インスリン類似体
Ａ鎖の１９位にチロシン残基の修飾を含む、インスリンの完全な効力を有する類似体が提供される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
インスリンは驚異的なペプチドホルモンである。インスリンは、実質的にすべての形態の糖尿病においてグルコースを低下させる比類なき能力を示す。残念ながら、その薬理作用はグルコース感受性ではなく、それ自体、過剰に作用して、生命を脅かす低血糖症をもたらすことがある。一貫性のない薬理作用がインスリン療法の顕著な特徴であるので、低血糖症の発生を伴わずに血糖を正常化することは極めて困難である。さらに、天然インスリンは作用期間が短く、基礎グルコースの管理における使用に適するようにするためには改変が必要である。インスリン療法における１つの中心的な目標は、１日１回型の作用時間を提供できるインスリン製剤を設計することである。インスリン投薬の作用時間を延長することは、注射部位でのインスリンの溶解度を低下させることによって達成できる。
【０００２】
溶解度を低下させるための３つの立証された異なる分子手法があり、それらは：（１）亜鉛との不溶性懸濁液としてのインスリンの製剤、（２）カチオン性アミノ酸の添加を介してその等電点を生理的ｐＨに上昇させること、（３）溶解度を低下させ、アルブミンに結合する疎水性リガンドを提供する共有結合修飾、を含む。これらの手法はすべて、注射部位での沈殿、およびその後の再可溶化と活性ホルモンとしての血液への輸送に伴って起こる固有の変動性によって制限される。
【０００３】
プロドラッグ化学は、投与部位からのクリアランスおよび高度に定義された濃度での血漿中の平衡後のインスリン作用の開始と期間を正確に制御する選択的機構を提供する。現在の長時間作用性インスリン類似体および製剤と比べてそのような手法の主要な利点は、インスリンの貯蔵所が、注射が行われる皮下脂肪組織ではなく血液画分であることである。これは、沈殿および可溶化の変動性を取り除く。これはまた、皮下注射以外の経路によるペプチドホルモンの投与を可能にする。有効なプロドラッグ−ホルモンを確立するために、プロドラッグ構造エレメントの可逆的な結合のための基礎を形成することができる活性部位の構造アドレス（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｄｄｒｅｓｓ）が必要である。構造アドレスは２つの鍵となる特徴を提供する必要がある：（１）選択的化学修飾のための潜在能、および（２）プロドラッグ構造エレメントの除去時に天然形態で完全な活性を提供する能力である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
インスリンは、低い効力の一本鎖プロインスリン前駆体から酵素プロセシングを介する生合成によって誘導される二本鎖ヘテロ二量体である。ヒトインスリンは、ジスルフィド結合によって共に結合された、合計５１個のアミノ酸を有する２本のペプチド鎖（「Ａ鎖」（配列番号１）と「Ｂ鎖」（配列番号２））から成る。Ｂ鎖のＣ末端領域とＡ鎖の２つの末端は三次元構造において会合し、インスリン受容体への高親和性結合のための部位を構築する。天然インスリン構造は、アミド結合したプロドラッグエレメントの選択的構築のために使用され得る、活性部位残基における限られた独自の化学エレメントを有する。プロドラッグエレメントの結合のためのエレメントを提供するように修飾できる２つの部位は、天然Ａ鎖の１９位のチロシン残基（「Ａ１９チロシン」）および天然Ｂ鎖の２４位のフェニルアラニン残基（「Ｂ２４フェニルアラニン」）を含む。これら２つのアミノ酸はどちらも、インスリン作用における中心的な重要性を有する。しかし、導入することができ、それでもなお完全な効力を維持することができる構造変化の種類に関しては、これら２つのアミノ酸はまた、極めて限定的であることが証明されている。
【０００５】
本明細書で開示するように、出願人は、Ａ１９位で修飾された、インスリンプロドラッグ誘導体を構築するために潜在的に使用できる完全な効力のインスリン類似体を発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの実施形態によれば、１個のアミノ基が、効力の喪失を伴わずにインスリンの活性部位内のペプチドに挿入された、完全な効力のインスリン類似体が提供される。より詳細には、Ａ鎖の１９位の天然チロシンに代わる４−アミノフェニルアラニンのアミノ酸部分の選択的挿入を、インスリンペプチドの効力の喪失を伴わずに受け入れることができる。特定のジペプチドによるこの活性部位アミノ基のその後の化学的アミド化は、活性を著しく低下させ、適切なプロドラッグとして働く。
【０００７】
１つの実施形態によれば、インスリンペプチドのＡ鎖が配列：
ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）
を含み、Ｂ鎖が配列：
Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）
を含むインスリン類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化１】
［式中、Ｒ４は、−ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
さらなる実施形態では、Ｂ鎖は、配列Ｘ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）
を含む。
［配列中、
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される］
【０００８】
１つの実施形態によれば、インスリンペプチドのＡ鎖が、配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＮ（配列番号６）を含み、Ｂ鎖が、ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号７）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）およびＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）から成る群より選択される配列を含む、インスリン類似体が提供される。
［配列中、Ｘ２は、一般式：
【化２】
のアミノ酸である］
【０００９】
１つの実施形態によれば、一本鎖Ａ１９インスリン類似体が提供される。この実施形態では、ヒトインスリンＢ鎖のカルボキシ末端またはその機能的類似体は、本開示のＡ１９ Ａ鎖類似体のＮ末端に共有結合で連結されている。１つの実施形態では、Ｂ鎖は、４〜１２または４〜８アミノ酸のペプチドリンカーを介してＡ鎖に連結されている。
【００１０】
もう１つの実施形態では、ペプチドに親水性部分を共有結合させることによってインスリン類似体の溶解度を高める。１つの実施形態では、親水性部分は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸または配列番号９の２８位のアミノ酸または配列番号８の２９位のアミノ酸のいずれかに連結される。１つの実施形態では、親水性部分は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。もう１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００１１】
アシル化またはアルキル化は、循環中のインスリンペプチドの半減期を高めることができる。アシル化またはアルキル化は、好都合にも、インスリン受容体における作用の開始を遅延させる、および／または作用の期間を延長させることができる。インスリン類似体は、親水性部分が連結されている同じアミノ酸位置でまたは異なるアミノ酸位置でアシル化またはアルキル化し得る。
【００１２】
１つの実施形態によれば、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルの、本明細書で開示される新規Ａ１９インスリン類似体のいずれか、および医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を含有し得る。１つの実施形態では、医薬組成物は、滅菌され、場合により様々な包装容器内に納められて貯蔵される水溶液を含む。他の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物は、組成物を患者に投与するための使い捨て装置を含むキットの一部としてさらに包装され得る。容器またはキットは、周囲室温または冷蔵温度での保存に関してラベル表示され得る。
【００１３】
１つの実施形態によれば、インスリン依存患者における血糖値を調節する改善された方法が提供される。その方法は、本開示のＡ１９インスリン類似体を糖尿病の管理のために治療上有効な量で投与する工程を含む。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、約５，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するＰＥＧ鎖でペグ化される。
【００１４】
＝＝関連出願の相互参照＝＝
本出願は、その開示が全体として参照により明白に本明細書に組み込まれる、２００８年１２月１９日出願の米国特許出願第６１／１３９，２２１号の優先権を主張する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヒトインスリンを調製するための２段階合成法の概略図である。手順の詳細は実施例１で述べられており、工程ａの試薬は２，２’ジチオビス（５−ニトロピリジン）、室温のＤＭＳＯを含み、工程ｂの試薬はインスリンＡ（６、１１および２０位のＡｃｍならびに７位のＳＨ）、室温のＤＭＳＯを含み、工程ｃの試薬はＩ２、８０％ＡｃＯＨを含む。
【図２】図２は、精製天然インスリンと合成ヒトインスリンのインスリン受容体への特異的結合を比較するグラフである。結果が示すように、２つの分子は同様の結合活性を有する。
【図３】図３は、天然インスリンとＡ１９インスリン類似体（インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）１９）の相対的インスリン受容体結合を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本発明を説明し、特許請求する際に、以下の用語を以下で述べる定義に従って使用する。
【００１７】
本明細書で使用される、「プロドラッグ」という用語は、化学修飾を受けた後にその薬理学的作用を示す任意の化合物と定義される。
【００１８】
「生物活性ポリペプチド」は、インビトロおよび／またはインビボで生物学的作用を及ぼすことができるポリペプチドを指す。
【００１９】
その立体化学を明記していないアミノ酸の指定は、アミノ酸のＬもしくはＤ形態またはラセミ混合物を包含することが意図されている。
【００２０】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型または油中水型乳剤のような乳剤、および様々なタイプの湿潤剤などの、標準的な医薬担体の任意のものを含む。この用語はまた、米国連邦政府の規制当局によって承認されたまたはヒトを含む動物における使用のために米国薬局方にリストされている物質の任意のものを包含する。
【００２１】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される塩」という用語は、親化合物の生物活性を保持し、生物学的にまたは他の理由から望ましくないものではない化合物の塩を指す。本明細書で開示される化合物の多くは、アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれらに類似の基の存在によって酸性および／または塩基性塩を形成することができる。
【００２２】
医薬的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩は、ほんの一例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩を含む。有機塩基から誘導される塩は、第一級、第二級および第三級アミンの塩を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
医薬的に許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製され得る。無機酸から誘導される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等を含む。有機酸から誘導される塩は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等を含む。
【００２４】
本明細書で使用される、「治療すること」という用語は、特定の障害もしくは疾患の予防、特定の障害もしくは疾患に関連する症状の緩和、および／または前記症状を予防するもしくは除去することを含む。たとえば、本明細書で使用される「糖尿病を治療すること」という用語は、一般に血糖値を正常値近くに維持することを指し、所与の状況に依存して血糖値を上昇させるまたは低下させることを含み得る。
【００２５】
本明細書で使用される、インスリン類似体の「有効」量または「治療有効量」は、非毒性であるが所望効果を与えるのに十分なインスリン類似体の量を指す。たとえば、１つの所望効果は、低血糖症の予防または治療である。「有効」な量は、個体の年齢および全般的健康状態、投与方法等に依存して、被験者によって異なる。従って、正確な「有効量」を特定することは必ずしも可能ではない。しかし、任意の個別症例における適切な「有効」量は、常套的な実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００２６】
「非経口的」という用語は、消化管を通さず、鼻内、吸入、皮下、筋肉内、髄腔内または静脈内などの何らかの他の経路によることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「インスリンペプチド」という用語は、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖を含む５１アミノ酸のヘテロ二量体、ならびにその一本鎖インスリン類似体（たとえば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９６／３４８８２号および米国特許第６，６３０，３４８号に開示されているものを含む）を表す一般用語であり、Ａ１９、Ｂ１６もしくはＢ２５位のアミノ酸の４−アミノフェニルアラニンへの改変、またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位から選択される位置の１もしくはそれ以上のアミノ酸置換、またはＢ１〜４位およびＢ２６〜３０位のいずれかまたは全部の欠失を含む、天然Ａ鎖および／またはＢ鎖の修飾された誘導体を含むヘテロ二量体および一本鎖類似体を包含する。
【００２８】
本明細書で使用される、「一本鎖インスリン類似体」という用語は、インスリンのＡ鎖とＢ鎖がポリペプチドリンカーによって共有結合で連結されている、構造的に関連するタンパク質の群を包含する。
【００２９】
本明細書で使用される「Ａ１９ Ａ鎖類似体」は、配列番号６のＡ鎖を含むアミノ酸およびＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１から選択される位置に１またはそれ以上のアミノ酸置換を含む配列番号６の修飾された誘導体を表す。
【００３０】
「Ａ１９インスリン類似体」は、天然インスリンのＡ鎖の１９位の天然チロシン残基の４−アミノフェニルアラニンまたは４−メトキシフェニルアラニンによる置換を有するインスリンペプチドである。
【００３１】
本明細書で使用されるアミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、またはアミノ酸への化学基の付加および／もしくはアミノ酸からの化学基の除去によるアミノ酸の誘導体化を指し、ヒトタンパク質中で一般的に認められる２０個のアミノ酸、ならびに異型または非天然のアミノ酸のいずれかによる置換を含む。異型アミノ酸の商業的入手源は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、およびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む。異型アミノ酸は、商業的供給者から購入し得るか、新たに合成し得る、または天然アミノ酸から化学修飾もしくは誘導体化し得る。
【００３２】
本明細書で使用されるアミノ酸「置換」は、あるアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置換を指す。本出願全体を通して、文字と番号による特定アミノ酸位置（たとえばＡ５位）のすべての参照は、それぞれの天然ヒトインスリンＡ鎖（配列番号１）またはＢ鎖（配列番号２）におけるＡ鎖のその位置（たとえばＡ５位）またはＢ鎖のその位置（たとえばＢ５位）のアミノ酸、またはその任意の類似体における対応するアミノ酸位置を指す。たとえば、いかなるさらなる精緻化も伴わない「Ｂ２８位」への本明細書での参照は、配列番号２の第一アミノ酸が欠失しているインスリン類似体のＢ鎖の対応する位置、Ｂ２７を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書では以下の５つの群の１つの中での交換と定義される：
Ｉ．小型の脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の正に荷電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型の脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
【００３４】
本明細書で使用される「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」という一般的用語は、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは少なくとも９である］によって表される、分枝または直鎖状の、エチレンオキシドと水の縮合重合体の混合物を指す。いかなるさらなる特徴づけも伴わずに、この用語は、５００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールの重合体を含むことが意図されている。「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」は、そのおおよその平均分子量を示す数字接尾語と組み合わせて使用される。たとえば、ＰＥＧ−５，０００は、約５，０００ダルトンの総分子量平均を有するポリエチレングリコール鎖を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「ペグ化」という用語および同様の用語は、化合物にポリエチレングリコール鎖を連結することによってその天然の状態から改変された化合物を指す。「ペグ化ポリペプチド」は、ポリペプチドに共有結合されたＰＥＧ鎖を有するポリペプチドである。
【００３６】
本明細書で使用される「リンカー」は、２つの別個の実体を互いに結合する結合、分子または分子の群である。リンカーは、２つの実体の最適の間隔を提供し得るかまたは２つの実体が互いから分離されることを可能にする不安定結合をさらに供給し得る。不安定結合は、光開裂性基、酸不安定部分、塩基不安定部分および酵素開裂性基を含む。
【００３７】
本明細書で使用される「二量体」は、リンカーによって互いに共有結合された２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、いかなる限定語も伴わずに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は２つの同一サブユニットを含み、ヘテロ二量体は異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは実質的に互いに類似する。
【００３８】
本明細書で使用される、ｎが１〜６である「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」という用語は、１から特定数の炭素原子を有する分枝または直鎖状アルキル基を表す。典型的なＣ１〜Ｃ６アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用されるｎが２〜６である「Ｃ２〜Ｃｎアルケニル」という用語は、２から特定数の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を有するオレフィン性不飽和分枝または直鎖状基を表す。そのような基の例として、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル、ペンテニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
ｎが２〜６である「Ｃ２〜Ｃｎアルキニル」という用語は、２からｎ個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を有する不飽和分枝または直鎖状基を指す。そのような基の例として、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル等を含むがこれらに限定されない、１または２個の芳香環を有する単環式または二環式炭素環系を指す。アリール環の大きさおよび置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指定することによって示される。たとえば、（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）という用語は、１〜３員アルキル鎖によって親部分に結合された５〜１０員アリールを指す。
【００４２】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、１または２個の芳香環を含み、芳香環中に少なくとも１個の窒素、酸素または硫黄原子を含む単環式または二環式環系を指す。ヘテロアリール環の大きさおよび置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指定することによって指示される。たとえば、（Ｃ１〜Ｃｎアルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）という用語は、１〜「ｎ」員アルキル鎖によって親部分に結合された５または６員ヘテロアリールを指す。
【００４３】
本明細書で使用される、さらなる指定を伴わない「患者」という用語は、任意の家畜化された温血脊椎動物（たとえば、家畜、ウマ、ネコ、イヌおよび他のペット動物を含むが、これらに限定されない）ならびにヒトを包含することが意図されている。
【００４４】
本開示は、天然インスリンと比較してインスリン受容体および／またはＩＧＦ−１受容体における高い活性を保持するインスリン類似体を対象とする。１つの実施形態では、インスリン類似体は天然インスリンのＡ鎖の１９位に存在するチロシン残基の修飾を含み、前記類似体は天然インスリンの活性を保持する。そのような類似体を本明細書では「Ａ１９インスリン類似体」と称する。Ａ１９インスリン類似体は、天然インスリンペプチドと比較して付加的な修飾を含んでもよく、このインスリン類似体は、天然インスリンと比較してインスリン受容体において７０％、８０％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上の活性を示す。
【００４５】
１つの実施形態では、アミノ基が、効力の喪失を伴わずにインスリンの活性部位内のペプチドに挿入されたインスリン誘導体が調製される。より詳細には、Ａ鎖の１９位の天然チロシンの４−アミノフェニルアミノ酸部分による選択的置換を、インスリンペプチドの効力の喪失を伴わずに受け入れることができる。プロドラッグ部分によるこの活性部位アミノ基のその後の化学的アミド化は、活性を著しく低下させ、従ってインスリンの適切なプロドラッグを提供する。
【００４６】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に、天然インスリンと比較して、１またはそれ以上の付加的なアミノ酸置換を含み、１つの実施形態では、それらのアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。インスリンの所望活性に有害な影響を及ぼさないこれらの位置における適切なアミノ酸置換は、たとえば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００７；８８（５）：６８７−７１３に示されているように、当業者に公知である。
【００４７】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、天然チロシン残基の芳香環上に存在するヒドロキシル基のアミノ基またはメトキシ基による置換を含み、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、または１〜３アミノ酸置換をさらに含む。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に１〜１０、１〜８、１〜５、または１〜３アミノ酸置換を含み、この類似体は、天然インスリン配列と比較して、天然インスリンＢペプチドのＢ１〜４位およびＢ２６〜３０位のアミノ酸の１またはそれ以上の欠失によってさらに修飾されている。もう１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に１〜８、１〜５、または１〜３アミノ酸置換を含み、天然インスリン配列と比較して、アミノ酸Ｂ１〜４および／またはＢ２６〜３０の欠失によってさらに修飾されている。
【００４８】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、天然チロシン残基の芳香環上に存在するヒドロキシル基のアミノ基またはメトキシ基による置換を含み、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンから成る群より選択されるアミノ酸によるＡ８位のアミノ酸置換（天然インスリンペプチドと比較して）をさらに含む。さらなる実施形態では、Ｂ１０位のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択されるアミノ酸である。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、天然チロシン残基の芳香環上に存在するヒドロキシル基のアミノ基またはメトキシ基による置換を含み、天然インスリンペプチドと比較して、Ａ８およびＢ２８〜３０から成る群より選択される位置のアミノ酸置換をさらに含む。
【００４９】
１つの実施形態によれば、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）を含有するＡ鎖ポリペプチド鎖を含むインスリン類似体またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８位から選択される、１〜９、１〜５もしくは１〜３アミノ酸修飾によって配列番号３と異なる配列を含有するその類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化３】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２もしくはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；そして
Ｘ３は、アスパラギン、グリシンもしくはアラニンである］
１つの実施形態では、Ｒ４は、ＮＨ２である。別の実施形態では、Ｘ１は、トレオニンであり、Ｘ３は、アスパラギンであり、Ｒ４は、ＮＨ２である。
【００５０】
より詳細には、１つの実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびにＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）の配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体、または配列番号３および／もしくは配列番号４が、独立して、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位から選択される１〜３アミノ酸修飾によってそれぞれの配列番号３および／もしくは配列番号４配列と異なるその類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化４】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２もしくはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンもしくはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
【００５１】
もう１つの実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびにＸ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）の配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニン、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化５】
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される］
１つの実施形態では、Ｂ鎖配列は、配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号７）を含み、さらなる実施形態では、Ｂ鎖は、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）およびＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１０）から成る群より選択される。さらなる実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびに配列番号７、配列番号８および配列番号９から成る群より選択される配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体が提供される。
［配列中、Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され、Ｘ２は、一般式
【化６】
のアミノ酸であり、そしてＸ３はアスパラギンであり、１つの実施形態では、Ｘ１はトレオニンであり、Ｘ２は４−アミノフェニルアラニンであり、そしてＸ３はアスパラギンである]
【００５２】
１つの実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびにＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）またはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）の配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化７】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；そして
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンである］
さらなる実施形態では、Ｒ４はＮＨ２であり、そしてＸ３はアスパラギンであり、また１つの実施形態では、Ｒ４はＮＨ２であり、Ｘ１はトレオニンであり、そしてＸ３はアスパラギンである。
【００５３】
１つの実施形態によれば、Ａ１９アミノ酸が、一般式
【化８】
のアミノ酸で置換されている一本鎖インスリン類似体が提供される。
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
１つの実施形態によれば、一本鎖インスリン類似体は、式：Ｂ−Ｐ−Ａ１９の化合物を含む［式中、Ｂは、インスリンのＢ鎖またはその機能的類似体を表し、Ａ１９は、本明細書で開示されるＡ１９ Ａ鎖類似体を表し、そしてＰは、Ａ鎖のアミノ末端をＢ鎖のカルボキシ末端に共有結合で連結する、ペプチドリンカーを含むリンカーを表す］。１つの実施形態では、リンカーは、約５〜約１８、または約１０〜約１４、または約４〜約８、または約６アミノ酸のペプチドリンカーである。
【００５４】
１つの実施形態では、一本鎖インスリン類似体は、式：Ｂ−Ｐ−Ａ１９の化合物を含む。
［式中、
Ｂは、Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）の配列を含有するＢ鎖配列を表し；
Ａ１９は、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）の配列を含有するＡ鎖配列を表し；そして
Ｐは、４〜８アミノ酸のペプチドリンカーを表し、さらに配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化９】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
１つの実施形態によれば、ペプチドリンカーは、５〜１８アミノ酸長であり、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号１２）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２１）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ （配列番号１５）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１８）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１９）およびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２０）から成る群より選択される配列を含む。
【００５５】
１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＡＧＲＧＳＧＫ（配列番号２４）、ＡＧＬＧＳＧＫ（配列番号２５）、ＡＧＭＧＳＧＫ（配列番号２６）、ＡＳＷＧＳＧＫ（配列番号２７）、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＴＧＬＧＲＧＫ（配列番号２９）、ＴＧＬＧＳＧＫ（配列番号３０）、ＨＧＬＹＳＧＫ（配列番号３１）、ＫＧＬＧＳＧＱ（配列番号３２）、ＶＧＬＭＳＧＫ（配列番号３３）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＹＳＧＫ（配列番号３５）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号３７）、ＶＷＳＳＳＧＫ（配列番号３８）、ＶＧＳＳＳＧＫ（配列番号３９）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号４０）、ＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号４１）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４２）、ＫＧＬＳＳＧＱ（配列番号４３）、ＶＫＬＳＳＧＱ（配列番号４４）、ＶＧＬＫＳＧＱ（配列番号４５）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４６）およびＶＧＬＳＫＧＱ（配列番号４７）から成る群より選択される配列を含む。１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、７〜１２アミノ酸長であり、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１）またはＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号１２）を含む。
【００５６】
１つの実施形態では、一本鎖インスリン類似体は、アミノ酸配列：
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号２３）を有する。
［配列中、Ｘａａは、一般式
【化１０】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸である］
【００５７】
本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、ペプチドの腎クリアランスを防ぐことによってペプチドの有効期間を延長させつつ、生理的ｐＨの水溶液へのペプチドの溶解度を改善するようにさらに修飾することができる。ペプチドは、血漿タンパク質と比較した場合それらの比較的小さな分子サイズのために容易に除去される。ペプチドの分子量を４０ｋＤａ超に増大させると、腎閾値を上回り、血漿中の持続期間を有意に延長させる。従って、１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、共有結合で連結された親水性部分を含むようにさらに修飾される。１つの実施形態では、親水性部分は、血漿タンパク質、ポリエチレン鎖または免疫グロブリンのＦｃ部分である。それ故、１つの実施形態では、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、アミノ酸の側鎖に共有結合で連結された１またはそれ以上の親水性基を含むようにさらに修飾される。
【００５８】
１つの実施形態によれば、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸または、たとえば配列番号９の２８位もしくは配列番号８の２９位を含む、Ｂ鎖のカルボキシ末端に位置するリシンアミノ酸の側鎖に親水性部分を連結することによって修飾される。１つの実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸の１個が、ペプチドリンカーの側鎖に親水性部分を連結することによって修飾された一本鎖インスリン類似体が提供される。１つの実施形態では、修飾アミノ酸は、システイン、リシンまたはアセチルフェニルアラニンである。１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号４１）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４２）、ＫＧＬＳＳＧＱ（配列番号４３）、ＶＫＬＳＳＧＱ（配列番号４４）、ＶＧＬＫＳＧＱ（配列番号４５）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４６）およびＶＧＬＳＫＧＱ（配列番号４７）から成る群より選択され、親水性部分（たとえばポリエチレングリコール）は、ペプチドリンカーのリシン側鎖に連結される。もう１つの実施形態では、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、Ａ１９インスリン類似体のＢ鎖のカルボキシ末端への修飾アミノ酸の付加によってさらに修飾され、Ｃ末端に付加されるアミノ酸は、そのアミノ酸に連結された親水性部分を含むように修飾される。１つの実施形態では、Ｃ末端に付加されるアミノ酸は、修飾されたシステイン、リシンまたはアセチルフェニルアラニンである。１つの実施形態では、親水性部分は、血漿タンパク質、ポリエチレンオキシド鎖および免疫グロブリンのＦｃ部分から成る群より選択される。
【００５９】
１つの実施形態では、親水性基はポリエチレンオキシド鎖であり、１つの実施形態では、２またはそれ以上のポリエチレンオキシド鎖が、Ａ１９インスリン類似体の２またはそれ以上のアミノ酸側鎖に共有結合で連結される。１つの実施形態によれば、親水性部分は、Ａ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ鎖のＣ末端またはＮ末端から成る群より選択される位置で、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体のアミノ酸側鎖に共有結合で連結される。複数のポリエチレンオキシド鎖を有するＡ１９インスリン類似体に関しては、ポリエチレンオキシド鎖は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸で、またはＢ鎖のカルボキシ末端に位置するリシンアミノ酸の側鎖に、またはペプチドのＣ末端の単一アミノ酸の付加によって結合することができ、この付加されるアミノ酸は、その側鎖に連結されたポリエチレンオキシド鎖を有する。
【００６０】
１つの実施形態によれば、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、アミノ酸置換によってさらに修飾され、この置換アミノ酸は、たとえばポリエチレングリコールを含む、親水性部分と架橋するのに適した側鎖を含む。１つの実施形態では、親水性部分が連結されるＡ１９インスリン類似体の位置のアミノ酸を、親水性部分を導入するまたは親水性部分の結合を容易にする天然または合成アミノ酸で置換する（またはＣ末端に付加する）。たとえば、１つの実施形態では、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置の天然アミノ酸を、ポリエチレンオキシド鎖の共有結合での連結を可能にするリシン、システインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換する（またはリシン、システインまたはアセチルフェニルアラニン残基をＣ末端に付加する）。
【００６１】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に付加された単一システイン残基を有するか、またはＡ１９インスリン類似体は、少なくとも１個のシステイン残基で置換されており、このシステイン残基の側鎖は、たとえばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキルおよびハロアシルを含むチオール反応性試薬でさらに修飾されている。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシルおよびエーテル基ならびにポリエチレングリコール単位などの他の親水性部分を含んでもよい。別の実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のカルボキシ末端に付加された単一リシン残基を有するか、またはＡ１９インスリン類似体はリシンで置換されており、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物等）などのアミン反応性試薬またはポリエチレングリコールなどの親水性部分のアルデヒドを使用してさらに修飾されている。
【００６２】
Ａ１９インスリン類似体がポリエチレングリコール鎖を含む実施形態では、ポリエチレン鎖は直鎖の形態であってもよく、または分枝であってもよい。１つの実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約６０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。複数のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結して、最適の溶解度および血液クリアランス特性を有するＡ１９インスリン類似体を提供することができる。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体を、約２０，０００〜約６０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する１本のポリエチレングリコール鎖に連結する。もう１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体を、２本の鎖の総平均分子量が約４０，０００〜約８０，０００ダルトンの範囲から選択される２本のポリエチレングリコール鎖に連結する。１つの実施形態では、２０，０００または６０，０００ダルトンの平均分子量を有する１本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結する。もう１つの実施形態では、１本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結し、１本のポリエチレングリコール鎖は、約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。１つの実施形態では、２本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結し、第一および第二ポリエチレングリコール鎖は各々２０，０００ダルトンの平均分子量を有する。もう１つの実施形態では、２本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結し、第一および第二ポリエチレングリコール鎖は各々４０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００６３】
さらなる実施形態では、ペプチドに共有結合された２またはそれ以上のポリエチレングリコール鎖を含むＡ１９インスリン類似体が提供され、このポリエチレングリコール鎖の合計分子量は約４０，０００〜約６０，０００ダルトンである。１つの実施形態では、ペグ化Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のＮ末端および／または配列番号９の２８位もしくは配列番号８の２９位から選択される１またはそれ以上のアミノ酸に連結されたポリエチレングリコール鎖を含み、ＰＥＧ鎖の総分子量は約４０，０００〜約８０，０００ダルトンである。
【００６４】
１つの実施形態によれば、Ａ１９インスリン類似体の溶解度、安定性および／または薬物動態を改善するために血漿タンパク質がペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合で連結されたＡ１９インスリン類似体が提供される。たとえば、血清アルブミンを本明細書で提供されるＡ１９インスリン類似体に共有結合することができる。血漿タンパク質は、Ｂ鎖のＮ末端またはＡ鎖もしくはＢ鎖のＣ末端に連結することができる。１つの実施形態では、血漿タンパク質をＢ鎖のＮ末端および／または配列番号９の２８位もしくは配列番号８の２９位に対応するアミノ酸に共有結合する。
【００６５】
１つの実施形態によれば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に相当する直鎖状アミノ酸配列が、開示されるＡ１９インスリン類似体のアミノ酸側鎖に共有結合で連結されたＡ１９インスリン類似体が提供される。Ｆｃ部分の結合は、Ａ１９インスリン類似体の溶解度、安定性および／または薬物動態を改善するために行われる。Ｆｃ部分は、Ｂ鎖のＮ末端またはＡ鎖もしくはＢ鎖のＣ末端に連結することができる。たとえば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に相当するアミノ酸配列を、たとえば配列番号９の２８位または配列番号８の２９位に対応するアミノ酸への連結を含む、Ｂ鎖のＣ末端に共有結合することができる。Ｆｃ部分は、典型的にはＩｇＧから単離されたものであるが、任意の免疫グロブリンからのＦｃペプチドフラグメントが同等に機能するはずである。
【００６６】
本発明の特定態様では、Ａ１９インスリン類似体を、Ａ１９インスリン類似体のアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接アシル化によってアシル基を含むように修飾する。一部の実施形態では、Ａ１９インスリン類似体を、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して直接アシル化する。一部の実施形態では、アシル化は、Ａ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９から選択される１またはそれ以上の位置においてなされる。これに関して、アシル化Ａ１９インスリン類似体は、配列番号３のＡ鎖アミノ酸配列および配列番号５のＢ鎖、またはＡ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の少なくとも１つが側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含む任意のアミノ酸に修飾された配列番号３および／もしくは配列番号５の修飾アミノ酸配列を含み得る。一部の特定実施形態では、Ａ１９インスリン類似体の直接アシル化は、Ｂ２８またはＢ２９位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して起こる。１つのさらなる実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ２８またはＢ２９位に存在するＬｙｓのε−アミノ基に結合した１〜２４個の炭素原子を有するカルボン酸のアシル基を含む。
【００６７】
１つの実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸の１つが、ペプチドリンカーのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接アシル化によってアシル基を含むように修飾されている、一般式Ｂ−Ｐ−Ａ１９の一本鎖インスリン類似体が提供される。１つの実施形態によれば、一本鎖インスリン類似体のペプチドリンカーは、ＡＧＲＧＳＧＫ（配列番号２４）、ＡＧＬＧＳＧＫ（配列番号２５）、ＡＧＭＧＳＧＫ（配列番号２６）、ＡＳＷＧＳＧＫ（配列番号２７）、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＴＧＬＧＲＧＫ（配列番号２９）、ＴＧＬＧＳＧＫ（配列番号３０）、ＨＧＬＹＳＧＫ（配列番号３１）、ＫＧＬＧＳＧＱ（配列番号３２）、ＶＧＬＭＳＧＫ（配列番号３３）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＹＳＧＫ（配列番号３５）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号３７）、ＶＷＳＳＳＧＫ（配列番号３８）、ＶＧＳＳＳＧＫ（配列番号３９）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号４０）、ＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号４１）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４２）、ＫＧＬＳＳＧＱ（配列番号４３）、ＶＫＬＳＳＧＱ（配列番号４４）、ＶＧＬＫＳＧＱ（配列番号４５）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４６）およびＶＧＬＳＫＧＱ（配列番号４７）から成る群より選択され、Ａ鎖中、Ｂ鎖中または連結ペプチド中の少なくとも１つのリシン残基はアシル化によって化学修飾されている。１つの実施形態では、アシル化基は、１〜５、１０〜１２または１２〜２４炭素鎖を含む。
【００６８】
本開示はまた、本発明のＡ１９インスリン類似体が、場合により共有結合を介して、また場合によりリンカーを介して、コンジュゲートに連結されている他のコンジュゲートを包含する。連結は、共有化学結合、静電相互作用、水素相互作用、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、または疎水性もしくは親水性相互作用などの物理的力によって実現することができる。様々な非共有結合カップリングシステムを使用してよく、たとえばビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着パートナー、または互いに対して親和性を有する任意の結合パートナーもしくはそのフラグメントを含む。
【００６９】
本開示のＡ１９インスリン類似体は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、これらの標的アミノ酸の選択される側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、直接共有結合による連結を介してコンジュゲート部分に連結することができる。ペプチドまたはコンジュゲート部分上の反応基は、たとえばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基を含む。誘導体化剤は、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当技術分野で公知の他の物質を含む。あるいは、コンジュゲート部分は、リンカーまたは多糖もしくはポリペプチド担体などの中間担体を介して間接的にペプチドに連結することができる。多糖担体の例としてアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例として、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、および生じる負荷担体に望ましい溶解度特性を付与する、これらのアミノ酸とたとえばセリンなどの他のアミノ酸の混合ポリマーが挙げられる。
【００７０】
例示的なコンジュゲート部分は、異種ペプチドもしくはポリペプチド（たとえば血漿タンパク質を含む）、標的化剤、免疫グロブリンもしくはその部分（たとえば可変領域、ＣＤＲもしくはＦｃ領域）、放射性同位体、発蛍光団もしくは酵素標識などの診断標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、または他の治療もしくは診断物質を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本開示のＡ１９インスリン類似体および血漿タンパク質を含むコンジュゲートが提供され、血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリンおよびフィブリノーゲンから成る群より選択される。１つの実施形態では、コンジュゲートの血漿タンパク質部分はアルブミンまたはトランスフェリンである。一部の実施形態では、Ａ１９インスリン類似体はリンカーを介してコンジュゲート部分に結合され、このリンカーは、１〜約６０個の原子、または１〜３０個の原子またはそれ以上の長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子、または１０〜２０個の原子の長さの鎖を含む。一部の実施形態では、鎖の原子はすべて炭素原子である。一部の実施形態では、リンカーの骨格中の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから成る群より選択される。炭素原子およびリンカーは、より可溶性のコンジュゲートを提供するためにそれらの予想される溶解度（親水性）に従って選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、標的組織または器官または細胞中で認められる酵素または他の触媒または加水分解条件による切断に供される官能基を提供する。一部の実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の潜在的可能性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合またはペプチジル結合であり、コンジュゲートがポリペプチドである場合、コンジュゲート全体が融合タンパク質であり得る。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであってよい。例示的なリンカーは、約１〜５０アミノ酸長、５〜５０、３〜５、５〜１０、５〜１５または１０〜３０アミノ酸長である。そのような融合タンパク質は、選択的に、当業者に公知の組換え遺伝子操作法によって作製され得る。
【００７１】
開示されるＡ１９インスリン類似体は、インスリンペプチドに関してこれまでに記述されている任意の使用に適すると考えられる。従って、本明細書で述べるＡ１９インスリン類似体は、高血糖症を治療するため、または高い血糖値から生じる他の代謝性疾患を治療するために使用できる。従って、本発明は、高血糖値に有する患者を治療する際に使用するための、本開示のＡ１９インスリン類似体および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を包含する。１つの実施形態によれば、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を使用して治療される患者は家畜であり、もう１つの実施形態では、治療される患者はヒトである。
【００７２】
本開示に従って高血糖症を治療する１つの方法は、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内などの非経口経路、髄腔内、経皮、経直腸、経口、経鼻または吸入によるものを含む、任意の標準的な投与経路を用いて本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を患者に投与する工程を含む。１つの実施形態では、組成物は皮下的にまたは筋肉内に投与される。１つの実施形態では、組成物は非経口的に投与され、Ａ１９インスリン類似体は注射器中に予備充填される。
【００７３】
本発明のＡ１９インスリン類似体は、単独でまたは他の抗糖尿病薬と組み合わせて投与され得る。当技術分野で公知のまたは試験中の抗糖尿病薬は、天然インスリン、天然グルカゴンおよびそれらの機能的誘導体、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）もしくはグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）などのスルホニル尿素、；レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）もしくはナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）などのメグリチニド；メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）もしくはフェンホルミンなどのビグアナイド薬；ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）もしくはトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）などのチアゾリジンジオン、または他のＰＰＡＲγ阻害剤；ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）などの、炭水化物消化を阻害するαグルコシダーゼ阻害剤；エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）もしくはプラムリンチド；ビルダグリプチンもしくはシタグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）阻害剤；またはＦＢＰアーゼ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害剤を含む。
【００７４】
本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を含有する医薬組成物は、標準的な医薬的に許容される担体を使用して製剤化され、当業者に公知の投与経路によって患者に投与される。従って、本開示はまた、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体の１またはそれ以上、またはその医薬的に許容される塩を、医薬的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物を包含する。１つの実施形態では、医薬組成物は、リン酸緩衝系中ｐＨ約４．０〜約７．０ので１ｍｇ／ｍｌ濃度のＡ１９インスリン類似体を含有する。医薬組成物はＡ１９インスリン類似体を唯一の医薬的活性成分として含有してもよく、またはＡ１９インスリン類似体を１もしくはそれ以上の付加的な活性物質と組み合わせることができる。１つの実施形態によれば、好ましくは無菌で、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルの、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体の１つ、および医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬組成物が提供される。そのような組成物は、生じる活性ペプチドが少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で存在する、Ａ１９インスリン類似体を含有し得る。１つの実施形態では、医薬組成物は、滅菌され、場合により様々な容器内で保存される水溶液を含む。
【００７５】
本発明の化合物を１つの実施形態に従って使用して、注射用のあらかじめ製剤された溶液を調製することができる。他の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物は、組成物を患者に投与するための使い捨て装置を含むキットの一部としてさらに包装され得る。容器またはキットは、周囲室温または冷蔵温度での保存に関してラベル表示され得る。
【００７６】
本明細書で述べるすべての治療方法、医薬組成物、キットおよび他の同様の実施形態は、Ａ１９インスリン類似体がすべての医薬的に許容されるその塩を含むことを企図する。
【００７７】
１つの実施形態では、キットは、Ａ１９インスリン類似体組成物を患者に投与するための装置と共に提供される。キットは、様々な容器、たとえばバイアル、チューブ、ビン等をさらに含み得る。好ましくは、キットは使用のための指示書も含む。１つの実施形態によれば、キットの装置は、組成物がエアロゾル装置内に前充填されたエアロゾル投与装置である。もう１つの実施形態では、キットは注射器と針を含み、１つの実施形態では、インスリン類似体組成物は注射器内に前充填される。
【００７８】
本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術、またはペプチドおよび融合タンパク質を調製する任意の他の方法によって調製され得る。特定の非天然アミノ酸は標準的な組換えＤＮＡ技術によって発現することができないが、それらの調製のための技術は当技術分野において公知である。非ペプチド部分を含有する本発明の化合物は、該当する場合は標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によって合成され得る。
【実施例】
【００７９】
[実施例１]
＝＝インスリンＡおよびＢ鎖の合成＝＝
インスリンＡおよびＢ鎖を、Ｂｏｃ化学を用いて４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂または４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上で合成した。９５：５のＨＦ／ｐ−クレゾールを使用して０℃で１時間、ペプチドを樹脂から切断した。ＨＦの除去およびエーテル沈殿後、ペプチドを５０％酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。あるいは、Ｆｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成した。これらのペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）を使用して室温で２時間インキュベートし、樹脂から切断した。過剰量のジエチルエーテルを添加してペプチドを沈殿させ、ペレットを酸性緩衝水溶液に可溶化した。ペプチドの品質をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、質量分析（ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩ）によって確認した。
【００８０】
インスリンＡ鎖を、７位のアミノ酸の単一遊離システインを用いて合成し、他のすべてのシステインをアセトアミドメチルＡ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）６、１１、２０として保護した。インスリンＢ鎖を、７位の単一遊離システインを用いて合成し、その他のシステインをアセトアミドメチルＢ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）１９として保護した。粗ペプチドを従来のＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００８１】
合成したＡ鎖とＢ鎖を、図１に概略を示す一般手順に従ってそれらの天然ジスルフィド結合を介して互いに連結した。それぞれのＢ鎖を、ＤＭＦまたはＤＭＳＯに溶解することによってＣｙｓ７−Ｎｐｙｓ誘導体へと活性化し、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（Ｎｐｙｓ）と１：１のモル比で室温にて反応させた。活性化をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、生成物をＥＳＩ−ＭＳによって確認した。
【００８２】
それぞれのＡ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）６、１１、２０およびＢ−（Ｎｙｐｓ）７（Ａｃｍ）１９を１：１のモル比で１０ｍｇ／ｍｌの総ペプチド濃度に溶解することによって第一Ｂ７−Ａ７ジスルフィド結合を形成した。鎖の結合反応が完了したとき、混合物を５０％酢酸水溶液の濃度に希釈した。最後の２つのジスルフィド結合は、ヨウ素の添加を介して同時に形成した。４０倍モル過剰のヨウ素を溶液に添加し、混合物を室温でさらに１時間撹拌した。アスコルビン酸水溶液を添加して反応を終了させた。混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、最終化合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって確認した。図２および表１のデータに示すように、この手順に従って調製した合成インスリンは、インスリン受容体結合に関して精製インスリンに良好に匹敵する。
【００８３】
修飾アミノ酸（Ａ１９位の４−アミノフェニルアラニンなど）を含むインスリンペプチドも、たとえば米国特許第７，０４５，３３７号および同第７，０８３，９７０号において教示される系を含む、非コードアミノ酸のタンパク質への組込みを可能にする系を用いてインビボで合成することができる。
表１：天然インスリンと比較した合成インスリンの活性
【００８４】
[実施例２]
＝＝還元的アルキル化によるアミン基（Ｎ末端およびリシン）のペグ化＝＝
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−アルデヒドおよびＮａＢＨ３ＣＮを１：２：３０のモル比でｐＨ４．１〜４．４の酢酸緩衝液に溶解した。反応溶液は、０．１Ｎ ＮａＣｌ、０．２Ｎ酢酸および０．１Ｎ Ｎａ２ＣＯ３から成る。インスリンペプチド濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応は室温で６時間にわたって行った。反応完了の程度をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、反応の収率は約５０％であった。
【００８５】
ｂ．精製
反応混合物を０．１％ＴＦＡで２〜５倍に希釈し、準備ておいたＲＰ−ＨＰＬＣカラムに供した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａ緩衝液、水中１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂ緩衝液、ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ；Ｂの直線勾配（％）が０〜４０％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体は約３５％のＢ緩衝液で溶出した。加硫分解またはトリプシン分解を介した化学修飾後、所望化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認した。
【００８６】
＝＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアシル化によるアミン基（Ｎ末端およびリシン）のペグ化＝＝
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）をｍＰＥＧ２０ｋ−ＮＨＳと共に０．１Ｎビシン緩衝液（ｐＨ８．０）に１：１のモル比で溶解した。インスリンペプチド濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした。反応の収率は、室温で２時間後に約９０％であった。
【００８７】
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍に希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａ緩衝液、水中１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂ緩衝液、ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ；Ｂの直線勾配（％）が０〜４０％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体を約３５％Ｂで収集した。加硫分解またはトリプシン分解を介した化学修飾後、所望化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認した。
【００８８】
＝＝フェニルアラニンの芳香環上のアセチル基の還元的アミノペグ化＝＝
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−ヒドラジドおよびＮａＢＨ３ＣＮを１：２：２０のモル比で酢酸緩衝液（ｐＨ４．１〜４．４）に溶解した。反応溶液は、０．１Ｎ ＮａＣｌ、０．２Ｎ酢酸および０．１Ｎ Ｎａ２ＣＯ３から成る。インスリンまたはインスリン類似体濃度は、室温で２４時間、約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応の経過をＨＰＬＣによってモニターした。反応の変換率は約５０％であった（ＨＰＬＣによって算定した）。
【００８９】
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍に希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａ緩衝液、水中１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂ緩衝液、ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ；Ｂ直線勾配（％）が０〜４０％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたはＰＥＧ−インスリン類似体を約３５％Ｂで収集した。加硫分解またはトリプシン分解を介した化学修飾後、所望化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認した。
【００９０】
[実施例３]
＝＝インスリン受容体結合アッセイ＝＝
インスリンまたはＩＧＦ−１受容体に対する各々のペプチドの親和性を、シンチレーション近接技術を利用した競合結合アッセイにおいて測定した。ペプチドの連続３倍希釈をＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）中で作製し、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）において０．０５ｎＭ（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）Ａ ＴｙｒＡ１４インスリンまたは（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）ＩＧＦ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と混合した。ヒトインスリンまたはＩＧＦ−１受容体を過剰発現する細胞から調製した形質膜フラグメントの１〜６μｇを各ウエルに分注し、０．２５ｍｇ／ウエルのポリエチレンイミン処理コムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を添加した。８００ｒｐｍで５分間振とうした後、プレートを室温で１２時間インキュベートし、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ１４５０液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）で放射能を測定した。非特異的結合（ＮＳＢ）の放射能を、試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「非放射性（コールド）」天然リガンドを含むウエルで測定した。競合物質を含まないウエルで総結合放射能を検出した。特異的結合のパーセントを以下のように計算した：特異的結合％＝（結合−ＮＳＢ／総結合−ＮＳＢ）×１００。ＩＣ５０値は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて決定した。
【００９１】
[実施例４]
＝＝インスリン受容体リン酸化アッセイ＝＝
インスリンまたはインスリン類似体の受容体リン酸化を測定するため、受容体をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を９６穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３５９６，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に播種し、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．２５％ウシ増殖血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３０５４１，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２および９０％湿度で１６〜２０時間培養した。インスリンまたはインスリン類似体の連続希釈を、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏ．１００３５０，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加したＤＭＥＭ中で調製し、接着した細胞を含むウエルに添加した。５％ＣＯ２の加湿条件下で３７℃で１５分間インキュベートした後、細胞を５％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定し、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４で２回洗浄して、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。次にプレートを３回洗浄し、製造者の推奨に従って２％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ中で再構成したホスホチロシンに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏ．１６−１０５，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）で満たした。室温で３時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ ｓｉｎｇｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．００−２０２３，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ）０．１ｍｌを各々のウエルに添加した。１Ｎ ＨＣｌ ０．０５ｍｌを添加することによって５分後に発色を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をＴｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ３４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で測定した。吸光度に対するペプチド濃度用量反応曲線をプロットし、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてＥＣ５０値を決定した。
【００９２】
[実施例５]
Ａ１９のインスリンの特定類似体を合成し、インスリン受容体におけるそれらの活性に関して特徴づけた。２つの活性の高い構造類似体がＡ１９で同定されたが、２番目の活性部位の芳香族残基（Ｂ２４）での同程度の構造変化により、同様の完全な活性のインスリン類似体は同定されなかった。表２および３は、インスリン受容体における完全な活性のために、Ａ１９位が高度に構造保存されていることを例示する。表２は、Ａ１９に修飾を有する２つのインスリン類似体だけが天然インスリンと同様の受容体結合活性を有することを明らかにする。４−アミノフェニルアラニンインスリン類似体に関して、３つの別々の実験からのデータを提示する。「活性（本試験）」と表示された欄は、同時に実施された２つの別々の実験における、天然インスリンに比較したインスリン類似体の結合パーセントを比較する。「活性（０．６０ｎＭ）」と表示された欄は、このアッセイを用いてインスリン結合に関して得られた過去平均値と比較したインスリン類似体の相対的結合パーセントである。どちらの分析においても、２つのＡ１９インスリン類似体（４−アミノフェニルアラニンおよび４−メトキシフェニルアラニン）は天然インスリンにおおよそ等しい受容体結合を示す。図３は、インスリン受容体への天然インスリンとＡ１９インスリン類似体のそれぞれの特異的結合を示すグラフである。表３は、天然インスリンと等しい結合活性を示す２つのＡ１９インスリン類似体（４−アミノおよび４−メトキシ）が、同時にインスリン受容体における等しいリン酸化活性も示すことを説明するデータを提示する。
表２：Ａ１９インスリン類似体のインスリン受容体結合活性
表３：Ａ１９インスリン類似体のインスリン受容体リン酸化活性
【背景技術】
【０００１】
インスリンは驚異的なペプチドホルモンである。インスリンは、実質的にすべての形態の糖尿病においてグルコースを低下させる比類なき能力を示す。残念ながら、その薬理作用はグルコース感受性ではなく、それ自体、過剰に作用して、生命を脅かす低血糖症をもたらすことがある。一貫性のない薬理作用がインスリン療法の顕著な特徴であるので、低血糖症の発生を伴わずに血糖を正常化することは極めて困難である。さらに、天然インスリンは作用期間が短く、基礎グルコースの管理における使用に適するようにするためには改変が必要である。インスリン療法における１つの中心的な目標は、１日１回型の作用時間を提供できるインスリン製剤を設計することである。インスリン投薬の作用時間を延長することは、注射部位でのインスリンの溶解度を低下させることによって達成できる。
【０００２】
溶解度を低下させるための３つの立証された異なる分子手法があり、それらは：（１）亜鉛との不溶性懸濁液としてのインスリンの製剤、（２）カチオン性アミノ酸の添加を介してその等電点を生理的ｐＨに上昇させること、（３）溶解度を低下させ、アルブミンに結合する疎水性リガンドを提供する共有結合修飾、を含む。これらの手法はすべて、注射部位での沈殿、およびその後の再可溶化と活性ホルモンとしての血液への輸送に伴って起こる固有の変動性によって制限される。
【０００３】
プロドラッグ化学は、投与部位からのクリアランスおよび高度に定義された濃度での血漿中の平衡後のインスリン作用の開始と期間を正確に制御する選択的機構を提供する。現在の長時間作用性インスリン類似体および製剤と比べてそのような手法の主要な利点は、インスリンの貯蔵所が、注射が行われる皮下脂肪組織ではなく血液画分であることである。これは、沈殿および可溶化の変動性を取り除く。これはまた、皮下注射以外の経路によるペプチドホルモンの投与を可能にする。有効なプロドラッグ−ホルモンを確立するために、プロドラッグ構造エレメントの可逆的な結合のための基礎を形成することができる活性部位の構造アドレス（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｄｄｒｅｓｓ）が必要である。構造アドレスは２つの鍵となる特徴を提供する必要がある：（１）選択的化学修飾のための潜在能、および（２）プロドラッグ構造エレメントの除去時に天然形態で完全な活性を提供する能力である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
インスリンは、低い効力の一本鎖プロインスリン前駆体から酵素プロセシングを介する生合成によって誘導される二本鎖ヘテロ二量体である。ヒトインスリンは、ジスルフィド結合によって共に結合された、合計５１個のアミノ酸を有する２本のペプチド鎖（「Ａ鎖」（配列番号１）と「Ｂ鎖」（配列番号２））から成る。Ｂ鎖のＣ末端領域とＡ鎖の２つの末端は三次元構造において会合し、インスリン受容体への高親和性結合のための部位を構築する。天然インスリン構造は、アミド結合したプロドラッグエレメントの選択的構築のために使用され得る、活性部位残基における限られた独自の化学エレメントを有する。プロドラッグエレメントの結合のためのエレメントを提供するように修飾できる２つの部位は、天然Ａ鎖の１９位のチロシン残基（「Ａ１９チロシン」）および天然Ｂ鎖の２４位のフェニルアラニン残基（「Ｂ２４フェニルアラニン」）を含む。これら２つのアミノ酸はどちらも、インスリン作用における中心的な重要性を有する。しかし、導入することができ、それでもなお完全な効力を維持することができる構造変化の種類に関しては、これら２つのアミノ酸はまた、極めて限定的であることが証明されている。
【０００５】
本明細書で開示するように、出願人は、Ａ１９位で修飾された、インスリンプロドラッグ誘導体を構築するために潜在的に使用できる完全な効力のインスリン類似体を発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの実施形態によれば、１個のアミノ基が、効力の喪失を伴わずにインスリンの活性部位内のペプチドに挿入された、完全な効力のインスリン類似体が提供される。より詳細には、Ａ鎖の１９位の天然チロシンに代わる４−アミノフェニルアラニンのアミノ酸部分の選択的挿入を、インスリンペプチドの効力の喪失を伴わずに受け入れることができる。特定のジペプチドによるこの活性部位アミノ基のその後の化学的アミド化は、活性を著しく低下させ、適切なプロドラッグとして働く。
【０００７】
１つの実施形態によれば、インスリンペプチドのＡ鎖が配列：
ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）
を含み、Ｂ鎖が配列：
Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）
を含むインスリン類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化１】
［式中、Ｒ４は、−ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
さらなる実施形態では、Ｂ鎖は、配列Ｘ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）
を含む。
［配列中、
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される］
【０００８】
１つの実施形態によれば、インスリンペプチドのＡ鎖が、配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＮ（配列番号６）を含み、Ｂ鎖が、ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号７）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）およびＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）から成る群より選択される配列を含む、インスリン類似体が提供される。
［配列中、Ｘ２は、一般式：
【化２】
のアミノ酸である］
【０００９】
１つの実施形態によれば、一本鎖Ａ１９インスリン類似体が提供される。この実施形態では、ヒトインスリンＢ鎖のカルボキシ末端またはその機能的類似体は、本開示のＡ１９ Ａ鎖類似体のＮ末端に共有結合で連結されている。１つの実施形態では、Ｂ鎖は、４〜１２または４〜８アミノ酸のペプチドリンカーを介してＡ鎖に連結されている。
【００１０】
もう１つの実施形態では、ペプチドに親水性部分を共有結合させることによってインスリン類似体の溶解度を高める。１つの実施形態では、親水性部分は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸または配列番号９の２８位のアミノ酸または配列番号８の２９位のアミノ酸のいずれかに連結される。１つの実施形態では、親水性部分は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。もう１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００１１】
アシル化またはアルキル化は、循環中のインスリンペプチドの半減期を高めることができる。アシル化またはアルキル化は、好都合にも、インスリン受容体における作用の開始を遅延させる、および／または作用の期間を延長させることができる。インスリン類似体は、親水性部分が連結されている同じアミノ酸位置でまたは異なるアミノ酸位置でアシル化またはアルキル化し得る。
【００１２】
１つの実施形態によれば、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルの、本明細書で開示される新規Ａ１９インスリン類似体のいずれか、および医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を含有し得る。１つの実施形態では、医薬組成物は、滅菌され、場合により様々な包装容器内に納められて貯蔵される水溶液を含む。他の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物は、組成物を患者に投与するための使い捨て装置を含むキットの一部としてさらに包装され得る。容器またはキットは、周囲室温または冷蔵温度での保存に関してラベル表示され得る。
【００１３】
１つの実施形態によれば、インスリン依存患者における血糖値を調節する改善された方法が提供される。その方法は、本開示のＡ１９インスリン類似体を糖尿病の管理のために治療上有効な量で投与する工程を含む。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、約５，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するＰＥＧ鎖でペグ化される。
【００１４】
＝＝関連出願の相互参照＝＝
本出願は、その開示が全体として参照により明白に本明細書に組み込まれる、２００８年１２月１９日出願の米国特許出願第６１／１３９，２２１号の優先権を主張する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヒトインスリンを調製するための２段階合成法の概略図である。手順の詳細は実施例１で述べられており、工程ａの試薬は２，２’ジチオビス（５−ニトロピリジン）、室温のＤＭＳＯを含み、工程ｂの試薬はインスリンＡ（６、１１および２０位のＡｃｍならびに７位のＳＨ）、室温のＤＭＳＯを含み、工程ｃの試薬はＩ２、８０％ＡｃＯＨを含む。
【図２】図２は、精製天然インスリンと合成ヒトインスリンのインスリン受容体への特異的結合を比較するグラフである。結果が示すように、２つの分子は同様の結合活性を有する。
【図３】図３は、天然インスリンとＡ１９インスリン類似体（インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）１９）の相対的インスリン受容体結合を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本発明を説明し、特許請求する際に、以下の用語を以下で述べる定義に従って使用する。
【００１７】
本明細書で使用される、「プロドラッグ」という用語は、化学修飾を受けた後にその薬理学的作用を示す任意の化合物と定義される。
【００１８】
「生物活性ポリペプチド」は、インビトロおよび／またはインビボで生物学的作用を及ぼすことができるポリペプチドを指す。
【００１９】
その立体化学を明記していないアミノ酸の指定は、アミノ酸のＬもしくはＤ形態またはラセミ混合物を包含することが意図されている。
【００２０】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型または油中水型乳剤のような乳剤、および様々なタイプの湿潤剤などの、標準的な医薬担体の任意のものを含む。この用語はまた、米国連邦政府の規制当局によって承認されたまたはヒトを含む動物における使用のために米国薬局方にリストされている物質の任意のものを包含する。
【００２１】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される塩」という用語は、親化合物の生物活性を保持し、生物学的にまたは他の理由から望ましくないものではない化合物の塩を指す。本明細書で開示される化合物の多くは、アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれらに類似の基の存在によって酸性および／または塩基性塩を形成することができる。
【００２２】
医薬的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩は、ほんの一例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩を含む。有機塩基から誘導される塩は、第一級、第二級および第三級アミンの塩を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
医薬的に許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製され得る。無機酸から誘導される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等を含む。有機酸から誘導される塩は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等を含む。
【００２４】
本明細書で使用される、「治療すること」という用語は、特定の障害もしくは疾患の予防、特定の障害もしくは疾患に関連する症状の緩和、および／または前記症状を予防するもしくは除去することを含む。たとえば、本明細書で使用される「糖尿病を治療すること」という用語は、一般に血糖値を正常値近くに維持することを指し、所与の状況に依存して血糖値を上昇させるまたは低下させることを含み得る。
【００２５】
本明細書で使用される、インスリン類似体の「有効」量または「治療有効量」は、非毒性であるが所望効果を与えるのに十分なインスリン類似体の量を指す。たとえば、１つの所望効果は、低血糖症の予防または治療である。「有効」な量は、個体の年齢および全般的健康状態、投与方法等に依存して、被験者によって異なる。従って、正確な「有効量」を特定することは必ずしも可能ではない。しかし、任意の個別症例における適切な「有効」量は、常套的な実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００２６】
「非経口的」という用語は、消化管を通さず、鼻内、吸入、皮下、筋肉内、髄腔内または静脈内などの何らかの他の経路によることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「インスリンペプチド」という用語は、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖を含む５１アミノ酸のヘテロ二量体、ならびにその一本鎖インスリン類似体（たとえば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９６／３４８８２号および米国特許第６，６３０，３４８号に開示されているものを含む）を表す一般用語であり、Ａ１９、Ｂ１６もしくはＢ２５位のアミノ酸の４−アミノフェニルアラニンへの改変、またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位から選択される位置の１もしくはそれ以上のアミノ酸置換、またはＢ１〜４位およびＢ２６〜３０位のいずれかまたは全部の欠失を含む、天然Ａ鎖および／またはＢ鎖の修飾された誘導体を含むヘテロ二量体および一本鎖類似体を包含する。
【００２８】
本明細書で使用される、「一本鎖インスリン類似体」という用語は、インスリンのＡ鎖とＢ鎖がポリペプチドリンカーによって共有結合で連結されている、構造的に関連するタンパク質の群を包含する。
【００２９】
本明細書で使用される「Ａ１９ Ａ鎖類似体」は、配列番号６のＡ鎖を含むアミノ酸およびＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１から選択される位置に１またはそれ以上のアミノ酸置換を含む配列番号６の修飾された誘導体を表す。
【００３０】
「Ａ１９インスリン類似体」は、天然インスリンのＡ鎖の１９位の天然チロシン残基の４−アミノフェニルアラニンまたは４−メトキシフェニルアラニンによる置換を有するインスリンペプチドである。
【００３１】
本明細書で使用されるアミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、またはアミノ酸への化学基の付加および／もしくはアミノ酸からの化学基の除去によるアミノ酸の誘導体化を指し、ヒトタンパク質中で一般的に認められる２０個のアミノ酸、ならびに異型または非天然のアミノ酸のいずれかによる置換を含む。異型アミノ酸の商業的入手源は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、およびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む。異型アミノ酸は、商業的供給者から購入し得るか、新たに合成し得る、または天然アミノ酸から化学修飾もしくは誘導体化し得る。
【００３２】
本明細書で使用されるアミノ酸「置換」は、あるアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置換を指す。本出願全体を通して、文字と番号による特定アミノ酸位置（たとえばＡ５位）のすべての参照は、それぞれの天然ヒトインスリンＡ鎖（配列番号１）またはＢ鎖（配列番号２）におけるＡ鎖のその位置（たとえばＡ５位）またはＢ鎖のその位置（たとえばＢ５位）のアミノ酸、またはその任意の類似体における対応するアミノ酸位置を指す。たとえば、いかなるさらなる精緻化も伴わない「Ｂ２８位」への本明細書での参照は、配列番号２の第一アミノ酸が欠失しているインスリン類似体のＢ鎖の対応する位置、Ｂ２７を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書では以下の５つの群の１つの中での交換と定義される：
Ｉ．小型の脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の正に荷電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型の脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
【００３４】
本明細書で使用される「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」という一般的用語は、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎは少なくとも９である］によって表される、分枝または直鎖状の、エチレンオキシドと水の縮合重合体の混合物を指す。いかなるさらなる特徴づけも伴わずに、この用語は、５００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールの重合体を含むことが意図されている。「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」は、そのおおよその平均分子量を示す数字接尾語と組み合わせて使用される。たとえば、ＰＥＧ−５，０００は、約５，０００ダルトンの総分子量平均を有するポリエチレングリコール鎖を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「ペグ化」という用語および同様の用語は、化合物にポリエチレングリコール鎖を連結することによってその天然の状態から改変された化合物を指す。「ペグ化ポリペプチド」は、ポリペプチドに共有結合されたＰＥＧ鎖を有するポリペプチドである。
【００３６】
本明細書で使用される「リンカー」は、２つの別個の実体を互いに結合する結合、分子または分子の群である。リンカーは、２つの実体の最適の間隔を提供し得るかまたは２つの実体が互いから分離されることを可能にする不安定結合をさらに供給し得る。不安定結合は、光開裂性基、酸不安定部分、塩基不安定部分および酵素開裂性基を含む。
【００３７】
本明細書で使用される「二量体」は、リンカーによって互いに共有結合された２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、いかなる限定語も伴わずに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は２つの同一サブユニットを含み、ヘテロ二量体は異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは実質的に互いに類似する。
【００３８】
本明細書で使用される、ｎが１〜６である「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」という用語は、１から特定数の炭素原子を有する分枝または直鎖状アルキル基を表す。典型的なＣ１〜Ｃ６アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用されるｎが２〜６である「Ｃ２〜Ｃｎアルケニル」という用語は、２から特定数の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を有するオレフィン性不飽和分枝または直鎖状基を表す。そのような基の例として、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル、ペンテニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
ｎが２〜６である「Ｃ２〜Ｃｎアルキニル」という用語は、２からｎ個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を有する不飽和分枝または直鎖状基を指す。そのような基の例として、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル等を含むがこれらに限定されない、１または２個の芳香環を有する単環式または二環式炭素環系を指す。アリール環の大きさおよび置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指定することによって示される。たとえば、（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）という用語は、１〜３員アルキル鎖によって親部分に結合された５〜１０員アリールを指す。
【００４２】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、１または２個の芳香環を含み、芳香環中に少なくとも１個の窒素、酸素または硫黄原子を含む単環式または二環式環系を指す。ヘテロアリール環の大きさおよび置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指定することによって指示される。たとえば、（Ｃ１〜Ｃｎアルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）という用語は、１〜「ｎ」員アルキル鎖によって親部分に結合された５または６員ヘテロアリールを指す。
【００４３】
本明細書で使用される、さらなる指定を伴わない「患者」という用語は、任意の家畜化された温血脊椎動物（たとえば、家畜、ウマ、ネコ、イヌおよび他のペット動物を含むが、これらに限定されない）ならびにヒトを包含することが意図されている。
【００４４】
本開示は、天然インスリンと比較してインスリン受容体および／またはＩＧＦ−１受容体における高い活性を保持するインスリン類似体を対象とする。１つの実施形態では、インスリン類似体は天然インスリンのＡ鎖の１９位に存在するチロシン残基の修飾を含み、前記類似体は天然インスリンの活性を保持する。そのような類似体を本明細書では「Ａ１９インスリン類似体」と称する。Ａ１９インスリン類似体は、天然インスリンペプチドと比較して付加的な修飾を含んでもよく、このインスリン類似体は、天然インスリンと比較してインスリン受容体において７０％、８０％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上の活性を示す。
【００４５】
１つの実施形態では、アミノ基が、効力の喪失を伴わずにインスリンの活性部位内のペプチドに挿入されたインスリン誘導体が調製される。より詳細には、Ａ鎖の１９位の天然チロシンの４−アミノフェニルアミノ酸部分による選択的置換を、インスリンペプチドの効力の喪失を伴わずに受け入れることができる。プロドラッグ部分によるこの活性部位アミノ基のその後の化学的アミド化は、活性を著しく低下させ、従ってインスリンの適切なプロドラッグを提供する。
【００４６】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に、天然インスリンと比較して、１またはそれ以上の付加的なアミノ酸置換を含み、１つの実施形態では、それらのアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。インスリンの所望活性に有害な影響を及ぼさないこれらの位置における適切なアミノ酸置換は、たとえば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００７；８８（５）：６８７−７１３に示されているように、当業者に公知である。
【００４７】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、天然チロシン残基の芳香環上に存在するヒドロキシル基のアミノ基またはメトキシ基による置換を含み、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、または１〜３アミノ酸置換をさらに含む。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に１〜１０、１〜８、１〜５、または１〜３アミノ酸置換を含み、この類似体は、天然インスリン配列と比較して、天然インスリンＢペプチドのＢ１〜４位およびＢ２６〜３０位のアミノ酸の１またはそれ以上の欠失によってさらに修飾されている。もう１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置に１〜８、１〜５、または１〜３アミノ酸置換を含み、天然インスリン配列と比較して、アミノ酸Ｂ１〜４および／またはＢ２６〜３０の欠失によってさらに修飾されている。
【００４８】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、天然チロシン残基の芳香環上に存在するヒドロキシル基のアミノ基またはメトキシ基による置換を含み、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンから成る群より選択されるアミノ酸によるＡ８位のアミノ酸置換（天然インスリンペプチドと比較して）をさらに含む。さらなる実施形態では、Ｂ１０位のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択されるアミノ酸である。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、天然チロシン残基の芳香環上に存在するヒドロキシル基のアミノ基またはメトキシ基による置換を含み、天然インスリンペプチドと比較して、Ａ８およびＢ２８〜３０から成る群より選択される位置のアミノ酸置換をさらに含む。
【００４９】
１つの実施形態によれば、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）を含有するＡ鎖ポリペプチド鎖を含むインスリン類似体またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８位から選択される、１〜９、１〜５もしくは１〜３アミノ酸修飾によって配列番号３と異なる配列を含有するその類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化３】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２もしくはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；そして
Ｘ３は、アスパラギン、グリシンもしくはアラニンである］
１つの実施形態では、Ｒ４は、ＮＨ２である。別の実施形態では、Ｘ１は、トレオニンであり、Ｘ３は、アスパラギンであり、Ｒ４は、ＮＨ２である。
【００５０】
より詳細には、１つの実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびにＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）の配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体、または配列番号３および／もしくは配列番号４が、独立して、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位から選択される１〜３アミノ酸修飾によってそれぞれの配列番号３および／もしくは配列番号４配列と異なるその類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化４】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２もしくはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンもしくはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
【００５１】
もう１つの実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびにＸ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）の配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニン、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化５】
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される］
１つの実施形態では、Ｂ鎖配列は、配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号７）を含み、さらなる実施形態では、Ｂ鎖は、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）およびＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１０）から成る群より選択される。さらなる実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびに配列番号７、配列番号８および配列番号９から成る群より選択される配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体が提供される。
［配列中、Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され、Ｘ２は、一般式
【化６】
のアミノ酸であり、そしてＸ３はアスパラギンであり、１つの実施形態では、Ｘ１はトレオニンであり、Ｘ２は４−アミノフェニルアラニンであり、そしてＸ３はアスパラギンである]
【００５２】
１つの実施形態では、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）のＡ鎖配列ならびにＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）またはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）の配列を含有するＢ鎖配列を含むＡ１９インスリン類似体が提供される。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化７】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；そして
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンである］
さらなる実施形態では、Ｒ４はＮＨ２であり、そしてＸ３はアスパラギンであり、また１つの実施形態では、Ｒ４はＮＨ２であり、Ｘ１はトレオニンであり、そしてＸ３はアスパラギンである。
【００５３】
１つの実施形態によれば、Ａ１９アミノ酸が、一般式
【化８】
のアミノ酸で置換されている一本鎖インスリン類似体が提供される。
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
１つの実施形態によれば、一本鎖インスリン類似体は、式：Ｂ−Ｐ−Ａ１９の化合物を含む［式中、Ｂは、インスリンのＢ鎖またはその機能的類似体を表し、Ａ１９は、本明細書で開示されるＡ１９ Ａ鎖類似体を表し、そしてＰは、Ａ鎖のアミノ末端をＢ鎖のカルボキシ末端に共有結合で連結する、ペプチドリンカーを含むリンカーを表す］。１つの実施形態では、リンカーは、約５〜約１８、または約１０〜約１４、または約４〜約８、または約６アミノ酸のペプチドリンカーである。
【００５４】
１つの実施形態では、一本鎖インスリン類似体は、式：Ｂ−Ｐ−Ａ１９の化合物を含む。
［式中、
Ｂは、Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）の配列を含有するＢ鎖配列を表し；
Ａ１９は、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）の配列を含有するＡ鎖配列を表し；そして
Ｐは、４〜８アミノ酸のペプチドリンカーを表し、さらに配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式
【化９】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
１つの実施形態によれば、ペプチドリンカーは、５〜１８アミノ酸長であり、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号１２）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２１）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ （配列番号１５）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１８）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１９）およびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２０）から成る群より選択される配列を含む。
【００５５】
１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＡＧＲＧＳＧＫ（配列番号２４）、ＡＧＬＧＳＧＫ（配列番号２５）、ＡＧＭＧＳＧＫ（配列番号２６）、ＡＳＷＧＳＧＫ（配列番号２７）、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＴＧＬＧＲＧＫ（配列番号２９）、ＴＧＬＧＳＧＫ（配列番号３０）、ＨＧＬＹＳＧＫ（配列番号３１）、ＫＧＬＧＳＧＱ（配列番号３２）、ＶＧＬＭＳＧＫ（配列番号３３）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＹＳＧＫ（配列番号３５）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号３７）、ＶＷＳＳＳＧＫ（配列番号３８）、ＶＧＳＳＳＧＫ（配列番号３９）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号４０）、ＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号４１）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４２）、ＫＧＬＳＳＧＱ（配列番号４３）、ＶＫＬＳＳＧＱ（配列番号４４）、ＶＧＬＫＳＧＱ（配列番号４５）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４６）およびＶＧＬＳＫＧＱ（配列番号４７）から成る群より選択される配列を含む。１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、７〜１２アミノ酸長であり、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１）またはＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号１２）を含む。
【００５６】
１つの実施形態では、一本鎖インスリン類似体は、アミノ酸配列：
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号２３）を有する。
［配列中、Ｘａａは、一般式
【化１０】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸である］
【００５７】
本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、ペプチドの腎クリアランスを防ぐことによってペプチドの有効期間を延長させつつ、生理的ｐＨの水溶液へのペプチドの溶解度を改善するようにさらに修飾することができる。ペプチドは、血漿タンパク質と比較した場合それらの比較的小さな分子サイズのために容易に除去される。ペプチドの分子量を４０ｋＤａ超に増大させると、腎閾値を上回り、血漿中の持続期間を有意に延長させる。従って、１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、共有結合で連結された親水性部分を含むようにさらに修飾される。１つの実施形態では、親水性部分は、血漿タンパク質、ポリエチレン鎖または免疫グロブリンのＦｃ部分である。それ故、１つの実施形態では、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、アミノ酸の側鎖に共有結合で連結された１またはそれ以上の親水性基を含むようにさらに修飾される。
【００５８】
１つの実施形態によれば、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸または、たとえば配列番号９の２８位もしくは配列番号８の２９位を含む、Ｂ鎖のカルボキシ末端に位置するリシンアミノ酸の側鎖に親水性部分を連結することによって修飾される。１つの実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸の１個が、ペプチドリンカーの側鎖に親水性部分を連結することによって修飾された一本鎖インスリン類似体が提供される。１つの実施形態では、修飾アミノ酸は、システイン、リシンまたはアセチルフェニルアラニンである。１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号４１）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４２）、ＫＧＬＳＳＧＱ（配列番号４３）、ＶＫＬＳＳＧＱ（配列番号４４）、ＶＧＬＫＳＧＱ（配列番号４５）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４６）およびＶＧＬＳＫＧＱ（配列番号４７）から成る群より選択され、親水性部分（たとえばポリエチレングリコール）は、ペプチドリンカーのリシン側鎖に連結される。もう１つの実施形態では、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、Ａ１９インスリン類似体のＢ鎖のカルボキシ末端への修飾アミノ酸の付加によってさらに修飾され、Ｃ末端に付加されるアミノ酸は、そのアミノ酸に連結された親水性部分を含むように修飾される。１つの実施形態では、Ｃ末端に付加されるアミノ酸は、修飾されたシステイン、リシンまたはアセチルフェニルアラニンである。１つの実施形態では、親水性部分は、血漿タンパク質、ポリエチレンオキシド鎖および免疫グロブリンのＦｃ部分から成る群より選択される。
【００５９】
１つの実施形態では、親水性基はポリエチレンオキシド鎖であり、１つの実施形態では、２またはそれ以上のポリエチレンオキシド鎖が、Ａ１９インスリン類似体の２またはそれ以上のアミノ酸側鎖に共有結合で連結される。１つの実施形態によれば、親水性部分は、Ａ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ鎖のＣ末端またはＮ末端から成る群より選択される位置で、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体のアミノ酸側鎖に共有結合で連結される。複数のポリエチレンオキシド鎖を有するＡ１９インスリン類似体に関しては、ポリエチレンオキシド鎖は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸で、またはＢ鎖のカルボキシ末端に位置するリシンアミノ酸の側鎖に、またはペプチドのＣ末端の単一アミノ酸の付加によって結合することができ、この付加されるアミノ酸は、その側鎖に連結されたポリエチレンオキシド鎖を有する。
【００６０】
１つの実施形態によれば、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体は、アミノ酸置換によってさらに修飾され、この置換アミノ酸は、たとえばポリエチレングリコールを含む、親水性部分と架橋するのに適した側鎖を含む。１つの実施形態では、親水性部分が連結されるＡ１９インスリン類似体の位置のアミノ酸を、親水性部分を導入するまたは親水性部分の結合を容易にする天然または合成アミノ酸で置換する（またはＣ末端に付加する）。たとえば、１つの実施形態では、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置の天然アミノ酸を、ポリエチレンオキシド鎖の共有結合での連結を可能にするリシン、システインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換する（またはリシン、システインまたはアセチルフェニルアラニン残基をＣ末端に付加する）。
【００６１】
１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に付加された単一システイン残基を有するか、またはＡ１９インスリン類似体は、少なくとも１個のシステイン残基で置換されており、このシステイン残基の側鎖は、たとえばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキルおよびハロアシルを含むチオール反応性試薬でさらに修飾されている。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシルおよびエーテル基ならびにポリエチレングリコール単位などの他の親水性部分を含んでもよい。別の実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のカルボキシ末端に付加された単一リシン残基を有するか、またはＡ１９インスリン類似体はリシンで置換されており、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物等）などのアミン反応性試薬またはポリエチレングリコールなどの親水性部分のアルデヒドを使用してさらに修飾されている。
【００６２】
Ａ１９インスリン類似体がポリエチレングリコール鎖を含む実施形態では、ポリエチレン鎖は直鎖の形態であってもよく、または分枝であってもよい。１つの実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約６０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。複数のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結して、最適の溶解度および血液クリアランス特性を有するＡ１９インスリン類似体を提供することができる。１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体を、約２０，０００〜約６０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する１本のポリエチレングリコール鎖に連結する。もう１つの実施形態では、Ａ１９インスリン類似体を、２本の鎖の総平均分子量が約４０，０００〜約８０，０００ダルトンの範囲から選択される２本のポリエチレングリコール鎖に連結する。１つの実施形態では、２０，０００または６０，０００ダルトンの平均分子量を有する１本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結する。もう１つの実施形態では、１本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結し、１本のポリエチレングリコール鎖は、約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。１つの実施形態では、２本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結し、第一および第二ポリエチレングリコール鎖は各々２０，０００ダルトンの平均分子量を有する。もう１つの実施形態では、２本のポリエチレングリコール鎖をＡ１９インスリン類似体に連結し、第一および第二ポリエチレングリコール鎖は各々４０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００６３】
さらなる実施形態では、ペプチドに共有結合された２またはそれ以上のポリエチレングリコール鎖を含むＡ１９インスリン類似体が提供され、このポリエチレングリコール鎖の合計分子量は約４０，０００〜約６０，０００ダルトンである。１つの実施形態では、ペグ化Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ鎖のＮ末端および／または配列番号９の２８位もしくは配列番号８の２９位から選択される１またはそれ以上のアミノ酸に連結されたポリエチレングリコール鎖を含み、ＰＥＧ鎖の総分子量は約４０，０００〜約８０，０００ダルトンである。
【００６４】
１つの実施形態によれば、Ａ１９インスリン類似体の溶解度、安定性および／または薬物動態を改善するために血漿タンパク質がペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合で連結されたＡ１９インスリン類似体が提供される。たとえば、血清アルブミンを本明細書で提供されるＡ１９インスリン類似体に共有結合することができる。血漿タンパク質は、Ｂ鎖のＮ末端またはＡ鎖もしくはＢ鎖のＣ末端に連結することができる。１つの実施形態では、血漿タンパク質をＢ鎖のＮ末端および／または配列番号９の２８位もしくは配列番号８の２９位に対応するアミノ酸に共有結合する。
【００６５】
１つの実施形態によれば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に相当する直鎖状アミノ酸配列が、開示されるＡ１９インスリン類似体のアミノ酸側鎖に共有結合で連結されたＡ１９インスリン類似体が提供される。Ｆｃ部分の結合は、Ａ１９インスリン類似体の溶解度、安定性および／または薬物動態を改善するために行われる。Ｆｃ部分は、Ｂ鎖のＮ末端またはＡ鎖もしくはＢ鎖のＣ末端に連結することができる。たとえば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に相当するアミノ酸配列を、たとえば配列番号９の２８位または配列番号８の２９位に対応するアミノ酸への連結を含む、Ｂ鎖のＣ末端に共有結合することができる。Ｆｃ部分は、典型的にはＩｇＧから単離されたものであるが、任意の免疫グロブリンからのＦｃペプチドフラグメントが同等に機能するはずである。
【００６６】
本発明の特定態様では、Ａ１９インスリン類似体を、Ａ１９インスリン類似体のアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接アシル化によってアシル基を含むように修飾する。一部の実施形態では、Ａ１９インスリン類似体を、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して直接アシル化する。一部の実施形態では、アシル化は、Ａ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９から選択される１またはそれ以上の位置においてなされる。これに関して、アシル化Ａ１９インスリン類似体は、配列番号３のＡ鎖アミノ酸配列および配列番号５のＢ鎖、またはＡ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の少なくとも１つが側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含む任意のアミノ酸に修飾された配列番号３および／もしくは配列番号５の修飾アミノ酸配列を含み得る。一部の特定実施形態では、Ａ１９インスリン類似体の直接アシル化は、Ｂ２８またはＢ２９位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して起こる。１つのさらなる実施形態では、Ａ１９インスリン類似体は、Ｂ２８またはＢ２９位に存在するＬｙｓのε−アミノ基に結合した１〜２４個の炭素原子を有するカルボン酸のアシル基を含む。
【００６７】
１つの実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸の１つが、ペプチドリンカーのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接アシル化によってアシル基を含むように修飾されている、一般式Ｂ−Ｐ−Ａ１９の一本鎖インスリン類似体が提供される。１つの実施形態によれば、一本鎖インスリン類似体のペプチドリンカーは、ＡＧＲＧＳＧＫ（配列番号２４）、ＡＧＬＧＳＧＫ（配列番号２５）、ＡＧＭＧＳＧＫ（配列番号２６）、ＡＳＷＧＳＧＫ（配列番号２７）、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＴＧＬＧＲＧＫ（配列番号２９）、ＴＧＬＧＳＧＫ（配列番号３０）、ＨＧＬＹＳＧＫ（配列番号３１）、ＫＧＬＧＳＧＱ（配列番号３２）、ＶＧＬＭＳＧＫ（配列番号３３）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＹＳＧＫ（配列番号３５）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号３７）、ＶＷＳＳＳＧＫ（配列番号３８）、ＶＧＳＳＳＧＫ（配列番号３９）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号４０）、ＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号４１）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４２）、ＫＧＬＳＳＧＱ（配列番号４３）、ＶＫＬＳＳＧＱ（配列番号４４）、ＶＧＬＫＳＧＱ（配列番号４５）、ＴＧＬＧＫＧＱ（配列番号４６）およびＶＧＬＳＫＧＱ（配列番号４７）から成る群より選択され、Ａ鎖中、Ｂ鎖中または連結ペプチド中の少なくとも１つのリシン残基はアシル化によって化学修飾されている。１つの実施形態では、アシル化基は、１〜５、１０〜１２または１２〜２４炭素鎖を含む。
【００６８】
本開示はまた、本発明のＡ１９インスリン類似体が、場合により共有結合を介して、また場合によりリンカーを介して、コンジュゲートに連結されている他のコンジュゲートを包含する。連結は、共有化学結合、静電相互作用、水素相互作用、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、または疎水性もしくは親水性相互作用などの物理的力によって実現することができる。様々な非共有結合カップリングシステムを使用してよく、たとえばビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着パートナー、または互いに対して親和性を有する任意の結合パートナーもしくはそのフラグメントを含む。
【００６９】
本開示のＡ１９インスリン類似体は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、これらの標的アミノ酸の選択される側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、直接共有結合による連結を介してコンジュゲート部分に連結することができる。ペプチドまたはコンジュゲート部分上の反応基は、たとえばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基を含む。誘導体化剤は、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当技術分野で公知の他の物質を含む。あるいは、コンジュゲート部分は、リンカーまたは多糖もしくはポリペプチド担体などの中間担体を介して間接的にペプチドに連結することができる。多糖担体の例としてアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例として、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、および生じる負荷担体に望ましい溶解度特性を付与する、これらのアミノ酸とたとえばセリンなどの他のアミノ酸の混合ポリマーが挙げられる。
【００７０】
例示的なコンジュゲート部分は、異種ペプチドもしくはポリペプチド（たとえば血漿タンパク質を含む）、標的化剤、免疫グロブリンもしくはその部分（たとえば可変領域、ＣＤＲもしくはＦｃ領域）、放射性同位体、発蛍光団もしくは酵素標識などの診断標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、または他の治療もしくは診断物質を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本開示のＡ１９インスリン類似体および血漿タンパク質を含むコンジュゲートが提供され、血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリンおよびフィブリノーゲンから成る群より選択される。１つの実施形態では、コンジュゲートの血漿タンパク質部分はアルブミンまたはトランスフェリンである。一部の実施形態では、Ａ１９インスリン類似体はリンカーを介してコンジュゲート部分に結合され、このリンカーは、１〜約６０個の原子、または１〜３０個の原子またはそれ以上の長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子、または１０〜２０個の原子の長さの鎖を含む。一部の実施形態では、鎖の原子はすべて炭素原子である。一部の実施形態では、リンカーの骨格中の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから成る群より選択される。炭素原子およびリンカーは、より可溶性のコンジュゲートを提供するためにそれらの予想される溶解度（親水性）に従って選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、標的組織または器官または細胞中で認められる酵素または他の触媒または加水分解条件による切断に供される官能基を提供する。一部の実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の潜在的可能性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合またはペプチジル結合であり、コンジュゲートがポリペプチドである場合、コンジュゲート全体が融合タンパク質であり得る。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであってよい。例示的なリンカーは、約１〜５０アミノ酸長、５〜５０、３〜５、５〜１０、５〜１５または１０〜３０アミノ酸長である。そのような融合タンパク質は、選択的に、当業者に公知の組換え遺伝子操作法によって作製され得る。
【００７１】
開示されるＡ１９インスリン類似体は、インスリンペプチドに関してこれまでに記述されている任意の使用に適すると考えられる。従って、本明細書で述べるＡ１９インスリン類似体は、高血糖症を治療するため、または高い血糖値から生じる他の代謝性疾患を治療するために使用できる。従って、本発明は、高血糖値に有する患者を治療する際に使用するための、本開示のＡ１９インスリン類似体および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を包含する。１つの実施形態によれば、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を使用して治療される患者は家畜であり、もう１つの実施形態では、治療される患者はヒトである。
【００７２】
本開示に従って高血糖症を治療する１つの方法は、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内などの非経口経路、髄腔内、経皮、経直腸、経口、経鼻または吸入によるものを含む、任意の標準的な投与経路を用いて本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を患者に投与する工程を含む。１つの実施形態では、組成物は皮下的にまたは筋肉内に投与される。１つの実施形態では、組成物は非経口的に投与され、Ａ１９インスリン類似体は注射器中に予備充填される。
【００７３】
本発明のＡ１９インスリン類似体は、単独でまたは他の抗糖尿病薬と組み合わせて投与され得る。当技術分野で公知のまたは試験中の抗糖尿病薬は、天然インスリン、天然グルカゴンおよびそれらの機能的誘導体、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）もしくはグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）などのスルホニル尿素、；レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）もしくはナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）などのメグリチニド；メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）もしくはフェンホルミンなどのビグアナイド薬；ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）もしくはトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）などのチアゾリジンジオン、または他のＰＰＡＲγ阻害剤；ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）などの、炭水化物消化を阻害するαグルコシダーゼ阻害剤；エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）もしくはプラムリンチド；ビルダグリプチンもしくはシタグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）阻害剤；またはＦＢＰアーゼ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害剤を含む。
【００７４】
本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体を含有する医薬組成物は、標準的な医薬的に許容される担体を使用して製剤化され、当業者に公知の投与経路によって患者に投与される。従って、本開示はまた、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体の１またはそれ以上、またはその医薬的に許容される塩を、医薬的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物を包含する。１つの実施形態では、医薬組成物は、リン酸緩衝系中ｐＨ約４．０〜約７．０ので１ｍｇ／ｍｌ濃度のＡ１９インスリン類似体を含有する。医薬組成物はＡ１９インスリン類似体を唯一の医薬的活性成分として含有してもよく、またはＡ１９インスリン類似体を１もしくはそれ以上の付加的な活性物質と組み合わせることができる。１つの実施形態によれば、好ましくは無菌で、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルの、本明細書で開示されるＡ１９インスリン類似体の１つ、および医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬組成物が提供される。そのような組成物は、生じる活性ペプチドが少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で存在する、Ａ１９インスリン類似体を含有し得る。１つの実施形態では、医薬組成物は、滅菌され、場合により様々な容器内で保存される水溶液を含む。
【００７５】
本発明の化合物を１つの実施形態に従って使用して、注射用のあらかじめ製剤された溶液を調製することができる。他の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物は、組成物を患者に投与するための使い捨て装置を含むキットの一部としてさらに包装され得る。容器またはキットは、周囲室温または冷蔵温度での保存に関してラベル表示され得る。
【００７６】
本明細書で述べるすべての治療方法、医薬組成物、キットおよび他の同様の実施形態は、Ａ１９インスリン類似体がすべての医薬的に許容されるその塩を含むことを企図する。
【００７７】
１つの実施形態では、キットは、Ａ１９インスリン類似体組成物を患者に投与するための装置と共に提供される。キットは、様々な容器、たとえばバイアル、チューブ、ビン等をさらに含み得る。好ましくは、キットは使用のための指示書も含む。１つの実施形態によれば、キットの装置は、組成物がエアロゾル装置内に前充填されたエアロゾル投与装置である。もう１つの実施形態では、キットは注射器と針を含み、１つの実施形態では、インスリン類似体組成物は注射器内に前充填される。
【００７８】
本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術、またはペプチドおよび融合タンパク質を調製する任意の他の方法によって調製され得る。特定の非天然アミノ酸は標準的な組換えＤＮＡ技術によって発現することができないが、それらの調製のための技術は当技術分野において公知である。非ペプチド部分を含有する本発明の化合物は、該当する場合は標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によって合成され得る。
【実施例】
【００７９】
[実施例１]
＝＝インスリンＡおよびＢ鎖の合成＝＝
インスリンＡおよびＢ鎖を、Ｂｏｃ化学を用いて４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂または４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上で合成した。９５：５のＨＦ／ｐ−クレゾールを使用して０℃で１時間、ペプチドを樹脂から切断した。ＨＦの除去およびエーテル沈殿後、ペプチドを５０％酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。あるいは、Ｆｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成した。これらのペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）を使用して室温で２時間インキュベートし、樹脂から切断した。過剰量のジエチルエーテルを添加してペプチドを沈殿させ、ペレットを酸性緩衝水溶液に可溶化した。ペプチドの品質をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、質量分析（ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩ）によって確認した。
【００８０】
インスリンＡ鎖を、７位のアミノ酸の単一遊離システインを用いて合成し、他のすべてのシステインをアセトアミドメチルＡ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）６、１１、２０として保護した。インスリンＢ鎖を、７位の単一遊離システインを用いて合成し、その他のシステインをアセトアミドメチルＢ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）１９として保護した。粗ペプチドを従来のＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００８１】
合成したＡ鎖とＢ鎖を、図１に概略を示す一般手順に従ってそれらの天然ジスルフィド結合を介して互いに連結した。それぞれのＢ鎖を、ＤＭＦまたはＤＭＳＯに溶解することによってＣｙｓ７−Ｎｐｙｓ誘導体へと活性化し、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（Ｎｐｙｓ）と１：１のモル比で室温にて反応させた。活性化をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、生成物をＥＳＩ−ＭＳによって確認した。
【００８２】
それぞれのＡ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）６、１１、２０およびＢ−（Ｎｙｐｓ）７（Ａｃｍ）１９を１：１のモル比で１０ｍｇ／ｍｌの総ペプチド濃度に溶解することによって第一Ｂ７−Ａ７ジスルフィド結合を形成した。鎖の結合反応が完了したとき、混合物を５０％酢酸水溶液の濃度に希釈した。最後の２つのジスルフィド結合は、ヨウ素の添加を介して同時に形成した。４０倍モル過剰のヨウ素を溶液に添加し、混合物を室温でさらに１時間撹拌した。アスコルビン酸水溶液を添加して反応を終了させた。混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、最終化合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって確認した。図２および表１のデータに示すように、この手順に従って調製した合成インスリンは、インスリン受容体結合に関して精製インスリンに良好に匹敵する。
【００８３】
修飾アミノ酸（Ａ１９位の４−アミノフェニルアラニンなど）を含むインスリンペプチドも、たとえば米国特許第７，０４５，３３７号および同第７，０８３，９７０号において教示される系を含む、非コードアミノ酸のタンパク質への組込みを可能にする系を用いてインビボで合成することができる。
表１：天然インスリンと比較した合成インスリンの活性
【００８４】
[実施例２]
＝＝還元的アルキル化によるアミン基（Ｎ末端およびリシン）のペグ化＝＝
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−アルデヒドおよびＮａＢＨ３ＣＮを１：２：３０のモル比でｐＨ４．１〜４．４の酢酸緩衝液に溶解した。反応溶液は、０．１Ｎ ＮａＣｌ、０．２Ｎ酢酸および０．１Ｎ Ｎａ２ＣＯ３から成る。インスリンペプチド濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応は室温で６時間にわたって行った。反応完了の程度をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、反応の収率は約５０％であった。
【００８５】
ｂ．精製
反応混合物を０．１％ＴＦＡで２〜５倍に希釈し、準備ておいたＲＰ−ＨＰＬＣカラムに供した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａ緩衝液、水中１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂ緩衝液、ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ；Ｂの直線勾配（％）が０〜４０％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体は約３５％のＢ緩衝液で溶出した。加硫分解またはトリプシン分解を介した化学修飾後、所望化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認した。
【００８６】
＝＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアシル化によるアミン基（Ｎ末端およびリシン）のペグ化＝＝
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）をｍＰＥＧ２０ｋ−ＮＨＳと共に０．１Ｎビシン緩衝液（ｐＨ８．０）に１：１のモル比で溶解した。インスリンペプチド濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした。反応の収率は、室温で２時間後に約９０％であった。
【００８７】
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍に希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａ緩衝液、水中１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂ緩衝液、ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ；Ｂの直線勾配（％）が０〜４０％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体を約３５％Ｂで収集した。加硫分解またはトリプシン分解を介した化学修飾後、所望化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認した。
【００８８】
＝＝フェニルアラニンの芳香環上のアセチル基の還元的アミノペグ化＝＝
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−ヒドラジドおよびＮａＢＨ３ＣＮを１：２：２０のモル比で酢酸緩衝液（ｐＨ４．１〜４．４）に溶解した。反応溶液は、０．１Ｎ ＮａＣｌ、０．２Ｎ酢酸および０．１Ｎ Ｎａ２ＣＯ３から成る。インスリンまたはインスリン類似体濃度は、室温で２４時間、約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応の経過をＨＰＬＣによってモニターした。反応の変換率は約５０％であった（ＨＰＬＣによって算定した）。
【００８９】
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍に希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａ緩衝液、水中１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂ緩衝液、ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ；Ｂ直線勾配（％）が０〜４０％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたはＰＥＧ−インスリン類似体を約３５％Ｂで収集した。加硫分解またはトリプシン分解を介した化学修飾後、所望化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認した。
【００９０】
[実施例３]
＝＝インスリン受容体結合アッセイ＝＝
インスリンまたはＩＧＦ−１受容体に対する各々のペプチドの親和性を、シンチレーション近接技術を利用した競合結合アッセイにおいて測定した。ペプチドの連続３倍希釈をＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）中で作製し、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）において０．０５ｎＭ（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）Ａ ＴｙｒＡ１４インスリンまたは（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）ＩＧＦ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と混合した。ヒトインスリンまたはＩＧＦ−１受容体を過剰発現する細胞から調製した形質膜フラグメントの１〜６μｇを各ウエルに分注し、０．２５ｍｇ／ウエルのポリエチレンイミン処理コムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を添加した。８００ｒｐｍで５分間振とうした後、プレートを室温で１２時間インキュベートし、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ１４５０液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）で放射能を測定した。非特異的結合（ＮＳＢ）の放射能を、試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「非放射性（コールド）」天然リガンドを含むウエルで測定した。競合物質を含まないウエルで総結合放射能を検出した。特異的結合のパーセントを以下のように計算した：特異的結合％＝（結合−ＮＳＢ／総結合−ＮＳＢ）×１００。ＩＣ５０値は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて決定した。
【００９１】
[実施例４]
＝＝インスリン受容体リン酸化アッセイ＝＝
インスリンまたはインスリン類似体の受容体リン酸化を測定するため、受容体をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を９６穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３５９６，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に播種し、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．２５％ウシ増殖血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３０５４１，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２および９０％湿度で１６〜２０時間培養した。インスリンまたはインスリン類似体の連続希釈を、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏ．１００３５０，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加したＤＭＥＭ中で調製し、接着した細胞を含むウエルに添加した。５％ＣＯ２の加湿条件下で３７℃で１５分間インキュベートした後、細胞を５％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定し、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４で２回洗浄して、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。次にプレートを３回洗浄し、製造者の推奨に従って２％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ中で再構成したホスホチロシンに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏ．１６−１０５，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）で満たした。室温で３時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ ｓｉｎｇｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏ．００−２０２３，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ）０．１ｍｌを各々のウエルに添加した。１Ｎ ＨＣｌ ０．０５ｍｌを添加することによって５分後に発色を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をＴｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ３４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で測定した。吸光度に対するペプチド濃度用量反応曲線をプロットし、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてＥＣ５０値を決定した。
【００９２】
[実施例５]
Ａ１９のインスリンの特定類似体を合成し、インスリン受容体におけるそれらの活性に関して特徴づけた。２つの活性の高い構造類似体がＡ１９で同定されたが、２番目の活性部位の芳香族残基（Ｂ２４）での同程度の構造変化により、同様の完全な活性のインスリン類似体は同定されなかった。表２および３は、インスリン受容体における完全な活性のために、Ａ１９位が高度に構造保存されていることを例示する。表２は、Ａ１９に修飾を有する２つのインスリン類似体だけが天然インスリンと同様の受容体結合活性を有することを明らかにする。４−アミノフェニルアラニンインスリン類似体に関して、３つの別々の実験からのデータを提示する。「活性（本試験）」と表示された欄は、同時に実施された２つの別々の実験における、天然インスリンに比較したインスリン類似体の結合パーセントを比較する。「活性（０．６０ｎＭ）」と表示された欄は、このアッセイを用いてインスリン結合に関して得られた過去平均値と比較したインスリン類似体の相対的結合パーセントである。どちらの分析においても、２つのＡ１９インスリン類似体（４−アミノフェニルアラニンおよび４−メトキシフェニルアラニン）は天然インスリンにおおよそ等しい受容体結合を示す。図３は、インスリン受容体への天然インスリンとＡ１９インスリン類似体のそれぞれの特異的結合を示すグラフである。表３は、天然インスリンと等しい結合活性を示す２つのＡ１９インスリン類似体（４−アミノおよび４−メトキシ）が、同時にインスリン受容体における等しいリン酸化活性も示すことを説明するデータを提示する。
表２：Ａ１９インスリン類似体のインスリン受容体結合活性
表３：Ａ１９インスリン類似体のインスリン受容体リン酸化活性
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）を含むポリペプチド、またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８位から選択される１〜３個のアミノ酸修飾によって配列番号３と異なる配列を含むその類似体。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化１】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２もしくはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；そして
Ｘ３は、アスパラギン、グリシンもしくはアラニンである］
【請求項２】
Ｒ４がＮＨ２である、請求項１に記載のインスリン類似体。
【請求項３】
ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）
の配列を含有するＡ鎖配列；および
Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）
の配列を含有するＢ鎖配列を含むインスリン類似体。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化２】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
【請求項４】
前記Ｂ鎖配列が、配列Ｘ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）を含む、請求項３に記載のインスリン類似体。
［配列中、
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される］
【請求項５】
前記Ａ鎖配列が、配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＮ（配列番号６）を含む、請求項３に記載のインスリン類似体。
［配列中、Ｘ２は、一般式：
【化３】
のアミノ酸である］
【請求項６】
前記Ｂ鎖配列が、配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号７）を含む、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項７】
前記Ｂ鎖配列が、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）を含む、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項８】
前記Ｂ鎖配列が、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）を含む、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項９】
前記Ｂ鎖のアミノ酸に連結されている親水性部分をさらに含む、請求項３に記載のインスリン類似体。
【請求項１０】
前記親水性部分が前記Ｂ鎖の前記Ｎ末端アミノ酸に連結されている、請求項９に記載のインスリン類似体。
【請求項１１】
親水性部分が、前記Ｂ鎖の前記Ｎ末端アミノ酸または配列番号８の２９位の前記アミノ酸のいずれかに連結されている、請求項７に記載のインスリン類似体。
【請求項１２】
親水性部分が、前記Ｂ鎖の前記Ｎ末端アミノ酸または配列番号９の２８位の前記アミノ酸のいずれかに連結されている、請求項８に記載のインスリン類似体。
【請求項１３】
前記親水性部分がポリエチレングリコールである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
【請求項１４】
式：Ｂ−Ｐ−Ａ１９の化合物を含む一本鎖インスリン類似体。
［式中、
Ｂは、Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）の配列を含む配列を表し；
Ａ１９は、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）の配列を含む配列を表し；そして
Ｐは、約４〜約１４アミノ酸のペプチドリンカーを表し、さらに、
配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化４】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーが、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号１２）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２１）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１８）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１９）およびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２０）
から成る群より選択される、請求項１４に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１６】
Ｒ４がＮＨ２である、請求項１５に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１７】
Ｒ４がＮＨ２であり；
Ｂ鎖が、Ｘ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）の配列を含み；そして
前記ペプチドリンカーが４〜８アミノ酸長であり；さらに、
配列中、
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される、
請求項１４に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１８】
前記ペプチドリンカーが、配列：ＧＧＧＰＧＫＲ（配列番号１１）、ＡＧＲＧＳＧＫ（配列番号２４）、ＡＧＬＧＳＧＫ（配列番号２５）、ＡＧＭＧＳＧＫ（配列番号２６）、ＡＳＷＧＳＧＫ（配列番号２７）、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＴＧＬＧＲＧＫ（配列番号２９）、ＴＧＬＧＳＧＫ（配列番号３０）、ＨＧＬＹＳＧＫ（配列番号３１）、ＫＧＬＧＳＧＱ（配列番号３２）、ＶＧＬＭＳＧＫ（配列番号３３）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＹＳＧＫ（配列番号３５）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号３７）、ＶＷＳＳＳＧＫ（配列番号３８）、ＶＧＳＳＳＧＫ（配列番号３９）およびＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号４０）を含む、請求項１７に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１９】
親水性部分が、前記Ｂ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８、Ｂ２９位、前記Ｃ末端もしくはＮ末端のアミノ酸側鎖または前記ペプチドリンカーのリシン側鎖を介して連結されている、請求項３〜８または１４〜１８のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
【請求項２０】
前記類似体が、Ａ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９から選択される１またはそれ以上の位置でアシル化されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
【請求項２１】
請求項３または１４に記載の前記インスリン類似体および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、糖尿病を治療する方法。
【請求項１】
配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）を含むポリペプチド、またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８位から選択される１〜３個のアミノ酸修飾によって配列番号３と異なる配列を含むその類似体。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化１】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２もしくはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；そして
Ｘ３は、アスパラギン、グリシンもしくはアラニンである］
【請求項２】
Ｒ４がＮＨ２である、請求項１に記載のインスリン類似体。
【請求項３】
ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）
の配列を含有するＡ鎖配列；および
Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）
の配列を含有するＢ鎖配列を含むインスリン類似体。
［配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化２】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
【請求項４】
前記Ｂ鎖配列が、配列Ｘ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）を含む、請求項３に記載のインスリン類似体。
［配列中、
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される］
【請求項５】
前記Ａ鎖配列が、配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＮ（配列番号６）を含む、請求項３に記載のインスリン類似体。
［配列中、Ｘ２は、一般式：
【化３】
のアミノ酸である］
【請求項６】
前記Ｂ鎖配列が、配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号７）を含む、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項７】
前記Ｂ鎖配列が、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号８）を含む、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項８】
前記Ｂ鎖配列が、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）を含む、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項９】
前記Ｂ鎖のアミノ酸に連結されている親水性部分をさらに含む、請求項３に記載のインスリン類似体。
【請求項１０】
前記親水性部分が前記Ｂ鎖の前記Ｎ末端アミノ酸に連結されている、請求項９に記載のインスリン類似体。
【請求項１１】
親水性部分が、前記Ｂ鎖の前記Ｎ末端アミノ酸または配列番号８の２９位の前記アミノ酸のいずれかに連結されている、請求項７に記載のインスリン類似体。
【請求項１２】
親水性部分が、前記Ｂ鎖の前記Ｎ末端アミノ酸または配列番号９の２８位の前記アミノ酸のいずれかに連結されている、請求項８に記載のインスリン類似体。
【請求項１３】
前記親水性部分がポリエチレングリコールである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
【請求項１４】
式：Ｂ−Ｐ−Ａ１９の化合物を含む一本鎖インスリン類似体。
［式中、
Ｂは、Ｘ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号４）の配列を含む配列を表し；
Ａ１９は、ＧＩＶＥＱＣＣＸ１ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ２ＣＸ３（配列番号３）の配列を含む配列を表し；そして
Ｐは、約４〜約１４アミノ酸のペプチドリンカーを表し、さらに、
配列中、
Ｘ１は、トレオニンおよびヒスチジンから成る群より選択され；
Ｘ２は、一般式：
【化４】
［式中、Ｒ４は、ＮＨ２またはＯＣＨ３である］
のアミノ酸であり；
Ｘ３は、アスパラギンまたはグリシンであり；
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択される］
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーが、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号１２）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２１）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１３）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１５）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１７）、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１８）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１９）およびＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２０）
から成る群より選択される、請求項１４に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１６】
Ｒ４がＮＨ２である、請求項１５に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１７】
Ｒ４がＮＨ２であり；
Ｂ鎖が、Ｘ１１ＶＮＱＸ４ＬＣＧＸ５Ｘ６ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＸ９Ｘ１０（配列番号５）の配列を含み；そして
前記ペプチドリンカーが４〜８アミノ酸長であり；さらに、
配列中、
Ｘ４は、ヒスチジンおよびトレオニンから成る群より選択され；
Ｘ５は、アラニン、グリシンおよびセリンから成る群より選択され；
Ｘ６は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸から成る群より選択され；
Ｘ９は、アスパラギン酸塩−リシンジペプチド、リシン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リシンジペプチドであり；
Ｘ１０は、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドであり；
Ｘ１１は、フェニルアラニンおよびデスアミノ−フェニルアラニンから成る群より選択される、
請求項１４に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１８】
前記ペプチドリンカーが、配列：ＧＧＧＰＧＫＲ（配列番号１１）、ＡＧＲＧＳＧＫ（配列番号２４）、ＡＧＬＧＳＧＫ（配列番号２５）、ＡＧＭＧＳＧＫ（配列番号２６）、ＡＳＷＧＳＧＫ（配列番号２７）、ＴＧＬＧＳＧＱ（配列番号２８）、ＴＧＬＧＲＧＫ（配列番号２９）、ＴＧＬＧＳＧＫ（配列番号３０）、ＨＧＬＹＳＧＫ（配列番号３１）、ＫＧＬＧＳＧＱ（配列番号３２）、ＶＧＬＭＳＧＫ（配列番号３３）、ＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号３４）、ＶＧＬＹＳＧＫ（配列番号３５）、ＶＧＬＳＳＧＫ（配列番号３６）、ＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号３７）、ＶＷＳＳＳＧＫ（配列番号３８）、ＶＧＳＳＳＧＫ（配列番号３９）およびＶＧＭＳＳＧＫ（配列番号４０）を含む、請求項１７に記載の一本鎖インスリン類似体。
【請求項１９】
親水性部分が、前記Ｂ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８、Ｂ２９位、前記Ｃ末端もしくはＮ末端のアミノ酸側鎖または前記ペプチドリンカーのリシン側鎖を介して連結されている、請求項３〜８または１４〜１８のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
【請求項２０】
前記類似体が、Ａ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９から選択される１またはそれ以上の位置でアシル化されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
【請求項２１】
請求項３または１４に記載の前記インスリン類似体および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、糖尿病を治療する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５１２８９９（Ｐ２０１２−５１２８９９Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２４８２（Ｐ２０１１−５４２４８２）
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８７１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０６０６
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０７２７７６４２）インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション (21)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８７１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０６０６
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０７２７７６４２）インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション (21)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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