グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子の発現阻害剤
【課題】 癌細胞の増殖を促進する生体内分子を同定し、その分子メカニズムに基づく抗癌剤の同定方法及び抗癌剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 Ｒｈｏ―ＧＥＦ遺伝子の発現を阻害する二重鎖ポリヌクレオチド。該二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、Ｒｈｏ―ＧＥＦ遺伝子の発現阻害方法、Ｒｈｏ―ＧＥＦの阻害方法、細胞増殖抑制方法、又は、癌の予防及び／又は治療方法。Ｒｈｏ―ＧＥＦ遺伝子の発現及び／又はＲｈｏ―ＧＥＦの機能の阻害を指標とする、細胞増殖抑制剤又は抗癌剤の同定方法。
【解決手段】 Ｒｈｏ―ＧＥＦ遺伝子の発現を阻害する二重鎖ポリヌクレオチド。該二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、Ｒｈｏ―ＧＥＦ遺伝子の発現阻害方法、Ｒｈｏ―ＧＥＦの阻害方法、細胞増殖抑制方法、又は、癌の予防及び／又は治療方法。Ｒｈｏ―ＧＥＦ遺伝子の発現及び／又はＲｈｏ―ＧＥＦの機能の阻害を指標とする、細胞増殖抑制剤又は抗癌剤の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（Ｒｈｏ Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ、以下Ｒｈｏ−ＧＥＦと称することもある）コードする遺伝子の発現を阻害する二本鎖ポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、該二本鎖ポリヌクレオチドを形成する一本鎖ポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、前記二本鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子の発現阻害方法、Ｒｈｏ−ＧＥＦの阻害方法、細胞増殖抑制方法、癌の予防及び／又は治療方法に関する。さらに、本発明は、Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子の発現及び／又はＲｈｏ−ＧＥＦの機能の阻害を指標とする、細胞増殖抑制剤又は抗癌剤の同定方法に関する。また、本発明は、Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子及び／又はＲｈｏ−ＧＥＦを含有する、細胞増殖抑制剤又は抗癌剤の同定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、Ｒｈｏファミリー蛋白質と称することもある）の分子スイッチとしての作用に関与する分子の１つがＲｈｏ−ＧＥＦである。Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する。この機能により、Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進する機能をＧＥＦ活性と称することもある。
【０００３】
本発明者らは、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーから、あるＲｈｏ−ＧＥＦ（以下、ｈｊ０３７９６と称することもある）をコードする遺伝子を同定し、ｈｊ０３７９６の部分蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質であるＣｄｃ４２に対してＧＥＦ活性を有することを見出した（特許文献１）。さらに、本発明者らは、胃腺癌腫瘍におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現が正常胃組織におけるそれと比べ約５倍に亢進していることを見出した（特許文献１）。
【０００４】
しかし、特許文献１は、ｈｊ０３７９６の阻害が細胞増殖抑制を誘導することを開示していない。また、特許文献１は、ｈｊ０３７９６の阻害化合物が大腸癌又は肺癌に対して予防ないし治療効果を有することも開示していない。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ ２００５/０９５６１２号
【特許文献２】特開２００４−３５０６０７号
【非特許文献１】エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８
【非特許文献２】ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジ−（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２
【非特許文献３】デビッド（Ｄａｖｉｄ Ｈ．ＧｕｔＭａｎｎ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００６年、第１１６巻、ｐ．８４７−８５２
【非特許文献４】ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ Ａ．Ｌｕｂｅｔ）ら、「チェスト（ＣＨＥＳＴ）」、２００４年、第１２５巻、１４４Ｓ−７Ｓ
【非特許文献５】べリンスキー（Ｂｅｌｉｎｓｋｙ，ＳＡ）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９３年、第５３巻、ｐ．４１０−４１６
【非特許文献６】バーマ（Ｖｅｒｍａ）ら、「クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.）」、２００３年、第９巻、ｐ．１２９１−１３００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌細胞の増殖に関与する生体内分子を同定し、その分子メカニズムに基づく抗癌剤とその同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＲＮＡ干渉法を用いて、大腸癌又は肺癌由来の細胞におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害したところ、該癌細胞の増殖が抑制されることを見出した。さらに、本発明者らは、該癌細胞の増殖抑制が足場非依存的な増殖抑制であることを見出した。
【０００８】
本発明者らは、これら知見に基づき本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２１）を提供する。
（１）下記の群より選ばれるいずれか１のＲＮＡ；
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（ii）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（iii）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（iv）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、及び
（v）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ。
【０００９】
（２）下記の群より選ばれるいずれか１の二重鎖ポリヌクレオチド；
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（ii）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（iii）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（iv）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、及び、
（v）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【００１０】
（３）オーバーハング配列が２つのデオキシチミジル酸からなる塩基配列である、前記（２）に記載の二重鎖ポリヌクレオチド。
【００１１】
（４）以下の工程を含む、細胞増殖抑制剤の同定方法；
（i）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（ii）（i）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【００１２】
（５）以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（i）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（ii）（i）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【００１３】
（６）以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（i）リポフェクション法により被験化合物を肺癌由来の培養細胞に導入する工程、
（ii）（i）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（iii）（ii）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された肺癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【００１４】
（７）さらに、被験化合物を肺癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、前記（５）又は前記（６）に記載の肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【００１５】
（８）以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（i）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（ii）（i）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【００１６】
（９）以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の同定方法；
（i）リポフェクション法により被験化合物を大腸癌由来の培養細胞に導入する工程、
（ii）（i）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（iii）（ii）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された大腸癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【００１７】
（１０）さらに、被験化合物を大腸癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、前記（８）又は前記（９）に記載の大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【００１８】
（１１）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現阻害剤。
【００１９】
（１２）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６の阻害剤。
【００２０】
（１３）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、細胞増殖抑制剤。
【００２１】
（１４）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、癌の予防及び／又は治療剤。
【００２２】
（１５）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する方法。
【００２３】
（１６）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６を阻害する方法。
【００２４】
（１７）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、細胞増殖の抑制方法。
【００２５】
（１８）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌の予防及び／又は治療方法。
【００２６】
（１９）ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、細胞増殖抑制剤の同定用試薬キット
（２０）ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、肺癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【００２７】
（２１）ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、大腸癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【発明の効果】
【００２８】
本発明はｈｊ０３７９６が、大腸癌又は肺癌由来の癌細胞の足場非依存的な増殖に関与するという新しい知見に基づくものであり、この新しいメカニズムに基づく抗癌剤とその同定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。
【００３０】
本発明はｈｊ０３７９６の阻害化合物を提供する。ｈｊ０３７９６の阻害化合物をｈｊ０３７９６の阻害剤と称することもある。
【００３１】
本発明者らは、Ａ５４９（ヒト肺癌由来の細胞株）又はＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来の細胞株）に対して５種類の二重鎖ポリヌクレオチドを導入することにより、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現が阻害されることを見出した。具体的には、本発明者らは、本願実施例に記載の５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（本願明細書において、ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５と称される）が導入されたＡ５４９又は又はＨＣＴ１１６の細胞溶解液に含まれるｈｊ０３７９６量が、陰性対照化合物を導入したＡ５４９又は化合物を導入しないＡ５４９にそれぞれ含まれるｈｊ０３７９６量と比較して低減していることを見出した。これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉法に基づき設計された二重鎖ポリヌクレオチドであることから、発明者は、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉によりｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害すると考えている。すなわち、発明者は、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子に対するｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ(以下、ｓｉＲＮＡと称することもある)であると考えている。
【００３２】
従って、ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５はいずれもｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物である。ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物をｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害剤と称することもある。ある遺伝子の発現阻害は、その遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害し、その低減を誘導する。従ってｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は、ｈｊ０３７９６の阻害化合物である。すなわち、ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５はいずれもｈｊ０３７９６の阻害化合物である。
【００３３】
ｈｊ０３７９６の阻害とは、結果としてｈｊ０３７９６の機能を阻害することを意味する。ｈｊ０３７９６の阻害の具体的態様として、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害、ｈｊ０３７９６の活性阻害、ｈｊ０３７９６の分解、ｈｊ０３７９６の変性が例示される。
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現とは、ｈｊ０３７９６をコードするＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、遺伝子産物であるｈｊ０３７９６が生成する一連の反応を意味する。従ってｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害とは、この反応の全部又は一部を阻害することを意味する。ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害は、例えば、リボザイム法、アンチセンス法又はＲＮＡ干渉法を用いて実施できる。ＲＮＡ干渉法は、リボザイム法やアンチセンス法と比べて低濃度、及び高確率で特異的に目的遺伝子の発現を阻害することができる有用な方法であることから、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害方法としてＲＮＡ干渉法を好ましく例示できる。
【００３４】
本発明者らは、ｈｊ０３７９６のＤＨ／ＰＨドメイン部分を含む蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質であるＣｄｃ４２に対してＧＥＦ活性を有することを見出した（特許文献１）。本発明者らは、ｈｊ０３７９６の全長蛋白質も、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対してＧＥＦ活性を有していると考えている。従ってｈｊ０３７９６の活性として、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対するＧＥＦ活性を例示できる。
【００３５】
ｈｊ０３７９６の分解として、ｈｊ０３７９６分子内に存在するペプチド結合の加水分解を例示できる。
【００３６】
ｈｊ０３７９６の阻害化合物は、結果としてｈｊ０３７９６の機能を阻害する化合物である限りにおいて特に限定されず、例えば、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物、ｈｊ０３７９６の活性阻害化合物、ｈｊ０３７９６の分解化合物であり得る。
【００３７】
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物として、例えばｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害するｓｈｏｒｔ ｈｅａｐｉｎ ＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと称することもある）、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡを例示できる。例えば、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物として、次の（１）〜（５）のいずれか１の二重鎖ポリヌクレオチドを例示できる。（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、及び、（５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。（本願実施例）。
【００３８】
オーバーハング配列は、その作用の１つとして、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、前記二重鎖ポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばＴＴ）、ウリジル酸からなる配列（例えばＵＵ）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばＴＮ）といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、２つのデオキシチミジル酸からなる配列をオーバーハング配列として使用する（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）。オーバーハング配列は、目的のＲＮＡの３'末端のリボース３'水酸基部位に、ジエステル結合によって結合させる。
【００３９】
本発明は、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドのいずれか１を形成するポリヌクレオチドを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドとして、配列表の配列番号１〜１０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドが例示される。
【００４０】
本発明に係るポリヌクレオチドの特徴の１つは、該ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがｈｊ０３７９６遺伝子に対しＲＮＡ干渉効果を有する点である。
【００４１】
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡを包含する。本発明に係るＲＮＡとして、配列表の配列番号１〜１０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡが例示される。
【００４２】
本発明に係るＲＮＡの特徴の１つは、本発明に係るＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、該ＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがｈｊ０３７９６遺伝子に対しＲＮＡ干渉効果を有する点である。
【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドおよびＲＮＡは、自体公知の製法に従って、例えば市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により合成され得る。
【００４４】
本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる。ハイブリダイゼーションは、これら２つのポリヌクレオチドを慣用の方法でアニーリングすることにより実施可能である（特許文献２）。例えば、センス鎖のポリヌクレオチド溶液とアンチセンス鎖のポリヌクレオチド溶液を混合して、得られた溶液に５×アニ−リングバッファー（５００ｍＭ 酢酸カリウム、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を添加し、得られた溶液を９５℃で１分間および７５℃で１分間熱処理しさらに６０分間かけて徐々に３７℃でまで冷却することによりハイブリダイゼーションを実施し得る。
【００４５】
ある二重鎖ポリヌクレオチドのｈｊ０３７９６遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果は、該二重鎖ポリヌクレオチドが自体公知の方法により導入された哺乳動物細胞に含まれるｈｊ０３７９６遺伝子の遺伝子産物を、自体公知の測定方法、例えば、ウェスタンブロット法に従って測定することにより確認され得る（本願実施例）。例えば、ある二重鎖ポリヌクレオチドが導入された細胞の細胞溶解液に含まれるｈｊ０３７９６が、化合物を導入しない細胞の細胞溶解液に含まれるｈｊ０３７９６と比べ量的に低減又は消失している場合には、該二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果を有すると判定可能である。
【００４６】
以上のことから、本発明は、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害方法、ｈｊ０３７９６の阻害方法を提供する。これらの方法はいずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法でよく、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの方法でもよい。
【００４７】
さらに、本発明は、ｈｊ０３７９６の阻害を指標とする細胞増殖抑制剤の同定方法、ｈｊ０３７９６の阻害を指標とする癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供する。両方法ともに、被験化合物のｈｊ０３７９６に対する阻害の有無及び／又はその程度を指標とする点で共通する。
【００４８】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれ（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）を３種類の細胞株それぞれ（ＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９）に導入し、導入から４日後の該細胞株内に存在するｈｊ０３７９６を測定した。その結果、これら全ての二重鎖ポリヌクレオチドは、これら各細胞株の細胞増殖を抑制することを見出した（本願実施例）。
【００４９】
前述のように、発明者は、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物であると考える。ｈｊ０３７９６のＤＨ／ＰＨドメイン部分蛋白質が作用するＣｄｃ４２はＲｈｏファミリー蛋白質である。Ｒｈｏファミリー蛋白質は細胞内伝達の制御を介して様々な細胞機能（例えば、細胞骨格の再構成、細胞接着など）に関与することが知られている（特許文献１）。Ｃｄｃ４２はｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る（特許文献１）。ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られている（非特許文献２）。以上のことから、本発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害により、ｈｊ０３７９６が作用するＲｈｏファミリー蛋白質が阻害され、その結果として、細胞増殖が抑制されると考えている。
【００５０】
すなわち、本発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物は細胞増殖を抑制すると考える。
【００５１】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）を導入したＡ５４９を低付着性プレート又は通常付着性のプレート上で培養した（本願実施例）。低付着性プレートで培養された細胞の増殖は足場非依存的な細胞増殖であることが知られている。
【００５２】
発明者は、これら二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を通常付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖は、陰性対照化合物を導入した場合又は化合物を導入しないＡ５４９を通常付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖と比較して抑制されていることを明らかにした（本願実施例、図８）。しかし、これら二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を通常付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９は、ゆっくりではあるが経時的（導入後１日、２日、４日）に増殖した（本願実施例、図８）。一方、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を低付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９については、そのような経時的な増殖が認められなかった（本願実施例、図７）。
【００５３】
さらに、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を低付着性プレートプレート上培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖は、細胞接着に関与するβ―ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果を有する陽性対照化合物を導入したＡ５４９を低付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖と比較して、より強く抑制されていることが明らかとなった（本願実施例）。
【００５４】
以上のことから、発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は特に足場非依存的な細胞増殖を抑制し得ると考える。本発明者らは、いかなる理論に拘泥するわけではないが、例えばｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害することにより、細胞接着やその運動に関与するＲｈｏファミリー蛋白質に対するｈｊ０３７９６のＧＥＦ活性が減弱され、その結果、足場非依存的な細胞増殖の抑制が誘導されるものと考えている。
【００５５】
本発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現が胃腫瘍において亢進していることを見出した（特許文献１）。さらに、本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）が大腸癌又は肺癌由来の細胞株（ＨＣＴ−１１６、Ａ５４９）に対して、細胞増殖抑制活性を示すことを見出した（本願実施例）。
【００５６】
以上のことから、発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は抗癌活性を有すると考える。ある遺伝子の発現阻害は、その遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害し、その低減を誘導する。従って、発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物も抗癌活性を有すると考える。前述のように、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は、大腸癌又は肺癌由来の細胞に対する増殖抑制活性を示す。従って、本発明に係る癌の治療及び／又は予防剤の有効成分の同定方法として、大腸癌又は肺癌の治療及び／又は予防剤の有効成分の同定方法を好ましく例示できる。
【００５７】
ｈｊ０３７９６の阻害を指標とするとは、被験化合物によるｈｊ０３７９６阻害の有無及び／又はその程度を同定の基準とすることを意味する。例えば、１）被験化合物がｈｊ０３７９６を阻害する場合、２）被験化合物によるｈｊ０３７９６阻害が陰性対照化合物によるｈｊ０３７９６阻害と比較して同等又はより強い場合、及び／又は、３）被験化合物によるｈｊ０３７９６阻害が陽性対照化合物によるｈｊ０３７９６阻害と比較して同等又はより強い場合、被験化合物を細胞増殖抑制剤あるいは癌の予防及び／又は治療剤の有効成分と同定できる（本願実施例）。
【００５８】
ｈｊ０３７９６とは、ＤＨ／ＰＨドメイン（配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質）と一定以上（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の相同性を有し、かつ、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対してＧＥＦ活性を示す蛋白質を意味する（特許文献１）。
【００５９】
ｈｊ０３７９６として、配列表の配列番号１２、１４および１６のいずれか１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が例示できる。配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列の第９０番目のリジン（Ｌｙｓ）から第４５４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までからなるアミノ酸配列である。配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）が付加されたアミノ酸配列である。これら例示された３種類のｈｊ０３７９６は、いずれも、ＤＨ／ＰＨ相同ドメイン（配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質）を有する点で共通する。
【００６０】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドとして、配列表の配列番号１１、１３および１５のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質が例示される。配列表の配列番号１１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質として、配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質として、配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質として、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。
【００６１】
ｈｊ０３７９６及びその遺伝子の由来生物種は、特に制限されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ等が挙げられ、好ましく、ヒトを例示できる。ｈｊ０３７９６及びその遺伝子は、天然に存在する野生型の蛋白質又はその遺伝子のみならず、ｈｊ０３７９６及びその遺伝子の機能が認められる限り、変異蛋白質や相同蛋白質又はそれらの遺伝子であってもよい。ｈｊ０３７９６の機能として、例えば、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対するＧＥＦ活性、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対する結合活性が例示される。
【００６２】
このような変異蛋白質や相同蛋白質は、一般的には、野生型の蛋白質のアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸の欠乏、置換、付加及び／又は挿入等の変異を有するアミノ酸配列、あるいは、野生型の蛋白質のアミノ酸配列と一定以上（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列で表される。このような変異蛋白質や相同蛋白質又はそれらの遺伝子を取得する方法は既知であり、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法又はそれに準ずる方法により適宜実施可能である。
【００６３】
さらに、ｈｊ０３７９６は、ｈｊ０３７９６の機能が認められる限りにおいて、その構成アミノ基又はカルボキシル基等を改変することもできる。例えばｈｊ０３７９６の機能が認められる限りにおいて、タグペプチド（例えば、ＧＳＴ−ｔａｇ, Ｈｉｓ−ｔａｇ, Ｍｙｃ−ｔａｇ, ＨＡ−ｔａｇ, ＦＬＡＧ−ｔａｇ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）及びビオチンなどを単独又は組合せてｈｊ０３７９６を化学修飾することも可能である。これらの化学修飾によりｈｊ０３７９６の精製や検出などが容易になる場合がある。
【００６４】
細胞増殖抑制剤における細胞は、特に限定されず、例えば、初代培養、樹立細胞株、生体を構成する各種の細胞（組織細胞、リンパ球など）を例示できるが、好ましくは癌細胞、さらに好ましくはヒト癌細胞を例示できる。ヒト癌細胞として、例えば、ヒト大腸癌細胞、ヒト肺癌細胞を例示できる。このような細胞として、例えば、Ａ５４９やＨＣＴ１１６を例示できる（本願実施例）。
【００６５】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）それぞれをＡ５４９に導入した結果、いずれの二重鎖ポリヌクレオチドを導入した場合においてもＡ５４９におけるｈｊ０３７９６量が低減し、かつ、Ａ５４９の増殖が足場非依存的に抑制されることを見出した（本願実施例）。癌細胞は正常細胞と異なり足場非依存下でも増殖が可能である。
【００６６】
以上のことから、細胞増殖抑制剤として、特に好ましくヒト肺癌細胞の増殖抑制剤を例示できる。
【００６７】
抗癌活性を有する化合物は、癌細胞の細胞増殖を抑制する化合物のみならず、癌細胞に対する殺細胞効果を有する化合物、哺乳動物（ヒトを含む）に投与可能な抗癌剤の有効成分など、細胞又は組織レベルにおいて、抗癌活性を示すあらゆる化合物を含む。
【００６８】
本発明に係る同定方法の１つの具体的態様として、例えば、（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び、（２）（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程を含む同定方法を例示できる。
【００６９】
各工程について、具体的に説明する。
【００７０】
まず、（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する。
【００７１】
（１）の工程は、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系で実行される。ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系でよく、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの試験系でもよい。
【００７２】
本発明に係る同定方法で用いる被験化合物（ｔｅｓｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は特に制限されない。被験化合物は、合成化合物でもよく、天然物抽出物中に存在する化合物であってもよい。被験化合物として、例えば、合成化合物、天然化合物、植物抽出物、動物抽出物、発酵生産物、市販の試薬、化合物ライブラリーから選抜された化合物などが挙げられる。被験化合物の分子種も特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、糖、核酸等を例示できる。核酸として、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを例示できる。
【００７３】
本発明に係る同定方法で用いる陰性対照化合物は、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を阻害しない或いは微弱に阻害する化合物である限りにおいて特に制限されず、例えば、ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡが例示される（本願実施例）。
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能なｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系について説明する。
【００７４】
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を測定可能なｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳試験系、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳試験系を例示できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳試験系として、転写及び翻訳を望む遺伝子（ｃＤＮＡ等）を挿入した組換えベクターを、ウサギ網状赤血球抽出液又は小麦胚芽抽出液に添加することにより、該遺伝子の転写と翻訳反応が行われる試験系を例示できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳試験系として、翻訳を望む遺伝子の転写産物を、ウサギ網状赤血球抽出液又は小麦胚芽抽出液に添加することにより、該遺伝子がコードする蛋白質の合成反応が行われる試験系を例示できる。これらの試験を実施するための試薬が市販されている（ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社製）。
【００７５】
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現の測定は、ｈｊ０３７９６遺伝子の転写産物（ｈｊ０３７９６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ）の測定でもよく、該ｈｊ０３７９６遺伝子の転写産物から翻訳されてなるｈｊ０３７９６の測定としてもよく、またその組合せでもよい。
ｈｊ０３７９６遺伝子の転写産物は、逆転写ポリメラーゼ鎖伸長反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）やノーザンブロット法により測定可能である。定量性の観点から、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現量の測定方法として、好ましくＲＴ−ＰＣＲ法を、より好ましくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を例示できる。
【００７６】
ｈｊ０３７９６は、例えば、免疫沈降法やウェスタンブロット法などにより測定され得る。
【００７７】
ｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系として、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｊ０３７９６とその基質であるＲｈｏファミリー蛋白質との酵素反応系を例示できる。すなわち、ｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系として、ｈｊ０３７９６のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を測定可能な試験系を例示できる。
【００７８】
ｈｊ０３７９６のＧＥＦ活性は、例えば、Ｒｈｏファミリー蛋白質とｈｊ０３７９６を含む適当な緩衝液を調製し、ｈｊ０３７９６によるＲｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を行わせた後、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の増加又は発生を検出することにより測定可能である。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、エフェクター分子を用いて定量され得る。ここでのエフェクター分子は、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質には結合するが、活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質には結合しないか弱く結合するエフェクター分子であることが好ましい。具体的には、エフェクター分子の活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合部位を含む蛋白質にＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質と、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合をプルダウン法により検出し、さらに活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質を電気泳動法およびウェスタンブロット法により測定する。Ｒｈｏファミリー蛋白質によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。従って、用いるＲｈｏファミリー蛋白質の種類によって適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性化されたＣｄｃ４２は、そのエフェクター分子であるＰＡＫ−１に結合することが知られている（特許文献１）。
【００７９】
次に、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能なｉｎ ｖｉｖｏの試験系について説明する。
【００８０】
ｉｎ ｖｉｖｏの試験系として、培養細胞の試験系を好ましく例示できる。培養細胞の細胞内の転写／翻訳システムにより、該細胞内において、ｈｊ０３７９６遺伝子が転写／翻訳され、結果として、ｈｊ０３７９６が合成される。
【００８１】
本試験系における培養細胞はｈｊ０３７９６遺伝子を発現する限りにおいて特に制限されず、初代培養、細胞株のいずれでもよい。培養細胞の由来生物種は特に限定されないが、ヒトを含む哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。細胞内におけるｈｊ０３７９６遺伝子発現の有無は、例えばｈｊ０３７９６特異的な抗体を用いたウェスタンブロット方法により確認できる。また、本発明に係る同定方法で用いるｈｊ０３７９６遺伝子を発現する細胞は、ｈｊ０３７９６遺伝子を導入して形質転換させた細胞であってもよい。あるいはｈｊ０３７９６をコードする遺伝子とＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を共導入して形質転換させた細胞であってもよい。ｈｊ０３７９６遺伝子の導入による形質転換は、例えばｈｊ０３７９６遺伝子を含有する組換えベクターを慣用の遺伝子工学的手法で細胞にトランスフェクションすることで実施できる。ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子とＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子の共導入による形質転換は、ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含む組換えベクターとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを慣用の遺伝子工学的手法で細胞にトランスフェクションすることで実施できる。ｈｊ０３７９６遺伝子を発現する細胞として、肺癌由来細胞、大腸癌由来細胞、腎臓由来細胞を例示できる。このような細胞として、例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸癌由来）、Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌由来）をより好ましく例示できる。
【００８２】
本発明に係る同定方法で用いる細胞の培養は、用いる細胞に応じた各種培養条件（培地の組成、培養時間、培養温度、培養プレートなど）に従って適宜に実施することができる。本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）をＡ５４９又はＨＣＴ１１６に導入した結果、その細胞増殖が抑制されることを見出した（本願実施例）。Ａ５４９又はＨＣＴ１１６はいずれもヒト癌由来の細胞株である。癌細胞は、正常細胞とは異なり、足場非存在下においても増殖が可能である。低付着性プレートで培養された細胞の増殖は足場非依存的な細胞増殖であることが知られている。以上のことから、本発明に係る同定方法で用いる細胞を培養するためのプレートは、低付着性培養プレートであることが好ましい。
【００８３】
（１）の工程では、前記の試験系に被験化合物を混在させ、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する。
【００８４】
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｊ０３７９６とＲｈｏファミリー蛋白質との酵素反応系に被験化合物を混在させる場合には、該酵素反応の前に該酵素反応溶液に被験化合物を添加してもよく、あるいは該酵素反応中に酵素反応溶液に被験化合物を添加してもよい。
【００８５】
培養細胞の試験系に被験化合物を混在させる場合には、該細胞内に被験化合物を導入してもよく、該細胞の培養上清に添加してもよい。これらの導入又は添加は、該細胞の培養からｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能の測定までの過程のいずれの時であってもよい。被験化合物が核酸の場合には、該細胞に導入することが好ましい。被験化合物が核酸の場合、自体公知の遺伝子導入方法（リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法など）により、好ましくは、リポフェクション法により被験化合物を培養細胞に導入することができる。
【００８６】
さらに、（２）（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する。このような比較として、（a）（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現量と被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現量との比較、（b）（１）で測定したｈｊ０３７９６の機能と被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の機能との比較、又は（a）及び（b）の両方の比較を例示できる。比較の結果、（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能が、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を下回る（ｈｊ０３７９６遺伝子の発現量とｈｊ０３７９６の機能が共に下回る、又は、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現量とｈｊ０３７９６の機能のいずれかが下回る）場合には、被験化合物はｈｊ０３７９６を阻害すると判定できる。
【００８７】
例えば、被験化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現と比べ低減又は消滅している場合、被験化合物存在下におけるｈｊ０３７９６量が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６量と比べ低減又は消滅している場合、被験化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の機能が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の機能と比べ低減又は消滅している場合、被験化合物存在下における活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下における活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量と比べ低減又は消滅している場合、及び、被験化合物存在下における活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質量が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下における活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質量と比べ発生又は増加している場合の少なくともいずれかの場合には、被験化合物はｈｊ０３７９６を阻害すると判定され得る。
【００８８】
本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法において、さらに、ｉｎ
ｖｉｖｏの癌モデル動物を用いて、被験化合物が癌の予防及び／又は治療剤の有効成分であることを確認する工程を含んでいてもよい。癌モデル動物として、好ましく癌非ヒト哺乳動物、より好ましく，癌マウス又は癌ラットを例示可能である。癌種は特に制限されないが、癌モデル動物として、肺癌モデル動物又は大腸癌モデル動物を例示できる。
【００８９】
一般的には、癌モデル動物は、マウスやラットなどの非ヒト哺乳動物に対して、腫瘍細胞を移植する又は発癌物質を投与すること等により製造され得る（非特許文献３）。肺癌モデル動物として、例えば、Ａ／Ｊマウスが利用されている（非特許文献４）。前臨床試験における大腸癌の治療剤のスクリーニングを実施する際、Ａ／Ｊマウスが利用されていることも報告されている（非特許文献５）。
【００９０】
癌モデル動物に被験化合物を投与して、その病変部位の変化を確認することにより、被験化合物が癌の予防及び／又は治療剤の有効成分であることを確認することができる。例えば、癌モデル動物に被験化合物を経口投与又は非経口投与し、該モデル動物における癌病変部位の縮小若しくは消滅又は癌進行の抑制などの治療効果を確認できた場合には、被験化合物が癌の予防及び／又は治療剤の有効成分であると確認することが可能である。
【００９１】
前述のように、本発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物が細胞増殖を抑制すると考える。さらに、本発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物も抗癌活性を有すると考える。従って、本発明は、ｈｊ０３７９６阻害化合物を含有する、細胞増殖抑制剤、癌の予防及び／又は治療剤を提供する。本発明は、ｈｊ０３７９６阻害化合物を用いることを特徴とする、細胞増殖抑制方法、癌の予防及び／又は治療方法を提供する。本発明に係る細胞増殖抑制方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞増殖抑制方法でもよく、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞増殖抑制方法でもよい。
【００９２】
本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤が適用可能な癌の種類は特に限定されない。具体的には、本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤は、固形腫瘍又は非固形腫瘍のいずれにも適用可能であり、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現が認められるあらゆる種類の癌に適用可能である。例えば、胃癌 、食道癌 、大腸癌 、小腸癌 、十二指腸癌 、肺癌 、肝臓癌 、胆嚢癌 、膵臓癌 、腎臓癌 、膀胱癌 、口腔癌 、骨癌 、皮膚癌 、乳癌 、子宮癌 、前立腺癌 、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を挙げることができる。
【００９３】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）をＡ５４９又はＨＣＴ１１６に導入した結果、その細胞増殖が抑制されることを見出した（本願実施例）。従って、本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤が適用可能な癌種として、肺癌又は大腸癌を好ましく例示できる。
【００９４】
本発明に係る細胞増殖抑制剤および本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤の有効成分はいずれも、適当な医薬担体と組合せて癌の予防及び／又は治療剤として用いられる。製剤化にあたっては、その剤形に応じて適切な製剤用添加物を用いることができる。
【００９５】
このような製剤用添加物として、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐH調節剤、安定化剤等を用いることができる。
【００９６】
投与経路は、全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。投与経路は、疾患や症状に応じて選択する。例えば、静脈投与、動脈投与、皮下、皮内、又は筋肉内投与を選択することができる。腫瘍患部に直接に抗癌剤を投与してもよい。
【００９７】
必要な容量範囲は、有効成分の有効性、疾患、患者の症状、投与経路、及び担当医師の判断等によるが、一般的には、患者の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇ程度である。
【００９８】
経口投与に適する製剤の例として、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤を挙げることができる。非経口投与に適する製剤の例として、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリ−ム剤、貼付剤を例示できる。
【００９９】
さらに、本発明はｈｊ０３７９６及び／又はｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含有する、上記同定方法用試薬キットを提供する。
【０１００】
本試薬キットには、上記同定方法に用いられるマーカー物質、緩衝液、塩、安定化剤、防腐剤などが含まれていてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【０１０１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。
【実施例１】
【０１０２】
（ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物の合成）
細胞内のｈｊ０３７９６遺伝子発現が該細胞増殖に与える影響を評価するために、まずｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物を合成した。
【０１０３】
具体的には、ＲＮＡ干渉によりｈｊ０３７９６遺伝子発現を阻害すると考えられる以下に示す１）〜５）の二重鎖ポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を合成（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社に委託）した。
【０１０４】
１）ｈｊ―１
5´- CCAAGACAGUGGAGGAGAAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号１)
3´ dTdTGGUUCUGUCACCUCCUCUU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号２)
２）ｈｊ―２
5´- CGAGAAAGCCCGAGCAGCAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号３)
3´ dTdTGCUCUUUCGGGCUCGUCGU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号４)
３）ｈｊ―３
5´- CAGAAGUCCUGGAGACACAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号５)
3´ dTdTGUCUUCAGGACCUCUGUGU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号６)
４）ｈｊ―４
5´- CCAAAGGACUGGUAAGAAAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号７)
3´ dTdTGGUUUCCUGACCAUUCUUU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号８)
５）ｈｊ―５
5´- GUGAGAAACCUUAGAGAGAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号９)
3´ dTdTCACUCUUUGGAAUCUCUCU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号１０)
また、対照の陰性化合物として、６）の二重鎖ポリヌクレオチド(ｓｉＲＮＡ)を合成（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社に委託）した。ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡは、哺乳動物の細胞には存在しない配列を二本鎖にしたRNAであって、植物の葉緑体遺伝子の中にある配列から選出された。
【０１０５】
６）ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ
5´- GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT 3´
3´ dTdTCGCGCGAAACAUCCUAAGC - 5´
次に、ｈｊ―１〜５がｈｊ０３７９６遺伝子発現に与える影響を評価する為に、これらの二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれをＡ５４９（ヒト肺癌由来細胞株）又はＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来の細胞株）に導入し、その導入後、該細胞内におけるｈｊ０３７９６を検出した。
【０１０６】
前日に24well plateへ2.5 x 104 cells/wellで播種したA549又はHCT116に、導入試薬であるLipofectamine2000とともに20 pmol/wellの上記６種類の二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれを導入した。二重鎖ポリヌクレオチドを導入後2日目にA549又はHCT116を回収し、凍結させた。凍結サンプルを融解後、Lysis buffer（2M Thiourea, 7M Urea, 4%(w/v) CHAPS, 30mM Tris-HCl(pH8.5)）にてA549又はHCT116の細胞溶解液を調製した。細胞溶解液の総蛋白質濃度を測定後、総蛋白質量を一定にした細胞溶解液をSDS-PAGE装置に供与し、western blot法を実施した。ｈｊ０３７９６の検出量を向上させるため、Can Get Signal（TOYOBO社）の溶液を用いて抗体反応を実施した。検出試薬として、ECL plus（Amersham社製）を使用した。HCT116を用いた実験において、Survivinに対してRNA干渉作用を有する二重鎖ポリヌクレオチドを用いた。
【０１０７】
ｈｊ―１〜５それぞれを導入したＨＣＴ１１６において、ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡをＨＣＴ１１６に導入した場合と比べて、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現抑制が確認された（図３）。さらに、ｈｊ―１〜５それぞれを導入したＡ５４９において、mock又はｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡをＡ５４９に導入した場合と比較すると、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現抑制が確認された（図４）。ｈｊ―１〜５の全二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子の発現抑制効果を有することが明らかとなった。
【０１０８】
すなわち、ｈｊ―１〜５はｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物であることが明らかとなった。
【０１０９】
（ｈｊ０３７９６遺伝子を阻害する二重鎖ポリヌクレオチドが細胞増殖に与える影響の検討）
ｈｊ―１〜５はｈｊ０３７９６遺伝子発現を阻害する二重鎖ポリヌクレオチドであることが確認されたため、これらの二重鎖ポリヌクレオチドが細胞増殖に与える影響を３種類の細胞株を用いて検討した。３種類の細胞株は、Ａ５４９（ヒト肺癌由来細胞株）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来細胞株）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓由来細胞株）である。
【０１１０】
前日に24well plateへ以下の播種数で播種した各細胞株に、導入試薬であるLipofectamine2000とともに20 pmol/wellの上記６種類の二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれを導入した。siRNAによる細胞の表現型の変化を確認するため、導入1日、2日と4日後にTetraColor Oneキットによって細胞増殖を数値化した。
細胞播種数
HEK293： 2.5 x 104 cells/well
HCT116： 5.0 x 104 cells/well
A549： 2.5 x 104 cells/well
各二重鎖ポリヌクレオチドの導入による細胞増殖抑制効果の結果を図１と図２に示す。導入2日後ではｈｊ−１〜５によるＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９の増殖抑制が確認された。また、導入４日後においても、ｈｊ−１〜５全ての二本鎖ポリヌクレオチドは、ＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９の細胞増殖を抑制することを確認した。
【０１１１】
以上の結果から、ｈｊ―１〜５全ての二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害することにより、細胞増殖が抑制すると考えられる。
【実施例２】
【０１１２】
（ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害による足場非依存的増殖抑制効果の検討）
線維芽細胞などの正常付着細胞は、足場となる細胞外基質に接着することにより生存ならびに細胞分裂が可能となる。一方、癌細胞は、正常細胞とは異なり、足場非存在下においても増殖が可能である。
そこで、ｈｊ―１〜５のｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害による細胞増殖抑制が、癌細胞の特徴の１つである足場非依存的増殖の抑制であるか否かについて検討した。
【０１１３】
前日に6well plateへ8 x 104 cells/wellで播種したA549に、導入試薬であるLipofectamine2000とともに80 pmol/wellの5種類のｈｊ―１〜５それぞれを導入した。足場非依存的増殖抑制のポジティブコントロールとして細胞の接着に関与するβ-cateninに対するsiRNA(b-cat-5；非特許文献６に基づき設計された下記７)に記載のsiRNA；DHRMACON社製)を導入した。導入6-9時間後にHydroCell（12 well plate, CellSeed社製）またはnormal plate(12 well)に播種し、1、2、4日後にTetraColor Oneキットによって細胞増殖を数値化し、足場非依存的な増殖の確認を実施した。なお、HydroCellは超親水性のポリマーがコーティングされており、付着性細胞が接着できない培養プレートである。足場非依存的増殖を確認するには、従来法として軟寒天法があるが、軟寒天法は操作が煩雑であり、しかも細胞数を測定する際、軟寒天に覆われているため、コロニー数を判定するのも困難である。一方、HydroCellによる培養は、通常の培養法で培養可能であり、軟寒天法を反映すると考えられているため、軟寒天法に替わる足場非依存的増殖試験と位置付けている。
【０１１４】
７）β-cateninに対するsiRNA(b-cat-5)
5'- AGCUGAUAUUGAUGGACAGdTdT -3'
3'- dTdTUCGACUAUAACUACCUGUC -5'
ｈｊ―１〜５の各二重鎖ポリヌクレオチドによりＡ５４９の増殖が抑制されていることが確認された（図７）。その増殖抑制はβ-cateninに対するsiRNAによる増殖抑制よりも効果が高かった。コントロールであるmockとscramble siRNAでは足場非依存的にも増殖していることからも、HydroCellでの培養による増殖抑制ではなく、siRNA導入による現象であることが示唆された。また、normal plateにおいてhj03796遺伝子に対するsiRNAを導入した細胞は、増殖速度は遅いものの、経時的に増殖していることが確認された（図８）。
低分子G蛋白質であるＲｈｏファミリー蛋白質は、接着、細胞運動、遺伝子発現等に関与している。Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化はＲｈｏ−ＧＥＦにより制御されている。細胞の足場依存的な増殖は、その接着に関与していることから、ｈｊ０３７９６遺伝子に対するsiRNAの導入によってｈｊ０３７９６レベルが減少した結果、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化が低下し、足場非依存的な増殖が抑制されたかもしれない。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害する二重鎖ポリヌクレオチドを提供できる。本二重鎖ポリヌクレオチドを利用して、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現の阻害、ｈｊ０３７９６の阻害又は細胞増殖の抑制を実施できる。また、本発明によれば、ｈｊ０３７９６の阻害を指標とする、細胞増殖抑制剤又は癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供できる。本二重鎖ポリヌクレオチド、本同定方法により同定された細胞増殖抑制剤或いは癌の予防及び／又は治療剤の有効成分を利用して、癌の治療及び／又は予防を実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれを３種類の細胞株（Ａ５４９（図上部）、ＨＣＴ１１６（図中央）、ＨＥＫ２９３（図下部））それぞれに導入した後２日目の該細胞の増殖を示す。各図の横軸は導入した化合物（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ、ｈｊ−１〜５）を表し、図の縦軸は各化合物を導入した後２日目の各細胞の増殖度合いを表す。増殖度合いはｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡが導入された各細胞の増殖に対する比で表される。
【図２】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれを３種類の細胞株（Ａ５４９（図上部）、ＨＣＴ１１６（図中央）、ＨＥＫ２９３（図下部））それぞれに導入した後４日目の該細胞の増殖を示す。図の横軸は導入した化合物（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ、ｈｊ−１〜５）を表し、図の縦軸は各化合物を導入した後４日目の各細胞の増殖度合いを表す。増殖度合いはｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡが導入された各細胞の増殖に対する比で表される。
【図３】５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ−１〜５）のｈｊ０３７９６遺伝子発現阻害効果を示す。５種類の該二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれをＨＣ１１６に導入した後４日目の該細胞の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した。Ｓｃｒａｍｂｌｅ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎはそれぞれ陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）又はＳｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の発現阻害化合物を導入したＨＣＴ１１６の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。また、ｈｊ０３７９６Ｐｌａｓｍｉｄは、ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含有する組替えベクターを導入したＨＥＫ２９３の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。矢頭はｈｊ０３７９６のバンド位置を示す。
【図４】５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ−１〜５）のｈｊ０３７９６遺伝子発現阻害効果を示す。５種類の該二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれをＡ５４９に導入した後４日目の該細胞の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した。Ｍｏｃｋ、Ｓｃｒａｍｂｌｅはそれぞれ二重鎖ポリヌクレオチドを導入しないあるいは陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。ｈｊ０３７９６Ｐｌａｓｍｉｄは、ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含有する組替えベクターを導入したＨＥＫ２９３の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。矢頭はｈｊ０３７９６のバンド位置を示す。
【図５】低付着性培養プレートであるＨｙｄｒｏＣｅｌｌ上で陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９を培養した場合の該Ａ５４９の形態を示す。
【図６】通常プレートであるＮｏｒｍａｌＰｌａｔｅ上で陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９を培養した場合の該Ａ５４９の形態を示す。
【図７】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれが足場非依存的な細胞増殖に与える影響を示す。各化合物をＡ５４９に導入し、導入６−９時間後に低付着性培養プレートであるＨｙｄｒｏＣｅｌｌ上に該Ａ５４９を播種し、播種後１、２又は４日後の該Ａ５４９の細胞増殖を数値化した。Ｍｏｃｋ、Ｓｃｒａｍｂｌｅはそれぞれ二重鎖ポリヌクレオチドを導入しないあるいは陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示す。ｂ−ｃａｔ−５は陽性対照化合物（β-catenin遺伝子の発現阻害化合物）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示す。
【図８】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれが細胞増殖に与える影響を示す。各化合物をＡ５４９に導入し、導入６−９時間後に通常プレート上に該Ａ５４９を播種し、播種後１、２又は４日後の該Ａ５４９の細胞増殖を数値化した。Ｍｏｃｋ、Ｓｃｒａｍｂｌｅはそれぞれ二重鎖ポリヌクレオチドを導入しないあるいは陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示すｂ−ｃａｔ−５は陽性対照化合物（β-catenin遺伝子の発現阻害化合物）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１：ｈｊ―１と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号２：ｈｊ―１と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号３：ｈｊ―２と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号４：ｈｊ―２と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号５：ｈｊ―３と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号６：ｈｊ―３と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号７：ｈｊ―４称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の配列。
配列番号８：ｈｊ―４と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号９：ｈｊ―５と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号１０：ｈｊ―５と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号１１：グアニンヌクレオチド交換因子として機能する蛋白質（配列番号１２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１２：グアニンヌクレオチド交換因子として機能する蛋白質。
配列番号１３：配列番号１１の第５８１番目から第１６７５番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１４：配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列の第９０番目のリジン（Ｌｙｓ）から第４５４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までからなるアミノ酸配列。
配列番号１５：５´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンに対応するコドンとを有し、それに続いて、配列番号１１の第５８１番目から第１６７５番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１６：配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）が付加されたアミノ酸配列。
配列番号１７：Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードするポリヌクレオチド。
配列番号１８：Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメイン。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（Ｒｈｏ Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ、以下Ｒｈｏ−ＧＥＦと称することもある）コードする遺伝子の発現を阻害する二本鎖ポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、該二本鎖ポリヌクレオチドを形成する一本鎖ポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、前記二本鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子の発現阻害方法、Ｒｈｏ−ＧＥＦの阻害方法、細胞増殖抑制方法、癌の予防及び／又は治療方法に関する。さらに、本発明は、Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子の発現及び／又はＲｈｏ−ＧＥＦの機能の阻害を指標とする、細胞増殖抑制剤又は抗癌剤の同定方法に関する。また、本発明は、Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子及び／又はＲｈｏ−ＧＥＦを含有する、細胞増殖抑制剤又は抗癌剤の同定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、Ｒｈｏファミリー蛋白質と称することもある）の分子スイッチとしての作用に関与する分子の１つがＲｈｏ−ＧＥＦである。Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する。この機能により、Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進する機能をＧＥＦ活性と称することもある。
【０００３】
本発明者らは、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーから、あるＲｈｏ−ＧＥＦ（以下、ｈｊ０３７９６と称することもある）をコードする遺伝子を同定し、ｈｊ０３７９６の部分蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質であるＣｄｃ４２に対してＧＥＦ活性を有することを見出した（特許文献１）。さらに、本発明者らは、胃腺癌腫瘍におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現が正常胃組織におけるそれと比べ約５倍に亢進していることを見出した（特許文献１）。
【０００４】
しかし、特許文献１は、ｈｊ０３７９６の阻害が細胞増殖抑制を誘導することを開示していない。また、特許文献１は、ｈｊ０３７９６の阻害化合物が大腸癌又は肺癌に対して予防ないし治療効果を有することも開示していない。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ ２００５/０９５６１２号
【特許文献２】特開２００４−３５０６０７号
【非特許文献１】エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８
【非特許文献２】ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジ−（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２
【非特許文献３】デビッド（Ｄａｖｉｄ Ｈ．ＧｕｔＭａｎｎ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００６年、第１１６巻、ｐ．８４７−８５２
【非特許文献４】ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ Ａ．Ｌｕｂｅｔ）ら、「チェスト（ＣＨＥＳＴ）」、２００４年、第１２５巻、１４４Ｓ−７Ｓ
【非特許文献５】べリンスキー（Ｂｅｌｉｎｓｋｙ，ＳＡ）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９３年、第５３巻、ｐ．４１０−４１６
【非特許文献６】バーマ（Ｖｅｒｍａ）ら、「クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.）」、２００３年、第９巻、ｐ．１２９１−１３００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌細胞の増殖に関与する生体内分子を同定し、その分子メカニズムに基づく抗癌剤とその同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＲＮＡ干渉法を用いて、大腸癌又は肺癌由来の細胞におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害したところ、該癌細胞の増殖が抑制されることを見出した。さらに、本発明者らは、該癌細胞の増殖抑制が足場非依存的な増殖抑制であることを見出した。
【０００８】
本発明者らは、これら知見に基づき本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２１）を提供する。
（１）下記の群より選ばれるいずれか１のＲＮＡ；
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（ii）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（iii）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（iv）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、及び
（v）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ。
【０００９】
（２）下記の群より選ばれるいずれか１の二重鎖ポリヌクレオチド；
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（ii）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（iii）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（iv）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、及び、
（v）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【００１０】
（３）オーバーハング配列が２つのデオキシチミジル酸からなる塩基配列である、前記（２）に記載の二重鎖ポリヌクレオチド。
【００１１】
（４）以下の工程を含む、細胞増殖抑制剤の同定方法；
（i）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（ii）（i）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【００１２】
（５）以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（i）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（ii）（i）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【００１３】
（６）以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（i）リポフェクション法により被験化合物を肺癌由来の培養細胞に導入する工程、
（ii）（i）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（iii）（ii）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された肺癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【００１４】
（７）さらに、被験化合物を肺癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、前記（５）又は前記（６）に記載の肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【００１５】
（８）以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（i）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（ii）（i）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【００１６】
（９）以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の同定方法；
（i）リポフェクション法により被験化合物を大腸癌由来の培養細胞に導入する工程、
（ii）（i）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（iii）（ii）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された大腸癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【００１７】
（１０）さらに、被験化合物を大腸癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、前記（８）又は前記（９）に記載の大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【００１８】
（１１）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現阻害剤。
【００１９】
（１２）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６の阻害剤。
【００２０】
（１３）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、細胞増殖抑制剤。
【００２１】
（１４）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、癌の予防及び／又は治療剤。
【００２２】
（１５）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する方法。
【００２３】
（１６）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６を阻害する方法。
【００２４】
（１７）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、細胞増殖の抑制方法。
【００２５】
（１８）前記（２）又は（３）に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌の予防及び／又は治療方法。
【００２６】
（１９）ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、細胞増殖抑制剤の同定用試薬キット
（２０）ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、肺癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【００２７】
（２１）ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、大腸癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【発明の効果】
【００２８】
本発明はｈｊ０３７９６が、大腸癌又は肺癌由来の癌細胞の足場非依存的な増殖に関与するという新しい知見に基づくものであり、この新しいメカニズムに基づく抗癌剤とその同定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。
【００３０】
本発明はｈｊ０３７９６の阻害化合物を提供する。ｈｊ０３７９６の阻害化合物をｈｊ０３７９６の阻害剤と称することもある。
【００３１】
本発明者らは、Ａ５４９（ヒト肺癌由来の細胞株）又はＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来の細胞株）に対して５種類の二重鎖ポリヌクレオチドを導入することにより、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現が阻害されることを見出した。具体的には、本発明者らは、本願実施例に記載の５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（本願明細書において、ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５と称される）が導入されたＡ５４９又は又はＨＣＴ１１６の細胞溶解液に含まれるｈｊ０３７９６量が、陰性対照化合物を導入したＡ５４９又は化合物を導入しないＡ５４９にそれぞれ含まれるｈｊ０３７９６量と比較して低減していることを見出した。これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉法に基づき設計された二重鎖ポリヌクレオチドであることから、発明者は、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉によりｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害すると考えている。すなわち、発明者は、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子に対するｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ(以下、ｓｉＲＮＡと称することもある)であると考えている。
【００３２】
従って、ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５はいずれもｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物である。ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物をｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害剤と称することもある。ある遺伝子の発現阻害は、その遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害し、その低減を誘導する。従ってｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は、ｈｊ０３７９６の阻害化合物である。すなわち、ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５はいずれもｈｊ０３７９６の阻害化合物である。
【００３３】
ｈｊ０３７９６の阻害とは、結果としてｈｊ０３７９６の機能を阻害することを意味する。ｈｊ０３７９６の阻害の具体的態様として、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害、ｈｊ０３７９６の活性阻害、ｈｊ０３７９６の分解、ｈｊ０３７９６の変性が例示される。
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現とは、ｈｊ０３７９６をコードするＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、遺伝子産物であるｈｊ０３７９６が生成する一連の反応を意味する。従ってｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害とは、この反応の全部又は一部を阻害することを意味する。ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害は、例えば、リボザイム法、アンチセンス法又はＲＮＡ干渉法を用いて実施できる。ＲＮＡ干渉法は、リボザイム法やアンチセンス法と比べて低濃度、及び高確率で特異的に目的遺伝子の発現を阻害することができる有用な方法であることから、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害方法としてＲＮＡ干渉法を好ましく例示できる。
【００３４】
本発明者らは、ｈｊ０３７９６のＤＨ／ＰＨドメイン部分を含む蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質であるＣｄｃ４２に対してＧＥＦ活性を有することを見出した（特許文献１）。本発明者らは、ｈｊ０３７９６の全長蛋白質も、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対してＧＥＦ活性を有していると考えている。従ってｈｊ０３７９６の活性として、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対するＧＥＦ活性を例示できる。
【００３５】
ｈｊ０３７９６の分解として、ｈｊ０３７９６分子内に存在するペプチド結合の加水分解を例示できる。
【００３６】
ｈｊ０３７９６の阻害化合物は、結果としてｈｊ０３７９６の機能を阻害する化合物である限りにおいて特に限定されず、例えば、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物、ｈｊ０３７９６の活性阻害化合物、ｈｊ０３７９６の分解化合物であり得る。
【００３７】
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物として、例えばｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害するｓｈｏｒｔ ｈｅａｐｉｎ ＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと称することもある）、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡを例示できる。例えば、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物として、次の（１）〜（５）のいずれか１の二重鎖ポリヌクレオチドを例示できる。（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、及び、（５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。（本願実施例）。
【００３８】
オーバーハング配列は、その作用の１つとして、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、前記二重鎖ポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばＴＴ）、ウリジル酸からなる配列（例えばＵＵ）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばＴＮ）といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、２つのデオキシチミジル酸からなる配列をオーバーハング配列として使用する（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）。オーバーハング配列は、目的のＲＮＡの３'末端のリボース３'水酸基部位に、ジエステル結合によって結合させる。
【００３９】
本発明は、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドのいずれか１を形成するポリヌクレオチドを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドとして、配列表の配列番号１〜１０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドが例示される。
【００４０】
本発明に係るポリヌクレオチドの特徴の１つは、該ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがｈｊ０３７９６遺伝子に対しＲＮＡ干渉効果を有する点である。
【００４１】
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡを包含する。本発明に係るＲＮＡとして、配列表の配列番号１〜１０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡが例示される。
【００４２】
本発明に係るＲＮＡの特徴の１つは、本発明に係るＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、該ＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる二重鎖ポリヌクレオチドがｈｊ０３７９６遺伝子に対しＲＮＡ干渉効果を有する点である。
【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドおよびＲＮＡは、自体公知の製法に従って、例えば市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により合成され得る。
【００４４】
本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに含まれるＲＮＡの相補的な塩基配列からなるＲＮＡにそのＲＮＡの３'末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせて得られる。ハイブリダイゼーションは、これら２つのポリヌクレオチドを慣用の方法でアニーリングすることにより実施可能である（特許文献２）。例えば、センス鎖のポリヌクレオチド溶液とアンチセンス鎖のポリヌクレオチド溶液を混合して、得られた溶液に５×アニ−リングバッファー（５００ｍＭ 酢酸カリウム、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を添加し、得られた溶液を９５℃で１分間および７５℃で１分間熱処理しさらに６０分間かけて徐々に３７℃でまで冷却することによりハイブリダイゼーションを実施し得る。
【００４５】
ある二重鎖ポリヌクレオチドのｈｊ０３７９６遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果は、該二重鎖ポリヌクレオチドが自体公知の方法により導入された哺乳動物細胞に含まれるｈｊ０３７９６遺伝子の遺伝子産物を、自体公知の測定方法、例えば、ウェスタンブロット法に従って測定することにより確認され得る（本願実施例）。例えば、ある二重鎖ポリヌクレオチドが導入された細胞の細胞溶解液に含まれるｈｊ０３７９６が、化合物を導入しない細胞の細胞溶解液に含まれるｈｊ０３７９６と比べ量的に低減又は消失している場合には、該二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果を有すると判定可能である。
【００４６】
以上のことから、本発明は、本発明に係る二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害方法、ｈｊ０３７９６の阻害方法を提供する。これらの方法はいずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法でよく、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの方法でもよい。
【００４７】
さらに、本発明は、ｈｊ０３７９６の阻害を指標とする細胞増殖抑制剤の同定方法、ｈｊ０３７９６の阻害を指標とする癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供する。両方法ともに、被験化合物のｈｊ０３７９６に対する阻害の有無及び／又はその程度を指標とする点で共通する。
【００４８】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれ（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）を３種類の細胞株それぞれ（ＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９）に導入し、導入から４日後の該細胞株内に存在するｈｊ０３７９６を測定した。その結果、これら全ての二重鎖ポリヌクレオチドは、これら各細胞株の細胞増殖を抑制することを見出した（本願実施例）。
【００４９】
前述のように、発明者は、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物であると考える。ｈｊ０３７９６のＤＨ／ＰＨドメイン部分蛋白質が作用するＣｄｃ４２はＲｈｏファミリー蛋白質である。Ｒｈｏファミリー蛋白質は細胞内伝達の制御を介して様々な細胞機能（例えば、細胞骨格の再構成、細胞接着など）に関与することが知られている（特許文献１）。Ｃｄｃ４２はｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る（特許文献１）。ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られている（非特許文献２）。以上のことから、本発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害により、ｈｊ０３７９６が作用するＲｈｏファミリー蛋白質が阻害され、その結果として、細胞増殖が抑制されると考えている。
【００５０】
すなわち、本発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物は細胞増殖を抑制すると考える。
【００５１】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）を導入したＡ５４９を低付着性プレート又は通常付着性のプレート上で培養した（本願実施例）。低付着性プレートで培養された細胞の増殖は足場非依存的な細胞増殖であることが知られている。
【００５２】
発明者は、これら二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を通常付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖は、陰性対照化合物を導入した場合又は化合物を導入しないＡ５４９を通常付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖と比較して抑制されていることを明らかにした（本願実施例、図８）。しかし、これら二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を通常付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９は、ゆっくりではあるが経時的（導入後１日、２日、４日）に増殖した（本願実施例、図８）。一方、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を低付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９については、そのような経時的な増殖が認められなかった（本願実施例、図７）。
【００５３】
さらに、これら５種類の二重鎖ポリヌクレオチドを導入したＡ５４９を低付着性プレートプレート上培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖は、細胞接着に関与するβ―ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果を有する陽性対照化合物を導入したＡ５４９を低付着性プレート上で培養した場合のそのＡ５４９の細胞増殖と比較して、より強く抑制されていることが明らかとなった（本願実施例）。
【００５４】
以上のことから、発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は特に足場非依存的な細胞増殖を抑制し得ると考える。本発明者らは、いかなる理論に拘泥するわけではないが、例えばｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害することにより、細胞接着やその運動に関与するＲｈｏファミリー蛋白質に対するｈｊ０３７９６のＧＥＦ活性が減弱され、その結果、足場非依存的な細胞増殖の抑制が誘導されるものと考えている。
【００５５】
本発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現が胃腫瘍において亢進していることを見出した（特許文献１）。さらに、本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）が大腸癌又は肺癌由来の細胞株（ＨＣＴ−１１６、Ａ５４９）に対して、細胞増殖抑制活性を示すことを見出した（本願実施例）。
【００５６】
以上のことから、発明者らは、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は抗癌活性を有すると考える。ある遺伝子の発現阻害は、その遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害し、その低減を誘導する。従って、発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物も抗癌活性を有すると考える。前述のように、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物は、大腸癌又は肺癌由来の細胞に対する増殖抑制活性を示す。従って、本発明に係る癌の治療及び／又は予防剤の有効成分の同定方法として、大腸癌又は肺癌の治療及び／又は予防剤の有効成分の同定方法を好ましく例示できる。
【００５７】
ｈｊ０３７９６の阻害を指標とするとは、被験化合物によるｈｊ０３７９６阻害の有無及び／又はその程度を同定の基準とすることを意味する。例えば、１）被験化合物がｈｊ０３７９６を阻害する場合、２）被験化合物によるｈｊ０３７９６阻害が陰性対照化合物によるｈｊ０３７９６阻害と比較して同等又はより強い場合、及び／又は、３）被験化合物によるｈｊ０３７９６阻害が陽性対照化合物によるｈｊ０３７９６阻害と比較して同等又はより強い場合、被験化合物を細胞増殖抑制剤あるいは癌の予防及び／又は治療剤の有効成分と同定できる（本願実施例）。
【００５８】
ｈｊ０３７９６とは、ＤＨ／ＰＨドメイン（配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質）と一定以上（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の相同性を有し、かつ、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対してＧＥＦ活性を示す蛋白質を意味する（特許文献１）。
【００５９】
ｈｊ０３７９６として、配列表の配列番号１２、１４および１６のいずれか１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が例示できる。配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列の第９０番目のリジン（Ｌｙｓ）から第４５４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までからなるアミノ酸配列である。配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）が付加されたアミノ酸配列である。これら例示された３種類のｈｊ０３７９６は、いずれも、ＤＨ／ＰＨ相同ドメイン（配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質）を有する点で共通する。
【００６０】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドとして、配列表の配列番号１１、１３および１５のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質が例示される。配列表の配列番号１１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質として、配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質として、配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質として、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。
【００６１】
ｈｊ０３７９６及びその遺伝子の由来生物種は、特に制限されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ等が挙げられ、好ましく、ヒトを例示できる。ｈｊ０３７９６及びその遺伝子は、天然に存在する野生型の蛋白質又はその遺伝子のみならず、ｈｊ０３７９６及びその遺伝子の機能が認められる限り、変異蛋白質や相同蛋白質又はそれらの遺伝子であってもよい。ｈｊ０３７９６の機能として、例えば、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対するＧＥＦ活性、Ｒｈｏファミリー蛋白質（例えば、Ｃｄｃ４２）に対する結合活性が例示される。
【００６２】
このような変異蛋白質や相同蛋白質は、一般的には、野生型の蛋白質のアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸の欠乏、置換、付加及び／又は挿入等の変異を有するアミノ酸配列、あるいは、野生型の蛋白質のアミノ酸配列と一定以上（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列で表される。このような変異蛋白質や相同蛋白質又はそれらの遺伝子を取得する方法は既知であり、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法又はそれに準ずる方法により適宜実施可能である。
【００６３】
さらに、ｈｊ０３７９６は、ｈｊ０３７９６の機能が認められる限りにおいて、その構成アミノ基又はカルボキシル基等を改変することもできる。例えばｈｊ０３７９６の機能が認められる限りにおいて、タグペプチド（例えば、ＧＳＴ−ｔａｇ, Ｈｉｓ−ｔａｇ, Ｍｙｃ−ｔａｇ, ＨＡ−ｔａｇ, ＦＬＡＧ−ｔａｇ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）及びビオチンなどを単独又は組合せてｈｊ０３７９６を化学修飾することも可能である。これらの化学修飾によりｈｊ０３７９６の精製や検出などが容易になる場合がある。
【００６４】
細胞増殖抑制剤における細胞は、特に限定されず、例えば、初代培養、樹立細胞株、生体を構成する各種の細胞（組織細胞、リンパ球など）を例示できるが、好ましくは癌細胞、さらに好ましくはヒト癌細胞を例示できる。ヒト癌細胞として、例えば、ヒト大腸癌細胞、ヒト肺癌細胞を例示できる。このような細胞として、例えば、Ａ５４９やＨＣＴ１１６を例示できる（本願実施例）。
【００６５】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）それぞれをＡ５４９に導入した結果、いずれの二重鎖ポリヌクレオチドを導入した場合においてもＡ５４９におけるｈｊ０３７９６量が低減し、かつ、Ａ５４９の増殖が足場非依存的に抑制されることを見出した（本願実施例）。癌細胞は正常細胞と異なり足場非依存下でも増殖が可能である。
【００６６】
以上のことから、細胞増殖抑制剤として、特に好ましくヒト肺癌細胞の増殖抑制剤を例示できる。
【００６７】
抗癌活性を有する化合物は、癌細胞の細胞増殖を抑制する化合物のみならず、癌細胞に対する殺細胞効果を有する化合物、哺乳動物（ヒトを含む）に投与可能な抗癌剤の有効成分など、細胞又は組織レベルにおいて、抗癌活性を示すあらゆる化合物を含む。
【００６８】
本発明に係る同定方法の１つの具体的態様として、例えば、（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び、（２）（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程を含む同定方法を例示できる。
【００６９】
各工程について、具体的に説明する。
【００７０】
まず、（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する。
【００７１】
（１）の工程は、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系で実行される。ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系でよく、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの試験系でもよい。
【００７２】
本発明に係る同定方法で用いる被験化合物（ｔｅｓｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は特に制限されない。被験化合物は、合成化合物でもよく、天然物抽出物中に存在する化合物であってもよい。被験化合物として、例えば、合成化合物、天然化合物、植物抽出物、動物抽出物、発酵生産物、市販の試薬、化合物ライブラリーから選抜された化合物などが挙げられる。被験化合物の分子種も特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、糖、核酸等を例示できる。核酸として、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを例示できる。
【００７３】
本発明に係る同定方法で用いる陰性対照化合物は、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を阻害しない或いは微弱に阻害する化合物である限りにおいて特に制限されず、例えば、ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡが例示される（本願実施例）。
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能なｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系について説明する。
【００７４】
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を測定可能なｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳試験系、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳試験系を例示できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳試験系として、転写及び翻訳を望む遺伝子（ｃＤＮＡ等）を挿入した組換えベクターを、ウサギ網状赤血球抽出液又は小麦胚芽抽出液に添加することにより、該遺伝子の転写と翻訳反応が行われる試験系を例示できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳試験系として、翻訳を望む遺伝子の転写産物を、ウサギ網状赤血球抽出液又は小麦胚芽抽出液に添加することにより、該遺伝子がコードする蛋白質の合成反応が行われる試験系を例示できる。これらの試験を実施するための試薬が市販されている（ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社製）。
【００７５】
ｈｊ０３７９６遺伝子の発現の測定は、ｈｊ０３７９６遺伝子の転写産物（ｈｊ０３７９６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ）の測定でもよく、該ｈｊ０３７９６遺伝子の転写産物から翻訳されてなるｈｊ０３７９６の測定としてもよく、またその組合せでもよい。
ｈｊ０３７９６遺伝子の転写産物は、逆転写ポリメラーゼ鎖伸長反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）やノーザンブロット法により測定可能である。定量性の観点から、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現量の測定方法として、好ましくＲＴ−ＰＣＲ法を、より好ましくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を例示できる。
【００７６】
ｈｊ０３７９６は、例えば、免疫沈降法やウェスタンブロット法などにより測定され得る。
【００７７】
ｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系として、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｊ０３７９６とその基質であるＲｈｏファミリー蛋白質との酵素反応系を例示できる。すなわち、ｈｊ０３７９６の機能を測定可能な試験系として、ｈｊ０３７９６のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を測定可能な試験系を例示できる。
【００７８】
ｈｊ０３７９６のＧＥＦ活性は、例えば、Ｒｈｏファミリー蛋白質とｈｊ０３７９６を含む適当な緩衝液を調製し、ｈｊ０３７９６によるＲｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を行わせた後、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の増加又は発生を検出することにより測定可能である。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、エフェクター分子を用いて定量され得る。ここでのエフェクター分子は、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質には結合するが、活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質には結合しないか弱く結合するエフェクター分子であることが好ましい。具体的には、エフェクター分子の活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合部位を含む蛋白質にＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質と、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合をプルダウン法により検出し、さらに活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質を電気泳動法およびウェスタンブロット法により測定する。Ｒｈｏファミリー蛋白質によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。従って、用いるＲｈｏファミリー蛋白質の種類によって適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性化されたＣｄｃ４２は、そのエフェクター分子であるＰＡＫ−１に結合することが知られている（特許文献１）。
【００７９】
次に、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定可能なｉｎ ｖｉｖｏの試験系について説明する。
【００８０】
ｉｎ ｖｉｖｏの試験系として、培養細胞の試験系を好ましく例示できる。培養細胞の細胞内の転写／翻訳システムにより、該細胞内において、ｈｊ０３７９６遺伝子が転写／翻訳され、結果として、ｈｊ０３７９６が合成される。
【００８１】
本試験系における培養細胞はｈｊ０３７９６遺伝子を発現する限りにおいて特に制限されず、初代培養、細胞株のいずれでもよい。培養細胞の由来生物種は特に限定されないが、ヒトを含む哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。細胞内におけるｈｊ０３７９６遺伝子発現の有無は、例えばｈｊ０３７９６特異的な抗体を用いたウェスタンブロット方法により確認できる。また、本発明に係る同定方法で用いるｈｊ０３７９６遺伝子を発現する細胞は、ｈｊ０３７９６遺伝子を導入して形質転換させた細胞であってもよい。あるいはｈｊ０３７９６をコードする遺伝子とＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を共導入して形質転換させた細胞であってもよい。ｈｊ０３７９６遺伝子の導入による形質転換は、例えばｈｊ０３７９６遺伝子を含有する組換えベクターを慣用の遺伝子工学的手法で細胞にトランスフェクションすることで実施できる。ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子とＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子の共導入による形質転換は、ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含む組換えベクターとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを慣用の遺伝子工学的手法で細胞にトランスフェクションすることで実施できる。ｈｊ０３７９６遺伝子を発現する細胞として、肺癌由来細胞、大腸癌由来細胞、腎臓由来細胞を例示できる。このような細胞として、例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸癌由来）、Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌由来）をより好ましく例示できる。
【００８２】
本発明に係る同定方法で用いる細胞の培養は、用いる細胞に応じた各種培養条件（培地の組成、培養時間、培養温度、培養プレートなど）に従って適宜に実施することができる。本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）をＡ５４９又はＨＣＴ１１６に導入した結果、その細胞増殖が抑制されることを見出した（本願実施例）。Ａ５４９又はＨＣＴ１１６はいずれもヒト癌由来の細胞株である。癌細胞は、正常細胞とは異なり、足場非存在下においても増殖が可能である。低付着性プレートで培養された細胞の増殖は足場非依存的な細胞増殖であることが知られている。以上のことから、本発明に係る同定方法で用いる細胞を培養するためのプレートは、低付着性培養プレートであることが好ましい。
【００８３】
（１）の工程では、前記の試験系に被験化合物を混在させ、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する。
【００８４】
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈｊ０３７９６とＲｈｏファミリー蛋白質との酵素反応系に被験化合物を混在させる場合には、該酵素反応の前に該酵素反応溶液に被験化合物を添加してもよく、あるいは該酵素反応中に酵素反応溶液に被験化合物を添加してもよい。
【００８５】
培養細胞の試験系に被験化合物を混在させる場合には、該細胞内に被験化合物を導入してもよく、該細胞の培養上清に添加してもよい。これらの導入又は添加は、該細胞の培養からｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能の測定までの過程のいずれの時であってもよい。被験化合物が核酸の場合には、該細胞に導入することが好ましい。被験化合物が核酸の場合、自体公知の遺伝子導入方法（リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法など）により、好ましくは、リポフェクション法により被験化合物を培養細胞に導入することができる。
【００８６】
さらに、（２）（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する。このような比較として、（a）（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現量と被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現量との比較、（b）（１）で測定したｈｊ０３７９６の機能と被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の機能との比較、又は（a）及び（b）の両方の比較を例示できる。比較の結果、（１）で測定したｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能が、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を下回る（ｈｊ０３７９６遺伝子の発現量とｈｊ０３７９６の機能が共に下回る、又は、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現量とｈｊ０３７９６の機能のいずれかが下回る）場合には、被験化合物はｈｊ０３７９６を阻害すると判定できる。
【００８７】
例えば、被験化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６遺伝子の発現と比べ低減又は消滅している場合、被験化合物存在下におけるｈｊ０３７９６量が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６量と比べ低減又は消滅している場合、被験化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の機能が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６の機能と比べ低減又は消滅している場合、被験化合物存在下における活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下における活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量と比べ低減又は消滅している場合、及び、被験化合物存在下における活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質量が被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下における活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質量と比べ発生又は増加している場合の少なくともいずれかの場合には、被験化合物はｈｊ０３７９６を阻害すると判定され得る。
【００８８】
本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法において、さらに、ｉｎ
ｖｉｖｏの癌モデル動物を用いて、被験化合物が癌の予防及び／又は治療剤の有効成分であることを確認する工程を含んでいてもよい。癌モデル動物として、好ましく癌非ヒト哺乳動物、より好ましく，癌マウス又は癌ラットを例示可能である。癌種は特に制限されないが、癌モデル動物として、肺癌モデル動物又は大腸癌モデル動物を例示できる。
【００８９】
一般的には、癌モデル動物は、マウスやラットなどの非ヒト哺乳動物に対して、腫瘍細胞を移植する又は発癌物質を投与すること等により製造され得る（非特許文献３）。肺癌モデル動物として、例えば、Ａ／Ｊマウスが利用されている（非特許文献４）。前臨床試験における大腸癌の治療剤のスクリーニングを実施する際、Ａ／Ｊマウスが利用されていることも報告されている（非特許文献５）。
【００９０】
癌モデル動物に被験化合物を投与して、その病変部位の変化を確認することにより、被験化合物が癌の予防及び／又は治療剤の有効成分であることを確認することができる。例えば、癌モデル動物に被験化合物を経口投与又は非経口投与し、該モデル動物における癌病変部位の縮小若しくは消滅又は癌進行の抑制などの治療効果を確認できた場合には、被験化合物が癌の予防及び／又は治療剤の有効成分であると確認することが可能である。
【００９１】
前述のように、本発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物が細胞増殖を抑制すると考える。さらに、本発明者らは、ｈｊ０３７９６阻害化合物も抗癌活性を有すると考える。従って、本発明は、ｈｊ０３７９６阻害化合物を含有する、細胞増殖抑制剤、癌の予防及び／又は治療剤を提供する。本発明は、ｈｊ０３７９６阻害化合物を用いることを特徴とする、細胞増殖抑制方法、癌の予防及び／又は治療方法を提供する。本発明に係る細胞増殖抑制方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞増殖抑制方法でもよく、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞増殖抑制方法でもよい。
【００９２】
本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤が適用可能な癌の種類は特に限定されない。具体的には、本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤は、固形腫瘍又は非固形腫瘍のいずれにも適用可能であり、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現が認められるあらゆる種類の癌に適用可能である。例えば、胃癌 、食道癌 、大腸癌 、小腸癌 、十二指腸癌 、肺癌 、肝臓癌 、胆嚢癌 、膵臓癌 、腎臓癌 、膀胱癌 、口腔癌 、骨癌 、皮膚癌 、乳癌 、子宮癌 、前立腺癌 、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を挙げることができる。
【００９３】
本発明者らは、５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ―１、ｈｊ―２、ｈｊ―３、ｈｊ―４及びｈｊ―５）をＡ５４９又はＨＣＴ１１６に導入した結果、その細胞増殖が抑制されることを見出した（本願実施例）。従って、本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤が適用可能な癌種として、肺癌又は大腸癌を好ましく例示できる。
【００９４】
本発明に係る細胞増殖抑制剤および本発明に係る癌の予防及び／又は治療剤の有効成分はいずれも、適当な医薬担体と組合せて癌の予防及び／又は治療剤として用いられる。製剤化にあたっては、その剤形に応じて適切な製剤用添加物を用いることができる。
【００９５】
このような製剤用添加物として、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐH調節剤、安定化剤等を用いることができる。
【００９６】
投与経路は、全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。投与経路は、疾患や症状に応じて選択する。例えば、静脈投与、動脈投与、皮下、皮内、又は筋肉内投与を選択することができる。腫瘍患部に直接に抗癌剤を投与してもよい。
【００９７】
必要な容量範囲は、有効成分の有効性、疾患、患者の症状、投与経路、及び担当医師の判断等によるが、一般的には、患者の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇ程度である。
【００９８】
経口投与に適する製剤の例として、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤を挙げることができる。非経口投与に適する製剤の例として、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリ−ム剤、貼付剤を例示できる。
【００９９】
さらに、本発明はｈｊ０３７９６及び／又はｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含有する、上記同定方法用試薬キットを提供する。
【０１００】
本試薬キットには、上記同定方法に用いられるマーカー物質、緩衝液、塩、安定化剤、防腐剤などが含まれていてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【０１０１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。
【実施例１】
【０１０２】
（ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物の合成）
細胞内のｈｊ０３７９６遺伝子発現が該細胞増殖に与える影響を評価するために、まずｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物を合成した。
【０１０３】
具体的には、ＲＮＡ干渉によりｈｊ０３７９６遺伝子発現を阻害すると考えられる以下に示す１）〜５）の二重鎖ポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を合成（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社に委託）した。
【０１０４】
１）ｈｊ―１
5´- CCAAGACAGUGGAGGAGAAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号１)
3´ dTdTGGUUCUGUCACCUCCUCUU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号２)
２）ｈｊ―２
5´- CGAGAAAGCCCGAGCAGCAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号３)
3´ dTdTGCUCUUUCGGGCUCGUCGU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号４)
３）ｈｊ―３
5´- CAGAAGUCCUGGAGACACAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号５)
3´ dTdTGUCUUCAGGACCUCUGUGU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号６)
４）ｈｊ―４
5´- CCAAAGGACUGGUAAGAAAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号７)
3´ dTdTGGUUUCCUGACCAUUCUUU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号８)
５）ｈｊ―５
5´- GUGAGAAACCUUAGAGAGAdTdT 3´ (dTdTを除く部分配列：配列番号９)
3´ dTdTCACUCUUUGGAAUCUCUCU - 5´ (dTdTを除く部分配列：配列番号１０)
また、対照の陰性化合物として、６）の二重鎖ポリヌクレオチド(ｓｉＲＮＡ)を合成（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社に委託）した。ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡは、哺乳動物の細胞には存在しない配列を二本鎖にしたRNAであって、植物の葉緑体遺伝子の中にある配列から選出された。
【０１０５】
６）ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ
5´- GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT 3´
3´ dTdTCGCGCGAAACAUCCUAAGC - 5´
次に、ｈｊ―１〜５がｈｊ０３７９６遺伝子発現に与える影響を評価する為に、これらの二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれをＡ５４９（ヒト肺癌由来細胞株）又はＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来の細胞株）に導入し、その導入後、該細胞内におけるｈｊ０３７９６を検出した。
【０１０６】
前日に24well plateへ2.5 x 104 cells/wellで播種したA549又はHCT116に、導入試薬であるLipofectamine2000とともに20 pmol/wellの上記６種類の二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれを導入した。二重鎖ポリヌクレオチドを導入後2日目にA549又はHCT116を回収し、凍結させた。凍結サンプルを融解後、Lysis buffer（2M Thiourea, 7M Urea, 4%(w/v) CHAPS, 30mM Tris-HCl(pH8.5)）にてA549又はHCT116の細胞溶解液を調製した。細胞溶解液の総蛋白質濃度を測定後、総蛋白質量を一定にした細胞溶解液をSDS-PAGE装置に供与し、western blot法を実施した。ｈｊ０３７９６の検出量を向上させるため、Can Get Signal（TOYOBO社）の溶液を用いて抗体反応を実施した。検出試薬として、ECL plus（Amersham社製）を使用した。HCT116を用いた実験において、Survivinに対してRNA干渉作用を有する二重鎖ポリヌクレオチドを用いた。
【０１０７】
ｈｊ―１〜５それぞれを導入したＨＣＴ１１６において、ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡをＨＣＴ１１６に導入した場合と比べて、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現抑制が確認された（図３）。さらに、ｈｊ―１〜５それぞれを導入したＡ５４９において、mock又はｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡをＡ５４９に導入した場合と比較すると、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現抑制が確認された（図４）。ｈｊ―１〜５の全二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子の発現抑制効果を有することが明らかとなった。
【０１０８】
すなわち、ｈｊ―１〜５はｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物であることが明らかとなった。
【０１０９】
（ｈｊ０３７９６遺伝子を阻害する二重鎖ポリヌクレオチドが細胞増殖に与える影響の検討）
ｈｊ―１〜５はｈｊ０３７９６遺伝子発現を阻害する二重鎖ポリヌクレオチドであることが確認されたため、これらの二重鎖ポリヌクレオチドが細胞増殖に与える影響を３種類の細胞株を用いて検討した。３種類の細胞株は、Ａ５４９（ヒト肺癌由来細胞株）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌由来細胞株）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓由来細胞株）である。
【０１１０】
前日に24well plateへ以下の播種数で播種した各細胞株に、導入試薬であるLipofectamine2000とともに20 pmol/wellの上記６種類の二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれを導入した。siRNAによる細胞の表現型の変化を確認するため、導入1日、2日と4日後にTetraColor Oneキットによって細胞増殖を数値化した。
細胞播種数
HEK293： 2.5 x 104 cells/well
HCT116： 5.0 x 104 cells/well
A549： 2.5 x 104 cells/well
各二重鎖ポリヌクレオチドの導入による細胞増殖抑制効果の結果を図１と図２に示す。導入2日後ではｈｊ−１〜５によるＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９の増殖抑制が確認された。また、導入４日後においても、ｈｊ−１〜５全ての二本鎖ポリヌクレオチドは、ＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９の細胞増殖を抑制することを確認した。
【０１１１】
以上の結果から、ｈｊ―１〜５全ての二重鎖ポリヌクレオチドはｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害することにより、細胞増殖が抑制すると考えられる。
【実施例２】
【０１１２】
（ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害による足場非依存的増殖抑制効果の検討）
線維芽細胞などの正常付着細胞は、足場となる細胞外基質に接着することにより生存ならびに細胞分裂が可能となる。一方、癌細胞は、正常細胞とは異なり、足場非存在下においても増殖が可能である。
そこで、ｈｊ―１〜５のｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害による細胞増殖抑制が、癌細胞の特徴の１つである足場非依存的増殖の抑制であるか否かについて検討した。
【０１１３】
前日に6well plateへ8 x 104 cells/wellで播種したA549に、導入試薬であるLipofectamine2000とともに80 pmol/wellの5種類のｈｊ―１〜５それぞれを導入した。足場非依存的増殖抑制のポジティブコントロールとして細胞の接着に関与するβ-cateninに対するsiRNA(b-cat-5；非特許文献６に基づき設計された下記７)に記載のsiRNA；DHRMACON社製)を導入した。導入6-9時間後にHydroCell（12 well plate, CellSeed社製）またはnormal plate(12 well)に播種し、1、2、4日後にTetraColor Oneキットによって細胞増殖を数値化し、足場非依存的な増殖の確認を実施した。なお、HydroCellは超親水性のポリマーがコーティングされており、付着性細胞が接着できない培養プレートである。足場非依存的増殖を確認するには、従来法として軟寒天法があるが、軟寒天法は操作が煩雑であり、しかも細胞数を測定する際、軟寒天に覆われているため、コロニー数を判定するのも困難である。一方、HydroCellによる培養は、通常の培養法で培養可能であり、軟寒天法を反映すると考えられているため、軟寒天法に替わる足場非依存的増殖試験と位置付けている。
【０１１４】
７）β-cateninに対するsiRNA(b-cat-5)
5'- AGCUGAUAUUGAUGGACAGdTdT -3'
3'- dTdTUCGACUAUAACUACCUGUC -5'
ｈｊ―１〜５の各二重鎖ポリヌクレオチドによりＡ５４９の増殖が抑制されていることが確認された（図７）。その増殖抑制はβ-cateninに対するsiRNAによる増殖抑制よりも効果が高かった。コントロールであるmockとscramble siRNAでは足場非依存的にも増殖していることからも、HydroCellでの培養による増殖抑制ではなく、siRNA導入による現象であることが示唆された。また、normal plateにおいてhj03796遺伝子に対するsiRNAを導入した細胞は、増殖速度は遅いものの、経時的に増殖していることが確認された（図８）。
低分子G蛋白質であるＲｈｏファミリー蛋白質は、接着、細胞運動、遺伝子発現等に関与している。Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化はＲｈｏ−ＧＥＦにより制御されている。細胞の足場依存的な増殖は、その接着に関与していることから、ｈｊ０３７９６遺伝子に対するsiRNAの導入によってｈｊ０３７９６レベルが減少した結果、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化が低下し、足場非依存的な増殖が抑制されたかもしれない。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現を阻害する二重鎖ポリヌクレオチドを提供できる。本二重鎖ポリヌクレオチドを利用して、ｈｊ０３７９６遺伝子の発現の阻害、ｈｊ０３７９６の阻害又は細胞増殖の抑制を実施できる。また、本発明によれば、ｈｊ０３７９６の阻害を指標とする、細胞増殖抑制剤又は癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供できる。本二重鎖ポリヌクレオチド、本同定方法により同定された細胞増殖抑制剤或いは癌の予防及び／又は治療剤の有効成分を利用して、癌の治療及び／又は予防を実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれを３種類の細胞株（Ａ５４９（図上部）、ＨＣＴ１１６（図中央）、ＨＥＫ２９３（図下部））それぞれに導入した後２日目の該細胞の増殖を示す。各図の横軸は導入した化合物（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ、ｈｊ−１〜５）を表し、図の縦軸は各化合物を導入した後２日目の各細胞の増殖度合いを表す。増殖度合いはｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡが導入された各細胞の増殖に対する比で表される。
【図２】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれを３種類の細胞株（Ａ５４９（図上部）、ＨＣＴ１１６（図中央）、ＨＥＫ２９３（図下部））それぞれに導入した後４日目の該細胞の増殖を示す。図の横軸は導入した化合物（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ、ｈｊ−１〜５）を表し、図の縦軸は各化合物を導入した後４日目の各細胞の増殖度合いを表す。増殖度合いはｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡが導入された各細胞の増殖に対する比で表される。
【図３】５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ−１〜５）のｈｊ０３７９６遺伝子発現阻害効果を示す。５種類の該二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれをＨＣ１１６に導入した後４日目の該細胞の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した。Ｓｃｒａｍｂｌｅ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎはそれぞれ陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）又はＳｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の発現阻害化合物を導入したＨＣＴ１１６の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。また、ｈｊ０３７９６Ｐｌａｓｍｉｄは、ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含有する組替えベクターを導入したＨＥＫ２９３の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。矢頭はｈｊ０３７９６のバンド位置を示す。
【図４】５種類の二重鎖ポリヌクレオチド（ｈｊ−１〜５）のｈｊ０３７９６遺伝子発現阻害効果を示す。５種類の該二重鎖ポリヌクレオチドそれぞれをＡ５４９に導入した後４日目の該細胞の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した。Ｍｏｃｋ、Ｓｃｒａｍｂｌｅはそれぞれ二重鎖ポリヌクレオチドを導入しないあるいは陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。ｈｊ０３７９６Ｐｌａｓｍｉｄは、ｈｊ０３７９６をコードする遺伝子を含有する組替えベクターを導入したＨＥＫ２９３の細胞溶解液サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供与し、ウェスタンブロット法でｈｊ０３７９６を測定した結果を示す。矢頭はｈｊ０３７９６のバンド位置を示す。
【図５】低付着性培養プレートであるＨｙｄｒｏＣｅｌｌ上で陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９を培養した場合の該Ａ５４９の形態を示す。
【図６】通常プレートであるＮｏｒｍａｌＰｌａｔｅ上で陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９を培養した場合の該Ａ５４９の形態を示す。
【図７】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれが足場非依存的な細胞増殖に与える影響を示す。各化合物をＡ５４９に導入し、導入６−９時間後に低付着性培養プレートであるＨｙｄｒｏＣｅｌｌ上に該Ａ５４９を播種し、播種後１、２又は４日後の該Ａ５４９の細胞増殖を数値化した。Ｍｏｃｋ、Ｓｃｒａｍｂｌｅはそれぞれ二重鎖ポリヌクレオチドを導入しないあるいは陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示す。ｂ−ｃａｔ−５は陽性対照化合物（β-catenin遺伝子の発現阻害化合物）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示す。
【図８】ｈｊ０３７９６遺伝子の発現阻害化合物（ｈｊ−１〜５）それぞれが細胞増殖に与える影響を示す。各化合物をＡ５４９に導入し、導入６−９時間後に通常プレート上に該Ａ５４９を播種し、播種後１、２又は４日後の該Ａ５４９の細胞増殖を数値化した。Ｍｏｃｋ、Ｓｃｒａｍｂｌｅはそれぞれ二重鎖ポリヌクレオチドを導入しないあるいは陰性対照化合物（Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示すｂ−ｃａｔ−５は陽性対照化合物（β-catenin遺伝子の発現阻害化合物）を導入したＡ５４９の細胞増殖を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１：ｈｊ―１と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号２：ｈｊ―１と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号３：ｈｊ―２と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号４：ｈｊ―２と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号５：ｈｊ―３と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号６：ｈｊ―３と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号７：ｈｊ―４称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の配列。
配列番号８：ｈｊ―４と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号９：ｈｊ―５と称した二重鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号１０：ｈｊ―５と称した二重鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖（ただしdTdTを除く）の塩基配列。
配列番号１１：グアニンヌクレオチド交換因子として機能する蛋白質（配列番号１２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１２：グアニンヌクレオチド交換因子として機能する蛋白質。
配列番号１３：配列番号１１の第５８１番目から第１６７５番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１４：配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列の第９０番目のリジン（Ｌｙｓ）から第４５４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までからなるアミノ酸配列。
配列番号１５：５´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンに対応するコドンとを有し、それに続いて、配列番号１１の第５８１番目から第１６７５番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１６：配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）が付加されたアミノ酸配列。
配列番号１７：Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードするポリヌクレオチド。
配列番号１８：Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメイン。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるいずれか１のＲＮＡ；
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、及び
（５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ。
【請求項２】
下記の群より選ばれるいずれか１の二重鎖ポリヌクレオチド；
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、及び、
（５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項３】
オーバーハング配列が２つのデオキシチミジル酸からなる塩基配列である、請求項２に記載の二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の工程を含む、細胞増殖抑制剤の同定方法；
（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（２）（１）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【請求項５】
以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（２）（１）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）リポフェクション法により被験化合物を肺癌由来の培養細胞に導入する工程、
（２）（１）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（３）（２）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された肺癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【請求項７】
さらに、被験化合物を肺癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、請求項５又は６に記載の肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（２）（１）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【請求項９】
以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）リポフェクション法により被験化合物を大腸癌由来の培養細胞に導入する工程、
（２）（１）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（３）（２）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された大腸癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【請求項１０】
さらに、被験化合物を大腸癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、請求項８又は９に記載の大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【請求項１１】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現阻害剤。
【請求項１２】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６の阻害剤。
【請求項１３】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１５】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する方法。
【請求項１６】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６を阻害する方法。
【請求項１７】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、細胞増殖の抑制方法。
【請求項１８】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌の予防及び／又は治療方法。
【請求項１９】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、細胞増殖抑制剤の同定用試薬キット。
【請求項２０】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、肺癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【請求項２１】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、大腸癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【請求項１】
下記の群より選ばれるいずれか１のＲＮＡ；
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、
（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ、及び
（５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡ。
【請求項２】
下記の群より選ばれるいずれか１の二重鎖ポリヌクレオチド；
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、
（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド、及び、
（５）配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列で表されるＲＮＡの３´末端にオーバーハング配列を結合させてなるポリヌクレオチドとからなる二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項３】
オーバーハング配列が２つのデオキシチミジル酸からなる塩基配列である、請求項２に記載の二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の工程を含む、細胞増殖抑制剤の同定方法；
（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（２）（１）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【請求項５】
以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（２）（１）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む、肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）リポフェクション法により被験化合物を肺癌由来の培養細胞に導入する工程、
（２）（１）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（３）（２）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された肺癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【請求項７】
さらに、被験化合物を肺癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、請求項５又は６に記載の肺癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）被験化合物存在下、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能を測定する工程、及び
（２）（１）で測定されたｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下におけるｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現及び／又はｈｊ０３７９６の機能とを比較する工程。
【請求項９】
以下の工程を含む、大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法；
（１）リポフェクション法により被験化合物を大腸癌由来の培養細胞に導入する工程、
（２）（１）の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を測定する工程、及び
（３）（２）で測定されたｈｊ０３７９６と、被験化合物非存在下若しくは陰性対照化合物存在下で培養された大腸癌由来の培養細胞に存在するｈｊ０３７９６を比較する工程。
【請求項１０】
さらに、被験化合物を大腸癌モデル非ヒト哺乳動物に投与してその病変部位の変化を確認する工程を含む、請求項８又は９に記載の大腸癌の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法。
【請求項１１】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現阻害剤。
【請求項１２】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、ｈｊ０３７９６の阻害剤。
【請求項１３】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを含有する、癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１５】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する方法。
【請求項１６】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、ｈｊ０３７９６を阻害する方法。
【請求項１７】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、細胞増殖の抑制方法。
【請求項１８】
請求項２又は３に記載の二重鎖ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌の予防及び／又は治療方法。
【請求項１９】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、細胞増殖抑制剤の同定用試薬キット。
【請求項２０】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、肺癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【請求項２１】
ｈｊ０３７９６をコードするポリヌクレオチド及び／又はｈｊ０３７９６を含有する、大腸癌の予防及び／又は治療剤の同定用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−２２８１１（Ｐ２００８−２２８１１Ａ）
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０１４５１（Ｐ２００６−２０１４５１）
【出願日】平成１８年７月２５日（２００６．７．２５）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２５日（２００６．７．２５）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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