アンタゴニストとして作用する、サイロトロピンレセプターに対するヒトモノクローナル抗体
本発明はＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離抗体を提供する。本発明はまた、本発明の抗体の使用法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサイロトロピン（ＴＳＨ）レセプター（ＴＳＨＲ）と反応する抗体に関し、限定はされないが、特に、ＴＳＨＲに結合して、ＴＳＨまたはＴＳＨＲ刺激性抗体によるＴＳＨＲへの刺激を阻害できる抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイロトロピン、すなわち甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、ＴＳＨＲを通して甲状腺機能を調節する下垂体ホルモンである（Szkudlinski MW, Fremont V, Ronin C, Weintraub BD 2002 Thyroid-stimulating hormone and TSHR structure-function relationships.
Physiological Reviews 82: 473-502）。ＴＳＨＲはＧタンパク質共役型レセプターであり、ロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ）、切断ドメイン（ＣＤ）、および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）の３つのドメインよりなる（Nunez Miguel R, Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Blundell TL, Rees Smith B, Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor- thyrotropin interaction by comparative modelling. Thyroid 14: 991-1011）。ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合により、甲状腺ホルモンであるサイロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）の形成および放出への刺激を導くレセプターシグナルを引き起こされる。循環しているＴ４およびＴ３の濃度に関わる負のフィードバックのメカニズムは下垂体からのＴＳＨの放出（および視床下部から分泌されるサイロトロピン放出ホルモン）を制御し、これが次に甲状腺刺激、および血清中の甲状腺ホルモンの濃度を制御する。
【０００３】
当該技術分野において、ある自己免疫性甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）の患者がＴＳＨＲと反応する自己抗体を有することはよく実証されている（Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121）。大部分の場合、これらの自己抗体はＴＳＨＲに結合してＴＳＨの作用を模倣することにより、甲状腺を刺激して高濃度のＴ４およびＴ３を産生する。これらの自己抗体は、刺激活性またはＴＳＨアゴニスト活性を有する、甲状腺刺激性自己抗体またはＴＳＨＲ自己抗体（ＴＲＡｂ）として記載されている。上述の甲状腺機能制御の生理的フィードバックメカニズムは、このような甲状腺刺激性自己抗体の存在下、および甲状腺機能亢進または甲状腺中毒症（血清中の過剰な甲状腺ホルモン）の徴候をもつ患者には有効でない。この疾患はグレーブス病として知られる。ある患者において、刺激活性のあるＴＲＡｂは後眼窩組織のＴＳＨＲとの相互作用に関与し、かつグレーブス病の目の徴候の一因となると考えられている。強力な甲状腺刺激剤として作用するヒトモノクローナル自己抗体（ｈＭＡｂであるＴＳＨＲ１）の詳細が、特許出願の国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載されている。
【０００４】
一方ＡＩＴＤのある患者においては、自己抗体はＴＳＨＲに結合してＴＳＨのレセプターへの結合を阻止するが、ＴＳＨＲへの刺激能はもたない。このタイプの自己抗体は遮断活性またはＴＳＨアンタゴニスト活性をもつＴＲＡｂとして知られており、血清中に遮断性のＴＲＡｂを有する患者は、不活発な甲状腺の症状（甲状腺機能低下症）を有し得る（Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121）。特に、妊婦の血清中に遮断活性を有するＴＲＡｂが存在すると、これが胎盤を通過して胎児の甲状腺ＴＳＨＲを遮断する場合があり、新生児甲状腺機能低下症および発育における重篤な結果を引き起こす。さらに、遮断活性を有するＴＲＡｂは発症した母親の母乳中に見出され、これが乳児の臨床的な甲状腺機能低下症のさらなる一因となり得る。現在までのところ、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有
する、ＴＳＨＲに対するヒトモノクローナル自己抗体は入手不可能である。従って、このタイプの自己抗体がどのようにＴＳＨＲと相互作用するか、およびそのＴＳＨＲとの相互作用が、刺激性の自己抗体（例えばＭ２２）およびＴＳＨとＴＳＨＲとの相互作用とどのように比較されるかについての詳細な研究は限られている。
【０００５】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、妊娠中に産生される、軽度の甲状腺刺激効果をもつホルモンである。
【０００６】
刺激活性または遮断活性によりＴＲＡｂの性質を特徴づけることは、ＴＳＨＲへの自己免疫反応に関連する疾患の診断および管理を改善することを目標とする研究において決定的に重要である。特許出願の国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載されている発明は、強力な刺激活性をもつヒトモノクローナル自己抗体の性質およびそのＴＳＨＲとの相互作用についての詳細を提供する。さらに、特許出願の国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号は、少なくとも１つの点突然変異を含む変異ＴＳＨＲ製剤を開示しており、これは患者血清刺激性ＴＳＨＲ自己抗体、患者血清遮断性ＴＳＨＲ自己抗体、およびスクリーニングされた患者体液サンプル中のＴＳＨの識別スクリーニングおよび同定に用いられる。特許出願の国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号はまた、ＴＳＨＲ遮断活性をもつマウスモノクローナル抗体（９Ｄ３３）について記載している。９Ｄ３３は高アフィニティー（２ｘ１０10Ｌ／ｍｏｌ）でＴＳＨＲに結合する、ＴＳＨ、ｈＭＡｂであるＴＳＨＲ１（Ｍ２２）、および刺激活性または遮断活性をもつ患者血清ＴＲＡｂの効果的なアンタゴニストである（特許出願国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号およびSanders J,
Allen F, Jeffreys J, Bolton J, Richards T, Depraetere H, Nakatake N, Evans M, Kiddie A, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Miguel RN, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2005 Characteristics of a monoclonal antibody to the thyrotropin receptor that acts as a powerful thyroid-stimulating autoantibody antagonist. Thyroid 15: 672-682）。このマウスモノクローナル抗体９Ｄ３３は、遮断活性をもつ患者血清ＴＲＡｂの特性の少なくとも幾つかを示すものの、これは実験動物をＴＳＨＲで免役することにより作られたマウス抗体であり、ヒトにおけるＴＳＨＲへの自己免疫反応過程で産生されるＴＳＨＲ自己抗体を真に表し得ない。マウスモノクローナル抗体として、９Ｄ３３はヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ応用のためにヒト化される必要がある。このことは、ヒト化の過程に関わる費用および複雑化を考慮すれば不利であり得る。
【０００７】
本発明は、患者血清中のＴＳＨおよび刺激性ＴＲＡｂの効果的なアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対するヒトモノクローナル自己抗体（５Ｃ９）の産生および特性に由来する。５Ｃ９は、甲状腺機能低下症および高濃度のＴＳＨＲ自己抗体を有する患者の末梢リンパ球から単離された。このリンパ球をエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）の感染により不死化させ、安定クローンを作製するために陽性クローンをマウス／ヒト細胞株と融合した。クローン培養の上清からＩｇＧを精製し、５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合能、およびＴＳＨＲ活性への影響を評価した。特に、ＴＳＨＲへのＴＳＨの結合の阻害、およびＴＳＨのサイクリックＡＭＰ刺激活性の阻害に対する５Ｃ９の能力について調べた。さらに、刺激性または遮断性の患者血清ＴＲＡｂのＴＳＨＲへの結合の阻害、およびそれらの生物活性の阻害に対する５Ｃ９の能力もまた評価した。加えて、ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨ、および関連化合物のアッセイにおける５Ｃ９の使用も検討した。５Ｃ９の、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の可変領域（Ｖ領域）の遺伝子の配列を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を特定した。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第一の態様によれば、ＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離されたヒト抗体が提供される。
【０００９】
本発明の第二の態様によれば、ＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離されたヒト化抗体が提供される。
【００１０】
本発明の第一または第二の態様いずれかによる抗体は、「本発明による抗体」である。
【００１１】
本発明による抗体は甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであってよい。
【００１２】
本発明による抗体は、ＴＳＨアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のＴＳＨアンタゴニスト特性を有してよい。
【００１３】
本発明による抗体は、ＴＳＨのアンタゴニストおよび甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであってよい。
【００１４】
本発明による抗体は、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のアンタゴニスト特性を有してよい。
【００１５】
本発明による抗体は、ＴＳＨ、Ｍ２２、またはＴＳＨＲへの刺激活性をもつ抗体または遮断活性をもつ抗体による、ＴＳＨＲまたはその一部への結合の阻害剤であってよい。ＴＳＨＲの一部はＬＲＤまたはその実質的な一部を含んでよい。好ましくは、このような結合を阻止する抗体である。
【００１６】
本発明による抗体は、モノクローナルもしくはリコンビナント抗体であってよいか、またはＴＳＨのアンタゴニストであるその断片を含むかもしくはその断片からなってよい。本発明による抗体は、図２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される１または２以上のＣＤＲ、またはこれらＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列を含むＶH領域を含んでよい。さらに、またはあるいは、本発明による抗体は図３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される１または２以上のＣＤＲ、またはこれらＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列を含むＶL領域を含んでよい。
【００１７】
本発明による抗体は、ヒト完全長ＴＳＨＲに対し、約１０10Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有してよい。本発明による抗体は、好ましくはヒト完全長ＴＳＨＲに対し、約１０9Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有する。
【００１８】
本発明は当業者が、刺激性および遮断性ＴＳＨＲ自己抗体の発生および産生を推進する免疫メカニズムを理解するのに役立つ。さらに、本発明は当業者が、ＴＳＨＲ自己抗体の甲状腺刺激活性を有するものと遮断活性を有するものの間の分子的相違を理解するのに役立つ。さらに、本発明の医学的治療法および薬理学的組成物は甲状腺関連疾患に対する新しい治療法を提供する。
【００１９】
本発明による好ましい抗体は５Ｃ９である。５Ｃ９は、甲状腺刺激ホルモンレセプターの恒常的活性、すなわち甲状腺刺激ホルモンまたはＭ２２の非存在下での試験システムにおけるサイクリックＡＭＰの産生を阻害することが予想外に見出された。これは特に、甲状腺内に残存、または転移した甲状腺癌細胞の治療、とりわけこれらの細胞が甲状腺刺激ホルモンレセプターの恒常的活性の結果としてさらに迅速に増殖し得る再増殖を防止または遅延させることに有利である。
【００２０】
ここで用いられる「抗体(単数形：antibody）」および類似語、例えば「抗体(複数形：antibodies）」の語は、状況に従い、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体のような免疫グロブリンを基礎とした結合部分を包含し、かつ当業者
によってこのような免疫グロブリンを基礎とした結合部分へ置換されてもよい結合部分、例えばドメイン抗体、二重特異性抗体、ＩｇＧΔＣH２、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶL、ＶH、ｄｓＦｖ、ミニボディ（Minibody）、トリアボディ（Triabody）、テトラボディ（Tetrabody）、（ｓｃＦｖ）2、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）3もまた包含する（Holliger P, Prospero T, Winter G 1993 "Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments" Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448.）、（Carter PJ 2006 "Potent antibody therapeutics by design" Nat Rev Immunol 6: 343-357）。
【００２１】
「ＴＳＨＲ」との語は、図４に示されるアミノ酸配列を有する完全長のヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター、またはその変異体または断片で、甲状腺刺激ホルモンレセプターとの高い相同性を有するものに適用される。好ましくはこのような変異体および断片は、図４に示されるアミノ酸配列と７０から９９．９％の相同性を有する。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、
ａ）本発明の第一の態様による抗体をコードするヌクレオチド配列；
ｂ）図２または３に示される抗体ＶHドメイン、抗体ＶLドメイン、またはＣＤＲのアミノ酸配列をコードする、図２または３に示されるヌクレオチド配列；または
ｃ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列と高い相同性を有し、かつ少なくとも約１０9Ｌ／ｍｏｌのアフィニティーでＴＳＨＲに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドが提供される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、上記本発明の態様によるヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２４】
該ベクターはプラスミド、ウィルスまたはその断片であってよい。当業者には多くの異なるタイプのベクターが知られている。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、本発明による抗体；ヌクレオチドまたは／ベクターを含む、単離細胞が提供される。該単離細胞は本発明による抗体を発現してよい。好ましくは、該単離細胞は本発明による抗体を分泌する。好ましくは、本発明による単離細胞は安定へテロ−ハイブリドーマ細胞株由来である。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、ＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含み、かつ本発明による抗体を含む組成物が提供される。このような組成物は、ＴＳＨアンタゴニスト活性をもつＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含んでよく、かつ本発明による抗体を含む。
【００２７】
あるいは、本発明のこの態様による組成物は、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであるＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含んでよく、かつ本発明による抗体を含む。組成物は、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである、ＴＳＨアンタゴニスト活性をもつＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含んでよく、かつ本発明による抗体を含む。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、甲状腺関連疾患の治療のために哺乳類被療体に投与するための、本発明による抗体を薬理学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。該甲状腺関連疾患は、甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択されてよい。
【００２９】
本発明による医薬組成物は、ヒトへの投与に適してよい。好ましくは本発明による医薬組成物は、被療体の免疫システムにおいて有意な有害作用をもたない。
【００３０】
本発明による医薬組成物は、さらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストを含んでよい。適切な、さらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストは、国際公開第２００４／０５０７０８号に開示されている９Ｄ３３である。
【００３１】
本発明による医薬組成物のために様々な形式が企図される。甲状腺関連疾患の治療における使用のための本発明による医薬組成物は、注射用の形式であってよい。前頚骨粘液水腫の治療における使用のための本発明による医薬組成物は、好ましくは局所用の形式である。グレーブス眼病の治療における使用のための本発明による医薬組成物は、好ましくは点眼薬の形式である。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、本発明の発明に従ったいずれかの抗体を、いずれかの薬理学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルと共に含む。本発明の医薬組成物に使用されてよい薬理学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルは、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンのような塩または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを基礎とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、経口で、吸入噴霧により非経口で、点眼薬により局所的に、経直腸、経鼻、口腔経由で、経膣で、または埋め込み型リザーバー経由で投与されてよい。好ましくは経口投与、または注射による投与である。ここで用いられる「非経口」との語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、包膜内、病巣内、および頭蓋内への注射または注入方法を含む。
【００３４】
該医薬組成物は、例えば水性または油性の無菌注射用懸濁液のような、無菌注射用製剤の形であってよい。この懸濁液は当該技術分野で公知の方法により、適切な分散剤または湿潤剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ８０)および懸濁剤を用いて処方されてよい。該無菌注射用製剤はまた、無毒性の非経口投与可能な希釈剤または溶媒、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての無菌注射用溶液または懸濁液であってよい。許容されるビヒクルおよび溶媒のうちで使用されてよいものは、マンニトール、水、リンゲル液および生理食塩水である。さらに、従来から、無菌の固定油が溶媒または懸濁化剤として使用されている。この目的のため、合成モノ−またはジグリセリドを含む、いずれの無菌性固定油も使用されてよい。オレイン酸のような脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブオイルまたはヒマシ油のような天然の薬理学的に許容される油、特にこれらのポリオキシエチル化された形として、注射液の製剤に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、Ph. Helvまたは類似アルコールのような長鎖アルコール希釈液または分散剤を含んでよい。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、および水性懸濁液および溶液を含むがこれらに限定されない、いずれかの経口に使用可能な剤形により経口投与されてよい。経口使用のための錠剤の場合、一般に用いられる担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセルの形による経口投与のための有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液を経口投与する場合、有効成分は乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。必要に応じ、特定の甘味料および／または香料および／または着色料が添加されてよい。
【００３６】
本発明の医薬組成物はまた、直腸内投与のための坐薬の形で投与されてよい。これらの
組成物は、本発明の化合物を適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製できる。この賦形剤は室温では固体であるが直腸温では液体であることにより、有効成分を放出するために直腸内で溶解し得る。このような物質はココアバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の医薬組成物の局所投与は、望ましい治療が局所投与により容易に利用できる部位または臓器に関わる場合に特に有用である。皮膚への局所投与のために該医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した有効成分を含む適切な軟膏剤により処方されなければならない。本発明の化合物の局所投与のための担体は、ミネラルオイル、鉱油、ホワイトペトロリアム（white petroleum）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水を含むがこれらに限定されない。あるいは該医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した有効成分を含む適切なローションまたはクリームにより処方できる。適切な担体は、ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を含むがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物はまた、直腸坐薬製剤または適切な浣腸製剤により下部腸管に局所投与されてよい。局所的な経皮パッチもまた、本発明に含まれる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入により投与されてよい。このような組成物は医薬品処方の技術分野における公知の方法により調製され、ベンジルアルコールまたはその他の適切な保存料、生物学的利用能を増強させるための吸収促進剤、フッ化炭素、および／またはその他の当該技術分野で公知の可溶化剤または分散剤を用いた、生理食塩水溶液として調製されてよい。
【００３９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による１または２以上の単離細胞を培養することにより該細胞が抗体を発現することを含む、本発明による抗体の産生方法が提供される。好ましくは、該抗体は該細胞により分泌される。
【００４０】
本発明のさらなる態様によれば、哺乳類被療体、または該被療体由来の細胞における甲状腺関連疾患の治療方法が提供され、該方法は該被療体、または該細胞を本発明による抗体に接触させることを含む。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、哺乳類被療体の甲状腺中のＴＳＨＲを刺激する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法が提供され、該方法は該被療体を本発明による抗体に接触させることを含む。好ましくは、甲状腺刺激性自己抗体のＴＳＨＲへの結合が阻止される。
【００４２】
本発明の他の態様によれば、哺乳類被療体の甲状腺外ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法が提供され、該方法は該被療体を本発明による抗体に接触させることを含む。該甲状腺外ＴＳＨＲは、該被療体の後眼窩組織および／または前頚骨組織に存在してよい。本発明による抗体は、該方法において使用される際、甲状腺外ＴＳＨＲに結合するＴＳＨＲ自己抗体を好ましく遮断する。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、甲状腺内にあるか、または転移した甲状腺癌を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法が提供され、該方法は細胞内の恒常的甲状腺刺激ホルモンレセプター活性を阻害するために、癌性細胞を本発明による抗体に接触させることを含む。好ましくは、甲状腺癌細胞の再増殖は阻止または遅延される。
【００４４】
恒常的な甲状腺活性による甲状腺活動亢進症を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法もまた提供され、該方法は恒常的な甲状腺活性による甲状腺
活動亢進を阻害するために、被療体または甲状腺細胞を本発明による抗体に接触させることを含む。
【００４５】
上記本発明の様々な方法において治療される被療体は、好ましくはヒトである。
【００４６】
本発明の他の態様によれば、甲状腺関連疾患の治療における本発明による抗体の使用が提供される。あるいは、甲状腺関連疾患の治療のための薬剤の調製における本発明による抗体の使用が提供される。
【００４７】
医学的治療における使用のための、本発明による抗体もまた提供される。特に、甲状腺関連疾患の治療における使用のための、本発明による抗体の使用が提供される。該甲状腺関連疾患は、甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択されてよい。
【００４８】
本発明の他の態様によれば、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの、試験されるＴＳＨＲ抗体の結合を決定することを含む、ＴＳＨＲ抗体を特徴付けるための方法が提供され、ここで該方法は本発明による抗体の使用を含む方法工程に関わる。好ましくは、該方法はＴＳＨＲ抗体の該ポリペプチドへの結合において、本発明による抗体の効果を決定することを含む。ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有する該ポリペプチドは、好ましくは完全長のヒトＴＳＨＲを含む。
【００４９】
本発明の他の態様によれば、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの、試験されるＴＳＨ、または関連分子の結合を決定することを含む、ＴＳＨおよび関連分子を特徴付けるための方法が提供され、ここで該方法は本発明による抗体の使用を含む方法工程に関わる。
【００５０】
上記のＴＳＨＲ抗体、またはＴＳＨを特徴付けるための方法および関連方法はＥＬＩＳＡ形式によるものであってよい。
【００５１】
本発明の他の態様によれば、アンタゴニストとして作用するＴＳＨＲ自己抗体の結合に関わるＴＳＨＲアミノ酸を決定する方法が提供され、該方法は、本発明による抗体が結合する第一のＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供すること、該ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果を抗体の結合において決定することを含む。
【００５２】
本発明による抗体を改変するための方法は、該抗体の少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果をＴＳＨＲ関連配列への結合において決定することを含む。改変ＴＳＨＲ抗体は、ＴＳＨＲに対する増強されたアフィニティーを有するものが好ましく選択される。
【００５３】
本発明の他の態様によれば、ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻害する分子を同定するための方法が提供され、該方法は、本発明による少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む。試験される分子は、ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻止するものが好ましく選択される。
【００５４】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻害する分子を同定するための方法もまた提供され、該方法は、本発明による少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む。好ましくは、ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻止する分子が選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
これより本発明による抗体および方法を、例としてのみの目的で、添付する図１から図４への参照により記述する。
【００５６】
【図１−１】ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２の結合における、グレーブス病の患者（ｎ＝４０）および健常血液ドナー（ｎ＝１０）からの血清の効果の比較を図示する一連の３グラフ。 ａ．125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−ＴＳＨ結合
【図１−２】ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２の結合における、グレーブス病の患者（ｎ＝４０）および健常血液ドナー（ｎ＝１０）からの血清の効果の比較を図示する一連の３グラフ。 ｂ．125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合
【図１−３】ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２の結合における、グレーブス病の患者（ｎ＝４０）および健常血液ドナー（ｎ＝１０）からの血清の効果の比較を図示する一連の３グラフ。 ｃ．125Ｉ−ＴＳＨ対125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合
【図２−１】５Ｃ９重鎖（ＨＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ａ．５Ｃ９ＨＣのオリゴヌクレオチド配列を、注釈なし、および注釈付きの形式で示す。注釈付きの形式では、ＰＣＲプライマーに使用した配列を下線で示し、個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）を四角で囲み、定常領域を太字で示す。
【図２−２】５Ｃ９重鎖（ＨＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ｂ．オリゴヌクレオチド配列由来の５Ｃ９ＨＣのアミノ酸配列を、注釈なし、および注釈付きの形式で示す。
【図３−１】５Ｃ９軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ａ．５Ｃ９ＬＣのオリゴヌクレオチド配列を、注釈なし、および注釈付き（図２の通り）の形式で示す。
【図３−２】５Ｃ９軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ｂ．オリゴヌクレオチド配列由来の５Ｃ９ＬＣのアミノ酸配列を、注釈なし、および注釈付きの形式で示す。
【図４】ヒトＴＳＨＲ（受入番号Ｐ１６４７３、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=62298994）のコンセンサスアミノ酸配列を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
方法
リンパ球分離およびヒトモノクローナルＴＳＨＲ自己抗体５Ｃ９のクローニング
モノクローナル自己抗体５Ｃ９は通常、国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載された方法を用いて分離した。リンパ球は最初に、産後甲状腺機能低下症で高濃度のＴＲＡｂを有する患者から集めた血液サンプルより分離した（地域の倫理委員会の承認を得た）。該リンパ球はエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）（European Collection of Cell Cultures - ECACC; Porton Down, SP4 OJG5,UK）に感染させ、国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載されているように、マウスマクロファージフィーダー層上で培養した。ＴＳＨＲ自己抗体を分泌する不死化リンパ球はマウス／ヒトのハイブリッド細胞株であるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＥＣＡＣＣ）と融合させ、単一コロニーを得るため、限界希釈による４回のクローニングを行った。クローニングの様々な段階における、細胞培養上清
中のＴＳＨＲ自己抗体の存在は、125Ｉで標識したＴＳＨのＴＳＨＲへの結合の阻害により検出した（国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号）。ＴＳＨＲ自己抗体を産生する単一クローンを増殖させ、自己抗体の精製のために培養上清を回収した。
【００５８】
５Ｃ９ＩｇＧ製剤の精製および標識化
５Ｃ９ＩｇＧは、Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Kiddie A, Brereton K, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Nunez Miguel R, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonal autoantibody
to the thyrotropin receptor: sequence structure and function. Thyroid 2004 14: 560-570に記載されている、MabSelect(商標）（GE Healthcare、英国）によるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養上清より精製し、純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により評価した。
【００５９】
５Ｃ９の重鎖アイソタイプは、放射拡散アッセイ（The Binding Site；バーミンガム、Ｂ２９ ６ＡＴ、英国）を用いて決定し、軽鎖のアイソタイプは、抗ヒトカッパ鎖、および抗ヒトラムダ鎖特異的マウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich Company Ltd；プール、英国）を用いたウェスタンブロッティングにより決定した。
【００６０】
２０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中における１０ｍｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧを、製造者（Perbio Science UK Ltd、クラムリントン、英国）の指示に従い調製した固定化ペプシンと共に、室温で４時間半、振とうしながらインキュベートした。その後、固定化ペプシンを遠心（１０００ｘｇ、室温で５分間）により除去し、上清を３００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対し、４℃においてオーバーナイトで透析した。５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2および少量のインタクトなＩｇＧを含む透析された混合物は、Sephacryl S-300 High Resolution Matrix（GE Healthcare、チャルフォント・セント・ジャイルズ、英国）を用いて分離した。この方法で精製された５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣゲルろ過分析での判断によればインタクトなＩｇＧを含まなかった。
【００６１】
さらにＦ（ａｂ’）2は、最終濃度１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−システインを用い、３７℃、１時間で還元した。この反応は、最終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミドにより、室温、３０分間で停止させた。Ｆ（ａｂ’）は、上記のようにSephacryl S-300カラムを用いて精製した。この方法で精製されたＦ（ａｂ’）製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣゲルろ過分析での判断によればＦ（ａｂ’）2を含まなかった。
【００６２】
さらに、５Ｃ９ＩｇＧをマーキュリーパパイン（Sigma、英国）により、１：１００の酵素／タンパク質の比において処理し、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０中へ透析し、Ｆａｂ製剤からインタクトなＩｇＧまたはＦｃを分離するため、陰イオン交換セファロース（GE Healthcareから入手したQ-Sepharose Fast flow）カラムを通した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過（Sephacryl S- 300カラム；上記）による分析は、該Ｆａｂ製剤中にインタクトなＩｇＧは検出されないことを示した。
【００６３】
５Ｃ９ＩｇＧは、Sanders J, Oda Y, Roberts S, Kiddie A, Richards T, Bolton J, McGrath V, Walters S, Jaskolski D, Furmaniak J, Rees Smith B 1999. The interaction of TSH receptor autoantibodies with 125I-labelled TSH receptor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1999 84: 3797-3802に記載されているように125Ｉにて標識するか、またはビオチンヒドラジド（Perbio Science、クラムリントン、英国）にて標識した。
【００６４】
125Ｉ−ＴＳＨまたは125Ｉ−Ｍ２２または125Ｉ−５Ｃ９のＴＳＨＲへの結合の阻害
国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号の記述に従い、ＴＳＨＲをコートしたチューブを用いて結合阻害アッセイを行った。このアッセイにおいて、１００μＬの試験サンプル（ＭＡｂ製剤、患者血清または非標識ＴＳＨ）および５０μＬの開始緩衝液（RSR Ltd）を、ＴＳＨＲをコートしたチューブ内で穏やかに振とうしながら、室温で２時間インキュベートした。吸引後チューブを洗浄し、１００μＬの125Ｉ−標識タンパク質（５ｘ１０4ｃｐｍ）を加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後チューブを吸引、洗浄し、ガンマカウンター中で計数した。
【００６５】
標識タンパク質の結合の阻害は以下のように算出した。
【数１】
コントロール物質は種々の実験結果に示すように、健常血液ドナー血清のプール、または個々の健常血液ドナー血清、またはその他の物質であった。
【００６６】
５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合のスキャッチャード解析
５０μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中の非標識５Ｃ９ＩｇＧおよび５０μＬの125Ｉ−標識５Ｃ９ＩｇＧ（アッセイ緩衝液中で３０，０００ｃｐｍ）を、ＴＳＨＲをコートしたチューブ内で振とうしながら、室温で２時間インキュベート（これらの条件下で最大の結合が生じた）、吸引し、１ｍＬのアッセイ緩衝液で２回洗浄し、ガンマカウンター中で計数した。結合定数を求めるため、結合したＩｇＧの濃度に対して結合濃度／遊離濃度をプロットした（Scatchard G 1949 The attraction of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences 51: 660-672）。
【００６７】
サイクリックＡＭＰ産生刺激の解析
５Ｃ９ＩｇＧおよびその他の製剤の、ヒトＴＳＨＲを導入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生の刺激能を、国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号の記述に従い試験した。細胞あたり約５ｘ１０4または約５ｘ１０5のＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルプレート内にウェルあたり３ｘ１０4細胞まき、ウシ胎仔血清を含まないＤＭＥＭ（Invitrogen Ltd、ペーズリー、英国）に適応させた後、試験サンプル（ＴＳＨ、ＩｇＧまたは患者血清）を加え（１ｇ／Ｌのグルコース、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、２２２ｍｍｏｌ／Ｌのシュクロース、１５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、および０．５ｍｍｏｌ／Ｌの３ イソブチル−１−メチルキサンチン
ｐＨ７．４を含み、ＮａＣｌを含まないハンクス緩衝塩溶液であるサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中に希釈して、１００μＬ）、３７℃で１時間インキュベートした。試験溶液の除去後、細胞を溶解し、ライセート中のサイクリックＡＭＰ濃度を以下の２つの方法のうちの１つによりアッセイした：１）GE Healthcare (チャルフォント・セント・ジャイルズ、英国)から入手したBiotrak enzyme immunoassay systemの使用、または２）Assay Designs; Cambridge Bioscience（英国）から入手したDirect Cyclic AMP Correlate-EIA kitsの使用。結果は、細胞ライセート（２００μＬ）中のサイクリックＡＭＰをｐｍｏｌ／ｍＬにより、または細胞ウェルあたりのｆｍｏｌにより表した。
【００６８】
アンタゴニスト（遮断）活性の測定
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞において、５Ｃ９ＩｇＧおよびその他の製剤が、ブタ（ｐ）ＴＳＨ、天然ヒト（ｈ）ＴＳＨ、およびリコンビナントヒト（ｒｈ）ＴＳＨ、ＭＡｂＭ２２、および患者血清ＴＲＡｂの刺激活性を阻害する能力を評価した。これは、ＴＳＨ、Ｍ２２、またはＴＲＡｂの刺激効果を５Ｃ９ＩｇＧ（またはその他の試験される製剤）
の非存在下および存在下において比較することにより行なわれた。アッセイは、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中に希釈した５０μＬの５Ｃ９（またはその他の試験される製剤）を細胞ウェルに加え、続いて５０μＬのＴＳＨまたはＭ２２または患者血清（サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中に適宜希釈）を加えること以外は上記のように行なわれ、上記の刺激アッセイと同様にインキュベートおよび試験された。
【００６９】
５Ｃ９に加え、その他のＭＡｂおよび遮断性ＴＲＡｂをもつ患者由来の血清がこのアッセイにおいて試験された。
【００７０】
可変領域遺伝子解析
５Ｃ９重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子は国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号の記述に従い、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）反応のためのｍＲＮＡを作製するため、５Ｃ９ＩｇＧを分泌する１ｘ１０7のヘテロハイブリドーマ細胞から調整した全ＲＮＡを用いて決定した。ＩｇＧ１ＨＣおよびカッパＬＣに特異的なセンスおよびアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーは、Medical Research CouncilのV-base（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）を用いてデザインし、Invitrogen（ペーズリー、ＰＡ４ ９ＲＦ、英国）により合成した。ＲＴ反応は５０℃１５分間で行い、それに続いて９４℃１５秒間、５０℃３０秒間、および７２℃３０秒間で４０サイクルのＰＣＲを行なった。ＤＮＡ産物はｐＵＣ１８中にクローニングし、Sanger-Coulson法によりシークエンスした（Sanger
F, Nicklen S, Coulson AR 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors.
Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 74: 5463-5467）。Ｖ領域の配列は、Ig blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いて、入手できるヒトＩｇ遺伝子の配列と比較した。
【００７１】
ヒトＴＳＨＲ配列のアミノ酸変異の、５Ｃ９活性における効果の解析
ＴＳＨＲ配列中に特異的変異を導入するために使用された方法は、特許出願の国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されている。さらに、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを用いたＣＨＯ細胞への変異ＴＳＨＲコンストラクトのトランスフェクションもまた、国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されている。
【００７２】
野生型または変異ＴＳＨＲのいずれかを発現するＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートにまき、５Ｃ９製剤がＴＳＨ、Ｍ２２、または患者血清ＴＲＡｂの刺激活性を遮断する能力を試験するため上記のように使用した。
【００７３】
ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨおよび関連分子のための５Ｃ９に基づいたアッセイ
２．５５ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧを１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中に透析し、ＩｇＧのビオチンに対する分子比１／１０により、EZ-Link NHS-LC-Biotin（Perbio）と反応させた。試験血清サンプル（７５μＬ）を、ＴＳＨＲをコートしたＥＬＩＳＡプレートウェル（RSR Ltd）中で振とう（１分間に５００振とう）しながら、室温で２時間インキュベートした。試験サンプルを除去および洗浄した後、ビオチン標識５Ｃ９ＩｇＧ（１００μＬ中に２ｎｇ）を加え、インキュベーションを室温で２５分間、振とうなしで継続した。ウェルを空にし、洗浄して１００μＬのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（１００μＬ中に１０ｎｇ；RSR Ltd）を加え、室温で２０分間、振とうなしでインキュベートした。その後ウェルを３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；１００μＬ；RSR Ltd）を加え、暗所において室温で３０分間、振とうなしでインキュベートした。その後反応を停止させるため５０μＬの０．５ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、各プレートウェルの吸光度を４５０ｎｍにて読み取った。５Ｃ９ＩｇＧ−ビオチン結合の阻害は、以下のように算出した。
【数２】
【００７４】
結果
５Ｃ９分泌細胞株の単離およびクローニング
２０ｍＬの患者血液から得られたリンパ球（２７ｘ１０6）にＥＢＶを感染させ、４８ウェルプレート内のマウスマクロファージフィーダー層上に、ウェルあたり１ｘ１０6の細胞をまいた。ＥＢＶ感染後１３日目に、プレートウェルの上清の、125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害についてモニターした。陽性ウェルからの細胞を増殖させ、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５ハイブリドーマ細胞株と融合し、９６ウェルプレートにまいた。125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害活性をもつ抗体を安定に産生する１クローンを得て、４回再クローニングした。ヘテロ−ハイブリドーマ培養上清から精製され、５Ｃ９と名付けられたモノクローナル抗体は、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１のサブクラスである。
【００７５】
５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合および遮断活性
様々な濃度における５Ｃ９ＩｇＧの、標識ＴＳＨまたは標識Ｍ２２または標識５Ｃ９それ自体のＴＳＨＲへの結合に対する阻害能を表１に示す。表１に示すように、最少量０．００５μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧによって125Ｉ−ＴＳＨ結合の１２％の阻害が認められ、この阻害は１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９による８４％の阻害に至るまで量依存性に増大した。これはドナー血清ＩｇＧによる125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害、すなわち０．０５ｍｇ／ｍＬにおける１３％の阻害から、１ｍｇ／ｍＬにおける９４％の阻害までの量依存的な増大と比較することができる。ドナー血漿の場合、健常人血液ドナープール血清の１：１６０希釈においては125Ｉ−ＴＳＨ結合の１６％の阻害が認められ、１：１０希釈においては９５％の阻害が認められた。
【００７６】
５Ｃ９ＩｇＧはまた、ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの結合に対する効果を有していた（表１）。０．０１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧによって、125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合の９％の阻害が認められ、濃度を増大させることにより、１００μｇ／ｍＬにおける８５％に至るまでの阻害の量依存的な増大がもたらされた。ドナー血清ＩｇＧは、９％の阻害を起こす０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて有効であり、この効果は１ｍｇ／ｍＬにおける８９％の阻害まで量依存的に増大した。ドナー血清血漿は、１：３２０の希釈において125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合の１３％の阻害を示し、１：１０の希釈において９１％の阻害を示した。
【００７７】
非標識５Ｃ９ＩｇＧは、ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９の結合を量依存的に阻害（０．００５μｇ／ｍＬにおける１１％の阻害から、１００μｇ／ｍＬにおける８８％の阻害まで）（表１−２）することができた。125Ｉ−５Ｃ９の結合はまた、ドナー血清ＩｇＧによっても阻害（０．０５ｍｇ／ｍＬにおける１５％の阻害、および１ｍｇ／ｍＬにおける９１％の阻害）され、同様にドナー血漿の希釈によっても阻害（１：３２０希釈における１０％の阻害、および１：１０希釈における９２％の阻害）された。
【００７８】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨおよびＭ２２を介したサイクリックＡＭＰの刺激に対する、５Ｃ９ＩｇＧの遮断能を表２ａ−ｃに示す。ブタＴＳＨ（３ｎｇ／ｍＬ）は、サイクリックＡＭＰ産生を強力に刺激した（１９，０２０±２１５４ｆｍｏｌ／細胞ウェル；平均±ＳＤ；ｎ＝３）（表２ａ）。０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在で、ブタＴＳＨの刺激活性は１１８７４±４２１４ｆｍｏｌ／細胞ウェル（平均±ＳＤ；ｎ＝３）まで減少し、かつ１μｇ／ｍＬの５Ｃ９の存在下ではわずかに２，２０８±３２
９ｆｍｏｌ／細胞ウェルのサイクリックＡＭＰが産生されたことから、この阻害効果は５Ｃ９濃度に依存していた（表２ａ）。リンパ球ドナー血清もまた、ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰ刺激の強力な阻害効果を有していた。表２ａに示すように、サイクリックＡＭＰ産生は血清非存在下での１９０００ｆｍｏｌ／細胞ウェルに比較して、１：１０希釈のドナー血清（この希釈における全血清ＩｇＧ濃度は１．４３ｍｇ／ｍＬ）存在下では約６０００ｆｍｏｌ／細胞ウェルへ減少する阻害が生じた。この効果は、約０．３７μｇ／ｍＬの精製５Ｃ９ＩｇＧによる効果に一致していた（表２ａに示す、様々な濃度の５Ｃ９ＩｇＧによる効果の希釈曲線から算出した）。このことは、ＴＳＨのサイクリックＡＭＰ産生刺激能を遮断する能力に関して、精製５Ｃ９ＩｇＧはドナー血清ＩｇＧよりも約３９００倍強い活性があることを示している。
【００７９】
５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2および５Ｃ９Ｆａｂのような５Ｃ９の断片もまた、ＴＳＨ刺激の有効な阻害剤であった。特に、１００μｇ／ｍＬにおける５Ｃ９ＩｇＧ、５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2、および５Ｃ９ＦａｂのＴＳＨ刺激阻害活性は同等であった（表２ｂ）。１０μｇ／ｍＬにおける３種の全ての製剤、すなわち５Ｃ９ＩｇＧ、５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2、および５Ｃ９ＦａｂもまたＴＳＨ刺激活性の強力な阻害剤であったが、５Ｃ９ＩｇＧは５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2または５Ｃ９Ｆａｂよりもさらに効果的と考えられた（表２ｂ）。
【００８０】
Ｍ２２Ｆａｂ（３ｎｇ／ｍＬ）はサイクリックＡＭＰの強力な刺激剤である（９，４３２±８２２ｆｍｏｌ／細胞ウェル）（表２ｃ）。５Ｃ９の存在下でのＭ２２Ｆａｂの刺激効果は量依存的に阻害され、０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下でのサイクリックＡＭＰ濃度は１，２９８±１３４ｆｍｏｌ／細胞ウェルに減少した。Ｍ２２刺激の完全な阻害は、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９により生じた（表２ｃ）。
【００８１】
スキャッチャード解析は、ＴＳＨＲに結合する125Ｉ−標識５Ｃ９の結合定数は４ｘ１０10Ｌ／ｍｏｌであることを示した。
【００８２】
ＴＳＨＲへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合の、血清ＴＲＡｂによる阻害
ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧの結合に対する血清ＴＲＡｂの阻害能を表３および図１に示す。125Ｉ−ＴＳＨの結合および125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの結合に対する同じ血清ＴＲＡｂの効果もまた、比較のために示した。
【００８３】
125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合は、１０名の異なる健常血液ドナー（Ｎ１−Ｎ１０、表３）からの血清によって、明らかには阻害されなかった（阻害範囲は３．４−１８．９％）。125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２の阻害アッセイ（表３）において、全てがＴＳＨＲ自己抗体陽性であるグレーブス病の患者４０名（Ｇ１−Ｇ４０、表３）からの血清は、ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９の結合に対して健常血液ドナーからの血清よりも程度の大きな阻害を示した（阻害範囲は２２．０−８５．２％）（表３）。ＴＳＨＲに対する125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの結合に対する患者血清ＴＲＡｂの阻害能は、ピアソン相関係数ｒ＝０．９５（125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−ＴＳＨ；図１ａ）およびｒ＝０．９５（125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ；図１ｂ）で、同程度であった。図１ｃは、同血清による125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの阻害の比較を示す（ピアソン相関係数ｒ＝０．９９）。
【００８４】
これらの実験は、ＴＳＨＲへの５Ｃ９ＩｇＧ結合が血清ＴＲＡｂによって効果的に阻害されること、および５Ｃ９ＩｇＧ結合における血清ＴＲＡｂの阻害効果は、ＴＳＨまたはＭ２２結合におけるこれらの阻害効果に類似していることを示している。
【００８５】
表４は、ＴＳＨ遮断活性を有する患者血清ＴＲＡｂ（Ｂ１−Ｂ５）および強力な甲状腺
刺激活性を有する患者血清ＴＲＡｂ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４）の様々な希釈による、125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合の阻害を示す。125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合は、血清Ｂ１−Ｂ５により、同様に血清Ｓ１、Ｓ２、およびＳ４により量依存的に阻害された。同遮断性および刺激性血清はまた、125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合を量依存的に阻害し、さらに３種の全ての標識リガンドに対する阻害のパーセンテージは血清の同希釈において同程度であった（表４ａおよびｂ）。
【００８６】
これらの結果は、刺激活性および遮断活性の両方を有するＴＳＨＲ自己抗体は、ＴＳＨＲへの５Ｃ９結合を阻害することを示している。
【００８７】
ＴＳＨ結合阻害活性を有するマウスＭＡｂによる、ＴＳＨＲへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合の阻害
125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性をもつ様々なマウスＴＳＨＲＭＡｂの、ＴＳＨＲへの125Ｉ−５Ｃ９結合の阻害能を試験し、125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合における効果と比較した（表５）。表５に示すように、125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合に対する阻害能を有する全てのＭＡｂは125Ｉ−５Ｃ９結合もまた阻害したが、幾つかのＭＡｂの場合、125Ｉ−５Ｃ９および125Ｉ−Ｍ２２結合における阻害効果は125Ｉ−ＴＳＨ結合における阻害効果よりも弱かった。
【００８８】
これらの実験は、ＴＳＨＲ上の５Ｃ９に対する結合部位と、ＴＳＨ結合の阻害能を有するマウスＴＳＨＲＭＡｂに対する結合部位の間にかなりの重複があることを示唆している。
【００８９】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における、患者血清によるサイクリックＡＭＰの産生刺激に対する５Ｃ９ＩｇＧの効果
表２に示すように、５Ｃ９ＩｇＧはＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内のサイクリックＡＭＰ濃度に関するＴＳＨまたはＭ２２の刺激を遮断することができた。一連の異なる実験において、患者血清ＴＲＡｂの刺激活性における５Ｃ９ＩｇＧの効果を試験した。その結果を表６ａに示す。血清Ｔ１−Ｔ９およびＴ１１−Ｔ１８はＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞内のサイクリックＡＭＰ産生を刺激し、コントロールＭＡｂＩｇＧ（ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに特異的な２Ｇ４）とのインキュベーションはそれらの刺激活性への影響をもたなかった。しかしながら、５Ｃ９ＩｇＧ（２００μｇ／ｍＬを５０μＬ）の存在下では、試験された全ての血清の刺激活性は明らかに減少した（表６ａ）。
【００９０】
６種の異なる血清（Ｔ１、Ｔ６、Ｔ３、Ｔ１９、Ｔ２０、Ｔ２１）の量反応効果を表６ｂ−ｇに示す。これらの実験において、０．１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度の５Ｃ９ＩｇＧは血清の刺激活性の量依存的減少を起こし、５Ｃ９ＩｇＧの効果は血清Ｔ３を除く全ての試験された血清において、遮断活性をもつＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体９Ｄ３３（国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載）の効果と同程度であった。Ｔ３血清の場合（表６ａおよび６ｄ）、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下においてサイクリックＡＭＰ産生の約５０％の阻害が観察されたが、１００μｇ／ｍＬの９Ｄ３３ＩｇＧはほとんど完全な阻害をもたらした。このことは、５Ｃ９および９Ｄ３３によって認識されるエピトープの間に、ある小さな違いがある可能性を示唆した。
【００９１】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ産生における５Ｃ９ＩｇＧの効果
ＴＳＨおよびＴＳＨＲ抗体の刺激活性の阻害と同様に、５Ｃ９はこれらの甲状腺刺激剤の非存在下で産生されるサイクリックＡＭＰの量を阻害した。特に表６ｂは、１００μｇ／ｍＬのコントロールモノクローナルＩｇＧ（２Ｇ４）の存在下で産生された１２０７±
１２３ｆｍｏｌ／細胞ウェルのサイクリックＡＭＰが、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下で３０１±３８ｆｍｏｌ／細胞ウェルに減少したことを示している。９Ｄ３３ＩｇＧの効果は、１００μｇ／ｍＬの９Ｄ３３ＩｇＧの存在下での７２１±１８３ｆｍｏｌ／細胞ウェルの産生より、少なかった。表６ｄ、６ｅ、６ｆおよび６ｇに示す別々の実験において同様の結果が得られた。このことは、５Ｃ９ＩｇＧがＴＳＨＲの基本的、または恒常的活性において著しい効果を有することを示している。
【００９２】
アミノ酸変異を含むＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内サイクリックＡＭＰの産生刺激における５Ｃ９ＩｇＧの効果
ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞内でのブタＴＳＨのサイクリックＡＭＰ刺激活性に対する５Ｃ９の遮断能における、ＴＳＨＲの単一アミノ酸変異の効果を表７に示す。特に以下の残基：Ｌｙｓ５８、Ｉｌｅ６０、Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ｔｈｒ１０４、Ａｒｇ１０９、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３４、Ａｓｐ１５１、Ｌｙｓ１８３、Ｇｌｎ２３５、Ａｒｇ２５５、Ｔｒｐ２５８、Ｓｅｒ２８１をアラニンに変異させたＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞において、サイクリックＡＭＰ産生刺激に対する５Ｃ９の効果を調べた。さらに、ＴＳＨＲの残基：Ａｒｇ８０Ａｓｐ、Ａｓｐ１５１Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８３Ａｓｐ、Ａｒｇ２５５Ａｓｐの事例において、電荷の変化による変異（change of charge mutation）の効果を調べた。ここでは従来の表記法に従い、置換されたアミノ酸残基、およびその一次配列ポリペプチド内の位置を置換アミノ酸残基の前に示す。以前の研究は、ＴＳＨＲの電荷の変化による変異（change of charge mutation）であるＡｓｐ１６０ＬｙｓはＴＳＨＲのＴＳＨに対する反応性の喪失の原因となったが、Ｍ２２に対する反応は影響されなかったことを示している（特許出願国際公開第ＷＯ２００６／０１６１２１Ａ号）。従って、５Ｃ９の生物活性におけるＴＳＨＲのＡｓｐ１６０Ｌｙｓ変異の効果は、Ｍ２２をＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるサイクリックＡＭＰ刺激剤として使用することにより調べられた（表７１）。
【００９３】
研究された全てのＴＳＨＲ変異のうち、３種の変異のみがアンタゴニストとして作用する５Ｃ９の能力に影響することが見出された。Ｌｙｓ１２９のＡｌａへの変異（表７ｈ）は、サイクリックＡＭＰ産生のＴＳＨによる刺激を遮断する５Ｃ９ＩｇＧの能力の完全な喪失をもたらした。
【００９４】
ＴＳＨＲ変異であるＬｙｓ１８３Ａｌａもまた、５Ｃ９ＩｇＧの遮断活性の部分的な減少の原因となった。試験の際、１μｇ／ｍＬにおいてＴＳＨＲのＬｙｓ１８３Ａｌａ変異ではＴＳＨ刺激の２８％の阻害が観察され、これは野生型ＴＳＨＲによる８４％の阻害と比較される（表７ｍ）。１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧにおいても、ＴＳＨＲのＬｙｓ１８３Ａｌａ変異を用いた実験ではＴＳＨ刺激の部分的な阻害（４３％）のみが検出されたが、野生型レセプターを用いた実験においては、同濃度においてＴＳＨ刺激活性の完全な遮断（９３％）が観察された(表７ｍ)。陽性荷電のＬｙｓ１８３を陰性荷電のアスパラギン酸に変異させると、５Ｃ９の生物活性における効果はＬｙｓ１８３Ａｌａ変異によって観察されたそれに類似した(表７ｍ）。このことは、Ｌｙｓ１８３が５Ｃ９の生物活性に重要であることを示唆している。Ａｓｐ１５１Ａｌａ変異の場合、５Ｃ９ＩｇＧ遮断活性のわずかな減少；１μｇ／ｍＬにおいて、野生型による８８％の遮断と比較して４９％の阻害が観察された(表７ｊ)。しかしながら１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下では、この活性は野生型のＴＳＨＲによるものと同等であった。陰性荷電のＡｓｐ１５１を陽性荷電のアルギニンに変異させると、５Ｃ９ＩｇＧ遮断活性の有意な減少は観察されなかった（表７ｋ）。
【００９５】
５Ｃ９活性におけるＴＳＨＲ変異の効果は、９Ｄ３３活性におけるＴＳＨＲ変異の効果と比較できる。特許出願国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されているように、ＴＳＨＲのＬｙｓ５８、Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ａｒｇ１０９、Ｌｙｓ１２９および
Ｐｈｅ１３４の変異は、９Ｄ３３活性における効果を有していた。しかしながらＬｙｓ１２９を除いたこれらの変異のいずれもまた、５Ｃ９活性における効果を有してはいなかった。さらに、特許出願国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されているようなＭ２２活性に影響する変異（Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ｇｌｕ１０７，Ａｒｇ１０９，Ｌｙｓ１２９，Ｐｈｅ１３０、Ｌｙｓ１８３、Ｔｙｒ１８５、Ａｒｇ２５５およびＴｒｐ２５８）であるＬｙｓ１２９を除いたこれらの変異のいずれも、５Ｃ９活性には影響しなかった。さらに、Ｌｙｓ１８３変異は５Ｃ９活性およびＭ２２活性において部分的効果を有していたが、９Ｄ３３活性における効果は有していなかった。
【００９６】
これらの結果は、甲状腺刺激性ヒト自己抗体Ｍ２２、マウス遮断性抗体９Ｄ３３、およびヒト遮断性自己抗体５Ｃ９との相互作用に重要なＴＳＨＲ残基は異なっていることを示している。従って、５Ｃ９とアンタゴニスト活性をもつその他のＴＳＨＲ抗体（例えば９Ｄ３３）との組み合わせは、患者血清ＴＲＡｂ、その他の刺激剤による刺激活性および／またはＴＳＨＲの恒常的活性を阻害するための特に有効な手段となり得る。
【００９７】
５Ｃ９の可変領域配列
５Ｃ９をコードする遺伝子の配列解析は、ＨＣのＶ領域遺伝子はＶＨ３−５３ファミリー由来、Ｄ遺伝子はＤ２−２ファミリー由来、およびＪ遺伝子はＪＨ４ファミリー由来であることを示した。ＬＣの場合、Ｖ領域遺伝子はＯ１２ファミリー由来、およびＪ領域遺伝子はＪＫ２の生殖系列由来であった。ＨＣのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図２ａおよび２ｂそれぞれに示され、ＬＣのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図３ａおよび３ｂそれぞれに示される。
【００９８】
生殖系列配列と比較して、ＨＣ遺伝子配列には体細胞変異、特にＦＷＲ１には１個のサイレント変異、ＣＤＲ２には２個の置換変異、ＣＤＲ３には１個のサイレント変異および１個の置換変異、およびＦＷＲ４には１個のサイレント変異が存在する。しかしながらＨＣのＶ領域配列は２個の挿入、すなわちＶおよびＤ遺伝子の間の長さ６塩基対の１個、および、ＤおよびＪ遺伝子の間の長さ１５塩基対の１個により特徴付けられる。従って、ＨＣのＣＤＲ１は長さ５アミノ酸、ＣＤＲ２は長さ１６アミノ酸、およびＣＤＲ３は長さ１８アミノ酸となる(図２ｂ）。
【００９９】
ＬＣ配列では、ＦＷＲ１には１個のサイレント変異、ＣＤＲ１には１個の置換変異、ＣＤＲ３には１個の置換変異、および、ＶおよびＪ遺伝子の間に長さ６塩基対の１個の挿入が存在する。ＬＣのＣＤＲ１は１１アミノ酸、ＣＤＲ２は７アミノ酸、およびＣＤＲ３は１０アミノ酸よりなる(図３ｂ）。
【０１００】
ＴＳＨまたはＴＲＡｂ検出のための５Ｃ９に基づくアッセイ
ＴＳＨＲ自己抗体を検出するための、ＴＳＨＲをコートしたプレートウェルへの５Ｃ９ＩｇＧ−ビオチン結合に基づいたＥＬＩＳＡの例を表８に示す。このアッセイにおいて、ＴＳＨ−ビオチン結合の阻害に対して陽性の全てのサンプルは、５Ｃ９ＩｇＧ−ビオチン結合に対してもまた陽性であった。さらに、吸光度シグナル、パーセント阻害、および組立単位／Ｌ値は、ＴＳＨ−ビオチンおよび５Ｃ９−ビオチンアッセイの間で同程度であった(表８）。
【０１０１】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞へのマウス甲状腺刺激性モノクローナル抗体(マウスＴＳＨＲＭＡｂ；ＴＳＭＡｂ）の刺激活性に対する５Ｃ９ＩｇＧの効果
表９に示すように５Ｃ９ＩｇＧは、試験された５種の全てのＴＳＭＡｂ（１，２，４，５および７）によるサイクリックＡＭＰ産生の刺激を遮断することができた。例えばＴＳＭＡｂ１(表９)により刺激されたサイクリックＡＭＰの濃度は１８．９４±７．４ｐｍｏｌ／ｍＬであったが、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下ではわずかに１．２４±
０．０７ｐｍｏｌ／ｍＬのサイクリックＡＭＰが産生された。これは、１００μｇ／ｍＬのコントロールＭＡｂ２Ｇ４の存在下でのサイクリックＡＭＰの濃度である、１６．５±１．１ｐｍｏｌ／ｍＬと比較することができる(表９)。
【０１０２】
以下の表９、同様に表１０−１５に示すサイクリックＡＭＰ濃度はｐｍｏｌ／ｍＬで表している。すなわち、細胞ウェルあたりのサイクリックＡＭＰの量はｐｍｏｌ／ｍＬ÷５（アッセイされた各ウェルからのサンプル２００μＬを表す）である。
【０１０３】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞への天然ヒトＴＳＨおよびリコンビナントヒトＴＳＨの刺激活性に対する５Ｃ９ＩｇＧの効果
ブタＴＳＨによるサイクリックＡＭＰ刺激を遮断する５Ｃ９ＩｇＧの能力を、表２および表１０に示す。さらに、５Ｃ９ＩｇＧは天然ヒトＴＳＨ（NIBSC reference preparation 81/565 from National Institute for Biological Standards and Control, South Mimms, Potters Bar EN6 3QG UK）およびリコンビナントＴＳＨ（NIBSC reference preparation 94/674）両者のサイクリックＡＭＰ刺激に対する阻害能を示した(表１０）。特に１００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントまたは天然ヒトＴＳＨいずれかによるサイクリックＡＭＰ産生刺激は、サイクリックＡＭＰ産生の完全な阻害を得るために０．１−１．０μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧを要求する。５Ｃ９分離のための血液採集時におけるドナー血清中の循環ＴＳＨ濃度は１６０ｍＵ／Ｌ（約３２ｎｇ／ｍＬ）であり、得られた結果(表２ａおよび表１０）は、この濃度の循環ＴＳＨは血清中の３２−３２０ｎｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在により完全に遮断され得ることを示している。ドナー血清中のＴＳＨＲ自己抗体の濃度は、ＴＳＨＲへの125Ｉ−Ｍ２２結合の阻害（Nakatake N, Sanders J, Richards T, Burne P, Barrett C, Dal Pra C, Presotto F, Betterle C, Furmaniak J, Rees Smith
B 2006 Estimation of serum TSH receptor autoantibody concentration and affinity. Thyroid 16: 1077-1084に記載されているように）を用いることにより１７００ｎｇ／ｍＬ（１２０ｎｇ／ｍｇ）と推定された。これはすなわち、ＴＳＨによる甲状腺刺激の遮断に要求される５Ｃ９の濃度よりも数倍高めである。
【０１０４】
活性化変異であるＳ２８１Ｉ、Ｉ５６８ＴおよびＡ６２３ＩをもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性における５Ｃ９ＩｇＧの効果
５Ｃ９ＩｇＧは、甲状腺活性化剤（すなわちＴＳＨまたはＴＳＨＲ抗体）の非存在下で、活性化変異をもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内で産生されるサイクリックＡＭＰの量を減少させることができた。表１１ａに示すように、活性化変異であるＳ２８１ＩをもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内の基本的なサイクリックＡＭＰ濃度は５Ｃ９の非存在下で９．９０±１．５１ｐｍｏｌ／ｍＬであり、これは０．０１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下で４．１７±０．６０ｐｍｏｌ／ｍＬに減少し、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下で３．４４±０．６３ｐｍｏｌ／ｍＬに減少した。遮断性マウスＴＳＨＲＭＡｂ９Ｄ３３は、コントロールＭＡｂ２Ｇ４と同程度のわずかな効果を有した（表１１ａ）。
【０１０５】
２１．３９±５．３１ｐｍｏｌ／ｍＬの基本的なサイクリックＡＭＰ濃度を示す、ＴＳＨＲ活性化変異のＩ５６８Ｔによって同様の結果が得られた（表１１ｂ）。これは１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの添加によって５．２９±０．７５ｐｍｏｌ／ｍＬに減少し、２Ｇ４ＩｇＧ、および５Ｃ９ＩｇＧを添加した場合の、２０．５２±０．９５ｐｍｏｌ／ｍＬ、および２１．６５±１．９９ｐｍｏｌ／ｍＬそれぞれと比較される。３６．８９ｐｍｏｌ／ｍＬの基本的なサイクリックＡＭＰ濃度を有する、研究された第３のＴＳＨＲ活性化変異であるＡ６２３Ｉの場合は、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの添加によりサイクリックＡＭＰ濃度は１６．４３±１．２７ｐｍｏｌ／ｍＬに減少し、これは１μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧである２Ｇ４によるわずかな効果（２８．９６±２．２９ｐｍｏｌ／ｍＬ）または１μｇ／ｍＬの９Ｄ３３ＩｇＧ（４０．０９±７．７３ｐｍｏｌ／ｍＬ）と比較
される（表１１ｃ）。
【０１０６】
これらの結果は、５Ｃ９はマウス遮断性ＭＡｂの９Ｄ３３とは異なり、たとえＴＳＨＲ活性化変異がＴＳＨＲの異なる部分に存在していても（すなわち、Ｓ２８１Ｉは細胞外ドメインにあり、Ｉ５６８Ｔは膜貫通ドメインの２番目の細胞外ループにあり、かつＡ６２３Ｉは膜貫通ドメインの３番目の細胞内ループにある）、これらの変異に関連したサイクリックＡＭＰ産生において著しい効果を有することを示している。
【０１０７】
野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する、５Ｃ９およびマウスＴＳＨＲ遮断性モノクローナル抗体９Ｄ３３およびこれら２種の抗体の混合物の効果の比較
前記の実験および表１２に示すように、低くとも１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＴＳＨＲ遮断性ＭＡｂ５Ｃ９およびマウスＴＳＨＲ遮断性ＭＡｂ９Ｄ３３は、ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるＴＳＨのＴＳＨＲサイクリックＡＭＰ刺激活性に対する遮断能を有する。表１２の実験１−５に示すように、ＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰの刺激に対する９Ｄ３３ＩｇＧおよび５Ｃ９ＩｇＧの効果は相加的であった。刺激に２つの異なった濃度のＴＳＨ（３ｎｇ／ｍＬおよび０．３ｎｇ／ｍＬ）を用いた際、同じ相加的効果が観察された（表１２；実験１−３および実験４および５の各実験）。
【０１０８】
野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＭ２２を介したサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する、５Ｃ９およびマウスＴＳＨＲ遮断性モノクローナル抗体９Ｄ３３およびこれら２種の抗体の混合物の効果の比較
以前に示したように、５Ｃ９および９Ｄ３３は、ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるＭ２２Ｆａｂを介したサイクリックＡＭＰの刺激もまた阻害できる。Ｍ２２を介したサイクリックＡＭＰの刺激に対する９Ｄ３３ＩｇＧおよび５Ｃ９ＩｇＧの効果は相加的であった（表１３、実験１−４）。刺激に２つの異なった濃度のＭ２２Ｆａｂ（３ｎｇ／ｍＬおよび０．３ｎｇ／ｍＬ）を用いた際、同じ相加的効果が観察された（表１３；実験１および２、および実験３および４の各実験）。
【０１０９】
５Ｃ９ＩｇＧおよび９Ｄ３３ＩｇＧの相加的効果は、ＴＳＨおよびＭ２２の両者を介したサイクリックＡＭＰ産生の刺激について同様であった（表１２および１３）。
【０１１０】
野生型ＴＳＨＲを細胞あたり多数発現するＣＨＯ細胞内の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性における５Ｃ９の効果
細胞あたり約５ｘ１０5のレセプターを発現するＣＨＯ細胞株は、以前の実験（例えば表９−１３）で用いた標準的なＣＨＯ細胞株(細胞あたり約５ｘ１０4のＴＳＨＲを発現する)に比較して高濃度の基本的（すなわち無刺激の）サイクリックＡＭＰを示した。すなわち、それぞれの濃度は、約１．０ｐｍｏｌ／ｍＬに比較して４７．１±１１．７ｐｍｏｌ／ｍＬである。野生型ＴＳＨＲの基本的活性における５Ｃ９ＩｇＧおよび９Ｄ３３ＩｇＧの効果を、細胞あたり多数のレセプターを発現する細胞株を用いて評価した。９Ｄ３３ＩｇＧおよびネガティブコントロールの抗ＧＡＤ抗体（５Ｂ３）とのインキュベーションは、基本的サイクリックＡＭＰ活性の０−５．３％の阻害をもたらした(表１４；実験１)。このことは、マウス遮断性ＭＡｂ９Ｄ３３またはコントロールＭＡｂは、野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対して効果をもたないことを示している。しかしながら５Ｃ９ＩｇＧの場合、基本的サイクリックＡＭＰ活性の明らかな阻害が観察された(表１４；実験２）。すなわち、０．１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの濃度はそれぞれ、４５．７％および７４．６％の阻害を起こした。さらに、５Ｃ９Ｆａｂおよび５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）もまた、細胞あたり多数のＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における基本的サイクリックＡＭＰ活性の有効な阻害剤であった(表１４、実験３)。例えば、１μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９Ｆａｂはそれぞれ、基本
的なサイクリックＡＭＰ産生の３９％および６１％の阻害を示し、これは１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）による４８％の
阻害と比較される(表１４、実験３)。
【０１１１】
アンタゴニスト（すなわち遮断性）活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、活性化変異Ｉ５６８Ｔを有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
ＴＳＨＲＩ５６８Ｔ細胞によるサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生（２０．５±８．７ｐｍｏｌ／ｍＬ）は、試験された健常血液ドナーからの正常プール血清（ＮＰＳ）または異なった３名の個々の健常血液ドナー血清（Ｎ１−Ｎ３）の１／１０および１／５０希釈における添加によって基本的に影響されなかった。ＮＰＳおよびＮ１−Ｎ３血清の存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生は、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生に比較して０−１４％の阻害を示した(表１５)。しかしながら、高濃度の遮断性ＴＲＡｂ（Ｂ２−Ｂ５）を有する４種の異なる血清の存在下では、基本的なサイクリックＡＭＰ産生の２３−８９％の阻害が観察された(表１５)。５Ｃ９ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）の存在下では、ＴＳＨＲＩ５６８Ｔの基本的なサイクリックＡＭＰ活性の８３％の阻害が観察された。Ｉ５６８Ｔ変異をもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対する、２種の遮断性血清（Ｂ３およびＢ４）の量依存性効果もまた表１５に示す。
【０１１２】
これらの結果は、５Ｃ９が、特にＴＳＨＲ活性化変異であるＩ５６８Ｔにおける基本的なサイクリックＡＭＰ産生の阻害に関して、患者遮断ＴＳＨＲ自己抗体のＴＳＨＲ遮断活性特性を有することを示す。
【０１１３】
アンタゴニスト活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、活性化変異Ｓ２８１Ｉを有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
ＴＳＨＲＳ２８１Ｉ細胞によるサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生は１１．２±２．０ｐｍｏｌ／ｍＬであり、健常血液ドナープール血清または個々の健常血液ドナー血清（１／１０または１／５０希釈）とのインキュベーションは効果を示さなかった（表１６）。一方で、高濃度の遮断性ＴＲＡｂ（Ｂ２−Ｂ５）を有する４種の異なる血清の存在下では、基本的なサイクリックＡＭＰ産生の３１−５６％の阻害が観察された（表１６）。ＴＳＨＲＳ２８１Ｉを用いた実験において、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧは基本的なサイクリックＡＭＰ活性を７１％阻害した。
【０１１４】
アンタゴニスト活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、活性化変異Ａ６２３Ｉを有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
ＴＳＨＲＡ６２３Ｉ細胞の場合、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生は４３．５±１１．２ｐｍｏｌ／ｍＬであり、健常血液ドナープール血清または個々の血清とのインキュベーションによって基本的に影響されなかった。（表１７）。高濃度の遮断性ＴＲＡｂ（Ｂ２−Ｂ５）を有する４種の異なる血清とのインキュベーションでは、これらの実験においてサイクリックＡＭＰの−１％から５６％を阻害した（表１７）。このことは、同じ実験における１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧによる４９％の阻害と比較することができる。
【０１１５】
アンタゴニスト活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、細胞あたり約５ｘ１０5の野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
細胞あたり比較的多数の野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的なサイクリック
ＡＭＰ産生は、この一連の実験で２８．１±０．７ｐｍｏｌ／ｍＬであった。該細胞を１／１０希釈の健常血液ドナープール血清または個々の血清（Ｎ１−Ｎ３）とインキュベートしたとき、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ濃度は９９％から１４６％の範囲であったが、１／５０希釈においてその範囲は９３％から１３７％であった。遮断性ＴＳＨＲ自己抗体を有する試験された４種の血清のうち、１種の血清（Ｂ２）は基本的なサイクリックＡＭＰ産生において効果を示さなかった（表１８）。２種の血清（Ｂ３およびＢ５）の場合、サイクリックＡＭＰ濃度は、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下で観察された濃度に比較して増大した（表１８）。血清Ｂ３およびＢ５が刺激活性および遮断活性を有するＴＳＨＲ自己抗体の混合物を含むことは十分にあり得る。一方、血清Ｂ４は１／１０および１／５０希釈において、基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対する明らかな阻害効果を有していた。すなわち基本的なサイクリックＡＭＰ濃度は、サイクリックＡＭＰ緩衝液存在下での濃度に比較してそれぞれ３１％および６１％であった（表１８）。このことは、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧ存在下での濃度が、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での濃度に比べ３３％であることと比較することができる（表１８）。
【０１１６】
概して５Ｃ９ＩｇＧは、野生型ＴＳＨＲ、または遮断性ＴＳＨＲ自己抗体陽性患者由来の血清により観察された効果に対する活性化変異を有するＴＳＨＲを導入したＣＨＯ細胞における、基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対し同様の効果を示す。しかしながら、様々な変異の場合において個々の患者血清による効果は変動する（表１９）。野生型ＴＳＨＲの場合、ある血清は刺激効果を示す。これはおそらく遮断性自己抗体と同様にＴＳＨＲ刺激性自己抗体も存在するためである（表１９）。
【０１１７】
アミノ酸変異を含むＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する５Ｃ９の効果
アミノ酸変異を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する５Ｃ９の効果は、以下の、アラニンへの変異の包含に及ぶ：Ａｓｐ４３、Ｇｌｕ６１、Ｈｉｓ１０５、Ｇｌｕ１０７、Ｐｈｅ１３０、Ｇｌｕ１７８、Ｔｙｒ１８５、Ａｓｐ２０３、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２０９、Ａｓｐ２３２、Ｌｙｓ２５０、Ｇｌｕ２５１、Ｔｈｒ２５７、Ａｒｇ２７４、Ａｓｐ２７６（表２０ａ−ｐ、および表２１に要約）。
【０１１８】
ＴＳＨＲのアミノ酸であるＡｓｐ４３、Ｇｌｕ６１、Ｈｉｓ１０５、Ｇｌｕ１０７、Ｔｙｒ１８５、Ａｓｐ２３２およびＴｈｒ２７５のアラニンへの変異は、ＴＳＨ刺激によるサイクリックＡＭＰ産生に対する５Ｃ９ＩｇＧの阻害能に効果を示さなかった。ＴＳＨ刺激によるサイクリックＡＭＰ産生に対する５Ｃ９の阻害能は、ＴＳＨＲのＰｈｅ１３０、Ｇｌｕ１７８、Ａｓｐ２０３、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２５０、Ｇｌｕ２５１およびＡｓｐ２７６のアラニンへの変異により減少した。Ｌｙｓ２０９ＡｌａおよびＡｓｐ２７４Ａｌａの２種の変異の場合、ＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰ産生に対する５Ｃ９ＩｇＧの阻害能は増大した。
【０１１９】
要約すると(表７，２０、および２１)、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３０、Ａｓｐ１５１、Ｇｌｕ１７８、Ｌｙｓ１８３、Ａｓｐ２０３、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２５０、Ｇｌｕ２５１およびＡｓｐ２７６の１０種のＴＳＨＲ残基全ては、５Ｃ９のＴＳＨによるサイクリックＡＭＰ刺激に対する阻害能を、野生型ＴＳＨＲに比べて減少させた。ＴＳＨＲのＬｙｓ１２９およびＡｓｐ２０３の変異は最大の効果を示し、５Ｃ９活性の完全な阻害の原因となった。
【０１２０】
野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰの産生刺激に対する遮断性血清Ｂ２−Ｂ５の、Ａｓｐ２０３Ａｌａ変異ＴＳＨＲとの比較による
効果
野生型ＴＳＨＲにおける１μｇ／ｍＬの５Ｃ９による遮断効果は（ＴＳＨにより誘導されたサイクリックＡＭＰ刺激の９２％の阻害）、Ａｓｐ２０３Ａｌａ変異ＴＳＨＲにおいては４％に減少した(表２２）。
【０１２１】
遮断性血清Ｂ４の活性はＴＳＨＲのＡｓｐ２０３Ａｌａ変異により影響されなかったが、遮断性血清Ｂ２およびＢ３では、ＴＳＨＲのＡｓｐ２０３Ａｌａ変異の場合、野生型ＴＳＨＲと比較してＴＳＨにより誘導されたサイクリックＡＭＰ刺激のパーセント阻害にわずかな減少がみられた。
【０１２２】
一血清Ｂ５の場合、ＴＳＨにより誘導されたサイクリックＡＭＰ刺激のパーセント阻害に顕著な減少が観察された；すなわち、野生型ＴＳＨＲでの６９％の阻害に対して、変異ＴＳＨＲでは３０％の阻害であった。
【０１２３】
５Ｃ９活性に対するＴＳＨＲのＡｓｐ２０３Ａｌａ変異の効果は遮断性血清の活性に対する効果よりも大きかったが、試験された３／４の血清の遮断活性は様々な程度に影響された。このことは、遮断性ＴＳＨＲ自己抗体および５Ｃ９の結合部位は重複しているが、様々な血清と接触する実際のＴＳＨＲアミノ酸には幾らかの違いのあることを示し得る。
【０１２４】
要約および結論
上記の実験は５Ｃ９のような本発明による抗体が、ヒトおよびマウスＴＳＨＲ刺激性抗体、天然ヒトおよび動物ＴＳＨ、およびリコンビナントヒトＴＳＨを含む様々な甲状腺刺激剤の刺激活性を遮断できることを証明する。さらに、２種の異なる遮断性抗体、すなわちヒトＭＡｂ５Ｃ９およびマウスＭＡｂ９Ｄ３３は個別に試験した際、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨまたはＭ２２を介したサイクリックＡＭＰ刺激に対する遮断能を有し、混合した際、ＴＳＨまたはＭ２２刺激に対して相加的遮断効果を示すことが証明される。
【０１２５】
５Ｃ９のような本発明による抗体は、ＴＳＨＲの基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する新規な効果を有する。これらの効果は、比較的高濃度の基本的なサイクリックＡＭＰを有するＴＳＨＲ導入ＣＨＯ細胞を用いた実験により研究されてきた。すなわち、５Ｃ９のような本発明による抗体の基本的なサイクリックＡＭＰ活性に対する遮断効果が確認されてきた。さらに、遮断（アンタゴニスト）活性をもつＴＳＨＲ自己抗体を有する幾つかの血清は、これらのＴＳＨＲ導入細胞における基本的なサイクリックＡＭＰ活性への遮断能を有することが示されてきた。この実験はまた、５Ｃ９のような本発明による抗体および血清ＴＳＨＲ遮断自己抗体の、活性化ＴＳＨＲ変異に関連した基本的なサイクリックＡＭＰ活性に対する遮断効果を証明する。
【０１２６】
これらの結果は、５Ｃ９が遮断性ＴＳＨＲ自己抗体の特性を示すヒトＭＡｂであること、すなわち甲状腺自己免疫疾患に付随する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の典型であることを強調する。
【０１２７】
記載された実験はまた、本発明による抗体の遮断活性に重要な幾つかのＴＳＨＲアミノ酸の同定も可能にした。
【０１２８】
概してこの結果は、５Ｃ９のような本発明による抗体は、甲状腺自己免疫疾患の患者由来の様々な血清中に見出されたＴＳＨＲ遮断性自己抗体と同様のＴＳＨＲ結合活性、およびＴＳＨＲの機能における同様の生物学的効果を呈することを示す。従って、血清中の遮断性ＴＳＨＲ自己抗体の特性および生物学的活性を有する５Ｃ９のような本発明による抗体は、様々な病態におけるＴＳＨＲの不活性化に適用できる。これらの病態は、ＴＳＨを
介したＴＳＨＲの活性化、甲状腺刺激性ＴＳＨＲ自己抗体を介したＴＳＨＲの活性化、基本的な(無刺激の、恒常的な）ＴＳＨＲ活性、および活性化ＴＳＨＲ変異によるＴＳＨＲの活性化を含む。従って、５Ｃ９のような本発明による抗体は、上述のＴＳＨＲの活性化による病態；例えばグレーブス病、グレーブス眼症、ＴＳＨＲの活性化変異による甲状腺機能亢進症、ＴＳＨの異常な濃度(病理的または薬理的）による甲状腺機能亢進症、甲状腺癌、および甲状腺癌転移の管理および制御に適用できる。
【０１２９】
【表１−１】
【表１−２】
ＴＳＨＲをコートしたチューブへの標識ラベルの平均結合％
125Ｉ−ＴＳＨを用いた実験において１４％
125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧを用いた実験において２１％
および、５Ｃ９ＩｇＧを用いた実験において２０％
ＨＢＤプール＝健常人血液ドナープール血清
２Ｇ４＝コントロールのＩｇＧ（ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトＭＡｂ）
【０１３０】
【表２ａ】
1１回の決定
a ドナー血清は示されたようにサイクリックＡＭＰ検定緩衝液で希釈した
b 比濁法により決定された非希釈血清のＩｇＧ濃度は１４．３ｍｇ/ｍＬであった
５Ｃ９ＩｇＧおよびＴＳＨはサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈した。
【０１３１】
【表２ｂ−１】
【表２ｂ−２】
1２組のサンプルの平均
２Ｇ４＝コントロールのＩｇＧ（ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトＭＡｂ）
抗体およびＴＳＨ標本はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈した。
【０１３２】
【表２ｃ−１】
【表２ｃ−２】
1２組のサンプルの平均
９Ｄ３３は、ＴＳＨＲが発現するＣＨＯ細胞において、ＴＳＨおよびＴＲＡｂが介在するサイクリックＡＭＰ生産を遮断するマウス抗体である。
抗体およびＴＳＨ標本はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈した。
【０１３３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
Ｎ１−１０＝健常人血液ドナーからの血清
Ｇ１−Ｇ４０＝グレーブス病にかかった経験のある患者からの血清
結果はほぼ一致する二重測定の平均である。
【数３】
ここで、Ａ＝テスト血清存在下での結合；Ｂ＝健常人血液ドナーからの血清ＨＢＤプールのプールの存在下での結合。
ＨＢＤプール存在下での125Ｉ−５Ｃ９は２０％の結合率であり、ＨＢＤプール存在下での125Ｉ−ＴＳＨは１２％の結合率であり、ＨＢＤプール存在下での125Ｉ−Ｍ２２は２０％の結合率であった。
【０１３４】
【表４ａ−１】
【表４ａ−２】
【表４ａ−３】
【０１３５】
【表４ｂ−１】
【表４ｂ−２】
Ｂ１−Ｂ５はアンタゴニスト（遮断）活性を伴う高いレベルのＴＲＡｂを有する患者血清である。
Ｂ３は５Ｃ９に対するリンパ球ドナーからの血清である
Ｓ１、Ｓ２、およびＳ４はアンタゴニスト（遮断）活性を伴う高いレベルのＴＲＡｂを有する患者血清である。
アッセイキャリブレーター４０Ｕ／Ｌ、８Ｕ／Ｌ、２Ｕ／Ｌ、および１Ｕ／Ｌ、は、Ｍ２２ ＩｇＧを健常人血液ドナー血清（ＨＢＤプール）で希釈し、ＮＩＢＳＣ９０／６７２のＵ／Ｌ活性を、標識したＴＳＨがＴＳＨＲでコートしたチューブへ結合することの阻害率を用いて測定したものである。
【数４】
ここで、Ａ＝テストサンプル；Ｂ＝ＨＢＤプール
ＮＴ＝テストしない
１／５、１／１０等はＨＢＤプールにおけるテスト血清の希釈率を示し、ニートは希釈無し、を示す。
ＨＢＤプールの存在下、125Ｉで標識したＭ２２ＩｇＧ、５Ｃ９ＩｇＧ、ＴＳＨの、それぞれ約２０％、１７％、１２％がコートしたチューブへ結合した。
【０１３６】
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【表５−４】
【表５−５】
【表５−６】
抗体は健常人血液ドナー血清のプールで希釈した（ＨＢＤプール）。
【数５】
ここで、Ａ＝テストサンプル存在下での結合率（％）；Ｂ＝ＨＢＤプール存在下での結合率（％）
1甲状腺刺激活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ
2ＴＳＨおよびＴＲＡｂ両方が仲介するサイクリックＡＭＰ生産の刺激を遮断するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ
3甲状腺ペルオキシダーゼＭＡｂに対するヒトＭＡｂ（ネガティブコントロール）
4ＴＳＨ遮断活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ（ＴＳＨＲアミノ酸３８１−３８５により形成されるエピトープを認識する）
5ＴＳＨ遮断活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ（ＴＳＨＲアミノ酸３６−４２により形成されるエピトープを認識する）
6ＴＳＨ遮断活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ（ＴＳＨＲアミノ酸２４６−２６０により形成されるエピトープを認識する）
7マウスＴｇＭＡｂ（ネガティブコントロール）
ＨＢＤプールの存在下、125Ｉで標識したＭ２２ＩｇＧ、５Ｃ９ＩｇＧ、ＴＳＨの、それぞれ約１３％、２４％、１５％がコートしたチューブへ結合する。
【０１３７】
【表６ａ−１】
【表６ａ−２】
【表６ａ−３】
【表６ａ−４】
【表６ａ−５】
【表６ａ−６】
ｕｄ＝検出されず
1＝二重測定
ＨＢＤプールは健常人血液ドナー血清のプールである；これらの実験では、１：１０に希釈したサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液を使用した。
Ｔ１−Ｔ９およびＴ１１−Ｔ１８はＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞においてサイクリックＡＭＰ産生を刺激する血清である。Ｔ１―Ｔ９およびＴ１１−Ｔ１８はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で１：１０に希釈しテストした。
２Ｇ４は甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトモノクローナル抗体である（ネガティブコントロール）。
２Ｇ４ ＩｇＧおよび５Ｃ９ ＩｇＧは１００μｇ/ｍＬでテストした。
【０１３８】
【表６ｂ−１】
【表６ｂ−２】
Ｔ１は、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生を刺激する、患者の血清サンプルである；これらの実験ではサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で１：１０に希釈したものを用いた。
２Ｇ４は甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトモノクローナル抗体である（ネガティブコントロール）。
９Ｄ３３は、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における、ＴＳＨおよびＴＲＡｂによるサイクリックＡＭＰ産生を遮断するマウス抗体である（表２を参照）。
【０１３９】
【表６ｃ−１】
【表６ｃ−２】
1一回の測定
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４０】
【表６ｄ−１】
【表６ｄ−２】
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４１】
【表６ｅ−１】
【表６ｅ−２】
1二重サンプルの平均
2１回の測定
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４２】
【表６ｆ−１】
【表６ｆ−２】
1二重サンプルの平均
ＮＴ＝テストせず
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４３】
【表６ｇ−１】
【表６ｇ−２】
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４４】
【表７ａ】
1二重測定の平均値
ｐＴＳＨ濃度＝３ｎｇ／ｍＬ
全ての希釈液はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液
２Ｇ４は甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトモノクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）
【０１４５】
【表７ｂ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４６】
【表７ｃ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４７】
【表７ｄ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４８】
【表７ｅ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４９】
【表７ｆ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５０】
【表７ｇ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５１】
【表７ｈ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５２】
【表７ｉ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５３】
【表７ｊ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５４】
【表７ｋ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５５】
【表７ｌ】
Ｍ２２濃度＝３ｎｇ／ｍＬ
説明注釈については表７ａを参照
【０１５６】
【表７ｍ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１５７】
【表７ｎ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１５８】
【表７ｏ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１５９】
【表７ｐ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６０】
【表７ｑ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６１】
【表７ｒ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６２】
【表７ｓ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６３】
【表８】
アッセイキャリブレーター４０Ｕ／Ｌ、８Ｕ／Ｌ、２Ｕ／Ｌ、および１Ｕ／ＬはＭ２２ ＩｇＧを健常人血液ドナー血清（ＨＢＤプール）で希釈したものであり、ＮＩＢＳＣ ９０／６７２のＵ／Ｌ活性により、標識されたＴＳＨのＴＳＨＲをコートしたチューブへの結合の阻害を測定した。アッセイのネガティブコントロールはＨＢＤプールである。
【０１６４】
【表９】
aサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液による希釈液
b２Ｇ４はヒト甲状腺ペルオキシダーゼモノクローナル自己抗体コントロールである。
【０１６５】
【表１０−１】
【表１０−２】
【表１０−３】
【表１０−４】
【表１０−５】
【０１６６】
【表１１ａ】
a２Ｇ４はヒト甲状腺ペルオキシダーゼモノクローナル抗体コントロールである。
【０１６７】
【表１１ｂ】
【０１６８】
【表１１ｃ】
a２回の測定
【０１６９】
【表１２−１】
【表１２−２】
【表１２−３】
【表１２−４】
【表１２−５】
【０１７０】
【表１３−１】
【表１３−２】
【表１３−３】
【表１３−４】
【０１７１】
【表１４−１】
コントロールのＣＨＯ細胞では、ＴＳＨＲが発現されず、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液の存在下での基礎的なサイクリックＡＭＰ産生は１．０２±０．０６ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であり、３ｎｇ／ｍＬ ＴＳＨの存在下では０．７４±０．３２ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。
−ｖe＝ネガティブ、すなわちサイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
b５Ｂ３はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）ヒトモロクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）。
【表１４−２】
コントロールのＣＨＯ細胞では、ＴＳＨＲが発現されず、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液の存在下での基礎的なサイクリックＡＭＰ産生は０．０３ｐｍｏｌ／ｍＬ（ｎ＝２）であり、３ｎｇ／ｍＬ ＴＳＨの存在下では０．４０±０．０９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。
−ｖe＝ネガティブ、すなわちサイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
b５Ｂ３はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）ヒトモロクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）。
【表１４−３】
【表１４−４】
コントロールのＣＨＯ細胞では、ＴＳＨＲが発現されず、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液の存在下での基礎的なサイクリックＡＭＰ産生は１．０３ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝２）であり、３ｎｇ／ｍＬ ＴＳＨの存在下では０．０４±０．０９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。
−ｖe＝ネガティブ、すなわち還元サイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
Ｆ（ａｂ‘） Ｆ（ａｂ‘）2の還元により準備される；詳細な説明の記載を参照
【０１７２】
【表１５−１】
【表１５−２】
【表１５−３】
−ｖe＝ネガティブ、すなわちサイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
ＨＢＤプール＝健常人血液ドナー血清のプール
Ｎ１−Ｎ３＝個々の健常人血液ドナー
全ての血清はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈された。
【０１７３】
【表１６】
説明注釈については表１５を参照。
１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ ＩｇＧは、ＴＳＨＲ Ｓ２８１Ｉを用いた実験における基本的なサイクリックＡＭＰ活性の阻害の７１％を引き起こした。
【０１７４】
【表１７】
説明注釈については表１５を参照。
１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ ＩｇＧは、ＴＳＨＲ Ａ６２３Ｉを用いた実験における基本的なサイクリックＡＭＰ活性の４９％阻害を引き起こした。
【０１７５】
【表１８】
【数６】
１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ ＩｇＧの存在下、基本的なサイクリックＡＭＰレベルはサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下でのレベルに比べ３３％に減少した。
【０１７６】
【表１９】
ＨＢＤプール＝健常人血液ドナー血清のプール。
ＨＢＤプールおよびＢ２〜Ｂ５の血清はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中で１：１０に希釈した。
５Ｃ９ ＩｇＧはサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中１μｇ／ｍＬの濃度で用いた。
Ｂ２−Ｂ５は、野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞中での、ＴＳＨおよびＭ２２の両方によるサイクリックＡＭＰ産生刺激を遮断した。
【０１７７】
【表２０ａ】
【０１７８】
1二重測定の平均
2一重測定
ｐＴＳＨ濃度＝３ｎｇ／ｍＬ。
全ての希釈はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で行った。
a５Ｂ３はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対するヒトモノクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）。
【０１７９】
【表２０ｂ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８０】
【表２０ｃ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８１】
【表２０ｄ−１】
説明注釈については表２０aを参照。
【表２０ｄ−２】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８２】
【表２０ｅ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８３】
【表２０ｆ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８４】
【表２０ｇ】
ＵＤ＝アッセイ測定限界以下。
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８５】
【表２０ｈ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８６】
【表２０ｉ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８７】
【表２０ｊ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８８】
【表２０ｋ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８９】
【表２０ｌ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９０】
【表２０ｍ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９１】
【表２０ｎ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９２】
【表２０ｏ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９３】
【表２０ｐ−１】
説明注釈については表２０aを参照。
【表２０ｐ−２】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９４】
【表２１−１】
【表２１−２】
使用したｐＴＳＨ濃度＝３ｎｇ／ｍＬ
ＴＳＨＲの比較した効果は野生型とともに観察された活性のパーセンテージで以下のように表される：−＋＋＋＋＋＝野生型活性の１００％；＋＋＋＋＝野生型活性の８０％以上１００％未満；＋＋＋＝野生型活性の６０％以上８０％未満；＋＋＝野生型活性の４０％以上６０％未満；＋＝野生型活性の２０％以上４０％未満、０＝野生型の２０％未満、および野生型と比較して増加した活性：＞１００％は＋＋＋＋＋＋＋。ＮＴ＝テストせず。aこの実験のためのサイクリックＡＭＰ刺激は、ＴＳＨの応答を欠失したＭ２２を用いた（詳しくは明細書を参照）。
【０１９５】
【表２２】
aサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液での希釈
bＴＳＨの関与するサイクリックＡＭＰ刺激の阻害率％
【数７】
1二重サンプルの平均
c最終濃度３ｎｇ／ｍＬで使用されたｐＴＳＨ
ＨＢＤプール＝健常人ドナー血清のプール
【技術分野】
【０００１】
本発明はサイロトロピン（ＴＳＨ）レセプター（ＴＳＨＲ）と反応する抗体に関し、限定はされないが、特に、ＴＳＨＲに結合して、ＴＳＨまたはＴＳＨＲ刺激性抗体によるＴＳＨＲへの刺激を阻害できる抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイロトロピン、すなわち甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、ＴＳＨＲを通して甲状腺機能を調節する下垂体ホルモンである（Szkudlinski MW, Fremont V, Ronin C, Weintraub BD 2002 Thyroid-stimulating hormone and TSHR structure-function relationships.
Physiological Reviews 82: 473-502）。ＴＳＨＲはＧタンパク質共役型レセプターであり、ロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ）、切断ドメイン（ＣＤ）、および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）の３つのドメインよりなる（Nunez Miguel R, Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Blundell TL, Rees Smith B, Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor- thyrotropin interaction by comparative modelling. Thyroid 14: 991-1011）。ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合により、甲状腺ホルモンであるサイロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）の形成および放出への刺激を導くレセプターシグナルを引き起こされる。循環しているＴ４およびＴ３の濃度に関わる負のフィードバックのメカニズムは下垂体からのＴＳＨの放出（および視床下部から分泌されるサイロトロピン放出ホルモン）を制御し、これが次に甲状腺刺激、および血清中の甲状腺ホルモンの濃度を制御する。
【０００３】
当該技術分野において、ある自己免疫性甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）の患者がＴＳＨＲと反応する自己抗体を有することはよく実証されている（Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121）。大部分の場合、これらの自己抗体はＴＳＨＲに結合してＴＳＨの作用を模倣することにより、甲状腺を刺激して高濃度のＴ４およびＴ３を産生する。これらの自己抗体は、刺激活性またはＴＳＨアゴニスト活性を有する、甲状腺刺激性自己抗体またはＴＳＨＲ自己抗体（ＴＲＡｂ）として記載されている。上述の甲状腺機能制御の生理的フィードバックメカニズムは、このような甲状腺刺激性自己抗体の存在下、および甲状腺機能亢進または甲状腺中毒症（血清中の過剰な甲状腺ホルモン）の徴候をもつ患者には有効でない。この疾患はグレーブス病として知られる。ある患者において、刺激活性のあるＴＲＡｂは後眼窩組織のＴＳＨＲとの相互作用に関与し、かつグレーブス病の目の徴候の一因となると考えられている。強力な甲状腺刺激剤として作用するヒトモノクローナル自己抗体（ｈＭＡｂであるＴＳＨＲ１）の詳細が、特許出願の国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載されている。
【０００４】
一方ＡＩＴＤのある患者においては、自己抗体はＴＳＨＲに結合してＴＳＨのレセプターへの結合を阻止するが、ＴＳＨＲへの刺激能はもたない。このタイプの自己抗体は遮断活性またはＴＳＨアンタゴニスト活性をもつＴＲＡｂとして知られており、血清中に遮断性のＴＲＡｂを有する患者は、不活発な甲状腺の症状（甲状腺機能低下症）を有し得る（Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121）。特に、妊婦の血清中に遮断活性を有するＴＲＡｂが存在すると、これが胎盤を通過して胎児の甲状腺ＴＳＨＲを遮断する場合があり、新生児甲状腺機能低下症および発育における重篤な結果を引き起こす。さらに、遮断活性を有するＴＲＡｂは発症した母親の母乳中に見出され、これが乳児の臨床的な甲状腺機能低下症のさらなる一因となり得る。現在までのところ、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有
する、ＴＳＨＲに対するヒトモノクローナル自己抗体は入手不可能である。従って、このタイプの自己抗体がどのようにＴＳＨＲと相互作用するか、およびそのＴＳＨＲとの相互作用が、刺激性の自己抗体（例えばＭ２２）およびＴＳＨとＴＳＨＲとの相互作用とどのように比較されるかについての詳細な研究は限られている。
【０００５】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、妊娠中に産生される、軽度の甲状腺刺激効果をもつホルモンである。
【０００６】
刺激活性または遮断活性によりＴＲＡｂの性質を特徴づけることは、ＴＳＨＲへの自己免疫反応に関連する疾患の診断および管理を改善することを目標とする研究において決定的に重要である。特許出願の国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載されている発明は、強力な刺激活性をもつヒトモノクローナル自己抗体の性質およびそのＴＳＨＲとの相互作用についての詳細を提供する。さらに、特許出願の国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号は、少なくとも１つの点突然変異を含む変異ＴＳＨＲ製剤を開示しており、これは患者血清刺激性ＴＳＨＲ自己抗体、患者血清遮断性ＴＳＨＲ自己抗体、およびスクリーニングされた患者体液サンプル中のＴＳＨの識別スクリーニングおよび同定に用いられる。特許出願の国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号はまた、ＴＳＨＲ遮断活性をもつマウスモノクローナル抗体（９Ｄ３３）について記載している。９Ｄ３３は高アフィニティー（２ｘ１０10Ｌ／ｍｏｌ）でＴＳＨＲに結合する、ＴＳＨ、ｈＭＡｂであるＴＳＨＲ１（Ｍ２２）、および刺激活性または遮断活性をもつ患者血清ＴＲＡｂの効果的なアンタゴニストである（特許出願国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号およびSanders J,
Allen F, Jeffreys J, Bolton J, Richards T, Depraetere H, Nakatake N, Evans M, Kiddie A, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Miguel RN, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2005 Characteristics of a monoclonal antibody to the thyrotropin receptor that acts as a powerful thyroid-stimulating autoantibody antagonist. Thyroid 15: 672-682）。このマウスモノクローナル抗体９Ｄ３３は、遮断活性をもつ患者血清ＴＲＡｂの特性の少なくとも幾つかを示すものの、これは実験動物をＴＳＨＲで免役することにより作られたマウス抗体であり、ヒトにおけるＴＳＨＲへの自己免疫反応過程で産生されるＴＳＨＲ自己抗体を真に表し得ない。マウスモノクローナル抗体として、９Ｄ３３はヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ応用のためにヒト化される必要がある。このことは、ヒト化の過程に関わる費用および複雑化を考慮すれば不利であり得る。
【０００７】
本発明は、患者血清中のＴＳＨおよび刺激性ＴＲＡｂの効果的なアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対するヒトモノクローナル自己抗体（５Ｃ９）の産生および特性に由来する。５Ｃ９は、甲状腺機能低下症および高濃度のＴＳＨＲ自己抗体を有する患者の末梢リンパ球から単離された。このリンパ球をエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）の感染により不死化させ、安定クローンを作製するために陽性クローンをマウス／ヒト細胞株と融合した。クローン培養の上清からＩｇＧを精製し、５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合能、およびＴＳＨＲ活性への影響を評価した。特に、ＴＳＨＲへのＴＳＨの結合の阻害、およびＴＳＨのサイクリックＡＭＰ刺激活性の阻害に対する５Ｃ９の能力について調べた。さらに、刺激性または遮断性の患者血清ＴＲＡｂのＴＳＨＲへの結合の阻害、およびそれらの生物活性の阻害に対する５Ｃ９の能力もまた評価した。加えて、ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨ、および関連化合物のアッセイにおける５Ｃ９の使用も検討した。５Ｃ９の、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の可変領域（Ｖ領域）の遺伝子の配列を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を特定した。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第一の態様によれば、ＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離されたヒト抗体が提供される。
【０００９】
本発明の第二の態様によれば、ＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離されたヒト化抗体が提供される。
【００１０】
本発明の第一または第二の態様いずれかによる抗体は、「本発明による抗体」である。
【００１１】
本発明による抗体は甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであってよい。
【００１２】
本発明による抗体は、ＴＳＨアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のＴＳＨアンタゴニスト特性を有してよい。
【００１３】
本発明による抗体は、ＴＳＨのアンタゴニストおよび甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであってよい。
【００１４】
本発明による抗体は、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のアンタゴニスト特性を有してよい。
【００１５】
本発明による抗体は、ＴＳＨ、Ｍ２２、またはＴＳＨＲへの刺激活性をもつ抗体または遮断活性をもつ抗体による、ＴＳＨＲまたはその一部への結合の阻害剤であってよい。ＴＳＨＲの一部はＬＲＤまたはその実質的な一部を含んでよい。好ましくは、このような結合を阻止する抗体である。
【００１６】
本発明による抗体は、モノクローナルもしくはリコンビナント抗体であってよいか、またはＴＳＨのアンタゴニストであるその断片を含むかもしくはその断片からなってよい。本発明による抗体は、図２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される１または２以上のＣＤＲ、またはこれらＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列を含むＶH領域を含んでよい。さらに、またはあるいは、本発明による抗体は図３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される１または２以上のＣＤＲ、またはこれらＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列を含むＶL領域を含んでよい。
【００１７】
本発明による抗体は、ヒト完全長ＴＳＨＲに対し、約１０10Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有してよい。本発明による抗体は、好ましくはヒト完全長ＴＳＨＲに対し、約１０9Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有する。
【００１８】
本発明は当業者が、刺激性および遮断性ＴＳＨＲ自己抗体の発生および産生を推進する免疫メカニズムを理解するのに役立つ。さらに、本発明は当業者が、ＴＳＨＲ自己抗体の甲状腺刺激活性を有するものと遮断活性を有するものの間の分子的相違を理解するのに役立つ。さらに、本発明の医学的治療法および薬理学的組成物は甲状腺関連疾患に対する新しい治療法を提供する。
【００１９】
本発明による好ましい抗体は５Ｃ９である。５Ｃ９は、甲状腺刺激ホルモンレセプターの恒常的活性、すなわち甲状腺刺激ホルモンまたはＭ２２の非存在下での試験システムにおけるサイクリックＡＭＰの産生を阻害することが予想外に見出された。これは特に、甲状腺内に残存、または転移した甲状腺癌細胞の治療、とりわけこれらの細胞が甲状腺刺激ホルモンレセプターの恒常的活性の結果としてさらに迅速に増殖し得る再増殖を防止または遅延させることに有利である。
【００２０】
ここで用いられる「抗体(単数形：antibody）」および類似語、例えば「抗体(複数形：antibodies）」の語は、状況に従い、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体のような免疫グロブリンを基礎とした結合部分を包含し、かつ当業者
によってこのような免疫グロブリンを基礎とした結合部分へ置換されてもよい結合部分、例えばドメイン抗体、二重特異性抗体、ＩｇＧΔＣH２、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶL、ＶH、ｄｓＦｖ、ミニボディ（Minibody）、トリアボディ（Triabody）、テトラボディ（Tetrabody）、（ｓｃＦｖ）2、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）3もまた包含する（Holliger P, Prospero T, Winter G 1993 "Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments" Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448.）、（Carter PJ 2006 "Potent antibody therapeutics by design" Nat Rev Immunol 6: 343-357）。
【００２１】
「ＴＳＨＲ」との語は、図４に示されるアミノ酸配列を有する完全長のヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター、またはその変異体または断片で、甲状腺刺激ホルモンレセプターとの高い相同性を有するものに適用される。好ましくはこのような変異体および断片は、図４に示されるアミノ酸配列と７０から９９．９％の相同性を有する。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、
ａ）本発明の第一の態様による抗体をコードするヌクレオチド配列；
ｂ）図２または３に示される抗体ＶHドメイン、抗体ＶLドメイン、またはＣＤＲのアミノ酸配列をコードする、図２または３に示されるヌクレオチド配列；または
ｃ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列と高い相同性を有し、かつ少なくとも約１０9Ｌ／ｍｏｌのアフィニティーでＴＳＨＲに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドが提供される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、上記本発明の態様によるヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２４】
該ベクターはプラスミド、ウィルスまたはその断片であってよい。当業者には多くの異なるタイプのベクターが知られている。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、本発明による抗体；ヌクレオチドまたは／ベクターを含む、単離細胞が提供される。該単離細胞は本発明による抗体を発現してよい。好ましくは、該単離細胞は本発明による抗体を分泌する。好ましくは、本発明による単離細胞は安定へテロ−ハイブリドーマ細胞株由来である。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、ＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含み、かつ本発明による抗体を含む組成物が提供される。このような組成物は、ＴＳＨアンタゴニスト活性をもつＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含んでよく、かつ本発明による抗体を含む。
【００２７】
あるいは、本発明のこの態様による組成物は、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであるＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含んでよく、かつ本発明による抗体を含む。組成物は、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである、ＴＳＨアンタゴニスト活性をもつＴＳＨＲ自己抗体の規定濃度を含んでよく、かつ本発明による抗体を含む。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、甲状腺関連疾患の治療のために哺乳類被療体に投与するための、本発明による抗体を薬理学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。該甲状腺関連疾患は、甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択されてよい。
【００２９】
本発明による医薬組成物は、ヒトへの投与に適してよい。好ましくは本発明による医薬組成物は、被療体の免疫システムにおいて有意な有害作用をもたない。
【００３０】
本発明による医薬組成物は、さらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストを含んでよい。適切な、さらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストは、国際公開第２００４／０５０７０８号に開示されている９Ｄ３３である。
【００３１】
本発明による医薬組成物のために様々な形式が企図される。甲状腺関連疾患の治療における使用のための本発明による医薬組成物は、注射用の形式であってよい。前頚骨粘液水腫の治療における使用のための本発明による医薬組成物は、好ましくは局所用の形式である。グレーブス眼病の治療における使用のための本発明による医薬組成物は、好ましくは点眼薬の形式である。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、本発明の発明に従ったいずれかの抗体を、いずれかの薬理学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルと共に含む。本発明の医薬組成物に使用されてよい薬理学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルは、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンのような塩または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを基礎とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、経口で、吸入噴霧により非経口で、点眼薬により局所的に、経直腸、経鼻、口腔経由で、経膣で、または埋め込み型リザーバー経由で投与されてよい。好ましくは経口投与、または注射による投与である。ここで用いられる「非経口」との語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、包膜内、病巣内、および頭蓋内への注射または注入方法を含む。
【００３４】
該医薬組成物は、例えば水性または油性の無菌注射用懸濁液のような、無菌注射用製剤の形であってよい。この懸濁液は当該技術分野で公知の方法により、適切な分散剤または湿潤剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ８０)および懸濁剤を用いて処方されてよい。該無菌注射用製剤はまた、無毒性の非経口投与可能な希釈剤または溶媒、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての無菌注射用溶液または懸濁液であってよい。許容されるビヒクルおよび溶媒のうちで使用されてよいものは、マンニトール、水、リンゲル液および生理食塩水である。さらに、従来から、無菌の固定油が溶媒または懸濁化剤として使用されている。この目的のため、合成モノ−またはジグリセリドを含む、いずれの無菌性固定油も使用されてよい。オレイン酸のような脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブオイルまたはヒマシ油のような天然の薬理学的に許容される油、特にこれらのポリオキシエチル化された形として、注射液の製剤に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、Ph. Helvまたは類似アルコールのような長鎖アルコール希釈液または分散剤を含んでよい。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、および水性懸濁液および溶液を含むがこれらに限定されない、いずれかの経口に使用可能な剤形により経口投与されてよい。経口使用のための錠剤の場合、一般に用いられる担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセルの形による経口投与のための有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液を経口投与する場合、有効成分は乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。必要に応じ、特定の甘味料および／または香料および／または着色料が添加されてよい。
【００３６】
本発明の医薬組成物はまた、直腸内投与のための坐薬の形で投与されてよい。これらの
組成物は、本発明の化合物を適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製できる。この賦形剤は室温では固体であるが直腸温では液体であることにより、有効成分を放出するために直腸内で溶解し得る。このような物質はココアバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の医薬組成物の局所投与は、望ましい治療が局所投与により容易に利用できる部位または臓器に関わる場合に特に有用である。皮膚への局所投与のために該医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した有効成分を含む適切な軟膏剤により処方されなければならない。本発明の化合物の局所投与のための担体は、ミネラルオイル、鉱油、ホワイトペトロリアム（white petroleum）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水を含むがこれらに限定されない。あるいは該医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した有効成分を含む適切なローションまたはクリームにより処方できる。適切な担体は、ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を含むがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物はまた、直腸坐薬製剤または適切な浣腸製剤により下部腸管に局所投与されてよい。局所的な経皮パッチもまた、本発明に含まれる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入により投与されてよい。このような組成物は医薬品処方の技術分野における公知の方法により調製され、ベンジルアルコールまたはその他の適切な保存料、生物学的利用能を増強させるための吸収促進剤、フッ化炭素、および／またはその他の当該技術分野で公知の可溶化剤または分散剤を用いた、生理食塩水溶液として調製されてよい。
【００３９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による１または２以上の単離細胞を培養することにより該細胞が抗体を発現することを含む、本発明による抗体の産生方法が提供される。好ましくは、該抗体は該細胞により分泌される。
【００４０】
本発明のさらなる態様によれば、哺乳類被療体、または該被療体由来の細胞における甲状腺関連疾患の治療方法が提供され、該方法は該被療体、または該細胞を本発明による抗体に接触させることを含む。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、哺乳類被療体の甲状腺中のＴＳＨＲを刺激する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法が提供され、該方法は該被療体を本発明による抗体に接触させることを含む。好ましくは、甲状腺刺激性自己抗体のＴＳＨＲへの結合が阻止される。
【００４２】
本発明の他の態様によれば、哺乳類被療体の甲状腺外ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法が提供され、該方法は該被療体を本発明による抗体に接触させることを含む。該甲状腺外ＴＳＨＲは、該被療体の後眼窩組織および／または前頚骨組織に存在してよい。本発明による抗体は、該方法において使用される際、甲状腺外ＴＳＨＲに結合するＴＳＨＲ自己抗体を好ましく遮断する。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、甲状腺内にあるか、または転移した甲状腺癌を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法が提供され、該方法は細胞内の恒常的甲状腺刺激ホルモンレセプター活性を阻害するために、癌性細胞を本発明による抗体に接触させることを含む。好ましくは、甲状腺癌細胞の再増殖は阻止または遅延される。
【００４４】
恒常的な甲状腺活性による甲状腺活動亢進症を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法もまた提供され、該方法は恒常的な甲状腺活性による甲状腺
活動亢進を阻害するために、被療体または甲状腺細胞を本発明による抗体に接触させることを含む。
【００４５】
上記本発明の様々な方法において治療される被療体は、好ましくはヒトである。
【００４６】
本発明の他の態様によれば、甲状腺関連疾患の治療における本発明による抗体の使用が提供される。あるいは、甲状腺関連疾患の治療のための薬剤の調製における本発明による抗体の使用が提供される。
【００４７】
医学的治療における使用のための、本発明による抗体もまた提供される。特に、甲状腺関連疾患の治療における使用のための、本発明による抗体の使用が提供される。該甲状腺関連疾患は、甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択されてよい。
【００４８】
本発明の他の態様によれば、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの、試験されるＴＳＨＲ抗体の結合を決定することを含む、ＴＳＨＲ抗体を特徴付けるための方法が提供され、ここで該方法は本発明による抗体の使用を含む方法工程に関わる。好ましくは、該方法はＴＳＨＲ抗体の該ポリペプチドへの結合において、本発明による抗体の効果を決定することを含む。ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有する該ポリペプチドは、好ましくは完全長のヒトＴＳＨＲを含む。
【００４９】
本発明の他の態様によれば、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの、試験されるＴＳＨ、または関連分子の結合を決定することを含む、ＴＳＨおよび関連分子を特徴付けるための方法が提供され、ここで該方法は本発明による抗体の使用を含む方法工程に関わる。
【００５０】
上記のＴＳＨＲ抗体、またはＴＳＨを特徴付けるための方法および関連方法はＥＬＩＳＡ形式によるものであってよい。
【００５１】
本発明の他の態様によれば、アンタゴニストとして作用するＴＳＨＲ自己抗体の結合に関わるＴＳＨＲアミノ酸を決定する方法が提供され、該方法は、本発明による抗体が結合する第一のＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供すること、該ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果を抗体の結合において決定することを含む。
【００５２】
本発明による抗体を改変するための方法は、該抗体の少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果をＴＳＨＲ関連配列への結合において決定することを含む。改変ＴＳＨＲ抗体は、ＴＳＨＲに対する増強されたアフィニティーを有するものが好ましく選択される。
【００５３】
本発明の他の態様によれば、ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻害する分子を同定するための方法が提供され、該方法は、本発明による少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む。試験される分子は、ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻止するものが好ましく選択される。
【００５４】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻害する分子を同定するための方法もまた提供され、該方法は、本発明による少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む。好ましくは、ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻止する分子が選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
これより本発明による抗体および方法を、例としてのみの目的で、添付する図１から図４への参照により記述する。
【００５６】
【図１−１】ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２の結合における、グレーブス病の患者（ｎ＝４０）および健常血液ドナー（ｎ＝１０）からの血清の効果の比較を図示する一連の３グラフ。 ａ．125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−ＴＳＨ結合
【図１−２】ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２の結合における、グレーブス病の患者（ｎ＝４０）および健常血液ドナー（ｎ＝１０）からの血清の効果の比較を図示する一連の３グラフ。 ｂ．125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合
【図１−３】ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２の結合における、グレーブス病の患者（ｎ＝４０）および健常血液ドナー（ｎ＝１０）からの血清の効果の比較を図示する一連の３グラフ。 ｃ．125Ｉ−ＴＳＨ対125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合
【図２−１】５Ｃ９重鎖（ＨＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ａ．５Ｃ９ＨＣのオリゴヌクレオチド配列を、注釈なし、および注釈付きの形式で示す。注釈付きの形式では、ＰＣＲプライマーに使用した配列を下線で示し、個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）を四角で囲み、定常領域を太字で示す。
【図２−２】５Ｃ９重鎖（ＨＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ｂ．オリゴヌクレオチド配列由来の５Ｃ９ＨＣのアミノ酸配列を、注釈なし、および注釈付きの形式で示す。
【図３−１】５Ｃ９軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ａ．５Ｃ９ＬＣのオリゴヌクレオチド配列を、注釈なし、および注釈付き（図２の通り）の形式で示す。
【図３−２】５Ｃ９軽鎖（ＬＣ）の可変領域配列の配列を示す。 ｂ．オリゴヌクレオチド配列由来の５Ｃ９ＬＣのアミノ酸配列を、注釈なし、および注釈付きの形式で示す。
【図４】ヒトＴＳＨＲ（受入番号Ｐ１６４７３、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=62298994）のコンセンサスアミノ酸配列を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
方法
リンパ球分離およびヒトモノクローナルＴＳＨＲ自己抗体５Ｃ９のクローニング
モノクローナル自己抗体５Ｃ９は通常、国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載された方法を用いて分離した。リンパ球は最初に、産後甲状腺機能低下症で高濃度のＴＲＡｂを有する患者から集めた血液サンプルより分離した（地域の倫理委員会の承認を得た）。該リンパ球はエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）（European Collection of Cell Cultures - ECACC; Porton Down, SP4 OJG5,UK）に感染させ、国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載されているように、マウスマクロファージフィーダー層上で培養した。ＴＳＨＲ自己抗体を分泌する不死化リンパ球はマウス／ヒトのハイブリッド細胞株であるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＥＣＡＣＣ）と融合させ、単一コロニーを得るため、限界希釈による４回のクローニングを行った。クローニングの様々な段階における、細胞培養上清
中のＴＳＨＲ自己抗体の存在は、125Ｉで標識したＴＳＨのＴＳＨＲへの結合の阻害により検出した（国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号）。ＴＳＨＲ自己抗体を産生する単一クローンを増殖させ、自己抗体の精製のために培養上清を回収した。
【００５８】
５Ｃ９ＩｇＧ製剤の精製および標識化
５Ｃ９ＩｇＧは、Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Kiddie A, Brereton K, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Nunez Miguel R, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonal autoantibody
to the thyrotropin receptor: sequence structure and function. Thyroid 2004 14: 560-570に記載されている、MabSelect(商標）（GE Healthcare、英国）によるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養上清より精製し、純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により評価した。
【００５９】
５Ｃ９の重鎖アイソタイプは、放射拡散アッセイ（The Binding Site；バーミンガム、Ｂ２９ ６ＡＴ、英国）を用いて決定し、軽鎖のアイソタイプは、抗ヒトカッパ鎖、および抗ヒトラムダ鎖特異的マウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich Company Ltd；プール、英国）を用いたウェスタンブロッティングにより決定した。
【００６０】
２０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中における１０ｍｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧを、製造者（Perbio Science UK Ltd、クラムリントン、英国）の指示に従い調製した固定化ペプシンと共に、室温で４時間半、振とうしながらインキュベートした。その後、固定化ペプシンを遠心（１０００ｘｇ、室温で５分間）により除去し、上清を３００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対し、４℃においてオーバーナイトで透析した。５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2および少量のインタクトなＩｇＧを含む透析された混合物は、Sephacryl S-300 High Resolution Matrix（GE Healthcare、チャルフォント・セント・ジャイルズ、英国）を用いて分離した。この方法で精製された５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣゲルろ過分析での判断によればインタクトなＩｇＧを含まなかった。
【００６１】
さらにＦ（ａｂ’）2は、最終濃度１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−システインを用い、３７℃、１時間で還元した。この反応は、最終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミドにより、室温、３０分間で停止させた。Ｆ（ａｂ’）は、上記のようにSephacryl S-300カラムを用いて精製した。この方法で精製されたＦ（ａｂ’）製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣゲルろ過分析での判断によればＦ（ａｂ’）2を含まなかった。
【００６２】
さらに、５Ｃ９ＩｇＧをマーキュリーパパイン（Sigma、英国）により、１：１００の酵素／タンパク質の比において処理し、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０中へ透析し、Ｆａｂ製剤からインタクトなＩｇＧまたはＦｃを分離するため、陰イオン交換セファロース（GE Healthcareから入手したQ-Sepharose Fast flow）カラムを通した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過（Sephacryl S- 300カラム；上記）による分析は、該Ｆａｂ製剤中にインタクトなＩｇＧは検出されないことを示した。
【００６３】
５Ｃ９ＩｇＧは、Sanders J, Oda Y, Roberts S, Kiddie A, Richards T, Bolton J, McGrath V, Walters S, Jaskolski D, Furmaniak J, Rees Smith B 1999. The interaction of TSH receptor autoantibodies with 125I-labelled TSH receptor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1999 84: 3797-3802に記載されているように125Ｉにて標識するか、またはビオチンヒドラジド（Perbio Science、クラムリントン、英国）にて標識した。
【００６４】
125Ｉ−ＴＳＨまたは125Ｉ−Ｍ２２または125Ｉ−５Ｃ９のＴＳＨＲへの結合の阻害
国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号の記述に従い、ＴＳＨＲをコートしたチューブを用いて結合阻害アッセイを行った。このアッセイにおいて、１００μＬの試験サンプル（ＭＡｂ製剤、患者血清または非標識ＴＳＨ）および５０μＬの開始緩衝液（RSR Ltd）を、ＴＳＨＲをコートしたチューブ内で穏やかに振とうしながら、室温で２時間インキュベートした。吸引後チューブを洗浄し、１００μＬの125Ｉ−標識タンパク質（５ｘ１０4ｃｐｍ）を加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後チューブを吸引、洗浄し、ガンマカウンター中で計数した。
【００６５】
標識タンパク質の結合の阻害は以下のように算出した。
【数１】
コントロール物質は種々の実験結果に示すように、健常血液ドナー血清のプール、または個々の健常血液ドナー血清、またはその他の物質であった。
【００６６】
５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合のスキャッチャード解析
５０μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中の非標識５Ｃ９ＩｇＧおよび５０μＬの125Ｉ−標識５Ｃ９ＩｇＧ（アッセイ緩衝液中で３０，０００ｃｐｍ）を、ＴＳＨＲをコートしたチューブ内で振とうしながら、室温で２時間インキュベート（これらの条件下で最大の結合が生じた）、吸引し、１ｍＬのアッセイ緩衝液で２回洗浄し、ガンマカウンター中で計数した。結合定数を求めるため、結合したＩｇＧの濃度に対して結合濃度／遊離濃度をプロットした（Scatchard G 1949 The attraction of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences 51: 660-672）。
【００６７】
サイクリックＡＭＰ産生刺激の解析
５Ｃ９ＩｇＧおよびその他の製剤の、ヒトＴＳＨＲを導入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生の刺激能を、国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号の記述に従い試験した。細胞あたり約５ｘ１０4または約５ｘ１０5のＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルプレート内にウェルあたり３ｘ１０4細胞まき、ウシ胎仔血清を含まないＤＭＥＭ（Invitrogen Ltd、ペーズリー、英国）に適応させた後、試験サンプル（ＴＳＨ、ＩｇＧまたは患者血清）を加え（１ｇ／Ｌのグルコース、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、２２２ｍｍｏｌ／Ｌのシュクロース、１５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、および０．５ｍｍｏｌ／Ｌの３ イソブチル−１−メチルキサンチン
ｐＨ７．４を含み、ＮａＣｌを含まないハンクス緩衝塩溶液であるサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中に希釈して、１００μＬ）、３７℃で１時間インキュベートした。試験溶液の除去後、細胞を溶解し、ライセート中のサイクリックＡＭＰ濃度を以下の２つの方法のうちの１つによりアッセイした：１）GE Healthcare (チャルフォント・セント・ジャイルズ、英国)から入手したBiotrak enzyme immunoassay systemの使用、または２）Assay Designs; Cambridge Bioscience（英国）から入手したDirect Cyclic AMP Correlate-EIA kitsの使用。結果は、細胞ライセート（２００μＬ）中のサイクリックＡＭＰをｐｍｏｌ／ｍＬにより、または細胞ウェルあたりのｆｍｏｌにより表した。
【００６８】
アンタゴニスト（遮断）活性の測定
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞において、５Ｃ９ＩｇＧおよびその他の製剤が、ブタ（ｐ）ＴＳＨ、天然ヒト（ｈ）ＴＳＨ、およびリコンビナントヒト（ｒｈ）ＴＳＨ、ＭＡｂＭ２２、および患者血清ＴＲＡｂの刺激活性を阻害する能力を評価した。これは、ＴＳＨ、Ｍ２２、またはＴＲＡｂの刺激効果を５Ｃ９ＩｇＧ（またはその他の試験される製剤）
の非存在下および存在下において比較することにより行なわれた。アッセイは、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中に希釈した５０μＬの５Ｃ９（またはその他の試験される製剤）を細胞ウェルに加え、続いて５０μＬのＴＳＨまたはＭ２２または患者血清（サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中に適宜希釈）を加えること以外は上記のように行なわれ、上記の刺激アッセイと同様にインキュベートおよび試験された。
【００６９】
５Ｃ９に加え、その他のＭＡｂおよび遮断性ＴＲＡｂをもつ患者由来の血清がこのアッセイにおいて試験された。
【００７０】
可変領域遺伝子解析
５Ｃ９重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子は国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号の記述に従い、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）反応のためのｍＲＮＡを作製するため、５Ｃ９ＩｇＧを分泌する１ｘ１０7のヘテロハイブリドーマ細胞から調整した全ＲＮＡを用いて決定した。ＩｇＧ１ＨＣおよびカッパＬＣに特異的なセンスおよびアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーは、Medical Research CouncilのV-base（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）を用いてデザインし、Invitrogen（ペーズリー、ＰＡ４ ９ＲＦ、英国）により合成した。ＲＴ反応は５０℃１５分間で行い、それに続いて９４℃１５秒間、５０℃３０秒間、および７２℃３０秒間で４０サイクルのＰＣＲを行なった。ＤＮＡ産物はｐＵＣ１８中にクローニングし、Sanger-Coulson法によりシークエンスした（Sanger
F, Nicklen S, Coulson AR 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors.
Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 74: 5463-5467）。Ｖ領域の配列は、Ig blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いて、入手できるヒトＩｇ遺伝子の配列と比較した。
【００７１】
ヒトＴＳＨＲ配列のアミノ酸変異の、５Ｃ９活性における効果の解析
ＴＳＨＲ配列中に特異的変異を導入するために使用された方法は、特許出願の国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されている。さらに、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを用いたＣＨＯ細胞への変異ＴＳＨＲコンストラクトのトランスフェクションもまた、国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されている。
【００７２】
野生型または変異ＴＳＨＲのいずれかを発現するＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートにまき、５Ｃ９製剤がＴＳＨ、Ｍ２２、または患者血清ＴＲＡｂの刺激活性を遮断する能力を試験するため上記のように使用した。
【００７３】
ＴＳＨＲ抗体、ＴＳＨおよび関連分子のための５Ｃ９に基づいたアッセイ
２．５５ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧを１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中に透析し、ＩｇＧのビオチンに対する分子比１／１０により、EZ-Link NHS-LC-Biotin（Perbio）と反応させた。試験血清サンプル（７５μＬ）を、ＴＳＨＲをコートしたＥＬＩＳＡプレートウェル（RSR Ltd）中で振とう（１分間に５００振とう）しながら、室温で２時間インキュベートした。試験サンプルを除去および洗浄した後、ビオチン標識５Ｃ９ＩｇＧ（１００μＬ中に２ｎｇ）を加え、インキュベーションを室温で２５分間、振とうなしで継続した。ウェルを空にし、洗浄して１００μＬのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（１００μＬ中に１０ｎｇ；RSR Ltd）を加え、室温で２０分間、振とうなしでインキュベートした。その後ウェルを３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；１００μＬ；RSR Ltd）を加え、暗所において室温で３０分間、振とうなしでインキュベートした。その後反応を停止させるため５０μＬの０．５ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、各プレートウェルの吸光度を４５０ｎｍにて読み取った。５Ｃ９ＩｇＧ−ビオチン結合の阻害は、以下のように算出した。
【数２】
【００７４】
結果
５Ｃ９分泌細胞株の単離およびクローニング
２０ｍＬの患者血液から得られたリンパ球（２７ｘ１０6）にＥＢＶを感染させ、４８ウェルプレート内のマウスマクロファージフィーダー層上に、ウェルあたり１ｘ１０6の細胞をまいた。ＥＢＶ感染後１３日目に、プレートウェルの上清の、125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害についてモニターした。陽性ウェルからの細胞を増殖させ、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５ハイブリドーマ細胞株と融合し、９６ウェルプレートにまいた。125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害活性をもつ抗体を安定に産生する１クローンを得て、４回再クローニングした。ヘテロ−ハイブリドーマ培養上清から精製され、５Ｃ９と名付けられたモノクローナル抗体は、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１のサブクラスである。
【００７５】
５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合および遮断活性
様々な濃度における５Ｃ９ＩｇＧの、標識ＴＳＨまたは標識Ｍ２２または標識５Ｃ９それ自体のＴＳＨＲへの結合に対する阻害能を表１に示す。表１に示すように、最少量０．００５μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧによって125Ｉ−ＴＳＨ結合の１２％の阻害が認められ、この阻害は１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９による８４％の阻害に至るまで量依存性に増大した。これはドナー血清ＩｇＧによる125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害、すなわち０．０５ｍｇ／ｍＬにおける１３％の阻害から、１ｍｇ／ｍＬにおける９４％の阻害までの量依存的な増大と比較することができる。ドナー血漿の場合、健常人血液ドナープール血清の１：１６０希釈においては125Ｉ−ＴＳＨ結合の１６％の阻害が認められ、１：１０希釈においては９５％の阻害が認められた。
【００７６】
５Ｃ９ＩｇＧはまた、ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの結合に対する効果を有していた（表１）。０．０１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧによって、125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合の９％の阻害が認められ、濃度を増大させることにより、１００μｇ／ｍＬにおける８５％に至るまでの阻害の量依存的な増大がもたらされた。ドナー血清ＩｇＧは、９％の阻害を起こす０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて有効であり、この効果は１ｍｇ／ｍＬにおける８９％の阻害まで量依存的に増大した。ドナー血清血漿は、１：３２０の希釈において125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合の１３％の阻害を示し、１：１０の希釈において９１％の阻害を示した。
【００７７】
非標識５Ｃ９ＩｇＧは、ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９の結合を量依存的に阻害（０．００５μｇ／ｍＬにおける１１％の阻害から、１００μｇ／ｍＬにおける８８％の阻害まで）（表１−２）することができた。125Ｉ−５Ｃ９の結合はまた、ドナー血清ＩｇＧによっても阻害（０．０５ｍｇ／ｍＬにおける１５％の阻害、および１ｍｇ／ｍＬにおける９１％の阻害）され、同様にドナー血漿の希釈によっても阻害（１：３２０希釈における１０％の阻害、および１：１０希釈における９２％の阻害）された。
【００７８】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨおよびＭ２２を介したサイクリックＡＭＰの刺激に対する、５Ｃ９ＩｇＧの遮断能を表２ａ−ｃに示す。ブタＴＳＨ（３ｎｇ／ｍＬ）は、サイクリックＡＭＰ産生を強力に刺激した（１９，０２０±２１５４ｆｍｏｌ／細胞ウェル；平均±ＳＤ；ｎ＝３）（表２ａ）。０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在で、ブタＴＳＨの刺激活性は１１８７４±４２１４ｆｍｏｌ／細胞ウェル（平均±ＳＤ；ｎ＝３）まで減少し、かつ１μｇ／ｍＬの５Ｃ９の存在下ではわずかに２，２０８±３２
９ｆｍｏｌ／細胞ウェルのサイクリックＡＭＰが産生されたことから、この阻害効果は５Ｃ９濃度に依存していた（表２ａ）。リンパ球ドナー血清もまた、ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰ刺激の強力な阻害効果を有していた。表２ａに示すように、サイクリックＡＭＰ産生は血清非存在下での１９０００ｆｍｏｌ／細胞ウェルに比較して、１：１０希釈のドナー血清（この希釈における全血清ＩｇＧ濃度は１．４３ｍｇ／ｍＬ）存在下では約６０００ｆｍｏｌ／細胞ウェルへ減少する阻害が生じた。この効果は、約０．３７μｇ／ｍＬの精製５Ｃ９ＩｇＧによる効果に一致していた（表２ａに示す、様々な濃度の５Ｃ９ＩｇＧによる効果の希釈曲線から算出した）。このことは、ＴＳＨのサイクリックＡＭＰ産生刺激能を遮断する能力に関して、精製５Ｃ９ＩｇＧはドナー血清ＩｇＧよりも約３９００倍強い活性があることを示している。
【００７９】
５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2および５Ｃ９Ｆａｂのような５Ｃ９の断片もまた、ＴＳＨ刺激の有効な阻害剤であった。特に、１００μｇ／ｍＬにおける５Ｃ９ＩｇＧ、５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2、および５Ｃ９ＦａｂのＴＳＨ刺激阻害活性は同等であった（表２ｂ）。１０μｇ／ｍＬにおける３種の全ての製剤、すなわち５Ｃ９ＩｇＧ、５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2、および５Ｃ９ＦａｂもまたＴＳＨ刺激活性の強力な阻害剤であったが、５Ｃ９ＩｇＧは５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）2または５Ｃ９Ｆａｂよりもさらに効果的と考えられた（表２ｂ）。
【００８０】
Ｍ２２Ｆａｂ（３ｎｇ／ｍＬ）はサイクリックＡＭＰの強力な刺激剤である（９，４３２±８２２ｆｍｏｌ／細胞ウェル）（表２ｃ）。５Ｃ９の存在下でのＭ２２Ｆａｂの刺激効果は量依存的に阻害され、０．１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下でのサイクリックＡＭＰ濃度は１，２９８±１３４ｆｍｏｌ／細胞ウェルに減少した。Ｍ２２刺激の完全な阻害は、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９により生じた（表２ｃ）。
【００８１】
スキャッチャード解析は、ＴＳＨＲに結合する125Ｉ−標識５Ｃ９の結合定数は４ｘ１０10Ｌ／ｍｏｌであることを示した。
【００８２】
ＴＳＨＲへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合の、血清ＴＲＡｂによる阻害
ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧの結合に対する血清ＴＲＡｂの阻害能を表３および図１に示す。125Ｉ−ＴＳＨの結合および125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの結合に対する同じ血清ＴＲＡｂの効果もまた、比較のために示した。
【００８３】
125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧのＴＳＨＲへの結合は、１０名の異なる健常血液ドナー（Ｎ１−Ｎ１０、表３）からの血清によって、明らかには阻害されなかった（阻害範囲は３．４−１８．９％）。125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２の阻害アッセイ（表３）において、全てがＴＳＨＲ自己抗体陽性であるグレーブス病の患者４０名（Ｇ１−Ｇ４０、表３）からの血清は、ＴＳＨＲをコートしたチューブへの125Ｉ−５Ｃ９の結合に対して健常血液ドナーからの血清よりも程度の大きな阻害を示した（阻害範囲は２２．０−８５．２％）（表３）。ＴＳＨＲに対する125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ、125Ｉ−ＴＳＨ、または125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの結合に対する患者血清ＴＲＡｂの阻害能は、ピアソン相関係数ｒ＝０．９５（125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−ＴＳＨ；図１ａ）およびｒ＝０．９５（125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ対125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ；図１ｂ）で、同程度であった。図１ｃは、同血清による125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧの阻害の比較を示す（ピアソン相関係数ｒ＝０．９９）。
【００８４】
これらの実験は、ＴＳＨＲへの５Ｃ９ＩｇＧ結合が血清ＴＲＡｂによって効果的に阻害されること、および５Ｃ９ＩｇＧ結合における血清ＴＲＡｂの阻害効果は、ＴＳＨまたはＭ２２結合におけるこれらの阻害効果に類似していることを示している。
【００８５】
表４は、ＴＳＨ遮断活性を有する患者血清ＴＲＡｂ（Ｂ１−Ｂ５）および強力な甲状腺
刺激活性を有する患者血清ＴＲＡｂ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４）の様々な希釈による、125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合の阻害を示す。125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合は、血清Ｂ１−Ｂ５により、同様に血清Ｓ１、Ｓ２、およびＳ４により量依存的に阻害された。同遮断性および刺激性血清はまた、125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合を量依存的に阻害し、さらに３種の全ての標識リガンドに対する阻害のパーセンテージは血清の同希釈において同程度であった（表４ａおよびｂ）。
【００８６】
これらの結果は、刺激活性および遮断活性の両方を有するＴＳＨＲ自己抗体は、ＴＳＨＲへの５Ｃ９結合を阻害することを示している。
【００８７】
ＴＳＨ結合阻害活性を有するマウスＭＡｂによる、ＴＳＨＲへの125Ｉ−５Ｃ９ＩｇＧ結合の阻害
125Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性をもつ様々なマウスＴＳＨＲＭＡｂの、ＴＳＨＲへの125Ｉ−５Ｃ９結合の阻害能を試験し、125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合における効果と比較した（表５）。表５に示すように、125Ｉ−ＴＳＨおよび125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧ結合に対する阻害能を有する全てのＭＡｂは125Ｉ−５Ｃ９結合もまた阻害したが、幾つかのＭＡｂの場合、125Ｉ−５Ｃ９および125Ｉ−Ｍ２２結合における阻害効果は125Ｉ−ＴＳＨ結合における阻害効果よりも弱かった。
【００８８】
これらの実験は、ＴＳＨＲ上の５Ｃ９に対する結合部位と、ＴＳＨ結合の阻害能を有するマウスＴＳＨＲＭＡｂに対する結合部位の間にかなりの重複があることを示唆している。
【００８９】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における、患者血清によるサイクリックＡＭＰの産生刺激に対する５Ｃ９ＩｇＧの効果
表２に示すように、５Ｃ９ＩｇＧはＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内のサイクリックＡＭＰ濃度に関するＴＳＨまたはＭ２２の刺激を遮断することができた。一連の異なる実験において、患者血清ＴＲＡｂの刺激活性における５Ｃ９ＩｇＧの効果を試験した。その結果を表６ａに示す。血清Ｔ１−Ｔ９およびＴ１１−Ｔ１８はＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞内のサイクリックＡＭＰ産生を刺激し、コントロールＭＡｂＩｇＧ（ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに特異的な２Ｇ４）とのインキュベーションはそれらの刺激活性への影響をもたなかった。しかしながら、５Ｃ９ＩｇＧ（２００μｇ／ｍＬを５０μＬ）の存在下では、試験された全ての血清の刺激活性は明らかに減少した（表６ａ）。
【００９０】
６種の異なる血清（Ｔ１、Ｔ６、Ｔ３、Ｔ１９、Ｔ２０、Ｔ２１）の量反応効果を表６ｂ−ｇに示す。これらの実験において、０．１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度の５Ｃ９ＩｇＧは血清の刺激活性の量依存的減少を起こし、５Ｃ９ＩｇＧの効果は血清Ｔ３を除く全ての試験された血清において、遮断活性をもつＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体９Ｄ３３（国際公開第２００４／０５０７０８Ａ２号に記載）の効果と同程度であった。Ｔ３血清の場合（表６ａおよび６ｄ）、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下においてサイクリックＡＭＰ産生の約５０％の阻害が観察されたが、１００μｇ／ｍＬの９Ｄ３３ＩｇＧはほとんど完全な阻害をもたらした。このことは、５Ｃ９および９Ｄ３３によって認識されるエピトープの間に、ある小さな違いがある可能性を示唆した。
【００９１】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ産生における５Ｃ９ＩｇＧの効果
ＴＳＨおよびＴＳＨＲ抗体の刺激活性の阻害と同様に、５Ｃ９はこれらの甲状腺刺激剤の非存在下で産生されるサイクリックＡＭＰの量を阻害した。特に表６ｂは、１００μｇ／ｍＬのコントロールモノクローナルＩｇＧ（２Ｇ４）の存在下で産生された１２０７±
１２３ｆｍｏｌ／細胞ウェルのサイクリックＡＭＰが、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下で３０１±３８ｆｍｏｌ／細胞ウェルに減少したことを示している。９Ｄ３３ＩｇＧの効果は、１００μｇ／ｍＬの９Ｄ３３ＩｇＧの存在下での７２１±１８３ｆｍｏｌ／細胞ウェルの産生より、少なかった。表６ｄ、６ｅ、６ｆおよび６ｇに示す別々の実験において同様の結果が得られた。このことは、５Ｃ９ＩｇＧがＴＳＨＲの基本的、または恒常的活性において著しい効果を有することを示している。
【００９２】
アミノ酸変異を含むＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内サイクリックＡＭＰの産生刺激における５Ｃ９ＩｇＧの効果
ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞内でのブタＴＳＨのサイクリックＡＭＰ刺激活性に対する５Ｃ９の遮断能における、ＴＳＨＲの単一アミノ酸変異の効果を表７に示す。特に以下の残基：Ｌｙｓ５８、Ｉｌｅ６０、Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ｔｈｒ１０４、Ａｒｇ１０９、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３４、Ａｓｐ１５１、Ｌｙｓ１８３、Ｇｌｎ２３５、Ａｒｇ２５５、Ｔｒｐ２５８、Ｓｅｒ２８１をアラニンに変異させたＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞において、サイクリックＡＭＰ産生刺激に対する５Ｃ９の効果を調べた。さらに、ＴＳＨＲの残基：Ａｒｇ８０Ａｓｐ、Ａｓｐ１５１Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８３Ａｓｐ、Ａｒｇ２５５Ａｓｐの事例において、電荷の変化による変異（change of charge mutation）の効果を調べた。ここでは従来の表記法に従い、置換されたアミノ酸残基、およびその一次配列ポリペプチド内の位置を置換アミノ酸残基の前に示す。以前の研究は、ＴＳＨＲの電荷の変化による変異（change of charge mutation）であるＡｓｐ１６０ＬｙｓはＴＳＨＲのＴＳＨに対する反応性の喪失の原因となったが、Ｍ２２に対する反応は影響されなかったことを示している（特許出願国際公開第ＷＯ２００６／０１６１２１Ａ号）。従って、５Ｃ９の生物活性におけるＴＳＨＲのＡｓｐ１６０Ｌｙｓ変異の効果は、Ｍ２２をＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるサイクリックＡＭＰ刺激剤として使用することにより調べられた（表７１）。
【００９３】
研究された全てのＴＳＨＲ変異のうち、３種の変異のみがアンタゴニストとして作用する５Ｃ９の能力に影響することが見出された。Ｌｙｓ１２９のＡｌａへの変異（表７ｈ）は、サイクリックＡＭＰ産生のＴＳＨによる刺激を遮断する５Ｃ９ＩｇＧの能力の完全な喪失をもたらした。
【００９４】
ＴＳＨＲ変異であるＬｙｓ１８３Ａｌａもまた、５Ｃ９ＩｇＧの遮断活性の部分的な減少の原因となった。試験の際、１μｇ／ｍＬにおいてＴＳＨＲのＬｙｓ１８３Ａｌａ変異ではＴＳＨ刺激の２８％の阻害が観察され、これは野生型ＴＳＨＲによる８４％の阻害と比較される（表７ｍ）。１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧにおいても、ＴＳＨＲのＬｙｓ１８３Ａｌａ変異を用いた実験ではＴＳＨ刺激の部分的な阻害（４３％）のみが検出されたが、野生型レセプターを用いた実験においては、同濃度においてＴＳＨ刺激活性の完全な遮断（９３％）が観察された(表７ｍ)。陽性荷電のＬｙｓ１８３を陰性荷電のアスパラギン酸に変異させると、５Ｃ９の生物活性における効果はＬｙｓ１８３Ａｌａ変異によって観察されたそれに類似した(表７ｍ）。このことは、Ｌｙｓ１８３が５Ｃ９の生物活性に重要であることを示唆している。Ａｓｐ１５１Ａｌａ変異の場合、５Ｃ９ＩｇＧ遮断活性のわずかな減少；１μｇ／ｍＬにおいて、野生型による８８％の遮断と比較して４９％の阻害が観察された(表７ｊ)。しかしながら１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下では、この活性は野生型のＴＳＨＲによるものと同等であった。陰性荷電のＡｓｐ１５１を陽性荷電のアルギニンに変異させると、５Ｃ９ＩｇＧ遮断活性の有意な減少は観察されなかった（表７ｋ）。
【００９５】
５Ｃ９活性におけるＴＳＨＲ変異の効果は、９Ｄ３３活性におけるＴＳＨＲ変異の効果と比較できる。特許出願国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されているように、ＴＳＨＲのＬｙｓ５８、Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ａｒｇ１０９、Ｌｙｓ１２９および
Ｐｈｅ１３４の変異は、９Ｄ３３活性における効果を有していた。しかしながらＬｙｓ１２９を除いたこれらの変異のいずれもまた、５Ｃ９活性における効果を有してはいなかった。さらに、特許出願国際公開第２００６／０１６１２１Ａ号に記載されているようなＭ２２活性に影響する変異（Ａｒｇ８０、Ｔｙｒ８２、Ｇｌｕ１０７，Ａｒｇ１０９，Ｌｙｓ１２９，Ｐｈｅ１３０、Ｌｙｓ１８３、Ｔｙｒ１８５、Ａｒｇ２５５およびＴｒｐ２５８）であるＬｙｓ１２９を除いたこれらの変異のいずれも、５Ｃ９活性には影響しなかった。さらに、Ｌｙｓ１８３変異は５Ｃ９活性およびＭ２２活性において部分的効果を有していたが、９Ｄ３３活性における効果は有していなかった。
【００９６】
これらの結果は、甲状腺刺激性ヒト自己抗体Ｍ２２、マウス遮断性抗体９Ｄ３３、およびヒト遮断性自己抗体５Ｃ９との相互作用に重要なＴＳＨＲ残基は異なっていることを示している。従って、５Ｃ９とアンタゴニスト活性をもつその他のＴＳＨＲ抗体（例えば９Ｄ３３）との組み合わせは、患者血清ＴＲＡｂ、その他の刺激剤による刺激活性および／またはＴＳＨＲの恒常的活性を阻害するための特に有効な手段となり得る。
【００９７】
５Ｃ９の可変領域配列
５Ｃ９をコードする遺伝子の配列解析は、ＨＣのＶ領域遺伝子はＶＨ３−５３ファミリー由来、Ｄ遺伝子はＤ２−２ファミリー由来、およびＪ遺伝子はＪＨ４ファミリー由来であることを示した。ＬＣの場合、Ｖ領域遺伝子はＯ１２ファミリー由来、およびＪ領域遺伝子はＪＫ２の生殖系列由来であった。ＨＣのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図２ａおよび２ｂそれぞれに示され、ＬＣのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図３ａおよび３ｂそれぞれに示される。
【００９８】
生殖系列配列と比較して、ＨＣ遺伝子配列には体細胞変異、特にＦＷＲ１には１個のサイレント変異、ＣＤＲ２には２個の置換変異、ＣＤＲ３には１個のサイレント変異および１個の置換変異、およびＦＷＲ４には１個のサイレント変異が存在する。しかしながらＨＣのＶ領域配列は２個の挿入、すなわちＶおよびＤ遺伝子の間の長さ６塩基対の１個、および、ＤおよびＪ遺伝子の間の長さ１５塩基対の１個により特徴付けられる。従って、ＨＣのＣＤＲ１は長さ５アミノ酸、ＣＤＲ２は長さ１６アミノ酸、およびＣＤＲ３は長さ１８アミノ酸となる(図２ｂ）。
【００９９】
ＬＣ配列では、ＦＷＲ１には１個のサイレント変異、ＣＤＲ１には１個の置換変異、ＣＤＲ３には１個の置換変異、および、ＶおよびＪ遺伝子の間に長さ６塩基対の１個の挿入が存在する。ＬＣのＣＤＲ１は１１アミノ酸、ＣＤＲ２は７アミノ酸、およびＣＤＲ３は１０アミノ酸よりなる(図３ｂ）。
【０１００】
ＴＳＨまたはＴＲＡｂ検出のための５Ｃ９に基づくアッセイ
ＴＳＨＲ自己抗体を検出するための、ＴＳＨＲをコートしたプレートウェルへの５Ｃ９ＩｇＧ−ビオチン結合に基づいたＥＬＩＳＡの例を表８に示す。このアッセイにおいて、ＴＳＨ−ビオチン結合の阻害に対して陽性の全てのサンプルは、５Ｃ９ＩｇＧ−ビオチン結合に対してもまた陽性であった。さらに、吸光度シグナル、パーセント阻害、および組立単位／Ｌ値は、ＴＳＨ−ビオチンおよび５Ｃ９−ビオチンアッセイの間で同程度であった(表８）。
【０１０１】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞へのマウス甲状腺刺激性モノクローナル抗体(マウスＴＳＨＲＭＡｂ；ＴＳＭＡｂ）の刺激活性に対する５Ｃ９ＩｇＧの効果
表９に示すように５Ｃ９ＩｇＧは、試験された５種の全てのＴＳＭＡｂ（１，２，４，５および７）によるサイクリックＡＭＰ産生の刺激を遮断することができた。例えばＴＳＭＡｂ１(表９)により刺激されたサイクリックＡＭＰの濃度は１８．９４±７．４ｐｍｏｌ／ｍＬであったが、１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下ではわずかに１．２４±
０．０７ｐｍｏｌ／ｍＬのサイクリックＡＭＰが産生された。これは、１００μｇ／ｍＬのコントロールＭＡｂ２Ｇ４の存在下でのサイクリックＡＭＰの濃度である、１６．５±１．１ｐｍｏｌ／ｍＬと比較することができる(表９)。
【０１０２】
以下の表９、同様に表１０−１５に示すサイクリックＡＭＰ濃度はｐｍｏｌ／ｍＬで表している。すなわち、細胞ウェルあたりのサイクリックＡＭＰの量はｐｍｏｌ／ｍＬ÷５（アッセイされた各ウェルからのサンプル２００μＬを表す）である。
【０１０３】
ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞への天然ヒトＴＳＨおよびリコンビナントヒトＴＳＨの刺激活性に対する５Ｃ９ＩｇＧの効果
ブタＴＳＨによるサイクリックＡＭＰ刺激を遮断する５Ｃ９ＩｇＧの能力を、表２および表１０に示す。さらに、５Ｃ９ＩｇＧは天然ヒトＴＳＨ（NIBSC reference preparation 81/565 from National Institute for Biological Standards and Control, South Mimms, Potters Bar EN6 3QG UK）およびリコンビナントＴＳＨ（NIBSC reference preparation 94/674）両者のサイクリックＡＭＰ刺激に対する阻害能を示した(表１０）。特に１００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントまたは天然ヒトＴＳＨいずれかによるサイクリックＡＭＰ産生刺激は、サイクリックＡＭＰ産生の完全な阻害を得るために０．１−１．０μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧを要求する。５Ｃ９分離のための血液採集時におけるドナー血清中の循環ＴＳＨ濃度は１６０ｍＵ／Ｌ（約３２ｎｇ／ｍＬ）であり、得られた結果(表２ａおよび表１０）は、この濃度の循環ＴＳＨは血清中の３２−３２０ｎｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在により完全に遮断され得ることを示している。ドナー血清中のＴＳＨＲ自己抗体の濃度は、ＴＳＨＲへの125Ｉ−Ｍ２２結合の阻害（Nakatake N, Sanders J, Richards T, Burne P, Barrett C, Dal Pra C, Presotto F, Betterle C, Furmaniak J, Rees Smith
B 2006 Estimation of serum TSH receptor autoantibody concentration and affinity. Thyroid 16: 1077-1084に記載されているように）を用いることにより１７００ｎｇ／ｍＬ（１２０ｎｇ／ｍｇ）と推定された。これはすなわち、ＴＳＨによる甲状腺刺激の遮断に要求される５Ｃ９の濃度よりも数倍高めである。
【０１０４】
活性化変異であるＳ２８１Ｉ、Ｉ５６８ＴおよびＡ６２３ＩをもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性における５Ｃ９ＩｇＧの効果
５Ｃ９ＩｇＧは、甲状腺活性化剤（すなわちＴＳＨまたはＴＳＨＲ抗体）の非存在下で、活性化変異をもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内で産生されるサイクリックＡＭＰの量を減少させることができた。表１１ａに示すように、活性化変異であるＳ２８１ＩをもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞内の基本的なサイクリックＡＭＰ濃度は５Ｃ９の非存在下で９．９０±１．５１ｐｍｏｌ／ｍＬであり、これは０．０１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下で４．１７±０．６０ｐｍｏｌ／ｍＬに減少し、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの存在下で３．４４±０．６３ｐｍｏｌ／ｍＬに減少した。遮断性マウスＴＳＨＲＭＡｂ９Ｄ３３は、コントロールＭＡｂ２Ｇ４と同程度のわずかな効果を有した（表１１ａ）。
【０１０５】
２１．３９±５．３１ｐｍｏｌ／ｍＬの基本的なサイクリックＡＭＰ濃度を示す、ＴＳＨＲ活性化変異のＩ５６８Ｔによって同様の結果が得られた（表１１ｂ）。これは１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの添加によって５．２９±０．７５ｐｍｏｌ／ｍＬに減少し、２Ｇ４ＩｇＧ、および５Ｃ９ＩｇＧを添加した場合の、２０．５２±０．９５ｐｍｏｌ／ｍＬ、および２１．６５±１．９９ｐｍｏｌ／ｍＬそれぞれと比較される。３６．８９ｐｍｏｌ／ｍＬの基本的なサイクリックＡＭＰ濃度を有する、研究された第３のＴＳＨＲ活性化変異であるＡ６２３Ｉの場合は、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧの添加によりサイクリックＡＭＰ濃度は１６．４３±１．２７ｐｍｏｌ／ｍＬに減少し、これは１μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧである２Ｇ４によるわずかな効果（２８．９６±２．２９ｐｍｏｌ／ｍＬ）または１μｇ／ｍＬの９Ｄ３３ＩｇＧ（４０．０９±７．７３ｐｍｏｌ／ｍＬ）と比較
される（表１１ｃ）。
【０１０６】
これらの結果は、５Ｃ９はマウス遮断性ＭＡｂの９Ｄ３３とは異なり、たとえＴＳＨＲ活性化変異がＴＳＨＲの異なる部分に存在していても（すなわち、Ｓ２８１Ｉは細胞外ドメインにあり、Ｉ５６８Ｔは膜貫通ドメインの２番目の細胞外ループにあり、かつＡ６２３Ｉは膜貫通ドメインの３番目の細胞内ループにある）、これらの変異に関連したサイクリックＡＭＰ産生において著しい効果を有することを示している。
【０１０７】
野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する、５Ｃ９およびマウスＴＳＨＲ遮断性モノクローナル抗体９Ｄ３３およびこれら２種の抗体の混合物の効果の比較
前記の実験および表１２に示すように、低くとも１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＴＳＨＲ遮断性ＭＡｂ５Ｃ９およびマウスＴＳＨＲ遮断性ＭＡｂ９Ｄ３３は、ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるＴＳＨのＴＳＨＲサイクリックＡＭＰ刺激活性に対する遮断能を有する。表１２の実験１−５に示すように、ＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰの刺激に対する９Ｄ３３ＩｇＧおよび５Ｃ９ＩｇＧの効果は相加的であった。刺激に２つの異なった濃度のＴＳＨ（３ｎｇ／ｍＬおよび０．３ｎｇ／ｍＬ）を用いた際、同じ相加的効果が観察された（表１２；実験１−３および実験４および５の各実験）。
【０１０８】
野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＭ２２を介したサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する、５Ｃ９およびマウスＴＳＨＲ遮断性モノクローナル抗体９Ｄ３３およびこれら２種の抗体の混合物の効果の比較
以前に示したように、５Ｃ９および９Ｄ３３は、ＣＨＯ−ＴＳＨＲ細胞におけるＭ２２Ｆａｂを介したサイクリックＡＭＰの刺激もまた阻害できる。Ｍ２２を介したサイクリックＡＭＰの刺激に対する９Ｄ３３ＩｇＧおよび５Ｃ９ＩｇＧの効果は相加的であった（表１３、実験１−４）。刺激に２つの異なった濃度のＭ２２Ｆａｂ（３ｎｇ／ｍＬおよび０．３ｎｇ／ｍＬ）を用いた際、同じ相加的効果が観察された（表１３；実験１および２、および実験３および４の各実験）。
【０１０９】
５Ｃ９ＩｇＧおよび９Ｄ３３ＩｇＧの相加的効果は、ＴＳＨおよびＭ２２の両者を介したサイクリックＡＭＰ産生の刺激について同様であった（表１２および１３）。
【０１１０】
野生型ＴＳＨＲを細胞あたり多数発現するＣＨＯ細胞内の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性における５Ｃ９の効果
細胞あたり約５ｘ１０5のレセプターを発現するＣＨＯ細胞株は、以前の実験（例えば表９−１３）で用いた標準的なＣＨＯ細胞株(細胞あたり約５ｘ１０4のＴＳＨＲを発現する)に比較して高濃度の基本的（すなわち無刺激の）サイクリックＡＭＰを示した。すなわち、それぞれの濃度は、約１．０ｐｍｏｌ／ｍＬに比較して４７．１±１１．７ｐｍｏｌ／ｍＬである。野生型ＴＳＨＲの基本的活性における５Ｃ９ＩｇＧおよび９Ｄ３３ＩｇＧの効果を、細胞あたり多数のレセプターを発現する細胞株を用いて評価した。９Ｄ３３ＩｇＧおよびネガティブコントロールの抗ＧＡＤ抗体（５Ｂ３）とのインキュベーションは、基本的サイクリックＡＭＰ活性の０−５．３％の阻害をもたらした(表１４；実験１)。このことは、マウス遮断性ＭＡｂ９Ｄ３３またはコントロールＭＡｂは、野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対して効果をもたないことを示している。しかしながら５Ｃ９ＩｇＧの場合、基本的サイクリックＡＭＰ活性の明らかな阻害が観察された(表１４；実験２）。すなわち、０．１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの濃度はそれぞれ、４５．７％および７４．６％の阻害を起こした。さらに、５Ｃ９Ｆａｂおよび５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）もまた、細胞あたり多数のＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における基本的サイクリックＡＭＰ活性の有効な阻害剤であった(表１４、実験３)。例えば、１μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９Ｆａｂはそれぞれ、基本
的なサイクリックＡＭＰ産生の３９％および６１％の阻害を示し、これは１００μｇ／ｍＬの５Ｃ９Ｆ（ａｂ’）による４８％の
阻害と比較される(表１４、実験３)。
【０１１１】
アンタゴニスト（すなわち遮断性）活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、活性化変異Ｉ５６８Ｔを有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
ＴＳＨＲＩ５６８Ｔ細胞によるサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生（２０．５±８．７ｐｍｏｌ／ｍＬ）は、試験された健常血液ドナーからの正常プール血清（ＮＰＳ）または異なった３名の個々の健常血液ドナー血清（Ｎ１−Ｎ３）の１／１０および１／５０希釈における添加によって基本的に影響されなかった。ＮＰＳおよびＮ１−Ｎ３血清の存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生は、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生に比較して０−１４％の阻害を示した(表１５)。しかしながら、高濃度の遮断性ＴＲＡｂ（Ｂ２−Ｂ５）を有する４種の異なる血清の存在下では、基本的なサイクリックＡＭＰ産生の２３−８９％の阻害が観察された(表１５)。５Ｃ９ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）の存在下では、ＴＳＨＲＩ５６８Ｔの基本的なサイクリックＡＭＰ活性の８３％の阻害が観察された。Ｉ５６８Ｔ変異をもつＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対する、２種の遮断性血清（Ｂ３およびＢ４）の量依存性効果もまた表１５に示す。
【０１１２】
これらの結果は、５Ｃ９が、特にＴＳＨＲ活性化変異であるＩ５６８Ｔにおける基本的なサイクリックＡＭＰ産生の阻害に関して、患者遮断ＴＳＨＲ自己抗体のＴＳＨＲ遮断活性特性を有することを示す。
【０１１３】
アンタゴニスト活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、活性化変異Ｓ２８１Ｉを有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
ＴＳＨＲＳ２８１Ｉ細胞によるサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生は１１．２±２．０ｐｍｏｌ／ｍＬであり、健常血液ドナープール血清または個々の健常血液ドナー血清（１／１０または１／５０希釈）とのインキュベーションは効果を示さなかった（表１６）。一方で、高濃度の遮断性ＴＲＡｂ（Ｂ２−Ｂ５）を有する４種の異なる血清の存在下では、基本的なサイクリックＡＭＰ産生の３１−５６％の阻害が観察された（表１６）。ＴＳＨＲＳ２８１Ｉを用いた実験において、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧは基本的なサイクリックＡＭＰ活性を７１％阻害した。
【０１１４】
アンタゴニスト活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、活性化変異Ａ６２３Ｉを有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
ＴＳＨＲＡ６２３Ｉ細胞の場合、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ産生は４３．５±１１．２ｐｍｏｌ／ｍＬであり、健常血液ドナープール血清または個々の血清とのインキュベーションによって基本的に影響されなかった。（表１７）。高濃度の遮断性ＴＲＡｂ（Ｂ２−Ｂ５）を有する４種の異なる血清とのインキュベーションでは、これらの実験においてサイクリックＡＭＰの−１％から５６％を阻害した（表１７）。このことは、同じ実験における１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧによる４９％の阻害と比較することができる。
【０１１５】
アンタゴニスト活性を有する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の、細胞あたり約５ｘ１０5の野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する効果
細胞あたり比較的多数の野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の基本的なサイクリック
ＡＭＰ産生は、この一連の実験で２８．１±０．７ｐｍｏｌ／ｍＬであった。該細胞を１／１０希釈の健常血液ドナープール血清または個々の血清（Ｎ１−Ｎ３）とインキュベートしたとき、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での基本的なサイクリックＡＭＰ濃度は９９％から１４６％の範囲であったが、１／５０希釈においてその範囲は９３％から１３７％であった。遮断性ＴＳＨＲ自己抗体を有する試験された４種の血清のうち、１種の血清（Ｂ２）は基本的なサイクリックＡＭＰ産生において効果を示さなかった（表１８）。２種の血清（Ｂ３およびＢ５）の場合、サイクリックＡＭＰ濃度は、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下で観察された濃度に比較して増大した（表１８）。血清Ｂ３およびＢ５が刺激活性および遮断活性を有するＴＳＨＲ自己抗体の混合物を含むことは十分にあり得る。一方、血清Ｂ４は１／１０および１／５０希釈において、基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対する明らかな阻害効果を有していた。すなわち基本的なサイクリックＡＭＰ濃度は、サイクリックＡＭＰ緩衝液存在下での濃度に比較してそれぞれ３１％および６１％であった（表１８）。このことは、１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ＩｇＧ存在下での濃度が、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下での濃度に比べ３３％であることと比較することができる（表１８）。
【０１１６】
概して５Ｃ９ＩｇＧは、野生型ＴＳＨＲ、または遮断性ＴＳＨＲ自己抗体陽性患者由来の血清により観察された効果に対する活性化変異を有するＴＳＨＲを導入したＣＨＯ細胞における、基本的なサイクリックＡＭＰ産生に対し同様の効果を示す。しかしながら、様々な変異の場合において個々の患者血清による効果は変動する（表１９）。野生型ＴＳＨＲの場合、ある血清は刺激効果を示す。これはおそらく遮断性自己抗体と同様にＴＳＨＲ刺激性自己抗体も存在するためである（表１９）。
【０１１７】
アミノ酸変異を含むＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する５Ｃ９の効果
アミノ酸変異を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生の刺激に対する５Ｃ９の効果は、以下の、アラニンへの変異の包含に及ぶ：Ａｓｐ４３、Ｇｌｕ６１、Ｈｉｓ１０５、Ｇｌｕ１０７、Ｐｈｅ１３０、Ｇｌｕ１７８、Ｔｙｒ１８５、Ａｓｐ２０３、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２０９、Ａｓｐ２３２、Ｌｙｓ２５０、Ｇｌｕ２５１、Ｔｈｒ２５７、Ａｒｇ２７４、Ａｓｐ２７６（表２０ａ−ｐ、および表２１に要約）。
【０１１８】
ＴＳＨＲのアミノ酸であるＡｓｐ４３、Ｇｌｕ６１、Ｈｉｓ１０５、Ｇｌｕ１０７、Ｔｙｒ１８５、Ａｓｐ２３２およびＴｈｒ２７５のアラニンへの変異は、ＴＳＨ刺激によるサイクリックＡＭＰ産生に対する５Ｃ９ＩｇＧの阻害能に効果を示さなかった。ＴＳＨ刺激によるサイクリックＡＭＰ産生に対する５Ｃ９の阻害能は、ＴＳＨＲのＰｈｅ１３０、Ｇｌｕ１７８、Ａｓｐ２０３、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２５０、Ｇｌｕ２５１およびＡｓｐ２７６のアラニンへの変異により減少した。Ｌｙｓ２０９ＡｌａおよびＡｓｐ２７４Ａｌａの２種の変異の場合、ＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰ産生に対する５Ｃ９ＩｇＧの阻害能は増大した。
【０１１９】
要約すると(表７，２０、および２１)、Ｌｙｓ１２９、Ｐｈｅ１３０、Ａｓｐ１５１、Ｇｌｕ１７８、Ｌｙｓ１８３、Ａｓｐ２０３、Ｔｙｒ２０６、Ｌｙｓ２５０、Ｇｌｕ２５１およびＡｓｐ２７６の１０種のＴＳＨＲ残基全ては、５Ｃ９のＴＳＨによるサイクリックＡＭＰ刺激に対する阻害能を、野生型ＴＳＨＲに比べて減少させた。ＴＳＨＲのＬｙｓ１２９およびＡｓｐ２０３の変異は最大の効果を示し、５Ｃ９活性の完全な阻害の原因となった。
【０１２０】
野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨを介したサイクリックＡＭＰの産生刺激に対する遮断性血清Ｂ２−Ｂ５の、Ａｓｐ２０３Ａｌａ変異ＴＳＨＲとの比較による
効果
野生型ＴＳＨＲにおける１μｇ／ｍＬの５Ｃ９による遮断効果は（ＴＳＨにより誘導されたサイクリックＡＭＰ刺激の９２％の阻害）、Ａｓｐ２０３Ａｌａ変異ＴＳＨＲにおいては４％に減少した(表２２）。
【０１２１】
遮断性血清Ｂ４の活性はＴＳＨＲのＡｓｐ２０３Ａｌａ変異により影響されなかったが、遮断性血清Ｂ２およびＢ３では、ＴＳＨＲのＡｓｐ２０３Ａｌａ変異の場合、野生型ＴＳＨＲと比較してＴＳＨにより誘導されたサイクリックＡＭＰ刺激のパーセント阻害にわずかな減少がみられた。
【０１２２】
一血清Ｂ５の場合、ＴＳＨにより誘導されたサイクリックＡＭＰ刺激のパーセント阻害に顕著な減少が観察された；すなわち、野生型ＴＳＨＲでの６９％の阻害に対して、変異ＴＳＨＲでは３０％の阻害であった。
【０１２３】
５Ｃ９活性に対するＴＳＨＲのＡｓｐ２０３Ａｌａ変異の効果は遮断性血清の活性に対する効果よりも大きかったが、試験された３／４の血清の遮断活性は様々な程度に影響された。このことは、遮断性ＴＳＨＲ自己抗体および５Ｃ９の結合部位は重複しているが、様々な血清と接触する実際のＴＳＨＲアミノ酸には幾らかの違いのあることを示し得る。
【０１２４】
要約および結論
上記の実験は５Ｃ９のような本発明による抗体が、ヒトおよびマウスＴＳＨＲ刺激性抗体、天然ヒトおよび動物ＴＳＨ、およびリコンビナントヒトＴＳＨを含む様々な甲状腺刺激剤の刺激活性を遮断できることを証明する。さらに、２種の異なる遮断性抗体、すなわちヒトＭＡｂ５Ｃ９およびマウスＭＡｂ９Ｄ３３は個別に試験した際、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨまたはＭ２２を介したサイクリックＡＭＰ刺激に対する遮断能を有し、混合した際、ＴＳＨまたはＭ２２刺激に対して相加的遮断効果を示すことが証明される。
【０１２５】
５Ｃ９のような本発明による抗体は、ＴＳＨＲの基本的（すなわち無刺激の）なサイクリックＡＭＰ活性に対する新規な効果を有する。これらの効果は、比較的高濃度の基本的なサイクリックＡＭＰを有するＴＳＨＲ導入ＣＨＯ細胞を用いた実験により研究されてきた。すなわち、５Ｃ９のような本発明による抗体の基本的なサイクリックＡＭＰ活性に対する遮断効果が確認されてきた。さらに、遮断（アンタゴニスト）活性をもつＴＳＨＲ自己抗体を有する幾つかの血清は、これらのＴＳＨＲ導入細胞における基本的なサイクリックＡＭＰ活性への遮断能を有することが示されてきた。この実験はまた、５Ｃ９のような本発明による抗体および血清ＴＳＨＲ遮断自己抗体の、活性化ＴＳＨＲ変異に関連した基本的なサイクリックＡＭＰ活性に対する遮断効果を証明する。
【０１２６】
これらの結果は、５Ｃ９が遮断性ＴＳＨＲ自己抗体の特性を示すヒトＭＡｂであること、すなわち甲状腺自己免疫疾患に付随する患者血清ＴＳＨＲ自己抗体の典型であることを強調する。
【０１２７】
記載された実験はまた、本発明による抗体の遮断活性に重要な幾つかのＴＳＨＲアミノ酸の同定も可能にした。
【０１２８】
概してこの結果は、５Ｃ９のような本発明による抗体は、甲状腺自己免疫疾患の患者由来の様々な血清中に見出されたＴＳＨＲ遮断性自己抗体と同様のＴＳＨＲ結合活性、およびＴＳＨＲの機能における同様の生物学的効果を呈することを示す。従って、血清中の遮断性ＴＳＨＲ自己抗体の特性および生物学的活性を有する５Ｃ９のような本発明による抗体は、様々な病態におけるＴＳＨＲの不活性化に適用できる。これらの病態は、ＴＳＨを
介したＴＳＨＲの活性化、甲状腺刺激性ＴＳＨＲ自己抗体を介したＴＳＨＲの活性化、基本的な(無刺激の、恒常的な）ＴＳＨＲ活性、および活性化ＴＳＨＲ変異によるＴＳＨＲの活性化を含む。従って、５Ｃ９のような本発明による抗体は、上述のＴＳＨＲの活性化による病態；例えばグレーブス病、グレーブス眼症、ＴＳＨＲの活性化変異による甲状腺機能亢進症、ＴＳＨの異常な濃度(病理的または薬理的）による甲状腺機能亢進症、甲状腺癌、および甲状腺癌転移の管理および制御に適用できる。
【０１２９】
【表１−１】
【表１−２】
ＴＳＨＲをコートしたチューブへの標識ラベルの平均結合％
125Ｉ−ＴＳＨを用いた実験において１４％
125Ｉ−Ｍ２２ＩｇＧを用いた実験において２１％
および、５Ｃ９ＩｇＧを用いた実験において２０％
ＨＢＤプール＝健常人血液ドナープール血清
２Ｇ４＝コントロールのＩｇＧ（ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトＭＡｂ）
【０１３０】
【表２ａ】
1１回の決定
a ドナー血清は示されたようにサイクリックＡＭＰ検定緩衝液で希釈した
b 比濁法により決定された非希釈血清のＩｇＧ濃度は１４．３ｍｇ/ｍＬであった
５Ｃ９ＩｇＧおよびＴＳＨはサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈した。
【０１３１】
【表２ｂ−１】
【表２ｂ−２】
1２組のサンプルの平均
２Ｇ４＝コントロールのＩｇＧ（ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトＭＡｂ）
抗体およびＴＳＨ標本はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈した。
【０１３２】
【表２ｃ−１】
【表２ｃ−２】
1２組のサンプルの平均
９Ｄ３３は、ＴＳＨＲが発現するＣＨＯ細胞において、ＴＳＨおよびＴＲＡｂが介在するサイクリックＡＭＰ生産を遮断するマウス抗体である。
抗体およびＴＳＨ標本はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈した。
【０１３３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
Ｎ１−１０＝健常人血液ドナーからの血清
Ｇ１−Ｇ４０＝グレーブス病にかかった経験のある患者からの血清
結果はほぼ一致する二重測定の平均である。
【数３】
ここで、Ａ＝テスト血清存在下での結合；Ｂ＝健常人血液ドナーからの血清ＨＢＤプールのプールの存在下での結合。
ＨＢＤプール存在下での125Ｉ−５Ｃ９は２０％の結合率であり、ＨＢＤプール存在下での125Ｉ−ＴＳＨは１２％の結合率であり、ＨＢＤプール存在下での125Ｉ−Ｍ２２は２０％の結合率であった。
【０１３４】
【表４ａ−１】
【表４ａ−２】
【表４ａ−３】
【０１３５】
【表４ｂ−１】
【表４ｂ−２】
Ｂ１−Ｂ５はアンタゴニスト（遮断）活性を伴う高いレベルのＴＲＡｂを有する患者血清である。
Ｂ３は５Ｃ９に対するリンパ球ドナーからの血清である
Ｓ１、Ｓ２、およびＳ４はアンタゴニスト（遮断）活性を伴う高いレベルのＴＲＡｂを有する患者血清である。
アッセイキャリブレーター４０Ｕ／Ｌ、８Ｕ／Ｌ、２Ｕ／Ｌ、および１Ｕ／Ｌ、は、Ｍ２２ ＩｇＧを健常人血液ドナー血清（ＨＢＤプール）で希釈し、ＮＩＢＳＣ９０／６７２のＵ／Ｌ活性を、標識したＴＳＨがＴＳＨＲでコートしたチューブへ結合することの阻害率を用いて測定したものである。
【数４】
ここで、Ａ＝テストサンプル；Ｂ＝ＨＢＤプール
ＮＴ＝テストしない
１／５、１／１０等はＨＢＤプールにおけるテスト血清の希釈率を示し、ニートは希釈無し、を示す。
ＨＢＤプールの存在下、125Ｉで標識したＭ２２ＩｇＧ、５Ｃ９ＩｇＧ、ＴＳＨの、それぞれ約２０％、１７％、１２％がコートしたチューブへ結合した。
【０１３６】
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【表５−４】
【表５−５】
【表５−６】
抗体は健常人血液ドナー血清のプールで希釈した（ＨＢＤプール）。
【数５】
ここで、Ａ＝テストサンプル存在下での結合率（％）；Ｂ＝ＨＢＤプール存在下での結合率（％）
1甲状腺刺激活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ
2ＴＳＨおよびＴＲＡｂ両方が仲介するサイクリックＡＭＰ生産の刺激を遮断するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ
3甲状腺ペルオキシダーゼＭＡｂに対するヒトＭＡｂ（ネガティブコントロール）
4ＴＳＨ遮断活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ（ＴＳＨＲアミノ酸３８１−３８５により形成されるエピトープを認識する）
5ＴＳＨ遮断活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ（ＴＳＨＲアミノ酸３６−４２により形成されるエピトープを認識する）
6ＴＳＨ遮断活性を有するマウスＴＳＨＲ ＭＡｂ（ＴＳＨＲアミノ酸２４６−２６０により形成されるエピトープを認識する）
7マウスＴｇＭＡｂ（ネガティブコントロール）
ＨＢＤプールの存在下、125Ｉで標識したＭ２２ＩｇＧ、５Ｃ９ＩｇＧ、ＴＳＨの、それぞれ約１３％、２４％、１５％がコートしたチューブへ結合する。
【０１３７】
【表６ａ−１】
【表６ａ−２】
【表６ａ−３】
【表６ａ−４】
【表６ａ−５】
【表６ａ−６】
ｕｄ＝検出されず
1＝二重測定
ＨＢＤプールは健常人血液ドナー血清のプールである；これらの実験では、１：１０に希釈したサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液を使用した。
Ｔ１−Ｔ９およびＴ１１−Ｔ１８はＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞においてサイクリックＡＭＰ産生を刺激する血清である。Ｔ１―Ｔ９およびＴ１１−Ｔ１８はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で１：１０に希釈しテストした。
２Ｇ４は甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトモノクローナル抗体である（ネガティブコントロール）。
２Ｇ４ ＩｇＧおよび５Ｃ９ ＩｇＧは１００μｇ/ｍＬでテストした。
【０１３８】
【表６ｂ−１】
【表６ｂ−２】
Ｔ１は、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生を刺激する、患者の血清サンプルである；これらの実験ではサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で１：１０に希釈したものを用いた。
２Ｇ４は甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトモノクローナル抗体である（ネガティブコントロール）。
９Ｄ３３は、ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における、ＴＳＨおよびＴＲＡｂによるサイクリックＡＭＰ産生を遮断するマウス抗体である（表２を参照）。
【０１３９】
【表６ｃ−１】
【表６ｃ−２】
1一回の測定
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４０】
【表６ｄ−１】
【表６ｄ−２】
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４１】
【表６ｅ−１】
【表６ｅ−２】
1二重サンプルの平均
2１回の測定
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４２】
【表６ｆ−１】
【表６ｆ−２】
1二重サンプルの平均
ＮＴ＝テストせず
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４３】
【表６ｇ−１】
【表６ｇ−２】
説明注釈については表６ａおよび６ｂを参照
【０１４４】
【表７ａ】
1二重測定の平均値
ｐＴＳＨ濃度＝３ｎｇ／ｍＬ
全ての希釈液はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液
２Ｇ４は甲状腺ペルオキシダーゼに対するヒトモノクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）
【０１４５】
【表７ｂ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４６】
【表７ｃ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４７】
【表７ｄ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４８】
【表７ｅ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１４９】
【表７ｆ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５０】
【表７ｇ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５１】
【表７ｈ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５２】
【表７ｉ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５３】
【表７ｊ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５４】
【表７ｋ】
説明注釈については表７ａを参照
【０１５５】
【表７ｌ】
Ｍ２２濃度＝３ｎｇ／ｍＬ
説明注釈については表７ａを参照
【０１５６】
【表７ｍ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１５７】
【表７ｎ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１５８】
【表７ｏ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１５９】
【表７ｐ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６０】
【表７ｑ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６１】
【表７ｒ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６２】
【表７ｓ】
説明注釈については表７ａを参照。
【０１６３】
【表８】
アッセイキャリブレーター４０Ｕ／Ｌ、８Ｕ／Ｌ、２Ｕ／Ｌ、および１Ｕ／ＬはＭ２２ ＩｇＧを健常人血液ドナー血清（ＨＢＤプール）で希釈したものであり、ＮＩＢＳＣ ９０／６７２のＵ／Ｌ活性により、標識されたＴＳＨのＴＳＨＲをコートしたチューブへの結合の阻害を測定した。アッセイのネガティブコントロールはＨＢＤプールである。
【０１６４】
【表９】
aサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液による希釈液
b２Ｇ４はヒト甲状腺ペルオキシダーゼモノクローナル自己抗体コントロールである。
【０１６５】
【表１０−１】
【表１０−２】
【表１０−３】
【表１０−４】
【表１０−５】
【０１６６】
【表１１ａ】
a２Ｇ４はヒト甲状腺ペルオキシダーゼモノクローナル抗体コントロールである。
【０１６７】
【表１１ｂ】
【０１６８】
【表１１ｃ】
a２回の測定
【０１６９】
【表１２−１】
【表１２−２】
【表１２−３】
【表１２−４】
【表１２−５】
【０１７０】
【表１３−１】
【表１３−２】
【表１３−３】
【表１３−４】
【０１７１】
【表１４−１】
コントロールのＣＨＯ細胞では、ＴＳＨＲが発現されず、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液の存在下での基礎的なサイクリックＡＭＰ産生は１．０２±０．０６ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であり、３ｎｇ／ｍＬ ＴＳＨの存在下では０．７４±０．３２ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。
−ｖe＝ネガティブ、すなわちサイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
b５Ｂ３はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）ヒトモロクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）。
【表１４−２】
コントロールのＣＨＯ細胞では、ＴＳＨＲが発現されず、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液の存在下での基礎的なサイクリックＡＭＰ産生は０．０３ｐｍｏｌ／ｍＬ（ｎ＝２）であり、３ｎｇ／ｍＬ ＴＳＨの存在下では０．４０±０．０９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。
−ｖe＝ネガティブ、すなわちサイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
b５Ｂ３はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）ヒトモロクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）。
【表１４−３】
【表１４−４】
コントロールのＣＨＯ細胞では、ＴＳＨＲが発現されず、サイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液の存在下での基礎的なサイクリックＡＭＰ産生は１．０３ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝２）であり、３ｎｇ／ｍＬ ＴＳＨの存在下では０．０４±０．０９ｐｍｏｌ／ｍＬ（平均±ＳＤ；ｎ＝３）であった。
−ｖe＝ネガティブ、すなわち還元サイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
Ｆ（ａｂ‘） Ｆ（ａｂ‘）2の還元により準備される；詳細な説明の記載を参照
【０１７２】
【表１５−１】
【表１５−２】
【表１５−３】
−ｖe＝ネガティブ、すなわちサイクリックＡＭＰ産生の阻害が無い。
ＨＢＤプール＝健常人血液ドナー血清のプール
Ｎ１−Ｎ３＝個々の健常人血液ドナー
全ての血清はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で希釈された。
【０１７３】
【表１６】
説明注釈については表１５を参照。
１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ ＩｇＧは、ＴＳＨＲ Ｓ２８１Ｉを用いた実験における基本的なサイクリックＡＭＰ活性の阻害の７１％を引き起こした。
【０１７４】
【表１７】
説明注釈については表１５を参照。
１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ ＩｇＧは、ＴＳＨＲ Ａ６２３Ｉを用いた実験における基本的なサイクリックＡＭＰ活性の４９％阻害を引き起こした。
【０１７５】
【表１８】
【数６】
１μｇ／ｍＬの５Ｃ９ ＩｇＧの存在下、基本的なサイクリックＡＭＰレベルはサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液存在下でのレベルに比べ３３％に減少した。
【０１７６】
【表１９】
ＨＢＤプール＝健常人血液ドナー血清のプール。
ＨＢＤプールおよびＢ２〜Ｂ５の血清はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中で１：１０に希釈した。
５Ｃ９ ＩｇＧはサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液中１μｇ／ｍＬの濃度で用いた。
Ｂ２−Ｂ５は、野生型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞中での、ＴＳＨおよびＭ２２の両方によるサイクリックＡＭＰ産生刺激を遮断した。
【０１７７】
【表２０ａ】
【０１７８】
1二重測定の平均
2一重測定
ｐＴＳＨ濃度＝３ｎｇ／ｍＬ。
全ての希釈はサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液で行った。
a５Ｂ３はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対するヒトモノクローナル抗体である（５Ｃ９に対するネガティブコントロール）。
【０１７９】
【表２０ｂ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８０】
【表２０ｃ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８１】
【表２０ｄ−１】
説明注釈については表２０aを参照。
【表２０ｄ−２】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８２】
【表２０ｅ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８３】
【表２０ｆ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８４】
【表２０ｇ】
ＵＤ＝アッセイ測定限界以下。
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８５】
【表２０ｈ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８６】
【表２０ｉ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８７】
【表２０ｊ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８８】
【表２０ｋ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１８９】
【表２０ｌ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９０】
【表２０ｍ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９１】
【表２０ｎ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９２】
【表２０ｏ】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９３】
【表２０ｐ−１】
説明注釈については表２０aを参照。
【表２０ｐ−２】
説明注釈については表２０aを参照。
【０１９４】
【表２１−１】
【表２１−２】
使用したｐＴＳＨ濃度＝３ｎｇ／ｍＬ
ＴＳＨＲの比較した効果は野生型とともに観察された活性のパーセンテージで以下のように表される：−＋＋＋＋＋＝野生型活性の１００％；＋＋＋＋＝野生型活性の８０％以上１００％未満；＋＋＋＝野生型活性の６０％以上８０％未満；＋＋＝野生型活性の４０％以上６０％未満；＋＝野生型活性の２０％以上４０％未満、０＝野生型の２０％未満、および野生型と比較して増加した活性：＞１００％は＋＋＋＋＋＋＋。ＮＴ＝テストせず。aこの実験のためのサイクリックＡＭＰ刺激は、ＴＳＨの応答を欠失したＭ２２を用いた（詳しくは明細書を参照）。
【０１９５】
【表２２】
aサイクリックＡＭＰアッセイ緩衝液での希釈
bＴＳＨの関与するサイクリックＡＭＰ刺激の阻害率％
【数７】
1二重サンプルの平均
c最終濃度３ｎｇ／ｍＬで使用されたｐＴＳＨ
ＨＢＤプール＝健常人ドナー血清のプール
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のアンタゴニストである、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）に対する単離されたヒト抗体。
【請求項２】
ＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離されたヒト化抗体。
【請求項３】
甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ＴＳＨのアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のＴＳＨアンタゴニスト特性を有する、請求項１、２、または３に記載の抗体。
【請求項５】
ＴＳＨのアンタゴニストおよび甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のアンタゴニスト特性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
ＴＳＨ、Ｍ２２、ＴＳＨＲへの刺激活性を有する抗体、または遮断活性を有する抗体によるＴＳＨＲもしくはその一部への結合の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
該ＴＳＨＲの一部がＴＳＨＲのロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ）またはその実質的な一部を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記結合を阻止する、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナルもしくはリコンビナント抗体であるか、またはその断片を含むかもしくはその断片よりなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
１または２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶH領域を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体であって、該ＣＤＲが、
ａ）ＳＮＹＭＳ（ＣＤＲ１）；
ｂ）ＶＴＹＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）；または
ｃ）ＧＧＲＹＣＳＳＩＳＣＹＡＲＳＧＣＤＹ（ＣＤＲ３）
またはこれらのＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列から選択される抗体。
【請求項１２】
１または２以上のＣＤＲを含むＶL領域を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体であって、該ＣＤＲが、
ａ）ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（ＣＤＲ１）；
ｂ）ＡＡＳＳＬＱＳ（ＣＤＲ２）；または
ｃ）ＱＱＳＹＳＳＰＳＴＴ（ＣＤＲ３）
またはこれらのＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列から選択される抗体。
【請求項１３】
ヒト完全長ＴＳＨＲに対して約１０10Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒト完全長ＴＳＨＲに対して約１０9Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有する、請求
項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヌクレオチドであって、
ａ．請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列；
ｂ．
ｉ．
gaagtgcagctggtggagtctggaggaggcctgatccagcctggggggtc cctgagactctcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagtagcaactaca tgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagtt acttatagcggtggtagcacatcctacgcagactccgtgaagggccgatt
caccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatcttcaaatgaaca gcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggggggcga tattgtagtagtataagctgctacgcgaggagcgggtgtgactactgggg ccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcgg tcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggcc ctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtg gaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctac agtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagc agcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaa caccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactagt ；または
ｉｉ．
gccatccagatgacccagtctccttcctccctgtctgcatctgtaggaga cagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcaactatttaa attggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatc tgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttg caacttactactgtcaacagagttacagttccccctccaccacttttggc caggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttg tgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagca ggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag
ggcctgagctcgcccgt
から選択され、
抗体ＶHドメイン；および抗体ＶLドメインまたは
ｉ．ＳＮＹＭＳ（ＣＤＲ１）；
ｉｉ．ＶＴＹＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）；
ｉｉｉ．ＧＧＲＹＣＳＳＩＳＣＹＡＲＳＧＣＤＹ（ＣＤＲ３）；
ｉｖ．ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（ＣＤＲ１）；
ｖ．ＡＡＳＳＬＱＳ（ＣＤＲ２）；または
ｖｉ．ＱＱＳＹＳＳＰＳＴＴ（ＣＤＲ３）
から選択されるＣＤＲのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはその一部分；または
ｃ．ａ．またはｂ．のヌクレオチド配列への高い相同性を有し、かつ少なくとも約１０9Ｌ／ｍｏｌのアフィニティーでＴＳＨＲに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む単離細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を発現する単離細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を分泌する単離細胞。
【請求項２０】
安定へテロ−ハイブリドーマ細胞株由来である、請求項１７，１８、または１９に記載の単離細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、ＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有するＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであるＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有し、かつ甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであるＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を薬理学的に許容される担体と共に含み、甲状腺関連疾患の治療のために哺乳類被療体に投与するための医薬組成物。
【請求項２６】
該甲状腺関連疾患が甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ヒトへの投与に適する、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該抗体が被療体の免疫システムにおいて有意な有害作用をもたない、請求項２５、２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
該組成物が１または２以上のさらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストを含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
該さらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストが９Ｄ３３である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
注射用の形式である、甲状腺関連疾患の治療における使用のための請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
局所用の形式である、前頚骨粘液水腫の治療における使用のための請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
点眼薬の形式である、グレーブス眼病の治療における使用のための請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の産生方法であって、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の細胞を培養することにより該細胞に該抗体を発現させることを含む方法。
【請求項３５】
該抗体が該細胞により分泌される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳類被療体または該被療体由来の細胞における甲状腺関連疾患の治療方法であって、該被療体、または該細胞を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項３７】
該甲状腺関連疾患が甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳類被療体の甲状腺中のＴＳＨＲを刺激する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法であって、該被療体を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項３９】
甲状腺刺激性自己抗体のＴＳＨＲへの結合が阻止される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳類被療体の甲状腺外ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法であって、該被療体を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項４１】
該甲状腺外ＴＳＨＲが該被療体の後眼窩組織および／または前頚骨組織に存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該抗体が、甲状腺外ＴＳＨＲに結合するＴＳＨＲ自己抗体を遮断する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
甲状腺内にあるか、または転移した甲状腺癌を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法であって、細胞内の恒常的甲状腺刺激ホルモンレセプター活性を阻害するために、癌性細胞を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項４４】
甲状腺癌細胞の再増殖が阻止または遅延される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
恒常的な甲状腺活性による甲状腺活動亢進症を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法であって、このような甲状腺活動亢進を阻害するために、被療体または細胞を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項４６】
該被療体がヒトである、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
甲状腺関連疾患の治療における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４８】
甲状腺関連疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４９】
医学的治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５０】
甲状腺関連疾患の治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５１】
該甲状腺関連疾患が甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
ＴＳＨＲ抗体を特徴付けるための方法であって、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの試験されるＴＳＨＲ抗体の結合を決定することを含み、請求項１〜１４の
いずれか１項に記載の抗体の使用を含む方法工程に関わる方法。
【請求項５３】
ＴＳＨＲ抗体の該ポリペプチドへの結合における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の効果を決定することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該ＴＳＨＲ関連ポリペプチドが完全長ヒトＴＳＨＲを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＴＳＨおよび関連分子を特徴付けるための方法であって、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの、試験されるＴＳＨ、または関連分子の結合を決定することを含み、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用を含む方法工程に関わる方法。
【請求項５６】
ＥＬＩＳＡ形式である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
アンタゴニストとして作用するＴＳＨＲ自己抗体の結合に関わるＴＳＨＲアミノ酸を決定する方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体が結合する第一のＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供すること、該ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果を抗体の結合において決定することを含む方法。
【請求項５８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を改変するための方法であって、該抗体の少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果をＴＳＨＲ関連配列への結合において決定することを含む方法。
【請求項５９】
改変ＴＳＨＲ抗体は、ＴＳＨＲに対する増強されたアフィニティーを有するものが選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻害する分子を同定するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む方法。
【請求項６１】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻止する分子が選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻害する分子を同定するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む方法。
【請求項６３】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻止する分子が選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項１】
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のアンタゴニストである、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）に対する単離されたヒト抗体。
【請求項２】
ＴＳＨのアンタゴニストである、ＴＳＨＲに対する単離されたヒト化抗体。
【請求項３】
甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ＴＳＨのアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のＴＳＨアンタゴニスト特性を有する、請求項１、２、または３に記載の抗体。
【請求項５】
ＴＳＨのアンタゴニストおよび甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストである患者血清ＴＳＨＲ自己抗体のアンタゴニスト特性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
ＴＳＨ、Ｍ２２、ＴＳＨＲへの刺激活性を有する抗体、または遮断活性を有する抗体によるＴＳＨＲもしくはその一部への結合の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
該ＴＳＨＲの一部がＴＳＨＲのロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ）またはその実質的な一部を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記結合を阻止する、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナルもしくはリコンビナント抗体であるか、またはその断片を含むかもしくはその断片よりなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
１または２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶH領域を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体であって、該ＣＤＲが、
ａ）ＳＮＹＭＳ（ＣＤＲ１）；
ｂ）ＶＴＹＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）；または
ｃ）ＧＧＲＹＣＳＳＩＳＣＹＡＲＳＧＣＤＹ（ＣＤＲ３）
またはこれらのＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列から選択される抗体。
【請求項１２】
１または２以上のＣＤＲを含むＶL領域を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体であって、該ＣＤＲが、
ａ）ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（ＣＤＲ１）；
ｂ）ＡＡＳＳＬＱＳ（ＣＤＲ２）；または
ｃ）ＱＱＳＹＳＳＰＳＴＴ（ＣＤＲ３）
またはこれらのＣＤＲに実質的な相同性を有する１または２以上のアミノ酸配列から選択される抗体。
【請求項１３】
ヒト完全長ＴＳＨＲに対して約１０10Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒト完全長ＴＳＨＲに対して約１０9Ｌ／ｍｏｌの結合アフィニティーを有する、請求
項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヌクレオチドであって、
ａ．請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列；
ｂ．
ｉ．
gaagtgcagctggtggagtctggaggaggcctgatccagcctggggggtc cctgagactctcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagtagcaactaca tgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagtt acttatagcggtggtagcacatcctacgcagactccgtgaagggccgatt
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ｉｉ．
gccatccagatgacccagtctccttcctccctgtctgcatctgtaggaga cagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcaactatttaa attggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatc tgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttg caacttactactgtcaacagagttacagttccccctccaccacttttggc caggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttg tgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagca ggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag
ggcctgagctcgcccgt
から選択され、
抗体ＶHドメイン；および抗体ＶLドメインまたは
ｉ．ＳＮＹＭＳ（ＣＤＲ１）；
ｉｉ．ＶＴＹＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）；
ｉｉｉ．ＧＧＲＹＣＳＳＩＳＣＹＡＲＳＧＣＤＹ（ＣＤＲ３）；
ｉｖ．ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（ＣＤＲ１）；
ｖ．ＡＡＳＳＬＱＳ（ＣＤＲ２）；または
ｖｉ．ＱＱＳＹＳＳＰＳＴＴ（ＣＤＲ３）
から選択されるＣＤＲのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはその一部分；または
ｃ．ａ．またはｂ．のヌクレオチド配列への高い相同性を有し、かつ少なくとも約１０9Ｌ／ｍｏｌのアフィニティーでＴＳＨＲに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む単離細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を発現する単離細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を分泌する単離細胞。
【請求項２０】
安定へテロ−ハイブリドーマ細胞株由来である、請求項１７，１８、または１９に記載の単離細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、ＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有するＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであるＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、規定濃度の、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有し、かつ甲状腺刺激性抗体のアンタゴニストであるＴＳＨＲ自己抗体を含む組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を薬理学的に許容される担体と共に含み、甲状腺関連疾患の治療のために哺乳類被療体に投与するための医薬組成物。
【請求項２６】
該甲状腺関連疾患が甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ヒトへの投与に適する、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該抗体が被療体の免疫システムにおいて有意な有害作用をもたない、請求項２５、２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
該組成物が１または２以上のさらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストを含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
該さらなる甲状腺刺激ホルモンレセプターアンタゴニストが９Ｄ３３である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
注射用の形式である、甲状腺関連疾患の治療における使用のための請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
局所用の形式である、前頚骨粘液水腫の治療における使用のための請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
点眼薬の形式である、グレーブス眼病の治療における使用のための請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の産生方法であって、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の細胞を培養することにより該細胞に該抗体を発現させることを含む方法。
【請求項３５】
該抗体が該細胞により分泌される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳類被療体または該被療体由来の細胞における甲状腺関連疾患の治療方法であって、該被療体、または該細胞を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項３７】
該甲状腺関連疾患が甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳類被療体の甲状腺中のＴＳＨＲを刺激する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法であって、該被療体を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項３９】
甲状腺刺激性自己抗体のＴＳＨＲへの結合が阻止される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳類被療体の甲状腺外ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性自己抗体の阻害方法であって、該被療体を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項４１】
該甲状腺外ＴＳＨＲが該被療体の後眼窩組織および／または前頚骨組織に存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該抗体が、甲状腺外ＴＳＨＲに結合するＴＳＨＲ自己抗体を遮断する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
甲状腺内にあるか、または転移した甲状腺癌を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法であって、細胞内の恒常的甲状腺刺激ホルモンレセプター活性を阻害するために、癌性細胞を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項４４】
甲状腺癌細胞の再増殖が阻止または遅延される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
恒常的な甲状腺活性による甲状腺活動亢進症を、被療体内か、または被療体由来の甲状腺細胞において治療する方法であって、このような甲状腺活動亢進を阻害するために、被療体または細胞を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体に接触させることを含む方法。
【請求項４６】
該被療体がヒトである、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
甲状腺関連疾患の治療における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４８】
甲状腺関連疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４９】
医学的治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５０】
甲状腺関連疾患の治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５１】
該甲状腺関連疾患が甲状腺活動亢進症、グレーブス眼病、新生児甲状腺機能亢進症、ヒト絨毛性ゴナドトロピン誘導性甲状腺機能亢進症、前頚骨粘液水腫、甲状腺癌、および甲状腺炎から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
ＴＳＨＲ抗体を特徴付けるための方法であって、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの試験されるＴＳＨＲ抗体の結合を決定することを含み、請求項１〜１４の
いずれか１項に記載の抗体の使用を含む方法工程に関わる方法。
【請求項５３】
ＴＳＨＲ抗体の該ポリペプチドへの結合における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の効果を決定することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該ＴＳＨＲ関連ポリペプチドが完全長ヒトＴＳＨＲを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＴＳＨおよび関連分子を特徴付けるための方法であって、ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドへの、試験されるＴＳＨ、または関連分子の結合を決定することを含み、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用を含む方法工程に関わる方法。
【請求項５６】
ＥＬＩＳＡ形式である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
アンタゴニストとして作用するＴＳＨＲ自己抗体の結合に関わるＴＳＨＲアミノ酸を決定する方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体が結合する第一のＴＳＨＲ関連アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供すること、該ＴＳＨＲ関連アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果を抗体の結合において決定することを含む方法。
【請求項５８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を改変するための方法であって、該抗体の少なくとも１個のアミノ酸を改変すること、およびこのような改変の効果をＴＳＨＲ関連配列への結合において決定することを含む方法。
【請求項５９】
改変ＴＳＨＲ抗体は、ＴＳＨＲに対する増強されたアフィニティーを有するものが選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻害する分子を同定するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む方法。
【請求項６１】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺刺激性抗体を阻止する分子が選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻害する分子を同定するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を参照として提供することを含む方法。
【請求項６３】
ＴＳＨＲに結合する甲状腺遮断性抗体を阻止する分子が選択される、請求項６２に記載の方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５２１１３９（Ｐ２０１０−５２１１３９Ａ）
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９８４８（Ｐ２００９−５４９８４８）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００５１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９９１８５
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０７０４４４６８）アールエスアール リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００５１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９９１８５
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０７０４４４６８）アールエスアール リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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