エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤
【課題】天然抽出物を含有するエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供する。
【解決手段】エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤に、ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有せしめる。
【解決手段】エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤に、ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有せしめる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シミ、ソバカス、日焼け後の皮膚色素沈着症等は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化することにより、メラニンの産生が著しく亢進した結果として生じるものであり、中高年齢層における肌の悩みの一つになっている。
【０００３】
従来の美白剤開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきたが、近年、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトから産生され、メラノサイトを活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、一酸化窒素（ＮＯ）等が知られており、これらが関与する情報伝達系を遮断することによりメラニンの産生を抑制して美白効果を導く各種作用剤の開発が盛んに行われてきている。
【０００４】
また、循環器系疾患（例えば、心筋梗塞、高血圧、虚血性心疾患等）や腎疾患（例えば、急性腎不全等）の患者において、血中エンドセリン−１（ＥＴ−１）濃度が上昇していることが知られているため、エンドセリン−１（ＥＴ−１）の過剰分泌を抑制すること、すなわちエンドセリン−１ｍＲＮＡの発現上昇を抑制することによって、これらの疾患の予防・治療効果が期待できると考えられる。
【０００５】
このような考えに基づき、エンドセリン−１（ＥＴ−１）のメラノサイトへの作用を阻害する生薬としては、カミツレ抽出物・アルテア抽出物（非特許文献１参照）等が知られており、表皮ケラチノサイトからのエンドセリン−１（ＥＴ−１）産生を抑制する生薬としては、ジユ抽出物（非特許文献１参照）、β−グリチルレチン酸ステアリル（特許文献１参照）等が知られている。
【０００６】
皮膚は角層、表皮、基底膜及び真皮から構成されている。基底膜は表皮真皮境界部に存在し、表皮と真皮を繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献２参照）。基底膜の主要骨格はＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。基底膜と表皮の境界に存在し、基底膜と表皮を繋ぎとめているのがラミニン５を主成分とする各種糖蛋白質である。若い皮膚においては、基底膜の働きにより表皮、真皮の相互作用が恒常性を保つことで水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００７】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンや、ラミニン５は分解・変質を起こし、基底膜構造が破壊される（非特許文献３参照）。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるから、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化が関与している。
【０００８】
近年の研究により、この変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、ゼラチナーゼ群に属する酵素であるＭＭＰ−９は、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンやラミニン５を分解する酵素として知られているが、その発現及び活性は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献４参照）。
【０００９】
したがって、ＭＭＰ９ｍＲＮＡの発現上昇を抑制することにより基底膜成分の減少、基底膜の構造変化を抑制し、皮膚機能を改善する物質の開発が望まれている。
【００１０】
このような考えに基づき、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有するものとしては、例えば、黒霊芝抽出物（特許文献２参照）、クリ渋皮発酵物からの抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【００１１】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、ヒアルロン酸、コラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、線維芽細胞の増殖が活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより、水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【００１２】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化現象を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少・変性が関与している。したがって、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進することにより皮膚の老化を防止及び／又は改善することができると考えられる。
【００１３】
従来、コラーゲン産生促進作用を有する生薬として、五斂子抽出物（特許文献４参照）が知られている。
【００１４】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸，加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献５参照）。
【００１５】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献６参照）。
【００１６】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの産生促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができると期待されている。
【００１７】
このようなプロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用を有するものとしては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）等が知られており、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進作用を有するものとしては、例えば、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）等が知られている。
【００１８】
皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。
【００１９】
ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。
【００２０】
しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献７参照）。このような考えに基づき、ＡＱＰ３発現促進作用を有するものとして、例えば、トコフェリルレチノエート（特許文献８参照）、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献９参照）等が知られている。
【特許文献１】特開２００４−３０００４８号公報
【特許文献２】特開２００５−２９８３９１号公報
【特許文献３】特開２００４−３５２６３４号公報
【特許文献４】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【特許文献８】特開２００６−２９０８７３号公報
【特許文献９】特開２００４−１６８７３２号公報
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル」，2000年，Vol.28，No.9，p.65-71
【非特許文献２】Marinkovich MP et al.，「J. Cell. Biol.」，1992年，Vol.199，p.695-703
【非特許文献３】Lavker et al.，「J. Invest. Dermatol.」，1979年，Vol.73，p.59-66
【非特許文献４】Gary J. Fisher et al.，「Nature」，1996年，Vol.379，No.25，p.335
【非特許文献５】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献６】「Arch. Dermatol. Res.」，1996年，Vol.288，p.442-446
【非特許文献７】"フレグランスジャーナル"，2006年，Vol.34，No.10，p.19-23
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、安全性の高い天然物の中からエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するため、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進は、ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ブッチャーズブルーム抽出物エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進を有効成分として含有し、安全性に優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について説明する。
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有する。
【００２５】
ここで本発明において「抽出物」には、ブッチャーズブルームを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２６】
本発明において使用する抽出原料は、ブッチャーズブルームである。
ブッチャーズブルーム（学名：Ruscus aculeatus L.，別名：ナギイカダ）は、地中海沿岸の南欧、北アフリカ等に分布しているユリ科ナギイカダ属に属する多年生の常緑低木であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るブッチャーズブルームの構成部位としては、例えば、葉部、花部、樹皮部、枝部、根茎部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは根茎部である。
【００２７】
上記抽出原料からの抽出物に含有されるエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、天然物の抽出に一般に使用されている抽出方法によって、上記抽出原料からこれらの作用を有する抽出物を得ることができる。
【００２８】
例えば、上記抽出原料を必要に応じて乾燥した後、そのまま又は粗砕機を使用して粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する抽出物を得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を使用して行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、上記抽出原料の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２９】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００３０】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００３１】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００３２】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００３３】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００３４】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００３５】
ブッチャーズブルーム抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００３６】
以上のようにして得られるブッチャーズブルーム抽出物は、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、これらの作用を利用してエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用することができる。
【００３７】
また、ブッチャーズブルーム抽出物は、そのエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を利用して、エンドセリン−１ｍＲＮＡの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤（例えば、心筋梗塞、高血圧等の循環器系疾患の予防・治療剤等）の有効成分として用いることもできる。
【００３８】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物のみからなるものであってもよいし、ブッチャーズブルーム抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００３９】
ブッチャーズブルーム抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を使用することができる。また、ブッチャーズブルーム抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００４０】
なお、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として使用することができる。
【００４１】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００４２】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、エンドセリン−１の産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）等を予防・改善することができる。また、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、心筋梗塞、高血圧等の循環器系疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にも、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４３】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡの発現を抑制することができるため、これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にもマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００４４】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するコラーゲン産生促進作用を通じて、コラーゲンの産生を促進することができる。これにより、皮膚組織におけるコラーゲンの産生量が増加し、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のコラーゲン産生促進剤は、これらの用途以外にも、コラーゲン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４５】
本発明のプロフィラグリン産生促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するプロフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのプロフィラグリンの産生を促進し、プロフィラグリンの加水分解により得られるフィラグリン量を増加させ、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、乾燥肌、しわ、肌荒れ等を予防・改善することができる。ただし、本発明のプロフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４６】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのフィラグリンの産生を促進し、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、乾燥肌、しわ、肌荒れ等を予防・改善することができる。ただし、本発明のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４７】
本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、アクアポリン３ｍＲＮＡの発現を促進することができるため、皮膚の水分保持能やバリア機能を改善することができ、それにより皮膚の乾燥、しわの形成、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができる。ただし、本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４８】
なお、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４９】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の試験例に何ら制限されるものではない。なお、本試験例においては、ブッチャーズブルーム抽出物としてブッチャーズ・ブルーム抽出液（製品名，丸善製薬社製）の凍結乾燥品を使用した（試料１）。
【００５０】
〔試験例１〕エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を試験した。
【００５１】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermis Keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００５２】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度は下記表を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００５３】
この総ＲＮＡを鋳型とし、エンドセリン−１及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler （Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。エンドセリン−１のｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制率（％）を算出した。
【００５４】
ｍＲＮＡ発現抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、特に低濃度（１μｇ／ｍＬ）において優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を有することが確認された。
【００５７】
〔試験例２〕マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を試験した。
【００５８】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermis Keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００５９】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度：１μｇ／ｍＬ）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００６０】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＭＭＰ−９及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler （Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。ＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制率（％）を算出した。なお、ＭＭＰ−９のプライマーとしては、下記のものを用いた。
Ｆ：acgcacgacgtcttccagta
Ｒ：caactcactccgggaactca
【００６１】
ｍＲＮＡ発現抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
【００６２】
上記試験の結果、ブッチャーズブルーム抽出物のＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制率は、４２．６％であった。このことから、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を有することが確認された。
【００６３】
〔試験例３〕コラーゲン産生促進作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてコラーゲン産生促進作用を試験した。
【００６４】
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地にて１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加し、３日間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの培地中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。同様にして試料溶液を添加せずに培養し、Ｉ型コラーゲン量を測定した。得られた測定結果から、下記式に基づきコラーゲン産生促進率（％）を算出した。
【００６５】
コラーゲン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時のＩ型コラーゲン量」を表し、Ｂは「試料無添加時のＩ型コラーゲン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
表２に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたコラーゲン産生促進作用を有することが確認された。特に、試料濃度１００〜２００μｇ／ｍＬの範囲内であれば、有意なコラーゲン産生促進作用を有することが確認された。
【００６８】
〔試験例４〕プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用を試験した。
【００６９】
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬの細胞密度になるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で３日間培養した。培養後、培地を０．５％ＤＭＳＯに溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）を含むＫＧＭ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調整を行った。
【００７０】
＜ウエスタンブロッティング＞
１０μｇ／列に調整したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Harbor Bio-Products社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Whole Ab，Amersham Biosciences社製）及びストレプトアビジンーペルオキシダーゼ複合体（CALBIOCHEM社製）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）で１０００倍に希釈して順次反応させ、ECL Western blotting detection reagents and analysis system（Amersham Biosciences社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをKODAK 1D Image Analysis Software EDAS290 Version3.5にて定量的に測定した。
【００７１】
結果は、試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのNet intensity（バンド強度）を合算した値を用いて、試料のプロフィラグリン産生促進作用を評価し、プロフィラグリン産生促進率（％）を下記式に基づいて算出した。
【００７２】
プロフィラグリン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時のNet intensity（プロフィラグリン及びフィラグリンの合計値）」を、Ｂは「試料無添加時（コントロール）のNet intensity」を表す。
上記試験結果を表３に示す。
【００７３】
【表３】
【００７４】
表３に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたプロフィラグリン産生促進作用を有することが確認された。また、ブッチャーズブルーム抽出物が有するプロフィラグリン産生促進作用は、当該抽出物の濃度に依存することが確認された。なお、フィラグリンは、生体内でプロフィラグリンの加水分解により産生されるものであることから、プロフィラグリン産生促進作用を有するブッチャーズブルーム抽出物は、プロフィラグリンの産生を促進し、細胞内におけるプロフィラグリン量を増加させることで、フィラグリン量をも増加させることができ、結果としてフィラグリン産生促進作用を有するものと考えられる。
【００７５】
〔試験例５〕アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてアクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００７６】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Epilife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。
【００７７】
EpiLife-KG2を用いて回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Epilife-KG2で必要濃度に溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００７８】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３（aquaporin3）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＡＱＰ３の発現量は、「試料無添加」で及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００７９】
ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
表４に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の老化、乾燥肌、しわ、肌荒れ等の予防又は改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シミ、ソバカス、日焼け後の皮膚色素沈着症等は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化することにより、メラニンの産生が著しく亢進した結果として生じるものであり、中高年齢層における肌の悩みの一つになっている。
【０００３】
従来の美白剤開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきたが、近年、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトから産生され、メラノサイトを活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、一酸化窒素（ＮＯ）等が知られており、これらが関与する情報伝達系を遮断することによりメラニンの産生を抑制して美白効果を導く各種作用剤の開発が盛んに行われてきている。
【０００４】
また、循環器系疾患（例えば、心筋梗塞、高血圧、虚血性心疾患等）や腎疾患（例えば、急性腎不全等）の患者において、血中エンドセリン−１（ＥＴ−１）濃度が上昇していることが知られているため、エンドセリン−１（ＥＴ−１）の過剰分泌を抑制すること、すなわちエンドセリン−１ｍＲＮＡの発現上昇を抑制することによって、これらの疾患の予防・治療効果が期待できると考えられる。
【０００５】
このような考えに基づき、エンドセリン−１（ＥＴ−１）のメラノサイトへの作用を阻害する生薬としては、カミツレ抽出物・アルテア抽出物（非特許文献１参照）等が知られており、表皮ケラチノサイトからのエンドセリン−１（ＥＴ−１）産生を抑制する生薬としては、ジユ抽出物（非特許文献１参照）、β−グリチルレチン酸ステアリル（特許文献１参照）等が知られている。
【０００６】
皮膚は角層、表皮、基底膜及び真皮から構成されている。基底膜は表皮真皮境界部に存在し、表皮と真皮を繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献２参照）。基底膜の主要骨格はＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。基底膜と表皮の境界に存在し、基底膜と表皮を繋ぎとめているのがラミニン５を主成分とする各種糖蛋白質である。若い皮膚においては、基底膜の働きにより表皮、真皮の相互作用が恒常性を保つことで水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００７】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンや、ラミニン５は分解・変質を起こし、基底膜構造が破壊される（非特許文献３参照）。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるから、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化が関与している。
【０００８】
近年の研究により、この変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、ゼラチナーゼ群に属する酵素であるＭＭＰ−９は、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンやラミニン５を分解する酵素として知られているが、その発現及び活性は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献４参照）。
【０００９】
したがって、ＭＭＰ９ｍＲＮＡの発現上昇を抑制することにより基底膜成分の減少、基底膜の構造変化を抑制し、皮膚機能を改善する物質の開発が望まれている。
【００１０】
このような考えに基づき、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有するものとしては、例えば、黒霊芝抽出物（特許文献２参照）、クリ渋皮発酵物からの抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【００１１】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、ヒアルロン酸、コラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、線維芽細胞の増殖が活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより、水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【００１２】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化現象を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少・変性が関与している。したがって、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進することにより皮膚の老化を防止及び／又は改善することができると考えられる。
【００１３】
従来、コラーゲン産生促進作用を有する生薬として、五斂子抽出物（特許文献４参照）が知られている。
【００１４】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸，加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献５参照）。
【００１５】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献６参照）。
【００１６】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの産生促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができると期待されている。
【００１７】
このようなプロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用を有するものとしては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）等が知られており、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進作用を有するものとしては、例えば、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）等が知られている。
【００１８】
皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。
【００１９】
ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。
【００２０】
しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献７参照）。このような考えに基づき、ＡＱＰ３発現促進作用を有するものとして、例えば、トコフェリルレチノエート（特許文献８参照）、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献９参照）等が知られている。
【特許文献１】特開２００４−３０００４８号公報
【特許文献２】特開２００５−２９８３９１号公報
【特許文献３】特開２００４−３５２６３４号公報
【特許文献４】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【特許文献８】特開２００６−２９０８７３号公報
【特許文献９】特開２００４−１６８７３２号公報
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル」，2000年，Vol.28，No.9，p.65-71
【非特許文献２】Marinkovich MP et al.，「J. Cell. Biol.」，1992年，Vol.199，p.695-703
【非特許文献３】Lavker et al.，「J. Invest. Dermatol.」，1979年，Vol.73，p.59-66
【非特許文献４】Gary J. Fisher et al.，「Nature」，1996年，Vol.379，No.25，p.335
【非特許文献５】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献６】「Arch. Dermatol. Res.」，1996年，Vol.288，p.442-446
【非特許文献７】"フレグランスジャーナル"，2006年，Vol.34，No.10，p.19-23
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、安全性の高い天然物の中からエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するため、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進は、ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ブッチャーズブルーム抽出物エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進を有効成分として含有し、安全性に優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について説明する。
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有する。
【００２５】
ここで本発明において「抽出物」には、ブッチャーズブルームを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２６】
本発明において使用する抽出原料は、ブッチャーズブルームである。
ブッチャーズブルーム（学名：Ruscus aculeatus L.，別名：ナギイカダ）は、地中海沿岸の南欧、北アフリカ等に分布しているユリ科ナギイカダ属に属する多年生の常緑低木であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るブッチャーズブルームの構成部位としては、例えば、葉部、花部、樹皮部、枝部、根茎部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは根茎部である。
【００２７】
上記抽出原料からの抽出物に含有されるエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、天然物の抽出に一般に使用されている抽出方法によって、上記抽出原料からこれらの作用を有する抽出物を得ることができる。
【００２８】
例えば、上記抽出原料を必要に応じて乾燥した後、そのまま又は粗砕機を使用して粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する抽出物を得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を使用して行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、上記抽出原料の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２９】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００３０】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００３１】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００３２】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００３３】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００３４】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００３５】
ブッチャーズブルーム抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００３６】
以上のようにして得られるブッチャーズブルーム抽出物は、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、これらの作用を利用してエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用することができる。
【００３７】
また、ブッチャーズブルーム抽出物は、そのエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を利用して、エンドセリン−１ｍＲＮＡの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤（例えば、心筋梗塞、高血圧等の循環器系疾患の予防・治療剤等）の有効成分として用いることもできる。
【００３８】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物のみからなるものであってもよいし、ブッチャーズブルーム抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００３９】
ブッチャーズブルーム抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を使用することができる。また、ブッチャーズブルーム抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００４０】
なお、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用、コラーゲン産生促進作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として使用することができる。
【００４１】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００４２】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、エンドセリン−１の産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）等を予防・改善することができる。また、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、心筋梗塞、高血圧等の循環器系疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にも、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４３】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡの発現を抑制することができるため、これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にもマトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００４４】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するコラーゲン産生促進作用を通じて、コラーゲンの産生を促進することができる。これにより、皮膚組織におけるコラーゲンの産生量が増加し、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防・改善することができる。ただし、本発明のコラーゲン産生促進剤は、これらの用途以外にも、コラーゲン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４５】
本発明のプロフィラグリン産生促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するプロフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのプロフィラグリンの産生を促進し、プロフィラグリンの加水分解により得られるフィラグリン量を増加させ、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、乾燥肌、しわ、肌荒れ等を予防・改善することができる。ただし、本発明のプロフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４６】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのフィラグリンの産生を促進し、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、乾燥肌、しわ、肌荒れ等を予防・改善することができる。ただし、本発明のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４７】
本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブッチャーズブルーム抽出物が有するアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、アクアポリン３ｍＲＮＡの発現を促進することができるため、皮膚の水分保持能やバリア機能を改善することができ、それにより皮膚の乾燥、しわの形成、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができる。ただし、本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４８】
なお、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４９】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の試験例に何ら制限されるものではない。なお、本試験例においては、ブッチャーズブルーム抽出物としてブッチャーズ・ブルーム抽出液（製品名，丸善製薬社製）の凍結乾燥品を使用した（試料１）。
【００５０】
〔試験例１〕エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を試験した。
【００５１】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermis Keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００５２】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度は下記表を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００５３】
この総ＲＮＡを鋳型とし、エンドセリン−１及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler （Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。エンドセリン−１のｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制率（％）を算出した。
【００５４】
ｍＲＮＡ発現抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、特に低濃度（１μｇ／ｍＬ）において優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を有することが確認された。
【００５７】
〔試験例２〕マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を試験した。
【００５８】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermis Keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００５９】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度：１μｇ／ｍＬ）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００６０】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＭＭＰ−９及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler （Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。ＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現量は、紫外線未照射・試料無添加、紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに紫外線未照射・試料無添加の補正値を１００とした時の紫外線照射・試料無添加及び紫外線照射・試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制率（％）を算出した。なお、ＭＭＰ−９のプライマーとしては、下記のものを用いた。
Ｆ：acgcacgacgtcttccagta
Ｒ：caactcactccgggaactca
【００６１】
ｍＲＮＡ発現抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中Ａは「紫外線未照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｂは「紫外線照射・試料無添加時の補正値」を表し、Ｃは「紫外線照射・試料添加時の補正値」を表す。
【００６２】
上記試験の結果、ブッチャーズブルーム抽出物のＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制率は、４２．６％であった。このことから、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現抑制作用を有することが確認された。
【００６３】
〔試験例３〕コラーゲン産生促進作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてコラーゲン産生促進作用を試験した。
【００６４】
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地にて１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加し、３日間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの培地中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。同様にして試料溶液を添加せずに培養し、Ｉ型コラーゲン量を測定した。得られた測定結果から、下記式に基づきコラーゲン産生促進率（％）を算出した。
【００６５】
コラーゲン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時のＩ型コラーゲン量」を表し、Ｂは「試料無添加時のＩ型コラーゲン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
表２に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたコラーゲン産生促進作用を有することが確認された。特に、試料濃度１００〜２００μｇ／ｍＬの範囲内であれば、有意なコラーゲン産生促進作用を有することが確認された。
【００６８】
〔試験例４〕プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用を試験した。
【００６９】
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬの細胞密度になるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で３日間培養した。培養後、培地を０．５％ＤＭＳＯに溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）を含むＫＧＭ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調整を行った。
【００７０】
＜ウエスタンブロッティング＞
１０μｇ／列に調整したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Harbor Bio-Products社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Whole Ab，Amersham Biosciences社製）及びストレプトアビジンーペルオキシダーゼ複合体（CALBIOCHEM社製）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）で１０００倍に希釈して順次反応させ、ECL Western blotting detection reagents and analysis system（Amersham Biosciences社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをKODAK 1D Image Analysis Software EDAS290 Version3.5にて定量的に測定した。
【００７１】
結果は、試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのNet intensity（バンド強度）を合算した値を用いて、試料のプロフィラグリン産生促進作用を評価し、プロフィラグリン産生促進率（％）を下記式に基づいて算出した。
【００７２】
プロフィラグリン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時のNet intensity（プロフィラグリン及びフィラグリンの合計値）」を、Ｂは「試料無添加時（コントロール）のNet intensity」を表す。
上記試験結果を表３に示す。
【００７３】
【表３】
【００７４】
表３に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたプロフィラグリン産生促進作用を有することが確認された。また、ブッチャーズブルーム抽出物が有するプロフィラグリン産生促進作用は、当該抽出物の濃度に依存することが確認された。なお、フィラグリンは、生体内でプロフィラグリンの加水分解により産生されるものであることから、プロフィラグリン産生促進作用を有するブッチャーズブルーム抽出物は、プロフィラグリンの産生を促進し、細胞内におけるプロフィラグリン量を増加させることで、フィラグリン量をも増加させることができ、結果としてフィラグリン産生促進作用を有するものと考えられる。
【００７５】
〔試験例５〕アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用試験
ブッチャーズブルーム抽出物（試料１）について、以下のようにしてアクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００７６】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Epilife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。
【００７７】
EpiLife-KG2を用いて回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Epilife-KG2で必要濃度に溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００７８】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３（aquaporin3）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＡＱＰ３の発現量は、「試料無添加」で及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【００７９】
ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
表４に示すように、ブッチャーズブルーム抽出物は、優れたＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９ｍＲＮＡ発現抑制剤、コラーゲン産生促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の老化、乾燥肌、しわ、肌荒れ等の予防又は改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリン−１（ＥＴ−１）ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項２】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項３】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリン産生促進剤。
【請求項５】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項６】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項１】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリン−１（ＥＴ−１）ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項２】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項３】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリン産生促進剤。
【請求項５】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項６】
ブッチャーズブルーム抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進剤。
【公開番号】特開２００９−２３５０４４（Ｐ２００９−２３５０４４Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８６３３６（Ｐ２００８−８６３３６）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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