アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法
【課題】食品や環境検体などにおいてアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを選択的、迅速かつ簡便に検出する方法を提供する。
【解決手段】ＬＡＭＰ法によりアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出するためのＬＡＭＰプライマーセットであって、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン−ホペン環化酵素（ＳＨＣ）遺伝子の特定領域にアニーリング可能な少なくとも４種のＬＡＭＰプライマーのセットおよびこれらのＬＡＭＰプライマーセットを用いてアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出するための方法。
【解決手段】ＬＡＭＰ法によりアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出するためのＬＡＭＰプライマーセットであって、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン−ホペン環化酵素（ＳＨＣ）遺伝子の特定領域にアニーリング可能な少なくとも４種のＬＡＭＰプライマーのセットおよびこれらのＬＡＭＰプライマーセットを用いてアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius、以下、A. acidocaldariusと記載する）を選択的、迅速かつ簡便に検出する方法に関する。より具体的には、本発明はＬＡＭＰ(loop-mediated isothermal amplification)法によりA. acidocaldariusのスクアレン−ホペン環化酵素（squalene-hopene cyclase）遺伝子（以下、ＳＨＣ遺伝子と記載する）の増幅を検出することを含む、A. acidocaldariusの検出のための方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性好酸性菌（アリサイクロバチルス属細菌；Alicyclobacillus属細菌）は土壌や温泉などから分離され、好気的に高温・酸性下で増殖する芽胞形成細菌である。土壌などに存在する耐熱性好酸性菌芽胞が果汁に混入した場合、製品中で発芽・増殖し、変敗事故を引き起こす可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。そのなかでも異臭物質グアイアコールを生成するアリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris、以下、A. acidoterrestrisと記載する）が汚染事故の原因菌として注目されている。
【０００３】
しかし、土壌や食品からの検出頻度はA. acidocaldariusが最も高く、環境に広く存在することが知られ（非特許文献３）、A. acidocaldariusを選択的、迅速かつ簡便に検出することは原料・製品の品質向上に役立つ。
【０００４】
耐熱性好酸性菌の検出・種の同定は増菌や分離培養を経て、温度差法やペルオキシダーゼ法により行う（非特許文献４）。これらの手法は結果を得るまでに時間を要することから、遺伝子解析手法を用いた方法が注目されている。例えば、一般に細菌の分類・同定に用いる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較による方法（特許文献１；非特許文献５）、近年細菌の分類・同定に注目されているｇｙｒＢ（ＤＮＡジャイレースＢサブユニット）遺伝子の特異的な領域によるＰＣＲ法（特許文献２）、あるいは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子による耐熱性好酸性菌の特異的な領域によるreal-time ＰＣＲ法（非特許文献６）、ＳＨＣ遺伝子のA. acidocaldariusとA. acidoterrestrisに特異的な領域によるreal-time ＰＣＲ法（非特許文献７）などである。
【０００５】
しかし、シーケンス解析、ＰＣＲおよびreal-time ＰＣＲ法による細菌の検出法は反応を行うために特別かつ高価な機器を必要とする。
【０００６】
近年、新しい遺伝子増幅法の一つとしてＬＡＭＰ反応が栄研化学社（栃木）によって開発された。ＬＡＭＰ法は等温核酸増幅法であり、高い特異性および増幅効率を有し、反応から検出まで１時間程度で行うことができる(特許文献３；非特許文献８)。
【０００７】
ＬＡＭＰ法によるA. acidocaldariusの検出法はｇｙｒＢ遺伝子について報告がある（非特許文献９）。しかし、一般に細菌の分類・同定に用いる遺伝子ではなく、細菌の生体内機能に関与する遺伝子の方がその細菌種に有意な特徴を有する場合があるため、本発明者は今回、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子に着目した。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１３７２５９号
【特許文献２】特開２００６−２２３１６０号
【特許文献３】特開２００２−３３０７９６号
【非特許文献１】G．Cerny et al.，Z．Lebensm．Unters．Forsch.，179(3)，224-227，1984
【非特許文献２】M．Niwa et al.，果汁協会報，9，31-42，1991
【非特許文献３】ILSI Japan 食品安全研究部会微生物分科会，好熱性好酸性菌 −Alicyclobacillus属細菌−，93-94，2004
【非特許文献４】社団法人日本果汁協会，果汁協会報，3，4-12，2003
【非特許文献５】K．Goto et al.，J. Gen. Appl. Microbiol., 48，243-250，2002
【非特許文献６】CJ．Connor et al.，Int．J．Food．Microbiol.，99(3)，229-235，2005
【非特許文献７】H．Luo et al.，Lett．Appl．Microbiol., 39(4)，376-382，2004
【非特許文献８】T．Notomi et al., Nucleic Acids Research, 28(12), e63，2000
【非特許文献９】A．Nishibori et al., Jpn. J. Food. Microbiol., 24(1), 34-38, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＬＡＭＰ法によってA. acidocaldariusを特異的に検出可能であるプライマーセットを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、上記プライマーセットを用いてA. acidocaldariusを特異的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＬＡＭＰ法により増幅することにより、A. acidocaldariusを検体中から特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、A. acidocaldarius検出用ＬＡＭＰプライマーセットであって、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示されるそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰからなる４種のプライマーを含むセットを提供する。
【００１３】
その実施形態において、上記プライマーセットは、配列番号１〜４の４種のプライマーに加えて、配列番号５に示される塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｂのプライマーをさらに含むことができる。
【００１４】
本発明は、第２の態様において、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の増幅をＬＡＭＰ法によって検出することを含む、A. acidocaldariusの検出方法を提供する。
【００１５】
その実施形態において、ＬＡＭＰ法が、(i)上記の配列番号１〜４の４種のプライマーを含むＬＡＭＰプライマーセット、または(ii)配列番号１〜４の４種のプライマーに加えて、配列番号５のプライマーをさらに含むＬＡＭＰプライマーセットを用いて行われる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のA. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子増幅用プライマーセットはいずれも、ＬＡＭＰ法によりA. acidocaldariusを特異的に検出可能である（後述の表１）。種々の細菌株について試験した結果、本発明のプライマーセットによってそのすべてのA. acidocaldarius株が陽性に検出された。一方、他のAlicyclobacillus属細菌種および他の属の細菌に対してはいずれも陰性の結果が得られた。
【００１７】
本発明により、A. acidocaldariusを特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の塩基配列を他のAlicyclobacillus属細菌と比較し、A. acidocaldariusに特異的な配列を特定し、本発明のＬＡＭＰプライマーを設計した。この細菌のＳＨＣ遺伝子の塩基配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）から入手可能であり、Ｍ７３８３４の登録番号を有している。
【００１９】
A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な領域として決定された塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜４、５に示される塩基配列である。
【００２０】
これらの配列のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を実施するときには、 A. acidocaldariusを他のAlicyclobacillus属細菌種または他の属の細菌から区別して（すなわち特異的に）検出することができる。
【００２１】
したがって、本発明のA. acidocaldarius検出用ＬＡＭＰプライマーセットは、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー４種類（Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰ）を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するために１種類（Ｌｏｏｐ−Ｂ）のプライマーを追加した、合計５種類のプライマーで１セットとしてもよい。
【００２２】
ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６つの領域に対して４つのプライマー（一般にＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３およびＢ３と称する）を設定し、鎖置換反応を利用して等温で核酸を増幅させることが可能な手法である(特開２００２−３３０７９６号；T. Notomi et al., Nucleic Acids Research，28(12)，e63，2000)。この手法について以下に説明する。
【００２３】
まず、標的遺伝子について、３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、標的遺伝子の５’末端側に向かってＢ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を設計する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２４】
ＦＩＰは、標的遺伝子のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２５】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２６】
ＢＩＰは、標的遺伝子のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２７】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２８】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的ＤＮＡに制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２９】
また、Ｌｏｏｐ−Ｂプライマーを使用するときには、これらのプライマーが核酸増幅過程で利用されていないループ部分に結合することにより全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸の増幅反応が加速される（特開２００２−３４５４９９号）。
【００３０】
ＬＡＭＰ反応は、サンプル遺伝子、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を一緒に一定温度（約６０〜６５℃）で保温することにより、検出まで１ステップの工程で行うことができる。
【００３１】
この反応では鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が使用されるが、この酵素は、ＰＣＲ法における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと異なり安価であるうえに、鋳型ＤＮＡの二本鎖をほどきながらＤＮＡ合成を行うことができる。酵素の例は、BstＤＮＡポリメラーゼ、Bca(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ、Vent(Exo-)ＤＮＡポリメラーゼなどである。このため、ＬＡＭＰ法では、ＰＣＲ法のようにあらかじめ二本鎖ＤＮＡを一本鎖に熱変性する必要がない。
【００３２】
ＬＡＭＰ反応試薬は、栄研化学社から市販のＬｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（但し、プライマーセットを除く）を利用すると便利である。具体的には、反応液の例は次のとおりである。２倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betain、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP；ＤＮＡポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl；本発明の各プライマーの終濃度、ＦＩＰおよびＢＩＰ：40μM、Ｆ３およびＢ３：5μM、Loop-B：20μM。
【００３３】
ＬＡＭＰ反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を4.5μl、２倍濃度反応用緩衝液を12.5μl、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、Ｌｏｏｐ−Ｂの各プライマーを1μl加え、ＤＮＡポリメラーゼ1μl、検体液（鋳型ＤＮＡ）2μlを加え、全量25μlの反応液を調製する。
【００３４】
反応は、次のような工程を経て行われる。
(i) 鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
【００３５】
(ii) ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
【００３６】
(iii)Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
(iv) ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
【００３７】
(v) 上記(iv)の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡ合成が行われる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
(vi) 上記(v)の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
【００３８】
(vii)上記(v)の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニーリングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００３９】
本発明の各プライマーセットは、約６０〜６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニーリング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることが可能である。
【００４０】
A. acidocaldariusの特定のＤＮＡ領域が増幅されると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる、あるいは濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定することもできる。また、必要に応じて、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出することもできる。
【００４１】
核酸増幅によるA. acidocaldariusの同定のための検体としては、食品検体、例えば果実飲料、酸性飲料、野菜加工食品など、また環境検体、例えば土壌、水などでもよい。
【００４２】
これら検体をＬＡＭＰ法の試料として用いる場合には、検体中に存在する菌の濃縮、分離、菌体からの核酸分離や、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うこともできる。菌の濃縮、分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが知られており、適宜選択できる。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の遊離には、例えばLysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法もある。また、特に食品検体によってはさらなる精製の必要があれば、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい(J. Appl. Bacteriol.，70, 121-126，1991；J. Clin. Pathol., 49,861-863，1996)。
【００４３】
例えば食品中に存在すると考えられるA. acidocaldariusをＹＳＧ液体培地（酵母エキス0.2％、グルコース0.1％、可溶性デンプン0.2％、pH3.7±0.1）で増菌培養し、ＹＳＧ寒天培地（ＹＳＧ液体培地に寒天1.5％添加）上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して上記プライマーを用いたＬＡＭＰ反応を行い、A. acidocaldariusの特定遺伝子領域を増幅する。
【００４４】
増幅反応により副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響により反応液は、上述のとおり、白濁するので、反応液の濁度を目視または濁度測定装置などを用いた光学的手法により核酸増幅の有無を簡単に確認できる。もしＳＨＣ遺伝子の特定領域の核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、結果としてA. acidocaldarius陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、結果としてA. acidocaldarius陰性（−）を表す。
【００４５】
上で説明したように、本発明により、ＳＨＣ遺伝子に由来する特定遺伝子領域、すなわち配列番号６の塩基配列中、配列番号約１０２０〜約１３２０の領域内、好ましくは約１０６２〜約１２９８の領域内を増幅する配列番号１〜４、および適宜追加して実施可能な配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーセットをＬＡＭＰプライマーセットとして用いることによって、A. acidocaldariusを特異的に検出することができる。ここで、「特異的に」とは、検出反応が他のAlicyclobacillus属細菌種および他の属の細菌に対して陰性であることを意味する。
【００４６】
本発明のＬＡＭＰ法によるA. acidocaldariusの検出法は、食品や環境などの検査対象物から分離されたAlicyclobacillus属細菌の種を迅速に判別することができる検査法として用いることができる。
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
１．ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応に用いる各試薬の濃度の内容は次のとおりであるが、ＬＡＭＰ反応試薬は栄研化学社製のＬｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キットを用いた。２倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betain。各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP。ＤＮＡポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl。本発明の各プライマーの終濃度、ＦＩＰ、ＢＩＰ：各40μM、Ｆ３、Ｂ３：各5μM、Ｌｏｏｐ−Ｂ：20μM。(栄研化学社、ＤＮＡ増幅試薬キット添付説明書参照)
【００４９】
ＬＡＭＰ反応液は、滅菌蒸留水を4.5μl、２倍濃度反応用緩衝液を12.5μl、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、Ｌｏｏｐ−Ｂの各プライマーを1μl加え、ＤＮＡポリメラーゼ1μl、上記より得られた検体液（鋳型ＤＮＡ）2μlを加え、全量25μlの反応液を調製した。
【００５０】
ＬＡＭＰ反応は、テラメックス社製の濁度測定装置ＬＡ−２００Ｆを用い、６５℃の等温反応を６０分間行い、その後８０℃、２分間の酵素失活処理を行った。濁度測定装置は、ＬＡＭＰ反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を経時的に観察することが可能で、濁度が上昇するものをA. acidocaldarius陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００５１】
２．プライマーの設計
A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子と他のAlicyclobacillus属細菌の塩基配列とを比較し、A. acidocaldariusに特異的なＬＡＭＰプライマーを設計した。配列番号６に示すA. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の塩基配列のうち、塩基番号１０６２〜１２９８で表される塩基配列の領域をＬＡＭＰプライマーの設計に用いた。
【００５２】
３．結果
配列番号１〜４(それぞれＦ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰ）および追加可能な配列番号５（Ｌｏｏｐ−Ｂ）によるプライマーセットは、ＳＨＣ遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表１に示したA. acidocaldarius ７株、およびその他のAlicyclobacillus属細菌を用いてＬＡＭＰ反応を行った結果、A. acidocaldariusのみに、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。また、その他細菌でも交差性は見られなかった。結果を表１に示した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１に示されるように、本発明においてＳＨＣ遺伝子増幅用プライマーセットを使用してＬＡＭＰ法を実施することにより、A. acidocaldariusを特異的に検出することが可能であり、また１時間以内に増幅反応を確認することができた。
【００５５】
このことから、ＳＨＣ遺伝子増幅用プライマーセットは、A. acidocaldariusを特異的に検出するためのプライマーとして有効であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のＬＡＭＰ法によるA. acidocaldariusの検出法は、食品や環境検体などの検査対象物に存在するA. acidocaldariusの有無を迅速にかつ特異的に判別することができる検査法として用いることができるため、果実飲料、酸性飲料、野菜加工食品などでのA. acidocaldariusの汚染の検出に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius、以下、A. acidocaldariusと記載する）を選択的、迅速かつ簡便に検出する方法に関する。より具体的には、本発明はＬＡＭＰ(loop-mediated isothermal amplification)法によりA. acidocaldariusのスクアレン−ホペン環化酵素（squalene-hopene cyclase）遺伝子（以下、ＳＨＣ遺伝子と記載する）の増幅を検出することを含む、A. acidocaldariusの検出のための方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性好酸性菌（アリサイクロバチルス属細菌；Alicyclobacillus属細菌）は土壌や温泉などから分離され、好気的に高温・酸性下で増殖する芽胞形成細菌である。土壌などに存在する耐熱性好酸性菌芽胞が果汁に混入した場合、製品中で発芽・増殖し、変敗事故を引き起こす可能性がある（非特許文献１；非特許文献２）。そのなかでも異臭物質グアイアコールを生成するアリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris、以下、A. acidoterrestrisと記載する）が汚染事故の原因菌として注目されている。
【０００３】
しかし、土壌や食品からの検出頻度はA. acidocaldariusが最も高く、環境に広く存在することが知られ（非特許文献３）、A. acidocaldariusを選択的、迅速かつ簡便に検出することは原料・製品の品質向上に役立つ。
【０００４】
耐熱性好酸性菌の検出・種の同定は増菌や分離培養を経て、温度差法やペルオキシダーゼ法により行う（非特許文献４）。これらの手法は結果を得るまでに時間を要することから、遺伝子解析手法を用いた方法が注目されている。例えば、一般に細菌の分類・同定に用いる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列比較による方法（特許文献１；非特許文献５）、近年細菌の分類・同定に注目されているｇｙｒＢ（ＤＮＡジャイレースＢサブユニット）遺伝子の特異的な領域によるＰＣＲ法（特許文献２）、あるいは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子による耐熱性好酸性菌の特異的な領域によるreal-time ＰＣＲ法（非特許文献６）、ＳＨＣ遺伝子のA. acidocaldariusとA. acidoterrestrisに特異的な領域によるreal-time ＰＣＲ法（非特許文献７）などである。
【０００５】
しかし、シーケンス解析、ＰＣＲおよびreal-time ＰＣＲ法による細菌の検出法は反応を行うために特別かつ高価な機器を必要とする。
【０００６】
近年、新しい遺伝子増幅法の一つとしてＬＡＭＰ反応が栄研化学社（栃木）によって開発された。ＬＡＭＰ法は等温核酸増幅法であり、高い特異性および増幅効率を有し、反応から検出まで１時間程度で行うことができる(特許文献３；非特許文献８)。
【０００７】
ＬＡＭＰ法によるA. acidocaldariusの検出法はｇｙｒＢ遺伝子について報告がある（非特許文献９）。しかし、一般に細菌の分類・同定に用いる遺伝子ではなく、細菌の生体内機能に関与する遺伝子の方がその細菌種に有意な特徴を有する場合があるため、本発明者は今回、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子に着目した。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１３７２５９号
【特許文献２】特開２００６−２２３１６０号
【特許文献３】特開２００２−３３０７９６号
【非特許文献１】G．Cerny et al.，Z．Lebensm．Unters．Forsch.，179(3)，224-227，1984
【非特許文献２】M．Niwa et al.，果汁協会報，9，31-42，1991
【非特許文献３】ILSI Japan 食品安全研究部会微生物分科会，好熱性好酸性菌 −Alicyclobacillus属細菌−，93-94，2004
【非特許文献４】社団法人日本果汁協会，果汁協会報，3，4-12，2003
【非特許文献５】K．Goto et al.，J. Gen. Appl. Microbiol., 48，243-250，2002
【非特許文献６】CJ．Connor et al.，Int．J．Food．Microbiol.，99(3)，229-235，2005
【非特許文献７】H．Luo et al.，Lett．Appl．Microbiol., 39(4)，376-382，2004
【非特許文献８】T．Notomi et al., Nucleic Acids Research, 28(12), e63，2000
【非特許文献９】A．Nishibori et al., Jpn. J. Food. Microbiol., 24(1), 34-38, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＬＡＭＰ法によってA. acidocaldariusを特異的に検出可能であるプライマーセットを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、上記プライマーセットを用いてA. acidocaldariusを特異的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＬＡＭＰ法により増幅することにより、A. acidocaldariusを検体中から特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、A. acidocaldarius検出用ＬＡＭＰプライマーセットであって、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示されるそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰからなる４種のプライマーを含むセットを提供する。
【００１３】
その実施形態において、上記プライマーセットは、配列番号１〜４の４種のプライマーに加えて、配列番号５に示される塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｂのプライマーをさらに含むことができる。
【００１４】
本発明は、第２の態様において、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の増幅をＬＡＭＰ法によって検出することを含む、A. acidocaldariusの検出方法を提供する。
【００１５】
その実施形態において、ＬＡＭＰ法が、(i)上記の配列番号１〜４の４種のプライマーを含むＬＡＭＰプライマーセット、または(ii)配列番号１〜４の４種のプライマーに加えて、配列番号５のプライマーをさらに含むＬＡＭＰプライマーセットを用いて行われる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のA. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子増幅用プライマーセットはいずれも、ＬＡＭＰ法によりA. acidocaldariusを特異的に検出可能である（後述の表１）。種々の細菌株について試験した結果、本発明のプライマーセットによってそのすべてのA. acidocaldarius株が陽性に検出された。一方、他のAlicyclobacillus属細菌種および他の属の細菌に対してはいずれも陰性の結果が得られた。
【００１７】
本発明により、A. acidocaldariusを特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の塩基配列を他のAlicyclobacillus属細菌と比較し、A. acidocaldariusに特異的な配列を特定し、本発明のＬＡＭＰプライマーを設計した。この細菌のＳＨＣ遺伝子の塩基配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）から入手可能であり、Ｍ７３８３４の登録番号を有している。
【００１９】
A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な領域として決定された塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜４、５に示される塩基配列である。
【００２０】
これらの配列のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を実施するときには、 A. acidocaldariusを他のAlicyclobacillus属細菌種または他の属の細菌から区別して（すなわち特異的に）検出することができる。
【００２１】
したがって、本発明のA. acidocaldarius検出用ＬＡＭＰプライマーセットは、A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子上の他の細菌とは異なる塩基配列が存在している領域を利用し、これを標的としたプライマー４種類（Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰ）を用いるプライマーセットである。また、核酸の増幅反応を加速するために１種類（Ｌｏｏｐ−Ｂ）のプライマーを追加した、合計５種類のプライマーで１セットとしてもよい。
【００２２】
ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６つの領域に対して４つのプライマー（一般にＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３およびＢ３と称する）を設定し、鎖置換反応を利用して等温で核酸を増幅させることが可能な手法である(特開２００２−３３０７９６号；T. Notomi et al., Nucleic Acids Research，28(12)，e63，2000)。この手法について以下に説明する。
【００２３】
まず、標的遺伝子について、３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、標的遺伝子の５’末端側に向かってＢ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を設計する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２４】
ＦＩＰは、標的遺伝子のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２５】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２６】
ＢＩＰは、標的遺伝子のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２７】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように設計されたプライマーである。
【００２８】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的ＤＮＡに制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２９】
また、Ｌｏｏｐ−Ｂプライマーを使用するときには、これらのプライマーが核酸増幅過程で利用されていないループ部分に結合することにより全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸の増幅反応が加速される（特開２００２−３４５４９９号）。
【００３０】
ＬＡＭＰ反応は、サンプル遺伝子、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を一緒に一定温度（約６０〜６５℃）で保温することにより、検出まで１ステップの工程で行うことができる。
【００３１】
この反応では鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が使用されるが、この酵素は、ＰＣＲ法における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと異なり安価であるうえに、鋳型ＤＮＡの二本鎖をほどきながらＤＮＡ合成を行うことができる。酵素の例は、BstＤＮＡポリメラーゼ、Bca(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ、Vent(Exo-)ＤＮＡポリメラーゼなどである。このため、ＬＡＭＰ法では、ＰＣＲ法のようにあらかじめ二本鎖ＤＮＡを一本鎖に熱変性する必要がない。
【００３２】
ＬＡＭＰ反応試薬は、栄研化学社から市販のＬｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（但し、プライマーセットを除く）を利用すると便利である。具体的には、反応液の例は次のとおりである。２倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betain、各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP；ＤＮＡポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl；本発明の各プライマーの終濃度、ＦＩＰおよびＢＩＰ：40μM、Ｆ３およびＢ３：5μM、Loop-B：20μM。
【００３３】
ＬＡＭＰ反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を4.5μl、２倍濃度反応用緩衝液を12.5μl、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、Ｌｏｏｐ−Ｂの各プライマーを1μl加え、ＤＮＡポリメラーゼ1μl、検体液（鋳型ＤＮＡ）2μlを加え、全量25μlの反応液を調製する。
【００３４】
反応は、次のような工程を経て行われる。
(i) 鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
【００３５】
(ii) ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
【００３６】
(iii)Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
(iv) ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
【００３７】
(v) 上記(iv)の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡ合成が行われる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
(vi) 上記(v)の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
【００３８】
(vii)上記(v)の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニーリングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００３９】
本発明の各プライマーセットは、約６０〜６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニーリング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることが可能である。
【００４０】
A. acidocaldariusの特定のＤＮＡ領域が増幅されると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる、あるいは濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定することもできる。また、必要に応じて、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出することもできる。
【００４１】
核酸増幅によるA. acidocaldariusの同定のための検体としては、食品検体、例えば果実飲料、酸性飲料、野菜加工食品など、また環境検体、例えば土壌、水などでもよい。
【００４２】
これら検体をＬＡＭＰ法の試料として用いる場合には、検体中に存在する菌の濃縮、分離、菌体からの核酸分離や、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うこともできる。菌の濃縮、分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが知られており、適宜選択できる。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の遊離には、例えばLysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法もある。また、特に食品検体によってはさらなる精製の必要があれば、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい(J. Appl. Bacteriol.，70, 121-126，1991；J. Clin. Pathol., 49,861-863，1996)。
【００４３】
例えば食品中に存在すると考えられるA. acidocaldariusをＹＳＧ液体培地（酵母エキス0.2％、グルコース0.1％、可溶性デンプン0.2％、pH3.7±0.1）で増菌培養し、ＹＳＧ寒天培地（ＹＳＧ液体培地に寒天1.5％添加）上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して上記プライマーを用いたＬＡＭＰ反応を行い、A. acidocaldariusの特定遺伝子領域を増幅する。
【００４４】
増幅反応により副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響により反応液は、上述のとおり、白濁するので、反応液の濁度を目視または濁度測定装置などを用いた光学的手法により核酸増幅の有無を簡単に確認できる。もしＳＨＣ遺伝子の特定領域の核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、結果としてA. acidocaldarius陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、結果としてA. acidocaldarius陰性（−）を表す。
【００４５】
上で説明したように、本発明により、ＳＨＣ遺伝子に由来する特定遺伝子領域、すなわち配列番号６の塩基配列中、配列番号約１０２０〜約１３２０の領域内、好ましくは約１０６２〜約１２９８の領域内を増幅する配列番号１〜４、および適宜追加して実施可能な配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーセットをＬＡＭＰプライマーセットとして用いることによって、A. acidocaldariusを特異的に検出することができる。ここで、「特異的に」とは、検出反応が他のAlicyclobacillus属細菌種および他の属の細菌に対して陰性であることを意味する。
【００４６】
本発明のＬＡＭＰ法によるA. acidocaldariusの検出法は、食品や環境などの検査対象物から分離されたAlicyclobacillus属細菌の種を迅速に判別することができる検査法として用いることができる。
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
１．ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応に用いる各試薬の濃度の内容は次のとおりであるが、ＬＡＭＰ反応試薬は栄研化学社製のＬｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キットを用いた。２倍濃度反応用緩衝液：40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betain。各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP。ＤＮＡポリメラーゼ：Bst DNA Polymerase 8units/μl。本発明の各プライマーの終濃度、ＦＩＰ、ＢＩＰ：各40μM、Ｆ３、Ｂ３：各5μM、Ｌｏｏｐ−Ｂ：20μM。(栄研化学社、ＤＮＡ増幅試薬キット添付説明書参照)
【００４９】
ＬＡＭＰ反応液は、滅菌蒸留水を4.5μl、２倍濃度反応用緩衝液を12.5μl、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、Ｌｏｏｐ−Ｂの各プライマーを1μl加え、ＤＮＡポリメラーゼ1μl、上記より得られた検体液（鋳型ＤＮＡ）2μlを加え、全量25μlの反応液を調製した。
【００５０】
ＬＡＭＰ反応は、テラメックス社製の濁度測定装置ＬＡ−２００Ｆを用い、６５℃の等温反応を６０分間行い、その後８０℃、２分間の酵素失活処理を行った。濁度測定装置は、ＬＡＭＰ反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を経時的に観察することが可能で、濁度が上昇するものをA. acidocaldarius陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００５１】
２．プライマーの設計
A. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子と他のAlicyclobacillus属細菌の塩基配列とを比較し、A. acidocaldariusに特異的なＬＡＭＰプライマーを設計した。配列番号６に示すA. acidocaldariusのＳＨＣ遺伝子の塩基配列のうち、塩基番号１０６２〜１２９８で表される塩基配列の領域をＬＡＭＰプライマーの設計に用いた。
【００５２】
３．結果
配列番号１〜４(それぞれＦ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰ）および追加可能な配列番号５（Ｌｏｏｐ−Ｂ）によるプライマーセットは、ＳＨＣ遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。実際に表１に示したA. acidocaldarius ７株、およびその他のAlicyclobacillus属細菌を用いてＬＡＭＰ反応を行った結果、A. acidocaldariusのみに、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察された。また、その他細菌でも交差性は見られなかった。結果を表１に示した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１に示されるように、本発明においてＳＨＣ遺伝子増幅用プライマーセットを使用してＬＡＭＰ法を実施することにより、A. acidocaldariusを特異的に検出することが可能であり、また１時間以内に増幅反応を確認することができた。
【００５５】
このことから、ＳＨＣ遺伝子増幅用プライマーセットは、A. acidocaldariusを特異的に検出するためのプライマーとして有効であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のＬＡＭＰ法によるA. acidocaldariusの検出法は、食品や環境検体などの検査対象物に存在するA. acidocaldariusの有無を迅速にかつ特異的に判別することができる検査法として用いることができるため、果実飲料、酸性飲料、野菜加工食品などでのA. acidocaldariusの汚染の検出に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス検出用ＬＡＭＰプライマーセットであって、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン−ホペン環化酵素(ＳＨＣ)遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示されるそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰからなる４種のプライマーを含むセット。
【請求項２】
配列番号５に示される塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｂのプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのＳＨＣ遺伝子の増幅をＬＡＭＰ法によって検出することを含む、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス の検出方法。
【請求項４】
ＬＡＭＰ法が請求項１または２に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス検出用ＬＡＭＰプライマーセットであって、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン−ホペン環化酵素(ＳＨＣ)遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列番号１〜４に示されるそれぞれ塩基配列Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰからなる４種のプライマーを含むセット。
【請求項２】
配列番号５に示される塩基配列Ｌｏｏｐ−Ｂのプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項３】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのＳＨＣ遺伝子の増幅をＬＡＭＰ法によって検出することを含む、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス の検出方法。
【請求項４】
ＬＡＭＰ法が請求項１または２に記載のＬＡＭＰプライマーセットを用いて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【公開番号】特開２００９−２２１６８（Ｐ２００９−２２１６８Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８５６７６（Ｐ２００７−１８５６７６）
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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