ミトコンドリアの蛍光染色方法
【課題】本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色剤や、ミトコンドリアの蛍光染色キットや、ミトコンドリアの蛍光染色方法を提供することを課題とする。
【解決手段】一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用することを特徴とする。
【解決手段】一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色剤や、ミトコンドリアの蛍光染色キットや、ミトコンドリアの蛍光染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細胞内ミトコンドリアの染色には、生体染色色素が用いられている。例えば、胚形成初期精子のミトコンドリア細胞内挙動を観察するために、Rhodamine（登録商標）１２３（invitrogen社製；cat. R302, R22420）やMito Tracker（登録商標）(invitrogen社製; cat. M7512)によって染色し、蛍光顕微鏡下で観察することが行われている（例えば、非特許文献１〜４参照）。また、ミトコンドリアへのターゲット配列を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に付加することにより、ミトコンドリアを可視化することも行われている（例えば、非特許文献５〜６参照）。
【０００３】
しかし、前述の生体染色色素は、励起光により容易に退色してしまい、輝度が低下してしまう点、染色後においても色素が容易に解離してしまう点、色素によっては細胞を固定する必要がある点などの不十分な点があった。また、ＧＦＰを用いた前述のミトコンドリアの観察方法は、遺伝子組換え操作を伴うために煩雑であるなどの不十分な点があった。さらに、ミトコンドリアと機能的に深く関わる細胞小器官・生理活性物質をＧＦＰ標識する解析なども盛んに行われているが、そのような場合に、それらの細胞小器官等とミトコンドリアとを区別しつつ同時に観察するには、ミトコンドリアをＧＦＰ以外の波長特性をもつ蛍光タンパク質で標識する必要があった。
【０００４】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は、アミノ酸の一種であり植物の葉緑素や動物の血液中のヘムなどに必須なポルフィリン類の唯一の原料となる物質である。５−アミノレブリン酸は、動物においては、順に、ポルフォビリノーゲン、ヒドロキシメチルビラン、ウロポルフィリノーゲンIII、コプロポルフィリンIII、プロトポルフィリノーゲンIX、プロトポルフィリンIXへと代謝され、プロトポルフィリンは鉄イオンを配位してヘムとなり、ヘムはグロビンと結合してヘモグロビンとなることが知られている。
【０００５】
ＡＢＣＧ２（ATP-binding cassette, sub-family G, member 2）は、乳がん耐性タンパク質（breast cancer resistant protein：ＢＣＲＰ）とも呼ばれるが、ミトコンドリア膜に存在する、細胞膜貫通型のＡＢＣ（ATP−binding cassette）トランスポーターの一つである。ＡＢＣＧ２は、プロトポルフィリンIXを基質の一つとしており、ＡＢＣＧ２を欠失させると、細胞内にプロトポルフィリンIXが蓄積することや（非特許文献７〜８参照）、プロトポルフィリンIXからヘムへの反応はミトコンドリア内で行われ、プロトポルフィリンIXはＡＢＣＧ２を介して細胞質へ排出され得ることも知られている（非特許文献９参照）。さらに、５−アミノレブリン酸は、細胞質内においてポルフォビリノーゲンを経由しコポルフォビリノーゲンIIIに代謝された後、ＡＢＣＢ６を介してミトコンドリア内に取り込まれることが知られている（非特許文献１０参照）。また、非特許文献１１には、ＥＳ細胞を、ＡＢＣＧ２インヒビターであるフミトレモルギンＣ（fumitremorgin C：ＦＴＣ）で処理すると、細胞内のプロトポルフィリンIXが上昇することや、ＥＳ細胞を５−ＡＬＡ処理して内因性のプロトポルフィリンIXを誘導した後のプロトポルフィリンIXの排出が、ＦＴＣの添加により低下したことが記載されている。また、非特許文献１２には、膀胱癌細胞２５３ＪＢ−Ｖに、フェロキラターゼ阻害剤ＤＦＸ（プロトポルフィリンIXからヘムを生成する酵素の阻害剤）を作用させると、５−ＡＬＡを介したプロトポルフィリンIXの細胞内への蓄積が高まることが記載されているが、この現象は正常細胞では見られなかった。
【０００６】
以上のように、５−アミノレブリン酸とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤を併用することによって、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に染色し得ることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kaneda, H et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4542-4546.
【非特許文献２】Cummins, J. M et al., (1997) Zygote 5, 301-308.
【非特許文献３】Sutovsky, P. et al., (1996) Biol. Reprod. 55, 1195-1205.
【非特許文献４】Sutovsky, P. et al., (2000) Biol. Reprod. 63, 582-590.
【非特許文献５】Rizzuto, R et al., (1995) Curr. Biol. 5, 635-642.
【非特許文献６】Rizzuto, R et al., (1996) Curr. Biol. 6, 183-188.
【非特許文献７】J. W. Jonker et al., (2007) Am J Physiol Cell Physiol 292, C2204-C2212.
【非特許文献８】S. Zhou et al., (2005) Blood 105, 2571-2576.
【非特許文献９】Tamura, A et al., (2007) Drug Metabolism and Pharmacokinetics 22, No.6, 428-440.
【非特許文献１０】Iqbal Hamza, (2006) ACS Chem. Biol., 1 (10), pp 627-629.
【非特許文献１１】Susanto J. et al., (2008) PLoS ONE, vol. 3, issue 12, p. e4023
【非特許文献１２】Inoue, K et al., (2009) Pathology 76, 303-314
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色剤や、ミトコンドリアの蛍光染色キットや、ミトコンドリアの蛍光染色方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述のように、従来の生体染色色素は、励起光により容易に退色してしまい、輝度が低下してしまう点、染色後においても色素が容易に解離してしまう点、色素によっては細胞を固定する必要がある点などの不十分な点があった。また、ＧＦＰを用いた従来のミトコンドリアの観察方法は、遺伝子組換え操作を伴うために煩雑であるなどの不十分な点があった。そこで、本発明者らは、従来法の不十分な点を改善するべく鋭意検討を行ったところ、５−アミノレブリン酸と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用すると、５−アミノレブリン酸の代謝物質であるプロトポルフィリンIXがＡＢＣＧ２トランスポーターによりミトコンドリア外の細胞質に排出される量が著しく低減して、該プロトポルフィリンIXがミトコンドリア内に蓄積し、これにより、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に蛍光染色することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、〔１〕一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色剤や、
〔２〕ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする上記〔１〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色剤に関する。
【００１１】
また、本発明は、〔３〕一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでなることを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色キットや、
〔４〕ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする上記〔３〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色キットに関する。
【００１２】
さらに、本発明は、〔５〕一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用する工程を含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色方法や、
〔６〕次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする上記〔５〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法；
（ａ）一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類、又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象細胞に接触させる工程；
（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程；や、
〔７〕（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、対象細胞を洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする上記〔６〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に蛍光染色することができる。また、本発明の蛍光染色に用いる成分は細胞毒性がなく、生細胞に用いることができるため、観察するに際して細胞を固定する必要がない。また、本発明による蛍光染色は、原理的に色素の解離等を考慮する必要はないため、長時間にわたり、鮮明な蛍光が観察できる。また、プロトポルフィリンIXの最大蛍光波長は６３５ｎｍであり、ＧＦＰの最大蛍光波長（５０９ｎｍ）と重複しないため、ミトコンドリアと機能的に深く関わる細胞小器官・生理活性物質をＧＦＰ標識したときであっても、本発明によりミトコンドリアを蛍光染色すれば、それらの細胞小器官等とミトコンドリアとを区別しつつ同時に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を蛍光染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。図１左上パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１中央上パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１右上パネル：図１左上パネルと図１中央上パネルを重ね合わせた結果を示す。図１左下パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１中央下パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及びレセルピンを添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１右下パネル：図１左下パネルと図１中央下パネルを重ね合わせた結果を示す。
【図２】不死化サル腎線維芽細胞（ＣＯＳ細胞）を蛍光染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。図２左上パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２中央上パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２右上パネル：図２左上パネルと図２中央上パネルを重ね合わせた結果を示す。図２左下パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２中央下パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及びレセルピンを添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２右下パネル：図２左下パネルと図２中央下パネルを重ね合わせた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明のミトコンドリアの蛍光染色剤
本発明のミトコンドリアの蛍光染色剤（以下、単に「本発明の蛍光染色剤」とも表示する。）としては、上記の一般式（１）で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩（以下、「本発明における５−アミノレブリン酸類等」とも表示する。）と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでいる限り特に制限されず、本発明の蛍光染色剤の対象となるミトコンドリアとしては、生細胞中のミトコンドリアである限り特に制限されない。本発明の蛍光染色剤を利用すると、５−アミノレブリン酸の代謝物質であるプロトポルフィリンIXがＡＢＣＧ２トランスポーターによりミトコンドリア外の細胞質に排出される量が著しく低減して、該プロトポルフィリンIXがミトコンドリア内に蓄積し、これにより、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に蛍光染色することが可能となる。
【００１６】
上記の一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示す。
【００１７】
上記アルキル基としては、炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜１８のアルキル基、特に炭素数１〜６のアルキル基が好ましい。かかる炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基等が挙げられる。
【００１８】
上記アシル基としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルカノイル基、アルケニルカルボニル基又はアロイル基が好ましく、特に炭素数１〜６のアルカノイル基が好ましい。かかるアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられる。
【００１９】
上記アルコキシカルボニル基としては、総炭素数２〜１３のアルコキシカルボニル基が好ましく、特に炭素数２〜７のアルコキシカルボニル基が好ましい。かかるアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基等が挙げられる。
【００２０】
上記アリール基としては、炭素数６〜１６のアリール基が好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００２１】
上記アラルキル基としては、炭素数６〜１６のアリール基と上記炭素数１〜６のアルキル基とからなる基が好ましく、例えば、ベンジル基等が挙げられる。
【００２２】
上記の一般式（１）中、Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。
【００２３】
上記アルコキシ基としては、炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜１６のアルコキシ基、特に炭素数１〜１２のアルコキシ基が好ましい。かかるアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基等が挙げられる。
【００２４】
上記アシルオキシ基としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルカノイルオキシ基が好ましく、特に炭素数１〜６のアルカノイルオキシ基が好ましい。かかるアシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基等が挙げられる。
【００２５】
上記アルコキシカルボニルオキシ基としては、総炭素数２〜１３のアルコキシカルボニルオキシ基が好ましく、特に総炭素数２〜７のアルコキシカルボニルオキシ基が好ましい。かかるアルコキシカルボニルオキシ基としては、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ−プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
【００２６】
上記アリールオキシ基としては、炭素数６〜１６のアリールオキシ基が好ましく、例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等が挙げられる。アラルキルオキシ基としては、前記アラルキル基を有するものが好ましく、例えば、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００２７】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２としては水素原子が好ましい。Ｒ３としてはヒドロキシ基、アルコキシ基又はアラルキルオキシ基が好ましく、ヒドロキシ基又は炭素数１〜１２のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基又はヘキシルオキシ基が特に好ましい。
【００２８】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３がヒドロキシ基である化合物は５−アミノレブリン酸であり、特に好ましく挙げられる。５−アミノレブリン酸以外の５−アミノレブリン酸類（すなわち、５−アミノレブリン酸誘導体）の好適な例として、５−アミノレブリン酸メチルエステル、５−アミノレブリン酸エチルエステル、５−アミノレブリン酸プロピルエステル、５−アミノレブリン酸ブチルエステル、５−アミノレブリン酸ペンチルエステル、５−アミノレブリン酸ヘキシルエステル等の５−アミノレブリン酸エステルが挙げられ、特に５−アミノレブリン酸メチルエステル又は５−アミノレブリン酸ヘキシルエステルが好ましく挙げられる。
【００２９】
５−アミノレブリン酸類の塩としては、特に制限されないが、薬学的に許容される無機酸又は有機酸の酸付加塩が好ましい。無機酸の付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等、有機酸の付加塩としては、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩等が挙げられ、特に５−アミノレブリン酸塩酸塩又は５−アミノレブリン酸リン酸塩が好ましい。これらの塩は、化学合成、微生物や酵素を用いる方法のいずれの方法によっても製造できる。例えば、特開平４−９３６０号公報、特表平１１−５０１９１４号公報、特開２００６−１８２７５３号公報、特開２００５−３１４３６１号公報、特開２００５−３１４３６０号公報記載の方法が挙げられる。
【００３０】
本発明の蛍光染色剤に含まれるＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤としては、ＡＢＣＧ２トランスポーターがプロトポルフィリンIXをミトコンドリア内から細胞質へと排出する活性（以下、単に「ＡＢＣＧ２トランスポーターの排出活性」とも表示する。）を阻害する物質である限り特に制限されず、該活性を競争的に阻害する物質であってもよいし、非競争的に阻害する物質であってもよい。ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤の例としては、レセルピン（（３β，２０α）‐１１，１７α‐ジメトキシ‐１８β‐［（３，４，５‐トリメトキシベンゾイル）オキシ］ヨヒンバン‐１６β‐カルボン酸メチル）、トリプロスタチンＡ（（８ａα）‐ヘキサヒドロ‐３β‐［［２‐（３‐メチル‐２‐ブテニル）‐６‐メトキシ‐１Ｈ‐インドール‐３‐イル］メチル］ピロロ［１，２‐ａ］ピラジン‐１，４‐ジオン）、フミトレモルギンＣ（（１Ｓ）‐１α‐イソブテニル‐２，３α‐［カルボニル［（２Ｓ）‐ピロリジン‐２α，１‐ジイル］カルボニル］‐７‐メトキシ‐１，２，３，４‐テトラヒドロ‐β‐カルボリン）、ジピリダモール（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′‐テトラキス（２‐ヒドロキシエチル）‐４，８‐ジピペリジノピリミド［５，４‐ｄ］ピリミジン‐２，６‐ジアミン）、ノボビオシン（Ｎ‐［７‐［（３‐Ｏ‐カルバモイル‐４‐Ｏ，５‐Ｃ‐ジメチル‐６‐デオキシ‐β‐Ｌ‐ｌｙｘｏ‐ヘキソピラノシル）オキシ］‐４‐ヒドロキシ‐８‐メチル‐２‐オキソ‐２Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐３‐イル］‐４‐ヒドロキシ‐３‐（３‐メチル‐２‐ブテニル）ベンズアミド）、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体（ＷＯ／２００９／０７２２６７の一般式（１）で表されるアクリロニトリル誘導体）、ＧＦ１２０９１８（Ｎ−（４−［２−（１，２，３，４−テトラヒドロ−６，７−ジメトキシ−２−イソキノリニル）エチル］−フェニル）−９，１０−ジヒドロ−５−メトキシ−９−オキソ−４−アクリジンカルボキサミド）、メトトレキサート（Ｎ‐［４‐［［（２，４‐ジアミノ‐６‐プテリジニル）メチル］（メチル）アミノ］ベンゾイル］‐Ｌ‐グルタミン酸）、ミトキサントロン（５，８‐ジヒドロキシ‐１，４‐ビス［［２‐［（２‐ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］アミノ］‐９，１０‐アントラキノン）、ダウノルビシン（（８Ｓ）‐８‐アセチル‐１０α‐［（３‐アミノ‐２，３，６‐トリデオキシ‐α‐Ｌ‐ｌｙｘｏ‐ヘキソピラノシル）オキシ］‐７，８，９，１０‐テトラヒドロ‐６，８α，１１‐トリヒドロキシ‐１‐メトキシ‐５，１２‐ナフタセンジオン）、ドキソルビシン（（８Ｓ，１０Ｓ）‐１０‐［（３‐アミノ‐２，３，６‐トリデオキシ‐α‐Ｌ‐ｌｙｘｏ‐ヘキソピラノシル）オキシ］‐８‐グリコロイル‐７，８，９，１０‐テトラヒドロ‐６，８，１１‐トリヒドロキシ‐１‐メトキシ‐５，１２‐ナフタセンジオン）、ビスアントレン（ビス（２−イミダゾレン−２−イルヒドラゾン）−９，１０−アントラセンジカルボキシアルデヒド）、エトポシド（（５Ｒ）‐９α‐［４‐Ｏ，６‐Ｏ‐［（Ｒ）‐エチリデン］‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルオキシ］‐５，８，８ａβ，９‐テトラヒドロ‐５β‐（４‐ヒドロキシ‐３，５‐ジメトキシフェニル）フロ［３′，４′：６，７］ナフト［２，３‐ｄ］‐１，３‐ジオキソール‐６（５ａαＨ）‐オン）、ゲフィチニブ（Ｎ‐（３‐クロロ‐４‐フルオロフェニル）‐７‐メトキシ‐６‐（３‐モルホリノプロポキシ）‐４‐キナゾリンアミン）、イマチニブ（Ｎ‐［３‐［［４‐（３‐ピリジニル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ］‐４‐メチルフェニル］‐４‐［（４‐メチルピペラジン‐１‐イル）メチル］ベンズアミド）、イリノテカン（（４Ｓ）‐４α，１１‐ジエチル‐４β‐ヒドロキシ‐９‐［（４‐ピペリジノピペリジノ）カルボニルオキシ］‐１Ｈ‐ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２‐ｂ］キノリン‐３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）‐ジオン）、トポテカン（４α‐エチル‐４β，９‐ジヒドロキシ‐１０‐［（ジメチルアミノ）メチル］‐１Ｈ‐ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２‐ｂ］キノリン‐３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）‐ジオン）、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）、フラボピリドール（ｒｅｌ‐５，７‐ジヒドロキシ‐２‐（２‐クロロフェニル）‐８‐（１‐メチル‐３α＊‐ヒドロキシピペリジン‐４α＊‐イル）‐４Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐４‐オン）、ＣＩ１０３３（６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン）、タモキシフェン（２‐［ｐ‐［（Ｚ）‐１，２‐ジフェニル‐１‐ブテニル］フェニルオキシ］‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルエタンアミン）、それらの誘導体、及び、それらの塩が好ましく挙げられ、中でも、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンがより好ましく挙げられ、中でも、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンがさらに好ましく挙げられる。前述のＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤のうち、ＡＢＣＧ２トランスポーターの排出活性を競争的に阻害する物質として、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェン等の抗がん剤や、レセルピンを例示することができ、非競争的に阻害する物質として、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８を例示することができる。
【００３１】
本発明の蛍光染色剤に含まれる、本発明における５−アミノレブリン酸類等の含有量としては、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り特に制限されないが、例えば、本発明の蛍光染色剤の全量に対して例えば０．０００１〜９９．９９９９質量％、好ましくは０．００１〜８０質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％、さらに好ましくは０．００５〜２０質量％を好適に例示することができ、本発明の蛍光染色剤に含まれるＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤の含有量としては、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り特に制限されないが、例えば、本発明の蛍光染色剤の全量に対して例えば０．００００１〜９９．９９９９９質量％、好ましくは０．０００１〜６０質量％、より好ましくは０．０００１〜３０質量％、さらに好ましくは０．０００５〜１０質量％を好適に例示することができる。また、本発明の蛍光染色剤に含まれる、本発明における５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とのモル比率としては、１０００：１〜１：１０００、好ましくは５００：１〜１：１００、より好ましくは５００：１〜１：１、さらに好ましくは２００：１〜１０：１を好適に例示することができる。
【００３２】
本発明の蛍光染色剤は、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り、本発明における５−アミノレブリン酸類等及びＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤の他に、ミトコンドリア内へのプロトポルフィリンIXの蓄積を促進する物質（例えば、フェロキラターゼ）などの任意成分を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明における５−アミノレブリン酸類等やＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、簡便に使用し得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えば本発明における５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明における５−アミノレブリン酸類等やＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００３４】
本発明の蛍光染色剤は、生細胞中のミトコンドリアである限り、インビトロの系であってもインビボの系であっても、該ミトコンドリアを蛍光染色することができる。本発明の蛍光染色剤をインビトロの系で用いる場合の方法としては、（ａ）対象細胞に本発明の蛍光染色剤を接触させる工程、及び、（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程を含む方法を例示することができ、上記工程（ａ）としては、（ａ１）対象細胞を本発明の蛍光染色剤に接触させた状態で、一定時間（好ましくは５分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）培養する工程を好適に例示することができ、（ａ２）対象細胞を本発明の蛍光染色剤に接触させた状態で、一定時間（好ましくは５分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）培養した後、対象細胞を洗浄する工程をより好適に例示することができ、（ａ３）対象細胞を本発明の蛍光染色剤に接触させた状態で、一定時間（好ましくは５分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）培養した後、対象細胞を洗浄し、次いで、対象細胞を一定時間（好ましくは１分間〜３０分間、より好ましくは５分間〜２０分間、さらに好ましくは８分間〜１５分間、より好ましくは１０分間）インキュベートする工程をより好適に例示することができる。
【００３５】
また、本発明の蛍光染色剤をインビボの系で用いる場合の方法としては、（Ａ）対象に本発の蛍光染色剤を投与する工程、（Ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象に照射する工程を含む方法を例示することができ、上記工程（Ａ）としては、（Ａ１）対象に本発の蛍光染色剤を投与してから、一定時間（好ましくは２０分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）経過させる工程を好適に例示することができる。
【００３６】
上記工程（Ａ）における対象への投与方法としては、対象のミトコンドリアを蛍光染色し得る限り特に制限されず、静脈内、筋肉内、動脈内等への注射投与；経口投与；経皮投与；経粘膜投与；経直腸投与；経腔投与；脳等への局所投与を例示することができ、中でも、静脈内、筋肉内、動脈内等への注射投与；経口投与；経皮投与を好適に例示することができる。
【００３７】
本発明の蛍光染色剤の対象への投与量は、投与方法や対象の体重等によっても異なるが、例えば経口投与の場合、本発明における５−アミノレブリン酸類等換算で、１回に体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜５ｇ、より好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１〜６００ｍｇを好適に例示することができ、
ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤換算で、１回に体重１ｋｇ当たり０．００００２ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは０．０００２ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．００２〜２０ｍｇ、さらに好ましくは０．０２〜１２ｍｇを好適に例示することができる。
【００３８】
上記工程（ｂ）や工程（Ｂ）における「プロトポルフィリンIXに対する励起光」としては、プロトポルフィリンIXが励起する限り特に制限されないが、４０５ｎｍの励起光を好適に例示することができる。かかる励起光は、市販の励起光源を利用して、対象細胞や対象に照射することができる。
【００３９】
上記の対象細胞の由来や、対象の生物種としては、哺乳動物を好適に例示することができ、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
【００４０】
２．本発明のミトコンドリアの蛍光染色キット
本発明のミトコンドリアの蛍光染色キット（以下、単に「本発明の蛍光染色キット」とも表示する。）としては、本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでなる限り特に制限されず、例えば、本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを別々に製剤化して含むものを好適に例示することができる。
【００４１】
本発明の蛍光染色キットにおける５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とは、混合してから使用してもよいし、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り、混合せずに別々に使用してもよい。
【００４２】
３．本発明のミトコンドリアの蛍光染色方法
本発明のミトコンドリアの蛍光染色方法（以下、単に「本発明の蛍光染色方法」とも表示する。）としては、本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用する工程を含む限り特に制限されないが、（ａ）本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象細胞に接触させる工程；及び、（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程を含む方法を好適に例示することができ、さらに、（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、対象細胞を洗浄する工程を含む方法をより好適に例示することができる。
【００４３】
また、本発明の蛍光染色方法はインビボにおいても適用することができる。その場合は、（Ａ）本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象に投与する工程；及び、（Ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象に照射する工程を含む方法を例示することができる。
【００４４】
なお、５−アミノレブリン酸は、疾患（特に悪性腫瘍）の光線力学療法（ＰＤＴ）に好適に用いられている。というのも、５−アミノレブリン酸は、正常細胞内ではヘムまで代謝されるのに対し、悪性腫瘍細胞内では好気呼吸が低下して嫌気的条件となっているためプロトポルフィリンIXまでしか代謝されない結果、プロトポルフィリンIXが悪性腫瘍細胞特異的に蓄積するからである。５−アミノレブリン酸を投与した患者にレーザー光等を照射すると、悪性腫瘍細胞に蓄積したプロトポルフィリンIXが活性酸素種や活性ラジカル種を発生させ、悪性腫瘍細胞特異的に細胞の活動や増殖を阻害させて、治療効果を得ることが可能となる。本発明者らのこれまでの研究で、悪性腫瘍細胞に対するその治療効果が、アポトーシスやネクローシスによるものであることを明らかにしている（Cell Biochem Funct. 2009 27(8), 503-515参照）。また、本発明者らは、同文献において、５−アミノレブリン酸からプロトポルフィリンIXが合成された当初はプロトポルフィリンIXがミトコンドリアに分布し、その状態でＰＤＴを行うとアポトーシスを誘導するが、合成されて長時間経過するとプロトポルフィリンIXは細胞質から細胞膜に移動し、その状態でＰＤＴを行うとネクローシスを誘導することも明らかにしている。本発明者らは、本発明により、５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用することにより、顕著な量のプロトポルフィリンIXをミトコンドリア内に蓄積させ得ることを示した。本発明者らは、これらの知見から、５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用することにより、悪性腫瘍にネクローシスではなくアポトーシスを特異的に誘導させ得ると考えている。ネクローシスを生じさせた場合は、治療後の傷跡が残る場合があるのに対し、アポトーシスを生じさせた場合は、治療後の傷跡が残りにくいため、本発明における５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤と含む悪性腫瘍治療剤（アポトーシス誘導剤）は、特に外部から見える部位の悪性腫瘍に対し非常に有利な治療剤となると考えられる。
【実施例１】
【００４５】
［ミトコンドリアの蛍光染色実験１］
本発明の蛍光染色方法により、生細胞内のミトコンドリアを蛍光染色し得るかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
【００４６】
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用意した。このＨＵＶＥＣを、１ｍＭ ５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及び２０μＭ レセルピン（ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤）存在下で３時間培養した。次いで、ＨＵＶＥＣをＦＢＳ培地にて洗浄した後、１０分間インキュベートを行った。その後、このＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１の中央下パネルに示す。なお、４０５ｎｍの励起光により観察される蛍光は、プロトポルフィリンIXの蛍光である。
【００４７】
また、コントロールとして、レセルピンを用いなかったこと以外は上記と同様の方法で培養、洗浄、インキュベートしたＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１の中央上パネルに示す。
【００４８】
また、別のコントロールとして、前述のＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）をミトコンドリア染色試薬 Nonyl Acridine Orange（ＮＡＯ）にて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図１の左下パネルに示す。同様に、前述のＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図１の左上パネルに示す。
【００４９】
また、図１の左上パネルと図１の中央上パネルを重ね合わせたものを、図１の右上パネルに示し、図１の左下パネルと図１の中央下パネルを重ね合わせたものを、図１の右下パネルに示す。
【００５０】
図１の左下パネル、中央下パネル及び右下パネルの結果から分かるように、図１の左下パネルの蛍光と、中央下パネルの蛍光は重なり合っていたことから、プロトポルフィリンIXの蛍光（赤色蛍光）は、ミトコンドリア部位に特異的に観察されることが分かった。また、図１の中央上パネル及び中央下パネルの結果から分かるように、レセルピン（ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤）を欠いていると、プロトポルフィリンIXの蛍光はかなり不鮮明であり、ミトコンドリアを明確に染色することはできなかった。さらに、図１の左下パネル及び中央下パネルの結果を比較すると分かるように、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）と、レセルピン（ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤）とを併用すると（図１の中央下パネル）、従来のＮＡＯを用いた場合（図１の左下パネル）よりも著しく鮮明にミトコンドリアを染色できることが示された。
【実施例２】
【００５１】
［ミトコンドリアの蛍光染色実験２］
本発明の蛍光染色方法が、ＨＵＶＥＣ以外の細胞でも用い得るかどうかを確認するために、ＨＵＶＥＣに代えてＣＯＳ細胞（不死化サル腎線維芽細胞）を用いた点、ＦＢＳ培地に代えてＰＢＳを用いた点、洗浄後のインキュベートを行わなかった点以外は、上記実施例１の蛍光染色実験と同じ方法で蛍光染色実験を行った。その結果を図２に示す。より詳細には、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した結果を図２の中央下パネルに示し、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）をＮＡＯにて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図２の左下パネルに示し、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した結果を図２の中央上パネルに示し、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図２の左上パネルに示す。また、図２の左上パネルと図２の中央上パネルを重ね合わせたものを、図２の右上パネルに示し、図２の左下パネルと図２の中央下パネルを重ね合わせたものを、図２の右下パネルに示す。
【００５２】
図２の結果から分かるように、ＣＯＳ細胞を用いた場合も、図１の結果と同様の結果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色の分野に好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色剤や、ミトコンドリアの蛍光染色キットや、ミトコンドリアの蛍光染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細胞内ミトコンドリアの染色には、生体染色色素が用いられている。例えば、胚形成初期精子のミトコンドリア細胞内挙動を観察するために、Rhodamine（登録商標）１２３（invitrogen社製；cat. R302, R22420）やMito Tracker（登録商標）(invitrogen社製; cat. M7512)によって染色し、蛍光顕微鏡下で観察することが行われている（例えば、非特許文献１〜４参照）。また、ミトコンドリアへのターゲット配列を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に付加することにより、ミトコンドリアを可視化することも行われている（例えば、非特許文献５〜６参照）。
【０００３】
しかし、前述の生体染色色素は、励起光により容易に退色してしまい、輝度が低下してしまう点、染色後においても色素が容易に解離してしまう点、色素によっては細胞を固定する必要がある点などの不十分な点があった。また、ＧＦＰを用いた前述のミトコンドリアの観察方法は、遺伝子組換え操作を伴うために煩雑であるなどの不十分な点があった。さらに、ミトコンドリアと機能的に深く関わる細胞小器官・生理活性物質をＧＦＰ標識する解析なども盛んに行われているが、そのような場合に、それらの細胞小器官等とミトコンドリアとを区別しつつ同時に観察するには、ミトコンドリアをＧＦＰ以外の波長特性をもつ蛍光タンパク質で標識する必要があった。
【０００４】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は、アミノ酸の一種であり植物の葉緑素や動物の血液中のヘムなどに必須なポルフィリン類の唯一の原料となる物質である。５−アミノレブリン酸は、動物においては、順に、ポルフォビリノーゲン、ヒドロキシメチルビラン、ウロポルフィリノーゲンIII、コプロポルフィリンIII、プロトポルフィリノーゲンIX、プロトポルフィリンIXへと代謝され、プロトポルフィリンは鉄イオンを配位してヘムとなり、ヘムはグロビンと結合してヘモグロビンとなることが知られている。
【０００５】
ＡＢＣＧ２（ATP-binding cassette, sub-family G, member 2）は、乳がん耐性タンパク質（breast cancer resistant protein：ＢＣＲＰ）とも呼ばれるが、ミトコンドリア膜に存在する、細胞膜貫通型のＡＢＣ（ATP−binding cassette）トランスポーターの一つである。ＡＢＣＧ２は、プロトポルフィリンIXを基質の一つとしており、ＡＢＣＧ２を欠失させると、細胞内にプロトポルフィリンIXが蓄積することや（非特許文献７〜８参照）、プロトポルフィリンIXからヘムへの反応はミトコンドリア内で行われ、プロトポルフィリンIXはＡＢＣＧ２を介して細胞質へ排出され得ることも知られている（非特許文献９参照）。さらに、５−アミノレブリン酸は、細胞質内においてポルフォビリノーゲンを経由しコポルフォビリノーゲンIIIに代謝された後、ＡＢＣＢ６を介してミトコンドリア内に取り込まれることが知られている（非特許文献１０参照）。また、非特許文献１１には、ＥＳ細胞を、ＡＢＣＧ２インヒビターであるフミトレモルギンＣ（fumitremorgin C：ＦＴＣ）で処理すると、細胞内のプロトポルフィリンIXが上昇することや、ＥＳ細胞を５−ＡＬＡ処理して内因性のプロトポルフィリンIXを誘導した後のプロトポルフィリンIXの排出が、ＦＴＣの添加により低下したことが記載されている。また、非特許文献１２には、膀胱癌細胞２５３ＪＢ−Ｖに、フェロキラターゼ阻害剤ＤＦＸ（プロトポルフィリンIXからヘムを生成する酵素の阻害剤）を作用させると、５−ＡＬＡを介したプロトポルフィリンIXの細胞内への蓄積が高まることが記載されているが、この現象は正常細胞では見られなかった。
【０００６】
以上のように、５−アミノレブリン酸とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤を併用することによって、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に染色し得ることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kaneda, H et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4542-4546.
【非特許文献２】Cummins, J. M et al., (1997) Zygote 5, 301-308.
【非特許文献３】Sutovsky, P. et al., (1996) Biol. Reprod. 55, 1195-1205.
【非特許文献４】Sutovsky, P. et al., (2000) Biol. Reprod. 63, 582-590.
【非特許文献５】Rizzuto, R et al., (1995) Curr. Biol. 5, 635-642.
【非特許文献６】Rizzuto, R et al., (1996) Curr. Biol. 6, 183-188.
【非特許文献７】J. W. Jonker et al., (2007) Am J Physiol Cell Physiol 292, C2204-C2212.
【非特許文献８】S. Zhou et al., (2005) Blood 105, 2571-2576.
【非特許文献９】Tamura, A et al., (2007) Drug Metabolism and Pharmacokinetics 22, No.6, 428-440.
【非特許文献１０】Iqbal Hamza, (2006) ACS Chem. Biol., 1 (10), pp 627-629.
【非特許文献１１】Susanto J. et al., (2008) PLoS ONE, vol. 3, issue 12, p. e4023
【非特許文献１２】Inoue, K et al., (2009) Pathology 76, 303-314
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色剤や、ミトコンドリアの蛍光染色キットや、ミトコンドリアの蛍光染色方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述のように、従来の生体染色色素は、励起光により容易に退色してしまい、輝度が低下してしまう点、染色後においても色素が容易に解離してしまう点、色素によっては細胞を固定する必要がある点などの不十分な点があった。また、ＧＦＰを用いた従来のミトコンドリアの観察方法は、遺伝子組換え操作を伴うために煩雑であるなどの不十分な点があった。そこで、本発明者らは、従来法の不十分な点を改善するべく鋭意検討を行ったところ、５−アミノレブリン酸と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用すると、５−アミノレブリン酸の代謝物質であるプロトポルフィリンIXがＡＢＣＧ２トランスポーターによりミトコンドリア外の細胞質に排出される量が著しく低減して、該プロトポルフィリンIXがミトコンドリア内に蓄積し、これにより、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に蛍光染色することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、〔１〕一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色剤や、
〔２〕ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする上記〔１〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色剤に関する。
【００１１】
また、本発明は、〔３〕一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでなることを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色キットや、
〔４〕ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする上記〔３〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色キットに関する。
【００１２】
さらに、本発明は、〔５〕一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用する工程を含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色方法や、
〔６〕次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする上記〔５〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法；
（ａ）一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類、又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象細胞に接触させる工程；
（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程；や、
〔７〕（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、対象細胞を洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする上記〔６〕に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に蛍光染色することができる。また、本発明の蛍光染色に用いる成分は細胞毒性がなく、生細胞に用いることができるため、観察するに際して細胞を固定する必要がない。また、本発明による蛍光染色は、原理的に色素の解離等を考慮する必要はないため、長時間にわたり、鮮明な蛍光が観察できる。また、プロトポルフィリンIXの最大蛍光波長は６３５ｎｍであり、ＧＦＰの最大蛍光波長（５０９ｎｍ）と重複しないため、ミトコンドリアと機能的に深く関わる細胞小器官・生理活性物質をＧＦＰ標識したときであっても、本発明によりミトコンドリアを蛍光染色すれば、それらの細胞小器官等とミトコンドリアとを区別しつつ同時に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を蛍光染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。図１左上パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１中央上パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１右上パネル：図１左上パネルと図１中央上パネルを重ね合わせた結果を示す。図１左下パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１中央下パネル：ＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及びレセルピンを添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図１右下パネル：図１左下パネルと図１中央下パネルを重ね合わせた結果を示す。
【図２】不死化サル腎線維芽細胞（ＣＯＳ細胞）を蛍光染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す図である。図２左上パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２中央上パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２右上パネル：図２左上パネルと図２中央上パネルを重ね合わせた結果を示す。図２左下パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）をＮＡＯにて染色した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２中央下パネル：ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及びレセルピンを添加した後、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。図２右下パネル：図２左下パネルと図２中央下パネルを重ね合わせた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明のミトコンドリアの蛍光染色剤
本発明のミトコンドリアの蛍光染色剤（以下、単に「本発明の蛍光染色剤」とも表示する。）としては、上記の一般式（１）で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩（以下、「本発明における５−アミノレブリン酸類等」とも表示する。）と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでいる限り特に制限されず、本発明の蛍光染色剤の対象となるミトコンドリアとしては、生細胞中のミトコンドリアである限り特に制限されない。本発明の蛍光染色剤を利用すると、５−アミノレブリン酸の代謝物質であるプロトポルフィリンIXがＡＢＣＧ２トランスポーターによりミトコンドリア外の細胞質に排出される量が著しく低減して、該プロトポルフィリンIXがミトコンドリア内に蓄積し、これにより、ミトコンドリアを非常に簡便かつ鮮明に蛍光染色することが可能となる。
【００１６】
上記の一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示す。
【００１７】
上記アルキル基としては、炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜１８のアルキル基、特に炭素数１〜６のアルキル基が好ましい。かかる炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基等が挙げられる。
【００１８】
上記アシル基としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルカノイル基、アルケニルカルボニル基又はアロイル基が好ましく、特に炭素数１〜６のアルカノイル基が好ましい。かかるアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられる。
【００１９】
上記アルコキシカルボニル基としては、総炭素数２〜１３のアルコキシカルボニル基が好ましく、特に炭素数２〜７のアルコキシカルボニル基が好ましい。かかるアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基等が挙げられる。
【００２０】
上記アリール基としては、炭素数６〜１６のアリール基が好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００２１】
上記アラルキル基としては、炭素数６〜１６のアリール基と上記炭素数１〜６のアルキル基とからなる基が好ましく、例えば、ベンジル基等が挙げられる。
【００２２】
上記の一般式（１）中、Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。
【００２３】
上記アルコキシ基としては、炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜１６のアルコキシ基、特に炭素数１〜１２のアルコキシ基が好ましい。かかるアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基等が挙げられる。
【００２４】
上記アシルオキシ基としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐鎖のアルカノイルオキシ基が好ましく、特に炭素数１〜６のアルカノイルオキシ基が好ましい。かかるアシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基等が挙げられる。
【００２５】
上記アルコキシカルボニルオキシ基としては、総炭素数２〜１３のアルコキシカルボニルオキシ基が好ましく、特に総炭素数２〜７のアルコキシカルボニルオキシ基が好ましい。かかるアルコキシカルボニルオキシ基としては、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ−プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
【００２６】
上記アリールオキシ基としては、炭素数６〜１６のアリールオキシ基が好ましく、例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等が挙げられる。アラルキルオキシ基としては、前記アラルキル基を有するものが好ましく、例えば、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００２７】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２としては水素原子が好ましい。Ｒ３としてはヒドロキシ基、アルコキシ基又はアラルキルオキシ基が好ましく、ヒドロキシ基又は炭素数１〜１２のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基又はヘキシルオキシ基が特に好ましい。
【００２８】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３がヒドロキシ基である化合物は５−アミノレブリン酸であり、特に好ましく挙げられる。５−アミノレブリン酸以外の５−アミノレブリン酸類（すなわち、５−アミノレブリン酸誘導体）の好適な例として、５−アミノレブリン酸メチルエステル、５−アミノレブリン酸エチルエステル、５−アミノレブリン酸プロピルエステル、５−アミノレブリン酸ブチルエステル、５−アミノレブリン酸ペンチルエステル、５−アミノレブリン酸ヘキシルエステル等の５−アミノレブリン酸エステルが挙げられ、特に５−アミノレブリン酸メチルエステル又は５−アミノレブリン酸ヘキシルエステルが好ましく挙げられる。
【００２９】
５−アミノレブリン酸類の塩としては、特に制限されないが、薬学的に許容される無機酸又は有機酸の酸付加塩が好ましい。無機酸の付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等、有機酸の付加塩としては、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩等が挙げられ、特に５−アミノレブリン酸塩酸塩又は５−アミノレブリン酸リン酸塩が好ましい。これらの塩は、化学合成、微生物や酵素を用いる方法のいずれの方法によっても製造できる。例えば、特開平４−９３６０号公報、特表平１１−５０１９１４号公報、特開２００６−１８２７５３号公報、特開２００５−３１４３６１号公報、特開２００５−３１４３６０号公報記載の方法が挙げられる。
【００３０】
本発明の蛍光染色剤に含まれるＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤としては、ＡＢＣＧ２トランスポーターがプロトポルフィリンIXをミトコンドリア内から細胞質へと排出する活性（以下、単に「ＡＢＣＧ２トランスポーターの排出活性」とも表示する。）を阻害する物質である限り特に制限されず、該活性を競争的に阻害する物質であってもよいし、非競争的に阻害する物質であってもよい。ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤の例としては、レセルピン（（３β，２０α）‐１１，１７α‐ジメトキシ‐１８β‐［（３，４，５‐トリメトキシベンゾイル）オキシ］ヨヒンバン‐１６β‐カルボン酸メチル）、トリプロスタチンＡ（（８ａα）‐ヘキサヒドロ‐３β‐［［２‐（３‐メチル‐２‐ブテニル）‐６‐メトキシ‐１Ｈ‐インドール‐３‐イル］メチル］ピロロ［１，２‐ａ］ピラジン‐１，４‐ジオン）、フミトレモルギンＣ（（１Ｓ）‐１α‐イソブテニル‐２，３α‐［カルボニル［（２Ｓ）‐ピロリジン‐２α，１‐ジイル］カルボニル］‐７‐メトキシ‐１，２，３，４‐テトラヒドロ‐β‐カルボリン）、ジピリダモール（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′‐テトラキス（２‐ヒドロキシエチル）‐４，８‐ジピペリジノピリミド［５，４‐ｄ］ピリミジン‐２，６‐ジアミン）、ノボビオシン（Ｎ‐［７‐［（３‐Ｏ‐カルバモイル‐４‐Ｏ，５‐Ｃ‐ジメチル‐６‐デオキシ‐β‐Ｌ‐ｌｙｘｏ‐ヘキソピラノシル）オキシ］‐４‐ヒドロキシ‐８‐メチル‐２‐オキソ‐２Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐３‐イル］‐４‐ヒドロキシ‐３‐（３‐メチル‐２‐ブテニル）ベンズアミド）、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体（ＷＯ／２００９／０７２２６７の一般式（１）で表されるアクリロニトリル誘導体）、ＧＦ１２０９１８（Ｎ−（４−［２−（１，２，３，４−テトラヒドロ−６，７−ジメトキシ−２−イソキノリニル）エチル］−フェニル）−９，１０−ジヒドロ−５−メトキシ−９−オキソ−４−アクリジンカルボキサミド）、メトトレキサート（Ｎ‐［４‐［［（２，４‐ジアミノ‐６‐プテリジニル）メチル］（メチル）アミノ］ベンゾイル］‐Ｌ‐グルタミン酸）、ミトキサントロン（５，８‐ジヒドロキシ‐１，４‐ビス［［２‐［（２‐ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］アミノ］‐９，１０‐アントラキノン）、ダウノルビシン（（８Ｓ）‐８‐アセチル‐１０α‐［（３‐アミノ‐２，３，６‐トリデオキシ‐α‐Ｌ‐ｌｙｘｏ‐ヘキソピラノシル）オキシ］‐７，８，９，１０‐テトラヒドロ‐６，８α，１１‐トリヒドロキシ‐１‐メトキシ‐５，１２‐ナフタセンジオン）、ドキソルビシン（（８Ｓ，１０Ｓ）‐１０‐［（３‐アミノ‐２，３，６‐トリデオキシ‐α‐Ｌ‐ｌｙｘｏ‐ヘキソピラノシル）オキシ］‐８‐グリコロイル‐７，８，９，１０‐テトラヒドロ‐６，８，１１‐トリヒドロキシ‐１‐メトキシ‐５，１２‐ナフタセンジオン）、ビスアントレン（ビス（２−イミダゾレン−２−イルヒドラゾン）−９，１０−アントラセンジカルボキシアルデヒド）、エトポシド（（５Ｒ）‐９α‐［４‐Ｏ，６‐Ｏ‐［（Ｒ）‐エチリデン］‐β‐Ｄ‐グルコピラノシルオキシ］‐５，８，８ａβ，９‐テトラヒドロ‐５β‐（４‐ヒドロキシ‐３，５‐ジメトキシフェニル）フロ［３′，４′：６，７］ナフト［２，３‐ｄ］‐１，３‐ジオキソール‐６（５ａαＨ）‐オン）、ゲフィチニブ（Ｎ‐（３‐クロロ‐４‐フルオロフェニル）‐７‐メトキシ‐６‐（３‐モルホリノプロポキシ）‐４‐キナゾリンアミン）、イマチニブ（Ｎ‐［３‐［［４‐（３‐ピリジニル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ］‐４‐メチルフェニル］‐４‐［（４‐メチルピペラジン‐１‐イル）メチル］ベンズアミド）、イリノテカン（（４Ｓ）‐４α，１１‐ジエチル‐４β‐ヒドロキシ‐９‐［（４‐ピペリジノピペリジノ）カルボニルオキシ］‐１Ｈ‐ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２‐ｂ］キノリン‐３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）‐ジオン）、トポテカン（４α‐エチル‐４β，９‐ジヒドロキシ‐１０‐［（ジメチルアミノ）メチル］‐１Ｈ‐ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２‐ｂ］キノリン‐３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）‐ジオン）、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）、フラボピリドール（ｒｅｌ‐５，７‐ジヒドロキシ‐２‐（２‐クロロフェニル）‐８‐（１‐メチル‐３α＊‐ヒドロキシピペリジン‐４α＊‐イル）‐４Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐４‐オン）、ＣＩ１０３３（６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン）、タモキシフェン（２‐［ｐ‐［（Ｚ）‐１，２‐ジフェニル‐１‐ブテニル］フェニルオキシ］‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルエタンアミン）、それらの誘導体、及び、それらの塩が好ましく挙げられ、中でも、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンがより好ましく挙げられ、中でも、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンがさらに好ましく挙げられる。前述のＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤のうち、ＡＢＣＧ２トランスポーターの排出活性を競争的に阻害する物質として、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェン等の抗がん剤や、レセルピンを例示することができ、非競争的に阻害する物質として、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８を例示することができる。
【００３１】
本発明の蛍光染色剤に含まれる、本発明における５−アミノレブリン酸類等の含有量としては、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り特に制限されないが、例えば、本発明の蛍光染色剤の全量に対して例えば０．０００１〜９９．９９９９質量％、好ましくは０．００１〜８０質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％、さらに好ましくは０．００５〜２０質量％を好適に例示することができ、本発明の蛍光染色剤に含まれるＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤の含有量としては、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り特に制限されないが、例えば、本発明の蛍光染色剤の全量に対して例えば０．００００１〜９９．９９９９９質量％、好ましくは０．０００１〜６０質量％、より好ましくは０．０００１〜３０質量％、さらに好ましくは０．０００５〜１０質量％を好適に例示することができる。また、本発明の蛍光染色剤に含まれる、本発明における５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とのモル比率としては、１０００：１〜１：１０００、好ましくは５００：１〜１：１００、より好ましくは５００：１〜１：１、さらに好ましくは２００：１〜１０：１を好適に例示することができる。
【００３２】
本発明の蛍光染色剤は、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り、本発明における５−アミノレブリン酸類等及びＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤の他に、ミトコンドリア内へのプロトポルフィリンIXの蓄積を促進する物質（例えば、フェロキラターゼ）などの任意成分を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明における５−アミノレブリン酸類等やＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、簡便に使用し得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えば本発明における５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明における５−アミノレブリン酸類等やＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００３４】
本発明の蛍光染色剤は、生細胞中のミトコンドリアである限り、インビトロの系であってもインビボの系であっても、該ミトコンドリアを蛍光染色することができる。本発明の蛍光染色剤をインビトロの系で用いる場合の方法としては、（ａ）対象細胞に本発明の蛍光染色剤を接触させる工程、及び、（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程を含む方法を例示することができ、上記工程（ａ）としては、（ａ１）対象細胞を本発明の蛍光染色剤に接触させた状態で、一定時間（好ましくは５分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）培養する工程を好適に例示することができ、（ａ２）対象細胞を本発明の蛍光染色剤に接触させた状態で、一定時間（好ましくは５分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）培養した後、対象細胞を洗浄する工程をより好適に例示することができ、（ａ３）対象細胞を本発明の蛍光染色剤に接触させた状態で、一定時間（好ましくは５分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）培養した後、対象細胞を洗浄し、次いで、対象細胞を一定時間（好ましくは１分間〜３０分間、より好ましくは５分間〜２０分間、さらに好ましくは８分間〜１５分間、より好ましくは１０分間）インキュベートする工程をより好適に例示することができる。
【００３５】
また、本発明の蛍光染色剤をインビボの系で用いる場合の方法としては、（Ａ）対象に本発の蛍光染色剤を投与する工程、（Ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象に照射する工程を含む方法を例示することができ、上記工程（Ａ）としては、（Ａ１）対象に本発の蛍光染色剤を投与してから、一定時間（好ましくは２０分間〜２０時間、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは２時間〜４時間、より好ましくは３時間）経過させる工程を好適に例示することができる。
【００３６】
上記工程（Ａ）における対象への投与方法としては、対象のミトコンドリアを蛍光染色し得る限り特に制限されず、静脈内、筋肉内、動脈内等への注射投与；経口投与；経皮投与；経粘膜投与；経直腸投与；経腔投与；脳等への局所投与を例示することができ、中でも、静脈内、筋肉内、動脈内等への注射投与；経口投与；経皮投与を好適に例示することができる。
【００３７】
本発明の蛍光染色剤の対象への投与量は、投与方法や対象の体重等によっても異なるが、例えば経口投与の場合、本発明における５−アミノレブリン酸類等換算で、１回に体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜５ｇ、より好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１〜６００ｍｇを好適に例示することができ、
ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤換算で、１回に体重１ｋｇ当たり０．００００２ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは０．０００２ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．００２〜２０ｍｇ、さらに好ましくは０．０２〜１２ｍｇを好適に例示することができる。
【００３８】
上記工程（ｂ）や工程（Ｂ）における「プロトポルフィリンIXに対する励起光」としては、プロトポルフィリンIXが励起する限り特に制限されないが、４０５ｎｍの励起光を好適に例示することができる。かかる励起光は、市販の励起光源を利用して、対象細胞や対象に照射することができる。
【００３９】
上記の対象細胞の由来や、対象の生物種としては、哺乳動物を好適に例示することができ、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
【００４０】
２．本発明のミトコンドリアの蛍光染色キット
本発明のミトコンドリアの蛍光染色キット（以下、単に「本発明の蛍光染色キット」とも表示する。）としては、本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでなる限り特に制限されず、例えば、本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを別々に製剤化して含むものを好適に例示することができる。
【００４１】
本発明の蛍光染色キットにおける５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とは、混合してから使用してもよいし、ミトコンドリアを蛍光染色し得る限り、混合せずに別々に使用してもよい。
【００４２】
３．本発明のミトコンドリアの蛍光染色方法
本発明のミトコンドリアの蛍光染色方法（以下、単に「本発明の蛍光染色方法」とも表示する。）としては、本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用する工程を含む限り特に制限されないが、（ａ）本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象細胞に接触させる工程；及び、（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程を含む方法を好適に例示することができ、さらに、（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、対象細胞を洗浄する工程を含む方法をより好適に例示することができる。
【００４３】
また、本発明の蛍光染色方法はインビボにおいても適用することができる。その場合は、（Ａ）本発明における５−アミノレブリン酸類等と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象に投与する工程；及び、（Ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象に照射する工程を含む方法を例示することができる。
【００４４】
なお、５−アミノレブリン酸は、疾患（特に悪性腫瘍）の光線力学療法（ＰＤＴ）に好適に用いられている。というのも、５−アミノレブリン酸は、正常細胞内ではヘムまで代謝されるのに対し、悪性腫瘍細胞内では好気呼吸が低下して嫌気的条件となっているためプロトポルフィリンIXまでしか代謝されない結果、プロトポルフィリンIXが悪性腫瘍細胞特異的に蓄積するからである。５−アミノレブリン酸を投与した患者にレーザー光等を照射すると、悪性腫瘍細胞に蓄積したプロトポルフィリンIXが活性酸素種や活性ラジカル種を発生させ、悪性腫瘍細胞特異的に細胞の活動や増殖を阻害させて、治療効果を得ることが可能となる。本発明者らのこれまでの研究で、悪性腫瘍細胞に対するその治療効果が、アポトーシスやネクローシスによるものであることを明らかにしている（Cell Biochem Funct. 2009 27(8), 503-515参照）。また、本発明者らは、同文献において、５−アミノレブリン酸からプロトポルフィリンIXが合成された当初はプロトポルフィリンIXがミトコンドリアに分布し、その状態でＰＤＴを行うとアポトーシスを誘導するが、合成されて長時間経過するとプロトポルフィリンIXは細胞質から細胞膜に移動し、その状態でＰＤＴを行うとネクローシスを誘導することも明らかにしている。本発明者らは、本発明により、５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用することにより、顕著な量のプロトポルフィリンIXをミトコンドリア内に蓄積させ得ることを示した。本発明者らは、これらの知見から、５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用することにより、悪性腫瘍にネクローシスではなくアポトーシスを特異的に誘導させ得ると考えている。ネクローシスを生じさせた場合は、治療後の傷跡が残る場合があるのに対し、アポトーシスを生じさせた場合は、治療後の傷跡が残りにくいため、本発明における５−アミノレブリン酸類等とＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤と含む悪性腫瘍治療剤（アポトーシス誘導剤）は、特に外部から見える部位の悪性腫瘍に対し非常に有利な治療剤となると考えられる。
【実施例１】
【００４５】
［ミトコンドリアの蛍光染色実験１］
本発明の蛍光染色方法により、生細胞内のミトコンドリアを蛍光染色し得るかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
【００４６】
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用意した。このＨＵＶＥＣを、１ｍＭ ５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）及び２０μＭ レセルピン（ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤）存在下で３時間培養した。次いで、ＨＵＶＥＣをＦＢＳ培地にて洗浄した後、１０分間インキュベートを行った。その後、このＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１の中央下パネルに示す。なお、４０５ｎｍの励起光により観察される蛍光は、プロトポルフィリンIXの蛍光である。
【００４７】
また、コントロールとして、レセルピンを用いなかったこと以外は上記と同様の方法で培養、洗浄、インキュベートしたＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１の中央上パネルに示す。
【００４８】
また、別のコントロールとして、前述のＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ＋レセルピン）をミトコンドリア染色試薬 Nonyl Acridine Orange（ＮＡＯ）にて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図１の左下パネルに示す。同様に、前述のＨＵＶＥＣ（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図１の左上パネルに示す。
【００４９】
また、図１の左上パネルと図１の中央上パネルを重ね合わせたものを、図１の右上パネルに示し、図１の左下パネルと図１の中央下パネルを重ね合わせたものを、図１の右下パネルに示す。
【００５０】
図１の左下パネル、中央下パネル及び右下パネルの結果から分かるように、図１の左下パネルの蛍光と、中央下パネルの蛍光は重なり合っていたことから、プロトポルフィリンIXの蛍光（赤色蛍光）は、ミトコンドリア部位に特異的に観察されることが分かった。また、図１の中央上パネル及び中央下パネルの結果から分かるように、レセルピン（ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤）を欠いていると、プロトポルフィリンIXの蛍光はかなり不鮮明であり、ミトコンドリアを明確に染色することはできなかった。さらに、図１の左下パネル及び中央下パネルの結果を比較すると分かるように、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）と、レセルピン（ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤）とを併用すると（図１の中央下パネル）、従来のＮＡＯを用いた場合（図１の左下パネル）よりも著しく鮮明にミトコンドリアを染色できることが示された。
【実施例２】
【００５１】
［ミトコンドリアの蛍光染色実験２］
本発明の蛍光染色方法が、ＨＵＶＥＣ以外の細胞でも用い得るかどうかを確認するために、ＨＵＶＥＣに代えてＣＯＳ細胞（不死化サル腎線維芽細胞）を用いた点、ＦＢＳ培地に代えてＰＢＳを用いた点、洗浄後のインキュベートを行わなかった点以外は、上記実施例１の蛍光染色実験と同じ方法で蛍光染色実験を行った。その結果を図２に示す。より詳細には、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した結果を図２の中央下パネルに示し、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ＋レセルピン）をＮＡＯにて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図２の左下パネルに示し、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）を、４０５ｎｍの励起光下で蛍光顕微鏡観察した結果を図２の中央上パネルに示し、ＣＯＳ細胞（ＡＬＡ）をＮＡＯにて染色して蛍光顕微鏡観察した結果を図２の左上パネルに示す。また、図２の左上パネルと図２の中央上パネルを重ね合わせたものを、図２の右上パネルに示し、図２の左下パネルと図２の中央下パネルを重ね合わせたものを、図２の右下パネルに示す。
【００５２】
図２の結果から分かるように、ＣＯＳ細胞を用いた場合も、図１の結果と同様の結果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、ミトコンドリアの蛍光染色の分野に好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色剤。
【請求項２】
ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする請求項１に記載のミトコンドリアの蛍光染色剤。
【請求項３】
一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでなることを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色キット。
【請求項４】
ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする請求項３に記載のミトコンドリアの蛍光染色キット。
【請求項５】
一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用する工程を含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色方法。
【請求項６】
次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする請求項５に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法；
（ａ）一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類、又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象細胞に接触させる工程；
（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程。
【請求項７】
（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、対象細胞を洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法。
【請求項１】
一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色剤。
【請求項２】
ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする請求項１に記載のミトコンドリアの蛍光染色剤。
【請求項３】
一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを含んでなることを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色キット。
【請求項４】
ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤が、レセルピン、トリプロスタチンＡ、フミトレモルギンＣ、ジピリダモール、ノボビオシン、エストロゲン、アンチエストロゲン、アクリロニトリル誘導体、ＧＦ１２０９１８、メトトレキサート、ミトキサントロン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビスアントレン、エトポシド、ゲフィチニブ、イマチニブ、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、フラボピリドール、ＣＩ１０３３、タモキシフェンから選択されることを特徴とする請求項３に記載のミトコンドリアの蛍光染色キット。
【請求項５】
一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを併用する工程を含むことを特徴とするミトコンドリアの蛍光染色方法。
【請求項６】
次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする請求項５に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法；
（ａ）一般式（１）
Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３ （１）
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。］
で表される５−アミノレブリン酸類、又はそれらの塩と、ＡＢＣＧ２トランスポーター阻害剤とを、対象細胞に接触させる工程；
（ｂ）プロトポルフィリンIXに対する励起光を、対象細胞に照射する工程。
【請求項７】
（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、対象細胞を洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のミトコンドリアの蛍光染色方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２３７１９２（Ｐ２０１１−２３７１９２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０６４９０（Ｐ２０１０−１０６４９０）
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５０８１２３８５８）ＳＢＩアラプロモ株式会社 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５０８１２３８５８）ＳＢＩアラプロモ株式会社 (13)
【Ｆターム（参考）】
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