グラフト化ポリリジンデンドリマーの製造方法
沈殿物状の疎水性ポリペプチドを製造するための活性化α−アミノ酸モノマーの使用であって、そのポリペプチドが水性溶媒中で前記活性化α−アミノ酸モノマーの重合から生じ、前記溶媒中において再溶解できる使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に医薬組成物の製造の枠内における、グラフト化ポリリジンデンドリマーの製造方法、前記方法の実施により得られるグラフト化ポリリジンデンドリマー、及び前記ポリリジンデンドリマーの使用に関する。
【０００２】
高度に分岐したポリリジン合成に関する文献において、２つの方法が記載されている。段階的な方法は、Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒらにより始められ（１、２）、ＮＣＡアミノ酸重合方法はＫｌｏｋらにより始められた（３、４）。
最初の高度に分岐したポリリジン（通常のデンドリマーとして分類されている）は、１９８１年の初期に、ＤｅｎｋｅｗａｌｔｅｒによりＮα，Ｎ’ε−ジ−（ｔｅｒ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンから、一連のカップリング及び脱保護反応を介して調製された。
【０００３】
こうした合成は、リジンのカルボキシル基をベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）により保護されているリジンに一連のリジン単一層を添加することからなり、下記の化合物、ＢＨＡＬｙｓ、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４Ｌｙｓ８、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４Ｌｙｓ８Ｌｙｓ１６、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４Ｌｙｓ８Ｌｙｓ１６Ｌｙｓ３２等を徐々に生成することからなる。
カップリング反応は、無水溶媒中（ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ）で行われる。
得られた化合物は、表面上に多数のアミン官能基を有する。水中では、それらはポリカチオンである。
この段階的な合成方法は、文献において常に繰り返されている。
それは、例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら（５、６）、Ｂａｉｇｕｄｅら（７）及びＭｅｎｚとＣｈａｐｍａｎ（８）の研究において使用された。
【０００４】
例えば、第１段階では、Ｍａｔｔｈｅｗｓらは、Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒのポリリジンと同じポリリジンを合成した。第２段階では、それらは、各々の遊離アミン官能基、アニオン性官能基（−ＣＯ２−、ＳＯ３−等）を有する基に共有結合することによりそれらの表面を修飾し、そしてポリリジンコアをもつ新しいポリアニオン系材料を得た。こうした材料は、重要な抗ウィルス性（５）、抗菌性及び駆虫性（６）を有することが発見された。Ｂａｉｇｕｄｅらは、それらの末端のアミン官能基をオリゴ糖に結合することによりデンドリマーの表面を修飾し、得られた材料を使用し、ワクチンを作製した（７）。Ｔａｋｕｒｏらは、発生期の段階においてそれらを使用し、遺伝子をトランスフェクトした（９）。Ｃｈｏｉらは、ポリエチレングリコール−α，ω−ジアミンの２つの−ＮＨ２ｓから段階的にポリ−Ｌ−リジンデンドリマーを構築し、得られた材料は優れた遺伝子トランスフェクタントであることを示した（１０）。こうした多くの特性は、高度に分岐したポリリジンの新規材料としての大きな群のすべて又はその一部の利点をはっきり示していると思われる。
【０００５】
こうしたポリリジンデンドリマー（１、２）は、最大分岐比を有すると考えられている。
さらに、それでもなお、こうした材料の利点は、段階的な合成方法の複雑さを隠してはいけない。例えば、脱保護及び精製工程に加えて、６つの工程が６３リジンユニットのオリゴコンデンセイション（oligocondensation）に必要である。また、こうした無水溶媒中で非リジンプライマー（ＢＨＡ）を使用することの必要性に注意することも重要であり、それらの可能な生物相互作用に関する問題を提起することができる。
【０００６】
前記の段階的な合成と異なり、Ｋｌｏｋらにより最近提案された第２の方法は、高度に分岐したポリリジンの合成に関して多段階の手順でリジンＮ−カルボキシ無水物を重合することからなる（３、４）。アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）は、周知のペプチド前駆体である（１１）。こうした化合物は加水分解に敏感であり（１２、１３）、ある特定の研究を実施するための溶媒として使用される水を妨害しない（１４〜１７）。一般に、それでもなお、それは無水培地で、α−アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物を重合することが推奨されている（１１、１８、１９）。推奨される無水溶媒には、ＤＭＦ、ジオキサン及びＤＭＳＯがあり、好ましい溶媒はＤＭＦである（２０）。
【０００７】
リジンＮ−カルボキシ無水物からの高度分岐ポリリジン合成への第２アプローチを行なった著者は、無水反応培地の使用について推奨に従った。無水ＤＭＦ中における合成方法は、これに由来する。
この方法では、第１工程は、イプシロン官能基上で異なるように保護された２つのＮ−カルボキシ無水物リジン（Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡとＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡとの比が５／１〜２／１である）を共重合することからなる。保護基が選択され、その結果として、脱保護を選択することができる。加水分解によりＮＣＡを失うことを避けるために、適切な処置により注意深く無水にさせた溶媒（ＤＭＦ）中で共重合を実施する。共重合が行われるこうした条件下で、ＮＣＡの合成から得られる微量の酸を注意深く取り除かなければならない（２１）。無水ＤＭＦでは、アミン（例えば、ヘキシルアミン）により共重合がプライムされる。反応時間は５日間である。反応の終わりに、反応培地を水に注ぎ、直鎖のポリリジンポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｂｏｃ−Ｌ−リジン］）が沈殿する。濾過及び乾燥後、生成物はＢｏｃ官能基を抑制する酸処理（ＣＦ３ＣＯ２Ｈで１時間）が行なわれるが、Ｚ官能基は保持している。従って、ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）は形成される。その後、それを洗浄し、そして注意深く乾燥する。この直鎖ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）は、著者が「コア（ｃｏｒｅ）」と呼ぶ材料を構成しており、その後の工程において、分岐ポリリジンはそれから得られる。
【０００８】
無水ＤＭＦ中において、適切に精製された前記２つのＮＣＡ（Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ）の混合物と、この（コア）材料を、５日間反応させる。この反応の間に、この直鎖ポリリジンの遊離アミン官能基（例えば、Ｂｏｃ）は、Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡと反応し、新しい「分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｂｏｃ−Ｌ−リジン］）」を形成する。前記１つと同様の方法により形成される材料の回収後、この材料は、Ｂｏｃ官能基を取り除く酸処理（ＣＦ３ＣＯ２Ｈ）が行なわれ、Ｚ官能基は保持する。得られる生成物「Ｇ０と呼ばれる分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）」は、注意深くさらに精製され、そして乾燥される。
その後、無水ＤＭＦ中における５日間の、２つの試薬Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡの混合物との新しい反応において、この生成物はプライマーとして使用される。回収、乾燥、酸処理及び再乾燥後、生成物「Ｇ１と呼ばれる分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）」を得る。
【０００９】
無水ＤＭＦ中における５日間の、２つの試薬Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡの混合物との新しい反応において、この生成物Ｇ１が、次にはプライマーとして使用される。回収、乾燥、酸処理及び再乾燥後、生成物「Ｇ２と呼ばれる分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）」が得られる。
その後、生成物Ｇ０、Ｇ１又はＧ２は、非常に酸性な培地（ＨＢｒ／ＣＨ３ＣＯ２Ｈ）での処理が行なわれる。この処理は残存しているＺ官能基を抑制し、「分岐ポリ（Ｌ−リジン）Ｇ０，Ｇ１又はＧ２」が得られる。
その後、こうした「分岐ポリ−Ｌ−リジン」をジエチルエーテルで沈殿し、凍結乾燥する。
従って、この方法は、Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒらにより最初に記載された構造と異なる構造をもつ「分岐ポリ−Ｌ−リジン」を得ることを効果的に可能にする。
【００１０】
こうした「分岐ポリ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅｓ」（３）は、２つの１Ｈ−ＮＭＲシグナルのＨｂ／Ｈａ≦０．０８の比から推論される３０％以下のグラフト比の特徴を有する（表１）。Ｈｂはイプシロン位において隣接リジンに結合しているリジンユニットのキラルプロトンを表し、Ｈａはアルファ位において隣接リジンに結合しているリジンユニットのキラルプロトンを表している。しかし、異なる共鳴場を有するＮ−末端リジン（Ｈｃ）及びＣ−末端リジン（Ｈｄ）のプロトンを排除する。従って、こうしたｐｏｌｙ−Ｌ−リジンは、重合プライマーとして、第一級アミン（ヘキシルアミン）をもつ分岐ポリペプチドのネットワーク（３０％以下のグラフト比）を形成する。
《表１》
【００１１】
結果として、本発明の目的は、前記の複雑な方法を少なくすることを可能にさせる、ポリペプチド、特にポリリジンデンドリマーの製造方法を提供することである。
詳細には、本発明の目的は、公知の製造方法よりも速く、そして少ない合成工程及び／又は精製工程を含む、ポリペプチド、特にポリリジンデンドリマーの製造方法を提供することである。
本発明の別の目的は、本方法の実施により得ることができるデンドリマーにも関する。
最後に、本発明の別の目的は、医薬組成物又は防腐組成物の製造、並びに免疫型の分析のための、本発明の方法の実施により得られるデンドリマーの使用にも関する。
本発明は、沈殿物状の疎水性ポリペプチドの製造のための活性化α−アミノ酸モノマーの使用であって、前記ポリペプチドが水性溶媒中で前記活性化α−アミノ酸モノマーの重合から生じ、そして前記溶媒中において再溶解できるものである、前記使用に関する。
【００１２】
用語「活性化α−アミノ酸モノマー」は、常温及び常圧条件下においてα−アミノ酸を重合させる修飾を受けたα−アミノ酸を意味する。
用語「疎水性ポリペプチド」は、使用される水中又は水和−有機溶媒中において不溶性であるポリペプチドを意味する。溶質（ポリペプチド）の疎水性特性を、水中又は有機溶媒（一般に、基準として使用されるオクタノール）中における溶質の分配係数Ｐにより評価することができる。分配係数Ｐは、（有機相中における溶質の濃度）／（水相中における溶質の濃度）の比として定義される。Ｐの対数を、Ｒｅｋｋｅｒ定数により評価するか（２２）、又は有機相中の濃度と水相中の濃度との比により実験的に測定することができる。
用語「水性溶媒」は、大部分が水を含んでいる（少なくとも５０重量％）、任意の溶媒又は混和性の溶媒の混合物を意味する。
用語「再溶解」は、Ｒｅｋｋｅｒ定数の修正により疎水性ペプチドの水溶液に対する復帰を意味し、例えば、リジンのイプシロン官能基を保護している基を放出することにより得ることができる。
【００１３】
この使用の利点は、以下の実施することが簡単な基本的なサイクル方法を介することである。（１）制御された大きさのペプチドを合成し、それらを容易に回収すること、（２）脱保護によりそれらを再溶解すること、（３）制御された方法においてもそれらの大きさを増加させ、反応培地から容易に、均一にそれらを回収することが、可能である。
【００１４】
前記の使用の特定の実施態様では、活性化α−アミノ酸は、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、α−アミノ酸Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、α−アミノ酸硫化カルボニル、α−アミノ酸無水炭酸、及びアミノチオ酸−酸化剤から選択される。
α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）は、文献に記載されている方法（２３−２９）のいずれか１つにより調製されるが、Ｐａｓｃａｌらにより分析された間接方法によっても調製される（２２）。
【００１５】
前記の使用の別の特定の実施態様では、活性化α−アミノ酸は、下記式（１）で表されるα−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）である。
【化１】
（式中、Ｒは天然又は修飾α−アミノ酸の側鎖を示す）
用語「天然アミノ酸」は、生態系において発見されるアミノ酸を意味する。
用語「修飾されたアミノ酸」は、側鎖（Ｒ）において修飾を受けている天然アミノ酸を意味する。
【００１６】
前記使用のさらに特定の実施態様では、Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマーは、水性溶媒中においてポリリジンを製造するために使用される。
用語、ポリリジンは、ポリマーの大部分の単一成分がリジンであるポリマーを意味する。
Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマーにおいては、εアミノ基を保護するか、又は保護しないことができる。
用語「アミノ基の保護」は、反応性を減少するか又はさらになくし、分子の疎水性特性を修飾するための、アミノ基の上に保護基と呼ばれる化学基の可逆的な固定を意味する。
【００１７】
本発明は、少なくとも１つの第一級又は第二級アミン基を含むプライマーから、グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーを製造する方法であって、Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマー、並びに、場合により１種以上の他のα−アミノ酸ＮＣＡモノマー（特には、Ｌ−オルニチン−ＮＣＡ、Ｌ−グルタミン酸−ＮＣＡ及びそのγ−アミド、Ｌ−アスパラギン酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−ジアミノ−２．４−酪酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−チロシン−ＮＣＡ、Ｌ−セリン−ＮＣＡ、Ｌ−トレオニン−ＮＣＡ、Ｌ−フェニルアラニン−ＮＣＡ、Ｌ−バリン−ＮＣＡ、Ｌ−ロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−イソロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−アラニン−ＮＣＡ、並びにグリシン−ＮＣＡを含むリストから選択される）の水性溶媒中での前記プライマーへの添加工程を含む、前記製造方法にも関する。最終材料の表面機能を修飾するために、こうした他の（ＮＣＡ）モノマーをグラフト化デンドリマー構成の最終段階で使用することができる。
【００１８】
用語「ホモポリリジン」は、リジンのみにより構成されるポリリジンを意味する。
用語「ヘテロポリリジン」は、３０モル％を超えるリジンにより構成され、種々の天然ユニットも含んでいるポリリジンを意味する。
用語「グラフト化デンドリマー」、特にグラフト化ポリリジンデンドリマーは、高分子の構造がＤｅｎｋｅｗａｌｔｅｒ（１）により最初に記載されたデンドリマーの構造よりも曲げやすく、伸びやすく、そして規則正しくないが、Ｋｌｏｋら（３、４）の分岐分子の構造よりも構造化されている高分子を意味する。Ｆｒｅｃｈｅｔ及びＴｏｍａｌｉａにより編集された研究「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ」（３１）の１８頁に示されたように、前記の柔軟性構造は、従来のデンドリマーの特性と異なる特有の特性を有する。
【００１９】
用語「プライマー」は、重合プロセスをプライムすることができる任意の化学種を意味する。活性化アミノ酸の場合では、プライマーは、求核種、例えば第１Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ１２アルキルジアミン、第２又は第３Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミン、ＵＶ又は蛍光により検出できる多環芳香族のアリールアミン、検出できる放射性原子を有する第１又は第２アルキル又はアリールアミン、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するアミノ酸、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するペプチド、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するデンドリマー、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するポリマーである。
【００２０】
第ｉ（ｉ≧２）世代のデンドリマーの合成に関して、使用されるプライマーは第ｉ−１世代の脱保護されたグラフト化デンドリマーを表す。
最初の活性アミノ酸又は複数のアミノ酸と同一のユニットのみを含むペプチドを生成することが望ましい場合、本発明による第１世代のデンドリマーの合成の間に、プライマー、例えば外部のプライマーを反応混合物に添加することは不可能である。この場合、ＮＣＡ又はＮＣＡｓの加水分解（溶媒中における水の存在下により開始される）は、プライミングを必要とするアミノ酸（１種又は複数）を放出する。従って、第１世代の合成（Ｐ１と称する）に関して、外部のプライマーを使用するか又は使用しないことがあり、１つが使用される場合には、使用されるアミノ酸モノマーと異なることがある。
【００２１】
ホモポリリジンデンドリマーの合成の特定の場合において、外部のプライマーを第１世代生成物（Ｐ１）の合成工程に使用しない場合、プライマーとしてε保護されたリジンを使用することにより得られたものに対して、同じ結果が得られる。外部のプライマーとして保護されていないリジンについて、鎖の伸びは、プライム点として２つのα及びεアミン官能基を有する。これら２つの場合において、反応収率は、外部のプライマーを使用しない場合よりも５％大きい。一方、第２世代生成物（Ｐ２）、第３世代生成物（Ｐ３）又は第ｎ世代生成物（Ｐｎ）をもたらす各々の後に続く工程では、使用されるプライマーは、工程Ｐｎ−１において得られる生成物である。
【００２２】
前記の製造方法の特定の実施態様では、モノマーはＬ−リジン−ＮＣＡのみであった。
前記の製造方法の別の特定の実施態様では、Ｌ−リジン−ＮＣＡが、特には、
【化２】
から選択される基によって、Ｎεにおいて保護された。
前記の基は、疎水性のオーダー増加において分類され、それぞれのＲｅｋｋｅｒ定数はｌｏｇＰ＝−１．５２８、−０．９４６、０．９６４、１．１２４、２．８４９、５．８１により与えられる。
有利には、保護基の性質によって、得られるポリリジンの大きさを調節することを可能にする。保護基が疎水性になればなるほど、ポリリジンの沈殿を促進するために必要とされるポリリジン中に存在する保護されたリジンユニットの数は小さくなる。従って、弱疎水性保護基（Ｆｏｒｍｙｌ）で得られたポリリジンの大きさは、更に疎水性の基（ＴＦＡ）で得られたポリリジンの大きさよりも大きい。
【００２３】
前記製造方法の別の特定の実施態様では、プライマーは、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、ホモポリリジン、ポリ（エチレングリコール）−α、ω−ジアミン、ヘテロポリリジン、ヘテロペプチド又はホモペプチドから選択される。
用語「ホモペプチド」は、ペプチドの残基すべてが同じであるペプチドを意味する。
用語「ヘテロペプチド」は、異なる性質の残基により構成されるペプチドを意味する。
前記製造方法の別の実施態様では、溶媒のｐＨが約３〜９である。
このｐＨの使用は、ペプチド結合の安定性の範囲を表し（３２）、この範囲外のｐＨと比較して反応収率の増加をもたらす。
好ましい実施態様によれば、本発明は、前記１世代のグラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマー（Ｐ１）の製造方法に関し、下記の
沈殿物状の第１世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、Ｎε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡをプライマーに添加する工程、
第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程において得られた第１世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程を含む。
【００２４】
用語「世代（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」は、この高分子の各々の成長段階の間において得られる生成物を意味する。
用語「第１世代の（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １）」は、外部のプライマーなしか、又は前記ＴＦＡ−Ｌ−リジン又は他のどんなプライマーももっている、ＴＦＡ−Ｌ−リジンＮＣＡの第１重合反応の生成物を意味する。
本発明による第１世代のグラフト化デンドリマーは直鎖状であることに注意されたい。
前記第１世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーの製造方法の好ましい実施態様では、プライマーは、Ｎεにおいて保護されているか、又は保護されていないＬ−リジンである。
プライマーとしてＮε保護されているＬ−リジンの使用によって、Ｌ−リジンのホモポリペプチドが得ることができるようになる。
保護されていないＬ−リジンの使用によって、それぞれα及びεアミンから開始する２つのホモポリペプチドＬ−リジン鎖の伸長を可能にする。
【００２５】
前記１世代のヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法の別の好ましい実施態様では、プライマーはポリ（エチレングリコール）−α，ω−ジアミンであり、その分子量は１００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、好ましくは１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａである。
本発明の別の好ましい実施態様では、前記第１世代のホモポリリジンデンドリマーの製造方法は、以下の
第１世代の保護されたポリリジンデンドリマーの沈殿物を得るため、プライマーの添加がないか、又はＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジンプライマーを含む、約６〜約８のｐＨの水溶液に、ＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程、及び
分子量約１，４００Ｄａ、特に１，４５０Ｄａであり、約１．２の多分散性インデックスを有し、そしてリジンの８ユニットの平均重合度に相当する、直鎖の第１世代のポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程で得られたポリリジンポリマーを脱保護する工程、を含む。
【００２６】
前記及びこの後において、用語「平均分子量」は、数平均分子量
[式１]
（式中、合計は可能な分子量すべてに関し、Ｎｉは分子量Ｍｉを有する分子の数である）を意味する。重量平均分子量は、
[式２]
により定義される。多分散性インデックス（又は、多分子）は、Ｉ＝Ｍｗ／Ｍｎにより定義される。同様に、数平均重合度は、
[式３]
により定義され、そして重量平均重合度は、
[式４]
により定義される。用語「平均重合度」は、ポリマー鎖に含まれている平均モノマー数である。
【００２７】
光拡散及び示差屈折インデックス検出器に連結している立体排除クロマトグラフィーにより、平均（数又は重量）分子量、平均重合度ならびに多分子量インデックスを絶対的に測定する。第１世代（Ｐ１、低分子量ポリマー）に関して、絶対分子量の測定をキャピラリー電気泳動法により実施した。得られた結果は、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により得られた結果と一致している。
【００２８】
本発明は、前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジン又はヘテロポリリジンの製造方法にも関し、ｎは２〜１０の整数であり、
沈殿物状の第ｎ世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
保護された第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されたプライマーへの、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡの添加、及び前記ポリリジンの脱保護から得られたそれ自体であり、
前記第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーに関して示されたように得られたそれ自体であり、
ｎ＝２の場合、第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、請求項１０〜１３のいずれか一項で定義され、前記第１世代のポリリジンデンドリマーが第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーのコアを形成している前記工程；
第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、第ｎ世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程、
を含んでいる。
【００２９】
用語「適切なｐＨ」は、ｐＨが３〜９であり、より詳細にはｐＨが６．５を意味する。
特定の実施態様では、本発明は前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐｎ）の製造方法に関し、Ｌ−リジン−ＮＣＡが、ＴＦＡによりＮε保護されており、前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーのコアが、Ｌ−リジンの約８残基を含む直鎖のポリリジンから形成され、例えば前記第１世代のホモポリリジンの製造方法の実施により得ることができ、前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーの分岐度が約４０％〜約１００％、特に約６０％〜約１００％である。
【００３０】
第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐｎ）の用語「分岐度」、「グラフト比」及び「分岐比」は、第ｎ世代の生成物の全重合度（ＤＰｎ）に関して反応する、ＰｎにおけるεでのＮＨ２の割合と同義的な意味である。
分岐度を測定する好ましい手段は、ＨｂプロトンのＮＭＲシグナルの強度とＨａプロトンのＮＭＲシグナルの強度との比の測定であった。こうしたシグナルは、εアミン官能基に結合するリジンユニットのキラル炭素により運ばれるプロトンの共鳴（Ｈｂ（４．０１ｐｐｍ））、αアミン官能基に結合するリジンユニットのキラル炭素により運ばれるプロトンの共鳴（Ｈａ（４．０８ｐｐｍ））を意味し、３．５と３．９ｐｐｍとの間で共鳴するＮ−末端（Ｈｃ）及びＣ−末端（Ｈｄ）リジンユニットにより運ばれるプロトンを除いている。こうした２つのシグナルの強度比によって、こうしたグラフト化デンドリマーの分岐度を解明することは可能である（３）。
有利には、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーのＨｂ／Ｈａ比は、約０．２〜約０．８、特に約０．２５〜約０．６０である。
【００３１】
好ましい実施態様では、本発明は前記第２世代のグラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法に関し、
第１世代のポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第１世代のポリリジンデンドリマーが、上で定義したように、例えば、約８ユニットのリジンを含む第１世代のホモポリリジンデンドリマーの製造方法の実施により得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第１世代のポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
第２世代の保護されたポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中において、前記添加の工程が行われ；
− 約６，０００〜約１４，０００Ｄａ、特に約８，３５０Ｄａ、好ましくは約８，６００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約４０〜約６０、特に約４８である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ２）を得るために、前記工程において得られるポリリジンを脱保護する工程とを含む。
【００３２】
前記第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．１〜約０．８、特に約０．２〜約０．３、更に特に０．２５であることも特徴とする。さらに、前記第２世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ１プライマーは約５０％〜約１００％、特に約８０％〜約１００％、より特に約１００％のグラフト比となる。
【００３３】
用語「遊離の外部−ＮＨ２基（ｆｒｅｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ −ＮＨ２ ｇｒｏｕｐｓ）」は、脱保護されているεアミン官能基の−ＮＨ２基及びα位におけるＮＨ２基を意味する。
遊離−ＮＨ２基の存在を測定する好ましい方法はＮＭＲである。例えば、Ｎε−トリフルオアセチルリジンを使用する場合、保護基の除去及び遊離アミン官能基の発生によって、１９Ｆ ＮＭＲにおいて、（−７６ｐｐｍにおける）トリフルオロアセチル基シグナルの消失及び（−７５．８ｐｐｍにおける）トリフルオロ酢酸シグナルの同時発生が起こる。この消失は、１Ｍ水／メタノール／アンモニア溶液中において、４０℃、１５時間で完全となる。
【００３４】
別の好ましい実施態様では、本発明は前記第３世代のグラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐ３）の製造方法に関し、
第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが前記方法の実施により得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
第３世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ３）を得るために、水性溶媒中において、適切なｐＨで前記添加の工程が行われ；
約１５，０００〜約３０，０００Ｄａの平均分子量、特に約２１，５００Ｄａ、好ましくは約２２，０００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約１００〜約１５０、特に約１２３である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第３世代グラフト化ポリリジンデンドリマーを得るための、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程とを含む。
前記第３世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．２〜約０．８、特に約０．５〜約０．７、より特に約０．６であることも特徴とする。さらに、前記第３世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ２プライマーは約５０％〜約９０％、特に約７０％〜約９０％、より特に約８１％のグラフト比となる。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、本発明は前記第４世代のグラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐ４）の製造方法に関し、
第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、前記方法の実施により得られ、
（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
保護されている４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ４）を得るために、適切なｐＨの水性溶媒中で、前記添加の工程が行われ、
約５０，０００〜約８０，０００Ｄａ、特に約６４，０００Ｄａ、好ましくは約６５，０００Ｄａ又は６５，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約３００〜約４５０、特に約３６５である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るための、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程とを含む。
前記第４世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．２〜約０．８、特に約０．４〜約０．５、より特に０．４６であることも特徴とする。さらに、前記第４世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ３プライマーは約５０％〜約９０％、特に約７０％〜約９０％、より特に約８０％のグラフト比となる。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、本発明は前記グラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐ５）の製造方法に関し、
第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、前記方法の実施により得られるものであり、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
第５世代の保護されているポリリジンデンドリマー（Ｐ５）を得るために、水性溶媒中において、適切なｐＨで前記添加の工程が行われ；
約１４０，０００〜約２００，０００Ｄａ、特に約１６９，０００Ｄａ、好ましくは約１７２，０００Ｄａ又は１７２，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約９００〜約１１００、特に約９６３である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第５世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程とを含む。
前記５世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．２〜約０．８、特に約０．３〜約０．５、約０．４であることも特徴とする。さらに、前記５世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ４プライマーは約５０％〜約９０％、特に約６０％〜約７０％、より特に約６５％のグラフト比となる。
【００３７】
本発明は、前記グラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法にも関し、特に第１世代のために使用されたプライマーがグラフト化デンドリマーに共有結合的に固定され、前記プライマーはマーカー産物を含み、デンドリマーを下記の手段（ＵＶ吸光度、蛍光発光、Ｘ線不透明度又は磁場感度）により容易に検出する。下記の各々の式、７−アミノ−１，３−ナフタレン−ジスルホン酸、アミノフルオレセイン、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド、ローダミンスルホクロライド（テキサスレッド）、アミドトリゾエート又はアイオキサグレート、又はＡｕ１１（Ｐ（Ｃ６Ｈ４）ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨＯ）３）７）等のアルデヒド官能基、カルボン酸官能基又はアミンに対する他の活性官能基を有する金属クラスター（Ａｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ）等のポリヨウ化物造影剤が、限定されないマーカー産物の例として、与えられ、Ｘ線及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）において像を明瞭にする診断目的の薬剤に使用される。前記のマークされた分子が、例えば前記最初の２つのアミン官能基を有する場合、それらはＮＣＡの重合をプライムするために使用することができる。その後、それらはＣ末端に対するアミド結合により第１世代のグラフト化デンドリマー（Ｐ１）に共有結合する。対照的に、例えばマークされた分子がアミンに反応することができるアルデヒド、スルホクロライド、カルボン酸等の官能基を有する場合は、その後、従来の方法を使用することにより、ＮεにおけるＴＦＡ官能基の脱保護の前にデンドリマー（Ｐ１）のＮ末端にそれらを共有結合することが可能である。これらの操作は、ＤＭＦにおいて実施され、その後、反応生成物を水中での沈殿により回収する。Ｎε−ＴＦＡ官能基を放出後、デンドリマーの構築を続ける。第２世代デンドリマー、さらに第３世代デンドリマーから、マーカー産物はデンドリマーのコアに「埋めこまれ」ている。従って、下記の実施例２２に示すように、それらはデンドリマーそれ自体のようには、免疫系に対して認識されない。デンドリマーによって担持されていることにより、マーカー産物は生理的培地中に可溶となっている。こうしたマーカー産物の毒性（単独で使用された場合）は、デンドリマーにより生体から隠される。その後、マーカー産物の性質に従って、ＵＶ吸光度、蛍光、Ｘ線又は磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）により、こうしたマーカー産物を検出することができる。
【００３８】
本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーの製造方法は多数の利点を有する。
第１の利点は、水性溶媒中において、活性化モノマー（ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ）を、文献（２１）の推奨と対照的に、精製していない反応生成物（例えば、事前の精製をしていない）として使用することができることである。ＮＣＡの合成の間に形成される塩酸又は亜硝酸（２５、２９、３２）は、たとえ重合が起こるｐＨ３〜９を含んでいても、水性溶媒中では、どんな問題もない。
【００３９】
第２の利点は、本発明による重合反応は速いことである。それらは、−１０〜６０℃の間の温度及び３〜９の間のｐＨに応じて、３０分から２時間で完了する。
【００４０】
第３の利点は、ポリペプチドは水性溶媒中において沈殿物を（どの世代でも）形成し、濾過又は遠心分離により容易に回収可能であることである。沈殿物が低多分散性インデックスを有するペプチドであることにより、この利点は向上する。実際、低級アミノ酸のポリマーは可溶であり、それらの伸びを可能にするが、ある一定の長さを超えると沈殿し、それらの伸びをブロックする。結果として、得られた生成物は狭い分布曲線を有し、その平均質量は初期の担体（プライマー）と最終生成物との間の親水性と疎水性バランスにより特に決まる。このバランスは、εでのアミン官能基の保護のために使用される基の性質の機能でもある。
【００４１】
本発明の方法による第４の利点は、無水溶媒を必要とする前記方法とは異なり、水性培地中での重合反応を酸性培地中でプライムすることができる。従って、第１重合反応は、ＮＣＡの加水分解も由来するＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ、又は反応培地に添加されるＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓのいずれかからプライムされ、放出後に、第１世代のポリリジンデンドリマー（Ｐ１）はリジンにより厳密に構成される。Ｐ１は第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ２）用のプライマーであり、Ｐ２は第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ３）のプライマー等であるので、この定性的（生物学的に有益）な純度は、次の世代において必要である。
この可能性は、前記のもの、例えばアミノ酸、ペプチド、アルキルアミン、アルキルジアミン、アリールアミン以外のアミンによりプライムされる重合を妨げるものではない。
【００４２】
本発明の方法の第５の利点は、予想される第ｉ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐｉ）の数平均重量（Ｍｎ）を制御及びプログラムすることが容易であることである。グラフト化ポリリジンデンドリマーの形成反応では、実際、「ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ」／「プライマー」の比の選択が重要である。ａｄ ｈｏｃ比について、得られたグラフト化ポリリジンデンドリマーは単一であり、低多分散性及び所与のＭｎを有する。しかし、過剰の活性モノマーが使用された場合、得られたＰｉの平均Ｍｎはａｄ ｈｏｃ比が使用された場合よりも高い。より過剰な活性モノマーは、期待されるＰｉに加えて、精密濾過により除去される微量のＰ１の形成を導く。従って、この特性は、ａｄ ｈｏｃ平均重量よりも３０％制御可能である数平均重量のグラフト化ポリリジンデンドリマーの各々の世代にとって、得ることは可能である。従って、Ｍｎ１，４５０ＤａのＰ１世代からプライムすることにより、下記の最少と最大との間で変化する重量のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得ることを可能にする。
６，０００Ｄａ＜ＭｎＰ２＜１４，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ＜ＭｎＰ３＜３０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ＜ＭｎＰ４＜８０，０００Ｄａ、１４０，０００Ｄａ＜ＭｎＰ５＜２００，０００Ｄａ、好ましくは、ＭｎＰ２＜１２，０００Ｄａ、ＭｎＰ３＜２８，６００Ｄａ、ＭｎＰ４＜８４，０００Ｄａ、ＭｎＰ５＜２２４，０００Ｄａである。
【００４３】
イプシロンアミン官能基の保護基の性質が変化することにより、この基の疎水性に応じて、保護基がより疎水的である場合にはより低いＭｎのＰ１〜Ｐｉ化合物、保護基がより親水的である場合にはより高いＭｎのＰ１〜Ｐｉ化合物を得ることができる。従って、この方法により、望ましい平均重量（Ｍｎ）を有するグラフト化ポリリジンデンドリマーを容易に合成することが可能である。
第２世代に使用することができるプライマーが直鎖のポリリジンであることにより、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、世代数に応じて、従来技術のリジンデンドリマーよりも素早く増加する分子量を有する。この点において、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、Ｋｌｏｋらにより記載された分岐ポリリジン（３）と比較することができるが、非常に高いグラフト比により、それらは後者と構造的に相違している。
このような理由のために、本発明のポリリジンデンドリマーをグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）と称する。
【００４４】
本発明は、前記製造方法の実施により、特に前記第ｎ世代（ｎは１よりも大きい）のグラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法の実施により得ることができるグラフト化ポリリジンデンドリマーにも関する。特定の実施態様では、前記グラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）は、外部−ＮＨ２基が、単糖類、核酸、タンパク質、又はカルボキシル基、スルホン酸基及びリン酸官能基を有する基、エチレンポリオキサイド、及びヒドロ炭酸塩又はペルフルオロヒドロ炭酸塩鎖、アルデヒド又はそれらの前駆体、又はカルバモイル基又はクロロエチルニトロソ尿素基等のマスク反応官能基（イソシアネート）を含むリストから選択される基に、全部又は部分的に共有結合しているか、又は非共有結合されることを特徴とする。
こうした表面官能修飾は、それらに、新規な物理的特性、さらに新規な生物学的特性を与える。
【００４５】
別の特定の実施態様では、前記グラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）は、それらを支持体に共有結合的に又は非共有結合的に、特に静電結合的に固定することができ、それらによって支持体がその特性を保持することが可能であることを特徴とする。
第１の利点は、それらの特性を保持することにより、前記支持体（粒子、繊維又は表面）は、デンドリマーの特性を獲得する。そして、このような支持体を実施することによって、それらを、様々な状況において、濾過、組織、表面被覆、研磨粒子として使用することを可能にしている。
【００４６】
第２の利点は、本発明のグラフト化デンドリマーを支持体に固定することにおいて、こうした支持体の表面ユニット当たりに多数の反応官能基（アミン又は酸）を作り出し、それらの特性が修飾されることである。そして、この修飾の利点は、例えば、抗体、アプタマー、ＤＮＡフラグメントを、免疫学的アッセイのために通常使用されるプレートに固定することができるよりも多くの濃度で支持体に固定することであり、このような高い特異性のレセプターから前記アッセイ感度の増加を可能にする。
【００４７】
第３の利点は、従って、固定されたグラフト化ポリリジンデンドリマーが固定されていない条件と比べてその特性を保持することである。
用語「支持体」は、無機材料（シリカ、アルミナ、金属酸化物）又は有機材料（ポリアクリル、ポリウレタン、ポリエポキシ、ポリイソシアネート、多糖類、ポリアミド）を意味する。
好ましい実施態様によれば、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、
それらと接触する免疫系に関して密かであり、そして有利には、免疫系が反応するハプテン又は抗原の担体として使用され、抗体を形成することができる。
本発明は、前記抗原又は前記ハプテンに対する抗体の生成を目的とする、抗原−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体又はハプテン−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体を調製する、前記グラフト化ポリリジンデンドリマーの使用にも関する。
【００４８】
実際、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーは、グラフト化ポリリジンデンドリマーが免疫系に対して現れない、例えば免疫システムがグラフト化ポリリジンデンドリマーに対して抗体を生成しないことを特徴とする。しかし、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーがそれらの表面で固定されているハプテン又は抗原を有する場合、担体がＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）及びＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）等のタンパク質である場合に起こることと比較すると、グラフトリジンデンドリマー担体に対するいかなるものも産生することなく、免疫システムは前記ハプテン又は抗原に対する抗体を産生することができる。
【００４９】
利点は、従来の方法により産生される場合に起こることと比較すると、抗体は抗原及びハプテンに対して特異的に産生され、担体に特異的である抗体と混合されないため、その後の分析ツールとしてより直接的に使用することができる。
用語「ハプテン」は、それ自身により非抗原性である低分子量の分子を意味する。
本発明は、例えば、前記製造方法の実施により得ることができるグラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）組成物にも関する。
本発明は、抗菌剤又は抗真菌剤としての、前記グラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）に関するが、但し、それは人体又は動物体の治療上の処置に使用されない。
特に均一相においては、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマー（又は、グラフトリジンデンドリマー）は、殺菌性の処置の枠内での表面処置に使用され、又はこうした表面の微生物汚染の危険を予防するために使用される。
グラフトリジンデンドリマーは、例えば、貯蔵水等の微生物汚染の危険における液体貯蔵所の処理にも使用することができる。
抗菌性フィルター及びコーティングとして、バイオフィルムに対する循環抗菌性粒子として、特に汚染に対する船体保護として、前記支持体に固定し、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーを使用することができる。
【００５０】
本発明は、有効成分として、少なくとも１つの前記グラフト化ポリリジンデンドリマーを、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする、医薬用組成物にも関する。
本発明は、細菌感染若しくは真菌感染、又は癌の処置を目的とする薬剤の製造ための前記グラフト化ポリリジンデンドリマー（又は、グラフトリジンデンドリマー）の使用にも関する。
薬剤調製へのグラフト化ポリリジンデンドリマー（又は、グラフトリジンデンドリマー）の前記使用の特定の実施態様では、細菌感染が、特に、シュードモナス科、特にシュードモナス属；レジオネラ科、特にレジオネラ属；腸内細菌科、特にエシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、及びエルシニア属；ビブリオ科；パスツレラ科；アルカリゲネス科、特にボルデテラ属；ブルセラ科、特にブルセラ属；フランキセラ科、特にフランキセラ属；ナイセリア科；ミクロコッカス科、特にブドウ球菌属、連鎖球菌属、及びリステリア属；を含むリストから選択される科に属しているグラム陰性及びグラム陽性細菌による感染から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
《図１》
静的光拡散（static light diffusion:ＳＬ）を備えたＳＥＣ（立体排除クロマトグラフィー: Steric Exclusion Chromatography）での本発明の種々の世代のポリリジンデンドリマー（Ｐ１〜Ｐ５）で得られたクロマトグラムである。実験条件：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、溶出剤１、注入濃度：５ｇ／Ｌ、注入体積：１００μＬ。クロマトグラムは溶出体積（ｍＬ、ｘ軸）に対する屈折率信号（ｙ軸）を示す。
【００５２】
《図２》
世代（ｘ軸）に対する、本発明のポリリジンデンドリマーの数平均分子量（ｇ／ｍｏｌ、ｙ軸）（ひし形）、比較としての単官能性デンドリマーの理論的分子量（四角）、Ｈ．Ａ．Ｋｌｏｋらにより記載された二官能性デンドリマー（三角）の変化の図を示す。ＧＬＤの分子量は、光拡散を備えたＳＥＣにより（Ｐ２〜Ｐ５）、及びキャピラリー電気泳動により（Ｐ１）測定された。樹枝状構造が完全であると仮定して（すべてのリジンモノマーのアミン官能基は反応していると仮定する）ポリリジンデンドリマーの分子量を計算した。単官能デンドリマーのコアは、ベンズヒドリルアミンを表す。二官能性デンドリマーのコアは、１，４−ジアミノブタンを表す。指数法則による実験データの非線形修正により得られた式を相関係数Ｒ２で図に示す。
【００５３】
《図３》
３つの異なる実験方法を使用して測定された、世代（ｘ軸）に応じた本発明のグラフトリジンデンドリマー（ｎｍ，ｙ軸）の流体範囲を示す：ＴＤＡ（Ｔａｙｌｏｒ拡散分析、四角）、ＳＬＤ（半弾性光散乱、ひし形）、及び３Ｄ−ＳＥＣ（３重検出立体排除クロマトグラフィー：ｔｒｉｐｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔｅｒｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、光散乱、粘度検出器及び屈折率、三角）の図を示す。
【００５４】
《図４》
実施例において調べた３つの緩衝液（緩衝液１（ひし形）、緩衝液２（四角）、緩衝液３（三角））中においてＴＤＡにより測定された、世代（ｘ軸）に応じた本発明のグラフトリジンデンドリマー（ｎｍ、ｙ軸）の流体範囲の図を示す。
【００５５】
《図５》
両対数目盛において、分子量（ｇ／ｍｏｌ）に応じた、ＧＬＤの流体範囲（ｎｍ）の図を示す。直線は、関係式Ｒｈ〜Ｍ１／υを表す線形修正を示す。υ値は、２．７２±０．２２（緩衝液１）（四角）；２．８０±０．０９（緩衝液２）（円）；２．７４±０．０８（緩衝液３）（三角）と等しい。
【００５６】
《図６》
図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄは、３．７と４．４ｐｐｍとの間での、２５℃、Ｄ２Ｏ中の直鎖のトリリジン（図６Ｄ）及びペンタリジン（図６Ｃ）、ならびに本発明のグラフトリジンデンドリマー（１〜５世代（Ｐ１〜Ｐ５））（図６及び図６Ｂ）の４００ＭＨｚによる１ＨＮＭＲスペクトルを示す。図６Ｈはトリリジンの化学式を示す。図６Ｇはペンタリジンの化学式を示す。図６ＦはＰ１の化学式を示し、図６ＥはＰ２の化学式を示す。示されたスペクトル範囲は、Ｌ−リジンのキラル炭素が有するプロトンを表す。環境に応じて、このプロトンは種々の共鳴場を有する。図６Ｉは、こうした異なる生成物で観測される４つの異なる環境（Ｈａ、Ｈｂ、Ｈｃ、Ｈｄ）を示す。キラル炭素が有するプロトンＨａ、Ｈｂ、Ｈｃ及びＨｄを、それぞれ、白丸、黒丸、丸なし及び灰色の丸により示す。Ｈａは、ペプチド結合によりその隣接部に結合されるコアリジンのキラルプロトンを表す。ＨｃはＮ末端リジンのキラルプロトンを表す。ＨｄはＣ末端リジンのキラルプロトンを表す。Ｈｂは、隣接リジンのＮＨ２側鎖に結合するデンドリマーのコアリジンのキラルプロトンを表す。この結合はアミド及び非ペプチドである。
【００５７】
トリリジンスペクトル（図６Ｄ）では、等しい強度の３つの異なるシグナル（Ｈａ、Ｈｃ及びＨｄ）の存在を注意されたい。ペンタリジンスペクトル（図６Ｃ）では、Ｈａの強度は、等しい強度のシグナルＨｃ又はＨｄの強度よりも３倍大きい（３コアリジン）。比較すると、化合物Ｐ１のスペクトル（図６Ｂ）では、シグナルＨａの強度は、等しい強度のシグナルＨｃ又はＨｄ強度よりも約７倍大きく、その結果として化合物Ｐ１は９リジン（７コア及び２末端）と等しい平均長さの直鎖のポリリジンである。アミド結合の特性を決定するＨｂシグナルは、化合物Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５のスペクトルでのみ観測可能である。各々のこうしたスペクトルでは、Ｈｂシグナルの強度は、アミド結合により隣接リジンの側鎖（εＮＨ２）に結合するリジンの数に比例する。Ｈａは、ペプチド結合（Ｎ末端及びＣ末端残基を除く）によりα−ＮＨ２の隣接に結合するリジンの数に比例する。従って、Ｈｂ／Ｈａ比は、所与の世代が次の世代を生成するためにＮＣＡに反応する、側鎖（εＮＨ２）の数に結びつけられる。
【００５８】
Ｈｂ／Ｈａ比は、（ｎ）世代のポリリジンのグラフト（分岐）比を決定することを可能にする。このグラフト比は、（ｎ＋１）世代を生成するためにＮＣＡに反応する世代（ｎ）のεＮＨ２の割合である。
このグラフト比（表６）は、Ｐ１からＰ２への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．２５）については１００％であり（Ｐ２を生成するために、Ｐ１の８側鎖がＮＣＡに反応することを意味する）、Ｐ２からＰ３への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．６０）については８１％であり（Ｐ３を生成するために、Ｐ２の４８側鎖中３９がＮＣＡに反応することを意味する）、Ｐ３からＰ４への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．４６）については８０％、Ｐ４からＰ５への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．４０）については６５％、Ｐ５からＰ６への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．４２）については６４％である（図示せず）。
【００５９】
《図７》
第１世代（Ｐ１）〜５世代（Ｐ５）のグラフトリジンデンドリマーを表した図である。Ｐｎ構造の定義：
[式５]
【００６０】
《図８》
下記の実験条件下での保護されたＰ１（直鎖のポリ−Ｌ−リジン）の分離を表す電気泳動図を示す：未使用のシリカキャピラリー、６０ｃｍ（検出窓５０ｃｍ）×５０μｍ。電解質：５％デキストランを含むリン酸塩緩衝液（１２５ｍＭＨ３ＰＯ４ １２５ｍＭＮａ＋Ｈ２ＰＯ４− ｐＨ＝２．１６）。付与電圧：＋２０ｋＶ。２００ｎｍのＵＶ検出器。サンプル濃度：３ｇ／Ｌ。注入：ゲージ圧２ｐｓｉ（９分間）。この図は時間（分）の関数としての吸光度（ｍＡＵ）を表す。
同じ条件下で、直鎖のジ−、トリ−、テトラ−及びペンタ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した市販のペプチド）を分析することにより得られた電気泳動図と比較すると、化合物（脱保護されたＰ１）が３と約２０のリジン残基との間で含まれる長さの直鎖のオリゴリジンの混合物であることをこの電気泳動図は確認している。この電気泳動図から、数平均重合度（ＤＰｎ＝８）及び多分子性インデックス（Ｉ＝１．２）を決定することが可能である。数平均重合度ＤＰｎ及び重量平均重合度ＤＰｗを下記の比から計算した：
[式６]
（式中、Ｎｉは重合度ｉを有する高分子の数である）。吸光度がモノマーに起因するＵＶ検出器の場合では、検出器の応答はポリマーの質量濃度に比例する。従って、ＤＰｎ及びＤＰｗを、重合度ｉのポリマーに相当する各々の電気泳動ピークの高さｈｉの関数として（又は、ピークを一体化することができる場合には、移動時間により補正された面積Ａｉの関数として）表すことができる。
[式７]
【００６１】
《図９》
屈折及び線形モードの印加型バイオシステムボイジャーＯＦ−ＳＴＲ装置において作成された（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルを表す。フライトチューブの長さは、２ｍ（線形）又は３ｍ（屈折）及びレーザー波長λ＝３３７ｎｍである（レーザーＮ２）。マトリックスは、ＴＦＡ−ε−保護されたＰ１についてはＤＭＦ中の１０ｇ・Ｌ−１α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）であり、脱保護されたＰ１についてはＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中の１０ｇ・Ｌ−１α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸である。サンプルは、１０／１（ｖ／ｖ）マトリックス／サンプルの比率で調製され、続いて（１μｌ）をターゲットに析出した。３００レーザーショットの集積及び２０ｋＶへの加速電圧により、スペクトルを得る。図９Ａは、０℃で、純水で洗浄されたＴＦＡ−保護されたＰ１を表し、図９Ｂは、０℃で、重炭酸アンモニウムの溶液で４回洗浄された脱保護されたＰ１を表す。これらの図は、質量ｍ／ｚの関数としてのピークの割合強度を表す。これらＴＦＡ−保護されたＰ１化合物及び脱保護されたＰ１化合物の完全に再現可能なスペクトルは、Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンＮＣＡの重合をプライマーなしで、ｐＨ６．５の水中において起こした場合、直鎖のポリリジン（Ｐ１）が、明らかな副生成物なしに、そして「リビング（ｌｉｖｉｎｇ）」（すなわち、Ｃ末端残基での−ＣＯ２Ｈ官能基及びＮ末端残基での−ＮＨ２官能基をもっている）で得られることを示している。
【００６２】
《図１０》
アミノフルオレセイン存在下において、ｐＨ６．５で、水中でのＮε−ＴＦＡ−リジンＮＣＡの重合反応の生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。この反応で得られた沈殿物を、０．１ＮＨＣＯ３Ｎａ溶液により４回洗浄し、アンモニア溶液で処理し、凍結乾燥する。凍結乾燥の質量スペクトルは、得られた生成物が２と２０との間に含まれるリジン数ｎを有するフルオレセインアミド（＋Ｈ２（Ｌｙｓ）ｎ−ＮＨＣ２０Ｈ１１Ｏ５）であることを示す。４９０ｎｍでのl励起に関して、この材料は、ｐＨ８．５、０．１Ｍ炭酸二ナトリウム溶液中において、５１７ｎｍで最大lをもち、１０−３ｍｇ・Ｌ−１未満の検出限界値で蛍光発光する。この最大発光lは、同じ条件下で、遊離アミノフルオレセインの発光（５１３ｎｍ）と比較される。
【００６３】
《図１１》
最初の４日間は３６０ｍｇグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）Ｐ３、次の１８０日間は本発明の３０ｍｇＧＬＤＰ３を与えられたオスＳＤラット（ｎ＝６）のグループにおける、時間に応じた（ｘ軸（日数））平均体重推移（ｙ軸（ｇ））を表す（黒色曲線）。対照ラット（ｎ＝１００）は、０．５ｍｌ生理食塩水（溶液の溶媒）を与えられる（灰色曲線）。
【００６４】
《図１２》
時間に応じた（ｘ軸（日数））対照（ひし形）に対する、１０ｍｇ／Ｌでの第２世代（円）、１００ｍｇ／Ｌでの第２世代（三角）、１０ｍｇ／Ｌでの第３世代（四角）、１００ｍｇ／Ｌへの第３世代（星）の本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーと接触し置かれているレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）菌の生存率（ｙ軸）を表す。
【００６５】
《図１３》
種々の希釈におけるＭａｘｉｓｏｒｐ支持板上でのＥＬＩＳＡ。ＧＬＤ−ハプテン（黒円）又は天然ＧＬＤ（白円）でコーティングされた支持板上におけるロットＡＤ６５、ＧＬＤ−ハプテンでコーティングされた支持板上におけるロットＢ（黒三角）及び天然ＧＬＤでコーティングされた支持板上におけるロットＣ（×印）。吸光度（ＯＤ）は希釈血清対数の関数として示す。
【００６６】
《図１４》
ＥＬＩＳＡコバリンク。ロットＡＤ２１（黒三角）、ロットＡＤ３６（黒四角）、ロットＢ（破線）。吸光度（ＯＤ）は希釈血清対数の関数として示す。
【００６７】
《図１５》
ＢＳＡ−ハプテン（黒四角）又は天然ＢＳＡ（×印）でコーティングされた支持板上におけるＤ６５でのロットＡについて、種々の希釈生理食塩水でのＭａｘｉｓｏｒｐ支持板上でのＥＬＩＳＡ。吸光度（ＯＤ）は希釈血清対数の関数として示す。
【実施例】
【００６８】
《実施例１：第１世代のポリリジンデンドリマー（Ｐ１）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを従来の方法、特には、例えばＣｏｌｌｅｔら［２９］により記載され、又は再生成された方法によって合成される。
（２）０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを前記粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成された直鎖のポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンの白色沈殿物を回収した。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．２（ＣＥ（キャピラリー電気泳動、実施例７参照）により測定）をもつ直鎖のポリ−Ｌ−リジン５４ｇを得る。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により測定し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮＭＲにより確認された絶対平均質量は、１，４５０Ｄａである。
【００６９】
《実施例２：第２世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ２）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマー９４ｇを前記の通り合成する。
（２）重合プライマーとして実施例１の第１世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを、粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．４０（ＳＥＣにより測定）のグラフトポリ−Ｌ−リジンデンドリマー７０ｇを得る。ＳＬにより測定された平均質量は８，６００Ｄａである。モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が８，６００Ｄａと１２，０００Ｄａとの間で変化する第２世代生成物を得る。
【００７０】
《実施例３：第３世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ３）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを前記の通り合成する。
（２）実施例２の第２世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．４６（ＳＥＣにより測定）のグラフトポリ−Ｌ−リジンデンドリマー７０ｇを得る。ＳＬにより測定された平均質量は２２，０００Ｄａである。
モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が２２，０００Ｄａと２８，６００Ｄａとの間で変化する第３世代生成物を得る。
【００７１】
《実施例４：第４世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ４）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを前記の通り合成する。
（２）実施例３の第３世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．３６（ＳＥＣにより測定）及び平均質量 ６５，３００Ｄａ（ＬＳにより測定）のグラフトポリ−Ｌ−リジンデンドリマー７０ｇを得る。
モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が６５，３００Ｄａと８５，０００Ｄａとの間で変化する第３世代生成物を得る。
【００７２】
《実施例５：５世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ５）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを前記の通り合成する。
（２）実施例４の第４世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成された５世代のグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．４６（ＳＥＣにより測定）のグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーを得る。ＳＬにより測定された平均質量は１７２，３００Ｄａである。
モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が１７２，３００Ｄａと２２４，０００Ｄａとの間で変化する第３世代生成物を得る。
【００７３】
《実施例６：６、７及び８世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ６、Ｐ７及びＰ８）》
この合成は、次の６、７、８世代について繰り返された。外挿法により評価されたそれらの重量は、順に、４３０，０００Ｄａ、１，１３０，０００Ｄａ及び３，０００，０００Ｄａに等しい。
【００７４】
《実施例７：平均分子量及び多分散性指標の測定》
マルチアングル静的光拡散及び示差屈折インデックス検出器を備えた立体排除クロマトグラフィー（２Ｄ−ＳＥＣ）は、４つの世代のＧＬＤ（Ｐ２−Ｐ５）のモル質量分布を得ることが可能である。直鎖のＰ１コアのモル質量分布を、ＥＣ （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮＭＲにより確認）により得た。測定は、Ｈ２ＰＯ４−Ｎａ＋５０ｇ／Ｌにより構成される水性溶離液（溶離液１、溶離液の定義については、表２参照）中においてｐＨ４．５で実施された。得られたクロマトグラムを図１に示す。ＧＬＤの湿度に対する保護保管は集合体形成を減少することが可能であるが、それでも完全にこの現象を避けることはできない。従って、こうした注意にもかかわらず、特にＰ４及びＰ５に関して、集合体の形成（低溶離液体積でのショルダー）を図１は示す。平均分子量の結果を、屈折率の増加（ｄｎ／ｄＣ）と推定される重合度と共に、表３に示す。この方法は絶対分子量の測定を可能にするが、所与のモル質量値は対イオン（溶離液中のＨ２ＰＯ４−リン酸イオン）の一定の割合を考慮しなければならないことに注意されるべきである。実験的に評価することは困難であるが、この一定の割合をマニングにより記載された凝縮の理論により評価することは可能である。この理論の枠内で、ポリリジン中の２つの電荷間の平均距離（０．３４ｎｍ）とＢｊｅｒｒｕｍ長さ（０．６９ｎｍ、２５℃）との比により、凝縮速度が与えられる。リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の荷電モノマーの平均モル質量は、故に、１２９×０．４９＋２２７×０．５１＝１７９ｇ／ｍｏｌとなる。この平均から、モノマーの平均数Ｎを評価することは可能である。３Ｄ−ＳＥＣ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）による緩衝液２で得られた分子量の結果は、特にＰ４及びＰ５に関して非常に高いモル質量値を示す。多分、これは大量の集合体を形成するからである。その後、２Ｄ−ＳＥＣにより得られた値は保持されるだろう。
【００７５】
均等目盛（図２Ａ）又は片対数目盛（図２Ｂ）で図２Ａ−図２ＢにＧＬＤのモル質量の変化を示す。比較検討を介して、モノアミン（デンドリマー１、ベンズヒドリルアミンコアをもつ、（５、３３））又はジアミンプライマー（１，４−ジアミノブタンコアでプライムされたデンドリマー２（７））のどちらか一方でプライムされたポリリジンデンドリマーに関し、予想される（理論上の）分子量も示す。すべての場合（ＧＬＤを含む）において、モル質量の増加が指数関数的であることは興味深いことである。従って、２つの連続の世代のモル質量を同じ係数で掛ける。しかし、ＧＬＤの場合では、デンドリマー２についての２．１２、デンドリマー１についてのほんの１．９５に対して、増倍係数は３．２（ｅ１．１６２）である。ＧＬＤの分子量は、結果として、指数関数的成長の法則、デンドリマーの特性を有するが、同じタイプのデンドリマーよりもＧＬＤでは、モル質量の増加は非常に速い方法で起きる。
多分散性インデックスが比較的低く、１．２（第１世代）と１．４６（５世代）との間で含まれ、提案された合成方法が制御された多分散性の化合物を得ることを容易に可能にさせることを証明することに気付くであろう。
第ｉ世代から第ｉ＋１世代の移行中にポテンシャルプライマー（α又はεアミン官能基）により取り込まれたモノマーの平均数の計算結果を表４に示す。この結果は、第４世代の３官能基のデンドリマーに最少密度（最大固有粘度）を与える固有粘度についての結果と一致する（実施例９参照）。
【００７６】
《実施例８：ＧＬＤの流体力学的範囲（又は拡散係数）の測定》
溶液中のＧＬＤの特性次元を発見するために、ストークス−アインシュタインの比を使用することによって分子拡散係数から流体力学的範囲を決定した
[式８]
（式中、ηは培地の粘度であり、ｋはボルツマン定数であり、Ｔは温度（Ｋ）である）。Ｄｍを決定するために、２つの実験的方法である（ＳＥＣを備えているか、又はＳＥＣを備えていない）準弾性又は静的光拡散（ＳＬＤ）、及びテイラー拡散法（ＴＤＡ）を使用した。この後者の方法によって、流体流れ（流体流れの速度プロファイルは分散的であると知られている（放物ポアズイユプロファイル））の影響下で、種の拡散係数を溶質バンドの拡大から測定することは可能である。
キャピラリー電気泳動装置、５０μｍシリカキャピラリー（最大６０ｃｍ×５０ｃｍ検出器）（キャピラリーの表面上でのＧＬＤ溶質の吸着を制限するために、キャピラリーの内壁面をグラフトポリカチオン（ポリ（ジアリル−ジメチル−アンモニウム））によりあらかじめ修飾されている）を使用することにより、ＴＤＡ測定を実施した。ＵＶ分光光度計を使用し、ポアズイユの流れの影響下での溶質バンドの分散を測定した。その後、Ｔａｙｌｏｒにより最初に記載され、その後Ｂｅｌｌｏらにより繰り返された方法［３４］により、拡散係数を決定した。ＴＤＡ方法と平行して、ゼタサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ））装置を使用し、ＳＬＤにより、測定を実施した。最後に、３Ｄ−ＳＥＣ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）からＲｈ測定を得ることも可能である。合わせて、Ｒｈについての全ての数値データを表３に示す。
【００７７】
図３は、緩衝液２における、３つの使用された実験方法についての世代に応じたＧＬＤの流体力学的範囲の増加を示す。ＴＤＡにより得られた値がＳＬＤ又は３Ｄ−ＳＥＣにより得られた値よりも小さいことは明らかである。この相違は、おそらく、小さい割合においてもＳＬＤにより得られたＲｈ値を増加する傾向にあるサンプルにおいて、集合体が存在するためである。実際、高分子量の集合体は、（モル質量の６乗で変化する）拡散光シグナルに重要な貢献を示し、ユニマー（ｕｎｉｍｅｒｓ）に対応するＲｈ値の過大評価を導く（３５）。３Ｄ−ＳＥＣでは、ユニマーに対する集合体の部分分離がこの効果を制限し、これにより３Ｄ−ＳＥＣ値がＴＤＡ値により近くなる理由を説明することができる。結論として、ＵＶ吸収による検出器の場合における集合体の寄与は、それらの比較的低い質量濃度に比例するので、ＴＤＡにより得られた値は実際の値に最も近づくことは明らかである。
（約０．５Ｍの）ほぼ一定であるイオン力での緩衝液のｐＨの影響（緩衝液１対緩衝液３）は、ｐＨ７．０でのＧＬＤがｐＨ４．５でのＧＬＤよりも有意に低い流体力学的範囲を有することを示す（図４）。この結果は、ｐＨ７．０において有効に開始しなければならないアミン官能基の脱保護を考慮すると論理にかなっており、静電反発力を制限している。このｐＨ効果は、より低いイオン力において及び／又はｐＨ７以上に関して、さらに大きいことが好ましい。３％アセトニトリルの緩衝液１への添加は、流体力学的範囲を減少する傾向があるが、中程度の範囲である。これは、溶媒の質が低下することより説明することができる。
結論として、ＧＬＤは、世代の数によって準線形的に変化する流体力学的範囲を有する。前と同じように、デンドリマーと同様の挙動が観察される。さらに、ｐＨの増加及びアセトニトリルの添加は、それらの流体力学的範囲を減少する傾向にある。ＴＤＡ方法は、Ｒｈの測定に関しては、最も適した方法（ＳＬＤについて１０−２０％に対して約２−３％の相対標準偏差であり、最も再現可能である方法）であることが明らかである。
【００７８】
《実施例９：固有粘度の測定》
固有粘度［η］は、溶媒中の分子の密度に反比例する変数である。この変数は、結果として、分子量及び分子の体積（又は、流体力学的範囲）により決まる。粘度測定により、ゼロ濃度での減少した粘度又は固有の粘度（ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を外挿することにより、それを決定する。３Ｄ−ＳＥＣによって、固有粘度についての値を得ることが可能である。これらを表３に示す。官能基３のデンドリマーについての理論により予想されたように、［η］が第４世代で最大を通過するということは興味深いことであった。
流体力学的範囲及びファン・デル・ワールス（Ｖｗ）体積から始まる研究は、官能基３のデンドリマーの場合と同様の方法で、ＧＬＤの密度が発生することを示すことができる。ファン・デル・ワールス体積は、（溶媒和現象を考慮しないで）原子により実際に占有された体積を示す。増加分の合計により、それを計算することができ、各々の増加は原子の体積に対応する（隣接原子又は原子の性質の関数として表にされている）。重合度ｎのポリリジンに関して、ファン・デル・ワールス体積を下記の関係式により示す。
[式９]
Ｖｗ（ｎｍ３）＝０．１２２６×ＤＰｎ＋１８．６１０−３ （２）
その後、下記の式により自由体積分率ｆを計算することが可能である。
[式１０]
ｆ＝１−（Ｖｗ／Ｖｈ） （３）
表５はＰ１及び４つのＧＬＤ世代についてのＶｗ、Ｖｈ及びｆの値を示す。これらの値から、Ｐ４のｆが最大となることがわかる。
別のＧＬＤの樹状の挙動についての証明は、両対数目盛におけるモル質量に応じたＧＬＤの流体力学的範囲の変化を示す図５により提供される。こうしたデータの線形化を通じて得られる指数は約２．８であり、三官能デンドリマーについて得られた値と一致する。こうした指数は、デンドリマー構造のブランチ比についての良好な指標であり、３の数値が最大のブランチ構造に対応する事が分かる。
【００７９】
《実施例１０：ＧＬＤのグラフト比の分析》
用語「第ｎ世代のポリリジンデンドリマーのグラフト比（Ｐｎ）」は、この第ｎ世代の生成物の総重合度（ＤＰｎ）に対して反応するε−ＮＨ２官能基の割合を意味する。本発明のＧＰＬＤのグラフト比を下記の表６に示す。
《表６》
表６に示されるグラフト比は、第１世代から第ｎ世代へ開始するグラフト化デンドリマーの構造の進行的な分析により得られる。Ｐ１からＰ２へのグラフト比は、重合度の実験値から計算される（Ｐ１についてＤＰ＝８、Ｐ２についてＤＰ＝４８及び実験比率Ｈｂ／Ｈａ＝０．２５（図６Ａ−６Ｉ））。こうした値に基づくＤＰの変化は４０である。反応性官能基の最大値が８εＮＨ２及び１αＮＨ２であり、炭酸水中及びｐＨ６．５でのαＮＨ２官能基の反応性（ｐＫ＝７．２）が、εＮＨ２官能基（ｐＫ＝１１．２）の反応性よりもほんのわずかに大きかったことを考慮すると、Ｐ１の９ＮＨ２は平均して４．４モノマーを取り込んでいると推定される。従って、Ｐ２では最大Ｈｂ数は８であり、Ｈａ数は３０である（４０−９Ｈｃ＋１Ｈｄ（ＮＭＲでは種々の共鳴場を有する））。こうした値は、実験比率と同じＨｂ／Ｈａ比＝８／３０＝０．２６に導く。これはＰ２を生成するためにＰ１の８εＮＨ２ならびにＰ１のα−ＮＨ２官能基が反応したことを示し、Ｐ１の合計８εＮＨ２の中から８εＮＨ２ｓが反応した後Ｐ２を生成することを示す。従って、Ｐ１のグラフト比は８／８＝１００％であった。
【００８０】
放出後、Ｐ２は４０εＮＨ２及び９αＮＨ２を有している。Ｐ３へ移行するためのＰ２のグラフト比は、Ｐ２についてのＤＰ＝４８、Ｐ３についてのＤＰ＝１２３の実験値、ＤＰ＝７５の変化及び実験比Ｈｂ／Ｈａ＝０．６０から計算される（図６Ａ−６Ｉ）。
この実験値を満たす唯一の方法は、Ｐ２の反応性εＮＨ２の数が（考えられる）４０の中から３１であること（従って、９εＮＨ２は反応しない）を受け入れることである。従って、以下のように７５Ｌｙｓ（ＤＰの変化）を分類することができ、１つのリジンから各々に伸びる１０εＮＨ２、２つのリジンからの２１εＮＨ２ｓ、２つのリジンからの４αＮＨ２及び３つのリジンからの５αＮＨ２、後者は、εＮＨ２の反応性よりもわずかに大きいαＮＨ２の反応性を考慮する。この溶液は、６４Ｈａ及び２０Ｈｃ＋１Ｈｄをともなう、Ｈｂ数＝３１＋８＝３９に相当し、実験比と等しいＨｂ／Ｈａ＝３９／６４＝０．６０の比を示す。これは、Ｐ２の合計４８εＮＨ２の中から３９εＮＨ２がＰ３を生成するために反応し、Ｐ２のグラフト比は３９／４８＝８１％である事を示す。
実験比Ｈｂ／Ｈａに基づく同様の理論によって、表６に示すように、種々のＰ３、Ｐ４、Ｐ５のグラフト比を得ることが可能である。
このようなグラフト比は、本発明のグラフトリジンデンドリマーがたいへん種々であり、特にＫｌｏｋらにより記載された分岐したポリリジン［３］よりも非常に高密度であることを示す（表１参照）。約ｐＨ６．５で、重炭酸水中におけるα及びεＮＨ２官能基に対するＮＣＡの反応性により直接に生成される、本発明の化合物の高グラフト密度は、本発明のさらなる特徴である。
《表２》
《表３》
《表４》
《表５》
ＶＷ計算を考慮する重合度を表２に示す。
【００８１】
《実施例１１：トリブロックコポリマーの合成：グラフトポリ（Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−グラフトポリ（Ｌ−リジン）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ０．５ｇを合成する。
（２）３４００Ｄａのポリ（エチレングリコール）−α，ω−ジアミン０．４２ｇ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液５ｍＬを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフト｛直鎖のポリ（ＴＦＡ−Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−直鎖のポリ（ＴＦＡ−Ｌ−リジン）｝の白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１０ｍＬ中に、ｐＨ１２、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、第１世代の｛直鎖のポリ（Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−直鎖のポリ（Ｌ−リジン）｝０．４５ｇを得る。その多分散性は１．０７である（ＳＥＣにより測定）。ＬＳにより測定された平均質量は１５，５００Ｄａである。
この反応を繰り返すことにより、そして前記反応中において得られた生成物０．１５ｇをプライマーとして使用することにより、多分散性１．３及びＳＥＣ−二重検出（光拡散屈折率）により測定された２３，８００Ｄａと等しい平均質量の「グラフトポリ（Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−グラフトポリ（Ｌ−リジン）」を得た。
【００８２】
《実施例１１Ａ：第１世代の蛍光ＧＬＤ（Ｐ１）の合成》
アミノフルオレセイン５ｍｇを溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液５ｍＬを実施例１のＮε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ５００ｍｇに添加する。アミノフルオレセインのアミン官能基はＮＣＡの炭素５と反応し、Ｈ−（リジンＮε−ＴＦＡ）−ＮＨ−フルオレセインを形成し、これは次に、他のＮＣＡと反応し、８であるＤＰｎと沈殿するＨ−（リジン−Ｎε−ＴＦＡ）ｎ−ＮＨ−フルオレセインを形成する。
図１０に示されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより特徴付けられる、実施例１と同様に処理された沈殿物は、化学式（＋Ｈ２（Ｌｙｓ）ｎ−ＮＨＣ２０Ｈ１１Ｏ５）（式中、ｎは２〜２０である）の直鎖のポリ−Ｌ−リジン２４０ｍｇとなる。４９０ｎｍで励起される０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液、ｐＨ８．５、１ｃｍセル、ＳＬＭ−アミノＭＣ２００モノクロメータ分光蛍光計により、最大波長５１７ｎｍ、１０−３ｍｇ・Ｌ−１より小さい検出限界で、この材料は、蛍光発光する。この最大発光波長は、同じ条件下で、遊離アミノフルオレセインの最大発光波長（５１３ｎｍ）と比較される。デンドリマーのフルオレセインを観測するために、０．１Ｎ炭酸水素塩溶液１０ｍｌ中にこの材料５ｍｇを溶解する。０．１Ｎ炭酸水素塩溶液により、この最後の溶液１００μｌを１％に希釈する。この溶液を４９０ｎｍで励起する。蛍光発光は最大波長５１７ｎｍにおいて観測される。連続希釈により、濃度が１０−３ｍｇ・Ｌ−１である場合、１ｃｍセルを使用したＳＬＭ−アミノＭＣ２００モノクロメータ分光蛍光計の検出限界となる。最大発光波長５１７ｎｍは、同じ条件下で、遊離アミノフルオレセインの最大発光波長（５１３ｎｍ）と比較される。
【００８３】
《実施例１１Ｂ：第２世代の蛍光ＧＬＤ（Ｐ２）の合成》
この合成を、実施例１１Ａに記載された反応生成物をプライマーとして使用することにより、実施例２に記載した同じ方法で実施した。得られた生成物は、５１７ｎｍ（励起４９０ｎｍ）で蛍光を発する。その検出限界は、実施例１１Ａと同じ条件下で、約１０−３ｍｇ・Ｌ−１である。
【００８４】
《実施例１１Ｃ：第３世代の蛍光ＧＬＤ（Ｐ３）の合成》
この合成を、実施例１１Ｂに記載された反応生成物をプライマーとして使用することにより、実施例３に記載した同じ方法で実施する。得られた生成物は、５１９ｎｍ（励起４９０ｎｍ）で蛍光する。その検出限界は、実施例１１Ａと同じ条件下で、約１０−２ｍｇ・Ｌ−１である。
【００８５】
《実施例１１Ｄ：第１世代の（赤い）蛍光ＧＬＤ（Ｐ１）の合成》
実施例１と同様にして得られた、ＤＰｎ８の第１世代の直鎖のポリ−Ｎ−ＴＦＡ−Ｌ−リジン（Ｐ１）２００ｍｇを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍｌに溶解する。この溶液に、ローダミンスルホクロライド５ｍｇを添加する。マグネティックスターラーで、２５℃、２４時間、得られた均一培地を保持する。その後、０．１Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌを反応培地に添加する。明るい赤色の沈殿物は、培地中で、直ぐに形成する。５０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離により、この沈殿物を分離する。その後再び、０．１Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌの懸濁液に置き、１０回遠心分離し、未反応のローダミンを除去する。最後の洗浄水は無色であり、一方最後の沈殿物は明るい赤色のままであり、ローダミンは保護されたＰ１に十分に固定することを示す。その後、沈殿物Ｐ１を、アンモニア／メタノール５０／５０の１Ｎ水溶液５０ｍｌ中に置き、ＴＦＡ保護基からイプシロン官能基を放出する。その後、メタノール及びアンモニアを除去するために、真空中で、反応培地を半分に減らす。凍結乾燥後、明るい赤色の生成物１５０ｍｇを得る。その真っ赤な蛍光は、ローダミン（テキサスレッド）でマークされた、この新しい第１世代のデンドリマーを特徴づける。
【００８６】
《実施例１２：ＧＬＤの遊離アミン官能基への修飾》
水−アセトニトリル８０／２０溶媒の５０ｃｍ３溶液中に、３，５−ジメチルエステル−ジカルボキシフェニルイソチオシアネートの１ｇを、１ｇのＭｎ８６００ＤａのＧＬＤＰ２に添加する。得られる溶液を、４０℃、１０時間保持する。この溶液に、炭酸水素アンモニウム２ｇを添加する。４０℃での接触から５時間後、培地を透析及び凍結乾燥する。各々のアミン官能基がチオ尿素官能基によりフェニル−３，６−ジカルボン酸ナトリウムに結合する、１．５０ｇのＧＬＤＰ２を得る。得られた生成物のＤ２ＯのＮＭＲは、芳香族基と会合するＧＬＤシグナルの存在を示す。
【００８７】
《実施例１３：支持体へのＧＬＤのイオン固定》
Ｍｎ２２，０００Ｄａの３ｇのＧＬＤＰ３を滅菌蒸留水７０ｍｌ中のノーリット炭素（ＧＡＣ １２４０ ＰＬＵＳ）２４ｇでインキュベートする。その後、炭素を滅菌蒸留水２５０ｍｌで洗浄する。後者を蒸発後、１．８２ｇのＰ３を回収し、１．１８ｇのＰ３がノーリット炭素に吸着されることを示す。４９ｍｇのＰ３を吸着する炭素１ｇの活性は、Ｐ３がない対照支持体の活性と比較し、ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）で試験される。
【００８８】
《実施例１４：支持体へのＧＬＤの共有結合固定》
ヘキサメチレン−ジイソシアネート［ＯＣＮ−（ＣＨ２）６−（ＮＨＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６）ｎ−ＮＣＯ］オリゴマーを、ＧＬＤを支持体樹脂へ共有結合的に固定するために使用する。ＧＬＤの割合を０〜２０％で変動するために、ＧＬＤ（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）の周知の量をオリゴマー約５ｇ中で激しく混合し、その混合物をガラス板にプレートする。４８時間後、０．１〜１ｍｍの粒子が得られるまで、得られた樹脂を置き、アセトン２５０ｍｌ、水２５０ｍｌ、メタノール２５０ｍｌ、エチルエーテル２５０ｍｌで大量にそれを洗浄し、乾燥する。
【００８９】
《実施例１４Ａ：活性シリカへのＰ２及びＰ３の共有結合固定》
実施例１１Ｂ及び１１Ｃで得られた蛍光ＧＬＤ２５ｍｇを０．１ＮＨＣＯ３Ｎａ水溶液２５ｍＬに２５℃で溶解する。Ｓｉ−（ＣＨ２）３ＮＣＯの１．１ミリ当量を有するシリカ粒（５０ミクロン、比表面積（５００ｍ２／ｇ））１ｇをこの溶液に添加し、それを介して窒素の泡により攪拌する。２時間後、シリカ粒を分離し、水で洗浄し、乾燥する。従って、元の溶液の差により測定されたこれらＧＬＤ２０ｍｇを支持体１ｇに固定する。蛍光顕微鏡で観察されたこれら支持体の表面は、フルオレセインの緑色の蛍光特性を有する。
【００９０】
《実施例１５：ＧＬＤのインビボでの毒性研究》
４〜８週目のＳＤ系ラット（ＣＥＲ Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓｔ−Ｉｓｌｅにより繁殖）で実験を行った。
Ａ．急性毒性：
１日３回、４日間、５ラットにＧＬＤ Ｐ３（６０ｍｇ／ｍｌ）溶液２ｍＬ注射を行う。得られた結果を下記の表７に示す。
《表７》
毒性効果は見られない
Ｂ．慢性毒性
各々の日、１８０日間、ラットにＧＬＤ Ｐ３（６０ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍＬ皮下注射を行う。対照ラットは生理食塩水（溶液の溶媒）０．５ｍｌが与えられる。処理されたラット及び対照ラットの体重推移が比較される（図７）。体重推移の変化も、望ましくない効果も観察されなかった。
グラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）Ｐ３が明らかな毒性特性を示さなかった。すべての動物が生きており、対照実験と重ね合わせることのできる、等しい標準体重推移を示した。
【００９１】
《実施例１６：ＧＬＤの抗腫瘍活性》
マウスの骨髄腫細胞において、ＧＬＤ Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５の濃度変数で細胞毒性テストを実施した。得られた結果を下記の表８に示す。
《表８》
研究されるＧＬＤ世代に応じて、３４ｍｇ／Ｌ以下の濃度についてのマウスの骨髄腫において、ＧＬＤが活性であることを、マウスの骨髄腫細胞におけるこれらの試験は示す。高モル質量のＧＬＤにおいては最小活性である。
【００９２】
《実施例１７：ＧＬＤの抗真菌性活性》
Ｆｅｈｌｂａｕｍらにより記載された液体培地中での成長阻害方法（３７）により、糸状菌であるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ：ＩＮＲＡ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｓａｉｎｔ Ｃｈｒｉｓｔｏｌ−ｌｅｓ−Ａｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で、抗真菌性試験を実施した。テトラサイクリン０．１ｍｇを含む培地ＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ）の懸濁液中のF・オキシスポラムの胞子（終末濃度１０４胞子ｍＬ−１）８０μｌを、マイクロプレート上のデンドリマーの種々の希釈物２０μｌに添加する。そのデンドリマーを対照用の滅菌水２０μｌに置き換える。３０℃、２４時間インキューベーション後成長阻害を顕微鏡で観察し、４８時間における光学密度の測定後定量した。分子の（ダブレットでの）連続希釈法により最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を評価し、成長を阻害する最小デンドリマー濃度として最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を定義する。
抗真菌性試験の結果を下記の表に示す。
《表９》
ＭＩＣがフサリウム・オキシスポラムについて２７ｍｇ／Ｌであることに全体として注意することができる。
【００９３】
《実施例１８：ＧＬＤの抗菌活性》
抗菌性試験用に使用される方法は、Ｈａｎｃｏｃｋらの方法［３８］の改良である。液体の培地中の成長阻害の測定により、グラム陽性菌の３株：（ミクロコッカス・リソデイクティカスＡＴＣＣ４６９８、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１７７４８、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５２９３）、グラム陰性菌の４株：（エシェリシア・コリー３６３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ３６３）ＡＴＣＣ１１７７５、ビブリオ・ペナエイシダ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ）ＩＦＲＥＭＥＲ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ビブリオ・アングイラルム、リストネラ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１４１８１、ビブリオ・アルジノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１７７４９）で抗菌活性の測定を実施する。
【００９４】
Ａ．均一相中における
簡潔には、開始濃度Ｄ６００＝０．００１で各々の細菌懸濁液１００μｌと共に、ＰＢ培地（Ｐｏｏｒ Ｂｒｏｔｈ：ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ１％、ＮａＣｌ０．５％ ｗ／ｖ、ｐＨ７．５）中で、合成分子（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５）１０μｌをマイクロプレートでインキュベートする。攪拌下で３０℃、２４時間インキュベーション後、６００ｎｍにおいて細菌増殖を測定する。分子の（ダブレットでの）連続希釈法により最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を評価し、細菌の成長を阻害する最小デンドリマー濃度として最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を定義する。
下記の表で示される抗菌性試験の結果は、デンドリマーＰ２〜Ｐ５の活性スペクトルが広範であり、実際こうした分子がグラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方において活性があることを証明している。
《表１０》
μＭ又はｍｇ／Ｌで表される抗菌活性は、１つのデンドリマーから別のデンドリマーへの広範囲の変化及び研究された細菌の菌株に依存していることを示している。ＭＩＣが、各々の場合で最も活性のある世代のＧＬＤを使用し、グラム陽性に関しては３〜５０ｍｇ／Ｌ及びグラム陰性に関しては２３〜２００ｍｇ／Ｌで変化することに全体的に注意することができる。
【００９５】
Ｂ．不均一相中における
支持体へイオン性又は共有結合性で固定されたＧＬＤデンドリマーの抗菌活性を試験した。
１．イオン固定
実施例１３で記載したように、固定を実施した。その後、支持体（１ｇ）を滅菌水２０ｍｌで５回洗浄し、乾燥する。細菌懸濁液（ミクロコッカス・リソデイクティカス）２ｍｌと接触させ、２４時間、得られた生成物を置く。インキュベーション期間後、上清１００μＬを除去し、ＬＢ寒天皿上でプレートし、２４時間、３７℃でインキュベートする。観察された（又は、観察されない）コロニー数は、使用された支持体の活性を示す。結果を下記の表に示す。
《表１１》
こうした結果は、ＧＬＤが支持体にイオン固定される場合には、ＧＬＤは抗菌活性も実現するということを示している。
イオン固定が永久に必要ではないので、共有結合的に固定されたＧＬＤの抗菌活性も試験された。
【００９６】
２．共有結合固定
実施例１４で示したように、固定を実施した。その後、２・１０６細菌を含む細菌懸濁液（ミクロコッカス・リソデイクティカス）２ｍｌと接触させ、２４時間、各々の材料０．５ｇを置く。インキュベーション期間後、上清２５μＬを除去し、ＬＢ培地７５μＬ上に置く。この混合物をＬＢ寒天皿上でプレートし、３７℃でインキュベートする。インキュベーション９６時間後、読取りは下記の結果を示す。
《表１２》
結果は、支持体に共有結合的に固定されたＧＬＤが１％以上の濃度で優れた抗菌活性を保持していることを示す。補足研究をさらに細かい粉砕及び新しい樹脂で実施しなければならない。
【００９７】
《実施例１９：シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対するＧＬＤ活性》
Ａ：均一相中における
１、１０及び１００ｍｇ／ＬであるＰ２及びＰ３溶液と接触させ、１０，０００細菌／ｍｌであるシュードモナス・アエルギノーザの懸濁液を置いた。６、２４及び９６時間で、セトリマイド（ｃｅｔｒｉｍｉｄｅ）上で培養することにより、対照を実施した。
下記の表に示される結果は、Ｐ３溶液１００ｍｇ／Ｌによるシュードモナスの総阻害を示す。
《表１３》
【００９８】
Ｂ．支持された相中における
時間の変数のために、１０重量％Ｐ３を含む（前記と同様に合成された）ヘキサメチレン−ジイソシアネート樹脂（Ｐ３Ｓ）にシュードモナス・アエルギノーザをさらした。６、２４及び９６時間で、セトリマイド上で培養することにより、対照を実施した。下記の表に示される結果は、１，０００シュードモナス／ｍｌの懸濁液上におけるこのタイプの支持体によるシュードモナスの総阻害を示す。
《表１４》
【００９９】
［実施例２０］
レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）上のＧＬＤ活性
Ａ．均一相中における
レジオネラ・ニューモフィラ１０，０００／ｍｌの懸濁液を１０及び１００ｍｇ／ＬであるＰ２及びＰ３溶液で接触し置いた。２４、９６及び１６８時間で、ＧＶＰＣ上で培養することにより、対照を実施した。
下記の表及び図１２で示された結果は、レジオネラ・ニューモフィラがＰ３よりもＰ２に感受性があることを示す。
《表１５》
ＰＣＲ対照を実施した。
簡潔には、１０、１００ｍｇ／ＬのデンドリマーＰ２及びＰ３との接触から９６時間後、細菌懸濁液５ｍｌを０．４５μｍポリカーボネート膜でろ過し、存在する細胞（従って、細胞残渣を除去している）を抽出する。細胞をフィルター上で回収し、それらのＤＮＡを熱ショック及び化学ショックにより抽出する。１ｍｌを、限外ろ過により精製し、ＰＣＲ増幅により定量化する。結果を下記の表に示す。
《表１６》
従って、ＰＣＲ分析を下記のことを示している。
Ｐ２又はＰ３の存在によって、９６時間の培地から対照に対して９０％を超える細菌又は７０〜８０％の細菌をそれぞれ除去することを可能にする。レジオネラ・ニューモフィラには、Ｐ２の活性はＰ３の活性よりも大きい。
細胞壁の穿孔及びそれらのＤＮＡの放出により、致死濃度のＰ２又はＰ３は細菌分解を引き起こす。
【０１００】
Ｂ．支持された相中における
２重量％Ｐ１を含むヘキサメチレン−ジイソシアネート樹脂（Ｐ１Ｓ）及び２０重量％Ｐ３を含むヘキサメチレン−ジイソシアネート樹脂（Ｐ３Ｓ）を前記のように得る。
第一試験
チューブ１：対照は、ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌにより構成される。
チューブ２：ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌ＋Ｐ３Ｓ０．１ｇ
結果を下記の表に示す。
《表１７》
【０１０１】
第２試験
チューブ１：対照は、ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌにより構成される。
チューブ２：対照樹脂：ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌ＋Ｐ１Ｓ０．１ｇ
チューブ３：ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌ＋Ｐ３Ｓ０．１ｇ
《表１８》
ＰＣＲ対照を下記のように実施した。接触から９６時間後、樹脂はチューブの底に沈殿したままになっており、懸濁液５ｍｌを０．４５μｍポリカーボネート膜でろ過し、細胞を抽出する。これらを洗浄し、熱ショック及び化学ショックにより溶解する。ＤＮＡを精製し、ＰＣＲにより増幅し、カウントする。
こうした結果は、以下の、
ポリイソシアネート上のグラフト化デンドリマーＰ３の作用、
Ｐ３Ｓの効果よりも小さいと思われても、対照（Ｐ１Ｓ）の無視できない効果、
を証明する。
【０１０２】
《実施例２１：蛍光ＧＬＤの抗菌活性》
実施例１８で記載された実験は、実施例１１ＢのＧＬＤＰ２を使用し繰り返され、蛍光ＧＬＤの抗菌活性が非蛍光ＧＬＤの抗菌活性と同じであることを示している。
従って、ＧＬＤの作用機構を研究するために、蛍光ＧＬＤを使用することができる。抗菌メカニズム、さらに循環系で観察する薬物送達についてのメカニズムもまた、特異抗体を有するＧＬＤによる標的の蛍光標識は、作用機構を意味する。
【０１０３】
《実施例２２：抗体の生産及び特性へのＧＬＤの利点》
ヒスタミン免疫結合体誘導体を２つの担体で調製した：Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅ，Ｏ．らにより記載された方法によるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び第３世代ＧＬＤ（以下の式参照）。
【化３】
（「ＢＳＡ ｏｕ ＤＧＬ ｏｕ ｐｌａｑｕｅ ｃｏｖａｌｉｎｋ」は、「ＢＳＡ又はＤＧＬ又はコバリンクプレート」を示す）
ヒスタミン（ハプテンモデルを表す）と担体ＢＳＡ、ＧＬＤ及び共有結合プレートとの免疫結合体の構造。
１．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中において、ｐＨ８、ハプテン５ｍｇ、ＢＳＡ又はＧＬＤ２０ｍｇ、及び５％グルタルアルデヒド３００μｌでカップリングを実施し、３ＮＮａＢＨ４に還元する。下記のように、２匹ずつのウサギの３ロットを免疫した。
ロットＡ：Ｊ＝０でのフロイントの完全アジュバント中の免疫結合体−ＢＳＡ１５０μｇ、その後のＤ＝２１、Ｄ＝３６及びＤ＝５１でのフロイントの完全アジュバント中の結合体−ＤＧＬ１５０μｇ
ロットＢ：Ｄ＝０、Ｄ＝２１、Ｄ＝３６及びＤ＝５１でのフロイントの完全アジュバント中の結合体−ＧＬＤ１５０μｇ
ロットＣ：Ｄ＝０、Ｄ＝２１、Ｄ＝３６及びＤ＝５１でのフロイントの完全アジュバント中の天然ＧＬＤ３００μｇ。
以下の２つのＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｄ＝２１、Ｄ＝３６、Ｄ＝５１及びＤ＝６５で、ロットＡ、Ｂ、Ｃの血清を分析された。
（１）ＢＳＡ若しくはＧＬＤの免疫結合体（図１３及び図１５）又はＶａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅ，Ｏ．らにより記載された方法による遊離担体（３９）であらかじめ被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）によるＥＬＩＳＡアッセイ。この方法によって総抗体価（抗原又はハプテンに特異的、及び担体に特異的）ならびに抗担体抗体の比率を評価することを可能にする。
（２）（Ｃｌａｅｙｓ−Ｂｒｕｎｏらにより記載されたプロトコールによる（４０、４１））ハプテンであらかじめ被覆された共有結合プレート（ＮＵＮＣ）（図１４）上のＥＬＩＳＡアッセイ。この方法によって、特異的抗体のみの直接的な評価を可能にする。
【０１０４】
ロットＣ及びＢ（図１３）に関して、Ｄ６５（日数＝６５）での測定可能な抗体が無いことは、後者がハプテンにグラフトされる場合を含めて、第３世代ＧＬＤの免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｅａｌｔｈ）を証明する。同様に、天然ＧＬＤで被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐプレート上のＤ６５でのロットＡ及びＣに対するＥＬＩＳＡ応答が無いことは（図１３の白丸及びバツ）、抗ＧＬＤ抗体の欠如、ゆえにそれらは免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｅａｌｔｈ）を証明する。この結果は、任意の抗ハプテン抗体を示さないロットＢ（図１４の破線）に関する共有結合プレート上で証明される。
しかし、免疫原性担体（ＢＳＡ）による免疫システムの刺激後に、ＧＬＤが第２担体（ロットＡ）として使用される場合は、一方ではハプテン−特異抗体価の増加が起ること（図１４のＤ２１〜Ｄ３６参照）、他方ではＧＤＬ−ハプテンでの種々の免疫化後の抗−ＢＳＡ抗体（担体）の消滅（図１５）が起こることに注意されたい。
免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｅａｌｔｈ）であるが、ＧＬＤによって、初期免疫応答をトリガーとして使用される抗担体非特異的抗体の数を同時に減少することによりハプテン−特異的抗体価を増加することにより、全体として、こうした結果が証明される。
【０１０５】
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［４１］．Ｃｌａｅｙｓ−Ｂｒｕｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｐａｒｔ ＩＩ：Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ． Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００６．８０（（２），）：ｐ．１８６−１９
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に医薬組成物の製造の枠内における、グラフト化ポリリジンデンドリマーの製造方法、前記方法の実施により得られるグラフト化ポリリジンデンドリマー、及び前記ポリリジンデンドリマーの使用に関する。
【０００２】
高度に分岐したポリリジン合成に関する文献において、２つの方法が記載されている。段階的な方法は、Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒらにより始められ（１、２）、ＮＣＡアミノ酸重合方法はＫｌｏｋらにより始められた（３、４）。
最初の高度に分岐したポリリジン（通常のデンドリマーとして分類されている）は、１９８１年の初期に、ＤｅｎｋｅｗａｌｔｅｒによりＮα，Ｎ’ε−ジ−（ｔｅｒ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンから、一連のカップリング及び脱保護反応を介して調製された。
【０００３】
こうした合成は、リジンのカルボキシル基をベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）により保護されているリジンに一連のリジン単一層を添加することからなり、下記の化合物、ＢＨＡＬｙｓ、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４Ｌｙｓ８、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４Ｌｙｓ８Ｌｙｓ１６、ＢＨＡＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４Ｌｙｓ８Ｌｙｓ１６Ｌｙｓ３２等を徐々に生成することからなる。
カップリング反応は、無水溶媒中（ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ）で行われる。
得られた化合物は、表面上に多数のアミン官能基を有する。水中では、それらはポリカチオンである。
この段階的な合成方法は、文献において常に繰り返されている。
それは、例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら（５、６）、Ｂａｉｇｕｄｅら（７）及びＭｅｎｚとＣｈａｐｍａｎ（８）の研究において使用された。
【０００４】
例えば、第１段階では、Ｍａｔｔｈｅｗｓらは、Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒのポリリジンと同じポリリジンを合成した。第２段階では、それらは、各々の遊離アミン官能基、アニオン性官能基（−ＣＯ２−、ＳＯ３−等）を有する基に共有結合することによりそれらの表面を修飾し、そしてポリリジンコアをもつ新しいポリアニオン系材料を得た。こうした材料は、重要な抗ウィルス性（５）、抗菌性及び駆虫性（６）を有することが発見された。Ｂａｉｇｕｄｅらは、それらの末端のアミン官能基をオリゴ糖に結合することによりデンドリマーの表面を修飾し、得られた材料を使用し、ワクチンを作製した（７）。Ｔａｋｕｒｏらは、発生期の段階においてそれらを使用し、遺伝子をトランスフェクトした（９）。Ｃｈｏｉらは、ポリエチレングリコール−α，ω−ジアミンの２つの−ＮＨ２ｓから段階的にポリ−Ｌ−リジンデンドリマーを構築し、得られた材料は優れた遺伝子トランスフェクタントであることを示した（１０）。こうした多くの特性は、高度に分岐したポリリジンの新規材料としての大きな群のすべて又はその一部の利点をはっきり示していると思われる。
【０００５】
こうしたポリリジンデンドリマー（１、２）は、最大分岐比を有すると考えられている。
さらに、それでもなお、こうした材料の利点は、段階的な合成方法の複雑さを隠してはいけない。例えば、脱保護及び精製工程に加えて、６つの工程が６３リジンユニットのオリゴコンデンセイション（oligocondensation）に必要である。また、こうした無水溶媒中で非リジンプライマー（ＢＨＡ）を使用することの必要性に注意することも重要であり、それらの可能な生物相互作用に関する問題を提起することができる。
【０００６】
前記の段階的な合成と異なり、Ｋｌｏｋらにより最近提案された第２の方法は、高度に分岐したポリリジンの合成に関して多段階の手順でリジンＮ−カルボキシ無水物を重合することからなる（３、４）。アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）は、周知のペプチド前駆体である（１１）。こうした化合物は加水分解に敏感であり（１２、１３）、ある特定の研究を実施するための溶媒として使用される水を妨害しない（１４〜１７）。一般に、それでもなお、それは無水培地で、α−アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物を重合することが推奨されている（１１、１８、１９）。推奨される無水溶媒には、ＤＭＦ、ジオキサン及びＤＭＳＯがあり、好ましい溶媒はＤＭＦである（２０）。
【０００７】
リジンＮ−カルボキシ無水物からの高度分岐ポリリジン合成への第２アプローチを行なった著者は、無水反応培地の使用について推奨に従った。無水ＤＭＦ中における合成方法は、これに由来する。
この方法では、第１工程は、イプシロン官能基上で異なるように保護された２つのＮ−カルボキシ無水物リジン（Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡとＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡとの比が５／１〜２／１である）を共重合することからなる。保護基が選択され、その結果として、脱保護を選択することができる。加水分解によりＮＣＡを失うことを避けるために、適切な処置により注意深く無水にさせた溶媒（ＤＭＦ）中で共重合を実施する。共重合が行われるこうした条件下で、ＮＣＡの合成から得られる微量の酸を注意深く取り除かなければならない（２１）。無水ＤＭＦでは、アミン（例えば、ヘキシルアミン）により共重合がプライムされる。反応時間は５日間である。反応の終わりに、反応培地を水に注ぎ、直鎖のポリリジンポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｂｏｃ−Ｌ−リジン］）が沈殿する。濾過及び乾燥後、生成物はＢｏｃ官能基を抑制する酸処理（ＣＦ３ＣＯ２Ｈで１時間）が行なわれるが、Ｚ官能基は保持している。従って、ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）は形成される。その後、それを洗浄し、そして注意深く乾燥する。この直鎖ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）は、著者が「コア（ｃｏｒｅ）」と呼ぶ材料を構成しており、その後の工程において、分岐ポリリジンはそれから得られる。
【０００８】
無水ＤＭＦ中において、適切に精製された前記２つのＮＣＡ（Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ）の混合物と、この（コア）材料を、５日間反応させる。この反応の間に、この直鎖ポリリジンの遊離アミン官能基（例えば、Ｂｏｃ）は、Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡと反応し、新しい「分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｂｏｃ−Ｌ−リジン］）」を形成する。前記１つと同様の方法により形成される材料の回収後、この材料は、Ｂｏｃ官能基を取り除く酸処理（ＣＦ３ＣＯ２Ｈ）が行なわれ、Ｚ官能基は保持する。得られる生成物「Ｇ０と呼ばれる分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）」は、注意深くさらに精製され、そして乾燥される。
その後、無水ＤＭＦ中における５日間の、２つの試薬Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡの混合物との新しい反応において、この生成物はプライマーとして使用される。回収、乾燥、酸処理及び再乾燥後、生成物「Ｇ１と呼ばれる分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）」を得る。
【０００９】
無水ＤＭＦ中における５日間の、２つの試薬Ｚ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＣＡの混合物との新しい反応において、この生成物Ｇ１が、次にはプライマーとして使用される。回収、乾燥、酸処理及び再乾燥後、生成物「Ｇ２と呼ばれる分岐ポリ（［Ｚ−Ｌ−リジン］−ｃｏ−［Ｌ−リジン］）」が得られる。
その後、生成物Ｇ０、Ｇ１又はＧ２は、非常に酸性な培地（ＨＢｒ／ＣＨ３ＣＯ２Ｈ）での処理が行なわれる。この処理は残存しているＺ官能基を抑制し、「分岐ポリ（Ｌ−リジン）Ｇ０，Ｇ１又はＧ２」が得られる。
その後、こうした「分岐ポリ−Ｌ−リジン」をジエチルエーテルで沈殿し、凍結乾燥する。
従って、この方法は、Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒらにより最初に記載された構造と異なる構造をもつ「分岐ポリ−Ｌ−リジン」を得ることを効果的に可能にする。
【００１０】
こうした「分岐ポリ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅｓ」（３）は、２つの１Ｈ−ＮＭＲシグナルのＨｂ／Ｈａ≦０．０８の比から推論される３０％以下のグラフト比の特徴を有する（表１）。Ｈｂはイプシロン位において隣接リジンに結合しているリジンユニットのキラルプロトンを表し、Ｈａはアルファ位において隣接リジンに結合しているリジンユニットのキラルプロトンを表している。しかし、異なる共鳴場を有するＮ−末端リジン（Ｈｃ）及びＣ−末端リジン（Ｈｄ）のプロトンを排除する。従って、こうしたｐｏｌｙ−Ｌ−リジンは、重合プライマーとして、第一級アミン（ヘキシルアミン）をもつ分岐ポリペプチドのネットワーク（３０％以下のグラフト比）を形成する。
《表１》
【００１１】
結果として、本発明の目的は、前記の複雑な方法を少なくすることを可能にさせる、ポリペプチド、特にポリリジンデンドリマーの製造方法を提供することである。
詳細には、本発明の目的は、公知の製造方法よりも速く、そして少ない合成工程及び／又は精製工程を含む、ポリペプチド、特にポリリジンデンドリマーの製造方法を提供することである。
本発明の別の目的は、本方法の実施により得ることができるデンドリマーにも関する。
最後に、本発明の別の目的は、医薬組成物又は防腐組成物の製造、並びに免疫型の分析のための、本発明の方法の実施により得られるデンドリマーの使用にも関する。
本発明は、沈殿物状の疎水性ポリペプチドの製造のための活性化α−アミノ酸モノマーの使用であって、前記ポリペプチドが水性溶媒中で前記活性化α−アミノ酸モノマーの重合から生じ、そして前記溶媒中において再溶解できるものである、前記使用に関する。
【００１２】
用語「活性化α−アミノ酸モノマー」は、常温及び常圧条件下においてα−アミノ酸を重合させる修飾を受けたα−アミノ酸を意味する。
用語「疎水性ポリペプチド」は、使用される水中又は水和−有機溶媒中において不溶性であるポリペプチドを意味する。溶質（ポリペプチド）の疎水性特性を、水中又は有機溶媒（一般に、基準として使用されるオクタノール）中における溶質の分配係数Ｐにより評価することができる。分配係数Ｐは、（有機相中における溶質の濃度）／（水相中における溶質の濃度）の比として定義される。Ｐの対数を、Ｒｅｋｋｅｒ定数により評価するか（２２）、又は有機相中の濃度と水相中の濃度との比により実験的に測定することができる。
用語「水性溶媒」は、大部分が水を含んでいる（少なくとも５０重量％）、任意の溶媒又は混和性の溶媒の混合物を意味する。
用語「再溶解」は、Ｒｅｋｋｅｒ定数の修正により疎水性ペプチドの水溶液に対する復帰を意味し、例えば、リジンのイプシロン官能基を保護している基を放出することにより得ることができる。
【００１３】
この使用の利点は、以下の実施することが簡単な基本的なサイクル方法を介することである。（１）制御された大きさのペプチドを合成し、それらを容易に回収すること、（２）脱保護によりそれらを再溶解すること、（３）制御された方法においてもそれらの大きさを増加させ、反応培地から容易に、均一にそれらを回収することが、可能である。
【００１４】
前記の使用の特定の実施態様では、活性化α−アミノ酸は、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、α−アミノ酸Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、α−アミノ酸硫化カルボニル、α−アミノ酸無水炭酸、及びアミノチオ酸−酸化剤から選択される。
α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）は、文献に記載されている方法（２３−２９）のいずれか１つにより調製されるが、Ｐａｓｃａｌらにより分析された間接方法によっても調製される（２２）。
【００１５】
前記の使用の別の特定の実施態様では、活性化α−アミノ酸は、下記式（１）で表されるα−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）である。
【化１】
（式中、Ｒは天然又は修飾α−アミノ酸の側鎖を示す）
用語「天然アミノ酸」は、生態系において発見されるアミノ酸を意味する。
用語「修飾されたアミノ酸」は、側鎖（Ｒ）において修飾を受けている天然アミノ酸を意味する。
【００１６】
前記使用のさらに特定の実施態様では、Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマーは、水性溶媒中においてポリリジンを製造するために使用される。
用語、ポリリジンは、ポリマーの大部分の単一成分がリジンであるポリマーを意味する。
Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマーにおいては、εアミノ基を保護するか、又は保護しないことができる。
用語「アミノ基の保護」は、反応性を減少するか又はさらになくし、分子の疎水性特性を修飾するための、アミノ基の上に保護基と呼ばれる化学基の可逆的な固定を意味する。
【００１７】
本発明は、少なくとも１つの第一級又は第二級アミン基を含むプライマーから、グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーを製造する方法であって、Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマー、並びに、場合により１種以上の他のα−アミノ酸ＮＣＡモノマー（特には、Ｌ−オルニチン−ＮＣＡ、Ｌ−グルタミン酸−ＮＣＡ及びそのγ−アミド、Ｌ−アスパラギン酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−ジアミノ−２．４−酪酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−チロシン−ＮＣＡ、Ｌ−セリン−ＮＣＡ、Ｌ−トレオニン−ＮＣＡ、Ｌ−フェニルアラニン−ＮＣＡ、Ｌ−バリン−ＮＣＡ、Ｌ−ロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−イソロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−アラニン−ＮＣＡ、並びにグリシン−ＮＣＡを含むリストから選択される）の水性溶媒中での前記プライマーへの添加工程を含む、前記製造方法にも関する。最終材料の表面機能を修飾するために、こうした他の（ＮＣＡ）モノマーをグラフト化デンドリマー構成の最終段階で使用することができる。
【００１８】
用語「ホモポリリジン」は、リジンのみにより構成されるポリリジンを意味する。
用語「ヘテロポリリジン」は、３０モル％を超えるリジンにより構成され、種々の天然ユニットも含んでいるポリリジンを意味する。
用語「グラフト化デンドリマー」、特にグラフト化ポリリジンデンドリマーは、高分子の構造がＤｅｎｋｅｗａｌｔｅｒ（１）により最初に記載されたデンドリマーの構造よりも曲げやすく、伸びやすく、そして規則正しくないが、Ｋｌｏｋら（３、４）の分岐分子の構造よりも構造化されている高分子を意味する。Ｆｒｅｃｈｅｔ及びＴｏｍａｌｉａにより編集された研究「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ」（３１）の１８頁に示されたように、前記の柔軟性構造は、従来のデンドリマーの特性と異なる特有の特性を有する。
【００１９】
用語「プライマー」は、重合プロセスをプライムすることができる任意の化学種を意味する。活性化アミノ酸の場合では、プライマーは、求核種、例えば第１Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ１２アルキルジアミン、第２又は第３Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミン、ＵＶ又は蛍光により検出できる多環芳香族のアリールアミン、検出できる放射性原子を有する第１又は第２アルキル又はアリールアミン、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するアミノ酸、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するペプチド、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するデンドリマー、１種又は複数の遊離アミン官能基を有するポリマーである。
【００２０】
第ｉ（ｉ≧２）世代のデンドリマーの合成に関して、使用されるプライマーは第ｉ−１世代の脱保護されたグラフト化デンドリマーを表す。
最初の活性アミノ酸又は複数のアミノ酸と同一のユニットのみを含むペプチドを生成することが望ましい場合、本発明による第１世代のデンドリマーの合成の間に、プライマー、例えば外部のプライマーを反応混合物に添加することは不可能である。この場合、ＮＣＡ又はＮＣＡｓの加水分解（溶媒中における水の存在下により開始される）は、プライミングを必要とするアミノ酸（１種又は複数）を放出する。従って、第１世代の合成（Ｐ１と称する）に関して、外部のプライマーを使用するか又は使用しないことがあり、１つが使用される場合には、使用されるアミノ酸モノマーと異なることがある。
【００２１】
ホモポリリジンデンドリマーの合成の特定の場合において、外部のプライマーを第１世代生成物（Ｐ１）の合成工程に使用しない場合、プライマーとしてε保護されたリジンを使用することにより得られたものに対して、同じ結果が得られる。外部のプライマーとして保護されていないリジンについて、鎖の伸びは、プライム点として２つのα及びεアミン官能基を有する。これら２つの場合において、反応収率は、外部のプライマーを使用しない場合よりも５％大きい。一方、第２世代生成物（Ｐ２）、第３世代生成物（Ｐ３）又は第ｎ世代生成物（Ｐｎ）をもたらす各々の後に続く工程では、使用されるプライマーは、工程Ｐｎ−１において得られる生成物である。
【００２２】
前記の製造方法の特定の実施態様では、モノマーはＬ−リジン−ＮＣＡのみであった。
前記の製造方法の別の特定の実施態様では、Ｌ−リジン−ＮＣＡが、特には、
【化２】
から選択される基によって、Ｎεにおいて保護された。
前記の基は、疎水性のオーダー増加において分類され、それぞれのＲｅｋｋｅｒ定数はｌｏｇＰ＝−１．５２８、−０．９４６、０．９６４、１．１２４、２．８４９、５．８１により与えられる。
有利には、保護基の性質によって、得られるポリリジンの大きさを調節することを可能にする。保護基が疎水性になればなるほど、ポリリジンの沈殿を促進するために必要とされるポリリジン中に存在する保護されたリジンユニットの数は小さくなる。従って、弱疎水性保護基（Ｆｏｒｍｙｌ）で得られたポリリジンの大きさは、更に疎水性の基（ＴＦＡ）で得られたポリリジンの大きさよりも大きい。
【００２３】
前記製造方法の別の特定の実施態様では、プライマーは、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、ホモポリリジン、ポリ（エチレングリコール）−α、ω−ジアミン、ヘテロポリリジン、ヘテロペプチド又はホモペプチドから選択される。
用語「ホモペプチド」は、ペプチドの残基すべてが同じであるペプチドを意味する。
用語「ヘテロペプチド」は、異なる性質の残基により構成されるペプチドを意味する。
前記製造方法の別の実施態様では、溶媒のｐＨが約３〜９である。
このｐＨの使用は、ペプチド結合の安定性の範囲を表し（３２）、この範囲外のｐＨと比較して反応収率の増加をもたらす。
好ましい実施態様によれば、本発明は、前記１世代のグラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマー（Ｐ１）の製造方法に関し、下記の
沈殿物状の第１世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、Ｎε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡをプライマーに添加する工程、
第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程において得られた第１世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程を含む。
【００２４】
用語「世代（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」は、この高分子の各々の成長段階の間において得られる生成物を意味する。
用語「第１世代の（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １）」は、外部のプライマーなしか、又は前記ＴＦＡ−Ｌ−リジン又は他のどんなプライマーももっている、ＴＦＡ−Ｌ−リジンＮＣＡの第１重合反応の生成物を意味する。
本発明による第１世代のグラフト化デンドリマーは直鎖状であることに注意されたい。
前記第１世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーの製造方法の好ましい実施態様では、プライマーは、Ｎεにおいて保護されているか、又は保護されていないＬ−リジンである。
プライマーとしてＮε保護されているＬ−リジンの使用によって、Ｌ−リジンのホモポリペプチドが得ることができるようになる。
保護されていないＬ−リジンの使用によって、それぞれα及びεアミンから開始する２つのホモポリペプチドＬ−リジン鎖の伸長を可能にする。
【００２５】
前記１世代のヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法の別の好ましい実施態様では、プライマーはポリ（エチレングリコール）−α，ω−ジアミンであり、その分子量は１００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、好ましくは１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａである。
本発明の別の好ましい実施態様では、前記第１世代のホモポリリジンデンドリマーの製造方法は、以下の
第１世代の保護されたポリリジンデンドリマーの沈殿物を得るため、プライマーの添加がないか、又はＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジンプライマーを含む、約６〜約８のｐＨの水溶液に、ＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程、及び
分子量約１，４００Ｄａ、特に１，４５０Ｄａであり、約１．２の多分散性インデックスを有し、そしてリジンの８ユニットの平均重合度に相当する、直鎖の第１世代のポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程で得られたポリリジンポリマーを脱保護する工程、を含む。
【００２６】
前記及びこの後において、用語「平均分子量」は、数平均分子量
[式１]
（式中、合計は可能な分子量すべてに関し、Ｎｉは分子量Ｍｉを有する分子の数である）を意味する。重量平均分子量は、
[式２]
により定義される。多分散性インデックス（又は、多分子）は、Ｉ＝Ｍｗ／Ｍｎにより定義される。同様に、数平均重合度は、
[式３]
により定義され、そして重量平均重合度は、
[式４]
により定義される。用語「平均重合度」は、ポリマー鎖に含まれている平均モノマー数である。
【００２７】
光拡散及び示差屈折インデックス検出器に連結している立体排除クロマトグラフィーにより、平均（数又は重量）分子量、平均重合度ならびに多分子量インデックスを絶対的に測定する。第１世代（Ｐ１、低分子量ポリマー）に関して、絶対分子量の測定をキャピラリー電気泳動法により実施した。得られた結果は、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により得られた結果と一致している。
【００２８】
本発明は、前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジン又はヘテロポリリジンの製造方法にも関し、ｎは２〜１０の整数であり、
沈殿物状の第ｎ世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
保護された第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されたプライマーへの、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡの添加、及び前記ポリリジンの脱保護から得られたそれ自体であり、
前記第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーに関して示されたように得られたそれ自体であり、
ｎ＝２の場合、第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、請求項１０〜１３のいずれか一項で定義され、前記第１世代のポリリジンデンドリマーが第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーのコアを形成している前記工程；
第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、第ｎ世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程、
を含んでいる。
【００２９】
用語「適切なｐＨ」は、ｐＨが３〜９であり、より詳細にはｐＨが６．５を意味する。
特定の実施態様では、本発明は前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐｎ）の製造方法に関し、Ｌ−リジン−ＮＣＡが、ＴＦＡによりＮε保護されており、前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーのコアが、Ｌ−リジンの約８残基を含む直鎖のポリリジンから形成され、例えば前記第１世代のホモポリリジンの製造方法の実施により得ることができ、前記第ｎ世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーの分岐度が約４０％〜約１００％、特に約６０％〜約１００％である。
【００３０】
第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐｎ）の用語「分岐度」、「グラフト比」及び「分岐比」は、第ｎ世代の生成物の全重合度（ＤＰｎ）に関して反応する、ＰｎにおけるεでのＮＨ２の割合と同義的な意味である。
分岐度を測定する好ましい手段は、ＨｂプロトンのＮＭＲシグナルの強度とＨａプロトンのＮＭＲシグナルの強度との比の測定であった。こうしたシグナルは、εアミン官能基に結合するリジンユニットのキラル炭素により運ばれるプロトンの共鳴（Ｈｂ（４．０１ｐｐｍ））、αアミン官能基に結合するリジンユニットのキラル炭素により運ばれるプロトンの共鳴（Ｈａ（４．０８ｐｐｍ））を意味し、３．５と３．９ｐｐｍとの間で共鳴するＮ−末端（Ｈｃ）及びＣ−末端（Ｈｄ）リジンユニットにより運ばれるプロトンを除いている。こうした２つのシグナルの強度比によって、こうしたグラフト化デンドリマーの分岐度を解明することは可能である（３）。
有利には、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーのＨｂ／Ｈａ比は、約０．２〜約０．８、特に約０．２５〜約０．６０である。
【００３１】
好ましい実施態様では、本発明は前記第２世代のグラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法に関し、
第１世代のポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第１世代のポリリジンデンドリマーが、上で定義したように、例えば、約８ユニットのリジンを含む第１世代のホモポリリジンデンドリマーの製造方法の実施により得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第１世代のポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
第２世代の保護されたポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中において、前記添加の工程が行われ；
− 約６，０００〜約１４，０００Ｄａ、特に約８，３５０Ｄａ、好ましくは約８，６００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約４０〜約６０、特に約４８である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ２）を得るために、前記工程において得られるポリリジンを脱保護する工程とを含む。
【００３２】
前記第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．１〜約０．８、特に約０．２〜約０．３、更に特に０．２５であることも特徴とする。さらに、前記第２世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ１プライマーは約５０％〜約１００％、特に約８０％〜約１００％、より特に約１００％のグラフト比となる。
【００３３】
用語「遊離の外部−ＮＨ２基（ｆｒｅｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ −ＮＨ２ ｇｒｏｕｐｓ）」は、脱保護されているεアミン官能基の−ＮＨ２基及びα位におけるＮＨ２基を意味する。
遊離−ＮＨ２基の存在を測定する好ましい方法はＮＭＲである。例えば、Ｎε−トリフルオアセチルリジンを使用する場合、保護基の除去及び遊離アミン官能基の発生によって、１９Ｆ ＮＭＲにおいて、（−７６ｐｐｍにおける）トリフルオロアセチル基シグナルの消失及び（−７５．８ｐｐｍにおける）トリフルオロ酢酸シグナルの同時発生が起こる。この消失は、１Ｍ水／メタノール／アンモニア溶液中において、４０℃、１５時間で完全となる。
【００３４】
別の好ましい実施態様では、本発明は前記第３世代のグラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐ３）の製造方法に関し、
第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが前記方法の実施により得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
第３世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ３）を得るために、水性溶媒中において、適切なｐＨで前記添加の工程が行われ；
約１５，０００〜約３０，０００Ｄａの平均分子量、特に約２１，５００Ｄａ、好ましくは約２２，０００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約１００〜約１５０、特に約１２３である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第３世代グラフト化ポリリジンデンドリマーを得るための、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程とを含む。
前記第３世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．２〜約０．８、特に約０．５〜約０．７、より特に約０．６であることも特徴とする。さらに、前記第３世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ２プライマーは約５０％〜約９０％、特に約７０％〜約９０％、より特に約８１％のグラフト比となる。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、本発明は前記第４世代のグラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐ４）の製造方法に関し、
第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、前記方法の実施により得られ、
（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
保護されている４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ４）を得るために、適切なｐＨの水性溶媒中で、前記添加の工程が行われ、
約５０，０００〜約８０，０００Ｄａ、特に約６４，０００Ｄａ、好ましくは約６５，０００Ｄａ又は６５，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約３００〜約４５０、特に約３６５である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るための、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程とを含む。
前記第４世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．２〜約０．８、特に約０．４〜約０．５、より特に０．４６であることも特徴とする。さらに、前記第４世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ３プライマーは約５０％〜約９０％、特に約７０％〜約９０％、より特に約８０％のグラフト比となる。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、本発明は前記グラフトホモポリリジンデンドリマー（Ｐ５）の製造方法に関し、
第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、前記方法の実施により得られるものであり、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特に約３であり、
第５世代の保護されているポリリジンデンドリマー（Ｐ５）を得るために、水性溶媒中において、適切なｐＨで前記添加の工程が行われ；
約１４０，０００〜約２００，０００Ｄａ、特に約１６９，０００Ｄａ、好ましくは約１７２，０００Ｄａ又は１７２，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約９００〜約１１００、特に約９６３である遊離の外部−ＮＨ２基を有する第５世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程とを含む。
前記５世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーは、Ｈｂ／Ｈａ比が約０．２〜約０．８、特に約０．３〜約０．５、約０．４であることも特徴とする。さらに、前記５世代のグラフトホモポリリジンデンドリマーを合成している間に、Ｐ４プライマーは約５０％〜約９０％、特に約６０％〜約７０％、より特に約６５％のグラフト比となる。
【００３７】
本発明は、前記グラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法にも関し、特に第１世代のために使用されたプライマーがグラフト化デンドリマーに共有結合的に固定され、前記プライマーはマーカー産物を含み、デンドリマーを下記の手段（ＵＶ吸光度、蛍光発光、Ｘ線不透明度又は磁場感度）により容易に検出する。下記の各々の式、７−アミノ−１，３−ナフタレン−ジスルホン酸、アミノフルオレセイン、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド、ローダミンスルホクロライド（テキサスレッド）、アミドトリゾエート又はアイオキサグレート、又はＡｕ１１（Ｐ（Ｃ６Ｈ４）ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨＯ）３）７）等のアルデヒド官能基、カルボン酸官能基又はアミンに対する他の活性官能基を有する金属クラスター（Ａｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ）等のポリヨウ化物造影剤が、限定されないマーカー産物の例として、与えられ、Ｘ線及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）において像を明瞭にする診断目的の薬剤に使用される。前記のマークされた分子が、例えば前記最初の２つのアミン官能基を有する場合、それらはＮＣＡの重合をプライムするために使用することができる。その後、それらはＣ末端に対するアミド結合により第１世代のグラフト化デンドリマー（Ｐ１）に共有結合する。対照的に、例えばマークされた分子がアミンに反応することができるアルデヒド、スルホクロライド、カルボン酸等の官能基を有する場合は、その後、従来の方法を使用することにより、ＮεにおけるＴＦＡ官能基の脱保護の前にデンドリマー（Ｐ１）のＮ末端にそれらを共有結合することが可能である。これらの操作は、ＤＭＦにおいて実施され、その後、反応生成物を水中での沈殿により回収する。Ｎε−ＴＦＡ官能基を放出後、デンドリマーの構築を続ける。第２世代デンドリマー、さらに第３世代デンドリマーから、マーカー産物はデンドリマーのコアに「埋めこまれ」ている。従って、下記の実施例２２に示すように、それらはデンドリマーそれ自体のようには、免疫系に対して認識されない。デンドリマーによって担持されていることにより、マーカー産物は生理的培地中に可溶となっている。こうしたマーカー産物の毒性（単独で使用された場合）は、デンドリマーにより生体から隠される。その後、マーカー産物の性質に従って、ＵＶ吸光度、蛍光、Ｘ線又は磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）により、こうしたマーカー産物を検出することができる。
【００３８】
本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーの製造方法は多数の利点を有する。
第１の利点は、水性溶媒中において、活性化モノマー（ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ）を、文献（２１）の推奨と対照的に、精製していない反応生成物（例えば、事前の精製をしていない）として使用することができることである。ＮＣＡの合成の間に形成される塩酸又は亜硝酸（２５、２９、３２）は、たとえ重合が起こるｐＨ３〜９を含んでいても、水性溶媒中では、どんな問題もない。
【００３９】
第２の利点は、本発明による重合反応は速いことである。それらは、−１０〜６０℃の間の温度及び３〜９の間のｐＨに応じて、３０分から２時間で完了する。
【００４０】
第３の利点は、ポリペプチドは水性溶媒中において沈殿物を（どの世代でも）形成し、濾過又は遠心分離により容易に回収可能であることである。沈殿物が低多分散性インデックスを有するペプチドであることにより、この利点は向上する。実際、低級アミノ酸のポリマーは可溶であり、それらの伸びを可能にするが、ある一定の長さを超えると沈殿し、それらの伸びをブロックする。結果として、得られた生成物は狭い分布曲線を有し、その平均質量は初期の担体（プライマー）と最終生成物との間の親水性と疎水性バランスにより特に決まる。このバランスは、εでのアミン官能基の保護のために使用される基の性質の機能でもある。
【００４１】
本発明の方法による第４の利点は、無水溶媒を必要とする前記方法とは異なり、水性培地中での重合反応を酸性培地中でプライムすることができる。従って、第１重合反応は、ＮＣＡの加水分解も由来するＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ、又は反応培地に添加されるＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓのいずれかからプライムされ、放出後に、第１世代のポリリジンデンドリマー（Ｐ１）はリジンにより厳密に構成される。Ｐ１は第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ２）用のプライマーであり、Ｐ２は第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐ３）のプライマー等であるので、この定性的（生物学的に有益）な純度は、次の世代において必要である。
この可能性は、前記のもの、例えばアミノ酸、ペプチド、アルキルアミン、アルキルジアミン、アリールアミン以外のアミンによりプライムされる重合を妨げるものではない。
【００４２】
本発明の方法の第５の利点は、予想される第ｉ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー（Ｐｉ）の数平均重量（Ｍｎ）を制御及びプログラムすることが容易であることである。グラフト化ポリリジンデンドリマーの形成反応では、実際、「ＴＦＡ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＣＡ」／「プライマー」の比の選択が重要である。ａｄ ｈｏｃ比について、得られたグラフト化ポリリジンデンドリマーは単一であり、低多分散性及び所与のＭｎを有する。しかし、過剰の活性モノマーが使用された場合、得られたＰｉの平均Ｍｎはａｄ ｈｏｃ比が使用された場合よりも高い。より過剰な活性モノマーは、期待されるＰｉに加えて、精密濾過により除去される微量のＰ１の形成を導く。従って、この特性は、ａｄ ｈｏｃ平均重量よりも３０％制御可能である数平均重量のグラフト化ポリリジンデンドリマーの各々の世代にとって、得ることは可能である。従って、Ｍｎ１，４５０ＤａのＰ１世代からプライムすることにより、下記の最少と最大との間で変化する重量のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得ることを可能にする。
６，０００Ｄａ＜ＭｎＰ２＜１４，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ＜ＭｎＰ３＜３０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ＜ＭｎＰ４＜８０，０００Ｄａ、１４０，０００Ｄａ＜ＭｎＰ５＜２００，０００Ｄａ、好ましくは、ＭｎＰ２＜１２，０００Ｄａ、ＭｎＰ３＜２８，６００Ｄａ、ＭｎＰ４＜８４，０００Ｄａ、ＭｎＰ５＜２２４，０００Ｄａである。
【００４３】
イプシロンアミン官能基の保護基の性質が変化することにより、この基の疎水性に応じて、保護基がより疎水的である場合にはより低いＭｎのＰ１〜Ｐｉ化合物、保護基がより親水的である場合にはより高いＭｎのＰ１〜Ｐｉ化合物を得ることができる。従って、この方法により、望ましい平均重量（Ｍｎ）を有するグラフト化ポリリジンデンドリマーを容易に合成することが可能である。
第２世代に使用することができるプライマーが直鎖のポリリジンであることにより、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、世代数に応じて、従来技術のリジンデンドリマーよりも素早く増加する分子量を有する。この点において、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、Ｋｌｏｋらにより記載された分岐ポリリジン（３）と比較することができるが、非常に高いグラフト比により、それらは後者と構造的に相違している。
このような理由のために、本発明のポリリジンデンドリマーをグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）と称する。
【００４４】
本発明は、前記製造方法の実施により、特に前記第ｎ世代（ｎは１よりも大きい）のグラフトホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法の実施により得ることができるグラフト化ポリリジンデンドリマーにも関する。特定の実施態様では、前記グラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）は、外部−ＮＨ２基が、単糖類、核酸、タンパク質、又はカルボキシル基、スルホン酸基及びリン酸官能基を有する基、エチレンポリオキサイド、及びヒドロ炭酸塩又はペルフルオロヒドロ炭酸塩鎖、アルデヒド又はそれらの前駆体、又はカルバモイル基又はクロロエチルニトロソ尿素基等のマスク反応官能基（イソシアネート）を含むリストから選択される基に、全部又は部分的に共有結合しているか、又は非共有結合されることを特徴とする。
こうした表面官能修飾は、それらに、新規な物理的特性、さらに新規な生物学的特性を与える。
【００４５】
別の特定の実施態様では、前記グラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）は、それらを支持体に共有結合的に又は非共有結合的に、特に静電結合的に固定することができ、それらによって支持体がその特性を保持することが可能であることを特徴とする。
第１の利点は、それらの特性を保持することにより、前記支持体（粒子、繊維又は表面）は、デンドリマーの特性を獲得する。そして、このような支持体を実施することによって、それらを、様々な状況において、濾過、組織、表面被覆、研磨粒子として使用することを可能にしている。
【００４６】
第２の利点は、本発明のグラフト化デンドリマーを支持体に固定することにおいて、こうした支持体の表面ユニット当たりに多数の反応官能基（アミン又は酸）を作り出し、それらの特性が修飾されることである。そして、この修飾の利点は、例えば、抗体、アプタマー、ＤＮＡフラグメントを、免疫学的アッセイのために通常使用されるプレートに固定することができるよりも多くの濃度で支持体に固定することであり、このような高い特異性のレセプターから前記アッセイ感度の増加を可能にする。
【００４７】
第３の利点は、従って、固定されたグラフト化ポリリジンデンドリマーが固定されていない条件と比べてその特性を保持することである。
用語「支持体」は、無機材料（シリカ、アルミナ、金属酸化物）又は有機材料（ポリアクリル、ポリウレタン、ポリエポキシ、ポリイソシアネート、多糖類、ポリアミド）を意味する。
好ましい実施態様によれば、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、
それらと接触する免疫系に関して密かであり、そして有利には、免疫系が反応するハプテン又は抗原の担体として使用され、抗体を形成することができる。
本発明は、前記抗原又は前記ハプテンに対する抗体の生成を目的とする、抗原−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体又はハプテン−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体を調製する、前記グラフト化ポリリジンデンドリマーの使用にも関する。
【００４８】
実際、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーは、グラフト化ポリリジンデンドリマーが免疫系に対して現れない、例えば免疫システムがグラフト化ポリリジンデンドリマーに対して抗体を生成しないことを特徴とする。しかし、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマーがそれらの表面で固定されているハプテン又は抗原を有する場合、担体がＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）及びＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）等のタンパク質である場合に起こることと比較すると、グラフトリジンデンドリマー担体に対するいかなるものも産生することなく、免疫システムは前記ハプテン又は抗原に対する抗体を産生することができる。
【００４９】
利点は、従来の方法により産生される場合に起こることと比較すると、抗体は抗原及びハプテンに対して特異的に産生され、担体に特異的である抗体と混合されないため、その後の分析ツールとしてより直接的に使用することができる。
用語「ハプテン」は、それ自身により非抗原性である低分子量の分子を意味する。
本発明は、例えば、前記製造方法の実施により得ることができるグラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）組成物にも関する。
本発明は、抗菌剤又は抗真菌剤としての、前記グラフトリジンデンドリマー（又は、グラフト化ポリリジンデンドリマー）に関するが、但し、それは人体又は動物体の治療上の処置に使用されない。
特に均一相においては、本発明によるグラフト化ポリリジンデンドリマー（又は、グラフトリジンデンドリマー）は、殺菌性の処置の枠内での表面処置に使用され、又はこうした表面の微生物汚染の危険を予防するために使用される。
グラフトリジンデンドリマーは、例えば、貯蔵水等の微生物汚染の危険における液体貯蔵所の処理にも使用することができる。
抗菌性フィルター及びコーティングとして、バイオフィルムに対する循環抗菌性粒子として、特に汚染に対する船体保護として、前記支持体に固定し、本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーを使用することができる。
【００５０】
本発明は、有効成分として、少なくとも１つの前記グラフト化ポリリジンデンドリマーを、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする、医薬用組成物にも関する。
本発明は、細菌感染若しくは真菌感染、又は癌の処置を目的とする薬剤の製造ための前記グラフト化ポリリジンデンドリマー（又は、グラフトリジンデンドリマー）の使用にも関する。
薬剤調製へのグラフト化ポリリジンデンドリマー（又は、グラフトリジンデンドリマー）の前記使用の特定の実施態様では、細菌感染が、特に、シュードモナス科、特にシュードモナス属；レジオネラ科、特にレジオネラ属；腸内細菌科、特にエシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、及びエルシニア属；ビブリオ科；パスツレラ科；アルカリゲネス科、特にボルデテラ属；ブルセラ科、特にブルセラ属；フランキセラ科、特にフランキセラ属；ナイセリア科；ミクロコッカス科、特にブドウ球菌属、連鎖球菌属、及びリステリア属；を含むリストから選択される科に属しているグラム陰性及びグラム陽性細菌による感染から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
《図１》
静的光拡散（static light diffusion:ＳＬ）を備えたＳＥＣ（立体排除クロマトグラフィー: Steric Exclusion Chromatography）での本発明の種々の世代のポリリジンデンドリマー（Ｐ１〜Ｐ５）で得られたクロマトグラムである。実験条件：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、溶出剤１、注入濃度：５ｇ／Ｌ、注入体積：１００μＬ。クロマトグラムは溶出体積（ｍＬ、ｘ軸）に対する屈折率信号（ｙ軸）を示す。
【００５２】
《図２》
世代（ｘ軸）に対する、本発明のポリリジンデンドリマーの数平均分子量（ｇ／ｍｏｌ、ｙ軸）（ひし形）、比較としての単官能性デンドリマーの理論的分子量（四角）、Ｈ．Ａ．Ｋｌｏｋらにより記載された二官能性デンドリマー（三角）の変化の図を示す。ＧＬＤの分子量は、光拡散を備えたＳＥＣにより（Ｐ２〜Ｐ５）、及びキャピラリー電気泳動により（Ｐ１）測定された。樹枝状構造が完全であると仮定して（すべてのリジンモノマーのアミン官能基は反応していると仮定する）ポリリジンデンドリマーの分子量を計算した。単官能デンドリマーのコアは、ベンズヒドリルアミンを表す。二官能性デンドリマーのコアは、１，４−ジアミノブタンを表す。指数法則による実験データの非線形修正により得られた式を相関係数Ｒ２で図に示す。
【００５３】
《図３》
３つの異なる実験方法を使用して測定された、世代（ｘ軸）に応じた本発明のグラフトリジンデンドリマー（ｎｍ，ｙ軸）の流体範囲を示す：ＴＤＡ（Ｔａｙｌｏｒ拡散分析、四角）、ＳＬＤ（半弾性光散乱、ひし形）、及び３Ｄ−ＳＥＣ（３重検出立体排除クロマトグラフィー：ｔｒｉｐｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔｅｒｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、光散乱、粘度検出器及び屈折率、三角）の図を示す。
【００５４】
《図４》
実施例において調べた３つの緩衝液（緩衝液１（ひし形）、緩衝液２（四角）、緩衝液３（三角））中においてＴＤＡにより測定された、世代（ｘ軸）に応じた本発明のグラフトリジンデンドリマー（ｎｍ、ｙ軸）の流体範囲の図を示す。
【００５５】
《図５》
両対数目盛において、分子量（ｇ／ｍｏｌ）に応じた、ＧＬＤの流体範囲（ｎｍ）の図を示す。直線は、関係式Ｒｈ〜Ｍ１／υを表す線形修正を示す。υ値は、２．７２±０．２２（緩衝液１）（四角）；２．８０±０．０９（緩衝液２）（円）；２．７４±０．０８（緩衝液３）（三角）と等しい。
【００５６】
《図６》
図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄは、３．７と４．４ｐｐｍとの間での、２５℃、Ｄ２Ｏ中の直鎖のトリリジン（図６Ｄ）及びペンタリジン（図６Ｃ）、ならびに本発明のグラフトリジンデンドリマー（１〜５世代（Ｐ１〜Ｐ５））（図６及び図６Ｂ）の４００ＭＨｚによる１ＨＮＭＲスペクトルを示す。図６Ｈはトリリジンの化学式を示す。図６Ｇはペンタリジンの化学式を示す。図６ＦはＰ１の化学式を示し、図６ＥはＰ２の化学式を示す。示されたスペクトル範囲は、Ｌ−リジンのキラル炭素が有するプロトンを表す。環境に応じて、このプロトンは種々の共鳴場を有する。図６Ｉは、こうした異なる生成物で観測される４つの異なる環境（Ｈａ、Ｈｂ、Ｈｃ、Ｈｄ）を示す。キラル炭素が有するプロトンＨａ、Ｈｂ、Ｈｃ及びＨｄを、それぞれ、白丸、黒丸、丸なし及び灰色の丸により示す。Ｈａは、ペプチド結合によりその隣接部に結合されるコアリジンのキラルプロトンを表す。ＨｃはＮ末端リジンのキラルプロトンを表す。ＨｄはＣ末端リジンのキラルプロトンを表す。Ｈｂは、隣接リジンのＮＨ２側鎖に結合するデンドリマーのコアリジンのキラルプロトンを表す。この結合はアミド及び非ペプチドである。
【００５７】
トリリジンスペクトル（図６Ｄ）では、等しい強度の３つの異なるシグナル（Ｈａ、Ｈｃ及びＨｄ）の存在を注意されたい。ペンタリジンスペクトル（図６Ｃ）では、Ｈａの強度は、等しい強度のシグナルＨｃ又はＨｄの強度よりも３倍大きい（３コアリジン）。比較すると、化合物Ｐ１のスペクトル（図６Ｂ）では、シグナルＨａの強度は、等しい強度のシグナルＨｃ又はＨｄ強度よりも約７倍大きく、その結果として化合物Ｐ１は９リジン（７コア及び２末端）と等しい平均長さの直鎖のポリリジンである。アミド結合の特性を決定するＨｂシグナルは、化合物Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５のスペクトルでのみ観測可能である。各々のこうしたスペクトルでは、Ｈｂシグナルの強度は、アミド結合により隣接リジンの側鎖（εＮＨ２）に結合するリジンの数に比例する。Ｈａは、ペプチド結合（Ｎ末端及びＣ末端残基を除く）によりα−ＮＨ２の隣接に結合するリジンの数に比例する。従って、Ｈｂ／Ｈａ比は、所与の世代が次の世代を生成するためにＮＣＡに反応する、側鎖（εＮＨ２）の数に結びつけられる。
【００５８】
Ｈｂ／Ｈａ比は、（ｎ）世代のポリリジンのグラフト（分岐）比を決定することを可能にする。このグラフト比は、（ｎ＋１）世代を生成するためにＮＣＡに反応する世代（ｎ）のεＮＨ２の割合である。
このグラフト比（表６）は、Ｐ１からＰ２への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．２５）については１００％であり（Ｐ２を生成するために、Ｐ１の８側鎖がＮＣＡに反応することを意味する）、Ｐ２からＰ３への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．６０）については８１％であり（Ｐ３を生成するために、Ｐ２の４８側鎖中３９がＮＣＡに反応することを意味する）、Ｐ３からＰ４への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．４６）については８０％、Ｐ４からＰ５への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．４０）については６５％、Ｐ５からＰ６への移行（Ｈｂ／Ｈａ＝０．４２）については６４％である（図示せず）。
【００５９】
《図７》
第１世代（Ｐ１）〜５世代（Ｐ５）のグラフトリジンデンドリマーを表した図である。Ｐｎ構造の定義：
[式５]
【００６０】
《図８》
下記の実験条件下での保護されたＰ１（直鎖のポリ−Ｌ−リジン）の分離を表す電気泳動図を示す：未使用のシリカキャピラリー、６０ｃｍ（検出窓５０ｃｍ）×５０μｍ。電解質：５％デキストランを含むリン酸塩緩衝液（１２５ｍＭＨ３ＰＯ４ １２５ｍＭＮａ＋Ｈ２ＰＯ４− ｐＨ＝２．１６）。付与電圧：＋２０ｋＶ。２００ｎｍのＵＶ検出器。サンプル濃度：３ｇ／Ｌ。注入：ゲージ圧２ｐｓｉ（９分間）。この図は時間（分）の関数としての吸光度（ｍＡＵ）を表す。
同じ条件下で、直鎖のジ−、トリ−、テトラ−及びペンタ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した市販のペプチド）を分析することにより得られた電気泳動図と比較すると、化合物（脱保護されたＰ１）が３と約２０のリジン残基との間で含まれる長さの直鎖のオリゴリジンの混合物であることをこの電気泳動図は確認している。この電気泳動図から、数平均重合度（ＤＰｎ＝８）及び多分子性インデックス（Ｉ＝１．２）を決定することが可能である。数平均重合度ＤＰｎ及び重量平均重合度ＤＰｗを下記の比から計算した：
[式６]
（式中、Ｎｉは重合度ｉを有する高分子の数である）。吸光度がモノマーに起因するＵＶ検出器の場合では、検出器の応答はポリマーの質量濃度に比例する。従って、ＤＰｎ及びＤＰｗを、重合度ｉのポリマーに相当する各々の電気泳動ピークの高さｈｉの関数として（又は、ピークを一体化することができる場合には、移動時間により補正された面積Ａｉの関数として）表すことができる。
[式７]
【００６１】
《図９》
屈折及び線形モードの印加型バイオシステムボイジャーＯＦ−ＳＴＲ装置において作成された（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルを表す。フライトチューブの長さは、２ｍ（線形）又は３ｍ（屈折）及びレーザー波長λ＝３３７ｎｍである（レーザーＮ２）。マトリックスは、ＴＦＡ−ε−保護されたＰ１についてはＤＭＦ中の１０ｇ・Ｌ−１α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）であり、脱保護されたＰ１についてはＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中の１０ｇ・Ｌ−１α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸である。サンプルは、１０／１（ｖ／ｖ）マトリックス／サンプルの比率で調製され、続いて（１μｌ）をターゲットに析出した。３００レーザーショットの集積及び２０ｋＶへの加速電圧により、スペクトルを得る。図９Ａは、０℃で、純水で洗浄されたＴＦＡ−保護されたＰ１を表し、図９Ｂは、０℃で、重炭酸アンモニウムの溶液で４回洗浄された脱保護されたＰ１を表す。これらの図は、質量ｍ／ｚの関数としてのピークの割合強度を表す。これらＴＦＡ−保護されたＰ１化合物及び脱保護されたＰ１化合物の完全に再現可能なスペクトルは、Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンＮＣＡの重合をプライマーなしで、ｐＨ６．５の水中において起こした場合、直鎖のポリリジン（Ｐ１）が、明らかな副生成物なしに、そして「リビング（ｌｉｖｉｎｇ）」（すなわち、Ｃ末端残基での−ＣＯ２Ｈ官能基及びＮ末端残基での−ＮＨ２官能基をもっている）で得られることを示している。
【００６２】
《図１０》
アミノフルオレセイン存在下において、ｐＨ６．５で、水中でのＮε−ＴＦＡ−リジンＮＣＡの重合反応の生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。この反応で得られた沈殿物を、０．１ＮＨＣＯ３Ｎａ溶液により４回洗浄し、アンモニア溶液で処理し、凍結乾燥する。凍結乾燥の質量スペクトルは、得られた生成物が２と２０との間に含まれるリジン数ｎを有するフルオレセインアミド（＋Ｈ２（Ｌｙｓ）ｎ−ＮＨＣ２０Ｈ１１Ｏ５）であることを示す。４９０ｎｍでのl励起に関して、この材料は、ｐＨ８．５、０．１Ｍ炭酸二ナトリウム溶液中において、５１７ｎｍで最大lをもち、１０−３ｍｇ・Ｌ−１未満の検出限界値で蛍光発光する。この最大発光lは、同じ条件下で、遊離アミノフルオレセインの発光（５１３ｎｍ）と比較される。
【００６３】
《図１１》
最初の４日間は３６０ｍｇグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）Ｐ３、次の１８０日間は本発明の３０ｍｇＧＬＤＰ３を与えられたオスＳＤラット（ｎ＝６）のグループにおける、時間に応じた（ｘ軸（日数））平均体重推移（ｙ軸（ｇ））を表す（黒色曲線）。対照ラット（ｎ＝１００）は、０．５ｍｌ生理食塩水（溶液の溶媒）を与えられる（灰色曲線）。
【００６４】
《図１２》
時間に応じた（ｘ軸（日数））対照（ひし形）に対する、１０ｍｇ／Ｌでの第２世代（円）、１００ｍｇ／Ｌでの第２世代（三角）、１０ｍｇ／Ｌでの第３世代（四角）、１００ｍｇ／Ｌへの第３世代（星）の本発明のグラフト化ポリリジンデンドリマーと接触し置かれているレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）菌の生存率（ｙ軸）を表す。
【００６５】
《図１３》
種々の希釈におけるＭａｘｉｓｏｒｐ支持板上でのＥＬＩＳＡ。ＧＬＤ−ハプテン（黒円）又は天然ＧＬＤ（白円）でコーティングされた支持板上におけるロットＡＤ６５、ＧＬＤ−ハプテンでコーティングされた支持板上におけるロットＢ（黒三角）及び天然ＧＬＤでコーティングされた支持板上におけるロットＣ（×印）。吸光度（ＯＤ）は希釈血清対数の関数として示す。
【００６６】
《図１４》
ＥＬＩＳＡコバリンク。ロットＡＤ２１（黒三角）、ロットＡＤ３６（黒四角）、ロットＢ（破線）。吸光度（ＯＤ）は希釈血清対数の関数として示す。
【００６７】
《図１５》
ＢＳＡ−ハプテン（黒四角）又は天然ＢＳＡ（×印）でコーティングされた支持板上におけるＤ６５でのロットＡについて、種々の希釈生理食塩水でのＭａｘｉｓｏｒｐ支持板上でのＥＬＩＳＡ。吸光度（ＯＤ）は希釈血清対数の関数として示す。
【実施例】
【００６８】
《実施例１：第１世代のポリリジンデンドリマー（Ｐ１）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを従来の方法、特には、例えばＣｏｌｌｅｔら［２９］により記載され、又は再生成された方法によって合成される。
（２）０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを前記粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成された直鎖のポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンの白色沈殿物を回収した。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．２（ＣＥ（キャピラリー電気泳動、実施例７参照）により測定）をもつ直鎖のポリ−Ｌ−リジン５４ｇを得る。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により測定し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮＭＲにより確認された絶対平均質量は、１，４５０Ｄａである。
【００６９】
《実施例２：第２世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ２）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマー９４ｇを前記の通り合成する。
（２）重合プライマーとして実施例１の第１世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを、粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．４０（ＳＥＣにより測定）のグラフトポリ−Ｌ−リジンデンドリマー７０ｇを得る。ＳＬにより測定された平均質量は８，６００Ｄａである。モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が８，６００Ｄａと１２，０００Ｄａとの間で変化する第２世代生成物を得る。
【００７０】
《実施例３：第３世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ３）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを前記の通り合成する。
（２）実施例２の第２世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．４６（ＳＥＣにより測定）のグラフトポリ−Ｌ−リジンデンドリマー７０ｇを得る。ＳＬにより測定された平均質量は２２，０００Ｄａである。
モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が２２，０００Ｄａと２８，６００Ｄａとの間で変化する第３世代生成物を得る。
【００７１】
《実施例４：第４世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ４）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを前記の通り合成する。
（２）実施例３の第３世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．３６（ＳＥＣにより測定）及び平均質量 ６５，３００Ｄａ（ＬＳにより測定）のグラフトポリ−Ｌ−リジンデンドリマー７０ｇを得る。
モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が６５，３００Ｄａと８５，０００Ｄａとの間で変化する第３世代生成物を得る。
【００７２】
《実施例５：５世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ５）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ９４ｇを前記の通り合成する。
（２）実施例４の第４世代生成物３０ｇが溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液１Ｌを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成された５世代のグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーの白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１Ｌ中に、ｐＨ１１、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、多分散性１．４６（ＳＥＣにより測定）のグラフトポリ−Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジンデンドリマーを得る。ＳＬにより測定された平均質量は１７２，３００Ｄａである。
モノマー質量／プライマー比を３．９から２．６に変えることにより、重量が１７２，３００Ｄａと２２４，０００Ｄａとの間で変化する第３世代生成物を得る。
【００７３】
《実施例６：６、７及び８世代のグラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）（Ｐ６、Ｐ７及びＰ８）》
この合成は、次の６、７、８世代について繰り返された。外挿法により評価されたそれらの重量は、順に、４３０，０００Ｄａ、１，１３０，０００Ｄａ及び３，０００，０００Ｄａに等しい。
【００７４】
《実施例７：平均分子量及び多分散性指標の測定》
マルチアングル静的光拡散及び示差屈折インデックス検出器を備えた立体排除クロマトグラフィー（２Ｄ−ＳＥＣ）は、４つの世代のＧＬＤ（Ｐ２−Ｐ５）のモル質量分布を得ることが可能である。直鎖のＰ１コアのモル質量分布を、ＥＣ （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮＭＲにより確認）により得た。測定は、Ｈ２ＰＯ４−Ｎａ＋５０ｇ／Ｌにより構成される水性溶離液（溶離液１、溶離液の定義については、表２参照）中においてｐＨ４．５で実施された。得られたクロマトグラムを図１に示す。ＧＬＤの湿度に対する保護保管は集合体形成を減少することが可能であるが、それでも完全にこの現象を避けることはできない。従って、こうした注意にもかかわらず、特にＰ４及びＰ５に関して、集合体の形成（低溶離液体積でのショルダー）を図１は示す。平均分子量の結果を、屈折率の増加（ｄｎ／ｄＣ）と推定される重合度と共に、表３に示す。この方法は絶対分子量の測定を可能にするが、所与のモル質量値は対イオン（溶離液中のＨ２ＰＯ４−リン酸イオン）の一定の割合を考慮しなければならないことに注意されるべきである。実験的に評価することは困難であるが、この一定の割合をマニングにより記載された凝縮の理論により評価することは可能である。この理論の枠内で、ポリリジン中の２つの電荷間の平均距離（０．３４ｎｍ）とＢｊｅｒｒｕｍ長さ（０．６９ｎｍ、２５℃）との比により、凝縮速度が与えられる。リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の荷電モノマーの平均モル質量は、故に、１２９×０．４９＋２２７×０．５１＝１７９ｇ／ｍｏｌとなる。この平均から、モノマーの平均数Ｎを評価することは可能である。３Ｄ−ＳＥＣ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）による緩衝液２で得られた分子量の結果は、特にＰ４及びＰ５に関して非常に高いモル質量値を示す。多分、これは大量の集合体を形成するからである。その後、２Ｄ−ＳＥＣにより得られた値は保持されるだろう。
【００７５】
均等目盛（図２Ａ）又は片対数目盛（図２Ｂ）で図２Ａ−図２ＢにＧＬＤのモル質量の変化を示す。比較検討を介して、モノアミン（デンドリマー１、ベンズヒドリルアミンコアをもつ、（５、３３））又はジアミンプライマー（１，４−ジアミノブタンコアでプライムされたデンドリマー２（７））のどちらか一方でプライムされたポリリジンデンドリマーに関し、予想される（理論上の）分子量も示す。すべての場合（ＧＬＤを含む）において、モル質量の増加が指数関数的であることは興味深いことである。従って、２つの連続の世代のモル質量を同じ係数で掛ける。しかし、ＧＬＤの場合では、デンドリマー２についての２．１２、デンドリマー１についてのほんの１．９５に対して、増倍係数は３．２（ｅ１．１６２）である。ＧＬＤの分子量は、結果として、指数関数的成長の法則、デンドリマーの特性を有するが、同じタイプのデンドリマーよりもＧＬＤでは、モル質量の増加は非常に速い方法で起きる。
多分散性インデックスが比較的低く、１．２（第１世代）と１．４６（５世代）との間で含まれ、提案された合成方法が制御された多分散性の化合物を得ることを容易に可能にさせることを証明することに気付くであろう。
第ｉ世代から第ｉ＋１世代の移行中にポテンシャルプライマー（α又はεアミン官能基）により取り込まれたモノマーの平均数の計算結果を表４に示す。この結果は、第４世代の３官能基のデンドリマーに最少密度（最大固有粘度）を与える固有粘度についての結果と一致する（実施例９参照）。
【００７６】
《実施例８：ＧＬＤの流体力学的範囲（又は拡散係数）の測定》
溶液中のＧＬＤの特性次元を発見するために、ストークス−アインシュタインの比を使用することによって分子拡散係数から流体力学的範囲を決定した
[式８]
（式中、ηは培地の粘度であり、ｋはボルツマン定数であり、Ｔは温度（Ｋ）である）。Ｄｍを決定するために、２つの実験的方法である（ＳＥＣを備えているか、又はＳＥＣを備えていない）準弾性又は静的光拡散（ＳＬＤ）、及びテイラー拡散法（ＴＤＡ）を使用した。この後者の方法によって、流体流れ（流体流れの速度プロファイルは分散的であると知られている（放物ポアズイユプロファイル））の影響下で、種の拡散係数を溶質バンドの拡大から測定することは可能である。
キャピラリー電気泳動装置、５０μｍシリカキャピラリー（最大６０ｃｍ×５０ｃｍ検出器）（キャピラリーの表面上でのＧＬＤ溶質の吸着を制限するために、キャピラリーの内壁面をグラフトポリカチオン（ポリ（ジアリル−ジメチル−アンモニウム））によりあらかじめ修飾されている）を使用することにより、ＴＤＡ測定を実施した。ＵＶ分光光度計を使用し、ポアズイユの流れの影響下での溶質バンドの分散を測定した。その後、Ｔａｙｌｏｒにより最初に記載され、その後Ｂｅｌｌｏらにより繰り返された方法［３４］により、拡散係数を決定した。ＴＤＡ方法と平行して、ゼタサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ））装置を使用し、ＳＬＤにより、測定を実施した。最後に、３Ｄ−ＳＥＣ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）からＲｈ測定を得ることも可能である。合わせて、Ｒｈについての全ての数値データを表３に示す。
【００７７】
図３は、緩衝液２における、３つの使用された実験方法についての世代に応じたＧＬＤの流体力学的範囲の増加を示す。ＴＤＡにより得られた値がＳＬＤ又は３Ｄ−ＳＥＣにより得られた値よりも小さいことは明らかである。この相違は、おそらく、小さい割合においてもＳＬＤにより得られたＲｈ値を増加する傾向にあるサンプルにおいて、集合体が存在するためである。実際、高分子量の集合体は、（モル質量の６乗で変化する）拡散光シグナルに重要な貢献を示し、ユニマー（ｕｎｉｍｅｒｓ）に対応するＲｈ値の過大評価を導く（３５）。３Ｄ−ＳＥＣでは、ユニマーに対する集合体の部分分離がこの効果を制限し、これにより３Ｄ−ＳＥＣ値がＴＤＡ値により近くなる理由を説明することができる。結論として、ＵＶ吸収による検出器の場合における集合体の寄与は、それらの比較的低い質量濃度に比例するので、ＴＤＡにより得られた値は実際の値に最も近づくことは明らかである。
（約０．５Ｍの）ほぼ一定であるイオン力での緩衝液のｐＨの影響（緩衝液１対緩衝液３）は、ｐＨ７．０でのＧＬＤがｐＨ４．５でのＧＬＤよりも有意に低い流体力学的範囲を有することを示す（図４）。この結果は、ｐＨ７．０において有効に開始しなければならないアミン官能基の脱保護を考慮すると論理にかなっており、静電反発力を制限している。このｐＨ効果は、より低いイオン力において及び／又はｐＨ７以上に関して、さらに大きいことが好ましい。３％アセトニトリルの緩衝液１への添加は、流体力学的範囲を減少する傾向があるが、中程度の範囲である。これは、溶媒の質が低下することより説明することができる。
結論として、ＧＬＤは、世代の数によって準線形的に変化する流体力学的範囲を有する。前と同じように、デンドリマーと同様の挙動が観察される。さらに、ｐＨの増加及びアセトニトリルの添加は、それらの流体力学的範囲を減少する傾向にある。ＴＤＡ方法は、Ｒｈの測定に関しては、最も適した方法（ＳＬＤについて１０−２０％に対して約２−３％の相対標準偏差であり、最も再現可能である方法）であることが明らかである。
【００７８】
《実施例９：固有粘度の測定》
固有粘度［η］は、溶媒中の分子の密度に反比例する変数である。この変数は、結果として、分子量及び分子の体積（又は、流体力学的範囲）により決まる。粘度測定により、ゼロ濃度での減少した粘度又は固有の粘度（ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を外挿することにより、それを決定する。３Ｄ−ＳＥＣによって、固有粘度についての値を得ることが可能である。これらを表３に示す。官能基３のデンドリマーについての理論により予想されたように、［η］が第４世代で最大を通過するということは興味深いことであった。
流体力学的範囲及びファン・デル・ワールス（Ｖｗ）体積から始まる研究は、官能基３のデンドリマーの場合と同様の方法で、ＧＬＤの密度が発生することを示すことができる。ファン・デル・ワールス体積は、（溶媒和現象を考慮しないで）原子により実際に占有された体積を示す。増加分の合計により、それを計算することができ、各々の増加は原子の体積に対応する（隣接原子又は原子の性質の関数として表にされている）。重合度ｎのポリリジンに関して、ファン・デル・ワールス体積を下記の関係式により示す。
[式９]
Ｖｗ（ｎｍ３）＝０．１２２６×ＤＰｎ＋１８．６１０−３ （２）
その後、下記の式により自由体積分率ｆを計算することが可能である。
[式１０]
ｆ＝１−（Ｖｗ／Ｖｈ） （３）
表５はＰ１及び４つのＧＬＤ世代についてのＶｗ、Ｖｈ及びｆの値を示す。これらの値から、Ｐ４のｆが最大となることがわかる。
別のＧＬＤの樹状の挙動についての証明は、両対数目盛におけるモル質量に応じたＧＬＤの流体力学的範囲の変化を示す図５により提供される。こうしたデータの線形化を通じて得られる指数は約２．８であり、三官能デンドリマーについて得られた値と一致する。こうした指数は、デンドリマー構造のブランチ比についての良好な指標であり、３の数値が最大のブランチ構造に対応する事が分かる。
【００７９】
《実施例１０：ＧＬＤのグラフト比の分析》
用語「第ｎ世代のポリリジンデンドリマーのグラフト比（Ｐｎ）」は、この第ｎ世代の生成物の総重合度（ＤＰｎ）に対して反応するε−ＮＨ２官能基の割合を意味する。本発明のＧＰＬＤのグラフト比を下記の表６に示す。
《表６》
表６に示されるグラフト比は、第１世代から第ｎ世代へ開始するグラフト化デンドリマーの構造の進行的な分析により得られる。Ｐ１からＰ２へのグラフト比は、重合度の実験値から計算される（Ｐ１についてＤＰ＝８、Ｐ２についてＤＰ＝４８及び実験比率Ｈｂ／Ｈａ＝０．２５（図６Ａ−６Ｉ））。こうした値に基づくＤＰの変化は４０である。反応性官能基の最大値が８εＮＨ２及び１αＮＨ２であり、炭酸水中及びｐＨ６．５でのαＮＨ２官能基の反応性（ｐＫ＝７．２）が、εＮＨ２官能基（ｐＫ＝１１．２）の反応性よりもほんのわずかに大きかったことを考慮すると、Ｐ１の９ＮＨ２は平均して４．４モノマーを取り込んでいると推定される。従って、Ｐ２では最大Ｈｂ数は８であり、Ｈａ数は３０である（４０−９Ｈｃ＋１Ｈｄ（ＮＭＲでは種々の共鳴場を有する））。こうした値は、実験比率と同じＨｂ／Ｈａ比＝８／３０＝０．２６に導く。これはＰ２を生成するためにＰ１の８εＮＨ２ならびにＰ１のα−ＮＨ２官能基が反応したことを示し、Ｐ１の合計８εＮＨ２の中から８εＮＨ２ｓが反応した後Ｐ２を生成することを示す。従って、Ｐ１のグラフト比は８／８＝１００％であった。
【００８０】
放出後、Ｐ２は４０εＮＨ２及び９αＮＨ２を有している。Ｐ３へ移行するためのＰ２のグラフト比は、Ｐ２についてのＤＰ＝４８、Ｐ３についてのＤＰ＝１２３の実験値、ＤＰ＝７５の変化及び実験比Ｈｂ／Ｈａ＝０．６０から計算される（図６Ａ−６Ｉ）。
この実験値を満たす唯一の方法は、Ｐ２の反応性εＮＨ２の数が（考えられる）４０の中から３１であること（従って、９εＮＨ２は反応しない）を受け入れることである。従って、以下のように７５Ｌｙｓ（ＤＰの変化）を分類することができ、１つのリジンから各々に伸びる１０εＮＨ２、２つのリジンからの２１εＮＨ２ｓ、２つのリジンからの４αＮＨ２及び３つのリジンからの５αＮＨ２、後者は、εＮＨ２の反応性よりもわずかに大きいαＮＨ２の反応性を考慮する。この溶液は、６４Ｈａ及び２０Ｈｃ＋１Ｈｄをともなう、Ｈｂ数＝３１＋８＝３９に相当し、実験比と等しいＨｂ／Ｈａ＝３９／６４＝０．６０の比を示す。これは、Ｐ２の合計４８εＮＨ２の中から３９εＮＨ２がＰ３を生成するために反応し、Ｐ２のグラフト比は３９／４８＝８１％である事を示す。
実験比Ｈｂ／Ｈａに基づく同様の理論によって、表６に示すように、種々のＰ３、Ｐ４、Ｐ５のグラフト比を得ることが可能である。
このようなグラフト比は、本発明のグラフトリジンデンドリマーがたいへん種々であり、特にＫｌｏｋらにより記載された分岐したポリリジン［３］よりも非常に高密度であることを示す（表１参照）。約ｐＨ６．５で、重炭酸水中におけるα及びεＮＨ２官能基に対するＮＣＡの反応性により直接に生成される、本発明の化合物の高グラフト密度は、本発明のさらなる特徴である。
《表２》
《表３》
《表４》
《表５》
ＶＷ計算を考慮する重合度を表２に示す。
【００８１】
《実施例１１：トリブロックコポリマーの合成：グラフトポリ（Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−グラフトポリ（Ｌ−リジン）》
（１）Ｎε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ０．５ｇを合成する。
（２）３４００Ｄａのポリ（エチレングリコール）−α，ω−ジアミン０．４２ｇ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液５ｍＬを粗反応生成物に添加する。
（３）３０分後、ろ過又は遠心分離により、培地中で形成されたグラフト｛直鎖のポリ（ＴＦＡ−Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−直鎖のポリ（ＴＦＡ−Ｌ−リジン）｝の白色沈殿物を回収する。
（４）アンモニア水溶液１０ｍＬ中に、ｐＨ１２、１５時間、４０℃で置かれたこの沈殿物は、重合中に添加されたユニットの側鎖のＴＦＡ保護基を失い、水に可溶となる。
（５）溶媒の体積を回転式エバポレータで半分に減らす。
（６）凍結乾燥後、第１世代の｛直鎖のポリ（Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−直鎖のポリ（Ｌ−リジン）｝０．４５ｇを得る。その多分散性は１．０７である（ＳＥＣにより測定）。ＬＳにより測定された平均質量は１５，５００Ｄａである。
この反応を繰り返すことにより、そして前記反応中において得られた生成物０．１５ｇをプライマーとして使用することにより、多分散性１．３及びＳＥＣ−二重検出（光拡散屈折率）により測定された２３，８００Ｄａと等しい平均質量の「グラフトポリ（Ｌ−リジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）−ブロック−グラフトポリ（Ｌ−リジン）」を得た。
【００８２】
《実施例１１Ａ：第１世代の蛍光ＧＬＤ（Ｐ１）の合成》
アミノフルオレセイン５ｍｇを溶解している０℃に保持した０．１ＭＨＣＯ３Ｎａ水溶液５ｍＬを実施例１のＮε−ＴＦＡ−Ｌ−リジン−ＮＣＡ５００ｍｇに添加する。アミノフルオレセインのアミン官能基はＮＣＡの炭素５と反応し、Ｈ−（リジンＮε−ＴＦＡ）−ＮＨ−フルオレセインを形成し、これは次に、他のＮＣＡと反応し、８であるＤＰｎと沈殿するＨ−（リジン−Ｎε−ＴＦＡ）ｎ−ＮＨ−フルオレセインを形成する。
図１０に示されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより特徴付けられる、実施例１と同様に処理された沈殿物は、化学式（＋Ｈ２（Ｌｙｓ）ｎ−ＮＨＣ２０Ｈ１１Ｏ５）（式中、ｎは２〜２０である）の直鎖のポリ−Ｌ−リジン２４０ｍｇとなる。４９０ｎｍで励起される０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液、ｐＨ８．５、１ｃｍセル、ＳＬＭ−アミノＭＣ２００モノクロメータ分光蛍光計により、最大波長５１７ｎｍ、１０−３ｍｇ・Ｌ−１より小さい検出限界で、この材料は、蛍光発光する。この最大発光波長は、同じ条件下で、遊離アミノフルオレセインの最大発光波長（５１３ｎｍ）と比較される。デンドリマーのフルオレセインを観測するために、０．１Ｎ炭酸水素塩溶液１０ｍｌ中にこの材料５ｍｇを溶解する。０．１Ｎ炭酸水素塩溶液により、この最後の溶液１００μｌを１％に希釈する。この溶液を４９０ｎｍで励起する。蛍光発光は最大波長５１７ｎｍにおいて観測される。連続希釈により、濃度が１０−３ｍｇ・Ｌ−１である場合、１ｃｍセルを使用したＳＬＭ−アミノＭＣ２００モノクロメータ分光蛍光計の検出限界となる。最大発光波長５１７ｎｍは、同じ条件下で、遊離アミノフルオレセインの最大発光波長（５１３ｎｍ）と比較される。
【００８３】
《実施例１１Ｂ：第２世代の蛍光ＧＬＤ（Ｐ２）の合成》
この合成を、実施例１１Ａに記載された反応生成物をプライマーとして使用することにより、実施例２に記載した同じ方法で実施した。得られた生成物は、５１７ｎｍ（励起４９０ｎｍ）で蛍光を発する。その検出限界は、実施例１１Ａと同じ条件下で、約１０−３ｍｇ・Ｌ−１である。
【００８４】
《実施例１１Ｃ：第３世代の蛍光ＧＬＤ（Ｐ３）の合成》
この合成を、実施例１１Ｂに記載された反応生成物をプライマーとして使用することにより、実施例３に記載した同じ方法で実施する。得られた生成物は、５１９ｎｍ（励起４９０ｎｍ）で蛍光する。その検出限界は、実施例１１Ａと同じ条件下で、約１０−２ｍｇ・Ｌ−１である。
【００８５】
《実施例１１Ｄ：第１世代の（赤い）蛍光ＧＬＤ（Ｐ１）の合成》
実施例１と同様にして得られた、ＤＰｎ８の第１世代の直鎖のポリ−Ｎ−ＴＦＡ−Ｌ−リジン（Ｐ１）２００ｍｇを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍｌに溶解する。この溶液に、ローダミンスルホクロライド５ｍｇを添加する。マグネティックスターラーで、２５℃、２４時間、得られた均一培地を保持する。その後、０．１Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌを反応培地に添加する。明るい赤色の沈殿物は、培地中で、直ぐに形成する。５０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離により、この沈殿物を分離する。その後再び、０．１Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌの懸濁液に置き、１０回遠心分離し、未反応のローダミンを除去する。最後の洗浄水は無色であり、一方最後の沈殿物は明るい赤色のままであり、ローダミンは保護されたＰ１に十分に固定することを示す。その後、沈殿物Ｐ１を、アンモニア／メタノール５０／５０の１Ｎ水溶液５０ｍｌ中に置き、ＴＦＡ保護基からイプシロン官能基を放出する。その後、メタノール及びアンモニアを除去するために、真空中で、反応培地を半分に減らす。凍結乾燥後、明るい赤色の生成物１５０ｍｇを得る。その真っ赤な蛍光は、ローダミン（テキサスレッド）でマークされた、この新しい第１世代のデンドリマーを特徴づける。
【００８６】
《実施例１２：ＧＬＤの遊離アミン官能基への修飾》
水−アセトニトリル８０／２０溶媒の５０ｃｍ３溶液中に、３，５−ジメチルエステル−ジカルボキシフェニルイソチオシアネートの１ｇを、１ｇのＭｎ８６００ＤａのＧＬＤＰ２に添加する。得られる溶液を、４０℃、１０時間保持する。この溶液に、炭酸水素アンモニウム２ｇを添加する。４０℃での接触から５時間後、培地を透析及び凍結乾燥する。各々のアミン官能基がチオ尿素官能基によりフェニル−３，６−ジカルボン酸ナトリウムに結合する、１．５０ｇのＧＬＤＰ２を得る。得られた生成物のＤ２ＯのＮＭＲは、芳香族基と会合するＧＬＤシグナルの存在を示す。
【００８７】
《実施例１３：支持体へのＧＬＤのイオン固定》
Ｍｎ２２，０００Ｄａの３ｇのＧＬＤＰ３を滅菌蒸留水７０ｍｌ中のノーリット炭素（ＧＡＣ １２４０ ＰＬＵＳ）２４ｇでインキュベートする。その後、炭素を滅菌蒸留水２５０ｍｌで洗浄する。後者を蒸発後、１．８２ｇのＰ３を回収し、１．１８ｇのＰ３がノーリット炭素に吸着されることを示す。４９ｍｇのＰ３を吸着する炭素１ｇの活性は、Ｐ３がない対照支持体の活性と比較し、ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）で試験される。
【００８８】
《実施例１４：支持体へのＧＬＤの共有結合固定》
ヘキサメチレン−ジイソシアネート［ＯＣＮ−（ＣＨ２）６−（ＮＨＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６）ｎ−ＮＣＯ］オリゴマーを、ＧＬＤを支持体樹脂へ共有結合的に固定するために使用する。ＧＬＤの割合を０〜２０％で変動するために、ＧＬＤ（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）の周知の量をオリゴマー約５ｇ中で激しく混合し、その混合物をガラス板にプレートする。４８時間後、０．１〜１ｍｍの粒子が得られるまで、得られた樹脂を置き、アセトン２５０ｍｌ、水２５０ｍｌ、メタノール２５０ｍｌ、エチルエーテル２５０ｍｌで大量にそれを洗浄し、乾燥する。
【００８９】
《実施例１４Ａ：活性シリカへのＰ２及びＰ３の共有結合固定》
実施例１１Ｂ及び１１Ｃで得られた蛍光ＧＬＤ２５ｍｇを０．１ＮＨＣＯ３Ｎａ水溶液２５ｍＬに２５℃で溶解する。Ｓｉ−（ＣＨ２）３ＮＣＯの１．１ミリ当量を有するシリカ粒（５０ミクロン、比表面積（５００ｍ２／ｇ））１ｇをこの溶液に添加し、それを介して窒素の泡により攪拌する。２時間後、シリカ粒を分離し、水で洗浄し、乾燥する。従って、元の溶液の差により測定されたこれらＧＬＤ２０ｍｇを支持体１ｇに固定する。蛍光顕微鏡で観察されたこれら支持体の表面は、フルオレセインの緑色の蛍光特性を有する。
【００９０】
《実施例１５：ＧＬＤのインビボでの毒性研究》
４〜８週目のＳＤ系ラット（ＣＥＲ Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓｔ−Ｉｓｌｅにより繁殖）で実験を行った。
Ａ．急性毒性：
１日３回、４日間、５ラットにＧＬＤ Ｐ３（６０ｍｇ／ｍｌ）溶液２ｍＬ注射を行う。得られた結果を下記の表７に示す。
《表７》
毒性効果は見られない
Ｂ．慢性毒性
各々の日、１８０日間、ラットにＧＬＤ Ｐ３（６０ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍＬ皮下注射を行う。対照ラットは生理食塩水（溶液の溶媒）０．５ｍｌが与えられる。処理されたラット及び対照ラットの体重推移が比較される（図７）。体重推移の変化も、望ましくない効果も観察されなかった。
グラフトリジンデンドリマー（ＧＬＤ）Ｐ３が明らかな毒性特性を示さなかった。すべての動物が生きており、対照実験と重ね合わせることのできる、等しい標準体重推移を示した。
【００９１】
《実施例１６：ＧＬＤの抗腫瘍活性》
マウスの骨髄腫細胞において、ＧＬＤ Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５の濃度変数で細胞毒性テストを実施した。得られた結果を下記の表８に示す。
《表８》
研究されるＧＬＤ世代に応じて、３４ｍｇ／Ｌ以下の濃度についてのマウスの骨髄腫において、ＧＬＤが活性であることを、マウスの骨髄腫細胞におけるこれらの試験は示す。高モル質量のＧＬＤにおいては最小活性である。
【００９２】
《実施例１７：ＧＬＤの抗真菌性活性》
Ｆｅｈｌｂａｕｍらにより記載された液体培地中での成長阻害方法（３７）により、糸状菌であるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ：ＩＮＲＡ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｓａｉｎｔ Ｃｈｒｉｓｔｏｌ−ｌｅｓ−Ａｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で、抗真菌性試験を実施した。テトラサイクリン０．１ｍｇを含む培地ＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ）の懸濁液中のF・オキシスポラムの胞子（終末濃度１０４胞子ｍＬ−１）８０μｌを、マイクロプレート上のデンドリマーの種々の希釈物２０μｌに添加する。そのデンドリマーを対照用の滅菌水２０μｌに置き換える。３０℃、２４時間インキューベーション後成長阻害を顕微鏡で観察し、４８時間における光学密度の測定後定量した。分子の（ダブレットでの）連続希釈法により最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を評価し、成長を阻害する最小デンドリマー濃度として最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を定義する。
抗真菌性試験の結果を下記の表に示す。
《表９》
ＭＩＣがフサリウム・オキシスポラムについて２７ｍｇ／Ｌであることに全体として注意することができる。
【００９３】
《実施例１８：ＧＬＤの抗菌活性》
抗菌性試験用に使用される方法は、Ｈａｎｃｏｃｋらの方法［３８］の改良である。液体の培地中の成長阻害の測定により、グラム陽性菌の３株：（ミクロコッカス・リソデイクティカスＡＴＣＣ４６９８、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１７７４８、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５２９３）、グラム陰性菌の４株：（エシェリシア・コリー３６３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ３６３）ＡＴＣＣ１１７７５、ビブリオ・ペナエイシダ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ）ＩＦＲＥＭＥＲ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ビブリオ・アングイラルム、リストネラ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１４１８１、ビブリオ・アルジノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１７７４９）で抗菌活性の測定を実施する。
【００９４】
Ａ．均一相中における
簡潔には、開始濃度Ｄ６００＝０．００１で各々の細菌懸濁液１００μｌと共に、ＰＢ培地（Ｐｏｏｒ Ｂｒｏｔｈ：ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ１％、ＮａＣｌ０．５％ ｗ／ｖ、ｐＨ７．５）中で、合成分子（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５）１０μｌをマイクロプレートでインキュベートする。攪拌下で３０℃、２４時間インキュベーション後、６００ｎｍにおいて細菌増殖を測定する。分子の（ダブレットでの）連続希釈法により最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を評価し、細菌の成長を阻害する最小デンドリマー濃度として最小成長阻害濃度（ＭＩＣ）を定義する。
下記の表で示される抗菌性試験の結果は、デンドリマーＰ２〜Ｐ５の活性スペクトルが広範であり、実際こうした分子がグラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方において活性があることを証明している。
《表１０》
μＭ又はｍｇ／Ｌで表される抗菌活性は、１つのデンドリマーから別のデンドリマーへの広範囲の変化及び研究された細菌の菌株に依存していることを示している。ＭＩＣが、各々の場合で最も活性のある世代のＧＬＤを使用し、グラム陽性に関しては３〜５０ｍｇ／Ｌ及びグラム陰性に関しては２３〜２００ｍｇ／Ｌで変化することに全体的に注意することができる。
【００９５】
Ｂ．不均一相中における
支持体へイオン性又は共有結合性で固定されたＧＬＤデンドリマーの抗菌活性を試験した。
１．イオン固定
実施例１３で記載したように、固定を実施した。その後、支持体（１ｇ）を滅菌水２０ｍｌで５回洗浄し、乾燥する。細菌懸濁液（ミクロコッカス・リソデイクティカス）２ｍｌと接触させ、２４時間、得られた生成物を置く。インキュベーション期間後、上清１００μＬを除去し、ＬＢ寒天皿上でプレートし、２４時間、３７℃でインキュベートする。観察された（又は、観察されない）コロニー数は、使用された支持体の活性を示す。結果を下記の表に示す。
《表１１》
こうした結果は、ＧＬＤが支持体にイオン固定される場合には、ＧＬＤは抗菌活性も実現するということを示している。
イオン固定が永久に必要ではないので、共有結合的に固定されたＧＬＤの抗菌活性も試験された。
【００９６】
２．共有結合固定
実施例１４で示したように、固定を実施した。その後、２・１０６細菌を含む細菌懸濁液（ミクロコッカス・リソデイクティカス）２ｍｌと接触させ、２４時間、各々の材料０．５ｇを置く。インキュベーション期間後、上清２５μＬを除去し、ＬＢ培地７５μＬ上に置く。この混合物をＬＢ寒天皿上でプレートし、３７℃でインキュベートする。インキュベーション９６時間後、読取りは下記の結果を示す。
《表１２》
結果は、支持体に共有結合的に固定されたＧＬＤが１％以上の濃度で優れた抗菌活性を保持していることを示す。補足研究をさらに細かい粉砕及び新しい樹脂で実施しなければならない。
【００９７】
《実施例１９：シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対するＧＬＤ活性》
Ａ：均一相中における
１、１０及び１００ｍｇ／ＬであるＰ２及びＰ３溶液と接触させ、１０，０００細菌／ｍｌであるシュードモナス・アエルギノーザの懸濁液を置いた。６、２４及び９６時間で、セトリマイド（ｃｅｔｒｉｍｉｄｅ）上で培養することにより、対照を実施した。
下記の表に示される結果は、Ｐ３溶液１００ｍｇ／Ｌによるシュードモナスの総阻害を示す。
《表１３》
【００９８】
Ｂ．支持された相中における
時間の変数のために、１０重量％Ｐ３を含む（前記と同様に合成された）ヘキサメチレン−ジイソシアネート樹脂（Ｐ３Ｓ）にシュードモナス・アエルギノーザをさらした。６、２４及び９６時間で、セトリマイド上で培養することにより、対照を実施した。下記の表に示される結果は、１，０００シュードモナス／ｍｌの懸濁液上におけるこのタイプの支持体によるシュードモナスの総阻害を示す。
《表１４》
【００９９】
［実施例２０］
レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）上のＧＬＤ活性
Ａ．均一相中における
レジオネラ・ニューモフィラ１０，０００／ｍｌの懸濁液を１０及び１００ｍｇ／ＬであるＰ２及びＰ３溶液で接触し置いた。２４、９６及び１６８時間で、ＧＶＰＣ上で培養することにより、対照を実施した。
下記の表及び図１２で示された結果は、レジオネラ・ニューモフィラがＰ３よりもＰ２に感受性があることを示す。
《表１５》
ＰＣＲ対照を実施した。
簡潔には、１０、１００ｍｇ／ＬのデンドリマーＰ２及びＰ３との接触から９６時間後、細菌懸濁液５ｍｌを０．４５μｍポリカーボネート膜でろ過し、存在する細胞（従って、細胞残渣を除去している）を抽出する。細胞をフィルター上で回収し、それらのＤＮＡを熱ショック及び化学ショックにより抽出する。１ｍｌを、限外ろ過により精製し、ＰＣＲ増幅により定量化する。結果を下記の表に示す。
《表１６》
従って、ＰＣＲ分析を下記のことを示している。
Ｐ２又はＰ３の存在によって、９６時間の培地から対照に対して９０％を超える細菌又は７０〜８０％の細菌をそれぞれ除去することを可能にする。レジオネラ・ニューモフィラには、Ｐ２の活性はＰ３の活性よりも大きい。
細胞壁の穿孔及びそれらのＤＮＡの放出により、致死濃度のＰ２又はＰ３は細菌分解を引き起こす。
【０１００】
Ｂ．支持された相中における
２重量％Ｐ１を含むヘキサメチレン−ジイソシアネート樹脂（Ｐ１Ｓ）及び２０重量％Ｐ３を含むヘキサメチレン−ジイソシアネート樹脂（Ｐ３Ｓ）を前記のように得る。
第一試験
チューブ１：対照は、ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌにより構成される。
チューブ２：ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌ＋Ｐ３Ｓ０．１ｇ
結果を下記の表に示す。
《表１７》
【０１０１】
第２試験
チューブ１：対照は、ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌにより構成される。
チューブ２：対照樹脂：ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌ＋Ｐ１Ｓ０．１ｇ
チューブ３：ＰＢＳ９ｍｌ＋１０，０００レジオネラ・ニューモフィラを含むＰＢＳ１ｍｌ＋Ｐ３Ｓ０．１ｇ
《表１８》
ＰＣＲ対照を下記のように実施した。接触から９６時間後、樹脂はチューブの底に沈殿したままになっており、懸濁液５ｍｌを０．４５μｍポリカーボネート膜でろ過し、細胞を抽出する。これらを洗浄し、熱ショック及び化学ショックにより溶解する。ＤＮＡを精製し、ＰＣＲにより増幅し、カウントする。
こうした結果は、以下の、
ポリイソシアネート上のグラフト化デンドリマーＰ３の作用、
Ｐ３Ｓの効果よりも小さいと思われても、対照（Ｐ１Ｓ）の無視できない効果、
を証明する。
【０１０２】
《実施例２１：蛍光ＧＬＤの抗菌活性》
実施例１８で記載された実験は、実施例１１ＢのＧＬＤＰ２を使用し繰り返され、蛍光ＧＬＤの抗菌活性が非蛍光ＧＬＤの抗菌活性と同じであることを示している。
従って、ＧＬＤの作用機構を研究するために、蛍光ＧＬＤを使用することができる。抗菌メカニズム、さらに循環系で観察する薬物送達についてのメカニズムもまた、特異抗体を有するＧＬＤによる標的の蛍光標識は、作用機構を意味する。
【０１０３】
《実施例２２：抗体の生産及び特性へのＧＬＤの利点》
ヒスタミン免疫結合体誘導体を２つの担体で調製した：Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅ，Ｏ．らにより記載された方法によるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び第３世代ＧＬＤ（以下の式参照）。
【化３】
（「ＢＳＡ ｏｕ ＤＧＬ ｏｕ ｐｌａｑｕｅ ｃｏｖａｌｉｎｋ」は、「ＢＳＡ又はＤＧＬ又はコバリンクプレート」を示す）
ヒスタミン（ハプテンモデルを表す）と担体ＢＳＡ、ＧＬＤ及び共有結合プレートとの免疫結合体の構造。
１．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中において、ｐＨ８、ハプテン５ｍｇ、ＢＳＡ又はＧＬＤ２０ｍｇ、及び５％グルタルアルデヒド３００μｌでカップリングを実施し、３ＮＮａＢＨ４に還元する。下記のように、２匹ずつのウサギの３ロットを免疫した。
ロットＡ：Ｊ＝０でのフロイントの完全アジュバント中の免疫結合体−ＢＳＡ１５０μｇ、その後のＤ＝２１、Ｄ＝３６及びＤ＝５１でのフロイントの完全アジュバント中の結合体−ＤＧＬ１５０μｇ
ロットＢ：Ｄ＝０、Ｄ＝２１、Ｄ＝３６及びＤ＝５１でのフロイントの完全アジュバント中の結合体−ＧＬＤ１５０μｇ
ロットＣ：Ｄ＝０、Ｄ＝２１、Ｄ＝３６及びＤ＝５１でのフロイントの完全アジュバント中の天然ＧＬＤ３００μｇ。
以下の２つのＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｄ＝２１、Ｄ＝３６、Ｄ＝５１及びＤ＝６５で、ロットＡ、Ｂ、Ｃの血清を分析された。
（１）ＢＳＡ若しくはＧＬＤの免疫結合体（図１３及び図１５）又はＶａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅ，Ｏ．らにより記載された方法による遊離担体（３９）であらかじめ被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）によるＥＬＩＳＡアッセイ。この方法によって総抗体価（抗原又はハプテンに特異的、及び担体に特異的）ならびに抗担体抗体の比率を評価することを可能にする。
（２）（Ｃｌａｅｙｓ−Ｂｒｕｎｏらにより記載されたプロトコールによる（４０、４１））ハプテンであらかじめ被覆された共有結合プレート（ＮＵＮＣ）（図１４）上のＥＬＩＳＡアッセイ。この方法によって、特異的抗体のみの直接的な評価を可能にする。
【０１０４】
ロットＣ及びＢ（図１３）に関して、Ｄ６５（日数＝６５）での測定可能な抗体が無いことは、後者がハプテンにグラフトされる場合を含めて、第３世代ＧＬＤの免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｅａｌｔｈ）を証明する。同様に、天然ＧＬＤで被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐプレート上のＤ６５でのロットＡ及びＣに対するＥＬＩＳＡ応答が無いことは（図１３の白丸及びバツ）、抗ＧＬＤ抗体の欠如、ゆえにそれらは免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｅａｌｔｈ）を証明する。この結果は、任意の抗ハプテン抗体を示さないロットＢ（図１４の破線）に関する共有結合プレート上で証明される。
しかし、免疫原性担体（ＢＳＡ）による免疫システムの刺激後に、ＧＬＤが第２担体（ロットＡ）として使用される場合は、一方ではハプテン−特異抗体価の増加が起ること（図１４のＤ２１〜Ｄ３６参照）、他方ではＧＤＬ−ハプテンでの種々の免疫化後の抗−ＢＳＡ抗体（担体）の消滅（図１５）が起こることに注意されたい。
免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｅａｌｔｈ）であるが、ＧＬＤによって、初期免疫応答をトリガーとして使用される抗担体非特異的抗体の数を同時に減少することによりハプテン−特異的抗体価を増加することにより、全体として、こうした結果が証明される。
【０１０５】
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［３４］．Ｂｅｌｌｏ， Ｍ．Ｓ．， Ｒ． Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ， ａｎｄ Ｐ．Ｇ． Ｒｉｇｈｅｔｔｉ， Ｕｓｅ ｏｆ Ｔａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｏｌｕｔｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４．２６６：ｐ．７７３．
［３５］．Ｍｅｓ Ｅ． Ｐ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｉｌｕｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ： Ｐａｒｔ Ｂ：Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ，１９９９．３７：ｐ．５９３−６０３．
［３６］．Ｅｄｗａｒｄ Ｊ． Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｏｋｅｓ−ｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，１９７０．４７：ｐ． ２６１．
［３７］．Ｆｅｈｌｂａｕｍ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ ｉｍｕｎｉｔｙ．Ｓｅｐｔｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｌａｎｔ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４．２６９：ｐ．３３１５９−３３１６３．
［３８］．Ｈａｎｃｏｃｋ， Ｒ．Ｅ．，Ｔ．Ｆａｌｌａ，ａｎｄ Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９５．３７：ｐ．１３５−１７５．
［３９］．Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ−Ｔｒａｍｂｏｕｚｅ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｌ ａｎｄ Ｄ ｉｓｏｖａｌｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｒａｔｉｏ ｉｎ ｅｘｔｒａｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ｓａｍｐｌｅｓ： ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，２００２．１４：ｐ．５１９−５２６．
［４０］．Ｃｌａｅｙｓ−Ｂｒｕｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ． Ｐａｒｔ Ｉ：Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏａｔｅｄ−ｐｌａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００６．８０，（（２））：ｐ．１７６−１８５．
［４１］．Ｃｌａｅｙｓ−Ｂｒｕｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｐａｒｔ ＩＩ：Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ． Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００６．８０（（２），）：ｐ．１８６−１９
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
沈殿物状の疎水性ポリペプチドの製造のための活性化α−アミノ酸モノマーの使用であって、前記ポリペプチドが水性溶媒中で前記活性化α−アミノ酸モノマーの重合から生じ、そして前記溶媒中において再溶解できるものである、前記使用。
【請求項２】
前記活性化α−アミノ酸が、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、α−アミノ酸Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、α−アミノ酸硫化カルボニル、α−アミノ酸無水炭酸、及びアミノチオ酸酸化剤から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
下記式（１）で表されるα−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）
【化１】
（式中、Ｒは天然又は修飾α−アミノ酸の側鎖を示す）
の、請求項１又２に記載の使用。
【請求項４】
水性溶媒中におけるポリリジンの製造のためのＬ−リジン−ＮＣＡモノマーの、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１つの第一級又は第二級アミン基を含むプライマーから、グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーを製造する方法であって、
Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマー、並びに、場合により１種以上の他のα−アミノ酸ＮＣＡモノマー（特には、Ｌ−オルニチン−ＮＣＡ、Ｌ−グルタミン酸−ＮＣＡ及びそのγ−アミド、Ｌ−アスパラギン酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−ジアミノ−２．４−酪酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−チロシン−ＮＣＡ、Ｌ−セリン−ＮＣＡ、Ｌ−トレオニン−ＮＣＡ、Ｌ−フェニルアラニン−ＮＣＡ、Ｌ−バリン−ＮＣＡ、Ｌ−ロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−イソロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−アラニン−ＮＣＡ、並びにグリシン−ＮＣＡを含むリストから選択される）の水性溶媒中での前記プライマーへの添加工程を含む、前記製造方法。
【請求項６】
前記モノマーがＬ−リジン−ＮＣＡのみである、請求項５に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項７】
前記Ｌ−リジン−ＮＣＡが、特には、
【化２】
から選択される基によってＮε保護された請求項５又は６に記載の、グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項８】
前記プライマーが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、ホモポリリジン、ポリ（エチレングリコール）−α、ω−ジアミン、ヘテロポリリジン、ヘテロペプチド又はホモペプチドから選択される、請求項６又は７に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項９】
前記溶媒のｐＨが３〜９である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１０】
グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法であって、前記ポリリジンデンドリマーが第１世代であり、
沈殿物状の第１世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、Ｎε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡをプライマーに添加する工程、
第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程において得られた第１世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程
を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第１世代であり、プライマーがＮε保護されているか、又は保護されていないＬ−リジンである、請求項１０に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１２】
前記グラフト化ヘテロポリリジンデンドリマーが第１世代であり、前記プライマーがポリ（エチレングリコール）−α，ω−ジアミンであり、その分子量が特に約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ、好ましくは約１，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のグラフト化ヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１３】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第１世代であり、
第１世代の保護されたポリリジンデンドリマーの沈殿物を得るため、プライマーの添加がないか、又はＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジンプライマーを含む、約６〜約８のｐＨの水溶液に、ＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程、及び
分子量約１，４００Ｄａ、特に１，４５０Ｄａであり、約１．２の多分散性インデックスを有し、そしてリジンの８ユニットの平均重合度に相当する、直鎖の第１世代のポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程で得られたポリリジンポリマーを脱保護する工程、
を含む、請求項１０又は１１に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１４】
前記グラフト化ポリリジンデンドリマーが第ｎ世代（ｎは２〜１０の整数である）であり；
沈殿物状の第ｎ世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
保護された第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されたプライマーへの、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡの添加、及び前記ポリリジンの脱保護から得られたそれ自体であり、
前記第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーに関して示されたように得られたそれ自体であり、
ｎ＝２の場合、第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、請求項１０〜１３のいずれか一項で定義され、前記第１世代のポリリジンデンドリマーが第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーのコアを形成している前記工程；
第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、第ｎ世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程；
を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１５】
前記グラフト化ポリリジンデンドリマーが第ｎ世代であり、Ｌ−リジン−ＮＣＡがＴＦＡによりＮε保護され、前記第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーのコアがＬ−リジンの約８残基を含む直鎖のポリリジンから形成され、例えば、請求項１３の方法を実施することにより得ることができ、前記第ｎ世代のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの分岐度が約４０％〜約１００％である、請求項１４に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１６】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第２世代であり；
第１世代のポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第１世代のポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１３による方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第１世代のポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
第２世代の保護されたポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中において行われる、前記添加の工程；
約６，０００〜約１４，０００Ｄａ、特に約８，３５０Ｄａ、好ましくは約８，６００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約４０〜約６０、特に約４８、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程；
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１７】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第３世代であり；
第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１６に記載の方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
第３世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中において行われる、前記添加の工程；
約１５，０００〜約３０，０００Ｄａ、特に約２１，５００Ｄａ、好ましくは約２２，０００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約１００〜約１５０、特に約１２３、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第３世代グラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程で得られたポリリジンを脱保護する工程；
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１８】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第４世代であり；
第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１７に記載の方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
保護されている第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中で行われる、前記添加の工程；
約５０，０００〜約８０，０００Ｄａ、特に約６４，０００Ｄａ、好ましくは約６５，０００Ｄａ又は６５，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約３００〜約４５０、特に約３６５、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１９】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第５世代であり；
第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１８に記載の方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
第５世代の保護されているポリリジンデンドリマー（Ｐ５）を得るために、適切なｐＨの水性溶媒中で行われる、前記添加の工程；
約１４０，０００〜約２００，０００Ｄａ、特に約１６９，０００Ｄａ、好ましくは約１７２，０００Ｄａ又は１７２，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約９００〜約１１００、特に約９６３、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第５世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項２０】
前記プライマーがグラフト化デンドリマーに共有結合的に固定され、前記プライマーは測定可能なマーカー産物を含む、請求項５〜１９のいずれか一項に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項２１】
例えば、請求項６〜２０、特に請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施により得られるグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２２】
外部−ＮＨ２基が、単糖類、核酸、タンパク質、又はカルボキシル基、スルホン酸基及びリン酸官能基を有する基、エチレンポリオキサイド、及びヒドロ炭酸塩又はペルフルオロヒドロ炭酸塩鎖、アルデヒド又はそれらの前駆体、又はカルバモイル基又はクロロエチルニトロソ尿素基等のマスクされた反応官能基を含むリストから選択される基に、共有結合しているか又は非共有結合していることを特徴とする、請求項２１に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２３】
グラフト化ポリリジンデンドリマーが支持体に共有結合的に又は非共有結合的に、特に静電結合的に固定されていることを特徴とする、請求項２１又は２２に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２４】
グラフト化ポリリジンデンドリマーが、それと接触する免疫系に関して密かであることを特徴とし、そして有利には、免疫系が反応するハプテン又は抗原の担体として使用され、抗体を形成することを特徴とする、請求項２１又は２２に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２５】
抗原又はハプテンに対する抗体の生成を目的とする、抗原−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体又はハプテン−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体の製造のための、請求項２１又は２２に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーの使用。
【請求項２６】
例えば、請求項６〜２０のいずれか一項に記載の方法の実施により得られるグラフト化ポリリジンデンドリマーの組成物。
【請求項２７】
抗菌剤又は抗真菌剤としての、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーであって、但し、それは人体又は動物体の治療上の処置に使用されない、前記グラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２８】
有効成分として、少なくとも１つの請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーを、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする、医薬用組成物。
【請求項２９】
細菌感染若しくは真菌感染、又は癌の処置を目的とする薬剤の製造のための、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーの使用。
【請求項３０】
細菌感染が、特に、シュードモナス科、特にシュードモナス属；レジオネラ科、特にレジオネラ属；腸内細菌科、特にエシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、及びエルシニア属；ビブリオ科；パスツレラ科；アルカリゲネス科、特にボルデテラ属；ブルセラ科、特にブルセラ属；フランキセラ科、特にフランキセラ属；ナイセリア科；ミクロコッカス科、特にブドウ球菌属、連鎖球菌属、及びリステリア属；を含むリストから選択される科に属しているグラム陰性及びグラム陽性細菌による感染から選択される、請求項２９に記載の使用。
【請求項１】
沈殿物状の疎水性ポリペプチドの製造のための活性化α−アミノ酸モノマーの使用であって、前記ポリペプチドが水性溶媒中で前記活性化α−アミノ酸モノマーの重合から生じ、そして前記溶媒中において再溶解できるものである、前記使用。
【請求項２】
前記活性化α−アミノ酸が、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、α−アミノ酸Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、α−アミノ酸硫化カルボニル、α−アミノ酸無水炭酸、及びアミノチオ酸酸化剤から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
下記式（１）で表されるα−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）
【化１】
（式中、Ｒは天然又は修飾α−アミノ酸の側鎖を示す）
の、請求項１又２に記載の使用。
【請求項４】
水性溶媒中におけるポリリジンの製造のためのＬ−リジン−ＮＣＡモノマーの、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１つの第一級又は第二級アミン基を含むプライマーから、グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーを製造する方法であって、
Ｌ−リジン−ＮＣＡモノマー、並びに、場合により１種以上の他のα−アミノ酸ＮＣＡモノマー（特には、Ｌ−オルニチン−ＮＣＡ、Ｌ−グルタミン酸−ＮＣＡ及びそのγ−アミド、Ｌ−アスパラギン酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−ジアミノ−２．４−酪酸−ＮＣＡ及びそのβ−アミド、Ｌ−チロシン−ＮＣＡ、Ｌ−セリン−ＮＣＡ、Ｌ−トレオニン−ＮＣＡ、Ｌ−フェニルアラニン−ＮＣＡ、Ｌ−バリン−ＮＣＡ、Ｌ−ロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−イソロイシン−ＮＣＡ、Ｌ−アラニン−ＮＣＡ、並びにグリシン−ＮＣＡを含むリストから選択される）の水性溶媒中での前記プライマーへの添加工程を含む、前記製造方法。
【請求項６】
前記モノマーがＬ−リジン−ＮＣＡのみである、請求項５に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項７】
前記Ｌ−リジン−ＮＣＡが、特には、
【化２】
から選択される基によってＮε保護された請求項５又は６に記載の、グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項８】
前記プライマーが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、ホモポリリジン、ポリ（エチレングリコール）−α、ω−ジアミン、ヘテロポリリジン、ヘテロペプチド又はホモペプチドから選択される、請求項６又は７に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項９】
前記溶媒のｐＨが３〜９である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１０】
グラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法であって、前記ポリリジンデンドリマーが第１世代であり、
沈殿物状の第１世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、Ｎε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡをプライマーに添加する工程、
第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程において得られた第１世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程
を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第１世代であり、プライマーがＮε保護されているか、又は保護されていないＬ−リジンである、請求項１０に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１２】
前記グラフト化ヘテロポリリジンデンドリマーが第１世代であり、前記プライマーがポリ（エチレングリコール）−α，ω−ジアミンであり、その分子量が特に約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ、好ましくは約１，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のグラフト化ヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１３】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第１世代であり、
第１世代の保護されたポリリジンデンドリマーの沈殿物を得るため、プライマーの添加がないか、又はＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジンプライマーを含む、約６〜約８のｐＨの水溶液に、ＴＦＡ基によりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程、及び
分子量約１，４００Ｄａ、特に１，４５０Ｄａであり、約１．２の多分散性インデックスを有し、そしてリジンの８ユニットの平均重合度に相当する、直鎖の第１世代のポリリジンデンドリマーを得るため、前記工程で得られたポリリジンポリマーを脱保護する工程、
を含む、請求項１０又は１１に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１４】
前記グラフト化ポリリジンデンドリマーが第ｎ世代（ｎは２〜１０の整数である）であり；
沈殿物状の第ｎ世代の保護されたグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
保護された第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、前記第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、適切なｐＨの水性溶媒中で、第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されたプライマーへの、Ｎε保護Ｌ−リジン−ＮＣＡの添加、及び前記ポリリジンの脱保護から得られたそれ自体であり、
前記第ｎ−２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、第ｎ−１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーに関して示されたように得られたそれ自体であり、
ｎ＝２の場合、第１世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーは、請求項１０〜１３のいずれか一項で定義され、前記第１世代のポリリジンデンドリマーが第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーのコアを形成している前記工程；
第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るため、第ｎ世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを脱保護する工程；
を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１５】
前記グラフト化ポリリジンデンドリマーが第ｎ世代であり、Ｌ−リジン−ＮＣＡがＴＦＡによりＮε保護され、前記第ｎ世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーのコアがＬ−リジンの約８残基を含む直鎖のポリリジンから形成され、例えば、請求項１３の方法を実施することにより得ることができ、前記第ｎ世代のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの分岐度が約４０％〜約１００％である、請求項１４に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１６】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第２世代であり；
第１世代のポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第１世代のポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１３による方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第１世代のポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
第２世代の保護されたポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中において行われる、前記添加の工程；
約６，０００〜約１４，０００Ｄａ、特に約８，３５０Ｄａ、好ましくは約８，６００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約４０〜約６０、特に約４８、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程；
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１７】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第３世代であり；
第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１６に記載の方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
第３世代の保護されているグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中において行われる、前記添加の工程；
約１５，０００〜約３０，０００Ｄａ、特に約２１，５００Ｄａ、好ましくは約２２，０００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約１００〜約１５０、特に約１２３、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第３世代グラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程で得られたポリリジンを脱保護する工程；
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１８】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第４世代であり；
第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第３世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１７に記載の方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第２世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
保護されている第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、適切なｐＨの水性溶媒中で行われる、前記添加の工程；
約５０，０００〜約８０，０００Ｄａ、特に約６４，０００Ｄａ、好ましくは約６５，０００Ｄａ又は６５，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約３００〜約４５０、特に約３６５、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項１９】
前記グラフト化ホモポリリジンデンドリマーが第５世代であり；
第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーにより構成されるプライマーに、ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡを添加する工程であって、
前記第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーが、例えば、請求項１８に記載の方法を実施することにより得られ、
質量比（ＴＦＡによりＮε保護されたＬ−リジン−ＮＣＡ）／（第４世代のグラフト化ポリリジンデンドリマー）の比が約２．６〜約３．９、特には、約３であり、
第５世代の保護されているポリリジンデンドリマー（Ｐ５）を得るために、適切なｐＨの水性溶媒中で行われる、前記添加の工程；
約１４０，０００〜約２００，０００Ｄａ、特に約１６９，０００Ｄａ、好ましくは約１７２，０００Ｄａ又は１７２，３００Ｄａの平均分子量、約１．４の多分散性、及び約９００〜約１１００、特に約９６３、遊離の外部−ＮＨ２基を有する第５世代のグラフト化ポリリジンデンドリマーを得るために、前記工程において得られたポリリジンを脱保護する工程
を含む、請求項１４又は１５に記載のグラフト化ホモポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項２０】
前記プライマーがグラフト化デンドリマーに共有結合的に固定され、前記プライマーは測定可能なマーカー産物を含む、請求項５〜１９のいずれか一項に記載のグラフト化ホモ又はヘテロポリリジンデンドリマーの製造方法。
【請求項２１】
例えば、請求項６〜２０、特に請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施により得られるグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２２】
外部−ＮＨ２基が、単糖類、核酸、タンパク質、又はカルボキシル基、スルホン酸基及びリン酸官能基を有する基、エチレンポリオキサイド、及びヒドロ炭酸塩又はペルフルオロヒドロ炭酸塩鎖、アルデヒド又はそれらの前駆体、又はカルバモイル基又はクロロエチルニトロソ尿素基等のマスクされた反応官能基を含むリストから選択される基に、共有結合しているか又は非共有結合していることを特徴とする、請求項２１に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２３】
グラフト化ポリリジンデンドリマーが支持体に共有結合的に又は非共有結合的に、特に静電結合的に固定されていることを特徴とする、請求項２１又は２２に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２４】
グラフト化ポリリジンデンドリマーが、それと接触する免疫系に関して密かであることを特徴とし、そして有利には、免疫系が反応するハプテン又は抗原の担体として使用され、抗体を形成することを特徴とする、請求項２１又は２２に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２５】
抗原又はハプテンに対する抗体の生成を目的とする、抗原−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体又はハプテン−グラフト化ポリリジンデンドリマー複合体の製造のための、請求項２１又は２２に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーの使用。
【請求項２６】
例えば、請求項６〜２０のいずれか一項に記載の方法の実施により得られるグラフト化ポリリジンデンドリマーの組成物。
【請求項２７】
抗菌剤又は抗真菌剤としての、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーであって、但し、それは人体又は動物体の治療上の処置に使用されない、前記グラフト化ポリリジンデンドリマー。
【請求項２８】
有効成分として、少なくとも１つの請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーを、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする、医薬用組成物。
【請求項２９】
細菌感染若しくは真菌感染、又は癌の処置を目的とする薬剤の製造のための、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のグラフト化ポリリジンデンドリマーの使用。
【請求項３０】
細菌感染が、特に、シュードモナス科、特にシュードモナス属；レジオネラ科、特にレジオネラ属；腸内細菌科、特にエシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、及びエルシニア属；ビブリオ科；パスツレラ科；アルカリゲネス科、特にボルデテラ属；ブルセラ科、特にブルセラ属；フランキセラ科、特にフランキセラ属；ナイセリア科；ミクロコッカス科、特にブドウ球菌属、連鎖球菌属、及びリステリア属；を含むリストから選択される科に属しているグラム陰性及びグラム陽性細菌による感染から選択される、請求項２９に記載の使用。
【公表番号】特表２００８−５３９２９７（Ｐ２００８−５３９２９７Ａ）
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０８２６０（Ｐ２００８−５０８２６０）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００９５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１４５２８
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０５４０９２４７）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク (16)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０５４０９２５８）ユニヴェルシテ モンペリエ ドゥー (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ ＩＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００９５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１４５２８
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０５４０９２４７）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク (16)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０５４０９２５８）ユニヴェルシテ モンペリエ ドゥー (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ ＩＩ
【Ｆターム（参考）】
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