【課題】アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善する新規な組成物の提供。
【解決手段】前記組成物はヒトアポＡ−ＩペプチドまたはヒトアポＡ−Ｉペプチド類似体であるペプチドを含み、前記ペプチドはアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、少なくとも１つのクラスＡ両親媒性らせんおよび少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む。前記ペプチドは高度に安定であり、経口ルートにより容易に投与することができる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアテローム性動脈硬化症（アテローム性硬化症）の分野に関する。特に本発明は、経口投与が可能で、１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を改善するペプチド類の特定に関する。
【背景技術】
【０００２】
心脈管系疾患は、特に米国および西欧諸国では罹患率および死亡率の第一位である。心脈管系疾患の発生においていくつかの原因因子が示唆されているが、これらには、前記疾患に対する遺伝的素因、性別、生活様式因子（例えば喫煙および食事）、年齢、高血圧および高脂血症（高コレステロール血症を含む）が含まれる。前記因子のいくつか、特に高脂血症および高コレステロール血症（高コレステロール血中濃度）は、アテローム性硬化症の顕著な危険因子を提供する。
【０００３】
コレステロールは、血中では、リポタンパク質粒子内で遊離コレステロールおよびエステル化コレステロールとして存在する。前記リポタンパク質粒子は、一般にキロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）として知られている。血中の全コレステロール濃度は、（１）消化管からのコレステロールの吸収、（２）食物成分（例えば炭水化物、タンパク質、脂肪およびエタノール）を基にするコレステロールの合成、および（３）組織（特に肝臓）による血液からのコレステロールの排除およびそれに続くコレステロールの胆汁酸、ステロイドホルモンおよび胆汁コレステロールへの変換によって影響される。
【０００４】
血中コレステロールの維持は遺伝因子および環境因子によって影響を受ける。遺伝因子には、コレステロール生合成の律速段階の酵素の濃度、肝臓の低密度リポタンパク質のレセプター濃度、コレステロール胆汁酸変換の律速段階の酵素の濃度、リポタンパク質の合成速度および分泌速度、並びに個体の性別が含まれる。ヒトの血中コレステロール濃度のホメオスタシスに影響を与える環境因子には、食事の組成、喫煙の程度、運動量および種々の薬剤の使用が含まれる。食事に関する変動性因子には脂肪の量およびタイプ（飽和脂肪酸およびポリ不飽和脂肪酸）、コレステロールの量、線維の量およびタイプ、並びにおそらくはビタミン（例えばビタミンＣおよびＤ）およびミネラル（例えばカルシウム）の量が含まれる。
【０００５】
疫学的研究によって、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びアポリポタンパク質（アポ）Ａ−Ｉレベルはアテローム硬化の発生に関して負の相関を有することが示された（Wilson et al.(1988) Arteriosclerosis 8:737-741）。アテローム誘発性食餌を与えられたウサギにＨＤＬを注射することによってアテローム硬化病巣が抑制されることが示された（Badimon et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1234-1241）。
【０００６】
ヒトのアポＡ−Ｉは、その抗アテローム誘発特性のために熱心に研究されてきた。相互に取り替えることができるアポリポタンパク質（アポＡ−Ｉを含む）は、脂質付随ドメインを有する（Brouillette and Anantharamaiah (1995) Biochem. Biophys. Acta 1256:103-129; Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253）。アポＡ−Ｉは８個のタンデムに繰り返される２２量体配列（これらの大半はクラスＡの両親媒性らせん構造を形成する能力をもつ）を有するといわれている（Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253
）。クラスＡ両親媒性らせんの特徴には、極性−非極性境界に陽性荷電残基および極性表面の中心に陰性荷電残基が存在することである（Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253; Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-117）。
アポＡ−Ｉはリン脂質に強く結合し、複合体を形成しコレステロールに富む細胞からコレステロールの流出を促進させることが示された。アポＡ−Ｉの配送および血清レベルの維持が、なぜ１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を効果的に緩和するのかは、これまで明らかではなかった。
【非特許文献１】ウィルソンら、アーテリオスクレロシス（１９８８）、８巻７３７−７４１ページ（Wilson et al.(1988) Arteriosclerosis 8:737-741）
【非特許文献２】セグレストら、プロテインズ：ストラクチャーファンクションアンドジェネティクス（１９９０）８巻１０３−１１７ページ(Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-117）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
関連出願の相互引用
本出願は、ＵＳＳＮ０９／８９６８４１号（2001年6月29日出願）の部分継続出願であ
り、前記はさらにＵＳＳＮ０９／６４５４５４号（2000年8月24日出願）の部分継続出願
である。前記両出願は参照により本明細書に含まれる。
【０００８】
米国政府の研究開発支援により達成された発明の権利に関する記載
本研究は米国公衆衛生局および米国立循環器研究所（National Heart, Lung and Blood
Institute）のグラントＨＬ３０５６８およびＨＬ３４３４３により補助を受けた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００９】
本発明は、その投与によって１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状が緩和される新規なペプチドを提供する。特に、本発明の発見は、“Ｄ”アミノ酸残基とともに製剤化されるか、および／または保護アミノ末端およびカルボキシル末端を有する、クラスＡ両親媒性らせんを含むペプチドは、生物に経口投与することが可能で、容易に取り込まれ、血清に送られて効果的に１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を緩和するということであった。
【００１０】
したがって、ある実施態様では、本発明はアテローム性硬化症の症状を改善するペプチドを提供する。前記ペプチドの長さは約１０から約３０アミノ酸の範囲で、少なくとも１つのクラスＡ両親媒性らせんを含み、少なくとも１つの“Ｄ”アミノ酸残基を含み、酸化物質による酸化からリン脂質を保護し、さらにＤ−１８Ａペプチドではない（例えば、全てＤ型アミノ酸残基を有するＤ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ（配列識別番号：１））。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドはさらにアミノおよびカルボキシル末端と結合した保護基を含む。好ましい保護基には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：アセチル、アミドおよび３から２０個の炭素のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ），４，４−ジメトキシベンゾヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）。特に好ましいある種の実施態様では、前記ペプチドはさらに、アミノ末端に結合された第一の保護基およびカルボキシル末端に結合された第二の保護基を含む。特に好ましいペプチドは、ヒトまたはマウスのアポＡ−ＩのクラスＡ両親媒性らせんに極めて類似している。ある種の実施態様では、好ましいペプチドは、ヒトまたはマウスのアポＡ−ＩのクラスＡ両親媒性らせんをコードするエクソンによってコードされるポリペプチドと約５０％を越えるアミノ酸配列同一性を含む。ある種の好ましい実施態様では、鏡像異性アミノ酸の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、さらにまた好ましくは少なくとも約７５％、もっとも好ましくは少なくとも９０％および１００％すらが“Ｄ”アミノ酸である。前記ペプチドは、薬学的に許容できる賦形剤（例えば哺乳類への経口投与に適した賦形剤）と結合させてもよい。
【００１１】
特に好ましいある種の実施態様では、前記ペプチドは、D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号2), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L,K-E-A-F- (配列識別番号3), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号4), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号5), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号6), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号7), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号8), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号9), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号10), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号11), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号12), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号13), E-W-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号14), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号15), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号16), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号17), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号18), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号19), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号20), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号21), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号22), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号23), A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号24), A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号25), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号26), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号27), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号28), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号29), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号30), K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F- (配列識別番号31), L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号32), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号33), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号34), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号35), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号36), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号37), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号38), D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号39), D-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号40), D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号41), E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号42), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号43), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号44), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号45), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号46), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号47), D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号48), E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号49), D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W- (配列識別番号50), E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W- (配列識別番号51), D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(配列識別番号52), D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (配列識別番号53), E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F- (配列識別番号54), E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(配列識別番号55), D-W-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y- (配列識別番号56), E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (配列識別番号57), D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号58), E-W-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号59), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号60), E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号61), D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号62), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号63), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号64), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号65), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号66), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(配列識別番号67), D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号68), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号69), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号70), E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号71), D-W-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-I-K-E-A-F- (配列識別番号72), E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号73), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F- (配列識別番号74), E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F- (配列識別番号75), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号76), E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号77), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号78), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号79), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配列識別番号80),D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F- (配列
識別番号81), D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (配列識別番号82), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号83), D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号84), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号85) から選ばれる、１つまたは２つ以上の以下のアミノ酸配列、その切端形、その多量体（例えば好ましくは２量体から３量体、４量体、５量体、８量体または１０量体の範囲である）、その配列の保存的置換、および／またはアミノ酸類似体を含む前記配列を含む。
【００１２】
前記配列の鏡像異性アミノ酸は、好ましくは少なくとも１つの“Ｄ”アミノ酸を含む。ある種の好ましい実施態様では、本明細書で述べるように、前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、もっとも好ましくは少なくとも９０％および１００％すらが“Ｄ”アミノ酸である。前記のペプチドはまた、そのアミノ末端またはカルボキシ末端に結合された保護基（例えばアミド、アセチル、プロペオニル、および３から２０個の炭素のアルキルなど）を含むことができる。ある種の実施態様では、前記カルボキシル末端に結合された保護基はアミドである。ある種の実施態様では、前記アミノ末端に結合された保護基は、アセチル、プロペオニルまたは３から２０個の炭素のアルキルである。ある種のペプチドは、カルボキシル末端保護基およびアミノ末端保護基の両方を含む。前記のような実施態様の１つでは、前記アミノ末端の保護基はアセチル、プロペオニルおよび３から２０炭素のアルキルから成る群から選択される保護基で、前記カルボキシル末端の保護基はアミドである。
【００１３】
ある種の実施態様では、前記ペプチドは、例えば過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥおよびＨＥＴＥから成る群から選択される酸化物質による酸化からリン脂質を保護するペプチドである。前記リン脂質は以下から成る群から選択されるリン脂質であろう：１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＡＰＥ）。したがって、前記ペプチドは、例えば以下の脂質の生成を防止する：酸化１−パルミ

トイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の症状を改善する経口投与に適した組成物を提供する。前記組成物は、クラスＡの両親媒性らせんを含むヒトアポＡ−Ｉペプチドもしくはそのフラグメント、またはヒトアポＡ−Ｉペプチド類似体であるペプチドを含み、ここで前記ペプチドは、アミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドは複数のＤアミノ酸残基を含む。前記保護基には本明細書で述べる保護基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ある種の実施態様では、前記ペプチドを構成する鏡像異性アミノ酸の半分以上、より好ましくは８０％以上、もっとも好ましくは９０％以上またはその全てすらがＤアミノ酸である。前記組成物は、さらに医薬的に許容できる賦形剤（例えば経口投与に適した賦形剤または注射に適した賦形剤）を含むことができる。
【００１５】
好ましいペプチドは、酸化物質（例えば過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥおよびＨＥＴＥ）による酸化からリン脂質［例えば１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＡＰＥ）］を保護することができる。したがって、前記ペプチドは以下の生成を防ぐことができる：酸化１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）および１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【００１６】
本発明はまたアテローム性硬化症の症状を改善する方法を提供する。本方法は、生物（例えばヒトまたはヒト以外の哺乳類）に１つまたは２つ以上の本明細書に記載するペプチドを投与することを含む。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは複数の“Ｄ”アミノ酸を含み、および／または本明細書に記載するように保護されている。前記ペプチドは好ましくは前記生物に経口投与され、さらに前記生物は好ましくはアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状があるまたはそのおそれがあると診断された生物である。ある種の実施態様では、前記ペプチドは単離ペプチドとして提供されるか、または本明細書に記載する薬理学的賦形剤と一緒に提供することができる。投与は好ましくは、アテローム性硬化症の１つもしくは２つ以上の症状を改善させるか、及び／またはアテローム性硬化症の１つもしくは２つ以上の症状の発生のおそれを顕著に減少させるために十分な用量で提供される。
【００１７】
さらに別の実施態様では、本発明はアテローム性硬化症症状を改善するキットを提供する。好ましいキットは、本明細書に記載する１つまたは２つ以上のペプチドを収納した容器を含む。前記ペプチドは好ましくは、本明細書に記載するように複数の“Ｄ”アミノ酸を含み、および／または保護されている。ある種の実施態様では、前記キットは場合によってさらに医薬的に許容できる賦形剤を含み、および／または前記ペプチドは医薬的に許容できる賦形剤と結合された状態で（例えば個別投薬形態として）提供される。好ましいキットは経口投与用の個別投薬形態を提供する。前記キットはまた、場合によって、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善するために、および／またはアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の発生のおそれを減少させるために前記ペプチドの使用を説明する指示物を含む。
【００１８】
ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および／またはGarberらの
文献（Arteriosclerosis and Thrombosis, 12:886-894(1992)）に開示されたいずれのペ
プチドも除外する。ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および／
またはGarberら（1992）の文献に開示されたペプチドであって、全ての鏡像異性アミノ酸がＬアミノ酸であるものから合成されたもの、またはＤアミノ酸であるものから合成されたものをいずれも除外する（ここで前記ペプチドは封鎖基である）。ある種の実施態様では、本発明は、式Ａ₁−Ｂ₁−Ｂ₂−Ｃ₁−Ｄ−Ｂ₃−Ｂ₄−Ａ₂−Ｃ₂−Ｂ₅−Ｂ₆−Ａ₃−Ｃ₃−Ｂ₇−Ｃ₄−Ａ₄−Ｂ₈−Ｂ₉（配列識別番号：８７）を有するペプチドを除外する。前記式
中、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＡ₄はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、またはその同族体もしくは類似体であり、Ｂ₁、Ｂ₂、Ｂ₃、Ｂ₄、Ｂ₅、Ｂ₆、Ｂ₇、Ｂ₈およびＢ₉はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、チロシ
ン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアラニン、またはその同族体もしくは類似体であり、Ｃ₁、Ｃ₂、Ｃ₃およびＣ₄はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであり、Ｄはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体もしくは類似体であるが、ただし、Ａ₁およびＡ₂がアスパラギン酸であるときは、Ａ₃およびＡ₄はグルタミン酸であり、Ｂ₂およびＢ₉はロイシンであり、Ｂ₃およびＢ₇はフェニルアラニンであり、Ｂ₄はチロシンであり、Ｂ₅はバリンであり、Ｂ₆、Ｂ₈およびＤはアラニンであり、さらにＣ₁、Ｃ₂、Ｃ₃およびＣ₄はリジンであり、Ｂ₁はトリプトファンではないことを条
件とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書ではアミノ酸残基ポリマーを指すために互換的に用いられる。前記用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸にも適用される。
【００２０】
“クラスＡ両親媒性らせん”という用語は、極性および非極性表面の分離をもたらすα−らせんを形成し、陽性荷電残基を極性−非極性境界面に、陰性荷電残基を極性表面の中心部に有するタンパク質構造を指す（例えば以下の文献を参照されたい：Segrest et al.
(1990) Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117）。
【００２１】
“改善する”という用語は、“アテローム性（動脈）硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善する”という場合に用いられるときは、アテローム性硬化症および／または付随する病変の１つまたは２つ以上の症状の減少、防止または排除を指す。前記の減少には酸化リン脂質の減少または排除、アテローム性硬化症プラーク形成および断裂の減少、臨床症状（心臓発作、狭心症または卒中発作等）の減少、高血圧の低下、炎症性タンパク質の生合成の低下、血漿コレステロールの減少などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２２】
“鏡像異性アミノ酸”という用語は、互いに重ね合わすことができない少なくとも２つの形態として存在することができるアミノ酸を指す。ほとんどのアミノ酸（グリシンを除く）は鏡像異性であり、いわゆるＬ型（Ｌアミノ酸）またはＤ型（Ｄアミノ酸）として存在する。天然に存在するほとんどのアミノ酸は“Ｌ”アミノ酸である。“Ｄアミノ酸”および“Ｌアミノ酸”という用語は、平面偏光の特定の回転方向ではなくアミノ酸の絶対配置を指すために用いられる。本明細書での用い方は当業者の標準的な用い方と一致している。
【００２３】
“保護基”という用語は、アミノ酸の官能基に結合させたとき前記官能基の特性を阻害するかまたは覆い隠す化学基（例えば側鎖、アルファアミノ基、アルファカルボキシル基など）を指す。好ましいアミノ末端保護基にはアセチルまたはアミノ基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。他のアミノ末端保護基には、脂肪酸の場合のようなアルキル基、プロペオニル、フォルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましいカルボキシル末端保護基には、アミドまたはエステルを形成する基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２４】
“酸化物質による酸化からリン脂質を保護する”という語句は、リン脂質が酸化物質（例えば、過酸化水素、１３−（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５−（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、ＨＥＴＥなど）と接触したとき、リン脂質の酸化速度（または生成される酸化リン脂質の量）を減少させることができる化合物の能力を指す。
【００２５】
“低密度リポタンパク質”または“ＬＤＬ”という用語の定義は当業者の通常の取り扱いと一致する。一般に、ＬＤＬは、超遠心によって単離されたとき、ｄ＝１．０１９からｄ＝１．０６３の範囲の密度で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
【００２６】
“高密度リポタンパク質”または“ＨＤＬ”という用語の定義は当業者の通常の取り扱いと一致する。一般に、“ＨＤＬ”は、超遠心によって単離されたとき、ｄ＝１．０６３からｄ＝１．２１の範囲の密度で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
【００２７】
“Ｉ群ＨＤＬ”という用語は、酸化脂質を還元するか（例えば低密度リポタンパク質において）、または酸化物質による酸化から酸化された脂質を保護する高密度リポタンパク質またはその成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼなど）を指す。
【００２８】
“ＩＩ群ＨＤＬ”という用語は、酸化から脂質を保護する活性または酸化された脂質を修復（例えば還元）する活性が低いかまたは前記活性がないＨＤＬを指す。
【００２９】
“ＨＤＬ成分”という用語は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を構成する成分（例えば分子）を指す。酸化から脂質を保護するかまたは修復する（例えば酸化脂質を還元する）ＨＤＬについてのアッセイはまた、前記の活性を示すＨＤＬの成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼなど）についてのアッセイを含む。
【００３０】
“ヒトアポＡ−Ｉ”という用語は、完全長のヒトアポＡ−ＩペプチドまたはクラスＡ両親媒性らせんを含むそのフラグメントもしくはドメインを指す。
【００３１】
本明細書で用いられる“単球反応”は、アテローム性硬化症プラーク形成に付随する“炎症反応”に特徴的な単球の活動を指す。前記単球反応は、血管壁の細胞（例えば血管内皮の細胞）への単球の付着、および／または内皮下腔への走化性、および／または単球のマクロファージへの分化を特徴とする。
【００３２】
“変化がない”という語句は、酸化リン脂質の量を指すときは、検出可能な変化を欠くこと、より好ましくは統計的に有意な変化を欠くこと（例えば少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは少なくとも９８％または９９％の信頼度）を指す。検出可能な変化がないとはまた、酸化リン脂質レベルが変化するが、本明細書に記載するタンパク質が存在しない場合の変化より多くないか、または陽性もしくはネガティブコントロールに対する場合ほど多くないアッセイも指すことができる。
【００３３】
本明細書では以下の略語が用いられる：ＰＡＰＣ＝Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＶＰＣ＝１−パルミトイル−２−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＧＰＣ＝１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ＝１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ₂）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン；ＣｈＣ１８：２＝コレステリルリノレート；ＣｈＣ１８：２−ＯＯＨ＝コレステリルリノレートヒドロペルオキシド；ＤＭＰＣ＝１，２−ジテトラデカノイル−ｒａｃ−グリセロール−３−ホスホコリン；ＰＯＮ＝パラオキソナーゼ；ＨＰＦ＝標準化高倍率視野；ＰＡＰＣ＝Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＶＰＣ＝１−パルミトイル−２−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＧＰＣ＝１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ＝１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ₂）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＮ＝パラオキソナーゼ；ＢＬ
／６＝Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ３Ｈ＝Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ。
【００３４】
“保存的置換”という用語はタンパク質またはペプチドについて用いられ、実質的に前記分子の活性（特異性（例えばリポタンパク質に対する））または結合親和性（例えば脂質またはリポタンパク質に対する）を変化させないアミノ酸置換を意味する。典型的には、保存的アミノ酸置換には、１つのアミノ酸を同様な化学的特性（例えば荷電または疎水性）を有する別のアミノ酸と置換することが含まれる。以下の６群の各々は、互いに典型的な保存置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３５】
２つまたは３つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して“同一”またはパーセント“同一性”という用語は、最大の重なりとなるようアラインメントを実施して比較し、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、または直接目視で測定したとき、同じであるか、または一定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである２つ以上の配列またはサブ配列を指す。本発明のペプチドについては、配列同一性はペプチドの全長にわたって決定された。
【００３６】
配列を比較する場合、典型的には１つの配列はリファレンス配列として機能し、それに対してテスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列およびリファレンス配列をコンピューターにインプットし、必要な場合にはサブ配列コーディネートを指定し、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。続いて、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターを基にして、リファレンス配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３７】
比較のための配列の最適なアラインメントは以下によって実施することができる：局所相同性アルゴリズム（Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)）、相同性アラインメントアルゴリズム（Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)）、類似性検索法（Pearson & Lipman, Proc, Natl. Acad. Sci.
USA 85:2444(1988)）、これらアルゴリズムのコンピューターによる実行（GAP, BESTFIT, FASTAおよびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI））、または目視による精査（一般的には上
掲書（Ausubel et al.）を参照されたい）。
【００３８】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性とパーセント配列同一性を示すために、対毎に進めていく累積アラインメントを用いて一群の関連配列から多数の配列アラインメントを作製する。ＰＩＬＥＵＰはまた、前記アラインメントを作製するために用いられたクラスター形成（clustering）関係を示す系統樹または樹状図を作製する。ＰＩＬＥＵＰは、漸進アラインメント法（Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153(1989)）を簡易化させたものを用いる。使用される方法は上掲書（Higgins & Sharp, (1989)）に記載された方法に類似する。前記プログラムは、３００配列（各々最大の長さが５０００ヌクレオチドまたはアミノ酸である）のアラインメントを実施することができる。
【００３９】
前記のマルチアラインメントの実施手順は、２つのもっとも類似する配列を対毎にアラインメントを実施することで開始し、アラインされた２つの配列で構成されるクラスターを作製する。続いて、前記クラスターをその次に関連を有する配列またはアラインされた配列クラスターに対してアラインメントを実施する。２つの個々の配列を対毎にアラインしたものを単純に伸張させていくことによって２つの配列クラスターのアラインメントを実施する。最終的なアラインメントは一連の漸進的な対毎のアラインメントによって達成される。前記プログラムは、配列比較領域について特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、さらにプログラムパラメーターを指定することにより実行される。例えば、以下のパラメーター、デフォルトギャップ加重値（３．００）、デフォルトギャップ長過重値（０．１０）および過重エンドギャップを用いてリファレンス配列を他のテスト配列と比較し、パーセント配列同一性関係を決定できる。
【００４０】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したまた別のアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムで、前記は文献（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）に報告されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトは公的施設（National Center
for Biotechnology Information（ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/））を介して一般に利用可能である。前記アルゴリズムは、先ず初めに問題の配列中に存在する、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを実施したとき、いくつかの正の値をもつ閾値スコアＴと適合するか、またはこれを満たす長さがＷの短いワードを特定することによって高いスコアをもつ配列対（ＨＳＰ）を特定する。前記高スコアの配列対は、。Ｔは近縁ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul
et al. 上掲書）。前記の最初の近縁ワードヒットは検索開始の種子として機能し、前記近縁ワードを含むより長いＨＳＰを発見することができる。続いて前記ワードヒットを各配列の両方向に、累積アラインメントが増加するかぎり伸長する。ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（適合対に対する褒賞スコア、常に＞０）およびパラメーターＮ（非適合対に対する罰則スコア、常に＜０）を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合は、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを用いる。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の時に停止させる：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少したとき；累積スコアが、１つまたは２つ以上の負のスコアをもつ残基のアラインメントのために０または０未満になったとき；またはいずれかの配列の末端に達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは前記アルゴリズムの感度および速度を決定する。ヌクレオチド配列用ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）に１１、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列用ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）に３、期待値（Ｅ）に１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（例えば以下の文献を参照されたい：Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)）。
【００４１】
パーセント配列同一性の計算に加えて、前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば以下の文献を参照されたい：Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787(1993)）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに
よって提供される測定値は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、リファレンス核酸とテスト核酸の比較で前記最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、もっとも好ましくは０．００１未満ならば、核酸はリファレンス配列と類似であると考えられる。
【００４２】
“Ｄ−１８Ａペプチド”という用語は以下の配列を有するペプチドを指す：Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ（配列識別番号：１）。前記配列で、鏡像異性アミノ酸のいずれもＤ型アミノ酸である。
【００４３】
Ｉ．アテローム性硬化症の症状の軽減
本発明は、クラスＡ両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチド（Segrest et al. Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117(1990)）はリン脂質と結合し、ヒトアポＡ−Ｉと同様な多くの生物学的特性を示すことができるという発見に関する。特に、前記ペプチドがＤアミノ酸を用いて製剤化されるとき、前記ペプチドは劇的な血中半減期の増加を示し、特にアミノ末端および／またはカルボキシ末端を封鎖されたときは経口的にすら投与することができるというのが、本発明の発見である。
【００４４】
さらにまた、前記Ｄ型ペプチドは対応するＬ型ペプチドの生物学的活性を保持するということは、本発明の驚くべき発見であった。前記Ｄ型ペプチドを用いたIn vivoでの動物
実験は、経口による効果的な薬剤送達、血中半減期の増加およびアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の緩和または防止／抑制能力を示した。
【００４５】
正常なＨＤＬは穏やかに酸化されたＬＤＬの生成において３つの工程を抑制することを我々は発見した。これらの実験（同時係属中の特許出願USSN09/541,468（2000年3月31日
出願）を参照されたい）では、ヒトＬＤＬをin vitroでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ類似ペプチド（３７ｐＡ）で処理することによって、ＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むＬＤＬからシーディング（seeding）分子が除去されることを我々は示した。これらのシーデ
ィング分子は、ヒト動脈壁細胞混合培養がＬＤＬを酸化することを可能にするために、およびＬＤＬが動脈壁細胞に単球走化性活性を産生させるために必要である。我々はまた、アポＡ−Ｉのマウスへの注射またはヒトへの輸液の後、マウスまたは実験協力者から単離されたアポＡ−Ｉ注射／輸液後単離ＬＤＬは、ヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性を示し、さらに動脈壁細胞の混合培養において単球の走化性活性を誘発しないことを見出した。
【００４６】
本発明のＤペプチドの前記保護機能は図１から図５に示されている。図1Ａ、Ｂ、Ｃお
よびＤは、アポＥ欠損マウスにおける血液成分と¹⁴Ｃ−Ｄ−５Ｆの結合を示している。本明細書ではまた、アテローム誘発性食餌を与えたマウスおよびＰＢＳを注射したマウスのＨＤＬは、ヒトＨＤＬの酸化を抑制することができず、さらにヒトの動脈壁混合培養でＬＤＬ誘発単球走化性活性を抑制することができないことが示されている。対照的に、アテローム誘発性食餌を与え、さらに本明細書に記載するペプチドを毎日注射したマウスのＨＤＬは、正常なヒトＨＤＬと同じように、ヒトＬＤＬの酸化の抑制および混合培養でのＬＤＬ誘発単球走化性活性の防止に有効であった（図２Ａおよび２Ｂ）。さらにまた、アテローム誘発性食餌を与え、さらにＰＢＳを毎日注射したマウスから採取したＬＤＬは、同じ食餌を与えたが日量２０μｇのペプチド５Ｆを注射したマウスから採取したＬＤＬよりも容易に酸化され、さらに容易に単球走化性活性を誘発した。前記Ｄペプチドは免疫原性を有しないようであった（図４）。
【００４７】
アテローム誘発性食餌を与え、さらに本発明のペプチドを注射したマウスのＨＤＬおよびＬＤＬに対するヒト動脈壁細胞のin vitro反応は、前記ペプチドによって示されたin vivoでの保護作用と一致する。総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＩＤＬ＋Ｖ
ＬＤＬ−コレステロールレベルが同じで、ＨＤＬ−コレステロールの総コレステロールに対するパーセントが低いにもかかわらず、アテローム誘発性食餌を与えられ、さらに前記ペプチドを注射された動物は顕著に低い病巣スコアを有していた（図５）。したがって、本発明のペプチドは、アテローム誘発性食餌を与えられたマウスでアテローム性硬化症病巣の進行を防止した。
【００４８】
したがってある実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善および／または防止する方法を提供する。好ましくは前記方法は、生物（好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト）に本発明の１つまたは２つ以上のペプチド（または前記ペプチドの摸倣体）を投与することを含む。本明細書に記載するように、前記ペプチドは、標準的な多数の任意の方法（注射、座薬、経鼻スプレー、経時的放出移植物、経皮パッチなどを含むがただしこれらに限定されない）にしたがって投与することができる。特に好ましいある実施態様では、前記ペプチドは経口的に（例えばシロップ、カプセルまたは錠剤として）投与される。
【００４９】
前記方法は、本発明のただ１つのポリペプチドの投与、または２つ以上の異なるポリペプチドの投与を含む。前記ポリペプチドは、モノマーとしてまたはダイマー、オリゴマーもしくはポリマー形で提供することができる。ある種の実施態様では、前記多量体形は（例えばイオン結合または疎水性結合による）結合したモノマーを含んでいてもよいし、他方、別の多量体は（直接結合またはリンカーを介する）共有結合したモノマーを含んでいてもよい。
【００５０】
本発明は人間で使用することについて述べているが、一方、本発明は動物にも（例えば獣医学的使用にも）適している。したがって好ましい生物には、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、有蹄類、ウサギ類などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５１】
本発明の方法は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状［例えば高血圧、プラーク形成および断裂、臨床事象における転化（例えば心臓発作、狭心症または卒中発作）、高レベルの血漿コレステロール、高レベルの低密度リポタンパク質、高レベルの超低密度リポタンパク質または炎症性タンパク質など］を示すヒトまたはヒト以外の動物に限定されず、予防的な意味でも有用である。したがって、本発明のペプチド（またはその摸倣体）はアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の開始／進行を防止するために生物に投与することができる。前記の意味で特に好ましい対象は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の危険因子（例えば家族歴、高血圧、肥満、アルコールの大量摂取、喫煙、高血中コレステロール、高血中トリグリセリド、高血中ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬもしくは低ＨＤＬ、糖尿病、または糖尿病、高血中脂質、心臓発作、狭心症または卒中発作の家族歴など）を示す対象者である。
【００５２】
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドの使用方法の他に、本発明はまた前記ペプチド自体、医薬として製剤化されたペプチド（特に経口送達用）、およびアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の治療および／または予防のためのキットも提供する。
【００５３】
ＩＩ．急性炎症反応に付随するアテローム性硬化症の症状の緩和
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドはまた他の多くの場合に有用である。特に、我々は心脈管系合併症（例えばアテローム性硬化症、卒中発作など）はしばしば急性期炎症反応の開始を伴い、またはこれに付随することを見出した。前記のような急性炎症反応はしばしば、再発性炎症疾患（例えば癩、結核、全身性紅斑性狼瘡および慢性関節リウマチ）、ウイルス感染（例えばインフルエンザ）、細菌感染、真菌感染、器官移植、創傷もしくは他の外傷、人工器官、バイオフィルムなどに付随する。
【００５４】
本明細書に記載するペプチドの１つまたは２つ以上の投与によって、急性期反応時またはその後の酸化リン脂質の生成が減少または防止され、それによって前記の症状に付随する心脈管系合併症を緩和または排除できるということは本発明の驚くべき発見であった。
【００５５】
したがって例えば、我々は、インフルエンザ感染の結果ＨＤＬのパラオキソナーゼおよび血小板活性化アセチルヒドラーゼ活性が低下することを示した。特定の理論に拘束されないが、これらのＨＤＬ酵素活性の低下の結果として、さらにまた急性期反応時のプロオキシダントタンパク質とＨＤＬの結合の結果として、ＨＤＬはもはやＬＤＬの酸化を防ぐことができず、もはや内皮細胞によるＬＤＬ誘発単球走化性活性の生成を防止することができないのだと我々は考えている。
【００５６】
我々は、インフルエンザＡウイルス感染後に、一日当たり非常に低用量の本発明のポリペプチド（例えばマウス当たり２０μｇ）を注射された対象動物では、パラオキソナーゼレベルは低下せず、生物学的に活性を有する酸化リン脂質はバックグラウンド以上には生成されないことを見出した。これは、インフルエンザ感染時または急性期炎症反応を生じる他の事象時に（例えばウイルス感染、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫疾患などのために）、既知の冠状動脈疾患をもつ患者にＤ−４Ｆ（および／または本発明の他のペプチド）を（例えば経口的または注射によって）投与することができ、したがってこの短期間処置によって、前記炎症性症状を生じる病変に付随する心臓発作および卒中発作の発生の増加を防止することができることを示唆している。
【００５７】
したがってある種の実施態様では、本発明は、急性炎症反応のおそれがあるかもしくは急性反応を示している対象者、またはアテローム性硬化症のおそれがあるかもしくはアテローム性硬化症の症状を示している対象者に本発明の１つまたは２つ以上のペプチドを投与することを意図する。
【００５８】
したがって例えば、冠状動脈疾患またはそのおそれのある対象者に流感の季節に予防的に本発明のポリペプチドを投与することができる。再発性炎症症状（例えば慢性関節リウマチ、種々の自己免疫疾患など）を有する対象者（または動物）は、本発明のポリペプチドで処置してアテローム性硬化症の進行または卒中発作を緩和または防止することができる。外傷（例えば急性損傷、組織移植など）を受けた対象者（または動物）は、本発明のポリペプチドで処置してアテローム性硬化症の進行または卒中発作を緩和または防止することができる。
【００５９】
ある種の例では、前記方法は、急性炎症性反応の出現またはおそれがあると診断することを含むであろう。急性炎症性反応は、典型的には代謝の変化および肝臓における遺伝子調節を伴う。急性炎症性反応は、免疫系、心脈管系および中枢神経系に加え身体の主要なシステムの全てを巻き込む動的なホメオスタシスの過程である。通常は、急性期反応は数日続くだけであるが、慢性炎症または再発性炎症の場合には、急性期反応のいくつかの局面の異常な継続は前記疾患に付随する下部組織損傷の一因となり、さらにまた別の合併症、例えば心脈管系疾患またはタンパク質沈着疾患（例えばアミロイド症）をもたらすことになるであろう。
【００６０】
急性期反応の重要な局面は、肝臓の生合成プロフィルの急激な変化である。正常な状況下では、肝臓は固有の範囲内で一定の濃度の血漿タンパク質を生合成する。これらタンパク質の多くは重要な機能を有し、これら急性期反応物質（ＡＰＲ）または急性期タンパク質（ＡＰＰ）のより高い血中レベルが、炎症刺激に続く急性期反応の間に必要とされる。ほとんどのＡＰＲは肝細胞によって合成され、いくつかは他の細胞タイプ（単球、内皮細胞、線維芽細胞および脂肪細胞を含む）によって産生される。ほとんどのＡＰＲは、正常レベルを越える５０％から数倍の範囲で誘発される。対照的に、主要なＡＰＲは正常レベルの１０００倍に増加することが可能である。いおの群には血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）およびヒトのＣ−反応性タンパク質またはマウスホモログ、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）が含まれる。いわゆる陰性ＡＰＲは急性期反応時に血中濃度が減少し、肝臓の誘発されるＡＰＲ生合成能力を増加させる。
【００６１】
ある種の実施態様では、急性期反応またはそのおそれは、したがって１つまたは２つ以上のＡＰＰを測定することによって検定される。前記のようなマーカーの測定は当業者には周知で、そのような測定を提供する業者が存在する（例えばカルディオテック・サービス（Cardiotech Services, Lousiville, KY）はＡＧＰを測定する）。
【００６２】
ＩＩＩ．冠状動脈石灰沈着および骨粗しょう症に付随する症状の緩和
我々はまた、冠状動脈石灰沈着および骨粗しょう症の原因として酸化脂質を特定した。さらにまた、特定の理論に拘束されないが、我々は、石灰化大動脈狭窄の病理発生に同じメカニズムが存在すると考えている。
【００６３】
したがって、ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載するペプチドを使用して、例えばリウマチ性多発性筋痛、多発性結節性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、エイズ、冠状動脈石灰沈着、骨粗鬆症、石灰化大動脈狭窄などの疾患の症状を抑制または防止することを意図する。
【００６４】
ＩＶ．好ましいペプチドおよびそれらの調製
好ましいペプチド
クラスＡペプチドはアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を緩和することができるということは本発明の発見であった。クラスＡペプチドは、極性残基および非極性残基の分離をもたらすα−らせんを形成し、それによって極性−非極性境界に陽性に荷電した残基を位置し、さらに極性表面の中心に陰性に荷電した残基を位置する極性および非極性表面を形成することを特徴とする（例えば以下を参照されたい：Anantharamaiah, Meth. Enzymol., 128:626-668(1986)）。アポＡ−Ｉの４番目のエクソンは、３．６６７残
基／ターンに折り畳まれるときクラスＡ両親媒性らせん構造を生じることは特筆されよう。
【００６５】
特に好ましいクラスＡペプチド（１８Ａと称される）（表1および上掲書（Anantharamaiah）を参照されたい）を本明細書に記載するように改変し、経口投与が可能であり、さ
らにアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の抑制または防止に極めて有効なペプチドを製造した。特定の理論に拘束されないが、ＬＤＬの酸化を緩和する本発明のペプチドは、おそらくシーディング分子を摘み取ることによってin vivoで機能すると考えら
れる。
【００６６】
我々は、１８Ａの疎水性表面上のＰｈｅ残基の数を増すことによって理論上脂質親和性を増すことができることがPalgunachariら（Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology 16:328-338(1996)）が記載したコンピュータ処理により分かった。理論的には、１８Ａの非極性面の残基をＰｈｅによって系統的に置換することによって６つのペプチドが得られるであろう。２、３および４つのＰｈｅが付加されたペプチドは、それぞれ１３、１４および１５ユニットの理論的脂質親和性（λ）値を有するであろう。しかしながら、さらに付加Ｐｈｅが４から５に増加するならば前記の値は一挙に４ユニット増加するであろう（１９λユニットへ）。６つまたは７つのＰｈｅの増加は前記ほど劇的な増加をもたらさない（それぞれ２０および２１λユニット）。したがって、我々は５つの付加Ｐｈｅを選択した（したがってペプチドの名称は５Ｆ）。特に好ましい実施態様では、前記５Ｆペプチドのアミノ末端残基をアセチル化し、カルボキシル末端残基をアミド化してブロックした。
【００６７】
前記新規なクラスＡペプチド類似体、５Ｆは、アテローム性硬化症感受性マウスで病巣の成長を抑制した。前記新規なペプチド類似体、５Ｆは、Levineら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:12040-12044(1993)）の実験を基にしたペプチド投与量を用いて前記マウス
で食餌誘発性アテローム性硬化症の抑制効果についてマウスのアポＡ−Ｉ（ＭｏＡ−Ｉ）と比較された。
【００６８】
他の多数のクラスＡペプチドもまた製造し、これらは、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の軽減においてばらつきはあるものの、有意な程度の有効性を示した。前記多数のペプチドは表１に示す。
【００６９】
表１：本発明に用いられる好ましいペプチド

【００７０】

【００７１】

【００７２】

【００７３】
表１に示した種々のペプチドはアミノ末端を保護するアセチル基およびカルボキシル末端を保護するアミド基を有するが、これら保護基のいずれか一方または両方を除去しても、および／または本明細書に記載するまた別の保護基で置換してもよい。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは、本明細書に記載するように１つ以上のＤ型アミノ酸を含む。ある種の実施態様では、表１の各アミノ酸（例えば各鏡像異性アミノ酸）がＤ型アミノ酸である。
【００７４】
さらにまた表１は全てを網羅したものではないことを特記する。本明細書に提供した説明を用いて、他の適切なペプチドを典型的なやり方で製造することができる［例えば保存的または半保存的置換（例えばＤをＥに置換）、伸長、欠失など］。したがって例えば、ある実施態様では、配列識別番号：２から２０および３９から８５によって特定されるペプチドのいずれか１つまたは２つ以上の切端形が利用される。したがって例えば、配列識別番号：２１は、１８ＡのＣ−末端から１４アミノ酸を含み１つまたは２つ以上のＤアミノ酸を含むペプチドを示し、配列識別番号：２２から３８は別の切端形を示す。より長いペプチドもまた適している。前記のより長いペプチドは全体がクラスＡ両親媒性らせんを形成してもよいし、または前記クラスＡ両親媒性らせんは１つまたは２つ以上のペプチドドメインを形成するものでもよい。さらに、本発明は前記ペプチドの多量体型も包含する。したがって例えば、表１に示すペプチドは、［直接または１つもしくは２つ以上の介在アミノ酸をもつリンカー（例えば炭素リンカーまたは１つもしくは２つ以上のアミノ酸）を介して］一緒に結合させることができる。実例を挙げれば、ポリマーペプチドには１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａおよび配列識別番号：７９から８５のペプチドが含まれ、前記は好ましくは１つまたは２つ以上のＤアミノ酸を含み、より好ましくは本明細書に記載するように各アミノ酸はＤアミノ酸で、および／または一端もしくは両端が保護されている。
【００７５】
（例えば表１に例示されているような）クラスＡペプチドがＤアミノ酸を含むとき、前記ペプチドはその活性を保持し、しかも経口的に投与できるということは、本発明の驚くべき発見であった。さらにまた、この経口投与は、比較的効果的な取込みおよび顕著な血中半減期をもたらし、それによってアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を軽減する効果的な方法を提供する。
【００７６】
本明細書で提供される開示を用いて、当業者は前記例示したクラスＡペプチドを典型的なやり方で改変し、本発明の他の適切なクラスＡペプチドを製造することができる。例えば典型的な保存的または半保存的置換（例えばＥでＤを置換）を現在存在するアミノ酸に実施することができる。得られたペプチドの種々の置換がもつ脂質親和性に対する影響は、Palgunachariら（Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology, 16:328-338(1996)）が記載したコンピュータによる方法を用いて予測することができる。クラスＡαら
せん構造が保存されるかぎり、前記ペプチドは長くしても短くしてもよい。さらに、得られるペプチドを対象の種自身によって産生されるペプチドにいっそう類似させるために置換を施すことができる。
【００７７】
ある種の実施態様では、本発明のペプチドは、米国特許第4,643,988号に記載されたペ
プチドの“Ｄ”型を含み、より好ましくは一端または両端が保護基と結合した“Ｄ”型を含む。そのようなペプチドには、式Ａ₁−Ｂ₁−Ｂ₂−Ｃ₁−Ｄ−Ｂ₃−Ｂ₄−Ａ₂−Ｃ₂−Ｂ₅−Ｂ₆−Ａ₃−Ｃ₃−Ｂ₇−Ｃ₄−Ａ₄−Ｂ₈−Ｂ₉（配列識別番号：８６）をもつペプチドが含まれる。式中、Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃およびＡ₄はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸またはその同族体もしくは類似体であり；Ｂ₁、Ｂ₂、Ｂ₃、Ｂ₄、Ｂ₅、Ｂ₆、Ｂ₇、Ｂ₈およびＢ₉はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアミンまたはその同族体もしくは類似体であり；Ｃ₁、Ｃ₂、Ｃ₃およびＣ₄はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであり；さらにＤはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体もしくは類似体であり（ただし、Ａ₁およびＡ₂がアスパラギン酸であるときは、Ａ₃およびＡ₄はグルタミン酸、Ｂ₂およびＢ₉はロイシン、Ｂ₃およびＢ₇はフェニルアラニン、Ｂ₄はチロシン、Ｂ₅はバリン、Ｂ₆、Ｂ₈およびＤはアラニン、Ｃ₁、Ｃ₂、Ｃ₃およびＣ₄はリジンであり、Ｂ₁はトリプトファンではないことを条件とする）、さらに式中、少なくとも１つの鏡像異性アミノ酸は“Ｄ”型アミノ酸である。好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも５０％が“Ｄ”型であり、より好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも８０％が“Ｄ”型であり、もっとも好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも９０％が“Ｄ”型アミノ酸である。
【００７８】
好ましい実施態様では、本発明のペプチドは天然に存在するアミノ酸または天然に存在するアミノ酸のＤ型を利用する一方で、天然には存在しないアミノ酸（例えばメチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、ノルロイシン、エプシロン−アミノカプロン酸、４−アミノブタン酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、８−アミノカプリル酸、４−アミノブチル酸、Ｌｙｓ（Ｎ（エプシロン）−トリフルオロアセチル），α−アミノイソブチル酸など）の置換物もまた意図される。
【００７９】
本明細書に記載するクラスＡペプチドの他に、ペプチド摸倣体もまた本明細書で意図される。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性に類似する特性を有する非ペプチド薬として製薬工業では一般的に用いられる。前記のタイプの非ペプチド化合物は“ペプチド摸倣体”（peptide mimeticsまたはpeptidomimetics）（Fauchere(1986) Adv. Drug Res., 15:29; Veber & Freidinger(1985) TINS p.392; Evans et al.(1987) J. Med. Chem., 30:1229）と称され、通常はコンピューター支援分子モデリングによって開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド摸倣体を用いて、同等な治療効果または予防効果を得ることができる。
【００８０】
一般に、ペプチド摸倣体は模範ペプチド（すなわち本明細書に記載する５Ｆ）と構造的に類似するが、１つまたは２つ以上のペプチド結合を含み、前記ペプチド結合は、場合によって−ＣＨ₂ＮＨ−、ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＳＯ−などから成る群から選択される結合によって置換される。前記置換は、当業者に公知の方法および以下の文献に記載されている方法によって実施される： Spatola (1983) p.267 "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York; Spatola (1983) Vega Data 1(3) Peptide Backbone Modifications（一般的解説）；Morley (1980) Trends Pharm Sci. pp.463-468（一般的解説）；hudson et al.(1979) Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185（−ＣＨ₂ＮＨ−，ＣＨ₂ＣＨ₂−）；Spatola et al.(1986) Life Sci., 38:1243-1249（−ＣＨ₂−Ｓ）；Hann (1982) J. Chem. Soc. Perkin. Trans. I307-314（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Almquist et al.(1980) J. Med. Chem. 23:1392-1398（−ＣＯＣＨ₂−）；Jennings-White et al.(1982) Tetrahedron Lett. 23:2533（−ＣＯＣＨ₂）；M. Szelke et al.欧州特許出願EP45665(1982)CA:97:39405(1982)（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；Holladay et al.(1983) Tetrahedron Lett. 24:4401-4404（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；およびHruby (1982) Life Sci., 31:189-199（−ＣＨ₂−Ｓ−）。
【００８１】
特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ₂ＮＨ−である。前記のようなペプチド摸倣体は
ポリペプチドよりも顕著な利点を有するであろう。前記利点には、例えばより経済的な製造、より高い化学的安定性、薬理学的特性の強化（半減期、吸収性、高い性能、有効性など）、抗原性の減少などが含まれる。
【００８２】
さらにまた、本明細書に記載されるペプチドを環状に配列したもの、またはコンセンサス配列もしくは実質的に同一なコンセンサス配列変種を含む構造的に拘束されたペプチド（環状化ペプチドを含む）もまた、当分野で公知の方法（Rizo & Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387）によって、例えばペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基の付加によって生成することができる。
【００８３】
ペプチドの調製
本発明で用いられるペプチドは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて化学的に合成するか、または、特にペプチドが“Ｄ”アミノ酸残基を含まない場合は組換えによって発現される。ポリペプチドが組換えによって発現される場合、１つまたは２つ以上のアミノ酸がもっぱらＤ型で前記生物に提供される環境下で、ホスト生物（例えば細菌、植物、真菌細胞など）を培養すると、組換えによって発現されたペプチドはしたがって前記Ｄアミノ酸を含んでいる。
【００８４】
好ましい実施態様では、ペプチドは、当業者に公知の多数の液相または固相ペプチド合成技術のいずれかによって化学的に合成される。配列のＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて前記配列の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相合成は、本発明のポリペプチドの化学合成のために好ましい方法である。固相合成のための技術は当業者には周知で、例えば以下の文献に記載されている：Barany & Merrifield (1963) Solid-Phase Peptide Synthesis; pp.3-284, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.；Merrifield et al.(1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156；Stewart et al.(1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill.。
【００８５】
もっとも好ましい実施態様では、ペプチドは、固相支持体としてベンズヒドリルアミン樹脂（Beckman Bioproducts, ０．５９ミリモルＮＨ₂／ｇの樹脂）を用いて固相ペプチド合成法によって合成される。ＣＯＯＨ末端アミノ酸（例えばｔ−ブチルカルボニル−Ｐｈｅ）は、４−（オキシメチル）フェナセチル基により固相支持体に結合される。前記は、通常のベンジルエステル結合よりも安定な結合で、しかも完成したペプチドを水素添加によって切断することができる。水素供与体としてギ酸を用いる水素転移添加がこの方法に用いられる。ペプチド合成および合成されたペプチドの分析のための詳細なプロトコルは、Anantharamaiahらの文献（J. Biol. Chem., 260(16):10248-10255(1985)）に付随する補充ミニプリントに記載されている。
【００８６】
ペプチド、特にＤアミノ酸を含むペプチドの化学合成では、所望の完全長の生成物の他に合成によって通常末端が切り縮められた多数のペプチドが生成されることは特筆されよう。精製過程（例えばＨＰＬＣ）で、典型的には顕著な量の完全長の生成物が失われる。
【００８７】
Ｄペプチド（例えばＤ−４）の合成では、最長の形態を精製する際に損失を防ぐためにその混合物を透析して使用し、それによって最後のＨＰＬＣ精製を除くことができるということは本発明の発見であった。前記のような混合物は、高度に精製された生成物の性能の約５０％（例えばタンパク質生成物の重量当たり）を失うが、前記混合物は約６倍多いペプチドを含み、したがって総活性は高くなる。
【００８８】
Ｄ型アミノ酸
Ｄアミノ酸は、化学合成でＤ型誘導アミノ酸残基を用いることによってペプチド内の１つまたは２つ以上の位置に簡単に取り込まれる。固相ペプチド合成のためのＤ型アミノ酸残基は多数の供給元から市販されている（例えば、Advanced Chem Tech, Louisville; Nova Biochem, San Diego; Sigma, St Louis; Bachem California Inc., Torranceなど）。Ｄ型アミノ酸はペプチド内の任意の位置に所望のように取り込ませることができる。したがって例えば、ある実施態様では、ペプチドはただ１つのＤ−アミノ酸を含み、一方、別の実施態様では、ペプチドは少なくとも２つ、一般的には少なくとも３つ、より一般的には少なくとも４つ、もっとも一般的には少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも７つ、さらにもっとも好ましくは少なくとも８つのＤアミノ酸を含む。特に好ましい実施態様では、実質的に（鏡像異性）アミノ酸１つおきにＤ型アミノ酸が存在する。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の鏡像異性アミノ酸がＤ型アミノ酸である。特に好ましいある実施態様では、基本的に全ての鏡像異性アミノ酸がＤ型アミノ酸である。
【００８９】
保護基
ある種の実施態様では、構成アミノ酸および／または末端アミノ酸の１つまたは２つ以上のＲ基は保護基で封鎖されている。特定の理論に拘束されないが、本発明のペプチドの特にアミノ末端および／またはカルボキシル末端の封鎖は経口投与による薬剤送達を極めて改善し、さらに血中半減期を顕著に高めるということは本発明の発見であった。
【００９０】
多くの保護基が前記の目的に適している。そのような保護基には、アセチル、アミドおよびアルキル基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにアセチル基およびアルキル基がＮ末端の保護に特に好ましく、アミド基はカルボキシル末端の保護に好ましい。特に好ましいある種の実施態様では、前記保護基には脂肪酸の場合のようなアルキル鎖、プロペオニル、フォルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。特に好ましいカルボキシル保護基には、アミド、エステルおよびエーテル形成保護基が含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。前記封鎖基はペプチドのらせん形成傾向を強化する。ある種の特に好ましい封鎖基には、種々の長さのアルキル基、例えば式、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−を有する基が含まれる。式中、ｎは約１から約２０、好ましくは
約１から約１６または１８、より好ましくは約３から約１３、もっとも好ましくは約３から約１０の範囲である。
【００９１】
特に好ましいある種の実施態様では、保護基には、脂肪酸の場合のようなアルキル基、プロペオニル基、フォルミル基および他の基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。特に好ましいカルボキシル保護基には、アミド、エステルおよびエーテル形成保護基が含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。前記封鎖基はペプチドのらせん形成傾向を強化する。ある種の特に好ましい封鎖基には、種々の長さのアルキル基、例えば式、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ−を有する基が含まれる。式中、ｎは約３から約２０、好ましくは約３から約１６、より好ましくは約３から約１３、もっとも好ましくは約３から約１０の範囲である。
【００９２】
他の好ましい保護基には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：Ｆｍｏｃ、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ），４，４−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメンチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）。
【００９３】
保護基／封鎖基は、本発明のペプチドを構成する適切な残基に前記のような基を結合させる方法と同様に当業者には周知である（例えば以下を参照されたい：Greene at al. (1991) Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd ed., John Wiley & Sons, Inc. Somerset, NJ）。ある好ましい実施態様では、例えばアセチル化は、合成中にペプチドが樹脂上に在るときに無水酢酸を用いて実施される。アミド保護は、そのような合成に適した樹脂を選択することによって達成できる。本明細書の実施例で述べるペプチド合成時にはリンクアミド樹脂が用いられた。合成が終了した後、酸性二官能基アミノ酸（例えばＡｓｐおよびＧｌｕ）および塩基性アミノ酸Ｌｙｓの半永久的保護基、Ｔｙｒのヒドロキシルは全て同時に除去される。前記のような樹脂から酸性処理を用いて遊離させたペプチドは、Ｎ末端がアセチルとして保護され、カルボキシル末端がＮＨ₂として保護され、さらに全ての他の保護基が同時に除去されて得られる。
【００９４】
Ｖ．ペプチド取り込みの強化
全てがＬアミノ酸のペプチド（例えばその他の点では本発明のペプチドの配列を有するもの）をＤ型（すなわち本発明のペプチド）と一緒に投与したとき、前記Ｄ型ペプチドの取り込みが増加するということもまた、本発明の驚くべき発見であった。したがって、ある種の実施態様では、本発明は、Ｄ型およびＬ型ペプチドを組み合わせて本発明の方法で用いることを含む。前記Ｄ型ペプチドおよびＬ型ペプチドは異なるアミノ酸配列を有することができるが、好ましい実施態様では、それらはともに本明細書に記載するペプチドのアミノ酸配列を有し、さらに好ましい実施態様では、それらは同じアミノ酸配列を有する。
【００９５】
本発明のクラスＡ両親媒性ペプチドのコンカテマーもまたアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の緩和に有効であるということも本発明の発見であった。前記コンカテマーを含むモノマーを直接一緒に結合させるか、またはリンカーによって結合させてもよい。ある種の実施態様では、前記リンカーはアミノ酸リンカー（例えばプロリン）、またはペプチドリンカー（例えばＧｌｙ₄Ｓｅｒ₃）である。ある種の実施態様では、前記コンカテマーは２量体、より好ましくは３量体、さらに好ましくは４量体、もっとも好ましくは５量体、８量体または１０量体である。
【００９６】
ＶＩ．医薬製剤
本発明の方法を実施するために、本発明の１つもしくは２つ以上のペプチドまたはペプチド摸倣体を、例えばアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を有すると診断されたか、またはアテローム性硬化症のおそれがあると診断された個体に投与する。前記ペプチドまたはペプチド摸倣体はその“元々の形態”で投与してもよいし、所望の場合には塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などの形態で投与してもよい。ただし、前記塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体は薬理学的に適切であること、すなわち本方法で有効であることを条件とする。活性物質の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、および他の誘導体は、合成有機化学分野の業者にとって周知であり、さらに例えば下記文献に記載されている標準的な方法を用いて製造することができる：March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanism and Structure, 4^th Ed. NY. Wiley-Interscience。
【００９７】
例えば酸付加塩は、典型的には適切な酸との反応を伴う通常の方法を用いて遊離塩基から調製される。一般的には、薬剤の塩基形を極性有機溶媒、例えばメタノールまたはエタノールに溶解し、それに酸が添加される。生成された塩を沈澱させるか、またはより極性の小さい溶媒を添加して溶液から取り出すことができる。酸付加塩を製造するために適した酸には有機酸および無機酸の両方が含まれる。前記は、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などであり、後者は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などである。酸付加塩は、適切な塩基で処理することによって遊離塩基に再度変換することができる。活性物質の特に好ましい酸付加塩はハロゲン化塩、例えば塩酸または臭化水素酸で製造できるようなものである。逆に、前記ペプチドまたは摸倣体の塩基性塩調製物は、医薬的に許容できる塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなど）を用いて同様な態様で製造できる。特に好ましい塩基性塩にはアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩）および銅の塩が含まれる。
【００９８】
エステルの調製は、前記薬剤の分子構造内に存在しうるヒドロキシルおよび／またはカルボキシル基の機能化を必要とする。エステルは、典型的には遊離アルコール基［すなわち、式ＲＣＯＯＨ（式中Ｒはアルキル、好ましくは低級アルキル）のカルボン酸に由来する成分］のアシル置換誘導体である。エステルは、所望の場合は、通常の水素添加分解または加水分解によって遊離酸に再度変換することができる。
【００９９】
アミドおよびプロドラッグもまた、当業者に公知であるか、または適切な文献に記載されている技術を用いて製造できる。例えば、アミドは適切な反応物を用いてエステルから調製するか、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンとの反応によって無水物または酸塩化物から調製できる。プロドラッグは、典型的には、個体の代謝系によって改変されるまでは治療活性をもたない化合物を生じる成分を共有結合させて調製される。
【０１００】
本明細書で特定されるペプチドまたは摸倣体は、アテローム性硬化症および／またはその症状の予防的および／または治療的処置のために、非経口的、局所的、経口的、経鼻的（また別には吸入）、直腸、末梢投与（例えばエアロゾルまたは経皮的）で有用である。本医薬組成物は、投与方法に応じて多様な個別投薬形態として投与できる。適切な個別投薬形態には、粉薬、錠剤、ピル、カプセル、舐剤、座薬、パッチ、鼻腔スプレー、注射剤、植え込み用徐放性製剤、脂質複合剤などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１０１】
本発明のペプチドおよび／またはペプチド摸倣体は、典型的には医薬的に許容される担体（賦形剤）と結合させて薬理学的組成物が生成される。医薬的に許容される担体は、１つまたは２つ以上の生理学的に許容される化合物、例えば組成物を安定化させるか、活性物質の吸収を増加もしくは低下させるために機能するものを含むことができる。生理学的に許容される化合物には、例えば炭水化物（例えばグルコース、シュクロースまたはデキストラン）、抗酸化物質（例えばアスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、保護および取り込み増進剤（例えば脂質）、活性物質のクリアランスおよび加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤および／または緩衝物質が含まれる。
【０１０２】
他の生理学的に許容できる化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤または特に微生物の増殖または作用を防止するために有用な保存料が含まれる。種々の保存料が周知であり、これらには例えばフェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。医薬的に許容される担体（生理的に許容される化合物を含む）の選択は、例えば活性物質の投与経路および活性物質の個々の生理化学的特性に左右されることは、当業者には理解されよう。
【０１０３】
賦形剤は、好ましくは無菌的であり、一般的には望ましくない物質を含まない。前記組成物は通常の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。
【０１０４】
治療のために用いる場合には、本発明の組成物はアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状をもつか、またはアテローム性硬化症のおそれのある患者に、前記疾患および／またはその合併症を治癒または少なくとも部分的に防止もしくは停止させるために十分な量で投与される。前記を達成するために適切である量は“治療的に有効な投与量”と定義される。前記の使用に有効な量は、前記疾患の重篤度および患者の一般的健康状態に左右されるであろう。必要とされる用量および頻度並びに患者が許容できる用量および頻度に応じて、組成物を単回または多数回投与することができる。いずれの事例でも、患者を効果的に治療（１つまたは２つ以上の症状を改善）するために、本発明の製剤の活性物質の十分量が組成物によって提供されねばならない。
【０１０５】
ペプチドおよび模倣体の濃度は広範囲に変動させることが可能で、選択される具体的な投与態様および患者の必要性にしたがって、原則として液体容積、粘度、体重などを基準に選択されるであろう。しかしながら、濃度は典型的には、約０．１または1ｍｇ／ｋｇ
／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で、さらに時にはそれよりも多い。典型的な用量は、約３ｍｇ／ｋｇ／日から約３．５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約３．５ｍｇ／ｋｇ／日から約７．２ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約７．２ｍｇ／ｋｇ／日から約１１．０ｍｇ／ｋｇ／日、もっとも好ましくは約1１．０ｍｇ／ｋｇ／日から約１５．０ｍｇ／ｋｇ
／日の範囲である。ある種の好ましい実施態様では、用量は約1０ｍｇ／ｋｇ／日から約
５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。前記の用量は、個々の対象者または対象群の治療計画を最適化させるために変動しうることは理解されよう。
【０１０６】
ある種の好ましい実施態様では、本発明のペプチドまたはペプチド摸倣体は、当業者に周知の標準的方法にしたがって経口的に（例えば錠剤により）、または注射物として投与される。他の好ましい実施態様では、ペプチドはまた、通常の経皮的薬剤送達系を用いて皮膚を通して送達することができる。前記はすなわち経皮“パッチ”であり、この場合活性物質は典型的には、皮膚に貼り付ける薬剤送達装置として機能する層状構造物内に含まれる。前記構造物では、薬剤組成物は、典型的には層内又は上側の裏打ち層の下にある“貯蔵部”に含まれる。この場合の“貯蔵部”という用語は、皮膚表面への送達のために最終的に利用可能なある量の活性成分を指すことは理解されよう。したがって、例えば“貯蔵部”はパッチの裏打ち層上の粘着物質内にまたは当業者に公知の多様な種々のマトリックス構成のいずれかの内部に活性成分を含むことができる。パッチはただ１つの貯蔵部を含んでいても、多数の貯蔵部を含んでいてもよい。
【０１０７】
ある実施態様では、前記貯蔵部は、薬剤送達の間、前記系を皮膚に固定するために機能する医薬的に許容される接触粘着物質のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触粘着物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には、薬剤含有貯蔵部および皮膚接触粘着物質は分離した別個の層として存在し、貯蔵部の下に粘着物質が存在し、この場合には前記貯蔵部は、上記で述べたようなポリマーマトリックスであっても、液体もしくはヒドロゲル貯蔵部であっても、または他の何らかの形態をとってもよい。これらの層状物中の考案物の上側面として機能する裏打ち層は、好ましくは“パッチ”の基本構造成分として機能し、前記考案物にその高い柔軟性を提供する。前記裏打ち層のために選択された物質は、活性成分および含有される他のいずれの物質に対しても好ましくは実質的に非浸透性である。
【０１０８】
局所薬剤送達のための好ましい他の製剤には軟膏およびクリームが含まれるが、ただしこれらに限定されない。軟膏は半固形調製物で、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導体をベースにする選択した活性物質を含むクリームは、典型的には粘稠な液体または半固形乳液で、しばしば水中油または油中水である。クリームの基剤は典型的には水で洗浄可能で、油相、乳化剤および水相を含む。前記油相はまた時に“内部相”と呼ばれ、一般にワセリンおよび脂肪族アルコール（例えばセチルまたはステアリルアルコール）で構成され、水相は通常は油相の容積を越え（ただし必ずしもそうではないが）、一般に湿潤剤を含んでいる。クリーム製剤中の乳化剤は一般には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両親媒性界面活性剤である。使用される個々の軟膏またはクリーム基剤は、当業者には理解されるように、最適な薬剤送達を提供するものである。他の担体または賦形剤の場合のように、軟膏基剤は不活性で、安定で、非刺激性で、さらに非感作性でなければならない。
【０１０９】
典型的なペプチド製剤とは異なり、Ｄ型アミノ酸を含む本発明のペプチドは、経口的にさえも投与することが可能で、胃酸などによるタンパク質分解に対して防御する必要がない。それにもかかわらず、ある種の実施態様では、ペプチド送達は、保護的な賦形剤によって強化することができる。前記は、典型的には、酸加水分解および酵素加水分解に対して耐性を付与する組成物とポリペプチドの複合体形成によるか、または適切な抵抗性を有する担体（例えばリポソーム）にポリペプチドを包み込むことによって達成される。経口送達のためのポリペプチド保護手段は当分野で周知である（例えば、治療薬剤の経口送達のための脂質組成物を開示する米国特許第5,391,377号を参照されたい）。
【０１１０】
血中半減期の延長は、徐放性タンパク質“包装”系を使用することによって維持できる。前記のような徐放系は当業者には周知である。ある好ましい実施態様では、タンパク質およびペプチドのためのプロリース（ProLease）生物分解性微小球（microsphere）送達
系が用いられる（Tracy (1998) Biotechnol. Prog. 14:108; Johnson et al.(1996) Nature Med. 2:795; Herbert et al.(1998) Pharmaceut. Res. 15:357）。前記は、ポリマーマトリックス内にタンパク質を含む生物分解性ポリマー微小球で構成された乾燥粉末で、前記ポリマーマトリックスは、他の薬剤とともにまたは他の薬剤を含まずに乾燥製剤として混ぜ合わせることができる。
【０１１１】
プロリース微小球の製造方法は、タンパク質の完全性を維持しながら高いタンパク質封入効率を達成できるように特にデザインされている。前記方法は以下の工程から成る：（ｉ）薬剤溶液を安定化賦形剤とともに噴霧凍結乾燥させることによって、原料タンパク質から凍結乾燥タンパク質粒子を調製する；（ｉｉ）薬剤−ポリマー懸濁物を調製し、続いて超音波処理または均質化処理を実施して薬剤の粒子サイズを減少させる；（ｉｉｉ）液体窒素中に噴霧化することによって凍結薬剤−ポリマー微小球を製造する；（ｉｖ）エタノールでポリマー溶媒を抽出する；（ｖ）ろ過および真空乾燥を実施し最終的な乾燥粉末

生成物を製造する。得られた粉末は固形のタンパク質を含み、前記タンパク質は多孔質のポリマー粒子内に均一に固定されて分散している。前記方法でもっとも一般的に使用されるポリマー、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）は生体適合性および生物分解性の両方を有する。
【０１１２】
封入化は低温（例えば−４０℃）で達成できる。封入時に、前記タンパク質は水の非存在下で固体で維持され、したがって水によって誘発されるタンパク質のコンフォーメーション移動度を最小にし、反応物質として水を含むタンパク質分解反応を防止し、さらにタンパク質が変性を受ける有機相−水相境界面を回避できる。好ましい方法では、タンパク質が不溶で、したがって高い封入効率（例えば９５％を越える）を得ることができる溶媒が使用される。
【０１１３】
別の実施態様では、１つまたは２つ以上の成分溶液が、“濃縮物”として例えば直ぐに希釈できるように（例えば予め測定した容積で）保存容器内で、または一定の容積の水に直ぐに添加できる可溶性カプセルとして提供することができる。
【０１１４】
前述の製剤および投与方法は例示を目的としており、制限を意図するものではない。本明細書に提供した開示を用いて、他の適切な製剤および投与態様が容易に考案されることは理解されよう。
【０１１５】
ＶＩＩ．脂質ベース製剤
ある種の実施態様では、本発明のペプチドは１つまたは２つ以上の脂質と一緒に投与される。前記脂質は、ペプチドの保護および／または輸送／取込みの強化のための賦形剤として製剤化してもよいし、または前記脂質は別々に投与してもよい。
【０１１６】
特定の理論に拘束されないが、ある種のリン脂質の投与（例えば経口投与）は顕著にＨＤＬ／ＬＤＬ比を増加させることができるということは本発明の発見であった。さらに、ある種の中等度の長さのリン脂質は、一般的脂質輸送とは異なるプロセスによって輸送されると考えられる。したがって、ある種の中等度の長さのリン脂質を本発明のペプチドと一緒に同時投与することによって多くの利点が付与される。すなわち、それらは、消化または加水分解からリン脂質を保護し、ペプチドの取込みを改善し、ＨＤＬ／ＬＤＬ比を改善する。
【０１１７】
前記脂質は本発明のポリペプチドを封入するリポソームに成形してもよいし、および／または前記脂質は本発明のポリペプチドと単純に複合体化／混合してもよい。リポソームの製造方法および試薬の封入方法は当業者に周知である（例えば以下の文献を参照されたい：Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem., 257:286-288; Papahadjapoulos
et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11460-11464; Huang et al.(1992) Cancer Res., 52:6774-6781; Lasic et al.(1992) FEBS Lett., 312:255-258など）。
【０１１８】
これらの方法で使用される好ましいリン脂質は、ｓｎ−１およびｓｎ−２の位置に約４炭素から約２４炭素の範囲の脂肪酸を有する。ある種の実施態様では、脂肪酸は飽和されている。他の好ましい実施態様では、脂肪酸は不飽和でもよい。種々の好ましい脂肪酸は表２に示されている。
表２：Ｄポリペプチドの投与に好ましいリン脂質のｓｎ−１および／またはｓｎ−２位の好ましい脂肪酸

【０１１９】
前記の位置の脂肪酸は同じでも異なっていてもよい。特に好ましいリン脂質はｓｎ−３位にホスホリルコリンを有する。
【０１２０】
ＶＩＩＩ．追加的な薬理学的に活性な物質
追加的な薬理学的に活性な物質は、前記主要活性物質、例えば本発明のペプチドとともに送達することができる。ある実施態様では、そのような活性な物質にはアテローム性硬化症および／またはその合併症発生のおそれを減少させる物質が含まれるが、ただしこれに限定されない。前記物質には、ベータブロッカー、ベータブロッカーとチアジド利尿剤の組み合わせ、スタチン、アスピリン、ＡＣＥインヒビター、ＡＣＥレセプターインヒビター（ＡＲＢ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２１】
適切なベータブロッカーには、心選択性剤（選択性ベータブロッカー）、例えばアセブトール（セクトラール（登録商標）（Sectral））、アテノロール（テノルミン（登録商
標）（Tenormin））、ベータキソロール（カーロン（登録商標）（Kerlone））、ビソプ
ロロール（ゼベタ（登録商標）（Zebeta））、メトプロロール（ロプレッサー（登録商標）（Lopressor））などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な非選択性ブ
ロッカー（ベータ１およびベータ２を等しく遮断する）には、カーテオロール（カルトロール（登録商標）（Cartrol））、ナドロール（コルガード（登録商標）（Corgard））、ペンブトロール（レバトール（登録商標）（Levatol））、ピンドロール（ビスケン（登
録商標）（Visken））、プロプラノロール（インデラール（登録商標）（Inderal））、
チモロール（ブロッカドレン（登録商標）（Blockadren））、ラベタロール（ノルモダイン（登録商標）（Normodyne）、トランデート（登録商標）（Trandate））などが含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。
【０１２２】
適切なベータブロッカーとチアジド利尿剤の組み合わせには、ロプレッサーＨＣＴ、ＺＩＡＣ、テノレチック（Tenoretic）、コルジド（Corzide）、チモリド（Timolide）、インデラル（Inderal）ＬＡ４０／２５、インデリド（Inderide）、ノルモジド（Normozide）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２３】
適切なスタチンには、プラバスタチン（プラバコール（Prabachol）／Bristol-Meyers Squibb）、シムバスタチン（ゾカー（Zocor）／Merck）ロバスタチン（メバコー（Mevacor）／Merck）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２４】
適切なＡＣＥインヒビターには、カプトプリル（例えばカポテン（登録商標）（Capoten）、Squibbから）、ベナゼプリル（例えばロテンシン（登録商標）（Lotensin）、Novartisから）、エナラプリル（例えばバゾテック（登録商標）（Vasotec）、Merckから）、フォシノプリル（例えばモノプリル（登録商標）（Monopril）、Bristol-Meyersから）、リシノプリル（例えばプリニビル（登録商標）（Prinivil）、Merckから、またはゼストリル（登録商標）（Zestril）、Astra-Zenecaから）、キナプリル（例えばアキュプリル（登録商標）（Accupril）、Parke-Davisから）、ラミプリル（例えばアルテース（登録商標）（Altace）、Hoechst Marion Roussel、King Pharmaceuticalsから）、イミダプリル、ペリンドプリルエルブミン（例えばアセオン（登録商標）（Aceon）、Rhone-PoulencRorerから）、トランドラプリル（例えばメービック（登録商標）（Mavik）、Knoll Pharmaceuticalから）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なＡＲＢＳ（ＡＣＥレセプターブロッカー）には、ロサルタン（例えばコザール（登録商標）（Cozaar）、Merckから）、イルベサルタン（例えばアバプロ（登録商標）（Avapro）、Sanofiから）、カンデサルタン（例えばアタカンド（登録商標）（Atacand）、Astra Merckから）、バルサルタン（例えばジオバン（登録商標）（Diovan）、Novartisから）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２５】
ＩＸ．アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善するキット
別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善するか、またはアテローム性硬化症のおそれがある対象（ヒトまたは動物）を予防的に処置するキットを提供する。前記キットは、好ましくは、本発明の１つまたは２つ以上のペプチドまたはペプチド摸倣体を収納した容器を含む。前記ペプチドまたはペプチド摸倣体は個別投薬形態（例えば座薬、錠剤、カプセル、パッチなど）で提供することができ、および／または場合によって１つまたは２つ以上の医薬的に許容できる賦形剤と結合させてもよい。
【０１２６】
前記キットは、場合によってさらに、心疾患および／またはアテローム性硬化症の治療で使用される１つまたは２つ以上の他の薬剤を含んでもよい。前記薬剤には、例えば上記で述べたようなベータブロッカー、血管拡張剤、アスピリン、スタチン、ＡＣＥインヒビターまたはＡＣＥレセプターインヒビター（ＡＲＢ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２７】
さらに、前記キットは場合によって標識物質および／または指示用物質を含む。後者は、本発明の“治療薬”または“予防薬”の実施方法または使用についての説明を提供する。好ましい指示用物質は、本発明の１つまたは２つ以上のポリペプチドを使用して、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を緩和し、および／またはアテローム性硬化症のおそれがある個体で前記の１つまたは２つ以上の症状の開始または進行を予防することについて説明する。前記指示用物質はまた、場合によって好ましい用量／治療計画、対比指示などについて説明することができる。
【０１２８】
前記指示物質は典型的には手書きまたは印刷物質を含むが、指示物質はそのようなものに限定されない。前記の指示を保存し、さらに末端ユーザーにそれらを伝達することができる任意の媒体が本発明に包含される。前記媒体には、電子記録媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）などが含まれるが、ただしそれらに限定されない。前記媒体には前記指示物質を提供するインターネットのサイトのアドレスを含むことができる。
【０１２９】
以下の実施例は本発明の説明のために提供され、本発明の請求の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【０１３０】
実施例１
いくつかの合成クラスＡペプチド類似体が、ヒトアポＡ−Ｉの多くの特性と類似する特性をin vitroで提示することが示された。本実施例では、両親媒性が強化された新規なペプチド（５Ｆ）が、アテローム性硬化症誘発飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２０μｇ／日で１６週間腹腔内に注射された。マウスアポＡ−Ｉ（ＭｏＡＩ）（５０μｇ／日）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）注射をコントロールとして他のマウスに実施した。総血中コレステロールレベルおよびリポタンパク質プロフィルは前記処置群とコントロール群とで顕著には相違しなかったが、ただし５ＦまたはＭｏＡＩを投与したマウスでは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）−コレステロールは、総コレステロールのパーセントとして計算したとき低かった。
【０１３１】
注射物質に対する毒性または抗体の生成は観察されなかった。５Ｆを注射した動物からＬＤＬを採取し、これをヒト動脈壁細胞にin vitroで与えたとき、前記ＬＤＬは、コントロールから採取したＬＤＬよりも少ない脂質過酸化水素およびＬＤＬ誘発走化性活性をもたらした。さらに、５Ｆを注射したマウスからＨＤＬを採取し、これをヒトＬＤＬと一緒にヒト動脈壁細胞にin vitroで与えたとき、脂質ヒドロペルキシド生成は大幅に少なく、さらにＬＤＬ誘発単球走化性活性は大幅に低かった。ペプチド５Ｆを投与されたマウスの大動脈アテローム病巣面積は、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して顕著に小さかった。ＭｏＡＩを投与されたマウスの病巣面積はＰＢＳ注射動物のそれと類似していた。我々は、５Ｆはアテローム性硬化症の予防および治療に有効であると結論した。
【０１３２】
材料と方法
ペプチド
ペプチド５Ｆ（Ａｃ−１８Ａ［ＡｓｐＴｒｐＬｅｕＬｙｓＡｌａＰｈｅＴｙｒＡｓｐＬｙｓＶａｌＰｈｅＧｌｕＬｙｓＰｈｅＬｙｓＧｌｕＰｈｅＰｈｅ］−ＮＨ₂）を固相ペプ
チド合成によって合成した（例えば以下を参照されたい：Anantharamaiah & Garber (1996) Meth. Enzymol. 263:267-282; Palgunachari et al.(1996) Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology 16:328-338）。前記合成ペプチドの純度は分析用ＨＰＬＣおよびイオンスプレー質量分析法によって確定した。前記ペプチドは蒸留水に対して透析し、使用前に凍結乾燥させた。
【０１３３】
ＭｏＡＩは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血漿から単離した［ＥＤＴＡ血漿は業者（Harlan Bioproducts for Science, Indianapolis, IN）から購入した］。ＭｏＡＩは、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラフィーの組み合わせを用いて単離した。簡単に記せば、ＫＢｒを添加して血漿密度を１．２１ｇ／ｍＬに調節し、５００００ｒｐｍで２４時間、４℃で遠心沈澱を実施した（Ｔｉ７０ローター；Beckman, Fullerton, CA ）。上部分画を採集し水に対して透析してＫＢｒを除去し、凍結乾燥させて脱脂した。ペレットはＧｎ：ＤＴＴ：トリス溶液（３Ｍ塩酸グアニジン、１ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭトリス；ｐＨ＝８．０）に溶解し、続いて同じ溶液に対して１２０００ＭＷカットオフ透析チューブを用いて透析し、サンプルからアポＡ−ＩＩおよびＣアポリポタンパク質の大半を除去した。続いて前記サンプルを水に対して透析し凍結乾燥させた。ペレットは新鮮なＧｎ：ＤＴＴ：トリス溶液に溶解し、タンパク質をサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって分離した。カラムはＸＫ２６／１００カラム（２．６×１００ｃｍ）を使用し、バルクフェース・スーパーロース１２（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を充填し、Ｇｎ：ＤＴＴ：トリス溶液で平衡化させた。流速は０．５ｍＬ／分で、２．５ｍＬで分画を採集した。アポＡ−Ｉピークに一致する分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、さらに調製用Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣによって精製した（Anantharamaiah
& Garber (1996) Meth. Enzymol. 263:267-282）。
【０１３４】
マウス
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）を用いて全実験を行った。マウスは６週齢で購入し、食餌実験は８週齢のマウスを用いて開始した。代謝回転実験では体重が２０から２２グラムのマウスを用いた。全ての動物実験は、当該大学（University of Alabama, Birmingham）の動物管理および使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の事前検査を受け承認された。
【０１３５】
消長動態実験
５Ｆペプチド、ＭｏＡＩおよびヒトアポＡ−Ｉを文献（Bilheimer et al.(1972) Biochim. Biophys. Acta 260:212-221）の方法によって¹²⁵Ｉで標識した。マウスに改変トーマス・ハートロフト（Thomas-Hartroft）アテローム性硬化症誘発飼料（#TD88051; Teklad, Madison, WI）を４週間与え、この時点で２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解したペプチドまたはタンパク質の毎日の腹腔注射を開始した。ＭｏＡＩまたはヒトアポＡ−Ｉ（５０μｇ／動物）を注射した動物、５Ｆ（２０μｇ／動物）を注射した動物は本消長動態実験では絶食させず、血液サンプルはキシラジン：ケタミン麻酔下で後眼窩洞から注射後１５、３０、４５分後、および１、１．５、２、３、４、６、８、１２および２４時間後に採取した。
【０１３６】
各動物は異なる時点で３つの血液サンプルを提供し（全て後眼窩洞および交互の眼から入手）、さらに別個の動物から少なくとも３つのサンプルが各時点で採集された。サンプルはヘパリン添加毛細管に採集し、続いて微量遠心管に入れ、遠心により血漿を分離した。各サンプルから１０μＬを２組づつ放射能活性の測定のために取り、サンプルにつき１０分間のガンマ計測（Corba; Packard Instruments, Downers Grove, IL）に用いた。全血漿容積を体重の４．２％として計算した。各サンプルは、全血漿中の注射されたＣＰＭのパーセントとして表した。遊離¹²⁵Ｉはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱によって決定した（１０μＬの血漿サンプルにつき１０％ＴＣＡを１ｍＬ）。消長動態モデルへの当てはめは、各時点での平均ではなく、全てのデータポイントを用いて実施した（ＰＫアナリスト（PKAnalyst）、MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT）。
【０１３７】
病巣実験のための注射プロトコルおよびサンプル採取
マウスは６週齢で入手し、任意に２０匹の群に分け（ただし処置を与えられないネガティブコントロール群は１０匹）、標準的なげっ歯類の固形飼料を与えた。８週齢で、処置群に改変トーマス・ハートロフトアテローム性硬化症誘発飼料（#TD88051; Teklad, Madison, WI）を与え、注射を開始した。前記飼料は４℃で保存し、脂質の酸化を最小限にするために製造日より３ヶ月を過ぎないものを使用した。動物に毎日１６週間腹腔内注射を施した（週末および休日を含む）。各群の２０匹のマウスに２００μＬのＰＢＳ（ポジティブコントロールとして）または２００μＬのＰＢＳ中の５Ｆ（２０μｇ）または２００μＬのＰＢＳ中のＭｏＡＩ（５０μｇ）を毎日注射した。
【０１３８】
凍結乾燥５Ｆペプチドをバイアルで調製した。各バイアルは１日の注射に十分なペプチドを含有していた。５ＦペプチドはＰＢＳ中で凍結乾燥させ、注射の日にオートクレーブしたミリＱ（Milli-Q）水（Millipore Corp., Bedford, MA）に溶解した。全群について注射容積を２００μＬ／マウス／日で維持した。
【０１３９】
血液サンプルは麻酔下で、実験開始時（食餌前）および器官採取時に後眼窩洞採血によって採取した。実験終了時（１６週）の最後の採血で心臓および肝臓を摘出した。心臓は血液を除去し、さらに心筋を弛緩させるため、０．９％食塩水溶液に約１時間保持した。前記器官を続いてリン酸緩衝４％ホルムアルデヒド中で切片作製まで少なくとも１週間固定した。肝臓は取り出し重量を測定した。
【０１４０】
組織学的評価
組織学的評価は文献の方法（Paigen et al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323）にいくつかの改変を加えて実施した。簡単に記せば、心臓をリン酸緩衝ホルムアルデヒド溶液中で少なくとも１週間固定した。心臓の下部２／３を除去し、残りの組織をＯＣＴ媒質体（Tissue-Tek, Miles Inc., Elkhart, IN）中で凍結し、−２０℃で低温槽中で切片を作製した。大動脈根の開始部について２０μｍ毎の切片をスライド上に確保し、観察した。続いて切片をさらに６００μｍ分採集するか、または大動脈の横断切片が円形化し弁の尖頭がもはや明瞭でなくなるまで切片を採集した。スライドをオイルレッドＯで染色し、さらにヘマトキシリンで対比染色した。染色した病巣の横断面積を８０μｍ離れた連続切片で画像分析（SigmaScan Pro, SPSS Scientific, Chicago, IL）で測定し、平均病巣面積を各大動脈洞について４００μｍ（５枚のスライド）の長さにわたって決定し、最大平均病巣面積を示した。
【０１４１】
混合培養、単球の単離、リポタンパク質の単離、脂質過酸化水素の測定、および単球走化性活性
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常なヒトドナーの血漿から超遠心沈澱によるリポタンパク質の単離およびマウス血漿からＦＰＬＣによるリポタンパク質の単離、並びに脂質過酸化水素および単球走化性活性の測定は、標準的な方法にしたがって実施した。全ての参加対象者は、ＵＣＬＡヒト対象保護委員会（UCLA Human Subjects Protection Committee）によって承認されたインフォームドコンセントを示した。マウスリポタンパク質を混合培養でテストするためのプロトコルはまた以下のように実施した：簡単に記せば、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらに賦形剤（ＰＢＳ）またはペプチド５Ｆ（２０μｇ／マウス／日）を注射したマウスの血漿からＬＤＬおよびＨＤＬをＦＰＬＣによって単離した。混合培養は、ヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍＬのＬＤＬタンパク質）、またはマウスＬＤＬ（２００μｇ／ｍＬ）、またはヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍＬ）＋ヒトＨＤＬ（３５０μｇ／ｍＬのＨＤＬタンパク質）もしくはマウスＨＤＬ（３００μｇ／ｍＬ）、またはマウスＨＤＬ（３００μｇ／ｍＬ）単独で処理した。前記混合培養を上記添加物とともにまたは上記添加物を含まずに８時間３７℃で１０％のリポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ）の存在下でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化水素同等物について分析した。続いて混合培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない新しい培養液でさらに８時間インキュベートした。この調整培養液を採集し、単球走化性活性について分析した。
【０１４２】
化学的および分析的方法：カラムコレステロールリポタンパク質プロフィル（ＣＬｉＰ）
血漿コレステロールリポタンパク質プロフィルは、我々が最近開発したＣＬｉＰ法（Garber et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1020-1026）を用いて測定した。簡単に記せば、５から１０μＬの血漿を１回のスーパーローズ（Superose）６（Pharmacia, Piscataway NJ）カラムを用いて分析した。カラムの直ぐ後でコレステロール試薬をＴ字型混合装置から導入し、溶出剤：試薬混合物はポストカラム反応コイルに入れた。溶出剤混合物中のコレステロール含有量は分光光度法によって５００ｎｍで検出し、検出値はコンピュータに採集した。得られたプロフィルは成分ピークに分解し、ピークフィット（PeakFit, SPss Science, Chicago, IL）を用いて相対面積を分析した。総コレステロールに対する絶対コレステロール値および各成分ピークは、既知の値をもつコントロールサンプルとの比較によって決定した。いくつかの事例では、分画を採集し放射能活性の分布を決定した。ＣＬｉｐ法は、プールしたサンプルを使用することなく個々のマウスサンプルを分析することを可能にした。
【０１４３】
抗体の検出
ペプチドを毎日注射することによって何らかの免疫反応をマウスで誘発するか否かを決定するために、器官採集時にマウスから採取した血漿（１６日間の毎日の注射の後）を用いて間接ＥＬＩＳＡ力価測定（Engvall (1980) Meth. Enzymol. 70:419-439）を実施した。注射に用いたペプチドまたはＭｏＡＩ（１０μｇ／ｍＬ）でプレートを被覆し、一晩インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ８．２）で完全に洗浄し、緩衝液（ホウ酸緩衝液中の０．１％ゼラチンおよび０．１％ＢＳＡ）で１時間ブロックした後、２００μＬの希釈マウス血漿（１：１００希釈）サンプルをホウ酸緩衝食塩水で段階的に１：１で希釈した。マウスＩｇＧに対するビオチン付加ヤギ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を続いてウェルに添加し、さらにＳＡ−ＨＲＰ（ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ）で１時間処理し、さらにＡＢＴＳおよび過酸化物を基質として用いて反応を進行させた。抗原／抗体のそれぞれの添加後には、プレートを一晩室温でインキュベートし、さらに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ８．２）で完全に洗浄し、次の添加の前に１時間緩衝液（ホウ酸緩衝液中の０．１％ゼラチンおよび０．１％ＢＳＡ）でブロックした。
【０１４４】
統計的方法
処置群を２テール（two-tailed）ｔ−検定または変数の一方向分析（この場合データは正常に分布していた）によって比較するか、または階層上の変数（variance on ranks）
の一方向分析（SigmaStat; SPSS Science, Chicago, IL）によって比較した。インプット速度およびアウトプット速度が等しくないと仮定するファーストオーダー・ワンコンパートメント・キネティックモデル（PKAnalyst; MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT）へのあてはめによって、ペプチドまたはタンパク質の代謝回転の消長動態を分析した。
【０１４５】
結果
消長動態実験
腹腔内注射の後、マウスの血漿からペプチド５Ｆ並びにヒトおよびマウスのアポＡ−Ｉが浄化除去される動態は表３に要約されている。
【０１４６】
表３：消長動態実験から得られた適合度検定データの要約

【０１４７】
表示のデータは、インプット速度およびアウトプット速度が等しくないと仮定するファーストオーダー・ワンコンパートメント・キネティックモデル（PKAnalyst; MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT）に対する適合検定データの結果を示している。略語：Ｔ１／２＝血漿から浄化除去される半減期；血漿中の最大％＝全血漿中に見出される注射された投与量のピークレベルのパーセント；ｒ²＝前記キネティックモデルの統計適合度
ヒトおよびマウスアポＡ−Ｉは、５Ｆペプチドと比較して非常に長いクリアランスを示した。ヒトアポＡ−Ｉおよび５Ｆは、マウスアポＡ−Ｉよりもピーク血漿レベルまでの時間が長かったが、ただし達成されたピークレベルはほぼ類似していた（ヒトアポＡ−Ｉは他の物質よりも高いピークレベルに達した）。カラムクロマトグラフィーによる血漿サンプルの分析によって、ペプチド５ＦおよびアポＡ−Ｉ（ヒトおよびマウスの両方）は血漿リポタンパク質（特にＨＤＬサイズ領域の粒子）と結合することが示された（図６）。５Ｆの注射後１．５時間のペプチド放射能活性のＨＤＬ：ＶＬＤＬ比は４．１９±０．５８（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）であった。同様な結果が５Ｆの注射後５時間で見出された（６．４４±１．１０、ｐ＜０．０２）。注射されたペプチドは開始時３％未満の遊離¹²⁵ＩをＴＣＡ沈澱によって示した。しかしながら注射後１．５時間で、全溶出放射能活性のパーセントとして表される血漿中の遊離¹²⁵Ｉの放射能活性は５Ｆについて増加し２６．９±９．４％で、５時間で３４．４±４．８％であった。これは、リポタンパク質およびリポタンパク質結合ペプチドの予想されたクリアランスを示している。遊離ヨウ素による１．５時間から５時間の放射能活性の増加速度は、注射から１．５時間までのそれよりも小さく、おそらく腹腔内での開始時の顕著なペプチド分解を示唆しているのであろう。
【０１４８】
固形飼料またはアテローム性硬化症誘発飼料による生存度および全体的形態
長期間の食餌実験中に理由が不明の原因によって死亡したマウスは３匹のみであった。前記動物のうち２匹はＭｏＡＩを与えられ、１匹は５Ｆペプチドを与えられた。器官採取時には全体的な形態学的相違は群の間で認められなかった。肝臓はアテローム性硬化症誘発飼料を与えられた全ての動物で増大したが、肝重量においても体重の百分率として表される肝重量においても群間で相違は認められなかった（表４）。アテローム性硬化症誘発飼料を与えた全動物（ＰＢＳ注射動物を含む）の体重は、固形飼料を与えたコントロールよりも軽かった（表４）。
【０１４９】
表４：処置後の体重および肝重量

【０１５０】
表示のデータは、器官採集時（処置の１６週間後）に得られた重量の平均±ＳＥＭである。固形飼料を与えた動物には注射しなかった。他のマウスは、方法の項に記載したようにアテローム性硬化症誘発飼料を与えられた。ＰＢＳ群は、２００μＬのリン酸緩衝食塩水を毎日腹腔内に注射した。５Ｆ群は２００μＬのＰＢＳ中の５Ｆ（２０μｇ）を、ＭｏＡＩ群は２００μＬのＰＢＳ中のＭｏＡＩ（５０μｇ）を毎日腹腔内に注射した。*５Ｆについてはｐ＜０．０５；２テールｔ検定。
【０１５１】
抗原性
前記ペプチドに対する抗体の存在について、１６週の注射期間の終了時に採取した血液サンプルを調べた。ペプチド５ＦまたはＭｏＡＩ（データは示されていない）に対する抗体は検出されなかった。一連の動物に注射していないペプチドでＥＬＩＳＡプレートを被覆した交差実験で得られた結果は、抗体の有無について前記直接的測定で示された結果と本質的に同一であった（データは示していない）。
【０１５２】
リポタンパク質およびアポリポタンパク質の特性
ＣＬｉｐ法で決定した総コレステロール値およびリポタンパク質コレステロール値は表３に示されている。総コレステロール値の正確さは手作業でのコレステロールアッセイ（Cholesterol 1000; Sigma, St.Louis, MO）によって確認された（データは示されていない）。総コレステロール値またはリポタンパク質分画コレステロール値について処置群の間に顕著な相違は認められなかった。しかしながら、リポタンパク質分画を総コレステロールのパーセントとして表した場合（表５）、ＨＤＬ−コレステロールは、ＰＢＳ群と比較して５Ｆ群およびＭＯＡＩ群で極めて低い百分率を構成した。
【０１５３】
表５：固形飼料およびアテローム性硬化症誘発飼料で１６週間後の総コレステロールレベルおよびリポタンパク質コレステロールレベル（ｍｇ／ｄｌおよび総コレステロールのパーセント）

【０１５４】
データは、平均ｍｇ／ｄｌ±ＳＥＭとして、さらに括弧内には総コレステロールのパーセントとして表されている。略語：ＶＬＤＬ＝超低密度リポタンパク質；ＩＤＬ＝中間密度リポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質；ＴＣ＝総コレステロール；ＭｏＡＩ＝マウスアポＡ−Ｉ；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水。固形飼料を与えた動物には注射を施さなかった。他のマウスは、方法の項に記載したようにアテローム性硬化症誘発飼料で飼育された。ＰＢＳ群には２００μＬのＰＢＳを毎日腹腔に注射した。５Ｆ群には２００μＬのＰＢＳ中の５Ｆ（２０μｇ）を毎日腹腔に注射した。ＭｏＡＩ群には２００μＬのＰＢＳ中のＭｏＡＩ（５０μｇ）を毎日腹腔に注射した。動物の数は表４に示されている。
*２テールｔ検定によりＰＢＳ群と比較した場合ｐ＜０．０５またはそれ未満。
【０１５５】
マウスリポタンパク質とヒト動脈壁細胞との相互作用
我々は最近、正常なＨＤＬは穏やかに酸化されたＬＤＬの生成で３つの工程を抑制することを発見した。これらの実験（同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願）で、我々は、ヒトＬＤＬをin vitroでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ摸倣ペプチド（３７ｐＡ）で処理することによって、ＬＤＬからＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むシーディング分子が除去されることを示した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培養がＬＤＬを酸化する能力をもつために、さらにＬＤＬに動脈壁細胞の単球走化性活性の産生を誘発させるために必要であった。我々はまた、アポＡ−Ｉのマウスへの注射後またはヒトへの輸液後に前記マウスまたはヒト実験協力者から単離したＬＤＬはヒト動脈壁細胞による酸化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しないことを示した。図７は、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにＰＢＳを注射した本実験のマウスから得たＨＤＬは、ヒトＬＤＬの酸化を抑制することができず（図７Ａ）、さらにヒト動脈壁混合培養でＬＤＬ誘発単球走化性活性を抑制できない（図７Ｂ）ことを示している。対照的に、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにペプチド５Ｆを注射したマウスのＨＤＬは、正常なヒトＨＤＬと同程度に、ヒトＬＤＬの酸化の抑制および混合培養でのＬＤＬ誘発単球走化性活性の防止に有効であった。図７はまた、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにＰＢＳを毎日注射したマウスから採取したＬＤＬは、同じ飼料を与えたが２０μｇのペプチド５Ｆを毎日注射したマウスから採取したＬＤＬよりも容易に酸化され、より容易に単球走化性活性を誘発することを示している。いずれのリポタンパク質で処理した動脈壁細胞にも細胞毒性は観察されなかった（データは示されていない）。同様な結果が３つの別個の実験（データは示されていない）の全てで得られた。
【０１５６】
病巣の形成
平均病巣横断面面積は図８に提示されている。予想したように、通常のマウスの固形飼料を与えた群では病巣は観察されなかった（データは示されていない）。以前に報告されたように（Paigen et al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323）、病巣面積における顕著なばらつきがアテローム性硬化症誘発飼料を与えた全ての群で観察された。しかしながら、２テールｔ−検定（ｐ＜０．００２）で解析するか、または階層上の変数（variance on ranks）の一方向分析（ｐ＜０．００１；平均病総面積の分布が正常でないために決定した）で解析するかに関係なく、５Ｆを注射した動物は、ＰＢＳ注射動物よりも顕著に小さな平均病巣を有していた。ＭｏＡＩ注射では、ＰＢＳ注射と比較して病巣面積に相違は出現せず、病巣面積は、ｔ−検定（ｐ＜０．００２）および階層上の変数の一方向分析（ｐ＜０．００１）の両方で５Ｆ注射動物の場合よりも顕著に大きかった。
【０１５７】
考察
クラスＡ両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチドはリン脂質と結合することができ、ヒトアポＡ−Ｉに類似する多くの生物学的特性を示すことを以前に我々は明らかにした（３、８、１０、１４、１５、２０）。我々はまた、前記ペプチドが動物の静脈内に投与されたとき、それらは血漿リポタンパク質と結合することを示した（１１）。本実験は、理論的脂質親和性が高められた新規なペプチド５Ｆは、抗アテローム性硬化症の特性を有するという仮説を立証するために考案した。
【０１５８】
ここに提示した実験は、ペプチド５Ｆは腹腔注射の後血漿に入り、ＭｏＡＩとほぼ匹敵する（がヒトアポＡ−Ｉよりは低い）血漿レベルに達することを示した（表３および図６）。腹腔内注射後の５Ｆの血中半減期は、マウスまたはヒトアポＡ−Ｉのいずれよりも短かった。循環コレステロールの大半がアテローム性硬化症誘発飼料のＶＬＤＬ−、ＩＤＬ−およびＬＤＬ−サイズ領域に存在するという事実にもかかわらず、注射後、大半の５Ｆは、ＨＤＬ領域に見出された（図６）。
【０１５９】
血漿コレステロールレベルおよびその分布は、アテローム性硬化症誘発飼料を与えられ注射を受けた群間で顕著な相違は認められなかった（表５）。しかしながら、リポタンパク質分画が総コレステロールのパーセントとして表されたとき（表５）、ＨＤＬコレステロールは、ＰＢＳ群と比較して５Ｆ群およびＭｏＡＩ群で顕著に低いパーセンテージを構成した。
【０１６０】
正常なＨＤＬは穏やかに酸化されたＬＤＬの生成で３つの工程を抑制する。我々は、ヒトＬＤＬをin vitroでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドで処理することによって、ＬＤＬからＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むシーディング分子が除去されることを示した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培養がＬＤＬを酸化する能力をもつために、さらにＬＤＬに動脈壁細胞の単球走化性活性の産生を誘発させるために必要であった（同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を参照されたい）。我々はまた、アポＡ−Ｉのマウスへの注射後またはヒトへの輸液後に、前記マウスまたはヒト実験協力者からアポＡ−Ｉの注射／輸液後に単離したＬＤＬは、ヒト動脈壁細胞による酸化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しないことを示した。本実験では、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにＰＢＳを注射したマウスから得たＨＤＬは、ヒトＬＤＬの酸化を抑制することができず（図７Ａ）、さらにヒト動脈壁混合培養でＬＤＬ誘発単球走化性活性を抑制できなかった（図７Ｂ）。全く対照的に、同じアテローム性硬化症誘発飼料を与えたが、ペプチド５Ｆを注射したマウスのＨＤＬは、正常なヒトＨＤＬと同程度に、ヒトＬＤＬの酸化の抑制および混合培養でのＬＤＬ誘発単球走化性活性の防止に有効であった（図７）。アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらに５Ｆを注射したマウスから採取したＬＤＬは、同じ飼料を与えたがＰＢＳを注射したマウスから採取したＬＤＬよりも酸化は容易ではなく、さらに単球走化性活性の誘発も容易ではなかった（図７）。血液循環で５ＦはＬＤＬと相互作用し（ＨＤＬと結合する前または結合後に）、ＬＤＬの酸化およびＬＤＬ誘発単球走化性活性に必要なシーディング分子を、関連するペプチド３７ｐＡについて記載されたin vitroでの態様と同様な態様で除去するということが可能である（同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を参照されたい）。
【０１６１】
アテローム性硬化症誘発飼料を与え、ペプチド５Ｆを注射したマウスから得たＨＤＬおよびＬＤＬに対するヒト動脈壁細胞のin vitroでの反応は、５Ｆのin vivoでの保護作用
と一致する。総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＩＤＬ＋ＶＬＤＬ−コレステロールレベルの類似性、および総コレステロールのパーセントとしてのＨＤＬ−コレステロールの低さにもかかわらず、アテローム性硬化症誘発飼料を与え５Ｆを注射した動物は、顕著に低い病巣スコアを示した（図８）。これらの結果は他の研究者の結果（Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785）といくぶん類似する。前記研究者らは、高コレステロール血症が続いているにもかかわらず、アポＡ−Ｉ_Milanoは、アポＥ欠損マウスでアテローム性硬化症病巣の進行を防止することを見出した。
【０１６２】
ヒトアポＡ−Ｉを用いて動物でアテローム性硬化症を防止／軽減できた（Wilson et al.(1988) Arteriosclerosis 8:737-741; Rubin et al.(1991) Nature 353:265-267; Pazty et al.(1994) J. Clin. Onvest. 94:899-903; Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785）が、前記実験で一日５０μｇの用量のＭｏＡＩの注射では成功しなかった理由は明らかではない。ＭｏＡＩは、ヒトアポＡ−Ｉのように安定なタンパク質：脂質複合体を形成しないことが示されている（Gong et al.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342）。マウスＨＤＬはまた、ヒトＨＤＬよりもいっそう容易に塩酸グアニジンによって変性することが示され（Gong et al.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342）、両親媒性らせんペプチドは、ヒトＨＤＬからヒトアポＡ−Ｉを除去するよりもいっそう容易にマウスＨＤＬからＭｏＡＩを除去する可能性が示唆される。これらの相違は、ＭｏＡＩが本実験で病巣を顕著には減少させなかったことの説明になるかもしれない。さらにまた、我々が用いた条件下ではさらに高用量のＭｏＡＩが必要である可能性もある。いずれの場合にも、５Ｆペプチドはこれらの条件下で非常に有効であったが、ＭｏＡＩは有効ではなかった。
【０１６３】
注射プロトコル終了時の血漿のＥＬＩＳＡ分析によって、５Ｆペプチドに対する抗体は生成されないことが示された。これらのペプチドはおそらく免疫反応を誘発するために必要なエピトープの露出が妨げられた状態で脂質と結合しているため、脂質結合ペプチドは抗体を生じないことが示されたということから考えると、このことは驚くに当たらない（Muranishi (1997) J. Pharm. Soc. Japan 117:394-404; Fricker & Drewer (1996) J. Peptide Sci. 2:195-211）。
【０１６４】
我々が実施した予備的実験は、本実験で用いたペプチドよりも理論的に低い脂質親和性を有するクラスＡ両親媒性らせんペプチド（３７ｐＡ）を発現する遺伝子導入マウスは、アテローム性硬化症に対して抵抗性をもつ可能性を示唆した（Garber et al.(1997) Circulation 96:I-490）。これまでの実験は、ペプチド５Ｆは、アテローム性硬化症誘発に必要なメカニズムを解明するために大きな可能性を有し、さらにまた治療のための潜在能力も有することを示唆している。
【実施例２】
【０１６５】
実施例２
Ｄペプチドの有効性
本実施例は本発明のＤペプチドの有効性を明示する。ヒト大動脈壁混合培養を、培養液単独（図では、ＬＤＬ、無細胞または細胞有り、ＬＤＬ無し）、健常対象者由来コントロールＬＤＬ２５０μｇ／ｍＬ（図ではＬＤＬ）およびＬＤＬ＋健常対象者由来コントロールＨＤＬ３５０μｇ／ｍＬ（図では＋ＨＤＬ）とともにインキュベートした。他の混合培養はコントロールＬＤＬと、種々の量の（横座標に示したμｇ）のＤ−２ＦもしくはＬ−２Ｆ（左から３番目の図、２Ｆ）、またはＤ−３７ｐＡもしくはＬ−３７ｐＡ（右側の最後の図、３７ｐＡ）とともにインキュベートした。データは４つの混合培養から得た値の平均±ＳＤを示す。ＨＤＬおよびペプチド添加の値は、ｐ＜０．０１のレベルでＬＤＬ単独（左側の最初の図）の場合といずれも顕著な相違を示した。
【０１６６】
混合培養は、１０％のＬＰＤＳの存在下で３７℃で4時間インキュベートされ、穏やか
に酸化されたＬＤＬを生じた。続いて上清を廃棄し、混合培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない培養液でさらに4時間インキュベートした。この調整培養液を集め、単球
の走化性活性について分析した。図9に示したように、ＬＤＬをＤペプチドでin vitroで処理することによって、動脈壁細胞によるそれらの酸化が防止された。
【０１６７】
図10は、Ｄペプチドをマウスに投与することによって赤血球細胞が溶血（ビタミンＥにより防止されることにより酸化による現象、データは示されていない）に対して抵抗性をもつことを示している。アテローム性硬化症病巣形成の動物モデルとして一般的に用いられるＬＤＬレセプター欠損マウス群（ｎ＝３）にＤ−ペプチドまたは食塩水担体を経管投与によって与えた。各動物に１００μＬの食塩水、１００μｇ／１００μＬのペプチドＤ−２ＦまたはＤ−３７ｐＡを投与した。１７および４８時間後に軽度の麻酔下で後眼窩洞から血液を採集した。赤血球を遠心沈澱によって分離し、ＰＢＳで１０％ヘマトクリットまで希釈し、穏やかに攪拌しながら３７℃でインキュベートした。部分標本をｔ＝０、２、６および１８時間の時点で取り出し、細胞ペレットを遠心沈澱させ、遊離ヘモグロビンによる光学密度を測定した。
【０１６８】
図１１は、経管投与でＤペプチドをマウスに投与し、続いてＬＤＬを単離することによって、単球走化性バイオアッセイで測定したときＬＤＬが動脈壁細胞酸化に抵抗性をもつことを示している。
【０１６９】
別の実験は、Ｄ−ペプチドは胃から吸収され、我々のヒト動脈壁混合培養モデルではＬＤＬが単球走化性活性を誘発できなくなるが、一方２ＦのＬ−ペプチドはこの特性をもたないことを示した。食塩水またはＤアミノ酸もしくはＬアミノ酸から合成した２Ｆを経管投与（管による胃への注入）によってマウスの胃に注入した。経管投与後、マウスから採血し、ＬＤＬを単離しヒト動脈壁細胞の混合培養に添加した。経管投与によって与えたときＤ−ペプチドはＬＤＬを保護し、これは、Ｄ−２Ｆペプチド（Ｄアミノ酸から合成された）を投与されたマウスから得たＬＤＬ（Ｄ２ＦＬＤＬ）によって誘発される単球走化性活性は低いが、Ｌ−２Ｆ（天然のＬアミノ酸から合成された）を投与されたマウスから得たＬＤＬ（Ｌ２ＦＬＤＬ）は単球走化性を容易に誘発したことによって立証されたとおりである（図１２を参照されたい）。
【０１７０】
ＬＤＬにin vitroで提示される場合は、Ｌアミノ酸から合成された２Ｆは、Ｄアミノ酸から合成された２Ｆと同じ程度に有効であった（図９参照）。したがって、ペプチドがin vivoで経管投与によって与えられる本実験の結果における相違は、Ｄアミノ酸から合成
された２Ｆは完全なままで胃から吸収され、一方、我々の仮説のとおり、天然のＬアミノ酸から合成された２Ｆペプチドは、消化過程において胃でおよび／または血漿中で分解されたことによると思われる。別の実験で、Ｄ−２Ｆペプチドに対する抗体生成の証拠は認められなかった。
【０１７１】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＬＤＬレセプターノックアウトマウスに５０μｇのＤ−５Ｆを経管投与で与えた実験から得られた２つのグラフである。動物から１．５、３または

６時間後に採血し、そのＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ／ＩＤＬを単離した。グラフに示したように、経管投与後１．５時間で採取したＨＤＬはコントロールＬＤＬを改変から保護しなかったが、経管投与の３時間後および６時間後より少し前に採取したＨＤＬは、コントロールＨＤＬと同じ程度でヒト動脈壁細胞によるＬＤＬ誘発単球走化性活性の産生に対して保護能力を示した（図13Ａ）。別のグラフ（図１３Ｂ）では、５０μｇのＤ−５Ｆの経管投与後１．５、３または６時間でマウスＬＤＬおよびＶＬＤＬ／ＩＤＬを単離した。左の図では、コントロールＬＤＬをヒト動脈壁細胞にコントロールＨＤＬとともにまたはコントロールＨＤＬを伴わずに添加し、動脈壁細胞によって生成される単球走化性活性を測定した。中央の図では、５０μｇのＤ−５Ｆの経管投与後１．５、３または６時間で採取したマウスＬＤＬが動脈壁細胞に添加された。結果は、３時間および６時間後のＬＤＬが誘発した単球走化性活性は顕著に低いことを示した。グラフの右側では、リポタンパク質のＶＬＤＬ／ＩＤＬ分画（図ではＶ／ＩＬＤＬ）が添加され、図に示されているように３時間では単球走化性活性の誘発は顕著に低かった。
【実施例３】
【０１７２】
実施例３
クラスＡ両親媒性らせんペプチドの物理化学的および生物学的特性に対する疎水性増加の影響
略語リスト
Ａｃ₂Ｏ＝無水酢酸；アポＡ−Ｉ＝アポリポたんぱく質Ａ−Ｉ；ＢＳＡ＝ウシ血清アル
ブミン；ＣＡＤ＝冠状動脈疾患；ＣＤ＝円偏光二色性；ＤＭＰＣ＝ジミリストイルホスファチジルコリン；ＤｉＰｏＰＥ＝ジ（１６：１）パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ＤＳＣ＝示差走査熱分析（Differential Scanning Calorimetry）；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸；ＥＰＣ＝卵黄ホスファチジルコリン；ＦＭＯＣ＝フルオリニルメチルオキシカルボニル；ＧｄｎＨＣｌ＝塩酸グアニジン；ＨＡＥＣ＝ヒト大動脈内皮細胞；ＨＡＳＭＣ＝ヒト大動脈平滑筋細胞；ＨＢＴＵ＝２−（Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＬＣＡＴ＝レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ；ＭＣＰ−１＝単球走化性タンパク質−１；Ｍ−ＣＳＦ＝マクロファージコロニー刺激因子；ＭＬＶ＝多層（multilamellar）小胞；ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルフォリン；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水；ＰＩＰＥＳ＝ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−エタンスルホン酸］；ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
要約
我々は最近、両親媒性が増強されたクラスＡ両親媒性ペプチド５Ｆは、食餌誘発性アテローム性硬化症からマウスを防御することを示した。我々は、現に存在する極性アミノ酸を系統的にフェニルアラニンで置換することによって、アテローム性硬化症抑制に関する物理的および機能的特性に対する一連のクラスＡ両親媒性ペプチド同族体（５Ｆを含む）の疎水性増強の影響を調査した。前記ペプチドは、配列Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ−ＮＨ₂（配列識別番号：１、Ａｃ−
１８Ａ−ＮＨ₂または２Ｆ）を基にして以下のとおりであった：３Ｆ³（Ａｃ−Ｆ³１８Ａ
−ＮＨ₂）、３Ｆ¹⁴（Ａｃ−Ｆ¹⁴１８Ａ−ＮＨ₂）、４Ｆ（Ａｃ−Ｆ^3,14１８Ａ−ＮＨ₂）、５Ｆ（Ａｃ−Ｆ^11,14,17１８Ａ−ＮＨ₂）、６Ｆ（Ａｃ−Ｆ^10,11,14,17１８Ａ−ＮＨ₂）、および７Ｆ（Ａｃ−Ｆ^{3,10,11,14,17}１８Ａ−ＮＨ₂）。水への溶解度、ＨＰＬＣ保持時間、卵黄ＰＣ単層膜中への浸透に対する排除圧（exclusion pressure）、および卵黄ＰＣ可溶化速度の測定によってペプチド４Ｆと５Ｆの間で突然疎水性が増加することが明らかになった。これは、リン脂質との結合能力増加を伴った。ペプチド６Ｆと７Ｆは影響がより少なく、これらのペプチドで脂質との相互作用の促進に対する疎水性増強の限界を示唆した。脂質親和性における前記の顕著な増強にもかかわらず、これらのペプチドは、血漿酵素、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化においてアポＡ−Ｉよりも有効性は低かった。すなわち、５ＦがＬＣＡＴをもっとも強く活性化し、それはアポＡ−Ｉの８０％であった。ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆは、ＬＤＬ誘発単球走化性活性の抑制に等しく有効であった。これらの実験は、ペプチド−ペプチドおよびペプチド−脂質相互作用間の適切なバランスが、両親媒性ペプチドの最適な生物学的活性に要求されることを示している。これらの実験は、アテローム性硬化症抑制能力が強化された小型アポＡ−Ｉ摸倣体のデザインのための理論的根拠を提供する。
【０１７３】
序論
高密度リポタンパク質およびアポＡ−Ｉ（ＨＤＬの主要なタンパク質構成成分）の血漿レベルは、冠状動脈疾患と反比例する（Sprecher et al.(1993) Arterioscler. Thromb. 13:495-504; Philips et al.(1993) Circulation 88:2762-2770）。ヒトアポＡ−Ｉは２４３残基のタンパク質で、２２量体の両親媒性らせんリピートを８つ含み、前記リピートの大半はクラスＡモチーフを有することが示された（Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-117; Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Epand ed.), CRC Press, Boca Raton, FL）。クラスＡ両親媒性らせんは特徴的な電荷分布を有する。すなわち、それらは、αらせんの極性／非極性境界に陽性荷電アミノ酸集団を、さらに極性面の中心に陰性荷電残基を有する（Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-117; Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Epand ed.), CRC Press, Boca Raton, FL; Segrest et al.(1992) J. Lipid Res. 33:141-166）。前記ユニークな二次構造モチーフは、アポＡ−Ｉの脂質結合特性に寄与していると説明されている（Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-117）。クラスＡ両親媒性らせんの合成類似体に関する多くの実験が前記の考えを支持した（Segrest er al.(1994) Adv. Prot. Chem., 45:303-369; Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim. Biophys. Acta 1256:103-129）。
【０１７４】
最近我々は、ヒトアポＡ−Ｉに存在する仮想の２２量体らせんの各々をモノマーおよびタンデムダイマーとして合成し、そのＮ−末端およびＣ−末端両親媒性らせんが最大の脂質結合能をもつことを示した（Mishra et al.(1998) Biochemistry 37:10313-10324）。
アポＡ−Ｉのエクソン４（４４−２４３残基）のＸ線結晶構造および分子モデリング研究によって、全長のアポＡ−Ｉ分子同士の結合状態が脂質の結合に必要であることが示唆された（Borhani et al.(1999) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 94:12291-12296; Segrest et al.(2000) Current Opin. Lipidol. 11:105-115）。このモデルでは、アポＡ−Ｉの２つの分子は頭−尾結合のダイマー形で配列され、１つのモノマーが互いに相互作用してアポＡ−Ｉの脂質結合構造を安定化させる。
【０１７５】
実験により得られた証拠は、冠状動脈疾患に対するアポＡ−ＩおよびＨＤＬの保護効果は、“逆コレステロール輸送”におけるそれらの役割によるものであろうということを示唆している（Fielding & Fielding (1995) J. Lipid Res. 36:211-228; Glomset (1968) J. Lipid Res. 9:155-167）。逆コレステロール輸送は、ＨＤＬ／アポＡ−Ｉを必要とする以下の３つの工程の合算である：ａ）ｘｘ細胞からのコレステロールの流出（Johnson et al.(1991) Biochim. Biophys. Acta.1085:273-298; Oram & Yokoyama (1996) J. Lipid Res. 37:2473-2491）、ｂ）ＨＤＬ結合コレステロールのＬＣＡＴによるエステル化（Fielding et al.(1972) Biochem. Biophys. Res. Comm. 46:1493-1498; Jonas (1991) Biochim. Biophys. Acta 1084:205-220）およびｃ）肝臓へのコレステロールエステルのレセプター介在輸送（Kreiger (1991) Ann. Rev. Biochem. 68:523-558）。In vivo実験によって、ヒトアポＡ−ＩおよびクラスＡ合成両親媒性らせんペプチドは、両方とも逆コレステロール輸送とは独立したメカニズムによって、血漿コレステロールレベルを変化させることなくアテローム性硬化症を抑制することが示された（Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785）。最近我々は、動脈壁細胞内へのＬＤＬ誘発単球走化性の抑制は、アテローム性硬化症の防止においてアポＡ−ＩおよびＨＤＬが演じるまた別の主要な役割であることを示唆した（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipids Res. 41:1495-1508）。
【０１７６】
ヒトアポＡ−Ｉの特性と類似することが示されたペプチド、１８Ａはまた、ＬＣＡＴ活性化能（Anantharamaiah et al.(1990) Arteriosclerosis 10:95-105; Epand et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:9389-9396）およびコレステロール流出能（Davidson et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:22975-22982; Yancey et al.(1995) Biochemistry 34:7955-7965）を有することが示された。１８Ａの末端荷電を中和して、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ₂を生成することによって、その脂質親和性および生物学的活性が増強されることが示された（Yancey et al.(1995) Biochemistry 34:7955-7965; Venkatachalapathi et al.(1993) Proteins: Structure, Function and Genetics 15:349-359）。この“親”分子、１８Ａのアミノ酸配列のいくつかの改変が、そのアポＡ−Ｉ類似特性を改善するために実施された（Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim Biophys. Acta 1256:103-1291; Mishra et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191; Mishra et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:1602-1611）。
【０１７７】
我々の以前の実験（Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim Biophys. Acta 1256:103-1291; Epand et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:9389-9396）は、このペプチドの疎水性の増加は、その脂質親和性およびアポＡ−Ｉ類似特性を増加させることを示した。合成ペプチド５Ｆ（両親媒性が増強されたＡｃ−１８Ａ−ＮＨ₂の類似体）は食餌誘発性アテローム性硬化症をマウスで抑制することが示された（例えば実施例１および２を参照されたい）。しかしながら、ペプチド２Ｆは、Ｃ５７ＢＬ６マウスでは食餌誘発病巣形成を顕著には抑制しなかった（Garber et al.(1999) Circulation 100:I538）。１８Ａダイマーペプチドの実験は、ペプチド−ペプチド結合の増加はペプチド：脂質結合を低下させることを示した（Mishra et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:1602-1611）。
【０１７８】
脂質結合特性およびアポＡ−Ｉ類似特性を伴いつつ、１８Ａペプチドの脂質親和性を増加させることができる最大限度を決定するために、非極性面の疎水性アミノ酸（例えばＬｅｕおよびＡｌａ）をＰｈｅで置換することによってＰｈｅ残基が系統的に増加する一連の同種ペプチドをデザインした。Wimley & White（Nature Struc. Biol. 3:842-848(1996)）の実験的に決定された疎水度基準にしたがえば、ＴｒｐおよびＰｈｅは、それらが水相から膜内への最大の分配を示すという意味でもっとも疎水性のアミノ酸である。膜活性ペプチドにおいてＰｈｅがもっとも耐酸性疎水性アミノ酸であり、さらにＰｈｅ含有ペプチドはＴｒｐ含有ペプチドよりも容易に合成できるので、我々はＰｈｅをペプチドの疎水性の増加に用いた。物理的特性および脂質結合特性、並びにアポＡ−Ｉに類似する生物学的特性（例えばＬＣＡＴ活性化およびＬＤＬ誘発走化性活性の抑制）に対する前記疎水性増加の影響を調べた。
【０１７９】
実験方法
ペプチド合成
ペプチドは、自動固相合成装置（PS3 Protein Technologies, Woburn, MA）を用いて固相法によって合成した。ＦＭＯＣ−アミノ酸をリンクアミド樹脂（０．５３６ｍＥｑ／ｇ）（Peninsula Laboratories, Inc. Belmont, CA）とＨＢＴＵおよびＮＭＭの存在下で結合させ、Ｎ−末端を無水酢酸でアセチル化した。アニソール（１％）、メルカプトエタノール（０．１％）およびトリプトファン（ペプチド樹脂の重量の２０％）の存在下で、ジクロロメタン中の７０％のＴＦＡを用いてペプチドを固相支持体から切断し、ＶＹＤＡＣＣ−４（２２ｍｍ×２５ｃｍ、粒子サイズ１０μｍ）逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム上で、水に２５％から５８％の０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルのグラディエント（２２分）を用い４．８ｍＬ／分の流速で６６分かけて精製した。ペプチドの純度は、Ｃ₁₈カラム（ＶＹＤＡＣ、４．６ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ）およびアセトニトリル−水（０．１％ＴＦＡ含有）の２５％から５８％の直線グラディエントを用い３３分かけて分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって確認し、さらに質量分析によって確認した。
【０１８０】
円偏光二色性
ＣＤスペクトルはＡＶＩＶ・６２ＤＳ分光偏光計で文献（Mishra et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191）にしたがって記録した。簡単に記せば、通過窓の長さが０．１ｃｍのセルを用いてスペクトルを得て、測定値は、２６０ｎｍから１９０ｎｍまで１ｎｍ毎に２５℃で採取した。全てのＣＤスペクトルは４つのスキャンを合算することによって平均化したシグナルであった。基準線は修正し凹凸を無くした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のペプチド溶液は１１μＭの濃度で用いた。ペプチド−ＤＭＰＣ複合体（１：２０ ｍｏｌ：ｍｏｌ）を用いて、これらペプチドのらせんに対するペプチド結合の影響を決定した。これら複合体は、適切な容積のペプチド溶液をＤＭＰＣ多層小胞に添加することによって調製した。ＤＭＰＣ多層小胞は以下のようにして調製した：既知量の脂質をエタノールに溶解し、希薄な窒素流の下でゆっくり蒸発させることによって溶媒を除去した。残留溶媒は脂質フィルムを真空下に一晩保存することによって除去した。適切な容積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を薄い脂質フィルムに添加して、要求される最終濃度のＤＰＭＣを得た。脂質−ペプチド複合体は必要な容積のペプチド溶液を添加することによって調製し、２０：１の脂質：ペプチドモル比を得た。これらペプチドの溶解度が小さいので、１１μＭのペプチド濃度を用いた。２２２ｎｍの平均残基楕円率、[θ]_MRE（ｄｅｇ．ｃｍ²．ｄｍｏｌ^-1）は以下の等式を用いて計算した：
[θ]_MRE＝ＭＲＷ[θ]／１０ｃｌ
式中、ＭＲＷはペプチドの平均残基重量であり、θは度で表した観察された楕円率であり、ｃはｇ／ｍＬで表したペプチドの濃度であり、ｌはセンチメートルで表したセルの観察窓の長さである。ペプチドのパーセントらせん度は、Morrisettら（Biochemistry 12:1290-1299(1973)）が記載した以下の等式から概算した：
％αらせん度＝（[θ]₂₂₂＋３０００）／（３６０００＋３０００）
式中、[θ]₂₂₂は２２２ｎｍでの平均残基楕円率である。
【０１８１】
示差走査熱分析
ＤＳＣ実験は、マイクロカルＭＣ−２走査熱分析計（MicroCal, Inc., Amherst, MA）を用い、ＤＭＰＣについては走査速度２０℃／時間で、ＤｉＰｏＰＥについては走査速度３７℃／時間で文献（Mishra et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191）に記載された方法を用いて実施した。既知量のリン脂質をクロロホルムに溶解した。サンプル１組について、ペプチドをメタノールに溶解し、クロロホルム／メタノール（２：１、ｖ：ｖ）中のＤｉＰｏＰＥの溶液に添加した。純粋な脂質サンプルおよび脂質とペプチドの有機溶液の両方について、溶媒をゆっくりとした窒素流の下で除去した。残留溶媒は真空下で除去した。緩衝液（ＤＭＰＣ用はｐＨ７．４、ＰＢＳ、ＤｉＰｏＰＥ用はｐＨ７．４、２０ｍＭＰＩＰＥＳ，１ｍＭＥＤＴＡ，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．００２％ＮａＮ₃）単独、または固有の脂質／ペプチドモル比を提供するために緩衝溶液中の既知濃度のペプチドを前記乾燥フィルムに添加し、さらに室温で３０分ボルテックスミキサーで水和させた。ＤＭＰＣの場合は、スキャンの間に６０分の平衡化時間を含む４つの連続スキャンを実施した。ＤＳＣサーモグラムは、マイクロカル社（MicroCal Inc., Amherst, MA）が提供するソフトおよびオリジン（Origin）バージョン５．０を用いて分析した。
【０１８２】
表面圧測定
単層排除圧（monolayer exclusion pressure）測定は、脂質−水境界面に対するペプチドの親和性を提供し、PhillipsとKrebsの方法（Phillips & Krebs (1986) Methods Enzymol. 128:387-403; Ibdah et al.(1989) Biochim. Biophys. Acta 1004:300-308）に従った。卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）の不溶性単層膜をテフロン（登録商標）皿内の空気−水境界面に室温で広げて５−４５ｄｙｎ／ｃｍの最初の表面圧（π_i）を提供した。１．５Ｍの塩酸グアニジンを含むＰＢＳ中のペプチド溶液を下相に注意深く注入し、５０μｇ／ｄＬの最終濃度を提供した。塩酸グアニジンをサブフェース中で１ｍＭ以下の最終濃度に希釈して、ペプチドを再生させた。サブフェースを持続的に攪拌しＥＰＣ単層膜の表面圧の増加（Δπ）を定常値が得られるまで記録した。ペプチドがもはやＥＹＰＣ単層膜に進入しない最初の表面圧（π_i），すなわち排除圧（π_e）は、π_i対Δπ直線回帰適合をΔπ＝０ｄｙｎ／ｃｍに外挿することによって計算した。
【０１８３】
直角光散乱測定
これらペプチドと卵黄ホスファチジルコリンとの結合は、文献（Mishra et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191）に記載されたように、ＳＬＭ８０００Ｃ光子計測スペクトロフルオロメーターを用いて直角光散乱により、ＥＰＣ多層小胞の分解を追跡することによって決定した。ＥＰＣＭＬＶは、ＥＰＣ（Avanti Polar, AL）の溶液を窒素下で蒸発させ、さらに脂質フィルムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で水和させることによって調製した。１０５μＭのＥＰＣおよび等モル量のペプチドを含むサンプルを２５℃で維持し、持続的に攪拌した。濁り度の清澄化を３０分モニターした。ＥＰＣ小胞の完全な溶解は、最終濃度１ｍＭのＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加によって達成された。
【０１８４】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の精製
ＬＣＡＴを新鮮な血中脂肪値正常血漿から文献（Albers et al.(1986) MethodsEnzymol. 129:763-783）の方法にいくつかの改変を加えて単離した。血漿密度を１．２１ｇ／ｍＬに調節し、１７５０００ｇで２４時間遠心した。ＬＣＡＴ含有分画をアフィ−ゲル（Affi-Gel）ブルークロマトグラフィーに、続いてＤＥ−５２クロマトグラフィーに付した。トリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）中の７５から２００ｍＭのＮａＣｌグラディエントを用いてＬＣＡＴをＤＥ−５２カラムから溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ヒトアポＡ−Ｉが夾雑していない９０％を越える純度の酵素であると分かった。
【０１８５】
ＬＣＡＴ活性のアッセイ
微量の７α−³Ｈコレステロールを含む卵黄ＰＣ／コレステロール（９０：２０モル／モル）をブランソン２５０ソニケーターで１２分超音波処理し、小さい単層小胞を作製して基質を調製した。前記基質（５０μＬ）を５μｇのペプチドまたはヒトアポＡ−Ｉおよび５０μＬのＢＳＡ（４０μｇ／ｍＬ）とともに１時間３７℃でインキュベートした。総容積を１５０μＬまで増やした。１時間インキュベートした後、１００μＬのＬＣＡＴを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、さらにシリカ片上に１０μＬを滴下することによって反応を停止させた。ヘキサン：クロロホルム（２：１ｖ／ｖ）混合物中でシリカ片の薄層クロマトグラフィーによって、コレステロールとコレステリルエステルを分離させた。コレステロールおよびコレステリルオレエート標準物は、３％の酢酸第二銅、８％のリン酸緩衝液中にＴＬＣプレートを浸漬し加熱することによって可視化した。標準物の位置を用いて前記プレートを２つに切断し、この２つの部分をパッカードトリカーブ（Tri Carb）４５３０中でシンチレーション液で計測した。全反応を３組ずつ実施した。ペプチドによるＬＣＡＴの活性化は、アポＡ−Ｉによる全活性化の百分率で表される。
【０１８６】
電気泳動
非変性ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥはLaemmliの方法（Nature 227:680-685(1970)）を用いて実施した。プリメードノベックス（Premade Novex）ゲルを用い、さらにゲルはクーマシーブルーで染色してタンパク質バンドを特定した。
【０１８７】
ＬＤＬ誘発単球走化性活性
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常者ドナー血漿からの超遠心沈澱による、またはマウス血漿からのＦＰＬＣによるリポタンパク質の単離、並びに脂質ペルオキシドおよび単球走化性活性の測定は、文献の記載にしたがって実施した（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046; Navab et al.(1977) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）。簡単に記せば、ＬＤＬおよびＨＤＬをヒト血漿からHavelら（J. Clin. Invest. 43:1345-1353(1955)）の方法によって単離した。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）および平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）を文献（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046）に記載にされたように単離した。マイクロタイタープレートを０．１％のゼラチンで３７℃で一晩処理した。ＨＡＳＭＣを１×１０⁵細胞／ｃｍ²の密集成長した密度で添加した。細胞を２日間培養し、このとき細胞はウェルの表面全体を覆い、かなりの量の細胞外マトリックスを産生していた。続いてＨＡＥＣを２×１０⁵細胞／ｃｍ²で添加して増殖させ、２日間で密集成長したＨＡＥＣの完全な単層培養が形成された。全ての実験で、ＨＡＥＣおよび同一個体由来のＨＡＳＭＣを４代から６代の継代レベルで用いた。単球は健常なドナーから文献（Fogelman et al.(1988) J. Lipid Res. 29:1243-1247）に記載されたように単離した。混合培養は天然のＬＤＬ（２５０μｇタンパク質／ｍＬ）で処理するか、またはＨＤＬ（３５０μｇタンパク質／ｍＬ）もしくはペプチドの存在下で８時間処理した。続いて前記混合培養を洗浄し、メディウム１９９でさらに８時間インキュベートした。得られた混合培養上清を文献（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）の記載にしたがって単球走化性活性についてアッセイした。
【０１８８】
結果
ペプチドの分析
表６は、合成した種々の１８Ａ類似体の配列を示す。ペプチドＡｃ−１８Ａ−ＮＨ₂（前記は２つのＰｈｅ残基を６位および１８位（境界面のリジン残基の近く）に有する）は２Ｆと称される。２つの３Ｆペプチド、３Ｆ³または３Ｆ¹⁴を合成した。前記ペプチドでは、３位および１４位のＬｅｕ（両方とも非極性面の中心に存在する）がそれぞれＰｈｅによって置換されている。ペプチド４Ｆは、非極性面の中心に２つのＰｈｅを有し、これは２つの中心部のＬｅｕ残基が置換された結果である。ペプチドの置換（３Ｆから７Ｆ）は表６に示されている。Ｐｈｅ残基の数が増加するにつれて、非極性面上の残基当たりの理論的疎水性が、ペプチド２Ｆに対する２．０５から７Ｆに対する３．１５に増加する。
【０１８９】
表６：疎水性を増加させるためのＡｃ−１８Ａ−ＮＨ₂の改変

【０１９０】
¹基本配列１８Ａ ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列識別番号：２）
²疎水性は非極性面上の残基当たりの疎水性として表されている。
³理論的脂質親和性は文献（Palgunachari et al.(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338）の記載に示されているように計算した。
【０１９１】
ペプチドは、調製用ＶｙｄａｃＣ₄カラムで逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣにより、水（０．１％トリフルオロ酢酸含有）とアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸含有）を用いて精製した。ペプチドの純度および保持時間は、分析用ＶｙｄａｃＣ₁₈カラムで水にアセトニトリル２５％−５８％のグラディエント（０．１％ＴＦＡ含有）を用いて決定した。前記ペプチドの純度はまた質量分析法によって確認した。前記質量は計算によって得られた分子量と一致した。ペプチドの保持時間は表７に示されている。３Ｆペプチドおよび４Ｆペプチドはともに２Ｆと比較して付加されたＰｈｅ残基を有するが、Ｃ₁₈カラムにおけるこれらペプチドの保持時間は大きくは相違しない（〜２２分）。保持時間における突然の増加は５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆで明白である（〜２６分）。Ｐｈｅ残基の数が増すにつれ、これらペプチドのＰＢＳ中の溶解度は減少する。表７から明らかなように、２Ｆ、３Ｆ³，３Ｆ¹⁴および４Ｆの溶解度（１．２５から１．４ｍｇ／ｍＬ）は、５Ｆ、６Ｆおよび
７Ｆの溶解度（０．０３から０．１ｍｇ／ｍＬ）よりも顕著に高い。
【０１９２】
表７：Ｆ−ペプチドの物理的特性

【０１９３】
¹質量分析によって決定した質量は、理論的に計算で得られた分子量と極めて近かった。
²保持時間は、水にアセトニトリル２５％−５８％（３３分）のグラディエント（０．１％ＴＦＡ含有）を用いＶｙｄａｃＣ₁₈カラムから溶出したペプチドについて得られた時間である。
³溶解度はＰＢＳ中で決定された。
⁴これらの測定の再現性は±１ｄｙｎ／ｃｍである。
【０１９４】
これらの両親媒性ペプチドの自己結合を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で調べた。図１４は、変性ＳＤＳゲル（図１４Ａ）および非変性ゲル（図１４Ｂ）の両方での２Ｆの移動度を示している。２Ｆの分子量は２２４２であり、もっとも小さい分子量標準物質（３．５−２．５ｋＤａ）よりもわずかに遅く移動する単一のバンドとしてＳＤＳゲル（図１４Ａ）上に認められる。しかしながら、図１４Ｂで認められるように、前記は非変性条件下では濃度依存態様で凝集物を形成する。低濃度（１００μｇ／ｍＬ）では、前記は２つのサイズの凝集物を形成するが、高濃度（２５０μｇ／ｍＬ）では、より大きな凝集物のみが形成される（図１４Ｂ）。調べた他の全てのペプチドもまた非変性条件下で凝集物を示し、これらペプチドは強い自己結合傾向を有することを示唆している。
【０１９５】
円偏光二色性
ペプチドの二次構造は円偏光二色性分光分析によって決定した。表８は、ＰＢＳ中およびＤＭＰＣ存在下でのペプチドのパーセントらせんを示している。ＰＢＳ中では、同族体２Ｆ、４Ｆ、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆは、３Ｆ³および３Ｆ¹⁴よりも高いらせんパーセントを有する（表８）。５Ｆ、６Ｆおよび７ＦはＰＢＳに難溶であるので、ＣＤ実験は１１μＭのペプチド（それらが完全に溶解する濃度）を用いて実施した。ペプチド２Ｆは、溶液中の５Ｆに匹敵する５５％らせんを示した。６Ｆおよび７Ｆは両方ともわずかに高いらせん（それぞれ６７％および５８％）を示し、４Ｆはわずかに低かった（４５％）。３Ｆペプチドは両方ともはるかに低いらせんを示した（〜２０％）。しかしながら、ＤＭＰＣへの結合は、６Ｆを除いて全てのペプチドのらせんを顕著に増加させた（表８）。脂質環境下では、２Ｆ、５Ｆおよび７Ｆは高いらせん含有量（６８％から７６％）を示した。ペプチド３Ｆ³および３Ｆ¹⁴はＰＢＳ中ではらせん含有量は非常に少ないが、脂質環境下では顕著ならせんの増加があった（３Ｆ³については約２２％から４２％に、３Ｆ¹⁴については１９％から５５％に増加）。ペプチド６Ｆおよび４Ｆのらせんは、脂質の存在下でもそれほど変化しなかった。しかしながら、これらのペプチドはなお２Ｆおよび５Ｆペプチドよりもらせん的でなかった。ＣＤの結果は、Ｐｈｅによる置換の増加に関してペプチドのらせん形成に系統的な変化は存在しないことを示唆している。ペプチド２Ｆおよび５Ｆは溶液中およびリン脂質の存在下で最大らせんを示した。
表８：水性環境および脂質環境下でのＦペプチドのらせん形成

【０１９６】
¹１１μＭのペプチド溶液を用いた。用いたペプチド：ＤＭＰＣ比は１：２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。３回の測定を実施し、±１０％の誤差を得た。
ＤＭＰＣ及びＤｉＰｏＰＥを用いたＤＳＣの研究
ＤＭＰＣの多層小胞の鎖溶融遷移に対するこれら１８Ａ類似体の影響をペプチド−脂質混合物（脂質／ペプチドモル比１００：１）を用いて調べた。表９は、ペプチドの存在下および非存在下でのＤＭＰＣの鎖溶融遷移の遷移温度並びにエンタルピーを示す。純粋な脂質は１３℃で予備遷移を、２３℃で主要な鎖溶融遷移を示す。ＤＭＰＣへのペプチドの添加は、ゲルから液晶への遷移の拡大、および遷移エンタルピーの低下をもたらした（表９）。予備遷移はいずれのペプチドの存在下でも認められなかった。調べたペプチドの中で２Ｆ、３Ｆ³、５Ｆおよび６Ｆが遷移エンタルピーを最も大きく減少させた（表９）。
いずれのペプチドも遷移温度の変化は０．２℃を越えなかった。
【０１９７】
表９：ＤＭＰＣの鎖溶融遷移パラメーターに対するＦペプチドの影響

【０１９８】
用いたＤＭＰＣ／ペプチド比は１００：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。用いたＤＭＰＣの濃度は１．５ｍＭであった。Ｔ_CMは鎖溶融遷移が生じる温度で、ΔＨ_CMは遷移のエンタルピーで、Δ_T1/2は遷移の最大値の半値幅である。
【０１９９】
二重層から六方晶形相への遷移温度（ＴＨ）におけるシフトは、リン脂質の固有の屈曲特性に対するペプチドの影響を評価するために用いられた（Epand (1998) Biochim. Biophys. Acta 1376:353-368）。２ＦはＤｉＰｏＰＥのＴ_Hを上昇させることが以前に示された（Tytler et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:22112-22118）。これまでの実験で我々は２つの方法でペプチド−脂質混合物を調製した。１つは、有機溶媒中のペプチドを有機溶媒中の脂質に添加し、続いて前記物質をフィルムとして沈積させ、さらに緩衝液で水和させる方法である。他の方法では、ペプチドおよび脂質を別々に水和させた後でそれらを混合する。混合物がＤＳＣ分析の前に平衡化すれば、ペプチドと脂質が最初にどのようにして混合されたかは重要ではない。しかしながら、膜系はゆっくりと平衡化させることができ、その場合には、ペプチドが脂質フィルムに高濃度で取り込まれるときはより多くのペプチドが脂質中に存在することができる。一般に、両方法によるサンプル調製の結果は同様であるが（結果は示されていない）、Ｔ_Hのシフトは、脂質とペプチドで構成されたフィルムにペプチドが取り込まれたサンプルでより大きい傾向がある。ペプチドのモル濃度分画に関するＴ_Hのばらつきは、種々のペプチドおよびアポＡ−Ｉについて示されている（図１５）。Ｔ_Hにおける直線状の増加が２Ｆおよび５Ｆについて観察されるが、４Ｆは、より迅速な増加が低いペプチド濃度で観察されるという点においてアポＡ−Ｉに類似する態様を示す。他方、２つの３Ｆ類似体は、６Ｆおよび７Ｆと同様にＴ_Hに顕著な影響を与えない。
【０２００】
ペプチドとリン脂質単層膜との相互作用
単層の排除圧（π_e）は、ペプチドがもはやＥＰＣ単層膜に侵入できない表面圧である。π_eの値はペプチドの理論的脂質親和性を反映する。Ｆペプチドの排除圧はＰｈｅ残基の数が増加するにつれ増加する（表７）。ここで調べた全てのペプチドが、アポＡ−Ｉおよび親ペプチド１８Ａよりも高い排除圧を有していた。π_eの値は２Ｆから４Ｆへと（３８から４０ｄｙｎ／ｃｍ）徐々に増加した。これは３７ｐＡ（プロリンが間に入った１８Ａのタンデムリピート）について観察された範囲内である。排除圧値は５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆについて顕著に増加した（４０から４５ｄｙｎ／ｃｍ）。排除圧によって決定されたように、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆ同族体は、ＥＰＣ単層膜と類似の相互反応能力を有することは明白である。表７に挙げたＦペプチドは、ＨＰＬＣ保持時間および単層膜排除圧について類似傾向を有し、４Ｆと５Ｆの間で急激な増加を示すことは興味深い。
【０２０１】
直角光散乱
図１６で認められるように、アポＡ−Ｉ（ＥＰＣＭＬＶを清澄化できない）と異なり、全てのペプチドがＥＰＣＭＬＶを清澄化することができた。３Ｆの２つの同族体ペプチドはＥＰＣＭＬＶの清澄化でもっとも有効性が低かった。同族体ペプチド２Ｆ、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆは全てＥＰＣＭＬＶを同程度に清澄化した。ペプチド４Ｆは、ＥＰＣＭＬＶをもっとも効果的に清澄化し、活性はＴｒｉｔｏｎＸ−１００のそれと類似していた。ＥＰＣＭＬＶの濁り度の５０％クリアランスのための時間もまた４Ｆ同族体でもっとも短かった。ペプチド７Ｆは５０％クリアランスの達成のためにもっとも長時間を要し、これは、最初のラグ時間（〜３００秒）のためであった（図１６）。前記はおそらく、ＥＰＣＭＬＶと相互作用する前に自己結合した７Ｆ分子が分解し、それらを可溶化させる必要性があるからであろう。同族体２Ｆ、５Ｆおよび６Ｆによって示されたより遅いクリアランス速度もまた、これらペプチドの高い自己結合が原因であるかもしれない。
【０２０２】
血漿酵素ＬＣＡＴの活性化
これらのペプチドの血漿酵素ＬＣＡＴを活性化する能力を、基質として卵黄ＰＣ−コレステロール小胞を用いＬＣＡＴ反応の最初の粘度を測定することによって決定した（図１７）。ＬＣＡＴ活性化は、アポＡ−Ｉによる活性化（これを１００％とする）との比較で表される。２０μｇ／ｍＬのペプチドおよびアポＡ−ＩによるＬＣＡＴの活性化は図４に示されている。この濃度では、アポＡ−Ｉはいずれのペプチドよりも良好にＬＣＡＴを活性化する。ここで調べたペプチドの中では、しかしながら５Ｆが最良の活性化物質である（アポＡ−Ｉの８０％）。ＬＣＡＴ活性化に関するかぎり、３Ｆ³および３Ｆ¹⁴は同様な活性化能力を有している。したがって、それらは１本の棒線で表した（図１７）。
【０２０３】
ＬＤＬ誘発単球走化性活性
ＬＤＬをヒト動脈壁混合培養系とともにインキュベートしたとき、ＬＤＬは内皮下腔に捕捉され、酸化されて生物学的に活性な脂質を生じる。これらの脂質は単球走化性を誘発する。したがって、混合培養単球走化性は、生物学的に活性な脂質の生成についての十分に確立されたアッセイである。走化性の抑制は “シーディング分子”の除去と正比例す
ることが示された。前記シーディング分子は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の分泌（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508）および分化因子、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の分泌に必要である。図１８は、ペプチドとインキュベートした後のＬＤＬが作用の変動を表すことを示し、ＬＤＬの走化性特性は同族体４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆによりもっとも減少する。ペプチド３Ｆは、２Ｆおよび７Ｆと比較して全く有効性がなく、２Ｆおよび７Ｆは、４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆよりも有効性は低かった。
【０２０４】
考察
クラスＡ両親媒性らせんペプチド類似体の疎水性増加によるその物理化学的特性および脂質結合特性に対する影響
本明細書で調べたペプチドは親ペプチド１８Ａの同族体である。非極性面上の残基当たりの計算による疎水性（改変ＧＥＳスケールによる（Palgunachari et al.(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338））は、Ｐｈｅ残基の数が増すにつれ増加する。疎水性におけるこの増加（表６）は、理論的な脂質親和性、Λにおいて再現される（上掲書）。しかしながら、Λ値は、２Ｆから４Ｆまで徐々に増加し（１３．０３から１４．５９）、さらに突然１４．５９（４Ｆの場合）から１９．０７（５Ｆの場合）の値に増加する。Λが徐々に増加するのが５Ｆの後に６Ｆおよび７Ｆに対する値で再び観察される（表６）。これは、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ₂の３位および１４位のＬｅｕがＰｈｅで置換されたことによる。Ｐｈｅは、非極性面の疎水性のわずかな増加をもたらし、したがって２つの３Ｆ類似体および４ＦのΛ値にわずかな増加が生じる。同族体５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆでは、しかしながら、ＬｅｕからＰｈｅへの置換の他に、１１位および１７位のＡｌａもまたＰｈｅで置換され、Λ値の顕著な増加がもたらされる（表６）。ＡｌａはＬｅｕよりも疎水性が小さく、さらにＬｅｕはＰｈｅよりも疎水性が小さいので、ＡｌａからＰｈｅへの置換は、ＬｅｕからＰｈｅへの置換よりも、得られたペプチドにおいて疎水性および理論的脂質親和性に大きな変化をひき起こす。
【０２０５】
これらペプチドのＣ₁₈逆相ＨＰＬＣカラムにおける保持時間、溶解度、およびＥＰＣ単層膜に侵入する能力は全て、理論的な脂質親和性値で認められる傾向と同様な傾向を示した（表７）。ペプチド２Ｆ、３Ｆ³、３Ｆ¹⁴および４Ｆの保持時間はほぼ同じで（２１から２２分）、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆ（これらは第二の群を構成する）の値（２６から２７分）よりも顕著に小さい。ペプチド２Ｆから４Ｆは、同族体５Ｆから７Ｆ（これらは難溶性である）よりも水への溶解度は顕著に高い。排除圧が２Ｆから４Ｆまで徐々に増加するのが観察され、その後４０ｄｙｎ／ｃｍから４５ｄｙｎ／ｃｍへ急激に増加する。ペプチド５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆの場合の排除圧は互いに大きな相違をもたず、アポＡ−Ｉのそれよりも顕著に高い（表７）。親ペプチド１８Ａ（３０ｄｙｎ／ｃｍ）および１８Ａのダイマー、３７ｐＡ（４０ｄｙｎ／ｃｍ）さえもまた、空気−水境界面に広げた卵黄ＰＣ単層膜への侵入の効率は顕著に低かった。上記の物理的特性を基にして、Ｆペプチドは２つの群に分けることができる。すなわち２Ｆ、３Ｆ³、３Ｆ¹⁴、４Ｆの群Ｉ並びに５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆの群ＩＩである。
【０２０６】
ＣＤのデータ（表８）は、全てのペプチドのパーセントらせん値はＤＭＰＣの存在下で増加することを示し、このことは、全てのペプチドが脂質と結合していることを示唆している。ＤＳＣによって示唆されるように（表９）、これらペプチドのＤＭＰＣへの結合は類似しているように思われる。しかしながら、ＤｉＰｏＰＥの二重膜構造の安定化に対するこれらのペプチドの影響は異なっている。４Ｆおよび５Ｆは他のペプチドよりも良好な安定化物質のようであるので、ＤｉＰｏＰＥとより良好に相互作用するように思われる。
【０２０７】
一方、アポＡ−ＩはＥＰＣＭＬＶを清澄化できないが、全てのペプチド類似体は程度に差はあるが清澄化することができる。水性緩衝液に容易に溶解し、３８から４０ｄｙｎ／ｃｍの範囲の単層排除圧を示すＩ群ペプチド（２Ｆ、３Ｆ類似体および４Ｆ）の中で、４Ｆはもっとも有効であるようで、調べたペプチド：脂質比では、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のそれと同様な動的態様を示す（図１６）。ペプチド２Ｆおよび３Ｆの単層排除圧は類似しているが、３Ｆ同族体はＥＰＣＭＬＶの清澄化がもっとも遅い。３Ｆ同族体のＥＰＣ清澄化能力が低い理由は現時点では明らかではない。水性緩衝液に容易に溶解することができず、表面圧値が４５ｄｙｎ／ｃｍの群ＩＩのペプチド（５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆ）は比較的ゆっくりとＥＰＣＭＬＶを可溶化する。これらの結果は、分解してからＥＰＣと相互作用する必要があるペプチド凝集物と一致する。４Ｆの優れた反応性は、その疎水性が最適であり、そのため自己結合に有利な疎水性ペプチド：ペプチド相互作用がペプチド：脂質相互作用を妨げないという事実によって説明することができる。
【０２０８】
疎水性増加のＬＣＡＴ活性に対する影響
ＬＣＡＴの活性化は複雑な過程であり、脂質の親和性に左右されるだけではなく、両親媒性らせんタンパク質と酵素ＬＣＡＴとの相互作用にも依存する（Jonas (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:245-256）。前記の記述と合致して、ＬＣＡＴを活性化する能力は同族体ペプチドについて異なることが見出された。ペプチド５Ｆは最大のＬＣＡＴ活性化能を示し、これは、表７に示した物理的特性と一致する（表７では、卵黄ＰＣ−水境界面での排除圧値を含む急激な増加が４Ｆから５Ｆで認められた）。ペプチド６Ｆおよび７Ｆは５Ｆほど効果的ではないという事実は、これらペプチドの水への低い溶解度によって反映されるように、ペプチド：ペプチド相互作用の増加（前記増加はペプチド：脂質またはペプチド：ＬＣＡＴ相互作用を許容しない）によって説明することができるであろう。これらの結果は、１８Ａダイマーに関する我々の以前の観察と合致する。以前の観察では、ダイマー１８Ａ−１８Ａ（３６Ａ）におけるペプチドの自己結合の強化は、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａペプチドと比較して脂質と相互作用する能力を低下させた（Jonas (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:245-256）。前記ペプチドによるＬＣＡＴの活性化はアポＡ−Ｉのそれと匹敵したが、アポＡ−Ｉと前記の全てのペプチドはＥＰＣに対して異なる反応性を有するので（図１６）、それらは違った態様で基質と相互作用するということは留意されねばならない。同様な観察がChungらによって報告された。彼らは、合成ペプチド１８Ａ−Ｐｒｏ−１８ＡおよびアポＡ−Ｉは異なる態様でＥＰＣと相互作用することを示した（Chung et al.(1985) J. Biol. Chem. 260:10256-10262）。
【０２０９】
非極性面の疎水性の増加のＬＤＬ誘発単球走化性に対する影響
我々が報告したように（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508）、“シーディング分子”の除去はペプチドの両親媒性度に左右されるので、我々はこれらペプチドのＬＤＬ誘発単球走化性抑制能力を調べた。このアッセイでは、一方向変数分析を基にして、ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆ（１００μｇ／ｍＬレベル）は、顕著かつ類似するＬＤＬ誘発走化性の抑制を示した。同族体２Ｆはある程度の抑制活性を示し、（その理由は不明であるが）、類似体ペプチド３Ｆは抑制を示さずＬＤＬ単独と類似していた。これらの結果は、ペプチド３Ｆは脂質過酸化水素を除去できない（データは示されていない）という事実およびＥＰＣＭＬＶを清澄化する能力が低いことと一致した。ペプチド７Ｆは、ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆより顕著に有効性が低かった（Ｐ＜０．００１）。７Ｆの能力の低下はまた前記ペプチドの自己結合の増強によって説明できる（自己結合の増強はＥＰＣＭＬＶの清澄化実験で観察されたように脂質との相互作用能力を低下させる）。これらの結果はあらためて、ペプチドの疎水性が自己結合に与える影響間に存在する微妙なバランスがアポＡ−Ｉ摸倣特性に決定的な影響を与えることを示している。
【０２１０】
ペプチド５Ｆ（ＬＣＡＴ活性化能力および“シーディング分子”除去能力が増強されている）のin vivo投与によって、マウスは食餌誘発アテローム性硬化症から防御される。対照的に、２Ｆ（ＬＣＡＴ活性化能力は４Ｆと同様であるが、“シーディング分子”をＬＤＬから除去する能力は４Ｆおよび５Ｆよりも低い）の投与は、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける食餌誘発性病巣の形成を顕著には抑制しなかった（ＰＢＳを投与したコントロールマウスの平均病巣面積は１４．７±１．８μｍ²×１０^-3に対して、２Ｆ投与マウスでは１３．２±１．７μｍ²×１０^-3、ｎ＝１５）。したがって、前記のマウスモデルでは、ＬＤＬ誘発単球走化性の抑制が、ＬＣＡＴ活性よりもアテローム性硬化症誘発に対してより強い対抗力を示す。ペプチド２Ｆおよび４ＦはＬＣＡＴの活性化においては類似し、４Ｆおよび５ＦはＬＤＬから“シーディング分子”を除去する能力において類似しているので、ペプチド４Ｆは、異なるアテローム性硬化症感受性マウスモデルでＬＣＡＴ活性化とＬＤＬ誘発単球走化性の抑制の重要性を識別する試薬として機能するかもしれない。ＬＤＬ誘発走化性の抑制がＬＣＡＴ活性化能力よりも重要であるならば、４Ｆは５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆよりもより可溶性であるのでアテローム性硬化症の抑制として用いることができるより優れたペプチドであるはずである。
【実施例４】
【０２１１】
実施例４
ペプチドＤ−４Ｆは、急性炎症性反応時にパロキシナーゼレベルを維持し、酸化リン脂質生成を阻害する
我々は、インフルエンザＡウイルスのマウス鼻腔内点滴によって惹起されるＨＤＬの抗炎症性特性の時間依存性低下は接種後７から９日で最大に達することを観察した。選択した接種量はウイルス血症をひき起こさない量で、したがって、惹起される変化はウイルスによって直接ひき起こされるものではなく、ウイルス感染に対するホストの全身反応によって誘発される炎症状態によるものであった。前記の反応は生来の免疫系の一部分であり、急性期反応として知られている。
【０２１２】
結果の１つは、インフルエンザ感染後のマウスのＨＤＬにおけるパラオキソナーゼ活性および血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性の低下であった。これらＨＤＬ酵素活性の低下の結果として、さらにまた急性期反応時のプロオキシダントタンパク質とＨＤＬとの結合の結果として、ＨＤＬはもはやＬＤＬの酸化を防止することができず、さらにＬＤＬにより誘発される内皮細胞の単球走化性活性の産生を防止することができなかった。正常なＨＤＬは、生物学的に活性な酸化リン脂質を破壊するために十分なパラオキソナーゼおよび血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性を含むので、前記ＨＤＬは、ＬＤＬにより誘発される内皮細胞の単球走化性活性の産生を防止することができる。
【０２１３】
本実施例では、インフルエンザＡ感染後初期には（２日）、感染マウスの肝臓はこれら酸化されたリン脂質を生成し（図１９）、後期には（感染後７から９日）これら生物学的に活性な酸化されたリン脂質はマウスの大動脈に出現した。しかしながら、インフルエンザＡウイルス感染後、マウスに２０μｇのＤ−４Ｆを毎日注射した場合、パラオキソナーゼレベルは低下せず（図２０）、生物学的に活性な酸化リン脂質もバックグラウンド以上には生成されなかった（図２１）。
【０２１４】
これらのデータは、Ｄ−４Ｆ（および／または本発明の他のペプチド）は、既知の冠状動脈疾患をもつ患者にインフルエンザ感染または他の急性期炎症反応を生じる事象（例えばウイルス感染、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫症状などによる事象）時に経口的または注射によって投与し、その結果この短期間の処置によって前記炎症性状態を生じる病変に伴う心臓発作および卒中発作の発生の増加を防止することができることを示している。
【実施例５】
【０２１５】
実施例５
Ｄ−アミノ酸から合成されたアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドの経口投与はマウスのアテローム性硬化症を劇的に減少させる
ＤまたはＬアミノ酸から合成されたアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドは、動脈壁細胞による酸化に対して低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を防御するためにin vitroで有効であった。しかしながら、前記ペプチドをＬＤＬレセプター欠損マウスに経口的に与え、そのＨＤＬを単離し、ＬＤＬを酸化から保護する能力をin vitroで調べたとき、Ｄ−アミノ酸から合成されたペプチドのみが有効であった。Ｄ−アミノ酸から合成されたペプチドは血液循環中で安定であり、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の分画から見出された。Ｌアミノ酸から合成されたペプチドは急速に分解され尿中に排泄された。Ｄ−４Ｆとして知られるＤ−アミノ酸から合成されたペプチドを１日に２回経口的に、西洋風食餌を与えたＬＤＬレセプター欠損マウスに投与したとき、病巣は７９％減少した。アポＥ欠損マウスの飲料水に添加したとき、Ｄ−４Ｆは病巣を８４％以上減少させた。我々は、Ｄ−アミノ酸から合成したアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および酸化脂質によってひき起こされる他の慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であると結論した。
【０２１６】
背景
ＨＤＬ−コレステロール濃度はアテローム性硬化を示す冠状動脈疾患の危険性と反比例する（Miller & Miller (1975) Lancet, 1:16-19）。アポＡ−Ｉ（ＨＤＬの主要なアポリポタンパク質）の輸液（Badimon et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1234-1241）または遺伝子導入による発現（Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9607-9611）は、動物モデルでアテローム性硬化症を防御できることが示された。アポＡ−Ｉがアテローム性硬化症の進行を防御するメカニズムは、逆コレステロール輸送（Shah et al.(2001) Circulation, 103:3047-3050）およびＬＤＬの酸化に必要な低レベルの酸化脂質（“シーディング分子”）の除去（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508; Navab et al.(2001) Arteriosclerosis Thromb. Vasc. Biol. 21:481-488）を含むのではないかと考えられている。クラスＡ両親媒性らせんペプチド類似体は、ＬＤＬの酸化に必要な“シーディング分子”の除去（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1495-1508）を含むアポＡ−Ｉのいくつかのin vitroでの特性に類似する特性を有することが示された。前記には、。クラスＡ両親媒性らせんペプチドの腹腔内投与は、血漿コレステロールレベルに変化を生じないで食餌誘発アテローム性硬化症からマウスを保護することが最近示された（Garber et al.(2001) J. Lipid Res. 42:545-552）。病巣の減少に、in vitroでのＬＤＬの酸化を抑制するＨＤＬの能力の顕著な改善が付随していた（上掲書）。これまで、アポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドを薬理的物質として用いる場合の主要な制限は、非経口ルートによる投与の必要性であった。
【０２１７】
哺乳類の酵素、例えばプロテアーゼは、Ｌアミノ酸から合成されたペプチドおよびタンパク質を認識するが、Ｄ−アミノ酸から合成されたものはほとんど認識しない。本明細書で我々は、Ｄ−アミノ酸から合成したアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドの特別な製剤は、経口的に投与してマウスで劇的にアテローム性硬化症を抑制できることを示す。
【０２１８】
方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌のＬＤＬレセプター欠損マウスまたはアポＥ欠損マウスをジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）から購入した。ＬＤＬレセプター欠損マウスは、プリナ固形飼料（Purina chow diet, Ralston Purina Co.）で４週齢まで飼育し、その時点で西洋風食餌（Western diet, Tekland, Madison, WI, diet#88137）に切り替え６週間用いた。アポＥ欠損マウスは実験を通してプリナ固形飼料で飼育した。ＬＤＬレセプター欠損マウスは、経管投与によって１日に２回テストペプチドまたは担体コントロールを、図の説明文に示された期間投与された。４週齢で、アポＥ欠損マウスの幾匹かの飲料水に図の説明文に示した濃度でテストペプチドを添加し、アポＥ欠損マウスには固形飼料を続けた。
【０２１９】
マウスは、ＵＣＬＡ動物実験委員会（Animal Research Committee）によって承認されたプロトコルにしたがって麻酔下で後眼窩静脈叢から採血した。アテローム性硬化症病巣は以前に記載したように測定した（９）。
【０２２０】
リポタンパク質
ＬＤＬおよびＨＤＬは、インフォームド・コンセントを得た後で実験協力者から、および上記に記したようにマウスから文献（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; および本明細書実施例）の記載にしたがって単離した。
【０２２１】
混合培養、ＬＤＬの細胞性酸化、単球単離および単球走化性活性アッセイ
以前に述べたように（上掲書）、ヒト大動脈内皮細胞および平滑筋細胞を単離し培養した。ＨＤＬの存在下および非存在下でのＬＤＬの細胞性酸化は以前に述べたように（上掲書）決定した。ヒト血液単球はインフォームド・コンセントを得た後で単離し、単球走化性活性は以前に記載（５）されたように決定した。
【０２２２】
アポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドの合成および調製
アポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドは以前に記載（１１）されたように合成したが、ただしいくつかの事例では、ペプチドの各アミノ酸は該当アミノ酸のＤ型立体異性体であった。前記ペプチドは、Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ−ＮＨ₂（配列識別番号：１）（Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ₂または２Ｆ）をベースにしている。２Ｆまたは２Ｆの類似体を用いてここに報告する実験に用いた。前記２Ｆ類似体の一次アミノ酸配列は以下のとおりであった：Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ−ＮＨ₂（配列識別番号：５、４Ｆとも称される）。Ｌ−アミノ酸から合成したペプチドはＬ（例えばＬ−４Ｆ）と称され、Ｄ−アミノ酸から合成したペプチドはＤ（例えばＤ−４Ｆ）と称される。いくつかの事例では、前記ペプチドはＩＯＤＯ−ＢＥＡＤ試薬（Pierce, Rockford, IL）を用い、製造元の推奨にしたがってヨウ素化した。Ｄ−４ＦとともにまたはＤ−４Ｆを用いないで、Ｌ−α−１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL）から作製したリポソームは、製造元の推奨にしたがって製造した。完全なペプチドのマウス血漿からの抽出および検出は、逆相ＨＰＬＣを用い文献（Garber et al.(1992) Arterioscler. Thromb. 12:886-894）の記載にしたがって実施した。
【０２２３】
その他の方法
リポタンパク質のタンパク質（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494）およびコレステロール（Van Lenten et al.(2000) Circulation 103:2283-2288）の含有量、並びに統計分析は、Ｐ＜０．０５と規定される有意差で、文献（Van Lenten et al.(2001) Circulation 103:2283-2288）の記載にしたがって実施した。
【０２２４】
結果
Iｎ vitroでは、Ｌ−２ＦおよびＤ−２Ｆは、両者とも等しくＬＤＬの酸化およびヒト大動脈壁細胞混合培養でのＬＤＬ誘発単球走化性活性をブロックすることができた（データは示していない）。しかしながらin vivoでは図２２Ａに示したように、経口投与の後、Ｄ−４Ｆのみが血液循環中で無傷のままであり、ＨＤＬ保護能力を強化し（図２２Ｂ）、ＬＤＬ誘発単球走化性活性を低下させることができた（図２２Ｃ）。¹²⁵Ｉ−Ｌ−４Ｆまたは¹²⁵Ｉ−Ｄ−４Ｆの経口投与後２時間で、Ｌ−４Ｆを投与されたマウスの尿は、Ｄ−４Ｆを与えられたマウスの場合の約１５倍の放射能活性を示した（データは示されていない）。
【０２２５】
図２３は、１日２回のＤ−４Ｆの経管投与によって、西洋風食餌を与えたＬＤＬレセプター欠損マウスはアテローム性硬化症病巣が７９％減少することを示している。総血中コレステロールレベルは、Ｄ−４Ｆを投与されたＬＤＬレセプター欠損マウスとリポソーム単独または食塩水単独投与マウスで顕著な違いはなかった。総コレステロールはＤ−４Ｆ群で７６１±６９ｍｇ／ｄｌであり、リポソーム群で６７７±５２ｍｇ／ｄｌであり、食塩水群で６９９±３１ｍｇ／ｄｌであった。平均ＨＤＬ−コレステロールレベルはＤ−４Ｆ群でわずかに高く７３±８．７ｍｇ／ｄｌであったが、リポソーム群の６５．９±９．２ｍｇ／ｄｌおよび食塩水群の６７．１±６．３ｍｇ／ｄｌと比較してこれらの相違は統計的には有意でなかった。
【０２２６】
図２４では、飲料水でＤ−４Ｆを投与されたアポＥ欠損マウスでは病巣が８４％減少し、２．５ｍｇ／日／マウスでの投与と５．０ｍｇ／日／マウスでの投与に顕著な相違はないことが示されている。ペプチドを投与されていないアポＥ欠損マウスと２．５ｍｇＤ−４Ｆ／マウス／日または５．０ｍｇＤ−４Ｆ／マウス／日を投与されたマウスとの間に消費された水の量（２．５ｍＬ／日／マウス）に顕著な差はなく、さらに３つの群のアポＥ欠損マウスの体重、心臓重量、または肝重量にも顕著な相違はなかった（データは示されていない）。さらにまた、血中総コレステロール濃度についてはＤ−４Ｆを投与されたアポＥ欠損マウスで顕著な相違はなかった（ペプチドを含まない水を与えられたマウスで４７８±１４９ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを２．５ｍｇ／マウス／日で投与されたマウスで５３４±１２．３ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを５．０ｍｇ／マウス／日で投与されたマウスで５７９±４．６ｍｇ／ｄＬ）。平均ＨＤＬ−コレステロールは、Ｄ−４Ｆを投与されたマウスで軽度に増加したが、その相違は統計的な有意差に達しなかった（ペプチドを含まない水を投与したマウスで３２．２±７ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを２．５ｍｇ／マウス／日で投与されたマウスで３８．７±５ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを５．０ｍｇ／マウス／日で投与されたマウスで４３．４±６ｍｇ／ｄＬ）。
【０２２７】
考察
これまではアポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドを薬剤として使用することには非経口的投与の必要性から制限があった。本実験でのアテローム性硬化症病巣の目ざましい減少は、血中総コレステロールに顕著な変化が存在しないにもかかわらず生じた。Ｄ−４Ｆを投与されたマウスではＨＤＬ−コレステロールレベルはわずかに高くなったが、この相違は統計的な有意差に達しなかった。本明細書に提示した実験は、Ｄ−アミノ酸で合成したアポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および他の酸化脂質によって惹起される慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であろうということを示唆している。
【０２２８】
本明細書で述べた実施例および実施態様は例示を目的としており、前記の記載を基にして種々の改変または変更が当業者には示唆されるであろうが、それらは本発明あるいは特許請求の範囲の範囲内にあることは理解されるところである。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は参照によりそっくり本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、アポＥ欠損マウスにおける¹⁴Ｃ−Ｄ−５Ｆと血液成分との結合を示す。¹⁴Ｃアミノ酸で標識したアポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５Ｆを、経口経管投与によりアポＥ欠損マウス（ｎ＝５）に投与するか、または前記マウスの血漿とともにin vitroでインキュベートした。空腹時血液を経管投与後６時間で採集し、血液、血漿およびリポタンパク質と結合した¹⁴Ｃを測定した。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、経口的に投与したＤペプチドが活性を有することを示す。アポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５ＦおよびＬ−５Ｆ（１００μｇ／動物）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与によって投与した。血液を6時間後に採集し、ＬＤＬおよびＨＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）で単離し、動脈壁モデル系でＨＤＬ保護能力（図２Ａ）およびＬＤＬの酸化耐性（図２Ｂ）について生じた単球の走化性活性を測定することによって調べた。図に示されたように、Ｄ−５ＦはＨＤＬの防御性を顕著に高め（ただしＬ−５Ｆはそうではない）、Ｄ−５Ｆ後にはＬＤＬは酸化に対して強い耐性を得た。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、経管投与後のＤ対Ｌペプチドの血漿濃度を示している。アポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−４Ｆ（図３Ｂ）およびＬ−４Ｆ（図３Ｂ）を¹²⁵Ｉで標識し、経口経管投与によってＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝４）に投与した。血液を３時間後に採集し、血漿をＦＰＬＣで分画し、溶出分画中の放射能活性を測定した。Ｌペプチドの１５％未満が完全な１８量体として溶出し、一方、Ｄ−４Ｆの７０％以上が完全であった。前記の実験は、ＤペプチドはＬペプチドと比較してin vivoで分解に対して極めて耐性を有することを示している。
【図４】図４は、処置マウスでＤ−４Ｆに対する抗体が存在しないことを示す。Ｄ−４Ｆに対する抗体（白色の沈澱線）が存在しないことが、５ｍｇ／日（下図）のペプチドによる処置後６週のＬＤＬレセプター欠損マウスの血漿で見出された。ポジティブコントロール（上図）は、マウス血漿のアポＡ−Ｉに対する沈澱線の存在を示している。上図：中央＝ウサギ抗アポＡ−Ｉ、および周囲＝Ｄ−４Ｆマウスの血漿。下図：中央＝Ｄ４Ｆで処置したＬＤＬＲ−／−マウスの血漿、および周囲＝０〜８０μｇの純粋Ｄ−４Ｆペプチド。
【図５】図５は、西洋風食事を与えたＬＤＬレセプター欠損マウスにおける大動脈根の脂肪線病巣発生率を示す。ＬＤＬレセプター欠損マウス群に西洋風食餌を与え、さらに経口的に賦形剤（コントロール）（ｎ＝９）またはペプチドＤ−４Ｆ（ｎ＝６）を１日に２回６週間投与した。続いてマウスを殺し、大動脈弓を固定し切片を作製して脂肪線病巣を定量した。Ｄ−４Ｆを与えたマウスは病巣面積が８１％減少した（ｐ＜０．０１）。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、腹腔内注射後のペプチド５ＦまたはアポＡ−Ｉの血中分布を示す。ヒトアポＡ−Ｉ、マウスアポＡ−Ｉおよびペプチド５Ｆを¹²⁵Ｉで標識し、アテローム誘発食餌を少なくとも３週間与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に注射した。表３に記載した動態実験中にサンプルを採取した。代表的なサンプルをＣＬｉＰ法で分析し、分画を採集して放射能活性を測定した。溶出容積はカラムポンプの速度だけを基準にし、酵素試薬ポンプが影響を与える容積は無視した。提示したデータはコレステロール（恣意単位による５００ｎｍでの吸収；実線）および放射能活性（カウント／分、点線）である。Ａ＝ヒトアポＡ−Ｉ（注射後１時間）；Ｂ＝マウスアポＡ−Ｉ（１時間）；Ｃ＝５Ｆ（１．５時間）。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、マウスリポタンパク質とヒトの動脈壁細胞との相互作用を示す。アテローム誘発食餌を与えたマウスおよび賦形剤（ＰＢＳ）またはペプチド５Ｆ（２０μｇ／マウス／日）を注射したマウスの血漿からＦＰＬＣによってＬＤＬおよびＨＤＬを単離した。混合培養を以下のもので処置するかまたは処置しなかった（図中では無添加と表示）：ヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）（２００μｇ／ｍｌＬＤＬタンパク質）もしくはマウスＬＤＬ（ＭｏＬＤＬ）（２００μｇ／ｍｌ）、またはヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍｌ）＋ヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇ／ｍｌＨＤＬタンパク質）もしくはマウスＨＤＬ（ＭｏＨＤＬ）（３００μｇ／ｍｌ）。混合培養に上記を添加し１０％のリポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ）の存在下で８時間３７℃でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化水素等価物についてアッセイした（Ａ図）。続いて前記混合培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない新しい培養液でさらに８時間インキュベートした。前記調整培養液を採集し、単球走化性活性についてアッセイした（Ｂ図）。無細胞ブランクを比較のために両図に加えた。
【図８】図８は病巣横断面積を示す。提示のデータは、各動物の平均病巣横断面積（白丸）および各群の全動物の平均±ＳＥＭ（黒丸）を誤差幅とともに示している。略語：ＰＢＳ＝アテローム誘発食餌を与え、さらに毎日２００μＬのリン酸緩衝食塩水を注射したマウス；５Ｆ＝アテローム誘発食餌を与え、さらに毎日２００μＬのリン酸緩衝食塩水中の２０μｇの５Ｆを注射したマウス；ＭｏＡＩ＝アテローム誘発食餌を与え、さらに毎日２００μＬのリン酸緩衝食塩水中の５０μｇのマウスアポＡ−Ｉを注射したマウス。*＝ｐ＜０．００２（２テール（two-tailed）ｔ−検定によって決定）。有意差は階層上の変数の一方向分析によってもまた示された（ｐ＜０．００１）。
【図９】図９は、アポＡ−Ｉペプチド類似物質のＤおよびＬ異性体は両者ともに、invitroで穏やかに酸化されたＬＤＬによって誘発される単球の走化性活性を防止することを示している。培養液単独（図中ではＬＤＬ、無細胞または細胞、ＬＤＬ無し）、正常動物由来コントロールＬＤＬ（２５０μｇ／ｍＬ）（図中ではＬＤＬ）、およびＬＤＬ＋正常動物由来ＨＤＬ（３５０μｇ／ｍＬ）（図中では＋ＨＤＬ）。他の混合培養は、種々の量（横座標に示したマイクログラム）のＤ−２ＦもしくはＬ−２Ｆ（左から３番目の図、２Ｆ）とともに、またはＤ−３７ｐＡもしくはＬ−３７ｐＡ（右側の最後の図、３７ｐＡ）とともにコントロールＬＤＬとインキュベートされた。データは４回の混合培養から得られた値の平均±ＳＤを示している。ＨＤＬまたは添加ペプチドの値は全て、ＬＤＬ単独（左側の最初の図）とはｐ＜０．０１で有意差を示した。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、本発明のアポＡ−Ｉペプチド類似物質をマウスに与えることによって赤血球がin vitro溶解に対して耐性になることを示している。図１０Ａおよび１０Ｂは、１８時間（図１０Ａ）および４８時間（図１０Ｂ）のin vitro赤血球細胞溶解アッセイの結果を示している。星印は、賦形剤を与えられた動物の赤血球細胞溶解と前記ペプチドを与えられた動物の赤血球細胞溶解との間に有意差（ｐ＜０．００１）が存在することを示している。
【図１１】図１１は、本発明のアポＡ−Ｉ類似Ｄペプチドをマウスに与えることによって循環ＬＤＬが酸化に対して耐性になることを示している。ＬＤＬレセプター欠損マウス群（ｎ＝３）にＤペプチドまたは賦形剤（食塩水）を経管投与によって与えた。各動物に１００μＬの食塩水、１００μｇ／１００μＬのペプチドＤ−２ＦまたはペプチドＤ−３７ｐＡを与えた。１７時間後に後眼窩洞から軽度の麻酔下で血液を採集した。ＦＰＬＣによって血漿からＬＤＬを単離した。動脈壁の混合培養を培養液単独（図中では無添加）、正常動物のコントロールＬＤＬ（図中ではＬＤＬ）、ＬＤＬ＋正常動物のコントロールＨＤＬ（図中では＋ＨＤＬ）とともにインキュベートした。他の混合培養は、食塩水（図中では食塩水ＬＤＬ）、Ｄ−２Ｆ（図中ではＤ−２Ｆ ＬＤＬ）またはＤ−３７ｐＡペプチド（図中ではＤ−３７ｐＡ ＤＤＬ）を経管投与した後のネズミのＬＤＬとともにインキュベートした。前記混合培養は１０％のＬＰＤＳの存在下で３７℃で４時間インキュベートした。続いて上清を廃棄し、前記混合培養を洗浄し、さらに血清またはＬＰＤＳを含まない培養液とともにさらに４時間インキュベートした。前記調整培養液を採集し、単球の走化性活性について分析した。値は４回の混合培養の平均±ＳＤである。星印はｐ＜０．００１を示している。
【図１２】図１２は、Ｄ型またはＬ型ペプチドを経管投与で与えられたマウスのリポタンパク質を比較する走化性アッセイの結果を示す。
【図１３】図１３Ａは、コントロールＨＤＬとＤ型ペプチドを経管投与で与えられたマウスのＨＤＬを比較する走化性アッセイの結果を示す。図１３Ｂは、Ｄ型ペプチドを経管投与で与えられたマウスのＬＤＬとＶＬＤＬ／ＩＤＬを比較する走化性アッセイの結果を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは２Ｆの電気泳動で、その自己結合を示す。図１４Ａ：２ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％）。レーン１は分子量スタンダードを示し、レーン２は、最小の分子量スタンダード（３．５−２．５ｋＤａ）よりもわずかに遅く移動する２Ｆ（分子量２２４２）に対応するバンドを示している。図１４Ｂ：１００μｇ／ｍＬ（レーン２）および２５０μｇ／ｍＬ（レーン1）の２Fの移動度を示す非変性ＰＡＧＥ（４−１２％）で、溶液中での自己結合を示している。レーン３は高分子量スタンダードの移動度を示す。
【図１５】図１５は、同種ペプチドシリーズはＤｉＰｏＰＥ二重膜の６相転移を安定化させることを示す。添加ペプチドのモル分画の関数としてのＤｉＰｏＰＥのＴ_Hシフトは、３７°／ｈの加熱スキャン速度でＤＳＣによって測定された。２Ｆ（黒丸）；３Ｆ³（白丸）；４Ｆ（黒四角）；５Ｆ（白四角）；６Ｆ（逆黒三角）；７Ｆ（黒三角）；アポＡ−Ｉ（白三角）。
【図１６】図１６は、同種ペプチドシリーズによるＥＰＣ・ＭＬＶの時間の関数として分解の相対直角光分散モニター（relative right angle light scattering monitoring）を示す。代表的なＥＰＣ・ＭＬＶ清澄曲線が同種ペプチドの各々について示される。等モル濃度のペプチドおよびＥＰＣを用いた（１０５μＭ）。励起および放射波長はともに４００ｎｍであった。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は最終濃度１ｍＭで完全な溶解を達成した。ＥＰＣ（黒丸）；２Ｆ（白丸）；３Ｆ³（黒四角）；３Ｆ¹⁴（白四角）；４Ｆ（黒三角）；５Ｆ（白三角）；６Ｆ（逆黒三角）；７Ｆ（逆白三角）；ヒトアポＡ−Ｉ（白菱形）；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（黒菱形）。
【図１７】図１７は同種ペプチドのＬＣＡＴ活性化能を示す。柱状図はＦ−ペプチドによるＬＣＡＴの活性化を示す。ＬＣＡＴ活性は、ＥＰＣ−コレステロールの単層小胞を用いて測定し、活性は、アポＡ−Ｉ活性（これを１００％とする）に対するパーセントとして表した。各値は３回の値の平均値である。用いたペプチド濃度は２０μｇ／ｍＬであった。
【図１８】図１８は、ＬＤＬ誘発単球走化性は同種ペプチドシリーズによって抑制されることを示す。ＬＤＬ単独またはヒトＨＤＬもしくは同種ペプチドシリーズと一緒にインキュベートしたＬＤＬをヒト動脈壁細胞混合培養に１０％のＬＰＤＳ存在下で８時間添加した。上清を除き、前記混合培養を血清またはＬＰＤＳを含まない培養液で洗浄した。続いて前記調整培養液を採集し、単球の走化性活性について分析した。データは平均±ＳＥＭ値（各事例でｎ＝９）を表す。ＬＤＬとのペア比較によれば、３Ｆペプチドを除く全てのペプチドが顕著に有効であった（少なくともｐ＜０．００１、長十字および星印によって示されている）。全てのペプチド間の比較は一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。星印は、ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆは同族体の２Ｆおよび７Ｆよりも有意に有効であることを示している（デュケット（Duckett）比較によってｐ＜０．０５）。表中のかぎ括弧は、これら３つのペプチド間ではＬＤＬ誘発走化性の抑制能力に有意差はないことを示している。
【図１９】図１９は、インフルエンザＡの感染は肝臓の酸化リン脂質を感染後２日で増加させることを示す。固形飼料で飼育したＣ５７ＢＬ／６マウスに、文献（Van Lenten et al. Circulation, 103:2283-2288(2001)）に記載されたようにウイルス血症が生じないような投与量のインフルエンザＡウイルスを経鼻的に感染させた。感染後０、２、３、５、７および９日後に、肝臓を取り出し、酸化リン脂質含有量をＥＳＩ−ＭＳで測定した。
【図２０】図２０は、Ｄ−４ＦはインフルエンザＡ感染後のパラオキソゲナーゼ活性の低下を防止することを示す。図１９のマウス数匹の腹腔内に２０μｇのＤ−４Ｆを毎日注射し、他のマウスにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。パラオキソゲナーゼ活性（ＰＯＮ）を感染後０、２、７および９日に測定した。
【図２１】図２１は、Ｄ−４ＦはインフルエンザＡ感染マウスの大動脈で酸化リン脂質の誘発を防止することを示す。図１９のマウス数匹の腹腔内に２０μｇのＤ−４Ｆを毎日注射し、他のマウスにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。前記マウスの大動脈を感染後０、２、７および９日に採取し、ＥＳＩ−ＭＳで酸化リン脂質含有量を測定した。
【図２２】図２２Ａから２２Ｃは、経口投与後に、Ｄ−４ＦはＬＤＬレセプター欠損マウスの循環血流中で完全なままで（ただしＬ−４Ｆはそうではなかった）、さらにＨＤＬの能力を強化しヒト大動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護してＬＤＬ誘発単球走化性活性を低下させることを示す。図２２Ａ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆをヨードビーズ試薬を用いて放射能標識し、ＬＤＬレセプター欠損マウスに経口経管投与によって与えた［非標識ペプチド＋¹²⁵Ｉ−標識ペプチド（比活性１１×１０⁶ｃｐｍ／μｇ／動物）の１００μｇを含む１００μＬの食塩水、ｎ＝３］。血液を４時間後に採集し、血漿を分離し脂質を除去し、参考文献１２に記載されたように逆相ＨＰＬＣで分析した。図ＢおよびＣ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆ（各動物に１００μＬの食塩水中の１００μｇ）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与で与えた。血液を６時間後に採集し、血漿ＨＤＬおよびＬＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）によって単離し、混合培養で調べた。図２２Ｂ：ヒト動脈壁細胞による酸化からコントロールのヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）を保護するマウスおよびヒトＨＤＬの能力、およびＬＤＬ−誘発単球走化性活性を抑制する同能力が示される。２００μｇタンパク質／ｍＬの濃度のヒトＬＤＬをヒト動脈壁細胞の混合培養にヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇタンパク質／ｍＬ）またはマウスＨＤＬ（ｍＨＤＬ）（１００μｇコレステロール／ｍＬ）［前記マウスＨＤＬは、食塩水投与マウス（図中では食塩水Ｒｘ）またはＬ−４Ｆ（図中ではＬ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（図中ではＤ−４ＦＲｘ）投与マウスから採取］とともに添加し、本明細書に記載したように単球の走化性活性を決定した。図２２Ｃ：マウスＬＤＬの単球走化性活性誘発能力を示す。アッセイコントロールは図Ｂのように左側に示されている。右側については、食塩水投与マウス（食塩水Ｒｘ）、またはＬ−４Ｆ（Ｌ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（Ｄ−４ＦＲｘ）投与マウスからマウスＬＤＬ（ｍＬＤＬ）を単離し、これをＨＤＬ無しに動脈壁細胞混合培養に１００μｇ／ｍＬで添加し、単球の走化性活性を測定した。値は、２つの別個の実験での４つのウェルの平均±ＳＤである。
【図２３】図２３は、Ｄ−４Ｆの経口投与は西洋風食餌を与えたＬＤＬレセプター欠損マウスで劇的に病巣を減少させることを示す。ＬＤＬレセプター欠損マウス群に西洋風食餌を与え、さらに１００μＬの食塩水単独（図中では食塩水）（ｎ＝４）、またはＤ−４Ｆを含まない１００μＬのリポソーム（図中ではリポソーム）（ｎ＝５）、または１００μＬのリポソーム中の２．５ｍｇのＤ−４Ｆペプチド（図中ではＤ−４Ｆリポソーム）（ｎ＝６匹の動物）を経口経管投与により１日２回６週間与えた。マウスから採血し、その後殺して大動脈根を固定し、切片を作製し、脂肪線病巣のオイルレッドＯ染色の程度を定量した。
【図２４】図２４は、Ｄ−４Ｆの経口投与は固形飼料を与えたアポＥ欠損マウスで劇的に病巣を減少させることを示す。４週齢の数匹のアポＥ欠損マウスの飲料水にＤ−４Ｆを添加し、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤ−４Ｆを与えた（ｎ＝４マウス）。別の群のマウスの飲料水には２ｍｇ／ｍＬの濃度のＤ−４Ｆを添加し（ｎ＝４）、さらに第三の群のマウスの飲料水にはペプチドを添加しなかった（ｎ＝５）。全てのマウスは１日あたり約２．５ｍＬの水を消費し、したがって１つの群のマウスはペプチドを全く投与されず（図中では水）、第二の群は２．５ｍｇのＤ−４Ｆ／マウス／日（図中では２．５ｍｇＤ−４Ｆ）を投与され、さらに第三の群は５．０ｍｇのＤ−４Ｆ／マウス／日（図中では５．０ｍｇＤ−４Ｆ）を投与された。全マウスは５週間固形飼料で飼育され、前記５週間の時点でマウスから採血し、その後殺して大動脈根を固定し、切片を作製し、脂肪線病巣のオイルレッドＯ染色の程度を定量した。
【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症の症状を改善する、経口投与に適した組成物であって、前記組成物が、ヒトアポＡ−ＩペプチドまたはヒトアポＡ−Ｉペプチド類似体であるペプチドを含み、前記ペプチドがアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドが複数のＤアミノ酸残基を含む、前記経口投与に適した組成物。
【請求項２】
前記第一の保護基および前記第二の保護基が、それぞれ別個に
アセチル、アミド、３から２０個の炭素のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ），４，４＝−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメンチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）
から成る群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第一の保護基がアセチルである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第二の保護基がアミドである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドを構成する鏡像異性アミノ酸の半分を超えるものがＤアミノ酸である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドを構成する全ての鏡像異性アミノ酸がＤアミノ酸である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物がさらに医薬的に許容できる賦形剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記賦形剤が経口投与に適した賦形剤である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記賦形剤が注射に適した賦形剤である請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが酸化物質による酸化からリン脂質を保護する請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸化物質が、過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥおよびＨＥＴＥから成る群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リン脂質が、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＡＰＥ）から成る群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
アテローム性動脈硬化症の症状を改善する薬剤の製造における、ヒトアポＡ−ＩペプチドまたはヒトアポＡ−Ｉペプチド類似体であるペプチドを含む組成物の使用であって、前記ペプチドがアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドが複数のＤアミノ酸残基を含む、前記使用。
【請求項１４】
アテローム性動脈硬化症の症状を改善するキットであって、前記キットが、アテローム性動脈硬化症の症状を改善する経口投与に適した組成物を収納する容器を含み、前記組成物が、ヒトアポＡ−ＩペプチドまたはヒトアポＡ−Ｉペプチド類似体であるペプチドを含み、前記ペプチドがアミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドが複数のＤアミノ酸残基を含む、前記アテローム性動脈硬化症の症状を改善するキット。
【請求項１５】
前記ペプチドが医薬的に許容できる賦形剤と個別投薬形態で結合されている請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
さらに、アテローム性動脈硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善するために前記ペプチドの使用を説明する指示物を含む請求項１４に記載のキット。

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８】

【図９】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２２Ｃ】

【図２３】

【図２４】

【公開番号】特開２００７−２７７２５０（Ｐ２００７−２７７２５０Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１８４５１（Ｐ２００７−１１８４５１）
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【分割の表示】特願２００６−２２０８３１（Ｐ２００６−２２０８３１）の分割
【原出願日】平成１３年８月２３日（２００１．８．２３）
【出願人】（５０００２７９３２）ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア (39)
【Ｆターム（参考）】