イヌにおける軟骨損傷を軽減するための方法
イヌにおける関節軟骨の酵素分解を調節するための方法は、たとえば、フード組成物の成分として、酵素分解の調節に有効な量のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）をイヌに投与することを含む。関節炎を患うイヌにおける該方法の実施により、イヌの可動性を増すことができ、関節炎の肢における体重負荷を増すことができ、および／または関節炎に関連した疼痛を減らすことができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連する出願に対する相互参照
本出願は２００５年、２月１４日に出願された米国特許出願番号第１１／０５７，７１８号に対する優先権を主張し、その開示は参照として本明細書に援用される。
発明の背景
発明が属する技術分野
本発明は伴侶動物、より具体的にはイヌにおける関節および関節に関連した状態を管理する方法に関する。
関連技術の説明
関節炎、より具体的には変形性関節炎はヒトにおいて、および伴侶動物において普通に見られる退行性関節疾患である。たとえば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２７，８８３−９１１を参照されたい。
【０００２】
変形性関節炎はプロテオグリカンおよびコラーゲンの損失、ならびに新骨の増殖を伴う関節軟骨の進行性劣化を包含し、滑膜内の多様な炎症性反応を伴う。それはイヌを冒す関節および筋骨格疾患の最も一般的な型であるが、ネコには比較的珍しい。たとえば、Ｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，編：Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４版、９０７−９２１，Ｗａｌｓｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｍａｒｃｅｌｉｎｅ，ＭＯの中のＳｃｈｏｅｎｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）；Ｈｅｄｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５９，４５−５３；Ｐｏｏｌ（１９９９）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４，Ｄ６６２−Ｄ６７０を参照されたい。
【０００３】
変形性関節炎の管理には、薬理学的処置、外科手術、ニュートラシューティカル投与および規定食管理を挙げることができる。そのような現行の管理方法は、しかし、症状の緩和に関心が集中し、そのためそれらは疾患の管理において、または基礎をなす病変の処置において完全に成功していない。それゆえ、伴侶動物、より具体的にはイヌの変形性関節炎の管理における新規な研究方法に対する継続した必要性が依然として存在する。
【０００４】
オメガ‐３（ｎ−３としても公知）脂肪酸は哺乳動物の規定食に必要とされる。それらは食物の中に天然に存在する物質であり、食物サプリメントとして使用されてきた。Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００），（上記）は、関節炎を含む炎症性疾患におけるｎ−３脂肪酸を含む脂肪酸の使用を総説し、皮膚科学的問題に対して脂肪酸で処置した場合に、イヌにおける関節炎の臨床徴候の改善を認知したイヌ所用者の観察からなるＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃａｎｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ １７（６），６−８，による編集物を参照した。
【０００５】
３種のオメガ‐３脂肪酸：エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびアルファ‐リノレン酸（ＡＬＡ）は、現在食物成分として最も関心がもたれている。
発明の概要
現在、イヌにおいて、オメガ‐３脂肪酸は軟骨が関係する関節炎状態におけるそれらの活性が等しくないことが見いだされている。本明細書に報告された研究では、ＥＰＡだけがイヌの軟骨によって明らかに吸収されたが、ＤＨＡまたはＡＬＡは吸収されず、そしてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）遊離によって測定されるような軟骨損傷はＥＰＡに暴露後に著しく弱まったが、ＤＨＡまたはＡＬＡでは弱まらなかった。関節炎を患うイヌに特定のオメガ‐３脂肪酸ＥＰＡを投与することの利点としては、増大したイヌの可動性、イヌの肢における増大した体重支持、および関節炎に伴う疼痛の緩和を挙げることができる。
【０００６】
したがって、関節炎を患うイヌの可動性を増すための方法がここで提供される。該方法は、イヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む。
【０００７】
さらに、関節炎を患うイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの肢における体重支持を増すための方法が提供される。
さらにその上、イヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌにおける関節炎に伴う疼痛を減らすための方法が提供される。
【０００８】
本発明の別の態様では、酵素分解の調節に有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの関節軟骨の酵素分解を調節するための方法が提供される。
別の態様では、本発明は軟骨損傷を軽減する量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することによってイヌにおける軟骨損傷を軽減するための方法を提供する。
【０００９】
上記の方法に従って、ＥＰＡはフード組成物の成分として、またはサプリメントとして、経口投与を含む種々の経路により投与することができる。
本発明のそれ以上の好都合な点および利点は、本明細書を読むことによって当業者には明らかである。
発明の詳細な説明
本発明はイヌにおける、変形性関節炎疾患および状態、ならびにその症状を管理する方法としてのＥＰＡの投与を包含する。
【００１０】
オメガ‐３脂肪酸は多価不飽和長鎖（一般に１２〜２６炭素原子）カルボン酸の確認された群である。生理学的により重要なオメガ‐３脂肪酸は、長さが１８〜２２炭素原子である非分枝鎖を有する。すべてが分枝のメチル（オメガ）末端から数えて３番目と４番目の炭素原子の間に二重結合を有する。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は２０炭素原子の鎖長を有し、そしてオメガ‐３の位置の１つを含む、全部で５つの二重結合を有する。
【００１１】
オメガ‐３脂肪酸、とりわけＥＰＡが本明細書で言及される場合、所望するならば当業者に公知のその誘導体を代わりに使用できることが理解される。適切な誘導体の例としては、オメガ‐３脂肪酸、とりわけＥＰＡのエステル、たとえば分枝または非分枝および／または飽和または不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキルまたはシクロアルキルエステル、とりわけＣ１〜Ｃ６アルキルエステルが挙げられる。
【００１２】
ＥＰＡは１種以上の多くの投与経路、たとえば、経口、鼻腔内、非経口（たとえば、静脈内または皮下）経路などによってイヌに投与することができる。経口経路がとりわけ適切であり、そしてＥＰＡは、ニュートラシューティカルもしくは医薬剤形で、またはフード組成物の成分として経口的に投与することができる。
【００１３】
ウェットまたはドライであることが可能なフード組成物に存在する場合、ＥＰＡはたとえばいずれか適切な混合手順によりその中に取り込まれ、および／またはフード小片の表面に、たとえば噴霧する、凝集させる、散布する、または沈殿させることにより、表面に分配することができる。具体的な態様では、ＥＰＡはそれ自体栄養食を提供するフード組成物の中、スナック、サプリメントもしくはトリートの中、または水もしくは別の流動物のような規定食の液体部分の中に存在する。
【００１４】
ＥＰＡはあるいは、粉末のような固体型で、または液体もしくはゲル型で、またはカプセル剤、錠剤、カプレット、シリンジなどのようなニュートラシューティカルもしくは医薬剤形で投与することができる。そのような剤形内でＥＰＡは固体、液体またはゲル型で存在することができる。水、グルコース、スクロースなどを含む、いずれかの通常のニュートラシューティカルまたは医薬キャリアをＥＰＡと一緒に使用することができる。
【００１５】
ある態様では、本質的にＤＨＡおよび／またはＡＬＡを含まないＥＰＡ‐含有フード組成物が投与される。「本質的にＤＨＡおよび／またはＡＬＡを含まない」とは、ＤＨＡおよびＡＬＡのいずれかまたは両方が実質的に存在しないこと、または、ＤＨＡまたはＡＬＡのいずれかまたは両方のほんの少しの、取るに足らない量、たとえば組成物の重量で約０．１％未満、約０．０３％未満、約０．０１％未満、約０．００３％未満または約０．００１％未満が存在することを意味すると意図される。本明細書において、「本質的にＤＨＡおよび／またはＡＬＡを含まない」態様では、存在するＤＨＡおよび／またはＡＬＡのいずれかの量が、変形性関節炎のイヌにおいて、変形性関節炎またはその進行もしくはそれによって生じた症状に対して実質的な増大作用を引き起こさないような、十分に低い濃度である。
【００１６】
別の態様では、ＤＨＡおよびＡＬＡのような別のオメガ‐３脂肪酸が、かなりの量でＥＰＡと一緒に存在することができる。ある態様では、オメガ‐６脂肪酸、たとえばリノール酸、ガンマ‐リノレン酸（ＧＬＡ）および／またはとりわけアラキドン酸（ＡＡ）も存在することができる。オメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸は、魚油およびフィッシュミールのような供与源の中に、比較的多量に見いだすことができる。本発明にしたがって、オメガ‐３脂肪酸の混合物またはオメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸の混合物の投与によって軟骨損傷を軽減することにおける利点は、大部分または本質的に完全にＥＰＡに起因する。いずれかのそのような混合物では、したがって、ＥＰＡがイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量で存在することが重要である。
【００１７】
本発明に従って投与されるＥＰＡは、種々の型の変形性関節炎、ならびにリウマチ性関節炎を含む別の型の関節炎を防ぐために有効である。
ＥＰＡは関節軟骨における退行性プロセスの進行を阻止するため、または退行プロセスを縮小させ、それによって変形性関節炎のイヌにおける、または変形性関節炎を異なって発症する可能性があるイヌにおける関節の健康を改善するために作用する。この効果は、変形性関節炎における炎症の関与が限定されているために、イヌの変形性関節炎における重要性が少なくてもよいオメガ‐３脂肪酸のいずれかの抗炎症作用に対して付加されたものである。
【００１８】
以下の実施例に示すような、関節軟骨を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ移植片法の使用は、軟骨からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の誘発された遊離を著しく低下させるための、ＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡの中のただ１つのオメガ‐３脂肪酸はＥＰＡであることを証明した。ＧＡＧはプロテオグリカンの構造成分であり、したがってＧＡＧの遊離はプロテオグリカンの分解を示す。
【００１９】
変形性関節炎に由来する関節損傷の予防に関して、特定のイヌの標的群はそのような予防的ケアが必要なものを含む。たとえば、ラブラドールレトリーバー、ロットワイラー、ドイツシェパードなどのような大型の血統は、これらの血統におけるより高い発生によって証明されるように、より変形性関節炎に罹りやすい。その上、約６歳以上のイヌには著しく高い変形性関節炎の発生が見られる。活発なイヌ、筋骨型のイヌおよび肥満のイヌも危険な状態でありうる。
【００２０】
投与されることになるＥＰＡの量は実質的に変更可能である。本明細書の実施例に示すように、実際の用量反応は、投与されるＥＰＡの量が多いほど、抗関節炎効果が大きいことが認められる。一般に、イヌの通常の１日必要量を満たす、栄養に富んだ規定食の重量で、少なくとも約０．２％の最少量が必要とされる。種々の態様では、規定食の重量で少なくとも約０．２％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％または少なくとも約０．６％が使用可能である。適切には、規定食は種々の態様において、ＥＰＡの重量で、約５％まで、約４％まで、約３％まで、約２．５％まで、約２．２５％まで、または約２％までを含有することができる。本明細書のすべての重量百分率は、特記しない限り、乾物を基にする。
【００２１】
特定の量のＥＰＡを、１日を基準として通常のフード割当量の中に包含することができる、あるいは同一量を１日を基準としてトリートまたはサプリメントにて動物に提供することができる。ＥＰＡの有効な量が毎日提供される限り、これらの組み合わせまたはいずれか別の投与手段が使用可能である。
【００２２】
オメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸の混合物において、オメガ‐３対オメガ‐６脂肪酸の重量比は著しく変化しうる。種々の態様において、オメガ‐６対オメガ‐３重量比は約１．１：１〜約０．２：１、または約１．０８：１〜約０．４２：１；たとえば約０．２：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．８：１、約１．０：１またはそれ以上でありうる。種々の態様において、オメガ‐６対ＥＰＡ重量比は約１２．５：１〜約１．０：１、または約１２．４：１〜約１．１２：１、たとえば約０．２：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．８：１、約１．０：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７．５：１、約１０：１、約１２．５：１、またはそれより以上でありうる。種々の態様において、アラキドン酸（ＡＡ、オメガ‐６脂肪酸）対ＥＰＡ重量比は約２．８：１〜約０．０１：１、または約０．２８：１〜約０．０８：１、たとえば約０．０１：１、約０．０２：１、約０．０４：１、約０．０６：１、約０．０８：１、約１．０：１、約１．５：１、約２．８：１、またはそれ以上でありうる。
【００２３】
ＥＰＡはｍｇ／ｋｇ体重として計算される量で投与することができる。したがって、たとえば、２０ｋｇのイヌは１日につきフード約２７５ｇの１日分の規定食を消費する。規定食における重量で約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％または約０．６％のＥＰＡの量は、そのようなイヌにそれぞれ約２７．５、約４１．２５、約５５、約６８．７５または約８２．５ｍｇ／ｋｇ体重を投与することになる。より具体的には、ＥＰＡは１日につき約２０ｍｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の量で、たとえば約２０、約２８、約３０、約４０、約４１、約５０、約５５、約６０、約６９、約７０、約８０、約８２、約９０、約１００、約１２０もしくは約１５０ｍｇ／ｋｇ体重、またはそれ以上の量でイヌに投与することができる。
【００２４】
フードはペットフード産業の中で、一般に「ウェット」または「ドライ」として分類される。ウェットフードは比較的水を多く含み、通常、空気が実質的に、または完全に排除されている缶または別の容器の中に提供される。そのようなフードの例としては、液体のグレービー存在下に個々の固体小片を有する組成物である「チャンクアンドグレイビー（ｃｈｕｎｋ ａｎｄ ｇｒａｖｙ）」組成物、および通常容器の形態をとるローフ型組成物が挙げられる。ドライフードは一般にオーブンで焼いたか、または押し出し成形された材料であり、後者はその後、通常キブルとして公知の、個別に成形された部分に切り分けられる。ＥＰＡは慣用の手段により、ウェットフードの中に容易に取り込まれる。カプセル化を使用して、ドライフードにおける空気酸化からＥＰＡを保護することができる。その上、酸化防止剤の使用およびパッケージの窒素除去も利用することができる。このことは、特定の魚油のマイクロカプセル化を特に強調する米国特許第４，８９５，７２５号に例示される。高レベルのオメガ‐３脂肪酸を有するオイルには、メンヘーデン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）、サケ、タラなどのオイルが挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、種々の態様において、実質的な有害反応または副作用なしに、変形性関節炎の臨床徴候およびこの疾患に伴う疼痛の重症度および頻度を減らすための、ＥＰＡを含有する組成物のイヌへの投与を含む方法を提供する。その上、種々の態様において、本発明はＥＰＡを含有する組成物の投与を含む、イヌの変形性関節炎状態の臨床的進行を遅らせる方法を提供する。種々の態様において、本明細書に記載の方法の利点が変形性関節炎の肢における増加した体重支持により客観的に測定できるように、該方法はイヌの全体的な変形性関節炎状態を実質的に改善する。本発明はまた、種々の抗関節炎薬の投与および／または体重管理規定食を動物に与えるといった、両方とも当該技術分野で公知である様式を含む、変形性関節炎の別の処置様式と組み合わせたＥＰＡの投与を含む方法を提供する。
【００２６】
変形性関節炎に伴う軟骨損傷を軽減することにおけるＥＰＡの効果は、少なくとも部分的に、軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子のダウンレギュレーションを通して発生することができると考えられる。いくつかの場合では、軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされうる。本発明の態様に従って、イヌの軟骨組織における、軟骨分解を引き起こす酵素、たとえばアグレカナーゼのｍＲＮＡメッセージ発現が減少する。軽減された軟骨損傷は、軟骨組織からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の誘発された遊離の低下によって示すことができる。したがって、以下は本発明の別の態様である。
【００２７】
遺伝子ダウンレギュレーションに有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌにおける関節軟骨の酵素分解に関連する１種以上の遺伝子をダウンレギュレーションする方法。
【００２８】
遺伝子ターンオフに有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌにおける関節軟骨の酵素分解に関連する１種以上の遺伝子をターンオフするための方法。
ｍＲＮＡメッセージ発現減少に有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの軟骨組織における酵素、たとえば軟骨分解を引き起こすアグレカナーゼのｍＲＮＡメッセージ発現を減らすための方法。
【００２９】
ＧＡＧ遊離低下に有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの軟骨組織からのＧＡＧの誘発された遊離を低下させるための方法。
本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬は変更してもよいため、本発明はそれらに限定されない。さらに、本明細書で使用される専門用語は特定の態様を説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定することを意図しない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるような単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに異なっていることを文脈が指図しない限り、複数の指示内容を包含する。同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という語は、排他的というよりむしろ包括的に解釈されることになる。
【００３０】
異なって定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語ならびに頭字語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似するか、または等しい、いずれかの組成物、方法、製造された品、または別の手段もしくは材料は本発明の実施において使用することができるが、好ましい組成物、方法、製造された品、または別の手段もしくは材料は本明細書に記載される。
【００３１】
本明細書で引用または言及したすべての特許、特許出願、刊行物、およびその他の参考文献は、法律に許容される程度まで参照として本明細書に援用される。それらの参考文献の論議はそのなかでされた主張を要約することだけを意図する。いずれかのそのような特許、特許出願、刊行物、もしくは参考文献、またはいずれかのその部分は、本発明に関連のある先行技術であるとは認められず、そのような特許、特許出願、刊行物、およびその他の参考文献の正確さおよび妥当性に異議を唱えるための権利は明確に留保される。
実施例
本発明は以下の実施例によってさらに説明することができるが、特記しない限り、これらの実施例は説明のためだけに包含され、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解される。
【００３２】
実施例１
この実施例は、培養したイヌの軟骨組織におけるオメガ‐３脂肪酸によって引き起こされるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の遊離を説明する。
【００３３】
関節軟骨は４匹のイヌの左および右膝関節（大腿骨頭および脛骨粗面の両方）から得た。軟骨移植片は、１０％ウシ胎児血清を含む培地中で３日間培養し、その後無血清培地で３回洗浄した。移植片は次に、０，１００または３００μｇ／ｍｌ ｎ−３脂肪酸（ＥＰＡ、ＡＬＡまたはＤＨＡ）を含有する無血清培地中で６日間培養した。この期間後、すべての移植片は無脂肪酸、無血清培地の中で３回洗浄した。移植片はその後、添加物を含まない（対照、Ｃ）か、１０−６レチノイン酸（ＲＡ）または５０ｎｇ／ｍｌ オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含有する１ｍｌの無脂肪酸、無血清培地の中で４日間、トリプリケートで個別に培養した。軟骨のアベイラビリティーのために、すべてのイヌに対してすべての処置が可能ではなかったことに注意されたい。培地へのＧＡＧの遊離（μｇ／ｍｇ湿重量）は培養終了時に測定された。以下の表において、ＧＡＧ遊離の平均値および標準偏差（ＳＤ）は、４匹のイヌのそれぞれに由来するトリプリケート培養物に対して示される。その上、培地の乳酸濃度（μｇ／ｍｇ湿重量）がそれぞれの処置に対して示される。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１に示すように、ＧＡＧ遊離の有意な低下は、ＯＳＭ処置培養物では１００μｇ／ｍｌ ＥＰＡで、そしてＲＡおよびＯＳＭ処置培養物では３００μｇ／ｍｌで発生した。ＥＰＡのいずれかの濃度による培地乳酸濃度における有意な低下はなかった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２に示すように、ＥＰＡはＯＳＭ処置培養物において有意にＧＡＧ遊離を低下させたが、ＡＬＡまたはＤＨＡは低下させなかった。いずれかの脂肪酸のいずれかの用量による培地乳酸濃度への有意な効果はなかった。
【００３８】
【表３】
【００３９】
表３に示すように、どの脂肪酸もこの特定の動物におけるＲＡまたはＯＳＭ刺激軟骨からのＧＡＧ遊離を有意に変化させなかった。いずれかの脂肪酸のいずれかの濃度に伴う培地乳酸における変化はなかった。
【００４０】
【表４】
【００４１】
表４に示すように、３００μｇ／ｍｌのＥＰＡは、ＲＡ処置培養物からのＧＡＧ遊離を有意に低下させたが、いずれかの濃度における、いずれか別の脂肪酸は低下させなかった。３００μｇ／ｍｌのＯＳＭ前処置により、対照、ＲＡ‐およびＯＳＭ‐処置培養物における培地乳酸濃度における有意な低下があった。
実施例２
この実施例はイヌ軟骨細胞膜へのオメガ‐３脂肪酸の取り込みを説明する。
【００４２】
これらの実験の大部分は単層培養物を使用して行われたが、一実験では、イヌ軟骨移植片培養物への脂肪酸の取り込みが分析された。
単層培養物：２４または４８時間にわたり、２匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への１８：３オメガ‐３脂肪酸ＡＬＡの取り込みはなかった。培地だけでインキュベーションした軟骨細胞におけるＡＬＡの割合は５例で＜１％（範囲０．３〜０．９％）であり、そして１００または３００μｇ／ｍｌのＡＬＡとの２４または４８時間インキュベーション後に、この割合は有意に変化しなかった（範囲０．３〜２．５％）。
【００４３】
４８時間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの有意な取り込みがあった。培養物が１００または３００μｇ／ｍｌのＥＰＡで４８時間処置された場合、ＥＰＡの割合は＜１％（範囲０．２〜０．６％）からおよそ７％（範囲５．６〜８％）に増加した。培養が５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下または非存在下で行われた場合、取り込みは違わなかった。
【００４４】
４８時間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの有意な取り込みがあったが、１８：３オメガ‐３脂肪酸ＡＬＡの取り込みはなかった（それぞれの脂肪酸に対して用量は３００μｇ／ｍｌ）。ＥＰＡの割合は＜１％からおよそ１５％まで増した。
【００４５】
３または６日間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの有意な取り込みがあった（用量３００μｇ／ｍｌ ＥＰＡ）。ＥＰＡの割合は＜１％から１６〜１８％まで増加し、３および６日のインキュベーション間で差はなかった。
【００４６】
移植片培養物：６日間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨移植片への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの明白な取り込みがあったが、１８：３オメガ‐３脂肪酸ＤＨＡまたはオメガ‐６脂肪酸ＡＡの取り込みはなかった（それぞれの脂肪酸に対して用量３００μｇ／ｍｌ）。ＥＰＡの割合は０％（検出不能）からおよそ２％まで増えた。
【００４７】
まとめ：これらのデータは、ＥＰＡは単層または移植片のいずれかの培養物におけるイヌの軟骨細胞膜に取り込まれるが、別のオメガ‐３脂肪酸は取り込まれないことを示した。
【００４８】
実施例３
この実施例はイヌ軟骨細胞代謝に対するオメガ‐３脂肪酸の効果を説明する。
イヌ軟骨におけるタンパク質およびプロテオグリカン代謝に対するオメガ‐３脂肪酸の潜在的な効果を評価するために、異化刺激が加えられなかった（すなわち、すべて「対照」培養物）培養最後の４日間以外は、実施例１に記載のように培養物が準備された。培養最後の２４時間に、（ｉ）３５ＳＯ４（プロテオグリカン合成を測定するため）または（ｉｉ）３５Ｓ‐メチオニンおよび３５Ｓ‐システイン（タンパク質合成を測定するため）が培地に添加され、新規に合成されたプロテオグリカンおよびタンパク質をそれぞれ放射標識した。軟骨マトリックスへの放射標識の取り込みは培養終了時に測定した。２４時間の標識期間にわたり、軟骨からの放射標識された物質の損失を定量することは試みなかった。ＤＰＭ／ｍｇ湿重量としての３５ＳＯ４（「ＰＧ」）または３５Ｓ‐メチオニンおよび３５Ｓ‐システイン（「ＰＲＯＴ」）の取り込みの平均値および標準偏差（ＳＤ）は以下の表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示すように、タンパク質合成およびマトリックスへの取り込みに対するいずれかのオメガ‐３脂肪酸は有意な効果がなかった。１００μｇ／ｍｌのＥＰＡはプロテオグリカン合成および取り込みを有意に増した。その他の用量または脂肪酸は、プロテオグリカン合成および軟骨マトリックスへの取り込みを有意に変化させなかった。
【００５１】
逆転写‐ＰＣＲを使用して、マトリクスプロテイナーゼ（アグレカナーゼ‐１および‐２）、シクロオキシゲナーゼ‐１および‐２、リポキシゲナーゼ‐５および‐１２、ならびに潜在的なオートクリンサイトカインおよびそれらの受容体（たとえばＩＬ‐１、ＩＬ‐６およびＴＮＦ）のｍＲＮＡメッセージ発現レベルを測定した。
【００５２】
この研究の結果は、アグレカナーゼ‐１およびアグレカナーゼ‐２ｍＲＮＡメッセージが「正常な」イヌ軟骨組織において発現されることを見いだした。その上、数匹のイヌは関節病変の徴候がなかったにもかかわらず、これらの動物はシクロオキシゲナーゼ‐２（ＣＯＸ‐２）メッセージのｍＲＮＡメッセージを発現した。このことは、非刺激イヌ関節軟骨移植片におけるアグレカナーゼ‐１およびＣＯＸ‐２のｍＲＮＡ発現に対するオメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸補足の効果のモニタリングを可能にした。ＥＰＡはイヌ関節軟骨における、分解酵素、アグレカナーゼ‐１およびアグレカナーゼ‐２のｍＲＮＡメッセージを減らすことが可能な唯一の脂肪酸であった。このことは軟骨分解に関与する遺伝子を「ターンオフ」するＥＰＡの能力を証明した。
実施例４
この実施例はイヌの変形性関節炎臨床研究におけるオメガ‐３脂肪酸の効果を説明する。
【００５３】
変形性関節炎に罹患していると臨床的に診断されたペット犬において３種の臨床研究が行われた。一般開業獣医師および動物整形外科専門医は、顧客が所有する、特定の適格基準に合うイヌを登録した。すべての患畜は、（ｉ）ペット所有者による病歴の説明および獣医師による身体的検査に基づいた、測定可能な疾患の臨床徴候を伴う、変形性関節炎のＸ線写真の証拠を有する、（ｉｉ）他の点では健康で、身体的検査、完全血球測定（ＣＢＣ）、血液化学および尿検査に基づいて併発する疾患が見られない；そして（ｉｉｉ）研究に登録する前３０日間、変形性関節炎に対して処方された薬剤またはサプリメントを与えられている場合、治療の計画を維持することを要求された。
【００５４】
以下の測定が行われた。血清脂肪酸特性：これはクロロホルムおよびメタノール混合物（２：１）による脂肪酸の抽出、三フッ化ホウ素‐メタノール（ＢＦ３：ＭｅＯＨ）試薬を使用したメチル化、それに続く水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）を含むガスクロマトグラフィー法により検出した。脂肪酸メチルエステルは、保持時間を既知の標準物の保持時間と比較することにより同定し、内部標準を使用して定量した。獣医学的臨床評価：獣医師は臨床試験経過中、身体的検査ならびにスクリーニング中およびそれぞれの給餌間隔終了時の患畜の変形性関節炎状態の臨床評価の両方を実施した。獣医師は５種の変形性関節炎パラメータ：跛行、体重支持を嫌がること、運動範囲の減少、反体側の肢を挙げるのを嫌がること、および関節の触診時の疼痛の重症度を評価した。これらの個々のパラメータの重症度スコアの変化は給餌期間中継続して測定された。患畜の変形性関節炎状態に対する食餌介入の影響の包括的な獣医学的臨床評価は、５種すべての個々のパラメータの重症度スコアにおける変化を合わせることにより得た。
【００５５】
ペット所有者主観評価。ペット所有者は研究に参加する前の登録アンケート、および臨床試験経過中のそれぞれの給餌間隔終了時の付加的なアンケートを仕上げることを要求された。
【００５６】
登録アンケート。ペット所有者は：立ち上がり困難、跛行、硬直、触痛、歩行時の立ち後れ、疼痛のためにキャンキャンまたはクンクン鳴くこと、攻撃的行動、走り回り困難、歩行困難、階段よじ登り困難、ジャンプ困難、遊び困難、可動性障害、および全体的な活動レベルを含む、イヌの変形性関節炎の最も一般的な徴候の観察された頻度および重症度を採点した。なおその上、所有者はペットの全体的な変形性関節炎状態を採点した。
【００５７】
給餌アンケート。ペット所有者は登録中に基準を定められたイヌの変形性関節炎徴候の頻度および重症度の変化の両方を採点した。その上、ペット所有者は動物の変形性関節炎に伴う疼痛の重症度を採点した。
【００５８】
床反力計歩様分析。イヌは０、６および１２週目にそれぞれの施設においてコンピュータ化された生体工学用床反力計を使用して評価された。板は１０ｍの歩行路の中心に、その表面と同じ高さに据えられた。調教師は、肢部接地（ｆｏｏｔ ｓｔｒｉｋｅｓ）と歩様を確認するために、イヌを床反力計の端から端まで速足で走らせ、観察者は板の端から端までのそれぞれの通過を評価して、肢部接地と歩様を確認した。イヌが１．７〜２．０ｍ／ｓの速度、−０．５〜０．５ｍ／ｓ２の加速度変化量で床反力計を端から端まで速足で走る間、はっきり識別できる同じ側の前肢および後肢の接地がある場合、トライアルは妥当であるとみなされた。それぞれのトライアル中、イヌの前進速度はミリ秒タイマーおよび２つの光電スイッチを使用して測定した。それぞれのトライアルは妥当な肢部接地の再検討および確認のためにビデオテープに録画した。イヌがタイマーを始動させること、およびそれぞれのトライアル中に板の端から端まで（調教師および観察者によって感知されるような）一貫した速度が維持されることを確実にするための注意が払われた。
【００５９】
それぞれの試験期間の間に５つの妥当なトライアルが、それぞれのイヌのそれぞれの冒された肢およびそれぞれの同側肢に対して得られた。鉛直ピーク力の直交床反力、鉛直インパルス、制動および推進ピーク力、ならびに制動および推進インパルスが測定され、専門化されたソフトウェアプログラム（Ａｃｑｕｉｒｅ，Ｓｈａｒｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＤｅＷｉｔｔ，ＭＩ）によって記録され、すべての力はキログラムで表した体重に関して正規化された。それぞれの肢の妥当なトライアルに由来するデータは平均化され、それぞれの期間におけるそれぞれの力とインパルスに対して平均値を得た。
【００６０】
床反力データは、それぞれの期間における不自由な肢と同側の肢間の割合の差として、処置およびプラセボ群で比較した。不自由な肢の床反力データの百分率の変化は給餌期間の開始時と終了時の間で比較した。
【００６１】
研究番号１：イヌの研究は、変形性関節炎と診断されたイヌへの増加したレベルのｎ−３脂肪酸を与えることの食餌効果を評価するために実施した。１８人の一般開業獣医師が動員され、研究に患畜を登録した。全部で１３１匹のイヌは無作為に２種の食餌処置に割り当て、１８０日間給餌した。試験および対照フードは同様の主要栄養素特性を有するが、脂肪酸組成において有意に異なった（表６）。試験規定食は高レベルのＡＬＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡを含有し、低いｎ−６／ｎ−３比で調合された。対照規定食は、製造業に特徴的な、典型的なｎ−３脂肪酸レベルおよびｎ−６／ｎ−３比を有する、一番よく売れている市販のドッグフードであった。
【００６２】
【表６】
【００６３】
血清脂肪酸とペット所有者評価は０、４５、９０および１８０日目に記録した。血清脂肪酸特性は試験フードによって有意に改変された。試験群は、それぞれの給餌間隔の終了時に対照群と比較して、有意に高濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、とりわけＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡ、有意に低濃度のＡＡ（Ｐ＜０．０１）、および有意に低いｎ−６／ｎ−３比（Ｐ＜０．０１）を有した（表７）。試験群は、たとえ強力なプラセボ効果の存在下でも、ペット所有者観察に基づき、対照群に比較して４５日目に立ち上がり、走り回りおよび遊び、そして９０および１８０日目に歩行に関して有意な改善（ｐ＜０．０５）を示した（表８）。
【００６４】
【表７】
【００６５】
【表８】
【００６６】
研究番号２：イヌの研究は、変形性関節炎と診断されたイヌへの増加したレベルのｎ−３脂肪酸を与えることの食餌効果を評価するために実施された。２人の動物整形外科専門医が研究に患畜を登録した。全部で３８匹のイヌは無作為に２種の食餌処置に割り当て、９０日間給餌された。試験および対照フードは先に記載のように、同じロットのフードから工業的に製造された（表６）。
【００６７】
血清脂肪酸、床反力計歩様解析および獣医師臨床評価は０、４５、および９０日目に記録した。血清脂肪酸特性は試験フードによって有意に改変された。試験群は、それぞれの給餌間隔の終了時に対照群と比較して、有意に高濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、とりわけＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡ、９０日目における有意に低濃度のＡＡ（Ｐ＜０．０１）、そして有意に低いｎ−６／ｎ−３比（Ｐ＜０．０１）を有した（表９）。
【００６８】
【表９】
【００６９】
イヌの最も重篤な変形性関節炎肢の生体工学的評価は、床反力計歩様解析を使用して客観的に評価した（表１０）。鉛直ピーク力は冒された肢の体重支持を確認するために測定される重要なパラメータである。対照群では９０日間の給餌期間中、平均鉛直ピーク力に有意な変化はなかった（Ｐ＝０．９１）が、試験群では期間中、平均鉛直ピーク力において有意な増加が見られた（Ｐ＝０．０１）。鉛直ピーク力の百分率平均変化も群間で有意に異なり（Ｐ＜０．０５）、研究経過中、試験群は冒された肢における体重支持を増したが、対照群は体重支持に変化を表さなかったことを示した。体重支持能力も、それぞれの食餌群に対する鉛直力の百分率変化の頻度分布を表示することにより表すことができる。対照群の３１％の動物だけが９０日間の給餌後に体重支持の改善を示し、一方試験群の８２％のイヌは研究期間中に体重支持を増した。
【００７０】
【表１０】
【００７１】
動物整形外科医により行われた主観臨床評価は試験規定食の有効性にとって付加的な支持を提供した。包括的な獣医師による臨床評価に基づいて、対照フードを消費したイヌに比べ、有意に高い割合の試験フードを消費したイヌが改善したと評価された（Ｐ＜０．０５）。動物専門医はまた、対照群に比較して、高い割合の試験群のイヌが関節の触診時に疼痛の緩和を表すことを観察した（Ｐ＝０．０５）。
【００７２】
研究番号３：イヌの研究は、変形性関節炎と診断されたイヌへの増加したレベルのｎ−３脂肪酸を与えることの用量効果を確認するために実施された。２８人の一般開業獣医が研究に患畜を登録した。全部で１７７匹のイヌは無作為に２種の食餌処置に割り当て、９０日間給餌された。研究に参加したイヌのおよそ２／３は、治療食を消費することを評価されることに加えて、変形性関節炎を治療するために処方された薬剤および／またはサプリメントを与えられていた。３種の試験フードは類似の主要栄養素特性を有したが、ＥＰＡおよびＤＨＡの組成が異なり、変数Ａは最低レベルを含有し、変数Ｃは最高レベルを含有した（表１１）。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
血清脂肪酸、ペット所有者評価、および獣医師臨床評価は０、２１、４５、および９０日目に記録した。血清脂肪酸特性はすべての食餌変数によって有意に改変された。試験変数Ｂ＆Ｃを与えられたイヌは、それぞれの給餌間隔の終了時に試験変数Ａを与えられたイヌに比較して、有意に高血清濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、とりわけＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡ、有意に低濃度のｎ−６脂肪酸、とりわけＡＡ（Ｐ＜０．０１）、そして有意に低いｎ−６／ｎ−３比（Ｐ＜０．０１）を有した（表１２）。
【００７５】
【表１２】
【００７６】
ペット所有者は、２１日間食餌変数のいずれかを消費したイヌについて、個々の変形性関節炎徴候１４種の中の１３種における改善を報告した（表１３）。その上、ペット所有者は、９０日間食餌変数のいずれかを消費したイヌについて、個々の変形性関節炎徴候１４種の中の１３種に対して重症度の低下を報告した（表１４）。ペット所有者はまた、イヌが９０日間食餌変数のいずれかを消費した後では、観察可能な変形性関節炎徴候の頻度における有意な減少を報告した（表１５）。
【００７７】
【表１３】
【００７８】
【表１４】
【００７９】
【表１５】
【００８０】
獣医師の臨床評価に基づき、高濃度のｎ−３脂肪酸を消費したイヌは、最低量を与えられたイヌより、いっそう有意な変形性関節炎状態の改善、および変形性関節炎の進行のいっそう有意な減少を示すことが報告された（表１６）。薬剤および／またはサプリメントを与えられた群と投薬されない群の間の、変形性関節炎状態の改善または変形性関節炎の進行の減少における有意な差はなかった（表１７）。このことは変形性関節炎を患うイヌに付加的な利点を提供することによって、治療的規定食が別の治療と相乗的に働くか、または少なくとも別の治療に抵抗しないことを示す。
【００８１】
この研究に参加したイヌの中では、極めて低い有害反応または副作用の発生率が報告された。フードを割り当てられた２１５匹のイヌの中の５匹の動物だけが下痢および嘔吐を示し、それらはことによると食餌変数の１種を消費することに起因する可能性があった。有害反応または副作用の類似の発生率が、以前に論じられた２つの研究において治療用規定食を消費するイヌに関して報告された（実施例１および２のそれぞれに対して１／８８および１／２６）。
【００８２】
【表１６】
【００８３】
【表１７】
【００８４】
本明細書では、本発明の典型的な好ましい態様が開示されていて、特有の用語が使用されるが、それらは一般的で説明的な意味で使用され、限定するためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲において明らかにされる。明らかに本発明の多くの改変および変更が上記の教示の観点から可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明が明確に記載されたものとは異なって実施されてもよいことは理解されるべきである。
【発明の開示】
【０００１】
関連する出願に対する相互参照
本出願は２００５年、２月１４日に出願された米国特許出願番号第１１／０５７，７１８号に対する優先権を主張し、その開示は参照として本明細書に援用される。
発明の背景
発明が属する技術分野
本発明は伴侶動物、より具体的にはイヌにおける関節および関節に関連した状態を管理する方法に関する。
関連技術の説明
関節炎、より具体的には変形性関節炎はヒトにおいて、および伴侶動物において普通に見られる退行性関節疾患である。たとえば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２７，８８３−９１１を参照されたい。
【０００２】
変形性関節炎はプロテオグリカンおよびコラーゲンの損失、ならびに新骨の増殖を伴う関節軟骨の進行性劣化を包含し、滑膜内の多様な炎症性反応を伴う。それはイヌを冒す関節および筋骨格疾患の最も一般的な型であるが、ネコには比較的珍しい。たとえば、Ｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，編：Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４版、９０７−９２１，Ｗａｌｓｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｍａｒｃｅｌｉｎｅ，ＭＯの中のＳｃｈｏｅｎｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）；Ｈｅｄｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５９，４５−５３；Ｐｏｏｌ（１９９９）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４，Ｄ６６２−Ｄ６７０を参照されたい。
【０００３】
変形性関節炎の管理には、薬理学的処置、外科手術、ニュートラシューティカル投与および規定食管理を挙げることができる。そのような現行の管理方法は、しかし、症状の緩和に関心が集中し、そのためそれらは疾患の管理において、または基礎をなす病変の処置において完全に成功していない。それゆえ、伴侶動物、より具体的にはイヌの変形性関節炎の管理における新規な研究方法に対する継続した必要性が依然として存在する。
【０００４】
オメガ‐３（ｎ−３としても公知）脂肪酸は哺乳動物の規定食に必要とされる。それらは食物の中に天然に存在する物質であり、食物サプリメントとして使用されてきた。Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００），（上記）は、関節炎を含む炎症性疾患におけるｎ−３脂肪酸を含む脂肪酸の使用を総説し、皮膚科学的問題に対して脂肪酸で処置した場合に、イヌにおける関節炎の臨床徴候の改善を認知したイヌ所用者の観察からなるＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃａｎｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ １７（６），６−８，による編集物を参照した。
【０００５】
３種のオメガ‐３脂肪酸：エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびアルファ‐リノレン酸（ＡＬＡ）は、現在食物成分として最も関心がもたれている。
発明の概要
現在、イヌにおいて、オメガ‐３脂肪酸は軟骨が関係する関節炎状態におけるそれらの活性が等しくないことが見いだされている。本明細書に報告された研究では、ＥＰＡだけがイヌの軟骨によって明らかに吸収されたが、ＤＨＡまたはＡＬＡは吸収されず、そしてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）遊離によって測定されるような軟骨損傷はＥＰＡに暴露後に著しく弱まったが、ＤＨＡまたはＡＬＡでは弱まらなかった。関節炎を患うイヌに特定のオメガ‐３脂肪酸ＥＰＡを投与することの利点としては、増大したイヌの可動性、イヌの肢における増大した体重支持、および関節炎に伴う疼痛の緩和を挙げることができる。
【０００６】
したがって、関節炎を患うイヌの可動性を増すための方法がここで提供される。該方法は、イヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む。
【０００７】
さらに、関節炎を患うイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの肢における体重支持を増すための方法が提供される。
さらにその上、イヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌにおける関節炎に伴う疼痛を減らすための方法が提供される。
【０００８】
本発明の別の態様では、酵素分解の調節に有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの関節軟骨の酵素分解を調節するための方法が提供される。
別の態様では、本発明は軟骨損傷を軽減する量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することによってイヌにおける軟骨損傷を軽減するための方法を提供する。
【０００９】
上記の方法に従って、ＥＰＡはフード組成物の成分として、またはサプリメントとして、経口投与を含む種々の経路により投与することができる。
本発明のそれ以上の好都合な点および利点は、本明細書を読むことによって当業者には明らかである。
発明の詳細な説明
本発明はイヌにおける、変形性関節炎疾患および状態、ならびにその症状を管理する方法としてのＥＰＡの投与を包含する。
【００１０】
オメガ‐３脂肪酸は多価不飽和長鎖（一般に１２〜２６炭素原子）カルボン酸の確認された群である。生理学的により重要なオメガ‐３脂肪酸は、長さが１８〜２２炭素原子である非分枝鎖を有する。すべてが分枝のメチル（オメガ）末端から数えて３番目と４番目の炭素原子の間に二重結合を有する。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は２０炭素原子の鎖長を有し、そしてオメガ‐３の位置の１つを含む、全部で５つの二重結合を有する。
【００１１】
オメガ‐３脂肪酸、とりわけＥＰＡが本明細書で言及される場合、所望するならば当業者に公知のその誘導体を代わりに使用できることが理解される。適切な誘導体の例としては、オメガ‐３脂肪酸、とりわけＥＰＡのエステル、たとえば分枝または非分枝および／または飽和または不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキルまたはシクロアルキルエステル、とりわけＣ１〜Ｃ６アルキルエステルが挙げられる。
【００１２】
ＥＰＡは１種以上の多くの投与経路、たとえば、経口、鼻腔内、非経口（たとえば、静脈内または皮下）経路などによってイヌに投与することができる。経口経路がとりわけ適切であり、そしてＥＰＡは、ニュートラシューティカルもしくは医薬剤形で、またはフード組成物の成分として経口的に投与することができる。
【００１３】
ウェットまたはドライであることが可能なフード組成物に存在する場合、ＥＰＡはたとえばいずれか適切な混合手順によりその中に取り込まれ、および／またはフード小片の表面に、たとえば噴霧する、凝集させる、散布する、または沈殿させることにより、表面に分配することができる。具体的な態様では、ＥＰＡはそれ自体栄養食を提供するフード組成物の中、スナック、サプリメントもしくはトリートの中、または水もしくは別の流動物のような規定食の液体部分の中に存在する。
【００１４】
ＥＰＡはあるいは、粉末のような固体型で、または液体もしくはゲル型で、またはカプセル剤、錠剤、カプレット、シリンジなどのようなニュートラシューティカルもしくは医薬剤形で投与することができる。そのような剤形内でＥＰＡは固体、液体またはゲル型で存在することができる。水、グルコース、スクロースなどを含む、いずれかの通常のニュートラシューティカルまたは医薬キャリアをＥＰＡと一緒に使用することができる。
【００１５】
ある態様では、本質的にＤＨＡおよび／またはＡＬＡを含まないＥＰＡ‐含有フード組成物が投与される。「本質的にＤＨＡおよび／またはＡＬＡを含まない」とは、ＤＨＡおよびＡＬＡのいずれかまたは両方が実質的に存在しないこと、または、ＤＨＡまたはＡＬＡのいずれかまたは両方のほんの少しの、取るに足らない量、たとえば組成物の重量で約０．１％未満、約０．０３％未満、約０．０１％未満、約０．００３％未満または約０．００１％未満が存在することを意味すると意図される。本明細書において、「本質的にＤＨＡおよび／またはＡＬＡを含まない」態様では、存在するＤＨＡおよび／またはＡＬＡのいずれかの量が、変形性関節炎のイヌにおいて、変形性関節炎またはその進行もしくはそれによって生じた症状に対して実質的な増大作用を引き起こさないような、十分に低い濃度である。
【００１６】
別の態様では、ＤＨＡおよびＡＬＡのような別のオメガ‐３脂肪酸が、かなりの量でＥＰＡと一緒に存在することができる。ある態様では、オメガ‐６脂肪酸、たとえばリノール酸、ガンマ‐リノレン酸（ＧＬＡ）および／またはとりわけアラキドン酸（ＡＡ）も存在することができる。オメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸は、魚油およびフィッシュミールのような供与源の中に、比較的多量に見いだすことができる。本発明にしたがって、オメガ‐３脂肪酸の混合物またはオメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸の混合物の投与によって軟骨損傷を軽減することにおける利点は、大部分または本質的に完全にＥＰＡに起因する。いずれかのそのような混合物では、したがって、ＥＰＡがイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量で存在することが重要である。
【００１７】
本発明に従って投与されるＥＰＡは、種々の型の変形性関節炎、ならびにリウマチ性関節炎を含む別の型の関節炎を防ぐために有効である。
ＥＰＡは関節軟骨における退行性プロセスの進行を阻止するため、または退行プロセスを縮小させ、それによって変形性関節炎のイヌにおける、または変形性関節炎を異なって発症する可能性があるイヌにおける関節の健康を改善するために作用する。この効果は、変形性関節炎における炎症の関与が限定されているために、イヌの変形性関節炎における重要性が少なくてもよいオメガ‐３脂肪酸のいずれかの抗炎症作用に対して付加されたものである。
【００１８】
以下の実施例に示すような、関節軟骨を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ移植片法の使用は、軟骨からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の誘発された遊離を著しく低下させるための、ＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡの中のただ１つのオメガ‐３脂肪酸はＥＰＡであることを証明した。ＧＡＧはプロテオグリカンの構造成分であり、したがってＧＡＧの遊離はプロテオグリカンの分解を示す。
【００１９】
変形性関節炎に由来する関節損傷の予防に関して、特定のイヌの標的群はそのような予防的ケアが必要なものを含む。たとえば、ラブラドールレトリーバー、ロットワイラー、ドイツシェパードなどのような大型の血統は、これらの血統におけるより高い発生によって証明されるように、より変形性関節炎に罹りやすい。その上、約６歳以上のイヌには著しく高い変形性関節炎の発生が見られる。活発なイヌ、筋骨型のイヌおよび肥満のイヌも危険な状態でありうる。
【００２０】
投与されることになるＥＰＡの量は実質的に変更可能である。本明細書の実施例に示すように、実際の用量反応は、投与されるＥＰＡの量が多いほど、抗関節炎効果が大きいことが認められる。一般に、イヌの通常の１日必要量を満たす、栄養に富んだ規定食の重量で、少なくとも約０．２％の最少量が必要とされる。種々の態様では、規定食の重量で少なくとも約０．２％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％または少なくとも約０．６％が使用可能である。適切には、規定食は種々の態様において、ＥＰＡの重量で、約５％まで、約４％まで、約３％まで、約２．５％まで、約２．２５％まで、または約２％までを含有することができる。本明細書のすべての重量百分率は、特記しない限り、乾物を基にする。
【００２１】
特定の量のＥＰＡを、１日を基準として通常のフード割当量の中に包含することができる、あるいは同一量を１日を基準としてトリートまたはサプリメントにて動物に提供することができる。ＥＰＡの有効な量が毎日提供される限り、これらの組み合わせまたはいずれか別の投与手段が使用可能である。
【００２２】
オメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸の混合物において、オメガ‐３対オメガ‐６脂肪酸の重量比は著しく変化しうる。種々の態様において、オメガ‐６対オメガ‐３重量比は約１．１：１〜約０．２：１、または約１．０８：１〜約０．４２：１；たとえば約０．２：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．８：１、約１．０：１またはそれ以上でありうる。種々の態様において、オメガ‐６対ＥＰＡ重量比は約１２．５：１〜約１．０：１、または約１２．４：１〜約１．１２：１、たとえば約０．２：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．８：１、約１．０：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７．５：１、約１０：１、約１２．５：１、またはそれより以上でありうる。種々の態様において、アラキドン酸（ＡＡ、オメガ‐６脂肪酸）対ＥＰＡ重量比は約２．８：１〜約０．０１：１、または約０．２８：１〜約０．０８：１、たとえば約０．０１：１、約０．０２：１、約０．０４：１、約０．０６：１、約０．０８：１、約１．０：１、約１．５：１、約２．８：１、またはそれ以上でありうる。
【００２３】
ＥＰＡはｍｇ／ｋｇ体重として計算される量で投与することができる。したがって、たとえば、２０ｋｇのイヌは１日につきフード約２７５ｇの１日分の規定食を消費する。規定食における重量で約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％または約０．６％のＥＰＡの量は、そのようなイヌにそれぞれ約２７．５、約４１．２５、約５５、約６８．７５または約８２．５ｍｇ／ｋｇ体重を投与することになる。より具体的には、ＥＰＡは１日につき約２０ｍｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の量で、たとえば約２０、約２８、約３０、約４０、約４１、約５０、約５５、約６０、約６９、約７０、約８０、約８２、約９０、約１００、約１２０もしくは約１５０ｍｇ／ｋｇ体重、またはそれ以上の量でイヌに投与することができる。
【００２４】
フードはペットフード産業の中で、一般に「ウェット」または「ドライ」として分類される。ウェットフードは比較的水を多く含み、通常、空気が実質的に、または完全に排除されている缶または別の容器の中に提供される。そのようなフードの例としては、液体のグレービー存在下に個々の固体小片を有する組成物である「チャンクアンドグレイビー（ｃｈｕｎｋ ａｎｄ ｇｒａｖｙ）」組成物、および通常容器の形態をとるローフ型組成物が挙げられる。ドライフードは一般にオーブンで焼いたか、または押し出し成形された材料であり、後者はその後、通常キブルとして公知の、個別に成形された部分に切り分けられる。ＥＰＡは慣用の手段により、ウェットフードの中に容易に取り込まれる。カプセル化を使用して、ドライフードにおける空気酸化からＥＰＡを保護することができる。その上、酸化防止剤の使用およびパッケージの窒素除去も利用することができる。このことは、特定の魚油のマイクロカプセル化を特に強調する米国特許第４，８９５，７２５号に例示される。高レベルのオメガ‐３脂肪酸を有するオイルには、メンヘーデン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）、サケ、タラなどのオイルが挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、種々の態様において、実質的な有害反応または副作用なしに、変形性関節炎の臨床徴候およびこの疾患に伴う疼痛の重症度および頻度を減らすための、ＥＰＡを含有する組成物のイヌへの投与を含む方法を提供する。その上、種々の態様において、本発明はＥＰＡを含有する組成物の投与を含む、イヌの変形性関節炎状態の臨床的進行を遅らせる方法を提供する。種々の態様において、本明細書に記載の方法の利点が変形性関節炎の肢における増加した体重支持により客観的に測定できるように、該方法はイヌの全体的な変形性関節炎状態を実質的に改善する。本発明はまた、種々の抗関節炎薬の投与および／または体重管理規定食を動物に与えるといった、両方とも当該技術分野で公知である様式を含む、変形性関節炎の別の処置様式と組み合わせたＥＰＡの投与を含む方法を提供する。
【００２６】
変形性関節炎に伴う軟骨損傷を軽減することにおけるＥＰＡの効果は、少なくとも部分的に、軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子のダウンレギュレーションを通して発生することができると考えられる。いくつかの場合では、軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされうる。本発明の態様に従って、イヌの軟骨組織における、軟骨分解を引き起こす酵素、たとえばアグレカナーゼのｍＲＮＡメッセージ発現が減少する。軽減された軟骨損傷は、軟骨組織からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の誘発された遊離の低下によって示すことができる。したがって、以下は本発明の別の態様である。
【００２７】
遺伝子ダウンレギュレーションに有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌにおける関節軟骨の酵素分解に関連する１種以上の遺伝子をダウンレギュレーションする方法。
【００２８】
遺伝子ターンオフに有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌにおける関節軟骨の酵素分解に関連する１種以上の遺伝子をターンオフするための方法。
ｍＲＮＡメッセージ発現減少に有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの軟骨組織における酵素、たとえば軟骨分解を引き起こすアグレカナーゼのｍＲＮＡメッセージ発現を減らすための方法。
【００２９】
ＧＡＧ遊離低下に有効な量のＥＰＡをイヌに投与することを含む、イヌの軟骨組織からのＧＡＧの誘発された遊離を低下させるための方法。
本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬は変更してもよいため、本発明はそれらに限定されない。さらに、本明細書で使用される専門用語は特定の態様を説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定することを意図しない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるような単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに異なっていることを文脈が指図しない限り、複数の指示内容を包含する。同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という語は、排他的というよりむしろ包括的に解釈されることになる。
【００３０】
異なって定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語ならびに頭字語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似するか、または等しい、いずれかの組成物、方法、製造された品、または別の手段もしくは材料は本発明の実施において使用することができるが、好ましい組成物、方法、製造された品、または別の手段もしくは材料は本明細書に記載される。
【００３１】
本明細書で引用または言及したすべての特許、特許出願、刊行物、およびその他の参考文献は、法律に許容される程度まで参照として本明細書に援用される。それらの参考文献の論議はそのなかでされた主張を要約することだけを意図する。いずれかのそのような特許、特許出願、刊行物、もしくは参考文献、またはいずれかのその部分は、本発明に関連のある先行技術であるとは認められず、そのような特許、特許出願、刊行物、およびその他の参考文献の正確さおよび妥当性に異議を唱えるための権利は明確に留保される。
実施例
本発明は以下の実施例によってさらに説明することができるが、特記しない限り、これらの実施例は説明のためだけに包含され、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解される。
【００３２】
実施例１
この実施例は、培養したイヌの軟骨組織におけるオメガ‐３脂肪酸によって引き起こされるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の遊離を説明する。
【００３３】
関節軟骨は４匹のイヌの左および右膝関節（大腿骨頭および脛骨粗面の両方）から得た。軟骨移植片は、１０％ウシ胎児血清を含む培地中で３日間培養し、その後無血清培地で３回洗浄した。移植片は次に、０，１００または３００μｇ／ｍｌ ｎ−３脂肪酸（ＥＰＡ、ＡＬＡまたはＤＨＡ）を含有する無血清培地中で６日間培養した。この期間後、すべての移植片は無脂肪酸、無血清培地の中で３回洗浄した。移植片はその後、添加物を含まない（対照、Ｃ）か、１０−６レチノイン酸（ＲＡ）または５０ｎｇ／ｍｌ オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含有する１ｍｌの無脂肪酸、無血清培地の中で４日間、トリプリケートで個別に培養した。軟骨のアベイラビリティーのために、すべてのイヌに対してすべての処置が可能ではなかったことに注意されたい。培地へのＧＡＧの遊離（μｇ／ｍｇ湿重量）は培養終了時に測定された。以下の表において、ＧＡＧ遊離の平均値および標準偏差（ＳＤ）は、４匹のイヌのそれぞれに由来するトリプリケート培養物に対して示される。その上、培地の乳酸濃度（μｇ／ｍｇ湿重量）がそれぞれの処置に対して示される。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１に示すように、ＧＡＧ遊離の有意な低下は、ＯＳＭ処置培養物では１００μｇ／ｍｌ ＥＰＡで、そしてＲＡおよびＯＳＭ処置培養物では３００μｇ／ｍｌで発生した。ＥＰＡのいずれかの濃度による培地乳酸濃度における有意な低下はなかった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２に示すように、ＥＰＡはＯＳＭ処置培養物において有意にＧＡＧ遊離を低下させたが、ＡＬＡまたはＤＨＡは低下させなかった。いずれかの脂肪酸のいずれかの用量による培地乳酸濃度への有意な効果はなかった。
【００３８】
【表３】
【００３９】
表３に示すように、どの脂肪酸もこの特定の動物におけるＲＡまたはＯＳＭ刺激軟骨からのＧＡＧ遊離を有意に変化させなかった。いずれかの脂肪酸のいずれかの濃度に伴う培地乳酸における変化はなかった。
【００４０】
【表４】
【００４１】
表４に示すように、３００μｇ／ｍｌのＥＰＡは、ＲＡ処置培養物からのＧＡＧ遊離を有意に低下させたが、いずれかの濃度における、いずれか別の脂肪酸は低下させなかった。３００μｇ／ｍｌのＯＳＭ前処置により、対照、ＲＡ‐およびＯＳＭ‐処置培養物における培地乳酸濃度における有意な低下があった。
実施例２
この実施例はイヌ軟骨細胞膜へのオメガ‐３脂肪酸の取り込みを説明する。
【００４２】
これらの実験の大部分は単層培養物を使用して行われたが、一実験では、イヌ軟骨移植片培養物への脂肪酸の取り込みが分析された。
単層培養物：２４または４８時間にわたり、２匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への１８：３オメガ‐３脂肪酸ＡＬＡの取り込みはなかった。培地だけでインキュベーションした軟骨細胞におけるＡＬＡの割合は５例で＜１％（範囲０．３〜０．９％）であり、そして１００または３００μｇ／ｍｌのＡＬＡとの２４または４８時間インキュベーション後に、この割合は有意に変化しなかった（範囲０．３〜２．５％）。
【００４３】
４８時間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの有意な取り込みがあった。培養物が１００または３００μｇ／ｍｌのＥＰＡで４８時間処置された場合、ＥＰＡの割合は＜１％（範囲０．２〜０．６％）からおよそ７％（範囲５．６〜８％）に増加した。培養が５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下または非存在下で行われた場合、取り込みは違わなかった。
【００４４】
４８時間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの有意な取り込みがあったが、１８：３オメガ‐３脂肪酸ＡＬＡの取り込みはなかった（それぞれの脂肪酸に対して用量は３００μｇ／ｍｌ）。ＥＰＡの割合は＜１％からおよそ１５％まで増した。
【００４５】
３または６日間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨細胞膜への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの有意な取り込みがあった（用量３００μｇ／ｍｌ ＥＰＡ）。ＥＰＡの割合は＜１％から１６〜１８％まで増加し、３および６日のインキュベーション間で差はなかった。
【００４６】
移植片培養物：６日間にわたり、１匹のイヌ由来の軟骨移植片への２０：５オメガ‐３脂肪酸ＥＰＡの明白な取り込みがあったが、１８：３オメガ‐３脂肪酸ＤＨＡまたはオメガ‐６脂肪酸ＡＡの取り込みはなかった（それぞれの脂肪酸に対して用量３００μｇ／ｍｌ）。ＥＰＡの割合は０％（検出不能）からおよそ２％まで増えた。
【００４７】
まとめ：これらのデータは、ＥＰＡは単層または移植片のいずれかの培養物におけるイヌの軟骨細胞膜に取り込まれるが、別のオメガ‐３脂肪酸は取り込まれないことを示した。
【００４８】
実施例３
この実施例はイヌ軟骨細胞代謝に対するオメガ‐３脂肪酸の効果を説明する。
イヌ軟骨におけるタンパク質およびプロテオグリカン代謝に対するオメガ‐３脂肪酸の潜在的な効果を評価するために、異化刺激が加えられなかった（すなわち、すべて「対照」培養物）培養最後の４日間以外は、実施例１に記載のように培養物が準備された。培養最後の２４時間に、（ｉ）３５ＳＯ４（プロテオグリカン合成を測定するため）または（ｉｉ）３５Ｓ‐メチオニンおよび３５Ｓ‐システイン（タンパク質合成を測定するため）が培地に添加され、新規に合成されたプロテオグリカンおよびタンパク質をそれぞれ放射標識した。軟骨マトリックスへの放射標識の取り込みは培養終了時に測定した。２４時間の標識期間にわたり、軟骨からの放射標識された物質の損失を定量することは試みなかった。ＤＰＭ／ｍｇ湿重量としての３５ＳＯ４（「ＰＧ」）または３５Ｓ‐メチオニンおよび３５Ｓ‐システイン（「ＰＲＯＴ」）の取り込みの平均値および標準偏差（ＳＤ）は以下の表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示すように、タンパク質合成およびマトリックスへの取り込みに対するいずれかのオメガ‐３脂肪酸は有意な効果がなかった。１００μｇ／ｍｌのＥＰＡはプロテオグリカン合成および取り込みを有意に増した。その他の用量または脂肪酸は、プロテオグリカン合成および軟骨マトリックスへの取り込みを有意に変化させなかった。
【００５１】
逆転写‐ＰＣＲを使用して、マトリクスプロテイナーゼ（アグレカナーゼ‐１および‐２）、シクロオキシゲナーゼ‐１および‐２、リポキシゲナーゼ‐５および‐１２、ならびに潜在的なオートクリンサイトカインおよびそれらの受容体（たとえばＩＬ‐１、ＩＬ‐６およびＴＮＦ）のｍＲＮＡメッセージ発現レベルを測定した。
【００５２】
この研究の結果は、アグレカナーゼ‐１およびアグレカナーゼ‐２ｍＲＮＡメッセージが「正常な」イヌ軟骨組織において発現されることを見いだした。その上、数匹のイヌは関節病変の徴候がなかったにもかかわらず、これらの動物はシクロオキシゲナーゼ‐２（ＣＯＸ‐２）メッセージのｍＲＮＡメッセージを発現した。このことは、非刺激イヌ関節軟骨移植片におけるアグレカナーゼ‐１およびＣＯＸ‐２のｍＲＮＡ発現に対するオメガ‐３およびオメガ‐６脂肪酸補足の効果のモニタリングを可能にした。ＥＰＡはイヌ関節軟骨における、分解酵素、アグレカナーゼ‐１およびアグレカナーゼ‐２のｍＲＮＡメッセージを減らすことが可能な唯一の脂肪酸であった。このことは軟骨分解に関与する遺伝子を「ターンオフ」するＥＰＡの能力を証明した。
実施例４
この実施例はイヌの変形性関節炎臨床研究におけるオメガ‐３脂肪酸の効果を説明する。
【００５３】
変形性関節炎に罹患していると臨床的に診断されたペット犬において３種の臨床研究が行われた。一般開業獣医師および動物整形外科専門医は、顧客が所有する、特定の適格基準に合うイヌを登録した。すべての患畜は、（ｉ）ペット所有者による病歴の説明および獣医師による身体的検査に基づいた、測定可能な疾患の臨床徴候を伴う、変形性関節炎のＸ線写真の証拠を有する、（ｉｉ）他の点では健康で、身体的検査、完全血球測定（ＣＢＣ）、血液化学および尿検査に基づいて併発する疾患が見られない；そして（ｉｉｉ）研究に登録する前３０日間、変形性関節炎に対して処方された薬剤またはサプリメントを与えられている場合、治療の計画を維持することを要求された。
【００５４】
以下の測定が行われた。血清脂肪酸特性：これはクロロホルムおよびメタノール混合物（２：１）による脂肪酸の抽出、三フッ化ホウ素‐メタノール（ＢＦ３：ＭｅＯＨ）試薬を使用したメチル化、それに続く水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）を含むガスクロマトグラフィー法により検出した。脂肪酸メチルエステルは、保持時間を既知の標準物の保持時間と比較することにより同定し、内部標準を使用して定量した。獣医学的臨床評価：獣医師は臨床試験経過中、身体的検査ならびにスクリーニング中およびそれぞれの給餌間隔終了時の患畜の変形性関節炎状態の臨床評価の両方を実施した。獣医師は５種の変形性関節炎パラメータ：跛行、体重支持を嫌がること、運動範囲の減少、反体側の肢を挙げるのを嫌がること、および関節の触診時の疼痛の重症度を評価した。これらの個々のパラメータの重症度スコアの変化は給餌期間中継続して測定された。患畜の変形性関節炎状態に対する食餌介入の影響の包括的な獣医学的臨床評価は、５種すべての個々のパラメータの重症度スコアにおける変化を合わせることにより得た。
【００５５】
ペット所有者主観評価。ペット所有者は研究に参加する前の登録アンケート、および臨床試験経過中のそれぞれの給餌間隔終了時の付加的なアンケートを仕上げることを要求された。
【００５６】
登録アンケート。ペット所有者は：立ち上がり困難、跛行、硬直、触痛、歩行時の立ち後れ、疼痛のためにキャンキャンまたはクンクン鳴くこと、攻撃的行動、走り回り困難、歩行困難、階段よじ登り困難、ジャンプ困難、遊び困難、可動性障害、および全体的な活動レベルを含む、イヌの変形性関節炎の最も一般的な徴候の観察された頻度および重症度を採点した。なおその上、所有者はペットの全体的な変形性関節炎状態を採点した。
【００５７】
給餌アンケート。ペット所有者は登録中に基準を定められたイヌの変形性関節炎徴候の頻度および重症度の変化の両方を採点した。その上、ペット所有者は動物の変形性関節炎に伴う疼痛の重症度を採点した。
【００５８】
床反力計歩様分析。イヌは０、６および１２週目にそれぞれの施設においてコンピュータ化された生体工学用床反力計を使用して評価された。板は１０ｍの歩行路の中心に、その表面と同じ高さに据えられた。調教師は、肢部接地（ｆｏｏｔ ｓｔｒｉｋｅｓ）と歩様を確認するために、イヌを床反力計の端から端まで速足で走らせ、観察者は板の端から端までのそれぞれの通過を評価して、肢部接地と歩様を確認した。イヌが１．７〜２．０ｍ／ｓの速度、−０．５〜０．５ｍ／ｓ２の加速度変化量で床反力計を端から端まで速足で走る間、はっきり識別できる同じ側の前肢および後肢の接地がある場合、トライアルは妥当であるとみなされた。それぞれのトライアル中、イヌの前進速度はミリ秒タイマーおよび２つの光電スイッチを使用して測定した。それぞれのトライアルは妥当な肢部接地の再検討および確認のためにビデオテープに録画した。イヌがタイマーを始動させること、およびそれぞれのトライアル中に板の端から端まで（調教師および観察者によって感知されるような）一貫した速度が維持されることを確実にするための注意が払われた。
【００５９】
それぞれの試験期間の間に５つの妥当なトライアルが、それぞれのイヌのそれぞれの冒された肢およびそれぞれの同側肢に対して得られた。鉛直ピーク力の直交床反力、鉛直インパルス、制動および推進ピーク力、ならびに制動および推進インパルスが測定され、専門化されたソフトウェアプログラム（Ａｃｑｕｉｒｅ，Ｓｈａｒｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＤｅＷｉｔｔ，ＭＩ）によって記録され、すべての力はキログラムで表した体重に関して正規化された。それぞれの肢の妥当なトライアルに由来するデータは平均化され、それぞれの期間におけるそれぞれの力とインパルスに対して平均値を得た。
【００６０】
床反力データは、それぞれの期間における不自由な肢と同側の肢間の割合の差として、処置およびプラセボ群で比較した。不自由な肢の床反力データの百分率の変化は給餌期間の開始時と終了時の間で比較した。
【００６１】
研究番号１：イヌの研究は、変形性関節炎と診断されたイヌへの増加したレベルのｎ−３脂肪酸を与えることの食餌効果を評価するために実施した。１８人の一般開業獣医師が動員され、研究に患畜を登録した。全部で１３１匹のイヌは無作為に２種の食餌処置に割り当て、１８０日間給餌した。試験および対照フードは同様の主要栄養素特性を有するが、脂肪酸組成において有意に異なった（表６）。試験規定食は高レベルのＡＬＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡを含有し、低いｎ−６／ｎ−３比で調合された。対照規定食は、製造業に特徴的な、典型的なｎ−３脂肪酸レベルおよびｎ−６／ｎ−３比を有する、一番よく売れている市販のドッグフードであった。
【００６２】
【表６】
【００６３】
血清脂肪酸とペット所有者評価は０、４５、９０および１８０日目に記録した。血清脂肪酸特性は試験フードによって有意に改変された。試験群は、それぞれの給餌間隔の終了時に対照群と比較して、有意に高濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、とりわけＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡ、有意に低濃度のＡＡ（Ｐ＜０．０１）、および有意に低いｎ−６／ｎ−３比（Ｐ＜０．０１）を有した（表７）。試験群は、たとえ強力なプラセボ効果の存在下でも、ペット所有者観察に基づき、対照群に比較して４５日目に立ち上がり、走り回りおよび遊び、そして９０および１８０日目に歩行に関して有意な改善（ｐ＜０．０５）を示した（表８）。
【００６４】
【表７】
【００６５】
【表８】
【００６６】
研究番号２：イヌの研究は、変形性関節炎と診断されたイヌへの増加したレベルのｎ−３脂肪酸を与えることの食餌効果を評価するために実施された。２人の動物整形外科専門医が研究に患畜を登録した。全部で３８匹のイヌは無作為に２種の食餌処置に割り当て、９０日間給餌された。試験および対照フードは先に記載のように、同じロットのフードから工業的に製造された（表６）。
【００６７】
血清脂肪酸、床反力計歩様解析および獣医師臨床評価は０、４５、および９０日目に記録した。血清脂肪酸特性は試験フードによって有意に改変された。試験群は、それぞれの給餌間隔の終了時に対照群と比較して、有意に高濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、とりわけＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡ、９０日目における有意に低濃度のＡＡ（Ｐ＜０．０１）、そして有意に低いｎ−６／ｎ−３比（Ｐ＜０．０１）を有した（表９）。
【００６８】
【表９】
【００６９】
イヌの最も重篤な変形性関節炎肢の生体工学的評価は、床反力計歩様解析を使用して客観的に評価した（表１０）。鉛直ピーク力は冒された肢の体重支持を確認するために測定される重要なパラメータである。対照群では９０日間の給餌期間中、平均鉛直ピーク力に有意な変化はなかった（Ｐ＝０．９１）が、試験群では期間中、平均鉛直ピーク力において有意な増加が見られた（Ｐ＝０．０１）。鉛直ピーク力の百分率平均変化も群間で有意に異なり（Ｐ＜０．０５）、研究経過中、試験群は冒された肢における体重支持を増したが、対照群は体重支持に変化を表さなかったことを示した。体重支持能力も、それぞれの食餌群に対する鉛直力の百分率変化の頻度分布を表示することにより表すことができる。対照群の３１％の動物だけが９０日間の給餌後に体重支持の改善を示し、一方試験群の８２％のイヌは研究期間中に体重支持を増した。
【００７０】
【表１０】
【００７１】
動物整形外科医により行われた主観臨床評価は試験規定食の有効性にとって付加的な支持を提供した。包括的な獣医師による臨床評価に基づいて、対照フードを消費したイヌに比べ、有意に高い割合の試験フードを消費したイヌが改善したと評価された（Ｐ＜０．０５）。動物専門医はまた、対照群に比較して、高い割合の試験群のイヌが関節の触診時に疼痛の緩和を表すことを観察した（Ｐ＝０．０５）。
【００７２】
研究番号３：イヌの研究は、変形性関節炎と診断されたイヌへの増加したレベルのｎ−３脂肪酸を与えることの用量効果を確認するために実施された。２８人の一般開業獣医が研究に患畜を登録した。全部で１７７匹のイヌは無作為に２種の食餌処置に割り当て、９０日間給餌された。研究に参加したイヌのおよそ２／３は、治療食を消費することを評価されることに加えて、変形性関節炎を治療するために処方された薬剤および／またはサプリメントを与えられていた。３種の試験フードは類似の主要栄養素特性を有したが、ＥＰＡおよびＤＨＡの組成が異なり、変数Ａは最低レベルを含有し、変数Ｃは最高レベルを含有した（表１１）。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
血清脂肪酸、ペット所有者評価、および獣医師臨床評価は０、２１、４５、および９０日目に記録した。血清脂肪酸特性はすべての食餌変数によって有意に改変された。試験変数Ｂ＆Ｃを与えられたイヌは、それぞれの給餌間隔の終了時に試験変数Ａを与えられたイヌに比較して、有意に高血清濃度のｎ−３脂肪酸（Ｐ＜０．０１）、とりわけＥＰＡ、ＤＨＡおよびＡＬＡ、有意に低濃度のｎ−６脂肪酸、とりわけＡＡ（Ｐ＜０．０１）、そして有意に低いｎ−６／ｎ−３比（Ｐ＜０．０１）を有した（表１２）。
【００７５】
【表１２】
【００７６】
ペット所有者は、２１日間食餌変数のいずれかを消費したイヌについて、個々の変形性関節炎徴候１４種の中の１３種における改善を報告した（表１３）。その上、ペット所有者は、９０日間食餌変数のいずれかを消費したイヌについて、個々の変形性関節炎徴候１４種の中の１３種に対して重症度の低下を報告した（表１４）。ペット所有者はまた、イヌが９０日間食餌変数のいずれかを消費した後では、観察可能な変形性関節炎徴候の頻度における有意な減少を報告した（表１５）。
【００７７】
【表１３】
【００７８】
【表１４】
【００７９】
【表１５】
【００８０】
獣医師の臨床評価に基づき、高濃度のｎ−３脂肪酸を消費したイヌは、最低量を与えられたイヌより、いっそう有意な変形性関節炎状態の改善、および変形性関節炎の進行のいっそう有意な減少を示すことが報告された（表１６）。薬剤および／またはサプリメントを与えられた群と投薬されない群の間の、変形性関節炎状態の改善または変形性関節炎の進行の減少における有意な差はなかった（表１７）。このことは変形性関節炎を患うイヌに付加的な利点を提供することによって、治療的規定食が別の治療と相乗的に働くか、または少なくとも別の治療に抵抗しないことを示す。
【００８１】
この研究に参加したイヌの中では、極めて低い有害反応または副作用の発生率が報告された。フードを割り当てられた２１５匹のイヌの中の５匹の動物だけが下痢および嘔吐を示し、それらはことによると食餌変数の１種を消費することに起因する可能性があった。有害反応または副作用の類似の発生率が、以前に論じられた２つの研究において治療用規定食を消費するイヌに関して報告された（実施例１および２のそれぞれに対して１／８８および１／２６）。
【００８２】
【表１６】
【００８３】
【表１７】
【００８４】
本明細書では、本発明の典型的な好ましい態様が開示されていて、特有の用語が使用されるが、それらは一般的で説明的な意味で使用され、限定するためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲において明らかにされる。明らかに本発明の多くの改変および変更が上記の教示の観点から可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明が明確に記載されたものとは異なって実施されてもよいことは理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節炎を患うイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌの可動性を増すための方法。
【請求項２】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イヌの軟骨組織における軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素がアグレカナーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
関節炎を患うイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌの肢における体重支持を増すための方法。
【請求項８】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
イヌの軟骨組織における軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
酵素がアグレカナーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
イヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌの関節炎に伴う疼痛を減らすための方法。
【請求項１４】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
イヌの軟骨組織における、軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
酵素がアグレカナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
酵素分解の調節に有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌにおける関節軟骨の酵素分解を調節するための方法。
【請求項２０】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
イヌの軟骨組織における軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
酵素がアグレカナーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｍＲＮＡのメッセージ発現の減少が軟骨細胞の膜へのエイコサペンタエン酸の取り込みを伴う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
エイコサペンタエン酸がフード組成物の状態で経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
フード組成物が、乾物を基準として、少なくとも重量で約０．２％のエイコサペンタエン酸を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
フード組成物が栄養食、スナック、サプリメントまたはトリートの成分である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
エイコサペンタエン酸がニュートラシューティカルまたは医薬剤形で経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
軟骨損傷を軽減する量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌにおける軟骨損傷を軽減するための方法。
【請求項３１】
イヌが１日につき約２０から約１５０ｍｇ／ｋｇ体重までの量でエイコサペンタエン酸を投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項１】
関節炎を患うイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌの可動性を増すための方法。
【請求項２】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イヌの軟骨組織における軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素がアグレカナーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
関節炎を患うイヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌの肢における体重支持を増すための方法。
【請求項８】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
イヌの軟骨組織における軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
酵素がアグレカナーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
イヌにおける軟骨損傷を軽減するために有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌの関節炎に伴う疼痛を減らすための方法。
【請求項１４】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
イヌの軟骨組織における、軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
酵素がアグレカナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
酵素分解の調節に有効な量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌにおける関節軟骨の酵素分解を調節するための方法。
【請求項２０】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がダウンレギュレーションされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
軟骨分解に関与する１種以上の遺伝子がターンオフされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
イヌの軟骨組織における軟骨分解を引き起こす酵素のｍＲＮＡメッセージ発現が減少する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
酵素がアグレカナーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｍＲＮＡのメッセージ発現の減少が軟骨細胞の膜へのエイコサペンタエン酸の取り込みを伴う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
イヌの軟骨組織からのグリコサミノグリカンの誘発された遊離が低下する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
エイコサペンタエン酸がフード組成物の状態で経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
フード組成物が、乾物を基準として、少なくとも重量で約０．２％のエイコサペンタエン酸を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
フード組成物が栄養食、スナック、サプリメントまたはトリートの成分である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
エイコサペンタエン酸がニュートラシューティカルまたは医薬剤形で経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
軟骨損傷を軽減する量のエイコサペンタエン酸をイヌに投与することを含む、イヌにおける軟骨損傷を軽減するための方法。
【請求項３１】
イヌが１日につき約２０から約１５０ｍｇ／ｋｇ体重までの量でエイコサペンタエン酸を投与される、請求項３０に記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５３１４８３（Ｐ２００８−５３１４８３Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５２６９（Ｐ２００７−５５５２６９）
【出願日】平成１８年２月１３日（２００６．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００４８５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８７５３
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０２３２９２２３）ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド (138)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１３日（２００６．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００４８５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８７５３
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０２３２９２２３）ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド (138)
【Ｆターム（参考）】
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