アンジオテンシン変換酵素阻害剤およびその製造方法
【課題】 特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、風味が良く、抽出、分画といった操作をすることなく、安全性が高く、食塩摂取による血圧上昇の恐れが無いＡＣＥ阻害剤とその製造方法ならびに前記ＡＣＥ阻害剤を含む血圧降下剤、飲食用組成物、および医薬用または動物薬用組成物を提供すること。
【解決手段】 キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および豆類を麹菌によって消化して得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【解決手段】 キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および豆類を麹菌によって消化して得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥという）阻害剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＣＥは、肺や血管内皮細胞に存在し、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する酵素である。ＡＣＥの働きによって生じるアンジオテンシンＩＩは血管壁平滑筋収縮作用を有するため、血圧上昇を誘発する。また、ＡＣＥは、血圧降下作用を持つペプチドであるブラジキニンを分解するため、結果として血圧を上昇させる作用を示す。
【０００３】
ＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換を抑制することによって昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系を抑制する作用に加えて、血圧降下作用を有する血液中のブラジキニンの分解を阻害する作用があり、血圧降下剤など高血圧症の治療薬として期待できる。例えば、化学合成によって作られたカプトプリル、エナラプリルなどがＡＣＥ阻害作用を有することから高血圧症の治療薬として利用されている。
【０００４】
また、ＡＣＥ阻害剤として発酵乳などの天然物由来成分を有効成分とするものも、副作用がなく安全性が高い血圧降下剤として、機能性食品などへの応用がされているものがある。
【０００５】
その他、天然由来であり、食経験のある素材から得られるＡＣＥ阻害剤としては、豆科植物種子の水抽出物に含まれるＡＣＥ阻害物（特許文献１）や、大豆から抽出、精製して得られるニコチアナミン（特許文献２）が報告されている。また、食経験のある素材に、食品製造に用いられる微生物を作用させて得られるＡＣＥ阻害剤として、麹菌を用いて原料体中にＡＣＥ阻害物質を生成させた生成物（特許文献３）が知られている。
【特許文献１】特開平４-２６１１２２号公報
【特許文献２】特開平５−２４６８６５号公報
【特許文献３】特開平７−２８９２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のＡＣＥ阻害作用が知られている天然成分には、ＡＣＥ阻害作用が不十分である、当該成分の分離、精製が必要であるなどといった問題がある。
また、原料に麹菌を作用させてその生成物を得る際、通常開放系で行うため雑菌繁殖による腐敗、変敗や異味異臭の発生のおそれがある。また、このような雑菌繁殖を防止するためには高濃度の食塩を添加する必要があり、生成物に多量の食塩が含まれるという問題がある。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、抽出、分画といった操作をすることなく、安全性が高く、風味が良く、食塩摂取による血圧上昇の恐れが無いＡＣＥ阻害剤とその製造方法、ならびに前記ＡＣＥ阻害剤を含む血圧降下剤、飲食用組成物、および医薬用または動物薬用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記の課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の穀類および豆類を麹菌以外の微生物の非存在下で製麹を行い、食塩を添加せず、かつ雑菌の混入しない条件下で消化を行うことにより得られる麹菌消化産物が、食塩を添加する場合と比べて短期間で製造することができ、しかも驚くべきことに、このようにして得られる産物は風味が良く、かつ、有効成分の分離精製操作を行うことなくＡＣＥ阻害剤として用いることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の構成は次のとおりである。
（１）キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化して得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤、
（２）麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う前記（１）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤、
（３）麹菌による消化を食塩を添加しないで行う前記（１）または（２）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤、
（４）前記（１）〜（３）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤、
（５）前記（１）〜（３）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する飲食用組成物、
（６）前記（１）〜（３）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する医薬用または動物薬用組成物、
（７）キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化させる工程を有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法、
（８）麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う前記（７）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法、
（９）麹菌による消化を食塩を添加しないで行う前記（７）または（８）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法、
（１０）キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を滅菌したのち麹菌を接種して麹菌以外の微生物やその培養物の非存在下で製麹を行い、製麹後の穀類および／または豆類に食塩を含まない水を添加した条件下で消化を行う前記（７）〜（９）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、風味が良く、有効成分の分離精製を行わなくとも充分なＡＣＥ阻害作用を有する、安全性の高いＡＣＥ阻害剤を得ることができる。また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、穀類および豆類を麹菌のみで消化するため、雑菌の混入、増殖あるいは雑菌によるアンモニアなどの有害物質の発生によりＡＣＥ阻害剤として使用できなくなる恐れがない。また、食塩を含有しないため、穀類および豆類の麹菌による消化が短期間で行われ、製造に有する時間を、食塩を添加する場合と比較して大幅に短くすることができる。また、食塩を含有しないため食塩摂取による血圧上昇の恐れがなく、他の食品と混合しての使用および摂取が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のＡＣＥ阻害剤は、特定の穀類および豆類、すなわち、キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化することで得られる。
【００１２】
ここで用いる穀類および豆類は、特に限定されないが市販のものを使用することができる。
【００１３】
また、前記麹菌は、醤油、味噌の生産に用いられるものを使用することができ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅが挙げられる。
【００１４】
本発明では、前記のように、食経験の豊富な食材（豆類、穀類）および古来より食品製造に利用されている麹菌を使用することで、安全性に優れたＡＣＥ阻害剤を得ることができる。
【００１５】
なお、本発明において消化とは、菌体の産生するプロテアーゼ、アミラーゼなどの酵素によって、原料の穀類および豆類に含まれるタンパク質、糖質などを分解し、低分子化させることをいう。
【００１６】
また、ここでいうＡＣＥ阻害活性とは、後述の実施例３記載の方法でＩＣ５０値を求めたとき、その値が４００μｇ/ｍＬ以下、好ましくは２００μｇ/ｍＬ以下、さらに好ましくは１００μｇ/ｍＬ以下であるもののことをいう。
【００１７】
本発明において、麹菌による前記穀類および豆類の消化は、好ましくは麹菌以外の微生物の非存在下で行う。これは、原料の穀類および豆類を蒸煮または炒熬割砕後、微生物を通さない孔径、例えば孔径０．２μｍ以下のメンブレンフィルターを装備し、このフィルターを通じて、容器内に無菌空気を供給することができる容器に前記原料を入れたのち滅菌する工程、滅菌後の原料に麹菌以外の微生物が混入しないよう麹菌を接種し、前記容器内に無菌空気を送り込みながら製麹する工程、製麹後の麹に滅菌水を添加し消化を促進する工程を実施することにより達成できる。
【００１８】
原料である穀類および豆類の滅菌方法は、特に限定されないが、例えば高圧蒸気滅菌を挙げることができる。
【００１９】
前記のように滅菌した穀類および豆類への麹菌の接種方法は、特に限定されず、例えば、麹菌の菌体を直接接種してもよいし、滅菌した小麦ふすまに麹菌のみを増殖させた種麹を接種してもよい。
【００２０】
なお、滅菌後の原料への麹菌の接種および後述の製麹後の麹への滅菌水の添加は、容器内への微生物の侵入を防ぐことができれば特に限定されないが、小スケールであれば、クリーンベンチ内で行うことができ、製造スケールであれば、無菌室で行うことができる。
【００２１】
前記のように、原料である前記穀類および豆類の消化を麹菌のみで行うようにすることで、風味が良好な消化物が得られるうえ、消化反応の制御が容易となるとともに、一定の品質の消化産物を再現よく得ることができる。また、異味異臭の原因となりうるバクテリオシンなどの静菌性物質を含有する微生物培養物を原料に加える必要を無くすことができる。
【００２２】
麹菌接種後の穀類および豆類は、麹菌が穀類および豆類全体に増殖するまで、フィルターを通じ無菌にした空気を送り込みながら静置して製麹を行う。このときの温度および時間は、麹菌が増殖できれば特に限定されないが、通常、麹菌の増殖状態が良好な２０〜４０℃、２４〜９６時間の範囲で行うことができる。
【００２３】
前記製麹の段階でも前記穀類および豆類の消化は行われるが、本発明ではこれにさらに水を添加することで、消化を促進することができる。
また、麹菌による穀類および豆類の消化は、好ましくは食塩を添加しないで行うことで促進される。
したがって、本発明では、製麹後の穀類および豆類への水の添加に食塩を含まない水を用いればよい。ここで用いる水は、飲用可能であり無菌であれば特に限定はされないが、例えば、飲用に適した水道水または井戸水を、ろ過滅菌、紫外線滅菌あるいは高圧蒸気滅菌などの滅菌処理をしたものを挙げることができる。
【００２４】
前記のように、麹菌による穀類および豆類の消化時に食塩を添加しないことによって、消化に要する期間は数時間から数日となり、食塩が存在する場合より大幅に短縮できる。また、得られる生成物は食塩を含まないため摂取しても血圧上昇の恐れがないという利点もある。
【００２５】
製麹後の穀類および豆類に添加する水の量は、特に制限されないが、消化を効率よく行う為には製麹後の穀類および豆類１重量部に対し、５０重量部以下であることが好ましい。
【００２６】
また、製麹後の穀類および豆類に水を添加した後の容器内の温度および時間は、特に制限されないが、消化が進行しやすい２０〜４０℃、６〜１２０時間の範囲で行うことができる。
【００２７】
なお、前記消化の終了は、消化物中のグルタミン酸濃度の上昇（目安として、製麹後の穀類および豆類１重量部に対して２重量部の水を加えて消化を促進したとき、消化物の液体部分におけるグルタミン酸濃度が５ｍｇ/ｍＬ以上）によって確認することができる。
【００２８】
以上のようにして得られる穀類および豆類の消化産物は、通常、ペースト状の部分と液体の部分が混在する状態で存在するが、このどちらをＡＣＥ阻害剤として用いてもよく、また混合して用いてもよい。これらは、取り扱いを容易にするため、凍結乾燥、スプレードライなどによって乾燥品とすることもできる。
【００２９】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、高血圧症の予防および／または処置のための、血圧降下剤として使用できる。したがって、本発明は、前記ＡＣＥ阻害剤を有効成分とする血圧降下剤に関する。
【００３０】
また、本発明のＡＣＥ阻害剤には、ＡＣＥ阻害作用を失わない範囲内で脱臭、精製などの操作を加えることができる。さらに、飲食品や医薬品として不適当な不純物を含有しない限り、そのまま、または精製物として飲食用、医療用、動物薬用に使用できる。
なお、本発明の対象は、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの哺乳動物）などである。
【００３１】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、これを含有する組成物とすることで、高血圧症の予防および／または処置のための、医薬用または動物薬用および飲食用組成物として利用することができる。また、それらの形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品などの飲食品、あるいはオーバー・ザ・カウンター・ドラッグ（ＯＴＣ）など容易に入手可能な医薬品または医薬部外品、動物薬品などとして利用できる。
【００３２】
本発明のＡＣＥ阻害剤や、これを含有する高血圧症の予防および／または改善・処置用組成物は、そのまま直接摂取することもできるし、また、公知の担体や助剤などの添加剤を使用して、カプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することもできる。
【００３３】
また、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用して用いることもできる。これらの成型剤における本発明のＡＣＥ阻害剤の含有量は、好ましくは０．０１〜１００重量％である。
【００３４】
さらに、本発明のＡＣＥ阻害剤を飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、はんぺんなどの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類；パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品など、すべての飲食物に使用することができる。
【００３５】
本発明のＡＣＥ阻害剤を飲食物に使用する場合、その摂取量は当該ＡＣＥ阻害剤として成人一人一日当たり、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜３００ミリグラム／ｋｇ体重である。
【００３６】
また、本発明のＡＣＥ阻害剤を医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。これら製剤の投与量としては、当該ＡＣＥ阻害剤換算で成人一人一日当たり、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重を１回ないし数回に分けて投与する。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
麹菌消化産物の調製
市販のキヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメの種子それぞれ１ｋｇを蒸煮または炒熬割砕後、フィルターを装備し無菌空気を供給することができる容器に入れ、蒸留水６００ｍＬを加えたのち、１２１℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。次に、滅菌した原料に麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＢＮ６１６（株式会社ビオック製）を培養したふすま麹）３ｇをクリーンベンチ内で麹菌以外の微生物が混入しないように接種し、無菌空気を容器内に供給しながら３１℃で４８時間、麹菌のみで製麹を行った。
その後、クリーンベンチ内でそれぞれの麹７５ｇを滅菌したガラス容器に取り、滅菌蒸留水１５０ｍＬを加えてシリコン栓をし、食塩を添加せずに、麹菌以外の微生物が存在しない条件下において３０℃で３日間消化を行い、消化液を得た。
その後、それぞれの消化液を９０℃で３０分の加熱を行った後、濾過により澄明な液を得た。これらを凍結乾燥し、それぞれの麹菌消化産物を得た。
【００３９】
（比較例１）
水抽出物の調製
市販のキヌア、うずら豆、アマランサス、小豆、トラマメ、フジマメ、四角豆、大手亡、大福豆の種子それぞれ１０ｇずつを、小型粉砕機で粉砕し０．５ｍｍ以下の粉末とした。それぞれの粉砕物にそれぞれ３０ｍＬのヘキサンを加え、スターラーで１時間撹拌した。
その後、濾過によりヘキサン画分を除去し、脱脂した粉砕物を得た。脱脂した粉砕物に４０ｍＬの蒸留水を加え、スターラーで２時間撹拌した。
その後４０ｍＬのエタノールを加えよく撹拌した後、１２０００×ｇ、２０分間遠心分離を行い、上清を回収した。
得られたそれぞれの上清を４０℃、５０ｍｍＨｇにて減圧濃縮後、凍結乾燥を行いそれぞれの水抽出物を得た。
【００４０】
（比較例２）
市販のあまぎ二条大麦の種子１ｋｇを炒熬割砕後、フィルターを装備し無菌空気を供給することができる容器に入れ、蒸留水６００ｍＬを加えたのち、１２１℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。次に、滅菌した原料に麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＢＮ６１６（株式会社ビオック製）を培養したふすま麹）３ｇをクリーンベンチ内で麹菌以外の微生物が混入しないように接種し、無菌空気を容器内に供給しながら３１℃で４８時間、麹菌のみで製麹を行った。
その後、クリーンベンチ内であまぎ二条大麦麹７５ｇを滅菌したガラス容器に取り、滅菌蒸留水１５０ｍＬを加えてシリコン栓をし、食塩を添加せずに、麹菌以外の微生物が存在しない条件下において３０℃で３日間消化を行い、消化液を得た。
その後、消化液を９０℃で３０分の加熱を行った後、濾過により澄明な液を得た。これを凍結乾燥し、あまぎ二条大麦の麹菌消化産物を得た。
【００４１】
（実施例２）
実施例１で得られた麹菌消化産物（小豆、アマランサス）および比較例１で得られた産物の官能評価を実施した。各産物を、１０％となるよう蒸留水に溶解し、パネラーに匂い、味を評価させた。評価はスコアで表し、パネラー５人の評価の平均値を表１に示した。
なお、評価基準であるが、風味の良さの評価基準は１：好ましくない、２：やや好ましくない、３：どちらともいえない、４：やや好ましい、５：好ましい、とした。
うまみの評価基準は１：全く感じない、２：ほとんど感じない、３：少し感じる、４：よく感じる、５：強く感じる、とした。
苦味の評価基準は１：強く感じる、２：よく感じる、３：少し感じる、４：ほとんど感じない、５：全く感じない、とした。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１の結果より、実施例１で得られた麹菌の消化物（小豆、アマランサス）は風味が良好でうまみが強く、また、タンパク質分解物に特有の苦味はほとんど感じられないことが明らかとなった。他の穀物、豆類を用いた場合も同様の結果であった。また、実施例１で得られた麹菌の消化物は、食塩が添加されていないため、消化物をそのまま摂取しても、食塩摂取による血圧上昇のおそれが生じないものであることは明らかである。また、パネラーには、上記麹菌の消化物を試食した前後で健康上に影響は見られなかった。
【００４４】
また、醤油の製造などの麹菌による原料の消化の際は、通常、開放系で製麹を行うため、麹菌のほか雑菌も同時に増殖する。これらの雑菌は製麹後、麹１グラムあたり１０9個にのぼることもある。醤油の場合、製麹にひき続く醸造工程では、これら雑菌の繁殖を抑制する目的で、通常２０〜２３％の食塩を含有する食塩水を添加して醸造を行う。この条件での麹菌による原料の消化は、高濃度の食塩のため非常にゆっくり進み、通常醸造期間は６ヶ月以上である。
これに対して、実施例１で得られた麹菌の消化物は、合計５日間程度消化したものであり、極めて短時間で製造されていることがわかる。
【００４５】
（実施例３）
血圧上昇メカニズムの一つであるレニン−アンジオテンシン系において、ＡＣＥの作用によってアンギオテンシンＩのＣ末端部His-Leuが離脱し、血管壁収縮作用のあるアンギオテンシンＩＩへと変換される。生体内で行われるこの反応のモデルとして、豚膵臓由来ＡＣＥおよび、合成基質であるヒプリルヒスチジルロイシンを用い、酵素反応の結果生じるヒスチジルロイシン(His-Leu)をo-フタルアルデヒドを加えて蛍光誘導体とし、その蛍光強度（励起波長355nm、測定波長460nm）を測定することによって、インビトロでサンプルのＡＣＥ阻害活性を求め、求めたＡＣＥ阻害活性からＩＣ５０値を求め、表２に表した。
【００４６】
なお、ＡＣＥ阻害活性率は、以下の式により求めた。
ＡＣＥ阻害率(％)＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
式中Ａは反応系にサンプルを添加せず酵素を添加した場合、Ｂは反応系にサンプルと酵素ともに添加しない場合、Ｃは反応系にサンプルと酵素ともに添加した場合、Ｄは反応系にサンプルを添加し酵素を添加しない場合の蛍光強度を表す。
【００４７】
また、ＩＣ５０値とは、ＡＣＥ阻害率が５０％となるときの反応系中のサンプル濃度のことであり、片対数グラフの対数軸にサンプル濃度を、非対数軸（リニアー軸）に阻害率をプロットした後対数近似曲線を引き、ここから阻害率５０％のときのサンプル濃度を読み取ることによって求めた。ＩＣ５０値が低いほど阻害活性が高いことを示す。
【００４８】
サンプルのＡＣＥ阻害率測定の具体的な手順を示す。黒色９６ウェルプレートに、ＡＣＥを添加しないウェルには６６μＬのバッファー、ＡＣＥを添加するウェルには３１μＬのバッファーを入れた。次に、４μＬのサンプル溶液を加えよく撹拌した。サンプルを添加しない対照ウェルには４μＬの蒸留水を加えよく撹拌した。
続いて、ＡＣＥを添加するウェルには３５μＬのＡＣＥ溶液を加えよく撹拌した。ここで９６ウェルプレートを３７℃で３分間インキュベートし、続いてすべてのウェルにＡＣＥの基質であるヒプリルヒスチジルロイシン溶液を加え、よく攪拌した。
次にこの９６ウェルプレートを３７℃で３０分間インキュベートし酵素反応を行った。
その後、すべてのウェルに３５μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を加え攪拌し、酵素反応を停止した。
続いてすべてのウェルに１４μＬの０．２％ｏ−フタルアルデヒド溶液を加え攪拌し、４℃で１５分間反応させた後、５６μＬの１．５Ｍリン酸を加えてよく攪拌した。
この９６ウェルプレートを蛍光強度測定装置（パーキンエルマー社製Ｗａｌｌａｃ１４２０ＡＲＶＯｍｘ）を用いて、励起波長355nm、測定波長460nmで測定を行い、酵素反応の結果生じたHis-Leuの量を測定した。
【００４９】
なお、前記バッファーの組成は１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３であり、ＡＣＥ溶液はＡＣＥ（ブタ腎臓由来）を１０ｍＵとなるようバッファーに溶解したものであり、ヒプリルヒスチジルロイシン溶液はヒプリルヒスチジルロイシンを５ｍＭとなるようバッファーに溶解したものであり、０．２％ｏ−フタルアルデヒド溶液はｏ−フタルアルデヒドが０．２％となるようメタノールに溶解したものであり、サンプル溶液は、実施例１、比較例１、比較例２で得られた粉末を７０００μｇ/ｍＬ、３５００μｇ/ｍＬ、１７５０μｇ/ｍＬ、７００μｇ/ｍＬ、３５０μｇ/ｍＬとなるよう蒸留水に溶解したものおよびマレイン酸エナラプリルを１４０μｇ/ｍＬ、７０μｇ/ｍＬ、３５μｇ/ｍＬとなるよう蒸留水に溶解したものである。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２の結果から明らかなように、特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、抽出、分画といった操作をすることなく、高い活性を有するＡＣＥ阻害剤を得ることができた。したがって、これらのＡＣＥ阻害剤は血圧降下剤としても有用であることがわかる。なお、水抽出物はいずれもＡＣＥ阻害活性がきわめて低いため、上記の方法ではＩＣ５０値を求めることはできなかった。また、比較例２で得られたあまぎ二条大麦消化物はいずれのサンプル濃度でもＡＣＥ阻害活性が低く（１８％以下）、濃度依存性も見られなかったことからＩＣ５０値を求めることができず、活性なしとした。
また、表２に示される特定の穀物類または豆類は、いずれも安価に入手できるものであることから、これらの特定の穀類または豆類を材料とすることで、安全性の高いＡＣＥ阻害剤を多量に安価で得られることがわかる。
【００５２】
前記の穀類および豆類を麹菌によって消化することで、高い活性を有するＡＣＥ阻害剤が得られる理由について明確ではないが、例えば、前記穀類および豆類中には、麹菌の消化によってはじめてＡＣＥ阻害活性を発現する成分が多量に含まれており、これらの成分は水などを用いた抽出操作だけでは有効な阻害活性を発現できないことが考えられる。
【００５３】
（実施例４）
カプセル剤の調製
実施例１で調製した小豆の麹菌消化物４０重量部、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム３０重量部、結晶セルロース２０重量部、ビタミンＣ１０重量部の組成で混合し、ゼラチン製カプセル（サイズ：０２号、カプスゲル・ジャパン株式会社）に充填して、ＡＣＥ阻害剤を４０重量％含有する飲食用カプセル剤を調製した。
【００５４】
（実施例５）
クッキーの調製
実施例１で調製した小豆の麹菌消化物６重量部、無塩バター２５重量部、砂糖２２重量部、卵黄１２重量部、薄力粉３５重量部を混合し、直径４ｃｍ程度の円盤状に成形した後、オーブントースターで焼いて（１８０℃、１５分）、ＡＣＥ阻害剤約６重量％含有するクッキーを調製した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥという）阻害剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＣＥは、肺や血管内皮細胞に存在し、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する酵素である。ＡＣＥの働きによって生じるアンジオテンシンＩＩは血管壁平滑筋収縮作用を有するため、血圧上昇を誘発する。また、ＡＣＥは、血圧降下作用を持つペプチドであるブラジキニンを分解するため、結果として血圧を上昇させる作用を示す。
【０００３】
ＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換を抑制することによって昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系を抑制する作用に加えて、血圧降下作用を有する血液中のブラジキニンの分解を阻害する作用があり、血圧降下剤など高血圧症の治療薬として期待できる。例えば、化学合成によって作られたカプトプリル、エナラプリルなどがＡＣＥ阻害作用を有することから高血圧症の治療薬として利用されている。
【０００４】
また、ＡＣＥ阻害剤として発酵乳などの天然物由来成分を有効成分とするものも、副作用がなく安全性が高い血圧降下剤として、機能性食品などへの応用がされているものがある。
【０００５】
その他、天然由来であり、食経験のある素材から得られるＡＣＥ阻害剤としては、豆科植物種子の水抽出物に含まれるＡＣＥ阻害物（特許文献１）や、大豆から抽出、精製して得られるニコチアナミン（特許文献２）が報告されている。また、食経験のある素材に、食品製造に用いられる微生物を作用させて得られるＡＣＥ阻害剤として、麹菌を用いて原料体中にＡＣＥ阻害物質を生成させた生成物（特許文献３）が知られている。
【特許文献１】特開平４-２６１１２２号公報
【特許文献２】特開平５−２４６８６５号公報
【特許文献３】特開平７−２８９２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のＡＣＥ阻害作用が知られている天然成分には、ＡＣＥ阻害作用が不十分である、当該成分の分離、精製が必要であるなどといった問題がある。
また、原料に麹菌を作用させてその生成物を得る際、通常開放系で行うため雑菌繁殖による腐敗、変敗や異味異臭の発生のおそれがある。また、このような雑菌繁殖を防止するためには高濃度の食塩を添加する必要があり、生成物に多量の食塩が含まれるという問題がある。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、抽出、分画といった操作をすることなく、安全性が高く、風味が良く、食塩摂取による血圧上昇の恐れが無いＡＣＥ阻害剤とその製造方法、ならびに前記ＡＣＥ阻害剤を含む血圧降下剤、飲食用組成物、および医薬用または動物薬用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記の課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の穀類および豆類を麹菌以外の微生物の非存在下で製麹を行い、食塩を添加せず、かつ雑菌の混入しない条件下で消化を行うことにより得られる麹菌消化産物が、食塩を添加する場合と比べて短期間で製造することができ、しかも驚くべきことに、このようにして得られる産物は風味が良く、かつ、有効成分の分離精製操作を行うことなくＡＣＥ阻害剤として用いることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の構成は次のとおりである。
（１）キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化して得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤、
（２）麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う前記（１）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤、
（３）麹菌による消化を食塩を添加しないで行う前記（１）または（２）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤、
（４）前記（１）〜（３）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤、
（５）前記（１）〜（３）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する飲食用組成物、
（６）前記（１）〜（３）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する医薬用または動物薬用組成物、
（７）キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化させる工程を有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法、
（８）麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う前記（７）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法、
（９）麹菌による消化を食塩を添加しないで行う前記（７）または（８）記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法、
（１０）キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を滅菌したのち麹菌を接種して麹菌以外の微生物やその培養物の非存在下で製麹を行い、製麹後の穀類および／または豆類に食塩を含まない水を添加した条件下で消化を行う前記（７）〜（９）いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、風味が良く、有効成分の分離精製を行わなくとも充分なＡＣＥ阻害作用を有する、安全性の高いＡＣＥ阻害剤を得ることができる。また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、穀類および豆類を麹菌のみで消化するため、雑菌の混入、増殖あるいは雑菌によるアンモニアなどの有害物質の発生によりＡＣＥ阻害剤として使用できなくなる恐れがない。また、食塩を含有しないため、穀類および豆類の麹菌による消化が短期間で行われ、製造に有する時間を、食塩を添加する場合と比較して大幅に短くすることができる。また、食塩を含有しないため食塩摂取による血圧上昇の恐れがなく、他の食品と混合しての使用および摂取が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のＡＣＥ阻害剤は、特定の穀類および豆類、すなわち、キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化することで得られる。
【００１２】
ここで用いる穀類および豆類は、特に限定されないが市販のものを使用することができる。
【００１３】
また、前記麹菌は、醤油、味噌の生産に用いられるものを使用することができ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅが挙げられる。
【００１４】
本発明では、前記のように、食経験の豊富な食材（豆類、穀類）および古来より食品製造に利用されている麹菌を使用することで、安全性に優れたＡＣＥ阻害剤を得ることができる。
【００１５】
なお、本発明において消化とは、菌体の産生するプロテアーゼ、アミラーゼなどの酵素によって、原料の穀類および豆類に含まれるタンパク質、糖質などを分解し、低分子化させることをいう。
【００１６】
また、ここでいうＡＣＥ阻害活性とは、後述の実施例３記載の方法でＩＣ５０値を求めたとき、その値が４００μｇ/ｍＬ以下、好ましくは２００μｇ/ｍＬ以下、さらに好ましくは１００μｇ/ｍＬ以下であるもののことをいう。
【００１７】
本発明において、麹菌による前記穀類および豆類の消化は、好ましくは麹菌以外の微生物の非存在下で行う。これは、原料の穀類および豆類を蒸煮または炒熬割砕後、微生物を通さない孔径、例えば孔径０．２μｍ以下のメンブレンフィルターを装備し、このフィルターを通じて、容器内に無菌空気を供給することができる容器に前記原料を入れたのち滅菌する工程、滅菌後の原料に麹菌以外の微生物が混入しないよう麹菌を接種し、前記容器内に無菌空気を送り込みながら製麹する工程、製麹後の麹に滅菌水を添加し消化を促進する工程を実施することにより達成できる。
【００１８】
原料である穀類および豆類の滅菌方法は、特に限定されないが、例えば高圧蒸気滅菌を挙げることができる。
【００１９】
前記のように滅菌した穀類および豆類への麹菌の接種方法は、特に限定されず、例えば、麹菌の菌体を直接接種してもよいし、滅菌した小麦ふすまに麹菌のみを増殖させた種麹を接種してもよい。
【００２０】
なお、滅菌後の原料への麹菌の接種および後述の製麹後の麹への滅菌水の添加は、容器内への微生物の侵入を防ぐことができれば特に限定されないが、小スケールであれば、クリーンベンチ内で行うことができ、製造スケールであれば、無菌室で行うことができる。
【００２１】
前記のように、原料である前記穀類および豆類の消化を麹菌のみで行うようにすることで、風味が良好な消化物が得られるうえ、消化反応の制御が容易となるとともに、一定の品質の消化産物を再現よく得ることができる。また、異味異臭の原因となりうるバクテリオシンなどの静菌性物質を含有する微生物培養物を原料に加える必要を無くすことができる。
【００２２】
麹菌接種後の穀類および豆類は、麹菌が穀類および豆類全体に増殖するまで、フィルターを通じ無菌にした空気を送り込みながら静置して製麹を行う。このときの温度および時間は、麹菌が増殖できれば特に限定されないが、通常、麹菌の増殖状態が良好な２０〜４０℃、２４〜９６時間の範囲で行うことができる。
【００２３】
前記製麹の段階でも前記穀類および豆類の消化は行われるが、本発明ではこれにさらに水を添加することで、消化を促進することができる。
また、麹菌による穀類および豆類の消化は、好ましくは食塩を添加しないで行うことで促進される。
したがって、本発明では、製麹後の穀類および豆類への水の添加に食塩を含まない水を用いればよい。ここで用いる水は、飲用可能であり無菌であれば特に限定はされないが、例えば、飲用に適した水道水または井戸水を、ろ過滅菌、紫外線滅菌あるいは高圧蒸気滅菌などの滅菌処理をしたものを挙げることができる。
【００２４】
前記のように、麹菌による穀類および豆類の消化時に食塩を添加しないことによって、消化に要する期間は数時間から数日となり、食塩が存在する場合より大幅に短縮できる。また、得られる生成物は食塩を含まないため摂取しても血圧上昇の恐れがないという利点もある。
【００２５】
製麹後の穀類および豆類に添加する水の量は、特に制限されないが、消化を効率よく行う為には製麹後の穀類および豆類１重量部に対し、５０重量部以下であることが好ましい。
【００２６】
また、製麹後の穀類および豆類に水を添加した後の容器内の温度および時間は、特に制限されないが、消化が進行しやすい２０〜４０℃、６〜１２０時間の範囲で行うことができる。
【００２７】
なお、前記消化の終了は、消化物中のグルタミン酸濃度の上昇（目安として、製麹後の穀類および豆類１重量部に対して２重量部の水を加えて消化を促進したとき、消化物の液体部分におけるグルタミン酸濃度が５ｍｇ/ｍＬ以上）によって確認することができる。
【００２８】
以上のようにして得られる穀類および豆類の消化産物は、通常、ペースト状の部分と液体の部分が混在する状態で存在するが、このどちらをＡＣＥ阻害剤として用いてもよく、また混合して用いてもよい。これらは、取り扱いを容易にするため、凍結乾燥、スプレードライなどによって乾燥品とすることもできる。
【００２９】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、高血圧症の予防および／または処置のための、血圧降下剤として使用できる。したがって、本発明は、前記ＡＣＥ阻害剤を有効成分とする血圧降下剤に関する。
【００３０】
また、本発明のＡＣＥ阻害剤には、ＡＣＥ阻害作用を失わない範囲内で脱臭、精製などの操作を加えることができる。さらに、飲食品や医薬品として不適当な不純物を含有しない限り、そのまま、または精製物として飲食用、医療用、動物薬用に使用できる。
なお、本発明の対象は、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの哺乳動物）などである。
【００３１】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、これを含有する組成物とすることで、高血圧症の予防および／または処置のための、医薬用または動物薬用および飲食用組成物として利用することができる。また、それらの形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品などの飲食品、あるいはオーバー・ザ・カウンター・ドラッグ（ＯＴＣ）など容易に入手可能な医薬品または医薬部外品、動物薬品などとして利用できる。
【００３２】
本発明のＡＣＥ阻害剤や、これを含有する高血圧症の予防および／または改善・処置用組成物は、そのまま直接摂取することもできるし、また、公知の担体や助剤などの添加剤を使用して、カプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することもできる。
【００３３】
また、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用して用いることもできる。これらの成型剤における本発明のＡＣＥ阻害剤の含有量は、好ましくは０．０１〜１００重量％である。
【００３４】
さらに、本発明のＡＣＥ阻害剤を飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、はんぺんなどの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類；パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品など、すべての飲食物に使用することができる。
【００３５】
本発明のＡＣＥ阻害剤を飲食物に使用する場合、その摂取量は当該ＡＣＥ阻害剤として成人一人一日当たり、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜３００ミリグラム／ｋｇ体重である。
【００３６】
また、本発明のＡＣＥ阻害剤を医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。これら製剤の投与量としては、当該ＡＣＥ阻害剤換算で成人一人一日当たり、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重を１回ないし数回に分けて投与する。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
麹菌消化産物の調製
市販のキヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメの種子それぞれ１ｋｇを蒸煮または炒熬割砕後、フィルターを装備し無菌空気を供給することができる容器に入れ、蒸留水６００ｍＬを加えたのち、１２１℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。次に、滅菌した原料に麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＢＮ６１６（株式会社ビオック製）を培養したふすま麹）３ｇをクリーンベンチ内で麹菌以外の微生物が混入しないように接種し、無菌空気を容器内に供給しながら３１℃で４８時間、麹菌のみで製麹を行った。
その後、クリーンベンチ内でそれぞれの麹７５ｇを滅菌したガラス容器に取り、滅菌蒸留水１５０ｍＬを加えてシリコン栓をし、食塩を添加せずに、麹菌以外の微生物が存在しない条件下において３０℃で３日間消化を行い、消化液を得た。
その後、それぞれの消化液を９０℃で３０分の加熱を行った後、濾過により澄明な液を得た。これらを凍結乾燥し、それぞれの麹菌消化産物を得た。
【００３９】
（比較例１）
水抽出物の調製
市販のキヌア、うずら豆、アマランサス、小豆、トラマメ、フジマメ、四角豆、大手亡、大福豆の種子それぞれ１０ｇずつを、小型粉砕機で粉砕し０．５ｍｍ以下の粉末とした。それぞれの粉砕物にそれぞれ３０ｍＬのヘキサンを加え、スターラーで１時間撹拌した。
その後、濾過によりヘキサン画分を除去し、脱脂した粉砕物を得た。脱脂した粉砕物に４０ｍＬの蒸留水を加え、スターラーで２時間撹拌した。
その後４０ｍＬのエタノールを加えよく撹拌した後、１２０００×ｇ、２０分間遠心分離を行い、上清を回収した。
得られたそれぞれの上清を４０℃、５０ｍｍＨｇにて減圧濃縮後、凍結乾燥を行いそれぞれの水抽出物を得た。
【００４０】
（比較例２）
市販のあまぎ二条大麦の種子１ｋｇを炒熬割砕後、フィルターを装備し無菌空気を供給することができる容器に入れ、蒸留水６００ｍＬを加えたのち、１２１℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。次に、滅菌した原料に麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＢＮ６１６（株式会社ビオック製）を培養したふすま麹）３ｇをクリーンベンチ内で麹菌以外の微生物が混入しないように接種し、無菌空気を容器内に供給しながら３１℃で４８時間、麹菌のみで製麹を行った。
その後、クリーンベンチ内であまぎ二条大麦麹７５ｇを滅菌したガラス容器に取り、滅菌蒸留水１５０ｍＬを加えてシリコン栓をし、食塩を添加せずに、麹菌以外の微生物が存在しない条件下において３０℃で３日間消化を行い、消化液を得た。
その後、消化液を９０℃で３０分の加熱を行った後、濾過により澄明な液を得た。これを凍結乾燥し、あまぎ二条大麦の麹菌消化産物を得た。
【００４１】
（実施例２）
実施例１で得られた麹菌消化産物（小豆、アマランサス）および比較例１で得られた産物の官能評価を実施した。各産物を、１０％となるよう蒸留水に溶解し、パネラーに匂い、味を評価させた。評価はスコアで表し、パネラー５人の評価の平均値を表１に示した。
なお、評価基準であるが、風味の良さの評価基準は１：好ましくない、２：やや好ましくない、３：どちらともいえない、４：やや好ましい、５：好ましい、とした。
うまみの評価基準は１：全く感じない、２：ほとんど感じない、３：少し感じる、４：よく感じる、５：強く感じる、とした。
苦味の評価基準は１：強く感じる、２：よく感じる、３：少し感じる、４：ほとんど感じない、５：全く感じない、とした。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１の結果より、実施例１で得られた麹菌の消化物（小豆、アマランサス）は風味が良好でうまみが強く、また、タンパク質分解物に特有の苦味はほとんど感じられないことが明らかとなった。他の穀物、豆類を用いた場合も同様の結果であった。また、実施例１で得られた麹菌の消化物は、食塩が添加されていないため、消化物をそのまま摂取しても、食塩摂取による血圧上昇のおそれが生じないものであることは明らかである。また、パネラーには、上記麹菌の消化物を試食した前後で健康上に影響は見られなかった。
【００４４】
また、醤油の製造などの麹菌による原料の消化の際は、通常、開放系で製麹を行うため、麹菌のほか雑菌も同時に増殖する。これらの雑菌は製麹後、麹１グラムあたり１０9個にのぼることもある。醤油の場合、製麹にひき続く醸造工程では、これら雑菌の繁殖を抑制する目的で、通常２０〜２３％の食塩を含有する食塩水を添加して醸造を行う。この条件での麹菌による原料の消化は、高濃度の食塩のため非常にゆっくり進み、通常醸造期間は６ヶ月以上である。
これに対して、実施例１で得られた麹菌の消化物は、合計５日間程度消化したものであり、極めて短時間で製造されていることがわかる。
【００４５】
（実施例３）
血圧上昇メカニズムの一つであるレニン−アンジオテンシン系において、ＡＣＥの作用によってアンギオテンシンＩのＣ末端部His-Leuが離脱し、血管壁収縮作用のあるアンギオテンシンＩＩへと変換される。生体内で行われるこの反応のモデルとして、豚膵臓由来ＡＣＥおよび、合成基質であるヒプリルヒスチジルロイシンを用い、酵素反応の結果生じるヒスチジルロイシン(His-Leu)をo-フタルアルデヒドを加えて蛍光誘導体とし、その蛍光強度（励起波長355nm、測定波長460nm）を測定することによって、インビトロでサンプルのＡＣＥ阻害活性を求め、求めたＡＣＥ阻害活性からＩＣ５０値を求め、表２に表した。
【００４６】
なお、ＡＣＥ阻害活性率は、以下の式により求めた。
ＡＣＥ阻害率(％)＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
式中Ａは反応系にサンプルを添加せず酵素を添加した場合、Ｂは反応系にサンプルと酵素ともに添加しない場合、Ｃは反応系にサンプルと酵素ともに添加した場合、Ｄは反応系にサンプルを添加し酵素を添加しない場合の蛍光強度を表す。
【００４７】
また、ＩＣ５０値とは、ＡＣＥ阻害率が５０％となるときの反応系中のサンプル濃度のことであり、片対数グラフの対数軸にサンプル濃度を、非対数軸（リニアー軸）に阻害率をプロットした後対数近似曲線を引き、ここから阻害率５０％のときのサンプル濃度を読み取ることによって求めた。ＩＣ５０値が低いほど阻害活性が高いことを示す。
【００４８】
サンプルのＡＣＥ阻害率測定の具体的な手順を示す。黒色９６ウェルプレートに、ＡＣＥを添加しないウェルには６６μＬのバッファー、ＡＣＥを添加するウェルには３１μＬのバッファーを入れた。次に、４μＬのサンプル溶液を加えよく撹拌した。サンプルを添加しない対照ウェルには４μＬの蒸留水を加えよく撹拌した。
続いて、ＡＣＥを添加するウェルには３５μＬのＡＣＥ溶液を加えよく撹拌した。ここで９６ウェルプレートを３７℃で３分間インキュベートし、続いてすべてのウェルにＡＣＥの基質であるヒプリルヒスチジルロイシン溶液を加え、よく攪拌した。
次にこの９６ウェルプレートを３７℃で３０分間インキュベートし酵素反応を行った。
その後、すべてのウェルに３５μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を加え攪拌し、酵素反応を停止した。
続いてすべてのウェルに１４μＬの０．２％ｏ−フタルアルデヒド溶液を加え攪拌し、４℃で１５分間反応させた後、５６μＬの１．５Ｍリン酸を加えてよく攪拌した。
この９６ウェルプレートを蛍光強度測定装置（パーキンエルマー社製Ｗａｌｌａｃ１４２０ＡＲＶＯｍｘ）を用いて、励起波長355nm、測定波長460nmで測定を行い、酵素反応の結果生じたHis-Leuの量を測定した。
【００４９】
なお、前記バッファーの組成は１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３であり、ＡＣＥ溶液はＡＣＥ（ブタ腎臓由来）を１０ｍＵとなるようバッファーに溶解したものであり、ヒプリルヒスチジルロイシン溶液はヒプリルヒスチジルロイシンを５ｍＭとなるようバッファーに溶解したものであり、０．２％ｏ−フタルアルデヒド溶液はｏ−フタルアルデヒドが０．２％となるようメタノールに溶解したものであり、サンプル溶液は、実施例１、比較例１、比較例２で得られた粉末を７０００μｇ/ｍＬ、３５００μｇ/ｍＬ、１７５０μｇ/ｍＬ、７００μｇ/ｍＬ、３５０μｇ/ｍＬとなるよう蒸留水に溶解したものおよびマレイン酸エナラプリルを１４０μｇ/ｍＬ、７０μｇ/ｍＬ、３５μｇ/ｍＬとなるよう蒸留水に溶解したものである。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２の結果から明らかなように、特定の穀類および豆類を麹菌によって消化することにより、抽出、分画といった操作をすることなく、高い活性を有するＡＣＥ阻害剤を得ることができた。したがって、これらのＡＣＥ阻害剤は血圧降下剤としても有用であることがわかる。なお、水抽出物はいずれもＡＣＥ阻害活性がきわめて低いため、上記の方法ではＩＣ５０値を求めることはできなかった。また、比較例２で得られたあまぎ二条大麦消化物はいずれのサンプル濃度でもＡＣＥ阻害活性が低く（１８％以下）、濃度依存性も見られなかったことからＩＣ５０値を求めることができず、活性なしとした。
また、表２に示される特定の穀物類または豆類は、いずれも安価に入手できるものであることから、これらの特定の穀類または豆類を材料とすることで、安全性の高いＡＣＥ阻害剤を多量に安価で得られることがわかる。
【００５２】
前記の穀類および豆類を麹菌によって消化することで、高い活性を有するＡＣＥ阻害剤が得られる理由について明確ではないが、例えば、前記穀類および豆類中には、麹菌の消化によってはじめてＡＣＥ阻害活性を発現する成分が多量に含まれており、これらの成分は水などを用いた抽出操作だけでは有効な阻害活性を発現できないことが考えられる。
【００５３】
（実施例４）
カプセル剤の調製
実施例１で調製した小豆の麹菌消化物４０重量部、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム３０重量部、結晶セルロース２０重量部、ビタミンＣ１０重量部の組成で混合し、ゼラチン製カプセル（サイズ：０２号、カプスゲル・ジャパン株式会社）に充填して、ＡＣＥ阻害剤を４０重量％含有する飲食用カプセル剤を調製した。
【００５４】
（実施例５）
クッキーの調製
実施例１で調製した小豆の麹菌消化物６重量部、無塩バター２５重量部、砂糖２２重量部、卵黄１２重量部、薄力粉３５重量部を混合し、直径４ｃｍ程度の円盤状に成形した後、オーブントースターで焼いて（１８０℃、１５分）、ＡＣＥ阻害剤約６重量％含有するクッキーを調製した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化して得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
麹菌による消化を食塩を添加しないで行う請求項１または２記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する飲食用組成物。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する医薬用または動物薬用組成物。
【請求項７】
キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化させる工程を有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項８】
麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う請求項７記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項９】
麹菌による消化を食塩を添加しないで行う請求項７または８記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項１０】
キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を滅菌したのち麹菌を接種して麹菌以外の微生物やその培養物の非存在下で製麹を行い、製麹後の穀類および／または豆類に食塩を含まない水を添加した条件下で消化を行う請求項７〜９いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項１】
キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化して得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
麹菌による消化を食塩を添加しないで行う請求項１または２記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する飲食用組成物。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する医薬用または動物薬用組成物。
【請求項７】
キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を麹菌によって消化させる工程を有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項８】
麹菌による消化を麹菌以外の微生物の非存在下で行う請求項７記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項９】
麹菌による消化を食塩を添加しないで行う請求項７または８記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【請求項１０】
キヌア、アマランサス、トラマメ、フジマメ、小豆、四角豆、大手亡、紫花豆、うずら豆、大福豆、およびナタマメからなる群より選ばれる１つ以上の穀類および／または豆類を滅菌したのち麹菌を接種して麹菌以外の微生物やその培養物の非存在下で製麹を行い、製麹後の穀類および／または豆類に食塩を含まない水を添加した条件下で消化を行う請求項７〜９いずれか１項記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【公開番号】特開２００８−２３９５２１（Ｐ２００８−２３９５２１Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７９８８４（Ｐ２００７−７９８８４）
【出願日】平成１９年３月２６日（２００７．３．２６）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２６日（２００７．３．２６）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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