特異的なヌクレオチド配列を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼともよばれる新規なレアカットエンドヌクレアーゼ、由来するポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター細胞、動物または植物、該レアカットエンドヌクレアーゼを製造する方法、ならびにより特異的には遺伝子工学、抗ウイルス療法および遺伝子治療のためのそのいずれの使用。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
メガヌクレアーゼ変異型が当初のメガヌクレアーゼの認識・切断部位とは異なるDNA標的配列を切断することができ、次の工程：
a) 当初のメガヌクレアーゼからメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを作製する工程；および
b) DNA標的配列を切断できる変異型を単離する工程
を含むことを特徴とする当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型を製造する方法。
【請求項２】
前記メガヌクレアーゼ変異型が、DNA標的と接触するかまたは該DNA標的と直接もしくは間接的に相互作用する位置にアミノ酸変異を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記当初のメガヌクレアーゼが、天然または修飾されたメガヌクレアーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記当初のメガヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、I-Cre I、I-Dmo I、PI-Sce IおよびPI-Pfu Iからなる群より選択されることを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼがI-Cre Iであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸変異が、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yからなる群より選択されるアミノ酸による当初のアミノ酸の置換であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項９】
I-Cre I変異型の前記ライブラリが、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択される位置においてアミノ酸多様性を導入することにより作製されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
I-Cre I変異型の前記ライブラリが、a) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140；b) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70；c) Q26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70；またはd) Q26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70の位置においてアミノ酸多様性を導入することにより作製されることを特徴とする請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
I-Cre I変異型の前記ライブラリが、Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70の位置においてアミノ酸多様性を導入することにより作製されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
DNA標的配列を切断し得る変異型の単離が：
a) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程；
b) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程；
c) 結合能力の選択工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程；または
d) 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程
からなる群から選択される工程を含むことを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１３】
次の工程：結合能力の選択工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程を含むかまたはこれらの工程からなることを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
結合能力の選択工程およびスクリーニング工程が、ファージディスプレイを用いることを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
切断活性の選択が、切断が正の選択マーカーの活性化または負の選択マーカーの不活性化のいずれかに導く試験を用いることを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
切断活性のスクリーニングが、切断がa) 正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の活性化；あるいはb) 負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の不活性化に導く試験を用いることを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
切断活性の選択が、切断が正の選択マーカーの活性化に導く試験を用いかつ切断活性のスクリーニングが、切断がレポーター遺伝子の活性化に導く試験を用いることを特徴とする請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
メガヌクレアーゼ変異型が由来する当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示すことを特徴とするメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項１９】
請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法により得ることができることを特徴とする請求項18に記載のメガヌクレアーゼ。
【請求項２０】
請求項18または19に記載のカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項18または19に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項２２】
ターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項21に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ターゲティングDNA構築物が、請求項18または19に記載のメガヌクレアーゼの切断部位の周囲の領域と相同性を共有する配列を含むことを特徴とする請求項21または22に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ターゲティングDNA構築物が：
a) 請求項18または19に記載のメガヌクレアーゼの切断部位の周囲の領域と相同性を共有する配列、および
b) a)の配列で挟まれる導入される配列
を含むことを特徴とする請求項21または22に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項20に記載のポリヌクレオチドまたは請求項21〜24のいずれか1つに記載のベクターにより改変されたことを特徴とする細胞。
【請求項２６】
請求項20に記載のポリヌクレオチドまたは請求項21〜24のいずれか1つに記載のベクターを含むことを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項２７】
請求項20に記載のポリヌクレオチドまたは請求項21〜24のいずれか1つに記載のベクターを含むことを特徴とするヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２８】
請求項18または19に記載のメガヌクレアーゼ、請求項20に記載のポリヌクレオチド、請求項21〜24のいずれか1つに記載のベクター、請求項25に記載の細胞、請求項26に記載のトランスジェニック植物、請求項27に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、分子生物学、インビボまたはインビトロ遺伝子工学およびインビボまたはインビトロゲノム工学のための使用。
【請求項２９】
DNA標的配列を含む対象の部位に二本鎖破壊を導入し、それによりDNA組換え事象、DNA損失または細胞死を導くための請求項28に記載の使用。
【請求項３０】
前記二本鎖破壊が、特定配列を修復するため、特定配列を改変するため、変異した遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、対象の内因性遺伝子を減弱させるかまたは活性化するため、対象の部位に突然変異を導入するため、外因性遺伝子またはその一部分を導入するため、内因性遺伝子またはその一部分を不活性化するかまたは欠失させるため、染色体腕を転座させるため、あるいはDNAを修復されないままにして分解させるためであることを特徴とする請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
前記メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物またはヒト以外の哺乳動物が、請求項23または24に規定されるターゲティングDNA構築物と関連することを特徴とする請求項28〜30のいずれか1つに記載の使用。
【請求項３２】
請求項18または19に記載のメガヌクレアーゼを用いてベクターに位置しかつDNA標的配列を含む対象の部位において二本鎖破壊を導入し、それにより切断部位の周囲の配列と相同性を示す別のベクターとの相同的組換えを誘導する工程を含むことを特徴とする遺伝子工学の方法。
【請求項３３】
次の工程：
1) 請求項18または19に記載のメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程；
2) 標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程
を含むことを特徴とするゲノム工学の方法。
【請求項３４】
次の工程：
1) 請求項18または19に記載のメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程；
2) 切断部位の周囲の領域と相同性を共有する染色体DNAと、相同的組換えに適切な条件下で保持する工程
を含むことを特徴とするゲノム工学の方法
【請求項３５】
請求項18〜24のいずれか1つに記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドまたはベクターを含むことを特徴とする組成物。
【請求項３６】
標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項18〜24のいずれか1つに記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドまたはベクターの、遺伝子疾患の予防、改善または治療を必要とする個体において該個体にいずれの手段により投与される該遺伝子疾患を予防、改善または治療するための医薬品を製造するための使用。
【請求項３８】
請求項18〜24のいずれか1つに記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドまたはベクターの、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善または治療を必要とする個体において該個体にいずれの手段により投与される該疾患を予防、改善または治療するための医薬品を製造するための方法。
【請求項３９】
請求項18〜24のいずれか1つに記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドまたはベクターの、生物学的に得られた物質または生物学的使用もしくは物体の消毒を意図する物質において、インビトロで、DNA媒介物を提示する感染性因子の増殖を阻害するかあるいは該感染性因子を不活性化または除去するための使用。
【請求項４０】
前記感染性因子がウイルスである請求項39に記載の使用。

【図１】

【図２−１】

【図２−２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】



【図１５】

【図１６】

【図１３】

【公表番号】特表２００６−５１６４０３（Ｐ２００６−５１６４０３Ａ）
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２４９０（Ｐ２００６−５０２４９０）
【出願日】平成１６年１月２８日（２００４．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００８２７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７７３６
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０４１００８４６）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＥＣＴＩＳ
【Ｆターム（参考）】