エナ活性ミネラルＡ活性水を有効成分として含有する肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物
本発明はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する肝機能改善用組成物に関し、より詳細には、有効成分として、イカ骨及び紅藻類破鎖粉末を原料としたアルカリ性エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する抗酸化、抗老化または肝損傷の防止または肝機能改善用薬学組成物及び健康または健康補助食品であり、本発明による組成物は生体内の血清中のビタミンＣ減少を抑制して、老化防止、肝細胞の損傷、肝細胞自滅死及び壊死を抑制して肝損傷を防止し、肝機能を改善する效能で、老化による肝臓での肝細胞の損傷、自滅死及び壊死に最も重要な肝細胞を保護することによって根本的な問題を解決することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する抗酸化、抗老化または肝機能改善用組成物に関し、より詳細には、有効成分としてエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する、血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物及び健康または健康補助食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度の発展の中で生きて行く現代人は外部からの各種ストレスに露出されており、このようなストレスは誰も避けることができないもので、体の全般的な老化の進行に影響を与える。老化というのは、疾病ではない自然的な生命現象で阻むことができないが、長生きしようとする人間の基本的な欲望の表出によって老化の進行を緩む研究が活発に行っている。さらに、現代人が日々に過重されるストレスの中で生きていると言っても過言ではなく、健康（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）ブームととも生活の質を高めるための関心が高まるにつれて老化の進行を抑制する抗酸化機能物質の探索が注目を集めている。
【０００３】
ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は、３４ｋＤａの老化マーカータンパク質としてラットの肝で初めて発見され、ラットの老化が進行されるにつれて、その発現量が顕著に減少されると報告されており、ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）の発現が減少される様相は雄の老化によるアンドロゲンホルモンの生成の減少とは無関係な様相を表すと公知されたことがある（Ｆｕｊｉｔａ Ｔ.，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ.１９９９ Ｊａｎ ８；２５４（１）：１−４，Ｍｏｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ.，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ２００４；５４：１６７−１７３７）。
【０００４】
ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は細胞の自滅死と壊死を防止して、生体の老化を防止する役割を果たすものと研究されており、その主な役割は下記の通りである。上記ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は体内でビタミンＣの合成に関与するグルコノラクトナーゼ（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）の役割を果たすことによって、体内ビタミンＣの生合成に重要な役割を果たし、細胞の自滅死と壊死に重要な役割を果たすシグナリング分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるカルシウムイオンの細胞の内外の恒常性を維持させることによって、細胞の自滅死と壊死を防止する。また、上記ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は、その自体でも生体に有害な活性酸素とラジカルを取り除く抗酸化タンパク質として作用することで生体の老化、細胞の自滅死及び壊死を防止する。従って、ＳＭＰ３０タンパク質が欠乏する時ビタミンＣの欠乏が現われるとともに、老化の進行はそうでない動物の場合より非常に早く進行されると知られている。
【０００５】
現代は、老人人口の増加とともに健康補助食品、各種ホルモン製剤、抗老化関連薬品、老人生活及び機能補助具などを含む長寿関連産業が急速に成長している。最近関心が集中されているプラセンタ注射は、皮膚美容、更年期障害、老化防止などに多様な効果、現代病の約９０％は活性酸素が原因だと言うが、プラセンタエキスの活性酸素除去作用は、現代病の９０％の効果があると言えることができ、プラセンタエキスの自律神経調節作用、内分泌調節作用、免疫復活作用がこの全ての疾病に対して正常に回復させる効果があると知られている。しかし、まだプラセンタエキスの多様な成分の効果に対する十分な研究が行われておらず、法的に強制規定ではないため、食品には薬品のように正確な成分と効果に対する説明が付いていない。抗老化治療に使用されるホルモンが実際このような効果を奏するか否かに対して根拠が確保されていない状態であるため推奨されていない。
【０００６】
本発明のエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、韓国登録特許第１０−０４６３８２５号でエナミネラルＡ活性水の製造方法及びこれを利用した骨粗鬆症の予防及び改善に有用な組成物を出願したことがあり、上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が肝細胞の損傷、また血清中のビタミンＣ減少を抑制する作用で哺乳類の老化進行を抑制する天然素材で、生体老化を防止または抑制する効果に対しては全く知られてない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する、血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物及び健康または健康補助食品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は有効成分としてエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する、血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物を提供する。
【０００９】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、生体内の血清中のビタミンＣ減少を抑制して老化を防止し、肝細胞の自滅死及び壊死を防止することを特徴とする。
【００１０】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、肝細胞の損傷、自滅死及び壊死を抑制して肝損傷の防止または肝機能を改善することを特徴とする。
【００１１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１２】
本発明は、天然食用海藻類である海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末、イカ骨を主成分として精製し、天然ミネラルを普及するアルカリ水溶液を製造する。韓国登録特許第１０−０４６３８２５号によって製造された物質をエナ活性ミネラルＡ活性水とし、下記の製造方法を参照する。
【００１３】
前記天然食用海藻類は紅藻類で、１００％植物性食用海藻であって、葉緑素の他に紅藻素を含有して紅色、紫色を呈する植物群を称する。体は大概多細胞で、ひも状や葉状を有し、大部分が海産であって、海苔、テングサ、フノリなどが含まれる。さらに、イカ骨は烏賊骨とも称し、イカの中心部にある白色の骨を乾燥させて使用する。
【００１４】
本発明において、前記紅藻類とイカ骨を利用した無機質ミネラルの製造方法は、綺麗に洗浄して乾燥させ、１０００〜２０００℃で１時間加熱焼成することが好ましく、焼成を行なうことで細菌や不純物が完全に燃焼されて除去されると、無機質であるミネラルだけが残るようになるが、これを室温で完全に冷却させた後、粉砕機を利用して微細粉末化する。
【００１５】
次に、焼成されたイカ骨、焼成された紅藻類を用いて微細粉末化されたミネラルを水に溶解させる。前記焼成されたミネラルを溶解させた水をイオン溶液化するためには、８０〜１００℃で揚水機ポンプを使用して、１０気圧以上の圧力による落差を利用して砕けるような方法で１時間以上続けて行うことが好ましい。揚水機のポンプ圧力は、最小１０ｋｇ／ｃｍ２以上である時に効果的である。このようにしてイオン化されたイオン溶液は、沈殿させてから濾過するが、１５時間〜３５時間そのまま放置し、ミネラルスラッジが下に自然に沈殿すると、上澄液である清い液のみを沈殿フィルタを使って濾過させると、アルカリ性を呈するミネラル活性水が製造される。
【００１６】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が体重の変化と生存率の変化の差、動物の骨格の変化と体の転換に及ぶ影響を確認した。具体的な例として、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を、ビタミンＣを供給した１８週齢ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）欠損マウスとビタミンＣを供給しない２６週齢、４６週齢ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）欠損マウスに０％、５％及び１０％の濃度で飲料水を通じて１８週間供給して、実験期間の中、肉眼で現われる変化、体重の変化と生存率を観察し、１８週後に全ての個体を剖検した。
【００１７】
その結果、上記体重の変化と生存率の変化の差は、ビタミンＣを供給したグループで試験物質であるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を投与したグループと投与しないグループとの間の体重の変化及び生存率の差を確認することができなかった。図１を参照する。
【００１８】
しかし、ビタミンＣを供給しないグループでは、体重の変化及び生存率の変化の差は、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の濃度によって平均体重より有意に急激に減少するとともに、生存率も０％で、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の濃度による有意性のある差を確認した。図２乃至図４を参照する。
【００１９】
また、自然に発生することができる老化に係わる臨床症状をＸ−ｒａｙ照射を通じて動物の骨格の変化と体の転換に及ぶ影響を確認した結果、ビタミンＣを供給したマウスのグループ全体では壊血病性骨原障害（ｓｃｏｒｂｕｔｉｃ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を確認することができなかったが、ビタミンＣを供給しないグループ全体では壊血病性骨原（ｓｃｏｒｂｕｔｉｃｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を確認した。図５を参照する。
【００２０】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が生体内血清中のビタミンＣの減少を抑制して老化を防止し、肝細胞の自滅死及び壊死の防止に対する効果を確認した。
【００２１】
まず、上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が血清の中でビタミンＣに及ぶ影響を確認した結果、ビタミンＣを供給したグループでのみ血清の中でビタミンＣを確認することができ、ビタミンＣを供給しないグループでは血清の中にビタミンＣを確認することができなかった。より具体的に、上記ビタミンＣを供給したグループにおける血清の中、総ビタミンＣの数値がエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を投与したグループで賦形剤対照群と比較して統計学的に有意に高い数値を確認した。また、還元型（Ｒｅｄｕｃｅｄ）ビタミンＣ／酸化型（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ）ビタミンＣの割合を示すグラフで賦形剤対照群と比較して還元型（Ｒｅｄｕｃｅｄ）ビタミンＣ／酸化型（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ）ビタミンＣの割合値が濃度依存的に増加することを観察した。これはエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が生体内ビタミンＣの合成、代謝、分解過程に影響を及ぼし、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の抗酸化機能によって生体内ビタミンＣの酸化が抑制されて老化を防止することを表す結果で、図６及び図７を参照する。
【００２２】
上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、肝細胞の損傷、自滅死及び壊死を抑制して肝損傷の防止または肝機能を改善することを特徴とする。より具体的な例として、雄ＳＭＰ３０欠損マウス週齢別の老化モデルでビタミンＣを供給したグループ及びビタミンＣを供給しないグループ別にエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の供給によるグループ間の１８週の全試験期間にわたって行われる老化過程において現われる組職病理学的変化をマウスの肝を組職切片に作って細胞自滅死程度、細胞損傷程度、抗酸化タンパク質の発現程度の差を確認した。その結果、ビタミンＣを供給したグループ全体では組職病理的異常所見が観察されておらず、グループの間の差も観察されなかった。またタネルアッセイ（Ｔｕｎｅｌ ａｓｓａｙ）陽性細胞をほとんど確認することができなく、正常な肝細胞の細胞質に分布するグリコーゲンを同定が可能だった。しかし、ビタミンＣを供給しないグループでは肥大された肝星細胞と肝細胞の空胞化が正常水準より多数観察され、タネルアッセイ（Ｔｕｎｅｌａｓｓａｙ）陽性細胞を確認した。同時に、肝細胞の細胞質内のグリコーゲン分布程度がエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を供給したグループで有意に肝細胞の細胞質内のグリコーゲン分布が増加したことを観察した。これは、本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水が肝の老化による肝細胞の自滅死と損傷を制御し、肝細胞の機能を正常に維持させて肝細胞質のグリコーゲン分布が正常に維持され、濃度依存的に肝細胞の保護効果が顕著であることを確認した結果である。図８乃至図１３を参考する。
【００２３】
本発明のエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は老化指標であるＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）を抑制する。具体的な例として、代表的な抗酸化タンパク質であるＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現に及ぶ影響を確認した結果、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現がマウスの週齢が高いほど発現が増加することが観察され、４６週齢グループの間でもエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の５％濃度群が賦形剤対照群に比較して、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤが低く発現されることが観察され、濃度依存的にＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現が減少されることが確認された。図１５を参照する。
【００２４】
本発明による上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を有効成分として、薬学組成物の全体の中で０.００１乃至１５重量％であり、好ましくは上記有効成分が０.０１乃至１０重量％で含まれる。
【００２５】
このように製造された薬学組成物の一回投与量は年齢、病変の程度などの個人差や剤形、形態によって適切に調節されることができ、一般の成人に対する一日２回、１回当り０.０１乃至１０００ｍｇの有効含量で使用し、本発明の薬学組成物はカプセル剤、錠剤、咬める錠剤、粉末制、乾燥シロップ、顆粒剤、チューイン錠剤、軟質カプセル制、丸剤、ドリンク剤及び舌下錠に製造されることができる。
【００２６】
本発明の薬学組成物は防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧の調節のための塩または緩衝剤などの薬剤学的補助剤及びその他治療的に有用な物質をさらに含有することができ、通常的な方法によって多様な経口または非経口投与形態に剤形化することができる。
【００２７】
経口投与用剤形としては、例えば錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル制、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤などがあり、これら剤形は有効成分以外に稀釈剤、即ち、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン、潤滑剤、即ち、シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウムまたはカルシウム塩及びポリエチレングリコールを含有している。また、錠剤はケイ酸アルミニウムマグネシウム、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリジンのような結合剤を含有することができ、場合によって澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有することができる。錠剤は、通常混合、顆粒化またはコーティング方法によって製造されることができる。また非経口投与用剤形の代表的なのは注射用剤形で、等張性水溶液または懸濁液が好ましい。
【００２８】
しかし、活性成分の実際投与量は症状の重症度、選択された投与経路、対象の年齢、性別、体重及び健康状態などの多くの関連因子に基づいて決めるものと理解すべきある。
【００２９】
本発明による薬学組成物として適合する投与量は、通常熟練された医者は、皮膚に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明による薬物の１日投与量は、投与しようとする対象のびまん性進行程度、発病時期、年齢、健康状態、余病などの多様な要因によって異なるが、成人を基準にする時、一般的には、上記に言及された重量比に組合された組成物１乃至５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、３０乃至２００ｍｇ／ｋｇを１日１乃至２回分割して投与することができ、上記投与量は、如何なる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
本発明による上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水及び食品学的に許容される食品補助添加剤を含有する健康機能食品を提供し、上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を有効成分として含有する錠剤、カプセル制、丸剤または液剤であり、本発明の健康食品の組成物はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を有効成分として、健康食品組成物の全体の中、０.００１乃至１０重量％に含有されるもので、食品剤形としては葡萄糖、クエン酸、液状オリゴ糖、コーン‐シロップ（ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）、大豆レシチン、バター、植物性硬化類、脱脂牛乳、砂糖、マーガリン、食塩、澱粉、小麦粉、水飴、麦芽糖、重曹及びショ糖エステルなどの通常使われる成分を利用してドリンク剤、キャラメル、チョコレッド、ダイエットバー剤形または菓子類である健康食品に剤形化されることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、老化による体重減少、斃死、臨床症状、肝細胞の自滅死、肝細胞の損傷、また血清中のビタミンＣ減少を抑制する作用で、哺乳類の老化進行を抑制する天然素材で生体老化を防止または抑制する効果を奏する。
【００３２】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、老化による肝臓における肝細胞の損傷、自滅死及び壊死に最も重要な肝細胞を保護することによって根本的な問題を解決することができ、その他臓器には毒性を現わさない天然素材で、肝損傷の防止または肝機能の改善に顕著な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、全試験期間にわたる各グループ動物の週別平均体重の変化を比較したグラフである。
【図２】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、１８週齢になったマウスの １８週の間に測定した各グループの平均生存率を示すグラフである。
【図３】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、２６週齢になったマウスの １８週の間に測定した各グループの平均生存率を示すグラフである。
【図４】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、４８週齢になったマウスの １８週の間に測定した各グループの平均生存率を示すグラフである。
【図５】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水の供給がＳＭＰ３０ノックアウトマウスに及ぶ骨原性障害に対するＸ−ｒａｙ写真である。
【図６】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、１８週になったマウスを剖検して測定した各グループのビタミンＣ全体の割合を示すグラフである。
【図７】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、１８週になったマウスを剖検して測定した各グループの還元型ビタミンＣ／酸化型ビタミンＣの割合を示すグラフである。
【図８】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、それぞれ動物を剖検してエナ活性ミネラルＡ活性水に対するＨ＆Ｅ染色陽性細胞の組職病理学的観察結果である。
【図９】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水のＨ＆Ｅ染色陽性細胞数に及ぶ効果を比較した結果である。
【図１０】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給して、それぞれ動物を剖検した後、エナ活性ミネラルＡ活性水に対するＰＡＳ染色陽性細胞の組職病理学的観察した結果である。
【図１１】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水のＰＡＳ染色陽性細胞数に及ぶ効果を比較した結果である。
【図１２】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給して、それぞれ動物を剖検した後、エナ活性ミネラルＡ活性水に対するタネル（Ｔｕｎｅｌ）染色陽性細胞の組職病理学的観察結果である。
【図１３】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水のタネル（Ｔｕｎｅｌ）染色陽性細胞数に及ぶ効果を比較した結果である。
【図１４】は本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、肝でＳＭＰ３０発現に及ぶエナ活性ミネラルＡ活性水の效能に対する組職病理学的観察した結果である。
【図１５】特殊タンパク質検出検査（免疫ブロット）を利用した本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水の供給がＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現に及ぶ効果を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
「製造例１」エナ活性ミネラルＡ活性水の製造
綺麗に洗浄して乾燥させたコウイカ骨と紅藻類をそれぞれ粉碎して粉末に製造した後、１１００℃で１時間加熱焼成する。上記焼成されたコウイカ骨と紅藻類を室温で完全に冷却させた後、粉砕機を利用して微細な粉末に製造した。前記紅藻類は、海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末を同一の量で混合して使用した。
【００３５】
水５００ｌに焼成されたコウイカ骨の微細粉末を１．５ｋｇ、焼成された紅藻類の微細粉末を４ｋｇを投入し、攪拌して溶解させた。この溶液を９０℃で揚水機ポンプを利用して１０気圧の圧力で落差を発生させ、粒子が砕けるような方法で２時間粉砕してイオン溶液を製造し、イオン溶液を２４時間放置した後、反応器内の上層の清い液を沈殿フィルタを利用して濾過し、ミネラル活性水を製造した。
【００３６】
上記製造されたミネラル活性水をエナ活性ミネラルＡ活性水とし、ミネラルの成分を分析した結果を表１に示した。
【表１】
【００３７】
上記表１から明らかなように、本発明によるイオン溶液はpHが１２．８５のアルカリ溶液であり、特に、カルシウム成分の含量が高く、人体に有益な多様な金属イオンを多量含んでいることが分かる。
【００３８】
［実施形態］
（１）試験係
１）種及び系統
特定病原体不在（ＳＰＦ）雄１８，２６，４６週齢ＳＭＰ３０ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス
【００３９】
２）供給源
Ｔｏｋｙｏ Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ（３５−２ Ｓａｋａｅ−ｃｈｏ、Ｉｔａｂａｓｈｉ−ｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、１７３−００１５、Ｊａｐａｎ）から供給され、自体遺伝子検定を経った後交配して、自ら生産したマウスである。
【００４０】
３）試験係の選択理由
本試験に使用されるマウスはＳＭＰ３０欠損動物であって、正常なマウスより老化が早く進行されて、老化実験動物モデルとして豊かな試験基礎資料があり、試験結果の解釈にこれを利用することができる。
【００４１】
４）検疫及び馴化
ＳＭＰ３０ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）マウスはＴｏｋｙｏ Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙでＳＭＰ３０ ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを雄１０匹、雌２０匹を分譲して慶北大学獣医科大学病理学教室動物室で繁殖させた。繁殖を通じて生まれたＦ１マウスの中にＰＣＲを利用したテール（ｔａｉｌ）ＤＮＡ遺伝型分析を通じて、ＳＭＰ３０ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）マウスのみ選別した。
【００４２】
５）動物の遺伝型分析
動物の遺伝型分析はテール（ｔａｉｌ）ＤＮＡを使用したＰＣＲ方法を通じて実施された。ゲノムＤＮＡは、文献に知られているように、複合的方法によってマウスの尾から抽出した。マウスの尾を生検して、−８０℃で最小１５分間冷凍させた。その後、各サンプルごとに３００μｌの分解緩衝制（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.０；５００ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％ ＳＤＳ；０.２ｍｇ／ｍｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ； １ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を添加した。サンプルの細胞溶解は５６℃ ＣＯ２インキュベーターで５時間震動して反応させた。細胞の溶解後、それぞれのサンプルは常温で１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて、サンプルの組職残骸を除去した。その後、上層液を分離した後、５００μｌのイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加して、ゲノムＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄した。サンプルは１０分間遠心分離させた。上層液を除去した後、
沈澱されたペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を常温で乾燥させた。ペレットは ５０μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.５）に溶解させて、６５℃で５分間放置させた。分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＵＳＡ）を利用してゲノムＤＮＡを定量化した後、ＤＮＡを２５０ｎｇ／ｕｌの濃度に稀釈させ、稀釈されたＤＮＡに１μｌのＰＣＲ 混合物を添加した。ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）の確認はプライマＴＡ４（５′−ＣＡＡＧＴＡＡＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＧＧＡＣ−３′）、ＴＳ３（５′−ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴ−３′）、ＮＥＯ（５′−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３′）を使用した。
【００４３】
（２）飼育環境
１）環境条件
本試験に使用したマウスの場合には、温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、照明時間１２時間(０８：００点灯〜２０：００消灯)として設定された自動温湿度調節装置が設置された慶北大学獣医科大学病理学教室の動物室で、馴化及び飼育された。飼育環境は全試験期間にわたって試験に影響を及ぼすと思われる変動は認められなかった。
【００４４】
２）飼育箱、飼育密度及び飼育箱の識別
全試験期間の間ポリカーボネート製飼育箱（２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈｍｍ）に５匹以下ずつ収容した。個体識別は油性マジックペンを利用した尾部表示法と飼育箱別個体識別カード表示法を利用した。
【００４５】
３）飼料及び水
イ）飼料の給与方法
飼料は実験動物用固形飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、５０５ Ｎｏｒｔｈ ４ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｉｎ ４７３７４、ＵＳＡ）を放射線照射（１３.２ｋＧｙ）滅菌して自由に攝取させた。
ロ）水の給与方法
水は上水道水を瓶を利用して自由に攝取させた。
【００４６】
（３）試験群の構成及び投与
実験Ａと実験Ｂに構成されて実施され、実験Ａは１８週齢、雄、ＳＭＰ３０ノックアウト Ｃ５７ＢＬ／６マウスが実験に使用され、対照群、実験群１、実験群２の三つのグループに８匹ずつ区分した。実験Ｂは２６，４６週齢、雄、ＳＭＰ３０ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスが実験に使用され、各週齢別に、実験Ａと同一に対照群、実験群１、実験群２の三つのグループで分けられて、２６週齢は４匹ずつ三つのグループに区分し、４６週齢は、６匹ずつ三つのグループに区分した。実験に使われたエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は上記製造例１で製造されたもので、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の原液を上水道水に各５％と１０％に稀釈して、１８週の実験の全試験期間にわたって自由に摂取するようにした。１８週目に全ての実験動物の剖検を実施し、病理組職学的検査のために各動物ごとに血液と臓器サンプルを採取した。
【００４７】
【表２】
【表３】
【００４８】
（４）観察及び実験検査項目
１）試験物質が体重の変化に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、週に一回体重を測定することによって体重の変化を観察した。その結果は下記の表１に示した。
【００４９】
２）試験物質が老化に係わる臨床症状に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、自然に発生することができる老化に係わる臨床症状を観察するために、Ｘ−ｒａｙ照射を通じて動物の骨格の変化と体の転換に試験物質が及ぶ影響を観察した。
【００５０】
３）試験物質が生存率に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、全てのグループの間の生存率の変化と差を観察した。その結果は下記の表４に示した。
【００５１】
【表４】
【００５２】
４）試験物質が血清ビタミンＣに及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、試験物質が血清のビタミンＣのレベルに及ぶ影響を観察するために、血液試料を遠心分離（３０００ｇ、１５分）を通じて血清を分離した後、血清１００μｌに３％メタリン酸（ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）４５０μｌを処理して遠心分離機で１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した後、その上層液９０μｌと０.１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１６.４μｌを混合して、氷に３０分程度放置した後、３％メタリン酸（ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄ）９５７.６μｌをさらに添加する。遠心分離機で１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した後、その上層液９００μｌを取ってＳｈｏｄｅｘ−５ＳＩＬ−４Ｅ ｃｏｌｕｍｎ（４.６２５０ｍｍ；Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ，Ｔｏｋｙｏ）を用いたｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｍｏａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）法を通じて血中ビタミンＣのレベルを測定した。
【００５３】
５）試験物質が肝臓での老化による組職学的変化に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって行われる老化過程に肝で現われる組職病理学的変化を観察するためにヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色、ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ）染色、タネルアッセイ（Ｔｕｎｅｌ ａｓｓａｙ）染色法、免疫組織化学法を実施した。上記染色法を実施して光学顕微鏡で観察して各染色法による陽性反応を現わす細胞を計算してグループの間の細胞自滅死程度、細胞損傷程度、抗酸化タンパク質の発現程度の差を観察した。全ての病理学的観察はダブルスクリーン（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｃｒｅｅｎ）を実施した。その結果は下記表５に示した。
【００５４】
【表５】
【００５５】
６）試験物質が肝臓での抗酸化タンパク質の発現に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで１８週の試験期間以後に代表的な抗酸化タンパク質である活性酸素除去酵素（スーパーオキシドディスムターゼ、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ）の発現に及ぶ影響を観察するため−７０℃に冷凍された肝組織を０.１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、Ｎａ３Ｖｏ４）とプロテアーゼ阻害混合錠剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット）（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を溶解させたＲＩＰＡバッファーに均質化させた。上記均質化された肝臓サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離して脂肪を除去して上層液を取った後、上層液を再び１４、０００ｒｐｍ、４℃で、２０分間遠心分離して上層液を取った。タンパク質定量分析（ブラッドフォード法）を利用してタンパク質の濃度を測定し、各タンパク質のサンプルを８０ｕｇ／ｗｅｌｌで、１０％ＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した。特殊タンパク質検出検査（免疫ブロット）のために電気泳動されたゲル内のタンパク質をＰＶＤＦメンブレイン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に電子伝達させた。３％のウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をトリス緩衝食塩水に溶解させたブロッキング溶液に１時間ブロッキングする過程の後にＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ（１：１００、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｃａｎａｄａ）、β−チューブリン（１：１０００Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）に反応させた。０.５％ ツイン２００が溶解されたＴＢＳ緩衝溶液に充分に洗浄し、一次抗体に対応する二次抗体（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１：１０００乃至１：２０００の割合で稀釈して室温で１時間反応させた。再びＴＢＳ緩衝溶液で充分に洗浄した後、特異的な反応を観察するために、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ、ＩＬ、ＵＳＡ）と反応させ、メディカルＸ−ｒａｙフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に露出させた。
【００５６】
（５）統計学的方法
得られた資料に対する統計分析は対応標本ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ Ｔ−ｔｅｓｔ）を利用して、互いに独立でない二つの集団の間の平均の差を分析した。Ｔ検定（Ｔ−ｔｅｓｔ）は二つの集団の平均の差を二つの集団の分散で標準化させた値を統計的に検定することで、二つの集団の分散が同一である時と二つの集団の分散が同一でない時の二つの場合があり、このような分析は統計プログラムであるＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３。０５、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ。）を利用して実施した。検定の危険率は５％及び１％に決めた。
【００５７】
［薬学組成物剤形例１］錠剤
エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水８０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動床乾燥機を利用して顆粒化した後、ショ糖エステル（ｓｕｇａｒ ｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加して打錠機で打錠した。内容物の最終重量は６００ｍｇとする。
【００５８】
［健康食品組成物剤形２］ドリンク剤
エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水８０ｍｇ、葡萄糖１０ｍｇ、クエン酸０.６ｇ及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつなるように充填した。瓶に充填した後１３０℃で４乃至５秒間殺菌して飲料を製造した。
【技術分野】
【０００１】
本発明はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する抗酸化、抗老化または肝機能改善用組成物に関し、より詳細には、有効成分としてエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する、血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物及び健康または健康補助食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度の発展の中で生きて行く現代人は外部からの各種ストレスに露出されており、このようなストレスは誰も避けることができないもので、体の全般的な老化の進行に影響を与える。老化というのは、疾病ではない自然的な生命現象で阻むことができないが、長生きしようとする人間の基本的な欲望の表出によって老化の進行を緩む研究が活発に行っている。さらに、現代人が日々に過重されるストレスの中で生きていると言っても過言ではなく、健康（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）ブームととも生活の質を高めるための関心が高まるにつれて老化の進行を抑制する抗酸化機能物質の探索が注目を集めている。
【０００３】
ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は、３４ｋＤａの老化マーカータンパク質としてラットの肝で初めて発見され、ラットの老化が進行されるにつれて、その発現量が顕著に減少されると報告されており、ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）の発現が減少される様相は雄の老化によるアンドロゲンホルモンの生成の減少とは無関係な様相を表すと公知されたことがある（Ｆｕｊｉｔａ Ｔ.，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ.１９９９ Ｊａｎ ８；２５４（１）：１−４，Ｍｏｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ.，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ２００４；５４：１６７−１７３７）。
【０００４】
ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は細胞の自滅死と壊死を防止して、生体の老化を防止する役割を果たすものと研究されており、その主な役割は下記の通りである。上記ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は体内でビタミンＣの合成に関与するグルコノラクトナーゼ（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）の役割を果たすことによって、体内ビタミンＣの生合成に重要な役割を果たし、細胞の自滅死と壊死に重要な役割を果たすシグナリング分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるカルシウムイオンの細胞の内外の恒常性を維持させることによって、細胞の自滅死と壊死を防止する。また、上記ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）は、その自体でも生体に有害な活性酸素とラジカルを取り除く抗酸化タンパク質として作用することで生体の老化、細胞の自滅死及び壊死を防止する。従って、ＳＭＰ３０タンパク質が欠乏する時ビタミンＣの欠乏が現われるとともに、老化の進行はそうでない動物の場合より非常に早く進行されると知られている。
【０００５】
現代は、老人人口の増加とともに健康補助食品、各種ホルモン製剤、抗老化関連薬品、老人生活及び機能補助具などを含む長寿関連産業が急速に成長している。最近関心が集中されているプラセンタ注射は、皮膚美容、更年期障害、老化防止などに多様な効果、現代病の約９０％は活性酸素が原因だと言うが、プラセンタエキスの活性酸素除去作用は、現代病の９０％の効果があると言えることができ、プラセンタエキスの自律神経調節作用、内分泌調節作用、免疫復活作用がこの全ての疾病に対して正常に回復させる効果があると知られている。しかし、まだプラセンタエキスの多様な成分の効果に対する十分な研究が行われておらず、法的に強制規定ではないため、食品には薬品のように正確な成分と効果に対する説明が付いていない。抗老化治療に使用されるホルモンが実際このような効果を奏するか否かに対して根拠が確保されていない状態であるため推奨されていない。
【０００６】
本発明のエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、韓国登録特許第１０−０４６３８２５号でエナミネラルＡ活性水の製造方法及びこれを利用した骨粗鬆症の予防及び改善に有用な組成物を出願したことがあり、上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が肝細胞の損傷、また血清中のビタミンＣ減少を抑制する作用で哺乳類の老化進行を抑制する天然素材で、生体老化を防止または抑制する効果に対しては全く知られてない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する、血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物及び健康または健康補助食品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は有効成分としてエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を含有する、血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷防止または肝機能改善用薬学組成物を提供する。
【０００９】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、生体内の血清中のビタミンＣ減少を抑制して老化を防止し、肝細胞の自滅死及び壊死を防止することを特徴とする。
【００１０】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、肝細胞の損傷、自滅死及び壊死を抑制して肝損傷の防止または肝機能を改善することを特徴とする。
【００１１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１２】
本発明は、天然食用海藻類である海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末、イカ骨を主成分として精製し、天然ミネラルを普及するアルカリ水溶液を製造する。韓国登録特許第１０−０４６３８２５号によって製造された物質をエナ活性ミネラルＡ活性水とし、下記の製造方法を参照する。
【００１３】
前記天然食用海藻類は紅藻類で、１００％植物性食用海藻であって、葉緑素の他に紅藻素を含有して紅色、紫色を呈する植物群を称する。体は大概多細胞で、ひも状や葉状を有し、大部分が海産であって、海苔、テングサ、フノリなどが含まれる。さらに、イカ骨は烏賊骨とも称し、イカの中心部にある白色の骨を乾燥させて使用する。
【００１４】
本発明において、前記紅藻類とイカ骨を利用した無機質ミネラルの製造方法は、綺麗に洗浄して乾燥させ、１０００〜２０００℃で１時間加熱焼成することが好ましく、焼成を行なうことで細菌や不純物が完全に燃焼されて除去されると、無機質であるミネラルだけが残るようになるが、これを室温で完全に冷却させた後、粉砕機を利用して微細粉末化する。
【００１５】
次に、焼成されたイカ骨、焼成された紅藻類を用いて微細粉末化されたミネラルを水に溶解させる。前記焼成されたミネラルを溶解させた水をイオン溶液化するためには、８０〜１００℃で揚水機ポンプを使用して、１０気圧以上の圧力による落差を利用して砕けるような方法で１時間以上続けて行うことが好ましい。揚水機のポンプ圧力は、最小１０ｋｇ／ｃｍ２以上である時に効果的である。このようにしてイオン化されたイオン溶液は、沈殿させてから濾過するが、１５時間〜３５時間そのまま放置し、ミネラルスラッジが下に自然に沈殿すると、上澄液である清い液のみを沈殿フィルタを使って濾過させると、アルカリ性を呈するミネラル活性水が製造される。
【００１６】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が体重の変化と生存率の変化の差、動物の骨格の変化と体の転換に及ぶ影響を確認した。具体的な例として、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を、ビタミンＣを供給した１８週齢ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）欠損マウスとビタミンＣを供給しない２６週齢、４６週齢ＳＭＰ３０（老化マーカータンパク質３０）欠損マウスに０％、５％及び１０％の濃度で飲料水を通じて１８週間供給して、実験期間の中、肉眼で現われる変化、体重の変化と生存率を観察し、１８週後に全ての個体を剖検した。
【００１７】
その結果、上記体重の変化と生存率の変化の差は、ビタミンＣを供給したグループで試験物質であるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を投与したグループと投与しないグループとの間の体重の変化及び生存率の差を確認することができなかった。図１を参照する。
【００１８】
しかし、ビタミンＣを供給しないグループでは、体重の変化及び生存率の変化の差は、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の濃度によって平均体重より有意に急激に減少するとともに、生存率も０％で、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の濃度による有意性のある差を確認した。図２乃至図４を参照する。
【００１９】
また、自然に発生することができる老化に係わる臨床症状をＸ−ｒａｙ照射を通じて動物の骨格の変化と体の転換に及ぶ影響を確認した結果、ビタミンＣを供給したマウスのグループ全体では壊血病性骨原障害（ｓｃｏｒｂｕｔｉｃ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を確認することができなかったが、ビタミンＣを供給しないグループ全体では壊血病性骨原（ｓｃｏｒｂｕｔｉｃｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を確認した。図５を参照する。
【００２０】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が生体内血清中のビタミンＣの減少を抑制して老化を防止し、肝細胞の自滅死及び壊死の防止に対する効果を確認した。
【００２１】
まず、上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が血清の中でビタミンＣに及ぶ影響を確認した結果、ビタミンＣを供給したグループでのみ血清の中でビタミンＣを確認することができ、ビタミンＣを供給しないグループでは血清の中にビタミンＣを確認することができなかった。より具体的に、上記ビタミンＣを供給したグループにおける血清の中、総ビタミンＣの数値がエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を投与したグループで賦形剤対照群と比較して統計学的に有意に高い数値を確認した。また、還元型（Ｒｅｄｕｃｅｄ）ビタミンＣ／酸化型（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ）ビタミンＣの割合を示すグラフで賦形剤対照群と比較して還元型（Ｒｅｄｕｃｅｄ）ビタミンＣ／酸化型（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ）ビタミンＣの割合値が濃度依存的に増加することを観察した。これはエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水が生体内ビタミンＣの合成、代謝、分解過程に影響を及ぼし、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の抗酸化機能によって生体内ビタミンＣの酸化が抑制されて老化を防止することを表す結果で、図６及び図７を参照する。
【００２２】
上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、肝細胞の損傷、自滅死及び壊死を抑制して肝損傷の防止または肝機能を改善することを特徴とする。より具体的な例として、雄ＳＭＰ３０欠損マウス週齢別の老化モデルでビタミンＣを供給したグループ及びビタミンＣを供給しないグループ別にエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の供給によるグループ間の１８週の全試験期間にわたって行われる老化過程において現われる組職病理学的変化をマウスの肝を組職切片に作って細胞自滅死程度、細胞損傷程度、抗酸化タンパク質の発現程度の差を確認した。その結果、ビタミンＣを供給したグループ全体では組職病理的異常所見が観察されておらず、グループの間の差も観察されなかった。またタネルアッセイ（Ｔｕｎｅｌ ａｓｓａｙ）陽性細胞をほとんど確認することができなく、正常な肝細胞の細胞質に分布するグリコーゲンを同定が可能だった。しかし、ビタミンＣを供給しないグループでは肥大された肝星細胞と肝細胞の空胞化が正常水準より多数観察され、タネルアッセイ（Ｔｕｎｅｌａｓｓａｙ）陽性細胞を確認した。同時に、肝細胞の細胞質内のグリコーゲン分布程度がエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を供給したグループで有意に肝細胞の細胞質内のグリコーゲン分布が増加したことを観察した。これは、本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水が肝の老化による肝細胞の自滅死と損傷を制御し、肝細胞の機能を正常に維持させて肝細胞質のグリコーゲン分布が正常に維持され、濃度依存的に肝細胞の保護効果が顕著であることを確認した結果である。図８乃至図１３を参考する。
【００２３】
本発明のエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は老化指標であるＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）を抑制する。具体的な例として、代表的な抗酸化タンパク質であるＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現に及ぶ影響を確認した結果、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現がマウスの週齢が高いほど発現が増加することが観察され、４６週齢グループの間でもエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の５％濃度群が賦形剤対照群に比較して、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤが低く発現されることが観察され、濃度依存的にＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現が減少されることが確認された。図１５を参照する。
【００２４】
本発明による上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を有効成分として、薬学組成物の全体の中で０.００１乃至１５重量％であり、好ましくは上記有効成分が０.０１乃至１０重量％で含まれる。
【００２５】
このように製造された薬学組成物の一回投与量は年齢、病変の程度などの個人差や剤形、形態によって適切に調節されることができ、一般の成人に対する一日２回、１回当り０.０１乃至１０００ｍｇの有効含量で使用し、本発明の薬学組成物はカプセル剤、錠剤、咬める錠剤、粉末制、乾燥シロップ、顆粒剤、チューイン錠剤、軟質カプセル制、丸剤、ドリンク剤及び舌下錠に製造されることができる。
【００２６】
本発明の薬学組成物は防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧の調節のための塩または緩衝剤などの薬剤学的補助剤及びその他治療的に有用な物質をさらに含有することができ、通常的な方法によって多様な経口または非経口投与形態に剤形化することができる。
【００２７】
経口投与用剤形としては、例えば錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル制、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤などがあり、これら剤形は有効成分以外に稀釈剤、即ち、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン、潤滑剤、即ち、シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウムまたはカルシウム塩及びポリエチレングリコールを含有している。また、錠剤はケイ酸アルミニウムマグネシウム、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリジンのような結合剤を含有することができ、場合によって澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有することができる。錠剤は、通常混合、顆粒化またはコーティング方法によって製造されることができる。また非経口投与用剤形の代表的なのは注射用剤形で、等張性水溶液または懸濁液が好ましい。
【００２８】
しかし、活性成分の実際投与量は症状の重症度、選択された投与経路、対象の年齢、性別、体重及び健康状態などの多くの関連因子に基づいて決めるものと理解すべきある。
【００２９】
本発明による薬学組成物として適合する投与量は、通常熟練された医者は、皮膚に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明による薬物の１日投与量は、投与しようとする対象のびまん性進行程度、発病時期、年齢、健康状態、余病などの多様な要因によって異なるが、成人を基準にする時、一般的には、上記に言及された重量比に組合された組成物１乃至５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、３０乃至２００ｍｇ／ｋｇを１日１乃至２回分割して投与することができ、上記投与量は、如何なる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
本発明による上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水及び食品学的に許容される食品補助添加剤を含有する健康機能食品を提供し、上記エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を有効成分として含有する錠剤、カプセル制、丸剤または液剤であり、本発明の健康食品の組成物はエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水を有効成分として、健康食品組成物の全体の中、０.００１乃至１０重量％に含有されるもので、食品剤形としては葡萄糖、クエン酸、液状オリゴ糖、コーン‐シロップ（ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）、大豆レシチン、バター、植物性硬化類、脱脂牛乳、砂糖、マーガリン、食塩、澱粉、小麦粉、水飴、麦芽糖、重曹及びショ糖エステルなどの通常使われる成分を利用してドリンク剤、キャラメル、チョコレッド、ダイエットバー剤形または菓子類である健康食品に剤形化されることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、老化による体重減少、斃死、臨床症状、肝細胞の自滅死、肝細胞の損傷、また血清中のビタミンＣ減少を抑制する作用で、哺乳類の老化進行を抑制する天然素材で生体老化を防止または抑制する効果を奏する。
【００３２】
本発明によるエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は、老化による肝臓における肝細胞の損傷、自滅死及び壊死に最も重要な肝細胞を保護することによって根本的な問題を解決することができ、その他臓器には毒性を現わさない天然素材で、肝損傷の防止または肝機能の改善に顕著な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、全試験期間にわたる各グループ動物の週別平均体重の変化を比較したグラフである。
【図２】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、１８週齢になったマウスの １８週の間に測定した各グループの平均生存率を示すグラフである。
【図３】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、２６週齢になったマウスの １８週の間に測定した各グループの平均生存率を示すグラフである。
【図４】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、４８週齢になったマウスの １８週の間に測定した各グループの平均生存率を示すグラフである。
【図５】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水の供給がＳＭＰ３０ノックアウトマウスに及ぶ骨原性障害に対するＸ−ｒａｙ写真である。
【図６】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、１８週になったマウスを剖検して測定した各グループのビタミンＣ全体の割合を示すグラフである。
【図７】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、１８週になったマウスを剖検して測定した各グループの還元型ビタミンＣ／酸化型ビタミンＣの割合を示すグラフである。
【図８】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、それぞれ動物を剖検してエナ活性ミネラルＡ活性水に対するＨ＆Ｅ染色陽性細胞の組職病理学的観察結果である。
【図９】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水のＨ＆Ｅ染色陽性細胞数に及ぶ効果を比較した結果である。
【図１０】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給して、それぞれ動物を剖検した後、エナ活性ミネラルＡ活性水に対するＰＡＳ染色陽性細胞の組職病理学的観察した結果である。
【図１１】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水のＰＡＳ染色陽性細胞数に及ぶ効果を比較した結果である。
【図１２】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給して、それぞれ動物を剖検した後、エナ活性ミネラルＡ活性水に対するタネル（Ｔｕｎｅｌ）染色陽性細胞の組職病理学的観察結果である。
【図１３】本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水のタネル（Ｔｕｎｅｌ）染色陽性細胞数に及ぶ効果を比較した結果である。
【図１４】は本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水を供給した後、肝でＳＭＰ３０発現に及ぶエナ活性ミネラルＡ活性水の效能に対する組職病理学的観察した結果である。
【図１５】特殊タンパク質検出検査（免疫ブロット）を利用した本発明によるエナ活性ミネラルＡ活性水の供給がＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤの発現に及ぶ効果を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
「製造例１」エナ活性ミネラルＡ活性水の製造
綺麗に洗浄して乾燥させたコウイカ骨と紅藻類をそれぞれ粉碎して粉末に製造した後、１１００℃で１時間加熱焼成する。上記焼成されたコウイカ骨と紅藻類を室温で完全に冷却させた後、粉砕機を利用して微細な粉末に製造した。前記紅藻類は、海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末を同一の量で混合して使用した。
【００３５】
水５００ｌに焼成されたコウイカ骨の微細粉末を１．５ｋｇ、焼成された紅藻類の微細粉末を４ｋｇを投入し、攪拌して溶解させた。この溶液を９０℃で揚水機ポンプを利用して１０気圧の圧力で落差を発生させ、粒子が砕けるような方法で２時間粉砕してイオン溶液を製造し、イオン溶液を２４時間放置した後、反応器内の上層の清い液を沈殿フィルタを利用して濾過し、ミネラル活性水を製造した。
【００３６】
上記製造されたミネラル活性水をエナ活性ミネラルＡ活性水とし、ミネラルの成分を分析した結果を表１に示した。
【表１】
【００３７】
上記表１から明らかなように、本発明によるイオン溶液はpHが１２．８５のアルカリ溶液であり、特に、カルシウム成分の含量が高く、人体に有益な多様な金属イオンを多量含んでいることが分かる。
【００３８】
［実施形態］
（１）試験係
１）種及び系統
特定病原体不在（ＳＰＦ）雄１８，２６，４６週齢ＳＭＰ３０ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス
【００３９】
２）供給源
Ｔｏｋｙｏ Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ（３５−２ Ｓａｋａｅ−ｃｈｏ、Ｉｔａｂａｓｈｉ−ｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、１７３−００１５、Ｊａｐａｎ）から供給され、自体遺伝子検定を経った後交配して、自ら生産したマウスである。
【００４０】
３）試験係の選択理由
本試験に使用されるマウスはＳＭＰ３０欠損動物であって、正常なマウスより老化が早く進行されて、老化実験動物モデルとして豊かな試験基礎資料があり、試験結果の解釈にこれを利用することができる。
【００４１】
４）検疫及び馴化
ＳＭＰ３０ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）マウスはＴｏｋｙｏ Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙでＳＭＰ３０ ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを雄１０匹、雌２０匹を分譲して慶北大学獣医科大学病理学教室動物室で繁殖させた。繁殖を通じて生まれたＦ１マウスの中にＰＣＲを利用したテール（ｔａｉｌ）ＤＮＡ遺伝型分析を通じて、ＳＭＰ３０ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）マウスのみ選別した。
【００４２】
５）動物の遺伝型分析
動物の遺伝型分析はテール（ｔａｉｌ）ＤＮＡを使用したＰＣＲ方法を通じて実施された。ゲノムＤＮＡは、文献に知られているように、複合的方法によってマウスの尾から抽出した。マウスの尾を生検して、−８０℃で最小１５分間冷凍させた。その後、各サンプルごとに３００μｌの分解緩衝制（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.０；５００ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％ ＳＤＳ；０.２ｍｇ／ｍｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ； １ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を添加した。サンプルの細胞溶解は５６℃ ＣＯ２インキュベーターで５時間震動して反応させた。細胞の溶解後、それぞれのサンプルは常温で１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて、サンプルの組職残骸を除去した。その後、上層液を分離した後、５００μｌのイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加して、ゲノムＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄した。サンプルは１０分間遠心分離させた。上層液を除去した後、
沈澱されたペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を常温で乾燥させた。ペレットは ５０μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８.５）に溶解させて、６５℃で５分間放置させた。分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＵＳＡ）を利用してゲノムＤＮＡを定量化した後、ＤＮＡを２５０ｎｇ／ｕｌの濃度に稀釈させ、稀釈されたＤＮＡに１μｌのＰＣＲ 混合物を添加した。ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）の確認はプライマＴＡ４（５′−ＣＡＡＧＴＡＡＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＧＧＡＣ−３′）、ＴＳ３（５′−ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴ−３′）、ＮＥＯ（５′−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３′）を使用した。
【００４３】
（２）飼育環境
１）環境条件
本試験に使用したマウスの場合には、温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、照明時間１２時間(０８：００点灯〜２０：００消灯)として設定された自動温湿度調節装置が設置された慶北大学獣医科大学病理学教室の動物室で、馴化及び飼育された。飼育環境は全試験期間にわたって試験に影響を及ぼすと思われる変動は認められなかった。
【００４４】
２）飼育箱、飼育密度及び飼育箱の識別
全試験期間の間ポリカーボネート製飼育箱（２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈｍｍ）に５匹以下ずつ収容した。個体識別は油性マジックペンを利用した尾部表示法と飼育箱別個体識別カード表示法を利用した。
【００４５】
３）飼料及び水
イ）飼料の給与方法
飼料は実験動物用固形飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、５０５ Ｎｏｒｔｈ ４ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｉｎ ４７３７４、ＵＳＡ）を放射線照射（１３.２ｋＧｙ）滅菌して自由に攝取させた。
ロ）水の給与方法
水は上水道水を瓶を利用して自由に攝取させた。
【００４６】
（３）試験群の構成及び投与
実験Ａと実験Ｂに構成されて実施され、実験Ａは１８週齢、雄、ＳＭＰ３０ノックアウト Ｃ５７ＢＬ／６マウスが実験に使用され、対照群、実験群１、実験群２の三つのグループに８匹ずつ区分した。実験Ｂは２６，４６週齢、雄、ＳＭＰ３０ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスが実験に使用され、各週齢別に、実験Ａと同一に対照群、実験群１、実験群２の三つのグループで分けられて、２６週齢は４匹ずつ三つのグループに区分し、４６週齢は、６匹ずつ三つのグループに区分した。実験に使われたエナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水は上記製造例１で製造されたもので、エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水の原液を上水道水に各５％と１０％に稀釈して、１８週の実験の全試験期間にわたって自由に摂取するようにした。１８週目に全ての実験動物の剖検を実施し、病理組職学的検査のために各動物ごとに血液と臓器サンプルを採取した。
【００４７】
【表２】
【表３】
【００４８】
（４）観察及び実験検査項目
１）試験物質が体重の変化に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、週に一回体重を測定することによって体重の変化を観察した。その結果は下記の表１に示した。
【００４９】
２）試験物質が老化に係わる臨床症状に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、自然に発生することができる老化に係わる臨床症状を観察するために、Ｘ−ｒａｙ照射を通じて動物の骨格の変化と体の転換に試験物質が及ぶ影響を観察した。
【００５０】
３）試験物質が生存率に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、全てのグループの間の生存率の変化と差を観察した。その結果は下記の表４に示した。
【００５１】
【表４】
【００５２】
４）試験物質が血清ビタミンＣに及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって、試験物質が血清のビタミンＣのレベルに及ぶ影響を観察するために、血液試料を遠心分離（３０００ｇ、１５分）を通じて血清を分離した後、血清１００μｌに３％メタリン酸（ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）４５０μｌを処理して遠心分離機で１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した後、その上層液９０μｌと０.１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１６.４μｌを混合して、氷に３０分程度放置した後、３％メタリン酸（ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄ）９５７.６μｌをさらに添加する。遠心分離機で１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した後、その上層液９００μｌを取ってＳｈｏｄｅｘ−５ＳＩＬ−４Ｅ ｃｏｌｕｍｎ（４.６２５０ｍｍ；Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ，Ｔｏｋｙｏ）を用いたｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｍｏａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）法を通じて血中ビタミンＣのレベルを測定した。
【００５３】
５）試験物質が肝臓での老化による組職学的変化に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで、１８週の全試験期間にわたって行われる老化過程に肝で現われる組職病理学的変化を観察するためにヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色、ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ）染色、タネルアッセイ（Ｔｕｎｅｌ ａｓｓａｙ）染色法、免疫組織化学法を実施した。上記染色法を実施して光学顕微鏡で観察して各染色法による陽性反応を現わす細胞を計算してグループの間の細胞自滅死程度、細胞損傷程度、抗酸化タンパク質の発現程度の差を観察した。全ての病理学的観察はダブルスクリーン（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｃｒｅｅｎ）を実施した。その結果は下記表５に示した。
【００５４】
【表５】
【００５５】
６）試験物質が肝臓での抗酸化タンパク質の発現に及ぶ影響
雄ＳＭＰ３０欠損マウス老化モデルで１８週の試験期間以後に代表的な抗酸化タンパク質である活性酸素除去酵素（スーパーオキシドディスムターゼ、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ）の発現に及ぶ影響を観察するため−７０℃に冷凍された肝組織を０.１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、Ｎａ３Ｖｏ４）とプロテアーゼ阻害混合錠剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット）（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を溶解させたＲＩＰＡバッファーに均質化させた。上記均質化された肝臓サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離して脂肪を除去して上層液を取った後、上層液を再び１４、０００ｒｐｍ、４℃で、２０分間遠心分離して上層液を取った。タンパク質定量分析（ブラッドフォード法）を利用してタンパク質の濃度を測定し、各タンパク質のサンプルを８０ｕｇ／ｗｅｌｌで、１０％ＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した。特殊タンパク質検出検査（免疫ブロット）のために電気泳動されたゲル内のタンパク質をＰＶＤＦメンブレイン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に電子伝達させた。３％のウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をトリス緩衝食塩水に溶解させたブロッキング溶液に１時間ブロッキングする過程の後にＣｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ（１：１００、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｃａｎａｄａ）、β−チューブリン（１：１０００Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）に反応させた。０.５％ ツイン２００が溶解されたＴＢＳ緩衝溶液に充分に洗浄し、一次抗体に対応する二次抗体（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１：１０００乃至１：２０００の割合で稀釈して室温で１時間反応させた。再びＴＢＳ緩衝溶液で充分に洗浄した後、特異的な反応を観察するために、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ、ＩＬ、ＵＳＡ）と反応させ、メディカルＸ−ｒａｙフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に露出させた。
【００５６】
（５）統計学的方法
得られた資料に対する統計分析は対応標本ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ Ｔ−ｔｅｓｔ）を利用して、互いに独立でない二つの集団の間の平均の差を分析した。Ｔ検定（Ｔ−ｔｅｓｔ）は二つの集団の平均の差を二つの集団の分散で標準化させた値を統計的に検定することで、二つの集団の分散が同一である時と二つの集団の分散が同一でない時の二つの場合があり、このような分析は統計プログラムであるＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３。０５、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ。）を利用して実施した。検定の危険率は５％及び１％に決めた。
【００５７】
［薬学組成物剤形例１］錠剤
エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水８０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動床乾燥機を利用して顆粒化した後、ショ糖エステル（ｓｕｇａｒ ｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加して打錠機で打錠した。内容物の最終重量は６００ｍｇとする。
【００５８】
［健康食品組成物剤形２］ドリンク剤
エナ活性ミネラルＡ（ＥＮＡ ａｃｔｉｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａ）活性水８０ｍｇ、葡萄糖１０ｍｇ、クエン酸０.６ｇ及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつなるように充填した。瓶に充填した後１３０℃で４乃至５秒間殺菌して飲料を製造した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イカ骨、海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末の中から選択される何れか一つ以上を破鎖粉末化して、１０００乃至２０００℃で加熱焼成し、これを冷却及び粉末化して、８０乃至１００℃の水に投入した後、揚水機ポンプを利用して、１０気圧以上の圧力で落差を利用して砕けるような方法でイオン溶液化した後濾過して得られたアルカリ性水溶液；を有効成分として含有することを特徴とする血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用薬学組成物。
【請求項２】
上記アルカリ性水溶液の含有量は薬学組成物の全体において０.００１乃至１５重量％であることを特徴とする請求項１に記載の血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用薬学組成物。
【請求項３】
上記薬学組成物はカプセル剤、錠剤、チューイング錠、粉末制、乾燥シロップ、顆粒剤、チューイング錠、軟質カプセル剤、丸剤、ドリンク剤及び舌下錠から選択されることを特徴とする請求項２に記載の血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用薬学組成物。
【請求項４】
イカ骨、海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末の中から選択される何れか一つ以上を破鎖粉末化して、１０００乃至２０００℃で加熱焼成し、これを冷却及び粉末化して、８０乃至１００℃の水に投入した後、揚水機ポンプを利用して、１０気圧以上の圧力で落差を利用して砕けるような方法でイオン溶液化した後濾過して得られたアルカリ性水溶液を有効成分として含有することを特徴とする血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用健康または健康補助食品。
【請求項５】
上記健康または健康補助食品は、ドリンク剤、キャラメル、チョコレッド、ダイエットバー剤形または菓子類から選択されることを特徴とする請求項４に記載の血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能改善用健康または健康補助食品。
【請求項１】
イカ骨、海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末の中から選択される何れか一つ以上を破鎖粉末化して、１０００乃至２０００℃で加熱焼成し、これを冷却及び粉末化して、８０乃至１００℃の水に投入した後、揚水機ポンプを利用して、１０気圧以上の圧力で落差を利用して砕けるような方法でイオン溶液化した後濾過して得られたアルカリ性水溶液；を有効成分として含有することを特徴とする血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用薬学組成物。
【請求項２】
上記アルカリ性水溶液の含有量は薬学組成物の全体において０.００１乃至１５重量％であることを特徴とする請求項１に記載の血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用薬学組成物。
【請求項３】
上記薬学組成物はカプセル剤、錠剤、チューイング錠、粉末制、乾燥シロップ、顆粒剤、チューイング錠、軟質カプセル剤、丸剤、ドリンク剤及び舌下錠から選択されることを特徴とする請求項２に記載の血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用薬学組成物。
【請求項４】
イカ骨、海苔、テングサ、オゴノリ、ウミゾウメン、ウシケノリ、ムカデノリ、スギノリ、イギス及び紅藻緑末の中から選択される何れか一つ以上を破鎖粉末化して、１０００乃至２０００℃で加熱焼成し、これを冷却及び粉末化して、８０乃至１００℃の水に投入した後、揚水機ポンプを利用して、１０気圧以上の圧力で落差を利用して砕けるような方法でイオン溶液化した後濾過して得られたアルカリ性水溶液を有効成分として含有することを特徴とする血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能の改善用健康または健康補助食品。
【請求項５】
上記健康または健康補助食品は、ドリンク剤、キャラメル、チョコレッド、ダイエットバー剤形または菓子類から選択されることを特徴とする請求項４に記載の血清ビタミンＣ減少抑制による抗老化、または肝細胞の損傷、自滅死または壊死抑制による肝損傷の防止または肝機能改善用健康または健康補助食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１５】
【図５】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１５】
【図５】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５１４９００（Ｐ２０１１−５１４９００Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４９５９０（Ｐ２０１０−５４９５９０）
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００５２８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３２９６４
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１０２０３６８１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００５２８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３２９６４
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１０２０３６８１）
【Ｆターム（参考）】
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