ゲル状集合体中への物質の混合方法
【課題】ゲル状集合体中に混合対象物を短時間で均一に混合し得る混合方法を提供すること。
【解決手段】ゲル状集合体を凍結すること、凍結した集合体を融解してゾルを得ること、得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法。
【解決手段】ゲル状集合体を凍結すること、凍結した集合体を融解してゾルを得ること、得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル状集合体中への物質の混合方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲル状集合体が注目されており、特に自己集合性を有する分子が分子集合して形成されたゲル状集合体が注目され、様々な用途への展開が期待されている。このようなゲル状集合体としては、例えば、自己集合性ペプチドの分子集合体であるペプチドゲルが挙げられ、該ペプチドゲルは、再生医療等の分野でスキャフォールド（細胞の足場）としての用途を有している。該ペプチドゲルをスキャフォールドとして使用する場合において、既にゲル化したペプチドゲルと細胞等の物質とを混合する際には、ゲルに３０分程度超音波処理してから混合するという方法が採用されている（非特許文献１）。しかしながら、該方法によれば、超音波処理に時間と手間がかかり、さらには、物質が十分に混合されないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００５，１０２（２４） ８４１４−８４１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、ゲル状集合体中に混合対象物を短時間で均一に混合し得る混合方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法が提供される。該方法は、
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。
好ましい実施形態においては、上記ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである。
好ましい実施形態においては、上記ゲル状集合体が、粘土鉱物が集合することによって形成されたゲルである。
好ましい実施形態においては、上記自己集合性分子が、自己集合性ペプチドである。
本発明の別の局面によれば、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法が提供される。該方法は、
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ゲル状集合体をゾル化した状態で混合を行うので、混合対象物を短時間で均一に混合し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】（ａ）実施例１で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例１で再形成されたゲルの写真である。
【図２】（ａ）実施例２で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例２で再形成されたゲルの写真である。
【図３】（ａ）実施例３で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例３で再形成されたゲルの写真である。
【図４】（ａ）実施例４で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例４で再形成されたゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
Ａ．語句の定義
（１）ゲル状集合体
「ゲル状集合体」とは、自己集合性分子または自己集合性を有する結晶が、媒質中において自発的に集合することによって形成されたゲルをいう。
（２）自己集合性分子
「自己集合性分子」とは、媒質中において、分子同士の相互作用を介して自発的に集合する分子をいう。このような分子は、分子間引力により自発的に凝集し、秩序正しく、安定に、共有結合によらずに分子集団を形成（いわゆる、分子集合）し得る。相互作用としては、特に限定されず、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用、疎水性相互作用が挙げられる。
（３）ゲル
「ゲル」とは、流動性を失ったコロイドである。ゲルは、粘性的な性質と弾性的な性質とを併せ持つ。具体的には、例えば、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を測定したときに、「Ｇ’＞Ｇ’’」となるものをいう。
（４）ゾル
「ゾル」とは、流動性を有するコロイドである。具体的には、例えば、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を測定したときに、「Ｇ’＜Ｇ’’」となるものをいう。
（５）ゾル‐ゲル転移
「ゾル‐ゲル転移」とは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’が「Ｇ’＞Ｇ’’」である状態から「Ｇ’＜Ｇ’’」である状態、または「Ｇ’＜Ｇ’’」である状態から「Ｇ’＞Ｇ’’」である状態へ転移する現象をいい、該現象が生じる温度をゾル‐ゲル転移点という。すなわち、ゾル‐ゲル転移点は「Ｇ’＝Ｇ’’」となる点である。
【０００９】
Ｂ．混合方法
本発明の混合方法は、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法であって、
ゲル状集合体を凍結すること（凍結工程）、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること（融解工程）、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること（混合工程）、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成すること（ゲル化工程）を含む。該方法は、必要に応じて、任意の工程をさらに含んでもよい。ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである場合、凍結融解することにより、分子間の結合が切断されてゲルを構成する三次元網目構造が崩壊するので、分子が均一に分散したゾルが得られ得る。また、ゲル状集合体が、自己集合性を有する結晶が集合することによって形成されたゲルである場合、凍結融解することにより、結晶間の結合が切断されて、結晶が均一に分散したゾルが得られ得る。本発明においては、このようにして得られた均一性の高いゾルと混合対象物とを混合するので、再形成されたゲル状集合体の内部においては、混合対象物が均一に分散された状態で存在し得る。凍結融解という極めて簡易な操作でゲル状集合体中に均一に混合対象物を混合し得ることは、本発明の大きな効果の１つである。
【００１０】
Ｂ−１．凍結工程
ゲル状集合体としては、凍結融解によってゾルを形成し、可逆的なゾル−ゲル転移特性を有する限り、任意の適切な集合体が採用され得る。凍結融解によってゾルを形成した後のゲルへの転移は、時間応答性、温度応答性、圧力応答性のいずれによるものであってもよく、また上記応答性のうち２つ以上の要因によるものであってもよい。ゲル状集合体は、該集合体を形成する分子または結晶と、媒質と、必要に応じて任意の添加物を含む。
【００１１】
上記自己集合性分子または自己集合性を有する結晶としては、可逆的なゾル−ゲル転移特性を有するコロイドを形成し、凍結融解によってゾルを形成する限り、任意の適切な分子または結晶が選択され得る。好ましい自己集合性分子としては、自己集合性ペプチド等が挙げられる。好ましい自己集合性を有する結晶としては、粘土鉱物等が挙げられる。このような分子または結晶から形成されたゲルは、架橋剤、凝集剤等のゲル化剤を用いることなく、自己集合性分子間または結晶間に形成された比較的弱い非共有結合に依存しているので、凍結融解処理により、これらの結合が容易に切断されてゾル化し得る。また、分子集合によってゾルからゲルの再形成が自発的に行われ得るからである。
【００１２】
自己集合性ペプチドの好ましい例としては、下記のアミノ酸配列からなる自己集合性ペプチドがあげられる。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（該アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
【００１３】
上記アミノ酸配列を有する自己集合性ペプチドの具体例としては、以下の配列を有するペプチドが挙げられる。
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号１）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号２）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲＬ−ｃ（配列番号３）
【００１４】
自己集合性ペプチドの別の好ましい具体例としてはＷＯ２００７／０００９７９号パンフレット、米国特許５６７０４８３号等に記載のペプチドが挙げられる。また、これらの自己集合性ペプチドに保護基の導入等の修飾を施したペプチドも本発明の方法に好ましく適用され得る。
【００１５】
上記自己集合性ペプチドは、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法で作製し得る。
【００１６】
粘土鉱物の好ましい具体例としては、モンモリロナイト、バイデライト、ヘクトライト、サポナイト、スチブンサイト等のスメクタイト族鉱物が挙げられる。これらは、天然のものであってもよく、合成品であってもよい。
【００１７】
ゲル状集合体の媒質は、該集合体を形成する分子または結晶の種類、濃度等に応じて適切に選択され得る。例えば、自己集合性ペプチドまたは粘土鉱物から形成されるゲル状集合体においては、媒質は、好ましくは水である。
【００１８】
上記添加物は、該集合体を形成する分子または結晶の種類、濃度等に応じて適切に選択され得る。該添加物としては、例えば、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤などが挙げられる。
【００１９】
ゲル状集合体中の添加物の濃度は、ゲル化工程におけるゲルの再形成に悪影響を及ぼさない濃度に設定され得る。該濃度は、ゲル状集合体を形成する分子または結晶の種類、濃度等に応じて、適切に設定され得るが、通常、低い濃度であることが好ましい。例えば、自己集合性ペプチドゲルの場合、緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌは終濃度が、好ましくは５０ｍＭ以下、さらに好ましくは４０ｍＭ以下である。炭酸水素ナトリウム溶液および炭酸ナトリウム溶液は終濃度が、好ましくは５ｍＭ以下、さらに好ましくは４ｍＭ以下である。ＰＢＳは終濃度が、好ましくは０．５×ＰＢＳ以下、さらに好ましくは０．３×ＰＢＳ以下である。また緩衝剤以外の添加物として、局方生理食塩水は終濃度が、好ましくは０．５重量％以下、さらに好ましくは０．４重量％以下である。
【００２０】
上記ゲル状集合体は、該集合体を構成する分子または結晶の種類および濃度、媒質の種類等に応じて、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、自己集合性ペプチドゲルは、自己集合性ペプチドを好ましくは０．１〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．２〜３ｗ／ｖ％となるように所望の媒質中に溶解または分散してペプチドゾルを調製し、該ペプチドゾルを静置して自己集合性ペプチドを分子集合させることにより調製され得る。また、自己集合性ペプチドゲルは、例えば、商品名「ＢＤＴＭ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ ペプチド ハイドロゲル」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等の市販品として入手可能である。また、粘土鉱物から形成されるゲル状集合体は、例えば、商品名「ラポナイトＸＬＧ」（ラポート社製）、商品名「ラポナイトＲＤ」（ラポート社製）等の市販品として入手可能である。
【００２１】
凍結条件は、ゲル状集合体が凍結する限りにおいて、任意の適切な条件が採用され得る。凍結温度は、ゲル状集合体が凍結する温度以下であればよい。凍結速度にも制限はなく、徐々に冷凍してもよく、急速冷凍してもよい。例えば、自己集合性ペプチドゲルの場合は、好ましくは−１０℃以下の温度条件下に置くことで好適に凍結され得る。
【００２２】
凍結手段としては、家庭用または業務用冷凍庫、液体窒素等の任意の適切な凍結手段が選択され得る。なお、凍結した集合体は、融解工程に供するまでの任意の期間、凍結したまま保存することが可能である。
【００２３】
Ｂ−２．融解工程
融解温度は、上記凍結した集合体が融解してゾルを形成する温度であれば、任意の適切な温度に設定され得る。一定の温度で融解してもよく、異なる温度で段階的に融解してもよい。融解速度および時間に制限はなく、徐々に融解してもよく、急速に融解してもよい。例えば、自己集合性ペプチドのゾルを得る場合は、好ましくは５〜７０℃、さらに好ましくは１５〜４５℃の温度条件下に凍結した自己集合性ペプチドを置くことで好適に融解を行い得る。
【００２４】
融解手段としては、任意の適切な手段が選択され得る。融解手段の具体例としては、水浴、油浴、恒温槽等が挙げられる。
【００２５】
上記のようにゲル状集合体を凍結融解することにより、ゲルを形成する分子間または結晶間の種々の結合が切断されて、ゾルが得られる。３０分程度の超音波処理によってもゲルをゾル化することが可能であるが、分子間または結晶間の種々の結合を十分に切断することができず、照射後、すばやくゲル化してしまう。そのため、混合対象物を均一に混合することができない。これに対し、凍結融解によって得られたゾルは分子間または結晶間の種々の結合が十分に切断されるので、粘度が著しく低下し、後述の混合工程において、混合対象物質と均一に混合することが可能である。
【００２６】
Ｂ−３．混合工程
混合対象物は、目的等に応じて、任意の適切な物質が選択され得る。混合対象物の具体例としては、ビタミン類；単糖；二糖；オリゴ糖；ヒアルロン酸、キトサン、親水化セルロース等の多糖類；アルコール；グリセリン、プロピレングリコール等のポリオール；ジルコニア、酸化チタン等の金属酸化物；色素；ホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子等の生理活性物質；ペプチド；酵素；抗体；ＤＮＡ；ＲＮＡ；触媒；架橋剤；培養液；その他一般的な低分子化合物が挙げられる。また、混合対象物は、細胞、細胞群、組織、微生物、ウイルス等の生物試料であってもよい。細胞は、動物細胞であっても、植物細胞であってもよい。微生物としては、例えば、細菌、酵母、原生動物が挙げられる。混合対象物は１種のみを用いてもよく、２種以上用いてもよい。
【００２７】
混合対象物の混合量は、ゾルがゲル状集合体を再形成し得る限り、任意の適切な量に設定され得る。例えば、自己集合性ペプチドゾルは、混合後のペプチド濃度が、好ましくは０．１〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．２〜３ｗ／ｖ％となるように設定される。
【００２８】
混合は、上記融解工程で得られたゾルがゾル状態を維持する間に行われる。例えば、自己集合性ペプチドのゾルの場合は、好ましくは−２〜１５℃、さらに好ましくは−２〜５℃で好適に混合が行われ得る。このような温度範囲であれば、急速なゲル化を防止し得、その結果、十分な混合時間を確保し得るからである。なお、上記温度範囲は、混合対象物を含むペプチドゾル、すなわち、混合対象物と混合中のペプチドゾルの温度範囲である。
【００２９】
混合は、ゾル中に分子または結晶および混合対象物が十分に分散するように行われることが好ましく、混合時間および混合手段に制限はない。混合手段としては、任意の適切な手段が選択され得る。大スケールな混合においては、攪拌棒、混合機等が用いられ得、小スケールな混合は、ピペッティング等の手作業で行われてもよい。
【００３０】
上記凍結、融解、混合工程は２回以上繰り返して行ってもよい。
【００３１】
Ｂ−４．ゲル化工程
ゲルの再形成条件（温度、時間等）は、ゲル状集合体が再形成される限り制限はなく、分子または結晶の種類および濃度、媒質の種類等に応じて適切に設定され得る。ゾル中に含まれる分子が自己集合性分子である場合、適切な条件に設定することにより、分子集合によってゲルが自発的に再形成され得る。
【００３２】
例えば、自己集合性ペプチドゲルを再形成する場合、上記混合工程で得られた混合対象物が混合されたゾルを静置すればよい。静置温度は、好ましくは１５℃以上、さらに好ましくは２５℃以上である。静置時間は、好ましくは１分以上、さらに好ましくは５分以上である。また静置する場所に制限はなく、ガラス、プラスチック等の容器内、シャーレ等の細胞培養器具内、注射器等の医療器具内が挙げられる。さらには、上記混合対象物が混合されたゾルを混合直後に生体内へ注入し、その場でゲル化させてもよい。
【００３３】
再形成されたゲル状集合体においては、混合対象物が均一に分散した状態で存在し得る。
【００３４】
Ｃ．製造方法
本発明の別の局面によれば、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法が提供され得る。該製造方法は、ゲル状集合体を凍結すること、凍結した集合体を融解してゾルを得ること、得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。各工程については、上記Ｂ項で記載したとおりである。該製造方法によれば、混合対象物が均一に混合されたゲル状集合体が得られ得る。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
［試験例１］
常法により、Ｎ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した自己集合性ペプチド１（［ＣＨ３ＣＯ］−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−［ＮＨ２］）を得た。該自己集合性ペプチド１を水に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液を終濃度が１．２ｍＭとなるように加えた。得られたペプチド溶液中のペプチド濃度は１ｗ/ｖ％であった。該ペプチド溶液を室温で１０分静置し、自己集合性ペプチドゲルを得た。
【００３７】
得られた自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、３．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００３８】
得られた細胞混合ゾルの上層、中層、および下層から１００μｌずつサンプリングし、それぞれの試料をＰＢＳで５倍希釈した。希釈した各試料を用いて血球計算盤上の４区画の細胞数を計測することにより、細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を求めた。結果を表１に示す。
【００３９】
［試験例２］
自己集合性ペプチドゲルとして、商品名「ＢＤＴＭ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ ペプチド ハイドロゲル」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペプチド濃度：１ｗ／ｖ％、ｐＨ３）を用いた。
【００４０】
上記自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、５．３８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００４１】
得られた細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を試験例１と同様にして求めた。結果を表１に示す。
【００４２】
［比較試験例１］
試験例１と同様にして得た自己集合性ペプチドゲルに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）を施すことにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、３．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００４３】
得られた細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を試験例１と同様にして求めた。結果を表１に示す。
【００４４】
［比較試験例２］
試験例２と同様の自己集合性ペプチドゲルに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）を施すことにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、５．３８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００４５】
得られた細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を試験例１と同様にして求めた。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１に示されるとおり、凍結融解によって得られるゾルには、超音波処理によって得られるゾルよりも均一に混合対象物を混合することができる。
【００４８】
［実施例１］
上記自己集合性ペプチド１を水に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液を終濃度が１．２ｍＭとなるように加えた。得られたペプチド溶液中のペプチド濃度は０．８ｗ/ｖ％であった。該ペプチド溶液を室温で１０分静置し、自己集合性ペプチドゲルを得た。
【００４９】
得られた自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μＬをサンプリングチューブに移し、フェノールレッドを含むＤＭＥＭ培地４５０μＬを加えて、５回ピペッティングした。
【００５０】
ついで、該サンプリングチューブを２５℃で５分静置することにより、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図１に示す。
【００５１】
［実施例２］
自己集合性ペプチドゲルとして、商品名「ＢＤＴＭ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ ペプチド ハイドロゲル」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペプチド濃度：１ｗ／ｖ％、ｐＨ３）を用いた。
【００５２】
上記自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μＬをサンプリングチューブに移し、エオシン水溶液４５０μＬを加えて、５回ピペッティングした。
【００５３】
ついで、該サンプリングチューブを２５℃で２０分静置することにより、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図２に示す。
【００５４】
［実施例３］
フェノールレッドを含むＤＭＥＭ培地の代わりに５０μＭ ＦＩＴＣ標識インスリン水溶液を混合したこと以外は実施例１と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図３に示す。
【００５５】
［実施例４］
エオシン水溶液の代わりに５０μＭ ＦＩＴＣ標識インスリン水溶液を混合したこと以外は実施例２と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図４に示す。
【００５６】
［比較例１］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例１と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図１に示す。
【００５７】
［比較例２］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例２と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図２に示す。
【００５８】
［比較例３］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例３と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図３に示す。
【００５９】
［比較例４］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例４と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図４に示す。
【００６０】
図１〜４に示されるとおり、本発明の方法によれば、一旦ゲル化した分子集合体に対して、凍結融解を行ってゾル化することにより、混合対象物を短時間で均一に混合することができる。一方、超音波処理によって得られたゾルを用いた場合、再形成されたゲルはモヤがかっており、混合対象物が不均一に混合されたことがわかる。
【００６１】
［参考例１］
商品名「ラポナイトＸＬＧ」（ラポート社製）を６ｗ／ｖ％の濃度で含むゲル状集合体（媒質：水）を液体窒素で凍結した。次いで、凍結した集合体を３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾルを２５℃で５時間静置することにより、ゲル状集合体を再形成した。
【００６２】
［参考例２］
商品名「ラポナイトＸＬＧ」（ラポート社製）を２ｗ／ｖ％の濃度で含むゲル状集合体（媒質：０．７５重量％界面活性剤（商品名「ＯＳ−１４」、日光ケミカルズ社製）および１．０重量％ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有水溶液）液体窒素で凍結した。次いで、凍結した集合体を３７℃の温水で一部融解し、その後室温静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾルを２５℃で１５分静置することにより、ゲル状集合体を再形成した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の混合方法および製造方法は、再生医療、ドラッグデリバリーシステム、化粧品、人工硝子体、止血剤、美容整形用注射剤、骨充填、関節潤滑剤、湿潤用保水材等の製造または使用において好適に適用され得る。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
配列番号２は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
配列番号３は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル状集合体中への物質の混合方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲル状集合体が注目されており、特に自己集合性を有する分子が分子集合して形成されたゲル状集合体が注目され、様々な用途への展開が期待されている。このようなゲル状集合体としては、例えば、自己集合性ペプチドの分子集合体であるペプチドゲルが挙げられ、該ペプチドゲルは、再生医療等の分野でスキャフォールド（細胞の足場）としての用途を有している。該ペプチドゲルをスキャフォールドとして使用する場合において、既にゲル化したペプチドゲルと細胞等の物質とを混合する際には、ゲルに３０分程度超音波処理してから混合するという方法が採用されている（非特許文献１）。しかしながら、該方法によれば、超音波処理に時間と手間がかかり、さらには、物質が十分に混合されないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００５，１０２（２４） ８４１４−８４１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、ゲル状集合体中に混合対象物を短時間で均一に混合し得る混合方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法が提供される。該方法は、
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。
好ましい実施形態においては、上記ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである。
好ましい実施形態においては、上記ゲル状集合体が、粘土鉱物が集合することによって形成されたゲルである。
好ましい実施形態においては、上記自己集合性分子が、自己集合性ペプチドである。
本発明の別の局面によれば、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法が提供される。該方法は、
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ゲル状集合体をゾル化した状態で混合を行うので、混合対象物を短時間で均一に混合し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】（ａ）実施例１で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例１で再形成されたゲルの写真である。
【図２】（ａ）実施例２で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例２で再形成されたゲルの写真である。
【図３】（ａ）実施例３で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例３で再形成されたゲルの写真である。
【図４】（ａ）実施例４で再形成されたゲルの写真であり、（ｂ）比較例４で再形成されたゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
Ａ．語句の定義
（１）ゲル状集合体
「ゲル状集合体」とは、自己集合性分子または自己集合性を有する結晶が、媒質中において自発的に集合することによって形成されたゲルをいう。
（２）自己集合性分子
「自己集合性分子」とは、媒質中において、分子同士の相互作用を介して自発的に集合する分子をいう。このような分子は、分子間引力により自発的に凝集し、秩序正しく、安定に、共有結合によらずに分子集団を形成（いわゆる、分子集合）し得る。相互作用としては、特に限定されず、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用、疎水性相互作用が挙げられる。
（３）ゲル
「ゲル」とは、流動性を失ったコロイドである。ゲルは、粘性的な性質と弾性的な性質とを併せ持つ。具体的には、例えば、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を測定したときに、「Ｇ’＞Ｇ’’」となるものをいう。
（４）ゾル
「ゾル」とは、流動性を有するコロイドである。具体的には、例えば、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を測定したときに、「Ｇ’＜Ｇ’’」となるものをいう。
（５）ゾル‐ゲル転移
「ゾル‐ゲル転移」とは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’が「Ｇ’＞Ｇ’’」である状態から「Ｇ’＜Ｇ’’」である状態、または「Ｇ’＜Ｇ’’」である状態から「Ｇ’＞Ｇ’’」である状態へ転移する現象をいい、該現象が生じる温度をゾル‐ゲル転移点という。すなわち、ゾル‐ゲル転移点は「Ｇ’＝Ｇ’’」となる点である。
【０００９】
Ｂ．混合方法
本発明の混合方法は、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法であって、
ゲル状集合体を凍結すること（凍結工程）、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること（融解工程）、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること（混合工程）、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成すること（ゲル化工程）を含む。該方法は、必要に応じて、任意の工程をさらに含んでもよい。ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである場合、凍結融解することにより、分子間の結合が切断されてゲルを構成する三次元網目構造が崩壊するので、分子が均一に分散したゾルが得られ得る。また、ゲル状集合体が、自己集合性を有する結晶が集合することによって形成されたゲルである場合、凍結融解することにより、結晶間の結合が切断されて、結晶が均一に分散したゾルが得られ得る。本発明においては、このようにして得られた均一性の高いゾルと混合対象物とを混合するので、再形成されたゲル状集合体の内部においては、混合対象物が均一に分散された状態で存在し得る。凍結融解という極めて簡易な操作でゲル状集合体中に均一に混合対象物を混合し得ることは、本発明の大きな効果の１つである。
【００１０】
Ｂ−１．凍結工程
ゲル状集合体としては、凍結融解によってゾルを形成し、可逆的なゾル−ゲル転移特性を有する限り、任意の適切な集合体が採用され得る。凍結融解によってゾルを形成した後のゲルへの転移は、時間応答性、温度応答性、圧力応答性のいずれによるものであってもよく、また上記応答性のうち２つ以上の要因によるものであってもよい。ゲル状集合体は、該集合体を形成する分子または結晶と、媒質と、必要に応じて任意の添加物を含む。
【００１１】
上記自己集合性分子または自己集合性を有する結晶としては、可逆的なゾル−ゲル転移特性を有するコロイドを形成し、凍結融解によってゾルを形成する限り、任意の適切な分子または結晶が選択され得る。好ましい自己集合性分子としては、自己集合性ペプチド等が挙げられる。好ましい自己集合性を有する結晶としては、粘土鉱物等が挙げられる。このような分子または結晶から形成されたゲルは、架橋剤、凝集剤等のゲル化剤を用いることなく、自己集合性分子間または結晶間に形成された比較的弱い非共有結合に依存しているので、凍結融解処理により、これらの結合が容易に切断されてゾル化し得る。また、分子集合によってゾルからゲルの再形成が自発的に行われ得るからである。
【００１２】
自己集合性ペプチドの好ましい例としては、下記のアミノ酸配列からなる自己集合性ペプチドがあげられる。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（該アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
【００１３】
上記アミノ酸配列を有する自己集合性ペプチドの具体例としては、以下の配列を有するペプチドが挙げられる。
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号１）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号２）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲＬ−ｃ（配列番号３）
【００１４】
自己集合性ペプチドの別の好ましい具体例としてはＷＯ２００７／０００９７９号パンフレット、米国特許５６７０４８３号等に記載のペプチドが挙げられる。また、これらの自己集合性ペプチドに保護基の導入等の修飾を施したペプチドも本発明の方法に好ましく適用され得る。
【００１５】
上記自己集合性ペプチドは、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法で作製し得る。
【００１６】
粘土鉱物の好ましい具体例としては、モンモリロナイト、バイデライト、ヘクトライト、サポナイト、スチブンサイト等のスメクタイト族鉱物が挙げられる。これらは、天然のものであってもよく、合成品であってもよい。
【００１７】
ゲル状集合体の媒質は、該集合体を形成する分子または結晶の種類、濃度等に応じて適切に選択され得る。例えば、自己集合性ペプチドまたは粘土鉱物から形成されるゲル状集合体においては、媒質は、好ましくは水である。
【００１８】
上記添加物は、該集合体を形成する分子または結晶の種類、濃度等に応じて適切に選択され得る。該添加物としては、例えば、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤などが挙げられる。
【００１９】
ゲル状集合体中の添加物の濃度は、ゲル化工程におけるゲルの再形成に悪影響を及ぼさない濃度に設定され得る。該濃度は、ゲル状集合体を形成する分子または結晶の種類、濃度等に応じて、適切に設定され得るが、通常、低い濃度であることが好ましい。例えば、自己集合性ペプチドゲルの場合、緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌは終濃度が、好ましくは５０ｍＭ以下、さらに好ましくは４０ｍＭ以下である。炭酸水素ナトリウム溶液および炭酸ナトリウム溶液は終濃度が、好ましくは５ｍＭ以下、さらに好ましくは４ｍＭ以下である。ＰＢＳは終濃度が、好ましくは０．５×ＰＢＳ以下、さらに好ましくは０．３×ＰＢＳ以下である。また緩衝剤以外の添加物として、局方生理食塩水は終濃度が、好ましくは０．５重量％以下、さらに好ましくは０．４重量％以下である。
【００２０】
上記ゲル状集合体は、該集合体を構成する分子または結晶の種類および濃度、媒質の種類等に応じて、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、自己集合性ペプチドゲルは、自己集合性ペプチドを好ましくは０．１〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．２〜３ｗ／ｖ％となるように所望の媒質中に溶解または分散してペプチドゾルを調製し、該ペプチドゾルを静置して自己集合性ペプチドを分子集合させることにより調製され得る。また、自己集合性ペプチドゲルは、例えば、商品名「ＢＤＴＭ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ ペプチド ハイドロゲル」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等の市販品として入手可能である。また、粘土鉱物から形成されるゲル状集合体は、例えば、商品名「ラポナイトＸＬＧ」（ラポート社製）、商品名「ラポナイトＲＤ」（ラポート社製）等の市販品として入手可能である。
【００２１】
凍結条件は、ゲル状集合体が凍結する限りにおいて、任意の適切な条件が採用され得る。凍結温度は、ゲル状集合体が凍結する温度以下であればよい。凍結速度にも制限はなく、徐々に冷凍してもよく、急速冷凍してもよい。例えば、自己集合性ペプチドゲルの場合は、好ましくは−１０℃以下の温度条件下に置くことで好適に凍結され得る。
【００２２】
凍結手段としては、家庭用または業務用冷凍庫、液体窒素等の任意の適切な凍結手段が選択され得る。なお、凍結した集合体は、融解工程に供するまでの任意の期間、凍結したまま保存することが可能である。
【００２３】
Ｂ−２．融解工程
融解温度は、上記凍結した集合体が融解してゾルを形成する温度であれば、任意の適切な温度に設定され得る。一定の温度で融解してもよく、異なる温度で段階的に融解してもよい。融解速度および時間に制限はなく、徐々に融解してもよく、急速に融解してもよい。例えば、自己集合性ペプチドのゾルを得る場合は、好ましくは５〜７０℃、さらに好ましくは１５〜４５℃の温度条件下に凍結した自己集合性ペプチドを置くことで好適に融解を行い得る。
【００２４】
融解手段としては、任意の適切な手段が選択され得る。融解手段の具体例としては、水浴、油浴、恒温槽等が挙げられる。
【００２５】
上記のようにゲル状集合体を凍結融解することにより、ゲルを形成する分子間または結晶間の種々の結合が切断されて、ゾルが得られる。３０分程度の超音波処理によってもゲルをゾル化することが可能であるが、分子間または結晶間の種々の結合を十分に切断することができず、照射後、すばやくゲル化してしまう。そのため、混合対象物を均一に混合することができない。これに対し、凍結融解によって得られたゾルは分子間または結晶間の種々の結合が十分に切断されるので、粘度が著しく低下し、後述の混合工程において、混合対象物質と均一に混合することが可能である。
【００２６】
Ｂ−３．混合工程
混合対象物は、目的等に応じて、任意の適切な物質が選択され得る。混合対象物の具体例としては、ビタミン類；単糖；二糖；オリゴ糖；ヒアルロン酸、キトサン、親水化セルロース等の多糖類；アルコール；グリセリン、プロピレングリコール等のポリオール；ジルコニア、酸化チタン等の金属酸化物；色素；ホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子等の生理活性物質；ペプチド；酵素；抗体；ＤＮＡ；ＲＮＡ；触媒；架橋剤；培養液；その他一般的な低分子化合物が挙げられる。また、混合対象物は、細胞、細胞群、組織、微生物、ウイルス等の生物試料であってもよい。細胞は、動物細胞であっても、植物細胞であってもよい。微生物としては、例えば、細菌、酵母、原生動物が挙げられる。混合対象物は１種のみを用いてもよく、２種以上用いてもよい。
【００２７】
混合対象物の混合量は、ゾルがゲル状集合体を再形成し得る限り、任意の適切な量に設定され得る。例えば、自己集合性ペプチドゾルは、混合後のペプチド濃度が、好ましくは０．１〜５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．２〜３ｗ／ｖ％となるように設定される。
【００２８】
混合は、上記融解工程で得られたゾルがゾル状態を維持する間に行われる。例えば、自己集合性ペプチドのゾルの場合は、好ましくは−２〜１５℃、さらに好ましくは−２〜５℃で好適に混合が行われ得る。このような温度範囲であれば、急速なゲル化を防止し得、その結果、十分な混合時間を確保し得るからである。なお、上記温度範囲は、混合対象物を含むペプチドゾル、すなわち、混合対象物と混合中のペプチドゾルの温度範囲である。
【００２９】
混合は、ゾル中に分子または結晶および混合対象物が十分に分散するように行われることが好ましく、混合時間および混合手段に制限はない。混合手段としては、任意の適切な手段が選択され得る。大スケールな混合においては、攪拌棒、混合機等が用いられ得、小スケールな混合は、ピペッティング等の手作業で行われてもよい。
【００３０】
上記凍結、融解、混合工程は２回以上繰り返して行ってもよい。
【００３１】
Ｂ−４．ゲル化工程
ゲルの再形成条件（温度、時間等）は、ゲル状集合体が再形成される限り制限はなく、分子または結晶の種類および濃度、媒質の種類等に応じて適切に設定され得る。ゾル中に含まれる分子が自己集合性分子である場合、適切な条件に設定することにより、分子集合によってゲルが自発的に再形成され得る。
【００３２】
例えば、自己集合性ペプチドゲルを再形成する場合、上記混合工程で得られた混合対象物が混合されたゾルを静置すればよい。静置温度は、好ましくは１５℃以上、さらに好ましくは２５℃以上である。静置時間は、好ましくは１分以上、さらに好ましくは５分以上である。また静置する場所に制限はなく、ガラス、プラスチック等の容器内、シャーレ等の細胞培養器具内、注射器等の医療器具内が挙げられる。さらには、上記混合対象物が混合されたゾルを混合直後に生体内へ注入し、その場でゲル化させてもよい。
【００３３】
再形成されたゲル状集合体においては、混合対象物が均一に分散した状態で存在し得る。
【００３４】
Ｃ．製造方法
本発明の別の局面によれば、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法が提供され得る。該製造方法は、ゲル状集合体を凍結すること、凍結した集合体を融解してゾルを得ること、得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。各工程については、上記Ｂ項で記載したとおりである。該製造方法によれば、混合対象物が均一に混合されたゲル状集合体が得られ得る。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
［試験例１］
常法により、Ｎ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した自己集合性ペプチド１（［ＣＨ３ＣＯ］−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−［ＮＨ２］）を得た。該自己集合性ペプチド１を水に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液を終濃度が１．２ｍＭとなるように加えた。得られたペプチド溶液中のペプチド濃度は１ｗ/ｖ％であった。該ペプチド溶液を室温で１０分静置し、自己集合性ペプチドゲルを得た。
【００３７】
得られた自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、３．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００３８】
得られた細胞混合ゾルの上層、中層、および下層から１００μｌずつサンプリングし、それぞれの試料をＰＢＳで５倍希釈した。希釈した各試料を用いて血球計算盤上の４区画の細胞数を計測することにより、細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を求めた。結果を表１に示す。
【００３９】
［試験例２］
自己集合性ペプチドゲルとして、商品名「ＢＤＴＭ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ ペプチド ハイドロゲル」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペプチド濃度：１ｗ／ｖ％、ｐＨ３）を用いた。
【００４０】
上記自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、５．３８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００４１】
得られた細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を試験例１と同様にして求めた。結果を表１に示す。
【００４２】
［比較試験例１］
試験例１と同様にして得た自己集合性ペプチドゲルに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）を施すことにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、３．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００４３】
得られた細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を試験例１と同様にして求めた。結果を表１に示す。
【００４４】
［比較試験例２］
試験例２と同様の自己集合性ペプチドゲルに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）を施すことにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μｌを、５．３８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ培地２００μｌが入った容器に加え、ピペッティングを３回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
【００４５】
得られた細胞混合ゾル中の各位置における細胞数を試験例１と同様にして求めた。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１に示されるとおり、凍結融解によって得られるゾルには、超音波処理によって得られるゾルよりも均一に混合対象物を混合することができる。
【００４８】
［実施例１］
上記自己集合性ペプチド１を水に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液を終濃度が１．２ｍＭとなるように加えた。得られたペプチド溶液中のペプチド濃度は０．８ｗ/ｖ％であった。該ペプチド溶液を室温で１０分静置し、自己集合性ペプチドゲルを得た。
【００４９】
得られた自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μＬをサンプリングチューブに移し、フェノールレッドを含むＤＭＥＭ培地４５０μＬを加えて、５回ピペッティングした。
【００５０】
ついで、該サンプリングチューブを２５℃で５分静置することにより、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図１に示す。
【００５１】
［実施例２］
自己集合性ペプチドゲルとして、商品名「ＢＤＴＭ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ ペプチド ハイドロゲル」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペプチド濃度：１ｗ／ｖ％、ｐＨ３）を用いた。
【００５２】
上記自己集合性ペプチドゲルを液体窒素で凍結した。次いで、凍結した自己集合性ペプチドゲルを３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾル３００μＬをサンプリングチューブに移し、エオシン水溶液４５０μＬを加えて、５回ピペッティングした。
【００５３】
ついで、該サンプリングチューブを２５℃で２０分静置することにより、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図２に示す。
【００５４】
［実施例３］
フェノールレッドを含むＤＭＥＭ培地の代わりに５０μＭ ＦＩＴＣ標識インスリン水溶液を混合したこと以外は実施例１と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図３に示す。
【００５５】
［実施例４］
エオシン水溶液の代わりに５０μＭ ＦＩＴＣ標識インスリン水溶液を混合したこと以外は実施例２と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図４に示す。
【００５６】
［比較例１］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例１と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図１に示す。
【００５７】
［比較例２］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例２と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図２に示す。
【００５８】
［比較例３］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例３と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図３に示す。
【００５９】
［比較例４］
凍結融解する代わりに超音波処理（製品名「超音波洗浄機 ＵＳ−４Ｒ」（アズワン社製、槽内体積９．５Ｌ）、１６０Ｗ、３０分間）をしてゾルを得たこと以外は実施例４と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図４に示す。
【００６０】
図１〜４に示されるとおり、本発明の方法によれば、一旦ゲル化した分子集合体に対して、凍結融解を行ってゾル化することにより、混合対象物を短時間で均一に混合することができる。一方、超音波処理によって得られたゾルを用いた場合、再形成されたゲルはモヤがかっており、混合対象物が不均一に混合されたことがわかる。
【００６１】
［参考例１］
商品名「ラポナイトＸＬＧ」（ラポート社製）を６ｗ／ｖ％の濃度で含むゲル状集合体（媒質：水）を液体窒素で凍結した。次いで、凍結した集合体を３７℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾルを２５℃で５時間静置することにより、ゲル状集合体を再形成した。
【００６２】
［参考例２］
商品名「ラポナイトＸＬＧ」（ラポート社製）を２ｗ／ｖ％の濃度で含むゲル状集合体（媒質：０．７５重量％界面活性剤（商品名「ＯＳ−１４」、日光ケミカルズ社製）および１．０重量％ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有水溶液）液体窒素で凍結した。次いで、凍結した集合体を３７℃の温水で一部融解し、その後室温静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾルを２５℃で１５分静置することにより、ゲル状集合体を再形成した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の混合方法および製造方法は、再生医療、ドラッグデリバリーシステム、化粧品、人工硝子体、止血剤、美容整形用注射剤、骨充填、関節潤滑剤、湿潤用保水材等の製造または使用において好適に適用され得る。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
配列番号２は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
配列番号３は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法。
【請求項２】
前記ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲル状集合体が、粘土鉱物が集合することによって形成されたゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記自己集合性分子が、自己集合性ペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法。
【請求項１】
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法。
【請求項２】
前記ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲル状集合体が、粘土鉱物が集合することによって形成されたゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記自己集合性分子が、自己集合性ペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２０７６７９（Ｐ２０１０−２０７６７９Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９８２（Ｐ２００９−５４９８２）
【出願日】平成２１年３月９日（２００９．３．９）
【特許番号】特許第４４４８５５２号（Ｐ４４４８５５２）
【特許公報発行日】平成２２年４月１４日（２０１０．４．１４）
【出願人】（０００１３８０８２）株式会社メニコン (150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月９日（２００９．３．９）
【特許番号】特許第４４４８５５２号（Ｐ４４４８５５２）
【特許公報発行日】平成２２年４月１４日（２０１０．４．１４）
【出願人】（０００１３８０８２）株式会社メニコン (150)
【Ｆターム（参考）】
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