アレルギー性疾患予防・治療剤
【課題】IL-4及び／又はIL-5産生を抑制し、アレルギー性疾患の予防・治療に有効であり、かつ日常的に使用できる安全な医薬、飲食品、化粧品の提供。
【解決手段】ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤。
【解決手段】ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、IgEの関与する即時型アレルギーとT細胞の反応による遅延型アレルギーとが複雑に影響して引き起こされる。この内、IgEの産生はIL-4（インターロイキン−４）産生により引き起こされ、IL-4産生はIFN-γの減少やIL-5（インターロイキン−５）産生により増強される。IL-4およびIL-5は抗原特異的なタイプ2のヘルパーT細胞（Th2細胞）から産生されることが知られており、IL-4およびIL-5産生を抑制し、かつ人体にとって安全である物質は、各種アレルギー性疾患（気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、薬物アレルギー、好酸球性肺炎等の好酸球増多症）の予防や治療に有効であると考えられる。
【０００３】
ところで、種々のアレルギー性疾患にはステロイド性抗炎症剤が用いられ、その劇的な治療効果が認められてきた。しかし、ステロイド剤は多くの臓器が標的となり、紅斑の発生、色素沈着、発育不全等の重篤な副作用が問題になっており、使用を中止すると、症状が再発・増悪するという問題も挙げられている。
【０００４】
そこで、多くの非ステロイド性抗炎症剤および抗アレルギー剤が開発されてきたが、これら非ステロイド性薬剤の内、気管支喘息やアトピー性皮膚炎等に著効するものはほとんど存在しない。また、これら薬剤の効果の多くが、非選択的な抗体産生細胞の増殖抑制効果、起炎物質の遊離阻害、起炎物質の競合拮抗阻害等であり、発症後の症状緩和には好適であっても、発症の予防のために日常的に用いるには効果や安全性の観点から問題があった。また、アレルギー性疾患の治療に用いられる現在の医薬品は、副作用、離脱の困難性から必ずしも安心して用いられるものではなく、投与を中止すると再発する薬剤が多いことから、アレルギー性疾患の予防・改善に寄与する安全な、飲食品、化粧品、医薬品等で日常的に使用できる物質が望まれている。
【０００５】
このような観点から、優れた抗アレルギー作用を有する天然由来成分の探索が精力的に行われており、これまでに、ニッケイ、ヤマモモ（ヨウバイヒ）、マルバニッケイ、アコウ、ヤブニッケイ、ダケカンバ、ナナカマド、シラカバ、ヤマネコヤナギ(特許文献1)、菊花、訶子（ミロバランノキ）、菱実、大根草、ウワウルシ、ヤロー、ローズ、クミン、クローブ、アキノキリンソウ、オンジ、クバク、キキョウ、ボットマリーゴールド、レッドペッパー、チモ、ホップ、ニンドウ（特許文献２）、ブラハミ、アシュワガンダ、ウコン、ギムネマ（特許文献３）等が様々な機序を介して、抗アレルギー作用を有するものとして報告されている。しかし、これらのいずれについても未だ十分な効果は得られていない。
【特許文献１】特開平１０−２８７５８２号公報
【特許文献２】特開平１１−１９９５００号公報
【特許文献３】特開２００３−２４６７４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明の目的は、IL-4及び／又はIL-5産生を抑制し、アレルギー性疾患の予防・治療に有効であり、かつ日常的に使用できる安全な医薬、飲食品、化粧品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
斯かる実情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行なった結果、ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる植物又はそれらの抽出物が、IL-4やIL-5の産生を抑制し、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤として有用であり、かつ副作用の少ないことを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするIL-4及び／又はIL-5産生抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の植物又はそれらの抽出物は、IL-4、IL-5の産生を有効に抑制することから、日常的に使用できる安全な各種アレルギー性疾患（気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、薬物アレルギー、好酸球性肺炎等の好酸球増多症）の予防及び／又は治療剤として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で使用される植物は、ムーニャ（Minthostachys setosa）、マセラ（Egletes viscose）、夜行キリン（Euphorbia phosphorea）、ハッショウマメ（Mucuna pruriens）、アジュンナ（Terminalia arjuna W. et A.）、アチオテ（Bixa orellana L.）、レッドラズベリー（Rubus wallichii）、アタンシ（BRUCEAE FRUCTUS）、ジョウザン（DICHROAE RADIX）、トコン（IPECACUANHAE RADIX）、ジャボチカバ（Myrciaria joboticaba）、パウ−フェルロ（Caesalpinia ferrea Mart.）、ベンゾイン（Styrax benzoin）及びオリバナーム（Boswellia carterii）である。
【００１２】
本発明における植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部及び根、塊茎などの地下部、種子、果実、樹脂などのすべての部位が使用可能である。また本発明における植物は、植物自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物（生もしくは乾燥）、それら自身を圧搾抽出することにより得られる搾汁、あるいは粗抽出物、粗抽出物の精製物等として用いることができる。これらは単独で用いてもよく、または二種類以上混合して用いてもよい。
【００１３】
抽出する溶媒としては、水、熱水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコール；酢酸エチル等のエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３-ブチレンアルコール、グリセリン等のグリコール類；ジエチルエーテル、石油エーテル等のエーテル類；アセトン、酢酸等の極性溶媒；ベンゼン、ヘキサン、キシレン等の炭化水素等を挙げることができ、これら溶媒は、単独で用いてもよく、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、溶媒に植物組織またはこれらの粉砕物を浸漬する方法、加温下（常温〜溶媒の沸点の範囲）攪拌する方法等を挙げることができる。抽出の際の植物と溶媒との比率は植物に対して溶媒１〜１００重量倍、特に２〜４０重量倍が好ましい。また抽出時間は、抽出温度によっても異なるが、水を用いた場合は１〜１２０分の範囲とすることが好ましく、特に５〜６０分が好ましい。一方、低級アルコールを用いた場合は１時間〜７日間の範囲とすることが好ましく、特に１時間〜４８時間が好ましい。得られた抽出物は、必要に応じて濾過又は遠心分離によって固形物を除いた後、そのまま用いるかまたは溶媒を濃縮もしくは乾燥して用いてもよいが、溶媒抽出物を減圧乾燥、真空凍結乾燥等の手段によって乾燥して、粗乾燥物として使用してもよい。
【００１５】
また、前記の方法で得られる粗抽出物は、公知の化合物の分離や精製に用いる方法で精製してもよい。このような方法としては、例えば、活性炭、シリカゲル、ポリマー系担体等を用いた吸脱着、カラムクロマトグラフィー、液−液抽出、分別沈殿等の方法を挙げることができる。
【００１６】
本発明で用いるこれらの特定の植物又は抽出物が、IL-4、IL-5産生を有効に抑制することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。本発明の植物又は植物抽出物は、IL-4、IL-5産生抑制作用を有し、また安全性が高いことから、アレルギー性疾患予防及び／又は治療剤として有用である。特に、ベンゾイン、オリバナーム又はこれらの抽出物は、T細胞には作用せず抗原提示した抗原提示細胞のみに作用してIL-4および／またはIL-5産生を抑制する物質であることから、極めて安全性が高い。
【００１７】
本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤、IL-4および／またはIL-5産生抑制剤の投与方法は、経口投与または非経口投与のいずれも使用できる。投与に際しては、本発明の植物又はそれらの抽出物を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００１８】
また、本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤、IL-4および／またはIL-5産生抑制剤は、医薬品製剤としてだけでなく、飲食品、化粧品等として用いることもできる。飲食品として用いる場合には、上記の植物又はそれらの抽出物をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、あるいは飲食品中に含有せしめてアレルギー性疾患の予防・治療に有用な保健用食品又は食品素材として用いることができる。例えば、前記の植物に、飲食品として使用可能な添加剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品；かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品；パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００１９】
また、化粧品として用いる場合には、慣用されている化粧品の形態、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧料、乳液、化粧液、ファンデーション、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンス、クリーム、ジェル、フォーム、パック、スティック、パウダー等の形態とすることができ、本発明の植物又はその抽出物の他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料、各種皮膚栄養剤、保湿剤、酸化防止剤、色素、ビタミン類、アミノ酸類、水等を任意に組合せて製造することができる。
【００２０】
医薬品製剤、飲食品および化粧品における本発明の植物又はそれらの抽出物の配合量は、その態様によって得られる効果が異なるため、適宜添加量を設定することが望ましいが、固型分換算で０．００００１重量％〜１００重量％、特に、０．０００１重量％〜９０重量％とすることが好ましく、成人１日あたりの投与量は、乾燥重量換算で０．０００２〜１ｇ／kg程度が好ましく、特に０．００２〜０．２ｇ／kg程度が好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔１〕Ｔ細胞株の取得
・マウス脾臓細胞からのT細胞群の分画
BALB／cマウス（雌、8〜16週齢）の脾臓を摘出し、Hank's balanced salt solution中で単細胞浮遊液を調製した。溶血処理後、遠心洗浄し、10％FCS／5×10-5M β-mercaptoethanol／RPMI 1640培地（FCS／ME／RPMI）に浮遊させ、スタフィロコッカスエンテロトキシンB（SEB）を1μg／mlの濃度で加えて37℃、5％ CO2／95％ airの条件で培養した。増殖してきた細胞にX線（5,000 Rad）で照射した脾臓細胞を加え、1μg／mlのSEBを添加したFCS／ME／RPMIで数回（週1回ずつ合計4回）植え継いだ。
【００２２】
・限界希釈法によるT細胞群からのSEB応答性T細胞株の選抜
上記培養により増殖してきた細胞を回収し、計数した。X線（5,000 Rad）で照射した脾臓細胞を抗原提示細胞とし、2.5μg／mlのSEBを添加したFCS／ME／RPMIで増殖してきたSEB応答性T細胞を96穴U底マイクロタイタープレートのウエルあたり1個となるように加えて培養した（限界希釈法）。増殖してきたT細胞株を10％ ConA SN（10μg／mlのConAで刺激したマウス脾臓細胞の培養上清）を添加したFCS／ME／RPMIにて培養し、細胞数を増やした。磁気ビーズ法（細胞浮遊液にビオチン化抗体を加えて処理した後ストレプトアビジンマイクロビーズを加え、外部から磁石を当てて抗体の付着した細胞と付着していない細胞を分ける方法）を用いてT細胞を除去した後、X線（3,000 Rad）で照射した脾臓細胞を抗原提示細胞とし、2.5μg／mlのSEBを添加したFCS／ME／RPMIで培養した時に多量のIL-4を産生するT細胞株を選抜し、T細胞株#15を取得した。
【００２３】
・T細胞株♯15の表面抗原とサイトカイン産生パターン
フローサイトメトリー法により分析した結果、T細胞株#15はT細胞抗原レセプターαβを保持し、Thy-1、CD4、CD44、CD69を発現するヘルパーT細胞であった。96穴U底マイクロタイタープレートを用いて、T細胞株#15の数をウエル当たり8×102〜1×105個、抗原提示細胞（T細胞を除去した後X線（3,000 Rad）照射した脾臓細胞）を無添加または5×105個／well添加、SEBを無添加または2.5μg／ml添加して、37℃、5％ CO2／95％ airの条件で48時間培養した。培地容積は0.2mlとした。培養上清のIFN-γおよびIL-4濃度はサンドイッチELISA法で測定した。その結果、T細胞株#15は抗原提示細胞とSEBの両者が存在する場合にIL-4を産生したが、IFN-γを産生しないことから、Th2細胞と考えられた（図１）。また、抗原提示細胞とSEBで刺激する際に100nMのFK506（T細胞抗原レセプターからのシグナル伝達を特異的に阻害する物質）を加えると、増殖応答は90％抑えられ、IL-4産生やIL-5産生は完全に阻害された（図２）。図２は、T細胞株#15（2 x 104 個／well）を培地のみ（None）、抗原提示細胞のみ（APC；1 x 105 個／well）、SEBのみ（1μg／ml）、APC+SEB、rIL-2（25U／ml）、または固相化抗CD3抗体（αCD3）の存在下で48時間培養したものについて、増殖応答（0.5μCiの3H-thymidineで8時間パルスし、DNAへの取り込みを測定）およびIL-4／IL-5産生能（培養上清中のIL-4／IL-5濃度をサンドイッチELISA法で測定）を調べた結果である。なお、T細胞抗原レセプターを介することなくT細胞株#15の増殖を刺激するコントロールとして、rIL-2を加えた。このように、T細胞株♯15を細胞株として樹立し、♯15はT細胞抗原レセプターを介して抗原提示細胞表面に結合したSEBを認識しIL-4およびIL-5を産生することを確認した。
【００２４】
〔２〕T細胞株♯15を用いたスクリーニング方法の構築
・T細胞株♯15のサイトカイン産生条件の検討
多くの被験物質のIL-4およびIL-5産生抑制効果をスクリーニングするため、T細胞株#15の培養条件を検討した。すなわち、96穴U底マイクロタイタープレートを用いて、T細胞株#15を2 x 104個／well添加すると、抗原提示細胞（5 x 105 個／well）とSEB（2.5μg／ml）に依存して充分な量のIL-4を産生した（図１）。次に、T細胞株#15の数を2×104 個／wellとし、抗原提示細胞（T細胞を除去した後X線（3,000 Rad）照射した脾臓細胞。B/c-Sp-APC；BALB/cマウスの脾臓細胞から調製した。）の数を1×104〜8×104 個／well加え、SEBを0、1、または2.5 μg／ml添加して、37℃、5％ CO2／95％ airの条件で48時間培養した。ウエル当たりの培地容積は0.2 mlとした。培養上清中に分泌されたIL-4の量をサンドイッチELISA法で検討した結果、8×104 個／wellの抗原提示細胞存在下、1および2.5μg／mlのSEB添加により充分な量のIL-4産生を誘導した（図３）。これらの結果を総合し、多数の被験物質をスクリーニングする条件として、T細胞株#15の細胞数を2×104 個／well、抗原提示細胞の細胞数を1×105 個／well、SEBの添加量を1μg／mlとした。
【００２５】
〔３〕IL-4および／またはIL-5の産生を抑制する物質のスクリーニング
・被験物質の調製
さまざまな植物の花、葉、茎、根、果実、種子等を乾燥し、そのままもしくは粉砕し、重量あたり20倍量のイオン交換水を添加した。加熱し沸騰状態で30分間抽出を行った。十分に冷却した後、4重のガーゼでろ過し、得られたろ液を凍結乾燥して熱水抽出物乾燥粉末とし、試験に供した。これらの成分を秤量し、PBSに溶解した後、0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過滅菌するか、あるいは10,000RadのX線照射で殺菌した。
【００２６】
・試験方法１（T細胞株♯15、抗原提示細胞、SEBおよび被験物質の共存培養下でのIL-4、IL-5の産生抑制能の検証）
〔２〕の培養条件に被験物質を1〜100μg／ml添加して48時間培養し、培養上清中のIL-4、IL-5濃度を特異抗体を用いたサンドイッチELISA法で測定した。IL-4、IL-5の産生抑制能は、被験物質を加えない場合のIL-4またはIL-5の濃度をA、被験物質を加えた場合のIL-4またはIL-5の濃度をBとし、(A-B)／A×100（％）により算出した。
【００２７】
・結果
878種の被験物質を試験した。33μg／mlの添加濃度でIL-4の産生を80％以上抑制する被験物質は、98種（11.2％）であった。次に、878種の被験物質から無作為に選んだ131種の被験物質についてIL-4とIL-5の産生抑制能を調べたところ、33μg／mlの添加濃度でIL-4とIL-5の産生を抑制する物質が13種（9.9％）、IL-4産生のみ抑制する物質が11種（8.4％）、IL-5産生のみ抑制する物質が1種（0.8％）あった。
これまでにアレルギー抑制効果を有することが知られていない植物から調製した被験物質の内、表１に示した実施例1〜14について、IL-4の産生抑制、もしくはIL-4およびIL-5の産生抑制が認められ、アレルギーの抑制効果を有することが新たに見出された。IL-4およびIL-5の産生抑制が認められなかった被験物質（比較例1〜4）、すでにアレルギーの抑制効果を有することが報告されている植物から調製した被験物質（比較例5〜9）の結果も併せて表1に示す。表１は、試験方法１で被験物質を最終濃度33μg／mlで添加して48時間培養し、培養上清中のIL-4とIL-5の濃度をサンドイッチELISA法で測定した結果である。
【００２８】
【表１】
【００２９】
・試験方法２（T細胞株♯15、抗CD3抗体および被験物質の共存培養下でのIL-4の産生抑制能の検証）
96穴U底マイクロタイタープレートのウエルに抗マウスCD3抗体をコーティング（10μg／mlの抗体溶液をウエル当たり30μl加え37℃で90分、または4℃で一晩放置後、PBSで5回洗浄）した後、T細胞株#15（2×104 個／well）および被験物質を10〜100μg／ml加え、48時間培養した。培養上清中のIL-4濃度を特異抗体を用いたサンドイッチELISA法で測定した。IL-4の産生抑制能は、被験物質を加えない場合のIL-4の濃度をA、被験物質を加えた場合のIL-4の濃度をBとし、(A-B)／A×100（％）により算出した。
【００３０】
・結果
ベンゾイン、オリバナームは、これまで知られているアレルギー抑制効果のある物質（比較例10〜12）に比較して、試験方法２で測定したIC50の値が高かった。このことから、ベンゾイン、オリバナームは、アレルギー性疾患治療予防剤として安全性が高いことが明らかになった。アレルギー抑制効果のない物質（比較例13〜16）の結果と併せて表２に示す。表２には、被験物質の濃度とIL-4産生抑制率の関係から、50％の抑制を示す被験物質の濃度（IC50）を算出したものを表す。
【００３１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】T細胞株#15によるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図２】T細胞株#15の増殖応答およびサイトカイン産生におよぼすFK506の影響を示すグラフである。
【図３】T細胞株#15によるIL-4産生量と、SEB量、抗原提示細胞数との関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、IgEの関与する即時型アレルギーとT細胞の反応による遅延型アレルギーとが複雑に影響して引き起こされる。この内、IgEの産生はIL-4（インターロイキン−４）産生により引き起こされ、IL-4産生はIFN-γの減少やIL-5（インターロイキン−５）産生により増強される。IL-4およびIL-5は抗原特異的なタイプ2のヘルパーT細胞（Th2細胞）から産生されることが知られており、IL-4およびIL-5産生を抑制し、かつ人体にとって安全である物質は、各種アレルギー性疾患（気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、薬物アレルギー、好酸球性肺炎等の好酸球増多症）の予防や治療に有効であると考えられる。
【０００３】
ところで、種々のアレルギー性疾患にはステロイド性抗炎症剤が用いられ、その劇的な治療効果が認められてきた。しかし、ステロイド剤は多くの臓器が標的となり、紅斑の発生、色素沈着、発育不全等の重篤な副作用が問題になっており、使用を中止すると、症状が再発・増悪するという問題も挙げられている。
【０００４】
そこで、多くの非ステロイド性抗炎症剤および抗アレルギー剤が開発されてきたが、これら非ステロイド性薬剤の内、気管支喘息やアトピー性皮膚炎等に著効するものはほとんど存在しない。また、これら薬剤の効果の多くが、非選択的な抗体産生細胞の増殖抑制効果、起炎物質の遊離阻害、起炎物質の競合拮抗阻害等であり、発症後の症状緩和には好適であっても、発症の予防のために日常的に用いるには効果や安全性の観点から問題があった。また、アレルギー性疾患の治療に用いられる現在の医薬品は、副作用、離脱の困難性から必ずしも安心して用いられるものではなく、投与を中止すると再発する薬剤が多いことから、アレルギー性疾患の予防・改善に寄与する安全な、飲食品、化粧品、医薬品等で日常的に使用できる物質が望まれている。
【０００５】
このような観点から、優れた抗アレルギー作用を有する天然由来成分の探索が精力的に行われており、これまでに、ニッケイ、ヤマモモ（ヨウバイヒ）、マルバニッケイ、アコウ、ヤブニッケイ、ダケカンバ、ナナカマド、シラカバ、ヤマネコヤナギ(特許文献1)、菊花、訶子（ミロバランノキ）、菱実、大根草、ウワウルシ、ヤロー、ローズ、クミン、クローブ、アキノキリンソウ、オンジ、クバク、キキョウ、ボットマリーゴールド、レッドペッパー、チモ、ホップ、ニンドウ（特許文献２）、ブラハミ、アシュワガンダ、ウコン、ギムネマ（特許文献３）等が様々な機序を介して、抗アレルギー作用を有するものとして報告されている。しかし、これらのいずれについても未だ十分な効果は得られていない。
【特許文献１】特開平１０−２８７５８２号公報
【特許文献２】特開平１１−１９９５００号公報
【特許文献３】特開２００３−２４６７４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明の目的は、IL-4及び／又はIL-5産生を抑制し、アレルギー性疾患の予防・治療に有効であり、かつ日常的に使用できる安全な医薬、飲食品、化粧品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
斯かる実情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行なった結果、ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる植物又はそれらの抽出物が、IL-4やIL-5の産生を抑制し、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤として有用であり、かつ副作用の少ないことを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするIL-4及び／又はIL-5産生抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の植物又はそれらの抽出物は、IL-4、IL-5の産生を有効に抑制することから、日常的に使用できる安全な各種アレルギー性疾患（気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、薬物アレルギー、好酸球性肺炎等の好酸球増多症）の予防及び／又は治療剤として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で使用される植物は、ムーニャ（Minthostachys setosa）、マセラ（Egletes viscose）、夜行キリン（Euphorbia phosphorea）、ハッショウマメ（Mucuna pruriens）、アジュンナ（Terminalia arjuna W. et A.）、アチオテ（Bixa orellana L.）、レッドラズベリー（Rubus wallichii）、アタンシ（BRUCEAE FRUCTUS）、ジョウザン（DICHROAE RADIX）、トコン（IPECACUANHAE RADIX）、ジャボチカバ（Myrciaria joboticaba）、パウ−フェルロ（Caesalpinia ferrea Mart.）、ベンゾイン（Styrax benzoin）及びオリバナーム（Boswellia carterii）である。
【００１２】
本発明における植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部及び根、塊茎などの地下部、種子、果実、樹脂などのすべての部位が使用可能である。また本発明における植物は、植物自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物（生もしくは乾燥）、それら自身を圧搾抽出することにより得られる搾汁、あるいは粗抽出物、粗抽出物の精製物等として用いることができる。これらは単独で用いてもよく、または二種類以上混合して用いてもよい。
【００１３】
抽出する溶媒としては、水、熱水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコール；酢酸エチル等のエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３-ブチレンアルコール、グリセリン等のグリコール類；ジエチルエーテル、石油エーテル等のエーテル類；アセトン、酢酸等の極性溶媒；ベンゼン、ヘキサン、キシレン等の炭化水素等を挙げることができ、これら溶媒は、単独で用いてもよく、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、溶媒に植物組織またはこれらの粉砕物を浸漬する方法、加温下（常温〜溶媒の沸点の範囲）攪拌する方法等を挙げることができる。抽出の際の植物と溶媒との比率は植物に対して溶媒１〜１００重量倍、特に２〜４０重量倍が好ましい。また抽出時間は、抽出温度によっても異なるが、水を用いた場合は１〜１２０分の範囲とすることが好ましく、特に５〜６０分が好ましい。一方、低級アルコールを用いた場合は１時間〜７日間の範囲とすることが好ましく、特に１時間〜４８時間が好ましい。得られた抽出物は、必要に応じて濾過又は遠心分離によって固形物を除いた後、そのまま用いるかまたは溶媒を濃縮もしくは乾燥して用いてもよいが、溶媒抽出物を減圧乾燥、真空凍結乾燥等の手段によって乾燥して、粗乾燥物として使用してもよい。
【００１５】
また、前記の方法で得られる粗抽出物は、公知の化合物の分離や精製に用いる方法で精製してもよい。このような方法としては、例えば、活性炭、シリカゲル、ポリマー系担体等を用いた吸脱着、カラムクロマトグラフィー、液−液抽出、分別沈殿等の方法を挙げることができる。
【００１６】
本発明で用いるこれらの特定の植物又は抽出物が、IL-4、IL-5産生を有効に抑制することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。本発明の植物又は植物抽出物は、IL-4、IL-5産生抑制作用を有し、また安全性が高いことから、アレルギー性疾患予防及び／又は治療剤として有用である。特に、ベンゾイン、オリバナーム又はこれらの抽出物は、T細胞には作用せず抗原提示した抗原提示細胞のみに作用してIL-4および／またはIL-5産生を抑制する物質であることから、極めて安全性が高い。
【００１７】
本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤、IL-4および／またはIL-5産生抑制剤の投与方法は、経口投与または非経口投与のいずれも使用できる。投与に際しては、本発明の植物又はそれらの抽出物を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００１８】
また、本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤、IL-4および／またはIL-5産生抑制剤は、医薬品製剤としてだけでなく、飲食品、化粧品等として用いることもできる。飲食品として用いる場合には、上記の植物又はそれらの抽出物をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、あるいは飲食品中に含有せしめてアレルギー性疾患の予防・治療に有用な保健用食品又は食品素材として用いることができる。例えば、前記の植物に、飲食品として使用可能な添加剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品；かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品；パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００１９】
また、化粧品として用いる場合には、慣用されている化粧品の形態、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧料、乳液、化粧液、ファンデーション、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンス、クリーム、ジェル、フォーム、パック、スティック、パウダー等の形態とすることができ、本発明の植物又はその抽出物の他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料、各種皮膚栄養剤、保湿剤、酸化防止剤、色素、ビタミン類、アミノ酸類、水等を任意に組合せて製造することができる。
【００２０】
医薬品製剤、飲食品および化粧品における本発明の植物又はそれらの抽出物の配合量は、その態様によって得られる効果が異なるため、適宜添加量を設定することが望ましいが、固型分換算で０．００００１重量％〜１００重量％、特に、０．０００１重量％〜９０重量％とすることが好ましく、成人１日あたりの投与量は、乾燥重量換算で０．０００２〜１ｇ／kg程度が好ましく、特に０．００２〜０．２ｇ／kg程度が好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔１〕Ｔ細胞株の取得
・マウス脾臓細胞からのT細胞群の分画
BALB／cマウス（雌、8〜16週齢）の脾臓を摘出し、Hank's balanced salt solution中で単細胞浮遊液を調製した。溶血処理後、遠心洗浄し、10％FCS／5×10-5M β-mercaptoethanol／RPMI 1640培地（FCS／ME／RPMI）に浮遊させ、スタフィロコッカスエンテロトキシンB（SEB）を1μg／mlの濃度で加えて37℃、5％ CO2／95％ airの条件で培養した。増殖してきた細胞にX線（5,000 Rad）で照射した脾臓細胞を加え、1μg／mlのSEBを添加したFCS／ME／RPMIで数回（週1回ずつ合計4回）植え継いだ。
【００２２】
・限界希釈法によるT細胞群からのSEB応答性T細胞株の選抜
上記培養により増殖してきた細胞を回収し、計数した。X線（5,000 Rad）で照射した脾臓細胞を抗原提示細胞とし、2.5μg／mlのSEBを添加したFCS／ME／RPMIで増殖してきたSEB応答性T細胞を96穴U底マイクロタイタープレートのウエルあたり1個となるように加えて培養した（限界希釈法）。増殖してきたT細胞株を10％ ConA SN（10μg／mlのConAで刺激したマウス脾臓細胞の培養上清）を添加したFCS／ME／RPMIにて培養し、細胞数を増やした。磁気ビーズ法（細胞浮遊液にビオチン化抗体を加えて処理した後ストレプトアビジンマイクロビーズを加え、外部から磁石を当てて抗体の付着した細胞と付着していない細胞を分ける方法）を用いてT細胞を除去した後、X線（3,000 Rad）で照射した脾臓細胞を抗原提示細胞とし、2.5μg／mlのSEBを添加したFCS／ME／RPMIで培養した時に多量のIL-4を産生するT細胞株を選抜し、T細胞株#15を取得した。
【００２３】
・T細胞株♯15の表面抗原とサイトカイン産生パターン
フローサイトメトリー法により分析した結果、T細胞株#15はT細胞抗原レセプターαβを保持し、Thy-1、CD4、CD44、CD69を発現するヘルパーT細胞であった。96穴U底マイクロタイタープレートを用いて、T細胞株#15の数をウエル当たり8×102〜1×105個、抗原提示細胞（T細胞を除去した後X線（3,000 Rad）照射した脾臓細胞）を無添加または5×105個／well添加、SEBを無添加または2.5μg／ml添加して、37℃、5％ CO2／95％ airの条件で48時間培養した。培地容積は0.2mlとした。培養上清のIFN-γおよびIL-4濃度はサンドイッチELISA法で測定した。その結果、T細胞株#15は抗原提示細胞とSEBの両者が存在する場合にIL-4を産生したが、IFN-γを産生しないことから、Th2細胞と考えられた（図１）。また、抗原提示細胞とSEBで刺激する際に100nMのFK506（T細胞抗原レセプターからのシグナル伝達を特異的に阻害する物質）を加えると、増殖応答は90％抑えられ、IL-4産生やIL-5産生は完全に阻害された（図２）。図２は、T細胞株#15（2 x 104 個／well）を培地のみ（None）、抗原提示細胞のみ（APC；1 x 105 個／well）、SEBのみ（1μg／ml）、APC+SEB、rIL-2（25U／ml）、または固相化抗CD3抗体（αCD3）の存在下で48時間培養したものについて、増殖応答（0.5μCiの3H-thymidineで8時間パルスし、DNAへの取り込みを測定）およびIL-4／IL-5産生能（培養上清中のIL-4／IL-5濃度をサンドイッチELISA法で測定）を調べた結果である。なお、T細胞抗原レセプターを介することなくT細胞株#15の増殖を刺激するコントロールとして、rIL-2を加えた。このように、T細胞株♯15を細胞株として樹立し、♯15はT細胞抗原レセプターを介して抗原提示細胞表面に結合したSEBを認識しIL-4およびIL-5を産生することを確認した。
【００２４】
〔２〕T細胞株♯15を用いたスクリーニング方法の構築
・T細胞株♯15のサイトカイン産生条件の検討
多くの被験物質のIL-4およびIL-5産生抑制効果をスクリーニングするため、T細胞株#15の培養条件を検討した。すなわち、96穴U底マイクロタイタープレートを用いて、T細胞株#15を2 x 104個／well添加すると、抗原提示細胞（5 x 105 個／well）とSEB（2.5μg／ml）に依存して充分な量のIL-4を産生した（図１）。次に、T細胞株#15の数を2×104 個／wellとし、抗原提示細胞（T細胞を除去した後X線（3,000 Rad）照射した脾臓細胞。B/c-Sp-APC；BALB/cマウスの脾臓細胞から調製した。）の数を1×104〜8×104 個／well加え、SEBを0、1、または2.5 μg／ml添加して、37℃、5％ CO2／95％ airの条件で48時間培養した。ウエル当たりの培地容積は0.2 mlとした。培養上清中に分泌されたIL-4の量をサンドイッチELISA法で検討した結果、8×104 個／wellの抗原提示細胞存在下、1および2.5μg／mlのSEB添加により充分な量のIL-4産生を誘導した（図３）。これらの結果を総合し、多数の被験物質をスクリーニングする条件として、T細胞株#15の細胞数を2×104 個／well、抗原提示細胞の細胞数を1×105 個／well、SEBの添加量を1μg／mlとした。
【００２５】
〔３〕IL-4および／またはIL-5の産生を抑制する物質のスクリーニング
・被験物質の調製
さまざまな植物の花、葉、茎、根、果実、種子等を乾燥し、そのままもしくは粉砕し、重量あたり20倍量のイオン交換水を添加した。加熱し沸騰状態で30分間抽出を行った。十分に冷却した後、4重のガーゼでろ過し、得られたろ液を凍結乾燥して熱水抽出物乾燥粉末とし、試験に供した。これらの成分を秤量し、PBSに溶解した後、0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過滅菌するか、あるいは10,000RadのX線照射で殺菌した。
【００２６】
・試験方法１（T細胞株♯15、抗原提示細胞、SEBおよび被験物質の共存培養下でのIL-4、IL-5の産生抑制能の検証）
〔２〕の培養条件に被験物質を1〜100μg／ml添加して48時間培養し、培養上清中のIL-4、IL-5濃度を特異抗体を用いたサンドイッチELISA法で測定した。IL-4、IL-5の産生抑制能は、被験物質を加えない場合のIL-4またはIL-5の濃度をA、被験物質を加えた場合のIL-4またはIL-5の濃度をBとし、(A-B)／A×100（％）により算出した。
【００２７】
・結果
878種の被験物質を試験した。33μg／mlの添加濃度でIL-4の産生を80％以上抑制する被験物質は、98種（11.2％）であった。次に、878種の被験物質から無作為に選んだ131種の被験物質についてIL-4とIL-5の産生抑制能を調べたところ、33μg／mlの添加濃度でIL-4とIL-5の産生を抑制する物質が13種（9.9％）、IL-4産生のみ抑制する物質が11種（8.4％）、IL-5産生のみ抑制する物質が1種（0.8％）あった。
これまでにアレルギー抑制効果を有することが知られていない植物から調製した被験物質の内、表１に示した実施例1〜14について、IL-4の産生抑制、もしくはIL-4およびIL-5の産生抑制が認められ、アレルギーの抑制効果を有することが新たに見出された。IL-4およびIL-5の産生抑制が認められなかった被験物質（比較例1〜4）、すでにアレルギーの抑制効果を有することが報告されている植物から調製した被験物質（比較例5〜9）の結果も併せて表1に示す。表１は、試験方法１で被験物質を最終濃度33μg／mlで添加して48時間培養し、培養上清中のIL-4とIL-5の濃度をサンドイッチELISA法で測定した結果である。
【００２８】
【表１】
【００２９】
・試験方法２（T細胞株♯15、抗CD3抗体および被験物質の共存培養下でのIL-4の産生抑制能の検証）
96穴U底マイクロタイタープレートのウエルに抗マウスCD3抗体をコーティング（10μg／mlの抗体溶液をウエル当たり30μl加え37℃で90分、または4℃で一晩放置後、PBSで5回洗浄）した後、T細胞株#15（2×104 個／well）および被験物質を10〜100μg／ml加え、48時間培養した。培養上清中のIL-4濃度を特異抗体を用いたサンドイッチELISA法で測定した。IL-4の産生抑制能は、被験物質を加えない場合のIL-4の濃度をA、被験物質を加えた場合のIL-4の濃度をBとし、(A-B)／A×100（％）により算出した。
【００３０】
・結果
ベンゾイン、オリバナームは、これまで知られているアレルギー抑制効果のある物質（比較例10〜12）に比較して、試験方法２で測定したIC50の値が高かった。このことから、ベンゾイン、オリバナームは、アレルギー性疾患治療予防剤として安全性が高いことが明らかになった。アレルギー抑制効果のない物質（比較例13〜16）の結果と併せて表２に示す。表２には、被験物質の濃度とIL-4産生抑制率の関係から、50％の抑制を示す被験物質の濃度（IC50）を算出したものを表す。
【００３１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】T細胞株#15によるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図２】T細胞株#15の増殖応答およびサイトカイン産生におよぼすFK506の影響を示すグラフである。
【図３】T細胞株#15によるIL-4産生量と、SEB量、抗原提示細胞数との関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするIL-4及び／又はIL-5産生抑制剤。
【請求項１】
ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
ムーニャ、マセラ、夜行キリン、ハッショウマメ、アジュンナ、アチオテ、レッドラズベリー、アタンシ、ジョウザン、トコン、ジャボチカバ、パウ−フェルロ、ベンゾイン及びオリバナームから選ばれる１種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするIL-4及び／又はIL-5産生抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−３４２０７８（Ｐ２００６−３４２０７８Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６７８１１（Ｐ２００５−１６７８１１）
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
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