ＳＳＬ代替物としてのベーキング酵素組成物
本発明は、生地およびベイクド製品中でＳＳＬおよび／またはＣＳＬまたはその他の乳化剤を完全に置き換えるために使用し得る、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質活性を有する脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼ、および好ましくはヘミセルラーゼまたはセルラーゼおよびアミログルコシダーゼから選択される少なくとももう１つの酵素を含んでなるベーキング酵素組成物に関する。ベーキング酵素組成物が有効量で添加された生地、およびそれから得られるベイクド製品は、優れた生地安定性と耐衝撃性、およびベイクド製品の改善された体積、クラム構造とクラムの柔らかさならびに改善された抗老化性などの改善された特性を有する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、新しいベーキング酵素組成物、前記組成物を使用して製造される生地、およびそれから得られるベイクド製品に関する。本発明はまた、生地またはそれから得られるベイクド製品の製造において、ＳＳＬまたはＣＳＬを置き換える新しいベーキング酵素組成物の使用にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
生地の取り扱い特性および／またはベイクド製品の最終特性を改善するために、特性を改善する加工助剤を開発するたゆみない努力がなされている。加工助剤は本明細書で、生地の取り扱い特性および／またはベイクド製品の最終特性を改善する化合物と定義される。改善されうる生地特性としては、安定性、機械加工適性、ガス保持能力、粘性低下、弾性、伸展性、成形性などが挙げられる。改善されベイクド製品の特性としては、膨化体積、外皮サクサク感、火ぶくれ減少、クラム構造、クラム柔らかさ、香味、相対老化、および貯蔵寿命が挙げられる。これらの生地および／またはベイクド製品改善加工助剤は、化学添加剤と酵素（ベーキング酵素とも称される）に二分し得る。
【０００３】
特性改善化学添加剤は、アスコルビン酸、臭素、およびアゾジカルボン酸などの酸化剤；Ｌ−システインおよびグルタチオンなどの還元剤；モノ／ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、ステアロイルラクチル酸ナトリウム（ＳＳＬ）またはステアロイルラクチル酸カルシウム（ＣＳＬ）などの生地調整剤として機能する乳化剤；またはモノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）などのクラム軟化剤として機能する乳化剤；トリグリセリド（脂肪）またはレシチンなどの脂肪質を含んでなる。
【０００４】
製パン工業で適用される乳化剤は、クラム軟化剤または生地強化剤に大まかに区分し得る。蒸留されたモノグリセリドは、主にクラム軟化のために使用される。モノグリセリドのデンプンとの複合体形成は、デンプンの完全な再結晶化を防止して、初期のクラム軟らかさおよび／またはベイクド製品の貯蔵寿命中のクラム固化速度の低下をもたらす。生地強化のためには、ＤＡＴＥＭ、ＣＳＬ、およびＳＳＬなどのいくつかの異なる合成極性脂質類似物を応用する。それらの製パンにおける効果は、主に生地の安定性を改善することである。
【０００５】
生地の粘性低下、生地機械加工性の改善などのその他の生地の特徴、そして膨化体積の増大、クラム構造の改善、クラム柔らかさと貯蔵寿命の改善、および外皮サクサク感の改善などの改善されたベイクド製品の特徴もまた達成され得る。
【０００６】
皮の硬いローフタイプのパンでは化学乳化剤としてＤＡＴＥＭが主に使用される一方、ＳＳＬまたはＣＳＬは、主に型焼きパン、サンドイッチパン、およびソフトロールバンズなどの柔らかいパンで使用される。
【０００７】
化学添加剤をより多くの天然物で置き換える消費者主導の必要性の結果として、特定のベーキング用途条件に応じた生地および／またはベイクド製品改善特性がある、いくつかのベーキング酵素が開発されている。
【０００８】
化学添加剤に対する消費者の抵抗は増大しており、したがって消費者に抵抗なく受け入れられる添加剤および／または酵素によって、加工助剤と見なされる乳化剤を置き換える絶え間ない需要がある。しかし例えば乳化剤を省くとパンの品質は相当に低下し、ＳＳＬまたはモノグリセリドのような乳化剤を使用せずに３〜５日間の貯蔵寿命を達成することは、サンドイッチパンなどの皮の硬くない各種パンにとって困難である。
【０００９】
パンの老化に関する研究は、パン中のデンプン画分が保存中に再結晶化することにより、クラムの硬さの増大を引き起こすことを示唆した。アミラーゼおよびヘミセルラーゼは、クラム柔らかさと膨化体積を改善するパン改良剤の中で広く使用されている。αアミラーゼはベーキング中にデンプン画分を部分的に分解し、クラム柔らかさを増大させる。ヘミセルラーゼは小麦粉のヘミセルロース画分を分解し、それによって常態ではこの画分に結合する水を生地の中に遊離させる。パン改良剤中のヘミセルラーゼの使用は、ベーキング中の改善された生地の窯伸び、ベーカリー製品の改善された膨化体積、粒構造、およびより良い保存性をもたらす。しかしアミラーゼおよびヘミセルラーゼによって与えられる改善は限定的であり、したがってパンの許容可能な日持ちを得るためには、乳化剤がなおも必要とされる。
【００１０】
Ｄｅ Ｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）７４：２９０−３００は、製パン工業においてホスホリパーゼを使用して、特にベイクド製品の製造において、ＤＡＴＥＭ、ＣＳＬまたはＳＳＬなどの乳化剤を部分的にまたは完全に置き換えてもよいことを記載する。
【００１１】
国際公開第０２／０３８０５号パンフレットは、異なる基質特異性のある２つの脂肪分解酵素の組み合わせが、生地、または生地からできたベイクド製品に対して相乗効果をもたらし、体積が改善されたベイクド製品および／またはベーキング中に形状がより良く保持されるベイクド製品を生じることを記載する。
【００１２】
欧州特許第０５８５９８８号明細書は、好ましくはショートニングと組み合わされた、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、およびアミラーゼを含んでなるパン改良剤組成物について記載する。前記酵素製剤および好ましくはショートニングの組み合わせは、ＳＳＬやモノグリセリドのような乳化剤を置換し得る。
【００１３】
ベーキング製品の製造において、ＳＳＬまたはＣＳＬなどの化学乳化剤の使用を削減する新しい趨勢のために、ベーキング工程において、これらの化学乳化剤を置き換え得る代替のまたは改善されたベーキング酵素組成物に対する必要性がある。生地およびそれから製造されるベイクド製品の生産において、乳化剤、特にＳＳＬまたはＣＳＬを部分的にまたは完全に置き換え得る、新しいベーキング酵素組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
［発明の概要］
本発明の第１の態様では、
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物に従うアミノ酸配列；または
（Ｂ）（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；または
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コード縮重の結果として縮重される配列；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる、単離ポリペプチドである脂肪分解酵素を含んでなる、ベーキング酵素組成物が開示され、
組成物は、トリアシルグリセロールリパーゼ、好ましくはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するリパーゼをさらに含んでなる。
【００１５】
ベーキング酵素組成物は、セルラーゼまたはヘミセルラーゼ、およびアミログルコシダーゼまたはこれらの酵素の１つ以上の混合物をさらに含んでなってもよい。本発明に従ったベーキング酵素組成物は、１つ以上のその他の酵素、１つ以上の生地改善および／またはパン改善添加剤をさらに含んでなってもよい。第２の態様では、本発明は本発明の第１の態様に従ったベーキング酵素組成物、小麦粉、および１つ以上の生地またはパン添加剤を含んでなるプレミックスを提供する。
【００１６】
別の態様では本発明は、小麦粉、水、酵母、および本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスを含んでなる生地を提供する。本発明に従ったベーキング酵素組成物を含んでなる生地は、優れた安定性、機械的損傷に対する耐衝性、および良好な伸展性や低粘性などのその他の特性を有することが意外にも分かった。本発明に従ったベーキング組成物の使用は、季節的変動に起因する小麦粉中の異なる脂質プロフィールの変化を自動的に緩和することで、小麦粉の変動性の影響を排除する。本発明の第４の態様では、本発明に従った生地を焼くことで得られるベイクド製品が提供される。本発明に従ったベイクド製品は、改善された体積と非常に良好なクラム構造、特に細かいクラム構造、クラム柔らかさを有し、したがって貯蔵寿命が増大することが意外にも発見された。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、本発明に従った生地およびベイクド製品を製造する方法が提供される。本発明はまた、生地またはそれに由来するベイクド製品の製造において、乳化剤を置き換え、好ましくはＳＳＬまたはＣＳＬを置き換えるための本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスの使用も提供する。プレミックスからのＳＳＬおよび／またはＣＳＬの省略は、ベイクド製品成分の製造中の取り扱いおよび保存節減をもたらし、本発明のベーキング組成物は、ＳＳＬまたはＣＳＬよりもはるかに低い投与量で使用し得るという事実のために、コスト削減を可能にする。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
したがって本発明の第１の態様では、
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物に従うアミノ酸配列；または
（Ｂ）（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；または
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コード縮重の結果として縮重される配列；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチドである、脂肪分解酵素（本細書中で本発明に従った脂肪分解酵素として示される）を含んでなるベーキング組成物が開示され、
組成物は、トリアシルグリセロールリパーゼ、好ましくはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するトリアシルグリセロールリパーゼをさらに含んでなる。
【００１９】
ベーキング酵素組成物中で使用される本発明に従った脂肪分解酵素は、製パン用途において、グリセリド（例えばトリグリセリド）、リン脂質、およびガラクト脂質などの糖脂質に及ぶ、いくつかの各種脂質に作用できる。好ましくは本発明に従った脂肪分解酵素は、製パン用途において、例えば生地状態で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を有する。
【００２０】
脂肪分解酵素は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または最も好ましくは９０％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドであり、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物である。
【００２１】
本発明のベーキング組成物で使用される好ましい脂肪分解酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸（Ｌ０１として示される）、すなわち配列番号２に記載のアミノ酸３４〜３０４に由来して、アミノ酸配列が配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる、成熟ポリペプチドに相当する脂肪分解酵素である。
【００２２】
さらに具体的には本発明に従ったベーキング酵素組成物中で使用される脂肪分解酵素は、生地中原位置で使用した場合に、以下の特性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す。
●無極性脂質に対する比較的低い活性。
●ジアシルガラクト脂質などの極性ジアシル脂質および／またはリン脂質に対する比較的高い活性。
●リゾガラクト脂質やリゾリン脂質などの極性モノアシル化合物に対する比較的低い活性。
【００２３】
これらの意外な特性は全て、生地中で化学乳化剤代替物として使用した場合に、極めて有利であることが分かった。
【００２４】
グリセリドは、グリセロールと脂肪酸のエステルである。トリグリセリド（トリアシルグリセロールまたはトリアシルグリセリドとしてもまた知られている）は、主に植物油および動物脂肪中に存在する。リパーゼ（トリアシルグリセロールリパーゼとしてもまた知られている）（ＥＣ３．１．１．３）は、本明細書で、トリグリセリド中に存在する脂肪酸の１つ以上を加水分解する酵素と定義され、さらに具体的にはそれらは脂肪酸とグリセロール部分の水酸基の間のエステル結合を加水分解する。
【００２５】
糖脂質（例えばガラクト脂質）は、外側（ｓｎ−１）および中央（ｓｎ−２）の位置に２つのエステル化脂肪酸があるグリセロール主鎖から構成される一方、第３の水酸基は、例えばモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ）またはジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）のようなガラクト脂質の場合は、ガラクトースなどの糖残基に結合する。ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）は、ガラクトシルジグリセリドからのそれぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置中の片方または双方の脂肪アシル基の加水分解を触媒する。
【００２６】
リン脂質は、外側（ｓｎ−１）と中央（ｓｎ−２）の位置に２つのエステル化脂肪酸があるグリセロール主鎖から構成される一方、グリセロールの第３の水酸基でリン酸でエステル化される。次にリン酸は、例えばエタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン）のようなアミノアルコール、コリン（ホスファチジルコリン）でエステル化されてもよい。ホスホリパーゼは、本明細書でリン脂質中の１つ以上の結合の加水分解に関与する酵素と定義される。
【００２７】
脂肪酸アシル部分をグリセロール主鎖に結合するエステル結合を加水分解する、ホスホリパーゼ活性のいくつかのタイプが、区別され得る。
●ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）およびＡ２（ＥＣ３．１．１．４）は、ジアシルグリセロリン脂質から、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置中の１つの脂肪酸アシル基の脱アシル化を触媒して、リゾリン脂質を生成する。これは乳化剤代替物質にとって、望ましい活性である。
●リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５；Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）によってホスホリパーゼＢとも称される）は、リゾリン脂質中の残る脂肪酸アシル基の加水分解を触媒する。
ジアシルグリセロリン脂質からの双方の脂肪酸の脱アシル化を触媒し、リゾホスホリパーゼ活性を内在性に有する、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）からのホスホリパーゼＢが報告されている（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９７：４４６−４５６）。リゾホスホリパーゼ活性は極性頭部と無極性尾部の組み合わせの欠失をもたらし、得られる製品は表面特性に影響できなくなるので、乳化剤代替物質にとって望ましくない。意外なことに、本発明に従った脂肪分解酵素は生地中で比較的低いリゾホスホリパーゼ活性を示すことが示された。
【００２８】
トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する本発明に従った脂肪分解酵素そのまま使用して、生地中の好ましくはＳＳＬおよび／またはＣＳＬである乳化剤を置き換えてもよい。生地に有効量で組み込まれると、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する脂肪分解酵素は、その中にポリペプチドが組み込まれない生地またはベイクド製品と比較して、生地またはそれから得られるベイクド製品の１つ以上の特性を改善するかもしれない。
【００２９】
「特性改善」という用語は、本明細書で、本発明に従った脂肪分解酵素または本発明に従ったベーキング酵素組成物の作用によって、その中に本発明に従った脂肪分解酵素または組成物組み込まれない生地または製品と比較して改善された、生地および／または生地から得られる製品、特にベイクド製品のあらゆる特性と定義される。改善された特性としては、生地の強度増大、生地の弾性増大、生地の安定性増大および耐衝撃性増大、生地の粘性低下、生地の伸展性改善、生地の機械加工適性改善、ベイクド製品の体積増大、ベイクド製品の香味改善、ベイクド製品のクラム構造改善、ベイクド製品のクラム柔らかさ改善、ベイクド製品の火ぶくれ減少および／またはベイクド製品の抗老化改善が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
特性改善は、下述する本発明の方法に従って、本発明の脂肪分解酵素またはベーキング酵素組成物の添加ありまたはなしで調製された生地および／またはベイクド製品を比較することで判定されてもよい。官能特性は製パン工業で確立された手順を使用して評価されてもよく、例えば訓練された味覚テスターパネルの使用を含んでもよい。
【００３１】
「生地の強度増大」という用語は、本明細書で、一般により弾力のある特性を有し、および／または成形と造形により多くの力を要する、生地の特性と定義される。
【００３２】
「生地の弾性増大」という用語は、本明細書で、特定の物理的歪みを加えられた後に、元の形状に復帰するより高い傾向を有する生地の特性と定義される。
【００３３】
「生地の安定性増大」という用語は、本明細書で機械的損傷を受けにくく、したがってその形状と体積をより良く保つ生地の特性と定義され、通常のおよび／または長時間発酵後のローフ断面の高さ：幅比率によって評価される。
【００３４】
「生地の粘性低下」という用語は、本明細書で例えば生地製造機内において、表面に付着するより低い傾向を有する生地の特性と定義され、当該技術分野で知られているように、熟練した試験パン職人によって経験的に評価され、またはテクスチャー分析器（例えばＴＡＸＴ２）の使用によって測定される。
【００３５】
「生地の伸展性改善」という用語は、本明細書で、裂けることなく、歪みまたは伸展の増大を被り得る生地の特性と定義される。
【００３６】
「生地の機械加工適性改善」という用語は、本明細書で、一般に粘性がより低くおよび／またはより堅固でおよび／または弾性のある生地の特性と定義される。
【００３７】
「生地の耐衝撃性増大」という用語は、本明細書で、機械的衝撃を被った後にその形状と体積を保つ生地の特性と定義される。これは衝撃を与えなかった同一の生地から得られるベイクド製品と比較して、衝撃を与えた生地から得られるベイクド製品の体積変動百分率を測定することで評価される。衝撃を与えた生地によって得られるベイクド製品の体積損失が、衝撃を与えなかった同一の生地によって得られるベイクド製品と比較して、可能な限り小さくまたは不在であれば、生地は十分に安定している。生地には当業者に知られている方法によって、例えば実験の項で報告される方法によって衝撃を与えてもよい。
【００３８】
「ベイクド製品の体積増大」という用語は、当該技術分野で知られている超音波またはレーザー検出を使用して、自動化パン体積分析器（例えばＢＶＭ−３；スウェーデン国のＴｅｘ Ｖｏｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ，Ｖｉｋｅｎ）によって測定される、特定のパンローフの体積として測定される。
【００３９】
「ベイクド製品の火ぶくれ減少」という用語は、本明細書で視覚的に判定される焼かれたパン外皮の火ぶくれ形成の減少と定義される。
【００４０】
「ベイクド製品のクラム構造改善」という用語は、本明細書で、クラム中のより細かい気泡および／またはより薄い気泡壁および／またはクラム中の気泡のより均一／均質の分布があるベイクド製品の特性と定義され、通常、当該技術分野で知られているように、パン職人によって視覚的に、またはデジタル画像分析（例えばＣ−ｃｅｌｌ；英国ウォリントンのアップルトン（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）のＣａｌｉｂｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）によって評価される。
【００４１】
「ベイクド製品の軟らかさ改善」という用語は、「硬さ」の逆であり、本明細書でより容易に押圧されるベイクド製品の特性と定義され、当該技術分野で知られているように、熟練した試験パン職人によって経験的に評価され、またはテクスチャー分析器（例えばＴＡＸＴ２またはＴＡ−ＸＴ Ｐｌｕｓ；英国サリーのＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ）の使用によって測定される。
【００４２】
「ベイクド製品の香味改善」という用語は、訓練された試験パネルによって評価される。
【００４３】
「ベイクド製品の抗老化改善」という用語は、本明細書で、保存中における例えば軟らかさおよび／または弾性などの品質パラメーターの劣化速度が低下している、ベイクド製品の特性と定義される。
【００４４】
「サクサク感の改善」という用語は、本明細書で、当該技術分野で知られている参考製品よりも強いサクサク感を与え、ならびにこの強いサクサク感を参考製品よりも長く保つベイクド製品の特性と定義される。この特性は、例えばテクスチャー分析器ＴＡ−ＸＴ Ｐｌｕｓ（英国サリーのＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ））を使用して、押圧実験で固定速度における距離対力曲線を測定し、この圧縮曲線から物理的パラメーター、すなわち（ｉ）第１のピーク力、（ｉｉ）第１のピーク距離、（ｉｉｉ）初期傾斜、（ｉｖ）最大ピーク力、（ｖ）グラフ下面積、および（ｖｉ）破壊事象数（力が特定の設定値よりも大きく低下する）を得ることによって定量化し得る。サクサク感改善の指標は、より高い第１のピーク力、より短い第１のピーク距離、より高い初期傾斜、より高い最高ピーク力、より大きなグラフ下面積、およびより多数の破壊事象である。サクサクのより強い製品は、参考製品と比較して、少なくともこれらのパラメーターの２つにおいて統計的に有意により良く得点すべきである。当該技術分野で、「サクサク感」はまた、サクサク感、カリカリ感またはパリパリ感とも称され、サクサク、カリカリしてまたはパリパリした破壊挙動のある物質を意味する。
【００４５】
トリアシルグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する、本発明に従った脂肪分解酵素をそのまま有効量で生地に組み込んだ場合、生地強度などのいくつかの生地特性、およびそれから得られるベイクド製品のパン体積などのいくつかの特性が改善されるかもしれない。しかしこれらの改善は、特にベイクド製品が、型焼きパンまたはサンドイッチパン、ロール、ハンバーガーバンズのようなバンズ、またはイーストで膨らませたドーナツなどの柔らかく皮が硬くないタイプである場合、完全に十分でないかもしれない。したがって所望の生地およびベイクド製品の特徴を得るためには、なおもＳＳＬまたはＣＳＬを生地成分として添加する必要がある。
【００４６】
本発明に従った脂肪分解酵素とトリアシルグリセロールリパーゼを型焼きパンなどのベイクド製品を製造するのに使用される生地に有効量で添加した場合、良好な強度、改善された安定性、および機械加工性がある生地が得られる一方、対応するベイクド製品は改善されたパン体積と細かいクラム構造を示すことが意外にも分かった。有効量の本発明に従った脂肪分解酵素と、トリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる生地は、ＳＳＬまたはＣＳＬが組み込まれた場合と同様の安定特性を有してもよい。
【００４７】
トリアシルグリセロールリパーゼは、好ましくは真菌リパーゼであり、好ましくはクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）に由来する。より好ましくはクモノスカビ属（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）に由来する、より好ましくはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するトリアシルグリセロールリパーゼが使用される。任意に２つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの組み合わせを使用し得る。したがって本発明の別の実施態様では、本発明に従ったベーキング酵素組成物は、２つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの組み合わせをさらに含んでなる。
【００４８】
好ましい本発明の実施態様では、本発明に従ったベーキング酵素組成物は、ヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼをさらに含んでなる。任意に２つ以上のヘミセルラーゼおよび／または２つ以上のセルラーゼの組み合わせ、および／または１つ以上のヘミセルラーゼと１つ以上のセルラーゼの組み合わせを使用し得る。
【００４９】
本発明に従った脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼを含んでなるベーキング組成物を型焼きパンまたはサンドイッチパン、ハンバーガーバンズのようなバンズ、ロール、およびイーストで膨らませたドーナツなどのベイクド製品を製造するのに使用される生地に有効量で添加すると、生地の特性および生地から得られるベイクド製品の特性が、本発明に従った脂肪分解酵素およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなるがヘミセルラーゼまたはセルラーゼを含まない生地と比較して、さらに改善されてもよいことが意外にも分かった。特に、さらに改善された体積および／またはより細かいクラム構造および／またはクラム柔らかさが得られてもよい。
【００５０】
特に良好な結果が、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に由来する、またはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来するセルラーゼを使用して得られてもよい。
【００５１】
なおもより好ましい本発明の実施態様では、本発明に従ったベーキング酵素組成物は、アミログルコシダーゼ、好ましくはコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、より好ましくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するアミログルコシダーゼをさらに含んでなる。
【００５２】
意外なことに、本発明に従った脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼ、ヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼ、およびアミログルコシダーゼを含んでなるベーキング酵素組成物を生地に有効量で組み込むと、生地およびそれから得られるベイクド製品の質が、本発明に従った脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼおよびヘミセルラーゼまたはセルラーゼを含んでなるが、アミログルコシダーゼを含まない生地と比較してさらに改善されてもよい。得られる生地は、改善された安定性および／または増大する耐衝撃性、改善された機械加工性、良好な膨らみなどの例外的な質を有し、対応する製品は、優れた体積、細かいクラム構造および／またはクラム柔らかさを有してもよく、結果としてそれは長期の貯蔵寿命を有してもよい。これらの改善は、生地中のＳＳＬまたはＣＳＬの完全な置き換えを可能にする。
【００５３】
本発明に従ったベーキング酵素組成物は、追加的酵素および／または生地および／またはパン添加剤をさらに含んでなってもよい。
【００５４】
追加的酵素は、哺乳類および植物をはじめとするあらゆる起源、好ましくは微生物（細菌、酵母または真菌）起源であってもよく、通常当該技術分野で利用される技術によって得られてもよい。
【００５５】
追加的酵素は、αアミラーゼ（酵母が発酵できる糖を提供し、老化を遅らせるのに有用である）、βアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼまたは非マルトース生成アミラーゼなどのアミラーゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；プロテアーゼ；特にエキソペプチダーゼ（香味改良に有用である）などのペプチダーゼ；トランスグルタミナーゼ；ガラクトリパーゼ；ホスホリパーゼ；特に例えばキシラナーゼ（ペントサンの部分的加水分解に有用であり、さらに具体的には生地の伸展性を増大させるアラビノキシラン）のようなペントサナーゼなどのヘミセルラーゼ；プロテアーゼ（特に強力粉を使用する場合、グルテン弱化に有用である）；例えば国際公開第９５／００６３６号パンフレットで開示されるようなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；ペルオキシダーゼ（生地粘稠度を改善するのに有用である）；ラッカーゼ；またはオキシダーゼ；例えばグルコースオキシダーゼなどのヘキソースオキシダーゼ；アルドースオキシダーゼ；ピラノースオキシダーゼ；リポキシゲナーゼまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼ（生地粘稠度を改善するのに有用である）であってもよい。本発明に従ったベーキング組成物がマルトース生成アミラーゼをさらに含んでなる場合、生地に添加された組成物は、改善されたクラム柔らかさ、ひいては改善された貯蔵寿命がある、それから得られるベイクド製品をもたらす。
【００５６】
生地およびパン製造において、本発明に従ったベーキング酵素組成物をその他のパンまたは生地成分との、または塩、酸化剤（例えばアスコルビン酸）や還元剤（例えばＬ−システイン）および／または乳化剤（例えばＤＡＴＥＭ、ＳＳＬおよび／またはＣＳＬ）のような化学加工助剤、および／またはオキシド還元酵素（例えばグルコースオキシダーゼ）や多糖類修飾酵素（例えばαアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、分枝酵素など）および／またはタンパク質修飾酵素（エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、分枝酵素など）などの酵素加工助剤などの添加剤との組み合わせで使用してもよい。好ましくはベイクド製品または生地を製造するのに使用される添加剤はＳＳＬおよび／またはＣＳＬを含まず、より好ましくはそれらはＳＳＬ、ＣＳＬ、ＤＡＴＥＭ、ＧＭＳから選択される乳化剤を含まず、より好ましくは乳化剤を含まない。
【００５７】
第２の態様では、本発明は、本発明に従ったベーキング酵素組成物、小麦粉、および前述の１つ以上のパンまたは生地添加剤を含んでなるプレミックスを提供する。
【００５８】
「プレミックス」という用語は、本明細書において、その従来の意味で、すなわち工業的製パン工場／設備だけでなく、小売ベーカリーでも使用されてよい、一般に小麦粉を含むベーキング剤の混合物と理解されるべきであると定義される。プレミックスは、本発明のベーキング酵素組成物を小麦粉、デンプン、糖、マルトデキストリンなどの複合糖質、または塩などの適切なキャリアと混合して調製されてもよい。プレミックスは、例えば上述のいずれかの酵素をはじめとする添加剤、その他の生地および／またはパン添加剤を含有してもよい。
【００５９】
別の態様では本発明は、少なくとも小麦粉、水、および酵母を含んでなる生地成分に、本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスを添加するステップを含んでなる、生地を調製する方法を開示する。
【００６０】
上述の成分およびパンまたは生地添加剤からの生地の調製は、当該技術分野で良く知られており、前記成分と添加剤を混合するステップと、１つ以上の成形および発酵ステップを含んでなる。
【００６１】
別の態様では、本発明は、小麦粉、水、酵母、および有効量の本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスを含んでなる生地を提供する。
【００６２】
本発明はまた、ポリペプチドが組み込まれていない生地またはベイクド製品と比較して、生地または生地から得られるベイクド製品の１つ以上の特性を改善する、有効量の本発明のベーキング酵素組成物を生地に組み込むステップを含んでなる、生地またはベイクド製品を調製する方法にも関する。
【００６３】
「生地に組み込む」という語句は、本明細書で、生地に、生地がそれから作られるあらゆる成分に、および／または生地がそれから作られるあらゆる生地成分混合物に、本発明に従ったベーキング酵素組成物を添加することと定義される。換言すれば本発明のベーキング酵素組成物は、生地調製のあらゆるステップで添加されてもよく、１つまたは２つ以上のステップで添加されてもよい。組成物は、当該技術分野で良く知られている方法を使用して、練られて焼かれベイクド製品が製造される生地成分に添加される。例えば米国特許第４，５６７，０４６号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−４２６，２１１号明細書、特開昭６０−７８５２９号公報、特開昭６２−１１１６２９号公報、および特開昭６３−２５８５２８号公報を参照されたい。
【００６４】
「有効量」という用語は、本明細書で、生地および／またはベイクド製品の関心のある少なくとも１つの特性に対して、測定可能な効果を与えるのに十分な、本発明に従ったベーキング酵素組成物の量と定義される。
【００６５】
「生地」という用語は、本明細書で、練るのにまたは丸めるのに十分に硬い小麦粉とその他の成分との混合物と定義される。生地は、新鮮、凍結、調製済、または予備焼成であってもよい。凍結生地の調製については、ＫｕｌｐおよびＬｏｒｅｎｚによって「Ｆｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｄｏｕｇｈｓ ａｎｄ Ｂａｔｔｅｒｓ」，Ｋ．Ｋｕｌｐ，Ｋ．Ｌｏｒｅｎｚ，Ｊ．Ｂｒｕｍｍｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９９５）で記載される。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様に従って、本発明に従った脂肪分解酵素は、本発明に従った脂肪分解酵素の小麦粉（例えばＬ０１）１ｋｇあたり少なくとも３．５７ＤＬＵ単位の量、好ましくは少なくとも７．１５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも１４．３０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。好ましい本発明の実施態様に従って、本発明に従った脂肪分解酵素は、最大で１４３ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の本発明に従った脂肪分解酵素、好ましくは最大で７１．５０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大で３５．７５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。本発明に従った脂肪分解酵素のＤＬＵ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００６７】
本発明に従った生地は、トリアシルグリセロールリパーゼをさらに含んでなる。本発明の好ましい実施態様に従って、トリアシルグリセロールリパーゼが、１ｋｇのトリアシルグリセロールリパーゼ小麦粉あたり少なくとも８０ＰＬＩ単位の量、好ましくは少なくとも１６０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも３２０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。好ましい本発明の実施態様に従って、トリアシルグリセロールリパーゼが、最大３２００ＰＬＩ／ｋｇトリアシルグリセロールリパーゼ小麦粉、好ましくは最大１６００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大８００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。トリアシルグリセロールリパーゼのＰＬＩ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００６８】
本発明に従った生地は、セルラーゼをさらに含んでなってもよい。本発明の好ましい実施態様に従って、セルラーゼが１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも２．３４ＣＸＵ単位のセルラーゼ、好ましくは少なくとも４．６８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも７．５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも９．３６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも１５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは少なくとも２３．４ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。本発明の好ましい実施態様に従って、セルラーゼが、最大３００ＣＸＵセルラーゼ／ｋｇ小麦粉の量で、好ましくは最大１５０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大９３．６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは最大７５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより、好ましくは最大４６．８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大３０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。セルラーゼのＣＸＵ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００６９】
本発明に従った生地は、アミログルコシダーゼをさらに含んでなってもよい。好ましい実施態様に従って、アミログルコシダーゼが、１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも１３０ＡＧＩ単位のアミログルコシダーゼ、好ましくは少なくとも２６０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも５２０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。本発明の好ましい実施態様に従って、アミログルコシダーゼが、最大５２００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼ、好ましくは最大２６００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大１３００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。アミログルコシダーゼのＡＧＩ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００７０】
好ましい実施態様では、本発明に従った生地はＳＳＬおよび／またはＣＳＬを実質的に含まず、好ましくはそれは実質的にＳＳＬ、ＣＳＬ、ＤＡＴＥＭ、ＧＳＭから選択される乳化剤を含まず、より好ましくはそれは乳化剤を含まない。一般に、通常生地中で使用されるＳＳＬおよび／またはＣＳＬの量は、生地中に存在する小麦粉を基準にして０．１〜０．５％ｗ／ｗである。本発明に従ったベーキング組成物を特に上述の量で生地に添加すると、生地中に存在する上述の量のＳＳＬまたはＣＳＬが完全に置き換えられてもよい。ＳＳＬが主にクラム軟化剤および老化防止として使用され、他の軟化システムが製パン過程で添加されない用途では、マルトース生成アミラーゼと組み合わされた本発明に従ったベーキング酵素組成物を使用して利点を達成し得て、置き換える各０．１％のＳＳＬに対し、１〜２ｐｐｍのマルトース生成アミラーゼを使用することが有用かもしれない。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、本発明に従った生地を焼くステップを含んでなるベイクド製品を調製する方法を提供する。
【００７２】
本発明はまた、本発明に従った生地焼くことで得られるベイクド製品も提供する。
【００７３】
このような生地からのベイクド製品の調製はまた、当該技術分野で良く知られており、生地を成形して造形しさらに発酵させるステップと、それに続く必要な温度とベーキング時間で焼くステップを含んでなってもよい。一実施態様では本発明は、本発明に従った生地を焼くステップを含んでなるベイクド製品を調製する方法を提供する。本発明はまた、この方法に従って得られるベイクド製品も提供する。好ましくは本発明に従ったベイクド製品はパンであり、より好ましくはベイクド製品は型焼きパン、サンドイッチパン、バンズまたはロールなどの柔らかい性質である。
【００７４】
「ベイクド製品」という用語は、本明細書で、生地から調製される柔らかいまたはサクサクした性質のどちらかのあらゆる製品と定義される。好ましくはベイクド製品は柔らかい性質であり、好ましくは型焼きパン、サンドイッチパン、バンズまたはロールなどの柔らかい性質である。白色、淡色または暗色タイプにかかわらず、有利には本発明によって製造されてもよいベイクド製品のさらなる例は、典型的にローフまたはロールの形態のパン（特に精白、全粒またはライ麦パン）、フランスパンタイプのパン、焼き菓子、クロワッサン、パスタ、麺類（茹で麺または炒め麺、揚げ麺）、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、マフィン、パンケーキ、ビスケット、クッキー、ドーナツ、ベーグル、パイ皮、蒸しパン、およびクリスプブレッドなどである。
【００７５】
本発明は、生地またはそれに由来するベイクド製品の製造において、ＳＳＬまたはＣＳＬを置き換え、好ましくはＳＳＬ、ＣＳＬ、ＤＡＴＥＭ、ＧＭＳから選択される乳化剤を置き換え、好ましくは全ての乳化剤を置き換える、本発明に従ったベーキング組成物またはプレミックスの使用をさらに提供する。
【００７６】
以下、製パン用途においてトリアシルグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する本発明に従った脂肪分解酵素、ならびに脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明に従ったポリヌクレオチドと称される）についてさらに詳しく記載する。
【００７７】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号２のアミノ酸配列の成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重された配列；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００７８】
特に本発明は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供し、前記配列は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的である。したがって本発明は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、なおもより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％相同的なポリヌクレオチドを提供する。
【００７９】
一実施態様ではこのような単離されたポリヌクレオチドは、例えば固相合成によって合成的に、または当業者に知られているその他の方法によって得られる。
【００８０】
別の実施態様では本発明は、配列番号１に記載の脂肪分解酵素遺伝子、または活性脂肪分解酵素をなおもコードする機能的同等物を提供する。
【００８１】
好ましくは本発明に従ったポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列である。
【００８２】
本発明はまた、本発明に従ったＤＮＡを増幅するまたは検出するのに使用してもよい、本発明に従ったポリヌクレオチド配列、プライマー、プローブ、および断片を含んでなるベクターにも関する。
【００８３】
さらなる好ましい実施態様では、その中で本発明に従ったポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの制御配列と、適切な宿主細胞内でポリヌクレオチド配列が発現できるように作動的に連結するベクターが提供される。好ましくは前記適切な宿主細胞は糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種である。適切な株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）に属する。好ましくは宿主細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。
【００８４】
本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドを含有する組換え的に生成された宿主細胞にも関する。
【００８５】
本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドおよびベクターを調製する方法も提供する。
【００８６】
別の実施態様では、本発明は、その中で本発明に従ったポリヌクレオチドの発現が顕著に増大されており、または脂肪分解活性の産生レベルが顕著に改善されている組み換え宿主細胞を提供する。
【００８７】
別の実施態様では本発明は、例えば本発明に従った遺伝子の増大したコピー数を含んでなるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株のように、その中で細胞が本発明に従った機能性の脂肪分解酵素産生でき、すなわち本発明に従った脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを発現または好ましくは過剰発現できる、本発明に従った異種または相同ＤＮＡを含有する組換え的に生成された宿主細胞を提供する。
【００８８】
本発明のさらに別の態様では、脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドが提供される。本発明に従ったポリペプチドは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００８９】
一実施態様では本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの機能的同等物である脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドにも関し、それは前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的である。
【００９０】
本発明に従ったポリペプチドを含んでなる融合タンパク質もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドを製造する方法も提供する。
【００９１】
本発明はまた、本発明に従ったベーキング酵素組成物中における、本発明に従った脂肪分解酵素の使用にも関する。
【００９２】
［ポリヌクレオチド］
本発明は、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重された配列；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００９３】
一実施態様では、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有する機能的同等物を有する、脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００９４】
本発明の文脈で「成熟ポリペプチド」とは、本明細書で、翻訳と、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などのあらゆる翻訳後修飾に続くその最終形態において、脂肪分解活性を有するポリペプチドと定義される。成熟過程は、使用される特定の発現ベクター、発現宿主、および製造工程に左右されてもよい。好ましくは成熟ポリペプチドは、アミノ酸配列番号２中のアミノ酸３４〜３０４である。「成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」は、本明細書で成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と定義される。好ましくは成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド１００〜９１２である。
【００９５】
別の実施態様では本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの機能的同等物である、脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、それは前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的である。
【００９６】
本発明は、脂肪分解酵素をコードする遺伝子を構成するポリヌクレオチド配列、ならびにそのコード配列を提供する。したがって本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、または配列番号１と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物などの変異体に関する。
【００９７】
特に本発明は、好ましくはストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関し、好ましくは前記配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的である。
【００９８】
さらに具体的には、本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなり、または本質的にそれからなる単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００９９】
このような単離されたポリヌクレオチドは、当業者に知られている方法を用いた合成によって得られてもよい。
【０１００】
本明細書での用法では、「遺伝子」および「組み換え遺伝子」という用語は、例えば脂肪分解酵素などのタンパク質をコードする読み取り枠を含む、染色体ＤＮＡから単離されてもよい核酸分子を指す。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロン、および制御配列を含んでもよい。さらに遺伝子は、本明細書で定義される単離された核酸分子またはポリヌクレオチドを指す。
【０１０１】
配列番号１のヌクレオチド配列またはその機能的同等物を有する核酸分子などの本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術および本明細書で提供される配列情報を使用して単離し得る。例えばハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸配列の全部または一部を使用して、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して本発明に従った核酸分子を単離し得る（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載される）。
【０１０２】
さらに配列番号１に含有される配列情報に基づいてデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、配列番号１の全部または一部を包含する核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離し得る。
【０１０３】
本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは代案としてはゲノムＤＮＡをテンプレートとして、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローンして、ＤＮＡ配列分析によって特性解析し得る。
【０１０４】
さらに本発明に従ったヌクレオチド配列の補体に対応する、またはそれとハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは、標準合成技術によって、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して調製し得る。
【０１０５】
好ましい実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる。配列番号１の配列は、配列番号２に記載のポリペプチドと、配列番号２に記載の成熟ポリペプチドに従った脂肪分解酵素とをコードする。配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドに従った脂肪分解酵素は、Ｌ０１として示される。配列番号１に記載のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ Ｌ０１として示される。
【０１０６】
別の好ましい実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に示すヌクレオチド配列の補体である核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列の機能的同等物を含んでなる。
【０１０７】
別のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子とは、それが別のヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定した二本鎖を形成し得る程度に、別のヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
【０１０８】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド、またはその機能的同等物などの変異体をコードする、例えば生物学的に活性な断片またはドメインなどの単離された核酸分子、ならびに核酸分子増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するのに適した、本発明のポリペプチドおよびこのような核酸分子の断片をコードする核酸分子を同定するハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。
【０１０９】
「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸」は、それが由来する生物の天然ゲノム中でそれが隣接するコード配列（片方は５’末端もう一方は３’末端）のどちらにも隣接しないＤＮＡまたはＲＮＡである。したがって一実施態様では、単離された核酸は、コード配列に隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部または全部を含む。したがってこの用語は、例えばベクターに、自己複製プラスミドまたはウィルスに、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組み換えＤＮＡ、またはその他の配列から独立して別個の分子として存在する組み換えＤＮＡ（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を含む。それはまた、実質的に細胞物質、ウィルス性物質、または培養液（組み換えＤＮＡ技術によって生成される場合）、または化学前駆体またはその他の化学物質（化学的に合成される場合）を含まない、追加的ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡも含む。さらに「単離された核酸断片」は、断片として天然に存在せず、自然状態では見られない核酸断片である。
【０１１０】
本明細書での用法では、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）と、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）と、ヌクレオチド類似体を使用して作成されるＤＮＡまたはＲＮＡ類似体とを含むことが意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。このようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば改変された塩基対合能力または増大したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製し得る。
【０１１１】
別の本発明の実施態様は、例えば本発明に従った核酸分子のコード鎖など、本発明に従った核酸分子のアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。
【０１１２】
本発明に従ったポリヌクレオチドの補体鎖もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１３】
［核酸断片、プローブ、およびプライマー］
本発明に従った核酸分子は、例えばプローブまたはプライマーとして使用し得る断片、または本発明に従ったタンパク質の一部をコードする断片など、配列番号１に記載の核酸配列の一部または断片のみを含んでなってもよい。本発明に従ったヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のタンパク質と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有する、本発明に従ったタンパク質の機能的同等物の同定および／またはクローニングで使用するためにデザインされたプローブおよびプライマーを作成できるようにする。プローブ／プライマーは、典型的に好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本発明に従ったヌクレオチド配列の少なくとも約１２または１５、好ましくは約１８または２０、好ましくは約２２または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５個以上の連続的ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでなる、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１１４】
本発明に従ったヌクレオチド配列に基づく、より好ましくは配列番号１に基づくプローブを使用して、例えば生物中で、転写物、またはそれをコードするゲノム配列、または相同タンパク質を検出し得る。好ましい実施態様では、プローブはそれに付着する標識グループをさらに含んでなり、例えば標識グループは、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子であり得る。このようなプローブはまた、本発明に従ったタンパク質を発現する細胞を同定する診断試験キットの一部としても使用し得る。
【０１１５】
［同一性および相同性］
「相同性」または「％同一性」は、本明細書で同義的に使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の％相同性を判定するために、配列は最適比較目的で配置合わせされると定義される。２配列間の位置合わせを最適化するために、比較される２配列のいずれかにギャップを導入してもよい。このような位置合わせは、比較される配列全長にわたって実施し得る。代案としては、位置合わせは、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／塩基またはアミノ酸などのより短い長さにわたって実施されてもよい。同一性は、報告された配列比較領域にわたる、２つの配列間の完全一致の百分率である。
【０１１６】
配列比較および２配列間の％同一性判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。当業者は、２配列の配列比較および２配列間の相同性判定のために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用できるという事実を知っている（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｉｎ Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、２配列間の配列比較のためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して判定されてもよい（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列のどちらも、アルゴリズムによって配列比較され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥで実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６-２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列では、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列では、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメーターは、ｇａｐ−ｏｐｅｎペナルティ１０およびｇａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎペナルティ０．５である。当業者は、これらの全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２配列の全体的同一性百分率は、異なるアルゴリズムを使用した場合に顕著に変化しないことを理解するであろう。
【０１１７】
上述のようなプログラムＮＥＥＤＬＥによる配列比較後、クエリー配列と本発明の配列間の同一性百分率は、次のように計算される。配列比較中のギャップ総数を減じた後に、双方の配列中の同一アミノ酸または同一ヌクレオチドを示す配列比較中の対応する位置の数を配列比較の全長で除する。同一性は本明細書で、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから入手し得ると定義され、プログラムの出力中で「最長同一性」と標識される。
【０１１８】
本発明の核酸およびタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として使用して公共データベースに対する検索を実施し、例えばその他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２を用いて実施され、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３を用いて実施され、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得る。比較目的で、ギャップド配列比較を得るためにＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるようなギャップドＢＬＡＳＴを利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。
【０１１９】
［ハイブリダイゼーション］
本明細書での用法では、「ハイブリダイズする」という用語は、その下で互いに少なくとも約６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同的なヌクレオチド配列が、典型的に互いの補体にハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件について記載することが意図される。
【０１２０】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的例は、６x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのハイブリダイゼーション後、１xＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃、好ましくは５５℃、好ましくは６０℃、なおもより好ましくは６５℃で１回以上の洗浄である。
【０１２１】
高度にストリンジェントな条件としては、例えば６８℃で５xＳＳＣ／５xデンハルト液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイズ、および室温で０．２xＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄が挙げられる。代案としては、洗浄は４２℃で実施されてもよい。
【０１２２】
当業者は、ストリンジェントおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に、どの条件を当てはめるかを知るであろう。このような条件に関する追加的ガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）にあり、当該技術分野で容易に入手できる。
【０１２３】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）のみ、またはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチのみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含有するあらゆる核酸分子またはその補体（例えば事実上あらゆる二本鎖ｃＤＮＡクローン）とハイブリダイズするので、このようなポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズさせるのに使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【０１２４】
［別の生物から全長ＤＮＡを得る］
典型的なアプローチでは、別の生物からｃＤＮＡライブラリーが構築され、例えば特にフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種からの糸状菌をスクリーニングし得る。
【０１２５】
例えばノーザンブロット法分析によって、配列番号１に関して相同的なポリヌクレオチドについてフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株をスクリーニングし得る。本発明に従ったポリヌクレオチドと相同的な転写物が検出されたら、当業者に良く知られている標準技術を使用して、適切な株から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築し得る。代案としては、本発明に従ったポリヌクレオチドとハイブリダイズできるプローブを使用して、全ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。
【０１２６】
相同遺伝子配列は、例えば本明細書で教示されるヌクレオチド配列に基づいてデザインされた２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用して、ＰＣＲを実施することによって単離し得る。
【０１２７】
反応のためのテンプレートは、本発明に従ったポリヌクレオチドを発現することが知られている、または疑われる株から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであり得る。ＰＣＲ産物をサブクローンして配列決定し、増幅された配列が本発明に従った新しい核酸配列、またはその機能的同等物の配列に相当することを確証し得る。
【０１２８】
次にＰＣＲ断片を使用して、多様な既知の方法によって全長ｃＤＮＡクローンを単離し得る。例えば増幅された断片を標識して使用し、バクテリオファージまたはコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。代案としては、標識断片を使用してゲノムライブラリをスクリーニングし得る。
【０１２９】
ＰＣＲ技術はまた、別の生物からの全長ｃＤＮＡ配列を単離するのにも使用し得る。例えば標準操作手順に続いて、適切な細胞または組織原料からＲＮＡが単離され得る。第一鎖合成のプライミングのために、増幅された断片のほとんどの５’末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、逆転写反応をＲＮＡ上で実施し得る。
【０１３０】
次に標準末端トランスフェラーゼ反応を使用して、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに（例えばグアニンで）「ｔａｉｌ付加」し得て、ハイブリッドをＲＮａｓｅ Ｈで消化し得て、次に第二鎖合成を（例えばポリ−Ｃプライマーによって）プライムし得る。したがって増幅された断片の上流のｃＤＮＡ配列は、容易に単離し得る。有用なクローニング戦略のレビューについては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前出；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出を参照されたい。
【０１３１】
［ベクター］
本発明の別の態様は、脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードする本発明に従ったポリヌクレオチド配列を含んでなる、クローニングおよび発現ベクターをはじめとするベクター、または本発明に従ったその機能的同等物に関する。本発明はまた、例えば本発明のポリペプチドの発現が起きる条件下で、このようなベクターを適切な宿主細胞内で成長させ、それに形質転換または形質移入する方法に関する。本明細書での用法では、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばクローニングまたは発現ベクターなどの組み換え複製可能なベクター中に組込み得る。ベクターを使用して、適合性宿主細胞内で核酸を複製してもよい。したがって本発明のさらなる実施態様は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合性宿主細胞に導入して、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を成長させることで、本発明のポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。適切な宿主細胞については下で述べる。
【０１３３】
その中に発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、好都合には組み換えＤＮＡ処置の対象であってもよいあらゆるベクターであってもよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。
【０１３４】
本発明に従ったベクターは、自己複製ベクター、すなわち例えばプラスミドなど、その複製が染色体の複製から独立している染色体外の実体として存在するベクターであってもよい。代案としてはベクターは、宿主細胞に導入され、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【０１３５】
ベクターの１タイプは「プラスミド」であり、それはその中に追加的ＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウィルスベクターであり、その中ではウィルス性ゲノムに追加的ＤＮＡセグメントをライゲートし得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製できる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに特定のベクターは、それらが作動可能なように結合する遺伝子に対して発現を誘導できる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。一般に組み換えＤＮＡ技術中で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは通常ベクターの形態で使用されることから、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で同義的に使用され得る。しかし本発明は、同等機能を果たすコスミド、ウィルスベクター（例えば複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルス）、およびファージベクターなどの別の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【０１３６】
本発明に従ったベクターは、例えばＲＮＡ生成のために生体外で使用してもよく、または宿主細胞を形質転換するために使用してもよい。
【０１３７】
本発明のベクターは、例えば過剰発現のために、２つ以上の、例えば３、４または５つの本発明のポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０１３８】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞内における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでなり、それは組み換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を含み、それが発現される核酸配列と作動的に連結することを意味する。
【０１３９】
組み換え発現ベクター内で「作動的に連結する」とは、関心のあるヌクレオチド配列が（例えば生体外転写／翻訳系で、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞内で）、ヌクレオチド配列を発現できるような様式で制御配列に結合していることを意味することが意図され、すなわち「作動的に連結する」という用語は、記載される構成要素がそれらの意図される様式で機能できるような関係にある並置を指す。コード配列と「作動的に連結する」プロモーター、エンハンサーまたはその他の発現調節シグナルなどの制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような様式で配置され、または配列は、それらの意図される目的のために協力して機能するように配列され、例えば転写はプロモーターで開始して、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通じて進行する。
【０１４０】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような制御配列については、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。
【０１４１】
制御配列という用語は、各種宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導する配列と、特定の宿主細胞（例えば組織特異的制御配列）中でのみヌクレオチド配列の発現を誘導する配列を含む。
【０１４２】
したがって所定の宿主細胞のためのベクターまたは発現コンストラクトは、第１の発明のポリペプチドをコードする配列のコード鎖に対して、５’末端から３’末端への連続した順序で互いに作動的に連結する以下の要素を含んでなってもよい。（１）特定の宿主細胞中でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を誘導できるプロモーター配列；（２）任意に培地内に特定の宿主細胞からのポリペプチド分泌を誘導できるシグナル配列；（３）本発明に従った脂肪分解活性を有する成熟した好ましくは活性形態のポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ配列；および好ましくはまた（４）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列下流の転写を終結できる転写終結領域（ターミネーター）。
【０１４３】
本発明に従ったヌクレオチド配列の下流には、１つ以上の転写終結部位（すなわちターミネーター）を含有する３’非翻訳領域があってもよい。ターミネーターの起源はそれほど重要でない。ターミネーターは、例えばポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に天然であり得る。しかし好ましくは酵母宿主細胞中では酵母ターミネーターが、糸状菌宿主細胞中では糸状菌ターミネーターが使用される。より好ましくはターミネーターは、（その中でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される）宿主細胞に内在性である。転写された領域中では、翻訳のためのリボソーム結合部位が存在してもよい。コンストラクトによって発現される成熟転写物のコーディング部分は、先頭に翻訳開始ＡＵＧを含み、終止コドンが翻訳されるポリペプチドの終わりに適切に配置される。
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチドの増強された発現は、発現宿主からの関心のあるタンパク質の発現と、所望ならば分泌レベルを増大させ、および／または本発明のポリペプチド発現の誘導性制御を提供する役割を果たしてもよい異種性調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダーおよび／またはターミネーター領域などの選択によって達成されてもよい。
【０１４５】
発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどのような要素に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され得て、それによって本明細書に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば本発明に従った脂肪分解活性を有するポリペプチド、ポリペプチド突然変異型、断片、変異体またはその機能的同等物、融合タンパク質など）が生成される。
【０１４６】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核生物または真核細胞中における本発明に従ったポリペプチドの発現のためにデザインし得る。例えば本発明に従ったポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および桿菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用）、真菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞中で生成され得る。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）でさらに詳しく考察される。代案としては、組み換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、生体外で転写され翻訳され得る。
【０１４７】
ほとんどの糸状菌および酵母では、安定した形質転換体を得るために、好ましくはベクターまたは発現コンストラクトは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。しかし特定の酵母では、安定した高レベル発現のためにその中に発現コンストラクトを組込み得る適切なエピソームベクターもまた利用でき、その例としては、それぞれサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の２μおよびｐＫＤ１プラスミドに由来するベクター、またはＡＭＡ配列（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのＡＭＡ１）を含有するベクターが挙げられる。発現コンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合、コンストラクトは、ゲノム中の無作為な遺伝子座に組み込まれるか、または相同的組換えを使用して所定の標的遺伝子座に組み込まれるかのどちらかであり、その場合、標的遺伝子座は好ましくは高度に発現される遺伝子を含んでなる。
【０１４８】
したがって本発明で有用な発現ベクターとしては、例えば細菌プラスミドと、バクテリオファージと、酵母エピソームと、酵母染色体要素と、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、およびレトロウィルスなどのウィルスに由来するベクターなどの染色体由来、エピソーム由来、およびウィルス由来ベクター、そしてコスミドやファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどのそれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。
【０１４９】
ヌクレオチド挿入断片は、適切なプロモーターと作動可能に結合しなくてはならない。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に天然のプロモーターの他に、別のプロモーターを使用して本発明のポリペプチドの発現を誘導してもよい。プロモーターは、所望の発現宿主中で本発明のポリペプチドの発現を誘導するその効率について選択されてもよい。本発明で有用かもしれないプロモーターの例としては、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、およびレトロウィルスＬＴＲプロモーターが挙げられる。その他の適切なプロモーターについては、当業者に知られている。特定の実施態様では、真菌または酵母中で本発明に従ったポリペプチドの高度発現レベルを誘導できるプロモーターが好ましい。このようなプロモーターは当該技術分野で知られている。
【０１５０】
本発明の宿主細胞中で転写を誘導できる、多様なプロモーターを使用し得る。好ましくはプロモーター配列は、高度に発現される遺伝子に由来する。それからプロモーターが好ましくは由来し、および／または発現コンストラクトの組み込みのために好ましい所定の標的遺伝子座にそれが含まれる、好ましい高度に発現される遺伝子の例としては、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫまたはＰＫＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）などの解糖作用酵素をコードする遺伝子、ならびにアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルコール（メタノール）オキシダーゼ、延長因子、およびリボソームタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な高度に発現される遺伝子の特定例としては、例えばクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種からのＬＡＣ４遺伝子、それぞれハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）からのメタノールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸおよびＭＯＸ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）からのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、およびＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１５１】
真菌発現宿主中で使用するのに好ましい強力な構成的および／または誘導性プロモーターの例は、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子からのＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）プロモーターの真菌遺伝子から得られるものである。
【０１５２】
強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものである。
【０１５３】
強力な細菌プロモーターの例は、αアミラーゼおよびＳＰｏ２プロモーター、ならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターである。
【０１５４】
植物細胞に適したプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、リブロース小サブユニット（ｒｕｂｉｓｃｏ ｓｓｕ）、ヒストン、イネアクチン、ファゼオリン、カリフラワーモザイクウィルス（ＣＭＶ）３５Ｓおよび１９Ｓ、およびサーコウィルスプロモーターが挙げられる。
【０１５５】
上述のプロモーターは全て当該技術分野で容易に入手できる。
【０１５６】
ベクターは、ポリヌクレオチドの側面にあって、真核生物ゲノム配列またはウィルスゲノム配列に相同的な配列を含んでなるＲＮＡを生じる配列をさらに含んでもよい。これは宿主細胞ゲノムへの本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。
【０１５７】
ベクターは、アンチセンス方向に配向する本発明のポリヌクレオチドを含有して、アンチセンスＲＮＡ生成を提供してもよい。
【０１５８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を通じて原核生物または真核細胞中に導入され得る。本明細書での用法では、「形質転換」および「形質移入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質移入、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン性脂質媒介形質移入または電気穿孔をはじめとする、外来性核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当業者に認識された多様な技術を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換するまたは形質移入する適切な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ， １９８９），Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、およびその他の実験手引き書に記載される。
【０１５９】
哺乳類細胞の安定した形質移入のためには、使用される発現ベクターおよび形質移入技術次第で、細胞のほんの一部のみが、それらのゲノムに外来性ＤＮＡを組み込むかもしれないことが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するために、一般に、関心のある遺伝子と共に、選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子が宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、薬剤耐性をもたらすものまたは宿主細胞中の欠陥を補うものが挙げられるが、これに限定されるものではない。それらとしては、例えばほとんどの糸状菌および酵母の形質転換のために使用し得る、アセトアミダーゼ遺伝子またはｃＤＮＡ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）からのａｍｄＳ、ｎｉａＤ、ｆａｃＡ遺伝子またはｃＤＮＡ）、またはＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキサート、フレオマイシンまたはベノミル耐性（ｂｅｎＡ）などの抗生物質耐性を提供する遺伝子などの用途の広いマーカー遺伝子が挙げられる。代案としては、例えばＵＲＡ３（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのまたはその他の酵母からの類似遺伝子）、ｐｙｒＧまたはｐｙｒＡ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から）、ａｒｇＢ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から）またはｔｒｐＣなど、対応する変異体宿主株を必要とする栄養要求性マーカーなどの特異的選択マーカーを使用し得る。好ましい実施態様では、選択マーカー遺伝子を含まないポリペプチドを生成できる形質転換宿主細胞を得るように、発現コンストラクトの導入後に選択マーカーを形質転換宿主細胞から除去する。
【０１６０】
その他のマーカーとしては、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸塩含有カルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、細菌Ｇ４１８耐性遺伝子（これはまた酵母で使用してもよいが真菌では使用できない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ネオマイシン耐性遺伝子（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子が挙げられる。ベクターは例えばＲＮＡを生成するために生体外で使用してもよく、または宿主細胞を形質移入または形質転換するために使用してもよい。
【０１６１】
原核生物中のタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のどちらかを発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施されることが多い。融合ベクターは、例えば組み換えタンパク質のアミノ末端など、その中でコードされるタンパク質にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的に３つの目的の役割を果たす。１）組み換えタンパク質の発現を増大させる；２）組み換えタンパク質の溶解度を増大させる；３）親和性精製中でリガンドとして機能することで組み換えタンパク質の精製を助ける。融合発現ベクター中では、融合タンパク質の精製に引き続いて、組み換えタンパク質を融合部分から分離できるように、融合部分と組み換えタンパク質の接合部にタンパク質分解切断部位が導入されることが多い。
【０１６２】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは選択可能なマーカーを含有する。このようなマーカーとしては、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌の培養では、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、および特定のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などの細菌細胞；例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）やコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）やＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、そして例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）および／または例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピチア（Ｐｕｃｈｉａ）のような酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫などの動物細胞；および植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培地および条件については、当該技術分野で知られている。
【０１６３】
細菌中で使用するのに好ましいベクターは、例えば本明細書に参照として援用する国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレットで開示される。その他の適切なベクターについては、当業者には容易に分かる。
【０１６４】
本発明で使用するのに適した既知の細菌プロモーターとしては、本明細書に参照として援用する国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレットで開示されるプロモーターが挙げられる。
【０１６５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中へのエンハンサー配列の挿入によって増大されてもよい。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用エレメントであり、それは特定の宿主細胞タイプでプロモーターの転写活性を増大させるように機能する。エンハンサーの例としては、複製起点後期側のｂｐ１００〜２７０に位置するＳＶ４０エンハンサーと、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサーと、複製起点後期側にあるポリオーマエンハンサーと、アデノウィルスエンハンサーとが挙げられる。
【０１６６】
小胞体内腔、細胞膜周辺腔、または細胞外環境への翻訳タンパク質分泌のために、発現される遺伝子に適切な分泌シグナルを組み込んでもよい。シグナルはポリペプチドに内在性であってもよく、またはそれらは異種性シグナルであってもよい。
【０１６７】
本発明に従ったポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾形態で生成されてもよく、分泌シグナルだけでなく追加的な異種性機能的領域もまた含んでもよい。したがって例えば、追加的なアミノ酸、特に荷電アミノ酸領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中または引き続く取り扱いと保存中に、宿主細胞中における安定性および持続性を改善してもよい。またポリペプチドにペプチド部分を付加して、精製を容易にしてもよい。
【０１６８】
［発明に従ったポリペプチド］
本発明は、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するまたはその機能的同等物；
（ｂ）本発明に従ったポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドを提供する。
【０１６９】
したがって本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドを含んでなり、好ましくは配列番号２のアミノ酸３４〜３０４を含んでなる脂肪分解活性を有する単離ポリペプチド、および適切な宿主中で配列番号１のポリヌクレオチドを発現することで得られるアミノ酸配列を提供する。また機能的同等物であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的である、ペプチドまたはポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１７０】
別の実施態様では本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと機能的同等物である脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドにも関し、それは前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的である。
【０１７１】
上記ポリペプチドは、「本発明に従ったポリペプチド」という用語に集合的に含まれる。
【０１７２】
「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、（一般に認識されるように）同義と見なされ、各用語はペプチジル結合でカップリングされた少なくとも２つのアミノ酸鎖を示すために文脈に応じて同義的に使用し得る。「ポリペプチド」（またはタンパク質）という用語は、本明細書で７個を超えるアミノ酸残基を含有する鎖について使用される。全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの化学式または配列は、本明細書ではアミノ末端からカルボキシ末端に向けて左から右に記述される。本明細書で使用されるアミノ酸の一文字コードは、一般に当該技術分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）にある。
【０１７３】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質であることが意図される。例えば宿主細胞中で生成された組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的のために単離されたと見なされ、例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）で開示されるシングルステップ純化法などのあらゆる適切な技術によって実質的に精製された、天然または組み換えポリペプチドについても同様である。
【０１７４】
当業者には知られているように、成熟中のプロセッシングエラーのために、配列番号２のＮ末端、または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドのＮ末端は不均一かもしれず、ならびに配列番号２のＣ末端または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドのＣ末端についても同様である。特にこのようなプロセッシングエラーは、ポリペプチドの過剰発現に際して起きるかもしれない。さらにエキソプロテアーゼ活性は、不均一性を引き起こすかもしれない。不均一性が起きる程度は、使用される宿主および発酵プロトコルにもまた左右される。このようなＣ末端プロセッシングアーチファクトは、配列番号２で、または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドで示されるように、より短いポリペプチドまたはより長いポリペプチドをもたらすかもしれない。このようなエラーの結果として、Ｎ末端もまた不均一かもしれない。
【０１７５】
さらなる実施態様では、本発明は、配列番号２に記載のポリペプチドの少なくとも１つの機能ドメインをコードする、または追加的残基を含有して、位置１、または２、または３などで開始する、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドの少なくとも１つの機能ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。代案としては、それは特定の残基を欠如しており、結果として位置２、または３、または４などで開始するかもしれない。また追加的残基が、例えば位置３４７、３４８などのＣ末端に存在してもよい。代案としては、Ｃ末端には特定の残基が欠如しており、結果として位置３４５または３４４で終わるかもしれない。
【０１７６】
本発明に従った脂肪分解酵素は、当該技術分野で知られている方法によって組み換え細胞培養物から回収して精製し得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ ｂｙ Ｐａｕｌ Ｃｕｔｌｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４）。
【０１７７】
本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学合成手順の産物、および例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞をはじめとする原核生物または真核生物の宿主から組み換え技術によって生成された産物を含む。組み換え生産手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されなくてもよい。さらに本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、修飾された開始メチオニン残基もまた含む。
【０１７８】
［ポリペプチド断片］
本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドの生物学的活性断片を特徴とする。
【０１７９】
本発明のポリペプチドの生物学的活性断片は、本発明に従ったタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であり、またはそれに由来する、アミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（例えば配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチド）を含み、それは全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示し、好ましくはそれは脂肪分解活性を示す。典型的に、生物学的活性断片は、本発明に従ったタンパク質の少なくとも１つの活性があるドメインまたはモチーフを含んでなる。本発明のタンパク質の生物学的活性断片は、例えば長さが配列番号２に記載の成熟ポリペプチドよりも５、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸以上短く、配列番号２に記載の成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するポリペプチドであり得る。さらに組み換え技術によって、その中でタンパク質の別の領域が消去された別の生物学的活性部分を調製し、天然形態の本発明のポリペプチドの生物学的活性の１つ以上について評価し得る。
【０１８０】
本発明はまた、本発明に従ったタンパク質の上記生物学的活性断片をコードする、核酸断片を特徴とする。
【０１８１】
［融合タンパク質］
本発明に従ったポリペプチド、または例えばその生物学的活性部分などのその機能的同等物は、本発明に従わないポリペプチド（例えば異種性アミノ酸配列）と作動的に連結して、融合タンパク質を形成し得る。「本発明に従わないポリペプチド」とは、本発明に従ったタンパク質と実質的に相同的でないタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。このような「本発明に従わないポリペプチド」は、同一または異なる生物に由来し得る。融合タンパク質内で、本発明に従ったポリペプチドは、本発明に従った脂肪分解酵素の全部または生物学的活性断片に相当し得る。好ましい実施態様では、融合タンパク質は、本発明に従ったタンパク質の少なくとも２つの生物学的活性部分を含んでなる。融合タンパク質内で「作動的に連結する」という用語は、本発明に従ったポリペプチドと本発明に従わないポリペプチドとが、互いにフレーム内融合していることを示すことが意図される。本発明に従わないポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１８２】
例えば一実施態様では、融合タンパク質は、その中でアミノ酸配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合している融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、本発明に従った組み換えタンパク質の精製を促進し得る。別の実施態様では、本発明に従った融合タンパク質は、そのＮ末端に異種性シグナル配列を含有するタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば哺乳類および酵母宿主細胞）中では、本発明に従ったタンパク質の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用を通じて増大させ得る。
【０１８３】
別の例では、異種性シグナル配列として、バキュロウィルス外被タンパク質のｇｐ６７分泌配列を使用し得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２）。真核生物の異種性シグナル配列の別の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌配列が挙げられる（カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ；）。さらに別の例では、有用な真核異種性シグナル配列としては、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびタンパク質Ａ分泌シグナル（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１８４】
シグナル配列を使用して、本発明のタンパク質またはポリペプチドの分泌および単離を促進し得る。シグナル配列は、典型的に疎水性アミノ酸コアによって特徴付けられ、それは一般に分泌中に１つ以上の切断事象において成熟タンパク質から切断される。このようなシグナルペプチドは、それらが分泌経路を通過する間に、成熟タンパク質からシグナル配列を切断できるようにするプロセッシング部位を含有する。シグナル配列は、その中に発現ベクターが形質転換された真核生物の宿主などからのタンパク質の分泌を誘導し、シグナル配列は引き続いてまたは同時に切断される。次にタンパク質は、既知の方法によって細胞外培地から容易に精製され得る。代案としては、ＧＳＴドメインなどの配列を使用してシグナル配列を関心のあるタンパク質に結合させ得て、それは精製を容易にする。したがって例えばペプチドをコードする配列などのマーカー配列に、ポリペプチドをコードする配列を融合させてもよく、それは融合ポリペプチドの精製を容易にする。本発明のこの態様の特定の好ましい実施態様では、マーカー配列は特にｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で提供されるｔａｇなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販される。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えばヘキサヒスチジンが融合タンパク質の都合よい精製を提供する。ＨＡ ｔａｇは精製のために有用な別のペプチドであり、それはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当し、それについては例えばＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載される。
【０１８５】
好ましくは、本発明に従った融合タンパク質は、標準組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えばライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いて、従来の技術に従って、例えば異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を共にインフレームでライゲーションする。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動化されたＤＮＡ合成機をはじめとする従来の技術によって合成し得る。代案としては、２つの連続的遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施し得て、それを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を作成し得る（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。さらに融合部分をあらかじめコードする多数の発現ベクターが市販される（例えばＧＳＴポリペプチド）。本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明に従ったタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローンし得る。
【０１８６】
［機能的同等物］
「機能的同等物」および「機能的変異体」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【０１８７】
本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有して、本発明に従った脂肪分解酵素の少なくとも特定の機能を示すポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、好ましくは脂肪分解活性を有するポリペプチドである。好ましくは本発明に従った脂肪分解酵素または脂肪分解活性を有するポリペプチドは、製パン用途において、例えば生地条件下で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を有する。本発明に従ったポリペプチドの機能的同等物は、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドであり、それは本発明に従った脂肪分解酵素の少なくとも１つの機能を示し、好ましくはそれは脂肪分解活性を示し、より好ましくはそれは製パン用途において、例えば生地条件下で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を示す。言及される機能的同等物はまた、上述のような脂肪分解活性を有する生物学的活性断片もまた包含する。
【０１８８】
本発明に従ったポリペプチドの機能的同等物は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換、または酵素の特定の機能性に影響を及ぼさないアミノ酸の置換、挿入または欠失を含有してもよい。したがって機能的中立アミノ酸置換は、その特定の機能性を実質的に改変しない、配列番号２に記載のアミノ酸配列の成熟ポリペプチド中の置換である。例えば本発明のタンパク質中で保存されるアミノ酸残基は、特に改変を容易に受け入れないことが予測される。さらに本発明に従ったタンパク質およびその他の脂肪分解酵素の中で保存されるアミノ酸は、改変を容易に受け入れない可能性が高い。
【０１８９】
本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、典型的にサイレント突然変異、またはコードされるポリペプチドの生物学的機能を改変しない突然変異を含有してもよい。したがって本発明は、特定の生物学的活性に必須でないアミノ酸残基の変更を含有する、本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。このようなタンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるが、なおもその少なくとも１つの生物学的活性を保ち、好ましくはそれらは脂肪分解活性を保つ。一実施態様では、本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、本発明に従ったポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドと実質的に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％相同的で、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的なアミノ酸配列を含んでなる。一実施態様では、それと少なくとも９０％の相同性を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドの機能的同等物は、配列番号４に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドであり（以下、Ｌ０２で示す）、別の実施態様では、それは配列番号６に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドであり（以下、Ｌ０３で示す）、さらに別の実施態様では、それは配列番号８に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドである（以下、Ｌ０４で示す）。好ましい実施態様では、配列番号４に記載のアミノ酸、配列番号６または配列番号８にそれぞれ由来する成熟ポリペプチドは、配列番号４、配列番号６または配列番号８にそれぞれ記載のアミノ酸中のアミノ酸配列３４〜３０４である。
【０１９０】
本発明に従ったポリペプチドをコードする本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１９１】
一実施態様では、それと少なくとも９０％の相同性を有する、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり（ＤＮＡ Ｌ０２で示す）、別の実施態様ではそれは配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり（ＤＮＡ Ｌ０３で示す）、さらに別の実施態様ではそれは配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである（ＤＮＡ Ｌ０４で示す）。配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列は配列番号４に記載のポリペプチドをコードし、配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列は、配列番号６に記載のポリペプチドをコードし、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のポリペプチドをコードする。好ましい実施態様では、配列番号３、５、７に記載のポリヌクレオチド１００〜９１２は、それぞれ配列番号４、６、８に記載の成熟ポリペプチドをコードする。
【０１９２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに相同的なタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、コードされるタンパク質中に１つ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入が導入されるように、配列番号１に記載のコードヌクレオチド配列中に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することで作り出し得る。このような突然変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準技術によって導入されてもよい。
【０１９３】
脂肪分解活性を有するその他のファミリーメンバーをコードし、したがって配列番号１、３、５、７とは異なるヌクレオチド配列を有し、上述の条件を満たす核酸は、本発明の範囲内である。さらに脂肪分解活性を有するタンパク質をコードして、配列番号２、４、６、８のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有し、上述の条件を満たす核酸は、本発明の範囲内である。
【０１９４】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、好ましくは国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載される方法に従ってそれらのコドン使用が最適化されてもよい。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドンペア最適化に対処する。コドンペア最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、コドン使用頻度、特に使用されるそれらのコドンペアに関して修正され、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改善された発現、および／またはコードされるポリペプチドの改善された生成が得られる方法である。コドンペアは、コード配列中の２つの続く三つ組（コドン）と定義される。
【０１９５】
本発明に従ったポリヌクレオチドの変異体（例えば天然の対立遺伝子変異体）および相同体に相当する核酸分子は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼーション技術に従って、本明細書で開示されるｃＤＮＡまたはその適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書で開示される核酸とのそれらの相同性に基づいて単離され得る。
【０１９６】
本発明の別の態様では、改善されたタンパク質が提供される。改善されたタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性と比較すれば、少なくとも１つの生物学的活性が改善されたタンパク質である。このようなタンパク質は、飽和変異誘発などによって、配列番号１のコード配列の全部または一部に沿って突然変異を無作為に導入することで得られてもよく、得られた突然変異体を組み換え的に発現させて生物学的活性についてスクリーニングし得る。例えば脂肪分解酵素の酵素活性を測定するための標準アッセイ、ひいては改善されたタンパク質を提供する技術は、容易に選択される。
【０１９７】
好ましい実施態様では、本発明に従ったポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸３４〜３０４に従ったアミノ酸配列を有する。別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも９０％相同的であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保ち、好ましくはそれは脂肪分解活性を保ち、より好ましくは製パン用途において、例えば生地状態でトリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を保ちながら、上述のような自然変動または変異誘発のためになおもアミノ酸配列が異なる。
【０１９８】
さらなる好ましい実施態様では、本発明に従ったタンパク質は、配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸断片によってコードされるアミノ酸配列を有し、前記ヌクレオチド配列は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である。
【０１９９】
したがって本発明に従ったタンパク質は、好ましくは配列番号２に記載の２アミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドの少なくとも１つの機能活性を保つアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、好ましくはそれは脂肪分解活性を保ち、より好ましくは、製パン用途において例えば生地状態で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を保つ。
【０２００】
本発明に従ったタンパク質の機能的同等物はまた、例えば脂肪分解酵素活性について、本発明のタンパク質の変異体、例えばトランケーション変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることで同定し得る。一実施態様では、変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作成される。変異体の多様化ライブラリーは、例えば可能なタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、または代案としては（例えばファージディスプレイのために）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲートして遺伝子配列にすることで生成し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から、本発明のポリペプチドの可能な変異体ライブラリーを生成するために使用し得る多様な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法については、当該技術分野で知られている（例えばＮａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。
【０２０１】
さらに引き続く変異体選択をスクリーニングするために、本発明のポリペプチドコード配列断片のライブラリーを使用して、ポリペプチド多様化集団を作成し得る。例えば分子あたりほぼ１回だけニッキングが起きる条件下において、関心のあるコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼ処理して二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニック生成物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖のＤＮＡを形成させて、Ｓ１ヌクレアーゼ処理によって再編成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーをライゲートして発現ベクターにすることで、コード配列断片のライブラリーを作成し得る。この方法によって、様々なサイズの関心のあるタンパク質のＮ末端および内部断片をコードする、発現ライブラリーを誘導し得る。
【０２０２】
トランケーションの点突然変異によって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、そして選択される特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該技術分野で知られている。より大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析にふさわしい最も広く使用されている技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングするステップと、適切な細胞を得られたベクターライブラリーで形質転換するステップと、所望の活性の検出が、その生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現するステップを含む。ライブラリー中機能性変異体の頻度を向上させる技術である再帰アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、本発明のタンパク質の変異体を同定し得る（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【０２０３】
本発明に従ったポリヌクレオチドの断片はまた、機能性ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のためのプローブまたはプライマーとして機能してもよい。
【０２０４】
本発明に従った核酸は、それらが機能性または非機能性ポリペプチドをコードするかどうかに関わりなく、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用し得る。本発明に従った脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としては、（１）タンパク質をコードする遺伝子、またはその対立遺伝子変異体をｃＤＮＡライブラリーから単離する；（２）Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体スプレッドのための原位置ハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）；（３）特定組織および／または細胞中でｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット法分析、および４）特定の生物学的（例えば組織）サンプル中で、プローブとハイブリッドできる核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用し得るプローブおよびプライマーが挙げられる。
【０２０５】
本発明に従った遺伝子の機能的同等物を得る方法もまた、本発明に包含される。このような方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドに従ったタンパク質配列、またはそれらのいずれかの変異体の全部または一部をコードする単離された核酸を含む標識されたプローブを得るステップと；プローブがライブラリー中の核酸断片にハイブリダイゼーションできるようにする条件下で、核酸断片ライブラリーを標識プローブでスクリーニングすることにより、核酸二本鎖を形成して、あらゆる標識二本鎖中の核酸断片から全長遺伝子配列を調製して、本発明に従った遺伝子に関連した遺伝子を得るステップを要する。
【０２０６】
［宿主細胞］
別の実施態様では、本発明は、例えば本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなる、または本発明に従ったベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞または組み換え宿主細胞などの細胞を特徴とする。
【０２０７】
「形質転換細胞」または「組み換え細胞」は、組み換えＤＮＡ技術の手段によって、その中に（またはその祖先中に）本発明に従った核酸が導入された細胞である。例えば細菌、真菌、酵母などの原核細胞と真核細胞の双方が含まれる。宿主細胞としてはまた、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および脈絡叢細胞系などの哺乳類細胞系が挙げられるが、これに限定されるものではない。哺乳類細胞の安定した形質移入に適したいくつかのベクターは、一般に入手でき、のような細胞系を構築する方法もまた、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）などのように一般に知られている。特に好ましいのは、糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からの細胞である。
【０２０８】
挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を特有の所望の様式で修飾して加工する宿主細胞を選択し得る。このようなタンパク質生成物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の最適機能化を促進してもよい。
【０２０９】
様々な宿主細胞が、タンパク質と遺伝子産物の翻訳後プロセシングと修飾のための特徴的で特異的な機序を有する。分子生物学および／または微生物学の当業者に良く知られている適切な細胞系または宿主系を選択して、外来性タンパク質生成物の所望の正確な修飾とプロセシングを確実にし得る。この目的を達成するために、遺伝子産物の一次転写産物、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセッシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用し得る。このような宿主細胞については、当該技術分野で良く知られている。
【０２１０】
所望ならば、本発明に従ったポリペプチドの調製において上述のような細胞を使用してもよい。このような方法は、典型的に、ポリペプチドをコードするコード配列の（ベクターによる）発現を提供する条件下で、（例えば上述のような発現ベクターで形質転換または形質移入された）組み換え宿主細胞を培養するステップと、任意に生成ポリペプチドを細胞または培地から回収し、より好ましくは回収して精製するステップを含んでなる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターなどの組み換え複製可能なベクターに組み込み得る。ベクターを使用して、適合性宿主細胞中で核酸を複製してもよい。したがってさらなる実施態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入して、ベクターを適合性宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を成長させることにより、本発明のポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。
【０２１１】
好ましくはポリペプチド分泌タンパク質はとして生成され、その場合、発現コンストラクト中の成熟形態のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列と作動的に連結する。好ましくはシグナル配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に天然（同種）である。代案としてはシグナル配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に外来性（異種性）であり、その場合、シグナル配列は、好ましくはその中で本発明に従ったヌクレオチド配列が発現される宿主細胞に内在性である。酵母宿主細胞のための適切なシグナル配列の例は、酵母ａ因子遺伝子に由来するシグナル配列である。同様に糸状菌宿主細胞のための適切なシグナル配列は、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡ遺伝子などの糸状菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子に由来するシグナル配列である。これはアミログルコシダーゼ（（グルコ）アミラーゼとも称される）プロモーターそれ自体と組み合わせて、ならびにその他のプロモーターと組み合わせて使用されてもよい。ハイブリッドシグナル配列もまた、本発明の文脈で使用されてもよい。
【０２１２】
好ましい異種性分泌リーダー配列は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのｇｌａＡ−１８および２４アミノ酸双方のバージョン）、α因子遺伝子（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母）、またはαアミラーゼ遺伝子（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））起源のものである。
【０２１３】
上述のような適切な宿主細胞中にベクターを形質転換または形質移入して、本発明のポリペプチド発現を提供してもよい。この方法は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供する条件下において、上述のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップを含んでなってもよい。
【０２１４】
したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換または形質移入された、またはそれを含んでなる宿主細胞を提供する。好ましくはポリヌクレオチドの複製および発現のために、ポリヌクレオチドをベクターに入れる。細胞は前記ベクターに適合するように選択され、例えば原核細胞（例えば細菌）、真菌細胞、酵母細胞または植物細胞であってもよい。
【０２１５】
その中で本発明のポリペプチドが、例えばデンプン分解、セルロース分解またはヘミセルロース分解酵素を含まないなど、用途を妨げるかもしれない酵素活性を実質的に含まない形態で生成される、異種宿主もまた選択してもよい。これは常態ではこのような酵素を産生しない宿主を選択することで、達成されてもよい。
【０２１６】
本発明は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の組み換え発現の手段によって、本発明のポリペプチドを生成する方法を包含する。この目的で、本発明のＤＮＡ配列は、適切な相同的または異種宿主細胞内でのポリペプチドの経済的生産を可能にするために、遺伝子増幅および／またはプロモーターや分泌シグナル配列などの発現シグナル交換のために使用し得る。相同的な宿主細胞は、同一種の宿主細胞であり、またはそれはＤＮＡ配列がそれから誘導された種と同一種内の変異株である。
【０２１７】
適切な宿主細胞は、好ましくは細菌などの原核微生物であり、またはより好ましくは例えば酵母または糸状菌などの真菌、または植物細胞などの真核生物である。操作が容易であることから、一般に真菌細胞よりも酵母細胞が好ましい。しかしタンパク質によっては、酵母からの分泌が不良であったり、または場合によっては適切にプロセッシングされない（例えば酵母中での過グリコシル化）。これらの場合、真菌宿主生物を選択すべきである。
【０２１８】
宿主細胞はポリペプチドを過剰発現してもよく、過剰発現を導く技術は良く知られている。したがって宿主は、コードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを有してもよい（したがってベクターは２つ以上のコピーを有してもよい）。
【０２１９】
したがって本発明の一実施態様では、本発明に従った組み換え宿主細胞は、本発明に従ったポリヌクレオチドまたはベクターを発現または過剰発現できる。
【０２２０】
本発明に従って、本発明のポリペプチドの生成は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換された、本発明に従った宿主細胞を従来の栄養発酵培地内で培養することによって達成され得る。
【０２２１】
本発明に従った組み換え宿主細胞は、当該技術分野で知られている手順を使用して培養されてもよい。プロモーターおよび宿主細胞の各組み合わせで、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現に寄与する培養条件が利用できる。所望の細胞密度またはポリペプチド力価に達した後、培養を停止し、既知の手順を使用してポリペプチドを回収する。
【０２２２】
発酵培地は、炭素源（例えばグルコース、マルトース、糖蜜など）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）、有機窒素源（例えば酵母抽出物、麦芽エキス、ペプトンなど）、および無機栄養源（例えばリン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など）を含有する既知の培地を含んでなり得る。
【０２２３】
適切な培地の選択は、発現宿主の選択に基づいてもよく、および／または発現コンストラクトの調節要件に基づいてもよい。このような培地は当業者に知られている。培地は、所望ならば、その他の潜在的汚染微生物よりも形質転換発現宿主の利益になる、さらなる構成要素を含有してもよい。
【０２２４】
発酵は、０．５〜３０日の期間にわたって実施し得る。それは適切には例えば約０〜４５℃の範囲の温度、および／または例えば約２〜約１０のｐＨにおける、バッチ、連続または流加プロセスであってもよい。好ましい発酵条件は、約２０〜約３７℃の範囲の温度、および／または約３〜約９のｐＨである。適切な条件は、通常、発現宿主の選択と、生成されるタンパク質に基づいて選択される。
【０２２５】
発酵後、必要ならば遠心分離または濾過の手段によって、発酵ブロスから細胞を除去し得る。発酵停止または細胞除去後、次に本発明のポリペプチドを回収し、所望ならば従来の手段によって精製および単離してもよい。
【０２２６】
本発明を制限するものではない実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【０２２７】
［実施例］
［材料および方法］
［アッセイ］
［脂肪分解活性（ＤＬＵ）］
［単位定義］
１ＤＬＵは、試験条件（ｐＨ８．５、３７℃）下で１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義される。
【０２２８】
［アッセイ］
脂肪分解活性は、色素産生基質パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を用いたアッセイ中で測定した。基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ） Ｎ２７５２）を２−プロパノール（３ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。激しく撹拌しながらこの溶液の３．５ｍＬを滴下して、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する４６．５ｍＬの１００ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ８．５に添加した。ｔ＝０の時点で、５０μＬのサンプルを１ｍＬの基質液体と混合した。３７℃でのインキュベーション中に、サンプル空試験と比較して、吸光度変化を４０５ｎｍで測定した。曲線の直線部分の傾斜（ΔＯＤ／時間）を活性尺度として使用する。活性は、ＤＬＵ（ＤＳＭリパーゼ単位）で表される。
【０２２９】
［リパーゼ活性（ＰＬＩ）］
［単位定義］
１ＰＬＩリパーゼ単位は、中和オリブ油エマルジョンから、３７℃およびｐＨ７．５で１分間あたり１μモルの遊離脂肪酸を遊離させる酵素量である。
【０２３０】
［アッセイ］
酵素インキュベーション中に発生する遊離脂肪酸を水酸化ナトリウムによって７．５の一定ｐＨに滴定する。使用される水酸化ナトリウムの量は、発生する遊離脂肪酸量に、ひいてはリパーゼ活性に正比例する。信頼できるデータを得るために、低酸度オリブ油（シグマカタログ録番号０１５１４）を使用すべきであり、オリブ油エマルジョンは特定の滴径要件を満たすべきである。Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘを用いた、５０ｍＬのオリブ油と、５０ｍＬのポリビニルアルコール溶液（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ／ＰｒｏｌａｂｏからのＲｈｏｄｏｖｉｏｌ ２５／１４０；カタログ番号２０９５４ ２９５）および２５ｍＬの水との混合によって、エマルジョンが得られる。１０μｍの直径を超える油滴が存在してはならず、小滴の１０〜２０％は４〜９μｍの直径を有するべきであり、小滴の８０％は４μｍ未満の直径を有すべきである。最終インキュベーション混合物は、７．５ｍＬのオリブ油エマルジョン、５．０ｍＬのＣａＣｌ２溶液（（３．６７５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ／２５０ｍＬ）、１．０ｍＬのアルブミン溶液（２００ｇ／ｌ）、および１１．５ｍＬの水を含有する。測定は、好都合にはｐＨ−ｓｔａｔユニット（、デンマーク国コペンハーゲン（Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）のＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ）中で実施される。
【０２３１】
［セルラーゼ活性（ＣＸＵ）］
［単位定義］
１ＣＸＵは、試験条件下で１時間あたり、０．５ｍｇのグルコースに相当する還元糖量を与えるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）量を加水分解する酵素量である。
【０２３２】
［アッセイ］
形成された還元糖の量は、ジニトロサリチル酸を用いて定量的に判定される。ＣＭＣ基質は、１８ｇのＣＭＣ（ＮｏｖａｃｅｌからのＢｌａｎｏｓｅ Ｒ．１１０、フランス国パリ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ））を９００ｍＬの水と１００ｍＬの酢酸緩衝液ｐＨ４．６とに１時間懸濁し、引き続いて粒子状物質を濾過して除くことによって調製される。ジニトロサリチル酸溶液は、次のようにして調製する。（Ａ）１３．５ｇのＮａＯＨペレットを３００ｍＬの水に溶解する。（Ｂ）８．８ｇジニトロサリチル酸を６０℃で４００ｍＬの水に溶解し、４００ｍＬの水に溶解した２２５ｇの酒石酸ナトリウムカリウムを添加して混合する。（Ｃ）次に３００ｍＬのＮａＯＨ溶液をジニトロサリチル酸／酒石酸ナトリウムカリウム溶液に混合する。（Ｄ）２．２ｇのＮａＯＨペレットと、１００ｍＬの水中の１０ｇの１００％フェノールとを合わせて溶液を調製し、さらに１００ｍＬの水に３７．５ｇのＮａＨＳＯ３を合わせて亜硫酸塩溶液を調製する。ジニトロサリチル酸使用液を調製するために、６９ｍＬの溶液（Ｄ）と溶液（Ｃ）とを混合し、２３．２ｍＬのＮａＨＳＯ３溶液を添加する。混合物は調製した５日後に使える状態になる。
【０２３３】
酵素インキュベーションは、１ｍＬのＣＭＣ溶液を１ｍＬのサンプル溶液に添加して３７℃で６０分間インキュベートすることで実施される。１ｍＬの１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを１ｍＬのインキュベーション混合物に添加して、反応を終結する。次に３ｍＬのジニトロサリチル酸使用液を添加して混合し、沸騰水中で５分間加熱し、冷却後、混合物に１９ｍＬの水を添加する。最後に分光光度計内で５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【０２３４】
［アミログルコシダーゼ活性（ＡＧＩ）］
［単位定義］
１アミログルコシダーゼ単位（ＡＧＩ）は、試験条件下で、１分間あたり１μｍｏｌのグルコースを遊離させる酵素量である。
【０２３５】
［アッセイ］
アミログルコシダーゼ活性を測定するために、以下の試薬を調製した。
【０２３６】
デンプン基質：１．６ｇのデンプン（メルク（Ｍｅｒｃｋ）；カタログ番号１２５２）を１０ｍＬの冷水に懸濁した。引き続いてこれを５０ｍＬの沸騰水に注いだ。２分間の沸騰と室温への冷却後、２ｍＬの酢酸緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．３）を添加した。ｐＨをチェックし、必要ならば４ｍｏｌ／Ｌの酢酸または４ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨによってｐＨ４．３に調節した。
【０２３７】
ｏ−アニシジン溶液：６６０ｍｇのｏ−ジアニシジン二塩酸塩（シグマＢ３２５２）を１００ｍＬの水に溶解した。
【０２３８】
グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ試薬：５０００単位のグルコースオキシダーゼ（シグマＧ６１２５）および１２００単位のペルオキシダーゼ（シグマＰ８１２５）を９００ｍＬの水に溶解した。連続的に１３．８ｇのリン酸水素二ナトリウム二水和物、６．４２ｇのリン酸水素二ナトリウム一水和物、および６．１０ｇトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを添加して溶解した。１００ｇ／Ｌのリン酸を添加して、溶液のｐＨを７．０に調節した。体積を水で１０００ｍＬにした後、溶液を再度混合した。
【０２３９】
［呈色試薬］
９９部のグルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ試薬を１部のｏ−アニシジン溶液と混合した。
【０２４０】
アッセイ：２ｍＬのデンプン基質と混合した２ｍＬのサンプルを６０℃で１５分間インキュベートした。２０ｍＬの０．００５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加して反応を停止した。
【０２４１】
１ｍＬのインキュベートを４ｍＬの呈色試薬と混合して、グルコース含量を測定した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、５ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加して反応を停止させた。吸光度を５４０ｎｍで測定した。２５〜１５０μｇ／ｍＬの範囲の標準を用いたグルコース検量線を使用して、グルコース含量を計算した。標準は、呈色試薬により直接着色された。
【０２４２】
［実施例１］
［発明のリパーゼの生成］
本明細書に提供される配列番号１（ＤＮＡ Ｌ０１）、配列番号３（ＤＮＡＬ０２）、配列番号５（ＤＮＡＬ０３）、配列番号７（ＤＮＡＬ０４）のヌクレオチド配列によってコードされる脂肪分解酵素Ｌ０１、Ｌ０２、Ｌ０３、Ｌ０４は、ＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを構築し、このようなプラスミドでアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株を形質転換して、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を以下のようにして成長させることで得られた。
【０２４３】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の新鮮な胞子（１０６〜１０７）を２０ｍＬのＣＳＬ培地（１００ｍＬフラスコ、整流装置）に接種して、３４℃および１７０ｒｐｍで２０〜２４時間培養した。５〜１０ｍＬのＣＳＬ前培養を１００ｍＬのＣＳＭ培地（５００ｍＬフラスコ、整流装置）に接種した後、株を３４℃および１７０ｒｐｍで３〜５日間発酵させた。
【０２４４】
４℃および５０００×ｇで３０分間の発酵ブロスの遠心分離によって、無細胞上清が得られた。無細胞上清を使用時まで−２０℃で保存した。任意に上清をＧＦ／Ａワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）ガラスマイクロファイバーフィルター（１５０ｍｍ径）上でさらに濾過し、より大きな粒子を除去し得る。必要ならば４ＮのＫＯＨによって上清のｐＨをｐＨ５に調節し、０．２μｍ（ボトルトップ）フィルター上で吸引して無菌濾過し、真菌材料を除去する。
【０２４５】
ＣＳＬ培地は次からなった（１Ｌあたりの量）：１００ｇのコーンスティープ固形物（ロケット（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ））、１ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２０、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、１０ｇのグルコース・Ｈ２Ｏ、および０．２５ｇのＢａｓｉｌｄｏｎ（消泡剤）。成分を純水に溶解して、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ５．８に調節した；整流装置および気泡ボール付きの１００ｍＬフラスコに２０ｍＬ発酵ブロスを充填して１２０℃で２０分間滅菌し、その後、室温への冷却後、５０００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する２００μｌの無菌溶液を各フラスコに添加した。
【０２４６】
ＣＳＭ培地は次からなった（１Ｌあたりの量）：１５０ｇのマルトース・Ｈ２０、６０ｇのＳｏｙｔｏｎｅ（ペプトン）、１ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２０、１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８ｇのＴｗｅｅｎ８０、０．０２ｇのＢａｓｉｌｄｏｎ（消泡剤）、２０ｇのＭＥＳ、１ｇのＬ−アルギニン。成分を純水に溶解して、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ６．２に調節した；整流装置および気泡ボール付きの５００ｍＬフラスコに１００ｍＬ発酵ブロスを充填して１２０℃で２０分間滅菌し、その後、室温への冷却後、５０００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する１ｍＬの無菌溶液を各フラスコに添加した。
【０２４７】
［実施例２］
［発明の脂肪分解酵素の精製］
実施例１で得られた凍結無細胞上清の解凍後に、上清を４℃で徹底的に遠心分離して、あらゆる固形物を除去した。低分子量の汚染物を除去するために、１０ｋＤａカットオフの濾紙を装着したミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステムを使用して、上清を限外濾過液した。０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む４０ｍＬ体積の冷１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いて、サンプルを３〜５回洗浄した。酵素溶液の最終体積は３０ｍＬであり、さらに「限外濾過液」と称される。
【０２４８】
さらなる精製のために、限外濾過液をモノＱアニオン交換カラムに通過させ得る。塩勾配を２０カラム体積にわたり１ＭのＮａＣｌに設定した。緩衝液は、７０ｍＭのＢｉｓ−ＴＲＩＳと５０ｍＭのＴＲＩＳの混合物であった。ｐＨを０．１Ｍ ＨＣｌで調整した。意外なことに、リパーゼが導電率３５ｍＳ／ｃｍで溶出するｐＨ＝９で精製を実施した場合に、最良の結果が得られることが察された。
【０２４９】
サンプルの総タンパク含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して測定された（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，Ｔｏｔｏｗａ ２００２，ｐ１５−２１）。
【０２５０】
［実施例３］
［オランダ型焼きパン（Ｄｕｔｃｈ ｔｉｎ ｂｒｅａｄ）のベーキング実験］
［Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼ、およびアミログルコシダーゼを含んでなる組成物の生地およびパン特性に対する効果］
オランダ型焼きパンを次のようにして調製した。３５００ｇの小麦粉（２８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋７００ｇのＩｂｉｓ）、小麦粉を基準にして５８％ｗ／ｗの水、８０ｇの圧搾酵母、９０ｇのパン改良剤（３５％酵素活性ダイズ粉、３０％小麦粉、１８％乳清粉末、７％油、１０％デキストロースを含んでなる）、７０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４０ｐｐｍのアスコルビン酸（小麦粉重量基準）、７ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表１に示す様々な酵素またはＳＳＬをＤｉｏｓｎａミキサーで上で、速度１で２分間、速度２で１２５ｋＷｈで、最終生地温度約２８℃に混合した。８８０ｇの生地片を丸めて３４℃および８５％の相対湿度で４０分間発酵させた。引き続いて生地片を成形して造形し、型に入れて３８℃および８５％相対湿度（Ｒ．Ｈ．）で７５分間発酵させた。完全に発酵した生地を２６５℃のオーブンで３０分間焼いた。
【０２５１】
室温への冷却後、自動化パン体積分析器（ＢＶＭ−３；ＴｅｘＶｏｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によってローフ体積を測定した。空試験パンの膨化体積を１００％と定義する。さらなる効果は、表２に示すように熟練パン職人により手動で視覚的に評価された。
【０２５２】
【表１】
【０２５３】
さらなる酵素：実施例１および２に示すように、脂肪分解酵素Ｌ０１を得て精製した。精製サンプルの活性は、「材料および方法」で指定されるアッセイを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質１グラムあたりのＤＬＵ単位で測定された。
Ｂａｋｅｚｙｍｅ ＡＧ８００は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来するアミログルコシダーゼである。Ｂａｋｅｚｙｍｅ Ｌ８００００は、リゾプス・オリーゼ（Ｒｈｙｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）に由来するトリアシルグリセロールリパーゼである。Ｂａｋｅｚｙｍｅ Ｘ−Ｐａｎは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来するセルラーゼである。
【０２５４】
【表２】
【０２５５】
実験の第１のセット（実施例１〜４）では、生地およびベイクド製品は上述の通り調製された。
生地および生地から得られたベイクド製品の評価結果を表３に示す。
【０２５６】
【表３】
【０２５７】
表３の結果は、本発明に従ったベーキング酵素組成物（実施例３、４）を使用して調製された生地およびパンが、例えば生地伸展性と粘性、パン体積、およびクラム柔らかさなどの生地特性を改善できることを示す。これらの改善は、乳化剤ＳＳＬ（実施例２）を使用して得られるものに匹敵する。本発明に従ったベーキング組成物を含んでなる生地から得られるベイクド製品の体積は、乳化剤ＳＳＬを含有する生地から得られるベイクド製品と比較すると、実際改善された。これらの結果は、本発明に従ったベーキング酵素組成物が、オランダ型焼きパンなどの柔らかいパンの調製においてＳＳＬを完全に置き換え得ることを示す。
【０２５８】
実験の第２のセット（実験５〜８）では、ベーキングに先だって生地に衝撃を与えたという違いを除いて、生地は上述の通り調製された。生地への衝撃付与は、ベーキング型に含有される完全に発酵した生地を２０ｃｍの高さから落下させて、それを上述の通り焼くことで実施された。生地から得られるベイクド製品の評価結果を表４に示す。
【０２５９】
【表４】
【０２６０】
結果は、乳化剤を使用せずに調製されて、衝撃を与えた生地から得られたパンが、その体積を２０％以超失ったことを示唆する。これはそれからそれが調製された生地の耐衝撃性が低いことを示唆する。同一条件下で衝撃を与えた生地から調製されてＳＳＬを含んでなるパンは、乳化剤を含まず衝撃を与えられなかった生地によって得られるパンとおよそ同一体積を有する。同一条件下で衝撃を与えた生地から得られ、本発明に従ったベーキング組成物を含んでなるパンは、乳化剤を含まず衝撃を与えられなかった生地によって得られるパン（体積１００％に相当する；表４には示さず）と比較しても、なおも改善された体積を有する。このパンはまた、ＳＳＬを含んでなる生地から得られて、衝撃を与えられた実験６のパンと比較して、より良い体積も有する。これは本発明に従ったベーキング組成物を含んでなる生地の優れた耐衝撃性を示唆し、それは乳化剤としてＳＳＬを含んでなる生地の耐衝撃性よりなおも良い。
【０２６１】
［実施例４］
［ベーキング実験−標準バタール］
［脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物の生地およびパン特性に対する効果］
標準バタールパンを次のようにして調製した。３０００ｇの小麦粉（２７００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋３００ｇのＩｂｉｓ）、５８％のｗ／ｗ水（小麦粉基準）、７０ｇの圧搾酵母、６０ｇの塩（ＮａＣｌ）、３４ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸、３ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１５ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表５に示す酵素をＤｉｏｓｎａミキサー上で速度１で２分間、速度２で１０５ｋＷｈで最終生地温度約２７℃に混合した。３５０ｇの生地片を丸め、３２℃および９０％の相対湿度で４０分間発酵させた。引き続いて生地片を成形して造形し３２℃および９０％Ｒ．Ｈ．で１００分間発酵させた。完全に発酵した生地をオーブン内で２８０℃で７分間、２６５〜２７０℃で２８分間焼いた。
【０２６２】
室温に冷却した後、実施例３に示すたようにローフの体積を測定した。生地弾性、生地安定性、およびベイクド製品のクラム構造は、熟練パン職人によって視覚的に評価された。
【０２６３】
【表５】
【０２６４】
実験は、脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる本発明に従った組成物をバタール製造において使用すると、良好な安定性と改善された弾性がある生地が得られ、対応するベイクド製品は、脂肪分解酵素Ｌ０１のみを使用して製造されたベイクド製品と比較すると、より細かいクラム構造と比較できるパン体積を有することを示す。
【０２６５】
［実施例５］
［ベーキング実験−標準バタール］
［先行技術の脂肪分解酵素と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物のパンおよび生地特性に対する効果］
速度２での成分混合が１０５ｋＷｈでなく７１ｋＷｈで達成されたという違いを除いて、実施例４に示すようにして標準バタールパンを調製した。以下の成分を使用した。２０００ｇの小麦粉（１８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋２００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗの水（小麦粉基準）、４７ｇの圧搾酵母、４０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４４ｐｐｍのアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉基準）、３ｐｐｍ（１ｋｇの小麦粉基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１５ｐｐｍ（１ｋｇの小麦粉基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表６に示す酵素。
【０２６６】
【表６】
【０２６７】
パン体積を実施例３と同様にして測定した。ベイクド製品の生地伸展性、生地弾性は、熟練パン職人によって視覚的に評価された。実験は、バタールの製造において、脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる本発明に従った組成物を使用した場合、良好な安定性と改善された弾性のある生地が得られ、対応するベイクド製品は、リン脂質、トリグリセリド、およびガラクト脂質に対する活性がある先行技術の脂肪分解酵素を使用して得られる生地およびベイクド製品と比較すると、改善された体積を有することを示す。
【０２６８】
［実施例６］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる組成物のパンおよび生地特性に対する効果］
一次発酵が３４℃および８５％Ｒ．Ｈ．で３５分間、二次発酵が３８℃および８５％Ｒ．Ｈ．で７０分間、完全発酵生地のベーキングが２８０℃で７分間、そして２６５〜２７０℃で２８分間実施されたことを除いては、実施例３に示すようにしてオランダ型焼きパンを調製した。以下の成分を使用した。３５００ｇの小麦粉（２８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋７００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、７７ｇの圧搾酵母、７０ｇの塩（ＮａＣｌ）、３５ｇの糖、３５ｇの脂肪、４０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸、３ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１５ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＭＡ１００００（抗老化アミラーゼ）、および表７に示す様々な酵素。
【０２６９】
実施例３に示すようにしてベイクド製品の体積を測定する一方、軟らかさは熟練パン職人によって経験的に判定された。
【０２７０】
【表７】
【０２７１】
実験は、本発明組成物が、柔らかい型焼きパンの製造において使用した場合に、パンの軟らかさをかなり改善することを明らかに示す。改善は、組成物中で脂肪分解酵素Ｌ０１を使用した場合に特に明白である。
【０２７２】
［実施例７］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる組成物の効果］
オランダ型焼きパンを次のようにして調製した。３５００ｇの小麦粉（２８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋７００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、８０ｇの圧搾酵母、８７．５ｇのパン改良剤（３５％酵素活性ダイズ粉、３０％小麦粉、１８％乳清粉末、７％油、１０％デキストロースを含んでなる）、７０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉重量基準）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＭＡ１００００（抗老化アミラーゼ）および表８に示す様々な酵素をＤｉｏｓｎａミキサー上で速度１で３分間、速度２で１３０ｋＷｈで、最終生地温度２８℃に混合した。８７５ｇの生地片を丸めて室温で５分間発酵させ、引き続いてそれらを成形して造形し室温で１５分間発酵させた。引き続いて生地を成形して造形し、型に入れて３８℃および８５％Ｒ．Ｈ．で７０分間発酵させた。完全に発酵させた生地をオーブン内で２８０℃で７分間、２６５〜２７０℃で２８分間焼いた。
【０２７３】
生地特徴およびパン体積を実施例３に示すように判定した。結果を表８に報告する。
【０２７４】
【表８】
【０２７５】
実験１と２の比較から、Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる本発明に従った組成物（実験２）は、パン生地に有効量で添加した際に、セルラーゼを含まない本発明に従った組成物と比較して、伸展性および弾性などの生地の特徴を改善し、生地粘性を低下させることは明白である。
【０２７６】
［実施例８］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる組成物と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼ、およびアミノグルコシダーゼを含んでなる組成物の効果］
混合を速度１で３分間、速度２で１２０ｋＷｈで実施したことを除いては、実施例７に示すようにしてオランダ型焼きパンを調製した。生地片（７５０ｇ）を３２℃および８５％Ｒ．Ｖ．で３５分間、引き続いて同一条件下で７０分間発酵させた。
【０２７７】
使用された成分は、次のとおりであった。３０００ｇの小麦粉（２４００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋６００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、６０ｇの圧搾酵母、７５ｇのパン改良剤（３５％酵素活性ダイズ粉、３０％小麦粉、１８％乳清粉末、７％油、１０％デキストロースを含んでなる）、６０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉重量基準）、７ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＭＡ１００００（抗老化アミラーゼ）、および表９に示す様々な酵素。
【０２７８】
生地特徴およびパン体積を実施例３に示すように判定した。結果を表９に報告する。
【０２７９】
【表９】
【０２８０】
実験１と２の比較から、Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼ、およびアミログルコシダーゼを含んでなる本発明に従った組成物（実験２）は、パン成分に有効量で添加された際に、伸展性や弾性などの生地特徴をさらに改善し、アミログルコシダーゼを含まない本発明に従った組成物（実験１）と比較して、更に細かいクラム構造のベイクド製品を生じることが明白である。
【０２８１】
［実施例９］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［ＧＭＳまたはＳＳＬと比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼおよびアミノグルコシダーゼを含んでなる組成物の生地特徴およびパン体積および軟らかさに対する効果］
混合を速度１で４分間、速度２で１１２ｋＷｈで実施したことを除いては、実施例７に示すようにしてオランダ型焼きパンを調製した。生地片（８４０ｇ）を３０℃および７０％Ｒ．Ｖ．で４０分間、引き続いて３８℃および９０％Ｒ．Ｈ．で７０分間発酵させた。
【０２８２】
使用した成分は、次のとおりであった。３０００ｇの小麦粉（２４００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋６００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、７５ｇの圧搾酵母、６０ｇの塩（ＮａＣｌ）、９０ｇのショートニング、４５ｇの糖、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＬ−システイン、３０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉重量基準）、７．８ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１７．５ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表１０に示す様々な酵素、ＳＳＬまたはＧＭＳ。
【０２８３】
パン体積を実施例３に示すようにして測定した。クラム硬さは、２４時間後にテクスチャー分析器ＴＡ−ＴＸ Ｐｌｕｓによって測定した。パン体積およびクラム硬さの結果を表１１に報告する。
【０２８４】
【表１０】
【０２８５】
【表１１】
【０２８６】
表１１の結果は、本発明に従ったベーキング酵素組成物（実施例４）を使用して調製されたパンが、ＳＳＬを含有するパン（実施例３）に匹敵し、ＧＭＳを含有するパン（実施例２）に優る、改善されたクラム柔らかさを有することを示す。本発明に従ったベーキング組成物を含んでなる生地から得られるベイクド製品の体積は、乳化剤ＳＳＬまたはＧＭＳを含有する生地から得られるベイクド製品と比較すると、実際、わずかに改善された。これらの結果はオランダ型焼きパンなどの柔らかいパンの調製において、本発明に従ったベーキング酵素組成物が、ＳＳＬまたはＧＭＳを完全に置き換え得ることを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、新しいベーキング酵素組成物、前記組成物を使用して製造される生地、およびそれから得られるベイクド製品に関する。本発明はまた、生地またはそれから得られるベイクド製品の製造において、ＳＳＬまたはＣＳＬを置き換える新しいベーキング酵素組成物の使用にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
生地の取り扱い特性および／またはベイクド製品の最終特性を改善するために、特性を改善する加工助剤を開発するたゆみない努力がなされている。加工助剤は本明細書で、生地の取り扱い特性および／またはベイクド製品の最終特性を改善する化合物と定義される。改善されうる生地特性としては、安定性、機械加工適性、ガス保持能力、粘性低下、弾性、伸展性、成形性などが挙げられる。改善されベイクド製品の特性としては、膨化体積、外皮サクサク感、火ぶくれ減少、クラム構造、クラム柔らかさ、香味、相対老化、および貯蔵寿命が挙げられる。これらの生地および／またはベイクド製品改善加工助剤は、化学添加剤と酵素（ベーキング酵素とも称される）に二分し得る。
【０００３】
特性改善化学添加剤は、アスコルビン酸、臭素、およびアゾジカルボン酸などの酸化剤；Ｌ−システインおよびグルタチオンなどの還元剤；モノ／ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、ステアロイルラクチル酸ナトリウム（ＳＳＬ）またはステアロイルラクチル酸カルシウム（ＣＳＬ）などの生地調整剤として機能する乳化剤；またはモノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）などのクラム軟化剤として機能する乳化剤；トリグリセリド（脂肪）またはレシチンなどの脂肪質を含んでなる。
【０００４】
製パン工業で適用される乳化剤は、クラム軟化剤または生地強化剤に大まかに区分し得る。蒸留されたモノグリセリドは、主にクラム軟化のために使用される。モノグリセリドのデンプンとの複合体形成は、デンプンの完全な再結晶化を防止して、初期のクラム軟らかさおよび／またはベイクド製品の貯蔵寿命中のクラム固化速度の低下をもたらす。生地強化のためには、ＤＡＴＥＭ、ＣＳＬ、およびＳＳＬなどのいくつかの異なる合成極性脂質類似物を応用する。それらの製パンにおける効果は、主に生地の安定性を改善することである。
【０００５】
生地の粘性低下、生地機械加工性の改善などのその他の生地の特徴、そして膨化体積の増大、クラム構造の改善、クラム柔らかさと貯蔵寿命の改善、および外皮サクサク感の改善などの改善されたベイクド製品の特徴もまた達成され得る。
【０００６】
皮の硬いローフタイプのパンでは化学乳化剤としてＤＡＴＥＭが主に使用される一方、ＳＳＬまたはＣＳＬは、主に型焼きパン、サンドイッチパン、およびソフトロールバンズなどの柔らかいパンで使用される。
【０００７】
化学添加剤をより多くの天然物で置き換える消費者主導の必要性の結果として、特定のベーキング用途条件に応じた生地および／またはベイクド製品改善特性がある、いくつかのベーキング酵素が開発されている。
【０００８】
化学添加剤に対する消費者の抵抗は増大しており、したがって消費者に抵抗なく受け入れられる添加剤および／または酵素によって、加工助剤と見なされる乳化剤を置き換える絶え間ない需要がある。しかし例えば乳化剤を省くとパンの品質は相当に低下し、ＳＳＬまたはモノグリセリドのような乳化剤を使用せずに３〜５日間の貯蔵寿命を達成することは、サンドイッチパンなどの皮の硬くない各種パンにとって困難である。
【０００９】
パンの老化に関する研究は、パン中のデンプン画分が保存中に再結晶化することにより、クラムの硬さの増大を引き起こすことを示唆した。アミラーゼおよびヘミセルラーゼは、クラム柔らかさと膨化体積を改善するパン改良剤の中で広く使用されている。αアミラーゼはベーキング中にデンプン画分を部分的に分解し、クラム柔らかさを増大させる。ヘミセルラーゼは小麦粉のヘミセルロース画分を分解し、それによって常態ではこの画分に結合する水を生地の中に遊離させる。パン改良剤中のヘミセルラーゼの使用は、ベーキング中の改善された生地の窯伸び、ベーカリー製品の改善された膨化体積、粒構造、およびより良い保存性をもたらす。しかしアミラーゼおよびヘミセルラーゼによって与えられる改善は限定的であり、したがってパンの許容可能な日持ちを得るためには、乳化剤がなおも必要とされる。
【００１０】
Ｄｅ Ｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）７４：２９０−３００は、製パン工業においてホスホリパーゼを使用して、特にベイクド製品の製造において、ＤＡＴＥＭ、ＣＳＬまたはＳＳＬなどの乳化剤を部分的にまたは完全に置き換えてもよいことを記載する。
【００１１】
国際公開第０２／０３８０５号パンフレットは、異なる基質特異性のある２つの脂肪分解酵素の組み合わせが、生地、または生地からできたベイクド製品に対して相乗効果をもたらし、体積が改善されたベイクド製品および／またはベーキング中に形状がより良く保持されるベイクド製品を生じることを記載する。
【００１２】
欧州特許第０５８５９８８号明細書は、好ましくはショートニングと組み合わされた、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、およびアミラーゼを含んでなるパン改良剤組成物について記載する。前記酵素製剤および好ましくはショートニングの組み合わせは、ＳＳＬやモノグリセリドのような乳化剤を置換し得る。
【００１３】
ベーキング製品の製造において、ＳＳＬまたはＣＳＬなどの化学乳化剤の使用を削減する新しい趨勢のために、ベーキング工程において、これらの化学乳化剤を置き換え得る代替のまたは改善されたベーキング酵素組成物に対する必要性がある。生地およびそれから製造されるベイクド製品の生産において、乳化剤、特にＳＳＬまたはＣＳＬを部分的にまたは完全に置き換え得る、新しいベーキング酵素組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
［発明の概要］
本発明の第１の態様では、
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物に従うアミノ酸配列；または
（Ｂ）（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；または
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コード縮重の結果として縮重される配列；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる、単離ポリペプチドである脂肪分解酵素を含んでなる、ベーキング酵素組成物が開示され、
組成物は、トリアシルグリセロールリパーゼ、好ましくはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するリパーゼをさらに含んでなる。
【００１５】
ベーキング酵素組成物は、セルラーゼまたはヘミセルラーゼ、およびアミログルコシダーゼまたはこれらの酵素の１つ以上の混合物をさらに含んでなってもよい。本発明に従ったベーキング酵素組成物は、１つ以上のその他の酵素、１つ以上の生地改善および／またはパン改善添加剤をさらに含んでなってもよい。第２の態様では、本発明は本発明の第１の態様に従ったベーキング酵素組成物、小麦粉、および１つ以上の生地またはパン添加剤を含んでなるプレミックスを提供する。
【００１６】
別の態様では本発明は、小麦粉、水、酵母、および本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスを含んでなる生地を提供する。本発明に従ったベーキング酵素組成物を含んでなる生地は、優れた安定性、機械的損傷に対する耐衝性、および良好な伸展性や低粘性などのその他の特性を有することが意外にも分かった。本発明に従ったベーキング組成物の使用は、季節的変動に起因する小麦粉中の異なる脂質プロフィールの変化を自動的に緩和することで、小麦粉の変動性の影響を排除する。本発明の第４の態様では、本発明に従った生地を焼くことで得られるベイクド製品が提供される。本発明に従ったベイクド製品は、改善された体積と非常に良好なクラム構造、特に細かいクラム構造、クラム柔らかさを有し、したがって貯蔵寿命が増大することが意外にも発見された。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、本発明に従った生地およびベイクド製品を製造する方法が提供される。本発明はまた、生地またはそれに由来するベイクド製品の製造において、乳化剤を置き換え、好ましくはＳＳＬまたはＣＳＬを置き換えるための本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスの使用も提供する。プレミックスからのＳＳＬおよび／またはＣＳＬの省略は、ベイクド製品成分の製造中の取り扱いおよび保存節減をもたらし、本発明のベーキング組成物は、ＳＳＬまたはＣＳＬよりもはるかに低い投与量で使用し得るという事実のために、コスト削減を可能にする。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
したがって本発明の第１の態様では、
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物に従うアミノ酸配列；または
（Ｂ）（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；または
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コード縮重の結果として縮重される配列；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチドである、脂肪分解酵素（本細書中で本発明に従った脂肪分解酵素として示される）を含んでなるベーキング組成物が開示され、
組成物は、トリアシルグリセロールリパーゼ、好ましくはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するトリアシルグリセロールリパーゼをさらに含んでなる。
【００１９】
ベーキング酵素組成物中で使用される本発明に従った脂肪分解酵素は、製パン用途において、グリセリド（例えばトリグリセリド）、リン脂質、およびガラクト脂質などの糖脂質に及ぶ、いくつかの各種脂質に作用できる。好ましくは本発明に従った脂肪分解酵素は、製パン用途において、例えば生地状態で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を有する。
【００２０】
脂肪分解酵素は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または最も好ましくは９０％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、または配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドであり、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物である。
【００２１】
本発明のベーキング組成物で使用される好ましい脂肪分解酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸（Ｌ０１として示される）、すなわち配列番号２に記載のアミノ酸３４〜３０４に由来して、アミノ酸配列が配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる、成熟ポリペプチドに相当する脂肪分解酵素である。
【００２２】
さらに具体的には本発明に従ったベーキング酵素組成物中で使用される脂肪分解酵素は、生地中原位置で使用した場合に、以下の特性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す。
●無極性脂質に対する比較的低い活性。
●ジアシルガラクト脂質などの極性ジアシル脂質および／またはリン脂質に対する比較的高い活性。
●リゾガラクト脂質やリゾリン脂質などの極性モノアシル化合物に対する比較的低い活性。
【００２３】
これらの意外な特性は全て、生地中で化学乳化剤代替物として使用した場合に、極めて有利であることが分かった。
【００２４】
グリセリドは、グリセロールと脂肪酸のエステルである。トリグリセリド（トリアシルグリセロールまたはトリアシルグリセリドとしてもまた知られている）は、主に植物油および動物脂肪中に存在する。リパーゼ（トリアシルグリセロールリパーゼとしてもまた知られている）（ＥＣ３．１．１．３）は、本明細書で、トリグリセリド中に存在する脂肪酸の１つ以上を加水分解する酵素と定義され、さらに具体的にはそれらは脂肪酸とグリセロール部分の水酸基の間のエステル結合を加水分解する。
【００２５】
糖脂質（例えばガラクト脂質）は、外側（ｓｎ−１）および中央（ｓｎ−２）の位置に２つのエステル化脂肪酸があるグリセロール主鎖から構成される一方、第３の水酸基は、例えばモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ）またはジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）のようなガラクト脂質の場合は、ガラクトースなどの糖残基に結合する。ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）は、ガラクトシルジグリセリドからのそれぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置中の片方または双方の脂肪アシル基の加水分解を触媒する。
【００２６】
リン脂質は、外側（ｓｎ−１）と中央（ｓｎ−２）の位置に２つのエステル化脂肪酸があるグリセロール主鎖から構成される一方、グリセロールの第３の水酸基でリン酸でエステル化される。次にリン酸は、例えばエタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン）のようなアミノアルコール、コリン（ホスファチジルコリン）でエステル化されてもよい。ホスホリパーゼは、本明細書でリン脂質中の１つ以上の結合の加水分解に関与する酵素と定義される。
【００２７】
脂肪酸アシル部分をグリセロール主鎖に結合するエステル結合を加水分解する、ホスホリパーゼ活性のいくつかのタイプが、区別され得る。
●ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）およびＡ２（ＥＣ３．１．１．４）は、ジアシルグリセロリン脂質から、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置中の１つの脂肪酸アシル基の脱アシル化を触媒して、リゾリン脂質を生成する。これは乳化剤代替物質にとって、望ましい活性である。
●リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５；Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）によってホスホリパーゼＢとも称される）は、リゾリン脂質中の残る脂肪酸アシル基の加水分解を触媒する。
ジアシルグリセロリン脂質からの双方の脂肪酸の脱アシル化を触媒し、リゾホスホリパーゼ活性を内在性に有する、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）からのホスホリパーゼＢが報告されている（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９７：４４６−４５６）。リゾホスホリパーゼ活性は極性頭部と無極性尾部の組み合わせの欠失をもたらし、得られる製品は表面特性に影響できなくなるので、乳化剤代替物質にとって望ましくない。意外なことに、本発明に従った脂肪分解酵素は生地中で比較的低いリゾホスホリパーゼ活性を示すことが示された。
【００２８】
トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する本発明に従った脂肪分解酵素そのまま使用して、生地中の好ましくはＳＳＬおよび／またはＣＳＬである乳化剤を置き換えてもよい。生地に有効量で組み込まれると、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する脂肪分解酵素は、その中にポリペプチドが組み込まれない生地またはベイクド製品と比較して、生地またはそれから得られるベイクド製品の１つ以上の特性を改善するかもしれない。
【００２９】
「特性改善」という用語は、本明細書で、本発明に従った脂肪分解酵素または本発明に従ったベーキング酵素組成物の作用によって、その中に本発明に従った脂肪分解酵素または組成物組み込まれない生地または製品と比較して改善された、生地および／または生地から得られる製品、特にベイクド製品のあらゆる特性と定義される。改善された特性としては、生地の強度増大、生地の弾性増大、生地の安定性増大および耐衝撃性増大、生地の粘性低下、生地の伸展性改善、生地の機械加工適性改善、ベイクド製品の体積増大、ベイクド製品の香味改善、ベイクド製品のクラム構造改善、ベイクド製品のクラム柔らかさ改善、ベイクド製品の火ぶくれ減少および／またはベイクド製品の抗老化改善が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
特性改善は、下述する本発明の方法に従って、本発明の脂肪分解酵素またはベーキング酵素組成物の添加ありまたはなしで調製された生地および／またはベイクド製品を比較することで判定されてもよい。官能特性は製パン工業で確立された手順を使用して評価されてもよく、例えば訓練された味覚テスターパネルの使用を含んでもよい。
【００３１】
「生地の強度増大」という用語は、本明細書で、一般により弾力のある特性を有し、および／または成形と造形により多くの力を要する、生地の特性と定義される。
【００３２】
「生地の弾性増大」という用語は、本明細書で、特定の物理的歪みを加えられた後に、元の形状に復帰するより高い傾向を有する生地の特性と定義される。
【００３３】
「生地の安定性増大」という用語は、本明細書で機械的損傷を受けにくく、したがってその形状と体積をより良く保つ生地の特性と定義され、通常のおよび／または長時間発酵後のローフ断面の高さ：幅比率によって評価される。
【００３４】
「生地の粘性低下」という用語は、本明細書で例えば生地製造機内において、表面に付着するより低い傾向を有する生地の特性と定義され、当該技術分野で知られているように、熟練した試験パン職人によって経験的に評価され、またはテクスチャー分析器（例えばＴＡＸＴ２）の使用によって測定される。
【００３５】
「生地の伸展性改善」という用語は、本明細書で、裂けることなく、歪みまたは伸展の増大を被り得る生地の特性と定義される。
【００３６】
「生地の機械加工適性改善」という用語は、本明細書で、一般に粘性がより低くおよび／またはより堅固でおよび／または弾性のある生地の特性と定義される。
【００３７】
「生地の耐衝撃性増大」という用語は、本明細書で、機械的衝撃を被った後にその形状と体積を保つ生地の特性と定義される。これは衝撃を与えなかった同一の生地から得られるベイクド製品と比較して、衝撃を与えた生地から得られるベイクド製品の体積変動百分率を測定することで評価される。衝撃を与えた生地によって得られるベイクド製品の体積損失が、衝撃を与えなかった同一の生地によって得られるベイクド製品と比較して、可能な限り小さくまたは不在であれば、生地は十分に安定している。生地には当業者に知られている方法によって、例えば実験の項で報告される方法によって衝撃を与えてもよい。
【００３８】
「ベイクド製品の体積増大」という用語は、当該技術分野で知られている超音波またはレーザー検出を使用して、自動化パン体積分析器（例えばＢＶＭ−３；スウェーデン国のＴｅｘ Ｖｏｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ，Ｖｉｋｅｎ）によって測定される、特定のパンローフの体積として測定される。
【００３９】
「ベイクド製品の火ぶくれ減少」という用語は、本明細書で視覚的に判定される焼かれたパン外皮の火ぶくれ形成の減少と定義される。
【００４０】
「ベイクド製品のクラム構造改善」という用語は、本明細書で、クラム中のより細かい気泡および／またはより薄い気泡壁および／またはクラム中の気泡のより均一／均質の分布があるベイクド製品の特性と定義され、通常、当該技術分野で知られているように、パン職人によって視覚的に、またはデジタル画像分析（例えばＣ−ｃｅｌｌ；英国ウォリントンのアップルトン（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）のＣａｌｉｂｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）によって評価される。
【００４１】
「ベイクド製品の軟らかさ改善」という用語は、「硬さ」の逆であり、本明細書でより容易に押圧されるベイクド製品の特性と定義され、当該技術分野で知られているように、熟練した試験パン職人によって経験的に評価され、またはテクスチャー分析器（例えばＴＡＸＴ２またはＴＡ−ＸＴ Ｐｌｕｓ；英国サリーのＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ）の使用によって測定される。
【００４２】
「ベイクド製品の香味改善」という用語は、訓練された試験パネルによって評価される。
【００４３】
「ベイクド製品の抗老化改善」という用語は、本明細書で、保存中における例えば軟らかさおよび／または弾性などの品質パラメーターの劣化速度が低下している、ベイクド製品の特性と定義される。
【００４４】
「サクサク感の改善」という用語は、本明細書で、当該技術分野で知られている参考製品よりも強いサクサク感を与え、ならびにこの強いサクサク感を参考製品よりも長く保つベイクド製品の特性と定義される。この特性は、例えばテクスチャー分析器ＴＡ−ＸＴ Ｐｌｕｓ（英国サリーのＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ））を使用して、押圧実験で固定速度における距離対力曲線を測定し、この圧縮曲線から物理的パラメーター、すなわち（ｉ）第１のピーク力、（ｉｉ）第１のピーク距離、（ｉｉｉ）初期傾斜、（ｉｖ）最大ピーク力、（ｖ）グラフ下面積、および（ｖｉ）破壊事象数（力が特定の設定値よりも大きく低下する）を得ることによって定量化し得る。サクサク感改善の指標は、より高い第１のピーク力、より短い第１のピーク距離、より高い初期傾斜、より高い最高ピーク力、より大きなグラフ下面積、およびより多数の破壊事象である。サクサクのより強い製品は、参考製品と比較して、少なくともこれらのパラメーターの２つにおいて統計的に有意により良く得点すべきである。当該技術分野で、「サクサク感」はまた、サクサク感、カリカリ感またはパリパリ感とも称され、サクサク、カリカリしてまたはパリパリした破壊挙動のある物質を意味する。
【００４５】
トリアシルグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する、本発明に従った脂肪分解酵素をそのまま有効量で生地に組み込んだ場合、生地強度などのいくつかの生地特性、およびそれから得られるベイクド製品のパン体積などのいくつかの特性が改善されるかもしれない。しかしこれらの改善は、特にベイクド製品が、型焼きパンまたはサンドイッチパン、ロール、ハンバーガーバンズのようなバンズ、またはイーストで膨らませたドーナツなどの柔らかく皮が硬くないタイプである場合、完全に十分でないかもしれない。したがって所望の生地およびベイクド製品の特徴を得るためには、なおもＳＳＬまたはＣＳＬを生地成分として添加する必要がある。
【００４６】
本発明に従った脂肪分解酵素とトリアシルグリセロールリパーゼを型焼きパンなどのベイクド製品を製造するのに使用される生地に有効量で添加した場合、良好な強度、改善された安定性、および機械加工性がある生地が得られる一方、対応するベイクド製品は改善されたパン体積と細かいクラム構造を示すことが意外にも分かった。有効量の本発明に従った脂肪分解酵素と、トリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる生地は、ＳＳＬまたはＣＳＬが組み込まれた場合と同様の安定特性を有してもよい。
【００４７】
トリアシルグリセロールリパーゼは、好ましくは真菌リパーゼであり、好ましくはクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）に由来する。より好ましくはクモノスカビ属（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）に由来する、より好ましくはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するトリアシルグリセロールリパーゼが使用される。任意に２つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの組み合わせを使用し得る。したがって本発明の別の実施態様では、本発明に従ったベーキング酵素組成物は、２つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの組み合わせをさらに含んでなる。
【００４８】
好ましい本発明の実施態様では、本発明に従ったベーキング酵素組成物は、ヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼをさらに含んでなる。任意に２つ以上のヘミセルラーゼおよび／または２つ以上のセルラーゼの組み合わせ、および／または１つ以上のヘミセルラーゼと１つ以上のセルラーゼの組み合わせを使用し得る。
【００４９】
本発明に従った脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼを含んでなるベーキング組成物を型焼きパンまたはサンドイッチパン、ハンバーガーバンズのようなバンズ、ロール、およびイーストで膨らませたドーナツなどのベイクド製品を製造するのに使用される生地に有効量で添加すると、生地の特性および生地から得られるベイクド製品の特性が、本発明に従った脂肪分解酵素およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなるがヘミセルラーゼまたはセルラーゼを含まない生地と比較して、さらに改善されてもよいことが意外にも分かった。特に、さらに改善された体積および／またはより細かいクラム構造および／またはクラム柔らかさが得られてもよい。
【００５０】
特に良好な結果が、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に由来する、またはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来するセルラーゼを使用して得られてもよい。
【００５１】
なおもより好ましい本発明の実施態様では、本発明に従ったベーキング酵素組成物は、アミログルコシダーゼ、好ましくはコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、より好ましくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するアミログルコシダーゼをさらに含んでなる。
【００５２】
意外なことに、本発明に従った脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼ、ヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼ、およびアミログルコシダーゼを含んでなるベーキング酵素組成物を生地に有効量で組み込むと、生地およびそれから得られるベイクド製品の質が、本発明に従った脂肪分解酵素、トリアシルグリセロールリパーゼおよびヘミセルラーゼまたはセルラーゼを含んでなるが、アミログルコシダーゼを含まない生地と比較してさらに改善されてもよい。得られる生地は、改善された安定性および／または増大する耐衝撃性、改善された機械加工性、良好な膨らみなどの例外的な質を有し、対応する製品は、優れた体積、細かいクラム構造および／またはクラム柔らかさを有してもよく、結果としてそれは長期の貯蔵寿命を有してもよい。これらの改善は、生地中のＳＳＬまたはＣＳＬの完全な置き換えを可能にする。
【００５３】
本発明に従ったベーキング酵素組成物は、追加的酵素および／または生地および／またはパン添加剤をさらに含んでなってもよい。
【００５４】
追加的酵素は、哺乳類および植物をはじめとするあらゆる起源、好ましくは微生物（細菌、酵母または真菌）起源であってもよく、通常当該技術分野で利用される技術によって得られてもよい。
【００５５】
追加的酵素は、αアミラーゼ（酵母が発酵できる糖を提供し、老化を遅らせるのに有用である）、βアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼまたは非マルトース生成アミラーゼなどのアミラーゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；プロテアーゼ；特にエキソペプチダーゼ（香味改良に有用である）などのペプチダーゼ；トランスグルタミナーゼ；ガラクトリパーゼ；ホスホリパーゼ；特に例えばキシラナーゼ（ペントサンの部分的加水分解に有用であり、さらに具体的には生地の伸展性を増大させるアラビノキシラン）のようなペントサナーゼなどのヘミセルラーゼ；プロテアーゼ（特に強力粉を使用する場合、グルテン弱化に有用である）；例えば国際公開第９５／００６３６号パンフレットで開示されるようなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；ペルオキシダーゼ（生地粘稠度を改善するのに有用である）；ラッカーゼ；またはオキシダーゼ；例えばグルコースオキシダーゼなどのヘキソースオキシダーゼ；アルドースオキシダーゼ；ピラノースオキシダーゼ；リポキシゲナーゼまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼ（生地粘稠度を改善するのに有用である）であってもよい。本発明に従ったベーキング組成物がマルトース生成アミラーゼをさらに含んでなる場合、生地に添加された組成物は、改善されたクラム柔らかさ、ひいては改善された貯蔵寿命がある、それから得られるベイクド製品をもたらす。
【００５６】
生地およびパン製造において、本発明に従ったベーキング酵素組成物をその他のパンまたは生地成分との、または塩、酸化剤（例えばアスコルビン酸）や還元剤（例えばＬ−システイン）および／または乳化剤（例えばＤＡＴＥＭ、ＳＳＬおよび／またはＣＳＬ）のような化学加工助剤、および／またはオキシド還元酵素（例えばグルコースオキシダーゼ）や多糖類修飾酵素（例えばαアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、分枝酵素など）および／またはタンパク質修飾酵素（エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、分枝酵素など）などの酵素加工助剤などの添加剤との組み合わせで使用してもよい。好ましくはベイクド製品または生地を製造するのに使用される添加剤はＳＳＬおよび／またはＣＳＬを含まず、より好ましくはそれらはＳＳＬ、ＣＳＬ、ＤＡＴＥＭ、ＧＭＳから選択される乳化剤を含まず、より好ましくは乳化剤を含まない。
【００５７】
第２の態様では、本発明は、本発明に従ったベーキング酵素組成物、小麦粉、および前述の１つ以上のパンまたは生地添加剤を含んでなるプレミックスを提供する。
【００５８】
「プレミックス」という用語は、本明細書において、その従来の意味で、すなわち工業的製パン工場／設備だけでなく、小売ベーカリーでも使用されてよい、一般に小麦粉を含むベーキング剤の混合物と理解されるべきであると定義される。プレミックスは、本発明のベーキング酵素組成物を小麦粉、デンプン、糖、マルトデキストリンなどの複合糖質、または塩などの適切なキャリアと混合して調製されてもよい。プレミックスは、例えば上述のいずれかの酵素をはじめとする添加剤、その他の生地および／またはパン添加剤を含有してもよい。
【００５９】
別の態様では本発明は、少なくとも小麦粉、水、および酵母を含んでなる生地成分に、本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスを添加するステップを含んでなる、生地を調製する方法を開示する。
【００６０】
上述の成分およびパンまたは生地添加剤からの生地の調製は、当該技術分野で良く知られており、前記成分と添加剤を混合するステップと、１つ以上の成形および発酵ステップを含んでなる。
【００６１】
別の態様では、本発明は、小麦粉、水、酵母、および有効量の本発明に従ったベーキング酵素組成物またはプレミックスを含んでなる生地を提供する。
【００６２】
本発明はまた、ポリペプチドが組み込まれていない生地またはベイクド製品と比較して、生地または生地から得られるベイクド製品の１つ以上の特性を改善する、有効量の本発明のベーキング酵素組成物を生地に組み込むステップを含んでなる、生地またはベイクド製品を調製する方法にも関する。
【００６３】
「生地に組み込む」という語句は、本明細書で、生地に、生地がそれから作られるあらゆる成分に、および／または生地がそれから作られるあらゆる生地成分混合物に、本発明に従ったベーキング酵素組成物を添加することと定義される。換言すれば本発明のベーキング酵素組成物は、生地調製のあらゆるステップで添加されてもよく、１つまたは２つ以上のステップで添加されてもよい。組成物は、当該技術分野で良く知られている方法を使用して、練られて焼かれベイクド製品が製造される生地成分に添加される。例えば米国特許第４，５６７，０４６号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−４２６，２１１号明細書、特開昭６０−７８５２９号公報、特開昭６２−１１１６２９号公報、および特開昭６３−２５８５２８号公報を参照されたい。
【００６４】
「有効量」という用語は、本明細書で、生地および／またはベイクド製品の関心のある少なくとも１つの特性に対して、測定可能な効果を与えるのに十分な、本発明に従ったベーキング酵素組成物の量と定義される。
【００６５】
「生地」という用語は、本明細書で、練るのにまたは丸めるのに十分に硬い小麦粉とその他の成分との混合物と定義される。生地は、新鮮、凍結、調製済、または予備焼成であってもよい。凍結生地の調製については、ＫｕｌｐおよびＬｏｒｅｎｚによって「Ｆｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｄｏｕｇｈｓ ａｎｄ Ｂａｔｔｅｒｓ」，Ｋ．Ｋｕｌｐ，Ｋ．Ｌｏｒｅｎｚ，Ｊ．Ｂｒｕｍｍｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９９５）で記載される。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様に従って、本発明に従った脂肪分解酵素は、本発明に従った脂肪分解酵素の小麦粉（例えばＬ０１）１ｋｇあたり少なくとも３．５７ＤＬＵ単位の量、好ましくは少なくとも７．１５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも１４．３０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。好ましい本発明の実施態様に従って、本発明に従った脂肪分解酵素は、最大で１４３ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の本発明に従った脂肪分解酵素、好ましくは最大で７１．５０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大で３５．７５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。本発明に従った脂肪分解酵素のＤＬＵ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００６７】
本発明に従った生地は、トリアシルグリセロールリパーゼをさらに含んでなる。本発明の好ましい実施態様に従って、トリアシルグリセロールリパーゼが、１ｋｇのトリアシルグリセロールリパーゼ小麦粉あたり少なくとも８０ＰＬＩ単位の量、好ましくは少なくとも１６０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも３２０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。好ましい本発明の実施態様に従って、トリアシルグリセロールリパーゼが、最大３２００ＰＬＩ／ｋｇトリアシルグリセロールリパーゼ小麦粉、好ましくは最大１６００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大８００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。トリアシルグリセロールリパーゼのＰＬＩ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００６８】
本発明に従った生地は、セルラーゼをさらに含んでなってもよい。本発明の好ましい実施態様に従って、セルラーゼが１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも２．３４ＣＸＵ単位のセルラーゼ、好ましくは少なくとも４．６８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも７．５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも９．３６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも１５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは少なくとも２３．４ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。本発明の好ましい実施態様に従って、セルラーゼが、最大３００ＣＸＵセルラーゼ／ｋｇ小麦粉の量で、好ましくは最大１５０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大９３．６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは最大７５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより、好ましくは最大４６．８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大３０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。セルラーゼのＣＸＵ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００６９】
本発明に従った生地は、アミログルコシダーゼをさらに含んでなってもよい。好ましい実施態様に従って、アミログルコシダーゼが、１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも１３０ＡＧＩ単位のアミログルコシダーゼ、好ましくは少なくとも２６０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも５２０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。本発明の好ましい実施態様に従って、アミログルコシダーゼが、最大５２００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼ、好ましくは最大２６００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大１３００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加されてもよい。アミログルコシダーゼのＡＧＩ単位での活性は、「材料および方法」で示されるようにして測定し得る。
【００７０】
好ましい実施態様では、本発明に従った生地はＳＳＬおよび／またはＣＳＬを実質的に含まず、好ましくはそれは実質的にＳＳＬ、ＣＳＬ、ＤＡＴＥＭ、ＧＳＭから選択される乳化剤を含まず、より好ましくはそれは乳化剤を含まない。一般に、通常生地中で使用されるＳＳＬおよび／またはＣＳＬの量は、生地中に存在する小麦粉を基準にして０．１〜０．５％ｗ／ｗである。本発明に従ったベーキング組成物を特に上述の量で生地に添加すると、生地中に存在する上述の量のＳＳＬまたはＣＳＬが完全に置き換えられてもよい。ＳＳＬが主にクラム軟化剤および老化防止として使用され、他の軟化システムが製パン過程で添加されない用途では、マルトース生成アミラーゼと組み合わされた本発明に従ったベーキング酵素組成物を使用して利点を達成し得て、置き換える各０．１％のＳＳＬに対し、１〜２ｐｐｍのマルトース生成アミラーゼを使用することが有用かもしれない。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、本発明に従った生地を焼くステップを含んでなるベイクド製品を調製する方法を提供する。
【００７２】
本発明はまた、本発明に従った生地焼くことで得られるベイクド製品も提供する。
【００７３】
このような生地からのベイクド製品の調製はまた、当該技術分野で良く知られており、生地を成形して造形しさらに発酵させるステップと、それに続く必要な温度とベーキング時間で焼くステップを含んでなってもよい。一実施態様では本発明は、本発明に従った生地を焼くステップを含んでなるベイクド製品を調製する方法を提供する。本発明はまた、この方法に従って得られるベイクド製品も提供する。好ましくは本発明に従ったベイクド製品はパンであり、より好ましくはベイクド製品は型焼きパン、サンドイッチパン、バンズまたはロールなどの柔らかい性質である。
【００７４】
「ベイクド製品」という用語は、本明細書で、生地から調製される柔らかいまたはサクサクした性質のどちらかのあらゆる製品と定義される。好ましくはベイクド製品は柔らかい性質であり、好ましくは型焼きパン、サンドイッチパン、バンズまたはロールなどの柔らかい性質である。白色、淡色または暗色タイプにかかわらず、有利には本発明によって製造されてもよいベイクド製品のさらなる例は、典型的にローフまたはロールの形態のパン（特に精白、全粒またはライ麦パン）、フランスパンタイプのパン、焼き菓子、クロワッサン、パスタ、麺類（茹で麺または炒め麺、揚げ麺）、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、マフィン、パンケーキ、ビスケット、クッキー、ドーナツ、ベーグル、パイ皮、蒸しパン、およびクリスプブレッドなどである。
【００７５】
本発明は、生地またはそれに由来するベイクド製品の製造において、ＳＳＬまたはＣＳＬを置き換え、好ましくはＳＳＬ、ＣＳＬ、ＤＡＴＥＭ、ＧＭＳから選択される乳化剤を置き換え、好ましくは全ての乳化剤を置き換える、本発明に従ったベーキング組成物またはプレミックスの使用をさらに提供する。
【００７６】
以下、製パン用途においてトリアシルグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する活性を有する本発明に従った脂肪分解酵素、ならびに脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明に従ったポリヌクレオチドと称される）についてさらに詳しく記載する。
【００７７】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号２のアミノ酸配列の成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重された配列；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００７８】
特に本発明は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供し、前記配列は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的である。したがって本発明は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、なおもより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％相同的なポリヌクレオチドを提供する。
【００７９】
一実施態様ではこのような単離されたポリヌクレオチドは、例えば固相合成によって合成的に、または当業者に知られているその他の方法によって得られる。
【００８０】
別の実施態様では本発明は、配列番号１に記載の脂肪分解酵素遺伝子、または活性脂肪分解酵素をなおもコードする機能的同等物を提供する。
【００８１】
好ましくは本発明に従ったポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列である。
【００８２】
本発明はまた、本発明に従ったＤＮＡを増幅するまたは検出するのに使用してもよい、本発明に従ったポリヌクレオチド配列、プライマー、プローブ、および断片を含んでなるベクターにも関する。
【００８３】
さらなる好ましい実施態様では、その中で本発明に従ったポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの制御配列と、適切な宿主細胞内でポリヌクレオチド配列が発現できるように作動的に連結するベクターが提供される。好ましくは前記適切な宿主細胞は糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種である。適切な株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）に属する。好ましくは宿主細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。
【００８４】
本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドを含有する組換え的に生成された宿主細胞にも関する。
【００８５】
本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドおよびベクターを調製する方法も提供する。
【００８６】
別の実施態様では、本発明は、その中で本発明に従ったポリヌクレオチドの発現が顕著に増大されており、または脂肪分解活性の産生レベルが顕著に改善されている組み換え宿主細胞を提供する。
【００８７】
別の実施態様では本発明は、例えば本発明に従った遺伝子の増大したコピー数を含んでなるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株のように、その中で細胞が本発明に従った機能性の脂肪分解酵素産生でき、すなわち本発明に従った脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを発現または好ましくは過剰発現できる、本発明に従った異種または相同ＤＮＡを含有する組換え的に生成された宿主細胞を提供する。
【００８８】
本発明のさらに別の態様では、脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドが提供される。本発明に従ったポリペプチドは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００８９】
一実施態様では本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの機能的同等物である脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドにも関し、それは前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的である。
【００９０】
本発明に従ったポリペプチドを含んでなる融合タンパク質もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドを製造する方法も提供する。
【００９１】
本発明はまた、本発明に従ったベーキング酵素組成物中における、本発明に従った脂肪分解酵素の使用にも関する。
【００９２】
［ポリヌクレオチド］
本発明は、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重された配列；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００９３】
一実施態様では、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有する機能的同等物を有する、脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００９４】
本発明の文脈で「成熟ポリペプチド」とは、本明細書で、翻訳と、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などのあらゆる翻訳後修飾に続くその最終形態において、脂肪分解活性を有するポリペプチドと定義される。成熟過程は、使用される特定の発現ベクター、発現宿主、および製造工程に左右されてもよい。好ましくは成熟ポリペプチドは、アミノ酸配列番号２中のアミノ酸３４〜３０４である。「成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」は、本明細書で成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と定義される。好ましくは成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド１００〜９１２である。
【００９５】
別の実施態様では本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの機能的同等物である、脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、それは前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的である。
【００９６】
本発明は、脂肪分解酵素をコードする遺伝子を構成するポリヌクレオチド配列、ならびにそのコード配列を提供する。したがって本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、または配列番号１と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物などの変異体に関する。
【００９７】
特に本発明は、好ましくはストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関し、好ましくは前記配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的である。
【００９８】
さらに具体的には、本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなり、または本質的にそれからなる単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００９９】
このような単離されたポリヌクレオチドは、当業者に知られている方法を用いた合成によって得られてもよい。
【０１００】
本明細書での用法では、「遺伝子」および「組み換え遺伝子」という用語は、例えば脂肪分解酵素などのタンパク質をコードする読み取り枠を含む、染色体ＤＮＡから単離されてもよい核酸分子を指す。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロン、および制御配列を含んでもよい。さらに遺伝子は、本明細書で定義される単離された核酸分子またはポリヌクレオチドを指す。
【０１０１】
配列番号１のヌクレオチド配列またはその機能的同等物を有する核酸分子などの本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術および本明細書で提供される配列情報を使用して単離し得る。例えばハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸配列の全部または一部を使用して、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して本発明に従った核酸分子を単離し得る（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載される）。
【０１０２】
さらに配列番号１に含有される配列情報に基づいてデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、配列番号１の全部または一部を包含する核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離し得る。
【０１０３】
本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは代案としてはゲノムＤＮＡをテンプレートとして、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローンして、ＤＮＡ配列分析によって特性解析し得る。
【０１０４】
さらに本発明に従ったヌクレオチド配列の補体に対応する、またはそれとハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは、標準合成技術によって、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して調製し得る。
【０１０５】
好ましい実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる。配列番号１の配列は、配列番号２に記載のポリペプチドと、配列番号２に記載の成熟ポリペプチドに従った脂肪分解酵素とをコードする。配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドに従った脂肪分解酵素は、Ｌ０１として示される。配列番号１に記載のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ Ｌ０１として示される。
【０１０６】
別の好ましい実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に示すヌクレオチド配列の補体である核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列の機能的同等物を含んでなる。
【０１０７】
別のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子とは、それが別のヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定した二本鎖を形成し得る程度に、別のヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
【０１０８】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド、またはその機能的同等物などの変異体をコードする、例えば生物学的に活性な断片またはドメインなどの単離された核酸分子、ならびに核酸分子増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するのに適した、本発明のポリペプチドおよびこのような核酸分子の断片をコードする核酸分子を同定するハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。
【０１０９】
「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸」は、それが由来する生物の天然ゲノム中でそれが隣接するコード配列（片方は５’末端もう一方は３’末端）のどちらにも隣接しないＤＮＡまたはＲＮＡである。したがって一実施態様では、単離された核酸は、コード配列に隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部または全部を含む。したがってこの用語は、例えばベクターに、自己複製プラスミドまたはウィルスに、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組み換えＤＮＡ、またはその他の配列から独立して別個の分子として存在する組み換えＤＮＡ（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を含む。それはまた、実質的に細胞物質、ウィルス性物質、または培養液（組み換えＤＮＡ技術によって生成される場合）、または化学前駆体またはその他の化学物質（化学的に合成される場合）を含まない、追加的ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡも含む。さらに「単離された核酸断片」は、断片として天然に存在せず、自然状態では見られない核酸断片である。
【０１１０】
本明細書での用法では、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）と、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）と、ヌクレオチド類似体を使用して作成されるＤＮＡまたはＲＮＡ類似体とを含むことが意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。このようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば改変された塩基対合能力または増大したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製し得る。
【０１１１】
別の本発明の実施態様は、例えば本発明に従った核酸分子のコード鎖など、本発明に従った核酸分子のアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。
【０１１２】
本発明に従ったポリヌクレオチドの補体鎖もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１３】
［核酸断片、プローブ、およびプライマー］
本発明に従った核酸分子は、例えばプローブまたはプライマーとして使用し得る断片、または本発明に従ったタンパク質の一部をコードする断片など、配列番号１に記載の核酸配列の一部または断片のみを含んでなってもよい。本発明に従ったヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のタンパク質と少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有する、本発明に従ったタンパク質の機能的同等物の同定および／またはクローニングで使用するためにデザインされたプローブおよびプライマーを作成できるようにする。プローブ／プライマーは、典型的に好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本発明に従ったヌクレオチド配列の少なくとも約１２または１５、好ましくは約１８または２０、好ましくは約２２または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５個以上の連続的ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでなる、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１１４】
本発明に従ったヌクレオチド配列に基づく、より好ましくは配列番号１に基づくプローブを使用して、例えば生物中で、転写物、またはそれをコードするゲノム配列、または相同タンパク質を検出し得る。好ましい実施態様では、プローブはそれに付着する標識グループをさらに含んでなり、例えば標識グループは、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子であり得る。このようなプローブはまた、本発明に従ったタンパク質を発現する細胞を同定する診断試験キットの一部としても使用し得る。
【０１１５】
［同一性および相同性］
「相同性」または「％同一性」は、本明細書で同義的に使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の％相同性を判定するために、配列は最適比較目的で配置合わせされると定義される。２配列間の位置合わせを最適化するために、比較される２配列のいずれかにギャップを導入してもよい。このような位置合わせは、比較される配列全長にわたって実施し得る。代案としては、位置合わせは、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／塩基またはアミノ酸などのより短い長さにわたって実施されてもよい。同一性は、報告された配列比較領域にわたる、２つの配列間の完全一致の百分率である。
【０１１６】
配列比較および２配列間の％同一性判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。当業者は、２配列の配列比較および２配列間の相同性判定のために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用できるという事実を知っている（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｉｎ Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、２配列間の配列比較のためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して判定されてもよい（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列のどちらも、アルゴリズムによって配列比較され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥで実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６-２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列では、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列では、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメーターは、ｇａｐ−ｏｐｅｎペナルティ１０およびｇａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎペナルティ０．５である。当業者は、これらの全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２配列の全体的同一性百分率は、異なるアルゴリズムを使用した場合に顕著に変化しないことを理解するであろう。
【０１１７】
上述のようなプログラムＮＥＥＤＬＥによる配列比較後、クエリー配列と本発明の配列間の同一性百分率は、次のように計算される。配列比較中のギャップ総数を減じた後に、双方の配列中の同一アミノ酸または同一ヌクレオチドを示す配列比較中の対応する位置の数を配列比較の全長で除する。同一性は本明細書で、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから入手し得ると定義され、プログラムの出力中で「最長同一性」と標識される。
【０１１８】
本発明の核酸およびタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として使用して公共データベースに対する検索を実施し、例えばその他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２を用いて実施され、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３を用いて実施され、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得る。比較目的で、ギャップド配列比較を得るためにＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるようなギャップドＢＬＡＳＴを利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。
【０１１９】
［ハイブリダイゼーション］
本明細書での用法では、「ハイブリダイズする」という用語は、その下で互いに少なくとも約６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同的なヌクレオチド配列が、典型的に互いの補体にハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件について記載することが意図される。
【０１２０】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的例は、６x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのハイブリダイゼーション後、１xＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃、好ましくは５５℃、好ましくは６０℃、なおもより好ましくは６５℃で１回以上の洗浄である。
【０１２１】
高度にストリンジェントな条件としては、例えば６８℃で５xＳＳＣ／５xデンハルト液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイズ、および室温で０．２xＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄が挙げられる。代案としては、洗浄は４２℃で実施されてもよい。
【０１２２】
当業者は、ストリンジェントおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に、どの条件を当てはめるかを知るであろう。このような条件に関する追加的ガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）にあり、当該技術分野で容易に入手できる。
【０１２３】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）のみ、またはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチのみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含有するあらゆる核酸分子またはその補体（例えば事実上あらゆる二本鎖ｃＤＮＡクローン）とハイブリダイズするので、このようなポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズさせるのに使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【０１２４】
［別の生物から全長ＤＮＡを得る］
典型的なアプローチでは、別の生物からｃＤＮＡライブラリーが構築され、例えば特にフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種からの糸状菌をスクリーニングし得る。
【０１２５】
例えばノーザンブロット法分析によって、配列番号１に関して相同的なポリヌクレオチドについてフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株をスクリーニングし得る。本発明に従ったポリヌクレオチドと相同的な転写物が検出されたら、当業者に良く知られている標準技術を使用して、適切な株から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築し得る。代案としては、本発明に従ったポリヌクレオチドとハイブリダイズできるプローブを使用して、全ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。
【０１２６】
相同遺伝子配列は、例えば本明細書で教示されるヌクレオチド配列に基づいてデザインされた２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用して、ＰＣＲを実施することによって単離し得る。
【０１２７】
反応のためのテンプレートは、本発明に従ったポリヌクレオチドを発現することが知られている、または疑われる株から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであり得る。ＰＣＲ産物をサブクローンして配列決定し、増幅された配列が本発明に従った新しい核酸配列、またはその機能的同等物の配列に相当することを確証し得る。
【０１２８】
次にＰＣＲ断片を使用して、多様な既知の方法によって全長ｃＤＮＡクローンを単離し得る。例えば増幅された断片を標識して使用し、バクテリオファージまたはコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。代案としては、標識断片を使用してゲノムライブラリをスクリーニングし得る。
【０１２９】
ＰＣＲ技術はまた、別の生物からの全長ｃＤＮＡ配列を単離するのにも使用し得る。例えば標準操作手順に続いて、適切な細胞または組織原料からＲＮＡが単離され得る。第一鎖合成のプライミングのために、増幅された断片のほとんどの５’末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、逆転写反応をＲＮＡ上で実施し得る。
【０１３０】
次に標準末端トランスフェラーゼ反応を使用して、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに（例えばグアニンで）「ｔａｉｌ付加」し得て、ハイブリッドをＲＮａｓｅ Ｈで消化し得て、次に第二鎖合成を（例えばポリ−Ｃプライマーによって）プライムし得る。したがって増幅された断片の上流のｃＤＮＡ配列は、容易に単離し得る。有用なクローニング戦略のレビューについては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前出；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出を参照されたい。
【０１３１】
［ベクター］
本発明の別の態様は、脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードする本発明に従ったポリヌクレオチド配列を含んでなる、クローニングおよび発現ベクターをはじめとするベクター、または本発明に従ったその機能的同等物に関する。本発明はまた、例えば本発明のポリペプチドの発現が起きる条件下で、このようなベクターを適切な宿主細胞内で成長させ、それに形質転換または形質移入する方法に関する。本明細書での用法では、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばクローニングまたは発現ベクターなどの組み換え複製可能なベクター中に組込み得る。ベクターを使用して、適合性宿主細胞内で核酸を複製してもよい。したがって本発明のさらなる実施態様は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合性宿主細胞に導入して、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を成長させることで、本発明のポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。適切な宿主細胞については下で述べる。
【０１３３】
その中に発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、好都合には組み換えＤＮＡ処置の対象であってもよいあらゆるベクターであってもよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。
【０１３４】
本発明に従ったベクターは、自己複製ベクター、すなわち例えばプラスミドなど、その複製が染色体の複製から独立している染色体外の実体として存在するベクターであってもよい。代案としてはベクターは、宿主細胞に導入され、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【０１３５】
ベクターの１タイプは「プラスミド」であり、それはその中に追加的ＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウィルスベクターであり、その中ではウィルス性ゲノムに追加的ＤＮＡセグメントをライゲートし得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製できる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに特定のベクターは、それらが作動可能なように結合する遺伝子に対して発現を誘導できる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。一般に組み換えＤＮＡ技術中で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは通常ベクターの形態で使用されることから、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で同義的に使用され得る。しかし本発明は、同等機能を果たすコスミド、ウィルスベクター（例えば複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルス）、およびファージベクターなどの別の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【０１３６】
本発明に従ったベクターは、例えばＲＮＡ生成のために生体外で使用してもよく、または宿主細胞を形質転換するために使用してもよい。
【０１３７】
本発明のベクターは、例えば過剰発現のために、２つ以上の、例えば３、４または５つの本発明のポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
【０１３８】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞内における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでなり、それは組み換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を含み、それが発現される核酸配列と作動的に連結することを意味する。
【０１３９】
組み換え発現ベクター内で「作動的に連結する」とは、関心のあるヌクレオチド配列が（例えば生体外転写／翻訳系で、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞内で）、ヌクレオチド配列を発現できるような様式で制御配列に結合していることを意味することが意図され、すなわち「作動的に連結する」という用語は、記載される構成要素がそれらの意図される様式で機能できるような関係にある並置を指す。コード配列と「作動的に連結する」プロモーター、エンハンサーまたはその他の発現調節シグナルなどの制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような様式で配置され、または配列は、それらの意図される目的のために協力して機能するように配列され、例えば転写はプロモーターで開始して、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通じて進行する。
【０１４０】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような制御配列については、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。
【０１４１】
制御配列という用語は、各種宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導する配列と、特定の宿主細胞（例えば組織特異的制御配列）中でのみヌクレオチド配列の発現を誘導する配列を含む。
【０１４２】
したがって所定の宿主細胞のためのベクターまたは発現コンストラクトは、第１の発明のポリペプチドをコードする配列のコード鎖に対して、５’末端から３’末端への連続した順序で互いに作動的に連結する以下の要素を含んでなってもよい。（１）特定の宿主細胞中でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を誘導できるプロモーター配列；（２）任意に培地内に特定の宿主細胞からのポリペプチド分泌を誘導できるシグナル配列；（３）本発明に従った脂肪分解活性を有する成熟した好ましくは活性形態のポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ配列；および好ましくはまた（４）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列下流の転写を終結できる転写終結領域（ターミネーター）。
【０１４３】
本発明に従ったヌクレオチド配列の下流には、１つ以上の転写終結部位（すなわちターミネーター）を含有する３’非翻訳領域があってもよい。ターミネーターの起源はそれほど重要でない。ターミネーターは、例えばポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に天然であり得る。しかし好ましくは酵母宿主細胞中では酵母ターミネーターが、糸状菌宿主細胞中では糸状菌ターミネーターが使用される。より好ましくはターミネーターは、（その中でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される）宿主細胞に内在性である。転写された領域中では、翻訳のためのリボソーム結合部位が存在してもよい。コンストラクトによって発現される成熟転写物のコーディング部分は、先頭に翻訳開始ＡＵＧを含み、終止コドンが翻訳されるポリペプチドの終わりに適切に配置される。
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチドの増強された発現は、発現宿主からの関心のあるタンパク質の発現と、所望ならば分泌レベルを増大させ、および／または本発明のポリペプチド発現の誘導性制御を提供する役割を果たしてもよい異種性調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダーおよび／またはターミネーター領域などの選択によって達成されてもよい。
【０１４５】
発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどのような要素に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され得て、それによって本明細書に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば本発明に従った脂肪分解活性を有するポリペプチド、ポリペプチド突然変異型、断片、変異体またはその機能的同等物、融合タンパク質など）が生成される。
【０１４６】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核生物または真核細胞中における本発明に従ったポリペプチドの発現のためにデザインし得る。例えば本発明に従ったポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および桿菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用）、真菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞中で生成され得る。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）でさらに詳しく考察される。代案としては、組み換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、生体外で転写され翻訳され得る。
【０１４７】
ほとんどの糸状菌および酵母では、安定した形質転換体を得るために、好ましくはベクターまたは発現コンストラクトは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。しかし特定の酵母では、安定した高レベル発現のためにその中に発現コンストラクトを組込み得る適切なエピソームベクターもまた利用でき、その例としては、それぞれサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の２μおよびｐＫＤ１プラスミドに由来するベクター、またはＡＭＡ配列（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのＡＭＡ１）を含有するベクターが挙げられる。発現コンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合、コンストラクトは、ゲノム中の無作為な遺伝子座に組み込まれるか、または相同的組換えを使用して所定の標的遺伝子座に組み込まれるかのどちらかであり、その場合、標的遺伝子座は好ましくは高度に発現される遺伝子を含んでなる。
【０１４８】
したがって本発明で有用な発現ベクターとしては、例えば細菌プラスミドと、バクテリオファージと、酵母エピソームと、酵母染色体要素と、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、およびレトロウィルスなどのウィルスに由来するベクターなどの染色体由来、エピソーム由来、およびウィルス由来ベクター、そしてコスミドやファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどのそれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。
【０１４９】
ヌクレオチド挿入断片は、適切なプロモーターと作動可能に結合しなくてはならない。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に天然のプロモーターの他に、別のプロモーターを使用して本発明のポリペプチドの発現を誘導してもよい。プロモーターは、所望の発現宿主中で本発明のポリペプチドの発現を誘導するその効率について選択されてもよい。本発明で有用かもしれないプロモーターの例としては、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、およびレトロウィルスＬＴＲプロモーターが挙げられる。その他の適切なプロモーターについては、当業者に知られている。特定の実施態様では、真菌または酵母中で本発明に従ったポリペプチドの高度発現レベルを誘導できるプロモーターが好ましい。このようなプロモーターは当該技術分野で知られている。
【０１５０】
本発明の宿主細胞中で転写を誘導できる、多様なプロモーターを使用し得る。好ましくはプロモーター配列は、高度に発現される遺伝子に由来する。それからプロモーターが好ましくは由来し、および／または発現コンストラクトの組み込みのために好ましい所定の標的遺伝子座にそれが含まれる、好ましい高度に発現される遺伝子の例としては、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫまたはＰＫＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）などの解糖作用酵素をコードする遺伝子、ならびにアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルコール（メタノール）オキシダーゼ、延長因子、およびリボソームタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な高度に発現される遺伝子の特定例としては、例えばクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種からのＬＡＣ４遺伝子、それぞれハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）からのメタノールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸおよびＭＯＸ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）からのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、およびＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１５１】
真菌発現宿主中で使用するのに好ましい強力な構成的および／または誘導性プロモーターの例は、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子からのＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）プロモーターの真菌遺伝子から得られるものである。
【０１５２】
強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものである。
【０１５３】
強力な細菌プロモーターの例は、αアミラーゼおよびＳＰｏ２プロモーター、ならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターである。
【０１５４】
植物細胞に適したプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、リブロース小サブユニット（ｒｕｂｉｓｃｏ ｓｓｕ）、ヒストン、イネアクチン、ファゼオリン、カリフラワーモザイクウィルス（ＣＭＶ）３５Ｓおよび１９Ｓ、およびサーコウィルスプロモーターが挙げられる。
【０１５５】
上述のプロモーターは全て当該技術分野で容易に入手できる。
【０１５６】
ベクターは、ポリヌクレオチドの側面にあって、真核生物ゲノム配列またはウィルスゲノム配列に相同的な配列を含んでなるＲＮＡを生じる配列をさらに含んでもよい。これは宿主細胞ゲノムへの本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。
【０１５７】
ベクターは、アンチセンス方向に配向する本発明のポリヌクレオチドを含有して、アンチセンスＲＮＡ生成を提供してもよい。
【０１５８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を通じて原核生物または真核細胞中に導入され得る。本明細書での用法では、「形質転換」および「形質移入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質移入、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン性脂質媒介形質移入または電気穿孔をはじめとする、外来性核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当業者に認識された多様な技術を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換するまたは形質移入する適切な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ， １９８９），Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、およびその他の実験手引き書に記載される。
【０１５９】
哺乳類細胞の安定した形質移入のためには、使用される発現ベクターおよび形質移入技術次第で、細胞のほんの一部のみが、それらのゲノムに外来性ＤＮＡを組み込むかもしれないことが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するために、一般に、関心のある遺伝子と共に、選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子が宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、薬剤耐性をもたらすものまたは宿主細胞中の欠陥を補うものが挙げられるが、これに限定されるものではない。それらとしては、例えばほとんどの糸状菌および酵母の形質転換のために使用し得る、アセトアミダーゼ遺伝子またはｃＤＮＡ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）からのａｍｄＳ、ｎｉａＤ、ｆａｃＡ遺伝子またはｃＤＮＡ）、またはＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキサート、フレオマイシンまたはベノミル耐性（ｂｅｎＡ）などの抗生物質耐性を提供する遺伝子などの用途の広いマーカー遺伝子が挙げられる。代案としては、例えばＵＲＡ３（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのまたはその他の酵母からの類似遺伝子）、ｐｙｒＧまたはｐｙｒＡ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から）、ａｒｇＢ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から）またはｔｒｐＣなど、対応する変異体宿主株を必要とする栄養要求性マーカーなどの特異的選択マーカーを使用し得る。好ましい実施態様では、選択マーカー遺伝子を含まないポリペプチドを生成できる形質転換宿主細胞を得るように、発現コンストラクトの導入後に選択マーカーを形質転換宿主細胞から除去する。
【０１６０】
その他のマーカーとしては、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸塩含有カルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、細菌Ｇ４１８耐性遺伝子（これはまた酵母で使用してもよいが真菌では使用できない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ネオマイシン耐性遺伝子（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子が挙げられる。ベクターは例えばＲＮＡを生成するために生体外で使用してもよく、または宿主細胞を形質移入または形質転換するために使用してもよい。
【０１６１】
原核生物中のタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のどちらかを発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施されることが多い。融合ベクターは、例えば組み換えタンパク質のアミノ末端など、その中でコードされるタンパク質にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的に３つの目的の役割を果たす。１）組み換えタンパク質の発現を増大させる；２）組み換えタンパク質の溶解度を増大させる；３）親和性精製中でリガンドとして機能することで組み換えタンパク質の精製を助ける。融合発現ベクター中では、融合タンパク質の精製に引き続いて、組み換えタンパク質を融合部分から分離できるように、融合部分と組み換えタンパク質の接合部にタンパク質分解切断部位が導入されることが多い。
【０１６２】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは選択可能なマーカーを含有する。このようなマーカーとしては、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌の培養では、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、および特定のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などの細菌細胞；例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）やコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）やＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、そして例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）などのクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）および／または例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピチア（Ｐｕｃｈｉａ）のような酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫などの動物細胞；および植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培地および条件については、当該技術分野で知られている。
【０１６３】
細菌中で使用するのに好ましいベクターは、例えば本明細書に参照として援用する国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレットで開示される。その他の適切なベクターについては、当業者には容易に分かる。
【０１６４】
本発明で使用するのに適した既知の細菌プロモーターとしては、本明細書に参照として援用する国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレットで開示されるプロモーターが挙げられる。
【０１６５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中へのエンハンサー配列の挿入によって増大されてもよい。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用エレメントであり、それは特定の宿主細胞タイプでプロモーターの転写活性を増大させるように機能する。エンハンサーの例としては、複製起点後期側のｂｐ１００〜２７０に位置するＳＶ４０エンハンサーと、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサーと、複製起点後期側にあるポリオーマエンハンサーと、アデノウィルスエンハンサーとが挙げられる。
【０１６６】
小胞体内腔、細胞膜周辺腔、または細胞外環境への翻訳タンパク質分泌のために、発現される遺伝子に適切な分泌シグナルを組み込んでもよい。シグナルはポリペプチドに内在性であってもよく、またはそれらは異種性シグナルであってもよい。
【０１６７】
本発明に従ったポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾形態で生成されてもよく、分泌シグナルだけでなく追加的な異種性機能的領域もまた含んでもよい。したがって例えば、追加的なアミノ酸、特に荷電アミノ酸領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中または引き続く取り扱いと保存中に、宿主細胞中における安定性および持続性を改善してもよい。またポリペプチドにペプチド部分を付加して、精製を容易にしてもよい。
【０１６８】
［発明に従ったポリペプチド］
本発明は、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するまたはその機能的同等物；
（ｂ）本発明に従ったポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドを提供する。
【０１６９】
したがって本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドを含んでなり、好ましくは配列番号２のアミノ酸３４〜３０４を含んでなる脂肪分解活性を有する単離ポリペプチド、および適切な宿主中で配列番号１のポリヌクレオチドを発現することで得られるアミノ酸配列を提供する。また機能的同等物であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％相同的である、ペプチドまたはポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１７０】
別の実施態様では本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと機能的同等物である脂肪分解活性を有する単離ポリペプチドにも関し、それは前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的である。
【０１７１】
上記ポリペプチドは、「本発明に従ったポリペプチド」という用語に集合的に含まれる。
【０１７２】
「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、（一般に認識されるように）同義と見なされ、各用語はペプチジル結合でカップリングされた少なくとも２つのアミノ酸鎖を示すために文脈に応じて同義的に使用し得る。「ポリペプチド」（またはタンパク質）という用語は、本明細書で７個を超えるアミノ酸残基を含有する鎖について使用される。全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの化学式または配列は、本明細書ではアミノ末端からカルボキシ末端に向けて左から右に記述される。本明細書で使用されるアミノ酸の一文字コードは、一般に当該技術分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）にある。
【０１７３】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質であることが意図される。例えば宿主細胞中で生成された組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的のために単離されたと見なされ、例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）で開示されるシングルステップ純化法などのあらゆる適切な技術によって実質的に精製された、天然または組み換えポリペプチドについても同様である。
【０１７４】
当業者には知られているように、成熟中のプロセッシングエラーのために、配列番号２のＮ末端、または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドのＮ末端は不均一かもしれず、ならびに配列番号２のＣ末端または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドのＣ末端についても同様である。特にこのようなプロセッシングエラーは、ポリペプチドの過剰発現に際して起きるかもしれない。さらにエキソプロテアーゼ活性は、不均一性を引き起こすかもしれない。不均一性が起きる程度は、使用される宿主および発酵プロトコルにもまた左右される。このようなＣ末端プロセッシングアーチファクトは、配列番号２で、または配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドで示されるように、より短いポリペプチドまたはより長いポリペプチドをもたらすかもしれない。このようなエラーの結果として、Ｎ末端もまた不均一かもしれない。
【０１７５】
さらなる実施態様では、本発明は、配列番号２に記載のポリペプチドの少なくとも１つの機能ドメインをコードする、または追加的残基を含有して、位置１、または２、または３などで開始する、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドの少なくとも１つの機能ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。代案としては、それは特定の残基を欠如しており、結果として位置２、または３、または４などで開始するかもしれない。また追加的残基が、例えば位置３４７、３４８などのＣ末端に存在してもよい。代案としては、Ｃ末端には特定の残基が欠如しており、結果として位置３４５または３４４で終わるかもしれない。
【０１７６】
本発明に従った脂肪分解酵素は、当該技術分野で知られている方法によって組み換え細胞培養物から回収して精製し得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ ｂｙ Ｐａｕｌ Ｃｕｔｌｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４）。
【０１７７】
本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学合成手順の産物、および例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞をはじめとする原核生物または真核生物の宿主から組み換え技術によって生成された産物を含む。組み換え生産手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されなくてもよい。さらに本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、修飾された開始メチオニン残基もまた含む。
【０１７８】
［ポリペプチド断片］
本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドの生物学的活性断片を特徴とする。
【０１７９】
本発明のポリペプチドの生物学的活性断片は、本発明に従ったタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であり、またはそれに由来する、アミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（例えば配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチド）を含み、それは全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示し、好ましくはそれは脂肪分解活性を示す。典型的に、生物学的活性断片は、本発明に従ったタンパク質の少なくとも１つの活性があるドメインまたはモチーフを含んでなる。本発明のタンパク質の生物学的活性断片は、例えば長さが配列番号２に記載の成熟ポリペプチドよりも５、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸以上短く、配列番号２に記載の成熟ポリペプチドと少なくとも６０、７０、８０または９０％の相同性を有するポリペプチドであり得る。さらに組み換え技術によって、その中でタンパク質の別の領域が消去された別の生物学的活性部分を調製し、天然形態の本発明のポリペプチドの生物学的活性の１つ以上について評価し得る。
【０１８０】
本発明はまた、本発明に従ったタンパク質の上記生物学的活性断片をコードする、核酸断片を特徴とする。
【０１８１】
［融合タンパク質］
本発明に従ったポリペプチド、または例えばその生物学的活性部分などのその機能的同等物は、本発明に従わないポリペプチド（例えば異種性アミノ酸配列）と作動的に連結して、融合タンパク質を形成し得る。「本発明に従わないポリペプチド」とは、本発明に従ったタンパク質と実質的に相同的でないタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。このような「本発明に従わないポリペプチド」は、同一または異なる生物に由来し得る。融合タンパク質内で、本発明に従ったポリペプチドは、本発明に従った脂肪分解酵素の全部または生物学的活性断片に相当し得る。好ましい実施態様では、融合タンパク質は、本発明に従ったタンパク質の少なくとも２つの生物学的活性部分を含んでなる。融合タンパク質内で「作動的に連結する」という用語は、本発明に従ったポリペプチドと本発明に従わないポリペプチドとが、互いにフレーム内融合していることを示すことが意図される。本発明に従わないポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１８２】
例えば一実施態様では、融合タンパク質は、その中でアミノ酸配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合している融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、本発明に従った組み換えタンパク質の精製を促進し得る。別の実施態様では、本発明に従った融合タンパク質は、そのＮ末端に異種性シグナル配列を含有するタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば哺乳類および酵母宿主細胞）中では、本発明に従ったタンパク質の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用を通じて増大させ得る。
【０１８３】
別の例では、異種性シグナル配列として、バキュロウィルス外被タンパク質のｇｐ６７分泌配列を使用し得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２）。真核生物の異種性シグナル配列の別の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌配列が挙げられる（カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ；）。さらに別の例では、有用な真核異種性シグナル配列としては、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびタンパク質Ａ分泌シグナル（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）のＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１８４】
シグナル配列を使用して、本発明のタンパク質またはポリペプチドの分泌および単離を促進し得る。シグナル配列は、典型的に疎水性アミノ酸コアによって特徴付けられ、それは一般に分泌中に１つ以上の切断事象において成熟タンパク質から切断される。このようなシグナルペプチドは、それらが分泌経路を通過する間に、成熟タンパク質からシグナル配列を切断できるようにするプロセッシング部位を含有する。シグナル配列は、その中に発現ベクターが形質転換された真核生物の宿主などからのタンパク質の分泌を誘導し、シグナル配列は引き続いてまたは同時に切断される。次にタンパク質は、既知の方法によって細胞外培地から容易に精製され得る。代案としては、ＧＳＴドメインなどの配列を使用してシグナル配列を関心のあるタンパク質に結合させ得て、それは精製を容易にする。したがって例えばペプチドをコードする配列などのマーカー配列に、ポリペプチドをコードする配列を融合させてもよく、それは融合ポリペプチドの精製を容易にする。本発明のこの態様の特定の好ましい実施態様では、マーカー配列は特にｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で提供されるｔａｇなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販される。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えばヘキサヒスチジンが融合タンパク質の都合よい精製を提供する。ＨＡ ｔａｇは精製のために有用な別のペプチドであり、それはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当し、それについては例えばＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載される。
【０１８５】
好ましくは、本発明に従った融合タンパク質は、標準組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えばライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いて、従来の技術に従って、例えば異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を共にインフレームでライゲーションする。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動化されたＤＮＡ合成機をはじめとする従来の技術によって合成し得る。代案としては、２つの連続的遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施し得て、それを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を作成し得る（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。さらに融合部分をあらかじめコードする多数の発現ベクターが市販される（例えばＧＳＴポリペプチド）。本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明に従ったタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローンし得る。
【０１８６】
［機能的同等物］
「機能的同等物」および「機能的変異体」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【０１８７】
本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有して、本発明に従った脂肪分解酵素の少なくとも特定の機能を示すポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、好ましくは脂肪分解活性を有するポリペプチドである。好ましくは本発明に従った脂肪分解酵素または脂肪分解活性を有するポリペプチドは、製パン用途において、例えば生地条件下で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を有する。本発明に従ったポリペプチドの機能的同等物は、配列番号２のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドであり、それは本発明に従った脂肪分解酵素の少なくとも１つの機能を示し、好ましくはそれは脂肪分解活性を示し、より好ましくはそれは製パン用途において、例えば生地条件下で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を示す。言及される機能的同等物はまた、上述のような脂肪分解活性を有する生物学的活性断片もまた包含する。
【０１８８】
本発明に従ったポリペプチドの機能的同等物は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換、または酵素の特定の機能性に影響を及ぼさないアミノ酸の置換、挿入または欠失を含有してもよい。したがって機能的中立アミノ酸置換は、その特定の機能性を実質的に改変しない、配列番号２に記載のアミノ酸配列の成熟ポリペプチド中の置換である。例えば本発明のタンパク質中で保存されるアミノ酸残基は、特に改変を容易に受け入れないことが予測される。さらに本発明に従ったタンパク質およびその他の脂肪分解酵素の中で保存されるアミノ酸は、改変を容易に受け入れない可能性が高い。
【０１８９】
本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、典型的にサイレント突然変異、またはコードされるポリペプチドの生物学的機能を改変しない突然変異を含有してもよい。したがって本発明は、特定の生物学的活性に必須でないアミノ酸残基の変更を含有する、本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。このようなタンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるが、なおもその少なくとも１つの生物学的活性を保ち、好ましくはそれらは脂肪分解活性を保つ。一実施態様では、本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、本発明に従ったポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドと実質的に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％相同的で、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的なアミノ酸配列を含んでなる。一実施態様では、それと少なくとも９０％の相同性を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドの機能的同等物は、配列番号４に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドであり（以下、Ｌ０２で示す）、別の実施態様では、それは配列番号６に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドであり（以下、Ｌ０３で示す）、さらに別の実施態様では、それは配列番号８に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドである（以下、Ｌ０４で示す）。好ましい実施態様では、配列番号４に記載のアミノ酸、配列番号６または配列番号８にそれぞれ由来する成熟ポリペプチドは、配列番号４、配列番号６または配列番号８にそれぞれ記載のアミノ酸中のアミノ酸配列３４〜３０４である。
【０１９０】
本発明に従ったポリペプチドをコードする本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１９１】
一実施態様では、それと少なくとも９０％の相同性を有する、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり（ＤＮＡ Ｌ０２で示す）、別の実施態様ではそれは配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり（ＤＮＡ Ｌ０３で示す）、さらに別の実施態様ではそれは配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである（ＤＮＡ Ｌ０４で示す）。配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列は配列番号４に記載のポリペプチドをコードし、配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列は、配列番号６に記載のポリペプチドをコードし、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のポリペプチドをコードする。好ましい実施態様では、配列番号３、５、７に記載のポリヌクレオチド１００〜９１２は、それぞれ配列番号４、６、８に記載の成熟ポリペプチドをコードする。
【０１９２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドに相同的なタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、コードされるタンパク質中に１つ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入が導入されるように、配列番号１に記載のコードヌクレオチド配列中に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することで作り出し得る。このような突然変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準技術によって導入されてもよい。
【０１９３】
脂肪分解活性を有するその他のファミリーメンバーをコードし、したがって配列番号１、３、５、７とは異なるヌクレオチド配列を有し、上述の条件を満たす核酸は、本発明の範囲内である。さらに脂肪分解活性を有するタンパク質をコードして、配列番号２、４、６、８のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有し、上述の条件を満たす核酸は、本発明の範囲内である。
【０１９４】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、好ましくは国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載される方法に従ってそれらのコドン使用が最適化されてもよい。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドンペア最適化に対処する。コドンペア最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、コドン使用頻度、特に使用されるそれらのコドンペアに関して修正され、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改善された発現、および／またはコードされるポリペプチドの改善された生成が得られる方法である。コドンペアは、コード配列中の２つの続く三つ組（コドン）と定義される。
【０１９５】
本発明に従ったポリヌクレオチドの変異体（例えば天然の対立遺伝子変異体）および相同体に相当する核酸分子は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼーション技術に従って、本明細書で開示されるｃＤＮＡまたはその適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書で開示される核酸とのそれらの相同性に基づいて単離され得る。
【０１９６】
本発明の別の態様では、改善されたタンパク質が提供される。改善されたタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性と比較すれば、少なくとも１つの生物学的活性が改善されたタンパク質である。このようなタンパク質は、飽和変異誘発などによって、配列番号１のコード配列の全部または一部に沿って突然変異を無作為に導入することで得られてもよく、得られた突然変異体を組み換え的に発現させて生物学的活性についてスクリーニングし得る。例えば脂肪分解酵素の酵素活性を測定するための標準アッセイ、ひいては改善されたタンパク質を提供する技術は、容易に選択される。
【０１９７】
好ましい実施態様では、本発明に従ったポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸３４〜３０４に従ったアミノ酸配列を有する。別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと少なくとも９０％相同的であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保ち、好ましくはそれは脂肪分解活性を保ち、より好ましくは製パン用途において、例えば生地状態でトリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を保ちながら、上述のような自然変動または変異誘発のためになおもアミノ酸配列が異なる。
【０１９８】
さらなる好ましい実施態様では、本発明に従ったタンパク質は、配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸断片によってコードされるアミノ酸配列を有し、前記ヌクレオチド配列は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である。
【０１９９】
したがって本発明に従ったタンパク質は、好ましくは配列番号２に記載の２アミノ酸配列に由来する成熟ポリペプチドと、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドの少なくとも１つの機能活性を保つアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、好ましくはそれは脂肪分解活性を保ち、より好ましくは、製パン用途において例えば生地状態で、トリグリセリド、リン脂質、およびガラクト脂質に対する脂肪分解活性を保つ。
【０２００】
本発明に従ったタンパク質の機能的同等物はまた、例えば脂肪分解酵素活性について、本発明のタンパク質の変異体、例えばトランケーション変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることで同定し得る。一実施態様では、変異体の多様化ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作成される。変異体の多様化ライブラリーは、例えば可能なタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、または代案としては（例えばファージディスプレイのために）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲートして遺伝子配列にすることで生成し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から、本発明のポリペプチドの可能な変異体ライブラリーを生成するために使用し得る多様な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法については、当該技術分野で知られている（例えばＮａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。
【０２０１】
さらに引き続く変異体選択をスクリーニングするために、本発明のポリペプチドコード配列断片のライブラリーを使用して、ポリペプチド多様化集団を作成し得る。例えば分子あたりほぼ１回だけニッキングが起きる条件下において、関心のあるコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼ処理して二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニック生成物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖のＤＮＡを形成させて、Ｓ１ヌクレアーゼ処理によって再編成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーをライゲートして発現ベクターにすることで、コード配列断片のライブラリーを作成し得る。この方法によって、様々なサイズの関心のあるタンパク質のＮ末端および内部断片をコードする、発現ライブラリーを誘導し得る。
【０２０２】
トランケーションの点突然変異によって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、そして選択される特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該技術分野で知られている。より大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析にふさわしい最も広く使用されている技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングするステップと、適切な細胞を得られたベクターライブラリーで形質転換するステップと、所望の活性の検出が、その生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現するステップを含む。ライブラリー中機能性変異体の頻度を向上させる技術である再帰アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、本発明のタンパク質の変異体を同定し得る（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【０２０３】
本発明に従ったポリヌクレオチドの断片はまた、機能性ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のためのプローブまたはプライマーとして機能してもよい。
【０２０４】
本発明に従った核酸は、それらが機能性または非機能性ポリペプチドをコードするかどうかに関わりなく、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用し得る。本発明に従った脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としては、（１）タンパク質をコードする遺伝子、またはその対立遺伝子変異体をｃＤＮＡライブラリーから単離する；（２）Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体スプレッドのための原位置ハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）；（３）特定組織および／または細胞中でｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット法分析、および４）特定の生物学的（例えば組織）サンプル中で、プローブとハイブリッドできる核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用し得るプローブおよびプライマーが挙げられる。
【０２０５】
本発明に従った遺伝子の機能的同等物を得る方法もまた、本発明に包含される。このような方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列がある成熟ポリペプチドに従ったタンパク質配列、またはそれらのいずれかの変異体の全部または一部をコードする単離された核酸を含む標識されたプローブを得るステップと；プローブがライブラリー中の核酸断片にハイブリダイゼーションできるようにする条件下で、核酸断片ライブラリーを標識プローブでスクリーニングすることにより、核酸二本鎖を形成して、あらゆる標識二本鎖中の核酸断片から全長遺伝子配列を調製して、本発明に従った遺伝子に関連した遺伝子を得るステップを要する。
【０２０６】
［宿主細胞］
別の実施態様では、本発明は、例えば本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなる、または本発明に従ったベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞または組み換え宿主細胞などの細胞を特徴とする。
【０２０７】
「形質転換細胞」または「組み換え細胞」は、組み換えＤＮＡ技術の手段によって、その中に（またはその祖先中に）本発明に従った核酸が導入された細胞である。例えば細菌、真菌、酵母などの原核細胞と真核細胞の双方が含まれる。宿主細胞としてはまた、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および脈絡叢細胞系などの哺乳類細胞系が挙げられるが、これに限定されるものではない。哺乳類細胞の安定した形質移入に適したいくつかのベクターは、一般に入手でき、のような細胞系を構築する方法もまた、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）などのように一般に知られている。特に好ましいのは、糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からの細胞である。
【０２０８】
挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を特有の所望の様式で修飾して加工する宿主細胞を選択し得る。このようなタンパク質生成物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の最適機能化を促進してもよい。
【０２０９】
様々な宿主細胞が、タンパク質と遺伝子産物の翻訳後プロセシングと修飾のための特徴的で特異的な機序を有する。分子生物学および／または微生物学の当業者に良く知られている適切な細胞系または宿主系を選択して、外来性タンパク質生成物の所望の正確な修飾とプロセシングを確実にし得る。この目的を達成するために、遺伝子産物の一次転写産物、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセッシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用し得る。このような宿主細胞については、当該技術分野で良く知られている。
【０２１０】
所望ならば、本発明に従ったポリペプチドの調製において上述のような細胞を使用してもよい。このような方法は、典型的に、ポリペプチドをコードするコード配列の（ベクターによる）発現を提供する条件下で、（例えば上述のような発現ベクターで形質転換または形質移入された）組み換え宿主細胞を培養するステップと、任意に生成ポリペプチドを細胞または培地から回収し、より好ましくは回収して精製するステップを含んでなる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターなどの組み換え複製可能なベクターに組み込み得る。ベクターを使用して、適合性宿主細胞中で核酸を複製してもよい。したがってさらなる実施態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入して、ベクターを適合性宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を成長させることにより、本発明のポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。
【０２１１】
好ましくはポリペプチド分泌タンパク質はとして生成され、その場合、発現コンストラクト中の成熟形態のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列と作動的に連結する。好ましくはシグナル配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に天然（同種）である。代案としてはシグナル配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に外来性（異種性）であり、その場合、シグナル配列は、好ましくはその中で本発明に従ったヌクレオチド配列が発現される宿主細胞に内在性である。酵母宿主細胞のための適切なシグナル配列の例は、酵母ａ因子遺伝子に由来するシグナル配列である。同様に糸状菌宿主細胞のための適切なシグナル配列は、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡ遺伝子などの糸状菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子に由来するシグナル配列である。これはアミログルコシダーゼ（（グルコ）アミラーゼとも称される）プロモーターそれ自体と組み合わせて、ならびにその他のプロモーターと組み合わせて使用されてもよい。ハイブリッドシグナル配列もまた、本発明の文脈で使用されてもよい。
【０２１２】
好ましい異種性分泌リーダー配列は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのｇｌａＡ−１８および２４アミノ酸双方のバージョン）、α因子遺伝子（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母）、またはαアミラーゼ遺伝子（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））起源のものである。
【０２１３】
上述のような適切な宿主細胞中にベクターを形質転換または形質移入して、本発明のポリペプチド発現を提供してもよい。この方法は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供する条件下において、上述のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップを含んでなってもよい。
【０２１４】
したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換または形質移入された、またはそれを含んでなる宿主細胞を提供する。好ましくはポリヌクレオチドの複製および発現のために、ポリヌクレオチドをベクターに入れる。細胞は前記ベクターに適合するように選択され、例えば原核細胞（例えば細菌）、真菌細胞、酵母細胞または植物細胞であってもよい。
【０２１５】
その中で本発明のポリペプチドが、例えばデンプン分解、セルロース分解またはヘミセルロース分解酵素を含まないなど、用途を妨げるかもしれない酵素活性を実質的に含まない形態で生成される、異種宿主もまた選択してもよい。これは常態ではこのような酵素を産生しない宿主を選択することで、達成されてもよい。
【０２１６】
本発明は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の組み換え発現の手段によって、本発明のポリペプチドを生成する方法を包含する。この目的で、本発明のＤＮＡ配列は、適切な相同的または異種宿主細胞内でのポリペプチドの経済的生産を可能にするために、遺伝子増幅および／またはプロモーターや分泌シグナル配列などの発現シグナル交換のために使用し得る。相同的な宿主細胞は、同一種の宿主細胞であり、またはそれはＤＮＡ配列がそれから誘導された種と同一種内の変異株である。
【０２１７】
適切な宿主細胞は、好ましくは細菌などの原核微生物であり、またはより好ましくは例えば酵母または糸状菌などの真菌、または植物細胞などの真核生物である。操作が容易であることから、一般に真菌細胞よりも酵母細胞が好ましい。しかしタンパク質によっては、酵母からの分泌が不良であったり、または場合によっては適切にプロセッシングされない（例えば酵母中での過グリコシル化）。これらの場合、真菌宿主生物を選択すべきである。
【０２１８】
宿主細胞はポリペプチドを過剰発現してもよく、過剰発現を導く技術は良く知られている。したがって宿主は、コードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを有してもよい（したがってベクターは２つ以上のコピーを有してもよい）。
【０２１９】
したがって本発明の一実施態様では、本発明に従った組み換え宿主細胞は、本発明に従ったポリヌクレオチドまたはベクターを発現または過剰発現できる。
【０２２０】
本発明に従って、本発明のポリペプチドの生成は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換された、本発明に従った宿主細胞を従来の栄養発酵培地内で培養することによって達成され得る。
【０２２１】
本発明に従った組み換え宿主細胞は、当該技術分野で知られている手順を使用して培養されてもよい。プロモーターおよび宿主細胞の各組み合わせで、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現に寄与する培養条件が利用できる。所望の細胞密度またはポリペプチド力価に達した後、培養を停止し、既知の手順を使用してポリペプチドを回収する。
【０２２２】
発酵培地は、炭素源（例えばグルコース、マルトース、糖蜜など）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）、有機窒素源（例えば酵母抽出物、麦芽エキス、ペプトンなど）、および無機栄養源（例えばリン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など）を含有する既知の培地を含んでなり得る。
【０２２３】
適切な培地の選択は、発現宿主の選択に基づいてもよく、および／または発現コンストラクトの調節要件に基づいてもよい。このような培地は当業者に知られている。培地は、所望ならば、その他の潜在的汚染微生物よりも形質転換発現宿主の利益になる、さらなる構成要素を含有してもよい。
【０２２４】
発酵は、０．５〜３０日の期間にわたって実施し得る。それは適切には例えば約０〜４５℃の範囲の温度、および／または例えば約２〜約１０のｐＨにおける、バッチ、連続または流加プロセスであってもよい。好ましい発酵条件は、約２０〜約３７℃の範囲の温度、および／または約３〜約９のｐＨである。適切な条件は、通常、発現宿主の選択と、生成されるタンパク質に基づいて選択される。
【０２２５】
発酵後、必要ならば遠心分離または濾過の手段によって、発酵ブロスから細胞を除去し得る。発酵停止または細胞除去後、次に本発明のポリペプチドを回収し、所望ならば従来の手段によって精製および単離してもよい。
【０２２６】
本発明を制限するものではない実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【０２２７】
［実施例］
［材料および方法］
［アッセイ］
［脂肪分解活性（ＤＬＵ）］
［単位定義］
１ＤＬＵは、試験条件（ｐＨ８．５、３７℃）下で１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義される。
【０２２８】
［アッセイ］
脂肪分解活性は、色素産生基質パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を用いたアッセイ中で測定した。基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ） Ｎ２７５２）を２−プロパノール（３ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。激しく撹拌しながらこの溶液の３．５ｍＬを滴下して、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する４６．５ｍＬの１００ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ８．５に添加した。ｔ＝０の時点で、５０μＬのサンプルを１ｍＬの基質液体と混合した。３７℃でのインキュベーション中に、サンプル空試験と比較して、吸光度変化を４０５ｎｍで測定した。曲線の直線部分の傾斜（ΔＯＤ／時間）を活性尺度として使用する。活性は、ＤＬＵ（ＤＳＭリパーゼ単位）で表される。
【０２２９】
［リパーゼ活性（ＰＬＩ）］
［単位定義］
１ＰＬＩリパーゼ単位は、中和オリブ油エマルジョンから、３７℃およびｐＨ７．５で１分間あたり１μモルの遊離脂肪酸を遊離させる酵素量である。
【０２３０】
［アッセイ］
酵素インキュベーション中に発生する遊離脂肪酸を水酸化ナトリウムによって７．５の一定ｐＨに滴定する。使用される水酸化ナトリウムの量は、発生する遊離脂肪酸量に、ひいてはリパーゼ活性に正比例する。信頼できるデータを得るために、低酸度オリブ油（シグマカタログ録番号０１５１４）を使用すべきであり、オリブ油エマルジョンは特定の滴径要件を満たすべきである。Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘを用いた、５０ｍＬのオリブ油と、５０ｍＬのポリビニルアルコール溶液（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ／ＰｒｏｌａｂｏからのＲｈｏｄｏｖｉｏｌ ２５／１４０；カタログ番号２０９５４ ２９５）および２５ｍＬの水との混合によって、エマルジョンが得られる。１０μｍの直径を超える油滴が存在してはならず、小滴の１０〜２０％は４〜９μｍの直径を有するべきであり、小滴の８０％は４μｍ未満の直径を有すべきである。最終インキュベーション混合物は、７．５ｍＬのオリブ油エマルジョン、５．０ｍＬのＣａＣｌ２溶液（（３．６７５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ／２５０ｍＬ）、１．０ｍＬのアルブミン溶液（２００ｇ／ｌ）、および１１．５ｍＬの水を含有する。測定は、好都合にはｐＨ−ｓｔａｔユニット（、デンマーク国コペンハーゲン（Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）のＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ）中で実施される。
【０２３１】
［セルラーゼ活性（ＣＸＵ）］
［単位定義］
１ＣＸＵは、試験条件下で１時間あたり、０．５ｍｇのグルコースに相当する還元糖量を与えるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）量を加水分解する酵素量である。
【０２３２】
［アッセイ］
形成された還元糖の量は、ジニトロサリチル酸を用いて定量的に判定される。ＣＭＣ基質は、１８ｇのＣＭＣ（ＮｏｖａｃｅｌからのＢｌａｎｏｓｅ Ｒ．１１０、フランス国パリ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ））を９００ｍＬの水と１００ｍＬの酢酸緩衝液ｐＨ４．６とに１時間懸濁し、引き続いて粒子状物質を濾過して除くことによって調製される。ジニトロサリチル酸溶液は、次のようにして調製する。（Ａ）１３．５ｇのＮａＯＨペレットを３００ｍＬの水に溶解する。（Ｂ）８．８ｇジニトロサリチル酸を６０℃で４００ｍＬの水に溶解し、４００ｍＬの水に溶解した２２５ｇの酒石酸ナトリウムカリウムを添加して混合する。（Ｃ）次に３００ｍＬのＮａＯＨ溶液をジニトロサリチル酸／酒石酸ナトリウムカリウム溶液に混合する。（Ｄ）２．２ｇのＮａＯＨペレットと、１００ｍＬの水中の１０ｇの１００％フェノールとを合わせて溶液を調製し、さらに１００ｍＬの水に３７．５ｇのＮａＨＳＯ３を合わせて亜硫酸塩溶液を調製する。ジニトロサリチル酸使用液を調製するために、６９ｍＬの溶液（Ｄ）と溶液（Ｃ）とを混合し、２３．２ｍＬのＮａＨＳＯ３溶液を添加する。混合物は調製した５日後に使える状態になる。
【０２３３】
酵素インキュベーションは、１ｍＬのＣＭＣ溶液を１ｍＬのサンプル溶液に添加して３７℃で６０分間インキュベートすることで実施される。１ｍＬの１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを１ｍＬのインキュベーション混合物に添加して、反応を終結する。次に３ｍＬのジニトロサリチル酸使用液を添加して混合し、沸騰水中で５分間加熱し、冷却後、混合物に１９ｍＬの水を添加する。最後に分光光度計内で５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【０２３４】
［アミログルコシダーゼ活性（ＡＧＩ）］
［単位定義］
１アミログルコシダーゼ単位（ＡＧＩ）は、試験条件下で、１分間あたり１μｍｏｌのグルコースを遊離させる酵素量である。
【０２３５】
［アッセイ］
アミログルコシダーゼ活性を測定するために、以下の試薬を調製した。
【０２３６】
デンプン基質：１．６ｇのデンプン（メルク（Ｍｅｒｃｋ）；カタログ番号１２５２）を１０ｍＬの冷水に懸濁した。引き続いてこれを５０ｍＬの沸騰水に注いだ。２分間の沸騰と室温への冷却後、２ｍＬの酢酸緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．３）を添加した。ｐＨをチェックし、必要ならば４ｍｏｌ／Ｌの酢酸または４ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨによってｐＨ４．３に調節した。
【０２３７】
ｏ−アニシジン溶液：６６０ｍｇのｏ−ジアニシジン二塩酸塩（シグマＢ３２５２）を１００ｍＬの水に溶解した。
【０２３８】
グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ試薬：５０００単位のグルコースオキシダーゼ（シグマＧ６１２５）および１２００単位のペルオキシダーゼ（シグマＰ８１２５）を９００ｍＬの水に溶解した。連続的に１３．８ｇのリン酸水素二ナトリウム二水和物、６．４２ｇのリン酸水素二ナトリウム一水和物、および６．１０ｇトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを添加して溶解した。１００ｇ／Ｌのリン酸を添加して、溶液のｐＨを７．０に調節した。体積を水で１０００ｍＬにした後、溶液を再度混合した。
【０２３９】
［呈色試薬］
９９部のグルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ試薬を１部のｏ−アニシジン溶液と混合した。
【０２４０】
アッセイ：２ｍＬのデンプン基質と混合した２ｍＬのサンプルを６０℃で１５分間インキュベートした。２０ｍＬの０．００５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加して反応を停止した。
【０２４１】
１ｍＬのインキュベートを４ｍＬの呈色試薬と混合して、グルコース含量を測定した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、５ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加して反応を停止させた。吸光度を５４０ｎｍで測定した。２５〜１５０μｇ／ｍＬの範囲の標準を用いたグルコース検量線を使用して、グルコース含量を計算した。標準は、呈色試薬により直接着色された。
【０２４２】
［実施例１］
［発明のリパーゼの生成］
本明細書に提供される配列番号１（ＤＮＡ Ｌ０１）、配列番号３（ＤＮＡＬ０２）、配列番号５（ＤＮＡＬ０３）、配列番号７（ＤＮＡＬ０４）のヌクレオチド配列によってコードされる脂肪分解酵素Ｌ０１、Ｌ０２、Ｌ０３、Ｌ０４は、ＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを構築し、このようなプラスミドでアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株を形質転換して、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を以下のようにして成長させることで得られた。
【０２４３】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の新鮮な胞子（１０６〜１０７）を２０ｍＬのＣＳＬ培地（１００ｍＬフラスコ、整流装置）に接種して、３４℃および１７０ｒｐｍで２０〜２４時間培養した。５〜１０ｍＬのＣＳＬ前培養を１００ｍＬのＣＳＭ培地（５００ｍＬフラスコ、整流装置）に接種した後、株を３４℃および１７０ｒｐｍで３〜５日間発酵させた。
【０２４４】
４℃および５０００×ｇで３０分間の発酵ブロスの遠心分離によって、無細胞上清が得られた。無細胞上清を使用時まで−２０℃で保存した。任意に上清をＧＦ／Ａワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）ガラスマイクロファイバーフィルター（１５０ｍｍ径）上でさらに濾過し、より大きな粒子を除去し得る。必要ならば４ＮのＫＯＨによって上清のｐＨをｐＨ５に調節し、０．２μｍ（ボトルトップ）フィルター上で吸引して無菌濾過し、真菌材料を除去する。
【０２４５】
ＣＳＬ培地は次からなった（１Ｌあたりの量）：１００ｇのコーンスティープ固形物（ロケット（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ））、１ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２０、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、１０ｇのグルコース・Ｈ２Ｏ、および０．２５ｇのＢａｓｉｌｄｏｎ（消泡剤）。成分を純水に溶解して、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ５．８に調節した；整流装置および気泡ボール付きの１００ｍＬフラスコに２０ｍＬ発酵ブロスを充填して１２０℃で２０分間滅菌し、その後、室温への冷却後、５０００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する２００μｌの無菌溶液を各フラスコに添加した。
【０２４６】
ＣＳＭ培地は次からなった（１Ｌあたりの量）：１５０ｇのマルトース・Ｈ２０、６０ｇのＳｏｙｔｏｎｅ（ペプトン）、１ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２０、１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８ｇのＴｗｅｅｎ８０、０．０２ｇのＢａｓｉｌｄｏｎ（消泡剤）、２０ｇのＭＥＳ、１ｇのＬ−アルギニン。成分を純水に溶解して、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４でｐＨをｐＨ６．２に調節した；整流装置および気泡ボール付きの５００ｍＬフラスコに１００ｍＬ発酵ブロスを充填して１２０℃で２０分間滅菌し、その後、室温への冷却後、５０００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する１ｍＬの無菌溶液を各フラスコに添加した。
【０２４７】
［実施例２］
［発明の脂肪分解酵素の精製］
実施例１で得られた凍結無細胞上清の解凍後に、上清を４℃で徹底的に遠心分離して、あらゆる固形物を除去した。低分子量の汚染物を除去するために、１０ｋＤａカットオフの濾紙を装着したミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステムを使用して、上清を限外濾過液した。０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む４０ｍＬ体積の冷１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いて、サンプルを３〜５回洗浄した。酵素溶液の最終体積は３０ｍＬであり、さらに「限外濾過液」と称される。
【０２４８】
さらなる精製のために、限外濾過液をモノＱアニオン交換カラムに通過させ得る。塩勾配を２０カラム体積にわたり１ＭのＮａＣｌに設定した。緩衝液は、７０ｍＭのＢｉｓ−ＴＲＩＳと５０ｍＭのＴＲＩＳの混合物であった。ｐＨを０．１Ｍ ＨＣｌで調整した。意外なことに、リパーゼが導電率３５ｍＳ／ｃｍで溶出するｐＨ＝９で精製を実施した場合に、最良の結果が得られることが察された。
【０２４９】
サンプルの総タンパク含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して測定された（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，Ｔｏｔｏｗａ ２００２，ｐ１５−２１）。
【０２５０】
［実施例３］
［オランダ型焼きパン（Ｄｕｔｃｈ ｔｉｎ ｂｒｅａｄ）のベーキング実験］
［Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼ、およびアミログルコシダーゼを含んでなる組成物の生地およびパン特性に対する効果］
オランダ型焼きパンを次のようにして調製した。３５００ｇの小麦粉（２８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋７００ｇのＩｂｉｓ）、小麦粉を基準にして５８％ｗ／ｗの水、８０ｇの圧搾酵母、９０ｇのパン改良剤（３５％酵素活性ダイズ粉、３０％小麦粉、１８％乳清粉末、７％油、１０％デキストロースを含んでなる）、７０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４０ｐｐｍのアスコルビン酸（小麦粉重量基準）、７ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表１に示す様々な酵素またはＳＳＬをＤｉｏｓｎａミキサーで上で、速度１で２分間、速度２で１２５ｋＷｈで、最終生地温度約２８℃に混合した。８８０ｇの生地片を丸めて３４℃および８５％の相対湿度で４０分間発酵させた。引き続いて生地片を成形して造形し、型に入れて３８℃および８５％相対湿度（Ｒ．Ｈ．）で７５分間発酵させた。完全に発酵した生地を２６５℃のオーブンで３０分間焼いた。
【０２５１】
室温への冷却後、自動化パン体積分析器（ＢＶＭ−３；ＴｅｘＶｏｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によってローフ体積を測定した。空試験パンの膨化体積を１００％と定義する。さらなる効果は、表２に示すように熟練パン職人により手動で視覚的に評価された。
【０２５２】
【表１】
【０２５３】
さらなる酵素：実施例１および２に示すように、脂肪分解酵素Ｌ０１を得て精製した。精製サンプルの活性は、「材料および方法」で指定されるアッセイを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質１グラムあたりのＤＬＵ単位で測定された。
Ｂａｋｅｚｙｍｅ ＡＧ８００は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来するアミログルコシダーゼである。Ｂａｋｅｚｙｍｅ Ｌ８００００は、リゾプス・オリーゼ（Ｒｈｙｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）に由来するトリアシルグリセロールリパーゼである。Ｂａｋｅｚｙｍｅ Ｘ−Ｐａｎは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来するセルラーゼである。
【０２５４】
【表２】
【０２５５】
実験の第１のセット（実施例１〜４）では、生地およびベイクド製品は上述の通り調製された。
生地および生地から得られたベイクド製品の評価結果を表３に示す。
【０２５６】
【表３】
【０２５７】
表３の結果は、本発明に従ったベーキング酵素組成物（実施例３、４）を使用して調製された生地およびパンが、例えば生地伸展性と粘性、パン体積、およびクラム柔らかさなどの生地特性を改善できることを示す。これらの改善は、乳化剤ＳＳＬ（実施例２）を使用して得られるものに匹敵する。本発明に従ったベーキング組成物を含んでなる生地から得られるベイクド製品の体積は、乳化剤ＳＳＬを含有する生地から得られるベイクド製品と比較すると、実際改善された。これらの結果は、本発明に従ったベーキング酵素組成物が、オランダ型焼きパンなどの柔らかいパンの調製においてＳＳＬを完全に置き換え得ることを示す。
【０２５８】
実験の第２のセット（実験５〜８）では、ベーキングに先だって生地に衝撃を与えたという違いを除いて、生地は上述の通り調製された。生地への衝撃付与は、ベーキング型に含有される完全に発酵した生地を２０ｃｍの高さから落下させて、それを上述の通り焼くことで実施された。生地から得られるベイクド製品の評価結果を表４に示す。
【０２５９】
【表４】
【０２６０】
結果は、乳化剤を使用せずに調製されて、衝撃を与えた生地から得られたパンが、その体積を２０％以超失ったことを示唆する。これはそれからそれが調製された生地の耐衝撃性が低いことを示唆する。同一条件下で衝撃を与えた生地から調製されてＳＳＬを含んでなるパンは、乳化剤を含まず衝撃を与えられなかった生地によって得られるパンとおよそ同一体積を有する。同一条件下で衝撃を与えた生地から得られ、本発明に従ったベーキング組成物を含んでなるパンは、乳化剤を含まず衝撃を与えられなかった生地によって得られるパン（体積１００％に相当する；表４には示さず）と比較しても、なおも改善された体積を有する。このパンはまた、ＳＳＬを含んでなる生地から得られて、衝撃を与えられた実験６のパンと比較して、より良い体積も有する。これは本発明に従ったベーキング組成物を含んでなる生地の優れた耐衝撃性を示唆し、それは乳化剤としてＳＳＬを含んでなる生地の耐衝撃性よりなおも良い。
【０２６１】
［実施例４］
［ベーキング実験−標準バタール］
［脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物の生地およびパン特性に対する効果］
標準バタールパンを次のようにして調製した。３０００ｇの小麦粉（２７００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋３００ｇのＩｂｉｓ）、５８％のｗ／ｗ水（小麦粉基準）、７０ｇの圧搾酵母、６０ｇの塩（ＮａＣｌ）、３４ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸、３ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１５ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表５に示す酵素をＤｉｏｓｎａミキサー上で速度１で２分間、速度２で１０５ｋＷｈで最終生地温度約２７℃に混合した。３５０ｇの生地片を丸め、３２℃および９０％の相対湿度で４０分間発酵させた。引き続いて生地片を成形して造形し３２℃および９０％Ｒ．Ｈ．で１００分間発酵させた。完全に発酵した生地をオーブン内で２８０℃で７分間、２６５〜２７０℃で２８分間焼いた。
【０２６２】
室温に冷却した後、実施例３に示すたようにローフの体積を測定した。生地弾性、生地安定性、およびベイクド製品のクラム構造は、熟練パン職人によって視覚的に評価された。
【０２６３】
【表５】
【０２６４】
実験は、脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる本発明に従った組成物をバタール製造において使用すると、良好な安定性と改善された弾性がある生地が得られ、対応するベイクド製品は、脂肪分解酵素Ｌ０１のみを使用して製造されたベイクド製品と比較すると、より細かいクラム構造と比較できるパン体積を有することを示す。
【０２６５】
［実施例５］
［ベーキング実験−標準バタール］
［先行技術の脂肪分解酵素と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物のパンおよび生地特性に対する効果］
速度２での成分混合が１０５ｋＷｈでなく７１ｋＷｈで達成されたという違いを除いて、実施例４に示すようにして標準バタールパンを調製した。以下の成分を使用した。２０００ｇの小麦粉（１８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋２００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗの水（小麦粉基準）、４７ｇの圧搾酵母、４０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４４ｐｐｍのアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉基準）、３ｐｐｍ（１ｋｇの小麦粉基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１５ｐｐｍ（１ｋｇの小麦粉基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表６に示す酵素。
【０２６６】
【表６】
【０２６７】
パン体積を実施例３と同様にして測定した。ベイクド製品の生地伸展性、生地弾性は、熟練パン職人によって視覚的に評価された。実験は、バタールの製造において、脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる本発明に従った組成物を使用した場合、良好な安定性と改善された弾性のある生地が得られ、対応するベイクド製品は、リン脂質、トリグリセリド、およびガラクト脂質に対する活性がある先行技術の脂肪分解酵素を使用して得られる生地およびベイクド製品と比較すると、改善された体積を有することを示す。
【０２６８】
［実施例６］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる組成物のパンおよび生地特性に対する効果］
一次発酵が３４℃および８５％Ｒ．Ｈ．で３５分間、二次発酵が３８℃および８５％Ｒ．Ｈ．で７０分間、完全発酵生地のベーキングが２８０℃で７分間、そして２６５〜２７０℃で２８分間実施されたことを除いては、実施例３に示すようにしてオランダ型焼きパンを調製した。以下の成分を使用した。３５００ｇの小麦粉（２８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋７００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、７７ｇの圧搾酵母、７０ｇの塩（ＮａＣｌ）、３５ｇの糖、３５ｇの脂肪、４０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸、３ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１５ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＭＡ１００００（抗老化アミラーゼ）、および表７に示す様々な酵素。
【０２６９】
実施例３に示すようにしてベイクド製品の体積を測定する一方、軟らかさは熟練パン職人によって経験的に判定された。
【０２７０】
【表７】
【０２７１】
実験は、本発明組成物が、柔らかい型焼きパンの製造において使用した場合に、パンの軟らかさをかなり改善することを明らかに示す。改善は、組成物中で脂肪分解酵素Ｌ０１を使用した場合に特に明白である。
【０２７２】
［実施例７］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［脂肪分解酵素Ｌ０１およびトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる組成物と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる組成物の効果］
オランダ型焼きパンを次のようにして調製した。３５００ｇの小麦粉（２８００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋７００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、８０ｇの圧搾酵母、８７．５ｇのパン改良剤（３５％酵素活性ダイズ粉、３０％小麦粉、１８％乳清粉末、７％油、１０％デキストロースを含んでなる）、７０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉重量基準）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＭＡ１００００（抗老化アミラーゼ）および表８に示す様々な酵素をＤｉｏｓｎａミキサー上で速度１で３分間、速度２で１３０ｋＷｈで、最終生地温度２８℃に混合した。８７５ｇの生地片を丸めて室温で５分間発酵させ、引き続いてそれらを成形して造形し室温で１５分間発酵させた。引き続いて生地を成形して造形し、型に入れて３８℃および８５％Ｒ．Ｈ．で７０分間発酵させた。完全に発酵させた生地をオーブン内で２８０℃で７分間、２６５〜２７０℃で２８分間焼いた。
【０２７３】
生地特徴およびパン体積を実施例３に示すように判定した。結果を表８に報告する。
【０２７４】
【表８】
【０２７５】
実験１と２の比較から、Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる本発明に従った組成物（実験２）は、パン生地に有効量で添加した際に、セルラーゼを含まない本発明に従った組成物と比較して、伸展性および弾性などの生地の特徴を改善し、生地粘性を低下させることは明白である。
【０２７６】
［実施例８］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、およびセルラーゼを含んでなる組成物と比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼ、およびアミノグルコシダーゼを含んでなる組成物の効果］
混合を速度１で３分間、速度２で１２０ｋＷｈで実施したことを除いては、実施例７に示すようにしてオランダ型焼きパンを調製した。生地片（７５０ｇ）を３２℃および８５％Ｒ．Ｖ．で３５分間、引き続いて同一条件下で７０分間発酵させた。
【０２７７】
使用された成分は、次のとおりであった。３０００ｇの小麦粉（２４００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋６００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、６０ｇの圧搾酵母、７５ｇのパン改良剤（３５％酵素活性ダイズ粉、３０％小麦粉、１８％乳清粉末、７％油、１０％デキストロースを含んでなる）、６０ｇの塩（ＮａＣｌ）、４０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉重量基準）、７ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、１０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＭＡ１００００（抗老化アミラーゼ）、および表９に示す様々な酵素。
【０２７８】
生地特徴およびパン体積を実施例３に示すように判定した。結果を表９に報告する。
【０２７９】
【表９】
【０２８０】
実験１と２の比較から、Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼ、およびアミログルコシダーゼを含んでなる本発明に従った組成物（実験２）は、パン成分に有効量で添加された際に、伸展性や弾性などの生地特徴をさらに改善し、アミログルコシダーゼを含まない本発明に従った組成物（実験１）と比較して、更に細かいクラム構造のベイクド製品を生じることが明白である。
【０２８１】
［実施例９］
［ベーキング実験−オランダ型焼きパン］
［ＧＭＳまたはＳＳＬと比較した、脂肪分解酵素Ｌ０１、トリアシルグリセロールリパーゼ、セルラーゼおよびアミノグルコシダーゼを含んでなる組成物の生地特徴およびパン体積および軟らかさに対する効果］
混合を速度１で４分間、速度２で１１２ｋＷｈで実施したことを除いては、実施例７に示すようにしてオランダ型焼きパンを調製した。生地片（８４０ｇ）を３０℃および７０％Ｒ．Ｖ．で４０分間、引き続いて３８℃および９０％Ｒ．Ｈ．で７０分間発酵させた。
【０２８２】
使用した成分は、次のとおりであった。３０００ｇの小麦粉（２４００ｇのＫｏｌｉｂｒｉ＋６００ｇのＩｂｉｓ）、５８％ｗ／ｗ（小麦粉基準）の水、７５ｇの圧搾酵母、６０ｇの塩（ＮａＣｌ）、９０ｇのショートニング、４５ｇの糖、２０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＬ−システイン、３０ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のアスコルビン酸（１ｋｇの小麦粉重量基準）、７．８ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ Ｐ５００（真菌αアミラーゼ）、１７．５ｐｐｍ（小麦粉重量基準）のＢａｋｅｚｙｍｅ ＨＳＰ６０００（真菌ヘミセルラーゼ）、および表１０に示す様々な酵素、ＳＳＬまたはＧＭＳ。
【０２８３】
パン体積を実施例３に示すようにして測定した。クラム硬さは、２４時間後にテクスチャー分析器ＴＡ−ＴＸ Ｐｌｕｓによって測定した。パン体積およびクラム硬さの結果を表１１に報告する。
【０２８４】
【表１０】
【０２８５】
【表１１】
【０２８６】
表１１の結果は、本発明に従ったベーキング酵素組成物（実施例４）を使用して調製されたパンが、ＳＳＬを含有するパン（実施例３）に匹敵し、ＧＭＳを含有するパン（実施例２）に優る、改善されたクラム柔らかさを有することを示す。本発明に従ったベーキング組成物を含んでなる生地から得られるベイクド製品の体積は、乳化剤ＳＳＬまたはＧＭＳを含有する生地から得られるベイクド製品と比較すると、実際、わずかに改善された。これらの結果はオランダ型焼きパンなどの柔らかいパンの調製において、本発明に従ったベーキング酵素組成物が、ＳＳＬまたはＧＭＳを完全に置き換え得ることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または前記配列番号２に記載のアミノ酸に由来する前記成熟ポリペプチドと少なくとも８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物に従うアミノ酸配列；または
（Ｂ）（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または前記配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；または
（ｂ）前記配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０または９０％相同的であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）前記配列番号２に記載のアミノ酸に由来する前記成熟ポリペプチド、または前記配列番号２のアミノ酸配列に記載の前記成熟ポリペプチドと少なくとも８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コード縮重の結果として縮重される配列；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる、単離ポリペプチドである脂肪分解酵素を含んでなり、
トリアシルグリセロールリパーゼをさらに含んでなるベーキング酵素組成物。
【請求項２】
ヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼをさらに含んでなる、請求項１に記載のベーキング酵素。
【請求項３】
アミログルコシダーゼをさらに含んでなる、請求項１または２に記載のベーキング酵素組成物。
【請求項４】
２つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの組み合わせをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベーキング酵素組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベーキング酵素組成物、小麦粉、および１つ以上の生地またはパン添加剤を含んでなるプレミックス。
【請求項６】
少なくとも小麦粉、水、および酵母を含んでなる生地成分に、請求項の１〜５のいずれか一項に記載のベーキング組成物またはプレミックスを添加するステップを含んでなる、生地を調製する方法。
【請求項７】
小麦粉、水、酵母、および有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のベーキング酵素組成物またはプレミックスを含んでなる生地。
【請求項８】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも３．５７ＤＬＵ単位の脂肪分解酵素、好ましくは少なくとも７．１５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも１４．３０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の脂肪分解酵素を含んでなり、そして好ましくは最大１４３ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の脂肪分解酵素、より好ましくは最大７１．５０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大３５．７５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の脂肪分解酵素を含んでなる請求項７に記載の生地。
【請求項９】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも８０ＰＬＩ単位のトリアシルグリセロールリパーゼ、好ましくは少なくとも１６０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも３２０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉のトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなり、好ましくは最大３２００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉のトリアシルグリセロールリパーゼ、より好ましくは最大１６００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大８００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉のトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる、請求項７または８に記載の生地。
【請求項１０】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも２．３４ＣＸＵ単位のセルラーゼ、好ましくは少なくとも４．６８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも７．５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも９．３６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも１５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは少なくとも２３．４ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉のセルラーゼを含んでなり、好ましくは最大３００ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉のセルラーゼ、好ましくは最大１５０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大９３．６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは最大７５ＣＸＵ／ｋｇの小麦粉、なおもより好ましくは最大４６．８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大３０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉のセルラーゼを含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の生地。
【請求項１１】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも１３０ＡＧＩ単位のアミログルコシダーゼ、好ましくは少なくとも２６０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも５２０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼを含んでなり、そして好ましくは最大５２００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼ、より好ましくは最大２６００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大１３００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼを含んでなる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の生地。
【請求項１２】
実質的にＳＳＬおよび／またはＣＳＬを含まない、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の生地。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の生地を焼くステップを含んでなる、ベイクド製品を調製する方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の生地を焼くことで得られるベイクド製品。
【請求項１５】
生地またはそれに由来するベイクド製品の製造において乳化剤を置き換えるための、好ましくはＳＳＬを置き換えるための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベーキング組成物またはプレミックスの使用。
【請求項１】
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸に由来する成熟ポリペプチド、または前記配列番号２に記載のアミノ酸に由来する前記成熟ポリペプチドと少なくとも８０または９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物に従うアミノ酸配列；または
（Ｂ）（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または前記配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物；または
（ｂ）前記配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０または９０％相同的であるヌクレオチド配列；または
（ｃ）前記配列番号２に記載のアミノ酸に由来する前記成熟ポリペプチド、または前記配列番号２のアミノ酸配列に記載の前記成熟ポリペプチドと少なくとも８０または９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コード縮重の結果として縮重される配列；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる、単離ポリペプチドである脂肪分解酵素を含んでなり、
トリアシルグリセロールリパーゼをさらに含んでなるベーキング酵素組成物。
【請求項２】
ヘミセルラーゼまたはセルラーゼ、好ましくはセルラーゼをさらに含んでなる、請求項１に記載のベーキング酵素。
【請求項３】
アミログルコシダーゼをさらに含んでなる、請求項１または２に記載のベーキング酵素組成物。
【請求項４】
２つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの組み合わせをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベーキング酵素組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベーキング酵素組成物、小麦粉、および１つ以上の生地またはパン添加剤を含んでなるプレミックス。
【請求項６】
少なくとも小麦粉、水、および酵母を含んでなる生地成分に、請求項の１〜５のいずれか一項に記載のベーキング組成物またはプレミックスを添加するステップを含んでなる、生地を調製する方法。
【請求項７】
小麦粉、水、酵母、および有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のベーキング酵素組成物またはプレミックスを含んでなる生地。
【請求項８】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも３．５７ＤＬＵ単位の脂肪分解酵素、好ましくは少なくとも７．１５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも１４．３０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の脂肪分解酵素を含んでなり、そして好ましくは最大１４３ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の脂肪分解酵素、より好ましくは最大７１．５０ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大３５．７５ＤＬＵ／ｋｇ小麦粉の脂肪分解酵素を含んでなる請求項７に記載の生地。
【請求項９】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも８０ＰＬＩ単位のトリアシルグリセロールリパーゼ、好ましくは少なくとも１６０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも３２０ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉のトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなり、好ましくは最大３２００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉のトリアシルグリセロールリパーゼ、より好ましくは最大１６００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大８００ＰＬＩ／ｋｇ小麦粉のトリアシルグリセロールリパーゼを含んでなる、請求項７または８に記載の生地。
【請求項１０】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも２．３４ＣＸＵ単位のセルラーゼ、好ましくは少なくとも４．６８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも７．５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも９．３６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは少なくとも１５ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは少なくとも２３．４ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉のセルラーゼを含んでなり、好ましくは最大３００ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉のセルラーゼ、好ましくは最大１５０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは最大９３．６ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、なおもより好ましくは最大７５ＣＸＵ／ｋｇの小麦粉、なおもより好ましくは最大４６．８ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大３０ＣＸＵ／ｋｇ小麦粉のセルラーゼを含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の生地。
【請求項１１】
１ｋｇの小麦粉あたり少なくとも１３０ＡＧＩ単位のアミログルコシダーゼ、好ましくは少なくとも２６０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、より好ましくは少なくとも５２０ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼを含んでなり、そして好ましくは最大５２００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼ、より好ましくは最大２６００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉、最も好ましくは最大１３００ＡＧＩ／ｋｇ小麦粉のアミログルコシダーゼを含んでなる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の生地。
【請求項１２】
実質的にＳＳＬおよび／またはＣＳＬを含まない、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の生地。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の生地を焼くステップを含んでなる、ベイクド製品を調製する方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の生地を焼くことで得られるベイクド製品。
【請求項１５】
生地またはそれに由来するベイクド製品の製造において乳化剤を置き換えるための、好ましくはＳＳＬを置き換えるための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベーキング組成物またはプレミックスの使用。
【公表番号】特表２０１３−５０３６１２（Ｐ２０１３−５０３６１２Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７３１２（Ｐ２０１２−５２７３１２）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２８３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２６８７７
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２８３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２６８７７
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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