アミノシクロヘキシルアルキル基を有する２，４−ジアミノピリミジン化合物
【課題】PKCθ阻害活性を有する医薬、特に移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。
【解決手段】本発明者らは、PKCθ阻害活性を有する化合物について検討し、2,4-ジアミノピリミジンの２位アミノ基上にアラルキル等の構造を有し、さらに４位アミノ基上にアミノシクロヘキシルアルキル基を有することを特徴とする化合物又はその塩が、優れたPKCθ阻害活性を有することを確認し、本発明を完成した。本発明の、アミノシクロヘキシルアルキル基を有する2,4-ジアミノピリミジン化合物は、PKCθ阻害剤、移植における急性拒絶反応抑制剤として使用しうる。
【解決手段】本発明者らは、PKCθ阻害活性を有する化合物について検討し、2,4-ジアミノピリミジンの２位アミノ基上にアラルキル等の構造を有し、さらに４位アミノ基上にアミノシクロヘキシルアルキル基を有することを特徴とする化合物又はその塩が、優れたPKCθ阻害活性を有することを確認し、本発明を完成した。本発明の、アミノシクロヘキシルアルキル基を有する2,4-ジアミノピリミジン化合物は、PKCθ阻害剤、移植における急性拒絶反応抑制剤として使用しうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物、殊に移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物の有効成分として有用なアミノシクロヘキシルアルキル基を有する2,4-ジアミノピリミジン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼＣ(PKC)は、プロテインキナーゼファミリーのひとつで、現在までに少なくとも10種類のisozyme が同定されており、一次構造上の違いから3つのサブファミリーに分類されている。
【０００３】
これら3つのサブファミリーの活性化機構は、サブファミリー間で非常に異なっている。カルシウムとジアシルグリセロール(DAG)によって活性化されるタイプのPKCはclassical PKC (cPKC)、DAGによって活性化されるが、その活性化においてカルシウムを必要としないタイプのPKCはnovel PKC (nPKC)、活性化にカルシウム・DAGともに必要としないタイプのPKCはatypical PKC (aPKC)と、それぞれ呼ばれている。
【０００４】
さらに、各サブファミリーは、複数のisozymeから成り、cPKCはPKCα、PKCβ、PKCγ、nPKCはPKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ、aPKCはPKCζ、PKCλに分類される。
各isozymeの発現分布は比較的広範にわたっているが、nPKCのひとつであるPKCθの発現は、Tリンパ球と骨格筋に限局している。また、PKCθのノックアウトマウスの表現型が、T細胞シグナル伝達阻害やT cell anergyの誘導であり、また、骨格筋の異常はみとめられていないことから、PKCθが副作用の少ない免疫抑制剤のターゲットとして有望である。
【０００５】
また、T細胞レセプターシグナル伝達経路において、現行の移植医療において広く使用されているFK506やサイクロスポリンAのターゲット分子であるカルシニューリンと、PKCθが相補的な関係にあることから、カルシニューリン阻害剤とPKCθ阻害剤の併用により、相乗的な免疫抑制効果を発現する可能性がある。
【０００６】
従って、PKCθを選択的に阻害することによって、副作用が少ない状態で免疫抑制活性を発現し、さらに、移植医療においては、カルシニューリン阻害剤との併用時に、相乗的な免疫抑制活性を発現出来る可能性があると考えられる。
【０００７】
特許文献１では、式（Ａ）で示される化合物がPKCθを阻害し、免疫抑制剤として有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化１】
（式中のR2は
【化２】
等を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【０００８】
特許文献２では、式（Ｂ）で示される化合物がPKCθを阻害し、免疫抑制剤として有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化３】
（式中のR3は
【化４】
を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【０００９】
特許文献３では、式（Ｃ）で示される化合物がPKCθを阻害し、免疫抑制剤として有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化５】
（式中のR1は
【化６】
を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【００１０】
特許文献４では、式（Ｄ）で示される化合物がサイクリン依存性キナーゼ（CDK）、オーロラBのキナーゼ等に対する阻害活性を有し、過度又は異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療および予防に有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されており、臓器移植における免疫抑制に有益であるとの記載があるが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化７】
（式中の記号は当該公報参照。）
【００１１】
特許文献５では、式（Ｅ）で示される化合物がポロ様キナーゼ（PLK）を阻害し、腫瘍、神経変性疾患、免疫系の活性化に関わる疾患の予防および／または治療に有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はなく、またPKCθ阻害活性に関する記述や移植における急性拒絶反応の抑制に有用であるとの記載はない。
【化８】
（式中の記号は当該公報参照。）
【００１２】
特許文献６では、式（Ｆ）で示される化合物がG蛋白質共役型レセプター蛋白質８８（GPR88）を阻害し、中枢疾患の予防および／または治療に有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はなく、またPKCθ阻害活性に関する記述や移植における急性拒絶反応の抑制に有用であるとの記載はない。
【化９】
（式中のR1は水素等、Aは置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよい複素環アルキル、置換されていてもよいC3-8シクロアルキル等を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第2004/067516号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2006/014482号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2007/076247号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2003/032997号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2004/043936号パンフレット
【特許文献６】国際公開第2004/054617号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、PKCθ阻害活性を有する医薬、特に移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物の有効成分として有用なアミノシクロヘキシルアルキル基を有する2,4-ジアミノピリミジン化合物の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、PKCθ阻害活性を有する化合物について検討した結果、2,4-ジアミノピリミジンの２位アミノ基上にアラルキル等の構造を有し、さらに４位アミノ基上にアミノシクロヘキシルアルキル基を有することを特徴とする化合物又はその塩が、優れたPKCθ阻害活性を有することを知見し本発明を完成した。
即ち、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩、並びに、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
【化１０】
（式中の記号は以下の意味を示す。
R1は、-H、置換されていてもよいシクロアルキル、(置換されていてもよいシクロアルキル)-C1-6アルキレン-、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル又は(置換されていてもよいヘテロシクロアルキル)-C1-6アルキレン-を示し；
R2は、-CN、-CF3、-NO2又はハロゲンを示し；
R3は、ハロゲン、-Q-(置換されていてもよいC1-6アルキル)を示し；
Qは、-O-又は-S-を示し；
Aは、CH又はNを示す。）
なお、特に記載がない限り、本明細書中のある化学式中の記号が他の化学式においても用いられる場合、同一の記号は同一の意味を示す。
【００１６】
また、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有する移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物、即ち、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有する移植における急性拒絶反応抑制剤に関する。
さらに、本発明は、移植における急性拒絶反応抑制剤の製造のための式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の使用、並びに、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の有効量を患者に投与することからなる移植における急性拒絶反応の抑制方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩は、PKCθ阻害作用を有し、移植における急性拒絶反応の抑制剤として使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中において、「C1-6アルキル」とは、直鎖又は分枝状の炭素数が１から６のアルキル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル基等であり、別の態様としては、C1-4アルキルであり、さらに別の態様としては、メチル、エチルである。
【００１９】
本明細書中において、「C1-6アルキレン」とは、直鎖又は分枝状の炭素数が１から６のアルキレン、例えばメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、プロピレン、メチルメチレン、エチルエチレン、1,2-ジメチルエチレン、1,1,2,2-テトラメチルエチレン等である。別の態様としては、C1-4アルキレンであり、さらに別の態様としては、メチレンである。
【００２０】
本明細書中において、「ハロゲン」とは、F、Cl、Br及びIを意味する。
【００２１】
本明細書中において、「シクロアルキル」とは、C3-10の飽和炭化水素環基であり、架橋を有していてもよい。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、アダマンチル等である。別の態様としては、C3-8シクロアルキルであり、さらに別の態様としては、C3-6シクロアルキルであり、またさらに別の態様としては、シクロヘキシルである。
【００２２】
本明細書中において、「ヘテロ環」とは、ｉ）酸素、硫黄及び窒素から選択されるヘテロ原子を１〜４個含有する３〜８員の、別の態様としては５〜７員の単環ヘテロ環、並びに、ｉｉ）当該単環ヘテロ環が、単環へテロ環、ベンゼン環、C5-8シクロアルカン及びC5-8シクロアルケンからなる群より選択される１又は２個の環と縮環し形成される、酸素、硫黄および窒素から選択されるヘテロ原子を１〜５個含有する二〜三環式ヘテロ環、から選択される環基を意味する。環原子である硫黄又は窒素が酸化されオキシドやジオキシドを形成してもよい。
【００２３】
「ヘテロ環」として以下の態様が挙げられる。
（１）単環式飽和へテロ環
（ａ）１〜４個の窒素原子を含むもの、例えば、アゼパニル、ジアゼパニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、アゾカニル等；
（ｂ）１〜３個の窒素原子、ならびに１〜２個の硫黄原子および／または１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、チオモルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、オキサゾリジニル、モルホリニル等；
（ｃ）１〜２個の硫黄原子を含むもの、例えば、テトラヒドロチオピラニル等；
（ｄ）１〜２個の硫黄原子および１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、オキサチオラニル等；
（ｅ）１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、オキシラニル、オキセタニル、ジオキソラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、1,4-ジオキサニル等；
【００２４】
（２）単環式不飽和へテロ環基
（ａ）１〜４個の窒素原子を含むもの、例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、ジヒドロトリアジニル、アゼピニル等；
（ｂ）１〜３個の窒素原子、ならびに１〜２個の硫黄原子および／または１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ジヒドロチアジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサジニル等；
（ｃ）１〜２個の硫黄原子を含むもの、例えば、チエニル、チエピニル、ジヒドロジチオピラニル、ジヒドロジチオニル等；
（ｄ）１〜２個の硫黄原子および１〜２個の酸素原子を含むもの、具体的には、ジヒドロオキサチオピラニル等；
（ｅ）１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、フリル、ピラニル、オキセピニル、ジオキソリル等；
【００２５】
（３）縮合多環式飽和へテロ環基
（ａ）１〜５個の窒素原子を含むもの、例えば、キヌクリジニル、7-アザビシクロ[2.2.1]ヘプチル、3-アザビシクロ[3.2.2]ノナニル等；
（ｂ）１〜４個の窒素原子、ならびに１〜３個の硫黄原子および／または１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、トリチアジアザインデニル、ジオキソロイミダゾリジニル等；
（ｃ）１〜３個の硫黄原子および／または１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、2,6-ジオキサビシクロ[3.2.2]オクト-7-イル等；
【００２６】
（４）縮合多環式不飽和へテロ環基
（ａ）１〜５個の窒素原子を含むもの、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、テトラヒゾロベンゾイミダゾリル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル、テトラヒドロイソキノリル、インダゾリル、イミダゾピリジル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル、カルバゾリル、アクリジニル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、テトラヒドロキノキサリニル、フタラジニル、ジヒドロインダゾリル、ベンゾピリミジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、シンノリニル等；
（ｂ）１〜４個の窒素原子、ならびに１〜３個の硫黄原子および／または１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、ベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾチアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾオキサジニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル等；
（ｃ）１〜３個の硫黄原子を含むもの、例えば、ベンゾチエニル、ベンゾジチオピラニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］チエニル等；
（ｄ）１〜３個の硫黄原子および１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、ベンゾオキサチオピラニル、フェノキサジニル等；
（ｅ）１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ジヒドロベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル等；
など。
【００２７】
本明細書中において、「ヘテロシクロアルキル」とは、上記の「ヘテロ環」のうち、（１）に記載の単環式飽和へテロ環基及び（３）に記載の縮合多環式飽和へテロ環基であり、環原子である硫黄又は窒素が酸化され、オキシドやジオキシドを形成してもよい。別の態様としては、環原子である硫黄又は窒素が酸化され、オキシドやジオキシドを形成してもよい（１）に記載の単環式飽和へテロ環であり、さらに別の態様としては、ピペリジルである。
【００２８】
本明細書中において、「置換されていてもよい」とは、無置換、若しくは置換基を１〜５個有していることを意味し、別の態様としては、無置換、若しくは置換基を１〜３個有していることを意味する。なお、複数個の置換基を有する場合、それらの置換基は同一であっても、互いに異なっていてもよい。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物のある態様を以下に示す。
（１）式（Ｉ）において、置換位置が、
【化１１】
である化合物。
（２）R1が-H、置換されていてもよいシクロヘキシル、(置換されていてもよいシクロヘキシル)-CH2-、置換されていてもよいピペリジル又は(置換されていてもよいピペリジル)-CH2-であり、別の態様としては、-H、R4-シクロヘキシル、R4-シクロヘキシル-CH2-、R5-ピペリジル又はR5-ピペリジル-CH2-であり、さらに別の態様としては、-H又は
【化１２】
である化合物。
（３）R4が-H、-OH、置換されていてもよいC1-6アルキル又は-NH2であり、別の態様としては、-H、-OH、-OHで置換されていてもよいC1-6アルキル又は-NH2であり、さらに別の態様としては、-H、-OH、-CH2OH又は-NH2である（２）に記載の化合物。
（４）R5が-H又は置換されていてもよいC1-6アルキルであり、別の態様としては、-H又は-CNで置換されていてもよいC1-6アルキルであり、さらに別の態様としては、-H又は-CH2CH2CNである（２）に記載の化合物。
（５）R2が-CN又は-NO2である化合物。
（６）R3がハロゲン、-O-(置換されていてもよいC1-6アルキル)又は-S-(C1-6アルキル)であり、別の態様としては、ハロゲン、-O-(ハロゲンで置換されていてもよいC1-6アルキル)又は-S-(C1-6アルキル)であり、さらに別の態様としては、-Cl、-OCH3、-OCF3又は-SCH3である化合物。
（７）上記（１）〜（６）に記載の基のうち二以上の組み合わせである化合物。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、式（Ｉ）の化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
また、式（Ｉ）の化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、式（Ｉ）の化合物の光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【００３１】
さらに、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下で、本発明化合物に変換される化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)や、「医薬品の開発」（廣川書店、1990年）第7巻 分子設計163-198に記載の基が挙げられる。
【００３２】
また、式（Ｉ）の化合物の塩とは、式（Ｉ）の化合物の製薬学的に許容される塩であり、置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００３３】
さらに、本発明は、式（Ｉ）の化合物及びその製薬学的に許容される塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
【００３４】
（製造法）
式（Ｉ）の化合物及びその製薬学的に許容される塩は、その基本構造あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成法を適用して製造することができる。その際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、ウッツ(P. G. M. Wuts)及びグリーン(T. W. Greene)著、「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)」に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。
また、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、上記保護基と同様、原料から中間体へ至る段階で特定の基を導入、あるいは得られた式（Ｉ）の化合物を用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。
以下、式（Ｉ）の化合物の代表的な製造法を説明する。各製法は、当該説明に付した参考文献を参照して行うこともできる。なお、本発明の製造法は以下に示した例には限定されない。
【００３５】
製法１
【化１３】
本製法は、化合物（１）にR1基のケトン体またはアルデヒド体を反応させて還元的にアルキル化し、式（Ｉ）の化合物を製造する方法である。
この反応では、化合物（１）とR1基のケトン体またはアルデヒド体を還元剤の存在下、反応に不活性な溶媒中、-45℃〜加熱還流下、好ましくは0℃〜室温において、通常0.1時間〜5日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定されないが、メタノール、エタノール等のアルコール類、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン若しくはクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、N,N-ジメチルホルムアミド及びこれらの混合物が挙げられる。還元剤としては、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられる。モレキュラーシーブス等の脱水剤、又は酢酸、塩酸、チタニウム（IV）イソプロポキシド錯体等の酸存在下で反応を行うことが好ましい場合がある。反応によっては、カルボニル化合物と一級又は二級アミン化合物との縮合によりイミンが生成し、安定な中間体として単離できる場合がある。そのような場合には、イミン中間体を単離した後に、還元反応により目的物を得ることもできる。また、前記還元剤での処理の代わりに、メタノール、エタノール、酢酸エチル等の溶媒中、酢酸、塩酸等の酸の存在下又は非存在下で、還元触媒（例えば、パラジウム炭素、ラネーニッケル等）を用いて反応を行うこともできる。この場合、反応を常圧から50気圧の水素雰囲気下で、冷却下から加熱下で行うことが好ましい。
〔文献〕
A. R. Katritzky及びR. J. K. Taylor著、「Comprehensive Organic Functional Group Transformations II」、第2巻、Elsevier Pergamon、2005年
日本化学会編「実験化学講座(第5版)」14巻(2005年)(丸善)
【００３６】
製法２：その他の製法
さらに、式（Ｉ）で示されるいくつかの化合物は、以上のように得られた本発明化合物から、さらにアルキル化等の当業者が通常採用しうる工程を任意に組み合わせることにより製造することもできる。例えば、以下の反応、後述の実施例に記載の方法、当業者にとって自明な方法、あるいはそれらの変法を適用することによって製造することができる。
【００３７】
２−１：アルキル化
アミン化合物を脱離基を有する化合物と反応させてアルキル化することにより、アルキルアミン化合物を得ることができる。
この反応では、アミン化合物と脱離基を有する化合物とを等量若しくは一方を過剰量用い、これらの混合物を、反応に不活性な溶媒中、又は無溶媒下、冷却下から加熱還流下、好ましくは0℃から80℃において、通常0.1時間〜5日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトニトリル及びこれらの混合物が挙げられる。トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン若しくはN-メチルモルホリン等の有機塩基、又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウム等の無機塩基の存在下で反応を行うのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
〔文献〕
S. R. Sandler及びW. Karo著、「Organic Functional Group Preparations」、第2版、第1巻、Academic Press Inc.、1991年
日本化学会編「実験化学講座(第5版)」14巻(2005年)(丸善)
【００３８】
(原料化合物の製法)
本発明化合物の製造に使用する原料、つまりアミン化合物（１）は、例えば、後述の製造例に記載の方法、「製法２：その他の製法」に記載した公知の方法または当業者にとって自明な方法、あるいはそれらの変法等を適用することによって、入手可能な公知化合物から製造することができる。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物は、遊離化合物、その製薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。式（Ｉ）の化合物の製薬学的に許容される塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
各種の異性体は、適当な原料化合物を選択することにより製造でき、あるいは異性体間の物理化学的性質の差を利用して分離することができる。例えば、光学異性体は、ラセミ体の一般的な光学分割法（例えば、光学活性な塩基又は酸とのジアステレオマー塩に導く分別結晶化や、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィー等）により得られ、また、適当な光学活性な原料化合物から製造することもできる。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物の薬理活性は、以下の試験により確認した。
【００４１】
試験方法１：ヒトPKCθ酵素阻害活性測定
HTRFR KinEASETM S1キット（CIS bio）を使用して試験を実施した。384穴プレート（CORNING）へ薬液4μL、STK Substrate 1-biotin（final 250nM）およびFull-length human PKCθ（Carna Biosciences、final 31ng/mL）混合液3μ\ochLを入れて室温で30分静置後、ATP液（final 30μM）3μLを分注し、酵素反応を室温で1時間行った。その後、Sa-XL665（final 31.25nM）および抗体STK-Antibody-Cryptate（final 800倍希釈）を含む反応停止液10μLを分注し、室温で1時間放置した。Discovery（PACKARD）にて620nm（Cryptate）および665nm（XL665）の蛍光強度を測定し、Vehicleを0%、Blankを100%抑制として、抑制率およびIC50値を算出した。
試験結果を、表１に示す。Exは後記実施例化合物番号を示す。
【表１】
【００４２】
試験方法２：ヒトIL-2産生抑制活性測定
i)プラスミドの調製
データベース記載のDNA塩基配列に対応するHuman IL-2 promoter領域のDNA断片(445bp)をクローニングし、レポータージーンアッセイ用VectorであるpGL3 basicに挿入し、pGL3-IL2-pro-43を取得した。
ii)Jurkat細胞の維持・継代
ヒトT細胞系培養細胞であるJurkat, Clone E6-1(ATCC No.TIB-152)を10%FBS RPMI 1640（シグマ）を培地として、37℃、5% CO2、飽和湿度条件下にて培養し、confluentの約90%状態になった時点で、継代を行った。
iii)トランスフェクションおよび播種
血球計数板を用いて細胞数を計測後、細胞濃度が2.5 x 107cells/mLになるように、10%FBS RPMI 1640（シグマ）を用いて細胞懸濁液を調製し、pGL3-IL2-pro-43 10μgを混合した。次いで、調製した各plasmid混合液に2.5x107cells/mLに調製したJurkat細胞を400μL加えて混ぜ、Gene PulsorR Cuvette（BIO-RAD）に全量添加した。Gene PulsorRII（BIO-RAD）により300V, 975μFにてplasmidを導入し、plasmid導入済みJurkat細胞全量を、10%FBS RPMI 1640 2.5mLに軽く懸濁した後、96 well plate（Corning Coster）に50μL/wellにて播種し、37℃、5% CO2、飽和湿度条件下で、約10時間培養した。
iv)ヒトIL-2産生抑制活性の測定
薬物溶液を25μL/wellずつ添加し、さらに抗CD3抗体、抗CD28抗体（Pharmingen）(ともに終濃度1μg/mLの1000倍液)を10%FBS RPMI1640で250倍希釈した混合液を25μL/wellずつ添加した。これを、37℃、5% CO2、飽和湿度条件下で、約14時間培養した。アッセイはduplicateにて実施した。
Bright-GloTM Luciferase Assay System（Promega）付属の基質溶液を100μL/wellずつ加え、穏やかに混和した。マルチラベルカウンター（ARVO SX、WALLAC）を反応温度：25℃、Shaking Duration：1sec、Measurement time：1secに設定し、各96 wells plateの測定wellを設定して、Firefly luciferase活性を測定した。
【００４３】
試験方法３：チトクロームP450(CYP3A4)酵素阻害活性測定
i)阻害試験I (残存率Iの算出)
96穴プレートを用いて、基質（ミダゾラム）、試験化合物及びヒト肝ミクロソーム（0.1mg protein/mL）を0.1mM EDTA、1mM NADPHを含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）、総量150μL中、37℃で20分間インキュベーションした。その後アセトニトリル80%含有水溶液を加えて反応を停止し、サンプルをLC/MS/MSで分析し、下記の数式1を用いて残存率Ｉを算出した。
（数式1）
残存率 I (%) = Ai,I/ Ao,I x 100
Ai,I=阻害試験Iで試験化合物存在下における反応後の代謝物の生成量
Ao,I=阻害試験Iで試験化合物非存在下における反応後の代謝物の生成量
ii)阻害試験ＩＩ(残存率ＩＩの算出)
96穴プレートを用いて、試験化合物及びヒト肝ミクロソーム（0.1mg protein/mL）を0.1mM EDTA、1mM NADPHを含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）総量145μL中、37℃で30分間インキュベーションした。その後、基質であるミダゾラムを添加して37℃で20分間インキュベーションした。インキュベーション後、アセトニトリル80%含有水溶液を加えて反応を停止し、サンプルをLC/MS/MSで分析し、下記の式2を用いて残存率ＩＩを算出した。
（数式2）
残存率 II(%) = Ai,II/Ao,II /(Ai,I/Ao,I)x 100
Ai,II=阻害試験IIで試験化合物存在下における反応後の代謝物の生成量
Ao,II=阻害試験IIで試験化合物非存在下における反応後の代謝物の生成量
【００４４】
試験の結果、式（Ｉ）の化合物はPKCθ阻害作用を有することが確認された。従って、移植における急性拒絶反応の抑制剤等に使用できる。
【００４５】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用賦形剤、薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００４６】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種又は2種以上の有効成分を、少なくとも1種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及び／又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【００４７】
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０（局方名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
【００４８】
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
【００４９】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【００５０】
通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重あたり約0.0001〜100 mg/kg程度であり、これを1回であるいは2乃至4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.0001〜10 mg/kgが適当で、1日1回〜複数回に分けて投与する。また、吸入の場合は、体重当たり約0.0001〜1 mg/kgを1日1回〜複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例に基づき、式（Ｉ）の化合物の製造法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の化合物に限定されるものではない。また、原料化合物の製法を製造例に示す。また、式（Ｉ）の化合物の製造法は、以下に示される具体的実施例の製造法のみに限定されるものではなく、式（Ｉ）の化合物はこれらの製造法の組み合わせ、あるいは当業者に自明である方法によっても製造されうる。
【００５３】
また、実施例、製造例及び後記表中において、以下の略号を用いることがある。
PEx：製造例番号、Ex：実施例番号、Str：構造式（構造式中に、例えばHClの記載がある場合は、その化合物が塩酸塩であることを意味し、2HClの記載がある場合は、その化合物が２塩酸塩であることを意味する。）、Syn：製造法（数字のみの場合は同様に製造した実施例番号を、数字の前にPがある場合は同様に製造した製造例番号をそれぞれ示す。）、Dat：物理化学的データ、NMR1：DMSO-d6中の1H NMRにおけるδ(ppm)、ESI+：ESI-MS (陽イオン)、TFA：トリフルオロ酢酸、THF：テトラヒドロフラン、DMF：N,N-ジメチルホルムアミド、MeOH：メタノール、EtOAc：酢酸エチル、Et2O：ジエチルエーテル、DIPEA：ジイソプロピルエチルアミン、MCPBA：m-クロロ過安息香酸。
また、物理化学的データ中にTLCのRf値（TLC:Rf）を記載したものがあるが、用いたプレートはアミノシリカゲルプレート（TLCプレート(NH), FUJI SILYSIA）、展開溶媒はヘキサン/EtOAc=1/1である。
【００５４】
製造例１
氷冷下、4-クロロ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-5-カルボニトリル(4.0g)のDMF(48ml)溶液にDIPEA(4.13ml)、tert-ブチル [トランス-4-(アミノメチル)シクロヘキシル]カルバマート(4.97g)とDIPEA(4.5ml)を加え、室温にて1.5時間撹拌した。反応混合液に水(300ml)と1M塩酸(5.0ml)を加え、析出する粉末を濾取し、水洗後、乾燥し、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマートを7.74g得た。
【００５５】
製造例２
氷冷下、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルフィニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマート(300mg)のDMF(2.4ml)溶液に2-クロロベンジルアミン(0.12ml)を加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物にEtOAcと飽和重曹水を加えて分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、析出する粉末を濾取した。Et2Oにて洗浄後、乾燥し、tert-ブチル {トランス-4-[({2-[(2-クロロベンジル)アミノ]-5-シアノピリミジン-4-イル}アミノ)メチル]シクロヘキシル}カルバマートを278mg得た。
【００５６】
製造例６
氷冷下、4-{[(トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリル（50mg）のジクロロメタン（1.5ml）懸濁液に、トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキサンカルバルデヒド（36mg）とトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（86mg）を加え、室温で2時間撹拌した。トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキサンカルバルデヒド（10mg）を追加し、さらに室温で1時間撹拌した。氷冷下、反応混合物に飽和重曹水を加え、室温で30分間撹拌した。混合物をクロロホルムで抽出した後、有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム-ヘキサン）にて精製することにより、4-{[(トランス-4-{[(トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリルを34.1mg得た。
【００５７】
製造例１７
氷冷下、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマート(7.73g)のジクロロメタン(93ml)懸濁液に75%MCPBA(含水品)(4.71g)を加え、同温度で1時間撹拌した。75%MCPBA(含水品)(1.65g)を追加して2時間撹拌し、反応液をを飽和重曹水（3回）、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣にEtOAcを加えて析出する粉末を濾取し、Et2Oにて洗浄後、乾燥し、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルフィニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマートを6.43g得た。
【００５８】
上記製造例の方法と同様にして、各製造例化合物をそれぞれ対応する原料を使用して製造した。製造例化合物の構造と、製法及び物理化学的データを以下の表に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
実施例１
4-[({トランス-4-[(ピペリジン-4-イルメチル)アミノ]シクロヘキシル}メチル)アミノ]-2-{[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]アミノ}ピリミジン-5-カルルボニトリル(70mg)の1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(0.7ml)懸濁液に3-ブロモプロピオニトリル(0.022ml)とDIPEA(0.047ml)を加え、マイクロウェーブ照射下、110℃で1時間撹拌した。反応液にクロロホルムを加え、そのままアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-MeOH)にて精製することにより、4-({[トランス-4-({[1-(2-シアノエチル)ピペリジン-4-イル]メチル}アミノ)シクロヘキシル]メチル}アミノ)-2-{[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]アミノ}ピリミジン-5-カルルボニトリルを40mg得た。
【００６３】
実施例３
N4-[(トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル]-5-ニトロ-N2-[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]ピリミジン-2,4-ジアミン 2塩酸塩(50mg)とDIPEA(0.037ml)のDMF−ジクロロメタン(2:1, 1.2ml)溶液に4-ヒドロキシシクロヘキサノン(22.2mg)とトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(103mg)を加え、室温にて18時間撹拌した。反応混合液に飽和重曹水を加え、EtOAcで抽出後、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-MeOH)にて精製することにより、4-[(トランス-4-{[(5-ニトロ-2-{[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]アミノ}ピリミジン-4-イル)アミノ]メチル}シクロヘキシル)アミノ]シクロヘキサノールを44.1mg得た。
【００６４】
実施例１１
氷冷下、tert-ブチル {トランス-4-[({2-[(2-クロロベンジル)アミノ]-5-シアノピリミジン-4-イル}アミノ)メチル]シクロヘキシル}カルバマート(322mg)のジクロロメタン(4.8ml)懸濁液にTFA(2.6ml)を加え、室温にて1.5時間撹拌した。反応混合液を減圧下濃縮し、得られた残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、EtOAcとTHFの混合液で抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-MeOH)にて精製することにより4-{[(トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリルを233mg得た。
【００６５】
実施例１９
4-{[(トランス-4-{[(トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリル（31mg）のMeOH（0.55ml）懸濁液に1M塩酸（0.3ml）を加え、室温で1時間撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣をクロロホルムで希釈した。氷冷下、飽和重曹水を加えた後、混合物をクロロホルム-MeOH(10:1）混合溶媒で抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム-MeOH）にて精製することにより、2-[(2-クロロベンジル)アミノ]-4-{[(トランス-4-{[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)メチル]アミノ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}ピリミジン-5-カルボニトリルを18.1mg得た。
【００６６】
上記実施例の方法と同様にして、各実施例化合物をそれぞれ対応する原料を使用して製造した。各実施例化合物の構造と、製法及び物理化学的データを以下の表に示す。
【００６７】
【表５】
【００６８】
【表６】
【００６９】
【表７】
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【００７２】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩は、PKCθ阻害作用を有し、移植における急性拒絶反応の抑制剤として使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物、殊に移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物の有効成分として有用なアミノシクロヘキシルアルキル基を有する2,4-ジアミノピリミジン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼＣ(PKC)は、プロテインキナーゼファミリーのひとつで、現在までに少なくとも10種類のisozyme が同定されており、一次構造上の違いから3つのサブファミリーに分類されている。
【０００３】
これら3つのサブファミリーの活性化機構は、サブファミリー間で非常に異なっている。カルシウムとジアシルグリセロール(DAG)によって活性化されるタイプのPKCはclassical PKC (cPKC)、DAGによって活性化されるが、その活性化においてカルシウムを必要としないタイプのPKCはnovel PKC (nPKC)、活性化にカルシウム・DAGともに必要としないタイプのPKCはatypical PKC (aPKC)と、それぞれ呼ばれている。
【０００４】
さらに、各サブファミリーは、複数のisozymeから成り、cPKCはPKCα、PKCβ、PKCγ、nPKCはPKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ、aPKCはPKCζ、PKCλに分類される。
各isozymeの発現分布は比較的広範にわたっているが、nPKCのひとつであるPKCθの発現は、Tリンパ球と骨格筋に限局している。また、PKCθのノックアウトマウスの表現型が、T細胞シグナル伝達阻害やT cell anergyの誘導であり、また、骨格筋の異常はみとめられていないことから、PKCθが副作用の少ない免疫抑制剤のターゲットとして有望である。
【０００５】
また、T細胞レセプターシグナル伝達経路において、現行の移植医療において広く使用されているFK506やサイクロスポリンAのターゲット分子であるカルシニューリンと、PKCθが相補的な関係にあることから、カルシニューリン阻害剤とPKCθ阻害剤の併用により、相乗的な免疫抑制効果を発現する可能性がある。
【０００６】
従って、PKCθを選択的に阻害することによって、副作用が少ない状態で免疫抑制活性を発現し、さらに、移植医療においては、カルシニューリン阻害剤との併用時に、相乗的な免疫抑制活性を発現出来る可能性があると考えられる。
【０００７】
特許文献１では、式（Ａ）で示される化合物がPKCθを阻害し、免疫抑制剤として有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化１】
（式中のR2は
【化２】
等を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【０００８】
特許文献２では、式（Ｂ）で示される化合物がPKCθを阻害し、免疫抑制剤として有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化３】
（式中のR3は
【化４】
を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【０００９】
特許文献３では、式（Ｃ）で示される化合物がPKCθを阻害し、免疫抑制剤として有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化５】
（式中のR1は
【化６】
を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【００１０】
特許文献４では、式（Ｄ）で示される化合物がサイクリン依存性キナーゼ（CDK）、オーロラBのキナーゼ等に対する阻害活性を有し、過度又は異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療および予防に有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されており、臓器移植における免疫抑制に有益であるとの記載があるが、本発明化合物の具体的開示はない。
【化７】
（式中の記号は当該公報参照。）
【００１１】
特許文献５では、式（Ｅ）で示される化合物がポロ様キナーゼ（PLK）を阻害し、腫瘍、神経変性疾患、免疫系の活性化に関わる疾患の予防および／または治療に有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はなく、またPKCθ阻害活性に関する記述や移植における急性拒絶反応の抑制に有用であるとの記載はない。
【化８】
（式中の記号は当該公報参照。）
【００１２】
特許文献６では、式（Ｆ）で示される化合物がG蛋白質共役型レセプター蛋白質８８（GPR88）を阻害し、中枢疾患の予防および／または治療に有用であることが報告されている。具体的な化合物としてピリミジン構造を有する化合物が開示されているが、本発明化合物の具体的開示はなく、またPKCθ阻害活性に関する記述や移植における急性拒絶反応の抑制に有用であるとの記載はない。
【化９】
（式中のR1は水素等、Aは置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよい複素環アルキル、置換されていてもよいC3-8シクロアルキル等を表す。その他の記号は当該公報参照。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第2004/067516号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2006/014482号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2007/076247号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2003/032997号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2004/043936号パンフレット
【特許文献６】国際公開第2004/054617号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、PKCθ阻害活性を有する医薬、特に移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物の有効成分として有用なアミノシクロヘキシルアルキル基を有する2,4-ジアミノピリミジン化合物の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、PKCθ阻害活性を有する化合物について検討した結果、2,4-ジアミノピリミジンの２位アミノ基上にアラルキル等の構造を有し、さらに４位アミノ基上にアミノシクロヘキシルアルキル基を有することを特徴とする化合物又はその塩が、優れたPKCθ阻害活性を有することを知見し本発明を完成した。
即ち、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩、並びに、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
【化１０】
（式中の記号は以下の意味を示す。
R1は、-H、置換されていてもよいシクロアルキル、(置換されていてもよいシクロアルキル)-C1-6アルキレン-、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル又は(置換されていてもよいヘテロシクロアルキル)-C1-6アルキレン-を示し；
R2は、-CN、-CF3、-NO2又はハロゲンを示し；
R3は、ハロゲン、-Q-(置換されていてもよいC1-6アルキル)を示し；
Qは、-O-又は-S-を示し；
Aは、CH又はNを示す。）
なお、特に記載がない限り、本明細書中のある化学式中の記号が他の化学式においても用いられる場合、同一の記号は同一の意味を示す。
【００１６】
また、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有する移植における急性拒絶反応の抑制用医薬組成物、即ち、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩を含有する移植における急性拒絶反応抑制剤に関する。
さらに、本発明は、移植における急性拒絶反応抑制剤の製造のための式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の使用、並びに、式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の有効量を患者に投与することからなる移植における急性拒絶反応の抑制方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩は、PKCθ阻害作用を有し、移植における急性拒絶反応の抑制剤として使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中において、「C1-6アルキル」とは、直鎖又は分枝状の炭素数が１から６のアルキル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル基等であり、別の態様としては、C1-4アルキルであり、さらに別の態様としては、メチル、エチルである。
【００１９】
本明細書中において、「C1-6アルキレン」とは、直鎖又は分枝状の炭素数が１から６のアルキレン、例えばメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、プロピレン、メチルメチレン、エチルエチレン、1,2-ジメチルエチレン、1,1,2,2-テトラメチルエチレン等である。別の態様としては、C1-4アルキレンであり、さらに別の態様としては、メチレンである。
【００２０】
本明細書中において、「ハロゲン」とは、F、Cl、Br及びIを意味する。
【００２１】
本明細書中において、「シクロアルキル」とは、C3-10の飽和炭化水素環基であり、架橋を有していてもよい。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、アダマンチル等である。別の態様としては、C3-8シクロアルキルであり、さらに別の態様としては、C3-6シクロアルキルであり、またさらに別の態様としては、シクロヘキシルである。
【００２２】
本明細書中において、「ヘテロ環」とは、ｉ）酸素、硫黄及び窒素から選択されるヘテロ原子を１〜４個含有する３〜８員の、別の態様としては５〜７員の単環ヘテロ環、並びに、ｉｉ）当該単環ヘテロ環が、単環へテロ環、ベンゼン環、C5-8シクロアルカン及びC5-8シクロアルケンからなる群より選択される１又は２個の環と縮環し形成される、酸素、硫黄および窒素から選択されるヘテロ原子を１〜５個含有する二〜三環式ヘテロ環、から選択される環基を意味する。環原子である硫黄又は窒素が酸化されオキシドやジオキシドを形成してもよい。
【００２３】
「ヘテロ環」として以下の態様が挙げられる。
（１）単環式飽和へテロ環
（ａ）１〜４個の窒素原子を含むもの、例えば、アゼパニル、ジアゼパニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、アゾカニル等；
（ｂ）１〜３個の窒素原子、ならびに１〜２個の硫黄原子および／または１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、チオモルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、オキサゾリジニル、モルホリニル等；
（ｃ）１〜２個の硫黄原子を含むもの、例えば、テトラヒドロチオピラニル等；
（ｄ）１〜２個の硫黄原子および１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、オキサチオラニル等；
（ｅ）１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、オキシラニル、オキセタニル、ジオキソラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、1,4-ジオキサニル等；
【００２４】
（２）単環式不飽和へテロ環基
（ａ）１〜４個の窒素原子を含むもの、例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、ジヒドロトリアジニル、アゼピニル等；
（ｂ）１〜３個の窒素原子、ならびに１〜２個の硫黄原子および／または１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ジヒドロチアジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサジニル等；
（ｃ）１〜２個の硫黄原子を含むもの、例えば、チエニル、チエピニル、ジヒドロジチオピラニル、ジヒドロジチオニル等；
（ｄ）１〜２個の硫黄原子および１〜２個の酸素原子を含むもの、具体的には、ジヒドロオキサチオピラニル等；
（ｅ）１〜２個の酸素原子を含むもの、例えば、フリル、ピラニル、オキセピニル、ジオキソリル等；
【００２５】
（３）縮合多環式飽和へテロ環基
（ａ）１〜５個の窒素原子を含むもの、例えば、キヌクリジニル、7-アザビシクロ[2.2.1]ヘプチル、3-アザビシクロ[3.2.2]ノナニル等；
（ｂ）１〜４個の窒素原子、ならびに１〜３個の硫黄原子および／または１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、トリチアジアザインデニル、ジオキソロイミダゾリジニル等；
（ｃ）１〜３個の硫黄原子および／または１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、2,6-ジオキサビシクロ[3.2.2]オクト-7-イル等；
【００２６】
（４）縮合多環式不飽和へテロ環基
（ａ）１〜５個の窒素原子を含むもの、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、テトラヒゾロベンゾイミダゾリル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル、テトラヒドロイソキノリル、インダゾリル、イミダゾピリジル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル、カルバゾリル、アクリジニル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、テトラヒドロキノキサリニル、フタラジニル、ジヒドロインダゾリル、ベンゾピリミジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、シンノリニル等；
（ｂ）１〜４個の窒素原子、ならびに１〜３個の硫黄原子および／または１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、ベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾチアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾオキサジニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル等；
（ｃ）１〜３個の硫黄原子を含むもの、例えば、ベンゾチエニル、ベンゾジチオピラニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］チエニル等；
（ｄ）１〜３個の硫黄原子および１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、ベンゾオキサチオピラニル、フェノキサジニル等；
（ｅ）１〜３個の酸素原子を含むもの、例えば、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ジヒドロベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル等；
など。
【００２７】
本明細書中において、「ヘテロシクロアルキル」とは、上記の「ヘテロ環」のうち、（１）に記載の単環式飽和へテロ環基及び（３）に記載の縮合多環式飽和へテロ環基であり、環原子である硫黄又は窒素が酸化され、オキシドやジオキシドを形成してもよい。別の態様としては、環原子である硫黄又は窒素が酸化され、オキシドやジオキシドを形成してもよい（１）に記載の単環式飽和へテロ環であり、さらに別の態様としては、ピペリジルである。
【００２８】
本明細書中において、「置換されていてもよい」とは、無置換、若しくは置換基を１〜５個有していることを意味し、別の態様としては、無置換、若しくは置換基を１〜３個有していることを意味する。なお、複数個の置換基を有する場合、それらの置換基は同一であっても、互いに異なっていてもよい。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物のある態様を以下に示す。
（１）式（Ｉ）において、置換位置が、
【化１１】
である化合物。
（２）R1が-H、置換されていてもよいシクロヘキシル、(置換されていてもよいシクロヘキシル)-CH2-、置換されていてもよいピペリジル又は(置換されていてもよいピペリジル)-CH2-であり、別の態様としては、-H、R4-シクロヘキシル、R4-シクロヘキシル-CH2-、R5-ピペリジル又はR5-ピペリジル-CH2-であり、さらに別の態様としては、-H又は
【化１２】
である化合物。
（３）R4が-H、-OH、置換されていてもよいC1-6アルキル又は-NH2であり、別の態様としては、-H、-OH、-OHで置換されていてもよいC1-6アルキル又は-NH2であり、さらに別の態様としては、-H、-OH、-CH2OH又は-NH2である（２）に記載の化合物。
（４）R5が-H又は置換されていてもよいC1-6アルキルであり、別の態様としては、-H又は-CNで置換されていてもよいC1-6アルキルであり、さらに別の態様としては、-H又は-CH2CH2CNである（２）に記載の化合物。
（５）R2が-CN又は-NO2である化合物。
（６）R3がハロゲン、-O-(置換されていてもよいC1-6アルキル)又は-S-(C1-6アルキル)であり、別の態様としては、ハロゲン、-O-(ハロゲンで置換されていてもよいC1-6アルキル)又は-S-(C1-6アルキル)であり、さらに別の態様としては、-Cl、-OCH3、-OCF3又は-SCH3である化合物。
（７）上記（１）〜（６）に記載の基のうち二以上の組み合わせである化合物。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、式（Ｉ）の化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
また、式（Ｉ）の化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、式（Ｉ）の化合物の光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【００３１】
さらに、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下で、本発明化合物に変換される化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)や、「医薬品の開発」（廣川書店、1990年）第7巻 分子設計163-198に記載の基が挙げられる。
【００３２】
また、式（Ｉ）の化合物の塩とは、式（Ｉ）の化合物の製薬学的に許容される塩であり、置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００３３】
さらに、本発明は、式（Ｉ）の化合物及びその製薬学的に許容される塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
【００３４】
（製造法）
式（Ｉ）の化合物及びその製薬学的に許容される塩は、その基本構造あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成法を適用して製造することができる。その際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料から中間体へ至る段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、ウッツ(P. G. M. Wuts)及びグリーン(T. W. Greene)著、「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)」に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。
また、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、上記保護基と同様、原料から中間体へ至る段階で特定の基を導入、あるいは得られた式（Ｉ）の化合物を用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。
以下、式（Ｉ）の化合物の代表的な製造法を説明する。各製法は、当該説明に付した参考文献を参照して行うこともできる。なお、本発明の製造法は以下に示した例には限定されない。
【００３５】
製法１
【化１３】
本製法は、化合物（１）にR1基のケトン体またはアルデヒド体を反応させて還元的にアルキル化し、式（Ｉ）の化合物を製造する方法である。
この反応では、化合物（１）とR1基のケトン体またはアルデヒド体を還元剤の存在下、反応に不活性な溶媒中、-45℃〜加熱還流下、好ましくは0℃〜室温において、通常0.1時間〜5日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定されないが、メタノール、エタノール等のアルコール類、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン若しくはクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、N,N-ジメチルホルムアミド及びこれらの混合物が挙げられる。還元剤としては、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられる。モレキュラーシーブス等の脱水剤、又は酢酸、塩酸、チタニウム（IV）イソプロポキシド錯体等の酸存在下で反応を行うことが好ましい場合がある。反応によっては、カルボニル化合物と一級又は二級アミン化合物との縮合によりイミンが生成し、安定な中間体として単離できる場合がある。そのような場合には、イミン中間体を単離した後に、還元反応により目的物を得ることもできる。また、前記還元剤での処理の代わりに、メタノール、エタノール、酢酸エチル等の溶媒中、酢酸、塩酸等の酸の存在下又は非存在下で、還元触媒（例えば、パラジウム炭素、ラネーニッケル等）を用いて反応を行うこともできる。この場合、反応を常圧から50気圧の水素雰囲気下で、冷却下から加熱下で行うことが好ましい。
〔文献〕
A. R. Katritzky及びR. J. K. Taylor著、「Comprehensive Organic Functional Group Transformations II」、第2巻、Elsevier Pergamon、2005年
日本化学会編「実験化学講座(第5版)」14巻(2005年)(丸善)
【００３６】
製法２：その他の製法
さらに、式（Ｉ）で示されるいくつかの化合物は、以上のように得られた本発明化合物から、さらにアルキル化等の当業者が通常採用しうる工程を任意に組み合わせることにより製造することもできる。例えば、以下の反応、後述の実施例に記載の方法、当業者にとって自明な方法、あるいはそれらの変法を適用することによって製造することができる。
【００３７】
２−１：アルキル化
アミン化合物を脱離基を有する化合物と反応させてアルキル化することにより、アルキルアミン化合物を得ることができる。
この反応では、アミン化合物と脱離基を有する化合物とを等量若しくは一方を過剰量用い、これらの混合物を、反応に不活性な溶媒中、又は無溶媒下、冷却下から加熱還流下、好ましくは0℃から80℃において、通常0.1時間〜5日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトニトリル及びこれらの混合物が挙げられる。トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン若しくはN-メチルモルホリン等の有機塩基、又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウム等の無機塩基の存在下で反応を行うのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
〔文献〕
S. R. Sandler及びW. Karo著、「Organic Functional Group Preparations」、第2版、第1巻、Academic Press Inc.、1991年
日本化学会編「実験化学講座(第5版)」14巻(2005年)(丸善)
【００３８】
(原料化合物の製法)
本発明化合物の製造に使用する原料、つまりアミン化合物（１）は、例えば、後述の製造例に記載の方法、「製法２：その他の製法」に記載した公知の方法または当業者にとって自明な方法、あるいはそれらの変法等を適用することによって、入手可能な公知化合物から製造することができる。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物は、遊離化合物、その製薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。式（Ｉ）の化合物の製薬学的に許容される塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
各種の異性体は、適当な原料化合物を選択することにより製造でき、あるいは異性体間の物理化学的性質の差を利用して分離することができる。例えば、光学異性体は、ラセミ体の一般的な光学分割法（例えば、光学活性な塩基又は酸とのジアステレオマー塩に導く分別結晶化や、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィー等）により得られ、また、適当な光学活性な原料化合物から製造することもできる。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物の薬理活性は、以下の試験により確認した。
【００４１】
試験方法１：ヒトPKCθ酵素阻害活性測定
HTRFR KinEASETM S1キット（CIS bio）を使用して試験を実施した。384穴プレート（CORNING）へ薬液4μL、STK Substrate 1-biotin（final 250nM）およびFull-length human PKCθ（Carna Biosciences、final 31ng/mL）混合液3μ\ochLを入れて室温で30分静置後、ATP液（final 30μM）3μLを分注し、酵素反応を室温で1時間行った。その後、Sa-XL665（final 31.25nM）および抗体STK-Antibody-Cryptate（final 800倍希釈）を含む反応停止液10μLを分注し、室温で1時間放置した。Discovery（PACKARD）にて620nm（Cryptate）および665nm（XL665）の蛍光強度を測定し、Vehicleを0%、Blankを100%抑制として、抑制率およびIC50値を算出した。
試験結果を、表１に示す。Exは後記実施例化合物番号を示す。
【表１】
【００４２】
試験方法２：ヒトIL-2産生抑制活性測定
i)プラスミドの調製
データベース記載のDNA塩基配列に対応するHuman IL-2 promoter領域のDNA断片(445bp)をクローニングし、レポータージーンアッセイ用VectorであるpGL3 basicに挿入し、pGL3-IL2-pro-43を取得した。
ii)Jurkat細胞の維持・継代
ヒトT細胞系培養細胞であるJurkat, Clone E6-1(ATCC No.TIB-152)を10%FBS RPMI 1640（シグマ）を培地として、37℃、5% CO2、飽和湿度条件下にて培養し、confluentの約90%状態になった時点で、継代を行った。
iii)トランスフェクションおよび播種
血球計数板を用いて細胞数を計測後、細胞濃度が2.5 x 107cells/mLになるように、10%FBS RPMI 1640（シグマ）を用いて細胞懸濁液を調製し、pGL3-IL2-pro-43 10μgを混合した。次いで、調製した各plasmid混合液に2.5x107cells/mLに調製したJurkat細胞を400μL加えて混ぜ、Gene PulsorR Cuvette（BIO-RAD）に全量添加した。Gene PulsorRII（BIO-RAD）により300V, 975μFにてplasmidを導入し、plasmid導入済みJurkat細胞全量を、10%FBS RPMI 1640 2.5mLに軽く懸濁した後、96 well plate（Corning Coster）に50μL/wellにて播種し、37℃、5% CO2、飽和湿度条件下で、約10時間培養した。
iv)ヒトIL-2産生抑制活性の測定
薬物溶液を25μL/wellずつ添加し、さらに抗CD3抗体、抗CD28抗体（Pharmingen）(ともに終濃度1μg/mLの1000倍液)を10%FBS RPMI1640で250倍希釈した混合液を25μL/wellずつ添加した。これを、37℃、5% CO2、飽和湿度条件下で、約14時間培養した。アッセイはduplicateにて実施した。
Bright-GloTM Luciferase Assay System（Promega）付属の基質溶液を100μL/wellずつ加え、穏やかに混和した。マルチラベルカウンター（ARVO SX、WALLAC）を反応温度：25℃、Shaking Duration：1sec、Measurement time：1secに設定し、各96 wells plateの測定wellを設定して、Firefly luciferase活性を測定した。
【００４３】
試験方法３：チトクロームP450(CYP3A4)酵素阻害活性測定
i)阻害試験I (残存率Iの算出)
96穴プレートを用いて、基質（ミダゾラム）、試験化合物及びヒト肝ミクロソーム（0.1mg protein/mL）を0.1mM EDTA、1mM NADPHを含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）、総量150μL中、37℃で20分間インキュベーションした。その後アセトニトリル80%含有水溶液を加えて反応を停止し、サンプルをLC/MS/MSで分析し、下記の数式1を用いて残存率Ｉを算出した。
（数式1）
残存率 I (%) = Ai,I/ Ao,I x 100
Ai,I=阻害試験Iで試験化合物存在下における反応後の代謝物の生成量
Ao,I=阻害試験Iで試験化合物非存在下における反応後の代謝物の生成量
ii)阻害試験ＩＩ(残存率ＩＩの算出)
96穴プレートを用いて、試験化合物及びヒト肝ミクロソーム（0.1mg protein/mL）を0.1mM EDTA、1mM NADPHを含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）総量145μL中、37℃で30分間インキュベーションした。その後、基質であるミダゾラムを添加して37℃で20分間インキュベーションした。インキュベーション後、アセトニトリル80%含有水溶液を加えて反応を停止し、サンプルをLC/MS/MSで分析し、下記の式2を用いて残存率ＩＩを算出した。
（数式2）
残存率 II(%) = Ai,II/Ao,II /(Ai,I/Ao,I)x 100
Ai,II=阻害試験IIで試験化合物存在下における反応後の代謝物の生成量
Ao,II=阻害試験IIで試験化合物非存在下における反応後の代謝物の生成量
【００４４】
試験の結果、式（Ｉ）の化合物はPKCθ阻害作用を有することが確認された。従って、移植における急性拒絶反応の抑制剤等に使用できる。
【００４５】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用賦形剤、薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００４６】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種又は2種以上の有効成分を、少なくとも1種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及び／又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【００４７】
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０（局方名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
【００４８】
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
【００４９】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【００５０】
通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重あたり約0.0001〜100 mg/kg程度であり、これを1回であるいは2乃至4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.0001〜10 mg/kgが適当で、1日1回〜複数回に分けて投与する。また、吸入の場合は、体重当たり約0.0001〜1 mg/kgを1日1回〜複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例に基づき、式（Ｉ）の化合物の製造法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の化合物に限定されるものではない。また、原料化合物の製法を製造例に示す。また、式（Ｉ）の化合物の製造法は、以下に示される具体的実施例の製造法のみに限定されるものではなく、式（Ｉ）の化合物はこれらの製造法の組み合わせ、あるいは当業者に自明である方法によっても製造されうる。
【００５３】
また、実施例、製造例及び後記表中において、以下の略号を用いることがある。
PEx：製造例番号、Ex：実施例番号、Str：構造式（構造式中に、例えばHClの記載がある場合は、その化合物が塩酸塩であることを意味し、2HClの記載がある場合は、その化合物が２塩酸塩であることを意味する。）、Syn：製造法（数字のみの場合は同様に製造した実施例番号を、数字の前にPがある場合は同様に製造した製造例番号をそれぞれ示す。）、Dat：物理化学的データ、NMR1：DMSO-d6中の1H NMRにおけるδ(ppm)、ESI+：ESI-MS (陽イオン)、TFA：トリフルオロ酢酸、THF：テトラヒドロフラン、DMF：N,N-ジメチルホルムアミド、MeOH：メタノール、EtOAc：酢酸エチル、Et2O：ジエチルエーテル、DIPEA：ジイソプロピルエチルアミン、MCPBA：m-クロロ過安息香酸。
また、物理化学的データ中にTLCのRf値（TLC:Rf）を記載したものがあるが、用いたプレートはアミノシリカゲルプレート（TLCプレート(NH), FUJI SILYSIA）、展開溶媒はヘキサン/EtOAc=1/1である。
【００５４】
製造例１
氷冷下、4-クロロ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-5-カルボニトリル(4.0g)のDMF(48ml)溶液にDIPEA(4.13ml)、tert-ブチル [トランス-4-(アミノメチル)シクロヘキシル]カルバマート(4.97g)とDIPEA(4.5ml)を加え、室温にて1.5時間撹拌した。反応混合液に水(300ml)と1M塩酸(5.0ml)を加え、析出する粉末を濾取し、水洗後、乾燥し、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマートを7.74g得た。
【００５５】
製造例２
氷冷下、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルフィニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマート(300mg)のDMF(2.4ml)溶液に2-クロロベンジルアミン(0.12ml)を加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物にEtOAcと飽和重曹水を加えて分液後、有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、析出する粉末を濾取した。Et2Oにて洗浄後、乾燥し、tert-ブチル {トランス-4-[({2-[(2-クロロベンジル)アミノ]-5-シアノピリミジン-4-イル}アミノ)メチル]シクロヘキシル}カルバマートを278mg得た。
【００５６】
製造例６
氷冷下、4-{[(トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリル（50mg）のジクロロメタン（1.5ml）懸濁液に、トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキサンカルバルデヒド（36mg）とトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（86mg）を加え、室温で2時間撹拌した。トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキサンカルバルデヒド（10mg）を追加し、さらに室温で1時間撹拌した。氷冷下、反応混合物に飽和重曹水を加え、室温で30分間撹拌した。混合物をクロロホルムで抽出した後、有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム-ヘキサン）にて精製することにより、4-{[(トランス-4-{[(トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリルを34.1mg得た。
【００５７】
製造例１７
氷冷下、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマート(7.73g)のジクロロメタン(93ml)懸濁液に75%MCPBA(含水品)(4.71g)を加え、同温度で1時間撹拌した。75%MCPBA(含水品)(1.65g)を追加して2時間撹拌し、反応液をを飽和重曹水（3回）、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣にEtOAcを加えて析出する粉末を濾取し、Et2Oにて洗浄後、乾燥し、tert-ブチル [トランス-4-({[5-シアノ-2-(メチルスルフィニル)ピリミジン-4-イル]アミノ}メチル)シクロヘキシル]カルバマートを6.43g得た。
【００５８】
上記製造例の方法と同様にして、各製造例化合物をそれぞれ対応する原料を使用して製造した。製造例化合物の構造と、製法及び物理化学的データを以下の表に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
実施例１
4-[({トランス-4-[(ピペリジン-4-イルメチル)アミノ]シクロヘキシル}メチル)アミノ]-2-{[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]アミノ}ピリミジン-5-カルルボニトリル(70mg)の1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(0.7ml)懸濁液に3-ブロモプロピオニトリル(0.022ml)とDIPEA(0.047ml)を加え、マイクロウェーブ照射下、110℃で1時間撹拌した。反応液にクロロホルムを加え、そのままアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-MeOH)にて精製することにより、4-({[トランス-4-({[1-(2-シアノエチル)ピペリジン-4-イル]メチル}アミノ)シクロヘキシル]メチル}アミノ)-2-{[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]アミノ}ピリミジン-5-カルルボニトリルを40mg得た。
【００６３】
実施例３
N4-[(トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル]-5-ニトロ-N2-[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]ピリミジン-2,4-ジアミン 2塩酸塩(50mg)とDIPEA(0.037ml)のDMF−ジクロロメタン(2:1, 1.2ml)溶液に4-ヒドロキシシクロヘキサノン(22.2mg)とトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(103mg)を加え、室温にて18時間撹拌した。反応混合液に飽和重曹水を加え、EtOAcで抽出後、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-MeOH)にて精製することにより、4-[(トランス-4-{[(5-ニトロ-2-{[2-(トリフルオロメトキシ)ベンジル]アミノ}ピリミジン-4-イル)アミノ]メチル}シクロヘキシル)アミノ]シクロヘキサノールを44.1mg得た。
【００６４】
実施例１１
氷冷下、tert-ブチル {トランス-4-[({2-[(2-クロロベンジル)アミノ]-5-シアノピリミジン-4-イル}アミノ)メチル]シクロヘキシル}カルバマート(322mg)のジクロロメタン(4.8ml)懸濁液にTFA(2.6ml)を加え、室温にて1.5時間撹拌した。反応混合液を減圧下濃縮し、得られた残渣に炭酸カリウム水溶液を加え、EtOAcとTHFの混合液で抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム-MeOH)にて精製することにより4-{[(トランス-4-アミノシクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリルを233mg得た。
【００６５】
実施例１９
4-{[(トランス-4-{[(トランス-4-{[tert-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}-2-[(2-クロロベンジル)アミノ]ピリミジン-5-カルボニトリル（31mg）のMeOH（0.55ml）懸濁液に1M塩酸（0.3ml）を加え、室温で1時間撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣をクロロホルムで希釈した。氷冷下、飽和重曹水を加えた後、混合物をクロロホルム-MeOH(10:1）混合溶媒で抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を除去後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をアミノシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム-MeOH）にて精製することにより、2-[(2-クロロベンジル)アミノ]-4-{[(トランス-4-{[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)メチル]アミノ}シクロヘキシル)メチル]アミノ}ピリミジン-5-カルボニトリルを18.1mg得た。
【００６６】
上記実施例の方法と同様にして、各実施例化合物をそれぞれ対応する原料を使用して製造した。各実施例化合物の構造と、製法及び物理化学的データを以下の表に示す。
【００６７】
【表５】
【００６８】
【表６】
【００６９】
【表７】
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【００７２】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩は、PKCθ阻害作用を有し、移植における急性拒絶反応の抑制剤として使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１４】
（式中の記号は以下の意味を示す。
R1は、-H、置換されていてもよいシクロアルキル、(置換されていてもよいシクロアルキル)-C1-6アルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル又は(置換されていてもよいヘテロシクロアルキル)-C1-6アルキルを示し；
R2は、-CN、-CF3、-NO2又はハロゲンを示し；
R3は、ハロゲン又は-Q-(置換されていてもよいC1-6アルキル)を示し；
Qは、-O-又は-S-を示し；
Aは、CH又はNを示す。）
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１４】
（式中の記号は以下の意味を示す。
R1は、-H、置換されていてもよいシクロアルキル、(置換されていてもよいシクロアルキル)-C1-6アルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル又は(置換されていてもよいヘテロシクロアルキル)-C1-6アルキルを示し；
R2は、-CN、-CF3、-NO2又はハロゲンを示し；
R3は、ハロゲン又は-Q-(置換されていてもよいC1-6アルキル)を示し；
Qは、-O-又は-S-を示し；
Aは、CH又はNを示す。）
【公開番号】特開２０１２−１４８９７７（Ｐ２０１２−１４８９７７Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２１４８５（Ｐ２００９−１２１４８５）
【出願日】平成２１年５月２０日（２００９．５．２０）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２０日（２００９．５．２０）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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