アシルコエンザイムＡを用いるアシル基転移酵素反応方法
本発明はアシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移するアシル基転移酵素反応方法において、アシルチオエステルとの化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムＡよりアシルコエンザイムＡを反応系内で生成および／または再生させて反応することを特徴とするアシル基転移酵素反応方法に関する。本発明によれば、高価なアシルＣｏＡが反応系内で非酵素的に再生されるため、少量のアシルＣｏＡとアシル基供与体及び受容体を系に投じるだけでアシル基転移酵素反応が連続的に進行する。従って、本発明の方法は、有用な生体分子を含む種々の化合物の工業的製造方法やポリエステル等の高分子の合成に適用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、アシルコエンザイムＡ（以下、コエンザイムＡをＣｏＡと表記することがある。）による種々の有機化合物へのアシル基転移酵素反応方法に関する。さらに詳しく言えば、本発明は、アシル基転移酵素を用いるアシル化合物の製造方法において、極めて高価なアシルＣｏＡを追加添加することなく反応を継続的に行い、その生産性を飛躍的に改善することによってアシル基転移酵素を種々の化合物の工業的製法に利用することを可能ならしめた新規なアシル基転移酵素反応方法に関する。
さらに、本発明は化学的チオエステル交換反応をアシルＣｏＡ再生系としたＣｏＡ酵素カップリング法に関する。
また、本発明はＣｏＡ酵素を用いて、スフィンゴ脂質のごとき重要な生理活性物質を製造する方法に関する。
さらに、本発明は酵素反応による高分子化合物の製造方法に関する。さらに詳しく言えば、チオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させてアシルコエンザイム（アシルＣｏＡ）を反応系内で再生させてチオエステルから高分子化合物を一貫して合成することの出来る効率的な生分解性の高分子化合物、特にポリエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
ＣｏＡは全ての生物種でアシルキャリア／アシルアクティベーターとして機能する物質である。例えば、アセチルＣｏＡはクエン酸回路を経由する脂肪酸・グルコース等主要な生体代謝のキー物質である他、ある種のアシルＣｏＡ誘導体はコレステロールや脂肪酸生合成においても重要な役割を果たしている。ＣｏＡはこれらの代謝に関わる酵素触媒反応（ＣｏＡ酵素）の補助因子（補酵素）として必須であり、代替不可能な物質であり、下記式で表わされる。
（式中、ＡＣＹはアシル基である。）
ＣｏＡ酵素には、転移させるアシル基の構造および基質（アシル基を導入する化合物）により種々のＣｏＡ酵素が存在する。従来、各種のＣｏＡ酵素を用いて物質を製造しようとする試みは多く成されており、例えば、抗生物質や医薬、ポリケチド合成経路を利用する各種化学物質の製造、アミノ酸類、ポリヒドロキシ酸などの製造例がある。
これらの方法ではアシルＣｏＡは反応においてアシル基受容体と等モル消費される。従って、必要なアシルＣｏＡを廉価に生産する必要がある。
上記の方法では、いずれも、発酵的に生産される生体内のアシルＣｏＡを用いるか、生産系とは別個に製造したアシルＣｏＡを用いている。発酵的に生産される生体内のアシルＣｏＡを用いる場合は、生体内で生産されるアセチルＣｏＡやマロニルＣｏＡといった特定のアシルＣｏＡしか利用し得ない。この課題を解決すべく、アセチルＣｏＡと各種脂肪酸間で酵素的にエステル交換を行い、非生体的なアシルＣｏＡを生産する技術も報告されている。生産系とは別個に製造したアシルＣｏＡを用いる方法は、汎用性が有り一般的に取られる方法であるが、このようにして製造したアシルＣｏＡは極めて高価であり、アシル基転移反応に使用するには等モル必要であることにかわりはない。
アシルＣｏＡの製造方法としては、アシルクロライドによる化学合成法、酸無水物を用いる化学合成法、クロロ炭酸エチルとの混合酸無水物を用いる化学合成法、チオエステル交換による化学合成法（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ２９Ｃ，４６９−４７４（１９７４）、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ３０ｃ，３５２−３５８（１９７５））、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５３，７５，２５２０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１３１８１、その他多くの化学合成法が一般に用いられている。しかしながらこれらの化学的方法は一般にチオール基への選択性が低いものが多く、非選択的なアシル化反応により収量が低下する問題があった。これらの製法は現在も用いられるが、アシルＣｏＡの実験室的調製法として用いられているにとどまっていた。
化学合成法の弱点を克服すべく、酵素的アシルＣｏＡの製造法も精力的に研究されている。すなわち、アセチルＣｏＡ合成酵素を用いる方法や脂肪酸ＣｏＡ合成酵素を用いる方法などが報告されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４０，６９９−７０９）が、これらの酵素反応法ではその触媒である酵素を必要量得ることが非常に困難である。
酵素を用いる製法に関しては、これらをアシルＣｏＡ再生系としてＣｏＡ酵素反応と協同させたカップリング法に関する研究も報告されている。すなわち、アシル基転移反応により消費されたアシルＣｏＡを酵素反応により再生して再び反応に用いるものであり、ホスホトランスアセチラーゼを用いるカップリング法、カルニチンアセチルトランスフェラーゼを用いるカップリング法、アセチルＣｏＡ合成酵素を用いるカップリング法、α−ケトグルタル酸脱水素酵素を用いるカップリング法などである。これらの方法はチオール基への選択性が高く、特にアセチルＣｏＡ合成酵素は基質特異性が広く各種のアシルＣｏＡを生成し得ることから有用である。
しかしながら、これらは酵素によりアシルＣｏＡを再生しており、この様な酵素的再生系は反応速度が遅いこと、酵素が不安定であること、反応にＡＴＰや比較的高価な副成分を必要とすること、高濃度のＣｏＡでは反応できないことなど、それぞれに課題が残されて一般に対象物の価格が余程高価で無い限り、アシルＣｏＡを１０，０００回以上回転させなければコスト的に工業的製法とは成り得ないと言われており、上記の方法は工業的製造法として充分とは言えないものであった。ジメチルアミノピリジンのＮ−アセチル体を用い非酵素反応を利用してアセチルＣｏＡを再生する試みもあるが（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．，１９９０，１８，１３１−１３５）、大量の有機溶媒を使用し２相系であるため生成物の精製上問題があり、工業的製法には適していない。
以上のように、現在までＣｏＡ酵素を工業的製法として利用することを可能とするに充分な、アシルＣｏＡ再生系は知られていなかった。
スフィンゴ脂質は、スフィンゴシンのようなスフィンゴイド塩基に由来する脂質であり、動物、植物及び微生物の細胞膜に存在する。ヒトのスフィンゴ脂質の正確な機能はまだわかっていないが、この化合物群が、神経系の電気シグナル伝達および細胞膜の安定化に関与している。スフィンゴ糖脂質は、免疫系において機能を有し、特に特定のスフィンゴ糖脂質は細菌毒の受容体として、またおそらくは細菌及びウイルスの受容体としても機能することが示されている。
セラミドはスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシンまたはフィトスフィンゴシンを塩基として含む、スフィンゴ脂質の特定のグループである。セラミドは、皮膚の上側層である角質層の主要脂質成分であり、重要な障壁機能を有している。セラミドのようなスフィンゴ脂質を含有する組成物の局所塗布は、例えば皮膚の障壁機能及び水分保持特性を改善することが知られている（Ｃｕｒａｔｏｌｏ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，４：２７１−２７７（１９８７）；Ｋｅｒｓｃｈｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１：３９−４３（１９９１））。
スフィンゴイド塩基それ自体は、シグナル伝達経路において重要な酵素であるプロテインキナーゼＣの活性を阻害することによって、いくつかの生理的作用を媒介することがわかっている。更に、スフィンゴイド塩基は、化粧組成物またはそれらの抗炎症活性及び抗菌活性のための皮膚科用組成物に含まれる。
現在、化粧品用の異種スフィンゴ脂質調製物は、主に動物供給源から抽出されているが、産業的規模では比較的経費のかかる方法であるばかりでなく、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の潜在性のため動物組織以外の供給源から入手できる純粋かつ構造の特定されたスフィンゴ脂質の新規供給源に関心が増している。
酵母Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉのような微生物は、スフィンゴ脂質、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び／またはそれらの誘導体を生成することが発見されている（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ及びＳｔｏｄｏｌａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８０：４８４−４９１（１９６０））。スフィンゴ脂質それ自身の供給源、及び他の商業的に価値のある化合物を生成するための出発材料の供給源を提供し、これらの化合物の動物性供給源の使用に対し実現可能な代用を与える。しかし微生物による生産は、スフィンゴイド塩基の微生物細胞に対する毒性のために、生産性の改善が困難であり（Ｐｉｎｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：２５６５−２５７４（１９９２）；Ｂｉｂｅｌら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３：２６９−２７３（１９９２））、より効率的な製造方法の提供が切望されていた。
また、近年環境問題への意識の高まりから、従来主流を占めてきた合成高分子から環境に優しい生分解性高分子への関心が高まっている。
その一つであるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略記することがある。）は、一般には微生物の発酵生産により製造され、生分解性が高いことから注目を集めているポリエステルであり、９０種以上の種類のものが知られている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，１２８，２１９−２２８）。その中でもポリ（３−ヒドロキシブチレート）（以下、ＰＨＢと略記することがある。）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）（以下、ＰＨＶと略記することがある。）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（以下、ＰＨＢ−ｃｏ−ＰＨＶと略記することがある。）は、その製造のしやすさ、及びその特性が良好であったことから研究開発が進んだ（特開昭５７−１５０３９３号公報（米国特許第４３９３１６７号）、特開昭５９−２２０１９２号公報（欧州特許公開第０１１４０８６号）、特開昭６３−２２６２９１号公報（欧州特許公開第０２７４１５１号）、特開昭６３−２６９９８９号公報）。しかし微生物の発酵生産では微生物体内にＰＨＡを蓄積するためにその生産性は低く、また微生物を粉砕してＰＨＡを抽出し、精製するためにコストもかかるなど問題点も多かった。
その後、発酵生産のメカニズムの解析が進んだことから微生物体内へのＰＨＡの蓄積濃度が飛躍的に向上し、また、微生物体内へのＰＨＡの蓄積状態の解析が進んだことから微生物からの抽出、精製コストも下がる結果となり、ＰＨＡの微生物的製造の実用化が始まった。
また、ＰＨＡを生産する微生物も多種に渡ることが次第に明らかになってきたことから、ＰＨＢ、ＰＨＶ、ＰＨＢ−ｃｏ−ＰＨＶ以外のＰＨＡへの研究開発も急速に進み、物性を改良するためコポリマーの研究開発もされている（特開昭６３−２６９９８９号公報、特開昭６４−４８８２１号公報、特開平１−１５６３２０号公報、特開平１−２２２７８８号公報、特開平５−９３０４９号公報）。
しかし、微生物の発酵生産によるＰＨＡの製造方法では複雑な生物代謝経路を経るために必ずしも所望のＰＨＡを作り出せるわけではなく、またＰＨＡのバリエーションも限定される。また発酵生産の制御方法によっては所望のホモポリマーとならずにコポリマーになることもあり、また逆にコポリマー生産においても必ずしも所望の重合比の均質なコポリマーを生産できる訳ではない（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９２，１０３，２０７−２１４）。さらに精製工程においても多種の化合物を含む微生物菌体より所望のＰＨＡを取り出すために、その純度の向上にも工業的生産においては限界がある。このように微生物発酵によるＰＨＡの製造は様々な問題を抱えている。
一方、近年急速に進んだ遺伝子組換え技術により、ＰＨＡを重合する酵素であるポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＰＨＡＳ）の遺伝子が単離され、その発現を増強することによりＰＨＡの生産の向上も図られるようになった（特開平７−２６５０６５号公報、特開平１０−１０８６８２号公報、特表２００１−５１６５７４号公報（ＷＯ９９／１４３１３））。
さらに遺伝子組換え技術を使うことでＰＨＡＳの大量分離精製もできるようになり、微生物発酵を用いないＰＨＢのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法が開発され、均質で高純度なＰＨＢが生産できるようになった（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９５，９２，６２７９−６２８３、Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，１９９６，２８−３５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，２２６，７１−８０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，４９，２５８−２６６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，３３，２２９−２３１）。
その後、ＰＨＢ以外のＰＨＡも同様のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法で合成できることが示され、微生物発酵法では達成できなかったＰＨＡのバリエーションの制限が無くなり、ＰＨＡのバリエーションが格段に広がることが示唆された（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，１，４３３−４３９、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，５６，１３１−１３６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４，６８８９−６８９４）。この方法ではホモポリマー以外にコポリマーをも合成することが可能である。
しかし、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法では反応出発物質にアシルＣｏＡを使用しなければならないが、上述の通り、その合成には種々の問題がある。
そのためアシルＣｏＡの使用量を極めて少量に抑えることや、工業的に容易に合成可能な他の化合物を出発物質として用いる高分子化合物の製造方法の開発が望まれている。
一方、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法では、酵素の基質としてアシルＣｏＡを用い、酵素が反応してＰＨＡが重合されると共に、反応系内には遊離したＣｏＡが放出される（下記式）。
（式中、Ｒ０はＲ０−ＳＨがＣｏＡを表わす有機基であり、Ｒ１は任意のアルキレン、ｎは重合度に相当する整数である。）
このように、アシルＣｏＡからのアシル基転移反応が１回起こる度に繰り返し単位が１単位ずつ付加され、ＣｏＡが１分子放出される。
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法ではこのＣｏＡは遊離状態のまま反応系内に留まり蓄積されるのみであり、高分子重合反応の収率は反応系内に投入したアシルＣｏＡの当量を超えることはない。このためＰＨＡの生産性は極めて低く、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法で作製したＰＨＡのコストは非常に高価にならざるを得ない。更に重合が進むにつれて反応系内のＣｏＡ濃度が高まることで、酵素反応への阻害効果も懸念される。
なお、この遊離して反応系内に高濃度で存在するＣｏＡの有効利用方法としてリサイクリングする試みもなされている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，１６８，３１９−３２４）。これは重合酵素反応液中に酢酸とアセチルＣｏＡシンセターゼとＡＴＰを共存させることで重合反応後に遊離してくるＣｏＡをアセチルＣｏＡに変換し、さらにプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼと３−ヒドロキシブチレートも共存させることで重合酵素の基質となる３−ヒドロキシブチレートＣｏＡを得るものである。しかしこの方法では精製が困難な酵素を３種類も使用し、さらに極めて高価であるＡＴＰも必須であることから工業的な生産方法に適用することは極めて難しい。
このようにインビトロ重合方法では、その反応基質にアシルＣｏＡを使わなければならず、アシルＣｏＡは非常に高価であることから、これを反応基質に用いたままＰＨＡを工業的に生産するのではＰＨＡの製造コストを下げることが極めて困難であると言わざるを得ない。またＣｏＡをアシルＣｏＡにリサイクリングするにも取得が困難な酵素が多種必要であり、かつ、ＡＴＰのような高価な化合物が必要である。さらにＰＨＡの生物、特に微生物を用いた製造方法では、ＰＨＡのバリエーションは限定され、更に生物体内での代謝により共重合体が重合される可能性が非常に高く、所望のＰＨＡのみを製造するのは難しいと言える。これらのことからＰＨＡのバリエーションが多く、かつ、その生産において簡易に合成できる化合物を出発物質に用いて、ＰＨＡの製造コストが下がるような製造方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
本発明は、アシルＣｏＡ再生系でＣｏＡ酵素を用いる工業的なアシル基転移酵素反応方法、特に生体物質等の生理活性物質の生産に有用なアシル基転移酵素反応方法を提供することを課題とする。
また、本発明の課題は、酵素反応で有用なスフィンゴイド塩基類を製造する全く新しい半合成製造方法を提供することにある。さらにはその製造の際に、触媒量の補酵素（ＣｏＡ）で効率的に製造できる経済的な方法を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、酵素反応で有用な生分解性の高分子化合物を製造する際に、触媒量の補酵素（ＣｏＡ）で効率的に製造できる方法を提供することにある。
本発明者らは、アシルＣｏＡの再生系について、効率、速度、コスト、選択性および酵素反応とのカップリング可否に関し鋭意研究した結果、これまで調製にのみ用いられていた化学合成法の一つであるチオエステル交換反応を酵素反応系とカップリングし得ることを突き止め、本発明を完成するに至った。
このチオエステル交換反応は中性〜弱塩基性域の系で進行すること、アシル基の基質特異性が極めて広いことから、チオエステル交換反応が起こり得る領域で反応性を示すＣｏＡ酵素の何れともカップリングが可能である。
さらに、本発明者らは、このカップリング法をスフィンゴ脂質生合成経路におけるキー酵素であるセリン・Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼに適用し、チオフェニル脂肪酸とセリンから、ＣｏＡを介した脂肪酸鎖の脱カルボキシ的転移反応により、重要な生理活性物質であるスフィンゴイド塩基類を生成する方法等を確立することに成功した。
さらに、本発明者らは高効率なＰＨＡの製造方法を開発すべく、有機化合物からＰＨＡに関連する種々の化合物について新たにな合成経路を見出すべく鋭意検討を行った結果、インビトロ重合方法にチオエステル交換反応を組み合わせることで、反応出発物質を容易に合成可能なチオフェニルエステルに代替することが出来、さらに重合反応で必須であるアシルＣｏＡについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能であり、ＣｏＡの濃度を抑えつつ、アシルＣｏＡ消費量を劇的に減少させることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のアシル基転移酵素反応方法に関する。
１． アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）のアシル基を転移するアシル基転移酵素反応において、チオール化合物のアシルエステルであるアシル基供与体との化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムＡよりアシルコエンザイムＡを反応系内で生成および／または再生させて反応させることを特徴とするアシル基転移酵素反応方法。
２． 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる前項１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
３． アシル基供与体のアシル基でアシルコエンザイムＡを生成および／または再生しながら行う前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
４． チオール化合物が芳香族チオールである前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
５． 芳香族チオールが置換基を有していてもよいチオフェノールである前項４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
６． アシル基受容体がアミノ酸および／またはその誘導体である前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
７． アシル基受容体がセリンおよび／またはその誘導体である前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
８． アシル基転移酵素がセリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼである前項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
９． セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼがスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌由来のものである前項８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１０． アシル基転移酵素がスフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼである前項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１１． 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる反応において、アシル基転移酵素が高分子重合酵素であり、高分子化合物を合成する前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１２． アシルコエンザイムＡまたはアシル基転移酵素反応による生成物をアシル基受容体としてアシル基転移酵素反応を繰り返すことにより高分子化合物を生成する前項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１３． アシルチオエステルが芳香族チオールのアシルエステルである前項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１４． 芳香族チオールのアシルエステルがヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである前項１３に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１５． ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである前項１４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１６． ３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルである前項１５に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１７． 高分子重合酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである前項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１８． ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼがラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属由来である前項１７に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１９． ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である前項１８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
２０． ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９である前項１９に記載のアシル基転移酵素反応方法。
２１． 前項７乃至９のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いるスフィンゴイド塩基類の製造方法。
２２． スフィンゴイド塩基類が３−ケトジヒドロスフィンゴシンである前項２１に記載の製造方法。
２３． 前項１０に記載のアシル基転移酵素反応を用いるセラミド類の製造方法。
２４． 前項１１乃至２０のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いる高分子化合物の製造方法であって、高分子化合物がポリエステル類であるポリエステル類の製造方法。
２５． ポリエステル類がポリヒドロキシアルカノエートである前項２４に記載のポリエステル類の製造方法。
２６． ポリヒドロキシアルカノエートがポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）である前項２５に記載のポリエステル類の製造方法。
２７． ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）がポリ（３−ヒドロキシブチレート）である前項２６に記載のポリエステル類の製造方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明によるチオエステル交換によるアシルＣｏＡ再生系とのカップリング反応を示すスキームである。
発明の詳細な説明
本発明によると、図１に示すように、アシル基供与体、アシル基受容体、ＣｏＡ、及びアシル基転移酵素（ＣｏＡ酵素）を一つの系に存在させ、反応進行により消費されるアシルＣｏＡが、酵素反応と同系内においてアシル基供与体とコエンザイムＡとの化学的チオエステル交換反応により生成・再生されるカップリング反応によってアシル基転移反応を行うことができる。
本発明の一つの態様においては、反応進行により消費されるアシルＣｏＡを化学的チオエステル交換反応により生成・再生させる。この結果、高価なアシルＣｏＡを少量のみ反応系に存在させるだけで効率的なアシル基転移反応を実現できる。
また、本発明の別の態様においては、アシルＣｏＡまたはアシル基転移反応による生成物をさらにアシル基受容体とする。この結果、アシル基転移反応の繰り返しにより効率的な重合体生成反応を実現できる。
上記第２の態様（重合体生成反応）は上記第１の態様（高効率アシル基転移反応）の一部であるが、以下、便宜上、第１の態様（高効率アシル基転移反応）と第２の態様（重合体生成反応）に分けて説明する。
（１）高効率アシル基転移反応
（１−１）ＣｏＡ酵素
この態様において使用するＣｏＡ酵素には、アシルＣｏＡを補足因子（補酵素）とするものである以外に特に制限は無い。これらの酵素の例としては、アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＥＣ ２．３．１．１）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．５０）等、「ＥＣ ２．３．１．ｘ」シリーズに属するトランスフェラーゼ類が挙げられる。これらの酵素類は既に多くの生物に存在することが明らかにされており、各種の生物から分離精製がなされている（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，１７８−１９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ．（１９９２））。中でも、中性〜弱塩基性域に至適ｐＨを示す酵素がさらに好適である。これらＣｏＡ酵素は精製酵素であってもよいが、ＣｏＡ酵素活性を有する触媒菌体あるいはその処理物を用いることもできる。但し、この場合は、アシルＣｏＡを補欠因子とする目的以外の酵素の影響を、欠損変異株の使用、活性阻害、失活処理等により回避することが望ましい。
（１−２）アシル基供与体
本発明による高効率アシル基転移において使用するアシル基供与体は、ＣｏＡと非触媒的にチオエステル交換反応が起こり得るチオール化合物のアシルエステル（本願において単に「アシルチオエステル」ともいう。）であれば制限は無いが、芳香族チオールのアシルエステルが好ましい。芳香族チオールの例としては、チオフェノール、メチルチオフェノール、クロロチオフェノール、２−メルカプトチアゾール、２−メルカプトイミダゾール、２−メルカプトトリアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾイミダゾール、２−メルカプトピリジン等を挙げることができる。特に好適な例として、チオフェノールのアシルエステル類（フェニル基が置換基を有する場合も含め、本願において単に「チオフェニルエステル」ともいう。）が挙げられる。
アシルエステルのチオールに対応するアシル基としては、基本的に制限無く使用することができる。例えば、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）、プロピオニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、ブチリル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、イソブチリル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＯ−）、アクリロイル（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−）、メタクリロイル（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、パルミトイル（ＣＨ３−［ＣＨ２］１４−ＣＯ−）、ステアロイル（ＣＨ３−［ＣＨ２］１６−ＣＯ−）、オレオイル（ＣＨ３−［ＣＨ２］６−ＣＨ＝ＣＨ−［ＣＨ２］６−ＣＯ−））等のＣ２〜Ｃ２０の飽和または不飽和の脂肪族アシル基、ベンゾイル等の芳香族アシル基などが挙げられる。もっとも、これらは例示であり、例えば、脂肪族アシル基のアルキル鎖は置換されていてもよく、一部または全部が環状でもよい。芳香族アシル基の芳香環は炭素環でもヘテロ環でも縮合環でもよく任意に置換されていてもよい。置換基の例としては、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、塩素、臭素等のハロゲン等が挙げられる。
（１−３）アシル基受容体
また、本発明による高効率アシル基転移反応において使用するアシル基受容体は、上記ＣｏＡ酵素の基質としうる限り制限は無い。酵素の基質特異性を反応条件によって変化させることや、タンパク質工学的に基質特異性を変化させた変異体などを用いることにより、酵素の通常の好適な基質でない物質をもアシル基受容体とし得る。
好ましいアシル基受容体は、アミノ酸、アミノ酸誘導体であり、天然アミノ酸、非天然アミノ酸が特に好ましい。例えば、アミノ酸がセリンで酵素がセリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼである場合、３−ケトジヒドロスフィンゴシンの効率的合成反応となる。また、アシル基受容体がアミノ酸誘導体であるスフィンゴシンで酵素がスフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼである場合、セラミドの効率的合成反応となる。なお、アシル基転移反応における生成物は、転移したアシル基をそのまま有するとは限らず、反応条件下で脱炭酸や転位等を経てもよく、一般的には用いる酵素と基質により定まる。
（１−４）反応条件
本発明による高効率アシル基転移反応において使用するＣｏＡは、化学合成法、半合成法、生物発酵法などいずれの方法で製造されたものでもよく、ＣｏＡとして機能し得るものであれば良い。
本発明による高効率アシル基転移反応において、使用する反応系は、アシル基供与体とＣｏＡのエステル交換反応と、用いるＣｏＡ酵素によるアシルＣｏＡからアシル基受容体へのアシル基転移反応が同時に進行する系である限り制限は無く、水均一系、有機溶媒均一系、あるいは有機溶媒−水二層系等を用いることができる。
本発明の反応は、ＣｏＡ酵素の安定性が確保され、反応が進行する温度であればよい。通常１０℃〜４５℃であり、好ましくは、２０℃〜４０℃である。
本発明の反応は、濃度に関してもＣｏＡ酵素の安定性が確保され、反応が進行するならば、特に制限はない。
反応系は開放型でも密閉型でも良く、臭気等が問題になる場合には密閉系において反応を行えば良い。
（２）高分子生成反応
（２−１）高分子化合物
前述のように、本発明は、高分子生成反応としても有用であり、具体的にはチオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させた溶液中でチオエステルから高分子化合物を合成する高分子化合物の製造方法に関するものである。
本発明において合成される高分子化合物としては、チオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させた溶液中でチオエステルから合成される高分子化合物であれば制限はないが、例としては、これまで主に微生物の発酵生産により製造されることが報告されているポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を挙げることが出来る。その種類は９０種以上が知られている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，１２８，２１９）。更に具体的には、側鎖にＣ２以上のアルキル鎖を持つもの、その中にはＣ６以上、更にはＣ１０以上の長鎖アルキル基を有するもの、側鎖に分岐したアルキル基を持つもの、側鎖にフェニル環を持つもの、その中にはフェニル環に修飾基を有するもの、側鎖にフェノキシ環を有するもの、その中にはフェノキシ環に修飾基を有するもの、側鎖に二重結合あるいは三重結合を有するもの、その中には良好な重合性を示すもの、側鎖にハロゲン元素を有するもの、側鎖にシクロ環を有するもの、側鎖にエポキシ環を有するものなどがある。これらのＰＨＡはホモポリマーであることもあれば、２種類以上のユニットからなるコポリマーも含まれる。
具体的には、アルキル基についてはＩｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１９９０，１２，９２−１０１など、フェニル環についてはＭａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，１９１，１９５７−１９６５、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９１，２４，５２５６−５２６０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，１７６２−１７６６など、フェノキシ環についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，３４３２−３４３５、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９９４，１９５，１６６５−１６７２など、二重結合についてはＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８，５４，２９２４−２９３２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１９９０，１２，８５−９１、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ Ａ，１９９５，３３，１３６７−１３７４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９４，２７，１６７５−１６７９、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１，１４８０−１４８６など、三重結合についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１，４７６０−４７６３など、ハロゲン元素についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９０，２３，３７０５−３７０７、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９０，３１，４０４−４０６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９２，２５，１８５２−１８５７、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，４５７２−４５８１などエポキシ環についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９９，３２，７３８９−７３９５などに示されたＰＨＡも含まれ、炭素数も多様である。
高分子化合物の具体例としては、主に生物、特に微生物の発酵生産により製造されることがよく知られているポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）やポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）を挙げることが出来る。更に、具体的には特にポリ（３−ヒドロキシブチレート）を挙げることができる。もっとも、これらは例示であり、本発明の方法によって高分子を形成し得る重合単位を含む高分子化合物はすべて含まれる。また、複数の種類の重合単位の組み合わせを含んでもよい。重合度は酵素反応が進行する限りにおいて特に制限はない。
本発明に利用できるの高分子重合酵素反応は制限はないが、例としてはアシルコエンザイムＡとしてヒドロキシアルカノエートコエンザイムＡを用いる反応を挙げることが可能であり、その場合は高分子化合物としてＰＨＡが生成する。
（２−２）ＣｏＡ酵素
本発明で使用する高分子重合酵素としては、本発明のチオエステル交換反応で生成する物質を基質として高分子化合物を合成する高分子重合酵素であればよい。例えば、ヒドロキシアルカノエートＣｏＡを基質とし、ＰＨＡとする場合、酵素であるポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＰＨＡＳ）を用いることが出来る。高分子重合酵素の取得方法は生物細胞から抽出精製する方法、あるいは生物培養物から抽出精製する方法など多種多様の方法が使われるが、例としてはＰＨＡＳは微生物細胞から抽出精製することが出来る。しかし通常の抽出精製方法では取得出来る酵素量が極めて少量に限られることから、近年は遺伝子組換え技術を利用してＰＨＡＳの遺伝子を単離し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，１５２９８−１５３０３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８８，１７０，４４３１−４４３６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８８，１７０，５８３７−５８４７）、高発現させることで高分子重合酵素を大量に分離精製できる（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，９３１１−９３２０、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．，１９９６，７，２０３−２１１）。また本発明の高分子重合反応で使用される酵素は、そのまま用いる場合のほかに、固定化酵素などの手法で修飾した酵素を用いることもできる。
本発明で用いる高分子重合酵素の由来に生物種としては特に制限はないが、例としてはＰＨＡの生産がよく知られているラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エクトチオロドスピラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ）属をはじめ多くの微生物を挙げることが出来る。またこれらの生物由来の高分子重合酵素遺伝子を供与体として有する遺伝子組換え体から高分子重合酵素を取得することも可能である。例としてはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９のＰＨＡＳの遺伝子を単離し、その組換え体エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を作製して培養し、その培養産物から所望のＰＨＡＳを抽出精製して、高分子重合反応の触媒として用いることが可能である。
（２−３）アシル基供与体
本発明による高分子生成反応において使用するアシル基供与体は、アシル基が高分子の構造単位となり得るものであるという点を除いて、前述の高効率アシル基転移反応と同様であり、芳香族チオールのアシルエステルが好ましい。芳香族チオールの例は、前記の通りである。
チオエステルの製法は例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７３，２２，５８２９に記載されている。
このチオエステルはアルカリ条件でＣｏＡ塩と共存させることで容易にＣｏＡのチオエステルであるアシルＣｏＡへと変換するチオエステル交換反応が可能である（Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，１９９６，２８−３５）。
（２−４）アシル基受容体
インビトロ重合方法では酵素の基質としてＣｏＡチオエステルを用い、酵素が反応してＰＨＡが重合されると共に、反応系内には遊離したＣｏＡが放出される。ＣｏＡチオエステルは反応当初に投入されるものと反応の進行により生じたものの両者が含まれるが、いずれにせよ、生成物は重合体とＣｏＡである（下記式）。
（式中、Ｒ０はＲ０−ＳＨがＣｏＡを表わす有機基であり、Ｒ１は任意のアルキレン、ｎは重合度に相当する整数である。）
本発明は、上記２つの反応、つまりチオエステル交換反応と高分子重合反応の２つの反応を組み合わせて、これらを１つの反応系内で共存させて実施することにより高分子化合物を製造する。つまり、重合反応後には反応系内に遊離されてこれまでは再び利用されることのなかったＣｏＡを、反応系内に投入したチオエステルと反応させて、再びＣｏＡのチオエステルを合成せしめ、これを重合反応の基質として再び用いるものである（下記式）。
これにより反応系内に投入したＣｏＡの当量以上の高分子化合物を生成物として得ることができるようになる。特にこのＣｏＡがチオエステル化と遊離を繰り返すことの反応回転数が多くなればなるほど、高分子化合物の工業的なコストを飛躍的に低価格化させることが可能となる。
また、重合が進むにつれて反応系内のＣｏＡ濃度が高まることで酵素反応への阻害効果をもたらすことがあるが、本発明では、その濃度を抑えることでＰＨＡの生産性を高めるのに非常に有効である。このように本発明は、高効率にＰＨＡを製造する方法である。
本発明の反応条件としては特に制限がなく、高効率アシル基転移反応と同様であるが、例としては酵素反応が促進される条件として、温度としては０℃から６０℃、好ましくは１０℃から５０℃、さらに好ましくは２０℃から４０℃で行うことが望ましい。簡便には室温下で反応を行うことも可能である。ｐＨは３から１２、好ましくは５から１０、さらに好ましくは７から９の間で行うことが望ましい。
なお、チオエステル交換反応と高分子重合反応が共存する状態とは、チオエステル交換反応と高分子重合反応が同一の水溶液、有機溶媒、あるいはその混合溶液中に存在すること、あるいは同一反応容器内において一種の溶液、あるいは複数の溶液が混合状態あるいは分離状態で存在している状況である。分離状態は、層状の場合、油滴状に存在、あるいは目視的に懸濁した状態などが含まれる。いずれにおいても、チオエステル交換反応と高分子重合反応に必要な状態が一体化して確保されていればよい。そしてその出発物質としては工業的に効率的に製造可能なチオエステルを用いて、これを反応系内でＣｏＡのチオエステル化して重合反応の基質とし高分子化合物を製造する。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１：アシルチオフェノール（チオフェニルパルミテート）の合成
よく乾燥させて窒素置換したフラスコに無水ジクロロメタン６ｍＬを添加し、氷上で冷やしながらよく撹拌した。そこに２Ｍトリメチルアルミニウム２ｍＬをゆっくりと添加した。さらにチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で１時間３０分撹拌を続けた後、無水ジクロロメタン６ｍＬに溶解したパルミチン酸エチルエステルをゆっくりと添加して反応させた。反応はＴＬＣでモニターした。反応終了後、反応液にジクロロメタン２０ｍＬを加え、更に気泡発生が無くなるまで３％塩酸水溶液を添加した。この溶液を分液漏斗に移して、３％塩酸水溶液で３回、飽和食塩水で２回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した後、エバポレーションで濃縮し、濃黄色のオイル状溶液を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）によって分離精製してチオフェニルパルミテートを得た。
実施例２：セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）の調製
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属由来の上記酵素を大腸菌にクローン化した形質転換体からＳＰＴ粗酵素抽出液を得た。本形質転換体の作成法、ＳＰＴ精製法はＩｋｕｓｈｉｒｏ，Ｈ．らによる「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６，１８２４９−１８２５６（２００１）」の記載に従った。
まず、上記ＳＰＴの全塩基配列から、Ｎ末端配列とＣ末端配列をコードするプライマー（配列番号１及び配列番号２）を作成し、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲによりＳＰＴコード領域に相当するＤＮＡ断片を作成した。このとき、Ｎ末端用プライマーにはベクターへの接続のためＮｃｏＩサイトを、Ｃ末端用プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた。
［プライマー］
［反応液組成］
ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、
同酵素添付の標準緩衝液、
鋳型染色体 ＜１μｇ、
プライマー 各１μＭ、
ｄＮＴＰ 各２００μＭ、
液量 ２５μＬ〜１００μＬ。
［反応条件］
変成温度 ９４℃、３０秒、
アニール温度 ４０＋０．２５℃／サイクル、３０秒、
伸張温度 ７２℃、９０秒。
作成したＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動した後ゲルより抽出し、カラムにより回収した。この断片を制限酵素ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、プラスミドｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とライゲーションし、宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
作成した形質転換体をアンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍＬで、３５℃、１６時間培養した後、菌体を遠心分離して回収し、生理食塩水で洗浄した。洗浄菌体をＳＰＴ用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（プロテアーゼ阻害剤），０．０２ｍＭ ＰＬＰを含む））２ｍＬに再懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機で約１０分間破砕した後、未破砕物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ×１０分間）して除去し粗酵素抽出液を得た。
実施例３：エステル交換反応とＣｏＡ酵素反応のカップリング（水均一系）
ＣｏＡナトリウム塩２ｍｇとＬ−セリン１ｍｇを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（１０μＭ ＰＬＰを含む、ｐＨ８．０）５ｍＬに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。そこにチオフェニルパルミテート３．５ｍｇをアセトニトリル０．１ｍＬで溶解させた溶液を混合した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてＳＰＴ粗酵素液０．５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で反応させた。この溶液を２Ｎアンモニア溶液１ｍＬでアルカリ性とした後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、下記の分析法に従って３−ケトジヒドロスフィンゴシンを定量したところ、生成量は約１．０ｍｇであった。
［スフィンゴシン類の分析法］
Ｔａｎａｋａ，Ｍ．らによるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ ２８４，４３３−４４０（１９８４）に記載の方法に従いＴＬＣ−ＦＩＤ（Ｉａｔｒｏｓｃａｎ）を用いてスフィンゴシン類の定量分析を行った。すなわち、標準試料として１〜１０ｍｇのジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）または３−ケトジヒドロスフィンゴシンをメタノール１ｍＬに溶解した溶液１μＬを、クロマトロッドＳ ＩＩ（シリカゲル）に供し、一次展開液（クロロホルム−メタノール−１５Ｎアンモニア溶液＝６０：１０：１で展開した。展開後のロッドをＩＡＴＲＯＳＣＡＮ ＴＨ−１０ＴＬＣ／ＦＩＤ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＩＡＴＲＯＮ社製）に供することでスフィンゴシン類を検出定量した。
さらに詳細なスフィンゴイド塩基類の定量分析は、文献（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９８（２００１）２８３−２９２）などを参考にし、生成物を蛍光誘導体化した後高速液体クロマトグラフィーによって分離分析した。
後述の反応液７５μＬを取り、７０．６ｍＭ トリエチルアミン／エタノール溶液４２５μＬを添加し撹拌した。５分間遠心して沈殿を除き、上清をＨＰＬＣサンプルバイアル（３００μＬ微量インサート）に１００μＬを取り、ＡＱＣ試薬（Ｗａｔｅｒｓ社製）溶液２０μＬを添加し、直ちに撹拌した。室温で４０分以上反応した後、下記のＨＰＬＣ条件で分析した。
本体：ＬＣ−ＶＰシリーズ（島津製作所）（ポンプＬＣ−１０ＡＤＶＰ、カラムオーブンＣＴＯ−１０ＡＣＶＰ、オートサンプラーＳＩＬ−１０ＡＦ、システムコントローラーＳＣＬ−１０ＡＶＰ）
検出器：蛍光検出器８２１−ＦＰ（日本分光）Ｅｘ．２４４ｎｍ，Ｅｍ．３９８ｎｍ、Ｇａｉｎ ｘ１００
カラム：ＳＨＯＤＥＸ Ｆ−５１１Ａ，３５℃
溶離液：アセトニトリル／メタノール／水／トリメチルアミン＝４８０／３２０／１９０／７、１．５ｍｌ／ｍｉｎ。
カラム再生方法：文献法の再生法はカラム圧が高くなりすぎエラーが出やすいため、下記の通り変更した。
分析サイクル：試料分析毎にカラム再生系を入れる。再生時はサンプル注入しない。
比較例１：カップリング系を用いないＣｏＡ酵素反応
パルミトイルＣｏＡ１０ｍｇとＬ−セリン１ｍｇを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（１０μＭ ＰＬＰを含む、ｐＨ８．０）５ｍＬに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてＳＰＴ粗酵素液０．５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で反応させた。この溶液を２Ｎアンモニア溶液１ｍＬでアルカリ性とした後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、実施例３と同様に分析した結果、３−ケトジヒドロスフィンゴシンの生成量は約０．０２ｍｇであった。
実施例４：エステル交換反応とＣｏＡ酵素反応のカップリング（油水二層系）
ＣｏＡナトリウム塩２ｍｇとＬ−セリン１ｍｇを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（１０μＭ ＰＬＰを含む、ｐＨ８．０）５ｍＬに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。そこにチオフェニルパルミテート３．５ｍｇをヘキサン５ｍＬで溶解させた溶液を混合した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてＳＰＴ粗酵素液０．５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で反応させた。この溶液を２Ｎアンモニア溶液１ｍＬで酸性化した後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、実施例３と同様にして３−ケトジヒドロスフィンゴシンを定量分析したところ、生成量は約２．２ｍｇであった。
以下、本発明による高分子化方法の例を挙げる。
参考例１（１）：３−オキソブチレートエチルエステルの合成
氷上で、乾燥したフラスコ中で３．９ｇのメルドラム酸を１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶かして撹拌したところへ、１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した４．３ｇのピリジンと２．２ｇのアセチルクロライドの溶液を窒素気流下でゆっくりと添加した。撹拌は０℃で１時間の後、室温で２時間行った。混合液を分液漏斗に移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして、ゆっくりと固化する濃オレンジ色でオイル状の３．６ｇの粗アシル化メルドラム酸を得た。この粗アシル化メルドラム酸を８０ｍｌの脱水エタノール中で還流した。この時二酸化炭素の発生が観察された。溶媒をエバポレーションで取り除き、赤色オイル状の１．３ｇの粗３−オキソブチレートエチルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、少し黄色でオイル状の０．６０ｇの精製３−オキソブチレートエチルエステルを得た。収率は未精製品に対して４６％であった。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．２０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ２０１．０６，１６７．４４，６１．５２，５０．２９，３０．３２，１４．２９
参考例１（２）：３−ヒドロキシブチレートエチルエステルの合成
乾燥したフラスコ中で７５．６ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを２ｍｌの脱水エタノールに溶かした溶液を撹拌し、そこへ５２０ｍｇの３−オキソブチレートエチルエステルを２ｍｌの脱水エタノールに溶解した溶液をゆっくりと添加した。撹拌は室温で２時間行い、その後４ｍｌの水を添加した。混合溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタンで２回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下でエバポレーションして、薄い黄色のオイル状の２８２ｍｇの３−ヒドロキシブチレートを得た。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１７２．９３，６４．２８，６０．６８，４２．９１，２２．４９，１４．１８
参考例１（３）：３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルの合成
氷上で乾燥したフラスコ中で６ｍｌの脱水ジクロロメタンを撹拌し、そこへ２ｍｌの２Ｍトリメチルアルミニウムを窒素気流下でゆっくりと添加した。そこへ続けて２ｍｍｏｌのチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で３０分間撹拌し、続けて６ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した３−ヒドロキシブチレートを添加した。反応はＴＬＣでモニターした。この混合液に２０ｍｌのジクロロメタンを加え、気泡発生が止むまで２０ｍｌの３％塩酸溶液を添加した。混合液を分液漏斗へ移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下でエバポレーションして濃黄色のオイル状の５３２ｍｇの粗３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、透明なオイル状の１２５ｍｇの３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。収率は未精製品に対して２４％であった。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ７．３８（ｓ，５Ｈ），４．３３（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１９８．２４，１３４．９０，１３０．０７，１２９．６９，１２７．６１，６５．２３，５２．０２，２２．８５
参考例１（４）：３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルの合成
小さなガラス瓶に３９．５ｍｇのコエンザイムＡナトリウム塩を０．５ｍｌの１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ８．０）に撹拌して溶かした溶液に、９．８ｍｇの３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを０．１ｍｌのアセトニトリルに溶かした溶液を添加した。撹拌は室温で３時間続け、次に０．１３ｍｌの１Ｍリン酸を添加した。混合液を０．５ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄し、減圧下でエバポレーションして３０ｍＭの３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液を得た。
参考例２（１）：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルの合成
２．５３ｇのｔ−ブチルジメチルシリルクロライドを無水ジメチルホルムアミドに溶かして撹拌したところへ、３．４ｇのイミダゾールを添加し、氷上、窒素気流下で１５分撹拌した。更に無水ジメチルホルムアミドに溶解した０．５ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートを添加して室温で一晩撹拌した。反応液に６０ｍｌの飽和食塩水を加え、ジエチルエーテル：石油エーテル＝１：３溶液での抽出を５回繰り返した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションした。これをメタノール：テトラヒドロフラン＝２：１溶液に溶解し、１．５ｇの炭酸カリウムを含む１０ｍｌの水溶液を加え、室温で一晩撹拌した。反応液は飽和食塩水で希釈し、更に１Ｍ硫酸でｐＨを３．０に調整し、ジエチルエーテル：石油エーテル＝１：３溶液での抽出を５回繰り返した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーション後、真空乾燥して３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブチレートを得た。氷上で、８７０ｍｇの３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブチレートと４５２ｍｇのチオフェノールを６ｍｌのジクロロメタンに溶解し、これに２ｍｌのジクロロメタンに溶解した８４６ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し撹拌後、室温で１０時間撹拌した。２０ｍｌのジエチルエーテルを加えてろ過後、溶媒をエバポレーションで取り除き、フラッシュクロマトグラフィー（溶離液は５％酢酸エチルを含むヘキサン）で３３０ｍｇの３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブチレートチオフェニルエステルを得た。これを２ｍｌアセトニトリルに溶解し、更に６ｍｌの５％フッ化水素を含むアセトニトリル溶液を加えた。２０分の反応後、気泡が発生しなくなるまで飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、ジエチルエーテルで抽出後、飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして８１ｍｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。
参考例２（２）：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルの合成
３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルの合成と同様にして、３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液を得た。
参考例３（１）：３−オキソバレレートエチルエステルの合成
氷上で、乾燥したフラスコ中で３．９ｇのメルドラム酸を１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶かして撹拌したところへ、１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した４．３ｇのピリジンと２．５ｇのプロピオニルクロライドの溶液を窒素気流下でゆっくりと添加した。撹拌は０℃で１時間の後、室温で２時間行った。混合液を分液漏斗に移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして、ゆっくりと固化する濃オレンジ色でオイル状の３．４ｇの粗アシル化メルドラム酸を得た。この粗アシル化メルドラム酸を８０ｍｌの脱水エタノール中で還流した。この時二酸化炭素の発生が観察された。溶媒をエバポレーションで取り除き、赤色オイル状の１．７ｇの粗３−オキソバレレートエチルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、少し黄色でオイル状の０．５０ｇの精製３−オキソバレレートエチルエステルを得た。収率は未精製品に対して２９％であった。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．１９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｓ，２Ｈ），２．５８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ２０３．４８，１８０．０７，６１．３３，４９．０３，３６．３２，１４．１３，７．５６
参考例３（２）：３−ヒドロキシバレレートエチルエステルの合成
乾燥したフラスコ中で７５．６ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを１ｍｌの脱水エタノールに溶かした溶液を撹拌し、そこへ２８８ｍｇの３−オキソバレレートエチルエステルを１ｍｌの脱水エタノールに溶解した溶液をゆっくりと添加した。撹拌は室温で２時間行い、その後２ｍｌの水を添加した。混合溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタンで２回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下でエバポレーションして、薄い黄色のオイル状の２１２ｍｇの３−ヒドロキシバレレートを得た。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．９６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１７３．３０，６９．６４，６０．９１，４１．４６，２９．７７，１４．４０，１０．０７
参考例３（３）：３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルの合成
氷上で乾燥したフラスコ中で３ｍｌの脱水ジクロロメタンを撹拌し、そこへ１ｍｌの２Ｍトリメチルアルミニウムを窒素気流下でゆっくりと添加した。そこへ続けて１ｍｍｏｌのチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で３０分間撹拌し、続けて３ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した３−ヒドロキシバレレートを添加した。反応はＴＬＣでモニターした。この混合液に１０ｍｌのジクロロメタンを加え、気泡発生が止むまで１０ｍｌの３％塩酸溶液を添加した。混合液を分液漏斗へ移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下でエバポレーションして濃黄色のオイル状の２５８ｍｇの粗３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、透明なオイル状の４４ｍｇの３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを得た。収率は未精製品に対して１７％であった。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ７．３９（ｓ，５Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１９８．３０，１３４．６７，１２９．８３，１２９．４６，１２７．３１，７０．０４，５０．０３，２９．６７，９．９６
参考例３（４）：３−ヒドロキシバレレートＣｏＡチオエステルの合成
小さなガラス瓶に７９ｍｇのコエンザイムＡナトリウム塩を２ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に撹拌して溶かした溶液に、４２ｍｇの３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを１ｍｌのアセトニトリルに溶かした溶液を添加した。撹拌は室温で３時間続け、次に０．５３ｍｌの１Ｍリン酸を添加した。混合液を２ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄し、減圧下でエバポレーションして３３ｍＭの３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液を得た。
参考例４：酵素の作製と精製
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９のゲノムＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ断片（約５ｋｂｐ）を切り出し、ｐＵＣ１８にクローニングしてＰＨＡ合成酵素遺伝子（ＰＨＡＳ）を含むプラスミドｐＴＩ３０５を取得した。次にｐＴＩ３０５のＮｏｔＩ・ＳｔｕＩ断片（１．６ｋｂｐ）と、ｐＴＩ３０５をテンプレートとして下記２種のプライマーでＰＣＲにより増幅したＤＮＡのＢａｍＨＩ・ＮｏｔＩ断片（１４０ｂｐ）と、ベクターｐＱＥ３０（キアゲン社製）のＢａｍＨＩとＳｍａＩ断片の３種類を混合してライゲーションし、プラスミドｐＱＥＲＥＣを調整した。これを大腸菌ＢＬ２１（ｐＲＥＰ４）に導入して、酵素調製用の大腸菌ＢＬ２１（ｐＱＥＲＥＣ）を作製した。この大腸菌を１０００ｍｌのＬＢ培地中、３０℃で１６時間培養し、菌体内に酵素を蓄積させ、超音波処理によって菌体を破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。このタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラムに通し、（Ｈｉｓ）−ＰｈａＣ（Ｎ末端にヒスチジンが６個付加されている）を特異的にカラムに吸着させた。洗浄後、イミダゾールを用いて（Ｈｉｓ）−ＰｈａＣを溶出し、透析後に精製酵素として１０ｍｇを得た。酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで６５ｋＤａであった。
ＰＣＲの条件
サイクル：（９４℃４５秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒）×３０サイクル。
実施例５：ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに５ｍｌの１ｍＭＣｏＡナトリウム溶液と、０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．４ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。分子量（ポリスチレン換算のＧＰＣ）はＭｗ＝９７００００であった。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ５．２６（ｍ，Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１６９．５３，６７．９９，４１．１６，２０．１５
比較例２：ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに５ｍｌの１ｍＭＣｏＡナトリウム溶液を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。しかし沈殿物は得られなかった。
実施例６：（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに５ｍｌの１ｍＭ３−ヒドロキシブチレートＣｏＡ溶液と、０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．３ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。
比較例３：ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、５ｍｌの１ｍＭ３−ヒドロキシブチレートＣｏＡを少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．２ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。
比較例４：
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。しかし沈殿物は得られなかった。
実施例７：ポリ（３−ヒドロキシバレレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、ここに５ｍｌの１ｍＭ（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシバレレートＣｏＡと、０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに室温で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．３ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレート）を得た。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ５．１２（ｍ，Ｈ），２．５６（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，２Ｈ），０．８１（ｔ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１６９．７１，７２．２６，３９．１７，２７．２３，９．７６
比較例５：ポリ（３−ヒドロキシバレレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として５ｍｌの１ｍＭ（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシバレレートＣｏＡを少しずつ添加し、さらに室温で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．１ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレート）を得た。
実施例８：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルからポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）、１ｍＭＣｏＡナトリウム塩溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して溶液温度を３０℃に保ち撹拌した。その上に１０ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを５ｍｌのヘキサン溶液を重層した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、３０℃で２４時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から５ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、２００ｍｌのメタノール中に滴下して４℃で２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、１．５ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。分子量（ポリスチレン換算のＧＰＣ）はＭｗ＝１０７００００であった。また、添加したＣｏＡのチオエステル化と遊離の反応回転数は３．４回である。
比較例６：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルからポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して溶液温度を３０℃に保ち撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、３０℃で２４時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から５ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、２００ｍｌのメタノール中に滴下して４℃で２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．４ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。
比較例７：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルからポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）に０．０１５ｍｇの酵素を添加して溶液温度を３０℃に保ち撹拌した。その上に１０ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを５ｍｌのヘキサン溶液を重層した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、３０℃で２４時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から５ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、２００ｍｌのメタノール中に滴下して４℃で２４時間放置した。沈殿物は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
アシル基転移酵素を用いる本発明の方法によれば、極めて高価なアシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）を追加添加することなく反応を継続的に行い、その生産性を飛躍的に改善することができる。従って、アシル基転移酵素の工業的製法への利用を可能とした新規なカップリング法により、種々の化合物を製造することができる。本発明によれば、スフィンゴイド塩基類の製造方法において、酵素反応にチオエステル交換反応を組み合わせて、従来の発酵法による方法では困難であったスフィンゴイド塩基類を細胞毒性の問題無く蓄積生産せしめ、さらに反応に必須である補酵素アシルＣｏＡについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能となり、補酵素の消費量が劇的に減少し、経済的にスフィンゴイド塩基類を製造することができる。この発明により、様々なスフィンゴイド塩基類を安価かつ純粋に製造できるようになり、その用途が飛躍的に広がる。
また、ＰＨＡの製造方法において、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法にチオエステル交換反応を組み合わせることにより、反応出発物質を容易に合成可能なチオフェニルエステルに代替し、さらに重合反応で必須である補酵素アシルＣｏＡについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能となり、補酵素の消費量を劇的に減少でき、様々なＰＨＡを安価に効率よく工業的に製造でき、その用途が飛躍的に広がる。
【配列表】
【図１】
【技術分野】
本発明は、アシルコエンザイムＡ（以下、コエンザイムＡをＣｏＡと表記することがある。）による種々の有機化合物へのアシル基転移酵素反応方法に関する。さらに詳しく言えば、本発明は、アシル基転移酵素を用いるアシル化合物の製造方法において、極めて高価なアシルＣｏＡを追加添加することなく反応を継続的に行い、その生産性を飛躍的に改善することによってアシル基転移酵素を種々の化合物の工業的製法に利用することを可能ならしめた新規なアシル基転移酵素反応方法に関する。
さらに、本発明は化学的チオエステル交換反応をアシルＣｏＡ再生系としたＣｏＡ酵素カップリング法に関する。
また、本発明はＣｏＡ酵素を用いて、スフィンゴ脂質のごとき重要な生理活性物質を製造する方法に関する。
さらに、本発明は酵素反応による高分子化合物の製造方法に関する。さらに詳しく言えば、チオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させてアシルコエンザイム（アシルＣｏＡ）を反応系内で再生させてチオエステルから高分子化合物を一貫して合成することの出来る効率的な生分解性の高分子化合物、特にポリエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
ＣｏＡは全ての生物種でアシルキャリア／アシルアクティベーターとして機能する物質である。例えば、アセチルＣｏＡはクエン酸回路を経由する脂肪酸・グルコース等主要な生体代謝のキー物質である他、ある種のアシルＣｏＡ誘導体はコレステロールや脂肪酸生合成においても重要な役割を果たしている。ＣｏＡはこれらの代謝に関わる酵素触媒反応（ＣｏＡ酵素）の補助因子（補酵素）として必須であり、代替不可能な物質であり、下記式で表わされる。
（式中、ＡＣＹはアシル基である。）
ＣｏＡ酵素には、転移させるアシル基の構造および基質（アシル基を導入する化合物）により種々のＣｏＡ酵素が存在する。従来、各種のＣｏＡ酵素を用いて物質を製造しようとする試みは多く成されており、例えば、抗生物質や医薬、ポリケチド合成経路を利用する各種化学物質の製造、アミノ酸類、ポリヒドロキシ酸などの製造例がある。
これらの方法ではアシルＣｏＡは反応においてアシル基受容体と等モル消費される。従って、必要なアシルＣｏＡを廉価に生産する必要がある。
上記の方法では、いずれも、発酵的に生産される生体内のアシルＣｏＡを用いるか、生産系とは別個に製造したアシルＣｏＡを用いている。発酵的に生産される生体内のアシルＣｏＡを用いる場合は、生体内で生産されるアセチルＣｏＡやマロニルＣｏＡといった特定のアシルＣｏＡしか利用し得ない。この課題を解決すべく、アセチルＣｏＡと各種脂肪酸間で酵素的にエステル交換を行い、非生体的なアシルＣｏＡを生産する技術も報告されている。生産系とは別個に製造したアシルＣｏＡを用いる方法は、汎用性が有り一般的に取られる方法であるが、このようにして製造したアシルＣｏＡは極めて高価であり、アシル基転移反応に使用するには等モル必要であることにかわりはない。
アシルＣｏＡの製造方法としては、アシルクロライドによる化学合成法、酸無水物を用いる化学合成法、クロロ炭酸エチルとの混合酸無水物を用いる化学合成法、チオエステル交換による化学合成法（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ２９Ｃ，４６９−４７４（１９７４）、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ３０ｃ，３５２−３５８（１９７５））、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５３，７５，２５２０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１３１８１、その他多くの化学合成法が一般に用いられている。しかしながらこれらの化学的方法は一般にチオール基への選択性が低いものが多く、非選択的なアシル化反応により収量が低下する問題があった。これらの製法は現在も用いられるが、アシルＣｏＡの実験室的調製法として用いられているにとどまっていた。
化学合成法の弱点を克服すべく、酵素的アシルＣｏＡの製造法も精力的に研究されている。すなわち、アセチルＣｏＡ合成酵素を用いる方法や脂肪酸ＣｏＡ合成酵素を用いる方法などが報告されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４０，６９９−７０９）が、これらの酵素反応法ではその触媒である酵素を必要量得ることが非常に困難である。
酵素を用いる製法に関しては、これらをアシルＣｏＡ再生系としてＣｏＡ酵素反応と協同させたカップリング法に関する研究も報告されている。すなわち、アシル基転移反応により消費されたアシルＣｏＡを酵素反応により再生して再び反応に用いるものであり、ホスホトランスアセチラーゼを用いるカップリング法、カルニチンアセチルトランスフェラーゼを用いるカップリング法、アセチルＣｏＡ合成酵素を用いるカップリング法、α−ケトグルタル酸脱水素酵素を用いるカップリング法などである。これらの方法はチオール基への選択性が高く、特にアセチルＣｏＡ合成酵素は基質特異性が広く各種のアシルＣｏＡを生成し得ることから有用である。
しかしながら、これらは酵素によりアシルＣｏＡを再生しており、この様な酵素的再生系は反応速度が遅いこと、酵素が不安定であること、反応にＡＴＰや比較的高価な副成分を必要とすること、高濃度のＣｏＡでは反応できないことなど、それぞれに課題が残されて一般に対象物の価格が余程高価で無い限り、アシルＣｏＡを１０，０００回以上回転させなければコスト的に工業的製法とは成り得ないと言われており、上記の方法は工業的製造法として充分とは言えないものであった。ジメチルアミノピリジンのＮ−アセチル体を用い非酵素反応を利用してアセチルＣｏＡを再生する試みもあるが（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．，１９９０，１８，１３１−１３５）、大量の有機溶媒を使用し２相系であるため生成物の精製上問題があり、工業的製法には適していない。
以上のように、現在までＣｏＡ酵素を工業的製法として利用することを可能とするに充分な、アシルＣｏＡ再生系は知られていなかった。
スフィンゴ脂質は、スフィンゴシンのようなスフィンゴイド塩基に由来する脂質であり、動物、植物及び微生物の細胞膜に存在する。ヒトのスフィンゴ脂質の正確な機能はまだわかっていないが、この化合物群が、神経系の電気シグナル伝達および細胞膜の安定化に関与している。スフィンゴ糖脂質は、免疫系において機能を有し、特に特定のスフィンゴ糖脂質は細菌毒の受容体として、またおそらくは細菌及びウイルスの受容体としても機能することが示されている。
セラミドはスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシンまたはフィトスフィンゴシンを塩基として含む、スフィンゴ脂質の特定のグループである。セラミドは、皮膚の上側層である角質層の主要脂質成分であり、重要な障壁機能を有している。セラミドのようなスフィンゴ脂質を含有する組成物の局所塗布は、例えば皮膚の障壁機能及び水分保持特性を改善することが知られている（Ｃｕｒａｔｏｌｏ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，４：２７１−２７７（１９８７）；Ｋｅｒｓｃｈｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１：３９−４３（１９９１））。
スフィンゴイド塩基それ自体は、シグナル伝達経路において重要な酵素であるプロテインキナーゼＣの活性を阻害することによって、いくつかの生理的作用を媒介することがわかっている。更に、スフィンゴイド塩基は、化粧組成物またはそれらの抗炎症活性及び抗菌活性のための皮膚科用組成物に含まれる。
現在、化粧品用の異種スフィンゴ脂質調製物は、主に動物供給源から抽出されているが、産業的規模では比較的経費のかかる方法であるばかりでなく、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の潜在性のため動物組織以外の供給源から入手できる純粋かつ構造の特定されたスフィンゴ脂質の新規供給源に関心が増している。
酵母Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉのような微生物は、スフィンゴ脂質、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び／またはそれらの誘導体を生成することが発見されている（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ及びＳｔｏｄｏｌａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８０：４８４−４９１（１９６０））。スフィンゴ脂質それ自身の供給源、及び他の商業的に価値のある化合物を生成するための出発材料の供給源を提供し、これらの化合物の動物性供給源の使用に対し実現可能な代用を与える。しかし微生物による生産は、スフィンゴイド塩基の微生物細胞に対する毒性のために、生産性の改善が困難であり（Ｐｉｎｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：２５６５−２５７４（１９９２）；Ｂｉｂｅｌら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３：２６９−２７３（１９９２））、より効率的な製造方法の提供が切望されていた。
また、近年環境問題への意識の高まりから、従来主流を占めてきた合成高分子から環境に優しい生分解性高分子への関心が高まっている。
その一つであるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略記することがある。）は、一般には微生物の発酵生産により製造され、生分解性が高いことから注目を集めているポリエステルであり、９０種以上の種類のものが知られている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，１２８，２１９−２２８）。その中でもポリ（３−ヒドロキシブチレート）（以下、ＰＨＢと略記することがある。）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）（以下、ＰＨＶと略記することがある。）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（以下、ＰＨＢ−ｃｏ−ＰＨＶと略記することがある。）は、その製造のしやすさ、及びその特性が良好であったことから研究開発が進んだ（特開昭５７−１５０３９３号公報（米国特許第４３９３１６７号）、特開昭５９−２２０１９２号公報（欧州特許公開第０１１４０８６号）、特開昭６３−２２６２９１号公報（欧州特許公開第０２７４１５１号）、特開昭６３−２６９９８９号公報）。しかし微生物の発酵生産では微生物体内にＰＨＡを蓄積するためにその生産性は低く、また微生物を粉砕してＰＨＡを抽出し、精製するためにコストもかかるなど問題点も多かった。
その後、発酵生産のメカニズムの解析が進んだことから微生物体内へのＰＨＡの蓄積濃度が飛躍的に向上し、また、微生物体内へのＰＨＡの蓄積状態の解析が進んだことから微生物からの抽出、精製コストも下がる結果となり、ＰＨＡの微生物的製造の実用化が始まった。
また、ＰＨＡを生産する微生物も多種に渡ることが次第に明らかになってきたことから、ＰＨＢ、ＰＨＶ、ＰＨＢ−ｃｏ−ＰＨＶ以外のＰＨＡへの研究開発も急速に進み、物性を改良するためコポリマーの研究開発もされている（特開昭６３−２６９９８９号公報、特開昭６４−４８８２１号公報、特開平１−１５６３２０号公報、特開平１−２２２７８８号公報、特開平５−９３０４９号公報）。
しかし、微生物の発酵生産によるＰＨＡの製造方法では複雑な生物代謝経路を経るために必ずしも所望のＰＨＡを作り出せるわけではなく、またＰＨＡのバリエーションも限定される。また発酵生産の制御方法によっては所望のホモポリマーとならずにコポリマーになることもあり、また逆にコポリマー生産においても必ずしも所望の重合比の均質なコポリマーを生産できる訳ではない（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９２，１０３，２０７−２１４）。さらに精製工程においても多種の化合物を含む微生物菌体より所望のＰＨＡを取り出すために、その純度の向上にも工業的生産においては限界がある。このように微生物発酵によるＰＨＡの製造は様々な問題を抱えている。
一方、近年急速に進んだ遺伝子組換え技術により、ＰＨＡを重合する酵素であるポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＰＨＡＳ）の遺伝子が単離され、その発現を増強することによりＰＨＡの生産の向上も図られるようになった（特開平７−２６５０６５号公報、特開平１０−１０８６８２号公報、特表２００１−５１６５７４号公報（ＷＯ９９／１４３１３））。
さらに遺伝子組換え技術を使うことでＰＨＡＳの大量分離精製もできるようになり、微生物発酵を用いないＰＨＢのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法が開発され、均質で高純度なＰＨＢが生産できるようになった（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９５，９２，６２７９−６２８３、Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，１９９６，２８−３５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，２２６，７１−８０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，４９，２５８−２６６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，３３，２２９−２３１）。
その後、ＰＨＢ以外のＰＨＡも同様のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法で合成できることが示され、微生物発酵法では達成できなかったＰＨＡのバリエーションの制限が無くなり、ＰＨＡのバリエーションが格段に広がることが示唆された（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，１，４３３−４３９、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，５６，１３１−１３６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４，６８８９−６８９４）。この方法ではホモポリマー以外にコポリマーをも合成することが可能である。
しかし、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法では反応出発物質にアシルＣｏＡを使用しなければならないが、上述の通り、その合成には種々の問題がある。
そのためアシルＣｏＡの使用量を極めて少量に抑えることや、工業的に容易に合成可能な他の化合物を出発物質として用いる高分子化合物の製造方法の開発が望まれている。
一方、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法では、酵素の基質としてアシルＣｏＡを用い、酵素が反応してＰＨＡが重合されると共に、反応系内には遊離したＣｏＡが放出される（下記式）。
（式中、Ｒ０はＲ０−ＳＨがＣｏＡを表わす有機基であり、Ｒ１は任意のアルキレン、ｎは重合度に相当する整数である。）
このように、アシルＣｏＡからのアシル基転移反応が１回起こる度に繰り返し単位が１単位ずつ付加され、ＣｏＡが１分子放出される。
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法ではこのＣｏＡは遊離状態のまま反応系内に留まり蓄積されるのみであり、高分子重合反応の収率は反応系内に投入したアシルＣｏＡの当量を超えることはない。このためＰＨＡの生産性は極めて低く、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法で作製したＰＨＡのコストは非常に高価にならざるを得ない。更に重合が進むにつれて反応系内のＣｏＡ濃度が高まることで、酵素反応への阻害効果も懸念される。
なお、この遊離して反応系内に高濃度で存在するＣｏＡの有効利用方法としてリサイクリングする試みもなされている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，１６８，３１９−３２４）。これは重合酵素反応液中に酢酸とアセチルＣｏＡシンセターゼとＡＴＰを共存させることで重合反応後に遊離してくるＣｏＡをアセチルＣｏＡに変換し、さらにプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼと３−ヒドロキシブチレートも共存させることで重合酵素の基質となる３−ヒドロキシブチレートＣｏＡを得るものである。しかしこの方法では精製が困難な酵素を３種類も使用し、さらに極めて高価であるＡＴＰも必須であることから工業的な生産方法に適用することは極めて難しい。
このようにインビトロ重合方法では、その反応基質にアシルＣｏＡを使わなければならず、アシルＣｏＡは非常に高価であることから、これを反応基質に用いたままＰＨＡを工業的に生産するのではＰＨＡの製造コストを下げることが極めて困難であると言わざるを得ない。またＣｏＡをアシルＣｏＡにリサイクリングするにも取得が困難な酵素が多種必要であり、かつ、ＡＴＰのような高価な化合物が必要である。さらにＰＨＡの生物、特に微生物を用いた製造方法では、ＰＨＡのバリエーションは限定され、更に生物体内での代謝により共重合体が重合される可能性が非常に高く、所望のＰＨＡのみを製造するのは難しいと言える。これらのことからＰＨＡのバリエーションが多く、かつ、その生産において簡易に合成できる化合物を出発物質に用いて、ＰＨＡの製造コストが下がるような製造方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
本発明は、アシルＣｏＡ再生系でＣｏＡ酵素を用いる工業的なアシル基転移酵素反応方法、特に生体物質等の生理活性物質の生産に有用なアシル基転移酵素反応方法を提供することを課題とする。
また、本発明の課題は、酵素反応で有用なスフィンゴイド塩基類を製造する全く新しい半合成製造方法を提供することにある。さらにはその製造の際に、触媒量の補酵素（ＣｏＡ）で効率的に製造できる経済的な方法を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、酵素反応で有用な生分解性の高分子化合物を製造する際に、触媒量の補酵素（ＣｏＡ）で効率的に製造できる方法を提供することにある。
本発明者らは、アシルＣｏＡの再生系について、効率、速度、コスト、選択性および酵素反応とのカップリング可否に関し鋭意研究した結果、これまで調製にのみ用いられていた化学合成法の一つであるチオエステル交換反応を酵素反応系とカップリングし得ることを突き止め、本発明を完成するに至った。
このチオエステル交換反応は中性〜弱塩基性域の系で進行すること、アシル基の基質特異性が極めて広いことから、チオエステル交換反応が起こり得る領域で反応性を示すＣｏＡ酵素の何れともカップリングが可能である。
さらに、本発明者らは、このカップリング法をスフィンゴ脂質生合成経路におけるキー酵素であるセリン・Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼに適用し、チオフェニル脂肪酸とセリンから、ＣｏＡを介した脂肪酸鎖の脱カルボキシ的転移反応により、重要な生理活性物質であるスフィンゴイド塩基類を生成する方法等を確立することに成功した。
さらに、本発明者らは高効率なＰＨＡの製造方法を開発すべく、有機化合物からＰＨＡに関連する種々の化合物について新たにな合成経路を見出すべく鋭意検討を行った結果、インビトロ重合方法にチオエステル交換反応を組み合わせることで、反応出発物質を容易に合成可能なチオフェニルエステルに代替することが出来、さらに重合反応で必須であるアシルＣｏＡについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能であり、ＣｏＡの濃度を抑えつつ、アシルＣｏＡ消費量を劇的に減少させることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のアシル基転移酵素反応方法に関する。
１． アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）のアシル基を転移するアシル基転移酵素反応において、チオール化合物のアシルエステルであるアシル基供与体との化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムＡよりアシルコエンザイムＡを反応系内で生成および／または再生させて反応させることを特徴とするアシル基転移酵素反応方法。
２． 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる前項１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
３． アシル基供与体のアシル基でアシルコエンザイムＡを生成および／または再生しながら行う前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
４． チオール化合物が芳香族チオールである前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
５． 芳香族チオールが置換基を有していてもよいチオフェノールである前項４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
６． アシル基受容体がアミノ酸および／またはその誘導体である前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
７． アシル基受容体がセリンおよび／またはその誘導体である前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
８． アシル基転移酵素がセリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼである前項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
９． セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼがスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌由来のものである前項８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１０． アシル基転移酵素がスフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼである前項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１１． 反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる反応において、アシル基転移酵素が高分子重合酵素であり、高分子化合物を合成する前項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１２． アシルコエンザイムＡまたはアシル基転移酵素反応による生成物をアシル基受容体としてアシル基転移酵素反応を繰り返すことにより高分子化合物を生成する前項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１３． アシルチオエステルが芳香族チオールのアシルエステルである前項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１４． 芳香族チオールのアシルエステルがヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである前項１３に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１５． ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである前項１４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１６． ３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルである前項１５に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１７． 高分子重合酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである前項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１８． ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼがラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属由来である前項１７に記載のアシル基転移酵素反応方法。
１９． ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である前項１８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
２０． ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９である前項１９に記載のアシル基転移酵素反応方法。
２１． 前項７乃至９のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いるスフィンゴイド塩基類の製造方法。
２２． スフィンゴイド塩基類が３−ケトジヒドロスフィンゴシンである前項２１に記載の製造方法。
２３． 前項１０に記載のアシル基転移酵素反応を用いるセラミド類の製造方法。
２４． 前項１１乃至２０のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いる高分子化合物の製造方法であって、高分子化合物がポリエステル類であるポリエステル類の製造方法。
２５． ポリエステル類がポリヒドロキシアルカノエートである前項２４に記載のポリエステル類の製造方法。
２６． ポリヒドロキシアルカノエートがポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）である前項２５に記載のポリエステル類の製造方法。
２７． ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）がポリ（３−ヒドロキシブチレート）である前項２６に記載のポリエステル類の製造方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明によるチオエステル交換によるアシルＣｏＡ再生系とのカップリング反応を示すスキームである。
発明の詳細な説明
本発明によると、図１に示すように、アシル基供与体、アシル基受容体、ＣｏＡ、及びアシル基転移酵素（ＣｏＡ酵素）を一つの系に存在させ、反応進行により消費されるアシルＣｏＡが、酵素反応と同系内においてアシル基供与体とコエンザイムＡとの化学的チオエステル交換反応により生成・再生されるカップリング反応によってアシル基転移反応を行うことができる。
本発明の一つの態様においては、反応進行により消費されるアシルＣｏＡを化学的チオエステル交換反応により生成・再生させる。この結果、高価なアシルＣｏＡを少量のみ反応系に存在させるだけで効率的なアシル基転移反応を実現できる。
また、本発明の別の態様においては、アシルＣｏＡまたはアシル基転移反応による生成物をさらにアシル基受容体とする。この結果、アシル基転移反応の繰り返しにより効率的な重合体生成反応を実現できる。
上記第２の態様（重合体生成反応）は上記第１の態様（高効率アシル基転移反応）の一部であるが、以下、便宜上、第１の態様（高効率アシル基転移反応）と第２の態様（重合体生成反応）に分けて説明する。
（１）高効率アシル基転移反応
（１−１）ＣｏＡ酵素
この態様において使用するＣｏＡ酵素には、アシルＣｏＡを補足因子（補酵素）とするものである以外に特に制限は無い。これらの酵素の例としては、アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＥＣ ２．３．１．１）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．５０）等、「ＥＣ ２．３．１．ｘ」シリーズに属するトランスフェラーゼ類が挙げられる。これらの酵素類は既に多くの生物に存在することが明らかにされており、各種の生物から分離精製がなされている（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，１７８−１９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ．（１９９２））。中でも、中性〜弱塩基性域に至適ｐＨを示す酵素がさらに好適である。これらＣｏＡ酵素は精製酵素であってもよいが、ＣｏＡ酵素活性を有する触媒菌体あるいはその処理物を用いることもできる。但し、この場合は、アシルＣｏＡを補欠因子とする目的以外の酵素の影響を、欠損変異株の使用、活性阻害、失活処理等により回避することが望ましい。
（１−２）アシル基供与体
本発明による高効率アシル基転移において使用するアシル基供与体は、ＣｏＡと非触媒的にチオエステル交換反応が起こり得るチオール化合物のアシルエステル（本願において単に「アシルチオエステル」ともいう。）であれば制限は無いが、芳香族チオールのアシルエステルが好ましい。芳香族チオールの例としては、チオフェノール、メチルチオフェノール、クロロチオフェノール、２−メルカプトチアゾール、２−メルカプトイミダゾール、２−メルカプトトリアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾイミダゾール、２−メルカプトピリジン等を挙げることができる。特に好適な例として、チオフェノールのアシルエステル類（フェニル基が置換基を有する場合も含め、本願において単に「チオフェニルエステル」ともいう。）が挙げられる。
アシルエステルのチオールに対応するアシル基としては、基本的に制限無く使用することができる。例えば、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）、プロピオニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、ブチリル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、イソブチリル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＯ−）、アクリロイル（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−）、メタクリロイル（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、パルミトイル（ＣＨ３−［ＣＨ２］１４−ＣＯ−）、ステアロイル（ＣＨ３−［ＣＨ２］１６−ＣＯ−）、オレオイル（ＣＨ３−［ＣＨ２］６−ＣＨ＝ＣＨ−［ＣＨ２］６−ＣＯ−））等のＣ２〜Ｃ２０の飽和または不飽和の脂肪族アシル基、ベンゾイル等の芳香族アシル基などが挙げられる。もっとも、これらは例示であり、例えば、脂肪族アシル基のアルキル鎖は置換されていてもよく、一部または全部が環状でもよい。芳香族アシル基の芳香環は炭素環でもヘテロ環でも縮合環でもよく任意に置換されていてもよい。置換基の例としては、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、塩素、臭素等のハロゲン等が挙げられる。
（１−３）アシル基受容体
また、本発明による高効率アシル基転移反応において使用するアシル基受容体は、上記ＣｏＡ酵素の基質としうる限り制限は無い。酵素の基質特異性を反応条件によって変化させることや、タンパク質工学的に基質特異性を変化させた変異体などを用いることにより、酵素の通常の好適な基質でない物質をもアシル基受容体とし得る。
好ましいアシル基受容体は、アミノ酸、アミノ酸誘導体であり、天然アミノ酸、非天然アミノ酸が特に好ましい。例えば、アミノ酸がセリンで酵素がセリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼである場合、３−ケトジヒドロスフィンゴシンの効率的合成反応となる。また、アシル基受容体がアミノ酸誘導体であるスフィンゴシンで酵素がスフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼである場合、セラミドの効率的合成反応となる。なお、アシル基転移反応における生成物は、転移したアシル基をそのまま有するとは限らず、反応条件下で脱炭酸や転位等を経てもよく、一般的には用いる酵素と基質により定まる。
（１−４）反応条件
本発明による高効率アシル基転移反応において使用するＣｏＡは、化学合成法、半合成法、生物発酵法などいずれの方法で製造されたものでもよく、ＣｏＡとして機能し得るものであれば良い。
本発明による高効率アシル基転移反応において、使用する反応系は、アシル基供与体とＣｏＡのエステル交換反応と、用いるＣｏＡ酵素によるアシルＣｏＡからアシル基受容体へのアシル基転移反応が同時に進行する系である限り制限は無く、水均一系、有機溶媒均一系、あるいは有機溶媒−水二層系等を用いることができる。
本発明の反応は、ＣｏＡ酵素の安定性が確保され、反応が進行する温度であればよい。通常１０℃〜４５℃であり、好ましくは、２０℃〜４０℃である。
本発明の反応は、濃度に関してもＣｏＡ酵素の安定性が確保され、反応が進行するならば、特に制限はない。
反応系は開放型でも密閉型でも良く、臭気等が問題になる場合には密閉系において反応を行えば良い。
（２）高分子生成反応
（２−１）高分子化合物
前述のように、本発明は、高分子生成反応としても有用であり、具体的にはチオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させた溶液中でチオエステルから高分子化合物を合成する高分子化合物の製造方法に関するものである。
本発明において合成される高分子化合物としては、チオエステル交換反応と高分子重合酵素反応を共存させた溶液中でチオエステルから合成される高分子化合物であれば制限はないが、例としては、これまで主に微生物の発酵生産により製造されることが報告されているポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を挙げることが出来る。その種類は９０種以上が知られている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９５，１２８，２１９）。更に具体的には、側鎖にＣ２以上のアルキル鎖を持つもの、その中にはＣ６以上、更にはＣ１０以上の長鎖アルキル基を有するもの、側鎖に分岐したアルキル基を持つもの、側鎖にフェニル環を持つもの、その中にはフェニル環に修飾基を有するもの、側鎖にフェノキシ環を有するもの、その中にはフェノキシ環に修飾基を有するもの、側鎖に二重結合あるいは三重結合を有するもの、その中には良好な重合性を示すもの、側鎖にハロゲン元素を有するもの、側鎖にシクロ環を有するもの、側鎖にエポキシ環を有するものなどがある。これらのＰＨＡはホモポリマーであることもあれば、２種類以上のユニットからなるコポリマーも含まれる。
具体的には、アルキル基についてはＩｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１９９０，１２，９２−１０１など、フェニル環についてはＭａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，１９１，１９５７−１９６５、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９１，２４，５２５６−５２６０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，１７６２−１７６６など、フェノキシ環についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，３４３２−３４３５、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９９４，１９５，１６６５−１６７２など、二重結合についてはＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８，５４，２９２４−２９３２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１９９０，１２，８５−９１、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ Ａ，１９９５，３３，１３６７−１３７４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９４，２７，１６７５−１６７９、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１，１４８０−１４８６など、三重結合についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１，４７６０−４７６３など、ハロゲン元素についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９０，２３，３７０５−３７０７、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９０，３１，４０４−４０６、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９２，２５，１８５２−１８５７、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，４５７２−４５８１などエポキシ環についてはＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９９，３２，７３８９−７３９５などに示されたＰＨＡも含まれ、炭素数も多様である。
高分子化合物の具体例としては、主に生物、特に微生物の発酵生産により製造されることがよく知られているポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）やポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）を挙げることが出来る。更に、具体的には特にポリ（３−ヒドロキシブチレート）を挙げることができる。もっとも、これらは例示であり、本発明の方法によって高分子を形成し得る重合単位を含む高分子化合物はすべて含まれる。また、複数の種類の重合単位の組み合わせを含んでもよい。重合度は酵素反応が進行する限りにおいて特に制限はない。
本発明に利用できるの高分子重合酵素反応は制限はないが、例としてはアシルコエンザイムＡとしてヒドロキシアルカノエートコエンザイムＡを用いる反応を挙げることが可能であり、その場合は高分子化合物としてＰＨＡが生成する。
（２−２）ＣｏＡ酵素
本発明で使用する高分子重合酵素としては、本発明のチオエステル交換反応で生成する物質を基質として高分子化合物を合成する高分子重合酵素であればよい。例えば、ヒドロキシアルカノエートＣｏＡを基質とし、ＰＨＡとする場合、酵素であるポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ（ＰＨＡＳ）を用いることが出来る。高分子重合酵素の取得方法は生物細胞から抽出精製する方法、あるいは生物培養物から抽出精製する方法など多種多様の方法が使われるが、例としてはＰＨＡＳは微生物細胞から抽出精製することが出来る。しかし通常の抽出精製方法では取得出来る酵素量が極めて少量に限られることから、近年は遺伝子組換え技術を利用してＰＨＡＳの遺伝子を単離し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，１５２９８−１５３０３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８８，１７０，４４３１−４４３６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８８，１７０，５８３７−５８４７）、高発現させることで高分子重合酵素を大量に分離精製できる（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，９３１１−９３２０、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．，１９９６，７，２０３−２１１）。また本発明の高分子重合反応で使用される酵素は、そのまま用いる場合のほかに、固定化酵素などの手法で修飾した酵素を用いることもできる。
本発明で用いる高分子重合酵素の由来に生物種としては特に制限はないが、例としてはＰＨＡの生産がよく知られているラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エクトチオロドスピラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ）属をはじめ多くの微生物を挙げることが出来る。またこれらの生物由来の高分子重合酵素遺伝子を供与体として有する遺伝子組換え体から高分子重合酵素を取得することも可能である。例としてはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９のＰＨＡＳの遺伝子を単離し、その組換え体エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を作製して培養し、その培養産物から所望のＰＨＡＳを抽出精製して、高分子重合反応の触媒として用いることが可能である。
（２−３）アシル基供与体
本発明による高分子生成反応において使用するアシル基供与体は、アシル基が高分子の構造単位となり得るものであるという点を除いて、前述の高効率アシル基転移反応と同様であり、芳香族チオールのアシルエステルが好ましい。芳香族チオールの例は、前記の通りである。
チオエステルの製法は例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７３，２２，５８２９に記載されている。
このチオエステルはアルカリ条件でＣｏＡ塩と共存させることで容易にＣｏＡのチオエステルであるアシルＣｏＡへと変換するチオエステル交換反応が可能である（Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，１９９６，２８−３５）。
（２−４）アシル基受容体
インビトロ重合方法では酵素の基質としてＣｏＡチオエステルを用い、酵素が反応してＰＨＡが重合されると共に、反応系内には遊離したＣｏＡが放出される。ＣｏＡチオエステルは反応当初に投入されるものと反応の進行により生じたものの両者が含まれるが、いずれにせよ、生成物は重合体とＣｏＡである（下記式）。
（式中、Ｒ０はＲ０−ＳＨがＣｏＡを表わす有機基であり、Ｒ１は任意のアルキレン、ｎは重合度に相当する整数である。）
本発明は、上記２つの反応、つまりチオエステル交換反応と高分子重合反応の２つの反応を組み合わせて、これらを１つの反応系内で共存させて実施することにより高分子化合物を製造する。つまり、重合反応後には反応系内に遊離されてこれまでは再び利用されることのなかったＣｏＡを、反応系内に投入したチオエステルと反応させて、再びＣｏＡのチオエステルを合成せしめ、これを重合反応の基質として再び用いるものである（下記式）。
これにより反応系内に投入したＣｏＡの当量以上の高分子化合物を生成物として得ることができるようになる。特にこのＣｏＡがチオエステル化と遊離を繰り返すことの反応回転数が多くなればなるほど、高分子化合物の工業的なコストを飛躍的に低価格化させることが可能となる。
また、重合が進むにつれて反応系内のＣｏＡ濃度が高まることで酵素反応への阻害効果をもたらすことがあるが、本発明では、その濃度を抑えることでＰＨＡの生産性を高めるのに非常に有効である。このように本発明は、高効率にＰＨＡを製造する方法である。
本発明の反応条件としては特に制限がなく、高効率アシル基転移反応と同様であるが、例としては酵素反応が促進される条件として、温度としては０℃から６０℃、好ましくは１０℃から５０℃、さらに好ましくは２０℃から４０℃で行うことが望ましい。簡便には室温下で反応を行うことも可能である。ｐＨは３から１２、好ましくは５から１０、さらに好ましくは７から９の間で行うことが望ましい。
なお、チオエステル交換反応と高分子重合反応が共存する状態とは、チオエステル交換反応と高分子重合反応が同一の水溶液、有機溶媒、あるいはその混合溶液中に存在すること、あるいは同一反応容器内において一種の溶液、あるいは複数の溶液が混合状態あるいは分離状態で存在している状況である。分離状態は、層状の場合、油滴状に存在、あるいは目視的に懸濁した状態などが含まれる。いずれにおいても、チオエステル交換反応と高分子重合反応に必要な状態が一体化して確保されていればよい。そしてその出発物質としては工業的に効率的に製造可能なチオエステルを用いて、これを反応系内でＣｏＡのチオエステル化して重合反応の基質とし高分子化合物を製造する。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１：アシルチオフェノール（チオフェニルパルミテート）の合成
よく乾燥させて窒素置換したフラスコに無水ジクロロメタン６ｍＬを添加し、氷上で冷やしながらよく撹拌した。そこに２Ｍトリメチルアルミニウム２ｍＬをゆっくりと添加した。さらにチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で１時間３０分撹拌を続けた後、無水ジクロロメタン６ｍＬに溶解したパルミチン酸エチルエステルをゆっくりと添加して反応させた。反応はＴＬＣでモニターした。反応終了後、反応液にジクロロメタン２０ｍＬを加え、更に気泡発生が無くなるまで３％塩酸水溶液を添加した。この溶液を分液漏斗に移して、３％塩酸水溶液で３回、飽和食塩水で２回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した後、エバポレーションで濃縮し、濃黄色のオイル状溶液を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）によって分離精製してチオフェニルパルミテートを得た。
実施例２：セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）の調製
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属由来の上記酵素を大腸菌にクローン化した形質転換体からＳＰＴ粗酵素抽出液を得た。本形質転換体の作成法、ＳＰＴ精製法はＩｋｕｓｈｉｒｏ，Ｈ．らによる「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６，１８２４９−１８２５６（２００１）」の記載に従った。
まず、上記ＳＰＴの全塩基配列から、Ｎ末端配列とＣ末端配列をコードするプライマー（配列番号１及び配列番号２）を作成し、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲによりＳＰＴコード領域に相当するＤＮＡ断片を作成した。このとき、Ｎ末端用プライマーにはベクターへの接続のためＮｃｏＩサイトを、Ｃ末端用プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた。
［プライマー］
［反応液組成］
ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、
同酵素添付の標準緩衝液、
鋳型染色体 ＜１μｇ、
プライマー 各１μＭ、
ｄＮＴＰ 各２００μＭ、
液量 ２５μＬ〜１００μＬ。
［反応条件］
変成温度 ９４℃、３０秒、
アニール温度 ４０＋０．２５℃／サイクル、３０秒、
伸張温度 ７２℃、９０秒。
作成したＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動した後ゲルより抽出し、カラムにより回収した。この断片を制限酵素ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、プラスミドｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とライゲーションし、宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
作成した形質転換体をアンピシリン５０ｐｐｍを含むＬＢ培地５ｍＬで、３５℃、１６時間培養した後、菌体を遠心分離して回収し、生理食塩水で洗浄した。洗浄菌体をＳＰＴ用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（プロテアーゼ阻害剤），０．０２ｍＭ ＰＬＰを含む））２ｍＬに再懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機で約１０分間破砕した後、未破砕物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ×１０分間）して除去し粗酵素抽出液を得た。
実施例３：エステル交換反応とＣｏＡ酵素反応のカップリング（水均一系）
ＣｏＡナトリウム塩２ｍｇとＬ−セリン１ｍｇを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（１０μＭ ＰＬＰを含む、ｐＨ８．０）５ｍＬに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。そこにチオフェニルパルミテート３．５ｍｇをアセトニトリル０．１ｍＬで溶解させた溶液を混合した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてＳＰＴ粗酵素液０．５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で反応させた。この溶液を２Ｎアンモニア溶液１ｍＬでアルカリ性とした後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、下記の分析法に従って３−ケトジヒドロスフィンゴシンを定量したところ、生成量は約１．０ｍｇであった。
［スフィンゴシン類の分析法］
Ｔａｎａｋａ，Ｍ．らによるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ ２８４，４３３−４４０（１９８４）に記載の方法に従いＴＬＣ−ＦＩＤ（Ｉａｔｒｏｓｃａｎ）を用いてスフィンゴシン類の定量分析を行った。すなわち、標準試料として１〜１０ｍｇのジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）または３−ケトジヒドロスフィンゴシンをメタノール１ｍＬに溶解した溶液１μＬを、クロマトロッドＳ ＩＩ（シリカゲル）に供し、一次展開液（クロロホルム−メタノール−１５Ｎアンモニア溶液＝６０：１０：１で展開した。展開後のロッドをＩＡＴＲＯＳＣＡＮ ＴＨ−１０ＴＬＣ／ＦＩＤ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＩＡＴＲＯＮ社製）に供することでスフィンゴシン類を検出定量した。
さらに詳細なスフィンゴイド塩基類の定量分析は、文献（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９８（２００１）２８３−２９２）などを参考にし、生成物を蛍光誘導体化した後高速液体クロマトグラフィーによって分離分析した。
後述の反応液７５μＬを取り、７０．６ｍＭ トリエチルアミン／エタノール溶液４２５μＬを添加し撹拌した。５分間遠心して沈殿を除き、上清をＨＰＬＣサンプルバイアル（３００μＬ微量インサート）に１００μＬを取り、ＡＱＣ試薬（Ｗａｔｅｒｓ社製）溶液２０μＬを添加し、直ちに撹拌した。室温で４０分以上反応した後、下記のＨＰＬＣ条件で分析した。
本体：ＬＣ−ＶＰシリーズ（島津製作所）（ポンプＬＣ−１０ＡＤＶＰ、カラムオーブンＣＴＯ−１０ＡＣＶＰ、オートサンプラーＳＩＬ−１０ＡＦ、システムコントローラーＳＣＬ−１０ＡＶＰ）
検出器：蛍光検出器８２１−ＦＰ（日本分光）Ｅｘ．２４４ｎｍ，Ｅｍ．３９８ｎｍ、Ｇａｉｎ ｘ１００
カラム：ＳＨＯＤＥＸ Ｆ−５１１Ａ，３５℃
溶離液：アセトニトリル／メタノール／水／トリメチルアミン＝４８０／３２０／１９０／７、１．５ｍｌ／ｍｉｎ。
カラム再生方法：文献法の再生法はカラム圧が高くなりすぎエラーが出やすいため、下記の通り変更した。
分析サイクル：試料分析毎にカラム再生系を入れる。再生時はサンプル注入しない。
比較例１：カップリング系を用いないＣｏＡ酵素反応
パルミトイルＣｏＡ１０ｍｇとＬ−セリン１ｍｇを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（１０μＭ ＰＬＰを含む、ｐＨ８．０）５ｍＬに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてＳＰＴ粗酵素液０．５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で反応させた。この溶液を２Ｎアンモニア溶液１ｍＬでアルカリ性とした後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、実施例３と同様に分析した結果、３−ケトジヒドロスフィンゴシンの生成量は約０．０２ｍｇであった。
実施例４：エステル交換反応とＣｏＡ酵素反応のカップリング（油水二層系）
ＣｏＡナトリウム塩２ｍｇとＬ−セリン１ｍｇを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（１０μＭ ＰＬＰを含む、ｐＨ８．０）５ｍＬに溶解し、マグネチックスターラーでよく撹拌した。そこにチオフェニルパルミテート３．５ｍｇをヘキサン５ｍＬで溶解させた溶液を混合した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落としてＳＰＴ粗酵素液０．５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で反応させた。この溶液を２Ｎアンモニア溶液１ｍＬで酸性化した後、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬで溶液中の生成物を抽出、回収した。抽出液をフィルターろ過した後適当に濃縮し、実施例３と同様にして３−ケトジヒドロスフィンゴシンを定量分析したところ、生成量は約２．２ｍｇであった。
以下、本発明による高分子化方法の例を挙げる。
参考例１（１）：３−オキソブチレートエチルエステルの合成
氷上で、乾燥したフラスコ中で３．９ｇのメルドラム酸を１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶かして撹拌したところへ、１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した４．３ｇのピリジンと２．２ｇのアセチルクロライドの溶液を窒素気流下でゆっくりと添加した。撹拌は０℃で１時間の後、室温で２時間行った。混合液を分液漏斗に移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして、ゆっくりと固化する濃オレンジ色でオイル状の３．６ｇの粗アシル化メルドラム酸を得た。この粗アシル化メルドラム酸を８０ｍｌの脱水エタノール中で還流した。この時二酸化炭素の発生が観察された。溶媒をエバポレーションで取り除き、赤色オイル状の１．３ｇの粗３−オキソブチレートエチルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、少し黄色でオイル状の０．６０ｇの精製３−オキソブチレートエチルエステルを得た。収率は未精製品に対して４６％であった。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．２０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ２０１．０６，１６７．４４，６１．５２，５０．２９，３０．３２，１４．２９
参考例１（２）：３−ヒドロキシブチレートエチルエステルの合成
乾燥したフラスコ中で７５．６ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを２ｍｌの脱水エタノールに溶かした溶液を撹拌し、そこへ５２０ｍｇの３−オキソブチレートエチルエステルを２ｍｌの脱水エタノールに溶解した溶液をゆっくりと添加した。撹拌は室温で２時間行い、その後４ｍｌの水を添加した。混合溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタンで２回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下でエバポレーションして、薄い黄色のオイル状の２８２ｍｇの３−ヒドロキシブチレートを得た。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１７２．９３，６４．２８，６０．６８，４２．９１，２２．４９，１４．１８
参考例１（３）：３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルの合成
氷上で乾燥したフラスコ中で６ｍｌの脱水ジクロロメタンを撹拌し、そこへ２ｍｌの２Ｍトリメチルアルミニウムを窒素気流下でゆっくりと添加した。そこへ続けて２ｍｍｏｌのチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で３０分間撹拌し、続けて６ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した３−ヒドロキシブチレートを添加した。反応はＴＬＣでモニターした。この混合液に２０ｍｌのジクロロメタンを加え、気泡発生が止むまで２０ｍｌの３％塩酸溶液を添加した。混合液を分液漏斗へ移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下でエバポレーションして濃黄色のオイル状の５３２ｍｇの粗３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、透明なオイル状の１２５ｍｇの３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。収率は未精製品に対して２４％であった。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ７．３８（ｓ，５Ｈ），４．３３（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１９８．２４，１３４．９０，１３０．０７，１２９．６９，１２７．６１，６５．２３，５２．０２，２２．８５
参考例１（４）：３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルの合成
小さなガラス瓶に３９．５ｍｇのコエンザイムＡナトリウム塩を０．５ｍｌの１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ８．０）に撹拌して溶かした溶液に、９．８ｍｇの３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを０．１ｍｌのアセトニトリルに溶かした溶液を添加した。撹拌は室温で３時間続け、次に０．１３ｍｌの１Ｍリン酸を添加した。混合液を０．５ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄し、減圧下でエバポレーションして３０ｍＭの３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液を得た。
参考例２（１）：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルの合成
２．５３ｇのｔ−ブチルジメチルシリルクロライドを無水ジメチルホルムアミドに溶かして撹拌したところへ、３．４ｇのイミダゾールを添加し、氷上、窒素気流下で１５分撹拌した。更に無水ジメチルホルムアミドに溶解した０．５ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートを添加して室温で一晩撹拌した。反応液に６０ｍｌの飽和食塩水を加え、ジエチルエーテル：石油エーテル＝１：３溶液での抽出を５回繰り返した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションした。これをメタノール：テトラヒドロフラン＝２：１溶液に溶解し、１．５ｇの炭酸カリウムを含む１０ｍｌの水溶液を加え、室温で一晩撹拌した。反応液は飽和食塩水で希釈し、更に１Ｍ硫酸でｐＨを３．０に調整し、ジエチルエーテル：石油エーテル＝１：３溶液での抽出を５回繰り返した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーション後、真空乾燥して３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブチレートを得た。氷上で、８７０ｍｇの３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブチレートと４５２ｍｇのチオフェノールを６ｍｌのジクロロメタンに溶解し、これに２ｍｌのジクロロメタンに溶解した８４６ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し撹拌後、室温で１０時間撹拌した。２０ｍｌのジエチルエーテルを加えてろ過後、溶媒をエバポレーションで取り除き、フラッシュクロマトグラフィー（溶離液は５％酢酸エチルを含むヘキサン）で３３０ｍｇの３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブチレートチオフェニルエステルを得た。これを２ｍｌアセトニトリルに溶解し、更に６ｍｌの５％フッ化水素を含むアセトニトリル溶液を加えた。２０分の反応後、気泡が発生しなくなるまで飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、ジエチルエーテルで抽出後、飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして８１ｍｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを得た。
参考例２（２）：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルの合成
３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルの合成と同様にして、３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液を得た。
参考例３（１）：３−オキソバレレートエチルエステルの合成
氷上で、乾燥したフラスコ中で３．９ｇのメルドラム酸を１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶かして撹拌したところへ、１８ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した４．３ｇのピリジンと２．５ｇのプロピオニルクロライドの溶液を窒素気流下でゆっくりと添加した。撹拌は０℃で１時間の後、室温で２時間行った。混合液を分液漏斗に移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下でエバポレーションして、ゆっくりと固化する濃オレンジ色でオイル状の３．４ｇの粗アシル化メルドラム酸を得た。この粗アシル化メルドラム酸を８０ｍｌの脱水エタノール中で還流した。この時二酸化炭素の発生が観察された。溶媒をエバポレーションで取り除き、赤色オイル状の１．７ｇの粗３−オキソバレレートエチルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、少し黄色でオイル状の０．５０ｇの精製３−オキソバレレートエチルエステルを得た。収率は未精製品に対して２９％であった。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．１９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｓ，２Ｈ），２．５８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ２０３．４８，１８０．０７，６１．３３，４９．０３，３６．３２，１４．１３，７．５６
参考例３（２）：３−ヒドロキシバレレートエチルエステルの合成
乾燥したフラスコ中で７５．６ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを１ｍｌの脱水エタノールに溶かした溶液を撹拌し、そこへ２８８ｍｇの３−オキソバレレートエチルエステルを１ｍｌの脱水エタノールに溶解した溶液をゆっくりと添加した。撹拌は室温で２時間行い、その後２ｍｌの水を添加した。混合溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタンで２回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下でエバポレーションして、薄い黄色のオイル状の２１２ｍｇの３−ヒドロキシバレレートを得た。この化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），０．９６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１７３．３０，６９．６４，６０．９１，４１．４６，２９．７７，１４．４０，１０．０７
参考例３（３）：３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルの合成
氷上で乾燥したフラスコ中で３ｍｌの脱水ジクロロメタンを撹拌し、そこへ１ｍｌの２Ｍトリメチルアルミニウムを窒素気流下でゆっくりと添加した。そこへ続けて１ｍｍｏｌのチオフェノールをゆっくりと添加した。室温で３０分間撹拌し、続けて３ｍｌの脱水ジクロロメタンに溶解した３−ヒドロキシバレレートを添加した。反応はＴＬＣでモニターした。この混合液に１０ｍｌのジクロロメタンを加え、気泡発生が止むまで１０ｍｌの３％塩酸溶液を添加した。混合液を分液漏斗へ移し、３％塩酸溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下でエバポレーションして濃黄色のオイル状の２５８ｍｇの粗３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを得た。これをシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（２０ｃｍ×Φ１ｃｍ、溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、透明なオイル状の４４ｍｇの３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを得た。収率は未精製品に対して１７％であった。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ７．３９（ｓ，５Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１９８．３０，１３４．６７，１２９．８３，１２９．４６，１２７．３１，７０．０４，５０．０３，２９．６７，９．９６
参考例３（４）：３−ヒドロキシバレレートＣｏＡチオエステルの合成
小さなガラス瓶に７９ｍｇのコエンザイムＡナトリウム塩を２ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に撹拌して溶かした溶液に、４２ｍｇの３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステルを１ｍｌのアセトニトリルに溶かした溶液を添加した。撹拌は室温で３時間続け、次に０．５３ｍｌの１Ｍリン酸を添加した。混合液を２ｍｌのジエチルエーテルで３回洗浄し、減圧下でエバポレーションして３３ｍＭの３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液を得た。
参考例４：酵素の作製と精製
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９のゲノムＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ断片（約５ｋｂｐ）を切り出し、ｐＵＣ１８にクローニングしてＰＨＡ合成酵素遺伝子（ＰＨＡＳ）を含むプラスミドｐＴＩ３０５を取得した。次にｐＴＩ３０５のＮｏｔＩ・ＳｔｕＩ断片（１．６ｋｂｐ）と、ｐＴＩ３０５をテンプレートとして下記２種のプライマーでＰＣＲにより増幅したＤＮＡのＢａｍＨＩ・ＮｏｔＩ断片（１４０ｂｐ）と、ベクターｐＱＥ３０（キアゲン社製）のＢａｍＨＩとＳｍａＩ断片の３種類を混合してライゲーションし、プラスミドｐＱＥＲＥＣを調整した。これを大腸菌ＢＬ２１（ｐＲＥＰ４）に導入して、酵素調製用の大腸菌ＢＬ２１（ｐＱＥＲＥＣ）を作製した。この大腸菌を１０００ｍｌのＬＢ培地中、３０℃で１６時間培養し、菌体内に酵素を蓄積させ、超音波処理によって菌体を破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。このタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラムに通し、（Ｈｉｓ）−ＰｈａＣ（Ｎ末端にヒスチジンが６個付加されている）を特異的にカラムに吸着させた。洗浄後、イミダゾールを用いて（Ｈｉｓ）−ＰｈａＣを溶出し、透析後に精製酵素として１０ｍｇを得た。酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで６５ｋＤａであった。
ＰＣＲの条件
サイクル：（９４℃４５秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒）×３０サイクル。
実施例５：ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに５ｍｌの１ｍＭＣｏＡナトリウム溶液と、０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．４ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。分子量（ポリスチレン換算のＧＰＣ）はＭｗ＝９７００００であった。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ５．２６（ｍ，Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１６９．５３，６７．９９，４１．１６，２０．１５
比較例２：ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに５ｍｌの１ｍＭＣｏＡナトリウム溶液を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。しかし沈殿物は得られなかった。
実施例６：（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに５ｍｌの１ｍＭ３−ヒドロキシブチレートＣｏＡ溶液と、０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．３ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。
比較例３：ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、５ｍｌの１ｍＭ３−ヒドロキシブチレートＣｏＡを少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．２ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。
比較例４：
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として溶液温度を３０℃に保ち、ここに０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに３０℃で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。しかし沈殿物は得られなかった。
実施例７：ポリ（３−ヒドロキシバレレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、ここに５ｍｌの１ｍＭ（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシバレレートＣｏＡと、０．５ｍｌの２０ｍＭ３−ヒドロキシバレレートチオフェニルエステル溶液（１００ｍＭリン酸カリウム溶液とアセトニトリルの１：１溶液に溶解）を少しずつ添加し、さらに室温で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．３ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレート）を得た。その化合物のＮＭＲ分析結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ５．１２（ｍ，Ｈ），２．５６（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，２Ｈ），０．８１（ｔ，３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ１６９．７１，７２．２６，３９．１７，２７．２３，９．７６
比較例５：ポリ（３−ヒドロキシバレレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して室温でよく撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として５ｍｌの１ｍＭ（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシバレレートＣｏＡを少しずつ添加し、さらに室温で２４時間反応させた。次にこの溶液を２０ｍｌのヘキサンで３回洗浄し、更に１０ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出、回収した。これを３回繰り返した。抽出液はフィルターろ過した後、３００ｍｌのメタノール中に滴下して２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．１ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレート）を得た。
実施例８：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルからポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）、１ｍＭＣｏＡナトリウム塩溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して溶液温度を３０℃に保ち撹拌した。その上に１０ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを５ｍｌのヘキサン溶液を重層した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、３０℃で２４時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から５ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、２００ｍｌのメタノール中に滴下して４℃で２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、１．５ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。分子量（ポリスチレン換算のＧＰＣ）はＭｗ＝１０７００００であった。また、添加したＣｏＡのチオエステル化と遊離の反応回転数は３．４回である。
比較例６：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステルからポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートＣｏＡチオエステル溶液に０．０１５ｍｇの酵素を添加して溶液温度を３０℃に保ち撹拌した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、３０℃で２４時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から５ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、２００ｍｌのメタノール中に滴下して４℃で２４時間放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥機で乾燥し、０．４ｍｇのポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）を得た。
比較例７：（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルからポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート）の重合
５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）に０．０１５ｍｇの酵素を添加して溶液温度を３０℃に保ち撹拌した。その上に１０ｍＭ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルを５ｍｌのヘキサン溶液を重層した。撹拌速度を軽く混ざる程度に落として、３０℃で２４時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、次に水層中から５ｍｌのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出溶液をフィルターろ過した後、２００ｍｌのメタノール中に滴下して４℃で２４時間放置した。沈殿物は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
アシル基転移酵素を用いる本発明の方法によれば、極めて高価なアシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）を追加添加することなく反応を継続的に行い、その生産性を飛躍的に改善することができる。従って、アシル基転移酵素の工業的製法への利用を可能とした新規なカップリング法により、種々の化合物を製造することができる。本発明によれば、スフィンゴイド塩基類の製造方法において、酵素反応にチオエステル交換反応を組み合わせて、従来の発酵法による方法では困難であったスフィンゴイド塩基類を細胞毒性の問題無く蓄積生産せしめ、さらに反応に必須である補酵素アシルＣｏＡについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能となり、補酵素の消費量が劇的に減少し、経済的にスフィンゴイド塩基類を製造することができる。この発明により、様々なスフィンゴイド塩基類を安価かつ純粋に製造できるようになり、その用途が飛躍的に広がる。
また、ＰＨＡの製造方法において、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）重合方法にチオエステル交換反応を組み合わせることにより、反応出発物質を容易に合成可能なチオフェニルエステルに代替し、さらに重合反応で必須である補酵素アシルＣｏＡについてもその再生反応を同一反応液系内で行うことが可能となり、補酵素の消費量を劇的に減少でき、様々なＰＨＡを安価に効率よく工業的に製造でき、その用途が飛躍的に広がる。
【配列表】
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）のアシル基を転移するアシル基転移酵素反応において、チオール化合物のアシルエステルであるアシル基供与体との化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムＡよりアシルコエンザイムＡを反応系内で生成および／または再生させて反応させることを特徴とするアシル基転移酵素反応方法。
【請求項２】
反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる請求項１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項３】
アシル基供与体のアシル基でアシルコエンザイムＡを生成および／または再生しながら行う請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項４】
チオール化合物が芳香族チオールである請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項５】
芳香族チオールが置換基を有していてもよいチオフェノールである請求項４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項６】
アシル基受容体がアミノ酸および／またはその誘導体である請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項７】
アシル基受容体がセリンおよび／またはその誘導体である請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項８】
アシル基転移酵素がセリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼである請求項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項９】
セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼがスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌由来のものである請求項８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１０】
アシル基転移酵素がスフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼである請求項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１１】
反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる反応において、アシル基転移酵素が高分子重合酵素であり、高分子化合物を合成する請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１２】
アシルコエンザイムＡまたはアシル基転移酵素反応による生成物をアシル基受容体としてアシル基転移酵素反応を繰り返すことにより高分子化合物を生成する請求項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１３】
アシルチオエステルが芳香族チオールのアシルエステルである請求項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１４】
芳香族チオールのアシルエステルがヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである請求項１３に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１５】
ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである請求項１４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１６】
３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルである請求項１５に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１７】
高分子重合酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである請求項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１８】
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼがラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属由来である請求項１７に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１９】
ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である請求項１８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項２０】
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９である請求項１９に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項２１】
請求項７乃至９のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いるスフィンゴイド塩基類の製造方法。
【請求項２２】
スフィンゴイド塩基類が３−ケトジヒドロスフィンゴシンである請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のアシル基転移酵素反応を用いるセラミド類の製造方法。
【請求項２４】
請求項１１乃至２０のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いる高分子化合物の製造方法であって、高分子化合物がポリエステル類であるポリエステル類の製造方法。
【請求項２５】
ポリエステル類がポリヒドロキシアルカノエートである請求項２４に記載のポリエステル類の製造方法。
【請求項２６】
ポリヒドロキシアルカノエートがポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）である請求項２５に記載のポリエステル類の製造方法。
【請求項２７】
ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）がポリ（３−ヒドロキシブチレート）である請求項２６に記載のポリエステル類の製造方法。
【請求項１】
アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）のアシル基を転移するアシル基転移酵素反応において、チオール化合物のアシルエステルであるアシル基供与体との化学的チオエステル交換反応によって、コエンザイムＡよりアシルコエンザイムＡを反応系内で生成および／または再生させて反応させることを特徴とするアシル基転移酵素反応方法。
【請求項２】
反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる請求項１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項３】
アシル基供与体のアシル基でアシルコエンザイムＡを生成および／または再生しながら行う請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項４】
チオール化合物が芳香族チオールである請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項５】
芳香族チオールが置換基を有していてもよいチオフェノールである請求項４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項６】
アシル基受容体がアミノ酸および／またはその誘導体である請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項７】
アシル基受容体がセリンおよび／またはその誘導体である請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項８】
アシル基転移酵素がセリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼである請求項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項９】
セリン Ｃ−パルミトイルトランスフェラーゼがスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌由来のものである請求項８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１０】
アシル基転移酵素がスフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼである請求項１または２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１１】
反応系内にアシル基供与体、アシル基受容体、コエンザイムＡ、及びアシル基転移酵素を同時に含み、アシル基供与体のアシル基を化学的チオエステル交換反応によってコエンザイムＡに転移させてアシルコエンザイムＡとし、アシルコエンザイムＡのアシル基をアシル基受容体に転移させる反応において、アシル基転移酵素が高分子重合酵素であり、高分子化合物を合成する請求項２に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１２】
アシルコエンザイムＡまたはアシル基転移酵素反応による生成物をアシル基受容体としてアシル基転移酵素反応を繰り返すことにより高分子化合物を生成する請求項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１３】
アシルチオエステルが芳香族チオールのアシルエステルである請求項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１４】
芳香族チオールのアシルエステルがヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである請求項１３に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１５】
ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルである請求項１４に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１６】
３−ヒドロキシアルカノエートチオフェニルエステルが３−ヒドロキシブチレートチオフェニルエステルである請求項１５に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１７】
高分子重合酵素がポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである請求項１１に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１８】
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼがラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属由来である請求項１７に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項１９】
ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である請求項１８に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項２０】
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９である請求項１９に記載のアシル基転移酵素反応方法。
【請求項２１】
請求項７乃至９のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いるスフィンゴイド塩基類の製造方法。
【請求項２２】
スフィンゴイド塩基類が３−ケトジヒドロスフィンゴシンである請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のアシル基転移酵素反応を用いるセラミド類の製造方法。
【請求項２４】
請求項１１乃至２０のいずれかに記載のアシル基転移酵素反応を用いる高分子化合物の製造方法であって、高分子化合物がポリエステル類であるポリエステル類の製造方法。
【請求項２５】
ポリエステル類がポリヒドロキシアルカノエートである請求項２４に記載のポリエステル類の製造方法。
【請求項２６】
ポリヒドロキシアルカノエートがポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）である請求項２５に記載のポリエステル類の製造方法。
【請求項２７】
ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）がポリ（３−ヒドロキシブチレート）である請求項２６に記載のポリエステル類の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５６０９
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０８１０８（Ｐ２００５−５０８１０８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００５００
【国際出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００５００
【国際出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
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