ＴＮＦ−α遮断薬に対する治療応答性の予測方法
本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する患者の応答性の予測方法であって、前記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定することを包含する方法であり、前記患者の前記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの同時的存在が標準応答性に比してＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する前記患者の応答性の可能性減少を示す方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節の損傷および能力障害を誘導する慢性の自己免疫および炎症性多発性関節炎である。滑膜炎症過程に関与する不可欠なサイトカインの1つとしてのＴＮＦ-αの認識を、種々の研究がもたらしてきた。このような結果は、ＲＡの治療のためのＴＮＦ遮断薬（ＴＢＡ）の開発のための基礎を提供してきた。3つのＴＢＡがＲＡ治療のために一般に用いられており、その1つは組換え形態のＴＮＦ受容体、即ちＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（エタネルセプト）に相当し、そして他の2つは抗ＴＮＦ-αモノクローナル抗体：即ちインフリキシマブおよびアダリムマブ（ＡＤＡ）に相当する。これらのＴＢＡは、細胞表面のＴＮＦ受容体とのＴＮＦの結合を抑制し、したがってＴＮＦ駆動シグナル伝達経路を妨害することにより作用する。エタネルセプトはＴＮＦ-αおよびＴＮＦ-β（リンフォトキシンＡ（ＬＴＡ）としても既知）の両方と結合し、一方、インフリキシマブおよびアダリムマブはＴＮＦ-αのみと結合する。
【０００３】
ＴＢＡ／メトトレキセート組合せを用いた種々の臨床試験は、ＲＡ患者の55〜75％において効能を示してきた。ＴＢＡは、関節炎症を低減し、関節損傷を遅らせ、そして身体機能を改善する。依然として、ＴＮＦ-α遮断薬／メトトレキセート組合せを投与されたＲＡ患者の25〜45％が子の治療に応答しない。さらにまた、ＴＢＡは副作用を有し得るし、且つ費用が掛かり、そして投与患者において任意に投与されたＴＢＡの効力は予測不可能である。
【０００４】
これらの治療の経費、潜在的長期悪事象（感染および癌）についての存続する疑念、ならびにＲＡの治療における他の効率的生物療法の利用可能性を考慮に入れると、応答の予測因子の同定は重要な問題である。
【０００５】
ＨＬＡ-ＤＲハプロタイプのような遺伝的多型はＲＡの可変性の自然な過程ならびに慣用的疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対する異種応答に関連するため、少数の研究がＴＢＡ効能に関して遺伝子マーカーの同定を試みてきたし、そしてそれらはいくつかのサイトカイン遺伝子のプロモーターに集中してきた（Kang CP et al. 2006；Mugnier et al. 2003；Cuchacovich et al. 2004；Padyulov et al. 2003）。例えばＴＮＦ-α遺伝子プロモーターにおける配列変異はインフリキシマブに対する可変性応答と関連づけられてきた（Mugnier et al. 2003）。しかしながらそれらの研究は、矛盾する結果を、特にＴＮＦ-３０８Ａ／Ｇ多型性および／または共有エピトープの役割に関して矛盾する結果をもたらした（Padyulov et al. 2003；Criswell et al. 2004；Mugnier et al. 2003；Cuchacovich et al. 2004；Martinez et al. 2004；Mugnier et al. 2004；Fronseca et al. 2005；Kang et al. 2005；Lee et al. 2006）。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明人等は、ここで、ＴＮＦ-α遺伝子中の-２３８Ｇ、-３０８Ｇおよび-８５７ＣからなるハプロタイプがＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答を予測するのに有用であり得る、ということを同定した。
【０００７】
彼らは実際、慢性関節リウマチを有し、メトトレキセート（ＭＴＸ）を伴いまたは伴わずにアダリムマブ（ＡＤＡ）を用いて処置された白色人種患者の大型コホートにおいて、ＨＬＡ-ＤＲＢ１、ならびにＴＮＦ-α遺伝子の3つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、すなわち-８５７Ｃ／Ｔ、-３０８Ａ／Ｇおよび-２３８Ａ／Ｇを遺伝子型分類した。各遺伝子型に関しては、遺伝子型およびハプロタイプは、処置の12週目に、ＡＣＲ50応答（米国リウマチ学会判定基準による症候の50％改善）との関連に関して試験された。本発明人等は、遺伝子型分布で別個に試験された3つのＴＮＦ-α多型の何れもが一変量または多変量分析においてＡＣＲ50応答と関連しない、ということを実証した。逆に、ＴＮＦ-α遺伝子座のハプロタイプ再構築は、-２３８Ｇ、-３０８Ｇおよび-８５７Ｃからなるハプロタイプ（「ＧＧＣ」ハプロタイプ）が、ホモ接合形態（患者のほぼ50％に存在）では、ＡＤＡに対するより乏しい応答と有意に関連する、ということを明示した。
【０００８】
したがって、本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する患者の応答性の予測方法、特にin vitro方法であって、上記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定することを包含する方法であり、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの同時的存在が標準応答性に比してＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する上記患者の応答性の可能性減少を示す方法に関する。
【０００９】
本発明は、ＴＮＦ-α関連疾患を有する患者を治療するために意図された薬剤の製造のためのＴＮＦ-α遮断薬の使用であって、上記患者が上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンを同時的に保有しない使用にも関する。
【００１０】
本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答すると思われる患者におけるＴＮＦ-α関連疾患の治療方法であって、以下の：
ａ）上記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定するステップ；
ｂ）上記患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答すると思われる場合、即ち、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンを上記患者が同時的に保有しない場合、治療的有効量の少なくとも1つのＴＮＦ-α遮断薬を患者に投与するステップ
を包含する方法にも関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
定義：
「コード配列」、あるは発現産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素を「コードする」配列は、発現された場合にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生を生じるヌクレオチド配列であり、即ち、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素に関するアミノ酸配列をコードする。タンパク質に関するコード配列は、開始コドン（通常はＡＴＧ）および停止コドンを含み得る。
【００１２】
「遺伝子」という用語は、1つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含むアミノ酸の一特定配列をコードするかまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、そして例えば遺伝子が発現される条件を確定する調節ＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列を含むことも含まないこともあり得る。構造遺伝子でないいくつかの遺伝子はＤＮＡからＲＮＡに転写され得るが、しかしアミノ酸配列に翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、あるいはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。特に遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、即ち調節因子、プロモーター、イントロンおよびエキソン配列を含む配列に関して意図され得る。
本明細書中で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に少なくとも10、好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも20のヌクレオチド、好ましくは100以下のヌクレオチド、さらに好ましくは70以下のヌクレオチドを有し、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズ可能である核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の技法に従って、例えば放射性標識、蛍光標識、酵素標識、配列タグ等を用いて、標識され得る。標識オリゴヌクレオチドは、ＴＮＦ核酸の対立遺伝子変異体の存在を検出するためのプローブとして用いられ得る。代替的には、オリゴヌクレオチド（標識され得るものの一方または両方）は、対立遺伝子変異体を検出するために、例えばＰＣＲ（Saiki et al., 1988）により、ＴＮＦ核酸の一領域を増幅するために用いられ得る。一般的には、オリゴヌクレオチドは、合成的に、好ましくは核酸合成機で、調製される。したがってオリゴヌクレオチドは、非天然リンエステル類似体結合、例えばチオエステル結合等を用いて調製され得る。
【００１３】
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で１本鎖形態の核酸分子が別の核酸分子とアニーリングされ得る場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡと「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al., 1989参照）。
【００１４】
温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「緊縮性」を確定する。同種の核酸に関する予備的スクリーニングのために、55℃のＴｍ（融点）に対応する低緊縮性ハイブリダイゼーション条件、例えば、5×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、0.25％ミルク、および無ホルムアミド；あるいは30％ホルムアミド、5×ＳＳＣ、0.5％ＳＤＳが用いられ得る。中等度の緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、最高Ｔｍ、例えば50％ホルムアミド、5×または6×ＳＣＣに相当する。ＳＣＣは、0.15 MＮａＣｌ、0.015 MＮａクエン酸塩である。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、しかしハイブリダイゼーションの緊縮性によって、塩基間のミスマッチが考えられる。核酸をハイブリダイズするための適切な緊縮性は、核酸の長さおよび相補性の程度（これらは当該技術分野で周知の変数である）によっている。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの総体的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で低減する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。100ヌクレオチド長より大きいハイブリッドに関しては、Ｔｍを算定するための方程式が得られている（Sambrook et al., 1989, 9.50-9.51参照）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を確定する（Sambrook et al., 1989, 11.7-11.8参照）。ハイブリダイズ可能な核酸に関する最小長は、少なくとも約10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり、そしてさらに好ましくはその長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００１５】
特定の一実施形態では、「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は55℃のＴｍを指し、そして上記のような条件を利用する。好ましい一実施形態では、Ｔｍは60℃である。さらに好ましい一実施形態では、Ｔｍは65℃である。特定の一実施形態では、「高緊縮性」は、0.2×ＳＳＣ中で68℃での、50％ホルムアミド、4×ＳＳＣ中で42℃での、あるいはこれら2つの条件のいずれかの下で観察されるものと等価のハイブリダイゼーションのレベルを提供する条件下での、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を指す。
【００１６】
本明細書中で用いる場合、増幅プライマーは、標的配列とのハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドの伸長による、あるいは標的配列とハイブリダイズされる場合に隣接する多数のオリゴヌクレオチドの結紮による標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドである。増幅プライマーの少なくとも一部分は、標的とハイブリダイズする。この部分は標的結合配列と呼ばれ、そしてそれはプライマーの標的特異性を確定する。標的結合配列のほかに、ある種の増幅方法は、増幅プライマー中に特殊化非標的結合配列を要する。これらの特殊化配列は、増幅反応が進行するために必要であり、そして典型的には、特殊化配列を標的に付すのに役立つ。例えば標準置換増幅（ＳＤＡ）に用いられる増幅プライマーとしては、標的結合配列に対して５‘の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が挙げられる（米国特許第5,455,166号および米国特許第5,270,184号）。核酸ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、ならびに転写ベースの増幅プライマーは、プライマーの標的結合配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを要する。選択された増幅反応に用いるための標的結合配列とのこのような特殊化配列の連結は、当該技術分野における常套手段である。それに対して、標的の末端に特殊化配列を必要としないＰＣＲのような増幅方法は、一般的に、標的結合配列のみからなる増幅プライマーを用いる。
【００１７】
本明細書中で用いる場合、「プライマー」および「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチドの機能を指す。プライマーは、典型的には、ポリメラーゼまたは標的とのハイブリダイゼーション後の結紮により伸長されるが、しかしプローブは典型的にはそうではない。ハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドは、それが標的配列を捕捉するかまたは検出するために用いられる場合、プローブとして機能し得るし、そして同一オリゴヌクレオチドは、それが増幅プライマー中の標的結合配列として用いられる場合、プライマーとして機能し得る。したがって、ＴＮＦ遺伝子の増幅、検出または量子化のために本明細書中で開示される標的結合配列のいずれかは、ハイブリダイゼーションプローブとして、あるいは選択された増幅反応に必要とされる特殊化配列に任意に連結される検出または増幅のためのプライマー中の標的結合配列として、あるいは検出を促進するために、用いられ得る、と理解される。
【００１８】
本明細書中で用いる場合、「ＴＮＦ-α遺伝子」という用語は、本発明の方法が適用し得るヒト遺伝子を意味する。当該遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する多機能性前炎症性サイトカインである。ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦ-α遺伝子は、位置６ｐ２１．３３で第６染色体上に限局され、この配列は、寄託番号Ｘ０２９１０下でGenebankに委託される。ＴＮＦプロモーター配列は、http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=prominfo&pid=113301に設置されたプロモーター・データベースでNo. 13301と呼ばれる。ＴＮＦ-α遺伝子のゲノム配列の一例は、配列番号１で示される。
【００１９】
本明細書中で意図される場合、「ＴＮＦ-α遺伝子の両コピー」という表現は、ヒトゲノム中に存在するＴＮＦ-α遺伝子の2つの対立遺伝子に関する。
【００２０】
「ＴＮＦ-α」という用語は、腫瘍壊死因子-αを意味する。ヒトＴＮＦ-αは、ＴＮＦ-α遺伝子によりコードされるヒトサイトカインである。このサイトカインは、17 kD分泌形態および26 kD膜関連形態として存在し、その生物学的活性形態は、非共有結合17 kD分子の三量体からなる。ヒトＴＮＦ-αの構造はさらに、例えばPennica, D., et al. (1984) Nature 312: 724-729；Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 26: 1322-1326；およびJones, E.Y., et al. (1989) Nature 338: 225-228に記載されている。天然サイトカインであるＴＮＦ-αは、炎症性応答において、そして免疫損傷において、中心的役割を演じる。それは前駆体膜貫通タンパク質の切断により形成されて、三分子複合体を形成するよう集合する可溶性分子を形成する。これらの複合体は、次に、種々の細胞上に見出される受容体と結合する。結合は、一連の前炎症性作用、例えば他の前炎症性サイトカイン（例えばＩＬ‐６、ＩＬ‐８およびＩＬ‐１）の放出；マトリックス・メタロプロテイナーゼの放出；および内皮細胞接着分子の発現の上向き調節、さらに血管外組織に白血球を引きつけることにより炎症および免疫カスケードの増幅を生じる。
【００２１】
「突然変異体」および「突然変異」という用語は、遺伝物質、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または任意のプロセス、メカニズムにおける任意の検出可能な変化、あるいはこのような変化の結果を意味する。これは、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変更される遺伝子突然変異、任意の突然変異過程から生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、ならびに修飾遺伝子またはＤＮＡ配列により発現される任意の発現産物（例えばタンパク質または酵素）を包含する。一般的には、突然変異は、被験者により発現される核酸またはポリペプチドの配列を、対照集団で発現される対応する核酸またはポリペプチドと比較することにより、上記被験者において同定される。遺伝物質における突然変異は「サイレント」でもあり得る、即ち、突然変異は、発現産物のアミノ酸配列の変更を生じない。
【００２２】
「単一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」という用語は、上記のような特異的置換を指す。ＴＮＦ-α遺伝子における-８５７Ｃ／Ｔ、-３０８Ａ／Ｇ、-２３８Ａ／Ｇ置換からなる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、それぞれ、ＮＣＢＩ寄託番号rs1799724、rs1800629およびrs361525（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp）により開示されている。
【００２３】
上記ＳＮＰは、当業者に周知の、そしてSimmonds et al. (2004)（特にSimmonds et alの図２）に特筆されているＴＮＦ-αの特定のナンバリングにより番号付けされる。上記の特定のナンバリングにおける元のヌクレオチド（ヌクレオチド0）は、標準ナンバリングを用いる場合、−１８０に対応する（ここで、ヌクレオチド＋１は翻訳開始コドンＡＴＧのＡに対応する）。標準ナンバリングによれば、上記ＳＮＰはそれぞれ、−１０３７Ｃ／Ｔ、−４８８Ａ／Ｇおよび−４１８Ａ／Ｇに対応する。代替的には、参照として配列番号１を考えると、ＳＮＰはそれぞれ、３３Ｃ／Ｔ、５８２Ａ／Ｇおよび６５２Ａ／Ｇに対応する。
【００２４】
「ハプロタイプ」という用語は、統計学的に関連する単一染色分体の上の一組の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を意味する。ハプロタイプは、ホモ接合またはヘテロ接合形態で存在し得る。
【００２５】
「患者」という用語は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療から利益を受けると思われる疾患、特にＴＮＦ-α関連疾患に罹患した任意の被験者（好ましくはヒト）を指す。
【００２６】
「ＴＮＦ-α関連疾患」という用語は、ＴＮＦ-αにより推進される炎症過程に関連した疾患を意味する。さらに特定的には、ＴＮＦ-α関連疾患としては、障害に罹患している被験者におけるＴＮＦ-αの存在が、障害の病態生理学の原因である存在または障害の悪化に関与する因子であることが示されているかまたはそれが疑われる疾患およびその他の障害が挙げられる。
【００２７】
「ＴＮＦ-α遮断薬」は、ＴＮＦ-α特性を有意に低減し得る分子、例えばタンパク質または小分子を指す。
【００２８】
ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する「応答者」または「応答性」患者、あるいは患者の群は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いて治療された場合に疾患における臨床的に有意の軽減を示すかまたは示すであろう患者または患者の群を指す。疾患活性は、当該技術分野で認識される基準、例えば「疾患活性スコア（ＤＡＡ）」または米国リウマチ学会（ＡＣＲ）判定基準（慢性関節リウマチの活性の測定である）に従って測定され得る。算定には、以下のパラメーターが包含される：
- 28-疼痛関節点数に基づいた接触に対する関節圧痛（ＴＥＮ）の数
- 28-疼痛関節点数に基づいた腫脹関節（ＳＷ）の数
- 赤血球沈降速度（ＥＳＲ）
- 疾患活性についての患者の査定（ＶＡＳ；mm）（ＰＡＴＤＡＩ）
ＤＡＳ28は、ベースラインに対する参照を必要としない連続変数を提供する：ＤＡＳ28＝0.56×平方根（ＴＥＮ28）＋0.28×平方根（ＳＷ28）＋0.70×（ＩｎＥＳＲ）＋0.014×ＰＡＴＤＡＩ．（Prevoo et al. 1995）。ＡＣＲ応答判定基準は、圧痛および腫脹関節の数、急性期応答、機能的評価（例えばＨＡＱスコア）、疼痛に関する視覚的アナログ尺度、ならびにこれも視覚的アナログ尺度に関する患者および医者による疾患の包括的評価におけるベースラインからの変化を測定する。腫脹および圧痛関節点数における、そして残りの5つのパラメーターのうちの3つにおける20％、50％および70％改善は、それぞれ、ＡＣＲ20、ＡＣＲ50およびＡＣＲ70応答を表す（Arnett）。したがって疾患が慢性関節リウマチである場合、参照値を提供する患者の好ましい一応答群は、ＡＣＲ判定基準および／またはＤＡＳの有意の変化を示す一群である。例えばＴＮＦ-α遮断薬、例えばアダリムマブ（ＡＤＡ）を用いた治療の3ヶ月後のＤＡＳ28≧1.2は、疾患における有意の軽減を示す。それぞれＴＮＦ-α遮断薬、例えばアダリムマブ（ＡＤＡ）を用いた治療の12週後のＡＣＲ50は、疾患の有意の軽減を示す。
【００２９】
本明細書中で意図されるように、「標準応答性に比してのＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する上記患者の応答性の見込み減少」とは、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合である例えばＲＡを有する患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答する確率は、同一病態、例えばＲＡを有する患者の一般集団に関して観察されたものより低いということを意味する。好ましくは、治療に応答する患者の比率が統計的に有意であると考えられ得るよう、一般集団は十分な患者を含む。
【００３０】
特に、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合である例えばＲＡを有する患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答する確率は、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合でない同一病態を有する患者の集団に関して観察されたものより低い。
【００３１】
例えば、以下の実施例で実証されるように、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合性であるＲＡ患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答するという確率は約35％であり、一方、この確率は、患者の一般集団においては少なくとも約40％を有するかまたは−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合でない患者の間では少なくとも約50％を有する。
【００３２】
本明細書中で意図されるように、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置−２３８のグアニン、位置−３０８のグアニン、および位置−８５７のシトシンを同時に保有しない患者は、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の少なくとも1つのコピー上の位置−２３８のアデニン、位置−３０８のアデニン、および位置−８５７のチミンのうちの少なくとも1つを特に保有し得る。
【００３３】
発明の方法：
本発明の方法は、ホモ接合形態でのその存在が患者をＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答者と非応答者とに区別可能にする特定のハプロタイプの同定に基づいている。
【００３４】
好ましくは、患者のハプロタイプは、上記患者から採取された核酸試料に関して確定される。
【００３５】
核酸試料は、任意の細胞源または組織生検から得られる。利用可能な細胞源の例としては、血球、頬細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、あるいは生検により得られる組織中に存在する任意の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、体液、例えば血液またはリンパ液等からも得られる。ＤＮＡは、当該技術分野で既知の任意の方法、例えばSambrook et al., 1989に記載されたような方法を用いて抽出され得る。
【００３６】
ＳＮＰは、好ましくは増幅後に、核酸試料中で検出され得る。例えば単離ＤＮＡは、突然変異化部位に特異的であるか、あるいは突然変異化部位を含有する領域の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に付され得る。第一の代替法によれば、プライマーアニーリングのための条件は、特異的逆転写（適切な場合）および増幅を保証するために選択され得る；したがって増幅産物の出現は、特定突然変異の存在の診断メッセージである。別の状況では、ＤＮＡが増幅され、その後、適切なプローブとのハイブリダイゼーションにより、あるいは直接シーケンシングまたは当該技術分野で既知の任意の他の適切な方法により、増幅配列中で、突然変異化部位が検出され得る。
【００３７】
実際には、遺伝子型分析のための多数の戦略が利用可能である。要するに、核酸分子は、制限部位の存在または非存在に関して試験され得る。塩基置換突然変異が制限酵素の認識部位を作製するかまたは廃棄する場合、これは、突然変異に関する簡単な直接ＰＣＲ試験を可能にする。さらなる戦略としては、直接シーケンシング、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析；適切緊縮ハイブリダイゼーション条件下で完全整合配列とのみハイブリダイズする短い合成プローブである対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とのハイブリダイゼーション；対立遺伝子特異的ＰＣＲ；突然変異誘発プライマー；リガーゼ-ＰＣＲ、ＨＯＴ切断；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度変性勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）および変性高速液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。直接シーケンシングは、任意の方法、例えば化学的シーケンシングにより、Maxam-Gilbert法を用いて；酵素的シーケンシングにより、Sanger法を用いて；質量分析的シーケンシングにより；チップ・ベースの技法を用いたシーケンシング；ならびに実時間定量的ＰＣＲにより成し遂げられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、被験者からのＤＮＡは、先ず、特異的増幅プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に付される。しかしながら、ＰＣＲとは別にＤＮＡを試験させるいくつかのその他の方法、例えばローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、インベーダーＴＭアッセイ、またはオリゴヌクレオチド結紮検定（ＯＬＡ）が利用可能である。ＯＬＡは、塩基置換突然変異を明示するために用いられ得る。この方法によれば、標的核酸中の隣接配列とハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドが構築され、連結は突然変異の位置に置かれる。ＤＮＡリガーゼは、それらが完全にハイブリダイズされる場合、2つのオリゴヌクレオチドのみを共有的に連結する。
【００３８】
本発明のＳＮＰは、文書WO 2004/106546およびWO 2006/001627に記載されたものと同様のＤＮＡチップ技法を用いることにより同定され得る。
【００３９】
少なくとも10ヌクレオチドを有し、そして本明細書中の当該配列と相補的なまたは相同の配列を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとしての有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、しかし典型的には、匹敵サイズを有する相同領域と少なくとも約80％同一、好ましくは85％同一、さらに好ましくは90〜95％同一である、と理解される。ある種の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するための適切な手段、例えば検出可能標識と組合せて核酸を用いることが有益である。広範な種々の適切な指標、例えば蛍光性、放射性および酵素的またはその他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）が、当該技術分野で既知である。プローブは、典型的には、10〜1000ヌクレオチド長の、例えば10〜800ヌクレオチド長の、さらに好ましくは15〜700ヌクレオチド長の、典型的には20〜500ヌクレオチド長の１本鎖核酸を含む。
【００４０】
プライマーは、典型的には、増幅されるべき当該核酸と完全にまたはほぼ完全に整合するよう意図された10〜25ヌクレオチド長のより短い１本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に「特異的」であり、即ち、それらは好ましくは、高緊縮ハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍに対応する、例えば50％ホルムアミド、5×または6×ＳＣＣ。ＳＣＣは0.15 MＮａＣｌ、0.015 MＮａクエン酸塩である）下でハイブリダイズする。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、当該突然変異は、患者の核酸試料を、任意に標識される核酸プローブと接触することにより検出される。プライマーは、当該突然変異化位置を含有するＴＮＦ-α遺伝子（例えば配列番号１）の部分を増幅するかまたはシーケンシングするためにも有用であり得る。
【００４２】
このようなプローブまたはプライマーは、当該突然変異化位置を含有するＴＮＦ-α遺伝子配列（例えば配列番号１）の一部分と特異的にハイブリダイズし得る核酸である。それは、それらが高緊縮条件下で関連する突然変異化ＴＮＦ-α核酸配列の部分とハイブリダイズする配列である、ということを意味する。
【００４３】
オリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマーは、少なくとも10、15、20または30のヌクレオチドを含有し得る。それらの長さは、400、300、200または100ヌクレオチドより短いことがある。
【００４４】
ＴＮＦ-α遮断薬：
特定の一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬は、組換えＴＮＦ-受容体ベースのタンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ断片により連結される2つの可溶性ＴＮＦ-α受容体からなる組換え融合タンパク質であるエタネルセプト）を包含する。ペギル化可溶性ＴＮＦ１型受容体も、ＴＮＦ遮断薬として用いられ得る。付加的には、サリドマイドは、強力な抗ＴＮＦ剤であることが実証されている。したがってＴＮＦ-α遮断薬はさらに、ホスホジエステラーゼ４（ＩＶ）阻害薬サリドマイド類似体およびその他のホスホジエステラーゼＩＶ阻害薬を包含する。特定の一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬は、可溶性形態のＴＮＦ-α受容体または抗ＴＮＦ-α抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブまたはＣＤＰ５７１である。別の特定の一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬は、エタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブから成る群から選択される。最も好ましい一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬はアダリムマブである。
【００４５】
ＴＮＦ-α関連疾患：
特定の実施形態では、患者はＴＮＦ-α関連疾患に冒される。
【００４６】
ＴＮＦ-α関連疾患としては、自己免疫障害、感染性疾患、移植片拒絶または移植片対宿主病、悪性疾患、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害および血管炎が挙げられ得る。一実施形態では、自己免疫障害は、慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、痛風関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎およびネフローゼ症候群から成る群から選択される。別の実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患は、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再還流損傷、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症および放射線毒から成る群から選択される。さらに別の実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患は、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、乾癬性関節炎および慢性尋常性乾癬から成る群から選択される。
【００４７】
本発明の一実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患はクローン病である。別の実施形態では、疾患は潰瘍性大腸炎である。さらに別の実施形態では、疾患は乾癬である。さらに別の実施形態では、疾患は乾癬性関節炎（ＰｓＡ）と組合せた乾癬である。
【００４８】
好ましい実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患は慢性関節リウマチである。
【００４９】
本発明の方法は、活動性である慢性関節リウマチ患者におけるＴＮＦ-α遮断薬による治療に対する応答性を予測するために特に有用である。
【００５０】
ＲＡの治療のために通常考察される最前線療法であるメトトレキセート（ＭＴＸ）に対して耐性である患者は、本発明の方法が特に有用であり得るさらなる好ましい群の患者である。
【００５１】
さらに一般的には、例えばＭＴＸ、アザチオプリンまたはレフルノミドを用いた彼らのＴＮＦ-α関連疾患のための基礎治療をすでに受けている患者は、本発明の試験方法のための特に良好な候補である。
【００５２】
ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答性に関して試験された後、患者は、同一基礎治療とともにまたは伴わずに、ＴＮＦ-α遮断薬を処方され得る。特に併用アダリムマブ／ＭＴＸは、ＲＡおよびその他のＴＮＦ-α関連疾患を有する患者において特に有効であり得る。
【００５３】
キット：
本発明はさらに、本発明のハプロタイプを確定するのに適したキットを提供する。
【００５４】
キットは、以下の構成成分を包含し得る：
（ｉ）通常はＤＮＡから作製され、そして前標識され得るプローブ。あるいはプローブは標識され得ず、そしてラベリングのための成分は別個の容器でキットに包含され得る；そして
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション試薬：キットは、特定のハイブリダイゼーション・プロトコールに必要とされる適切に包装された試薬および物質、例えば固相マトリックス（適用可能な場合）、そして標準物質も含有し得る。
【００５５】
別の実施形態では、キットは以下のものを包含する：
（ｉ）配列確定または増幅プライマー：シーケンシング・プライマーは前標識され得るし、あるいはアフィニティー精製または結合部分を含有し得る；そして
（ｉｉ）配列確定または増幅試薬：キットは、特定のシーケンシング増幅プロトコールに必要とされるその他の適切に包装された試薬および物質も含有し得る。好ましい一実施形態では、キットは、それらの配列が多型位置のうちの少なくとも1つに隣接する配列に対応するシーケンシングまたは増幅プライマーのパネルを、ならびに各多型性配列の存在を検出するための手段を含む。
【００５６】
特定の一実施形態では、本明細書中で同定される少なくとも1つの突然変異化位置、特にＴＮＦ遺伝子中の位置−２３８、−３０８および−８５７を含むＴＮＦ-α遺伝子プロモーターを増幅するために特異的な一対のヌクレオチドプライマーを含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】例示薬理遺伝学的試験の流れ図を表す。
【図２】ＴＮＦ-α遺伝子または別のハプロタイプに関して、−２３８Ｇ、−３０８Ｇおよび−８５７Ｃハプロタイプ（ＧＧＣ）を有するＲＡ患者のアダリムマブを用いた治療の開始後12週のＡＣＲ50（米国リウマチ学会判定基準による症候の50％改善）を表す。
【図３】治療（ＭＴＸを用いてまたは用いずに）およびＧＧＣハプロタイプ保有状態によるＡＣＲ50応答（縦軸、ＡＣＲ50応答者患者の％）の時間経過展開（横軸、週）を示す。
【実施例】
【００５８】
方法
患者：この薬理遺伝学的試験は、補助的に、欧州およびオーストラリアにおける種々の場所で実施されるＲｅＡｃｔ（活動期慢性関節リウマチの調査）プロトコールからであった。親ＲｅＡｃＴ試験において、完全ヒトＩｇＧ１抗ＴＮＦモノクローナル抗体であるアダリムマブの安全性および有効性を査定するために、6610名の患者を包含した。ＲｅＡｃｔ試験の目的は、エタネルセプトまたはインフリキシマブで予め処置された患者を含めて、種々の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と組合せたＡＤＡの効力および耐容性を評価することであった。要するに、ＲｅＡｃｔ試験に登録された患者は、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）の1987年改訂判定基準（Amett et al. 1988）に従った活動期成人発症性ＲＡを有する年齢≧18歳の男性および女性であった。選択基準は、≧3ヶ月の疾患持続期間；少なくとも中等度の疾患活性を示す≧3.2の赤血球沈降速度および28関節の評価に基づいた疾患活性スコア（ＤＡＳ28）（13）；ならびに少なくとも1つの伝統的ＤＭＡＲＤによる治療ミスを要した。他のＴＮＦアンタゴニストを含めた生物学的応答修飾剤を用いた従来の療法は、当該投薬が登録前に≧2ヶ月中断された場合、容認された。
【００５９】
本明細書中に記載される薬理遺伝学的試験は、フランス人患者の大型コホートを包含した。包含される患者はすべて、書面でインフォームド・コンセントを提供した。試験は、地方倫理委員会により承認された。主要結果変数（治療の12週間後のＡＣＲ50応答の達成）に対応する主分析において、臨床試験に含まれた患者7名が、彼らがアジア系またはアフリカ系であったため、この薬理遺伝学的試験から除外された（図１）。9名の他の患者は、治療に対する応答に関するデータの欠如のため、統計学的分析から除外された。したがって、元の集団から総計382名の患者がこの試験に適格であった。これらの患者の間では、ＡＤＡはＭＴＸと併用され（n=186）、そして他の場合はＭＴＸを伴わずに投与された（n=196）。
【００６０】
臨床的および生物学的データの収集ならびに結果測定： 臨床的および生物学的収集データは、元のＲｅＡｃｔプロトコールからのものであった。ベースライン、2、6、12週目に、ＤＡＳ 28およびＡＣＲ応答を査定するために必要な変数すべてを、ＡＡＱスコアと同様に記録した。遺伝的試験のために選択された主要結果は、治療の12週後のＡＣＲ50応答であった。12週目に記録された他の応答データは、ＡＣＲ20およびＡＣＲ70応答であった。
【００６１】
遺伝的多型：白人集団におけるＴＮＦ＋４８８、−２３８および−３０８単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）により構成される4つの主要ハプロタイプを立証した従来の報告に従って、分析されるＴＮＦ遺伝子多型を選択した。それにもかかわらず、ＴＮＦ＋４８８はＴＮＦ−８５７と強連鎖不均衡（ＬＤ）で存在すると報告されている（ＬＤ値、白人集団ではＤ‘＝0.92（Simmonds et al. 2004））ので、そしてＴＮＦ−８５７は、エタネルセプトに対する臨床的応答に影響を及ぼすことが近年報告された（Kang et al. 2005）ため、ＴＮＦ＋４８８の代わりにＴＮＦ−８５７を遺伝子型分類することに決めた。予測どおり、ハプロタイプ再構成後、ＲＡ患者の白人集団中に4つの主要ハプロタイプをわれわれも見出した。特定ＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子はＲＡ感受性 - 共有エピトープ仮説（ＳＥ）（Gregersen et al. 1987） - および重症度において重要な役割を演じることが従来報告されているので、われわれも、直接シーケンシングによりＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子に関してＲＡ患者を遺伝子型分類した。ＳＥを有すると考えられる対立遺伝子は、ＨＬＡ-ＤＲＢ１ *０１０１、*０１０２、*０４０１、*０４０４、*０４０５、*０４０８、*０４１３、*０１００１および*０１４０２であった（Gregersen et al. 1987）。ＡＤＡ治療に対する応答におけるＳＥ寄与を分析するために、ＳＥの0、1または2つのコピーを有するとして、あるいはＳＥキャリアであるか否かであるとして、患者を分類した。ＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子およびＴＮＦ ＳＮＰを含む延長されたハプロタイプも再構築した。
【００６２】
遺伝子型分類方法：ＨＬＡ-ＤＲＢ１および3つのＴＮＦ-α遺伝子多型（−２３８Ａ／Ｇ、−３０８Ａ／Ｇおよび−８５７Ｃ／Ｔ）に関して、患者を遺伝子型分類した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅およびＡＢＩ 3700シーケンサー（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いたＤＮＡシーケンシングにより、ＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子を確定した。
【００６３】
本明細書中で提供される手法に従って、対立遺伝子識別TaqMan ＰＣＲにより、ＴＮＦ-α −８５７Ｃ／Ｔを遺伝子型分類した。用いたプライマーは、5’ GGTCCTGGAGGCTCTTTCACT 3’（配列番号２）および5’ AGAATGTCCAGGGCTATGAAAGTC 3’（配列番号３）であった。本明細書中で用いたプローブは、野生型に関しては5’ CCCTGTCTTCATTAAG（配列番号４）および突然変異体に関しては5’ CCCTGTCTTCGTTAAG（配列番号５）であった。
【００６４】
ＭｓｐＩ制限酵素を用いて、ミスマッチポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）-制限全長多型（ＲＦＬＰ）により、ＴＮＦ −２３８Ａ／Ｇ ＰＣＲ遺伝子多型を遺伝子型分類した。ＰＣＲ増幅のために用いられるプライマーは、以下のものであった：順方向5’ ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG 3’（配列番号６）および逆方向5’ AGAAGACCCCCCTCGGAACC 3’（配列番号７）。逆方向プライマーは目的のあるミスマッチ配列を含有し、したがってＰＣＲ産物中に組入れられると、それらはＧ対立遺伝子を有するがしかしＡ対立遺伝子を有さないＭｓｐＩを作り出す。
【００６５】
PreDeveloped TaqMan検定キットC_7514879を用いて、対立遺伝子識別TaqMan ＰＣＲにより、ＴＮＦ-α −３０８Ａ／Ｇを遺伝子型分類した。7900HT Applied Biosystems実時間サーマルサイクラー（Applied Biosystems, Courtaboeuf, France）を用いて、増幅を実施した。
【００６６】
統計学的分析：定量的データはすべて、平均＋／−ＳＤとして表される。定性的データはすべて、頻度およびパーセンテージとして表される。一変量回帰を実施して、候補共変量をスクリーニングした。次に、共変量を有するモデルと有さないモデルを、χ2検定を用いて比較した。次に、前の分析で選択されたすべての共変量を含めた多変量回帰モデルを構築した。モデル中に共変量を保有するための閾値は、0.05であった。
【００６７】
各遺伝子に関しては、遺伝子型およびハプロタイプを、12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答との関連に関して試験した。遺伝子型分類されたＳＮＰはすべて、Hardy-Weinberg平衡であった。各遺伝子型に関しては3×2クロスタブを用いて、そして両側カイ二乗検定で、ホモ接合およびへテロ接合遺伝子型の各々の考え得る組合せに関しては2×2クロスタブを用いて、効能に関する遺伝子型分布の差を試験した。
【００６８】
ＴＮＦ遺伝子内で、異なるＳＮＰ間のＬＤの測定値を、Somers’のＤ係数を用いて概算した。すべてのＴＮＦ ＳＮＰ間、ならびにＴＮＦ ＳＮＰおよびＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子間に有意のＬＤが存在したので、ＴＮＦに関するハプロタイプならびにＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子およびＴＮＦを含む延長されたハプロタイプを、われわれも考察した。ソフトウエアＰＨＡＳＥ（バージョン2.1）を用いて、ハプロタイプ再構築を実施した。このBayesianアルゴリズムは、各被験者により保有されるハプロタイプの最もありそうな対を提供する（Stephens et al. 2001, Stephens et al. 2003）。ハプロタイプ推定におけるＰＨＡＳＥ確実性の平均確率は、ＴＮＦハプロタイプに関しては99％、そしてＳＥ-ＴＮＦ広範囲ハプロタイプに関しては83％であった。ＴＮＦ遺伝子座中のＳＥおよび３ ＳＮＰが調査されたため、そしてハプロタイプ再構築が実施されたため、多重比較のためにBonferroni補正を適用した。調整および非調整Ｐ値がともに、提示される。0.05未満のＰ値は有意と考えられた。
【００６９】
結果：
コホートの説明：患者のベースライン特性を表１に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
この薬理遺伝学的試験に含まれる382名の患者の臨床的応答のプロフィールは、全ＲｅＡｃｔ集団（6,610名の患者）のものと同一であった。12週目には、患者の41％（n=152）がＡＣＲ50応答者であり、70％（n=267）がＡＣＲ20応答者であり、そして15％（n=59）がＡＣＲ70応答者であった。ＡＤＡへのＭＴＸ付加は、一変量（Ｐ＝0.005）および多変量分析（見込み比：1.76；95％ＣＩ：1.14〜2.74）の両方において、より良好なＡＣＲ50応答に有意に関連した。
【００７２】
遺伝子型分布を以下に示す：ＴＮＦ −２３８ Ｇ＞Ａに関しては、94.4％ＧＧ、5.3％ＡＧ、一患者は稀なＡＡ遺伝子型を有した；−３０８Ｇ＞Ａに関しては、70％ＧＧ、26.5％ＡＧ、2.5％ＡＡ；−８５７ Ｃ＞Ｔに関しては：82.7％ＣＣ、17％ＣＴ、一患者は稀なＴＴ遺伝子型を有した。これらの分布は、白人集団に関する公的データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP）からのものと一致した。
【００７３】
患者間のＳＥの分布を、以下に示す：0コピー25.4％、1コピー47.6％、2コピー27％。このような分布は、ＳＥキャリア74.6％および非ＳＥキャリア25.4％を生じた。
【００７４】
位置−２３８、−３０８および−８５７でＴＮＦ-αプロモーター中にＳＮＰを有する4つの主要ハプロタイプを構築した（例えば−２３８Ｇ、−３０８Ｇおよび−８５７ＣからなるハプロタイプＧＧＣ）。これらの最高頻度のハプロタイプ（ＧＧＣ、ＧＡＣ、ＧＧＴおよびＡＧＣ）は、それぞれ73、15、9および3％の頻度で、合計99％以上を占める。稀なＡＡＣハプロタイプは、一患者にのみ見出された。
【００７５】
ＡＤＡ応答に及ぼすＳＥおよび個々のＴＮＦ-α遺伝子型の影響： 12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答とＳＥまたはＳＥ保有状態のコピー数との間の相関を、われわれは見出さなかった（表２）。
【００７６】
【表２】
【００７７】
12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答と3つのＴＮＦ-α遺伝子多型（−２３８Ａ／Ｇ、−３０８Ａ／Ｇおよび−８５７Ｃ／Ｔ）遺伝子型のいずれかとの間の相関も、われわれは見出さなかった（表２）。それにもかかわらず、−２３８ＧＧ、−３０８ＧＧおよび−８５７ＣＣ遺伝子型間の関連傾向、ならびにＡＤＡに対するより乏しい応答が観察された（表２）。
【００７８】
ＡＤＡ応答に及ぼすＴＮＦ-αハプロタイプの影響： ＡＤＡ応答に及ぼすＴＮＦＡハプロタイプの遺伝的作用が分析された場合、ＧＧＣハプロタイプ保有状態による有意の応答差をわれわれは観察した（表３）。
【００７９】
【表３】
【００８０】
第一の分析において、10回未満示される稀なハプロタイプの組合せ：ＡＧＣ／ＡＡＣ（Ｎ＝1）、ＧＡＣ／ＡＧＣ（Ｎ＝2）、ＧＡＣ／ＧＡＣ（Ｎ＝9）、ＧＧＴ／ＡＧＣ（Ｎ＝3）、ＧＧＴ／ＧＡＣ（Ｎ＝9）、ＧＧＴ／ＧＧＴ（Ｎ＝3）を、われわれは除いた。残りの4つの主要ハプロタイプの組合せでは、ＧＧＣハプロタイプに関するホモ接合個体（Ｎ＝184）は、3つの他のより高頻度の組合せハプロタイプ：ＧＧＣ／ＧＡＣ 47％（Ｎ＝77）、ＧＧＣ／ＧＧＴ 53％（Ｎ＝45）およびＧＧＣ／ＡＧＣ 71％（Ｎ＝14）と比較して、有意に低いＡＣＲ50応答率（34％）を有した（Ｐ＝0.0041、Ｐｃ＝0.02）（表３）。このような観察は、治療に対する応答に及ぼすＧＧＣハプロタイプの逆行性作用を大いに示唆した。実際、ＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリア間の応答率は33％で、他のハプロタイプの組合せすべてに関して観察された50％応答率より有意に低かった（Ｐ＝0.003、Ｐｃ＝0.015）（図２）。12週目のＡＣＲ20およびＡＣＲ70応答は、類似の傾向が両方の群で観察された場合でさえ、ＧＣＣホモ接合性により有意に影響されない二次終点判定基準であった：それぞれ、ＧＧＣ／ＧＧＣ群における69％応答対他のハプロタイプ・キャリアの間の76％（Ｐ＝0.14）、ならびにＧＧＣ／ＧＧＣ群における15％応答対他のハプロタイプ・キャリアの間の19％（Ｐ＝0.3）。これらの群における有意差の欠如は、おそらくは、応答者および非応答者間の患者の不均衡分布のための力の損失により説明される。逆に、12週目でのＡＣＲ50は、全集団の50％に近い応答者および非応答者の分布を伴う作用を実証するための最良の統計学的力を提供する。
【００８１】
次に、ＧＧＣホモ接合患者と、われわれの結果を妨害し得る他のハプロタイプ・キャリアとの間のベースライン特性差を探索した。特にＤＡＳ28ＲＡ疾患活性判定基準に関して、両群間に有意差は認められなかった（表４）。
【００８２】
【表４】
【００８３】
試験した集団の約半数はＭＴＸ治療を受けていたので、（ＭＴＸを用いてまたは用いずに）各治療亜群に及ぼすＧＧＣホモ接合性をさらに分析した。意外にも、ＧＧＣホモ接合性に関連したより不十分な応答は、ＭＴＸを摂取している患者の群に主に存在した：この群では、ＡＣＲ50応答率はＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリア間では38％であったが、これに対して他のハプロタイプ・キャリア間では60％であった（Ｐ＝0.0095；Ｐｃ＝0.047）。ＭＴＸを用いない群では、ＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリア間のＡＣＲ50応答率（30％）は他のハプロタイプ・キャリア間（40％）より低かったが、しかし両群間の差は有意ではなかった（Ｐ＝0.25）。各治療群におけるＡＣＲ50応答の時間経過展開は、非常に興味深いものであった（図３）。実際、ＭＴＸ処置患者の間では、ＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリアと他のハプロタイプ・キャリアとの間の応答差は2週目にすぐに同定可能であり、そして12週目まで依然として増大した。ＭＴＸを用いない群では、ＧＧＣ／ＧＧＣキャリアと他の患者との応答差はより遅く、約10週目に、より低い大きさで認められたが、これは、ＭＴＸを用いない群における12週目での応答率間の有意差を支持する傾向がＲｅＡｃｔプロトコールに残念ながら利用可能でないより長期の追跡調査で真の有意差になり得る、ということを示唆する。
【００８４】
ＡＤＡ応答に及ぼすＧＧＣホモ接合性の負の作用に及ぼすＳＥの影響： ＴＮＦＡ遺伝子座はＨＬＡ ＤＲＢ１の直ぐ近くに位置し、そこで、ＧＧＣハプロタイプがＳＥに属するいくつかの対立遺伝子とＬＤで存在する程度を分析したいとわれわれは考えた。ＳＥのコピー数の分布はＧＧＣホモ接合患者と他の患者との間で有意に異なり（Ｐ＝0.0012）、したがってＧＧＣハプロタイプとＳＥからの対立遺伝子との間のＬＤを示唆した（表４）。
【００８５】
それにもかかわらず、このような分布は延長されたハプロタイプ再構築を基礎とせず、そしてＧＧＣハプロタイプとのＳＥ対立遺伝子のシス、ならびにトランス関係を反映し得た。延長されたハプロタイプ再構築後、ＧＧＣハプロタイプの60％がＳＥの対立遺伝子と関連したが、これに比して、非ＧＧＣハプロタイプは28％に過ぎなかった（Ｐ＝2.10-12）。したがって、ＧＧＣハプロタイプとＳＥの対立遺伝子との間のＬＤが確証された。延長されたハプロタイプ再構築は、82のＳＥ-ＴＮＦハプロタイプ組合せをもたらした。これらの延長されたハプロタイプの注意深い検査は、ＧＧＣハプロタイプが、白人間の最も高頻度のＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子に対応して、ＳＥのＨＬＡ ＤＲＢ１*０１０１および*０４０１対立遺伝子と主に関連する、ということを示した（表５）。
【００８６】
【表５】
【００８７】
０７０１-ＧＧＣハプロタイプ（24％応答）および０４０５-ＧＧＣハプロタイプ（30％応答）を除いて、これらの延長されたハプロタイプのほとんどが約40％のＡＣＲ50応答率（範囲36〜42）と関連した。
【００８８】
試験のこの段階では、ＧＧＣホモ接合ハプロタイプ・キャリアの間で観察されたより不十分な応答がＳＥの対立遺伝子とのＬＤのためであり得るか否かを分析することが重要であった。2コピーのＳＥのキャリアの間の12週目のＡＣＲ50応答者の割合は40％で、0または1コピーのＳＥのキャリアの応答率（41％）と有意に異ならなかった。したがって、ＳＥとの関連の欠如は、両染色体上に保有された場合でも、そして12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答が不十分でも、このような仮説を申し立てる。さらに、ＧＧＣホモ接合ハプロタイプ・キャリアは、患者がＳＥを保有した場合（37％）または保有しなかった場合（27％）、ＡＤＡに対して等しく応答した（Ｐ＝0.43）。
【００８９】
結論：
この薬理遺伝学的試験は、集団のサイズならびにＲｅＡｃｔ試験内で記録された臨床データの質のために、注目に値する。それは、単一ＴＮＦ-α遺伝子座ハプロタイプ（−２３８Ｇ／−３０８Ｇ／−８５７Ｃ）が、両染色体上に保有される場合、特定のＳＥ対立遺伝子に起因しない劣性モードに従ってＲＡ患者におけるＡＤＩに対するより不十分な応答と関連する、ということを示す強固なデータを提供する。
【００９０】
参考文献
【化１】
【００９１】
【化２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節の損傷および能力障害を誘導する慢性の自己免疫および炎症性多発性関節炎である。滑膜炎症過程に関与する不可欠なサイトカインの1つとしてのＴＮＦ-αの認識を、種々の研究がもたらしてきた。このような結果は、ＲＡの治療のためのＴＮＦ遮断薬（ＴＢＡ）の開発のための基礎を提供してきた。3つのＴＢＡがＲＡ治療のために一般に用いられており、その1つは組換え形態のＴＮＦ受容体、即ちＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（エタネルセプト）に相当し、そして他の2つは抗ＴＮＦ-αモノクローナル抗体：即ちインフリキシマブおよびアダリムマブ（ＡＤＡ）に相当する。これらのＴＢＡは、細胞表面のＴＮＦ受容体とのＴＮＦの結合を抑制し、したがってＴＮＦ駆動シグナル伝達経路を妨害することにより作用する。エタネルセプトはＴＮＦ-αおよびＴＮＦ-β（リンフォトキシンＡ（ＬＴＡ）としても既知）の両方と結合し、一方、インフリキシマブおよびアダリムマブはＴＮＦ-αのみと結合する。
【０００３】
ＴＢＡ／メトトレキセート組合せを用いた種々の臨床試験は、ＲＡ患者の55〜75％において効能を示してきた。ＴＢＡは、関節炎症を低減し、関節損傷を遅らせ、そして身体機能を改善する。依然として、ＴＮＦ-α遮断薬／メトトレキセート組合せを投与されたＲＡ患者の25〜45％が子の治療に応答しない。さらにまた、ＴＢＡは副作用を有し得るし、且つ費用が掛かり、そして投与患者において任意に投与されたＴＢＡの効力は予測不可能である。
【０００４】
これらの治療の経費、潜在的長期悪事象（感染および癌）についての存続する疑念、ならびにＲＡの治療における他の効率的生物療法の利用可能性を考慮に入れると、応答の予測因子の同定は重要な問題である。
【０００５】
ＨＬＡ-ＤＲハプロタイプのような遺伝的多型はＲＡの可変性の自然な過程ならびに慣用的疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対する異種応答に関連するため、少数の研究がＴＢＡ効能に関して遺伝子マーカーの同定を試みてきたし、そしてそれらはいくつかのサイトカイン遺伝子のプロモーターに集中してきた（Kang CP et al. 2006；Mugnier et al. 2003；Cuchacovich et al. 2004；Padyulov et al. 2003）。例えばＴＮＦ-α遺伝子プロモーターにおける配列変異はインフリキシマブに対する可変性応答と関連づけられてきた（Mugnier et al. 2003）。しかしながらそれらの研究は、矛盾する結果を、特にＴＮＦ-３０８Ａ／Ｇ多型性および／または共有エピトープの役割に関して矛盾する結果をもたらした（Padyulov et al. 2003；Criswell et al. 2004；Mugnier et al. 2003；Cuchacovich et al. 2004；Martinez et al. 2004；Mugnier et al. 2004；Fronseca et al. 2005；Kang et al. 2005；Lee et al. 2006）。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明人等は、ここで、ＴＮＦ-α遺伝子中の-２３８Ｇ、-３０８Ｇおよび-８５７ＣからなるハプロタイプがＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答を予測するのに有用であり得る、ということを同定した。
【０００７】
彼らは実際、慢性関節リウマチを有し、メトトレキセート（ＭＴＸ）を伴いまたは伴わずにアダリムマブ（ＡＤＡ）を用いて処置された白色人種患者の大型コホートにおいて、ＨＬＡ-ＤＲＢ１、ならびにＴＮＦ-α遺伝子の3つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、すなわち-８５７Ｃ／Ｔ、-３０８Ａ／Ｇおよび-２３８Ａ／Ｇを遺伝子型分類した。各遺伝子型に関しては、遺伝子型およびハプロタイプは、処置の12週目に、ＡＣＲ50応答（米国リウマチ学会判定基準による症候の50％改善）との関連に関して試験された。本発明人等は、遺伝子型分布で別個に試験された3つのＴＮＦ-α多型の何れもが一変量または多変量分析においてＡＣＲ50応答と関連しない、ということを実証した。逆に、ＴＮＦ-α遺伝子座のハプロタイプ再構築は、-２３８Ｇ、-３０８Ｇおよび-８５７Ｃからなるハプロタイプ（「ＧＧＣ」ハプロタイプ）が、ホモ接合形態（患者のほぼ50％に存在）では、ＡＤＡに対するより乏しい応答と有意に関連する、ということを明示した。
【０００８】
したがって、本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する患者の応答性の予測方法、特にin vitro方法であって、上記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定することを包含する方法であり、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの同時的存在が標準応答性に比してＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する上記患者の応答性の可能性減少を示す方法に関する。
【０００９】
本発明は、ＴＮＦ-α関連疾患を有する患者を治療するために意図された薬剤の製造のためのＴＮＦ-α遮断薬の使用であって、上記患者が上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンを同時的に保有しない使用にも関する。
【００１０】
本発明は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答すると思われる患者におけるＴＮＦ-α関連疾患の治療方法であって、以下の：
ａ）上記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定するステップ；
ｂ）上記患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答すると思われる場合、即ち、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンを上記患者が同時的に保有しない場合、治療的有効量の少なくとも1つのＴＮＦ-α遮断薬を患者に投与するステップ
を包含する方法にも関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
定義：
「コード配列」、あるは発現産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素を「コードする」配列は、発現された場合にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生を生じるヌクレオチド配列であり、即ち、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素に関するアミノ酸配列をコードする。タンパク質に関するコード配列は、開始コドン（通常はＡＴＧ）および停止コドンを含み得る。
【００１２】
「遺伝子」という用語は、1つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含むアミノ酸の一特定配列をコードするかまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、そして例えば遺伝子が発現される条件を確定する調節ＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列を含むことも含まないこともあり得る。構造遺伝子でないいくつかの遺伝子はＤＮＡからＲＮＡに転写され得るが、しかしアミノ酸配列に翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、あるいはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。特に遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、即ち調節因子、プロモーター、イントロンおよびエキソン配列を含む配列に関して意図され得る。
本明細書中で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に少なくとも10、好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも20のヌクレオチド、好ましくは100以下のヌクレオチド、さらに好ましくは70以下のヌクレオチドを有し、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズ可能である核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の技法に従って、例えば放射性標識、蛍光標識、酵素標識、配列タグ等を用いて、標識され得る。標識オリゴヌクレオチドは、ＴＮＦ核酸の対立遺伝子変異体の存在を検出するためのプローブとして用いられ得る。代替的には、オリゴヌクレオチド（標識され得るものの一方または両方）は、対立遺伝子変異体を検出するために、例えばＰＣＲ（Saiki et al., 1988）により、ＴＮＦ核酸の一領域を増幅するために用いられ得る。一般的には、オリゴヌクレオチドは、合成的に、好ましくは核酸合成機で、調製される。したがってオリゴヌクレオチドは、非天然リンエステル類似体結合、例えばチオエステル結合等を用いて調製され得る。
【００１３】
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で１本鎖形態の核酸分子が別の核酸分子とアニーリングされ得る場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡと「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al., 1989参照）。
【００１４】
温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「緊縮性」を確定する。同種の核酸に関する予備的スクリーニングのために、55℃のＴｍ（融点）に対応する低緊縮性ハイブリダイゼーション条件、例えば、5×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、0.25％ミルク、および無ホルムアミド；あるいは30％ホルムアミド、5×ＳＳＣ、0.5％ＳＤＳが用いられ得る。中等度の緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、最高Ｔｍ、例えば50％ホルムアミド、5×または6×ＳＣＣに相当する。ＳＣＣは、0.15 MＮａＣｌ、0.015 MＮａクエン酸塩である。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、しかしハイブリダイゼーションの緊縮性によって、塩基間のミスマッチが考えられる。核酸をハイブリダイズするための適切な緊縮性は、核酸の長さおよび相補性の程度（これらは当該技術分野で周知の変数である）によっている。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの総体的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で低減する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。100ヌクレオチド長より大きいハイブリッドに関しては、Ｔｍを算定するための方程式が得られている（Sambrook et al., 1989, 9.50-9.51参照）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を確定する（Sambrook et al., 1989, 11.7-11.8参照）。ハイブリダイズ可能な核酸に関する最小長は、少なくとも約10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり、そしてさらに好ましくはその長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００１５】
特定の一実施形態では、「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は55℃のＴｍを指し、そして上記のような条件を利用する。好ましい一実施形態では、Ｔｍは60℃である。さらに好ましい一実施形態では、Ｔｍは65℃である。特定の一実施形態では、「高緊縮性」は、0.2×ＳＳＣ中で68℃での、50％ホルムアミド、4×ＳＳＣ中で42℃での、あるいはこれら2つの条件のいずれかの下で観察されるものと等価のハイブリダイゼーションのレベルを提供する条件下での、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を指す。
【００１６】
本明細書中で用いる場合、増幅プライマーは、標的配列とのハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドの伸長による、あるいは標的配列とハイブリダイズされる場合に隣接する多数のオリゴヌクレオチドの結紮による標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドである。増幅プライマーの少なくとも一部分は、標的とハイブリダイズする。この部分は標的結合配列と呼ばれ、そしてそれはプライマーの標的特異性を確定する。標的結合配列のほかに、ある種の増幅方法は、増幅プライマー中に特殊化非標的結合配列を要する。これらの特殊化配列は、増幅反応が進行するために必要であり、そして典型的には、特殊化配列を標的に付すのに役立つ。例えば標準置換増幅（ＳＤＡ）に用いられる増幅プライマーとしては、標的結合配列に対して５‘の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が挙げられる（米国特許第5,455,166号および米国特許第5,270,184号）。核酸ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、ならびに転写ベースの増幅プライマーは、プライマーの標的結合配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを要する。選択された増幅反応に用いるための標的結合配列とのこのような特殊化配列の連結は、当該技術分野における常套手段である。それに対して、標的の末端に特殊化配列を必要としないＰＣＲのような増幅方法は、一般的に、標的結合配列のみからなる増幅プライマーを用いる。
【００１７】
本明細書中で用いる場合、「プライマー」および「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチドの機能を指す。プライマーは、典型的には、ポリメラーゼまたは標的とのハイブリダイゼーション後の結紮により伸長されるが、しかしプローブは典型的にはそうではない。ハイブリダイズ化オリゴヌクレオチドは、それが標的配列を捕捉するかまたは検出するために用いられる場合、プローブとして機能し得るし、そして同一オリゴヌクレオチドは、それが増幅プライマー中の標的結合配列として用いられる場合、プライマーとして機能し得る。したがって、ＴＮＦ遺伝子の増幅、検出または量子化のために本明細書中で開示される標的結合配列のいずれかは、ハイブリダイゼーションプローブとして、あるいは選択された増幅反応に必要とされる特殊化配列に任意に連結される検出または増幅のためのプライマー中の標的結合配列として、あるいは検出を促進するために、用いられ得る、と理解される。
【００１８】
本明細書中で用いる場合、「ＴＮＦ-α遺伝子」という用語は、本発明の方法が適用し得るヒト遺伝子を意味する。当該遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する多機能性前炎症性サイトカインである。ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦ-α遺伝子は、位置６ｐ２１．３３で第６染色体上に限局され、この配列は、寄託番号Ｘ０２９１０下でGenebankに委託される。ＴＮＦプロモーター配列は、http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=prominfo&pid=113301に設置されたプロモーター・データベースでNo. 13301と呼ばれる。ＴＮＦ-α遺伝子のゲノム配列の一例は、配列番号１で示される。
【００１９】
本明細書中で意図される場合、「ＴＮＦ-α遺伝子の両コピー」という表現は、ヒトゲノム中に存在するＴＮＦ-α遺伝子の2つの対立遺伝子に関する。
【００２０】
「ＴＮＦ-α」という用語は、腫瘍壊死因子-αを意味する。ヒトＴＮＦ-αは、ＴＮＦ-α遺伝子によりコードされるヒトサイトカインである。このサイトカインは、17 kD分泌形態および26 kD膜関連形態として存在し、その生物学的活性形態は、非共有結合17 kD分子の三量体からなる。ヒトＴＮＦ-αの構造はさらに、例えばPennica, D., et al. (1984) Nature 312: 724-729；Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 26: 1322-1326；およびJones, E.Y., et al. (1989) Nature 338: 225-228に記載されている。天然サイトカインであるＴＮＦ-αは、炎症性応答において、そして免疫損傷において、中心的役割を演じる。それは前駆体膜貫通タンパク質の切断により形成されて、三分子複合体を形成するよう集合する可溶性分子を形成する。これらの複合体は、次に、種々の細胞上に見出される受容体と結合する。結合は、一連の前炎症性作用、例えば他の前炎症性サイトカイン（例えばＩＬ‐６、ＩＬ‐８およびＩＬ‐１）の放出；マトリックス・メタロプロテイナーゼの放出；および内皮細胞接着分子の発現の上向き調節、さらに血管外組織に白血球を引きつけることにより炎症および免疫カスケードの増幅を生じる。
【００２１】
「突然変異体」および「突然変異」という用語は、遺伝物質、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または任意のプロセス、メカニズムにおける任意の検出可能な変化、あるいはこのような変化の結果を意味する。これは、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変更される遺伝子突然変異、任意の突然変異過程から生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、ならびに修飾遺伝子またはＤＮＡ配列により発現される任意の発現産物（例えばタンパク質または酵素）を包含する。一般的には、突然変異は、被験者により発現される核酸またはポリペプチドの配列を、対照集団で発現される対応する核酸またはポリペプチドと比較することにより、上記被験者において同定される。遺伝物質における突然変異は「サイレント」でもあり得る、即ち、突然変異は、発現産物のアミノ酸配列の変更を生じない。
【００２２】
「単一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」という用語は、上記のような特異的置換を指す。ＴＮＦ-α遺伝子における-８５７Ｃ／Ｔ、-３０８Ａ／Ｇ、-２３８Ａ／Ｇ置換からなる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、それぞれ、ＮＣＢＩ寄託番号rs1799724、rs1800629およびrs361525（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp）により開示されている。
【００２３】
上記ＳＮＰは、当業者に周知の、そしてSimmonds et al. (2004)（特にSimmonds et alの図２）に特筆されているＴＮＦ-αの特定のナンバリングにより番号付けされる。上記の特定のナンバリングにおける元のヌクレオチド（ヌクレオチド0）は、標準ナンバリングを用いる場合、−１８０に対応する（ここで、ヌクレオチド＋１は翻訳開始コドンＡＴＧのＡに対応する）。標準ナンバリングによれば、上記ＳＮＰはそれぞれ、−１０３７Ｃ／Ｔ、−４８８Ａ／Ｇおよび−４１８Ａ／Ｇに対応する。代替的には、参照として配列番号１を考えると、ＳＮＰはそれぞれ、３３Ｃ／Ｔ、５８２Ａ／Ｇおよび６５２Ａ／Ｇに対応する。
【００２４】
「ハプロタイプ」という用語は、統計学的に関連する単一染色分体の上の一組の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を意味する。ハプロタイプは、ホモ接合またはヘテロ接合形態で存在し得る。
【００２５】
「患者」という用語は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療から利益を受けると思われる疾患、特にＴＮＦ-α関連疾患に罹患した任意の被験者（好ましくはヒト）を指す。
【００２６】
「ＴＮＦ-α関連疾患」という用語は、ＴＮＦ-αにより推進される炎症過程に関連した疾患を意味する。さらに特定的には、ＴＮＦ-α関連疾患としては、障害に罹患している被験者におけるＴＮＦ-αの存在が、障害の病態生理学の原因である存在または障害の悪化に関与する因子であることが示されているかまたはそれが疑われる疾患およびその他の障害が挙げられる。
【００２７】
「ＴＮＦ-α遮断薬」は、ＴＮＦ-α特性を有意に低減し得る分子、例えばタンパク質または小分子を指す。
【００２８】
ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する「応答者」または「応答性」患者、あるいは患者の群は、ＴＮＦ-α遮断薬を用いて治療された場合に疾患における臨床的に有意の軽減を示すかまたは示すであろう患者または患者の群を指す。疾患活性は、当該技術分野で認識される基準、例えば「疾患活性スコア（ＤＡＡ）」または米国リウマチ学会（ＡＣＲ）判定基準（慢性関節リウマチの活性の測定である）に従って測定され得る。算定には、以下のパラメーターが包含される：
- 28-疼痛関節点数に基づいた接触に対する関節圧痛（ＴＥＮ）の数
- 28-疼痛関節点数に基づいた腫脹関節（ＳＷ）の数
- 赤血球沈降速度（ＥＳＲ）
- 疾患活性についての患者の査定（ＶＡＳ；mm）（ＰＡＴＤＡＩ）
ＤＡＳ28は、ベースラインに対する参照を必要としない連続変数を提供する：ＤＡＳ28＝0.56×平方根（ＴＥＮ28）＋0.28×平方根（ＳＷ28）＋0.70×（ＩｎＥＳＲ）＋0.014×ＰＡＴＤＡＩ．（Prevoo et al. 1995）。ＡＣＲ応答判定基準は、圧痛および腫脹関節の数、急性期応答、機能的評価（例えばＨＡＱスコア）、疼痛に関する視覚的アナログ尺度、ならびにこれも視覚的アナログ尺度に関する患者および医者による疾患の包括的評価におけるベースラインからの変化を測定する。腫脹および圧痛関節点数における、そして残りの5つのパラメーターのうちの3つにおける20％、50％および70％改善は、それぞれ、ＡＣＲ20、ＡＣＲ50およびＡＣＲ70応答を表す（Arnett）。したがって疾患が慢性関節リウマチである場合、参照値を提供する患者の好ましい一応答群は、ＡＣＲ判定基準および／またはＤＡＳの有意の変化を示す一群である。例えばＴＮＦ-α遮断薬、例えばアダリムマブ（ＡＤＡ）を用いた治療の3ヶ月後のＤＡＳ28≧1.2は、疾患における有意の軽減を示す。それぞれＴＮＦ-α遮断薬、例えばアダリムマブ（ＡＤＡ）を用いた治療の12週後のＡＣＲ50は、疾患の有意の軽減を示す。
【００２９】
本明細書中で意図されるように、「標準応答性に比してのＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する上記患者の応答性の見込み減少」とは、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合である例えばＲＡを有する患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答する確率は、同一病態、例えばＲＡを有する患者の一般集団に関して観察されたものより低いということを意味する。好ましくは、治療に応答する患者の比率が統計的に有意であると考えられ得るよう、一般集団は十分な患者を含む。
【００３０】
特に、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合である例えばＲＡを有する患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答する確率は、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合でない同一病態を有する患者の集団に関して観察されたものより低い。
【００３１】
例えば、以下の実施例で実証されるように、−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合性であるＲＡ患者がＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に応答するという確率は約35％であり、一方、この確率は、患者の一般集団においては少なくとも約40％を有するかまたは−２３８Ｇ、−３０８Ｇ、−８５７Ｃハプロタイプに関してホモ接合でない患者の間では少なくとも約50％を有する。
【００３２】
本明細書中で意図されるように、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置−２３８のグアニン、位置−３０８のグアニン、および位置−８５７のシトシンを同時に保有しない患者は、上記患者の上記ＴＮＦ-α遺伝子の少なくとも1つのコピー上の位置−２３８のアデニン、位置−３０８のアデニン、および位置−８５７のチミンのうちの少なくとも1つを特に保有し得る。
【００３３】
発明の方法：
本発明の方法は、ホモ接合形態でのその存在が患者をＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答者と非応答者とに区別可能にする特定のハプロタイプの同定に基づいている。
【００３４】
好ましくは、患者のハプロタイプは、上記患者から採取された核酸試料に関して確定される。
【００３５】
核酸試料は、任意の細胞源または組織生検から得られる。利用可能な細胞源の例としては、血球、頬細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、あるいは生検により得られる組織中に存在する任意の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、体液、例えば血液またはリンパ液等からも得られる。ＤＮＡは、当該技術分野で既知の任意の方法、例えばSambrook et al., 1989に記載されたような方法を用いて抽出され得る。
【００３６】
ＳＮＰは、好ましくは増幅後に、核酸試料中で検出され得る。例えば単離ＤＮＡは、突然変異化部位に特異的であるか、あるいは突然変異化部位を含有する領域の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に付され得る。第一の代替法によれば、プライマーアニーリングのための条件は、特異的逆転写（適切な場合）および増幅を保証するために選択され得る；したがって増幅産物の出現は、特定突然変異の存在の診断メッセージである。別の状況では、ＤＮＡが増幅され、その後、適切なプローブとのハイブリダイゼーションにより、あるいは直接シーケンシングまたは当該技術分野で既知の任意の他の適切な方法により、増幅配列中で、突然変異化部位が検出され得る。
【００３７】
実際には、遺伝子型分析のための多数の戦略が利用可能である。要するに、核酸分子は、制限部位の存在または非存在に関して試験され得る。塩基置換突然変異が制限酵素の認識部位を作製するかまたは廃棄する場合、これは、突然変異に関する簡単な直接ＰＣＲ試験を可能にする。さらなる戦略としては、直接シーケンシング、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析；適切緊縮ハイブリダイゼーション条件下で完全整合配列とのみハイブリダイズする短い合成プローブである対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とのハイブリダイゼーション；対立遺伝子特異的ＰＣＲ；突然変異誘発プライマー；リガーゼ-ＰＣＲ、ＨＯＴ切断；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度変性勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）および変性高速液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。直接シーケンシングは、任意の方法、例えば化学的シーケンシングにより、Maxam-Gilbert法を用いて；酵素的シーケンシングにより、Sanger法を用いて；質量分析的シーケンシングにより；チップ・ベースの技法を用いたシーケンシング；ならびに実時間定量的ＰＣＲにより成し遂げられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、被験者からのＤＮＡは、先ず、特異的増幅プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に付される。しかしながら、ＰＣＲとは別にＤＮＡを試験させるいくつかのその他の方法、例えばローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、インベーダーＴＭアッセイ、またはオリゴヌクレオチド結紮検定（ＯＬＡ）が利用可能である。ＯＬＡは、塩基置換突然変異を明示するために用いられ得る。この方法によれば、標的核酸中の隣接配列とハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドが構築され、連結は突然変異の位置に置かれる。ＤＮＡリガーゼは、それらが完全にハイブリダイズされる場合、2つのオリゴヌクレオチドのみを共有的に連結する。
【００３８】
本発明のＳＮＰは、文書WO 2004/106546およびWO 2006/001627に記載されたものと同様のＤＮＡチップ技法を用いることにより同定され得る。
【００３９】
少なくとも10ヌクレオチドを有し、そして本明細書中の当該配列と相補的なまたは相同の配列を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとしての有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、しかし典型的には、匹敵サイズを有する相同領域と少なくとも約80％同一、好ましくは85％同一、さらに好ましくは90〜95％同一である、と理解される。ある種の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するための適切な手段、例えば検出可能標識と組合せて核酸を用いることが有益である。広範な種々の適切な指標、例えば蛍光性、放射性および酵素的またはその他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）が、当該技術分野で既知である。プローブは、典型的には、10〜1000ヌクレオチド長の、例えば10〜800ヌクレオチド長の、さらに好ましくは15〜700ヌクレオチド長の、典型的には20〜500ヌクレオチド長の１本鎖核酸を含む。
【００４０】
プライマーは、典型的には、増幅されるべき当該核酸と完全にまたはほぼ完全に整合するよう意図された10〜25ヌクレオチド長のより短い１本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に「特異的」であり、即ち、それらは好ましくは、高緊縮ハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍに対応する、例えば50％ホルムアミド、5×または6×ＳＣＣ。ＳＣＣは0.15 MＮａＣｌ、0.015 MＮａクエン酸塩である）下でハイブリダイズする。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、当該突然変異は、患者の核酸試料を、任意に標識される核酸プローブと接触することにより検出される。プライマーは、当該突然変異化位置を含有するＴＮＦ-α遺伝子（例えば配列番号１）の部分を増幅するかまたはシーケンシングするためにも有用であり得る。
【００４２】
このようなプローブまたはプライマーは、当該突然変異化位置を含有するＴＮＦ-α遺伝子配列（例えば配列番号１）の一部分と特異的にハイブリダイズし得る核酸である。それは、それらが高緊縮条件下で関連する突然変異化ＴＮＦ-α核酸配列の部分とハイブリダイズする配列である、ということを意味する。
【００４３】
オリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマーは、少なくとも10、15、20または30のヌクレオチドを含有し得る。それらの長さは、400、300、200または100ヌクレオチドより短いことがある。
【００４４】
ＴＮＦ-α遮断薬：
特定の一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬は、組換えＴＮＦ-受容体ベースのタンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ断片により連結される2つの可溶性ＴＮＦ-α受容体からなる組換え融合タンパク質であるエタネルセプト）を包含する。ペギル化可溶性ＴＮＦ１型受容体も、ＴＮＦ遮断薬として用いられ得る。付加的には、サリドマイドは、強力な抗ＴＮＦ剤であることが実証されている。したがってＴＮＦ-α遮断薬はさらに、ホスホジエステラーゼ４（ＩＶ）阻害薬サリドマイド類似体およびその他のホスホジエステラーゼＩＶ阻害薬を包含する。特定の一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬は、可溶性形態のＴＮＦ-α受容体または抗ＴＮＦ-α抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブまたはＣＤＰ５７１である。別の特定の一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬は、エタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブから成る群から選択される。最も好ましい一実施形態では、ＴＮＦ-α遮断薬はアダリムマブである。
【００４５】
ＴＮＦ-α関連疾患：
特定の実施形態では、患者はＴＮＦ-α関連疾患に冒される。
【００４６】
ＴＮＦ-α関連疾患としては、自己免疫障害、感染性疾患、移植片拒絶または移植片対宿主病、悪性疾患、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害および血管炎が挙げられ得る。一実施形態では、自己免疫障害は、慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、痛風関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎およびネフローゼ症候群から成る群から選択される。別の実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患は、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再還流損傷、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症および放射線毒から成る群から選択される。さらに別の実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患は、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、乾癬性関節炎および慢性尋常性乾癬から成る群から選択される。
【００４７】
本発明の一実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患はクローン病である。別の実施形態では、疾患は潰瘍性大腸炎である。さらに別の実施形態では、疾患は乾癬である。さらに別の実施形態では、疾患は乾癬性関節炎（ＰｓＡ）と組合せた乾癬である。
【００４８】
好ましい実施形態では、ＴＮＦ-α関連疾患は慢性関節リウマチである。
【００４９】
本発明の方法は、活動性である慢性関節リウマチ患者におけるＴＮＦ-α遮断薬による治療に対する応答性を予測するために特に有用である。
【００５０】
ＲＡの治療のために通常考察される最前線療法であるメトトレキセート（ＭＴＸ）に対して耐性である患者は、本発明の方法が特に有用であり得るさらなる好ましい群の患者である。
【００５１】
さらに一般的には、例えばＭＴＸ、アザチオプリンまたはレフルノミドを用いた彼らのＴＮＦ-α関連疾患のための基礎治療をすでに受けている患者は、本発明の試験方法のための特に良好な候補である。
【００５２】
ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する応答性に関して試験された後、患者は、同一基礎治療とともにまたは伴わずに、ＴＮＦ-α遮断薬を処方され得る。特に併用アダリムマブ／ＭＴＸは、ＲＡおよびその他のＴＮＦ-α関連疾患を有する患者において特に有効であり得る。
【００５３】
キット：
本発明はさらに、本発明のハプロタイプを確定するのに適したキットを提供する。
【００５４】
キットは、以下の構成成分を包含し得る：
（ｉ）通常はＤＮＡから作製され、そして前標識され得るプローブ。あるいはプローブは標識され得ず、そしてラベリングのための成分は別個の容器でキットに包含され得る；そして
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション試薬：キットは、特定のハイブリダイゼーション・プロトコールに必要とされる適切に包装された試薬および物質、例えば固相マトリックス（適用可能な場合）、そして標準物質も含有し得る。
【００５５】
別の実施形態では、キットは以下のものを包含する：
（ｉ）配列確定または増幅プライマー：シーケンシング・プライマーは前標識され得るし、あるいはアフィニティー精製または結合部分を含有し得る；そして
（ｉｉ）配列確定または増幅試薬：キットは、特定のシーケンシング増幅プロトコールに必要とされるその他の適切に包装された試薬および物質も含有し得る。好ましい一実施形態では、キットは、それらの配列が多型位置のうちの少なくとも1つに隣接する配列に対応するシーケンシングまたは増幅プライマーのパネルを、ならびに各多型性配列の存在を検出するための手段を含む。
【００５６】
特定の一実施形態では、本明細書中で同定される少なくとも1つの突然変異化位置、特にＴＮＦ遺伝子中の位置−２３８、−３０８および−８５７を含むＴＮＦ-α遺伝子プロモーターを増幅するために特異的な一対のヌクレオチドプライマーを含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】例示薬理遺伝学的試験の流れ図を表す。
【図２】ＴＮＦ-α遺伝子または別のハプロタイプに関して、−２３８Ｇ、−３０８Ｇおよび−８５７Ｃハプロタイプ（ＧＧＣ）を有するＲＡ患者のアダリムマブを用いた治療の開始後12週のＡＣＲ50（米国リウマチ学会判定基準による症候の50％改善）を表す。
【図３】治療（ＭＴＸを用いてまたは用いずに）およびＧＧＣハプロタイプ保有状態によるＡＣＲ50応答（縦軸、ＡＣＲ50応答者患者の％）の時間経過展開（横軸、週）を示す。
【実施例】
【００５８】
方法
患者：この薬理遺伝学的試験は、補助的に、欧州およびオーストラリアにおける種々の場所で実施されるＲｅＡｃｔ（活動期慢性関節リウマチの調査）プロトコールからであった。親ＲｅＡｃＴ試験において、完全ヒトＩｇＧ１抗ＴＮＦモノクローナル抗体であるアダリムマブの安全性および有効性を査定するために、6610名の患者を包含した。ＲｅＡｃｔ試験の目的は、エタネルセプトまたはインフリキシマブで予め処置された患者を含めて、種々の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と組合せたＡＤＡの効力および耐容性を評価することであった。要するに、ＲｅＡｃｔ試験に登録された患者は、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）の1987年改訂判定基準（Amett et al. 1988）に従った活動期成人発症性ＲＡを有する年齢≧18歳の男性および女性であった。選択基準は、≧3ヶ月の疾患持続期間；少なくとも中等度の疾患活性を示す≧3.2の赤血球沈降速度および28関節の評価に基づいた疾患活性スコア（ＤＡＳ28）（13）；ならびに少なくとも1つの伝統的ＤＭＡＲＤによる治療ミスを要した。他のＴＮＦアンタゴニストを含めた生物学的応答修飾剤を用いた従来の療法は、当該投薬が登録前に≧2ヶ月中断された場合、容認された。
【００５９】
本明細書中に記載される薬理遺伝学的試験は、フランス人患者の大型コホートを包含した。包含される患者はすべて、書面でインフォームド・コンセントを提供した。試験は、地方倫理委員会により承認された。主要結果変数（治療の12週間後のＡＣＲ50応答の達成）に対応する主分析において、臨床試験に含まれた患者7名が、彼らがアジア系またはアフリカ系であったため、この薬理遺伝学的試験から除外された（図１）。9名の他の患者は、治療に対する応答に関するデータの欠如のため、統計学的分析から除外された。したがって、元の集団から総計382名の患者がこの試験に適格であった。これらの患者の間では、ＡＤＡはＭＴＸと併用され（n=186）、そして他の場合はＭＴＸを伴わずに投与された（n=196）。
【００６０】
臨床的および生物学的データの収集ならびに結果測定： 臨床的および生物学的収集データは、元のＲｅＡｃｔプロトコールからのものであった。ベースライン、2、6、12週目に、ＤＡＳ 28およびＡＣＲ応答を査定するために必要な変数すべてを、ＡＡＱスコアと同様に記録した。遺伝的試験のために選択された主要結果は、治療の12週後のＡＣＲ50応答であった。12週目に記録された他の応答データは、ＡＣＲ20およびＡＣＲ70応答であった。
【００６１】
遺伝的多型：白人集団におけるＴＮＦ＋４８８、−２３８および−３０８単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）により構成される4つの主要ハプロタイプを立証した従来の報告に従って、分析されるＴＮＦ遺伝子多型を選択した。それにもかかわらず、ＴＮＦ＋４８８はＴＮＦ−８５７と強連鎖不均衡（ＬＤ）で存在すると報告されている（ＬＤ値、白人集団ではＤ‘＝0.92（Simmonds et al. 2004））ので、そしてＴＮＦ−８５７は、エタネルセプトに対する臨床的応答に影響を及ぼすことが近年報告された（Kang et al. 2005）ため、ＴＮＦ＋４８８の代わりにＴＮＦ−８５７を遺伝子型分類することに決めた。予測どおり、ハプロタイプ再構成後、ＲＡ患者の白人集団中に4つの主要ハプロタイプをわれわれも見出した。特定ＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子はＲＡ感受性 - 共有エピトープ仮説（ＳＥ）（Gregersen et al. 1987） - および重症度において重要な役割を演じることが従来報告されているので、われわれも、直接シーケンシングによりＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子に関してＲＡ患者を遺伝子型分類した。ＳＥを有すると考えられる対立遺伝子は、ＨＬＡ-ＤＲＢ１ *０１０１、*０１０２、*０４０１、*０４０４、*０４０５、*０４０８、*０４１３、*０１００１および*０１４０２であった（Gregersen et al. 1987）。ＡＤＡ治療に対する応答におけるＳＥ寄与を分析するために、ＳＥの0、1または2つのコピーを有するとして、あるいはＳＥキャリアであるか否かであるとして、患者を分類した。ＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子およびＴＮＦ ＳＮＰを含む延長されたハプロタイプも再構築した。
【００６２】
遺伝子型分類方法：ＨＬＡ-ＤＲＢ１および3つのＴＮＦ-α遺伝子多型（−２３８Ａ／Ｇ、−３０８Ａ／Ｇおよび−８５７Ｃ／Ｔ）に関して、患者を遺伝子型分類した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅およびＡＢＩ 3700シーケンサー（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いたＤＮＡシーケンシングにより、ＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子を確定した。
【００６３】
本明細書中で提供される手法に従って、対立遺伝子識別TaqMan ＰＣＲにより、ＴＮＦ-α −８５７Ｃ／Ｔを遺伝子型分類した。用いたプライマーは、5’ GGTCCTGGAGGCTCTTTCACT 3’（配列番号２）および5’ AGAATGTCCAGGGCTATGAAAGTC 3’（配列番号３）であった。本明細書中で用いたプローブは、野生型に関しては5’ CCCTGTCTTCATTAAG（配列番号４）および突然変異体に関しては5’ CCCTGTCTTCGTTAAG（配列番号５）であった。
【００６４】
ＭｓｐＩ制限酵素を用いて、ミスマッチポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）-制限全長多型（ＲＦＬＰ）により、ＴＮＦ −２３８Ａ／Ｇ ＰＣＲ遺伝子多型を遺伝子型分類した。ＰＣＲ増幅のために用いられるプライマーは、以下のものであった：順方向5’ ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG 3’（配列番号６）および逆方向5’ AGAAGACCCCCCTCGGAACC 3’（配列番号７）。逆方向プライマーは目的のあるミスマッチ配列を含有し、したがってＰＣＲ産物中に組入れられると、それらはＧ対立遺伝子を有するがしかしＡ対立遺伝子を有さないＭｓｐＩを作り出す。
【００６５】
PreDeveloped TaqMan検定キットC_7514879を用いて、対立遺伝子識別TaqMan ＰＣＲにより、ＴＮＦ-α −３０８Ａ／Ｇを遺伝子型分類した。7900HT Applied Biosystems実時間サーマルサイクラー（Applied Biosystems, Courtaboeuf, France）を用いて、増幅を実施した。
【００６６】
統計学的分析：定量的データはすべて、平均＋／−ＳＤとして表される。定性的データはすべて、頻度およびパーセンテージとして表される。一変量回帰を実施して、候補共変量をスクリーニングした。次に、共変量を有するモデルと有さないモデルを、χ2検定を用いて比較した。次に、前の分析で選択されたすべての共変量を含めた多変量回帰モデルを構築した。モデル中に共変量を保有するための閾値は、0.05であった。
【００６７】
各遺伝子に関しては、遺伝子型およびハプロタイプを、12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答との関連に関して試験した。遺伝子型分類されたＳＮＰはすべて、Hardy-Weinberg平衡であった。各遺伝子型に関しては3×2クロスタブを用いて、そして両側カイ二乗検定で、ホモ接合およびへテロ接合遺伝子型の各々の考え得る組合せに関しては2×2クロスタブを用いて、効能に関する遺伝子型分布の差を試験した。
【００６８】
ＴＮＦ遺伝子内で、異なるＳＮＰ間のＬＤの測定値を、Somers’のＤ係数を用いて概算した。すべてのＴＮＦ ＳＮＰ間、ならびにＴＮＦ ＳＮＰおよびＨＬＡ-ＤＲＢ１対立遺伝子間に有意のＬＤが存在したので、ＴＮＦに関するハプロタイプならびにＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子およびＴＮＦを含む延長されたハプロタイプを、われわれも考察した。ソフトウエアＰＨＡＳＥ（バージョン2.1）を用いて、ハプロタイプ再構築を実施した。このBayesianアルゴリズムは、各被験者により保有されるハプロタイプの最もありそうな対を提供する（Stephens et al. 2001, Stephens et al. 2003）。ハプロタイプ推定におけるＰＨＡＳＥ確実性の平均確率は、ＴＮＦハプロタイプに関しては99％、そしてＳＥ-ＴＮＦ広範囲ハプロタイプに関しては83％であった。ＴＮＦ遺伝子座中のＳＥおよび３ ＳＮＰが調査されたため、そしてハプロタイプ再構築が実施されたため、多重比較のためにBonferroni補正を適用した。調整および非調整Ｐ値がともに、提示される。0.05未満のＰ値は有意と考えられた。
【００６９】
結果：
コホートの説明：患者のベースライン特性を表１に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
この薬理遺伝学的試験に含まれる382名の患者の臨床的応答のプロフィールは、全ＲｅＡｃｔ集団（6,610名の患者）のものと同一であった。12週目には、患者の41％（n=152）がＡＣＲ50応答者であり、70％（n=267）がＡＣＲ20応答者であり、そして15％（n=59）がＡＣＲ70応答者であった。ＡＤＡへのＭＴＸ付加は、一変量（Ｐ＝0.005）および多変量分析（見込み比：1.76；95％ＣＩ：1.14〜2.74）の両方において、より良好なＡＣＲ50応答に有意に関連した。
【００７２】
遺伝子型分布を以下に示す：ＴＮＦ −２３８ Ｇ＞Ａに関しては、94.4％ＧＧ、5.3％ＡＧ、一患者は稀なＡＡ遺伝子型を有した；−３０８Ｇ＞Ａに関しては、70％ＧＧ、26.5％ＡＧ、2.5％ＡＡ；−８５７ Ｃ＞Ｔに関しては：82.7％ＣＣ、17％ＣＴ、一患者は稀なＴＴ遺伝子型を有した。これらの分布は、白人集団に関する公的データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP）からのものと一致した。
【００７３】
患者間のＳＥの分布を、以下に示す：0コピー25.4％、1コピー47.6％、2コピー27％。このような分布は、ＳＥキャリア74.6％および非ＳＥキャリア25.4％を生じた。
【００７４】
位置−２３８、−３０８および−８５７でＴＮＦ-αプロモーター中にＳＮＰを有する4つの主要ハプロタイプを構築した（例えば−２３８Ｇ、−３０８Ｇおよび−８５７ＣからなるハプロタイプＧＧＣ）。これらの最高頻度のハプロタイプ（ＧＧＣ、ＧＡＣ、ＧＧＴおよびＡＧＣ）は、それぞれ73、15、9および3％の頻度で、合計99％以上を占める。稀なＡＡＣハプロタイプは、一患者にのみ見出された。
【００７５】
ＡＤＡ応答に及ぼすＳＥおよび個々のＴＮＦ-α遺伝子型の影響： 12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答とＳＥまたはＳＥ保有状態のコピー数との間の相関を、われわれは見出さなかった（表２）。
【００７６】
【表２】
【００７７】
12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答と3つのＴＮＦ-α遺伝子多型（−２３８Ａ／Ｇ、−３０８Ａ／Ｇおよび−８５７Ｃ／Ｔ）遺伝子型のいずれかとの間の相関も、われわれは見出さなかった（表２）。それにもかかわらず、−２３８ＧＧ、−３０８ＧＧおよび−８５７ＣＣ遺伝子型間の関連傾向、ならびにＡＤＡに対するより乏しい応答が観察された（表２）。
【００７８】
ＡＤＡ応答に及ぼすＴＮＦ-αハプロタイプの影響： ＡＤＡ応答に及ぼすＴＮＦＡハプロタイプの遺伝的作用が分析された場合、ＧＧＣハプロタイプ保有状態による有意の応答差をわれわれは観察した（表３）。
【００７９】
【表３】
【００８０】
第一の分析において、10回未満示される稀なハプロタイプの組合せ：ＡＧＣ／ＡＡＣ（Ｎ＝1）、ＧＡＣ／ＡＧＣ（Ｎ＝2）、ＧＡＣ／ＧＡＣ（Ｎ＝9）、ＧＧＴ／ＡＧＣ（Ｎ＝3）、ＧＧＴ／ＧＡＣ（Ｎ＝9）、ＧＧＴ／ＧＧＴ（Ｎ＝3）を、われわれは除いた。残りの4つの主要ハプロタイプの組合せでは、ＧＧＣハプロタイプに関するホモ接合個体（Ｎ＝184）は、3つの他のより高頻度の組合せハプロタイプ：ＧＧＣ／ＧＡＣ 47％（Ｎ＝77）、ＧＧＣ／ＧＧＴ 53％（Ｎ＝45）およびＧＧＣ／ＡＧＣ 71％（Ｎ＝14）と比較して、有意に低いＡＣＲ50応答率（34％）を有した（Ｐ＝0.0041、Ｐｃ＝0.02）（表３）。このような観察は、治療に対する応答に及ぼすＧＧＣハプロタイプの逆行性作用を大いに示唆した。実際、ＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリア間の応答率は33％で、他のハプロタイプの組合せすべてに関して観察された50％応答率より有意に低かった（Ｐ＝0.003、Ｐｃ＝0.015）（図２）。12週目のＡＣＲ20およびＡＣＲ70応答は、類似の傾向が両方の群で観察された場合でさえ、ＧＣＣホモ接合性により有意に影響されない二次終点判定基準であった：それぞれ、ＧＧＣ／ＧＧＣ群における69％応答対他のハプロタイプ・キャリアの間の76％（Ｐ＝0.14）、ならびにＧＧＣ／ＧＧＣ群における15％応答対他のハプロタイプ・キャリアの間の19％（Ｐ＝0.3）。これらの群における有意差の欠如は、おそらくは、応答者および非応答者間の患者の不均衡分布のための力の損失により説明される。逆に、12週目でのＡＣＲ50は、全集団の50％に近い応答者および非応答者の分布を伴う作用を実証するための最良の統計学的力を提供する。
【００８１】
次に、ＧＧＣホモ接合患者と、われわれの結果を妨害し得る他のハプロタイプ・キャリアとの間のベースライン特性差を探索した。特にＤＡＳ28ＲＡ疾患活性判定基準に関して、両群間に有意差は認められなかった（表４）。
【００８２】
【表４】
【００８３】
試験した集団の約半数はＭＴＸ治療を受けていたので、（ＭＴＸを用いてまたは用いずに）各治療亜群に及ぼすＧＧＣホモ接合性をさらに分析した。意外にも、ＧＧＣホモ接合性に関連したより不十分な応答は、ＭＴＸを摂取している患者の群に主に存在した：この群では、ＡＣＲ50応答率はＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリア間では38％であったが、これに対して他のハプロタイプ・キャリア間では60％であった（Ｐ＝0.0095；Ｐｃ＝0.047）。ＭＴＸを用いない群では、ＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリア間のＡＣＲ50応答率（30％）は他のハプロタイプ・キャリア間（40％）より低かったが、しかし両群間の差は有意ではなかった（Ｐ＝0.25）。各治療群におけるＡＣＲ50応答の時間経過展開は、非常に興味深いものであった（図３）。実際、ＭＴＸ処置患者の間では、ＧＧＣハプロタイプホモ接合キャリアと他のハプロタイプ・キャリアとの間の応答差は2週目にすぐに同定可能であり、そして12週目まで依然として増大した。ＭＴＸを用いない群では、ＧＧＣ／ＧＧＣキャリアと他の患者との応答差はより遅く、約10週目に、より低い大きさで認められたが、これは、ＭＴＸを用いない群における12週目での応答率間の有意差を支持する傾向がＲｅＡｃｔプロトコールに残念ながら利用可能でないより長期の追跡調査で真の有意差になり得る、ということを示唆する。
【００８４】
ＡＤＡ応答に及ぼすＧＧＣホモ接合性の負の作用に及ぼすＳＥの影響： ＴＮＦＡ遺伝子座はＨＬＡ ＤＲＢ１の直ぐ近くに位置し、そこで、ＧＧＣハプロタイプがＳＥに属するいくつかの対立遺伝子とＬＤで存在する程度を分析したいとわれわれは考えた。ＳＥのコピー数の分布はＧＧＣホモ接合患者と他の患者との間で有意に異なり（Ｐ＝0.0012）、したがってＧＧＣハプロタイプとＳＥからの対立遺伝子との間のＬＤを示唆した（表４）。
【００８５】
それにもかかわらず、このような分布は延長されたハプロタイプ再構築を基礎とせず、そしてＧＧＣハプロタイプとのＳＥ対立遺伝子のシス、ならびにトランス関係を反映し得た。延長されたハプロタイプ再構築後、ＧＧＣハプロタイプの60％がＳＥの対立遺伝子と関連したが、これに比して、非ＧＧＣハプロタイプは28％に過ぎなかった（Ｐ＝2.10-12）。したがって、ＧＧＣハプロタイプとＳＥの対立遺伝子との間のＬＤが確証された。延長されたハプロタイプ再構築は、82のＳＥ-ＴＮＦハプロタイプ組合せをもたらした。これらの延長されたハプロタイプの注意深い検査は、ＧＧＣハプロタイプが、白人間の最も高頻度のＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子に対応して、ＳＥのＨＬＡ ＤＲＢ１*０１０１および*０４０１対立遺伝子と主に関連する、ということを示した（表５）。
【００８６】
【表５】
【００８７】
０７０１-ＧＧＣハプロタイプ（24％応答）および０４０５-ＧＧＣハプロタイプ（30％応答）を除いて、これらの延長されたハプロタイプのほとんどが約40％のＡＣＲ50応答率（範囲36〜42）と関連した。
【００８８】
試験のこの段階では、ＧＧＣホモ接合ハプロタイプ・キャリアの間で観察されたより不十分な応答がＳＥの対立遺伝子とのＬＤのためであり得るか否かを分析することが重要であった。2コピーのＳＥのキャリアの間の12週目のＡＣＲ50応答者の割合は40％で、0または1コピーのＳＥのキャリアの応答率（41％）と有意に異ならなかった。したがって、ＳＥとの関連の欠如は、両染色体上に保有された場合でも、そして12週目のＡＤＡに対するＡＣＲ50応答が不十分でも、このような仮説を申し立てる。さらに、ＧＧＣホモ接合ハプロタイプ・キャリアは、患者がＳＥを保有した場合（37％）または保有しなかった場合（27％）、ＡＤＡに対して等しく応答した（Ｐ＝0.43）。
【００８９】
結論：
この薬理遺伝学的試験は、集団のサイズならびにＲｅＡｃｔ試験内で記録された臨床データの質のために、注目に値する。それは、単一ＴＮＦ-α遺伝子座ハプロタイプ（−２３８Ｇ／−３０８Ｇ／−８５７Ｃ）が、両染色体上に保有される場合、特定のＳＥ対立遺伝子に起因しない劣性モードに従ってＲＡ患者におけるＡＤＩに対するより不十分な応答と関連する、ということを示す強固なデータを提供する。
【００９０】
参考文献
【化１】
【００９１】
【化２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する患者の応答性の予測方法であって、前記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定することを包含する方法であり、前記患者の前記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの同時的存在が標準応答性に関してＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する前記患者の応答性の可能性減少を示す方法。
【請求項２】
前記患者が慢性関節リウマチに罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記患者が活動期慢性関節リウマチに罹患している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＴＮＦ-α遮断薬が抗ＴＮＦ-α抗体または可溶性形態のＴＮＦ-α受容体である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＴＮＦ-α遮断薬がエタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＴＮＦ-α遮断薬がアダリムマブである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＴＮＦ-α関連疾患を有する患者を治療するために意図された薬剤の製造のためのＴＮＦ-α遮断薬の使用であって、前記患者が前記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンを同時的に保有しない使用。
【請求項８】
ＴＮＦ-α遮断薬が抗ＴＮＦ-α抗体または可溶性形態のＴＮＦ-α受容体である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＴＮＦ-α遮断薬がエタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブから成る群から選択される、請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
ＴＮＦ-α遮断薬がアダリムマブである、請求項７〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ＴＮＦ-α関連疾患が慢性関節リウマチである、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１】
ＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する患者の応答性の予測方法であって、前記患者のＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの存在または非存在を確定することを包含する方法であり、前記患者の前記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンの同時的存在が標準応答性に関してＴＮＦ-α遮断薬を用いた治療に対する前記患者の応答性の可能性減少を示す方法。
【請求項２】
前記患者が慢性関節リウマチに罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記患者が活動期慢性関節リウマチに罹患している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＴＮＦ-α遮断薬が抗ＴＮＦ-α抗体または可溶性形態のＴＮＦ-α受容体である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＴＮＦ-α遮断薬がエタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＴＮＦ-α遮断薬がアダリムマブである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＴＮＦ-α関連疾患を有する患者を治療するために意図された薬剤の製造のためのＴＮＦ-α遮断薬の使用であって、前記患者が前記ＴＮＦ-α遺伝子の両コピーにおけるＴＮＦ-α遺伝子の位置２３８でのグアニン、位置３０８でのグアニン、および位置８５７でのシトシンを同時的に保有しない使用。
【請求項８】
ＴＮＦ-α遮断薬が抗ＴＮＦ-α抗体または可溶性形態のＴＮＦ-α受容体である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＴＮＦ-α遮断薬がエタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブから成る群から選択される、請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
ＴＮＦ-α遮断薬がアダリムマブである、請求項７〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ＴＮＦ-α関連疾患が慢性関節リウマチである、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５０８８３８（Ｐ２０１０−５０８８３８Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３５８１９（Ｐ２００９−５３５８１９）
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３１６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５６１９８
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３１６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５６１９８
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【Ｆターム（参考）】
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