従って製造および使用が可能である。その他の実施形態において、このようなアレイは、米国特許第５,８０７,５２２号に記載されている方法によって生産される。
【００５４】
本明細書で引用された全ての特許、出願および遺伝子登録番号（関連情報を含む）、刊行物および文書、例えばパンフレットまたは技術報告の開示は、参照によりそれらの全体を本明細書に明示的に組み入れる。
【００５５】
当業者であれば、本発明の記載（実施例、図面、配列表および添付の請求項を含む）を用いて、本発明を最大限利用することができると考えられる。以下の実施例は、単に本発明の実施の説明と解釈すべきであり、どのような形でも開示されていない部分をまったく限定するものではない。
【００５６】
実施例１
０日目と１日目に、４匹の雄スプラーグ−ドーリーラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ウィルミントン，マサチューセッツ州）から排泄された尿を、午前中１回、および夕方１回、回収した。ＲＮＡ非含有のアルミニウム箔で覆って各ラットを保定しながらラットの腹部と胸部を手で刺激することによって排尿を行った。各期間における全てのラットの尿をプールし、急速凍結し、８０℃で保存した。２日目の初めに、各ラットに、シスプラチンを、用量１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射で投与した。２日目と３日目に、排出された尿を、再び、午前中１回、および夕方１回、回収し、プールし、急速凍結した。４日目に、排出された尿を午前中に回収し、プールし、急速凍結した。次に、ラットを安楽死させ、腎臓を剖検で回収した。腎臓組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、組織病理のために、トリミング、脱水、パラフィンへの包埋、切片作成、スライドガラス上へのマウント、およびヘマトキシリンとエオシン染色液での染色によって処理した。全ての動物が、尿細管上皮細胞において軽度の壊死を示し、この壊死は、個々の細胞壊死が、尿細管上皮細胞の再生領域に関連することを特徴としていた。
【００５７】
ＲＮイージーTMミニキット（キアゲン社，バレンシア，カリフォルニア州）を製造元の説明書に従って用いて、各期間の尿の一部（６５０μｌ）をＲＮＡ抽出に用いた。ＲＮＡマーカーのＫＩＭ−１およびＫＡＰの存在に関して、ＲＴ−ＰＣＲを用いて尿を分析した。
【００５８】
ＫＩＭ−１については、フォワードプライマーとして５’−ＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＴ−３’、リバースプライマーとして５’−ＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧ−３’、プローブとして５’−ＴＴＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡ−３’を用いた。
【００５９】
ＫＡＰについては、フォワードプライマーとして５’−ＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３’、リバースプライマーとして５’−ＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴ−３’、プローブとして５’−ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＴＣ−３’を用いた。ＡＢＩプリズム（Ｒ）７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステム）で、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６０】
以下の表１と２に、実施例１の結果を示す。
【表１】
【００６１】
実施例１は、被検体の尿における腎臓ＲＮＡマーカーを測定することに関連する本発明の方法を説明する。
【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ラットＫＩＭ−１およびＫＡＰを増幅し、検出するのに用いることができるＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００５年１月２８日付けで出願された米国特許本出願番号１１／０４６,３０１、および、２００４年６月３０日付けで出願された米国特許仮出願番号６０／５８４,４６１の利益を主張し、これらは参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、被検体の尿における腎臓ＲＮＡマーカーを測定することに関連する、腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法、作用物質を特徴付ける方法、作用物質の腎臓への保護的および治療的な特徴を評価する方法、および、被検体の腎臓における薬剤の医薬作用物質のモニター方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
製薬分野において、医薬作用物質の毒物学的な潜在性を最小化する多大な努力がなされている。毒物曝露に関連する危険のなかでも、体細胞に障害または死を引き起こす可能性が挙げられ、それにより、生体の器官へのダメージが生じる可能性がある。
【０００４】
ＭａｎｄｅｌおよびＭｅｔａｉｓ（１９４８）は、ヒト血漿中の細胞外核酸の発見を報告した。
【０００５】
Ｌｏ，Ｋ．Ｗ．等（１９９９）およびＫｏｐｒｅｓｋｉ，Ｍ．等（１９９９）は双方とも、癌患者の血漿中での腫瘍由来のＲＮＡの検出を報告している。
【０００６】
Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．等（２０００）は、乳癌患者の血清中の検出マーカーとしてのテロメラーゼＲＮＡの使用を提唱している。
【０００７】
Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．等（２０００）は、母体血漿中の胎児ＲＮＡの存在を報告している。
【０００８】
米国特許第６,３２９,１７９号は、癌または前癌の状態の検出、モニターまたは評価のための、血液の血漿または血清分画中に循環していることが見出された腫瘍由来または腫瘍関連の細胞外ＲＮＡの使用を開示している。
【０００９】
米国特許第６,１５６,５０４号は、新生物に関連する突然変異を含む、ヒトまたは動物における良性、前癌または悪性新生物の存在、進行または臨床状態を、血漿または血清分画中の新生物の突然変異核酸の検出による検出、同定またはモニターすることを開示している。
【００１０】
米国特許第６,０２０,１２４号は、生体液中での突然変異遺伝子および腫瘍遺伝子に関する可溶性ＤＮＡの検出を開示している。
【００１１】
ＲＮＡは不安定と考えられているため、研究者は、ヒト血漿中のＲＮＡを分解から保護する可能性のあるメカニズムを研究してきた。Ｈａｓｓｅｌｍａｎｎ，Ｄ．Ｏ．等（２００１）は、インビトロでのモデルにおいて、黒色腫細胞によって放出されたアポトーシス小体中のｍＲＮＡは、ヒト血清中でインキュベートすると、分解から保護されたことを報告している。
【００１２】
Ｎｇ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．等（２００２）は、相当部分の血漿ｍＲＮＡは粒子に結合していることを報告している。
【００１３】
同一出願人による米国特許出願番号１０／７４５８２３は、細胞中のメッセンジャーＲＮＡ放出を高める物質の能力を測定することによる、物質の細胞にダメージを与える可能性を評価する方法を開示している。
【００１４】
物質が、腎臓において組織および細胞のダメージを引き起こすかどうかを決定するのに利用可能な従来の方法は、尿の物理的および化学的特徴（例えば、色、透明性、臭気、量、重量オスモル濃度、比重、ｐＨ、ならびに沈渣、タンパク質、グルコース、ビリルビン、血液、ウロビリノーゲン、亜硝酸塩および酵素の存在）を測定すること、腎機能試験を行うこと、血中尿素窒素を測定すること、および血清クレアチンを測定することを含む。しかしながら、早期発見のためにこのような指標を使用するための能力は、酵素放出の速さや検出感度などの多数の因子に依存する。従って、従来の毒性検出方法に比べてより高い特異性と感度を有する毒性のさらなる早期の生物学的指標またはバイオマーカーを見出すことへの関心が高まっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
腎臓特異的アンドロゲン調節タンパク質（ＫＡＰ）は、腎臓の近位尿細管の上皮細胞に発現される。Ｔｏｏｌｅ等（１９７９）；ＭｅｓｅｇｕｅｒおよびＣａｔｔｅｒａｌｌ（１９８７）。近位尿細管の上皮細胞で発現された膜タンパク質、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）は、虚血性障害後にアップレギュレートされ、同様に、腎毒性物質、Ｓ−（１，１，２，２−テトラフルオロエチル）−Ｌ−システイン（ＴＦＥＣ）、葉酸およびシスプラチンでの処理後もアップレギュレートされる。Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９８）；Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（２００４）。ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現は、虚血性障害の後に、および腎毒性物質の塩化第二水銀での処理の後に腎臓で誘導される。Ｈｏｍｍａ等（１９９５）。線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）およびケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）、タンパク質の線維芽細胞増殖因子ファミリーの種類、ならびにＦＧＦ−７受容体、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂは、ＴＦＥＣでの処理の後に腎臓で誘導される。Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９５）；Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９６）。水チャンネルタンパク質のアクアポリン１、２および３は、腎臓で高度に発現される。Ａｇｒｅ等（１９９３）；Ｆｕｓｈｉｍｉ等（１９９３）；および、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等（１９９４）。タム−ホースフォール糖タンパク質は、腎上皮細胞で発現され、腎臓のヘンレのループの太い上行脚、および遠位尿細管に局在している。Ｓｉｋｒｉ等（１９８１）；およびＺｈｕ，Ｘ．等（２００２）。初期の増殖応答遺伝子、Ｅｇｒ−１、癌原遺伝子、ｃ−ｆｏｓ、およびストレス応答遺伝子、Ｈｓｐ７０の発現は、腎臓の虚血性障害の後に活性化される。Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ等（１９９０）；ＢａｒｄｅｌｌａおよびＣｏｍｏｌｌｉ（１９９４）。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一つには、被検体の腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法に関し、本方法は、哺乳動物の被検体（好ましくはヒト被検体）からの尿サンプルを採取すること、および前記尿サンプル中の腎臓ＲＮＡマーカーの量を測定することを含む。好ましい実施形態において、前記方法は、前記尿サンプルが、腎臓の病理学的な状態を有さないコントロール被検体で測定される量より少なくとも２倍高い量の前記腎臓ＲＮＡマーカーを含む場合、前記被検体を、腎臓の病理学的な状態を有すると特徴付けることをさらに含む。
【００１７】
本発明のさらなる形態は、作用物質を特徴付ける方法を提供し、本方法は、非ヒト哺乳動物の被検体を作用物質で処理すること、および前記被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への前記物質の作用を測定することを含む。好ましい実施形態において、前記腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される。
【００１８】
本発明のさらなる形態は、作用物質の腎臓への保護的な特徴を評価する方法に関し、本方法は、非ヒト哺乳動物の被検体を第一の作用物質で処理すること（ここにおいて、前記第一の作用物質は、前記被検体の尿に放出される腎臓ＲＮＡマーカーの量を高めることを特徴とする）、前記被検体を第二の作用物質で処理すること、および前記第一の作用物質によって引き起こされた前記被検体の尿に放出された前記腎臓ＲＮＡマーカーの量を減少させることにおける、前記第二の作用物質の作用を測定すること、を含む。
【００１９】
本発明のその他の形態は、被検体の腎臓における医薬作用物質の作用のモニター方法を提供し、本方法は、ヒト被検体を医薬作用物質で処理すること、および前記被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への前記作用物質の作用を測定することを含む。
【００２０】
本発明の全ての方法の好ましい実施形態において、前記腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される。
【００２１】
定義
本明細書で用いられる用語は、当業界におけるそれらの通常の意味を有する。
しかしながら、本発明をさらに明確にするために、便宜上、本明細書（実施例および添付の特許請求の範囲を含む）で用いられる特定の用語および語句の意味を以下に示す。
【００２２】
「作用物質」は、作用をもたらすための化学的、生物学的または物理的な手段を意味する。作用物質は、化学物質または生化学物質、生物学的な病原体または物理的摂動のうち１種または２種もしくはそれ以上の組み合わせであり得る。
【００２３】
「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、一本鎖または二本鎖の形態のいずれでもよい。用語「相補的ヌクレオチド配列」は、グアニジンヌクレオチド（Ｇ）とシチジンヌクレオチド（Ｃ）との対形成、アデノシンヌクレオチド（Ａ）とチミジンヌクレオチド（Ｔ）との対形成（ただ、ＲＮＡの場合Ｔがウリジンヌクレオチド（Ｕ）で置換されているためＵがＡと結合する）により他方のヌクレオチド配列にアニールする（結合する）ヌクレオチド配列を意味する。
【００２４】
「病理学的な状態」は、生物学的に異常な状態を意味し、例えば、器官、組織型または細胞型の異常な状態が挙げられる。この用語は、原因を問わず異常であることを意味し、例えば、生理学的な異常、遺伝学的な異常、または病原性物質、物理的な障害もしくは生体異物によって引き起こされる毒性によって引き起こされる病気が挙げられる。
【００２５】
「ＲＮＡマーカー」は、細胞のＤＮＡ遺伝情報から転写された特定の配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントを意味する。ＲＮＡマーカーという用語は、細胞で、例えば対応するＤＮＡ配列からコピーされた後５’キャッピング、ＲＮＡスプライシングおよび３’ポリアデニル化によってプロセシングされたｍＲＮＡポリヌクレオチド、またはそのフラグメントを含む。「ＲＮＡマーカー」が、器官、組織型または細胞型の名称の後にくる場合（例えば「腎臓ＲＮＡマーカー」）、この用語は、その器官、組織型または細胞型でＲＮＡマーカーが転写されることを意味する。本発明の目的で、このような用語の使用は、好ましくは、指定された器官、組織型または細胞型においてのみ転写されるＲＮＡマーカーを意味する。しかしながら、この用語はまた、本発明に係る対象となる特定の器官、組織型または細胞型を同定するのに用いることができるＲＮＡマーカーも含む。例えば、尿中の腎臓ＲＮＡマーカーを測定することによって腎臓の病理学的な状態を特徴付けることを含む本発明の方法において、特定のＲＮＡマーカーが、例えば第二の器官または組織におけるあらゆる発現が、その第二の器官または組織の病状の結果として尿中で検出される可能性が低いのであれば、もっぱら腎臓でのみで発現されるものでなくてもよい。
【００２６】
略語:
本明細書で用いられる略語は、当業界におけるそれらの通常の意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にするため、便宜上、いくつかの略語の意味を以下に示す：「℃」は、セ氏度を意味し；「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡを意味し；「ＣＴ」は、増幅のサイクル数を意味し；「ｄＬ」は、デシリットルを意味する、「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味し；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミンテトラ酢酸を意味し；「ｇ」は、グラムを意味し；「ｋｇ」は、キログラムを意味し；「ＮａＯＨ」は、水酸化ナトリウムを意味し；「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡを意味し；「ｍｇ」は、ミリグラムを意味し；「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し；「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し；「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味し；「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味し；「ＲＰＭ」は、毎分回転数を意味し；および、「ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００２７】
図１は、ラットＫＩＭ−１およびＫＡＰを増幅し、検出するのに用いることができるＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの配列を示す。
【００２８】
発明の詳細な説明
正常な細胞の代謝回転中、哺乳動物細胞は、血漿中で検出可能なＲＮＡを放出する。本発明は、一つには腎細胞によるＲＮＡの放出が、化学物質によって引き起こされる細胞傷害によって激化するという発見に基づいており、この作用は、哺乳動物の尿中で検出することができ、腎障害の有用な指標である。本発明の一形態は、遺伝子転写の組織型に特異的なおよび細胞型に特異的な性質（すなわち、特定の組織型または細胞型に関して、いくつかの遺伝子は転写可能だが、それ以外の遺伝子は転写されない可能性がある）、および特定の遺伝子転写物の、組織型および細胞型に特異的なスプライシング配列を利用する。特定の組織型または細胞型に特有であるＲＮＡは、特定の器官、組織型または細胞型に関する生物学的、生理学的または毒物学的な障害のバイオマーカーとして使用することができる。
【００２９】
本発明は、潜在的毒性の作用物質の試験方法、治療作用物質の同定方法、治療作用物質の有効性の試験方法、および腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法を提供し、これらの方法は細胞傷害または細胞死の指標として腎細胞による尿へのＲＮＡの放出に基づく。当業者既知の、またはこの開示に基づいて明白となるＲＮＡ検出技術は、本発明の実施において有用である。
【００３０】
一実施形態は、作用物質の腎毒性を早期発見するためのインビボでの非侵襲的方法を提供する。このような方法によれば、被検体の尿を試験して、特定の腎臓ＲＮＡマーカーのＲＮＡレベルを決定することができる。作用物質の毒性は、被検体の尿で測定して、細胞によるＲＮＡ放出を引き起こすそれらの能力に基づいて評価される。このような方法は、例えば試験動物を用いて、試験作用物質の腎毒性を評価するためのインビボアッセイとして有用となる。また、本方法を臨床的に用いて、起こり得る腎毒性を早期に警戒するために、薬物処理後に患者を非侵襲的にモニターしてもよい。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、試験作用物質の腎臓への保護的または治療的な特徴を評価するための非侵襲的な方法を提供する。このような方法によれば、例えば腎臓ＲＮＡマーカーの放出を高めることが既知である作用物質で処理された腎細胞によって放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量の減少は、その試験作用物質が、腎臓に対する望ましい保護的または治療効果を有することを示すことの指標となる。
【００３２】
本発明の方法の実施において、尿は、被検体から、滅菌収集チューブまたはバイアルに収集される。好ましくは、全ての収集器具および容器は、外来のＲＮＡをまったく含まない。次に、この尿は、好ましくは急速凍結され、８０℃で保存される。
【００３３】
一般的に、本発明の方法を実施するためのＲＮＡの検出は、複数の工程段階を伴う：（１）ＲＮＡの抽出；（２）増幅（これは、ＲＮＡからそのｃＤＮＡへの逆転写を含む場合がある）；および（３）検出。いかなる特定の理論またはメカニズムにも拘束されるものではないが、細胞外ＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ、リポタンパク質−ＲＮＡ複合体、脂質−ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡ複合体として細胞外に存在し、さらに、このような複合体化は、ＲＮＡの増幅およびＲＮＡレベルの検出に干渉する可能性があると考えられる。従って、この理論に従って、増幅および検出の前に、ＲＮＡが結合した複合体からＲＮＡを解離するための抽出工程を用いることが好ましい。
【００３４】
本発明の実施において、当業者既知の多数の核酸抽出方法のいずれかを用いることができる。公開されている方法の多くは、細胞内ＲＮＡの抽出を目的としているが、これらは、文献に記載されている通りに用いてもよいし、または本発明の開示に基づいて当業者には明白となる改変を施して用いてもよい。例えば、細胞外ＲＮＡは、Ｂｏｏｍ等（１９９０）またはＣｈｅｕｎｇ等（１９９４）に記載されている方法のように、シリカ粒子、ガラスビーズまたは珪藻類を用いて抽出してもよい。
【００３５】
本発明のインビトロでの方法のために細胞増殖培地からＲＮＡを抽出する典型的な方法において、当技術分野でよく知られた方法（例えば、遠心分離またはろ過）によって細胞から分離した培地を、カオトロピック物質のようなＲＮＡ安定剤（例えば、米国特許第５,２３４,８０９号に記載されているようなグアニジニウム（イソ）チオシアネート）で処理する。次に、ＲＮＡを固体結合剤（例えばシリカ粒子）に結合させる。次に、ＲＮＡ−固相をろ過によって液相から分離することができる。次に、ＲＮＡは、用いてシリカ粒子から溶出してもよいし、ＲＮＡは、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ８.０）を用いて溶出してもよい。
【００３６】
典型的な尿からの抽出方法において、尿約０.１ｍＬ〜約１.０ｍＬを、以下で説明されているように製造された水性シリカ懸濁液４０マイクロリットル、および以下に記載されているように製造された溶解緩衝液約９００マイクロリットルと混合し、室温で約１０分間混合する。次に、この混合物を１２,０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を除去する。次に、得られたシリカ−ＲＮＡペレットを、以下に記載されているように製造された洗浄緩衝液約４５０マイクロリットル、続いて７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール約１ｍｌで２回洗浄する。最後に、このペレットをアセトン１ｍＬで洗浄し、約５６℃で約１０分間乾燥させる。次に、このシリカペレットをジエチルプロカーボネートで処理した水約２０〜５０マイクロリットルに５６℃で約１０分間懸濁し、続いて約１２,０００×重力で約３分間遠心分離することによって、シリカペレットからＲＮＡを溶出する。あるいは、Ｂｏｏｍ等（１９９１）に記載されている方法に従って、ＲＮＡは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）およびＲＮアーゼ阻害剤（例えばＲＮＡｓｉｎ(R)，プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州）からなり、プロテイナーゼ（例えばプロテイナーゼＫ）を含む、または含まない緩衝液を用いて溶出してもよい。得られたＲＮＡを含む上清を、増幅および検出のために回収する。
【００３７】
上述の水性シリカ懸濁液は、二酸化ケイ素（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．），セントルイス，ミズーリ州）６０グラムを脱塩滅菌再蒸留水５００ｍＬに懸濁することによって製造してもよい。次に、この懸濁液を室温で約２４時間静置する。上清を除去し、粒子を、体積５００ミリリットルに等しくなるように添加した脱塩滅菌再蒸留水に懸濁した。この懸濁液を静置したら、上清約４４０ミリリットルを除去し、懸濁液のｐＨを、塩酸を用いて約ｐＨ２に調節する。
【００３８】
上述の溶解緩衝液は、グアニジンチオシアネート１２０グラムを、０.１Ｍトリス塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）（ｐＨ６.４）１００ｍＬ、および０.２ＭのＥＤＴＡ２２ミリリットルに溶解させ、ＮａＯＨとトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（シグマ−アルドリッチ社）２.６グラムで、ｐＨ８.０に調節することによって製造される。
【００３９】
上述の洗浄緩衝液は、グアニジンチオシアネート１２０グラムを、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６.４）１００ミリリットルに溶解させることによって製造される。
【００４０】
ＲＮＡを抽出するその他の方法を用いてもよく、例えば、これらに限定されないが、例えばＣｈｉｒｇｗｉｎ等（１９７９）に記載されているような、塩化セシウム濃度勾配による遠心分離、および例えばＦｏｕｒｎｉｅ等（１９８６）で一般的に記載されているような、ゼラチンを用いた血漿または血清からの細胞外ＲＮＡの共沈殿が挙げられる。その他のＲＮＡ抽出方法は、本発明の開示に基づいて当業者には明らかとなる。
【００４１】
尿からの好ましいＲＮＡ抽出方法としては、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙTM）キット（カタログ番号７４１２４，キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．），バレンシア，カリフォルニア州）、またはＱＩＡアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ウイルスＲＮＡキット（キアゲン社）の使用が挙げられる。
【００４２】
増幅および検出の前に、痕跡ＤＮＡを除去することによってＲＮＡをさらに精製することが望ましい場合がある。さらなる精製は、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．（１９９４）に記載されている方法に従って、ＤＮアーゼを用いて達成してもよい。
【００４３】
上述のようにして抽出され、必要に応じて精製されたＲＮＡは、所望の腎臓ＲＮＡマーカーに関する核酸増幅アッセイを用いて増幅してもよい。本発明の実施において、任意の腎臓ＲＮＡマーカーが使用可能である。好ましい腎臓ＲＮＡマーカーとしては、腎臓特異的アンドロゲン制御タンパク質（ＫＡＰ）（例えば、Ｔｏｏｌｅ等（１９７９）、ならびにＭｅｓｅｇｕｅｒおよびＣａｔｔｅｒａｌｌ（１９８７）に記載されているもの）、腎障害分子−１（ＫＩＭ−１）（例えば、Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９８）およびＩｃｈｉｍｕｒａ等（２００４）に記載されているもの）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（例えば、Ｈｏｍｍａ等（１９９５）に記載されているもの）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、ケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）、ＦＧＦ−７受容体、およびＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ（例えば、Ｉｃｈｉｍｕｒａ等（１９９５）、およびＩｃｈｉｍｕｒａ等（１９９６）に記載されているもの）、水チャンネルタンパク質、アクアポリン１、２および３（例えば、Ａｇｒｅ等（１９９３）、Ｆｕｓｈｉｍｉ等（１９９３）およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ等（１９９４）に記載されているもの）、タム−ホースフォール糖タンパク質（例えば、Ｓｉｋｒｉ等（１９８１）、およびＺｈｕ，Ｘ．等（２００２）に記載されているもの）、Ｅｇｒ−１およびｃ−ｆｏｓ（例えば、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ等（１９９０）；ＢａｒｄｅｌｌａおよびＣｏｍｏｌｌｉ（１９９４）に記載されているもの）、およびストレス応答遺伝子、Ｈｓｐ７０（例えば、Ｂａｒｄｅｌｌａ、およびＣｏｍｏｌｌｉ（１９９４）に記載されているもの）が挙げられる。
【００４４】
本発明の実施において、少数のＲＮＡ分子の検出が可能な任意の核酸増幅アッセイが使用可能である。適用可能なアッセイとしては、これらに限定されないが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．等（１９９５）を参照）、分岐状ＤＮＡシグナル増幅（例えば、Ｊｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．等（１９９３）を参照）、等温の核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（例えば、Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．等（１９９１）を参照）、およびその他の自律性配列複製分析が挙げられる。
【００４５】
本発明に係るＲＮＡ増幅のための好ましい実施形態は、ＲＴ−ＰＣＲの使用によるものである。ＲＴ−ＰＣＲを用いたＲＮＡの増幅方法は当業者周知であり、文献で十分に記載されている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４）、およびＩｎｎｉｓ等（１９９０）を参照）。
【００４６】
当業者であれば本発明の開示に基づいて明白と思われるが、増幅に使用しようとするプライマー、および例えばＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物を検出するためのプローブの選択は、本発明の方法によって評価される細胞型に依存することになる。本発明のインビトロでの方法にとって、このような評価は、１種またはそれ以上の細胞型を含む細胞培養の使用を伴う。インビボでの本方法にとって、このような評価は、被検体の体内の多数の異なる細胞型が必要となる場合がある。
【００４７】
従って、プローブおよびプライマー群は、このような細胞の１種またはそれ以上の転写された遺伝子を標的とすべきであり、それらの転写を用いて上記細胞を同定することが可能になる。好ましくは、このようなプローブおよびプライマーは、ある特定の細胞型に特有のＲＮＡを標的とするものとなる。また、このような遺伝子は、細胞の状態または細胞に影響を与える状態に関係なく、比較的高レベルで転写されていることが好ましく、連続して転写されていることも好ましい。
【００４８】
プローブおよびプライマーの製造および使用方法は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４）およびＩｎｎｉｓ等（１９９０）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、その目的（例えばプライマー）を対象としたコンピュータープログラムを用いることによって、既知の配列から誘導することができる（バージョン０.５，１９９１，ホワイトヘッド・バイオ医療研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），ケンブリッジ，マサチューセッツ州）。
【００４９】
プライマーとしての使用するためのオリゴヌクレオチドは、このような目的のための当技術分野で既知のソフトウェアを用いて選択される。例えば、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ(R)）バージョン６ソフトウェア（モレキュラー・バイオロジー・インサイト社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．），カスケード，コロラド州，www.oligo.net）は、それぞれ１００ヌクレオチド以下のＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、さらに、インプットされた３２キロベース以下のポリヌクレオチド配列からの、５,０００ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドおよびそれより大きいポリヌクレオチドの解析にも有用である。同様のプライマー選択プログラムに、拡張機能に関する追加の特徴が含まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス大学ゲノムセンター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ），サウスウエスト・メディカルセンター（Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ），ダラス，テキサス州から一般公開されている， ftp://ftp.genome.ou.edu/pub/programs/primou src.tar）は、メガベースの配列から特定のプライマーを選択することができ、従って、プライマーをゲノム規模で設計するのに有用である。プライマー３（Ｐｒｉｍｅｒ３）、バージョン０.９、プライマー選択プログラム（ホワイトヘッド研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）／ＭＩＴゲノム研究センター（ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），ケンブリッジ，マサチューセッツ州， http://www-genome.wi.mit.edu/genome software/other/primer3.htmlから一般公開されている）では、使用者が「ミスプライミングライブラリー」をインプットすることが可能になり、この場合、プライマー結合部位として回避すべき配列は、使用者指定である。プライマー３は、特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後者の２種のプライマー選択プログラムに関するソースコードはまた、それらのそれぞれのソースから得てもよいし、使用者の具体的な要求を満たすようにさらに改変してもよい）。ＰｒｉｍｅＧｅｎプログラム（英国ヒトゲノム・マッピングプロジェクト・リソースセンター（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ，ケンブリッジ，英国）から一般公開されている，http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Option/primegen.html）は、複数の配列アライメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、並べられた核酸配列の最も保存された領域、または最も保存されていない領域のいずれかにハイブリダイゼーションするプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、特有のオリゴヌクレオチド、および保存されたオリゴヌクレオチドの両方、ならびにポリヌクレオチドフラグメントの同定に有用である。その他のオリゴヌクレオチド選択方法は、本発明の記載に基づけば当業者には明白であろう。
【００５０】
上述のようにして抽出および／または増幅したＲＮＡは、検出方法を用いて検出することができる。ＲＮＡ検出方法は当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４）およびＩｎｎｉｓ等（１９９０）に記載されている。
【００５１】
好ましい検出システムは、統合型のサーマルサイクラー、蛍光を誘起する光源および検出器を用いた、ＰＣＲサイクル中のＲＮＡのリアルタイム検出を用いるものである。このような検出を行うための典型的な機器は、ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(R)）７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，カリフォルニア州）である。
【００５２】
ＲＮＡを検出するための別の方法は、本発明の説明に基づけば当業者には明白となる。このような方法としては、例えばゲル電気泳動、続いて サザンブロット分析（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｄ．（１９８９）を参照）、ＥＬＩＳＡ検出方法（例えば、Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ａ．等（１９９１）、Ｃｏｕｔｌｅｅ，Ｆ．等（１９８９）、およびＢｏｂｏ，Ｌ．等（１９９０）を参照）、および電気化学発光検出を用いた方法（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｆ．（１９９１）、およびＤｉＣｅｓａｒｅ，Ｊ．等（１９９３）を参照）が挙げられる。電気泳動による検出方法は、２種またはそれ以上のＲＮＡ群のバンドの比較を含んでいてもよい。一方のＲＮＡ群から得られた１つのゲルのオートラジオグラフに存在するバンドと、他方のオートラジオグラフに存在しないバンドとは、一方の群にある特定のＲＮＡの存在と、他方の群にないＲＮＡの存在とに相当するため、差異的に発現される可能性が高い遺伝子を示す（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．等（１９９０）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｓ．Ｒ．（１９９２）、Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．等（１９９２）、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．等（１９９２）、およびＬｉａｎｇ，Ｐ．等（１９９３）を参照）。
【００５３】
最後に、本発明に係る検出方法は、アレイまたはマイクロアレイの使用を含んでいてもよい。アレイおよびマイクロアレイは、基質上に合成された別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド群であり、基質としては、例えば、紙、ナイロンまたはその他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、スライドガラス、またはその他のあらゆる適切な固体支持体が挙げられる。好ましい実施形態において、アレイおよびマイクロアレイは、米国特許第５,８３７,８３２号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／１１９９５、Ｌｏｃｋｈａｒｔ等（１９９６）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．等（１９９６）に記載されている方法に従って製造および使用が可能である。その他の実施形態において、このようなアレイは、米国特許第５,８０７,５２２号に記載されている方法によって生産される。
【００５４】
本明細書で引用された全ての特許、出願および遺伝子登録番号（関連情報を含む）、刊行物および文書、例えばパンフレットまたは技術報告の開示は、参照によりそれらの全体を本明細書に明示的に組み入れる。
【００５５】
当業者であれば、本発明の記載（実施例、図面、配列表および添付の請求項を含む）を用いて、本発明を最大限利用することができると考えられる。以下の実施例は、単に本発明の実施の説明と解釈すべきであり、どのような形でも開示されていない部分をまったく限定するものではない。
【００５６】
実施例１
０日目と１日目に、４匹の雄スプラーグ−ドーリーラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ウィルミントン，マサチューセッツ州）から排泄された尿を、午前中１回、および夕方１回、回収した。ＲＮＡ非含有のアルミニウム箔で覆って各ラットを保定しながらラットの腹部と胸部を手で刺激することによって排尿を行った。各期間における全てのラットの尿をプールし、急速凍結し、８０℃で保存した。２日目の初めに、各ラットに、シスプラチンを、用量１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射で投与した。２日目と３日目に、排出された尿を、再び、午前中１回、および夕方１回、回収し、プールし、急速凍結した。４日目に、排出された尿を午前中に回収し、プールし、急速凍結した。次に、ラットを安楽死させ、腎臓を剖検で回収した。腎臓組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、組織病理のために、トリミング、脱水、パラフィンへの包埋、切片作成、スライドガラス上へのマウント、およびヘマトキシリンとエオシン染色液での染色によって処理した。全ての動物が、尿細管上皮細胞において軽度の壊死を示し、この壊死は、個々の細胞壊死が、尿細管上皮細胞の再生領域に関連することを特徴としていた。
【００５７】
ＲＮイージーTMミニキット（キアゲン社，バレンシア，カリフォルニア州）を製造元の説明書に従って用いて、各期間の尿の一部（６５０μｌ）をＲＮＡ抽出に用いた。ＲＮＡマーカーのＫＩＭ−１およびＫＡＰの存在に関して、ＲＴ−ＰＣＲを用いて尿を分析した。
【００５８】
ＫＩＭ−１については、フォワードプライマーとして５’−ＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＴ−３’、リバースプライマーとして５’−ＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧ−３’、プローブとして５’−ＴＴＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡ−３’を用いた。
【００５９】
ＫＡＰについては、フォワードプライマーとして５’−ＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ−３’、リバースプライマーとして５’−ＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴ−３’、プローブとして５’−ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＴＣ−３’を用いた。ＡＢＩプリズム（Ｒ）７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステム）で、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６０】
以下の表１と２に、実施例１の結果を示す。
【表１】
【００６１】
実施例１は、被検体の尿における腎臓ＲＮＡマーカーを測定することに関連する本発明の方法を説明する。
【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ラットＫＩＭ−１およびＫＡＰを増幅し、検出するのに用いることができるＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の被検体からの尿サンプルを採取すること、および該尿サンプル中の腎臓ＲＮＡマーカーの量を測定することを含む、被検体の腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法。
【請求項２】
尿サンプルが、腎臓の病理学的な状態を有さないコントロール被検体で測定される量より少なくとも２倍高い量の腎臓ＲＮＡマーカーを含む場合、該被検体を、腎臓の病理学的な状態を有すると特徴付けることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被検体は、ヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
非ヒト哺乳動物の被検体を作用物質で処理すること；および
該被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への該作用物質の作用を測定すること、
を含む、作用物質を特徴付ける方法。
【請求項６】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物の被検体を第一の作用物質で処理すること、ここにおいて、該第一の作用物質は、該被検体の尿に放出される腎臓ＲＮＡマーカーの量を高めることを特徴とする；
被検体を第二の作用物質で処理すること；および
該第二の作用物質の、該第一の作用物質によって引き起こされた該被検体の尿に放出された該腎臓ＲＮＡマーカーの量を減少させることへの作用を測定すること、
を含む、作用物質の腎臓への保護的または治療的な特徴を評価する方法。
【請求項８】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒト被検体を医薬作用物質で処理すること；および
該被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への該医薬作用物質の作用を測定すること、
を含む、被検体の腎臓における医薬作用物質の作用のモニター方法。
【請求項１０】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物の被検体からの尿サンプルを採取すること、および該尿サンプル中の腎臓ＲＮＡマーカーの量を測定することを含む、被検体の腎臓の病理学的な状態を特徴付ける方法。
【請求項２】
尿サンプルが、腎臓の病理学的な状態を有さないコントロール被検体で測定される量より少なくとも２倍高い量の腎臓ＲＮＡマーカーを含む場合、該被検体を、腎臓の病理学的な状態を有すると特徴付けることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被検体は、ヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
非ヒト哺乳動物の被検体を作用物質で処理すること；および
該被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への該作用物質の作用を測定すること、
を含む、作用物質を特徴付ける方法。
【請求項６】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物の被検体を第一の作用物質で処理すること、ここにおいて、該第一の作用物質は、該被検体の尿に放出される腎臓ＲＮＡマーカーの量を高めることを特徴とする；
被検体を第二の作用物質で処理すること；および
該第二の作用物質の、該第一の作用物質によって引き起こされた該被検体の尿に放出された該腎臓ＲＮＡマーカーの量を減少させることへの作用を測定すること、
を含む、作用物質の腎臓への保護的または治療的な特徴を評価する方法。
【請求項８】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒト被検体を医薬作用物質で処理すること；および
該被検体の尿に放出された腎臓ＲＮＡマーカーの量への該医薬作用物質の作用を測定すること、
を含む、被検体の腎臓における医薬作用物質の作用のモニター方法。
【請求項１０】
腎臓ＲＮＡマーカーは、ＫＡＰ、ＫＩＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、アクアポリン１、アクアポリン２、アクアポリン３、タム−ホースフォール糖タンパク質、Ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓ、およびＨｓｐ７０から選択される、請求項９に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５０４０４７（Ｐ２００８−５０４０４７Ａ）
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１８７２８（Ｐ２００７−５１８７２８）
【出願日】平成１７年６月２０日（２００５．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２００１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００３４９３
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２０日（２００５．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２００１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００３４９３
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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