アパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなる人工骨、及びその製造方法
【課題】支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆することで加重部位に適用できる強度を有し、かつ骨伝導能に優れた人工骨、及びその製造方法を提供する。
【解決手段】支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなることを特徴とする人工骨、及び支持体を繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体の分散液に浸漬し乾燥する工程を有することを特徴とする前記人工骨製造方法。
【解決手段】支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなることを特徴とする人工骨、及び支持体を繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体の分散液に浸漬し乾燥する工程を有することを特徴とする前記人工骨製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、材料表面がアパタイト／コラーゲン複合体で被覆された人工骨に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、外傷や病気により生じた骨欠損部の治療法として、患者自身の骨を採取して用いる自家骨移植、他人から提供された骨を用いる同種骨移植、チタンなどの金属や水酸アパタイトセラミックスで作られた人工骨の補填などがある。その中でも水酸アパタイトセラミックスは従来の金属、高分子、アルミナセラミックスにはない骨伝導を有し、骨と直接結合するという特徴を持つため、発売開始後、口腔外科、脳神経外科、耳鼻咽喉科、整形外科などの幅広い領域で自家骨に代わる骨修復材料として徐々に普及してきた。しかし、水酸アパタイトセラミックスに代表されるセラミックス人工骨は硬く脆いために術中に取り扱いづらいとの問題点があった。
【０００３】
材料の取り扱いを容易にするためにスポンジ状の弾力性を持ったアパタイト／コラーゲン複合体 が開発されている。例えば特表平11-513590号（特許文献１）は、アパタイト人工骨より自家骨の組成に近く、生体内で分解する人工骨として、ハイドロキシアパタイトにコラーゲン及び必要に応じてその他のバインダーが結合したネットワークを含む多孔体を開示している。この多孔体は生体分解性を有するので、多孔体内に自家骨が形成されるとともに、それ自身は体内に吸収される。そのため脊椎固定、骨欠損の補填、骨折修復、周欠損移植等に利用できる。しかし、特表平11-513590号に記載のアパタイト／コラーゲン複合体は強度が低いため加重部位には適用できないといった問題がある。
【０００４】
一方で、加重部位に適用される金属材料等は、骨伝導能がアパタイト系セラミックス人工骨に比べて劣るため、骨癒合しにくいといった問題がある。
【０００５】
【特許文献１】特表平11-513590号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆することで加重部位に適用できる強度を有し、かつ骨伝導能に優れた人工骨、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、セラミックス、金属又はポリマーの支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆してなる人工骨が骨伝導能に優れていることを見出し、本発明に想到した。
【０００８】
すなわち、本発明の人工骨は、支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなることを特徴とする。
【０００９】
前記支持体はセラミックス、金属又はポリマーであるのが好ましい。前記セラミックスはリン酸カルシウムであるのが好ましい。
【００１０】
支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなる人工骨を製造する本発明の方法は、支持体を繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体の分散液に浸漬し乾燥する工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の人工骨は、骨類似の構造と組成を有するアパタイト／コラーゲン複合体で表面が被覆されているので、優れた骨伝導能を有する。支持体として、セラミックス、金属又はポリマーを用いることにより、加重がかかる部位への使用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
[1] 人工骨
本発明の人工骨は、自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を支持体表面に被覆してなる。アパタイト／コラーゲン複合体は生体材料として好ましいため、本発明の人工骨は優れた生体親和性及び骨伝導能を有する。γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理することにより、加重部位に適用可能な骨再建材等として使用できる。
【００１３】
人工骨を形成する支持体は特に限定されないが、セラミックス、金属、ポリマー等を使用することができる。セラミックスとしては、リン酸カルシウムが好ましい。金属としては、チタンが好ましい。ポリマーを用いる場合、ポリマー自体が骨融合性を有するのが好ましく、特にポリ乳酸が好ましい。支持体の表面は、アパタイト／コラーゲン複合体が被覆されやすく、骨伝導性を高めるため、ある程度の粗さを有するのが好ましい。また、支持体は多孔体であるのが好ましい。多孔体である場合、特に制限はされないが、気孔率は30〜92％であるのが好ましく、50〜90％であるのがより好ましい。気孔率を前記範囲とすることで、人工骨は、機械的強度を維持しつつ、かつ気孔内にアパタイト/コラーゲン複合体を比較的多量に含むことが可能となるため、骨伝導能に優れたものとなる。人工骨は、アパタイト/コラーゲン複合体が気孔内に密に充填されても良いが、気孔壁に薄膜状に形成されても良い。アパタイト/コラーゲン複合体が気孔壁に薄膜状に形成される場合、体液の流通がよりスムーズとなり、骨形成が促進される可能性がある。支持体の形状は、特に限定されず、患部の治療に必要なものを採用することができるが、例えば直方体、角柱状、円柱状、ネジ状、ピン状、ワッシャー状、顆粒状が挙げられる。
【００１４】
[2] 製造方法
本発明の人工骨は、アパタイト／コラーゲン複合体を支持体の表面に被覆することによって得られる。アパタイト／コラーゲン複合体は、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンが自己組織化的に配向し、生体骨に類似の複合体を形成しているのが好ましい。本明細書中「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、アパタイト構造を有する水酸化リン酸カルシウム（ハイドロキシアパタイト）が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのC軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。
【００１５】
(1) アパタイト／コラーゲン複合体の製造
(a) 原料
アパタイト／コラーゲン複合体は、コラーゲン、リン酸塩及びカルシウム塩を原料として製造する。コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものが使用でき、由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（例えばニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用することができる。なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。また動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
【００１６】
リン酸又はその塩（以下単に「リン酸（塩）」という）としては、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。またカルシウム塩としては、例えば炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。リン酸塩及びカルシウム塩はそれぞれ均一な水溶液又は懸濁液の状態で添加するのが好ましい。
【００１７】
本発明に使用するアパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの混合比は、機械的強度の面から9/1〜6/4（質量比）が好ましく、8.5/1.5〜7/3（質量比）がより好ましく、約8/2（質量比）が最も好ましい。
【００１８】
(b) 溶液の調製
コラーゲン／リン酸（塩）水溶液、及びカルシウム塩水溶液（又は懸濁液）を調製する。コラーゲン／リン酸（塩）水溶液はコラーゲンとリン酸（塩）を溶解した水溶液で、コラーゲンの濃度は0.1〜1.5質量％が好ましく、約0.85質量％が特に好ましい。またリン酸（塩）の濃度は15〜240 mMが好ましく、約120 mMが特に好ましい。カルシウム塩水溶液（又は懸濁液）の濃度は50〜800 mMが好ましく、約400 mMが特に好ましい。各溶液の濃度を調整することにより、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維長を調整することができる。具体的には、各溶液の濃度を高くすると繊維長は短くなり、各溶液の濃度を低くすると繊維長は長くなる。コラーゲンは一般的にはリン酸水溶液の状態で、前述のリン酸（塩）水溶液に加える。コラーゲンのリン酸水溶液としては、コラーゲンの濃度が約0.85質量％、リン酸の濃度が20 mM程度のものを使用するのが好ましい。
【００１９】
(c) 合成方法
添加するカルシウム塩水溶液又は懸濁液の量とほぼ同量の水に、約40℃でコラーゲンを含有するリン酸（塩）水溶液、及びカルシウム塩水溶液又は懸濁液を同時に滴下することにより、アパタイト／コラーゲン複合体が生成する。滴下条件を制御することにより、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維長を制御できる。滴下速度は1〜60 mL/分が好ましく、約30 mL/分がより好ましい。攪拌速度は1〜400 rpmが好ましく、約200 rpmがより好ましい。リン酸（塩）及びカルシウム塩の混合比率は、1：1〜2：5が好ましく、3：5がより好ましい。またコラーゲンとアパタイト（リン酸塩とカルシウム塩の総量）の混合比率は、1：9〜4：6が好ましく、1.5：8.5〜3：7がより好ましい。
【００２０】
反応液中のカルシウムイオン濃度を3.75 mM以下、リン酸イオン濃度を2.25 mM以下に維持することにより、反応液のpHは8.9〜9.1に保つのが好ましい。カルシウムイオン及び／又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、複合体の自己組織化が妨げられる。上記の滴下条件により、自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は、粉末状アパタイト／コラーゲンの原料として好適な２ mm以下となる。
【００２１】
滴下終了後、スラリー状となったアパタイト／コラーゲン複合体の水分散物は凍結乾燥する。凍結乾燥は、-10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。
【００２２】
(2) 人工骨の製造
(a) アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散液の調製
アパタイト／コラーゲン複合体の粉末を水、生理食塩水等に加えて撹拌し、分散液を調製する。分散液中のアパタイト／コラーゲン複合体の濃度は、どのような量の複合体を支持体に被覆するかによって適宜選択できるが、1〜30質量％であるのが好ましく、3〜10質量％であるのがより好ましい。支持体への被覆量は、分散液の粘度によって制御することができる。液体を加えた後で分散液を撹拌すると、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維の一部が切断され繊維の長さの分布が大きくなる。撹拌条件を調節することにより、得られる被覆膜の強度を向上させることができる。
【００２３】
支持体とアパタイト／コラーゲン複合体との密着性を高めるため、分散液にさらにバインダーを添加するのが好ましい。バインダーとしては、可溶性コラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、カルボキシメチルセルロース、セルロースエステル、デキストロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、フィコール、コンドロイチン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、水溶性ポリアクリレート、水溶性ポリメタクリレート等が挙げられ、特に可溶性コラーゲンが好ましい。バインダーの添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体100質量％に対して、0.１〜10質量％が好ましく、0.5〜５質量％がより好ましい。
【００２４】
アパタイト／コラーゲン複合体を製造する場合と同様に、バインダーはリン酸水溶液の状態で加えるのが好ましい。添加するバインダー溶液の濃度等は特に限定されないが、実用的にはバインダーの濃度が約0.85質量％、リン酸の濃度が20 mM程度が好ましい。
【００２５】
バインダーのリン酸（塩）水溶液の添加後、水酸化ナトリウム水溶液で分散液のpHを７程度に調製する。分散液のpHは後述するゲル化処理時にコラーゲンがゼラチンに変性するのを防止するため6.8〜7.6が好ましく、7.0〜7.4がより好ましい。
【００２６】
バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進させるため、分散液にリン酸バッファー生理食塩水（PBS）の濃縮液（10倍程度）を添加し、イオン強度を0.2〜１に調整する。より好ましいイオン強度は、PBSと同程度の約0.8である。
【００２７】
本発明の目的を損なわない範囲内で、分散液にさら抗生物質（テトラサイクリン等）、抗癌剤（シスプラチン等）、骨髄細胞、細胞増殖因子（BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF、VEGF等）、生理活性因子（ホルモン、サイトカイン等）等の添加剤を添加することができる。
【００２８】
(b) 支持体への被覆
得られた分散液に支持体を浸漬し、支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆する。支持体として多孔体を用いた場合、細孔内に分散液が浸透するように、支持体を分散液に浸漬下状態で真空デシケータ等で減圧するのが好ましい。分散液の粘度及び支持体を分散液から引き上げる速度によって被覆量を調節することができる。被覆量はアパタイト／コラーゲン複合体を乾燥させたときの厚さで、1〜3000μmであるのが好ましく、300〜1000μmであるのがより好ましい。
【００２９】
(c) 分散液のゲル化
分散液を被覆した後、35〜45℃に保持することにより、バインダーとして加えたコラーゲンが繊維化し、分散液がゲル状となる。ゲル化により、均一な多孔被覆膜が得られる。より好ましい保持温度は35〜40℃である。保持時間は0.5〜3.5時間が好ましく、１〜３時間がより好ましい。
【００３０】
(d) 凍結乾燥
支持体に被覆した分散液は凍結する。凍結温度は-80〜-10℃であるのが好ましく、-80〜-20℃であるのがより好ましい。凍結速度により、被覆膜の気孔径及び気孔形状を制御することができる。例えば凍結速度が大きいと、生成する多孔質体の気孔径は小さくなる傾向がある。
【００３１】
凍結した被覆膜は凍結乾燥する。凍結乾燥は複合体の場合と同様に、-10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。凍結乾燥は分散液が十分に乾燥するまで行えばよく時間は特に制限されないが、一般的には24〜72時間程度である。
【００３２】
(e) コラーゲンの架橋
機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工骨の被覆膜を所望の期間保持し得るようにするため、被覆膜中のコラーゲンを架橋するのが好ましい。コラーゲンの架橋は、γ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いた物理的架橋、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋等の方法を用いて行うことができる。化学的架橋は、例えば凍結乾燥後の被覆膜を架橋剤の溶液に浸漬する方法、凍結乾燥後の被覆膜に架橋剤を含有する蒸気を作用させる方法、又はアパタイト／コラーゲン複合体を製造する際に水溶液又は懸濁液中に架橋剤を添加する方法により行うことができる。
【００３３】
架橋剤としては、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド、エチレングリコールジエチルエーテル等のエポキシ化合物、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤のうち、架橋度の制御の容易さや、得られるアパタイト／コラーゲン架橋被覆膜の生体適合性の観点から、グルタールアルデヒドが特に好ましい。
【００３４】
被覆膜をグルタールアルデヒド溶液に浸漬して架橋する場合、グルタールアルデヒド溶液の濃度は0.005〜0.015質量％が好ましく、0.005〜0.01質量％がより好ましい。グルタールアルデヒドの溶媒としてエタノール等のアルコールを使用すると、架橋と同時に脱水もされるため、アパタイト／コラーゲン複合体が収縮した状態で架橋が起こり、生成するアパタイト／コラーゲン架橋被覆膜の弾性が向上する。
【００３５】
架橋処理後、未反応のグルタールアルデヒドを除去するため２質量％程度のグリシン水溶液にアパタイト／コラーゲン架橋被覆膜を浸漬し水洗する。さらにエタノールに浸漬し脱水した後、室温で乾燥させる。
【００３６】
被覆後の人工骨は紫外線、γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理してもよい。
【実施例】
【００３７】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
120 mMリン酸水溶液400 mlに、コラーゲンのリン酸水溶液（濃度0.97 wt%、20 mMリン酸）を412 g加えて撹拌することにより溶液Iを得た。他方、400 mM水酸化カルシウム溶液（溶液II）を400 ml調製した。200 mlの水を入れた容器に溶液I及びIIを同時に滴下し、アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散液を作製した。反応溶液は200 rpmで撹拌し、滴下速度は約30 ml/minであった。溶液I及び溶液IIの滴下速度は、反応溶液のpHが8.9〜9.1に保持されるように調節した。生成したアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は、概ね２ mm以下であった。得られたスラリーは、凍結及び凍結乾燥した。複合体中のアパタイト／コラーゲンの配合比は8/2（質量比）であった。
【００３９】
500 mlの生理食塩水に、乾燥したアパタイト／コラーゲン複合体繊維を40 g、pH調整用の1N水酸化ナトリウム水溶液を２ mL、及び結合材用の0.58質量％コラーゲン水溶液（20 mMリン酸水溶液に溶解したもの）を66 g添加し、回転数10000 rpmで３分間攪拌しアパタイト／コラーゲン複合体の分散液を作製した。この分散液に、支持体として気孔率85％のリン酸カルシウムを浸漬し、真空デシケータを用いて減圧することで多孔体内部にも分散液を十分に浸透させた。分散液から引き上げた後、アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散液が被覆された支持体を、37℃のインキュベータで２時間ゲル化処理を行い、-５℃で12時間冷却し、さらに-30℃の冷凍庫で被覆膜を凍結させた。次いで凍結乾燥機を用いて乾燥させた後、140℃で12時間真空熱脱水架橋を行い、アパタイト／コラーゲン複合体が被覆された人工骨を得た。人工骨を任意の位置で破断し、破断面をSEMで確認したところ、気孔内にアパタイト/コラーゲン複合体の被覆層が確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、材料表面がアパタイト／コラーゲン複合体で被覆された人工骨に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、外傷や病気により生じた骨欠損部の治療法として、患者自身の骨を採取して用いる自家骨移植、他人から提供された骨を用いる同種骨移植、チタンなどの金属や水酸アパタイトセラミックスで作られた人工骨の補填などがある。その中でも水酸アパタイトセラミックスは従来の金属、高分子、アルミナセラミックスにはない骨伝導を有し、骨と直接結合するという特徴を持つため、発売開始後、口腔外科、脳神経外科、耳鼻咽喉科、整形外科などの幅広い領域で自家骨に代わる骨修復材料として徐々に普及してきた。しかし、水酸アパタイトセラミックスに代表されるセラミックス人工骨は硬く脆いために術中に取り扱いづらいとの問題点があった。
【０００３】
材料の取り扱いを容易にするためにスポンジ状の弾力性を持ったアパタイト／コラーゲン複合体 が開発されている。例えば特表平11-513590号（特許文献１）は、アパタイト人工骨より自家骨の組成に近く、生体内で分解する人工骨として、ハイドロキシアパタイトにコラーゲン及び必要に応じてその他のバインダーが結合したネットワークを含む多孔体を開示している。この多孔体は生体分解性を有するので、多孔体内に自家骨が形成されるとともに、それ自身は体内に吸収される。そのため脊椎固定、骨欠損の補填、骨折修復、周欠損移植等に利用できる。しかし、特表平11-513590号に記載のアパタイト／コラーゲン複合体は強度が低いため加重部位には適用できないといった問題がある。
【０００４】
一方で、加重部位に適用される金属材料等は、骨伝導能がアパタイト系セラミックス人工骨に比べて劣るため、骨癒合しにくいといった問題がある。
【０００５】
【特許文献１】特表平11-513590号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆することで加重部位に適用できる強度を有し、かつ骨伝導能に優れた人工骨、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、セラミックス、金属又はポリマーの支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆してなる人工骨が骨伝導能に優れていることを見出し、本発明に想到した。
【０００８】
すなわち、本発明の人工骨は、支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなることを特徴とする。
【０００９】
前記支持体はセラミックス、金属又はポリマーであるのが好ましい。前記セラミックスはリン酸カルシウムであるのが好ましい。
【００１０】
支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなる人工骨を製造する本発明の方法は、支持体を繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体の分散液に浸漬し乾燥する工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の人工骨は、骨類似の構造と組成を有するアパタイト／コラーゲン複合体で表面が被覆されているので、優れた骨伝導能を有する。支持体として、セラミックス、金属又はポリマーを用いることにより、加重がかかる部位への使用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
[1] 人工骨
本発明の人工骨は、自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を支持体表面に被覆してなる。アパタイト／コラーゲン複合体は生体材料として好ましいため、本発明の人工骨は優れた生体親和性及び骨伝導能を有する。γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理することにより、加重部位に適用可能な骨再建材等として使用できる。
【００１３】
人工骨を形成する支持体は特に限定されないが、セラミックス、金属、ポリマー等を使用することができる。セラミックスとしては、リン酸カルシウムが好ましい。金属としては、チタンが好ましい。ポリマーを用いる場合、ポリマー自体が骨融合性を有するのが好ましく、特にポリ乳酸が好ましい。支持体の表面は、アパタイト／コラーゲン複合体が被覆されやすく、骨伝導性を高めるため、ある程度の粗さを有するのが好ましい。また、支持体は多孔体であるのが好ましい。多孔体である場合、特に制限はされないが、気孔率は30〜92％であるのが好ましく、50〜90％であるのがより好ましい。気孔率を前記範囲とすることで、人工骨は、機械的強度を維持しつつ、かつ気孔内にアパタイト/コラーゲン複合体を比較的多量に含むことが可能となるため、骨伝導能に優れたものとなる。人工骨は、アパタイト/コラーゲン複合体が気孔内に密に充填されても良いが、気孔壁に薄膜状に形成されても良い。アパタイト/コラーゲン複合体が気孔壁に薄膜状に形成される場合、体液の流通がよりスムーズとなり、骨形成が促進される可能性がある。支持体の形状は、特に限定されず、患部の治療に必要なものを採用することができるが、例えば直方体、角柱状、円柱状、ネジ状、ピン状、ワッシャー状、顆粒状が挙げられる。
【００１４】
[2] 製造方法
本発明の人工骨は、アパタイト／コラーゲン複合体を支持体の表面に被覆することによって得られる。アパタイト／コラーゲン複合体は、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンが自己組織化的に配向し、生体骨に類似の複合体を形成しているのが好ましい。本明細書中「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、アパタイト構造を有する水酸化リン酸カルシウム（ハイドロキシアパタイト）が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのC軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。
【００１５】
(1) アパタイト／コラーゲン複合体の製造
(a) 原料
アパタイト／コラーゲン複合体は、コラーゲン、リン酸塩及びカルシウム塩を原料として製造する。コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものが使用でき、由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（例えばニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用することができる。なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。また動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
【００１６】
リン酸又はその塩（以下単に「リン酸（塩）」という）としては、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。またカルシウム塩としては、例えば炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。リン酸塩及びカルシウム塩はそれぞれ均一な水溶液又は懸濁液の状態で添加するのが好ましい。
【００１７】
本発明に使用するアパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの混合比は、機械的強度の面から9/1〜6/4（質量比）が好ましく、8.5/1.5〜7/3（質量比）がより好ましく、約8/2（質量比）が最も好ましい。
【００１８】
(b) 溶液の調製
コラーゲン／リン酸（塩）水溶液、及びカルシウム塩水溶液（又は懸濁液）を調製する。コラーゲン／リン酸（塩）水溶液はコラーゲンとリン酸（塩）を溶解した水溶液で、コラーゲンの濃度は0.1〜1.5質量％が好ましく、約0.85質量％が特に好ましい。またリン酸（塩）の濃度は15〜240 mMが好ましく、約120 mMが特に好ましい。カルシウム塩水溶液（又は懸濁液）の濃度は50〜800 mMが好ましく、約400 mMが特に好ましい。各溶液の濃度を調整することにより、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維長を調整することができる。具体的には、各溶液の濃度を高くすると繊維長は短くなり、各溶液の濃度を低くすると繊維長は長くなる。コラーゲンは一般的にはリン酸水溶液の状態で、前述のリン酸（塩）水溶液に加える。コラーゲンのリン酸水溶液としては、コラーゲンの濃度が約0.85質量％、リン酸の濃度が20 mM程度のものを使用するのが好ましい。
【００１９】
(c) 合成方法
添加するカルシウム塩水溶液又は懸濁液の量とほぼ同量の水に、約40℃でコラーゲンを含有するリン酸（塩）水溶液、及びカルシウム塩水溶液又は懸濁液を同時に滴下することにより、アパタイト／コラーゲン複合体が生成する。滴下条件を制御することにより、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維長を制御できる。滴下速度は1〜60 mL/分が好ましく、約30 mL/分がより好ましい。攪拌速度は1〜400 rpmが好ましく、約200 rpmがより好ましい。リン酸（塩）及びカルシウム塩の混合比率は、1：1〜2：5が好ましく、3：5がより好ましい。またコラーゲンとアパタイト（リン酸塩とカルシウム塩の総量）の混合比率は、1：9〜4：6が好ましく、1.5：8.5〜3：7がより好ましい。
【００２０】
反応液中のカルシウムイオン濃度を3.75 mM以下、リン酸イオン濃度を2.25 mM以下に維持することにより、反応液のpHは8.9〜9.1に保つのが好ましい。カルシウムイオン及び／又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、複合体の自己組織化が妨げられる。上記の滴下条件により、自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は、粉末状アパタイト／コラーゲンの原料として好適な２ mm以下となる。
【００２１】
滴下終了後、スラリー状となったアパタイト／コラーゲン複合体の水分散物は凍結乾燥する。凍結乾燥は、-10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。
【００２２】
(2) 人工骨の製造
(a) アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散液の調製
アパタイト／コラーゲン複合体の粉末を水、生理食塩水等に加えて撹拌し、分散液を調製する。分散液中のアパタイト／コラーゲン複合体の濃度は、どのような量の複合体を支持体に被覆するかによって適宜選択できるが、1〜30質量％であるのが好ましく、3〜10質量％であるのがより好ましい。支持体への被覆量は、分散液の粘度によって制御することができる。液体を加えた後で分散液を撹拌すると、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維の一部が切断され繊維の長さの分布が大きくなる。撹拌条件を調節することにより、得られる被覆膜の強度を向上させることができる。
【００２３】
支持体とアパタイト／コラーゲン複合体との密着性を高めるため、分散液にさらにバインダーを添加するのが好ましい。バインダーとしては、可溶性コラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、カルボキシメチルセルロース、セルロースエステル、デキストロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、フィコール、コンドロイチン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、水溶性ポリアクリレート、水溶性ポリメタクリレート等が挙げられ、特に可溶性コラーゲンが好ましい。バインダーの添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体100質量％に対して、0.１〜10質量％が好ましく、0.5〜５質量％がより好ましい。
【００２４】
アパタイト／コラーゲン複合体を製造する場合と同様に、バインダーはリン酸水溶液の状態で加えるのが好ましい。添加するバインダー溶液の濃度等は特に限定されないが、実用的にはバインダーの濃度が約0.85質量％、リン酸の濃度が20 mM程度が好ましい。
【００２５】
バインダーのリン酸（塩）水溶液の添加後、水酸化ナトリウム水溶液で分散液のpHを７程度に調製する。分散液のpHは後述するゲル化処理時にコラーゲンがゼラチンに変性するのを防止するため6.8〜7.6が好ましく、7.0〜7.4がより好ましい。
【００２６】
バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進させるため、分散液にリン酸バッファー生理食塩水（PBS）の濃縮液（10倍程度）を添加し、イオン強度を0.2〜１に調整する。より好ましいイオン強度は、PBSと同程度の約0.8である。
【００２７】
本発明の目的を損なわない範囲内で、分散液にさら抗生物質（テトラサイクリン等）、抗癌剤（シスプラチン等）、骨髄細胞、細胞増殖因子（BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF、VEGF等）、生理活性因子（ホルモン、サイトカイン等）等の添加剤を添加することができる。
【００２８】
(b) 支持体への被覆
得られた分散液に支持体を浸漬し、支持体表面にアパタイト／コラーゲン複合体を被覆する。支持体として多孔体を用いた場合、細孔内に分散液が浸透するように、支持体を分散液に浸漬下状態で真空デシケータ等で減圧するのが好ましい。分散液の粘度及び支持体を分散液から引き上げる速度によって被覆量を調節することができる。被覆量はアパタイト／コラーゲン複合体を乾燥させたときの厚さで、1〜3000μmであるのが好ましく、300〜1000μmであるのがより好ましい。
【００２９】
(c) 分散液のゲル化
分散液を被覆した後、35〜45℃に保持することにより、バインダーとして加えたコラーゲンが繊維化し、分散液がゲル状となる。ゲル化により、均一な多孔被覆膜が得られる。より好ましい保持温度は35〜40℃である。保持時間は0.5〜3.5時間が好ましく、１〜３時間がより好ましい。
【００３０】
(d) 凍結乾燥
支持体に被覆した分散液は凍結する。凍結温度は-80〜-10℃であるのが好ましく、-80〜-20℃であるのがより好ましい。凍結速度により、被覆膜の気孔径及び気孔形状を制御することができる。例えば凍結速度が大きいと、生成する多孔質体の気孔径は小さくなる傾向がある。
【００３１】
凍結した被覆膜は凍結乾燥する。凍結乾燥は複合体の場合と同様に、-10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。凍結乾燥は分散液が十分に乾燥するまで行えばよく時間は特に制限されないが、一般的には24〜72時間程度である。
【００３２】
(e) コラーゲンの架橋
機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工骨の被覆膜を所望の期間保持し得るようにするため、被覆膜中のコラーゲンを架橋するのが好ましい。コラーゲンの架橋は、γ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いた物理的架橋、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋等の方法を用いて行うことができる。化学的架橋は、例えば凍結乾燥後の被覆膜を架橋剤の溶液に浸漬する方法、凍結乾燥後の被覆膜に架橋剤を含有する蒸気を作用させる方法、又はアパタイト／コラーゲン複合体を製造する際に水溶液又は懸濁液中に架橋剤を添加する方法により行うことができる。
【００３３】
架橋剤としては、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド、エチレングリコールジエチルエーテル等のエポキシ化合物、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤のうち、架橋度の制御の容易さや、得られるアパタイト／コラーゲン架橋被覆膜の生体適合性の観点から、グルタールアルデヒドが特に好ましい。
【００３４】
被覆膜をグルタールアルデヒド溶液に浸漬して架橋する場合、グルタールアルデヒド溶液の濃度は0.005〜0.015質量％が好ましく、0.005〜0.01質量％がより好ましい。グルタールアルデヒドの溶媒としてエタノール等のアルコールを使用すると、架橋と同時に脱水もされるため、アパタイト／コラーゲン複合体が収縮した状態で架橋が起こり、生成するアパタイト／コラーゲン架橋被覆膜の弾性が向上する。
【００３５】
架橋処理後、未反応のグルタールアルデヒドを除去するため２質量％程度のグリシン水溶液にアパタイト／コラーゲン架橋被覆膜を浸漬し水洗する。さらにエタノールに浸漬し脱水した後、室温で乾燥させる。
【００３６】
被覆後の人工骨は紫外線、γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理してもよい。
【実施例】
【００３７】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
120 mMリン酸水溶液400 mlに、コラーゲンのリン酸水溶液（濃度0.97 wt%、20 mMリン酸）を412 g加えて撹拌することにより溶液Iを得た。他方、400 mM水酸化カルシウム溶液（溶液II）を400 ml調製した。200 mlの水を入れた容器に溶液I及びIIを同時に滴下し、アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散液を作製した。反応溶液は200 rpmで撹拌し、滴下速度は約30 ml/minであった。溶液I及び溶液IIの滴下速度は、反応溶液のpHが8.9〜9.1に保持されるように調節した。生成したアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は、概ね２ mm以下であった。得られたスラリーは、凍結及び凍結乾燥した。複合体中のアパタイト／コラーゲンの配合比は8/2（質量比）であった。
【００３９】
500 mlの生理食塩水に、乾燥したアパタイト／コラーゲン複合体繊維を40 g、pH調整用の1N水酸化ナトリウム水溶液を２ mL、及び結合材用の0.58質量％コラーゲン水溶液（20 mMリン酸水溶液に溶解したもの）を66 g添加し、回転数10000 rpmで３分間攪拌しアパタイト／コラーゲン複合体の分散液を作製した。この分散液に、支持体として気孔率85％のリン酸カルシウムを浸漬し、真空デシケータを用いて減圧することで多孔体内部にも分散液を十分に浸透させた。分散液から引き上げた後、アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散液が被覆された支持体を、37℃のインキュベータで２時間ゲル化処理を行い、-５℃で12時間冷却し、さらに-30℃の冷凍庫で被覆膜を凍結させた。次いで凍結乾燥機を用いて乾燥させた後、140℃で12時間真空熱脱水架橋を行い、アパタイト／コラーゲン複合体が被覆された人工骨を得た。人工骨を任意の位置で破断し、破断面をSEMで確認したところ、気孔内にアパタイト/コラーゲン複合体の被覆層が確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなることを特徴とする人工骨。
【請求項２】
請求項１に記載の人工骨において、前記支持体がセラミックス、金属又はポリマーであることを特徴とする人工骨。
【請求項３】
請求項２に記載の人工骨において、前記セラミックスがリン酸カルシウムであることを特徴とする人工骨。
【請求項４】
支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなる人工骨の製造方法であって、支持体を繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体の分散液に浸漬し乾燥する工程を有することを特徴とする製造方法。
【請求項１】
支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなることを特徴とする人工骨。
【請求項２】
請求項１に記載の人工骨において、前記支持体がセラミックス、金属又はポリマーであることを特徴とする人工骨。
【請求項３】
請求項２に記載の人工骨において、前記セラミックスがリン酸カルシウムであることを特徴とする人工骨。
【請求項４】
支持体の表面をアパタイト／コラーゲン複合体で被覆してなる人工骨の製造方法であって、支持体を繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体の分散液に浸漬し乾燥する工程を有することを特徴とする製造方法。
【公開番号】特開２００９−２６８６８５（Ｐ２００９−２６８６８５Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２１３９６（Ｐ２００８−１２１３９６）
【出願日】平成２０年５月７日（２００８．５．７）
【出願人】（０００１１３２６３）ＨＯＹＡ株式会社 (3,820)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月７日（２００８．５．７）
【出願人】（０００１１３２６３）ＨＯＹＡ株式会社 (3,820)
【Ｆターム（参考）】
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