ケラチノサイト増殖因子アナログ
【課題】安定性の改良されたケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）のポリペプチドアナログを提供する。
【解決手段】ＫＧＦの特定アミノ酸配列において、アミノ酸残基の１以上の欠失または置換による電荷変化を含むＫＧＦのタンパク質の、親分子ＫＧＦよりも安定である、新規なポリペプチドアナログを提供する。さらに該アナログが発現されるよう宿主細胞を増殖させ、産生されたアナログを単離することを特徴とするアナログの製法も提供する。
【解決手段】ＫＧＦの特定アミノ酸配列において、アミノ酸残基の１以上の欠失または置換による電荷変化を含むＫＧＦのタンパク質の、親分子ＫＧＦよりも安定である、新規なポリペプチドアナログを提供する。さらに該アナログが発現されるよう宿主細胞を増殖させ、産生されたアナログを単離することを特徴とするアナログの製法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術および蛋白質エンジニアリングに関する。特に、組換えＤＮＡ方法は、非繊維芽細胞上皮細胞増殖の優れたマイトジェンであり、親ＫＧＦと比較して改良された安定性を有するケラチノサイト増殖因子（ＫＦＧ）のポリペプチドアナログを生成するのに適用される。
【背景技術】
【０００２】
組織の生成および再生の複雑なプロセスは、時々、軟組織増殖因子と呼ばれる多数のタンパク質因子によって仲介される。これらの分子は、一般に、１つの細胞型によって放出され、他の細胞型の増殖に影響するように作用する（Ｒｕｂｉｎら，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８０２−８０６）。いくつかの軟組織増殖因子は特定の細胞型によって分泌され、多細胞生物の発生における応答細胞の増殖、分化および／または成熟に影響する（Ｆｉｎｃｈら，（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：７５２−７５５）。発生する生物におけるその役割に加えて、いくつかの因子は、より成熟した系の継続した健康および維持において重要である。例えば、哺乳動物では、迅速な細胞代謝回転が起こる多くの系がある。かかる系は皮膚および胃腸管を含み、共に上皮細胞からなる。軟組織増殖因子の群には繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のタンパク質が含まれる。
【０００３】
現在、一次構造の中には、同族性を共有する８つの公知のＦＧＦファミリーメンバーがある：塩基性繊維芽細胞増殖因子、ｂＦＧＦ（Ａｂｒａｈａｍら（１９８６），ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２５２３−２５２８）；酸性繊維芽細胞増殖因子、ａＦＧＦ（Ｊａｙｅら（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：５４１−５４５；ｉｎｔ−２遺伝子産物、ｉｎｔ−２（Ｄｉｃｋｓｏｎ ＆ Ｐｅｔｅｓ（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ，３２６：８３３）；ｈｓｔ／ｋＦＧＦ（Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉら（１９８７），Ｃｅｌｌ，５０：７２９−７３７およびＹｏｓｈｉｄａら（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７３０５−７３０９）；ＦＧＦ−５（Ｚｈａｎら（１９８８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３４８７−３４９５；ＦＧＦ−６（Ｍａｒｉｃｓら（１９８９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：３３５−３４０）；ケラチノサイト増殖因子（Ｆｉｎｃｈら（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：７５２−７５５）およびヒサクトフィリン（Ｈａｂａｚｚｅｔｔｌら（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：８５５−８５８）。
【０００４】
タンパク質のＦＧＦファミリーの中では、ケラチノサイト増殖因子（「ＫＧＦ」）は、間葉組織に由来する非繊維芽細胞上皮（特にケラチノサイト）細胞増殖のユニークなエフェクターである。「天然ＫＧＦ」なる語は、配列番号２に示したアミノ酸配列によって示される天然のヒト（ｈＫＧＦ）または組換え（ｒＫＧＦ）ポリペプチド（シグナル配列を含むまたは含まない）あるいはその対立遺伝子変異体をいう（特に断りのない限り、本明細書に記載した分子に対するアミノ酸番号付けは、配列番号２のアミノ酸３２ないし１９４によって示されるごとく、天然分子の成熟形態（すなわち、シグナル配列を除いたもの）について示されたものに対応する）。
【０００５】
天然ＫＧＦは天然ヒト源（ｈＫＧＦ）から単離することができるか、組換えＤＮＡ技術によって生成される（Ｆｉｎｃｈら（１９８９），前掲；Ｒｕｂｉｎら（１９８９），前掲；Ｒｏｎら（１９９３），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（４）；２９８４−２９８８；およびＹａｎら（１９９１），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２７Ａ：４３７−４３８）。
【０００６】
天然ＫＧＦは、水性状態では比較的不安定であって、化学的および物理的分解を受けて、その結果、処理および貯蔵の間に生物学的活性を喪失することが知られている（Ｃｈｅｎら（１９９４），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：１５８２−１５８９）。また、天然ＫＧＦは上昇した温度では凝集しやすく、酸性条件下では不活性となる（Ｒｕｂｉｎら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８０２−８０６）。また、水性溶液中での凝集の結果、不活化タンパク質となる。かかる活性の喪失のため、天然ＫＧＦタンパク質の水性組成物を長期間貯蔵できず、あるいはタンパク質を長期間にわたって投与できないので、不利である。さらに、これは特に、医薬組成物を調製する場合に問題となる。何故ならば、凝集したタンパク質は免疫原性となることが知られているからである（Ｃｌｅｌａｎｄら（１９９２），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０：３０７−３７７； Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９８７），Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３６，８３８−８４５；およびＰｉｎｃｋａｒｄら（１９６７），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：３３１−３４０）。
【０００７】
組換えＤＮＡ技術は、種々のＦＧＦフアミリーのメンバーの配列を修飾するのに利用されてきた。例えば、ｂＦＧＦおよびａＦＧＦは、天然または負に荷電したアミノ酸と結合するヘパリンで重要な正に荷電した残基を欠失または置換することによって修飾されてきた。その結果、修飾された分子ではヘパリン結合活性が低下することが報告されている。従って、患者におけるヘパリンおよび／またはヘパリン様分子によって隔離される修飾された分子の量は低下し、それにより、より多くのＫＧＦがその標的受容体に到達するのでより有効であろうと教示されている（ＥＰ ０ ２９８ ７２３）。
【０００８】
天然ＫＧＦの特性の１つ以上を改良し、または変更するために、蛋白質エンジニアリングを使用できる。Ｒｏｎ ら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（４）：２９８４−２９８８は、Ｎ−末端から３、８、２７、３８または４９のアミノ酸が欠失された修飾ＫＧＦポリペプチドを報告した。３、８または２７のＮ−末端残基を失ったポリペプチドはヘパリン結合活性を保持していたが、他のものは保持していなかった。また、３および８の残基を失ったポリペプチドは十分活性であり、他方、２７残基を失ったポリペプチドの細胞分裂性は１０−２０分の１となり、３８または４９アミノ酸を欠くポリペプチドは細胞分裂性を有しなかったと報告された。修飾ＫＧＦポリペプチドの安定性は議論されておらず、報告されていない。
【０００９】
公開されたＰＣＴ出願９０／０８７７１（前掲）はキメラタンパク質の生産を報告しており、ここでは天然ＫＧＦの成熟形態の最初の４０のＮ−末端アミノ酸をａＦＧＦのＣ−末端部分（約１４０アミノ酸）と合わせた。該キメラは、ＫＧＦ様のケラチノサイトを標的とするが、ヘパリンに対する感受性（ＫＧＦではなくａＦＧＦの特性）を欠くと報告された。該キメラの安定性は議論されておらず、報告されていない。
【００１０】
かくして、先行文献は、天然ＫＧＦに対する有意に改良された安定性を有する修飾ＫＧＦ分子を報告していない。さらに、先行文献は、かかる望ましい特性を持つＫＧＦ分子を首尾よく生成するだろうとの予測を抱くに十分な教示または証拠を報告していない。
【００１１】
現在、その一次構造のみの知識に基づいて、タンパク質の特性を予測することは不可能である。例えば、ａＦＧＦの分裂促進活性はヘパリンの存在下で実質的に増加するが、ｂＦＧＦの分裂促進活性は、ヘパリンはｂＦＧＦに強固に結合するという事実があるにも拘わらず、ヘパリンの存在下で僅かに増加するにすぎない［（ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ（１９８９），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：５７５−６０６；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１３８−６１４２；およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｚｃおよびＣｈｅｎｇ（１９８６），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２８：４７５−４８５）；およびＰＣＴ９０／００４１８）。対照的に、ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞に取り込まれたチミジンはヘパリンが培地中にＦＧＦと共に含まれる場合には阻害される。
【００１２】
一般に、アミノ酸変化のタンパク質に対する生物学的活性効果についても、効果は、タンパク質の三次元構造を含めた多数の因子、および修飾がタンパク質の一次構造上のヘパリン結合領域または受容体結合領域に対するものであるかに依存して変化するであろう。天然ＫＧＦの三次元構造も一次構造上のヘパリン結合領域および受容体結合領域も公表されていないので、先行技術での知識では、通常に範疇分けされるタンパク質に対するアミノ酸修飾の効果に基づいて、アミノ酸修飾の天然ＫＧＦに対する効果を推論できない。
【００１３】
本発明の目的は、ＫＧＦのポリペプチドアナログおよび天然ＫＧＦと比較して高い安定性を示す（例えば、典型的なｐＨ、熱および／または他の貯蔵条件に付した場合）、かかるアナログをコードする核酸分子を提供することにある。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、ＫＧＦの新規な生物学的活性ポリペプチドアナログを提供する。本発明では、「ＫＧＦ」なる語は、天然ＫＧＦ、ならびに天然ＫＧＦの生物学的活性のいくつかまたはすべて、特に非繊維芽細胞上皮細胞増殖を保持する、天然ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同一のペプチド配列によって特徴付けられるタンパク質を含む。「天然ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同一のペプチド配列によって特徴付けられる」とは、配列番号２のＡｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３およびＴｈｒ１５４に対応する残基を有し、好ましくは、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド２０１ないし６８４にハイブリダイズできるＤＮＡ配列によってコードされるペプチド配列を意味する。
【００１５】
２つのアミノ酸配列の間の対応するアミノ酸部分は、２つの配列を整列させて、アミノ末端および／またはカルボキシル末端のシフトを含めて残基を最大限にマッチングし、要すればギャップを導入しおよび／または候補体にインサートとして存在する残基を欠失させることによって決定できる。データベースのサーチ、配列解析および操作は、よく知られルーチンに使用されている配列相同性／同一性スキャンニングアルゴリズムプログラムのうちの１つを用いて行える（例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５；２４４４−２４４８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０；ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：１４３５またはＤｅｖｅｕｘら（１９８４），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５）。
【００１６】
ハイブリダイゼーションにおいて、緊縮条件は、塩、温度、有機溶媒および典型的にはハイブリダイゼーション反応で制御される他のパラメーターのストリンジェントな組合せ条件である。例示的緊縮条件は、６２−６７℃での４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、続いて６２−６７℃での約１時間の０．１×ＳＳＣ中での洗浄である。別法として、例示的緊縮条件は、４０−４５℃での４５−５５％ホルムアミド、４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションである［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２），３８７ないし３８９頁参照］。
【００１７】
かくして、タンパク質は、天然ＫＧＦの断片、キメラまたはハイブリッド分子を含めた、アミノ酸の対立遺伝子変異または欠失、置換または挿入を含む。ＫＧＦの１つの例は、置換されたまたは欠失された配列番号２のＣｙｓ１およびＣｙｓ１５に対応する残基を有するタンパク質を含み、得られた分子は（１９９５年７月７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４８７，８２５に教示されるごとく）親分子に比較して改良された安定性を有する。特に開示された分子は、Ｃ（１，１５）Ｓ、アミノ酸位１および１５のシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；ΔＮ１５−ΔＮ２４，天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の１５ないし２４アミノ酸のいずれか１個の欠失を有するＫＧＦ；ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の３つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５のシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；ΔＮ３／Ｃ（１５）、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の３つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５におけるシステインの欠失を有するＫＧＦ；ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の８つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５におけるシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；ΔＮ８／Ｃ（１５）、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の８つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５におけるシステインの欠失を有するＫＧＦ；Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、アミノ酸位１、１５および４０におけるシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ、アミノ酸位１、１５および１０２おけるシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、アミノ酸位１、１５、１０２および１０６におけるシステインの代わりのセリンの置換を有するＫＧＦを含む。
【００１８】
ＫＧＦのもう１つの例は、（１９９４年１０月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３２３，４７３に教示されているごとく）天然ＫＧＦのＡｓｎ１１５−Ｈｉｓ１１６−Ｔｙｒ１１７−Ａｓｎ１１８−Ｔｈｒ１１９のループ形成領域内の少なくとも１個のアミノ酸に代えてより高いループ形成能を有する少なくとも１個のアミノ酸を置換することによって生じるタンパク質を含み、特に、Ｈ（１１６）Ｇ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１１６のヒスチジンに代えてのグリシンの置換を有するＫＧＦを含む。
【００１９】
なおさらなる例は、天然ＫＧＦの１２３−１３３の領域（配列番号２のアミノ酸１５４−１６４）内に１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するタンパク質を含む。
【００２０】
驚くべきことに、ＫＧＦ分子（すなわち、親分子）のより正に荷電した残基を欠失させ、または中性または負に荷電したペプチドで置き換えることによって（すなわち、中性または正に荷電した残基に代えて負に荷電した残基で置き換えるか、または正に荷電した残基に代えて中性残基で置き換えることによって）、得られたＫＧＦアナログは親分子と比較して改良された安定性を有することが判明した。好ましくは、本発明は、増大した安定性を有することに加え、天然ＫＧＦと比較して、十分な生物学的活性（すなわち、少なくとも実質的に同様の受容体結合または親和性）も呈するアナログに関する。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、ＫＧＦの種々の生物学的活性ポリペプチドアナログをコードする精製単離された核酸分子に関する。１つの具体例において、かかる核酸は生物学的に機能するプラスミドまたはウイルスベクターにクローン化されたＤＮＡ分子を含む。別の具体例において、次いで、核酸構築体を利用して、原核生物または真核生物宿主細胞を安定に形質転換できる。さらにもう１つの具体例において、本発明は、核酸分子で安定に形質転換された原核生物（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞を適当な栄養条件下で、ＫＧＦアナログの発現を行うように増殖させる方法に関する。発現に続き、得られた組換えポリペプチドを単離し精製できる。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、治療上有効量のＫＧＦアナログおよび医薬上許容される担体よりなる医薬組成物に関する。かかる組成物は、上皮細胞疾患および負傷に悩む患者を治療するのに有用である。
【００２３】
これに関し、もう１つの態様は、治療上有効量のＫＧＦアナログを患者に投与することによって上皮細胞の増殖を刺激する方法に関する。１つの具体例において、非繊維芽細胞上皮細胞は、その増殖が刺激される細胞である。かかる上皮細胞は種々の、付属器細胞、膵細胞、肝細胞、および呼吸系および胃腸管における粘膜上皮細胞を含む。
【００２４】
図面の簡単な記載
図１は、天然ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）を示す（天然ＫＧＦの成熟形態をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１ないし６８４によって示され、ＫＧＦの成熟形態は配列番号２のアミノ酸残基３２ないし１９４によって示される）。
【００２５】
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、各々、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【００２６】
図３は構築体ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００２７】
図４はプラスミドＫＧＦに含まれる構築体のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【００２８】
図５はプラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中に構築体を生じさせるためにプラスミドＫＧＦに含有させた構築体におけるＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（配列番号６のアミノ酸位４６ないし８５）の間のＤＮＡ配列を置換するのに用いる化学的に合成したＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃６ないしＯＬＩＧＯ＃１１；配列番号１２−１７）を示す。
【００２９】
図６は、ＫＧＦを構築するのに使用される化学的に合成されたＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃１２ないしＯＬＩＧＯ＃２４；配列番号１８−３０）を示す。
【００３０】
図７は、Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１４４のアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【００３１】
図８は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【００３２】
図９は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３５）およびアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【００３３】
図１０は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
【００３４】
図１１は、３７℃におけるインキュベーション時間の関数としての、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した可溶性タンパク質の量を示す。
【００３５】
図１２は、天然ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥについてのｐＨの関数としての推定された融解温度（Ｔｍ）を示す。
【００３６】
図１３は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００３７】
図１４は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００３８】
図１５は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００３９】
図１６は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００４０】
図１７は、ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３７位におけるアスパラギンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【００４１】
図１８は、ΔＮ２３／Ｋ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【００４２】
図１９は、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。
【００４３】
図２０は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにアラニンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【００４４】
図２１は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにロイシンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。
【００４５】
図２２は、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。
【００４６】
図２３は、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。
【００４７】
図２４は、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。
【００４８】
図２５は、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。
【００４９】
図２６は、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５２位におけるグルタミンの代りにグルタミン酸の置換およびアミノ酸位１５３におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド（配列番号５９）配列およびアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【００５０】
詳細な記載
本発明により、ＫＧＦの新規なアナログが提供される。ＫＧＦアナログは、ＫＧＦにおける１つ以上の特異的な、正の荷電した残基を欠失または置換することによって生成される。
【００５１】
ＫＧＦアナログは、他の特性のうちでも、種々の精製および／または貯蔵条件のうち少なくとも１つの条件の下で改良された安定性を有する。例えば、ＫＧＦアナログは、一般に、可溶性で、正しく折り畳まれたタンパク質のより大きい収率にて精製される。さらに、一旦物質が精製されたならば、それは、親分子の安定性と比較して、ｐＨ、温度等に対してより安定である。（１４４位のアルギニンに代えてＧｌｎおよびＧｌｕでの置換によって修飾された［各々、Ｒ（１４４）ＱおよびＲ（１４４）Ｅ］およびある場合には同様にＮ−末端が修飾された）後記実施例に記載するごとく、天然ＫＧＦに対して、（１）３７℃での貯蔵に際して半減期の３５ないし３７．２日の延長、（２）熱変性間にわたっての７．９ないし９．５％高い熱融解温度、および（３）一定範囲のｐＨ値にわたってのＴｍの増加が呈される。
【００５２】
理論に拘束されるつもりはないが、Ｒ（１４４）ＱおよびＲ（１４４）Ｅの安定性が増強された考えられる理由は、ヘパリンの不存在下では、電荷の排斥により本来不安定である、塩基性残基のクラスターの総電荷密度が低下したためであろう。後記する結果は、Ｘ−線結晶解析によって測定した結果、１４４位におけるアルギニン残基はｂＦＧＦにおけるヘパリン結合を仲介する塩基性残基のクラスター内またはその近くにあると報告されている（Ａｇｏら（１９９１），Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０：３６０−３６３；およびＥｒｉｋｓｓｏｎら（１９９３）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１２７４−１２８４）残基に対応するらしいことを示唆する。
【００５３】
天然ＫＧＦは４６個の荷電残基（正電荷を担うものが２７）を含有する。ＫＧＦアナログで得られた結果に鑑みると、天然ＫＧＦの一次配列とｂＦＧＦの一次配列との比較は、２７個の正に荷電した残基のうちいくつかが、ｂＦＧＦの三次構造で見い出されたクラスターと同様のクラスターを形成することを示唆する。タンパク質の三次元構造におけるかかる残基の位置に応じて、これらのクラスターとなった残基のうちの１以上と、負または中性電荷を担うアミノ酸との置換は、隣接する残基の静電的相互作用を改変し、増大した安定性を達成するのに有用であろう。
【００５４】
本明細書に特に記載する好ましいＲ（１４４）Ｑに加えて、他のアナログも本発明に包含される。本発明で使用する「ＫＧＦアナログ」または「ＫＧＦのポリペプチドアナログ」は、特に、アミノ酸残基１２３−１３３（配列番号２のアミノ酸１５４−１６４）を含めた、アミノ酸残基４１−１５４（配列番号２のアミノ酸７２−１８５）のうち１つ以上が欠失した、または正電荷が減少したタンパク質を得るために選択された中性残基または負に荷電した残基で置換された電荷−電荷ポリペプチドを意味する。修飾で好ましい残基は、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ｌｙｓ１２８、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３またはＴｈｒ１５４であり、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２またはＬｙｓ１５３がより好ましく、Ａｒｇ１４４が最も好ましい。置換のための好ましいアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびスレオニンを含み、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギンがより好ましく、アラニンが特に好ましい。
【００５５】
いずれの修飾も分子の三次構造における電荷の排斥を最小とするように考慮されるべきである。最も好ましくは、アナログは親分子と比較して増大した安定性を有する。明らかに、欠失または置換は多数とすべきでなく、２個の負に荷電した残基の間で電荷排斥が生じるように残基を近接させるべきでもない。
【００５６】
ＫＧＦアナログが生物学的に生じた場合、すなわち、固相合成の産物、天然産物のタンパク質分解もしくは酵素的誘導体化とは反対に細胞発現の産物である場合、かかるポリヌクレオチドをコードする核酸は、天然ヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドが異なるであろう。かかるヌクレオチドは発現させることができ、得られたポリペプチドは、当業者に公知の多数の組換え技術のうちのいずれか１つによって精製できる。
【００５７】
ＫＧＦアナログの全てまたは一部につきコードするＤＮＡ配列は、とりわけ、容易に発現されるベクターの構築を容易とするための、特定宿主細胞における発現に「好ましい」コドンの取り込み（例えば、「Ｅ．ｃｏｌｉ発現コドン」）；制限酵素によって切断されるための部位の提供；およびさらなる開始、終止および中間ヌクレオチド配列の提供（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における発現のための開始メチオニンアミノ酸残基として）を含み得る。
【００５８】
また、本発明は、ポリペプチドの発現の方法で使用する組換え分子またはベクターを提供する。かかるベクターは、天然に存在するものであれ合成したものであれ、ＤＮＡまたはＲＮＡからなるものとでき、天然の環状、線状、一本鎖または二本鎖であり得、また、天然な存在するものまたは種々の成分の集合とできる。
【００５９】
かかる発現ベクターの多くの例が知られている。ベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター等は天然源から得られるか、あるいは公知の手法によって合成できる。かかる場合、本発明で有用な発現ベクターは、ＫＧＦポリペプチドアナログをコードする挿入された核酸分子と機能的に関連する少なくとも１つの発現制御エレメントを含有する。この制御エレメントは、本発明の核酸分子からのポリペプチド発現の調節を担う。有用な制御エレメントは、例えば、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、フアージλからのオペレーターおよびプロモーター、解糖酵母プロモーター、酵母酸性ホスファターゼ遺伝子、酵母アルファ接合因子、およびアデノウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ポリオーマ、およびシミアンウイルスからのプロモーター、ならびに種々のレトロウイルスからのものを含む。しかしながら、原核生物または真核生物発現に適した多数の他のベクターおよび制御エレメントが当該分野で公知であり、本発明の実施に使用できる。
【００６０】
適当な原核生物クローニングベクターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＵＣおよびＦ−因子）を含み、好ましいプラスミドはｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ ６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ ６９５７６）およびｐＣＦＭ３１０２（後記実施例に記載）である。他の適当な発現ベクターも哺乳動物、昆虫、酵母、真菌および細菌発現のために当該分野で知られており、これらもこの目的で使用できる。これらのベクターの適当な宿主細胞へのトランスフェクションの結果、ＫＧＦアナログポリペプチドが発現される。
【００６１】
本発明で有用な宿主微生物は原核生物または真核生物であってよい。適当な原核生物宿主は、種々のＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＦＭ５、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株を含み、Ｅ．ｃｏｌｉが好ましい。適当な真核生物宿主細胞は酵母および他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、およびＣＯＳのごとき動物細胞（例えば、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７）およびＣＶ−１サル細胞系、Ｓｗｉｓｓ由来の３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨ細胞、ＨｅＬａおよびＬ−９２９マウス細胞、およびＣＨＯ、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞を含む。使用する宿主に応じて、それにより産生される組換えポリペプチドは哺乳動物または他の真核生物炭水化物でグリコシレートされ、あるいはグリコシレートされない。
【００６２】
好ましい産生方法は、多くの因子および考慮に応じて変化し、所与の状況に対する最適産生手法は最小の実験にも拘わらず当業者に明らかであろう。次いで、得られた発現産物は当該分野で公知の手法を用いてほとんど均質に精製できる。原核生物細胞産生での典型的な精製手法は、圧力または他の手段による細胞壁の破壊、細胞夾雑物を除去するための遠心または濾過、続いての上清または濾液のイオン交換クロマトグラフィーおよび最後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。もしアナログが不溶性形態で発現されたならば、もう１つの精製技術は、アナログを含有する封入体の可溶化、続くイオン交換クロマトグラフィー、次いでのタンパク質の再折り畳み、および最後の疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。例示的精製技術は、１９９４年１０月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３２３，３３９に教示されている。一般に、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３２３，３３９は、（ａ）ＫＧＦからなる溶液を得て、（ｂ）（ａ）の該溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合させ；（ｃ）カチオン交換樹脂からの溶出物中のＫＧＦを溶出させ；（ｄ）（ｃ）からの溶出物溶液を適当な分子量排除マトリックスを通過させるか、（ｃ）の溶出物溶液についての疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い；次いで、（ｅ）分子量排除マトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーからＫＧＦを回収することよりなるケラチノサイト増殖因子を精製する方法を教示する。
【００６３】
勿論、当該アナログを迅速にスクリーニングして、その物理的特性を評価することができる。アナログをテストするのに使用する特異的アッセイは重要ではないが、実施例は種々のよく知られた安定性アッセイを記載する。さらに、生物学的活性のレベル（例えば、受容体結合および／またはアフィニティー、分裂促進、細胞増殖および／またはイン・ビトロ活性）も種々のアッセイを用いてテストすることができ、そのうちいくつかを実施例に記載する。多数のアッセイがよく知られており、それを用いて、ＫＧＦアナログを迅速にスクリーニングし、それらが許容される生物学的活性を有するか否かを決定できる。１つのかかるアッセイは、１２５Ｉ−ＫＧＦ結合と競合することによって、ＫＧＦ受容体（ＫＧＦＲ）に結合する能力についてＫＧＦアナログを特異的にテストする（Ｂｏｔｔａｒｏら（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７６７−１２７７０；Ｒｏｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８）。ＫＧＦＲ／ＫＧＦアナログ相互作用をアッセイするための別の方法は、リアルタイム生物特異的相互作用分析（ＢＩＡ）のごとき技術の使用を含む（Ｆｅｌｄｅｒら（１９９３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：１４４９−１４５５）。加えて、分裂促進アッセイを利用して、ＤＮＡ合成を刺激するＫＧＦアナログの能力をテストすることができる（Ｒｕｂｉｎら（１９８９），前掲）。最後に、細胞増殖アッセイを利用して、細胞増殖を刺激するＫＧＦアナログの能力をテストすることができる（Ｆａｌｃｏら（１９８８），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：５７３−５７８）。前記したアッセイ系のいずれかを用いて、ＫＧＦアナログを、その生物学的活性について迅速にスクリーニングできる。
【００６４】
ＫＧＦアナログは、通常はペプチドの一部ではなくさらなる化学部位を含有するようにさらに修飾できる。かかる誘導体化部位は、ＫＧＦアナログの溶解性、吸収、生物学的半減期等を改良できる。また、該物質はタンパク質等のいずれの望まない副作用も除去し、または軽減できる。かかる効果を仲介できる物質は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。共有結合修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子に導入できる（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３），ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，サンフランシスコ，７９−８６頁）。ポリエチレングリコール（「ＰＲＧ」）は、治療的タンパク質産物の調製で使用されてきた１つのかかる化学的物質である。いくつかのタンパク質については、ポリエチレングリコールの結合はタンパク質分解から保護することが示されており（Ｓａｄａら（１９９１），Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７１；１３７−１３９）、ある種のポリエチレングリコール部位を結合させる方法が利用できる。米国特許第４，１７９，３３７号、Ｄａｖｉｓら、「非免疫原性ポリペプチド」、１９７９年１２月１８日発行；および米国特許第４，００２，５３１号、Ｒｏｙｅｒ，「ポリエチレングリコールでの酵素の修飾およびそれにより産生された産物」、１９７７年１月１１日発行参照。レビューについては、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ（ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、３６７−３８３頁（１９９１））参照。ポリエチレングリコールについては、ポリエチレングリコール分子をタンパク質に付着させるために種々の手段が使用されてきた。一般に、ポリエチレングリコール分子は、タンパク質上の反応性基を介してタンパク質に結合される。リシン残基上またはＮ−末端のアミノ基のごときアミノ基はかかる結合に便利である。例えば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、前記）は、還元的アルキル化をポリエチレングリコール分子の酵素への結合に使用したと述べている。ＥＰ ０ ５３９ １６７は（１９９３年４月２８日公開、Ｗｒｉｇｈｔ、「ＰＥＧイミデートおよびそのタンパク質誘導体」）は、遊離アミノ基（類）を持つペプチドおよび有機化合物はＰＥＧのイミデート誘導体または関連する水溶性有機ポリマーで修飾されると述べている。米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗ、１９９０年１月２７日発行）は、反応性アミン基を介してのポリエチレングリコール分子の結合のためのタンパク質におけるリシン残基の数の修飾に関する。
【００６５】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、（ヒトのごとき）温血動物において病気を治療するために安全に非経口または経口投与される単一用量投与単位の医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は、凍結乾燥したまたは脱水した治療剤または診断剤の形態とすることができ、これは生理学上許容される溶媒の添加によって復元できる。該溶媒は、乾燥した組成物を溶解でき、選択された投与経路と適合し、かつ有効成分および使用する復元用安定化剤に負の影響を与えない滅菌水、生理食塩水溶液、グルコース溶液または他の水性炭水化物（例えば、マンニトール、キシロール、グリセロールのごときポリオール）のようないずれの媒体であってもよい。特別の具体例において、本発明は、単一用量投与単位を製造するためのキッ指向される。該キットは、乾燥したタンパク質を収容した第１の容器および復元用安定化剤を含む水性組成物を収容した第２の容器を共に含有する。溶液中のタンパク質の濃度、各容器に充填される溶液の容量、および容器のキャパシティ（目的投与量単位における有効成分の所望の濃度に応じて適当に修飾できる相互に関連したパラメーター）については、これらは当業者によく知られた広い範囲内で変化し得る。
【００６６】
本発明によるＫＧＦアナログは、治療剤および診断剤としておよび実験室試薬として有用であり得る。かくして、ＫＧＦアナログは、組織または器官試料中のＫＧＦの量を定量するのに、またＫＧＦＲを発現する細胞を測定および／または単離するのに、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボ診断アッセイで使用できる（Ｂｏｔｔａｒｏら（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１２７６７−１２７７０；Ｒｏｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８）。組織または器官のアッセイにおいては、ＫＧＦＲに結合する未標識天然ＫＧＦＲのため、１２５Ｉ−ＫＧＦアナログの標準化された結合曲線と比較して、ＫＧＦＲに結合する１２５Ｉ−ＫＧＦアナログからの放射能はより少ないであろう。同様に、１２５Ｉ−ＫＧＦアナログを用いて、種々の細胞型におけるＫＧＦＲの存在を検出できる。
【００６７】
また、本発明では、ペプチドに対して作製される抗体の生成におけるＫＧＦアナログの使用が考えられ、この抗体は天然ＫＧＦにも結合する。この具体例において、該抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであって、ＫＧＦアナログを用いて生成される。得られた抗体は、好ましくはそのタンパク質がその天然（生理学的活性）コンフォメーションにある場合に、天然ＫＧＦに優先的に結合する。これらの抗体はＫＧＦの検出または精製で使用できる。
【００６８】
さらに、本発明では、例えば、効果的なＫＧＦ送達の手段としてまたはＫＧＦ活性に対する阻害剤として、治療的適用を有する高親和性または低親和性ＫＧＦ結合分子の発見におけるＫＧＦアナログの使用が考えられる。ＫＧＦアナログの熱安定性は、生理学的条件（例えば、３７℃における）でかかる結合分子を同定するのに重要である。というのは、ＫＧＦに対するその親和性は高度に温度依存性であり得るし、４℃で観察される親和性からは予測できないかも知れないからである。
【００６９】
イン・ビボ使用では、ＫＧＦアナログは添加剤と共に処方され得る。かかる添加剤は緩衝液、担体、安定化剤、賦形剤、防腐剤、等張調節剤、抗酸化剤等（例えば、粘度調整剤または増量剤）を含む。特定の添加剤の選択は、貯蔵形態（例えば、液体または凍結乾燥したもの）およびＫＧＦアナログの投与様式に依存するであろう。当該分野で知られている適当な組成物は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ（最新版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＣＯｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見い出すことができる。
【００７０】
該ＫＧＦアナログは、損傷を有することによって特に特徴付けられる組織、または臨床的に不十分な数の非繊維芽細胞上皮細胞に治療上有効量にて投与できる。ＫＧＦはヘパリンに結合するので、細胞外環境において存在する、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリン様グリコサミノグリカンおよびヘパリン様グリコサミノグリカンはイン・ビボでＫＧＦに結合するようである。より多くのＫＧＦがその標的受容体に到達し、細胞外環境においてヘパリンおよびヘパリン−様化合物によって隔離されていないので、ヘパリン結合能力が低下したＫＧＦアナログは能力が増強されることになる。これらのアナログは、特別のＫＧＦアナログの治療に要する投与量がより低いので、治療的により有用であろう。
【００７１】
ＫＧＦアナログは、損傷を有することによって特に特徴付けられる組織、または臨床的に不十分な数の非繊維芽細胞上皮細胞に治療上有効量にて投与できる。ＫＧＦアナログが首尾よく投与できる領域は、限定されるものではないが、火傷および他の部分的および十分に厚みの負傷を持つ患者における毛嚢、汗腺および皮脂腺のごとき付属器構造の刺激、増殖および分化；表皮の下部皮膚への接着における欠点であり、その結果、ひどい病的状態を引き起こしかねないしばしば開いた水泡となる、表皮剥離によって引き起こされた病巣の加速された再上皮化；化学療法に誘導された脱毛症の予防、男性型禿頭または男性および女性における毛髪の進行的喪失の治療；胃および十二指腸潰瘍の治療；クローン病（一義的には小腸を患う）および潰瘍性結腸炎（一義的には大腸を患う）のごとき炎症性腸疾患の治療；細胞保護効果または再生またはその双方を誘導するための、治療（例えば、予備的治療および／または後治療）を介しての照射および化学療法的処置法における消化管毒の予防または低下；胃腸管全体の粘膜産生の刺激；未成熟幼児における硝子様膜病のごとき病気（すなわち、幼児呼吸困難症候群および気管支肺形成異常）の治療または予防を助け得る、ＩＩ型肺胞細胞の増殖および分化の誘導；吸入負傷（高酸素レベルを含む）、気腫、肺損傷化学療法剤の使用、換気器具外傷または他の肺損傷環境による、急性または慢性肺損傷または機能不全を伴う細気管支および／または歯槽上皮の増殖および分化の刺激；肝硬変、劇症肝不全、急性ウイルス肝炎および／または肝臓に対する毒性障害によって引き起こされる損傷を治療または予防するための肝機能の増加；例えば、角膜磨損の治療における角膜細胞再生の誘導；進行性歯肉病を治療するための上皮細胞再生の誘導；鼓膜損傷を治療するための鼓膜上皮細胞の再生の誘導ならびに糖尿病の開始の治療または予防を含み、または島細胞移植のセッティングにおける付属物としての使用を含む。
【００７２】
非繊維芽細胞上皮細胞の増殖が必要な患者には有効量のＫＧＦアナログを投与する。「有効量」とは、治療すべき患者において所望の応答を惹起するのに要するＫＧＦアナログの量であり、かくして、一般に、担当の医者によって決定される。投与するＫＧＦアナログの量に影響する因子は、患者の年齢および一般的状態、治療すべき病気等を含む。典型的な投与量は０．００１ｍｇ／ｋｇ体重ないし５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であろう。
【００７３】
ＫＧＦアナログは非経口（例えば、ＩＶ、ＩＴ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ経路）、経口または局所投与にて（ヒトのごとき）温血動物に安全に投与できる。ＫＧＦアナログは、患者の病気および状態に応じて、一回あるいは反復して投与できる。いくつかの場合では、ＫＧＦアナログは付属手段として他の療法に適用でき、また、他の医薬製剤と共に投与できる。
【００７４】
以下の実施例は本発明を十分に説明するために含める。発明の精神を逸脱することなく、これまでに記載した手法に修飾をなし得ることは理解されるであろう。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例に記載した手法、または適当な代替手法の多くについての標準的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｃｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓａｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）のごとき分子生物学の広く認識されたマニュアルで提供されている。
【００７６】
実施例１：ＫＧＦおよびＫＧＦアナログをコードするＤＮＡの作製
（天然ＫＧＦの配列を持つポリペプチドをコードする）全長ヒトＫＧＦ遺伝子のクローニングは、動物細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および化学的に合成した（Ｅ．ｃｏｌｉ最適化コドン）オリゴヌクレオチド（「ＯＬＩＧＯ」）のＰＣＲ双方によって行った。両手法を以下に記載する。
【００７７】
ポリペプチドを産生することが知られている細胞から単離したＲＮＡを用いるＰＣＲ増幅を行った。（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ニュージャージー州から入手した）ヒト繊維芽細胞系ＡＧ１５２３Ａを、チオシアン酸グアニジウムで破壊し、続いて、（Ｃｈｏｍｙｚｉｎｓｋｉら（１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：１５６の方法に従って）抽出した。全ＲＮＡについての標準的な逆転写酵素プロトコルを用い、ＫＧＦ ｃＤＮＡを生成させた。ＫＧＦ遺伝子のＰＣＲ（ＰＣＲ＃１）増幅は、鋳型としてＫＧＦ ｃＤＮＡを、およびＫＧＦ遺伝子の直ぐ５’および３’側のＤＮＡ配列をコードするプライマーＯＬＩＧＯ＃１およびＯＬＩＧＯ＃２を用いて行った［モデル９６００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）；２８サイクル；各サイクルは変性のために９４℃における１分、アニーリングのために６０℃における２分、および伸長のために７２℃における３分とする］。ＰＣＲ＃１産物の少量アリコートを、次いで、５０℃のアニーリング温度を除き前記したサイクル条件に同一である第２のＫＧＦ ＰＣＲ（ＰＣＲ＃２）用の鋳型として使用した。ＫＧＦ遺伝子の発現クローニングには、ネステッドＯＣＲプライマーを用いて、ＫＧＦ遺伝子の両末端に適当な制限部位を作った。ＯＬＩＧＯ＃３およびＯＬＩＧＯ＃４を用いて、ＰＣＲ＃２からのＫＧＦ ＤＮＡ産物を修飾し、各々、遺伝子の５’および３’末端にＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含ませた［ＰＣＲ＃３；３０サイクル；各サイクルは変性のために９４℃における１分、アニーリングのために６０℃における２分、および伸長のために７２℃における３分とする］。引き続いて、このＤＮＡをＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。次いで、それを再懸濁し、（Ｔ４リガーゼを用いて）「ＲＳＨ」シグナル配列を含有するｐＣＦＭ１１５６プラスミド（図２Ａ）に連絡させて、構築体ＲＳＨ−ＫＧＦを得た（図３）。
【００７８】
連結産物を（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７の方法に従って）Ｅ．ｃｏｌｉ下部ＦＭＳ（ＡＴＣＣ：５３９１１）に形質転換し、２８℃でＬＢ＋カナマイシンで平板培養した。いくつかの形質転換体を選択し、２０μｈ／ｍＬカナマイシンを含有する小さな液状培地中で増殖させた。ＲＳＨ−ＫＧＦプラスミドを各培養から単離し、ＤＮＡ配列を決定した。ＫＧＦ遺伝子における内部ＮｄｅＩ部位のため、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩのひとまとめにした制限部位を持つ所望の発現ベクターに天然遺伝子配列を直接クローニングすることは不可能であった。これは三方連結として達成された。プラスミドＲＳＨ−ＫＧＦをＢｓｍＩおよびＳｓｔＩの唯一の制限酵素で切断し、（ＫＧＦ遺伝子の３’末端を含有する）〜３ｋｂｐＤＮＡ断片を１％アガロースゲルを用いて電気泳動により単離した。ＰＣＲ（ＰＣＲ＃４）はＯＬＩＧＯ＃３の代わりにＯＬＩＧＯ＃５で置き換える以外は前記したごとくに行った。次いで、ＰＣＲ ＤＮＡ産物をＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで切断し、３１１ｂｐＤＮＡ断片を４％アガロースゲルを用いて電気泳動によって単離した。連結の第３片は、ＮｄｅＩおよびＳｓｔＩで切断したｐＣＲＭ１１５６の１．８ｋｂｐＤＮＡ断片であり、これは１％アガロースゲルにより電気泳動に従って単離した。前記したごとき連結（Ｔ４リカゼーゼ）、形質転換、カナマイシン選択およびＤＮＡ配列決定に続き、図４における構築体およびＫＧＦと命名したプラスミドを含有するクローンを拾った。裁断産物を生じた内部リボソーム結合部位のため、唯一のＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位間のＫＧＦ ＤＮＡ配列は化学的に合成したＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６ないしＯＬＩＧＯ＃１１）で置き換えて、内部開始部位の使用を最小化した（図５）。
【００７９】
【表１】
【００８０】
該ＯＬＩＧＯ類をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次いで、熱変性した。次いで、一本鎖（ｓｓ）ＯＬＩＧＯを放置して、温度をゆっくりと室温まで降下させることによってｄｓＤＮＡ断片を形成させた。次いで、Ｔ４リガーゼを用いて、内部ＯＬＩＧＯ付着末端および全ｄｓＯＬＩＧＯ断片をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで切断したＫＧＦプラスミドに共有結合連結させた。新しいプラスミドをＫＧＦ（ｄｓｄ）と命名した。
【００８１】
完全にＥ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたＫＧＦ遺伝子を、化学的に合成されたＯＬＩＧＯ＃１２ないし２４のＰＣＲ増幅によって構築した。
【００８２】
ＯＬＩＧＯ＃１２ないし２４を、天然ＫＧＦをコードする全ＤＮＡ配列が「Ｗａｔｓｏｎ」または「Ｃｒｉｃｋ」鎖のいずれかに由来のＯＬＩＧＯによって表され、ＰＣＲ増幅に際して、所望の二本鎖ＤＮＡ配列を生じるように設計した（図６）［ＰＣＲ＃５、モデル９６００サーモサイクラー、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ；２１サイクル、各サイクルは変性のために９４℃における３１秒、アニーリングのために５０℃における３１秒、および伸長のために７３℃における３１秒とする；２１サイクルに続き、ＰＣＲは７分の最終伸長工程で終了した］。ＰＣＲ増幅の後、ＤＮＡ断片をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、５２１ｂｐ断片を、同一酵素で切断した発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６に連結した。ＰＣＲ＃５は、連結のためにバンドエイドオリゴ（Ｊａｙａｒｍａｎら（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２：３９２）としてＯＬＩＧＯ＃２０ないしＯＬＩＧＯ＃２４を用い、外部プライマー（１００ピコモル／１００μｌ ｒｘｎ）ＯＬＩＧＯ＃１２およびＯＬＩＧＯ＃１３ならびにＯＬＩＧＯ＃１４ないしＯＬＩＧＯ＃１９の（Ｔ４リガーゼによる）連結によって誘導されるＫＧＦ鋳型の１μｌ／１００μｌｒｘｎ（ＯＬＩＧＯ＃１５ないしＯＬＩＧＯ＃１８はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した）を利用した。最終構築体はＫＧＦと命名した（最適化コドン）。
【００８３】
本明細書に記載するＫＧＦアナログのすべては、部分的には、ＫＧＦ（ｄｓｄ）またはＫＧＦ（最適化コドン）、または双方の組合せで見い出されるＤＮＡ配列からなる。該配列は、さらに、ＤＮＡ断片合成のための前記した技術の１つ以上を利用して作製された特定のＫＧＦアナログアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を適当な制限部位へ挿入することによって修飾（改変）される。いずれのアナログも、前記した技術によってその全体が生成できる。しかしながら、いずれかの遺伝子の一部的または全体的なＥ．ｃｏｌｉ最適化コドンの存在は、調べると、培養した細菌細胞から得られ得るタンパク質の収率を有意には増加させなかったが、一般的ＯＬＩＧＯ設計の一部として、適当な場合には最適化Ｅ．ｃｏｌｉコドンを使用した。図７ないし１０および１７ないし２６は、便宜な例によって、特定のＫＧＦアナログヌクレオチドおよびアミノ酸配列構築を記載する：Ｒ（１４４）Ｑ（図７）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ（図８）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ（図９）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ（図１０）；ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ（図１７）；ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅ（図１８）；ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ（図１９）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ（図２０）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ（図２１）；ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ（図２２）；ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ（図２３）：ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ（図２４）；ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ（図２５）；およびΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ（図２６）。本明細書に記載するすべてのＫＧＦアナログ構築は確認されたＤＮＡ配列であった。
【００８４】
実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生
３つの異なる発現プラスミドをＫＧＦアナログ遺伝子のクローニングで利用した。発現プラスミドは、ｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ＃６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）、およびｐＣＦＭ３１０２（各々、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。プラスミドｐ３１０２は、ＰＣＲ重複オリゴ突然変異誘発で一連の部位特異的塩基変化を作製することによってプラスミドｐＣＦＭ１６５６から得ることができる。プラスミド複製プロモーターＰｃｏｐＢの直ぐ５’側のＢｇＩＩＩ部位（ｐＣＦＭ１６５６プラスミドｂｐ＃１８０）で出発し、プラスミド複製遺伝子に向けて進行し、塩基対変化は以下の通りである。
【００８５】
【表２】
【００８６】
前記から分かるように、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２は相互に非常に似ており、多くの同一制限部位を含有する。プラスミドは便利さによって選択し、ベクターＤＮＡ成分は新しい構築体の目的で容易に交換できる。すべてのクローニングで使用した宿主はＥ．ｃｏｌｉ菌株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）であり、形質転換は、製造業者に指示に従い、（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）、前掲、に従って）またはＧｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＴＭトランスフェクション装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）での電気溶出によって行った。
【００８７】
最初に、適当な菌株の凍結グリセロールストック０．１ｍＬを、Ｌｕｒｉａブロス５００ｍＬを含有する２Ｌフラスコに入れることによって、３つのｐＣＦＭベクターのうちの１つの上に所望の構築体を有する所望の組換えＥ．ｃｏｌｉの小さくて新しく培養したばかりの接種物を開始した。培養を３０℃で１６時間振盪し、しかる後、培養を、滅菌したバッチ培地（Ｔｓａｉら（１９８７），Ｊ． Ｉｎｄｕｓｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：１８１−１８７）８Ｌを含有する１５Ｌファーメンターに移した。
【００８８】
フィードバッチ発酵はフィード＃１培地の供給で開始する（Ｔｓａｉら（１９８７）、前掲）。ＯＤ６００が３５に到達したら、培養温度を２時間で３７℃、次いで４２℃まで急速に上昇させて、Ｃ１リプレッサーを変性することによって、所望のＫＧＦアナログの発現を誘導した。フィード１の添加はフィード２の都合により断続し、その添加速度は３００ｍＬ／時間で開始した。フィード２は１７５ｇ／Ｌのトリプチカーゼ−ペプトン、８７．５ｇ／Ｌの酵母エキス、および２６０ｇ／Ｌのグルコースからなるものであった。４２℃での１時間後、培養温度を３６℃まで低下させ、次いで、この温度をさらに６時間持続させた。
【００８９】
次いで、発酵を停止し、遠心によって細胞を１Ｌ遠心ボトル内に入れたプラスチック製バッグに収穫した。４００ｒｐｍで６０分間遠心することによって細胞をペレット化し、しかる後、上清を除去し、細胞ペーストを−９０℃で凍結した。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける、種々のＫＧＦアナログの発現に続き、天然ＫＧＦ、Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびΔＮ２３／Ｅ（１４４）Ｑタンパク質を以下の手法を用いて精製した。高細胞密度発酵からの細胞ペーストを、４℃にて、適当な高剪断ミキサーを用い、１０−２０％溶液（ｗ／ｖ）としての０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５に懸濁した。次いで、懸濁した細胞を、ホモゲナイザー（ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ９）に溶液を３回通すことによって溶解させた。適当な熱交換器を用いることによって、流出するホモジネートを４−８℃まで冷却した。次いで、４２００ｒｐｍで、４℃にて、３９−６０分間、ＪＳ ４．２ローターを備えたＪ−６ＢＴＭ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）中で溶解物を遠心することによって夾雑物を除去した。次いで、上清を注意深くデカントし、４℃で０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗＴＭ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の先に調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムに充填した。次に、該カラムを４℃にて、５倍カラム容量の（２２５０ｍＬ）の０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５で洗浄した。５Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５でカラムを洗浄することによって所望にタンパク質を溶出させた。次いで、５０ｍＬずつの画分を収集し、溶出物のＡ２８０を連続的にモニターした。次いで、溶出した物質を含有するものとしてＡ２８０によって同定された画分を、１４％ゲルを通すＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、所望のポリペプチドの存在を確認した。
【００９１】
次いで、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、続いて、等容量の蒸留水を添加した。次いで、希釈した試料を、４℃にて、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの先に調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムに充填した。カラムを２２５０ｍＬの０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８で洗浄し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８から０．６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８の範囲の２０カラム容量の直線グラジエントを用いてタンパク質を溶出させた。再度、溶出物のＡ２８０を定常的にモニターしつつ、５０ｍＬずつの画分を収集した。次いで、（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して）タンパク質を含有する画分をプールし、続いて、３５０ｃｃの撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｍａｙｂｅｒｒｙ，ＭＡ）中、ＹＭ−１０膜（１００００分子量カットオフ）を通して３０−４０ｍＬ容量まで遠心した。
【００９２】
次いで、濃縮物を、１×ＰＢＳ（Dulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水、「Ｄ−ＰＢＳ」、無カルシウムおよびマグネシウム）または０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０からなるカラム緩衝液で平衡化したSuperdex−７５ＴＭ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の先に作製した１３００ｍＬ（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）カラムに充填した。試料がカラムに入った後、カラム緩衝液を用い、ゲル濾過マトリックスからタンパク質を溶出させた。しかる後、１０ｍＬずつの画分を回収し、（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して）アナログを含有するものをプールした。典型的には、タンパク質濃度は得られたプール中約５−１０ｍｇ／ｍＬであった。特に断りのない限り、前記手法の全ては４−８℃で行った。
【００９３】
分析
分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の天然ＫＧＦ；Ｒ（１４４）Ｑ；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑで行った。
【００９４】
コンフォメーション安定性
ポリペプチドを、その貯蔵安定性、熱変性転移温度（Ｔｍ）、および広範囲のｐＨ条件における安定性につき比較した。
【００９５】
高温での凝集を防ぐ、天然ＫＧＦ、Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの能力も調べた。０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する試料をＤ−ＰＢＳ中で調製した。各試料の０．５ｍＬのアリコットを３ｃｃの１型ガラス製バイアルに入れた。該バイアルを、ゴム製ストッパーで密封し、１３ｍｍのフリップ−オフアルミニウムシールをクリンプした。次いで、これらのバイアルを３７℃のインキュベーターに入れた。所定の時間間隔で、バイアルを取り出し、可溶性タンパク質の喪失につき分析した。０．２２μｍ Ｓｐｉｎ−Ｘフィルターユニット（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を通して、各試料２５０μＬを遠心することによって目に見える沈殿を除去した。濾過溶液中の可溶性タンパク質を引き続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。ＨＰＬＣピーク面積を積算し、結果を３７℃におけるインキュベーション時間の関数としてプロットすることによって、可溶性タンパク質の量を決定した。結果を図１１に示す。
【００９６】
次いで、可溶性のモノマータンパク質の喪失についての半減期を、これらのカイネティック曲線から見積もった。表１は、これらのタンパク質につき、３７℃での貯蔵に際して残存する可溶性ＫＧＦの半減期を示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
前記表１および図１１から分かるように、天然ＫＧＦは最も迅速に凝集し、半減期は０．６日であった。Ｒ（１４４）Ｑは半減期を４．１日まで増大させた。Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは、各々、可溶性半減期を１３．３、２２．３および３８日まで実質的に増加させた。
【００９９】
熱変性
熱変性は、ＰＴＣ−３４３ペティエ型温度制御系を備えたＪ−７２０ＴＭスペクトロポラリメーター（Ｊａｓｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）を用いて２３０ｎｍにて円二色性（ＣＤ）によってモニターした。ＣＤ分析については、分析すべき０．１ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含有する別の試料をＤ−ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で調製した。各試料につき、約２．５ｍＬを１００ｍｍ経路長の矩形ＳｕｐｒａｓｉｌＴＭ水晶（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｑｕａｒｔｚｓｃｈｍｅｌｚｅ，ＧｍｂＨ，Ｈａｎａｕ，ドイツ国）蛍光セル（Ｈｅｌｌａ Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｊａｍａｉｃａ，ＮＹ）に充填した。次いで、スペクトロポラリメーター中のペルティエ型温度制御系に入れた。加熱変性は５０℃／時間の速度で行った。楕円率の変化を２３０ｎｍでモニターして変性を示した。各試料のＴｍは、溶液中のタンパク質分子の５０％が変性される温度を確認することによって推定した（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，サンフランシスコ（１９８０）。３種のタンパク質の各々について推定したＴｍは表２にリストする。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
結果が示すように、Ｒ（１４４）Ｑは天然ＫＧＦと比較して、７℃より大きいＴｍ上昇を有する。Ｒ（１４４）ＱからＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱまたはΔＮ２３への置き換えは、少なくともさらに１℃のＴｍ上昇、かつ天然ＫＧＦと比較して８℃を超える上昇を与える。さらに、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは天然ＫＧＦよりも９℃を超えてより安定である。従って、アミノ酸１４４位における正に荷電した残基（Ａｒｇ）を中性または負に荷電した残基にスイッチすると、ポリペプチドを実質的に安定化させた。
【０１０２】
ｐＨ
濃塩酸またはＮａＯＨを添加することによりＤ−ＰＢＳを異なるｐＨ値に調整することによって、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの酸安定性を天然ＫＧＦのそれと比較した。異なるｐＨ値のＤ−ＰＢＳの２．３５ｍＬを、水晶セル中の２．４５ｍｇ／ｍＬ ＫＧＦタンパク質１００μｌと混合した。これらの試料を５０℃／時間の速度で熱変性させ、２３０ｎｍにおけるＣＤによってモニターした。図１２は、天然ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅにつき、ｐＨの関数としてのＴｍを示す。テストしたｐＨ範囲において、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは天然ＫＧＦよりも常に高いＴｍを有した。
【０１０３】
イン・ビトロ生物学的活性
（Ｒｕｂｉｎら（１９８９）、前掲の方法に従って）Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞による［３Ｈ］−チミジン摂取の測定によって、Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅのイン・ビトロ分裂促進活性を、タンパク質濃度および半最大濃度の関数として測定した。
【０１０４】
一般に、公知の標準的な天然ＫＧＦに対するＫＧＦアナログの各々の濃度は、イン・ビトロ生物学的アッセイを用いて測定した。次いで、各ＫＧＦアナログを希釈し、Ｂａｌｂ／ＭＫ分裂促進アッセイを用い、生物学的活性につきアッセイした。まず、試料を、５０％の使用者作製のイーグルＭＥＭ、５０％の使用者作製のＦ１２、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．０００５％のＨＳＡおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるバイオアッセイ培地中に希釈した。次いで、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞を接種したＦａｌｃｏｎ ｐｒｉｍｅｒｉａ９６穴プレートにＫＧＦ試料を添加した。ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、天然ＫＧＦ標準曲線との比較によって、入力天然ＫＧＦ濃度に変換した。結果を図１３ないし１６に示す。図１３ないし１６で分かるように、ＫＧＦアナログの各々は分裂促進活性を有する。
【０１０５】
本発明を一般的におよび好ましい具体例により記載したが、前記の記載に徴して他の変形および修飾が起こるのは当業者に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１−１】天然ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）を示す（天然ＫＧＦの成熟形態をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１ないし６８４によって示され、ＫＧＦの成熟形態は配列番号２のアミノ酸残基３２ないし１９４によって示される）。
【図１−２】天然ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）を示す（天然ＫＧＦの成熟形態をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１ないし６８４によって示され、ＫＧＦの成熟形態は配列番号２のアミノ酸残基３２ないし１９４によって示される）。
【図２−Ａ】ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【図２−Ｂ】ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【図２−Ｃ】ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【図３】構築体ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４】プラスミドＫＧＦに含まれる構築体のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５】プラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中に構築体を生じさせるためにプラスミドＫＧＦに含有させた構築体におけるＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（配列番号６のアミノ酸位４６ないし８５）の間のＤＮＡ配列を置換するのに用いる化学的に合成したＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃６ないしＯＬＩＧＯ＃１１；配列番号１２−１７）を示す。
【図６】ＫＧＦを構築するのに使用される化学的に合成されたＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃１２ないしＯＬＩＧＯ＃２４；配列番号１８−３０）を示す。
【図７】Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１４４のアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図８】Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図９】Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３５）およびアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【図１０】ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
【図１１】３７℃におけるインキュベーション時間の関数としての、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した可溶性タンパク質の量を示す。
【図１２】天然ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥについてのｐＨの関数としての推定された融解温度（Ｔｍ）を示す。
【図１３】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１４】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１５】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１６】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１７】ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３７位におけるアスパラギンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【図１８】ΔＮ２３／Ｋ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【図１９】ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。
【図２０】ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにアラニンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【図２１】ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにロイシンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す
【図２２】ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。
【図２３】ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。
【図２４】ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。
【図２５】ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。
【図２６】ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５２位におけるグルタミンの代りにグルタミン酸の置換およびアミノ酸位１５３におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド（配列番号５９）配列およびアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術および蛋白質エンジニアリングに関する。特に、組換えＤＮＡ方法は、非繊維芽細胞上皮細胞増殖の優れたマイトジェンであり、親ＫＧＦと比較して改良された安定性を有するケラチノサイト増殖因子（ＫＦＧ）のポリペプチドアナログを生成するのに適用される。
【背景技術】
【０００２】
組織の生成および再生の複雑なプロセスは、時々、軟組織増殖因子と呼ばれる多数のタンパク質因子によって仲介される。これらの分子は、一般に、１つの細胞型によって放出され、他の細胞型の増殖に影響するように作用する（Ｒｕｂｉｎら，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８０２−８０６）。いくつかの軟組織増殖因子は特定の細胞型によって分泌され、多細胞生物の発生における応答細胞の増殖、分化および／または成熟に影響する（Ｆｉｎｃｈら，（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：７５２−７５５）。発生する生物におけるその役割に加えて、いくつかの因子は、より成熟した系の継続した健康および維持において重要である。例えば、哺乳動物では、迅速な細胞代謝回転が起こる多くの系がある。かかる系は皮膚および胃腸管を含み、共に上皮細胞からなる。軟組織増殖因子の群には繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のタンパク質が含まれる。
【０００３】
現在、一次構造の中には、同族性を共有する８つの公知のＦＧＦファミリーメンバーがある：塩基性繊維芽細胞増殖因子、ｂＦＧＦ（Ａｂｒａｈａｍら（１９８６），ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２５２３−２５２８）；酸性繊維芽細胞増殖因子、ａＦＧＦ（Ｊａｙｅら（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：５４１−５４５；ｉｎｔ−２遺伝子産物、ｉｎｔ−２（Ｄｉｃｋｓｏｎ ＆ Ｐｅｔｅｓ（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ，３２６：８３３）；ｈｓｔ／ｋＦＧＦ（Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉら（１９８７），Ｃｅｌｌ，５０：７２９−７３７およびＹｏｓｈｉｄａら（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７３０５−７３０９）；ＦＧＦ−５（Ｚｈａｎら（１９８８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３４８７−３４９５；ＦＧＦ−６（Ｍａｒｉｃｓら（１９８９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：３３５−３４０）；ケラチノサイト増殖因子（Ｆｉｎｃｈら（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：７５２−７５５）およびヒサクトフィリン（Ｈａｂａｚｚｅｔｔｌら（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：８５５−８５８）。
【０００４】
タンパク質のＦＧＦファミリーの中では、ケラチノサイト増殖因子（「ＫＧＦ」）は、間葉組織に由来する非繊維芽細胞上皮（特にケラチノサイト）細胞増殖のユニークなエフェクターである。「天然ＫＧＦ」なる語は、配列番号２に示したアミノ酸配列によって示される天然のヒト（ｈＫＧＦ）または組換え（ｒＫＧＦ）ポリペプチド（シグナル配列を含むまたは含まない）あるいはその対立遺伝子変異体をいう（特に断りのない限り、本明細書に記載した分子に対するアミノ酸番号付けは、配列番号２のアミノ酸３２ないし１９４によって示されるごとく、天然分子の成熟形態（すなわち、シグナル配列を除いたもの）について示されたものに対応する）。
【０００５】
天然ＫＧＦは天然ヒト源（ｈＫＧＦ）から単離することができるか、組換えＤＮＡ技術によって生成される（Ｆｉｎｃｈら（１９８９），前掲；Ｒｕｂｉｎら（１９８９），前掲；Ｒｏｎら（１９９３），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（４）；２９８４−２９８８；およびＹａｎら（１９９１），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２７Ａ：４３７−４３８）。
【０００６】
天然ＫＧＦは、水性状態では比較的不安定であって、化学的および物理的分解を受けて、その結果、処理および貯蔵の間に生物学的活性を喪失することが知られている（Ｃｈｅｎら（１９９４），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：１５８２−１５８９）。また、天然ＫＧＦは上昇した温度では凝集しやすく、酸性条件下では不活性となる（Ｒｕｂｉｎら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８０２−８０６）。また、水性溶液中での凝集の結果、不活化タンパク質となる。かかる活性の喪失のため、天然ＫＧＦタンパク質の水性組成物を長期間貯蔵できず、あるいはタンパク質を長期間にわたって投与できないので、不利である。さらに、これは特に、医薬組成物を調製する場合に問題となる。何故ならば、凝集したタンパク質は免疫原性となることが知られているからである（Ｃｌｅｌａｎｄら（１９９２），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０：３０７−３７７； Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９８７），Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３６，８３８−８４５；およびＰｉｎｃｋａｒｄら（１９６７），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：３３１−３４０）。
【０００７】
組換えＤＮＡ技術は、種々のＦＧＦフアミリーのメンバーの配列を修飾するのに利用されてきた。例えば、ｂＦＧＦおよびａＦＧＦは、天然または負に荷電したアミノ酸と結合するヘパリンで重要な正に荷電した残基を欠失または置換することによって修飾されてきた。その結果、修飾された分子ではヘパリン結合活性が低下することが報告されている。従って、患者におけるヘパリンおよび／またはヘパリン様分子によって隔離される修飾された分子の量は低下し、それにより、より多くのＫＧＦがその標的受容体に到達するのでより有効であろうと教示されている（ＥＰ ０ ２９８ ７２３）。
【０００８】
天然ＫＧＦの特性の１つ以上を改良し、または変更するために、蛋白質エンジニアリングを使用できる。Ｒｏｎ ら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（４）：２９８４−２９８８は、Ｎ−末端から３、８、２７、３８または４９のアミノ酸が欠失された修飾ＫＧＦポリペプチドを報告した。３、８または２７のＮ−末端残基を失ったポリペプチドはヘパリン結合活性を保持していたが、他のものは保持していなかった。また、３および８の残基を失ったポリペプチドは十分活性であり、他方、２７残基を失ったポリペプチドの細胞分裂性は１０−２０分の１となり、３８または４９アミノ酸を欠くポリペプチドは細胞分裂性を有しなかったと報告された。修飾ＫＧＦポリペプチドの安定性は議論されておらず、報告されていない。
【０００９】
公開されたＰＣＴ出願９０／０８７７１（前掲）はキメラタンパク質の生産を報告しており、ここでは天然ＫＧＦの成熟形態の最初の４０のＮ−末端アミノ酸をａＦＧＦのＣ−末端部分（約１４０アミノ酸）と合わせた。該キメラは、ＫＧＦ様のケラチノサイトを標的とするが、ヘパリンに対する感受性（ＫＧＦではなくａＦＧＦの特性）を欠くと報告された。該キメラの安定性は議論されておらず、報告されていない。
【００１０】
かくして、先行文献は、天然ＫＧＦに対する有意に改良された安定性を有する修飾ＫＧＦ分子を報告していない。さらに、先行文献は、かかる望ましい特性を持つＫＧＦ分子を首尾よく生成するだろうとの予測を抱くに十分な教示または証拠を報告していない。
【００１１】
現在、その一次構造のみの知識に基づいて、タンパク質の特性を予測することは不可能である。例えば、ａＦＧＦの分裂促進活性はヘパリンの存在下で実質的に増加するが、ｂＦＧＦの分裂促進活性は、ヘパリンはｂＦＧＦに強固に結合するという事実があるにも拘わらず、ヘパリンの存在下で僅かに増加するにすぎない［（ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ（１９８９），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：５７５−６０６；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１３８−６１４２；およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｚｃおよびＣｈｅｎｇ（１９８６），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２８：４７５−４８５）；およびＰＣＴ９０／００４１８）。対照的に、ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞に取り込まれたチミジンはヘパリンが培地中にＦＧＦと共に含まれる場合には阻害される。
【００１２】
一般に、アミノ酸変化のタンパク質に対する生物学的活性効果についても、効果は、タンパク質の三次元構造を含めた多数の因子、および修飾がタンパク質の一次構造上のヘパリン結合領域または受容体結合領域に対するものであるかに依存して変化するであろう。天然ＫＧＦの三次元構造も一次構造上のヘパリン結合領域および受容体結合領域も公表されていないので、先行技術での知識では、通常に範疇分けされるタンパク質に対するアミノ酸修飾の効果に基づいて、アミノ酸修飾の天然ＫＧＦに対する効果を推論できない。
【００１３】
本発明の目的は、ＫＧＦのポリペプチドアナログおよび天然ＫＧＦと比較して高い安定性を示す（例えば、典型的なｐＨ、熱および／または他の貯蔵条件に付した場合）、かかるアナログをコードする核酸分子を提供することにある。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、ＫＧＦの新規な生物学的活性ポリペプチドアナログを提供する。本発明では、「ＫＧＦ」なる語は、天然ＫＧＦ、ならびに天然ＫＧＦの生物学的活性のいくつかまたはすべて、特に非繊維芽細胞上皮細胞増殖を保持する、天然ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同一のペプチド配列によって特徴付けられるタンパク質を含む。「天然ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同一のペプチド配列によって特徴付けられる」とは、配列番号２のＡｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３およびＴｈｒ１５４に対応する残基を有し、好ましくは、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド２０１ないし６８４にハイブリダイズできるＤＮＡ配列によってコードされるペプチド配列を意味する。
【００１５】
２つのアミノ酸配列の間の対応するアミノ酸部分は、２つの配列を整列させて、アミノ末端および／またはカルボキシル末端のシフトを含めて残基を最大限にマッチングし、要すればギャップを導入しおよび／または候補体にインサートとして存在する残基を欠失させることによって決定できる。データベースのサーチ、配列解析および操作は、よく知られルーチンに使用されている配列相同性／同一性スキャンニングアルゴリズムプログラムのうちの１つを用いて行える（例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５；２４４４−２４４８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０；ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：１４３５またはＤｅｖｅｕｘら（１９８４），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５）。
【００１６】
ハイブリダイゼーションにおいて、緊縮条件は、塩、温度、有機溶媒および典型的にはハイブリダイゼーション反応で制御される他のパラメーターのストリンジェントな組合せ条件である。例示的緊縮条件は、６２−６７℃での４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、続いて６２−６７℃での約１時間の０．１×ＳＳＣ中での洗浄である。別法として、例示的緊縮条件は、４０−４５℃での４５−５５％ホルムアミド、４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションである［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２），３８７ないし３８９頁参照］。
【００１７】
かくして、タンパク質は、天然ＫＧＦの断片、キメラまたはハイブリッド分子を含めた、アミノ酸の対立遺伝子変異または欠失、置換または挿入を含む。ＫＧＦの１つの例は、置換されたまたは欠失された配列番号２のＣｙｓ１およびＣｙｓ１５に対応する残基を有するタンパク質を含み、得られた分子は（１９９５年７月７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４８７，８２５に教示されるごとく）親分子に比較して改良された安定性を有する。特に開示された分子は、Ｃ（１，１５）Ｓ、アミノ酸位１および１５のシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；ΔＮ１５−ΔＮ２４，天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の１５ないし２４アミノ酸のいずれか１個の欠失を有するＫＧＦ；ΔＮ３／Ｃ（１５）Ｓ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の３つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５のシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；ΔＮ３／Ｃ（１５）、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の３つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５におけるシステインの欠失を有するＫＧＦ；ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の８つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５におけるシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；ΔＮ８／Ｃ（１５）、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の８つのアミノ酸の欠失およびアミノ酸位１５におけるシステインの欠失を有するＫＧＦ；Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、アミノ酸位１、１５および４０におけるシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；Ｃ（１，１５，１０２）Ｓ、アミノ酸位１、１５および１０２おけるシステインの代わりにセリンの置換を有するＫＧＦ；Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、アミノ酸位１、１５、１０２および１０６におけるシステインの代わりのセリンの置換を有するＫＧＦを含む。
【００１８】
ＫＧＦのもう１つの例は、（１９９４年１０月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３２３，４７３に教示されているごとく）天然ＫＧＦのＡｓｎ１１５−Ｈｉｓ１１６−Ｔｙｒ１１７−Ａｓｎ１１８−Ｔｈｒ１１９のループ形成領域内の少なくとも１個のアミノ酸に代えてより高いループ形成能を有する少なくとも１個のアミノ酸を置換することによって生じるタンパク質を含み、特に、Ｈ（１１６）Ｇ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１１６のヒスチジンに代えてのグリシンの置換を有するＫＧＦを含む。
【００１９】
なおさらなる例は、天然ＫＧＦの１２３−１３３の領域（配列番号２のアミノ酸１５４−１６４）内に１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するタンパク質を含む。
【００２０】
驚くべきことに、ＫＧＦ分子（すなわち、親分子）のより正に荷電した残基を欠失させ、または中性または負に荷電したペプチドで置き換えることによって（すなわち、中性または正に荷電した残基に代えて負に荷電した残基で置き換えるか、または正に荷電した残基に代えて中性残基で置き換えることによって）、得られたＫＧＦアナログは親分子と比較して改良された安定性を有することが判明した。好ましくは、本発明は、増大した安定性を有することに加え、天然ＫＧＦと比較して、十分な生物学的活性（すなわち、少なくとも実質的に同様の受容体結合または親和性）も呈するアナログに関する。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、ＫＧＦの種々の生物学的活性ポリペプチドアナログをコードする精製単離された核酸分子に関する。１つの具体例において、かかる核酸は生物学的に機能するプラスミドまたはウイルスベクターにクローン化されたＤＮＡ分子を含む。別の具体例において、次いで、核酸構築体を利用して、原核生物または真核生物宿主細胞を安定に形質転換できる。さらにもう１つの具体例において、本発明は、核酸分子で安定に形質転換された原核生物（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞を適当な栄養条件下で、ＫＧＦアナログの発現を行うように増殖させる方法に関する。発現に続き、得られた組換えポリペプチドを単離し精製できる。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、治療上有効量のＫＧＦアナログおよび医薬上許容される担体よりなる医薬組成物に関する。かかる組成物は、上皮細胞疾患および負傷に悩む患者を治療するのに有用である。
【００２３】
これに関し、もう１つの態様は、治療上有効量のＫＧＦアナログを患者に投与することによって上皮細胞の増殖を刺激する方法に関する。１つの具体例において、非繊維芽細胞上皮細胞は、その増殖が刺激される細胞である。かかる上皮細胞は種々の、付属器細胞、膵細胞、肝細胞、および呼吸系および胃腸管における粘膜上皮細胞を含む。
【００２４】
図面の簡単な記載
図１は、天然ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）を示す（天然ＫＧＦの成熟形態をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１ないし６８４によって示され、ＫＧＦの成熟形態は配列番号２のアミノ酸残基３２ないし１９４によって示される）。
【００２５】
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、各々、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【００２６】
図３は構築体ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００２７】
図４はプラスミドＫＧＦに含まれる構築体のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【００２８】
図５はプラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中に構築体を生じさせるためにプラスミドＫＧＦに含有させた構築体におけるＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（配列番号６のアミノ酸位４６ないし８５）の間のＤＮＡ配列を置換するのに用いる化学的に合成したＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃６ないしＯＬＩＧＯ＃１１；配列番号１２−１７）を示す。
【００２９】
図６は、ＫＧＦを構築するのに使用される化学的に合成されたＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃１２ないしＯＬＩＧＯ＃２４；配列番号１８−３０）を示す。
【００３０】
図７は、Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１４４のアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【００３１】
図８は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【００３２】
図９は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３５）およびアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【００３３】
図１０は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
【００３４】
図１１は、３７℃におけるインキュベーション時間の関数としての、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した可溶性タンパク質の量を示す。
【００３５】
図１２は、天然ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥについてのｐＨの関数としての推定された融解温度（Ｔｍ）を示す。
【００３６】
図１３は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００３７】
図１４は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００３８】
図１５は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００３９】
図１６は、ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【００４０】
図１７は、ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３７位におけるアスパラギンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【００４１】
図１８は、ΔＮ２３／Ｋ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【００４２】
図１９は、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。
【００４３】
図２０は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにアラニンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【００４４】
図２１は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにロイシンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。
【００４５】
図２２は、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。
【００４６】
図２３は、ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。
【００４７】
図２４は、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。
【００４８】
図２５は、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。
【００４９】
図２６は、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５２位におけるグルタミンの代りにグルタミン酸の置換およびアミノ酸位１５３におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド（配列番号５９）配列およびアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【００５０】
詳細な記載
本発明により、ＫＧＦの新規なアナログが提供される。ＫＧＦアナログは、ＫＧＦにおける１つ以上の特異的な、正の荷電した残基を欠失または置換することによって生成される。
【００５１】
ＫＧＦアナログは、他の特性のうちでも、種々の精製および／または貯蔵条件のうち少なくとも１つの条件の下で改良された安定性を有する。例えば、ＫＧＦアナログは、一般に、可溶性で、正しく折り畳まれたタンパク質のより大きい収率にて精製される。さらに、一旦物質が精製されたならば、それは、親分子の安定性と比較して、ｐＨ、温度等に対してより安定である。（１４４位のアルギニンに代えてＧｌｎおよびＧｌｕでの置換によって修飾された［各々、Ｒ（１４４）ＱおよびＲ（１４４）Ｅ］およびある場合には同様にＮ−末端が修飾された）後記実施例に記載するごとく、天然ＫＧＦに対して、（１）３７℃での貯蔵に際して半減期の３５ないし３７．２日の延長、（２）熱変性間にわたっての７．９ないし９．５％高い熱融解温度、および（３）一定範囲のｐＨ値にわたってのＴｍの増加が呈される。
【００５２】
理論に拘束されるつもりはないが、Ｒ（１４４）ＱおよびＲ（１４４）Ｅの安定性が増強された考えられる理由は、ヘパリンの不存在下では、電荷の排斥により本来不安定である、塩基性残基のクラスターの総電荷密度が低下したためであろう。後記する結果は、Ｘ−線結晶解析によって測定した結果、１４４位におけるアルギニン残基はｂＦＧＦにおけるヘパリン結合を仲介する塩基性残基のクラスター内またはその近くにあると報告されている（Ａｇｏら（１９９１），Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０：３６０−３６３；およびＥｒｉｋｓｓｏｎら（１９９３）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１２７４−１２８４）残基に対応するらしいことを示唆する。
【００５３】
天然ＫＧＦは４６個の荷電残基（正電荷を担うものが２７）を含有する。ＫＧＦアナログで得られた結果に鑑みると、天然ＫＧＦの一次配列とｂＦＧＦの一次配列との比較は、２７個の正に荷電した残基のうちいくつかが、ｂＦＧＦの三次構造で見い出されたクラスターと同様のクラスターを形成することを示唆する。タンパク質の三次元構造におけるかかる残基の位置に応じて、これらのクラスターとなった残基のうちの１以上と、負または中性電荷を担うアミノ酸との置換は、隣接する残基の静電的相互作用を改変し、増大した安定性を達成するのに有用であろう。
【００５４】
本明細書に特に記載する好ましいＲ（１４４）Ｑに加えて、他のアナログも本発明に包含される。本発明で使用する「ＫＧＦアナログ」または「ＫＧＦのポリペプチドアナログ」は、特に、アミノ酸残基１２３−１３３（配列番号２のアミノ酸１５４−１６４）を含めた、アミノ酸残基４１−１５４（配列番号２のアミノ酸７２−１８５）のうち１つ以上が欠失した、または正電荷が減少したタンパク質を得るために選択された中性残基または負に荷電した残基で置換された電荷−電荷ポリペプチドを意味する。修飾で好ましい残基は、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ｌｙｓ１２８、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３またはＴｈｒ１５４であり、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２またはＬｙｓ１５３がより好ましく、Ａｒｇ１４４が最も好ましい。置換のための好ましいアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびスレオニンを含み、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギンがより好ましく、アラニンが特に好ましい。
【００５５】
いずれの修飾も分子の三次構造における電荷の排斥を最小とするように考慮されるべきである。最も好ましくは、アナログは親分子と比較して増大した安定性を有する。明らかに、欠失または置換は多数とすべきでなく、２個の負に荷電した残基の間で電荷排斥が生じるように残基を近接させるべきでもない。
【００５６】
ＫＧＦアナログが生物学的に生じた場合、すなわち、固相合成の産物、天然産物のタンパク質分解もしくは酵素的誘導体化とは反対に細胞発現の産物である場合、かかるポリヌクレオチドをコードする核酸は、天然ヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドが異なるであろう。かかるヌクレオチドは発現させることができ、得られたポリペプチドは、当業者に公知の多数の組換え技術のうちのいずれか１つによって精製できる。
【００５７】
ＫＧＦアナログの全てまたは一部につきコードするＤＮＡ配列は、とりわけ、容易に発現されるベクターの構築を容易とするための、特定宿主細胞における発現に「好ましい」コドンの取り込み（例えば、「Ｅ．ｃｏｌｉ発現コドン」）；制限酵素によって切断されるための部位の提供；およびさらなる開始、終止および中間ヌクレオチド配列の提供（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における発現のための開始メチオニンアミノ酸残基として）を含み得る。
【００５８】
また、本発明は、ポリペプチドの発現の方法で使用する組換え分子またはベクターを提供する。かかるベクターは、天然に存在するものであれ合成したものであれ、ＤＮＡまたはＲＮＡからなるものとでき、天然の環状、線状、一本鎖または二本鎖であり得、また、天然な存在するものまたは種々の成分の集合とできる。
【００５９】
かかる発現ベクターの多くの例が知られている。ベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター等は天然源から得られるか、あるいは公知の手法によって合成できる。かかる場合、本発明で有用な発現ベクターは、ＫＧＦポリペプチドアナログをコードする挿入された核酸分子と機能的に関連する少なくとも１つの発現制御エレメントを含有する。この制御エレメントは、本発明の核酸分子からのポリペプチド発現の調節を担う。有用な制御エレメントは、例えば、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、フアージλからのオペレーターおよびプロモーター、解糖酵母プロモーター、酵母酸性ホスファターゼ遺伝子、酵母アルファ接合因子、およびアデノウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ポリオーマ、およびシミアンウイルスからのプロモーター、ならびに種々のレトロウイルスからのものを含む。しかしながら、原核生物または真核生物発現に適した多数の他のベクターおよび制御エレメントが当該分野で公知であり、本発明の実施に使用できる。
【００６０】
適当な原核生物クローニングベクターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＵＣおよびＦ−因子）を含み、好ましいプラスミドはｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ ６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ ６９５７６）およびｐＣＦＭ３１０２（後記実施例に記載）である。他の適当な発現ベクターも哺乳動物、昆虫、酵母、真菌および細菌発現のために当該分野で知られており、これらもこの目的で使用できる。これらのベクターの適当な宿主細胞へのトランスフェクションの結果、ＫＧＦアナログポリペプチドが発現される。
【００６１】
本発明で有用な宿主微生物は原核生物または真核生物であってよい。適当な原核生物宿主は、種々のＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＦＭ５、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株を含み、Ｅ．ｃｏｌｉが好ましい。適当な真核生物宿主細胞は酵母および他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、およびＣＯＳのごとき動物細胞（例えば、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７）およびＣＶ−１サル細胞系、Ｓｗｉｓｓ由来の３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨ細胞、ＨｅＬａおよびＬ−９２９マウス細胞、およびＣＨＯ、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞を含む。使用する宿主に応じて、それにより産生される組換えポリペプチドは哺乳動物または他の真核生物炭水化物でグリコシレートされ、あるいはグリコシレートされない。
【００６２】
好ましい産生方法は、多くの因子および考慮に応じて変化し、所与の状況に対する最適産生手法は最小の実験にも拘わらず当業者に明らかであろう。次いで、得られた発現産物は当該分野で公知の手法を用いてほとんど均質に精製できる。原核生物細胞産生での典型的な精製手法は、圧力または他の手段による細胞壁の破壊、細胞夾雑物を除去するための遠心または濾過、続いての上清または濾液のイオン交換クロマトグラフィーおよび最後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。もしアナログが不溶性形態で発現されたならば、もう１つの精製技術は、アナログを含有する封入体の可溶化、続くイオン交換クロマトグラフィー、次いでのタンパク質の再折り畳み、および最後の疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。例示的精製技術は、１９９４年１０月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３２３，３３９に教示されている。一般に、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３２３，３３９は、（ａ）ＫＧＦからなる溶液を得て、（ｂ）（ａ）の該溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合させ；（ｃ）カチオン交換樹脂からの溶出物中のＫＧＦを溶出させ；（ｄ）（ｃ）からの溶出物溶液を適当な分子量排除マトリックスを通過させるか、（ｃ）の溶出物溶液についての疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い；次いで、（ｅ）分子量排除マトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーからＫＧＦを回収することよりなるケラチノサイト増殖因子を精製する方法を教示する。
【００６３】
勿論、当該アナログを迅速にスクリーニングして、その物理的特性を評価することができる。アナログをテストするのに使用する特異的アッセイは重要ではないが、実施例は種々のよく知られた安定性アッセイを記載する。さらに、生物学的活性のレベル（例えば、受容体結合および／またはアフィニティー、分裂促進、細胞増殖および／またはイン・ビトロ活性）も種々のアッセイを用いてテストすることができ、そのうちいくつかを実施例に記載する。多数のアッセイがよく知られており、それを用いて、ＫＧＦアナログを迅速にスクリーニングし、それらが許容される生物学的活性を有するか否かを決定できる。１つのかかるアッセイは、１２５Ｉ−ＫＧＦ結合と競合することによって、ＫＧＦ受容体（ＫＧＦＲ）に結合する能力についてＫＧＦアナログを特異的にテストする（Ｂｏｔｔａｒｏら（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７６７−１２７７０；Ｒｏｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８）。ＫＧＦＲ／ＫＧＦアナログ相互作用をアッセイするための別の方法は、リアルタイム生物特異的相互作用分析（ＢＩＡ）のごとき技術の使用を含む（Ｆｅｌｄｅｒら（１９９３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：１４４９−１４５５）。加えて、分裂促進アッセイを利用して、ＤＮＡ合成を刺激するＫＧＦアナログの能力をテストすることができる（Ｒｕｂｉｎら（１９８９），前掲）。最後に、細胞増殖アッセイを利用して、細胞増殖を刺激するＫＧＦアナログの能力をテストすることができる（Ｆａｌｃｏら（１９８８），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：５７３−５７８）。前記したアッセイ系のいずれかを用いて、ＫＧＦアナログを、その生物学的活性について迅速にスクリーニングできる。
【００６４】
ＫＧＦアナログは、通常はペプチドの一部ではなくさらなる化学部位を含有するようにさらに修飾できる。かかる誘導体化部位は、ＫＧＦアナログの溶解性、吸収、生物学的半減期等を改良できる。また、該物質はタンパク質等のいずれの望まない副作用も除去し、または軽減できる。かかる効果を仲介できる物質は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。共有結合修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子に導入できる（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３），ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，サンフランシスコ，７９−８６頁）。ポリエチレングリコール（「ＰＲＧ」）は、治療的タンパク質産物の調製で使用されてきた１つのかかる化学的物質である。いくつかのタンパク質については、ポリエチレングリコールの結合はタンパク質分解から保護することが示されており（Ｓａｄａら（１９９１），Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７１；１３７−１３９）、ある種のポリエチレングリコール部位を結合させる方法が利用できる。米国特許第４，１７９，３３７号、Ｄａｖｉｓら、「非免疫原性ポリペプチド」、１９７９年１２月１８日発行；および米国特許第４，００２，５３１号、Ｒｏｙｅｒ，「ポリエチレングリコールでの酵素の修飾およびそれにより産生された産物」、１９７７年１月１１日発行参照。レビューについては、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ（ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、３６７−３８３頁（１９９１））参照。ポリエチレングリコールについては、ポリエチレングリコール分子をタンパク質に付着させるために種々の手段が使用されてきた。一般に、ポリエチレングリコール分子は、タンパク質上の反応性基を介してタンパク質に結合される。リシン残基上またはＮ−末端のアミノ基のごときアミノ基はかかる結合に便利である。例えば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、前記）は、還元的アルキル化をポリエチレングリコール分子の酵素への結合に使用したと述べている。ＥＰ ０ ５３９ １６７は（１９９３年４月２８日公開、Ｗｒｉｇｈｔ、「ＰＥＧイミデートおよびそのタンパク質誘導体」）は、遊離アミノ基（類）を持つペプチドおよび有機化合物はＰＥＧのイミデート誘導体または関連する水溶性有機ポリマーで修飾されると述べている。米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗ、１９９０年１月２７日発行）は、反応性アミン基を介してのポリエチレングリコール分子の結合のためのタンパク質におけるリシン残基の数の修飾に関する。
【００６５】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、（ヒトのごとき）温血動物において病気を治療するために安全に非経口または経口投与される単一用量投与単位の医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は、凍結乾燥したまたは脱水した治療剤または診断剤の形態とすることができ、これは生理学上許容される溶媒の添加によって復元できる。該溶媒は、乾燥した組成物を溶解でき、選択された投与経路と適合し、かつ有効成分および使用する復元用安定化剤に負の影響を与えない滅菌水、生理食塩水溶液、グルコース溶液または他の水性炭水化物（例えば、マンニトール、キシロール、グリセロールのごときポリオール）のようないずれの媒体であってもよい。特別の具体例において、本発明は、単一用量投与単位を製造するためのキッ指向される。該キットは、乾燥したタンパク質を収容した第１の容器および復元用安定化剤を含む水性組成物を収容した第２の容器を共に含有する。溶液中のタンパク質の濃度、各容器に充填される溶液の容量、および容器のキャパシティ（目的投与量単位における有効成分の所望の濃度に応じて適当に修飾できる相互に関連したパラメーター）については、これらは当業者によく知られた広い範囲内で変化し得る。
【００６６】
本発明によるＫＧＦアナログは、治療剤および診断剤としておよび実験室試薬として有用であり得る。かくして、ＫＧＦアナログは、組織または器官試料中のＫＧＦの量を定量するのに、またＫＧＦＲを発現する細胞を測定および／または単離するのに、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボ診断アッセイで使用できる（Ｂｏｔｔａｒｏら（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１２７６７−１２７７０；Ｒｏｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８）。組織または器官のアッセイにおいては、ＫＧＦＲに結合する未標識天然ＫＧＦＲのため、１２５Ｉ−ＫＧＦアナログの標準化された結合曲線と比較して、ＫＧＦＲに結合する１２５Ｉ−ＫＧＦアナログからの放射能はより少ないであろう。同様に、１２５Ｉ−ＫＧＦアナログを用いて、種々の細胞型におけるＫＧＦＲの存在を検出できる。
【００６７】
また、本発明では、ペプチドに対して作製される抗体の生成におけるＫＧＦアナログの使用が考えられ、この抗体は天然ＫＧＦにも結合する。この具体例において、該抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであって、ＫＧＦアナログを用いて生成される。得られた抗体は、好ましくはそのタンパク質がその天然（生理学的活性）コンフォメーションにある場合に、天然ＫＧＦに優先的に結合する。これらの抗体はＫＧＦの検出または精製で使用できる。
【００６８】
さらに、本発明では、例えば、効果的なＫＧＦ送達の手段としてまたはＫＧＦ活性に対する阻害剤として、治療的適用を有する高親和性または低親和性ＫＧＦ結合分子の発見におけるＫＧＦアナログの使用が考えられる。ＫＧＦアナログの熱安定性は、生理学的条件（例えば、３７℃における）でかかる結合分子を同定するのに重要である。というのは、ＫＧＦに対するその親和性は高度に温度依存性であり得るし、４℃で観察される親和性からは予測できないかも知れないからである。
【００６９】
イン・ビボ使用では、ＫＧＦアナログは添加剤と共に処方され得る。かかる添加剤は緩衝液、担体、安定化剤、賦形剤、防腐剤、等張調節剤、抗酸化剤等（例えば、粘度調整剤または増量剤）を含む。特定の添加剤の選択は、貯蔵形態（例えば、液体または凍結乾燥したもの）およびＫＧＦアナログの投与様式に依存するであろう。当該分野で知られている適当な組成物は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ（最新版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＣＯｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見い出すことができる。
【００７０】
該ＫＧＦアナログは、損傷を有することによって特に特徴付けられる組織、または臨床的に不十分な数の非繊維芽細胞上皮細胞に治療上有効量にて投与できる。ＫＧＦはヘパリンに結合するので、細胞外環境において存在する、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリン様グリコサミノグリカンおよびヘパリン様グリコサミノグリカンはイン・ビボでＫＧＦに結合するようである。より多くのＫＧＦがその標的受容体に到達し、細胞外環境においてヘパリンおよびヘパリン−様化合物によって隔離されていないので、ヘパリン結合能力が低下したＫＧＦアナログは能力が増強されることになる。これらのアナログは、特別のＫＧＦアナログの治療に要する投与量がより低いので、治療的により有用であろう。
【００７１】
ＫＧＦアナログは、損傷を有することによって特に特徴付けられる組織、または臨床的に不十分な数の非繊維芽細胞上皮細胞に治療上有効量にて投与できる。ＫＧＦアナログが首尾よく投与できる領域は、限定されるものではないが、火傷および他の部分的および十分に厚みの負傷を持つ患者における毛嚢、汗腺および皮脂腺のごとき付属器構造の刺激、増殖および分化；表皮の下部皮膚への接着における欠点であり、その結果、ひどい病的状態を引き起こしかねないしばしば開いた水泡となる、表皮剥離によって引き起こされた病巣の加速された再上皮化；化学療法に誘導された脱毛症の予防、男性型禿頭または男性および女性における毛髪の進行的喪失の治療；胃および十二指腸潰瘍の治療；クローン病（一義的には小腸を患う）および潰瘍性結腸炎（一義的には大腸を患う）のごとき炎症性腸疾患の治療；細胞保護効果または再生またはその双方を誘導するための、治療（例えば、予備的治療および／または後治療）を介しての照射および化学療法的処置法における消化管毒の予防または低下；胃腸管全体の粘膜産生の刺激；未成熟幼児における硝子様膜病のごとき病気（すなわち、幼児呼吸困難症候群および気管支肺形成異常）の治療または予防を助け得る、ＩＩ型肺胞細胞の増殖および分化の誘導；吸入負傷（高酸素レベルを含む）、気腫、肺損傷化学療法剤の使用、換気器具外傷または他の肺損傷環境による、急性または慢性肺損傷または機能不全を伴う細気管支および／または歯槽上皮の増殖および分化の刺激；肝硬変、劇症肝不全、急性ウイルス肝炎および／または肝臓に対する毒性障害によって引き起こされる損傷を治療または予防するための肝機能の増加；例えば、角膜磨損の治療における角膜細胞再生の誘導；進行性歯肉病を治療するための上皮細胞再生の誘導；鼓膜損傷を治療するための鼓膜上皮細胞の再生の誘導ならびに糖尿病の開始の治療または予防を含み、または島細胞移植のセッティングにおける付属物としての使用を含む。
【００７２】
非繊維芽細胞上皮細胞の増殖が必要な患者には有効量のＫＧＦアナログを投与する。「有効量」とは、治療すべき患者において所望の応答を惹起するのに要するＫＧＦアナログの量であり、かくして、一般に、担当の医者によって決定される。投与するＫＧＦアナログの量に影響する因子は、患者の年齢および一般的状態、治療すべき病気等を含む。典型的な投与量は０．００１ｍｇ／ｋｇ体重ないし５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であろう。
【００７３】
ＫＧＦアナログは非経口（例えば、ＩＶ、ＩＴ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ経路）、経口または局所投与にて（ヒトのごとき）温血動物に安全に投与できる。ＫＧＦアナログは、患者の病気および状態に応じて、一回あるいは反復して投与できる。いくつかの場合では、ＫＧＦアナログは付属手段として他の療法に適用でき、また、他の医薬製剤と共に投与できる。
【００７４】
以下の実施例は本発明を十分に説明するために含める。発明の精神を逸脱することなく、これまでに記載した手法に修飾をなし得ることは理解されるであろう。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例に記載した手法、または適当な代替手法の多くについての標準的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｃｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓａｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）のごとき分子生物学の広く認識されたマニュアルで提供されている。
【００７６】
実施例１：ＫＧＦおよびＫＧＦアナログをコードするＤＮＡの作製
（天然ＫＧＦの配列を持つポリペプチドをコードする）全長ヒトＫＧＦ遺伝子のクローニングは、動物細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および化学的に合成した（Ｅ．ｃｏｌｉ最適化コドン）オリゴヌクレオチド（「ＯＬＩＧＯ」）のＰＣＲ双方によって行った。両手法を以下に記載する。
【００７７】
ポリペプチドを産生することが知られている細胞から単離したＲＮＡを用いるＰＣＲ増幅を行った。（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ニュージャージー州から入手した）ヒト繊維芽細胞系ＡＧ１５２３Ａを、チオシアン酸グアニジウムで破壊し、続いて、（Ｃｈｏｍｙｚｉｎｓｋｉら（１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：１５６の方法に従って）抽出した。全ＲＮＡについての標準的な逆転写酵素プロトコルを用い、ＫＧＦ ｃＤＮＡを生成させた。ＫＧＦ遺伝子のＰＣＲ（ＰＣＲ＃１）増幅は、鋳型としてＫＧＦ ｃＤＮＡを、およびＫＧＦ遺伝子の直ぐ５’および３’側のＤＮＡ配列をコードするプライマーＯＬＩＧＯ＃１およびＯＬＩＧＯ＃２を用いて行った［モデル９６００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）；２８サイクル；各サイクルは変性のために９４℃における１分、アニーリングのために６０℃における２分、および伸長のために７２℃における３分とする］。ＰＣＲ＃１産物の少量アリコートを、次いで、５０℃のアニーリング温度を除き前記したサイクル条件に同一である第２のＫＧＦ ＰＣＲ（ＰＣＲ＃２）用の鋳型として使用した。ＫＧＦ遺伝子の発現クローニングには、ネステッドＯＣＲプライマーを用いて、ＫＧＦ遺伝子の両末端に適当な制限部位を作った。ＯＬＩＧＯ＃３およびＯＬＩＧＯ＃４を用いて、ＰＣＲ＃２からのＫＧＦ ＤＮＡ産物を修飾し、各々、遺伝子の５’および３’末端にＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含ませた［ＰＣＲ＃３；３０サイクル；各サイクルは変性のために９４℃における１分、アニーリングのために６０℃における２分、および伸長のために７２℃における３分とする］。引き続いて、このＤＮＡをＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。次いで、それを再懸濁し、（Ｔ４リガーゼを用いて）「ＲＳＨ」シグナル配列を含有するｐＣＦＭ１１５６プラスミド（図２Ａ）に連絡させて、構築体ＲＳＨ−ＫＧＦを得た（図３）。
【００７８】
連結産物を（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７の方法に従って）Ｅ．ｃｏｌｉ下部ＦＭＳ（ＡＴＣＣ：５３９１１）に形質転換し、２８℃でＬＢ＋カナマイシンで平板培養した。いくつかの形質転換体を選択し、２０μｈ／ｍＬカナマイシンを含有する小さな液状培地中で増殖させた。ＲＳＨ−ＫＧＦプラスミドを各培養から単離し、ＤＮＡ配列を決定した。ＫＧＦ遺伝子における内部ＮｄｅＩ部位のため、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩのひとまとめにした制限部位を持つ所望の発現ベクターに天然遺伝子配列を直接クローニングすることは不可能であった。これは三方連結として達成された。プラスミドＲＳＨ−ＫＧＦをＢｓｍＩおよびＳｓｔＩの唯一の制限酵素で切断し、（ＫＧＦ遺伝子の３’末端を含有する）〜３ｋｂｐＤＮＡ断片を１％アガロースゲルを用いて電気泳動により単離した。ＰＣＲ（ＰＣＲ＃４）はＯＬＩＧＯ＃３の代わりにＯＬＩＧＯ＃５で置き換える以外は前記したごとくに行った。次いで、ＰＣＲ ＤＮＡ産物をＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで切断し、３１１ｂｐＤＮＡ断片を４％アガロースゲルを用いて電気泳動によって単離した。連結の第３片は、ＮｄｅＩおよびＳｓｔＩで切断したｐＣＲＭ１１５６の１．８ｋｂｐＤＮＡ断片であり、これは１％アガロースゲルにより電気泳動に従って単離した。前記したごとき連結（Ｔ４リカゼーゼ）、形質転換、カナマイシン選択およびＤＮＡ配列決定に続き、図４における構築体およびＫＧＦと命名したプラスミドを含有するクローンを拾った。裁断産物を生じた内部リボソーム結合部位のため、唯一のＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位間のＫＧＦ ＤＮＡ配列は化学的に合成したＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６ないしＯＬＩＧＯ＃１１）で置き換えて、内部開始部位の使用を最小化した（図５）。
【００７９】
【表１】
【００８０】
該ＯＬＩＧＯ類をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次いで、熱変性した。次いで、一本鎖（ｓｓ）ＯＬＩＧＯを放置して、温度をゆっくりと室温まで降下させることによってｄｓＤＮＡ断片を形成させた。次いで、Ｔ４リガーゼを用いて、内部ＯＬＩＧＯ付着末端および全ｄｓＯＬＩＧＯ断片をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで切断したＫＧＦプラスミドに共有結合連結させた。新しいプラスミドをＫＧＦ（ｄｓｄ）と命名した。
【００８１】
完全にＥ．ｃｏｌｉコドンに最適化されたＫＧＦ遺伝子を、化学的に合成されたＯＬＩＧＯ＃１２ないし２４のＰＣＲ増幅によって構築した。
【００８２】
ＯＬＩＧＯ＃１２ないし２４を、天然ＫＧＦをコードする全ＤＮＡ配列が「Ｗａｔｓｏｎ」または「Ｃｒｉｃｋ」鎖のいずれかに由来のＯＬＩＧＯによって表され、ＰＣＲ増幅に際して、所望の二本鎖ＤＮＡ配列を生じるように設計した（図６）［ＰＣＲ＃５、モデル９６００サーモサイクラー、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ；２１サイクル、各サイクルは変性のために９４℃における３１秒、アニーリングのために５０℃における３１秒、および伸長のために７３℃における３１秒とする；２１サイクルに続き、ＰＣＲは７分の最終伸長工程で終了した］。ＰＣＲ増幅の後、ＤＮＡ断片をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、５２１ｂｐ断片を、同一酵素で切断した発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６に連結した。ＰＣＲ＃５は、連結のためにバンドエイドオリゴ（Ｊａｙａｒｍａｎら（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２：３９２）としてＯＬＩＧＯ＃２０ないしＯＬＩＧＯ＃２４を用い、外部プライマー（１００ピコモル／１００μｌ ｒｘｎ）ＯＬＩＧＯ＃１２およびＯＬＩＧＯ＃１３ならびにＯＬＩＧＯ＃１４ないしＯＬＩＧＯ＃１９の（Ｔ４リガーゼによる）連結によって誘導されるＫＧＦ鋳型の１μｌ／１００μｌｒｘｎ（ＯＬＩＧＯ＃１５ないしＯＬＩＧＯ＃１８はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した）を利用した。最終構築体はＫＧＦと命名した（最適化コドン）。
【００８３】
本明細書に記載するＫＧＦアナログのすべては、部分的には、ＫＧＦ（ｄｓｄ）またはＫＧＦ（最適化コドン）、または双方の組合せで見い出されるＤＮＡ配列からなる。該配列は、さらに、ＤＮＡ断片合成のための前記した技術の１つ以上を利用して作製された特定のＫＧＦアナログアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を適当な制限部位へ挿入することによって修飾（改変）される。いずれのアナログも、前記した技術によってその全体が生成できる。しかしながら、いずれかの遺伝子の一部的または全体的なＥ．ｃｏｌｉ最適化コドンの存在は、調べると、培養した細菌細胞から得られ得るタンパク質の収率を有意には増加させなかったが、一般的ＯＬＩＧＯ設計の一部として、適当な場合には最適化Ｅ．ｃｏｌｉコドンを使用した。図７ないし１０および１７ないし２６は、便宜な例によって、特定のＫＧＦアナログヌクレオチドおよびアミノ酸配列構築を記載する：Ｒ（１４４）Ｑ（図７）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ（図８）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ（図９）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ（図１０）；ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ（図１７）；ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｅ（図１８）；ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ（図１９）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ（図２０）；ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ（図２１）；ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ（図２２）；ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ（図２３）：ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ（図２４）；ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ（図２５）；およびΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ（図２６）。本明細書に記載するすべてのＫＧＦアナログ構築は確認されたＤＮＡ配列であった。
【００８４】
実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生
３つの異なる発現プラスミドをＫＧＦアナログ遺伝子のクローニングで利用した。発現プラスミドは、ｐＣＦＭ１１５６（ＡＴＣＣ＃６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）、およびｐＣＦＭ３１０２（各々、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。プラスミドｐ３１０２は、ＰＣＲ重複オリゴ突然変異誘発で一連の部位特異的塩基変化を作製することによってプラスミドｐＣＦＭ１６５６から得ることができる。プラスミド複製プロモーターＰｃｏｐＢの直ぐ５’側のＢｇＩＩＩ部位（ｐＣＦＭ１６５６プラスミドｂｐ＃１８０）で出発し、プラスミド複製遺伝子に向けて進行し、塩基対変化は以下の通りである。
【００８５】
【表２】
【００８６】
前記から分かるように、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２は相互に非常に似ており、多くの同一制限部位を含有する。プラスミドは便利さによって選択し、ベクターＤＮＡ成分は新しい構築体の目的で容易に交換できる。すべてのクローニングで使用した宿主はＥ．ｃｏｌｉ菌株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）であり、形質転換は、製造業者に指示に従い、（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）、前掲、に従って）またはＧｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＴＭトランスフェクション装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）での電気溶出によって行った。
【００８７】
最初に、適当な菌株の凍結グリセロールストック０．１ｍＬを、Ｌｕｒｉａブロス５００ｍＬを含有する２Ｌフラスコに入れることによって、３つのｐＣＦＭベクターのうちの１つの上に所望の構築体を有する所望の組換えＥ．ｃｏｌｉの小さくて新しく培養したばかりの接種物を開始した。培養を３０℃で１６時間振盪し、しかる後、培養を、滅菌したバッチ培地（Ｔｓａｉら（１９８７），Ｊ． Ｉｎｄｕｓｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：１８１−１８７）８Ｌを含有する１５Ｌファーメンターに移した。
【００８８】
フィードバッチ発酵はフィード＃１培地の供給で開始する（Ｔｓａｉら（１９８７）、前掲）。ＯＤ６００が３５に到達したら、培養温度を２時間で３７℃、次いで４２℃まで急速に上昇させて、Ｃ１リプレッサーを変性することによって、所望のＫＧＦアナログの発現を誘導した。フィード１の添加はフィード２の都合により断続し、その添加速度は３００ｍＬ／時間で開始した。フィード２は１７５ｇ／Ｌのトリプチカーゼ−ペプトン、８７．５ｇ／Ｌの酵母エキス、および２６０ｇ／Ｌのグルコースからなるものであった。４２℃での１時間後、培養温度を３６℃まで低下させ、次いで、この温度をさらに６時間持続させた。
【００８９】
次いで、発酵を停止し、遠心によって細胞を１Ｌ遠心ボトル内に入れたプラスチック製バッグに収穫した。４００ｒｐｍで６０分間遠心することによって細胞をペレット化し、しかる後、上清を除去し、細胞ペーストを−９０℃で凍結した。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける、種々のＫＧＦアナログの発現に続き、天然ＫＧＦ、Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびΔＮ２３／Ｅ（１４４）Ｑタンパク質を以下の手法を用いて精製した。高細胞密度発酵からの細胞ペーストを、４℃にて、適当な高剪断ミキサーを用い、１０−２０％溶液（ｗ／ｖ）としての０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５に懸濁した。次いで、懸濁した細胞を、ホモゲナイザー（ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ９）に溶液を３回通すことによって溶解させた。適当な熱交換器を用いることによって、流出するホモジネートを４−８℃まで冷却した。次いで、４２００ｒｐｍで、４℃にて、３９−６０分間、ＪＳ ４．２ローターを備えたＪ−６ＢＴＭ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）中で溶解物を遠心することによって夾雑物を除去した。次いで、上清を注意深くデカントし、４℃で０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗＴＭ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の先に調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムに充填した。次に、該カラムを４℃にて、５倍カラム容量の（２２５０ｍＬ）の０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５で洗浄した。５Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５でカラムを洗浄することによって所望にタンパク質を溶出させた。次いで、５０ｍＬずつの画分を収集し、溶出物のＡ２８０を連続的にモニターした。次いで、溶出した物質を含有するものとしてＡ２８０によって同定された画分を、１４％ゲルを通すＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、所望のポリペプチドの存在を確認した。
【００９１】
次いで、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、続いて、等容量の蒸留水を添加した。次いで、希釈した試料を、４℃にて、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの先に調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムに充填した。カラムを２２５０ｍＬの０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８で洗浄し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８から０．６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８の範囲の２０カラム容量の直線グラジエントを用いてタンパク質を溶出させた。再度、溶出物のＡ２８０を定常的にモニターしつつ、５０ｍＬずつの画分を収集した。次いで、（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して）タンパク質を含有する画分をプールし、続いて、３５０ｃｃの撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｍａｙｂｅｒｒｙ，ＭＡ）中、ＹＭ−１０膜（１００００分子量カットオフ）を通して３０−４０ｍＬ容量まで遠心した。
【００９２】
次いで、濃縮物を、１×ＰＢＳ（Dulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水、「Ｄ−ＰＢＳ」、無カルシウムおよびマグネシウム）または０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０からなるカラム緩衝液で平衡化したSuperdex−７５ＴＭ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の先に作製した１３００ｍＬ（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）カラムに充填した。試料がカラムに入った後、カラム緩衝液を用い、ゲル濾過マトリックスからタンパク質を溶出させた。しかる後、１０ｍＬずつの画分を回収し、（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して）アナログを含有するものをプールした。典型的には、タンパク質濃度は得られたプール中約５−１０ｍｇ／ｍＬであった。特に断りのない限り、前記手法の全ては４−８℃で行った。
【００９３】
分析
分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の天然ＫＧＦ；Ｒ（１４４）Ｑ；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑで行った。
【００９４】
コンフォメーション安定性
ポリペプチドを、その貯蔵安定性、熱変性転移温度（Ｔｍ）、および広範囲のｐＨ条件における安定性につき比較した。
【００９５】
高温での凝集を防ぐ、天然ＫＧＦ、Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの能力も調べた。０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する試料をＤ−ＰＢＳ中で調製した。各試料の０．５ｍＬのアリコットを３ｃｃの１型ガラス製バイアルに入れた。該バイアルを、ゴム製ストッパーで密封し、１３ｍｍのフリップ−オフアルミニウムシールをクリンプした。次いで、これらのバイアルを３７℃のインキュベーターに入れた。所定の時間間隔で、バイアルを取り出し、可溶性タンパク質の喪失につき分析した。０．２２μｍ Ｓｐｉｎ−Ｘフィルターユニット（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を通して、各試料２５０μＬを遠心することによって目に見える沈殿を除去した。濾過溶液中の可溶性タンパク質を引き続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。ＨＰＬＣピーク面積を積算し、結果を３７℃におけるインキュベーション時間の関数としてプロットすることによって、可溶性タンパク質の量を決定した。結果を図１１に示す。
【００９６】
次いで、可溶性のモノマータンパク質の喪失についての半減期を、これらのカイネティック曲線から見積もった。表１は、これらのタンパク質につき、３７℃での貯蔵に際して残存する可溶性ＫＧＦの半減期を示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
前記表１および図１１から分かるように、天然ＫＧＦは最も迅速に凝集し、半減期は０．６日であった。Ｒ（１４４）Ｑは半減期を４．１日まで増大させた。Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは、各々、可溶性半減期を１３．３、２２．３および３８日まで実質的に増加させた。
【００９９】
熱変性
熱変性は、ＰＴＣ−３４３ペティエ型温度制御系を備えたＪ−７２０ＴＭスペクトロポラリメーター（Ｊａｓｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）を用いて２３０ｎｍにて円二色性（ＣＤ）によってモニターした。ＣＤ分析については、分析すべき０．１ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含有する別の試料をＤ−ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で調製した。各試料につき、約２．５ｍＬを１００ｍｍ経路長の矩形ＳｕｐｒａｓｉｌＴＭ水晶（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｑｕａｒｔｚｓｃｈｍｅｌｚｅ，ＧｍｂＨ，Ｈａｎａｕ，ドイツ国）蛍光セル（Ｈｅｌｌａ Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｊａｍａｉｃａ，ＮＹ）に充填した。次いで、スペクトロポラリメーター中のペルティエ型温度制御系に入れた。加熱変性は５０℃／時間の速度で行った。楕円率の変化を２３０ｎｍでモニターして変性を示した。各試料のＴｍは、溶液中のタンパク質分子の５０％が変性される温度を確認することによって推定した（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，サンフランシスコ（１９８０）。３種のタンパク質の各々について推定したＴｍは表２にリストする。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
結果が示すように、Ｒ（１４４）Ｑは天然ＫＧＦと比較して、７℃より大きいＴｍ上昇を有する。Ｒ（１４４）ＱからＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱまたはΔＮ２３への置き換えは、少なくともさらに１℃のＴｍ上昇、かつ天然ＫＧＦと比較して８℃を超える上昇を与える。さらに、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは天然ＫＧＦよりも９℃を超えてより安定である。従って、アミノ酸１４４位における正に荷電した残基（Ａｒｇ）を中性または負に荷電した残基にスイッチすると、ポリペプチドを実質的に安定化させた。
【０１０２】
ｐＨ
濃塩酸またはＮａＯＨを添加することによりＤ−ＰＢＳを異なるｐＨ値に調整することによって、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの酸安定性を天然ＫＧＦのそれと比較した。異なるｐＨ値のＤ−ＰＢＳの２．３５ｍＬを、水晶セル中の２．４５ｍｇ／ｍＬ ＫＧＦタンパク質１００μｌと混合した。これらの試料を５０℃／時間の速度で熱変性させ、２３０ｎｍにおけるＣＤによってモニターした。図１２は、天然ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅにつき、ｐＨの関数としてのＴｍを示す。テストしたｐＨ範囲において、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅは天然ＫＧＦよりも常に高いＴｍを有した。
【０１０３】
イン・ビトロ生物学的活性
（Ｒｕｂｉｎら（１９８９）、前掲の方法に従って）Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞による［３Ｈ］−チミジン摂取の測定によって、Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅのイン・ビトロ分裂促進活性を、タンパク質濃度および半最大濃度の関数として測定した。
【０１０４】
一般に、公知の標準的な天然ＫＧＦに対するＫＧＦアナログの各々の濃度は、イン・ビトロ生物学的アッセイを用いて測定した。次いで、各ＫＧＦアナログを希釈し、Ｂａｌｂ／ＭＫ分裂促進アッセイを用い、生物学的活性につきアッセイした。まず、試料を、５０％の使用者作製のイーグルＭＥＭ、５０％の使用者作製のＦ１２、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．０００５％のＨＳＡおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０からなるバイオアッセイ培地中に希釈した。次いで、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞を接種したＦａｌｃｏｎ ｐｒｉｍｅｒｉａ９６穴プレートにＫＧＦ試料を添加した。ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、天然ＫＧＦ標準曲線との比較によって、入力天然ＫＧＦ濃度に変換した。結果を図１３ないし１６に示す。図１３ないし１６で分かるように、ＫＧＦアナログの各々は分裂促進活性を有する。
【０１０５】
本発明を一般的におよび好ましい具体例により記載したが、前記の記載に徴して他の変形および修飾が起こるのは当業者に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１−１】天然ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）を示す（天然ＫＧＦの成熟形態をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１ないし６８４によって示され、ＫＧＦの成熟形態は配列番号２のアミノ酸残基３２ないし１９４によって示される）。
【図１−２】天然ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）を示す（天然ＫＧＦの成熟形態をコードするヌクレオチドは配列番号１の塩基２０１ないし６８４によって示され、ＫＧＦの成熟形態は配列番号２のアミノ酸残基３２ないし１９４によって示される）。
【図２−Ａ】ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【図２−Ｂ】ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【図２−Ｃ】ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。
【図３】構築体ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４】プラスミドＫＧＦに含まれる構築体のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５】プラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中に構築体を生じさせるためにプラスミドＫＧＦに含有させた構築体におけるＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（配列番号６のアミノ酸位４６ないし８５）の間のＤＮＡ配列を置換するのに用いる化学的に合成したＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃６ないしＯＬＩＧＯ＃１１；配列番号１２−１７）を示す。
【図６】ＫＧＦを構築するのに使用される化学的に合成されたＯＬＩＧＯ類（ＯＬＩＧＯ＃１２ないしＯＬＩＧＯ＃２４；配列番号１８−３０）を示す。
【図７】Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１４４のアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図８】Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図９】Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのアミノ酸位１および１５におけるシステインの代りにセリンの置換および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３５）およびアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【図１０】ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失および１４４位におけるアルギニンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
【図１１】３７℃におけるインキュベーション時間の関数としての、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した可溶性タンパク質の量を示す。
【図１２】天然ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＱおよびＣ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥについてのｐＨの関数としての推定された融解温度（Ｔｍ）を示す。
【図１３】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１４】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１５】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１６】ＤＮＡ合成の間の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定し、それを天然ＫＧＦ標準曲線と比較することによって決定した、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅの分裂促進活性の典型的プロフィールを示す。
【図１７】ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３７位におけるアスパラギンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【図１８】ΔＮ２３／Ｋ（１３７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【図１９】ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１３９位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。
【図２０】ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにアラニンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【図２１】ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４４位におけるアルギニンの代りにロイシンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示す
【図２２】ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。
【図２３】ΔＮ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１４７位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。
【図２４】ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。
【図２５】ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５３位におけるリシンの代りにグルタミンの置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５８）を示す。
【図２６】ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ、天然ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３個のアミノ酸の欠失およびアミノ酸１５２位におけるグルタミンの代りにグルタミン酸の置換およびアミノ酸位１５３におけるリシンの代りにグルタミン酸の置換を有するＫＧＦアナログのヌクレオチド（配列番号５９）配列およびアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２のアミノ酸残基４１−１５４（配列番号２のアミノ酸７２−１８５）のうちの１以上の欠失または置換による電荷変化を含む天然ＫＧＦのポリペプチドアナログ。
【請求項２】
該欠失または置換アミノ酸が、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ｌｙｓ１２８、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３およびＴｈｒ１５４よりなる群から選択される請求項１記載のポリペプチドアナログ。
【請求項３】
Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑよりなる群から選択される請求項１記載のポリペプチドアナログ。
【請求項４】
治療上有効量の請求項１記載のＫＧＦのポリペプチドアナログおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
治療上有効量の凍結乾燥した請求項１記載のポリペプチドアナログを含む医薬組成物。
【請求項６】
さらに、医薬上許容される担体を含む請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＤＮＡおよびＲＮＡよりなる群から選択される核酸分子であって、該核酸分子が、図２のアミノ酸残基４１−１５４（配列番号２のアミノ酸７２−１８５）のうちの１以上の欠失または置換による電荷変化を含む天然ＫＧＦのポリペプチドアナログをコードする該核酸分子。
【請求項８】
該欠失または置換アミノ酸がＡｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ｌｙｓ１２８、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３およびＴｈｒ１５４よりなる群から選択される請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
ポリペプチドアナログがＲ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑよりなる群から選択される請求項７記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸分子を含む生物学的に機能的なプラスミドまたはベクター。
【請求項１１】
請求項８記載の生物学的に機能的なベクターで安定的にトランスフェクトまたは形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項１２】
Ｅ．ｃｏｌｉである請求項１１記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物細胞である請求項１１記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１４】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１２記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１５】
請求項７記載の核酸分子で安定的に形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞を、適当な栄養条件下、コードされたポリペプチドアナログが発現されるように増殖させ、次いで、かく産生されたポリペプチドアナログを単離することを特徴とするＫＧＦのポリペプチドアナログの製法。
【請求項１６】
有効量の請求項１記載のＫＧＦのポリペプチドアナログを非繊維芽細胞上皮細胞と接触させることを特徴とする該細胞の生産を刺激する方法。
【請求項１】
図２のアミノ酸残基４１−１５４（配列番号２のアミノ酸７２−１８５）のうちの１以上の欠失または置換による電荷変化を含む天然ＫＧＦのポリペプチドアナログ。
【請求項２】
該欠失または置換アミノ酸が、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ｌｙｓ１２８、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３およびＴｈｒ１５４よりなる群から選択される請求項１記載のポリペプチドアナログ。
【請求項３】
Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑよりなる群から選択される請求項１記載のポリペプチドアナログ。
【請求項４】
治療上有効量の請求項１記載のＫＧＦのポリペプチドアナログおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
治療上有効量の凍結乾燥した請求項１記載のポリペプチドアナログを含む医薬組成物。
【請求項６】
さらに、医薬上許容される担体を含む請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＤＮＡおよびＲＮＡよりなる群から選択される核酸分子であって、該核酸分子が、図２のアミノ酸残基４１−１５４（配列番号２のアミノ酸７２−１８５）のうちの１以上の欠失または置換による電荷変化を含む天然ＫＧＦのポリペプチドアナログをコードする該核酸分子。
【請求項８】
該欠失または置換アミノ酸がＡｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ９５、Ｌｙｓ１２８、Ａｓｎ１３７、Ｇｌｎ１３８、Ｌｙｓ１３９、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１４７、Ｇｌｎ１５２、Ｌｙｓ１５３およびＴｈｒ１５４よりなる群から選択される請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
ポリペプチドアナログがＲ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）ＥおよびΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑよりなる群から選択される請求項７記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸分子を含む生物学的に機能的なプラスミドまたはベクター。
【請求項１１】
請求項８記載の生物学的に機能的なベクターで安定的にトランスフェクトまたは形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞。
【請求項１２】
Ｅ．ｃｏｌｉである請求項１１記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物細胞である請求項１１記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１４】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１２記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１５】
請求項７記載の核酸分子で安定的に形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞を、適当な栄養条件下、コードされたポリペプチドアナログが発現されるように増殖させ、次いで、かく産生されたポリペプチドアナログを単離することを特徴とするＫＧＦのポリペプチドアナログの製法。
【請求項１６】
有効量の請求項１記載のＫＧＦのポリペプチドアナログを非繊維芽細胞上皮細胞と接触させることを特徴とする該細胞の生産を刺激する方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図１−２】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２００７−２０５７５（Ｐ２００７−２０５７５Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００６−２３７８７６（Ｐ２００６−２３７８７６）
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【分割の表示】特願平８−５１３３７０の分割
【原出願日】平成７年１０月１２日（１９９５．１０．１２）
【出願人】（５０３３４９２８０）アムジエン・インコーポレーテツド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３７８７６（Ｐ２００６−２３７８７６）
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【分割の表示】特願平８−５１３３７０の分割
【原出願日】平成７年１０月１２日（１９９５．１０．１２）
【出願人】（５０３３４９２８０）アムジエン・インコーポレーテツド (5)
【Ｆターム（参考）】
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