アミロイド線維形成抑制剤
【課題】
安全性の高い、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制する物質を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤を提供すること。
【解決手段】
置換されていてもよい糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種で修飾されたシクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤。
安全性の高い、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制する物質を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤を提供すること。
【解決手段】
置換されていてもよい糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種で修飾されたシクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤、及び該アミロイド線維形成抑制剤を含むアミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスとは、β−シート構造を有するタンパク質が重合して不溶性のアミロイド（ａｍｙｌｏｉｄ）と呼ばれる細線維を形成し、生体内に沈着して組織傷害をもたらす疾患群のことを指す。ドイツの病理学者であるＶｉｒｃｈｏｗは、アミロイドーシスの組織標本がヨードで紫色に染まることを発見した。この結果から、Ｖｉｒｃｈｏｗは組織に沈着した物質は多糖体であると考え、これを「デンプン様物質」すなわち「アミロイド」と命名し、アミロイドの沈着により惹起される病態をアミロイドーシスと呼ぶことを提唱した。その後の研究により、アミロイドの主成分はナイロン様に重合して線維を形成するタンパク質であり、アミロイドには血清アミロイドＰ成分やグリコサアミノグリカンなどが含まれていることが分かっている。現在では、アミロイドは「コンゴーレッド染色で橙赤色に染まり、偏光顕微鏡下で観察すると緑色に強く輝く複屈折を起こす幅８−１５ｎｍの枝分かれのない細線維の集積からなる」と定義されている。
【０００３】
アミロイドーシスには、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病その他遺伝性の疾患など様々な疾患が含まれる。その中でもＦＡＰは、末梢神経、自律神経、腎、皮膚、粘膜などの全身臓器にアミロイド沈着をきたし、常染色体優性遺伝形式で遺伝浸透するアミロイドーシスであり、我が国、特に九州地方及び中部地方で多くの症例が確認されている。１９５２年にポルトガル人のＦＡＰ症例が初めて報告されて以来、世界各国から同様の症例報告がなされている。ＦＡＰの原因となるアミロイド線維は、主として、血清タンパク質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）が変異したもので構成されている。
【０００４】
正常ＴＴＲは、β−シート構造を多く含む立体構造をしており、肝臓、脳脈絡叢、網膜、膵α細胞などで産生されるが、特にその９０％以上が肝臓で産生されるといわれている。正常ＴＴＲは、四量体を形成してサイロキシン（Ｔ４）やレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などを介したビタミンＡの輸送体としての役割を担っている。正常ＴＴＲの変異体は、これまでに１００種以上が報告されており、構造安定性が低く、四量体から単量体への構造変化を起こしやすいことが明らかになっている。
【０００５】
我国で多いＦＡＰは、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ型の変異ＴＴＲを原因タンパク質とするＩ型ＦＡＰである。Ｉ型ＦＡＰの主要性状は、左右対称性に下肢末端から上行する知覚障害を伴う多発性神経炎と自律神経障害（交代性の下痢と便秘、起立性低血圧、排尿傷害等）であり、これらはいずれもアミロイドによる神経傷害が原因である。その後、心臓、腎臓、消化管へのアミロイド沈着が著しくなり、これらの臓器の機能不全を引き起こす。一般的には、２０代後半から３０代で発症し１０年で歩行不能となり、１０〜２０年の経過で感染症、心不全、腎不全などで死亡する予後不良の疾患であり、厚生省特定疾患にも指定されている難病の一つである。
【０００６】
Ｉ型ＦＡＰをもたらし得る変異ＴＴＲタンパク質は、正常ＴＴＲタンパク質に比べ構造安定性が低く、分子中のβ−シート構造が互いに会合し不溶性のアミロイド線維を形成して組織に沈着するといわれている。したがって、変異ＴＴＲタンパク質によるアミロイド線維形成を抑制することにより、Ｉ型ＦＡＰを予防又は治療、或いはその両方をすることができると考えられている。アミロイド線維形成を抑制する方法としては、４量体ＴＴＲ分子の乖離を阻害する方法などが試みられているが、臨床的な治療効果は認められていない（Yoshiki Sekijima et.al., "Long-term effects of diflunisal on familial amyloid polyneuropathy," 2008, VIIth International symposium on Familial Amyloid Polyneuropathy）。さらに、アミロイドーシスの予防及び／又は治療に応用できる、安全性の高い、アミロイド線維形成を抑制する物質についてはこれまでに報告されていない（非特許文献１）。
【０００７】
以下の文献を含めて、本明細書中に記載のあるすべての文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【非特許文献１】Yukio Ando, (2005), Med Mol Morphol, 38: pp. 142-154
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の第一の課題は、安全性の高い、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制する物質を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤を提供することにある。さらに、本発明の第二の課題は、該抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬、特に家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）の予防及び／又は治療のための医薬を提供することにあり、さらにはアミロイドーシスに起因する知覚障害と自律神経障害の発症を予防するための医薬、及び上記知覚障害と自律神経障害の進行防止などを可能にする治療のための医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討したところ、シクロデキストリン誘導体がアミロイド線維形成を抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明によれば、置換されていてもよい糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種で修飾されたシクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤の好ましい態様は、シクロデキストリン誘導体がβ−シクロデキストリン誘導体である。
【００１１】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤の好ましい態様は、シクロデキストリン誘導体が下記式１
【化１】
［式中、Ｒはカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、又はアセチル基である］
の化合物である。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、アミロイド線維形成を有意に抑制することができる。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬は、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬として有用であり、特に対症療法や肝臓移植しか治療方法のない家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）に対して有効性の高い医薬として用いることができる。さらに、本発明の医薬は、本発明のアミロイド線維形成抑制剤が脂溶性薬物などの可溶化及び安定化などの目的で医薬品の賦形剤として汎用されている安全性の高いシクロデキストリン誘導体を有効成分として含有することから、人体に対して安全性の高い医薬である。したがって、本発明の医薬は、その有効性及び安全性から、アミロイドーシスの予防及び／又は治療に際して早期の実用化が見込める医薬である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤の有効成分であるシクロデキストリン誘導体は、シクロデキストリンを構成するグルコース骨格の一部又は全部が修飾されている。
【００１５】
シクロデキストリンは、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合した環状オリゴ糖であり、その分子内の空孔に疎水性の分子を包接することができるという特性を持つ。シクロデキストリンは、該特性と安全性の面から、脂溶性薬物の可溶化や安定化、局所刺激性の軽減など薬学領域において幅広く利用さている（Kaneto Uekama, (2004), YAKUGAKU ZASSHI, 124, (12), pp.909-935）。さらに、シクロデキストリンは、コレステロールやリン脂質の制御、タンパク質の安定化などの作用を示し、単なる医薬品添加物としての用途のみならず多様な機能を持つ。
【００１６】
シクロデキストリン誘導体を構成するシクロデキストリンとしては、分子を包接することができるものであれば特に制限されないが、例えば、グルコース骨格が６個であるα−シクロデキストリン、グルコース骨格が７個であるβ−シクロデキストリン、及びグルコース骨格が８個であるγ−シクロデキストリンが好ましく、これらの中でも入手が容易であり、医薬品の賦形剤として実績があり、さらには包接対象が多岐に渡るβ−シクロデキストリンがより好ましい。
【００１７】
シクロデキストリン誘導体は、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制できれば特に制限されるものではないが、例えば、糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる１種又は２種以上で修飾されたシクロデキストリン誘導体であることが好ましく、糖で修飾されたシクロデキストリン誘導体がより好ましい。シクロデキストリン誘導体における修飾基の数は、好ましくは１〜５種であり、より好ましくは１〜３種であり、さらに好ましくは１又は２種であり、なおさらに好ましいのは１種である。
【００１８】
シクロデキストリン誘導体の修飾に供される糖としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノースなどの単糖類；マルトース、トレハロース、コージービオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース、スクロース、パラチノース、メリビオース、ルチノース、プリメベロース、ツラノースなどの二糖類；マルトトリオース、イソマルトトリオース、パノース、セロトリオース、マンニノトリオース、ソラトリオース、メレジトース、プランテオース、ゲンチアノース、ウンベリフェロース、ラクトスクロース、ラフィノースなどの三糖類のみならず、それ以上の重合度のキシロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などのオリゴ糖類などが好ましい。
【００１９】
シクロデキストリンを修飾するペプチドは、例えば、アミノ酸の個数が１〜１０個のものが好ましく、アミノ酸の個数が２〜８個のものがより好ましく、アミノ酸の個数が２〜６個のものがさらに好ましい。ペプチドを構成するアミノ酸の種類は、適宜設定できるが、疎水性側鎖を有するアミノ酸を多く含むものが好ましい。
【００２０】
シクロデキストリンを修飾するポリエチレングリコールは、例えば、分子量が２００〜５００００のものが好ましく、分子量が１０００〜５００００のものがより好ましく、分子量が１００００〜３００００のものがさらに好ましい。
【００２１】
シクロデキストリンを修飾する糖は、ヒドロキシル基の一部又は全部がカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基などで置換されていてもよい。斯く置換されていてもよい糖としては、６−Ｏ−α−マルトース及び６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルコニル）−Ｄ−グルコースが最も好ましく用いられる。
【００２２】
シクロデキストリン誘導体の好ましい態様は、下記式１
【化２】
［式中、Ｒはカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、又はアセチル基である］
の化合物である。
【００２３】
上記式１の化合物の合成法は、これまでに知られている方法を制限なく使用できるが、例えば、イシグロらの文献（Toshihiro Ishiguro et. al., (2001), Carbohydrate Research, 331, pp.423−430）に記載の方法に準じて製造することもできる。一例として、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリン（２，６−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−b−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）の合成を以下に示す（図６）。
乾燥させたジメチル−β−シクロデキストリン（２，６−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−b−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を無水ピリジンに溶解した後、室温で無水条件下で２〜３時間かけて無水酢酸を加え、８０℃に加温し約１２時間攪拌する。反応終了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；メタノール：クロロホルム＝１５：２）により確認した後、反応液に氷水を添加して反応を停止し、次いでクロロホルムにて抽出する。その後、２ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄し、次いで水で洗浄する。得られた反応物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０；０．０６３〜０．２ｍｍ［７０〜２３０ｍｅｓｈ］）で分離及び／又は精製する。クロロホルムからメタノールの比率を徐々に増加させた移動層を用い（クロロホルム：メタノール＝１５：２まで）、アセチル基置換度の低いジメチルアセチル−β−シクロデキストリンから順に溶出させた後、水で再結晶する。なお、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリンは、ＮＭＲにより置換度が検討済みのジメチルアセチル−β−シクロデキストリン標品を用いてＴＬＣ（メタノール：クロロホルム＝１５：２）により確認する。
【００２４】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤が上記式１の化合物を有効成分とする場合において、例えば、Ｒがカルボキシル基又はヒドロキシメチル基である上記式１の化合物の濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬのＴＴＲタンパク質に対して、１０ｍＭ以上が好ましく、４０ｍＭ以上がより好ましく、１００ｍＭ以上がさらに好ましい。
【００２５】
上記したものも含めて、シクロデキストリン誘導体として、例えば、表１に記載の化合物がこれまでに知られている。
【表１】
【００２６】
表１の化合物は、Ｕｅｋａｍａらの文献（Kaneto Uekama, Fumitoshi Hirayama, and Tetsumi Irie, (1998), Chem. Rev., 98, pp.2045-2076）に記載されており、その製造方法は該文献が引用する文献に記載されている。
【００２７】
シクロデキストリンを修飾する一般的な方法としては、メチル化、ヒドロキシエチル及びヒドロキシプロピルなどのヒドロキシアルキル化、グルコシル化、マルトシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、硫酸化、スルフォブチル化、カルボキシメチル化、カルボキシエチル化、アミノ化、カルボキシル化、トシル化、及びジメチルアセチル化などの修飾方法、及びこれらの組み合わせによる修飾方法が知られている。これらのシクロデキストリンの修飾は、例えば、下記文献：シクロデキストリン−基礎と応用−、戸田不二緒監修、産業図書を参照して実施することができる。
【００２８】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、シクロデキストリン誘導体であってもその塩であってもよい。本発明のアミロイド線維形成抑制剤に含まれるシクロデキストリン誘導体又はその塩の割合は、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制できる量であれば特に制限されるものではないが、例えば、８０％〜１００％が好ましい。
【００２９】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、シクロデキストリン誘導体又はその塩の有効量を含めば、固体又は液体のいずれの形態でも利用することができるが、これに薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬組成物として調製することもできる。
【００３０】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、アミロイド線維形成の抑制を目的として使用することができ、例えば、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬に含めることができる。したがって、本発明の別の態様は、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬であって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬がある。
【００３１】
本発明の医薬の適用対象となるアミロイドーシスとしては、例えば、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）のほか、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患、例えば、アルツハイマー症、ウシ海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）（ＢＳＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ‐Ｊａｋｏｂ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＪＤ）、笑死症候群（ｌａｕｇｈｉｎｇ ｄｅａｔｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スクレピー（ｓｃｒａｐｉｅ）、ヒトにおける変形クロイツフェルト・ヤコブ病などを挙げることができる。これらのうち家族性アミロイドーシスポリニューロパチーは本発明の医薬の特に好適な対象である。
【００３２】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の医薬の作用メカニズムは以下の如く推測される。
血清蛋白質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）によるアミロイド線維は、次の３段階を経て形成される。まず、四量体の蛋白質として血清中に存在するトランスサイレチンは、なんらかの作用によって単量体に分解される。次いで、この単量体の大部分は分解され、一部は生体代謝経路を経て尿として体外に排出されるが、単量体の一部は組替えられてβ−シート構造となる。最終的には、このβ−シート構造が線状に重合して不溶化線維状のアミロイド線維が生成される。変異トランスサイレチンでは四量体の蛋白質が単量体へと乖離されやすい性質を有しており、その結果、アミロイド線維の生成が増加する。本発明者らは、トランスサイレチンのβ−シート構造化及び／又は安定化について鋭意研究した結果、疎水性分子を包接し得るシクロデキストリンを改良した本発明のシクロデキストリン誘導体を用いることによりアミロイド線維形成を抑制することができることを見出した。これは、トランスサイレチンのβ−シート化及び／又は安定化に疎水性アミノ酸（例えば、トリプトファンなど）が関与している可能性があり、本発明のシクロデキストリン誘導体がトランスサイレチンの疎水性アミノ酸に何らかの作用を及ぼして、アミロイド線維の形成過程において、トランスサイレチン単量体のβ−シート化を抑制することによりタンパク質の重合化を阻害し、結果としてアミロイド線維の形成を抑制することが予測される。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、変異トランスサイレチンからのアミロイド線維の生成反応を抑制することができ、さらには本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬はアミロイドーシスを予防及び／又は治療することができる。
【００３３】
例えば、ＦＡＰを発病した患者のうち症状が軽度な患者は本発明の医薬を投与することにより症状の進行や悪化を防ぐことが可能になる。症状が重篤な患者に対しても治療効果を期待できる場合がある。また、変異トランスサイレチンを有する個体は加齢とともにＦＡＰを発症する可能性の高い潜在患者であるが、本発明の医薬を投与することによりＦＡＰの発症を予防することができる。
【００３４】
本発明の医薬としては、本発明のアミロイド線維形成抑制剤をそのまま用いてもよいが、通常は有効成分である本発明のアミロイド線維形成抑制剤又はそれを含む混合物と１又は２種以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態を調製して用いることが望ましい。
【００３５】
ＦＡＰの予防及び治療の際には、本発明のアミロイド線維形成抑制剤だけでなく、トランスサイレチン四量体を安定化する非ステロイド性抗炎症薬、例えば、ジフルニサールなどと併用することも望ましい。
【００３６】
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、経皮吸収剤、又は経粘膜吸収剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、乳糖やオリゴ糖などの賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
本発明の医薬の好ましい形態として、注射剤を挙げることができる。注射剤としては、通常、非水溶媒（または水溶性有機溶媒）を実質的に含まず、媒体が実質的に水である溶媒で溶解または希釈可能である。さらに、本発明の医薬品の好ましい形態として、凍結乾燥製剤（凍結乾燥した注射剤）もまた挙げることができる。このような凍結乾燥製剤であっても、注射用水（注射用蒸留水）、電解質液（生理食塩水など）などを含む輸液、栄養輸液などから選択された少なくとも１つの液体または溶媒により溶解可能であり容易に注射液を調製でき、その容器もガラス容器およびプラスチック容器が使用できる。注射剤内容物の１００重量部に対して本発明のアミロイド形成抑制剤を０．０１重量部以上、好ましくは０．１〜１０重量部含有することができる。
【００３８】
本発明の医薬の投与量及び投与回数などは特に限定されず、患者の年齢、体重、及び性別などの条件、並びに疾患の種類や重篤度、予防又は治療の目的などに応じて適宜選択可能である。通常は、非経口投与による場合には有効成分量として成人一日あたり１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜５ｇがより好ましいが、斯く投与量を一日数回に分けて投与してもよい。
【００３９】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤、又は本発明の医薬は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
（１）実験材料
本実施例で用いたトランスサイレチン（ＴＴＲ）は、健常者ボランティアから得た血清より精製した。純度の検定は非加熱（非還元）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：ＣｙＤ）誘導体である６−Ｏ−a−（４−Ｏ−a−Ｄｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−b−ＣｙＤ（ＧＵＧ−b−ＣｙＤ）及び６−Ｏ−a−ｍａｌｔｏｓｙｌ−b−ＣｙＤ（Ｇ2−b−ＣｙＤ）は、イシグロらの文献（Toshihiro Ishiguro et. al., (2001), Carbohydrate Research, 331, pp.423−430）に従って合成した。なお、比較対照として、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｔｅｄ− b−ＣｙＤ（ＨＰ−b−ＣｙＤ）及びＳｕｌｆｏｂｕｔｙｌ ｅｔｈｅｒ-b−ＣｙＤ（ＳＢＥ−b−ＣｙＤ）もまた上記文献に従って合成した。
【００４２】
（２）アミロイド線維の形成方法
ＴＴＲを１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３．０−６．５）で０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、遮光して３７℃でインキュベーションしアミロイド線維を形成させた。
【００４３】
（３）アミロイド線維の測定方法
作成したアミロイド線維は、重合したb−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンＴを用いて検出した。５０ｍＭ グリシン溶液（ｐＨ９．５）に溶解した１０ｍＭ チオフラビンＴ溶液１ｍＬに、インキュベーションしたサンプル１０mＬを添加後混合し、測定用試料とした。日立蛍光分光光度計Ｆ−４５００を用い、２５℃で４４２ｎｍの励起光で励起される４８９ｎｍの蛍光強度を測定した。なお、励起側、蛍光側ともにスリット幅は５ｎｍで測定した。
【００４４】
（４）ＧＵＧ−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、１０ｍＭ、２０ｍＭ又は３０ｍＭのＧＵＧ−b−ＣｙＤの共存又は非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図１）。解析の結果、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ共存下では、ＴＴＲのアミロイド線維形成能は用量依存的に有意に低下していた。さらに、４０ｍＭのＧＵＧ−β−ＣｙＤを初期投与（Ｄａｙ ０）し、経時的にサンプリングしてアミロイド線維を測定することにより、ＧＵＧ−β−ＣｙＤのアミロイド線維形成抑制の維持効果を評価した（図７）。図７が示す通り、ＧＵＧ−β−ＣｙＤの初期投与は、経時的なアミロイド線維形成を抑制することができた。
【００４５】
（５）Ｇ2−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、１ｍＭ、１０ｍＭ又は１００ｍＭのＧ2−b−ＣｙＤの共存又は非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図２）。解析の結果、Ｇ2−b−ＣｙＤを共存させると、ＴＴＲのアミロイド線維形成能は、比較的高濃度ではあるが、用量依存的に低下していた。
【比較例】
【００４６】
（１）シクロデキストリン誘導体における分岐糖鎖の影響評価１
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、各４０ｍＭのＨＰ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ、Ｇ2−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図３）。解析の結果、シクロデキストリン誘導体のアミロイド線維に対する抑制効果は、各種分岐b−ＣｙＤ間の分岐糖鎖の差異により大きく変化し、ＧＵＧ−b−ＣｙＤが最も強いアミロイド形成抑制効果を示した。
【００４７】
（２）シクロデキストリン誘導体における分岐糖鎖の影響評価２
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、各４０ｍＭのＳＢＥ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図４）。解析の結果、シクロデキストリン誘導体のアミロイド線維に対する抑制効果は、各種分岐b−ＣｙＤ間の分岐糖鎖の差異により大きく変化し、ＳＢＥ−b−ＣｙＤでは逆に増強された。
【００４８】
（３）シクロデキストリンとの比較
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、各２０ｍＭのＧＵＧ−b−ＣｙＤ及びβ−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図５）。結果、ＧＵＧ−b−ＣｙＤを共存させるとアミロイド線維形成の抑制効果が見られたのに対して、β−ＣｙＤを共存させても抑制効果は得られなかった。本結果から、β−ＣｙＤは、修飾されてはじめて、アミロイド線維形成を抑制することができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
アミロイド線維の沈着によって臓器障害が引き起こされる疾患には、ＦＡＰをはじめ、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病、及びその他の遺伝性の疾患が含まれる。アミロイド線維の沈着はタンパク質の不溶性の繊維状凝集体の形成に起因することから、シクロデキストリン誘導体はこれらの多様なアミロイドーシス疾患への治療にも応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び３０ｍＭのＧＵＧ−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図２】図２は、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭのＧ2−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図３】図３は、ＨＰ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ、Ｇ2−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でのアミロイド線維形成の抑制を比較した結果を示す。
【図４】図４は、ＳＢＥ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でのアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図５】図５は、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ及びβ−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でのアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図６】図６は、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリンの合成経路の概略を示す。
【図７】図７は、ＧＵＧ−β−ＣｙＤのアミロイド線維形成抑制の持続効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤、及び該アミロイド線維形成抑制剤を含むアミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスとは、β−シート構造を有するタンパク質が重合して不溶性のアミロイド（ａｍｙｌｏｉｄ）と呼ばれる細線維を形成し、生体内に沈着して組織傷害をもたらす疾患群のことを指す。ドイツの病理学者であるＶｉｒｃｈｏｗは、アミロイドーシスの組織標本がヨードで紫色に染まることを発見した。この結果から、Ｖｉｒｃｈｏｗは組織に沈着した物質は多糖体であると考え、これを「デンプン様物質」すなわち「アミロイド」と命名し、アミロイドの沈着により惹起される病態をアミロイドーシスと呼ぶことを提唱した。その後の研究により、アミロイドの主成分はナイロン様に重合して線維を形成するタンパク質であり、アミロイドには血清アミロイドＰ成分やグリコサアミノグリカンなどが含まれていることが分かっている。現在では、アミロイドは「コンゴーレッド染色で橙赤色に染まり、偏光顕微鏡下で観察すると緑色に強く輝く複屈折を起こす幅８−１５ｎｍの枝分かれのない細線維の集積からなる」と定義されている。
【０００３】
アミロイドーシスには、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病その他遺伝性の疾患など様々な疾患が含まれる。その中でもＦＡＰは、末梢神経、自律神経、腎、皮膚、粘膜などの全身臓器にアミロイド沈着をきたし、常染色体優性遺伝形式で遺伝浸透するアミロイドーシスであり、我が国、特に九州地方及び中部地方で多くの症例が確認されている。１９５２年にポルトガル人のＦＡＰ症例が初めて報告されて以来、世界各国から同様の症例報告がなされている。ＦＡＰの原因となるアミロイド線維は、主として、血清タンパク質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）が変異したもので構成されている。
【０００４】
正常ＴＴＲは、β−シート構造を多く含む立体構造をしており、肝臓、脳脈絡叢、網膜、膵α細胞などで産生されるが、特にその９０％以上が肝臓で産生されるといわれている。正常ＴＴＲは、四量体を形成してサイロキシン（Ｔ４）やレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などを介したビタミンＡの輸送体としての役割を担っている。正常ＴＴＲの変異体は、これまでに１００種以上が報告されており、構造安定性が低く、四量体から単量体への構造変化を起こしやすいことが明らかになっている。
【０００５】
我国で多いＦＡＰは、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ型の変異ＴＴＲを原因タンパク質とするＩ型ＦＡＰである。Ｉ型ＦＡＰの主要性状は、左右対称性に下肢末端から上行する知覚障害を伴う多発性神経炎と自律神経障害（交代性の下痢と便秘、起立性低血圧、排尿傷害等）であり、これらはいずれもアミロイドによる神経傷害が原因である。その後、心臓、腎臓、消化管へのアミロイド沈着が著しくなり、これらの臓器の機能不全を引き起こす。一般的には、２０代後半から３０代で発症し１０年で歩行不能となり、１０〜２０年の経過で感染症、心不全、腎不全などで死亡する予後不良の疾患であり、厚生省特定疾患にも指定されている難病の一つである。
【０００６】
Ｉ型ＦＡＰをもたらし得る変異ＴＴＲタンパク質は、正常ＴＴＲタンパク質に比べ構造安定性が低く、分子中のβ−シート構造が互いに会合し不溶性のアミロイド線維を形成して組織に沈着するといわれている。したがって、変異ＴＴＲタンパク質によるアミロイド線維形成を抑制することにより、Ｉ型ＦＡＰを予防又は治療、或いはその両方をすることができると考えられている。アミロイド線維形成を抑制する方法としては、４量体ＴＴＲ分子の乖離を阻害する方法などが試みられているが、臨床的な治療効果は認められていない（Yoshiki Sekijima et.al., "Long-term effects of diflunisal on familial amyloid polyneuropathy," 2008, VIIth International symposium on Familial Amyloid Polyneuropathy）。さらに、アミロイドーシスの予防及び／又は治療に応用できる、安全性の高い、アミロイド線維形成を抑制する物質についてはこれまでに報告されていない（非特許文献１）。
【０００７】
以下の文献を含めて、本明細書中に記載のあるすべての文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【非特許文献１】Yukio Ando, (2005), Med Mol Morphol, 38: pp. 142-154
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の第一の課題は、安全性の高い、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制する物質を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤を提供することにある。さらに、本発明の第二の課題は、該抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬、特に家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）の予防及び／又は治療のための医薬を提供することにあり、さらにはアミロイドーシスに起因する知覚障害と自律神経障害の発症を予防するための医薬、及び上記知覚障害と自律神経障害の進行防止などを可能にする治療のための医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討したところ、シクロデキストリン誘導体がアミロイド線維形成を抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明によれば、置換されていてもよい糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種で修飾されたシクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤の好ましい態様は、シクロデキストリン誘導体がβ−シクロデキストリン誘導体である。
【００１１】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤の好ましい態様は、シクロデキストリン誘導体が下記式１
【化１】
［式中、Ｒはカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、又はアセチル基である］
の化合物である。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、アミロイド線維形成を有意に抑制することができる。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬は、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬として有用であり、特に対症療法や肝臓移植しか治療方法のない家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）に対して有効性の高い医薬として用いることができる。さらに、本発明の医薬は、本発明のアミロイド線維形成抑制剤が脂溶性薬物などの可溶化及び安定化などの目的で医薬品の賦形剤として汎用されている安全性の高いシクロデキストリン誘導体を有効成分として含有することから、人体に対して安全性の高い医薬である。したがって、本発明の医薬は、その有効性及び安全性から、アミロイドーシスの予防及び／又は治療に際して早期の実用化が見込める医薬である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤の有効成分であるシクロデキストリン誘導体は、シクロデキストリンを構成するグルコース骨格の一部又は全部が修飾されている。
【００１５】
シクロデキストリンは、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合した環状オリゴ糖であり、その分子内の空孔に疎水性の分子を包接することができるという特性を持つ。シクロデキストリンは、該特性と安全性の面から、脂溶性薬物の可溶化や安定化、局所刺激性の軽減など薬学領域において幅広く利用さている（Kaneto Uekama, (2004), YAKUGAKU ZASSHI, 124, (12), pp.909-935）。さらに、シクロデキストリンは、コレステロールやリン脂質の制御、タンパク質の安定化などの作用を示し、単なる医薬品添加物としての用途のみならず多様な機能を持つ。
【００１６】
シクロデキストリン誘導体を構成するシクロデキストリンとしては、分子を包接することができるものであれば特に制限されないが、例えば、グルコース骨格が６個であるα−シクロデキストリン、グルコース骨格が７個であるβ−シクロデキストリン、及びグルコース骨格が８個であるγ−シクロデキストリンが好ましく、これらの中でも入手が容易であり、医薬品の賦形剤として実績があり、さらには包接対象が多岐に渡るβ−シクロデキストリンがより好ましい。
【００１７】
シクロデキストリン誘導体は、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制できれば特に制限されるものではないが、例えば、糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる１種又は２種以上で修飾されたシクロデキストリン誘導体であることが好ましく、糖で修飾されたシクロデキストリン誘導体がより好ましい。シクロデキストリン誘導体における修飾基の数は、好ましくは１〜５種であり、より好ましくは１〜３種であり、さらに好ましくは１又は２種であり、なおさらに好ましいのは１種である。
【００１８】
シクロデキストリン誘導体の修飾に供される糖としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノースなどの単糖類；マルトース、トレハロース、コージービオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース、スクロース、パラチノース、メリビオース、ルチノース、プリメベロース、ツラノースなどの二糖類；マルトトリオース、イソマルトトリオース、パノース、セロトリオース、マンニノトリオース、ソラトリオース、メレジトース、プランテオース、ゲンチアノース、ウンベリフェロース、ラクトスクロース、ラフィノースなどの三糖類のみならず、それ以上の重合度のキシロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などのオリゴ糖類などが好ましい。
【００１９】
シクロデキストリンを修飾するペプチドは、例えば、アミノ酸の個数が１〜１０個のものが好ましく、アミノ酸の個数が２〜８個のものがより好ましく、アミノ酸の個数が２〜６個のものがさらに好ましい。ペプチドを構成するアミノ酸の種類は、適宜設定できるが、疎水性側鎖を有するアミノ酸を多く含むものが好ましい。
【００２０】
シクロデキストリンを修飾するポリエチレングリコールは、例えば、分子量が２００〜５００００のものが好ましく、分子量が１０００〜５００００のものがより好ましく、分子量が１００００〜３００００のものがさらに好ましい。
【００２１】
シクロデキストリンを修飾する糖は、ヒドロキシル基の一部又は全部がカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基などで置換されていてもよい。斯く置換されていてもよい糖としては、６−Ｏ−α−マルトース及び６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルコニル）−Ｄ−グルコースが最も好ましく用いられる。
【００２２】
シクロデキストリン誘導体の好ましい態様は、下記式１
【化２】
［式中、Ｒはカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、又はアセチル基である］
の化合物である。
【００２３】
上記式１の化合物の合成法は、これまでに知られている方法を制限なく使用できるが、例えば、イシグロらの文献（Toshihiro Ishiguro et. al., (2001), Carbohydrate Research, 331, pp.423−430）に記載の方法に準じて製造することもできる。一例として、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリン（２，６−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−b−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）の合成を以下に示す（図６）。
乾燥させたジメチル−β−シクロデキストリン（２，６−ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−b−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を無水ピリジンに溶解した後、室温で無水条件下で２〜３時間かけて無水酢酸を加え、８０℃に加温し約１２時間攪拌する。反応終了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；メタノール：クロロホルム＝１５：２）により確認した後、反応液に氷水を添加して反応を停止し、次いでクロロホルムにて抽出する。その後、２ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄し、次いで水で洗浄する。得られた反応物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０；０．０６３〜０．２ｍｍ［７０〜２３０ｍｅｓｈ］）で分離及び／又は精製する。クロロホルムからメタノールの比率を徐々に増加させた移動層を用い（クロロホルム：メタノール＝１５：２まで）、アセチル基置換度の低いジメチルアセチル−β−シクロデキストリンから順に溶出させた後、水で再結晶する。なお、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリンは、ＮＭＲにより置換度が検討済みのジメチルアセチル−β−シクロデキストリン標品を用いてＴＬＣ（メタノール：クロロホルム＝１５：２）により確認する。
【００２４】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤が上記式１の化合物を有効成分とする場合において、例えば、Ｒがカルボキシル基又はヒドロキシメチル基である上記式１の化合物の濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬのＴＴＲタンパク質に対して、１０ｍＭ以上が好ましく、４０ｍＭ以上がより好ましく、１００ｍＭ以上がさらに好ましい。
【００２５】
上記したものも含めて、シクロデキストリン誘導体として、例えば、表１に記載の化合物がこれまでに知られている。
【表１】
【００２６】
表１の化合物は、Ｕｅｋａｍａらの文献（Kaneto Uekama, Fumitoshi Hirayama, and Tetsumi Irie, (1998), Chem. Rev., 98, pp.2045-2076）に記載されており、その製造方法は該文献が引用する文献に記載されている。
【００２７】
シクロデキストリンを修飾する一般的な方法としては、メチル化、ヒドロキシエチル及びヒドロキシプロピルなどのヒドロキシアルキル化、グルコシル化、マルトシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、硫酸化、スルフォブチル化、カルボキシメチル化、カルボキシエチル化、アミノ化、カルボキシル化、トシル化、及びジメチルアセチル化などの修飾方法、及びこれらの組み合わせによる修飾方法が知られている。これらのシクロデキストリンの修飾は、例えば、下記文献：シクロデキストリン−基礎と応用−、戸田不二緒監修、産業図書を参照して実施することができる。
【００２８】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、シクロデキストリン誘導体であってもその塩であってもよい。本発明のアミロイド線維形成抑制剤に含まれるシクロデキストリン誘導体又はその塩の割合は、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制できる量であれば特に制限されるものではないが、例えば、８０％〜１００％が好ましい。
【００２９】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、シクロデキストリン誘導体又はその塩の有効量を含めば、固体又は液体のいずれの形態でも利用することができるが、これに薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬組成物として調製することもできる。
【００３０】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、アミロイド線維形成の抑制を目的として使用することができ、例えば、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬に含めることができる。したがって、本発明の別の態様は、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬であって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬がある。
【００３１】
本発明の医薬の適用対象となるアミロイドーシスとしては、例えば、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）のほか、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患、例えば、アルツハイマー症、ウシ海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）（ＢＳＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ‐Ｊａｋｏｂ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＪＤ）、笑死症候群（ｌａｕｇｈｉｎｇ ｄｅａｔｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スクレピー（ｓｃｒａｐｉｅ）、ヒトにおける変形クロイツフェルト・ヤコブ病などを挙げることができる。これらのうち家族性アミロイドーシスポリニューロパチーは本発明の医薬の特に好適な対象である。
【００３２】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の医薬の作用メカニズムは以下の如く推測される。
血清蛋白質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）によるアミロイド線維は、次の３段階を経て形成される。まず、四量体の蛋白質として血清中に存在するトランスサイレチンは、なんらかの作用によって単量体に分解される。次いで、この単量体の大部分は分解され、一部は生体代謝経路を経て尿として体外に排出されるが、単量体の一部は組替えられてβ−シート構造となる。最終的には、このβ−シート構造が線状に重合して不溶化線維状のアミロイド線維が生成される。変異トランスサイレチンでは四量体の蛋白質が単量体へと乖離されやすい性質を有しており、その結果、アミロイド線維の生成が増加する。本発明者らは、トランスサイレチンのβ−シート構造化及び／又は安定化について鋭意研究した結果、疎水性分子を包接し得るシクロデキストリンを改良した本発明のシクロデキストリン誘導体を用いることによりアミロイド線維形成を抑制することができることを見出した。これは、トランスサイレチンのβ−シート化及び／又は安定化に疎水性アミノ酸（例えば、トリプトファンなど）が関与している可能性があり、本発明のシクロデキストリン誘導体がトランスサイレチンの疎水性アミノ酸に何らかの作用を及ぼして、アミロイド線維の形成過程において、トランスサイレチン単量体のβ−シート化を抑制することによりタンパク質の重合化を阻害し、結果としてアミロイド線維の形成を抑制することが予測される。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、変異トランスサイレチンからのアミロイド線維の生成反応を抑制することができ、さらには本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬はアミロイドーシスを予防及び／又は治療することができる。
【００３３】
例えば、ＦＡＰを発病した患者のうち症状が軽度な患者は本発明の医薬を投与することにより症状の進行や悪化を防ぐことが可能になる。症状が重篤な患者に対しても治療効果を期待できる場合がある。また、変異トランスサイレチンを有する個体は加齢とともにＦＡＰを発症する可能性の高い潜在患者であるが、本発明の医薬を投与することによりＦＡＰの発症を予防することができる。
【００３４】
本発明の医薬としては、本発明のアミロイド線維形成抑制剤をそのまま用いてもよいが、通常は有効成分である本発明のアミロイド線維形成抑制剤又はそれを含む混合物と１又は２種以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態を調製して用いることが望ましい。
【００３５】
ＦＡＰの予防及び治療の際には、本発明のアミロイド線維形成抑制剤だけでなく、トランスサイレチン四量体を安定化する非ステロイド性抗炎症薬、例えば、ジフルニサールなどと併用することも望ましい。
【００３６】
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、経皮吸収剤、又は経粘膜吸収剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、乳糖やオリゴ糖などの賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
本発明の医薬の好ましい形態として、注射剤を挙げることができる。注射剤としては、通常、非水溶媒（または水溶性有機溶媒）を実質的に含まず、媒体が実質的に水である溶媒で溶解または希釈可能である。さらに、本発明の医薬品の好ましい形態として、凍結乾燥製剤（凍結乾燥した注射剤）もまた挙げることができる。このような凍結乾燥製剤であっても、注射用水（注射用蒸留水）、電解質液（生理食塩水など）などを含む輸液、栄養輸液などから選択された少なくとも１つの液体または溶媒により溶解可能であり容易に注射液を調製でき、その容器もガラス容器およびプラスチック容器が使用できる。注射剤内容物の１００重量部に対して本発明のアミロイド形成抑制剤を０．０１重量部以上、好ましくは０．１〜１０重量部含有することができる。
【００３８】
本発明の医薬の投与量及び投与回数などは特に限定されず、患者の年齢、体重、及び性別などの条件、並びに疾患の種類や重篤度、予防又は治療の目的などに応じて適宜選択可能である。通常は、非経口投与による場合には有効成分量として成人一日あたり１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜５ｇがより好ましいが、斯く投与量を一日数回に分けて投与してもよい。
【００３９】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤、又は本発明の医薬は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
（１）実験材料
本実施例で用いたトランスサイレチン（ＴＴＲ）は、健常者ボランティアから得た血清より精製した。純度の検定は非加熱（非還元）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：ＣｙＤ）誘導体である６−Ｏ−a−（４−Ｏ−a−Ｄｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−b−ＣｙＤ（ＧＵＧ−b−ＣｙＤ）及び６−Ｏ−a−ｍａｌｔｏｓｙｌ−b−ＣｙＤ（Ｇ2−b−ＣｙＤ）は、イシグロらの文献（Toshihiro Ishiguro et. al., (2001), Carbohydrate Research, 331, pp.423−430）に従って合成した。なお、比較対照として、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｔｅｄ− b−ＣｙＤ（ＨＰ−b−ＣｙＤ）及びＳｕｌｆｏｂｕｔｙｌ ｅｔｈｅｒ-b−ＣｙＤ（ＳＢＥ−b−ＣｙＤ）もまた上記文献に従って合成した。
【００４２】
（２）アミロイド線維の形成方法
ＴＴＲを１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３．０−６．５）で０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、遮光して３７℃でインキュベーションしアミロイド線維を形成させた。
【００４３】
（３）アミロイド線維の測定方法
作成したアミロイド線維は、重合したb−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンＴを用いて検出した。５０ｍＭ グリシン溶液（ｐＨ９．５）に溶解した１０ｍＭ チオフラビンＴ溶液１ｍＬに、インキュベーションしたサンプル１０mＬを添加後混合し、測定用試料とした。日立蛍光分光光度計Ｆ−４５００を用い、２５℃で４４２ｎｍの励起光で励起される４８９ｎｍの蛍光強度を測定した。なお、励起側、蛍光側ともにスリット幅は５ｎｍで測定した。
【００４４】
（４）ＧＵＧ−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、１０ｍＭ、２０ｍＭ又は３０ｍＭのＧＵＧ−b−ＣｙＤの共存又は非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図１）。解析の結果、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ共存下では、ＴＴＲのアミロイド線維形成能は用量依存的に有意に低下していた。さらに、４０ｍＭのＧＵＧ−β−ＣｙＤを初期投与（Ｄａｙ ０）し、経時的にサンプリングしてアミロイド線維を測定することにより、ＧＵＧ−β−ＣｙＤのアミロイド線維形成抑制の維持効果を評価した（図７）。図７が示す通り、ＧＵＧ−β−ＣｙＤの初期投与は、経時的なアミロイド線維形成を抑制することができた。
【００４５】
（５）Ｇ2−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、１ｍＭ、１０ｍＭ又は１００ｍＭのＧ2−b−ＣｙＤの共存又は非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図２）。解析の結果、Ｇ2−b−ＣｙＤを共存させると、ＴＴＲのアミロイド線維形成能は、比較的高濃度ではあるが、用量依存的に低下していた。
【比較例】
【００４６】
（１）シクロデキストリン誘導体における分岐糖鎖の影響評価１
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、各４０ｍＭのＨＰ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ、Ｇ2−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図３）。解析の結果、シクロデキストリン誘導体のアミロイド線維に対する抑制効果は、各種分岐b−ＣｙＤ間の分岐糖鎖の差異により大きく変化し、ＧＵＧ−b−ＣｙＤが最も強いアミロイド形成抑制効果を示した。
【００４７】
（２）シクロデキストリン誘導体における分岐糖鎖の影響評価２
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、各４０ｍＭのＳＢＥ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図４）。解析の結果、シクロデキストリン誘導体のアミロイド線維に対する抑制効果は、各種分岐b−ＣｙＤ間の分岐糖鎖の差異により大きく変化し、ＳＢＥ−b−ＣｙＤでは逆に増強された。
【００４８】
（３）シクロデキストリンとの比較
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型ＴＴＲを、各２０ｍＭのＧＵＧ−b−ＣｙＤ及びβ−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った（図５）。結果、ＧＵＧ−b−ＣｙＤを共存させるとアミロイド線維形成の抑制効果が見られたのに対して、β−ＣｙＤを共存させても抑制効果は得られなかった。本結果から、β−ＣｙＤは、修飾されてはじめて、アミロイド線維形成を抑制することができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
アミロイド線維の沈着によって臓器障害が引き起こされる疾患には、ＦＡＰをはじめ、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病、及びその他の遺伝性の疾患が含まれる。アミロイド線維の沈着はタンパク質の不溶性の繊維状凝集体の形成に起因することから、シクロデキストリン誘導体はこれらの多様なアミロイドーシス疾患への治療にも応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び３０ｍＭのＧＵＧ−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図２】図２は、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭのＧ2−b−ＣｙＤによるアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図３】図３は、ＨＰ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ、Ｇ2−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でのアミロイド線維形成の抑制を比較した結果を示す。
【図４】図４は、ＳＢＥ−b−ＣｙＤ、ＧＵＧ−b−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でのアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図５】図５は、ＧＵＧ−b−ＣｙＤ及びβ−ＣｙＤの共存又はこれらの非共存下でのアミロイド線維形成の抑制結果を示す。
【図６】図６は、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリンの合成経路の概略を示す。
【図７】図７は、ＧＵＧ−β−ＣｙＤのアミロイド線維形成抑制の持続効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換されていてもよい糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種で修飾されたシクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項２】
シクロデキストリン誘導体がβ−シクロデキストリン誘導体である、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項３】
シクロデキストリン誘導体が下記式１
【化１】
［式中、Ｒはカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、又はアセチル基である］
の化合物である、請求項１又は２に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項１】
置換されていてもよい糖、ペプチド、及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種で修飾されたシクロデキストリン誘導体又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項２】
シクロデキストリン誘導体がβ−シクロデキストリン誘導体である、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項３】
シクロデキストリン誘導体が下記式１
【化１】
［式中、Ｒはカルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メチル基、エチル基、ホルミル基、又はアセチル基である］
の化合物である、請求項１又は２に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−９００５４（Ｐ２０１０−９００５４Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６０９６５（Ｐ２００８−２６０９６５）
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
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