アミロイド蛋白質の凝集を抑制する物質とその作用
【課題】 アルツハイマー病の症状を抑制・改善する。
【解決手段】１）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）；
２）Ｌ−ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基をアラニンまたはセリンによって置換したＬ−ＰＧＤＳの変異体；および
３）β−ラクトグロブリン
よりなる群よりなる群から選択されるポリペプチドを有効成分として含む薬剤を投与する。このポリペプチドはβアミロイド蛋白質と結合しその凝集を抑制する。
【解決手段】１）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）；
２）Ｌ−ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基をアラニンまたはセリンによって置換したＬ−ＰＧＤＳの変異体；および
３）β−ラクトグロブリン
よりなる群よりなる群から選択されるポリペプチドを有効成分として含む薬剤を投与する。このポリペプチドはβアミロイド蛋白質と結合しその凝集を抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アルツハイマー病の症状を抑制・改善させる薬剤に関する。さらに詳しくは、この発明はアミロイド蛋白質の凝集を抑制し、アルツハイマー病の症状を抑制・改善させる薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会の到来とともに痴呆患者も増加しており、６５歳以上の約５％が痴呆患者と言われているが、神経変性疾患であるアルツハイマー病は老年期の痴呆のほとんどを占める重要な疾患である。その病態発生の第１段階は脳実質にＡβ蛋白質が・シート構造をとり凝集・沈着することにあると考えられており、ひきつづき老人斑の形成とニューロンの神経原性変化を引き起こす。近年、このＡβ蛋白質の凝集・沈着を阻害するために、Ａβワクチン・抗Ａβ抗体、βシートブレイカーの投与が考えられている（Hock C et al. Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease.
Neuron. 2003 38:547-54., Janus C et al. A beta peptide immunization reduces
behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature.
2000 408:979-82., Soto C et al. Beta-sheet breaker peptides inhibit
fibrillogenesis in a rat brain model of amyloidosis: implications for Alzheimer's therapy. Nat Med. 1998 4:822-6.）。しかし、いずれも非生理的物質であり副作用を合併する恐れがある。
【非特許文献１】Neuron. 2003 38:547-554
【非特許文献２】Nature. 2000 408:979-982
【非特許文献３】Nat Med. 1998 4:822-826
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この発明はアミロイド蛋白質の凝集を抑制し、アルツハイマー病の症状を抑制・改善させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行い、次のような知見を得たことに基づいて本発明を完成させた。
１）アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスにおいてアミロイド・プラークにＬ−ＰＧＤＳが沈着している。
２）ヒトアミロイド蛋白質に対し、リポカリン型プラスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）が強い親和性を示し、さらにチオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイによる凝集試験において強い凝集抑制作用を示す。
３）上記２）の効果はリポカリン型プラスタグランジンＤ合成酵素のみならずその変異体によっても生ずる。その変異体にはプラスタグランジンＤ合成酵素の活性部位のシステイン残基を置換したものも含まれる。
【０００５】
即ち、本発明は、アルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤であって、
１）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）；
２）Ｌ−ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基をアラニンまたはセリンによって置換したＬ−ＰＧＤＳの変異体；
３）β−ラクトグロブリン
４）生体内、特に脳内でのＬ−ＰＧＤＳ蛋白質の発現を増強する物質
よりなる群から選択される化合物を有効成分として含む薬剤
を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の薬剤によればアルツハイマー病の症状の抑制、改善をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第一の態様はＬ−ＰＧＤＳを有効成分とする。Ｌ−ＰＧＤＳは哺乳動物由来のものであり、ヒト由来（配列番号１、その１から２１番目のアミノ酸はシグナルペプチドである）およびマウス由来（配列番号２，その１から２４番目のアミノ酸はシグナルペプチドである）のものが好ましく、ヒト由来のものが特に好ましい。
【０００８】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第二の態様ではＬ−ＰＧＤＳ変異体を有効成分とする。好ましくは本発明におけるＬ−ＰＧＤＳ変異体は、Ｌ−ＰＧＤＳに含まれるシステイン残基の少なくとも１つを他のアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンで置換したものであり、その例は、
１）ヒトＬ−ＰＧＤＳ（配列番号１）の６５と１６７番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ１．３」および「Ｓｅｒ１．３」とそれぞれ略すことがある）；
２）ヒトＬ−ＰＧＤＳ（配列番号１）の８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ２．３．４」および「Ｓｅｒ２．３．４」とそれぞれ略すことがある）；
３）マウスＬ−ＰＧＤＳ（配列番号２）の６５番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ１」および「Ｓｅｒ１」とそれぞれ略すことがある）；
４）マウスＬ−ＰＧＤＳ（配列番号２）の８９と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ２．３」、「Ｓｅｒ２．３」とそれぞれ略すことがある）
である。
【０００９】
哺乳動物由来Ｌ−ＰＧＤＳは哺乳動物の組織から得ることも可能であるが、遺伝子組み換え技術により製造するのが便利である。ヒトまたはマウス由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）のアミノ酸配列は公知である。ヒト由来Ｌ−ＰＧＤＳのアミノ酸配列を配列番号１に示す（配列番号１の１から２１番目のアミノ酸残基はシグナルペプチドである）。マウス由来のＬ−ＰＧＤＳのアミノ酸配列を配列番号２に示す（配列番号１の１から２４番目のアミノ酸残基はシグナルペプチドである）。Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列も知られている。ヒト由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３に示す（配列番号３の１から６３番目のヌクレオチド残基はシグナルペプチドをコードする）。マウス由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４に示す（配列番号４の１から７２番目のヌクレオチド残基はシグナルペプチドをコードでする）。従って、適当な宿主系内で組換えＬ−ＰＧＤＳを発現する発現ベクターを構築することができる。得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体をＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、組換えＬ−ＰＧＤＳを製造することができる。
【００１０】
本発明のＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築することができる。Ｌ−ＰＧＤＳの発現に適したベクターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウイルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因子ＥＦ−１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウイルスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターやベーターガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌、大腸菌での発現に用いることができる。ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ＤＮＡの挿入部位下流には転写終結シグナルがあることが望ましい。
【００１１】
ベクター中にはたとえば薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在することが望ましい。あるいは、Ｌ−ＰＧＤＳをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換してもよい。
【００１２】
発現ベクターを構築するにはＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入する。適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。Ｌ−ＰＧＤＳｃＤＮＡを挿入し、培養細胞に導入してこのｃＤＮＡを発現する目的に用いることができるＤＮＡベクターとして、例えば動物細胞での発現においてはｐＫＣＲ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ等を挙げることができる。
【００１３】
Ｌ−ＰＧＤＳの発現に用い得る細胞は複製可能でＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡを発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ．セレビジエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内からＬ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
形質転換した細胞を常法に従い培養することにより所望の蛋白質が得られる。培養に用いる培地は宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大腸菌である場合にはＬＢ培地やＴＢ培地が、宿主が哺乳動物細胞である場合にはＲＰＭＩ１６４０培地等を適宜用いることができる。
この培養により得られる培養物からの本発明に用いる蛋白質の単離および精製は常法により行うことが可能であり、例えば培養物を蛋白質の物理的および化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。具体的には蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを単独で、または組み合わせて用いることができる。得られる蛋白質溶液は必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることができる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニトール，デキストロース，マルトース，グリセロールなどの安定剤を加えることができる。
【００１４】
Ｌ−ＰＧＤＳの変異体を製造するには好ましくは位置指定突然変異導入法を用いる。この方法は周知であり、実施するためのキット（例えば、STRATAGENE社製、QuickChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit）が市販されている。
位置指定突然変異導入法により変異を入れるためには、目的の部位にミスマッチコドンを含む約３０〜４０塩基のプライマー一対を合成し、これらのプライマーを用いて、野生型のプラスミドを鋳型としてＰｆｕポリメラーゼでプラスミド全体をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ終了後、反応液中には鋳型プラスミドと合成された変異体プラスミドが混在するので、ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼ酵素処理を行い、鋳型プラスミドを分解除去して変異体プラスミドを精製する。
【００１５】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第三の態様ではβラクトグロブリンを有効成分とする。βラクトグロブリンは、牛乳中に含まれ、リポカリンファミリーに属する蛋白質である。βラクトグロブリンは、市販されているものを（例えばＳigma社）用いることができる。
【００１６】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第四の態様ではＬ−ＰＧＤＳの発現を増強させる物質を有効成分とする。Ｌ−ＰＧＤＳの発現を増強させる物質としては、エストロジェン(Otsuki M et al. Specific regulation of lipocalin-type prostaglandin D synthase in mouse heart by estrogen receptor beta. Mol Endocrinol. 2003 Sep;17(9):1844-55. Epub 2003 Jun 26.)、グルココルチコイド（Garcia-Fernandez LF et al. Dexamethasone induces lipocalin-type prostaglandin D synthase gene expression in mouse neuronal cells. J Neurochem. 2000 Aug;75(2):460-70.）、インターロイキン−１β(Fujimori K et al. Regulation of lipocalin-type prostaglandin D synthase gene expression by Hes-1 through E-box and interleukin-1 beta via two NF-kappa B elements in rat leptomeningeal cells. J Biol Chem. 2003 Feb 21;278(8):6018-26. Epub 2002 Dec 17.)、サイロイドホルモン(Leone MG et al. Lipocalin type prostaglandin D-synthase: which role in male fertility Contraception. 2002 Apr;65(4):293-5.)がある。これらの物質は生体内、特に脳内でＬ−ＰＧＤＳの発現を増強させることが知られている。
【００１７】
本発明の薬剤の有効成分が蛋白質の場合、当該蛋白質を自体公知の担体と混合希釈して、たとえば液剤などとして製剤化することができる。液剤を調製するには、例えば精製水、生理食塩水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このように調整した液剤は、たとえば乳酸リンゲル液、輸液用電解質液よりなる維持液、術後回復液、脱水補給液、点滴用生理食塩液等に希釈して用いることができる。通常液剤に適宜選択して用いられる添加剤、例えば、ｐＨ調整用の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、等張化剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール，グルコース、塩化ナトリウム等）このような製剤にはさらに薬学上許容しうる塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキシノール、クロルクレゾール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノール等の適当な防腐殺菌剤、タルク等の湿潤剤、モノオレイン酸ポリエチレングリコール等の乳化剤、分散剤、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩等の安定剤のような補助剤を加えても良い。またアラビアゴム、カオリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を懸濁化剤として用いた懸濁剤として投与することも好ましい剤型の１つといえる。
【００１８】
投与経路としては非径口的投与が好ましく、例えば経静脈的投与、経脳脊髄液投与、カテーテルによる経動脈的な局所投与、もしくは外科的な局所投与を含む。本発明の有効成分の投与量は、０．０１〜２０.０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００１９】
本発明の薬剤の有効成分がエストロジェン、グルココルチコイド等の低分子化合物である場合にも医薬的に受容しうる担体と混合して薬剤を製造できる。この担体は投与に対して望ましい製剤の形態に応じて広い範囲の形態をとることができる。投与経路としては非経口的投与、および経口的投与のいずれも使用できる。経口的投与のための散剤、丸薬、カプセルおよび錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マニトール等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステルなどの表面活性剤、グリセリン等の可塑剤を用いて製造できる。本発明の有効成分の投与量は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００２０】
さらに、本発明はＬ−ＰＧＤＳおよび変異体の遺伝子を遺伝子治療に用い、脳内で局所的にＬ−ＰＧＤＳ、または変異体を発現させることで、Ａβ蛋白質の凝集・沈着を抑制し、アルツハイマー病の症状予防・抑制・改善に用いる方法を提供する。
本発明のＬ−ＰＧＤＳまたはその変異体の遺伝子をベクターに組み込み脳内に導入する。遺伝子治療法に用いるベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターを含むあらゆるウイルスベクター、リポソームベクターを含む。さらに詳しくは、ウイルスベクターとはウイルスの殻と遺伝子の一部を用い病原性を司る遺伝子を切り取り、代わりに脳膜もしくはオリゴデンドロサイトで発現するように修飾したL-PGDS遺伝子をはめ込んだものである。リポソームベクターとは、主に人工的な脂質二重膜でできたミクロの球体に、脳膜もしくはオリゴデンドロサイトで発現するように修飾したL-PGDS遺伝子を組み込んだものである（リポフェクション法）。通常ホスファチジルセリンからなるリポソームが用いられる。この陰電荷を有するリン脂質の代わりに、より安定したリポソームを作り易いＤＯＴＭＡ（N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N，N，N−トリメチルアンモニウムクロライド）と呼ばれる陽イオン脂質が市販されるようになった。正に荷電しているリポソームが負に荷電している細胞を表面に吸着し、細胞膜と融合することでＤＮＡを細胞内に導入する。このベクターを、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、髄腔内投与、局所投与にて投与する。
以下に本発明を実施例により更に説明するが、本発明が実施例により限定されるものでないことは明らかである。
【実施例】
【００２１】
実施例１
ヒト由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の製造
Ａｌａ２１からＣ末端までのヒトＬ−ＰＧＤＳ遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅により得、シグナルペプチドを欠損させて配列番号３のＤＮＡ配列の６７番目から３’末端までを発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）に挿入して、その発現ベクターで大腸菌(Escherichia coli) DH5αを形質転換した。ｐＧＥＸ−２Ｔは目的遺伝子をグルタチオン−Ｓ−トタンスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の下流に挿入し、目的蛋白質をＧＳＴ融合蛋白質として発現するための発現ベクターである。続いて、該ベクターをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度が０．４から０．６ｍＭになるように添加してＧＳＴとＬ−ＰＧＤＳの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに４−６時間培養した。
培養終了後、培養液から大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消化し、Ｌ−ＰＧＤＳフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製しヒト由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を得た。
【００２２】
実施例２
マウス由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の製造
実施例１においてヒト由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡを、マウス由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡ（配列番号４のＤＮＡ配列の７０番目から３’末端まで）に変えた外は実施例１と同様にしてマウス由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を得た。
【００２３】
実施例３
ヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１．３）の製造
ヒトＬ−ＰＧＤＳのＣｙｓ６５をアラニンに置換した変異体を作成するために、実施例１で得られた発現ベクターを鋳型として目的部位（Ｃｙｓ６５)にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー：
5’-gcgttgtccatgGCCaagtctgtggtggcc-3’ （配列番号５）
5’-ggccaccacagacttGGCcatggacaacgc-3’ （配列番号６）
を作成し、STRATAGENE 社製のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５Ａｌａ発現ベクターを作成した。
さらに、得られた発現ベクターを鋳型として、目的部位（Ｃｙｓ１６７)にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー：
5’-attcaccgccttcGCCaaggcccagggct-3’ （配列番号７）
5’-agccctgggccttGGCgaaggcggtgaat-3’ （配列番号８）
を作成し、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５、１６７Ａｌａ発現ベクターを作成した。
【００２４】
Ｃｙｓ６５および１６７をアラニンに置換した発現ベクターをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度が０．４から０．６ｍＭになるように添加してＧＳＴとＬ−ＰＧＤＳの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに４−６時間培養した。
培養終了後、培養液から大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消化し、Ｌ−ＰＧＤＳフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製しヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７のシステインをアラニンに置換したヒトＰＧＤＳ変異体（Ａｌａ１．３）を得た。
【００２５】
実施例４
ヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインをセリンに置換した変異体（Ｓｅｒ１．３）の製造
Ｃｙｓ６５をセリンに置換した変異体を作成するために、実施例１で得られた発現ベクターを鋳型として目的部位（Ｃｙｓ６５)にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー（Cys-65-Ser用合成オリゴマー）：
5’-gcgttgtccatgTCCaagtctgtggtggcc-3’ （配列番号９）
5’-ggccaccacagacttGGAcatggacaacgc-3’ （配列番号１０）
を作成し、STRATAGENE 社製のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５Ｓｅｒ発現ベクターを作成した。
さらに、得られた発現ベクターを鋳型として、目的部位にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー：
5’-attcaccgccttcTCCaaggcccagggct-3’ （配列番号１１）
5’-agccctgggccttGGAgaaggcggtgaat-3’ （配列番号１２）
を作成し、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５、１６７Ｓｅｒ発現ベクターを作成した。
【００２６】
Ｃｙｓ６５および１６７をセリンに置換した発現ベクターをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度が０．４から０．６ｍＭになるように添加してＧＳＴとＬ−ＰＧＤＳの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに４−６時間培養した。
培養終了後、培養液から大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消化し、Ｌ−ＰＧＤＳフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製し、ヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目をセリンに置換した変異体（Ｓｅｒ１．３）を得た。
【００２７】
実施例５
ヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３．４）の製造
実施例４において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例３と同様にしてヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３．４）を製造した。
【００２８】
実施例６
マウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１）の製造
STRATAGENE 社製のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、実施例２で得られたマウス由来Ｌ−ＰＧＤＳ発現プラスミドを鋳型としてマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１）を次のように製造した。
Ｃｙｓ６５をＡｌａに置換されるようにミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー
5’- gctgtattgtatatgGCAaagacagtggta-3’ （配列番号１３）
5’- taccactgtcttTGCcatatacaatacagc-3’ （配列番号１４）
を合成し、これを用いてＬ−ＰＧＤＳ発現プラスミドを鋳型としてＣｙｓ６５Ａｌａ変異体プラスミドをＰＣＲ増幅して得た。得られた変異体発現プラスミドをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させ、実施例２と同様の方法でマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１）を製造した。
【００２９】
実施例７
マウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３）の製造
実施例６において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例６と同様にしてマウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３）を製造した。
【００３０】
実施例８
アルツハイマー病モデルマウスにおけるアミロイド・プラークへのリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の結合
アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスＴｇ２５７６（Hsiao K et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice.Science. 274:99-102.1996; Hsiao KK et al. Age-related CNS disorder and early death in transgenic FVB/N mice overexpressing Alzheimer amyloid precursor proteins. Neuron.15:1203-18. 1995）を用いて、アミロイド・プラークとＬ−ＰＧＤＳの関連性を免疫組織染色法により解析した（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。Ｌ−ＰＧＤＳが、アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスともにアミロイド・プラーク部位に結合していることを同定した。
【００３１】
実施例９
ヒトアミロイド・ベータ蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳの結合能
表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、ヒトアミロイド・ベータ１−４０蛋白質および１−４２蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳのリコンビナント蛋白質の結合能を解析した（図２参照）。あらかじめ、Ｌ−ＰＧＤＳのリコンビナント蛋白質を固定化したセンサーチップにヒトアミロイド・ベータ１−４０および１−４２蛋白質を結合させたところ、解離定数がそれぞれ８８．４ｎＭ、６５．２ｎＭと強固な結合能を示した。
実施例１０
ヒトアミロイド・ベータ１−４０蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳおよびその変異体、ならびにβラクトグロビリンの凝集抑制作用
ＴｈＴアッセイ（Ban T et al., Direct observation of amyloid fibril growth monitored by thioflavin T fluorescence.J Biol Chem. 278:16462-5. 2003）を用い、Ａβ１−４０蛋白質の凝集に対するヒト髄液より精製したＬ−ＰＧＤＳ（βＴＲＡＣＥ）およびヒトＬ−ＰＧＤＳの変異体（Ａｌａ２．３．４，Ａｌａ１．３，Ａｌａ２．３、Ａｌａ１）およびβラクトグロブリンの影響を解析した（図３Ａ〜Ｃ参照）。
ＴｈＴはクロス・ベータシート構造を特異的に認識する蛍光物質であり、in vitroでアミロイド線維の伸長とともにＴｈＴの蛍光強度が増加することが知られている。そこでリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、Ａβ１−４０（５０μＭ）の混合液を調製し３７度で保温した。なおその際にＬ−ＰＧＤＳの類似物質をそれぞれ濃度調節し混合させる群も設定した。その各５μｌを１ｍｌのＴｈＴ（５μＭ）とグリシン緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．５）に混ぜ、蛍光光度計（励起波長４４６ｎｍ，蛍光波長４９０ｎｍ）にて蛍光強度を経時的に測定した。
Ｌ−ＢＧＤＳ（βＴＲＡＣＥ）およびその変異体、ならびにβラクトグロビリンはともに強い凝集抑制作用を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】免疫組織染色法によるアルツハイマー病患者剖検脳の老人班へのＬ−ＰＧＤＳの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】免疫組織染色法によるアルツハイマー病モデルマウスＴｇ２５７６のアミロイド・プラークに局在しているＬ−ＰＧＤＳを示す顕微鏡写真である。
【図２】表面プラズモン共鳴法によるヒトアミロイド・ベータ１−４０、１−４２蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳの結合能を示すグラフである。
【図３Ａ】ＴｈＴアッセイによるＡβ１−４０蛋白質の凝集に対するＡｌａ２，３，４の抑制効果を示す顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】ＴｈＴアッセイによるＡβ１−４０蛋白質の凝集に対するＡｌａ２．３．４の用量依存性抑制効果を示すグラフである。
【図３Ｃ】ＴｈＴアッセイによるＡβ１−４０蛋白質の凝集に対するＬ−ＰＧＤＳ，Ａｌａ２．３．４，Ａｌａ１．３，Ａｌａ２．３、Ａｌａ１、βラクトグロブリンの抑制効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アルツハイマー病の症状を抑制・改善させる薬剤に関する。さらに詳しくは、この発明はアミロイド蛋白質の凝集を抑制し、アルツハイマー病の症状を抑制・改善させる薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会の到来とともに痴呆患者も増加しており、６５歳以上の約５％が痴呆患者と言われているが、神経変性疾患であるアルツハイマー病は老年期の痴呆のほとんどを占める重要な疾患である。その病態発生の第１段階は脳実質にＡβ蛋白質が・シート構造をとり凝集・沈着することにあると考えられており、ひきつづき老人斑の形成とニューロンの神経原性変化を引き起こす。近年、このＡβ蛋白質の凝集・沈着を阻害するために、Ａβワクチン・抗Ａβ抗体、βシートブレイカーの投与が考えられている（Hock C et al. Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease.
Neuron. 2003 38:547-54., Janus C et al. A beta peptide immunization reduces
behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature.
2000 408:979-82., Soto C et al. Beta-sheet breaker peptides inhibit
fibrillogenesis in a rat brain model of amyloidosis: implications for Alzheimer's therapy. Nat Med. 1998 4:822-6.）。しかし、いずれも非生理的物質であり副作用を合併する恐れがある。
【非特許文献１】Neuron. 2003 38:547-554
【非特許文献２】Nature. 2000 408:979-982
【非特許文献３】Nat Med. 1998 4:822-826
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この発明はアミロイド蛋白質の凝集を抑制し、アルツハイマー病の症状を抑制・改善させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行い、次のような知見を得たことに基づいて本発明を完成させた。
１）アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスにおいてアミロイド・プラークにＬ−ＰＧＤＳが沈着している。
２）ヒトアミロイド蛋白質に対し、リポカリン型プラスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）が強い親和性を示し、さらにチオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイによる凝集試験において強い凝集抑制作用を示す。
３）上記２）の効果はリポカリン型プラスタグランジンＤ合成酵素のみならずその変異体によっても生ずる。その変異体にはプラスタグランジンＤ合成酵素の活性部位のシステイン残基を置換したものも含まれる。
【０００５】
即ち、本発明は、アルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤であって、
１）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）；
２）Ｌ−ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基をアラニンまたはセリンによって置換したＬ−ＰＧＤＳの変異体；
３）β−ラクトグロブリン
４）生体内、特に脳内でのＬ−ＰＧＤＳ蛋白質の発現を増強する物質
よりなる群から選択される化合物を有効成分として含む薬剤
を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の薬剤によればアルツハイマー病の症状の抑制、改善をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第一の態様はＬ−ＰＧＤＳを有効成分とする。Ｌ−ＰＧＤＳは哺乳動物由来のものであり、ヒト由来（配列番号１、その１から２１番目のアミノ酸はシグナルペプチドである）およびマウス由来（配列番号２，その１から２４番目のアミノ酸はシグナルペプチドである）のものが好ましく、ヒト由来のものが特に好ましい。
【０００８】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第二の態様ではＬ−ＰＧＤＳ変異体を有効成分とする。好ましくは本発明におけるＬ−ＰＧＤＳ変異体は、Ｌ−ＰＧＤＳに含まれるシステイン残基の少なくとも１つを他のアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンで置換したものであり、その例は、
１）ヒトＬ−ＰＧＤＳ（配列番号１）の６５と１６７番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ１．３」および「Ｓｅｒ１．３」とそれぞれ略すことがある）；
２）ヒトＬ−ＰＧＤＳ（配列番号１）の８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ２．３．４」および「Ｓｅｒ２．３．４」とそれぞれ略すことがある）；
３）マウスＬ−ＰＧＤＳ（配列番号２）の６５番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ１」および「Ｓｅｒ１」とそれぞれ略すことがある）；
４）マウスＬ−ＰＧＤＳ（配列番号２）の８９と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質（以下、「Ａｌａ２．３」、「Ｓｅｒ２．３」とそれぞれ略すことがある）
である。
【０００９】
哺乳動物由来Ｌ−ＰＧＤＳは哺乳動物の組織から得ることも可能であるが、遺伝子組み換え技術により製造するのが便利である。ヒトまたはマウス由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）のアミノ酸配列は公知である。ヒト由来Ｌ−ＰＧＤＳのアミノ酸配列を配列番号１に示す（配列番号１の１から２１番目のアミノ酸残基はシグナルペプチドである）。マウス由来のＬ−ＰＧＤＳのアミノ酸配列を配列番号２に示す（配列番号１の１から２４番目のアミノ酸残基はシグナルペプチドである）。Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列も知られている。ヒト由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３に示す（配列番号３の１から６３番目のヌクレオチド残基はシグナルペプチドをコードする）。マウス由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４に示す（配列番号４の１から７２番目のヌクレオチド残基はシグナルペプチドをコードでする）。従って、適当な宿主系内で組換えＬ−ＰＧＤＳを発現する発現ベクターを構築することができる。得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体をＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、組換えＬ−ＰＧＤＳを製造することができる。
【００１０】
本発明のＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築することができる。Ｌ−ＰＧＤＳの発現に適したベクターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウイルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因子ＥＦ−１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウイルスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターやベーターガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌、大腸菌での発現に用いることができる。ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ＤＮＡの挿入部位下流には転写終結シグナルがあることが望ましい。
【００１１】
ベクター中にはたとえば薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在することが望ましい。あるいは、Ｌ−ＰＧＤＳをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換してもよい。
【００１２】
発現ベクターを構築するにはＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入する。適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。Ｌ−ＰＧＤＳｃＤＮＡを挿入し、培養細胞に導入してこのｃＤＮＡを発現する目的に用いることができるＤＮＡベクターとして、例えば動物細胞での発現においてはｐＫＣＲ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ等を挙げることができる。
【００１３】
Ｌ−ＰＧＤＳの発現に用い得る細胞は複製可能でＬ−ＰＧＤＳをコードするＤＮＡを発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ．セレビジエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内からＬ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
形質転換した細胞を常法に従い培養することにより所望の蛋白質が得られる。培養に用いる培地は宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大腸菌である場合にはＬＢ培地やＴＢ培地が、宿主が哺乳動物細胞である場合にはＲＰＭＩ１６４０培地等を適宜用いることができる。
この培養により得られる培養物からの本発明に用いる蛋白質の単離および精製は常法により行うことが可能であり、例えば培養物を蛋白質の物理的および化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。具体的には蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを単独で、または組み合わせて用いることができる。得られる蛋白質溶液は必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることができる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニトール，デキストロース，マルトース，グリセロールなどの安定剤を加えることができる。
【００１４】
Ｌ−ＰＧＤＳの変異体を製造するには好ましくは位置指定突然変異導入法を用いる。この方法は周知であり、実施するためのキット（例えば、STRATAGENE社製、QuickChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit）が市販されている。
位置指定突然変異導入法により変異を入れるためには、目的の部位にミスマッチコドンを含む約３０〜４０塩基のプライマー一対を合成し、これらのプライマーを用いて、野生型のプラスミドを鋳型としてＰｆｕポリメラーゼでプラスミド全体をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ終了後、反応液中には鋳型プラスミドと合成された変異体プラスミドが混在するので、ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼ酵素処理を行い、鋳型プラスミドを分解除去して変異体プラスミドを精製する。
【００１５】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第三の態様ではβラクトグロブリンを有効成分とする。βラクトグロブリンは、牛乳中に含まれ、リポカリンファミリーに属する蛋白質である。βラクトグロブリンは、市販されているものを（例えばＳigma社）用いることができる。
【００１６】
本発明のアルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤の第四の態様ではＬ−ＰＧＤＳの発現を増強させる物質を有効成分とする。Ｌ−ＰＧＤＳの発現を増強させる物質としては、エストロジェン(Otsuki M et al. Specific regulation of lipocalin-type prostaglandin D synthase in mouse heart by estrogen receptor beta. Mol Endocrinol. 2003 Sep;17(9):1844-55. Epub 2003 Jun 26.)、グルココルチコイド（Garcia-Fernandez LF et al. Dexamethasone induces lipocalin-type prostaglandin D synthase gene expression in mouse neuronal cells. J Neurochem. 2000 Aug;75(2):460-70.）、インターロイキン−１β(Fujimori K et al. Regulation of lipocalin-type prostaglandin D synthase gene expression by Hes-1 through E-box and interleukin-1 beta via two NF-kappa B elements in rat leptomeningeal cells. J Biol Chem. 2003 Feb 21;278(8):6018-26. Epub 2002 Dec 17.)、サイロイドホルモン(Leone MG et al. Lipocalin type prostaglandin D-synthase: which role in male fertility Contraception. 2002 Apr;65(4):293-5.)がある。これらの物質は生体内、特に脳内でＬ−ＰＧＤＳの発現を増強させることが知られている。
【００１７】
本発明の薬剤の有効成分が蛋白質の場合、当該蛋白質を自体公知の担体と混合希釈して、たとえば液剤などとして製剤化することができる。液剤を調製するには、例えば精製水、生理食塩水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このように調整した液剤は、たとえば乳酸リンゲル液、輸液用電解質液よりなる維持液、術後回復液、脱水補給液、点滴用生理食塩液等に希釈して用いることができる。通常液剤に適宜選択して用いられる添加剤、例えば、ｐＨ調整用の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、等張化剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール，グルコース、塩化ナトリウム等）このような製剤にはさらに薬学上許容しうる塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキシノール、クロルクレゾール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノール等の適当な防腐殺菌剤、タルク等の湿潤剤、モノオレイン酸ポリエチレングリコール等の乳化剤、分散剤、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩等の安定剤のような補助剤を加えても良い。またアラビアゴム、カオリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を懸濁化剤として用いた懸濁剤として投与することも好ましい剤型の１つといえる。
【００１８】
投与経路としては非径口的投与が好ましく、例えば経静脈的投与、経脳脊髄液投与、カテーテルによる経動脈的な局所投与、もしくは外科的な局所投与を含む。本発明の有効成分の投与量は、０．０１〜２０.０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００１９】
本発明の薬剤の有効成分がエストロジェン、グルココルチコイド等の低分子化合物である場合にも医薬的に受容しうる担体と混合して薬剤を製造できる。この担体は投与に対して望ましい製剤の形態に応じて広い範囲の形態をとることができる。投与経路としては非経口的投与、および経口的投与のいずれも使用できる。経口的投与のための散剤、丸薬、カプセルおよび錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マニトール等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステルなどの表面活性剤、グリセリン等の可塑剤を用いて製造できる。本発明の有効成分の投与量は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００２０】
さらに、本発明はＬ−ＰＧＤＳおよび変異体の遺伝子を遺伝子治療に用い、脳内で局所的にＬ−ＰＧＤＳ、または変異体を発現させることで、Ａβ蛋白質の凝集・沈着を抑制し、アルツハイマー病の症状予防・抑制・改善に用いる方法を提供する。
本発明のＬ−ＰＧＤＳまたはその変異体の遺伝子をベクターに組み込み脳内に導入する。遺伝子治療法に用いるベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターを含むあらゆるウイルスベクター、リポソームベクターを含む。さらに詳しくは、ウイルスベクターとはウイルスの殻と遺伝子の一部を用い病原性を司る遺伝子を切り取り、代わりに脳膜もしくはオリゴデンドロサイトで発現するように修飾したL-PGDS遺伝子をはめ込んだものである。リポソームベクターとは、主に人工的な脂質二重膜でできたミクロの球体に、脳膜もしくはオリゴデンドロサイトで発現するように修飾したL-PGDS遺伝子を組み込んだものである（リポフェクション法）。通常ホスファチジルセリンからなるリポソームが用いられる。この陰電荷を有するリン脂質の代わりに、より安定したリポソームを作り易いＤＯＴＭＡ（N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N，N，N−トリメチルアンモニウムクロライド）と呼ばれる陽イオン脂質が市販されるようになった。正に荷電しているリポソームが負に荷電している細胞を表面に吸着し、細胞膜と融合することでＤＮＡを細胞内に導入する。このベクターを、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、髄腔内投与、局所投与にて投与する。
以下に本発明を実施例により更に説明するが、本発明が実施例により限定されるものでないことは明らかである。
【実施例】
【００２１】
実施例１
ヒト由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の製造
Ａｌａ２１からＣ末端までのヒトＬ−ＰＧＤＳ遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅により得、シグナルペプチドを欠損させて配列番号３のＤＮＡ配列の６７番目から３’末端までを発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）に挿入して、その発現ベクターで大腸菌(Escherichia coli) DH5αを形質転換した。ｐＧＥＸ−２Ｔは目的遺伝子をグルタチオン−Ｓ−トタンスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の下流に挿入し、目的蛋白質をＧＳＴ融合蛋白質として発現するための発現ベクターである。続いて、該ベクターをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度が０．４から０．６ｍＭになるように添加してＧＳＴとＬ−ＰＧＤＳの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに４−６時間培養した。
培養終了後、培養液から大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消化し、Ｌ−ＰＧＤＳフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製しヒト由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を得た。
【００２２】
実施例２
マウス由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の製造
実施例１においてヒト由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡを、マウス由来Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡ（配列番号４のＤＮＡ配列の７０番目から３’末端まで）に変えた外は実施例１と同様にしてマウス由来リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を得た。
【００２３】
実施例３
ヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１．３）の製造
ヒトＬ−ＰＧＤＳのＣｙｓ６５をアラニンに置換した変異体を作成するために、実施例１で得られた発現ベクターを鋳型として目的部位（Ｃｙｓ６５)にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー：
5’-gcgttgtccatgGCCaagtctgtggtggcc-3’ （配列番号５）
5’-ggccaccacagacttGGCcatggacaacgc-3’ （配列番号６）
を作成し、STRATAGENE 社製のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５Ａｌａ発現ベクターを作成した。
さらに、得られた発現ベクターを鋳型として、目的部位（Ｃｙｓ１６７)にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー：
5’-attcaccgccttcGCCaaggcccagggct-3’ （配列番号７）
5’-agccctgggccttGGCgaaggcggtgaat-3’ （配列番号８）
を作成し、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５、１６７Ａｌａ発現ベクターを作成した。
【００２４】
Ｃｙｓ６５および１６７をアラニンに置換した発現ベクターをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度が０．４から０．６ｍＭになるように添加してＧＳＴとＬ−ＰＧＤＳの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに４−６時間培養した。
培養終了後、培養液から大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消化し、Ｌ−ＰＧＤＳフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製しヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７のシステインをアラニンに置換したヒトＰＧＤＳ変異体（Ａｌａ１．３）を得た。
【００２５】
実施例４
ヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインをセリンに置換した変異体（Ｓｅｒ１．３）の製造
Ｃｙｓ６５をセリンに置換した変異体を作成するために、実施例１で得られた発現ベクターを鋳型として目的部位（Ｃｙｓ６５)にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー（Cys-65-Ser用合成オリゴマー）：
5’-gcgttgtccatgTCCaagtctgtggtggcc-3’ （配列番号９）
5’-ggccaccacagacttGGAcatggacaacgc-3’ （配列番号１０）
を作成し、STRATAGENE 社製のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５Ｓｅｒ発現ベクターを作成した。
さらに、得られた発現ベクターを鋳型として、目的部位にミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー：
5’-attcaccgccttcTCCaaggcccagggct-3’ （配列番号１１）
5’-agccctgggccttGGAgaaggcggtgaat-3’ （配列番号１２）
を作成し、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、Ｃｙｓ６５、１６７Ｓｅｒ発現ベクターを作成した。
【００２６】
Ｃｙｓ６５および１６７をセリンに置換した発現ベクターをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させた。発現プラスミドで形質転換された該大腸菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）にて３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度が０．４から０．６ｍＭになるように添加してＧＳＴとＬ−ＰＧＤＳの融合蛋白質の発現を誘導し、さらに４−６時間培養した。
培養終了後、培養液から大腸菌を回収して、これから超音波破砕処理によって菌体から蛋白質を抽出した。遠心分離によって、不用物を除去した後、グルタチオンセファロース４Ｂカラムに保持させた。カラムに保持された融合蛋白質をトロンビンで消化し、Ｌ−ＰＧＤＳフラクションを溶出させた。続いて、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製し、ヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目をセリンに置換した変異体（Ｓｅｒ１．３）を得た。
【００２７】
実施例５
ヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３．４）の製造
実施例４において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例３と同様にしてヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３．４）を製造した。
【００２８】
実施例６
マウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１）の製造
STRATAGENE 社製のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、実施例２で得られたマウス由来Ｌ−ＰＧＤＳ発現プラスミドを鋳型としてマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１）を次のように製造した。
Ｃｙｓ６５をＡｌａに置換されるようにミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー
5’- gctgtattgtatatgGCAaagacagtggta-3’ （配列番号１３）
5’- taccactgtcttTGCcatatacaatacagc-3’ （配列番号１４）
を合成し、これを用いてＬ−ＰＧＤＳ発現プラスミドを鋳型としてＣｙｓ６５Ａｌａ変異体プラスミドをＰＣＲ増幅して得た。得られた変異体発現プラスミドをEscherichia coliＢＬ２１株に形質転換させ、実施例２と同様の方法でマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ１）を製造した。
【００２９】
実施例７
マウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３）の製造
実施例６において、合成オリゴマーの設計を変更した以外は実施例６と同様にしてマウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンに置換した変異体（Ａｌａ２．３）を製造した。
【００３０】
実施例８
アルツハイマー病モデルマウスにおけるアミロイド・プラークへのリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の結合
アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスＴｇ２５７６（Hsiao K et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice.Science. 274:99-102.1996; Hsiao KK et al. Age-related CNS disorder and early death in transgenic FVB/N mice overexpressing Alzheimer amyloid precursor proteins. Neuron.15:1203-18. 1995）を用いて、アミロイド・プラークとＬ−ＰＧＤＳの関連性を免疫組織染色法により解析した（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。Ｌ−ＰＧＤＳが、アルツハイマー病患者剖検脳およびアルツハイマー病モデルマウスともにアミロイド・プラーク部位に結合していることを同定した。
【００３１】
実施例９
ヒトアミロイド・ベータ蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳの結合能
表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、ヒトアミロイド・ベータ１−４０蛋白質および１−４２蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳのリコンビナント蛋白質の結合能を解析した（図２参照）。あらかじめ、Ｌ−ＰＧＤＳのリコンビナント蛋白質を固定化したセンサーチップにヒトアミロイド・ベータ１−４０および１−４２蛋白質を結合させたところ、解離定数がそれぞれ８８．４ｎＭ、６５．２ｎＭと強固な結合能を示した。
実施例１０
ヒトアミロイド・ベータ１−４０蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳおよびその変異体、ならびにβラクトグロビリンの凝集抑制作用
ＴｈＴアッセイ（Ban T et al., Direct observation of amyloid fibril growth monitored by thioflavin T fluorescence.J Biol Chem. 278:16462-5. 2003）を用い、Ａβ１−４０蛋白質の凝集に対するヒト髄液より精製したＬ−ＰＧＤＳ（βＴＲＡＣＥ）およびヒトＬ−ＰＧＤＳの変異体（Ａｌａ２．３．４，Ａｌａ１．３，Ａｌａ２．３、Ａｌａ１）およびβラクトグロブリンの影響を解析した（図３Ａ〜Ｃ参照）。
ＴｈＴはクロス・ベータシート構造を特異的に認識する蛍光物質であり、in vitroでアミロイド線維の伸長とともにＴｈＴの蛍光強度が増加することが知られている。そこでリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、Ａβ１−４０（５０μＭ）の混合液を調製し３７度で保温した。なおその際にＬ−ＰＧＤＳの類似物質をそれぞれ濃度調節し混合させる群も設定した。その各５μｌを１ｍｌのＴｈＴ（５μＭ）とグリシン緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．５）に混ぜ、蛍光光度計（励起波長４４６ｎｍ，蛍光波長４９０ｎｍ）にて蛍光強度を経時的に測定した。
Ｌ−ＢＧＤＳ（βＴＲＡＣＥ）およびその変異体、ならびにβラクトグロビリンはともに強い凝集抑制作用を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】免疫組織染色法によるアルツハイマー病患者剖検脳の老人班へのＬ−ＰＧＤＳの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】免疫組織染色法によるアルツハイマー病モデルマウスＴｇ２５７６のアミロイド・プラークに局在しているＬ−ＰＧＤＳを示す顕微鏡写真である。
【図２】表面プラズモン共鳴法によるヒトアミロイド・ベータ１−４０、１−４２蛋白質に対するＬ−ＰＧＤＳの結合能を示すグラフである。
【図３Ａ】ＴｈＴアッセイによるＡβ１−４０蛋白質の凝集に対するＡｌａ２，３，４の抑制効果を示す顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】ＴｈＴアッセイによるＡβ１−４０蛋白質の凝集に対するＡｌａ２．３．４の用量依存性抑制効果を示すグラフである。
【図３Ｃ】ＴｈＴアッセイによるＡβ１−４０蛋白質の凝集に対するＬ−ＰＧＤＳ，Ａｌａ２．３．４，Ａｌａ１．３，Ａｌａ２．３、Ａｌａ１、βラクトグロブリンの抑制効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤であって、
１）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）；
２）Ｌ−ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基をアラニンまたはセリンによって置換したＬ−ＰＧＤＳの変異体；
３）β−ラクトグロブリン；および
４）エストロジェン、グルココルチコイド、インターロイキン−１β、サイロイドホルモンよりなる群から選択される、Ｌ−ＰＧＤＳ蛋白質の発現を増強する物質；
よりなる群から選択されるポリペプチドを有効成分として含む薬剤。
【請求項２】
リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）がヒト由来（配列番号１）またはマウス由来（配列番号２）である請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
Ｌ−ＰＧＤＳの変異体が、
（１）配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；
（２）配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；
（３）配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；および
（４）配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；
よりなる群から選択される請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
アルツハイマー病の症状の抑制・改善に対する遺伝子治療法に用いる、請求項１〜３に記載のＬ−ＰＧＤＳおよびその変異体をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインを、アラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項６】
配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項７】
配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項８】
配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項１】
アルツハイマー病の症状の抑制・改善に用いる薬剤であって、
１）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）；
２）Ｌ−ＰＧＤＳの少なくとも１つのシステイン残基をアラニンまたはセリンによって置換したＬ−ＰＧＤＳの変異体；
３）β−ラクトグロブリン；および
４）エストロジェン、グルココルチコイド、インターロイキン−１β、サイロイドホルモンよりなる群から選択される、Ｌ−ＰＧＤＳ蛋白質の発現を増強する物質；
よりなる群から選択されるポリペプチドを有効成分として含む薬剤。
【請求項２】
リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）がヒト由来（配列番号１）またはマウス由来（配列番号２）である請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
Ｌ−ＰＧＤＳの変異体が、
（１）配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；
（２）配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；
（３）配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；および
（４）配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質；
よりなる群から選択される請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
アルツハイマー病の症状の抑制・改善に対する遺伝子治療法に用いる、請求項１〜３に記載のＬ−ＰＧＤＳおよびその変異体をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの６５と１６７番目のシステインを、アラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項６】
配列番号１のヒトＬ−ＰＧＤＳの８９，１６７と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項７】
配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの６５番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【請求項８】
配列番号２のマウスＬ−ＰＧＤＳの８９と１８６番目のシステインをアラニンあるいはセリンに置換した蛋白質。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【公開番号】特開２００７−２８４３５１（Ｐ２００７−２８４３５１Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１８９５２（Ｐ２００４−２１８９５２）
【出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【出願人】（３９００００７４５）財団法人大阪バイオサイエンス研究所 (32)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（８９９００００４６）関西ティー・エル・オー株式会社 (75)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【出願人】（３９００００７４５）財団法人大阪バイオサイエンス研究所 (32)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（８９９００００４６）関西ティー・エル・オー株式会社 (75)
【Ｆターム（参考）】
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