コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼの変異体
本発明は、新規な変異体コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ核酸、上記核酸によりコードされるポリペプチド、並びに上記核酸及びポリペプチドの使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００３年６月１０日に出願された米国出願第６０／４７７，６４９号（これは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される）の利益及びそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府によって支援されている研究及び開発の下で行われた発明に対する権利に関する記述］
該当なし。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ（コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ）又はその一部の変異体ポリペプチド、並びにかかるポリペプチドをコードする核酸分子、及び組換え技法を用いてかかるポリペプチドを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
［発明の背景］
酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌ［β］１，３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ（ＧＬｃＮＡｃ→ＧａｌＮＡｃ）［β］１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（すなわち、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ（コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ））は、Ｏ結合グリカン生合成経路においてコア１（すなわちＧａｌ［β］１，３ＧａｌＮＡｃ［α］−Ｏ）をコア２構造（すなわち、Ｇａｌ［β］１，３［ＧｌｃＮＡｃ［β］１，６］ＧａｌＮＡｃ［α］−Ｏ）へ変換する(Williams and Schachter, J. Biol. Chem 255:11247, 1980及びSchachter H. and Brockhausen, I, In:Allen, H.J. and Kisailus E.C.(eds) Glycoconjugates. Composition, Structure, and Function. Marcel Dekker, New York, pp 263-332)。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性は、ポリ（Ｎ−アセチルラクトサミン）（すなわち、Ｇａｌ［β］１−４ＧｌｃＮＡｃ［β］１−３の反復）によるＯ結合糖の伸長において重要である。これらの構造は、悪性形質転換(Yousefi et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(3):1772-1782)及びリンパ球の増殖活性化(Higgins et al.
(1991) J. Biol. Chem. 266(10): 6280-6290)に関連しており、これらは、細胞接着に影響を及ぼし(Zhu and Laine (1985) J. Biol. Chem., 260(7):4041-4045; Laferte and Dennis (1988) Cancer Res.; 48(17):4743-4748)、且つこれらは、哺乳類レクチン用のリガンドとして作用し得る(Merkle and Cummings (1988) J. Biol. Chem. 263(31):16143-9)。
【０００５】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴは、標的分子のグリコシル化による細胞−細胞相互作用の調節において重要な酵素である。例えば、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴにより調節されるＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド（「ＰＳＧＬ−１」）のグリコシル化は、Ｐ−セレクチンの結合に関する重要な工程であることが見出されている(Kumar et al. (1996) Blood, 88(10):3872-3879; Li et al. (1996) J. Biol. Chem. 271(6):3255-3264)。糖尿病及び高血糖症は、ラットの心筋細胞において特異的にコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ遺伝子発現を誘導し、糖尿病患者の心臓におけるコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現はまた、ストレス反応及び心筋層肥大と関連がある(Nishio et al., (1995) J. Clin Invest., 96(4): 1759-1767)。
【０００６】
ゴルジへのＵＤＰ−Ｇａｌ輸送を阻止して、コア２構造を含むＯ結合及びＮ結合された
伸長をブロックする体細胞変異体は、いずれか一方の経路のみでのブロックよりも転移のより激しい減衰をもたらし、Ｏ結合コア２及びＮ結合分岐状オリゴ糖の両方が、悪性表現型に寄与することを示唆している。これに関して、ＧａｌＮＡｃαＲは、Ｏ結合経路の早期に、１つの酵素をブロックすることによりコア２合成を防止し、ＧａｌＮＡｃαＲは、浸潤及び転移を低減させることがわかっている。また、結腸直腸癌細胞におけるコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの増大された発現が、疾患の進行と密接に相関していることも見出されている(Shimodaira et al. (1997) Cancer Res., 57(23): 5201-5206)。
【０００７】
本明細書中の任意の参照文献の引用は、かかる参照文献が本発明に対する従来技術として利用可能であることを受け入れるものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ（コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ）の新規な変異体ポリペプチドを提供する。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチド（及び／又は適切な状況では、融合又はキメラコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチド）は、場合によっては本明細書中で「Ｃ２変異体」又は「Ｃ２変異体ポリペプチド」と称することもある。
【０００９】
本発明のある態様では、単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドが提供され、ここで第２１７位のアミノ酸は、システイン以外の任意のアミノ酸である。
【００１０】
本発明の特定の変異体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここでコア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアミノ酸残基は、置き換えられるか、又は欠失されて、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を保持しながら安定性を増大させたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴを提供する。
【００１１】
ある態様では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位に対応する本来のシステイン残基は、置換アミノ酸残基により置き換えられるか、又は欠失される。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのシステイン２１７の変更により、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を保持しながら、酵素の安定性が増大する。
【００１２】
特に好ましい実施形態（embodiment)では、本来のアミノ酸２１７位でのシステイン残基は、セリン残基又はアラニン残基により置き換えられる。
【００１３】
本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチドは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有し、且つ増強された安定性を有する。特定の実施形態では、本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチドはまた、ネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１と実質的に同じであり得るコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１供与体基質及び受容体基質に対するＫｍ値を有する。グリコシルトランスフェラーゼ産物であるＵＤＰ及びＧｌｃＮＡｃ（β１−６）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐの阻害能力は、本発明のＣ２変異体及びネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に関して実質的に同じであり得る。ネイティブ又は野生型酵素と同様に、本発明のＣ２変異体は、基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを使用しない。特定の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する変異体ポリペプチドの保存的置換を含む変異体ポリペプチドを意図する。
【００１４】
他の付加、置換及び／又は欠失が本発明のＣ２変異体になされてもよい。例えば、マウスＣ２変異体は、２３５位のシステインで第２のアミノ酸置換を必要に応じて包含してもよい。代替的には、当業者に既知であるように、末端アミノ酸残基の１つ又はそれ以上は
、Ｃ２変異体の改善された特性を実質的に保持しながら核酸配列から欠失されてもよい。ある実施形態では、Ｎ末端アミノ酸残基が欠失される。
【００１５】
本発明はまた、Ｃ２変異体ポリペプチドをコードする核酸分子又はポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
上記ポリヌクレオチドを使用して、宿主細胞を形質転換して、本発明のＣ２変異体を発現することができる。上記ポリヌクレオチドはまた、関連酵素を検出するためのプローブとして使用することもできる。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡサイジング標準物質として使用することができる。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む組換えベクターに関する。本発明の核酸分子は、適切なベクターに挿入されてもよく、ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必須の要素を含有し得る。したがって、本発明の核酸分子、及び適切な場合、核酸分子に連結された１つ又はそれ以上の転写及び翻訳要素を含むベクターが構築され得る。
【００１８】
ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換することができる。したがって、本発明は、本発明のベクターを含有する宿主細胞を提供する。同様に、本発明は、かかるベクター及び宿主細胞を作製する方法を提供する。
【００１９】
本発明の変異体Ｃ２ポリペプチドは、当業者に既知の多数の方法のいずれか１つの方法によりコード、発現及び精製され得る。好ましい生産方法は、材料のコスト及び入手可能性、並びに他の経済上の考慮を含む多くの要因に依存する。所定の状況に関する最適な生産手順は、最低限の実験を通して当業者に明らかであろう。
【００２０】
本発明のある態様によれば、本発明の核酸分子を利用した組換え技法によりＣ２変異体を生産する方法が提供される。上記方法は、Ｃ２変異体の発現を促進する条件下で、Ｃ２変異体をコードする核酸配列を含有する組換え宿主細胞を培養すること、及び続くＣ２変異体の回収を含み得る。
【００２１】
一態様では、本発明は、Ｃ２変異体を調製する方法であって、（ａ）Ｃ２変異体をコードする核酸分子を含む本発明のベクターを宿主細胞へ移入すること、（ｂ）非形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択すること、（ｃ）上記Ｃ２変異体の発現を可能にする条件下で、選択した形質転換宿主細胞を培養すること、及び（ｄ）上記Ｃ２変異体を単離することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の方法を用いて得られる組換えＣ２変異体ポリペプチドを意図する。
【００２３】
本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、ポリペプチドのような他の分子と結合させて、融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドを調製し得る。これは、例えばＮ末端又はＣ末端融合ポリペプチドの合成により達成され得る。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＣ２変異体ポリペプチドに対して特異性を有する抗体を意図する。抗体は、検出可能な物質で標識してもよく、Ｃ２変異体ポリペプチドを検出するのに使用され得る。別の実施形態では、本発明は、Ｃ２変異体ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２５】
それらの改善された特性により、本発明のＣ２変異体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法での使用に特に適切である。本発明の
一態様では、Ｃ２変異体を使用して、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの阻害剤を同定する方法が提供される。
【００２６】
さらに、本発明は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性を調節する能力に関して試験化合物を評価する方法を提供する。「調節する」は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性の変化又は変更を指す。調節は、活性の増加若しくは減少、特徴（例えば、動的特徴）、又はポリペプチドの生物学的、機能的若しくは免疫学的特性の任意の他の変化であり得る。
【００２７】
本発明のある実施形態では、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアンタゴニストとしての有効性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）ポリペプチドのアンタゴニスト活性が検出され得る条件下で、Ｃ２変異体ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程、及びｂ）アンタゴニスト活性を検出する工程を含む方法が提供される。
【００２８】
本発明の方法を用いて同定される物質及び化合物は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性を調節するのに使用されてもよく、それらは、炎症性障害、肝臓障害、腎臓障害、骨格筋障害、心臓血管障害、糖尿病、感染性疾患、ホルモン性疾患、寄生虫疾患及び増殖性疾患（例えば、癌）のようなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴにより媒介される状態の処置（treatment)において使用され得る。したがって、上記物質及び化合物は、これらの状態の１つ又はそれ以上を患う個体への投与用の組成物へ処方してもよい。したがって、本発明はまた、本発明の方法を用いて同定される物質若しくは化合物の１つ又はそれ以上、及び薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤を含む組成物に関する。これらの状態を処置又は防止する方法であって、それらを必要とする患者に本発明の組成物を投与することを含む方法もまた提供される。
【００２９】
コア２トランスフェラーゼ活性を有する新規なＣ２変異体ポリペプチドおよびこれをコードする核酸を提供した場合、したがって本発明は、ｓＬｅＸ抗原を含むオリゴ糖及び／又は多糖（例えば、二糖又はそれ以上の糖）を調製する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明は、オリゴ糖を調製する方法であって、本発明のＣ２変異体ポリペプチドの存在下で、糖供与体及び受容体を含む反応混合物を接触させることを含む方法に関する。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、科学研究、ＤＮＡの合成及びベクターの製造に関連したｉｎ ｖｉｔｒｏでの目的で、ポリペプチド又は核酸分子を利用する方法が提供される。
【００３１】
本発明のこれら及び他の態様、特徴及び利点は、以下の図面及び詳細な説明から当業者に明らかなはずである。
【００３２】
［詳細な説明］
本発明によれば、当該技術分野の技術内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技法が使用され得る。かかる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)、DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985)、Oligonucleotide
Synthesis(M.J. Gait ed. 1984)、Nucleic Acid Hybridization B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)、Transcription and Translation B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1984)、Animal Cell Culuture R.I. Freshney, ed.(1986)、Immobilized Cells and enzymes IRL Press, (1986)及びB. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照されたい。
【００３３】
用語解説
「コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ」又は「コア２トランスフェラーゼ」という用語は、本明細書中で使用する場合、天然に存在する（「ネイティブ」又は「野生型」）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ、並びに宿主細胞中で発現される場合にネイティブなタンパク質の反応と同一の反応を触媒する天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を有する天然に存在しないポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）を包含する。この用語はまた、対立遺伝子、種及び組織改変体も包含する。対立遺伝子改変体は、たった１つ又は多くても数個のアミノ酸置換により、ネイティブ又は野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと異なる。ポリペプチドの種バリエーションは、生物の異なる種間で天然に存在するバリエーションである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ Ｌ型（Ｔ１）、特にヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ［配列番号３を参照、またＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＡＡ３５９１９（ａａ）及びＭ９７３４７（ｎｔ）も参照］、マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ［配列番号７を参照、またＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｑ０９３２４（ａａ）及びＵ１９２６５（ｎｔ）も参照］又は別の種由来のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴであり得る。
【００３４】
「コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性」又は「コア２トランスフェラーゼ活性」は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴによるコア１からコア２構造への変換を指す。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの触媒活性は、ネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴと実質的に同じである。触媒活性は、それがネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴに関して得られる活性と同一である場合、「実質的に同じである」とみなされ、又はそれはネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性と比較して２倍〜１０倍、２倍〜５倍活性であってもよいし、２倍〜３倍劣る活性であってもよい。
【００３５】
触媒活性は、Ｃ２変異体の活性（例えば、触媒効率及び動力学的パラメータ）を野生型又はネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性と比較することにより評価される。Ｃ２変異体の活性は、例えば実施例に示されるように、１つ又はそれ以上の試験基質に対して測定され得る。
【００３６】
「変異体」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸残基の少なくとも１つが、置換アミノ酸残基で置き換えられるか、又は欠失されているコア２ ＧｌｃＮＡｃＴを指す。変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して有利な特性を有する。ある態様では、変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して増大した安定性を有する。
【００３７】
「置換アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸を置き換え、且つ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸を指す。置換アミノ酸は、それが重要な基質相互作用をブロックしないか、又は酵素のフォールディング／コンホメーションを劇的に変更させないように選択される。ある特定の実施形態では、置換アミノ酸は、変異体へ増大した安定性を付与し、一般的に酸化、アルキル化及び／又は重金属結合に対して感受性でないアミノ酸である。特に、置換アミノ酸は、空気酸化、酸化剤、チオール反応性試薬及び重金属により引き起こされる不活性化に対して非感受性である。かかるアミノ酸の例としては、天然アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）及びバリン（Ｖａｌ）、並びにそれらのＤ及びＬ立体異性体における対応する非天然アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン）及びそれらのアナログが挙げられる。
【００３８】
アミノ酸に関して「アナログ」という用語は、Ｃ末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基又は側鎖官能基のいずれかが別の官能基に化学的に改変されたアミノ酸を指す。アミノ酸アナログは、それらのＮ末端アミノ基又はそれらの側鎖基上で、化学的にブロックされて
いる（可逆的又は不可逆的に）か、又は改変されている天然及び非天然アミノ酸を包含する。セリン、アラニン及びバリンのアミノ酸アナログの例としては、Ｌ／Ｄ−Ｎ−メチルセリン、Ｌ／Ｄ−Ｎ−メチルアラニン、Ｌ／Ｄ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−セリンヒドロキサメート、Ｎ−（２−アミノエチル）−ｂ−アラニン、Ｄ−バリン−ＯＨ、Ｌ−アラニン−ＯＨ、Ｌ／Ｄ−セリン（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎ−メチル−Ｌ／Ｄ−アラニン−ＯＨ及びＮ−メチル−Ｌ／Ｄ−バリン−ＯＨが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明のある実施形態では、置換アミノ酸は、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位のシステインにおけるセリンである。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、置換アミノ酸は、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位のシステインにおけるアラニンである。
【００４１】
Ｃ２変異体ポリペプチドに関して本明細書中で使用する場合の「安定性」は、Ｃ２変異体ポリペプチドが、酸化、アルキル化又は重金属結合に対して感受性でないか、又はそれらに対する減少された感受性を有することを意味する。特に、「安定性」は、野生型酵素と比較して、チオールを標的とする試薬に対する減少された感受性を指す。ある態様では、この用語は、空気酸化、酸化剤、チオール反応性試薬及び重金属により引き起こされる不活性化に対する非感受性を指す。
【００４２】
「核酸」又は「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」という用語若しくは本明細書中の用語的(grammatical)等価物は、一緒に共有結合されている少なくとも２つのヌクレオチドを指す。これらの用語は、改変若しくは非改変ＤＮＡ、ＲＮＡ又は混合ポリマーを包含すると意図され、一本鎖、二本鎖又は三重鎖のいずれであってもよく、センス又はアンチセンス鎖を表す。例えば、核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域、又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖、より典型的には、二本鎖又は三本鎖、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む領域の混合物であり得るＲＮＡが挙げられる。かかる領域における鎖は、同じ分子由来又は異なる分子由来であり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、１つ又はそれ以上の改変塩基を含有してもよい。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、安定性のために、又は他の理由で改変された骨格を有し得る。したがって、核酸アナログは、例えばホスホルアミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49 (10):1925)及びその中の参照文献）、Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800、 Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579、Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487、Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805、Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470、及びPauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437、及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321)、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approch, Oxford University Pressを参照）並びにペプチド核酸骨格及び結合（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895、Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008、Nielsen (1993) Nature, 365:566、Carlsson et al. (1996) Nature 380:207を参照）を含む代わりの骨格を有し得るものが挙げられる。他のアナログ核酸としては、正の骨格（Denpcy
et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号及び同第４，４６９，８６３号、Letsinger et al (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470、Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597、Chapters 2 and 3, ACS Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook、Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395、Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17
、Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)）及び非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号、並びにChapters 6 and 7, ACS Symposium Series
580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されるものを含む）が挙げられる。１つ又はそれ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に包含される（Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev.
pp169-176を参照）。幾つかの核酸アナログが、Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35に記載されている。標識のようなさらなる部分の付加を容易とするために、又は生理学的環境においてかかる分子の安定性及び半減期を増大させるために、リボース−リン酸骨格のこれらの改変が行われ得る。
【００４３】
「核酸分子」という用語、特にＤＮＡ又はＲＮＡは、一次及び二次構造のみを指し、その用語は、一次および二次構造を任意の特定の三次形態に限定しない。
【００４４】
「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語は、本明細書中で使用する場合、天然、合成又は改変アミノ酸を指す。
【００４５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書中では交換可能に使用される。この用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸残基の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。
【００４６】
「保存的置換」という用語は、分子の活性及び／又は結合親和性を実質的に変更しないアミノ酸置換を表すためにタンパク質又はペプチドに関して使用される。通常、保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する別のアミノ酸で置換することを包含する。以下の６つの群はそれぞれ、互いに典型的な保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４７】
「融合分子」は、本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドへ結合されている（直接的又はリンカーを介して）任意の分子を指す。好ましい融合分子は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドとの融合タンパク質として発現され得るタンパク質である。
【００４８】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用する場合、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体等）に関する場合は、分子の異種集団（例えば、タンパク質及び他の生物製剤）中の生体分子の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された条件（例えば、抗体の場合ではイムノアッセイ条件、又は核酸の場合ではストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、特定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」分子に結合し、サンプル中に存在する他の分子には、有意な量で結合しない。特定の実施形態では、抗体は、約１０−６Ｍ又は１０−７Ｍを超えるＫｄ、好ましくは約１０−８Ｍを超えるＫｄ、さらに好ましくは１０−９Ｍを超えるＫｄ、最も好ましくは約１０−１０Ｍを超えるＫｄで、その標的（例えば、本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド）を特異的に結合する。
【００４９】
本発明の核酸分子
上述のように、特定の実施形態では、本発明は、Ｃ２変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５０】
本発明の一実施形態では、下記を含む単離された核酸分子が意図される。
【００５１】
（ｉ）配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９及び２０を含むか、又は配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９及び２０から本質的に構成されるＣ２変異体ポリペプチドをコードする核酸配列、
【００５２】
（ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列、
【００５３】
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重に起因してコドン配列において（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれとも異なる核酸配列及び／又は
【００５４】
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の対立遺伝子若しくは種バリエーション。
【００５５】
特定の実施形態では、単離された核酸分子は、下記を含む。
【００５６】
（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４を含むか、又は配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４から本質的に構成される核酸配列、
【００５７】
（ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列、
【００５８】
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重に起因してコドン配列において（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸配列のいずれとも異なる核酸配列及び／又は
【００５９】
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の対立遺伝子若しくは種バリエーション。
【００６０】
「相補的」という用語は、塩基対形成による、許容塩及び温度条件下での核酸分子の自然結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」であってもよく（ここでは、核酸のほんの幾つかが結合する）、又は２つの一本鎖分子間の相補性は、全体的な相補性が一本鎖分子間に存在する場合には完全であってもよい。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列によりコードされる核酸配列を含むか、又は配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４（ここでＴはＵであってもよい）で示される核酸配列を含む。
【００６２】
Ｃ２変異体ポリペプチドをコードし、且つ遺伝コードにおける縮重に起因して配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９又は２０の核酸配列と異なる配列を含む単離された核酸分子もまた本発明の範囲内である。かかる核酸は、同等のポリペプチドをコードするが、遺伝コードにおける縮重に起因して配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４の配列と、配列が異なる。例えば、種バリエーション、すなわち異なる種間で天然に存在するヌクレオチド配列のバリエーションが意図される。
【００６３】
変異は、当業者に既知の方法を用いて、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ核酸分子に導入されてもよい。ある実施形態では、Ｃ２変異体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発により調製される。部位特異的変異誘発又は非ランダム変異誘発を実施するための技法は、当該技術分野で既知であり、オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発(Adellman et al., (1983) DNA, 2: 183)、カセット変異誘発(Wells et al. (1985) Gene
344:315)及び結合変異誘発(Ladner et al ＷＯ８８／０６６３０号)が挙げられるが、こ
れらに限定されない。タンパク質の部位特異的改変に関するプロトコルは、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，９３２，４１９号、同第５，７８９，１６６号、同第５，７０５，４７９号、同第５，６３５，４７５号、同第５，５５６，７４７号、同第５，３５４，６７０号、同第５，３５２，７７９号、同第５，２８４，７６０号及び同第５，０７１，７４３号を参照）。さらに、部位特異的変異誘発用のキットが市販されている（BD Biosciences Clontechから入手可能な部位特異的変異誘発キットであるＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ（商標）、Bio-Radから入手可能なＭｕｔａＧｅｎｅファージミドｉｎ
ｖｉｔｒｏ変異誘発キット、及びStratagene（登録商標）からのＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的変異誘発キットを参照）。
【００６４】
一実施形態では、置換アミノ酸残基（例えばセリン、又は特定の実施形態では、システイン又はセリン以外の任意のアミノ酸）は、ポリメラーゼ連鎖反応技法を用いたオリゴヌクレオチド媒介性変異誘発により、選択した位置（例えば、システイン２１７）へ導入される。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴをコードする核酸分子は、便宜上、或いは望ましい場合に、当業者が選ぶことのできる適切なプラスミドにより保有される。プラスミドの例としては、ｐＢＲ，ｐＵＣ、ｐＵＢ、ｐＥＴ、ｐＴＲｉＥｘ、ｐＦＬＡＧ又はｐＨＹ４シリーズが挙げられる。
【００６５】
部位特異的変異誘発に関して、選択した変異部位を含有するフラグメントは、ネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴをコードする遺伝子から制限エンドヌクレアーゼにより切断され得る。フラグメントは、修飾（modified)ＰＣＲ技法における鋳型として使用される(Higushi et al. (1988) Nucleic Acid Res., 16: 7351-7367)。所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドは、５’と３’ＰＣＲフランキングプライマー間の鎖伸長を開始させるためのミスマッチプライマーとして使用される。概して、手順は、ミスマッチプライマー及び５’プライマーを用いて、所望の塩基置換（例えば、Ｃｙｓ２１７をＳｅｒへ）を含有するＤＮＡフラグメントを生成することを包含する。ＤＮＡフラグメントは、電気泳動によりプライマーから分離されて、所望の塩基置換を含有する完全フラグメントを生成するための３’プライマーを用いた第２のＰＣＲ反応における新たな５’プライマーとして使用される。変異は、配列決定により確認され、本来のフラグメントの位置へと挿入し戻される。
【００６６】
本発明の特定の実施形態では、Ｃ２変異体は、Bauer他に対する米国特許第５，７８９，１６６号、同第５，９３２，４１９号及び同第６，３９１，５４８号に記載される部位特異的変異誘発技法を用いて生産される。
【００６７】
２個以上の変異をコア２ ＧｌｃＮＡｃＴへ導入することができ、好ましくは本明細書中に記載するＣ２変異体の特性を保持する。例えば、変異（例えば、付加、置換及び／又は欠失）は、システイン２１７に加えて他の位置で導入することができ、変異は、新たな制限部位を創出することができ、コドン優先を変化させることができ、或いはスプライス改変体を生産することができる。ある実施形態では、マウスＣ２変異体は必要に応じて、システイン２３５で第２のアミノ酸置換を包含し得る。別の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸が欠失される。
【００６８】
本発明の核酸分子は、標準的な技法を用いて化学的合成されてもよい。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する方法は既知であり、固相合成（これは、ペプチド合成のように、市販のＤＮＡ合成機で完全に自動化されている）（例えば、Itakura et al., 米国特許第４，５９８，０４９号、Caruthers et al. 米国特許第４，４５８，０６６号並びにItakura 米国特許第４，４０１，７９６号及び同第４，３７３，０７１号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
Ｃ２変異体ポリペプチド
ある態様では、本発明の単離されたコア２変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの触媒活性を維持しながら、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと比較して増大した安定性をもたらすアミノ酸置換又は欠失を伴うコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの配列を含む。
【００７０】
一態様では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位に対応する本来のシステイン残基は、アミノ酸残基置換により置き換えられるか、或いは欠失される。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのシステイン２１７の変更が、触媒活性の保持と共に酵素の安定性を増大させることを見出した。
【００７１】
特定の実施形態では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドの２１７位に対応するシステインは、アミノ酸配列ＷＸＹＸＩＮＸＣＧＸＤＦＰ（配列番号２５）中で同定することができ、ここでＸは、任意のアミノ酸残基であり、システインは、アミノ酸配列の８番目の位置にある。システイン残基は、本明細書中で記載されるように置き換えられるか、又は欠失される。したがって、本発明は、アミノ酸配列ＷＸ１ＹＸ２ＩＮＸ３Ｘ４ＧＸ５ＤＦＰ（配列番号３１）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ５はそれぞれ独立して、任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４は、システイン以外の任意の残基、或いは特定の実施形態では、システイン又はセリン以外の任意の残基である）を含む単離されたコア２
ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ２は、イソロイシン、バリン又はロイシンであり、Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン又はバリンであり、Ｘ４は、セリン又はアラニンであり、Ｘ５は、イソロイシン、バリン又はメチオニンである。
【００７２】
さらなる実施形態では、単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドは、アミノ酸配列ＷＫＹＬＩＮＬＸ４ＧＭＤＦＰ（配列番号３２）を含む。特定の実施形態では、Ｘ４は、セリン又はアラニンである。特定の実施形態では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドは、ヒト又はマウスポリペプチドである。
【００７３】
ある実施形態では、本来のアミノ酸２１７位に対応するシステイン残基は、セリン残基で置き換えられる。別の実施形態では、本来のアミノ酸２１７位に対応するシステイン残基は、アラニン残基で置き換えられる。
【００７４】
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｃ２変異体ポリペプチドは、配列番号９、１１、１７又は１９のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアイソフォームを意図する。アイソフォームは、本発明のポリペプチドと同じ又は異なる数及び種類のアミノ酸を含有するが、アイソフォームは、異なる分子構造を有してもよい。本発明により意図されるアイソフォームは好ましくは、Ｃ２変異体ポリペプチドと同じ特性（例えば、類似したコア２機能及び特異性及び／又は酸化的不活性化若しくはチオール反応性試薬に対する非感受性）を有する。例えば、アイソフォームは、本発明のポリペプチドと比較して異なるグリコシル化パターンを有してもよい。
【００７６】
本発明はまた、融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドを生産するように、選択したポリペプチド又はマーカーポリペプチド（以下を参照）又は他のグリコシルトランスフェラーゼと結合させたＣ２変異体ポリペプチドを包含する。
【００７７】
Ｃ２変異体ポリペプチドは、組換えＤＮＡ方法を用いて調製してもよい。したがって、Ｃ２変異体ポリペプチドをコードする配列を有する本発明の核酸は、ポリペプチドの良好
な発現を確実にする適切なベクターへ、既知の様式で組み込まれ得る。考え得る発現ベクターとしては、ベクターが、使用する宿主細胞と適合性である限りは、コスミド、プラスミド、ファージ又は改変ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明はまた、本発明の核酸分子、並びに挿入されるポリペプチド配列の転写及び翻訳に必須の調節配列を含有する本発明のベクターを意図する。適切な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類又は昆虫遺伝子を含む様々な供給源に由来し得る（例えば、Goeddel (1990) Gene Expression Tehcnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAに記載される調節配列を参照）。適切な調節配列の選択は、以下に論述するように、選択される宿主細胞に依存し、当業者により容易に達成され得る。必須の調節配列は、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ及び／又はそのフランキング領域により供給され得る。
【００７９】
本発明のベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易とするマーカー遺伝子を含有してもよい。マーカー遺伝子の例は、ある特定の薬物、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、又は免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分）に対する耐性を付与するＧ４１８及びハイグロマイシンのようなポリペプチドをコードする遺伝子である。マーカーは、所定の核酸とは別個のベクター上で導入され得る。
【００８０】
ベクターはまた、組換えポリペプチドの増大された発現、組換えポリペプチドの増大された溶解性、及び親和性精製においてリガンドとして作用することにより標的組換えポリペプチドの精製の助長を提供する融合部分をコードする遺伝子を含有してもよい。例えば、タンパク質分解性切断部位を標的組換えポリペプチドへ付加して、融合ポリペプチドの精製に続いて融合部分から組換えポリペプチドの分離を可能としてもよい。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ(Amrad Corp., Melbourne, Australia)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, MA)、ｐＦＬＡＧ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、及びｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)（これらはそれぞれ、組換えポリペプチドにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを融合する）が挙げられる。利用され得る別の発現ベクター系は、ｐＴｒｉＥＸ（商標）システム(Novagen, Madison, WI)である。
【００８１】
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｃ２変異体ポリペプチド融合構築物は、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を生産してもよい。「トランスフェクトされた」及び「トランスフェクション」という用語は、多くの標準的な技法の１つによる細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含する。細胞は、トランスフェクトされた核酸が表現型の変化をもたらす場合に、核酸により「形質転換」される。原核生物細胞は、例えばエレクトロポレーション又は塩化カルシウム媒介性形質転換により、核酸でトランスフェクト又は形質転換され得る。核酸は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションのような従来の技法により、哺乳類細胞へ導入され得る。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press及び他の研究室テキストに見出すことができる。
【００８３】
適切な宿主細胞としては、広範囲の原核生物及び真核生物宿主細胞が挙げられる。例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用して）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び植物又は動物細胞（特に、哺乳類細胞）中で発現させてもよい。他の適切な宿主細胞は、Goeddel (1991) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAに見出すことができる。外因性遺伝物質を宿主細胞へ導入する方法は、当業者に既知である。
【００８４】
本発明のＣ２変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、選択した宿主細胞におけるポリペプチドの発現に好ましいコドン、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断の部位、及び／又は容易に発現されるベクターの構築を容易とするさらなる開始、終結又は中間配列の提供を包含してもよい。
【００８５】
挿入される核酸配列の発現を調節するか、又は所望の様式でポリペプチドを修飾及び切断する宿主細胞もまた選択され得る。ポリペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾に特異的且つ特徴的なメカニズムを有する宿主系又は細胞系が選択されてもよい。例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨＬ６０、Ａ４３１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３及びＷＩ３８を含む真核宿主細胞が使用され得る。ポリペプチドの長期間高収率の安定な発現のために、遺伝子産物を安定に発現する細胞系及び宿主系を操作してもよい。
【００８６】
宿主細胞、特に本明細書中に記載する方法を用いて生産される細胞系は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節する物質及び化合物をスクリーニング並びに評価するのに特に有用であり得る。
【００８７】
Ｃ２変異体ポリペプチドはまた、固相合成(Merrifield (1964) J. Am. Chem. Assoc., 85: 2149-2154)又は均質溶液(homogenous solution)中での合成(Houbenweyl (1987) Methods of Organic Chemistry, ed E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart)のようなポリペプチドの化学において既知の技法を用いて化学的合成により調製されてもよい。
【００８８】
ポリペプチドのような他の分子（例えば、マーカー又は他のグリコシルトランスフェラーゼ）と結合させた、本発明のＣ２変異体ポリペプチドを含むＮ末端若しくはＣ末端融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドは、組換え技法により、Ｃ２変異体ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端、及び所望の生物学的機能を有する選択したポリペプチド又はマーカーポリペプチドの配列を融合させることにより調製され得る。得られた融合ポリペプチドは、本明細書中に記載するように、選択したポリペプチド又はマーカーポリペプチドに融合させたＣ２変異体ポリペプチドを含有する。融合ポリペプチドを調製するのに使用され得るペプチド又はポリペプチドの例としては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、ＨＩ、赤血球凝集素（ＨＡ）、Ｓ・タグ、ＦＬＡＧ、β−ガラクトシダーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、ＧＡＬ、ＨＳＰ、ＬａｃＺ、ＩｇＧ、Ｈｉｓ−タグ、アビジン及び短縮型ｍｙｃ、又はそれらの一部が挙げられる。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有する。本明細書中に記載するように調製されるＣ２変異体ポリペプチドは、ＨＰＬＣに基づく方法(Koenderman et al. (1987) FEBS Lett. 222:42)、疎水性アグリコンに結合させた合成オリゴ糖受容体を用いる方法（Palcic et al. (1988) Glycoconjugate 5:49、及びPierce et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 146:679）又は本明細書中に記載する酵素アッセイ方法を用いて確認され得る。
【００９０】
抗体
本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な抗体を調製するのに使用することができる。本発明のＣ２変異体ポリペプチドに関する特異性を有する抗体はまた、本明細書中に記載するように宿主細胞において融合ポリペプチドを発現させることにより創出される融合ポリペプチドから惹起され得る。
【００９１】
本発明の抗体は、無傷モノクローナル又はポリクローナル抗体、及び免疫学的に活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２フラグメント）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、ヒト抗体、遺伝子操作した単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ分子）（Ladner et al., 米国特許第４，９４６，７７８号）、或いはキメラ抗体（例えば、マウス抗体の結合特異性を含有するが、残りの部分がヒト起源である抗体）を包含する。モノクローナル及びポリクローナル抗体、フラグメント並びにキメラを含む抗体は、当業者に既知の方法を用いて調製され得る。
【００９２】
例示的適用
本発明の核酸分子、Ｃ２変異体ポリペプチド及び抗体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性を調節する（例えば、アップレギュレートする、ダウンレギュレートする等）物質又は化合物の同定方法において使用され得る。同定された物質及び化合物は、コア２
ＧｌｃＮＡｃＴの調節を要する状態の処置に使用され得る。
【００９３】
物質／化合物を同定又は評価する方法
本明細書に記載する方法は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現若しくは活性を妨害するか又は増強する物質を含むコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現又は生物学的活性を調節する物質及び化合物を同定するように設計される。
【００９４】
本発明の方法を用いて同定される物質及び化合物としては、Ｉｇテールの(tailed)融合ペプチドを含む可溶性ペプチドのようなペプチド、ランダムペプチドライブラリー並びにＤ及び／又はＬ立体配置アミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバー、ホスホペプチド（ランダム又は部分的に縮重した方向付けられたホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む）、抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、単鎖抗体、フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２）及びＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、並びにそれらのエピトープ結合フラグメント）、ポリペプチド、核酸、炭水化物及び小有機又は無機分子が挙げられるが、これらに限定されない。物質又は化合物は、内因性の生理学的化合物であり得るか、或いは物質又は化合物は、天然又は合成化合物であり得る。
【００９５】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現若しくは生物学的活性を調節する物質又は化合物は、様々な実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することができる。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドの活性の量を増大させるか、或いはポリペプチドの活性の持続時間を延長させる分子を指す。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドの活性の量、或いはポリペプチドの活性の持続時間を減少させる分子を指す。アゴニスト及びアンタゴニストは、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質、核酸、炭水化物、小有機分子又は任意の他の分子を包含し得る。
【００９６】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴを調節する物質は、本発明のＣ２変異体ポリペプチドの活性を妨害するか、或いは本発明のＣ２変異体ポリペプチドの活性を増強するそれらの能力に基づいて同定することができる。本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、アゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために、野生型コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼを利用した任意の既知のアッセイ系で使用され得る。
【００９７】
ある態様では、本発明は、試験物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその
能力に関して評価する方法であって、（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ受容体及び糖供与体を、上記試験物質の存在下で本発明の変異体ポリペプチドと接触させること、及び（ｂ）工程（ａ）における受容体へ転移した糖供与体の量を、上記試験物質の非存在下で受容体へ転移した糖供与体の量と比較することを含む方法を提供する。
【００９８】
別の態様では、本発明は、物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその能力に関して評価する方法であって、（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴに対する受容体及び糖供与体及び本発明のＣ２変異体ポリペプチドを、上記試験物質の存在下で接触させること、（ｂ）受容体へ転移した糖供与体の量を測定すること、及び（ｃ）上記物質が、上記Ｃ２変異体ポリペプチドによる上記受容体への上記糖供与体の転移を妨害するか、或いは増強するかどうかを決定するために、上記試験物質の非存在下で工程（ａ）及び工程（ｂ）を実施することを含む方法を提供する。
【００９９】
本発明の方法で使用するのに適した受容体としては、還元末端にリンカーを伴う合成的であるか、或いは天然に存在する構造である糖、オリゴ糖、多糖、糖ペプチド、糖ポリペプチド又は糖脂質（例えば、アシアロ−アガラクト−フェチュイン糖ペプチド及びアシアロムチン）が挙げられるが、これらに限定されない。受容体は概して、β−Ｄ−ガラクトシル−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−を含む。
【０１００】
適切な糖供与体としては、ヌクレオチド糖、ドリコール−リン酸−糖又はドリコール−ピロリン酸−オリゴ糖（例えば、ウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ））或いはそれらの誘導体若しくはアナログが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
受容体又は糖供与体は、本明細書中に記載するように検出可能な物質で標識されてもよく、受容体及び糖供与体との本発明のＣ２変異体ポリペプチドの相互作用は、検出可能な変化を生じる。検出可能な変化は、比色的、光度測定的、放射測定的、電位差測定的等であり得る。
【０１０２】
受容体は、キャリア（例えば、固相キャリア）又は支持体に直接的又は間接的にカップリングさせてもよい。
【０１０３】
特定の実施形態では、コア２変異体ポリペプチドを、ポリペプチドが糖供与体を受容体へ転移させるのに有効なｐＨ及び温度で、受容体及び糖供与体と反応させて、ここで反応の生成物が検出される。受容体又は供与体の一方を標識して、検出可能な変化を生じてもよく、或いは反応の生成物を、容易に測定される二次生成物に変換してもよい。ポリペプチドに有効なｐＨ範囲内にｐＨを維持するように、受容体及び糖供与体とともに緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液、受容体及び糖供与体は、アッセイ組成物として使用され得る。ＥＤＴＡ及び洗浄剤のような他の化合物をアッセイ化合物に添加してもよい。
【０１０４】
本発明のコア２変異体ポリペプチドは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのモジュレーターを評価するためのハイスループット方法で使用され得る。例えば、Ｃ２変異体ポリペプチドは、ＰＣＴ／ＣＡ９９／００５５０号（ＷＯ９９／６４３７８号）に記載されるハイスループットスクリーニング技法で使用され得るか、或いはＣ２変異体ポリペプチドは、放射測定的又は発光測定的アッセイで使用され得る。
【０１０５】
例として、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ酵素用の炭水化物受容体をポリマーへカップリングさせること、及びキャリア又は支持体上へコーティングすること、Ｃ２変異体ポリペプチド、検出可能な物質で標識した糖ヌクレオチド供与体及び試験化合物が添加され、検出可能な物質により生じる検出可能な変化が測
定されることを含む固相バイオアッセイが提供される。
【０１０６】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ酵素用の炭水化物受容体をポリマーへカップリングさせる工程、及びそれをキャリア又は支持体上へコーティングする工程、（ｂ）本発明のＣ２変異体ポリペプチド、検出可能な物質で標識した糖ヌクレオチド供与体、及び試験化合物を添加する工程、及び（ｃ）上記検出可能な物質により生じる検出可能な変化を検出する工程を含む固相バイオアッセイを提供する。
【０１０７】
受容体がカップリングされ得るポリマーの例としては、ポリアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されない。キャリア又は支持体は、例えば、ニトロセルロース、或いはガラス、斑れい岩又は磁鉄鉱であり得る。支持体材料は、球状（例えば、ビーズ）、円筒状（例えば、試験管又はウェルの内部表面、或いはロッドの外部表面）、又は平面状（例えば、シート、試験片）を含む任意の可能な形状を有し得る。
【０１０８】
検出可能な物質の例としては、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体、量子ドット等）、発光標識（例えば、ルミノール）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエストラーゼ）及びビオチニル基（これは、印を付けたアビジン（例えば、光学的又は熱量測定方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出され得る）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、検出可能な物質は、放射性材料、最も好ましくはトリチウムである。
【０１０９】
本発明のある態様では、アッセイは、炭水化物受容体をポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）へカップリングさせること、及び９６ウェルプラスチックプレートの表面のようなキャリア上へコーティングすることを包含する。コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ反応は、Ｃ２変異体ポリペプチド及びトリチウム化した糖−ヌクレオチド供与体を用いて実施され、続いて洗浄、シンチレーションカウント用液体の添加、及びβ−カウンターによる放射能の測定を行う。
【０１１０】
コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼを調節する化合物を評価する本発明の方法を適用させるのに適した試薬は、適切な容器にパッケージングされた必要な材料を提供する利便性の高いキットへパッケージングされ得る。キットはまた、本発明の方法を実施するのに有用な適切な支持体を包含してもよい。
【０１１１】
キットを用いて、本明細書中に記載するスクリーニング方法を実施してもよい。一実施形態では、キットは、本発明のＣ２変異体ポリペプチド及びコア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼに対する基質を含む。基質は代表的には、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼに対する受容体及び糖供与体を包含する。
【０１１２】
特定の実施形態では、キットは、ハイスループット方法を用いて、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼのモジュレーターの検出及び同定に使用される。例えば、キットは、ＰＣＴ／ＣＡ９９／００５５０号（ＷＯ９９／６４３７８号）に記載されるハイスループット方法で使用することができる。
【０１１３】
組成物及び治療
本明細書中に記載する方法により同定される物質又は化合物、並びに本発明の抗体は、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼの生物学的活性を
調節するのに使用されてもよく、それらは、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼにより媒介される状態の治療に使用されてもよい。特に、これらは、炎症性障害及び癌を含む多数の障害に関連した細胞接着を調節するのに使用され得る。
【０１１４】
「炎症性」という用語は、特異的及び非特異的防御系の両方の反応を指す。特異的防御系反応は、抗原に対する特異的免疫系反応である。これらの反応の例としては、ウイルスのような抗原に対する抗体応答、及び遅延型過敏症が挙げられる。非特異的防御系反応は、概して免疫学的記憶が不可能な白血球（マクロファージ、好酸球及び好中球を含む）により媒介される炎症性応答である。非特異的な反応の例としては、蜂に刺された後の即時の腫大及び細菌感染の部位での末梢単核白血球の収集（細菌性肺炎における肺の浸潤及び膿瘍における膿形成）が挙げられる。
【０１１５】
治療可能な障害としては、慢性関節リウマチ、虚血後白血球媒介性組織損傷（再灌流障害）、凍傷障害又はショック、急性白血病媒介性肺障害（例えば、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ））、喘息、外傷性ショック、敗血症性ショック、腎炎、並びに急性及び慢性炎症（アトピー性皮膚炎、乾癬、異常炎症に関連した神経毒性及び炎症性腸疾患を含む）が挙げられる。様々な血小板媒介性病状（例えば、アテローム性動脈硬化症及び血餅形成）もまた治療することができる。物質及び化合物は、血栓障害に伴う組織損傷を最低限に抑えるのに有用であり得る。例えば、物質、化合物、抗体等は、発作、心筋梗塞、深静脈血栓症、肺塞栓症等を最近経験した個体において、或いはプレ血栓溶解療法において治療上有用であり得る。コア２トランスフェラーゼの阻害剤は、血管新生並びに炎症を起こした組織への白血球接着及び侵入を低減させるのに有用であり得る。
【０１１６】
物質、化合物又は抗体を用いて、敗血症性ショック又は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の二次的影響（例えば、病理学的組織崩壊及び／又は広範囲に及ぶ微小循環(microcirculatory)血栓及びびまん性炎症）を治療してもよい。本明細書中の物質、化合物及び抗体は、白血球遊出を阻害し、且つ組織損傷を軽減し得る。
【０１１７】
物質、化合物又は抗体はまた、外傷性ショック及び関連した急性組織障害を治療するのに有用であり得る。阻害性の物質、化合物及び抗体は、障害に関連した組織損傷を制御するように、局所的又は全身的に投与され得る。
【０１１８】
本明細書中に記載する方法により同定される物質及び化合物、並びに抗体は、腫瘍の予防及び治療に有用であり得る。腫瘍転移は、循環癌細胞の接着を阻害することにより阻害又は防止され得る。本発明の物質、化合物及び抗体は、白血病、リンパ腫、黒色腫、腺腫、肉腫及び患者における固形組織の癌腫のような様々な形態の新形成の治療に特に有用であり得る。特に、組成物は、悪性黒色腫、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓、腎臓、胃、肺、直腸、胸部、腸、胃、甲状腺、くび、頸部、唾液腺、胆管、骨盤、縦隔、尿道、気管支原性、膀胱、食道及び結腸の癌、並びにカポージ肉腫を治療するのに使用され得る。
【０１１９】
本明細書中に記載する方法により同定される物質及び化合物、並びに本発明の抗体は、心臓血管障害の予防及び治療に使用され得る。かかる障害としては、動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症及び非アテローム動脈硬化症を含む）、高血圧、発作、冠動脈疾患、虚血、心筋梗塞、狭心症、心不整脈、洞房結節ブロック、房室結節ブロック、慢性血行力学的荷負荷及び動脈瘤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書中に記載する方法により同定される物質又は化合物、及び本発明の抗体を用いて予防又は治療され得る肝臓障害としては、慢性肝炎、肝臓癌、肝硬変、嚢胞性肝疾患、ジルベール症候群、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎、及び肝臓に対する毒性傷害が挙げ
られる。
【０１２１】
本明細書中に記載する方法により同定される物質又は化合物、並びに本発明の抗体を用いて治療可能な他の状態は、増殖性障害（例えば、微生物又は寄生虫感染）、糖尿病、骨格筋障害、心筋症及び腎臓障害（例えば、多嚢胞腎疾患、糸球体腎炎）である。これらはまた、ヴィスコット−オールドリッチ症候群又はＡＩＤＳに起因するＴ細胞活性化及び免疫不全を調節するのに、或いは造血前駆細胞成長を刺激して、且つ／又は被験体における化学療法及び放射線療法に対する保護を付与するのに使用され得る。
【０１２２】
したがって、物質、抗体及び化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した生物学的に適合性の形態で被験体へ投与するための薬学的組成物中に処方され得る。「ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した生物学的に適合性の形態」とは、治療上の効果が任意の毒性の影響よりも上回る投与されるべき物質の形態を意味する。物質は、ヒト及び動物を含む生存生物へ投与することができる。治療的に活性な量の本発明の薬学的組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投与量で且つ期間、有効な量として定義される。例えば、物質の治療的に活性な量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに抗体の、個体における所望の応答を誘発する能力のような要因に依存して変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療的応答を提供するように調節することができる。例えば、幾つかに分割した用量を毎日投与してもよく、或いは用量は、治療状況の緊急性に示されるように比例して低減させてもよい。
【０１２３】
活性物質は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮塗布、又は直腸投与によるような利便性のよい様式で投与され得る。投与の経路に応じて、活性物質は、酵素、酸及び化合物を不活性化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料中にコーティングされ得る。
【０１２４】
本明細書中に記載する組成物は、有効量の活性物質が薬学的に許容可能な賦形剤と混合して組み合わせられるように、被験体へ投与され得る薬学的に許容可能な組成物の調製に関するそれ自体既知の方法により調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)に記載されている。これに基づいて、組成物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤又は希釈剤と関連させ、適切なｐＨを有する緩衝溶液中に含有させ、及びある特定の実施形態では、生理学的液体と等浸透圧の物質又は化合物の溶液を包含する（しかし、これに限らない）。
【０１２５】
薬学的組成物を調製した後、薬学的組成物は、適切な容器に入れて、示される状態の治療に関してラベルを付すことができる。コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼのモジュレーター（例えば、阻害剤）の投与に関して、かかるラベリングは、投与の量、頻度及び方法を包含し得る。
【０１２６】
化合物、物質及び抗体の治療上の有効性並びに毒性は、細胞培養においてか、又は実験動物を用いた標準的な薬学的手順により、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）又はＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）統計データを算出することにより決定され得る。治療指数は、毒性の影響に対する治療上の効果の用量比であり、それは、ＥＤ５０／ＬＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。
【０１２７】
オリゴ糖を調製する方法
本発明はまた、オリゴ糖を調製する方法であって、本発明のＣ２変異体ポリペプチドの存在下で活性化ＧｌｃＮＡｃ及び受容体を含む反応混合物を接触させることを含む方法を
提供する。
【０１２８】
オリゴ糖を調製する方法で使用するための受容体の例は、還元末端にリンカーを伴う合成的であるか、或いは天然に存在する構造である糖、オリゴ糖、多糖、糖ペプチド、糖ポリペプチド又は糖脂質（例えば、アシアロ−アガラクト−フェチュイン糖ペプチド又はアシアロムチン）である。活性化ＧｌｃＮＡｃは、ヌクレオチド−糖、ドリコール−リン酸−糖又はドリコール−ピロリン酸−オリゴ糖の一部であり得る。
【０１２９】
本発明のある実施形態では、オリゴ糖は、哺乳類、特にヒトに対して無毒性であるキャリア、例えば脂質イソプレノイド又はポリイソプレノイドアルコール上で調製される。適切なキャリアの例は、ドリコールリン酸塩である。オリゴ糖は、液体キャリアからのオリゴ糖の化学的除去を可能にする不安的な結合を介してキャリアへ結合されてもよい。代替法では、Ｃ２変異体ポリペプチドは、オリゴ糖を液体キャリアからポリペプチドへ転移させるのに使用され得る。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、説明するのに提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【０１３１】
［実施例１］
部位特異的変異誘発によるＣ２変異体の調製
Ｓタグ標識したヒト野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１構築物（配列番号２９）由来及びＦＬＡＧタグ標識したマウス野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１構築物（配列番号３０）由来の二本鎖プラスミドＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（登録商標）プラスミドｍｉｄｉプラスミドプレップシステムを用いて単離した。２１７位でのヒト又はマウスコア２システインは、Stratagene（登録商標）からのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キットを用いて、製造業者の指示書に従って、セリン又はアラニンのいずれかに変異させた。変異させた構築物はそれぞれ、各変異体並びに野生型配列の残りを確認するために、配列決定に送付した。変異させた構築物それぞれに関するプラスミド調製を実施した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）を用いて、製造業者の指示書に従って、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ又はＣＨＯ−Ｓ細胞系への一過性トランスフェクションに使用した。
【０１３２】
ヒト及びマウスコア２変異体の調製の詳細を以下に記載する。
【０１３３】
ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体
ＧをＣヌクレオチドで置き換えて、２１７位のシステインがセリンアミノ酸へ変異されたタンパク質を生成するように、ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡ（改変ｐＴｒｉＥＸ−４ベクターへサブクローニングさせた）をヌクレオチドレベルで変異させた。これらの実験は、StratageneからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットの指示書に従って実施した。ベクター（ＨＣ２Ｌｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）(Invitrogen)を用いて、製造業者の指示書に従って、ＣＯＳ−７へ一過的にトランスフェクトした。ＣＯＳ−７細胞を、トランスフェクションの前日にＴ７５ｃｍ２フラスコへ１／８〜１／１０希釈に分割した。確実に細胞が８０〜９０％コンフルエントとなり、且つトランスフェクションの当日に効率的な細胞付着が存在するように、細胞を３７℃で、５％ＣＯ２中で少なくとも１６時間、Ｄ−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。トランスフェクション前に、培地をＤ−ＭＥＭ ２０ｍｌ、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンで取り替えた。２つの溶液は、トランスフェクション用に調製し、それにより第１の溶液（溶液Ａ）は、ＯＰＴＩ培地（商標）(GIBCO, BRL)２．５ｍｌに添加されているｐＴＲＩ−ＥＸ（商標）(N
ovagen)Ｎ−末端Ｓタグ標識した野生型又は変異体（Ｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡのいずれか３２．２５μｇから構成された。第２の溶液（溶液Ｂ）は、ＯＰＴＩ培地（商標）(GIBCO/BRL)２．５ｍｌと混合したＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（商標）(Invitrogen)６２．４６μｌを含有する。溶液Ｂを室温で５分間静置させた後、２つの溶液を一緒に混合した。混合した溶液Ａ及びＢを室温で２０分間インキュベートした後、それらをＣＯＳ−７細胞に添加した。続いて、ＣＯＳ−７細胞／Ｔ７５ｃｍ２フラスコを、３７℃で５％ＣＯ２中で少なくとも４８時間インキュベートした。
【０１３４】
トランスフェクションの４８時間後、培地を収集して、ＣＯＳ−７トランスフェクト細胞を細胞スクラッパーで回収して、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１活性を決定した。これに続いて、ウェスタンブロット分析を行った。掻きだした細胞をエッペンドルフチューブに移して、１×ＰＢＳを用いた３回の洗浄工程の間に低速（６００×ｇ）でスピンした。続いて、細胞を０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．１％トリトンＸ−１００中に溶解させて、本明細書中に記載する標準的なコア２アッセイを用いて、５μｌをコア２
ＧｌｃＮＡｃＴ１活性に関してアッセイした。同様に、培地もまた低速（６００×ｇ）でスピンさせて、死細胞片を取り出した。
【０１３５】
トランスフェクトした培地１ミリリットルを１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）緩衝液（商標）(Novagen)２ｍｌ及びＳ−タンパク質（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム中の５０％スラリー）アガロース（商標）(Novagen)１ｍｌと混合した。混合物を穏やかに振とうしながら室温でインキュベートして、Ｎ末端Ｓタグ標識した野生型又は変異体（Ｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１とＳ−タンパク質アガロースとの間の効率的な結合を確実にした。混合物を、１×１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)１０ｍｌを用いた３回の洗浄工程の間に低速（５００×ｇ）でスピンした。Ｓ−プロテインアガロースを１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)５００μｌ中に再懸濁させて、２５μｌをウェスタンブロット分析に供した。
【０１３６】
Ｓ−タンパク質アガロース／コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１懸濁液およそ２００μｌを透明なエッペンドルフチューブへ分離して、ビオチン化トロンビン（商標）(Novagen)を利用して、トロンビン反応を設定した。最適条件は、振とう機上で室温で最大２時間インキュベートしたビオチン化トロンビン（商標）(Novagen)２．５ユニット／３μｌ（１×ストック濃度、０．８３ユニット／μｌ）であることを予め決定した。２時間のインキュベート後、反応混合物を低速（５００×ｇ）で５分間スピンさせて、上清（溶出液）を透明なチューブに移した。低速（５００×ｇ）でスピンしている間にペレットを１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)４００μｌで２回洗浄して、洗浄液すべてを溶出液に添加した。ビオチン化トロンビン（商標）(Novagen)の除去は、ストレプトアビジン（リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０２％アジ化ナトリウム中の５０％スラリー）アガロース（商標）(Novagen)２００μｌを、プールした上清へ添加することにより達成して、１０分間振とうしながら室温でインキュベートした。ストレプトアビジンアガロース（商標）(Novagen)を、低速（５００ｇ×ｇ）で懸濁液をスピンさせることにより除去した後、上清を２ｍｌのエッペンドルフチューブへ移した。ペレット／ストレプトアビジンアガロース（商標）(Novagen)は、低速（５００×ｇ）でスピンしている間に１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)２００μｌで２回洗浄して、再び上清はすべて、同じ２ｍｌのエッペンドルフチューブに一緒にプールした。野生型及び変異体（Ｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１酵素の両方の特徴化分析を行った。
【０１３７】
マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体
マウスコア２ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を、ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ挿入部位でｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクター(Sigma, St.Louis, MO, USA)へサブクローニングした。
【０１３８】
マウスＣ２１７Ｓ変異体をコードする核酸を生成するために、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターへサブクローニングしたマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を塩基対６５０で変異させた。Ｇヌクレオチドは、Stratagene(La Jolla, CA)からのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを用いて、セリン残基をコードするようにＣヌクレオチドで交換した。変異誘発性プライマーは、以下の配列：５’−ＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ（配列番号２６）を有していた。下線を付した配列は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ交換をコードする。
【０１３９】
マウスＣ２１７Ｔ変異体をコードする核酸を生成するために、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターへサブクローニングしたマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を塩基対６４９及び６５０で変異させた。Ｔ及びＧヌクレオチドは、StratageneからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを用いて、Ａ及びＣヌクレオチドで交換した。変異誘発性プライマーは、以下の配列：５’−ＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ（配列番号２７）を有していた。下線を付した配列は、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ交換をコードする。
【０１４０】
マウスＣ２１７Ａ変異体をコードする核酸を生成するために、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターへサブクローニングしたマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を塩基対６４９及び６５０で変異させた。Ｔ及びＧヌクレオチドは、StratageneからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを用いて、アラニン残基をコードするようにＧ及びＣヌクレオチドで交換した。変異誘発性プライマーは、以下の配列：５’−ＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ（配列番号２８）を有していた。下線を付した配列は、Ｃｙｓ−Ａｌａ交換をコードする。
【０１４１】
変異体構築物はそれぞれ、ＣＨＯ−Ｓ又はＣＯＳ−７細胞においてトランスフェクトして、発現させた。１０％ＦＢＳ及び０．１ｍＭ 非必須アミノ酸(Invitrogen, Burlington, CA)を含有するＤＭＥＭ培養培地(Invitrogen, Burlington, CA)とともに細胞をインキュベートして、確実に細胞がコンフルエントとなるようにした。トランスフェクションの１時間前に培養培地を交換して、細胞を活性化させた。同一容量の２つの溶液をトランスフェクション用に調製した。第１の溶液（溶液Ａ）は、７３０ｎｇ／ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（商標）(GIBCO, BRL)中のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３（商標）(Sigma)Ｎ−末端ＦＬＡＧタグ標識した野生型又は変異体（Ｃ２１７Ｓ）マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡのいずれかであった。第２の溶液（溶液Ｂ）は、１．３７μｌ／ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（商標）(GIBCO, BRL)中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）(Invitrogen)であった。溶液Ｂを室温で５分間インキュベートした後、溶液Ａと混合した。混合した溶液Ａ及びＢを室温で２０分間インキュベートした後、それらをＣＯＳ−７又はＣＨＯ−Ｓ細胞へ添加した。続いて、ＣＯＳ−７細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞を３７℃で５％ＣＯ２中で少なくとも２０時間インキュベートした。ＦＬＡＧタグ標識した野生型又は変異体（Ｃ２１７Ｓ）マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）の量は、トランスフェクションの規模に依存するが、ＦＬＡＧタグ標識した野生型又は変異体（Ｃ２１７Ｓ）マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡ ３２０ｎｇ〜６４０ｎｇに対するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）０．６μｌの比は維持した。
【０１４２】
細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄した後、培養培地をＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ(Invitrogen Burlington, CA)で交換した。細胞を２４時間インキュンベートして、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型又はＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチドを含有する無血清培養上清を収集した。ＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ上清を２４時間毎に収集して、細胞が、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型又はＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチドのそれらの生産性が損なわれるまで、新鮮なＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ培地を添加した。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１活性を、細胞培養上清中で同定し、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの存在は、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びペルオキシダーゼ結合抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体(Sigma)を用いたウェスタンブロットにより確認した。
【０１４３】
ＦＬＡＧタグ標識Ｃ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドを精製するために、無血清培養上清１Ｌ〜５Ｌを、ＣＨＯ−Ｓ細胞又はＣＯＳ−７細胞の大規模なトランスフェクションから収集した。収集した培養上清を２５ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ１親和性ビーズ(Sigma)に適用した。ビーズ及び上清を穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。続いて、ビーズ及び上清をカラムに移して、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）でビーズを洗浄した。カラムの流れを止めて、溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ツイーン２０）３５ｍｌをビーズに添加して、穏やかに混合しながら３０分間インキュベートして、ビーズから変異体ポリペプチドを脱離させた。ＦＬＡＧタグ標識した変異体ポリペプチドを含む溶出液を、カラムの流れを開放させることにより収集した。溶出手順を３回繰り返した。溶出液総計１０５ｍｌを収集した後、濃縮した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ８０(Millipore, Billerica, MA, USA)を用いて、溶媒を１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で取り替えた。
【０１４４】
ＦＬＡＧタグ標識Ｃ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの純度は、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)及びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ(Bio-Rad)の両方により９９％を超えると推定された。ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドは、４８ｋＤａで単一バンドとして移動した。ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドのタンパク質定量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて実施した。
【０１４５】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１活性は、実施例２及び実施例３の酵素アッセイにより確認された。特に、反応は、３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）、１．０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１．０μＣｉ ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、０．５ｍＭ Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び精製したＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチド０．５ｎｇを含有する溶液４０μｌ中で行った。反応液を３７℃で３０分間インキュベートして、水５００μｌの添加により停止させた。反応生成物Ｇａｌβ１−３（［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐを、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムを用いた固相抽出により未反応ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃから分離した。サンプルを、エタノールを用いてカラムから溶出させて、シンチレーション液体１０ｍｌに添加して、放射能（ＤＰＭ）を測定した。比活性は、１分間の反応当たり且つポリペプチド１ｍｇ当たりの反応生成物の量として算出した。
【０１４６】
最大１５．７マイクロモル／分／ｍｇの比活性を有する精製したＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドが得られた。比較用に、１ｍＭ
１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下でのＦＬＡＧタグ標識したマウス野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの比活性は、類似しており、９．２マイクロモ
ル／分／ｍｇであった。ＦＬＡＧタグ標識した野生型マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの精製は、細胞培養上清４０ｍｌを用いて、ＦＬＡＧタグ標識したマウスＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドに関して上述する方法に従った。ＦＬＡＧタグ標識したマウス野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの純度を図３Ａ及び図３Ｂに提供する。
【０１４７】
［実施例２］
ヒト及びマウス野生型並びに変異体コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチド
Ａ．ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型特性。
野生型ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の活性は、発現及び精製された組換え酵素の貯蔵に続く１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は他の還元剤の添加後に増大することが観察された。ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮ−エチルマレイミドは、野生型ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の阻害を引き起こす。重金属Ｈｇ２＋及びＺｎ２＋もまた、野生型ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害する。これらの結果は、野生型ヒト及びマウスコア２
ＧｌｃＮＡｃＴ１が、適正な酵素機能に必要である還元されたシステインアミノ酸残基を有することを示す。酸化、アルキル化又は重金属結合によるこの残基の遮断は、酵素の阻害を引き起こす。
【０１４８】
Ｂ．マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に対するスルフヒドリル試薬の影響
野生型及びＣ２１７Ｓのヒト並びにマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を、３０ｍＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．７）及び１．０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する水溶液中に溶解した。ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ＨｇＣｌ２及びＺｎＳＯ４を、図１及び図２に列挙した濃度で添加した。１．０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．５０ｍＭ Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐｎｐ、（３Ｈ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（０．５０μＣｉ）及び３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）も同様に添加した。溶液を３７℃で２時間インキュベートした。（３Ｈ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び（３Ｈ）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐｎｐを固相抽出により分離して、（３Ｈ）Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐｎｐのＤＰＭを液体シンチレーションによりカウントした。酵素を除くすべての構成成分を含有する溶液を調製して、バックグラウンドレベルを測定した。活性％は、以下の通りに算出した：（ＤＰＭ阻害剤−ＤＰＭバックグラウンド）／（ＤＰＭ対照−ＤＰＭバックグラウンド）×１００。アッセイはすべて、二重に行った。結果を図１及び図２にプロットしている。
【０１４９】
Ｃ２１７Ｓヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の活性は、比較的高濃度のチオール反応性試薬ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）により阻害されなかった。同様に、比較的高濃度のＨｇ２＋及びＺｎ２＋は、マウス酵素に影響を及ぼさなかったのに対して、ヒト酵素は、Ｈｇ２＋のみに対して非感受性であった。これらの結果は、チオール酸化、アルキル化又は幾つかの重金属結合は、Ｃ２１７Ｓヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１をもはや阻害しないことを示している。
【０１５０】
野生型及びＣ２１７Ｓのヒト並びにマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に対する抗チオール試薬の影響を示すデータを図１及び図２に示す。
【０１５１】
Ｃ．ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃ２１７Ｓ特性。
方法：
標準的な酵素アッセイ
野生型及び変異体（２１７Ｃｙｓ→Ｓｅｒ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に関する標準的な酵素アッセイを、アッセイ１回につき３０ｍＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．７）、１．０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（供与体基質）、１．０μＣｉ ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、０．５０ｍＭ（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（受容体基質、すなわちＡＳ）、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び１５〜２５μＵ（１ユニット＝１マイクロモル／分）の組換えコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１タンパク質を含有する溶液３０μｌ中で行った。反応は３７℃で２．０時間インキュベートして、水４６０μｌの添加により停止させた。反応は即座に進行しない場合には−２０℃で凍結させた。反応生成物Ｇａｌβ１，３［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（β１，６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐを、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムを用いた固相抽出により未反応ＵＤＰ−６［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃと分離した。サンプルを、エタノールを用いてカラムから溶出させて、シンチレーション液体１０ｍｌに添加して、放射能（ＤＰＭ）を測定した。
【０１５２】
動力学特徴化アッセイ
供与体基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度（Ｋｍ，ＤＳに関する）又はＡＳ濃度（Ｋｍ，ＡＳに関する）の滴定を除いて標準的なアッセイ条件を実行することにより、Ｋｍ値を決定した。標準的なアッセイ条件を実行すること、及び滴定した生成物を添加することにより、生成物ＵＤＰ及びＧｌｃＮＡｃ（β１−６）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関するＩＣ５０値を決定した。供与体及び受容体基質を同時に滴定することにより、メカニズムを決定した。
【０１５３】
結果：
野生型及びＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の動力学的比較
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１供与体基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して１．５ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して１．５ｍＭである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１受容体基質であるＧａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して０．１５ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して０．１３ｍＭである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｂｉ Ｂｉメカニズムを維持し、供与体基質に関するＫＤは、両方の酵素に関して０．１１ｍＭである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１生成物であるＵＤＰ及びＧａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関する阻害能力は、両方の酵素に関して同じである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを利用しない。ＤＴＴの存在下で野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害する化合物はまた、Ｃ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１も阻害する。ＤＴＴの存在下で野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害しない化合物は、Ｃ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害しない。
【０１５４】
ヒト野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の動力学的比較
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１供与体基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して１．２ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して１．１ｍＭである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１受容体基質であるＧａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して０．３４ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して０．３２ｍＭである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、同じ動力学的メカニズムを維持し、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１生成物であるＵＤＰ及びＧａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関する阻害能力は、両方の酵素に関して同じである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを利用しない。
【０１５５】
［実施例３］
スクリーニング方法
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから受容体基質Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−ｐニトロフェニルへの、３Ｈ放射標識したＧｌｃＮＡｃのグリコシル転移反応を触媒する。放射標識した生成物は、固相抽出により単離して、液体シンチレーションによりカウントされる。次に生成物形成の割合を算出する。試験化合物をコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ反応混合物に添加して、それらの阻害能力を決定する。グリコシル転移の割合を測定して、非阻害対照と比較して、対照活性％、すなわち「阻害率％」を得る。本発明の組換え変異体酵素を使用して、固有の阻害剤能力をアッセイする。
【０１５６】
特定のハイスループットプロトコルを以下に記載する。
【０１５７】
コア２受容体であるＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−ｐニトロフェニル（ＧＧＣＡＮ）のストック溶液は、水中に受容体を再懸濁させること、及び溶液を混合するようにボルテックスすることにより調製した。受容体溶液を−２０℃で貯蔵した。９６ウェルマイクロタイタープレート(MicroWell Plates, V-Bottom, Nalge Nunc)。組換えＣ２１７Ｓヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、本明細書中に記載するように調製した。
【０１５８】
酵素の阻害剤に関してスクリーニングするためのコア２トランスフェラーゼアッセイは、ウェル又はマイクロタイタープレート中での反応１回毎に組換えアッセイ混合物の添加を包含した。アッセイ混合物は、反応ウェルにつき試験化合物１０μｌ、３×アッセイ混合物（１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．７ ０．９ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ０．３ｍｌ、１００ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ０．３ｍｌ、１ｍＣｉ ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＧＧＮＡＮ ３ｍｌ及び水５．５ｍｌから構成されるストック溶液１０ｍｌとして作製される）１０μｌ、及び組換えＣ２１７Ｓヒト又はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１（１５〜２５μＵ［１ユニット＝１マイクロモル／分］）から構成されていた。プレートを攪拌しながら３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルに水２００μｌを添加することにより、反応を停止させた。生成物の単離を１時間以内に実施しない場合は、プレートを−２０℃で貯蔵した。
【０１５９】
生成物は、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ９６ウェルプレート(Waters)を用いて、製造業者の指示書に従って単離した。溶出は、エタノールを用いて行い、その後プレートを完全に乾燥させた後に、シンチレーション液体を用いて放射性生成物を再懸濁させた。溶出液における放射能は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘマイクロプレート液体シンチレーションカウンター(Wallac)を用いてカウントした。
【０１６０】
酵素活性（ｎｍｏｌ生成物／ｈｒ）は、以下の式を用いて決定した：
酵素活性＝ＤＰＭ−バックグラウンド／２．２２×１０６×３０ｎＭｏｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ／インキュベーション時間
阻害率％：（試験化合物の存在下での酵素活性／試験化合物の非存在下での酵素活性）×１００
【０１６１】
本発明は、本明細書中に記載する特定の実施形態により範囲が限定されない。というのは、かかる実施形態は、本発明の一態様の単なる一つの説明として意図されるものであり、任意の機能的に等価な実施形態が、本発明の範囲内であるためである。実際に、本明細書中に示し、且つ記載するもののほかに、本発明の様々な変更が、上述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。かかる修飾は、添付の特許請求の範囲の範疇にあると意図される。
【０１６２】
本明細書中で言及する刊行物、特許及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許又は特許出願それぞれが、その全体が参照により援用されるように具体的且つ個々に示されるのと同程度に、それらの全体が参照により援用される。本明細書中で言及する刊行物、特許
及び特許出願は、本発明と関連して使用され得るそれらの中で報告されている細胞系、ベクター、方法論等を記載及び開示する目的で、参照により本明細書中に援用される。本明細書中のいずれも、本発明は、先行発明によりかかる開示に先行する資格がないという承認として解釈されない。
【０１６３】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形"a","an"及び"the"は、文脈が明らかに別記しない限り、複数形の言及を包含することに留意されるべきである。したがって、例えば、「宿主細胞(a host cell)」に対する言及は、かかる複数のかかる宿主細胞を包含し、「抗体(the antibody)」に対する言及は、１つ又はそれ以上の抗体及び当業者に既知のそれらの等価物等に対する言及である。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
本発明は、以下の図面を参照してより理解されよう。
【図１】図１は、Ｃ２変異体マウスＣ２１７Ｓは、遊離チオール基を標的とする試薬により阻害されないことを示すグラフである。
【図２】図２は、Ｃ２変異体ヒトＣ２１７Ｓは、遊離チオール基を標的とする試薬により阻害されないことを示すグラフである。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより（図３Ａ）及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより（図３Ｂ）、ＦＬＡＧタグ標識した野生型マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１及びＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の小規模精製の分析を提供する。図３Ａ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：野生型マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清２０μＬ、レーン３：精製した野生マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド３μｇ、レーン４：Ｃ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清２０μＬ、レーン５：精製したＣ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド３μｇ。図３Ｂ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：野生型マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清１０μＬ、レーン３：精製した野生マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド０．１μＬ、レーン４：Ｃ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清１０μＬ、レーン５：精製したＣ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド０．１μｇ。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（図４Ａ）及びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ（商標）（図４Ｂ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の大規模精製の分析を提供する。図４Ａ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。図４Ｂ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（図４Ａ）及びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ（商標）（図４Ｂ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の大規模精製の分析を提供する。図４Ａ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。図４Ｂ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。
【配列表フリーテキスト】
【０１６５】
［配列の簡単な説明］
配列番号１はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１をコードする核酸配列である（GenBankア
クセス番号Ｍ９７３４７）。
配列番号２はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物をコードする核酸配列である。
配列番号３はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１のアミノ酸配列である（GenBankアクセス番号ＡＡＡ３５９１９）。
配列番号４はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物のアミノ酸配列である。
配列番号５はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１をコードする核酸配列である（GenBankアクセス番号Ｕ１９２６５）。
配列番号６はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物をコードする核酸配列である。
配列番号７はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１のアミノ酸配列である（GenBankアクセス番号Ｑ０９３２４）。
配列番号８はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物のアミノ酸配列である。
配列番号９はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１／Ｓ−タグ融合タンパク質のアミノ酸配列である（太字のＴａｇ及びＥＫ部位を、及び大活字のＣｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異を含む）。
配列番号１１はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１２はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異／ＦＬＡＧ−タグ融合タンパク質のアミノ酸配列である（太字のＴａｇ及びＥＫ部位を、及び大活字のＣｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異を含む）。
配列番号１３はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号１４はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号１５はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号１６はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号１７はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１８はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物のアミノ酸配列である。
配列番号１９はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２０はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物のアミノ酸配列である。
配列番号２１はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号２２はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号２３はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２４はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号２５は本発明の変異体コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドにおいて同定されたアミノ酸配列である。
配列番号２６はマウスＣｙｓ２１７Ｓ変異体ポリペプチドの調製に用いられる変異原性プライマーである。
配列番号２７はマウスＣｙｓ２１７Ｔ変異体ポリペプチドの調製に用いられる変異原性プライマーである。
配列番号２８はマウスＣｙｓ２１７Ａ変異体ポリペプチドの調製に用いられる変異原性プライマーである。
配列番号２９はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型構築物をコードする核酸配列である。
配列番号３０はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型構築物をコードする核酸配列である。
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【表１−１０】
【表１−１１】
【表１−１２】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００３年６月１０日に出願された米国出願第６０／４７７，６４９号（これは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される）の利益及びそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府によって支援されている研究及び開発の下で行われた発明に対する権利に関する記述］
該当なし。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ（コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ）又はその一部の変異体ポリペプチド、並びにかかるポリペプチドをコードする核酸分子、及び組換え技法を用いてかかるポリペプチドを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
［発明の背景］
酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌ［β］１，３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ（ＧＬｃＮＡｃ→ＧａｌＮＡｃ）［β］１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（すなわち、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ（コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ））は、Ｏ結合グリカン生合成経路においてコア１（すなわちＧａｌ［β］１，３ＧａｌＮＡｃ［α］−Ｏ）をコア２構造（すなわち、Ｇａｌ［β］１，３［ＧｌｃＮＡｃ［β］１，６］ＧａｌＮＡｃ［α］−Ｏ）へ変換する(Williams and Schachter, J. Biol. Chem 255:11247, 1980及びSchachter H. and Brockhausen, I, In:Allen, H.J. and Kisailus E.C.(eds) Glycoconjugates. Composition, Structure, and Function. Marcel Dekker, New York, pp 263-332)。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性は、ポリ（Ｎ−アセチルラクトサミン）（すなわち、Ｇａｌ［β］１−４ＧｌｃＮＡｃ［β］１−３の反復）によるＯ結合糖の伸長において重要である。これらの構造は、悪性形質転換(Yousefi et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(3):1772-1782)及びリンパ球の増殖活性化(Higgins et al.
(1991) J. Biol. Chem. 266(10): 6280-6290)に関連しており、これらは、細胞接着に影響を及ぼし(Zhu and Laine (1985) J. Biol. Chem., 260(7):4041-4045; Laferte and Dennis (1988) Cancer Res.; 48(17):4743-4748)、且つこれらは、哺乳類レクチン用のリガンドとして作用し得る(Merkle and Cummings (1988) J. Biol. Chem. 263(31):16143-9)。
【０００５】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴは、標的分子のグリコシル化による細胞−細胞相互作用の調節において重要な酵素である。例えば、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴにより調節されるＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド（「ＰＳＧＬ−１」）のグリコシル化は、Ｐ−セレクチンの結合に関する重要な工程であることが見出されている(Kumar et al. (1996) Blood, 88(10):3872-3879; Li et al. (1996) J. Biol. Chem. 271(6):3255-3264)。糖尿病及び高血糖症は、ラットの心筋細胞において特異的にコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ遺伝子発現を誘導し、糖尿病患者の心臓におけるコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現はまた、ストレス反応及び心筋層肥大と関連がある(Nishio et al., (1995) J. Clin Invest., 96(4): 1759-1767)。
【０００６】
ゴルジへのＵＤＰ−Ｇａｌ輸送を阻止して、コア２構造を含むＯ結合及びＮ結合された
伸長をブロックする体細胞変異体は、いずれか一方の経路のみでのブロックよりも転移のより激しい減衰をもたらし、Ｏ結合コア２及びＮ結合分岐状オリゴ糖の両方が、悪性表現型に寄与することを示唆している。これに関して、ＧａｌＮＡｃαＲは、Ｏ結合経路の早期に、１つの酵素をブロックすることによりコア２合成を防止し、ＧａｌＮＡｃαＲは、浸潤及び転移を低減させることがわかっている。また、結腸直腸癌細胞におけるコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの増大された発現が、疾患の進行と密接に相関していることも見出されている(Shimodaira et al. (1997) Cancer Res., 57(23): 5201-5206)。
【０００７】
本明細書中の任意の参照文献の引用は、かかる参照文献が本発明に対する従来技術として利用可能であることを受け入れるものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ（コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ）の新規な変異体ポリペプチドを提供する。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチド（及び／又は適切な状況では、融合又はキメラコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチド）は、場合によっては本明細書中で「Ｃ２変異体」又は「Ｃ２変異体ポリペプチド」と称することもある。
【０００９】
本発明のある態様では、単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドが提供され、ここで第２１７位のアミノ酸は、システイン以外の任意のアミノ酸である。
【００１０】
本発明の特定の変異体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここでコア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアミノ酸残基は、置き換えられるか、又は欠失されて、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を保持しながら安定性を増大させたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴを提供する。
【００１１】
ある態様では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位に対応する本来のシステイン残基は、置換アミノ酸残基により置き換えられるか、又は欠失される。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのシステイン２１７の変更により、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を保持しながら、酵素の安定性が増大する。
【００１２】
特に好ましい実施形態（embodiment)では、本来のアミノ酸２１７位でのシステイン残基は、セリン残基又はアラニン残基により置き換えられる。
【００１３】
本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチドは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有し、且つ増強された安定性を有する。特定の実施形態では、本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ変異体ポリペプチドはまた、ネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１と実質的に同じであり得るコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１供与体基質及び受容体基質に対するＫｍ値を有する。グリコシルトランスフェラーゼ産物であるＵＤＰ及びＧｌｃＮＡｃ（β１−６）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐの阻害能力は、本発明のＣ２変異体及びネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に関して実質的に同じであり得る。ネイティブ又は野生型酵素と同様に、本発明のＣ２変異体は、基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを使用しない。特定の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する変異体ポリペプチドの保存的置換を含む変異体ポリペプチドを意図する。
【００１４】
他の付加、置換及び／又は欠失が本発明のＣ２変異体になされてもよい。例えば、マウスＣ２変異体は、２３５位のシステインで第２のアミノ酸置換を必要に応じて包含してもよい。代替的には、当業者に既知であるように、末端アミノ酸残基の１つ又はそれ以上は
、Ｃ２変異体の改善された特性を実質的に保持しながら核酸配列から欠失されてもよい。ある実施形態では、Ｎ末端アミノ酸残基が欠失される。
【００１５】
本発明はまた、Ｃ２変異体ポリペプチドをコードする核酸分子又はポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
上記ポリヌクレオチドを使用して、宿主細胞を形質転換して、本発明のＣ２変異体を発現することができる。上記ポリヌクレオチドはまた、関連酵素を検出するためのプローブとして使用することもできる。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡサイジング標準物質として使用することができる。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む組換えベクターに関する。本発明の核酸分子は、適切なベクターに挿入されてもよく、ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必須の要素を含有し得る。したがって、本発明の核酸分子、及び適切な場合、核酸分子に連結された１つ又はそれ以上の転写及び翻訳要素を含むベクターが構築され得る。
【００１８】
ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換することができる。したがって、本発明は、本発明のベクターを含有する宿主細胞を提供する。同様に、本発明は、かかるベクター及び宿主細胞を作製する方法を提供する。
【００１９】
本発明の変異体Ｃ２ポリペプチドは、当業者に既知の多数の方法のいずれか１つの方法によりコード、発現及び精製され得る。好ましい生産方法は、材料のコスト及び入手可能性、並びに他の経済上の考慮を含む多くの要因に依存する。所定の状況に関する最適な生産手順は、最低限の実験を通して当業者に明らかであろう。
【００２０】
本発明のある態様によれば、本発明の核酸分子を利用した組換え技法によりＣ２変異体を生産する方法が提供される。上記方法は、Ｃ２変異体の発現を促進する条件下で、Ｃ２変異体をコードする核酸配列を含有する組換え宿主細胞を培養すること、及び続くＣ２変異体の回収を含み得る。
【００２１】
一態様では、本発明は、Ｃ２変異体を調製する方法であって、（ａ）Ｃ２変異体をコードする核酸分子を含む本発明のベクターを宿主細胞へ移入すること、（ｂ）非形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択すること、（ｃ）上記Ｃ２変異体の発現を可能にする条件下で、選択した形質転換宿主細胞を培養すること、及び（ｄ）上記Ｃ２変異体を単離することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の方法を用いて得られる組換えＣ２変異体ポリペプチドを意図する。
【００２３】
本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、ポリペプチドのような他の分子と結合させて、融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドを調製し得る。これは、例えばＮ末端又はＣ末端融合ポリペプチドの合成により達成され得る。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＣ２変異体ポリペプチドに対して特異性を有する抗体を意図する。抗体は、検出可能な物質で標識してもよく、Ｃ２変異体ポリペプチドを検出するのに使用され得る。別の実施形態では、本発明は、Ｃ２変異体ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２５】
それらの改善された特性により、本発明のＣ２変異体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法での使用に特に適切である。本発明の
一態様では、Ｃ２変異体を使用して、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの阻害剤を同定する方法が提供される。
【００２６】
さらに、本発明は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性を調節する能力に関して試験化合物を評価する方法を提供する。「調節する」は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性の変化又は変更を指す。調節は、活性の増加若しくは減少、特徴（例えば、動的特徴）、又はポリペプチドの生物学的、機能的若しくは免疫学的特性の任意の他の変化であり得る。
【００２７】
本発明のある実施形態では、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアンタゴニストとしての有効性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）ポリペプチドのアンタゴニスト活性が検出され得る条件下で、Ｃ２変異体ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程、及びｂ）アンタゴニスト活性を検出する工程を含む方法が提供される。
【００２８】
本発明の方法を用いて同定される物質及び化合物は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性を調節するのに使用されてもよく、それらは、炎症性障害、肝臓障害、腎臓障害、骨格筋障害、心臓血管障害、糖尿病、感染性疾患、ホルモン性疾患、寄生虫疾患及び増殖性疾患（例えば、癌）のようなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴにより媒介される状態の処置（treatment)において使用され得る。したがって、上記物質及び化合物は、これらの状態の１つ又はそれ以上を患う個体への投与用の組成物へ処方してもよい。したがって、本発明はまた、本発明の方法を用いて同定される物質若しくは化合物の１つ又はそれ以上、及び薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤を含む組成物に関する。これらの状態を処置又は防止する方法であって、それらを必要とする患者に本発明の組成物を投与することを含む方法もまた提供される。
【００２９】
コア２トランスフェラーゼ活性を有する新規なＣ２変異体ポリペプチドおよびこれをコードする核酸を提供した場合、したがって本発明は、ｓＬｅＸ抗原を含むオリゴ糖及び／又は多糖（例えば、二糖又はそれ以上の糖）を調製する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明は、オリゴ糖を調製する方法であって、本発明のＣ２変異体ポリペプチドの存在下で、糖供与体及び受容体を含む反応混合物を接触させることを含む方法に関する。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、科学研究、ＤＮＡの合成及びベクターの製造に関連したｉｎ ｖｉｔｒｏでの目的で、ポリペプチド又は核酸分子を利用する方法が提供される。
【００３１】
本発明のこれら及び他の態様、特徴及び利点は、以下の図面及び詳細な説明から当業者に明らかなはずである。
【００３２】
［詳細な説明］
本発明によれば、当該技術分野の技術内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技法が使用され得る。かかる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)、DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985)、Oligonucleotide
Synthesis(M.J. Gait ed. 1984)、Nucleic Acid Hybridization B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)、Transcription and Translation B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1984)、Animal Cell Culuture R.I. Freshney, ed.(1986)、Immobilized Cells and enzymes IRL Press, (1986)及びB. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照されたい。
【００３３】
用語解説
「コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ」又は「コア２トランスフェラーゼ」という用語は、本明細書中で使用する場合、天然に存在する（「ネイティブ」又は「野生型」）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ、並びに宿主細胞中で発現される場合にネイティブなタンパク質の反応と同一の反応を触媒する天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴのアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を有する天然に存在しないポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）を包含する。この用語はまた、対立遺伝子、種及び組織改変体も包含する。対立遺伝子改変体は、たった１つ又は多くても数個のアミノ酸置換により、ネイティブ又は野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと異なる。ポリペプチドの種バリエーションは、生物の異なる種間で天然に存在するバリエーションである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ Ｌ型（Ｔ１）、特にヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ［配列番号３を参照、またＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＡＡ３５９１９（ａａ）及びＭ９７３４７（ｎｔ）も参照］、マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ［配列番号７を参照、またＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｑ０９３２４（ａａ）及びＵ１９２６５（ｎｔ）も参照］又は別の種由来のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴであり得る。
【００３４】
「コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性」又は「コア２トランスフェラーゼ活性」は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴによるコア１からコア２構造への変換を指す。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの触媒活性は、ネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴと実質的に同じである。触媒活性は、それがネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴに関して得られる活性と同一である場合、「実質的に同じである」とみなされ、又はそれはネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性と比較して２倍〜１０倍、２倍〜５倍活性であってもよいし、２倍〜３倍劣る活性であってもよい。
【００３５】
触媒活性は、Ｃ２変異体の活性（例えば、触媒効率及び動力学的パラメータ）を野生型又はネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性と比較することにより評価される。Ｃ２変異体の活性は、例えば実施例に示されるように、１つ又はそれ以上の試験基質に対して測定され得る。
【００３６】
「変異体」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸残基の少なくとも１つが、置換アミノ酸残基で置き換えられるか、又は欠失されているコア２ ＧｌｃＮＡｃＴを指す。変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して有利な特性を有する。ある態様では、変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して増大した安定性を有する。
【００３７】
「置換アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸を置き換え、且つ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸を指す。置換アミノ酸は、それが重要な基質相互作用をブロックしないか、又は酵素のフォールディング／コンホメーションを劇的に変更させないように選択される。ある特定の実施形態では、置換アミノ酸は、変異体へ増大した安定性を付与し、一般的に酸化、アルキル化及び／又は重金属結合に対して感受性でないアミノ酸である。特に、置換アミノ酸は、空気酸化、酸化剤、チオール反応性試薬及び重金属により引き起こされる不活性化に対して非感受性である。かかるアミノ酸の例としては、天然アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）及びバリン（Ｖａｌ）、並びにそれらのＤ及びＬ立体異性体における対応する非天然アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン）及びそれらのアナログが挙げられる。
【００３８】
アミノ酸に関して「アナログ」という用語は、Ｃ末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基又は側鎖官能基のいずれかが別の官能基に化学的に改変されたアミノ酸を指す。アミノ酸アナログは、それらのＮ末端アミノ基又はそれらの側鎖基上で、化学的にブロックされて
いる（可逆的又は不可逆的に）か、又は改変されている天然及び非天然アミノ酸を包含する。セリン、アラニン及びバリンのアミノ酸アナログの例としては、Ｌ／Ｄ−Ｎ−メチルセリン、Ｌ／Ｄ−Ｎ−メチルアラニン、Ｌ／Ｄ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−セリンヒドロキサメート、Ｎ−（２−アミノエチル）−ｂ−アラニン、Ｄ−バリン−ＯＨ、Ｌ−アラニン−ＯＨ、Ｌ／Ｄ−セリン（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎ−メチル−Ｌ／Ｄ−アラニン−ＯＨ及びＮ−メチル−Ｌ／Ｄ−バリン−ＯＨが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明のある実施形態では、置換アミノ酸は、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位のシステインにおけるセリンである。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、置換アミノ酸は、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位のシステインにおけるアラニンである。
【００４１】
Ｃ２変異体ポリペプチドに関して本明細書中で使用する場合の「安定性」は、Ｃ２変異体ポリペプチドが、酸化、アルキル化又は重金属結合に対して感受性でないか、又はそれらに対する減少された感受性を有することを意味する。特に、「安定性」は、野生型酵素と比較して、チオールを標的とする試薬に対する減少された感受性を指す。ある態様では、この用語は、空気酸化、酸化剤、チオール反応性試薬及び重金属により引き起こされる不活性化に対する非感受性を指す。
【００４２】
「核酸」又は「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」という用語若しくは本明細書中の用語的(grammatical)等価物は、一緒に共有結合されている少なくとも２つのヌクレオチドを指す。これらの用語は、改変若しくは非改変ＤＮＡ、ＲＮＡ又は混合ポリマーを包含すると意図され、一本鎖、二本鎖又は三重鎖のいずれであってもよく、センス又はアンチセンス鎖を表す。例えば、核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域、又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖、より典型的には、二本鎖又は三本鎖、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む領域の混合物であり得るＲＮＡが挙げられる。かかる領域における鎖は、同じ分子由来又は異なる分子由来であり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、１つ又はそれ以上の改変塩基を含有してもよい。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、安定性のために、又は他の理由で改変された骨格を有し得る。したがって、核酸アナログは、例えばホスホルアミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49 (10):1925)及びその中の参照文献）、Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800、 Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579、Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487、Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805、Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470、及びPauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437、及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321)、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approch, Oxford University Pressを参照）並びにペプチド核酸骨格及び結合（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895、Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008、Nielsen (1993) Nature, 365:566、Carlsson et al. (1996) Nature 380:207を参照）を含む代わりの骨格を有し得るものが挙げられる。他のアナログ核酸としては、正の骨格（Denpcy
et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号及び同第４，４６９，８６３号、Letsinger et al (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470、Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597、Chapters 2 and 3, ACS Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook、Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395、Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17
、Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)）及び非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号、並びにChapters 6 and 7, ACS Symposium Series
580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されるものを含む）が挙げられる。１つ又はそれ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に包含される（Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev.
pp169-176を参照）。幾つかの核酸アナログが、Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35に記載されている。標識のようなさらなる部分の付加を容易とするために、又は生理学的環境においてかかる分子の安定性及び半減期を増大させるために、リボース−リン酸骨格のこれらの改変が行われ得る。
【００４３】
「核酸分子」という用語、特にＤＮＡ又はＲＮＡは、一次及び二次構造のみを指し、その用語は、一次および二次構造を任意の特定の三次形態に限定しない。
【００４４】
「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語は、本明細書中で使用する場合、天然、合成又は改変アミノ酸を指す。
【００４５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書中では交換可能に使用される。この用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸残基の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。
【００４６】
「保存的置換」という用語は、分子の活性及び／又は結合親和性を実質的に変更しないアミノ酸置換を表すためにタンパク質又はペプチドに関して使用される。通常、保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する別のアミノ酸で置換することを包含する。以下の６つの群はそれぞれ、互いに典型的な保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４７】
「融合分子」は、本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドへ結合されている（直接的又はリンカーを介して）任意の分子を指す。好ましい融合分子は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドとの融合タンパク質として発現され得るタンパク質である。
【００４８】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用する場合、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体等）に関する場合は、分子の異種集団（例えば、タンパク質及び他の生物製剤）中の生体分子の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された条件（例えば、抗体の場合ではイムノアッセイ条件、又は核酸の場合ではストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、特定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」分子に結合し、サンプル中に存在する他の分子には、有意な量で結合しない。特定の実施形態では、抗体は、約１０−６Ｍ又は１０−７Ｍを超えるＫｄ、好ましくは約１０−８Ｍを超えるＫｄ、さらに好ましくは１０−９Ｍを超えるＫｄ、最も好ましくは約１０−１０Ｍを超えるＫｄで、その標的（例えば、本発明のコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド）を特異的に結合する。
【００４９】
本発明の核酸分子
上述のように、特定の実施形態では、本発明は、Ｃ２変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５０】
本発明の一実施形態では、下記を含む単離された核酸分子が意図される。
【００５１】
（ｉ）配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９及び２０を含むか、又は配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９及び２０から本質的に構成されるＣ２変異体ポリペプチドをコードする核酸配列、
【００５２】
（ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列、
【００５３】
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重に起因してコドン配列において（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれとも異なる核酸配列及び／又は
【００５４】
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の対立遺伝子若しくは種バリエーション。
【００５５】
特定の実施形態では、単離された核酸分子は、下記を含む。
【００５６】
（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４を含むか、又は配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４から本質的に構成される核酸配列、
【００５７】
（ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列、
【００５８】
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重に起因してコドン配列において（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸配列のいずれとも異なる核酸配列及び／又は
【００５９】
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の対立遺伝子若しくは種バリエーション。
【００６０】
「相補的」という用語は、塩基対形成による、許容塩及び温度条件下での核酸分子の自然結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」であってもよく（ここでは、核酸のほんの幾つかが結合する）、又は２つの一本鎖分子間の相補性は、全体的な相補性が一本鎖分子間に存在する場合には完全であってもよい。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列によりコードされる核酸配列を含むか、又は配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４（ここでＴはＵであってもよい）で示される核酸配列を含む。
【００６２】
Ｃ２変異体ポリペプチドをコードし、且つ遺伝コードにおける縮重に起因して配列番号９、１０、１１、１２、１７、１８、１９又は２０の核酸配列と異なる配列を含む単離された核酸分子もまた本発明の範囲内である。かかる核酸は、同等のポリペプチドをコードするが、遺伝コードにおける縮重に起因して配列番号１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３及び２４の配列と、配列が異なる。例えば、種バリエーション、すなわち異なる種間で天然に存在するヌクレオチド配列のバリエーションが意図される。
【００６３】
変異は、当業者に既知の方法を用いて、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ核酸分子に導入されてもよい。ある実施形態では、Ｃ２変異体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発により調製される。部位特異的変異誘発又は非ランダム変異誘発を実施するための技法は、当該技術分野で既知であり、オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発(Adellman et al., (1983) DNA, 2: 183)、カセット変異誘発(Wells et al. (1985) Gene
344:315)及び結合変異誘発(Ladner et al ＷＯ８８／０６６３０号)が挙げられるが、こ
れらに限定されない。タンパク質の部位特異的改変に関するプロトコルは、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，９３２，４１９号、同第５，７８９，１６６号、同第５，７０５，４７９号、同第５，６３５，４７５号、同第５，５５６，７４７号、同第５，３５４，６７０号、同第５，３５２，７７９号、同第５，２８４，７６０号及び同第５，０７１，７４３号を参照）。さらに、部位特異的変異誘発用のキットが市販されている（BD Biosciences Clontechから入手可能な部位特異的変異誘発キットであるＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ（商標）、Bio-Radから入手可能なＭｕｔａＧｅｎｅファージミドｉｎ
ｖｉｔｒｏ変異誘発キット、及びStratagene（登録商標）からのＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的変異誘発キットを参照）。
【００６４】
一実施形態では、置換アミノ酸残基（例えばセリン、又は特定の実施形態では、システイン又はセリン以外の任意のアミノ酸）は、ポリメラーゼ連鎖反応技法を用いたオリゴヌクレオチド媒介性変異誘発により、選択した位置（例えば、システイン２１７）へ導入される。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴをコードする核酸分子は、便宜上、或いは望ましい場合に、当業者が選ぶことのできる適切なプラスミドにより保有される。プラスミドの例としては、ｐＢＲ，ｐＵＣ、ｐＵＢ、ｐＥＴ、ｐＴＲｉＥｘ、ｐＦＬＡＧ又はｐＨＹ４シリーズが挙げられる。
【００６５】
部位特異的変異誘発に関して、選択した変異部位を含有するフラグメントは、ネイティブなコア２ ＧｌｃＮＡｃＴをコードする遺伝子から制限エンドヌクレアーゼにより切断され得る。フラグメントは、修飾（modified)ＰＣＲ技法における鋳型として使用される(Higushi et al. (1988) Nucleic Acid Res., 16: 7351-7367)。所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドは、５’と３’ＰＣＲフランキングプライマー間の鎖伸長を開始させるためのミスマッチプライマーとして使用される。概して、手順は、ミスマッチプライマー及び５’プライマーを用いて、所望の塩基置換（例えば、Ｃｙｓ２１７をＳｅｒへ）を含有するＤＮＡフラグメントを生成することを包含する。ＤＮＡフラグメントは、電気泳動によりプライマーから分離されて、所望の塩基置換を含有する完全フラグメントを生成するための３’プライマーを用いた第２のＰＣＲ反応における新たな５’プライマーとして使用される。変異は、配列決定により確認され、本来のフラグメントの位置へと挿入し戻される。
【００６６】
本発明の特定の実施形態では、Ｃ２変異体は、Bauer他に対する米国特許第５，７８９，１６６号、同第５，９３２，４１９号及び同第６，３９１，５４８号に記載される部位特異的変異誘発技法を用いて生産される。
【００６７】
２個以上の変異をコア２ ＧｌｃＮＡｃＴへ導入することができ、好ましくは本明細書中に記載するＣ２変異体の特性を保持する。例えば、変異（例えば、付加、置換及び／又は欠失）は、システイン２１７に加えて他の位置で導入することができ、変異は、新たな制限部位を創出することができ、コドン優先を変化させることができ、或いはスプライス改変体を生産することができる。ある実施形態では、マウスＣ２変異体は必要に応じて、システイン２３５で第２のアミノ酸置換を包含し得る。別の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸が欠失される。
【００６８】
本発明の核酸分子は、標準的な技法を用いて化学的合成されてもよい。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する方法は既知であり、固相合成（これは、ペプチド合成のように、市販のＤＮＡ合成機で完全に自動化されている）（例えば、Itakura et al., 米国特許第４，５９８，０４９号、Caruthers et al. 米国特許第４，４５８，０６６号並びにItakura 米国特許第４，４０１，７９６号及び同第４，３７３，０７１号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
Ｃ２変異体ポリペプチド
ある態様では、本発明の単離されたコア２変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの触媒活性を維持しながら、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと比較して増大した安定性をもたらすアミノ酸置換又は欠失を伴うコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの配列を含む。
【００７０】
一態様では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの２１７位に対応する本来のシステイン残基は、アミノ酸残基置換により置き換えられるか、或いは欠失される。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのシステイン２１７の変更が、触媒活性の保持と共に酵素の安定性を増大させることを見出した。
【００７１】
特定の実施形態では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドの２１７位に対応するシステインは、アミノ酸配列ＷＸＹＸＩＮＸＣＧＸＤＦＰ（配列番号２５）中で同定することができ、ここでＸは、任意のアミノ酸残基であり、システインは、アミノ酸配列の８番目の位置にある。システイン残基は、本明細書中で記載されるように置き換えられるか、又は欠失される。したがって、本発明は、アミノ酸配列ＷＸ１ＹＸ２ＩＮＸ３Ｘ４ＧＸ５ＤＦＰ（配列番号３１）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ５はそれぞれ独立して、任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４は、システイン以外の任意の残基、或いは特定の実施形態では、システイン又はセリン以外の任意の残基である）を含む単離されたコア２
ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ２は、イソロイシン、バリン又はロイシンであり、Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン又はバリンであり、Ｘ４は、セリン又はアラニンであり、Ｘ５は、イソロイシン、バリン又はメチオニンである。
【００７２】
さらなる実施形態では、単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドは、アミノ酸配列ＷＫＹＬＩＮＬＸ４ＧＭＤＦＰ（配列番号３２）を含む。特定の実施形態では、Ｘ４は、セリン又はアラニンである。特定の実施形態では、天然に存在するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチドは、ヒト又はマウスポリペプチドである。
【００７３】
ある実施形態では、本来のアミノ酸２１７位に対応するシステイン残基は、セリン残基で置き換えられる。別の実施形態では、本来のアミノ酸２１７位に対応するシステイン残基は、アラニン残基で置き換えられる。
【００７４】
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｃ２変異体ポリペプチドは、配列番号９、１１、１７又は１９のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアイソフォームを意図する。アイソフォームは、本発明のポリペプチドと同じ又は異なる数及び種類のアミノ酸を含有するが、アイソフォームは、異なる分子構造を有してもよい。本発明により意図されるアイソフォームは好ましくは、Ｃ２変異体ポリペプチドと同じ特性（例えば、類似したコア２機能及び特異性及び／又は酸化的不活性化若しくはチオール反応性試薬に対する非感受性）を有する。例えば、アイソフォームは、本発明のポリペプチドと比較して異なるグリコシル化パターンを有してもよい。
【００７６】
本発明はまた、融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドを生産するように、選択したポリペプチド又はマーカーポリペプチド（以下を参照）又は他のグリコシルトランスフェラーゼと結合させたＣ２変異体ポリペプチドを包含する。
【００７７】
Ｃ２変異体ポリペプチドは、組換えＤＮＡ方法を用いて調製してもよい。したがって、Ｃ２変異体ポリペプチドをコードする配列を有する本発明の核酸は、ポリペプチドの良好
な発現を確実にする適切なベクターへ、既知の様式で組み込まれ得る。考え得る発現ベクターとしては、ベクターが、使用する宿主細胞と適合性である限りは、コスミド、プラスミド、ファージ又は改変ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明はまた、本発明の核酸分子、並びに挿入されるポリペプチド配列の転写及び翻訳に必須の調節配列を含有する本発明のベクターを意図する。適切な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類又は昆虫遺伝子を含む様々な供給源に由来し得る（例えば、Goeddel (1990) Gene Expression Tehcnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAに記載される調節配列を参照）。適切な調節配列の選択は、以下に論述するように、選択される宿主細胞に依存し、当業者により容易に達成され得る。必須の調節配列は、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ及び／又はそのフランキング領域により供給され得る。
【００７９】
本発明のベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易とするマーカー遺伝子を含有してもよい。マーカー遺伝子の例は、ある特定の薬物、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、又は免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分）に対する耐性を付与するＧ４１８及びハイグロマイシンのようなポリペプチドをコードする遺伝子である。マーカーは、所定の核酸とは別個のベクター上で導入され得る。
【００８０】
ベクターはまた、組換えポリペプチドの増大された発現、組換えポリペプチドの増大された溶解性、及び親和性精製においてリガンドとして作用することにより標的組換えポリペプチドの精製の助長を提供する融合部分をコードする遺伝子を含有してもよい。例えば、タンパク質分解性切断部位を標的組換えポリペプチドへ付加して、融合ポリペプチドの精製に続いて融合部分から組換えポリペプチドの分離を可能としてもよい。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ(Amrad Corp., Melbourne, Australia)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, MA)、ｐＦＬＡＧ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、及びｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)（これらはそれぞれ、組換えポリペプチドにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを融合する）が挙げられる。利用され得る別の発現ベクター系は、ｐＴｒｉＥＸ（商標）システム(Novagen, Madison, WI)である。
【００８１】
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｃ２変異体ポリペプチド融合構築物は、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を生産してもよい。「トランスフェクトされた」及び「トランスフェクション」という用語は、多くの標準的な技法の１つによる細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含する。細胞は、トランスフェクトされた核酸が表現型の変化をもたらす場合に、核酸により「形質転換」される。原核生物細胞は、例えばエレクトロポレーション又は塩化カルシウム媒介性形質転換により、核酸でトランスフェクト又は形質転換され得る。核酸は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションのような従来の技法により、哺乳類細胞へ導入され得る。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press及び他の研究室テキストに見出すことができる。
【００８３】
適切な宿主細胞としては、広範囲の原核生物及び真核生物宿主細胞が挙げられる。例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用して）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び植物又は動物細胞（特に、哺乳類細胞）中で発現させてもよい。他の適切な宿主細胞は、Goeddel (1991) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAに見出すことができる。外因性遺伝物質を宿主細胞へ導入する方法は、当業者に既知である。
【００８４】
本発明のＣ２変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、選択した宿主細胞におけるポリペプチドの発現に好ましいコドン、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断の部位、及び／又は容易に発現されるベクターの構築を容易とするさらなる開始、終結又は中間配列の提供を包含してもよい。
【００８５】
挿入される核酸配列の発現を調節するか、又は所望の様式でポリペプチドを修飾及び切断する宿主細胞もまた選択され得る。ポリペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾に特異的且つ特徴的なメカニズムを有する宿主系又は細胞系が選択されてもよい。例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨＬ６０、Ａ４３１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３及びＷＩ３８を含む真核宿主細胞が使用され得る。ポリペプチドの長期間高収率の安定な発現のために、遺伝子産物を安定に発現する細胞系及び宿主系を操作してもよい。
【００８６】
宿主細胞、特に本明細書中に記載する方法を用いて生産される細胞系は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節する物質及び化合物をスクリーニング並びに評価するのに特に有用であり得る。
【００８７】
Ｃ２変異体ポリペプチドはまた、固相合成(Merrifield (1964) J. Am. Chem. Assoc., 85: 2149-2154)又は均質溶液(homogenous solution)中での合成(Houbenweyl (1987) Methods of Organic Chemistry, ed E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart)のようなポリペプチドの化学において既知の技法を用いて化学的合成により調製されてもよい。
【００８８】
ポリペプチドのような他の分子（例えば、マーカー又は他のグリコシルトランスフェラーゼ）と結合させた、本発明のＣ２変異体ポリペプチドを含むＮ末端若しくはＣ末端融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドは、組換え技法により、Ｃ２変異体ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端、及び所望の生物学的機能を有する選択したポリペプチド又はマーカーポリペプチドの配列を融合させることにより調製され得る。得られた融合ポリペプチドは、本明細書中に記載するように、選択したポリペプチド又はマーカーポリペプチドに融合させたＣ２変異体ポリペプチドを含有する。融合ポリペプチドを調製するのに使用され得るペプチド又はポリペプチドの例としては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、ＨＩ、赤血球凝集素（ＨＡ）、Ｓ・タグ、ＦＬＡＧ、β−ガラクトシダーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、ＧＡＬ、ＨＳＰ、ＬａｃＺ、ＩｇＧ、Ｈｉｓ−タグ、アビジン及び短縮型ｍｙｃ、又はそれらの一部が挙げられる。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有する。本明細書中に記載するように調製されるＣ２変異体ポリペプチドは、ＨＰＬＣに基づく方法(Koenderman et al. (1987) FEBS Lett. 222:42)、疎水性アグリコンに結合させた合成オリゴ糖受容体を用いる方法（Palcic et al. (1988) Glycoconjugate 5:49、及びPierce et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 146:679）又は本明細書中に記載する酵素アッセイ方法を用いて確認され得る。
【００９０】
抗体
本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な抗体を調製するのに使用することができる。本発明のＣ２変異体ポリペプチドに関する特異性を有する抗体はまた、本明細書中に記載するように宿主細胞において融合ポリペプチドを発現させることにより創出される融合ポリペプチドから惹起され得る。
【００９１】
本発明の抗体は、無傷モノクローナル又はポリクローナル抗体、及び免疫学的に活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２フラグメント）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、ヒト抗体、遺伝子操作した単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ分子）（Ladner et al., 米国特許第４，９４６，７７８号）、或いはキメラ抗体（例えば、マウス抗体の結合特異性を含有するが、残りの部分がヒト起源である抗体）を包含する。モノクローナル及びポリクローナル抗体、フラグメント並びにキメラを含む抗体は、当業者に既知の方法を用いて調製され得る。
【００９２】
例示的適用
本発明の核酸分子、Ｃ２変異体ポリペプチド及び抗体は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの生物学的活性を調節する（例えば、アップレギュレートする、ダウンレギュレートする等）物質又は化合物の同定方法において使用され得る。同定された物質及び化合物は、コア２
ＧｌｃＮＡｃＴの調節を要する状態の処置に使用され得る。
【００９３】
物質／化合物を同定又は評価する方法
本明細書に記載する方法は、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現若しくは活性を妨害するか又は増強する物質を含むコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現又は生物学的活性を調節する物質及び化合物を同定するように設計される。
【００９４】
本発明の方法を用いて同定される物質及び化合物としては、Ｉｇテールの(tailed)融合ペプチドを含む可溶性ペプチドのようなペプチド、ランダムペプチドライブラリー並びにＤ及び／又はＬ立体配置アミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバー、ホスホペプチド（ランダム又は部分的に縮重した方向付けられたホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む）、抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、単鎖抗体、フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２）及びＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、並びにそれらのエピトープ結合フラグメント）、ポリペプチド、核酸、炭水化物及び小有機又は無機分子が挙げられるが、これらに限定されない。物質又は化合物は、内因性の生理学的化合物であり得るか、或いは物質又は化合物は、天然又は合成化合物であり得る。
【００９５】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの発現若しくは生物学的活性を調節する物質又は化合物は、様々な実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することができる。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドの活性の量を増大させるか、或いはポリペプチドの活性の持続時間を延長させる分子を指す。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドの活性の量、或いはポリペプチドの活性の持続時間を減少させる分子を指す。アゴニスト及びアンタゴニストは、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質、核酸、炭水化物、小有機分子又は任意の他の分子を包含し得る。
【００９６】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴを調節する物質は、本発明のＣ２変異体ポリペプチドの活性を妨害するか、或いは本発明のＣ２変異体ポリペプチドの活性を増強するそれらの能力に基づいて同定することができる。本発明のＣ２変異体ポリペプチドは、アゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために、野生型コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼを利用した任意の既知のアッセイ系で使用され得る。
【００９７】
ある態様では、本発明は、試験物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその
能力に関して評価する方法であって、（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ受容体及び糖供与体を、上記試験物質の存在下で本発明の変異体ポリペプチドと接触させること、及び（ｂ）工程（ａ）における受容体へ転移した糖供与体の量を、上記試験物質の非存在下で受容体へ転移した糖供与体の量と比較することを含む方法を提供する。
【００９８】
別の態様では、本発明は、物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその能力に関して評価する方法であって、（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴに対する受容体及び糖供与体及び本発明のＣ２変異体ポリペプチドを、上記試験物質の存在下で接触させること、（ｂ）受容体へ転移した糖供与体の量を測定すること、及び（ｃ）上記物質が、上記Ｃ２変異体ポリペプチドによる上記受容体への上記糖供与体の転移を妨害するか、或いは増強するかどうかを決定するために、上記試験物質の非存在下で工程（ａ）及び工程（ｂ）を実施することを含む方法を提供する。
【００９９】
本発明の方法で使用するのに適した受容体としては、還元末端にリンカーを伴う合成的であるか、或いは天然に存在する構造である糖、オリゴ糖、多糖、糖ペプチド、糖ポリペプチド又は糖脂質（例えば、アシアロ−アガラクト−フェチュイン糖ペプチド及びアシアロムチン）が挙げられるが、これらに限定されない。受容体は概して、β−Ｄ−ガラクトシル−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−を含む。
【０１００】
適切な糖供与体としては、ヌクレオチド糖、ドリコール−リン酸−糖又はドリコール−ピロリン酸−オリゴ糖（例えば、ウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ））或いはそれらの誘導体若しくはアナログが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
受容体又は糖供与体は、本明細書中に記載するように検出可能な物質で標識されてもよく、受容体及び糖供与体との本発明のＣ２変異体ポリペプチドの相互作用は、検出可能な変化を生じる。検出可能な変化は、比色的、光度測定的、放射測定的、電位差測定的等であり得る。
【０１０２】
受容体は、キャリア（例えば、固相キャリア）又は支持体に直接的又は間接的にカップリングさせてもよい。
【０１０３】
特定の実施形態では、コア２変異体ポリペプチドを、ポリペプチドが糖供与体を受容体へ転移させるのに有効なｐＨ及び温度で、受容体及び糖供与体と反応させて、ここで反応の生成物が検出される。受容体又は供与体の一方を標識して、検出可能な変化を生じてもよく、或いは反応の生成物を、容易に測定される二次生成物に変換してもよい。ポリペプチドに有効なｐＨ範囲内にｐＨを維持するように、受容体及び糖供与体とともに緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液、受容体及び糖供与体は、アッセイ組成物として使用され得る。ＥＤＴＡ及び洗浄剤のような他の化合物をアッセイ化合物に添加してもよい。
【０１０４】
本発明のコア２変異体ポリペプチドは、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴのモジュレーターを評価するためのハイスループット方法で使用され得る。例えば、Ｃ２変異体ポリペプチドは、ＰＣＴ／ＣＡ９９／００５５０号（ＷＯ９９／６４３７８号）に記載されるハイスループットスクリーニング技法で使用され得るか、或いはＣ２変異体ポリペプチドは、放射測定的又は発光測定的アッセイで使用され得る。
【０１０５】
例として、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ酵素用の炭水化物受容体をポリマーへカップリングさせること、及びキャリア又は支持体上へコーティングすること、Ｃ２変異体ポリペプチド、検出可能な物質で標識した糖ヌクレオチド供与体及び試験化合物が添加され、検出可能な物質により生じる検出可能な変化が測
定されることを含む固相バイオアッセイが提供される。
【０１０６】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ酵素用の炭水化物受容体をポリマーへカップリングさせる工程、及びそれをキャリア又は支持体上へコーティングする工程、（ｂ）本発明のＣ２変異体ポリペプチド、検出可能な物質で標識した糖ヌクレオチド供与体、及び試験化合物を添加する工程、及び（ｃ）上記検出可能な物質により生じる検出可能な変化を検出する工程を含む固相バイオアッセイを提供する。
【０１０７】
受容体がカップリングされ得るポリマーの例としては、ポリアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されない。キャリア又は支持体は、例えば、ニトロセルロース、或いはガラス、斑れい岩又は磁鉄鉱であり得る。支持体材料は、球状（例えば、ビーズ）、円筒状（例えば、試験管又はウェルの内部表面、或いはロッドの外部表面）、又は平面状（例えば、シート、試験片）を含む任意の可能な形状を有し得る。
【０１０８】
検出可能な物質の例としては、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体、量子ドット等）、発光標識（例えば、ルミノール）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエストラーゼ）及びビオチニル基（これは、印を付けたアビジン（例えば、光学的又は熱量測定方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出され得る）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、検出可能な物質は、放射性材料、最も好ましくはトリチウムである。
【０１０９】
本発明のある態様では、アッセイは、炭水化物受容体をポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）へカップリングさせること、及び９６ウェルプラスチックプレートの表面のようなキャリア上へコーティングすることを包含する。コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ反応は、Ｃ２変異体ポリペプチド及びトリチウム化した糖−ヌクレオチド供与体を用いて実施され、続いて洗浄、シンチレーションカウント用液体の添加、及びβ−カウンターによる放射能の測定を行う。
【０１１０】
コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼを調節する化合物を評価する本発明の方法を適用させるのに適した試薬は、適切な容器にパッケージングされた必要な材料を提供する利便性の高いキットへパッケージングされ得る。キットはまた、本発明の方法を実施するのに有用な適切な支持体を包含してもよい。
【０１１１】
キットを用いて、本明細書中に記載するスクリーニング方法を実施してもよい。一実施形態では、キットは、本発明のＣ２変異体ポリペプチド及びコア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼに対する基質を含む。基質は代表的には、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼに対する受容体及び糖供与体を包含する。
【０１１２】
特定の実施形態では、キットは、ハイスループット方法を用いて、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼのモジュレーターの検出及び同定に使用される。例えば、キットは、ＰＣＴ／ＣＡ９９／００５５０号（ＷＯ９９／６４３７８号）に記載されるハイスループット方法で使用することができる。
【０１１３】
組成物及び治療
本明細書中に記載する方法により同定される物質又は化合物、並びに本発明の抗体は、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼの生物学的活性を
調節するのに使用されてもよく、それらは、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼにより媒介される状態の治療に使用されてもよい。特に、これらは、炎症性障害及び癌を含む多数の障害に関連した細胞接着を調節するのに使用され得る。
【０１１４】
「炎症性」という用語は、特異的及び非特異的防御系の両方の反応を指す。特異的防御系反応は、抗原に対する特異的免疫系反応である。これらの反応の例としては、ウイルスのような抗原に対する抗体応答、及び遅延型過敏症が挙げられる。非特異的防御系反応は、概して免疫学的記憶が不可能な白血球（マクロファージ、好酸球及び好中球を含む）により媒介される炎症性応答である。非特異的な反応の例としては、蜂に刺された後の即時の腫大及び細菌感染の部位での末梢単核白血球の収集（細菌性肺炎における肺の浸潤及び膿瘍における膿形成）が挙げられる。
【０１１５】
治療可能な障害としては、慢性関節リウマチ、虚血後白血球媒介性組織損傷（再灌流障害）、凍傷障害又はショック、急性白血病媒介性肺障害（例えば、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ））、喘息、外傷性ショック、敗血症性ショック、腎炎、並びに急性及び慢性炎症（アトピー性皮膚炎、乾癬、異常炎症に関連した神経毒性及び炎症性腸疾患を含む）が挙げられる。様々な血小板媒介性病状（例えば、アテローム性動脈硬化症及び血餅形成）もまた治療することができる。物質及び化合物は、血栓障害に伴う組織損傷を最低限に抑えるのに有用であり得る。例えば、物質、化合物、抗体等は、発作、心筋梗塞、深静脈血栓症、肺塞栓症等を最近経験した個体において、或いはプレ血栓溶解療法において治療上有用であり得る。コア２トランスフェラーゼの阻害剤は、血管新生並びに炎症を起こした組織への白血球接着及び侵入を低減させるのに有用であり得る。
【０１１６】
物質、化合物又は抗体を用いて、敗血症性ショック又は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の二次的影響（例えば、病理学的組織崩壊及び／又は広範囲に及ぶ微小循環(microcirculatory)血栓及びびまん性炎症）を治療してもよい。本明細書中の物質、化合物及び抗体は、白血球遊出を阻害し、且つ組織損傷を軽減し得る。
【０１１７】
物質、化合物又は抗体はまた、外傷性ショック及び関連した急性組織障害を治療するのに有用であり得る。阻害性の物質、化合物及び抗体は、障害に関連した組織損傷を制御するように、局所的又は全身的に投与され得る。
【０１１８】
本明細書中に記載する方法により同定される物質及び化合物、並びに抗体は、腫瘍の予防及び治療に有用であり得る。腫瘍転移は、循環癌細胞の接着を阻害することにより阻害又は防止され得る。本発明の物質、化合物及び抗体は、白血病、リンパ腫、黒色腫、腺腫、肉腫及び患者における固形組織の癌腫のような様々な形態の新形成の治療に特に有用であり得る。特に、組成物は、悪性黒色腫、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓、腎臓、胃、肺、直腸、胸部、腸、胃、甲状腺、くび、頸部、唾液腺、胆管、骨盤、縦隔、尿道、気管支原性、膀胱、食道及び結腸の癌、並びにカポージ肉腫を治療するのに使用され得る。
【０１１９】
本明細書中に記載する方法により同定される物質及び化合物、並びに本発明の抗体は、心臓血管障害の予防及び治療に使用され得る。かかる障害としては、動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症及び非アテローム動脈硬化症を含む）、高血圧、発作、冠動脈疾患、虚血、心筋梗塞、狭心症、心不整脈、洞房結節ブロック、房室結節ブロック、慢性血行力学的荷負荷及び動脈瘤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書中に記載する方法により同定される物質又は化合物、及び本発明の抗体を用いて予防又は治療され得る肝臓障害としては、慢性肝炎、肝臓癌、肝硬変、嚢胞性肝疾患、ジルベール症候群、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎、及び肝臓に対する毒性傷害が挙げ
られる。
【０１２１】
本明細書中に記載する方法により同定される物質又は化合物、並びに本発明の抗体を用いて治療可能な他の状態は、増殖性障害（例えば、微生物又は寄生虫感染）、糖尿病、骨格筋障害、心筋症及び腎臓障害（例えば、多嚢胞腎疾患、糸球体腎炎）である。これらはまた、ヴィスコット−オールドリッチ症候群又はＡＩＤＳに起因するＴ細胞活性化及び免疫不全を調節するのに、或いは造血前駆細胞成長を刺激して、且つ／又は被験体における化学療法及び放射線療法に対する保護を付与するのに使用され得る。
【０１２２】
したがって、物質、抗体及び化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した生物学的に適合性の形態で被験体へ投与するための薬学的組成物中に処方され得る。「ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した生物学的に適合性の形態」とは、治療上の効果が任意の毒性の影響よりも上回る投与されるべき物質の形態を意味する。物質は、ヒト及び動物を含む生存生物へ投与することができる。治療的に活性な量の本発明の薬学的組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投与量で且つ期間、有効な量として定義される。例えば、物質の治療的に活性な量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに抗体の、個体における所望の応答を誘発する能力のような要因に依存して変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療的応答を提供するように調節することができる。例えば、幾つかに分割した用量を毎日投与してもよく、或いは用量は、治療状況の緊急性に示されるように比例して低減させてもよい。
【０１２３】
活性物質は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮塗布、又は直腸投与によるような利便性のよい様式で投与され得る。投与の経路に応じて、活性物質は、酵素、酸及び化合物を不活性化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料中にコーティングされ得る。
【０１２４】
本明細書中に記載する組成物は、有効量の活性物質が薬学的に許容可能な賦形剤と混合して組み合わせられるように、被験体へ投与され得る薬学的に許容可能な組成物の調製に関するそれ自体既知の方法により調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)に記載されている。これに基づいて、組成物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤又は希釈剤と関連させ、適切なｐＨを有する緩衝溶液中に含有させ、及びある特定の実施形態では、生理学的液体と等浸透圧の物質又は化合物の溶液を包含する（しかし、これに限らない）。
【０１２５】
薬学的組成物を調製した後、薬学的組成物は、適切な容器に入れて、示される状態の治療に関してラベルを付すことができる。コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼのモジュレーター（例えば、阻害剤）の投与に関して、かかるラベリングは、投与の量、頻度及び方法を包含し得る。
【０１２６】
化合物、物質及び抗体の治療上の有効性並びに毒性は、細胞培養においてか、又は実験動物を用いた標準的な薬学的手順により、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）又はＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）統計データを算出することにより決定され得る。治療指数は、毒性の影響に対する治療上の効果の用量比であり、それは、ＥＤ５０／ＬＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。
【０１２７】
オリゴ糖を調製する方法
本発明はまた、オリゴ糖を調製する方法であって、本発明のＣ２変異体ポリペプチドの存在下で活性化ＧｌｃＮＡｃ及び受容体を含む反応混合物を接触させることを含む方法を
提供する。
【０１２８】
オリゴ糖を調製する方法で使用するための受容体の例は、還元末端にリンカーを伴う合成的であるか、或いは天然に存在する構造である糖、オリゴ糖、多糖、糖ペプチド、糖ポリペプチド又は糖脂質（例えば、アシアロ−アガラクト−フェチュイン糖ペプチド又はアシアロムチン）である。活性化ＧｌｃＮＡｃは、ヌクレオチド−糖、ドリコール−リン酸−糖又はドリコール−ピロリン酸−オリゴ糖の一部であり得る。
【０１２９】
本発明のある実施形態では、オリゴ糖は、哺乳類、特にヒトに対して無毒性であるキャリア、例えば脂質イソプレノイド又はポリイソプレノイドアルコール上で調製される。適切なキャリアの例は、ドリコールリン酸塩である。オリゴ糖は、液体キャリアからのオリゴ糖の化学的除去を可能にする不安的な結合を介してキャリアへ結合されてもよい。代替法では、Ｃ２変異体ポリペプチドは、オリゴ糖を液体キャリアからポリペプチドへ転移させるのに使用され得る。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、説明するのに提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【０１３１】
［実施例１］
部位特異的変異誘発によるＣ２変異体の調製
Ｓタグ標識したヒト野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１構築物（配列番号２９）由来及びＦＬＡＧタグ標識したマウス野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１構築物（配列番号３０）由来の二本鎖プラスミドＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（登録商標）プラスミドｍｉｄｉプラスミドプレップシステムを用いて単離した。２１７位でのヒト又はマウスコア２システインは、Stratagene（登録商標）からのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キットを用いて、製造業者の指示書に従って、セリン又はアラニンのいずれかに変異させた。変異させた構築物はそれぞれ、各変異体並びに野生型配列の残りを確認するために、配列決定に送付した。変異させた構築物それぞれに関するプラスミド調製を実施した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）を用いて、製造業者の指示書に従って、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ又はＣＨＯ−Ｓ細胞系への一過性トランスフェクションに使用した。
【０１３２】
ヒト及びマウスコア２変異体の調製の詳細を以下に記載する。
【０１３３】
ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体
ＧをＣヌクレオチドで置き換えて、２１７位のシステインがセリンアミノ酸へ変異されたタンパク質を生成するように、ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡ（改変ｐＴｒｉＥＸ−４ベクターへサブクローニングさせた）をヌクレオチドレベルで変異させた。これらの実験は、StratageneからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットの指示書に従って実施した。ベクター（ＨＣ２Ｌｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）(Invitrogen)を用いて、製造業者の指示書に従って、ＣＯＳ−７へ一過的にトランスフェクトした。ＣＯＳ−７細胞を、トランスフェクションの前日にＴ７５ｃｍ２フラスコへ１／８〜１／１０希釈に分割した。確実に細胞が８０〜９０％コンフルエントとなり、且つトランスフェクションの当日に効率的な細胞付着が存在するように、細胞を３７℃で、５％ＣＯ２中で少なくとも１６時間、Ｄ−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。トランスフェクション前に、培地をＤ−ＭＥＭ ２０ｍｌ、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンで取り替えた。２つの溶液は、トランスフェクション用に調製し、それにより第１の溶液（溶液Ａ）は、ＯＰＴＩ培地（商標）(GIBCO, BRL)２．５ｍｌに添加されているｐＴＲＩ−ＥＸ（商標）(N
ovagen)Ｎ−末端Ｓタグ標識した野生型又は変異体（Ｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡのいずれか３２．２５μｇから構成された。第２の溶液（溶液Ｂ）は、ＯＰＴＩ培地（商標）(GIBCO/BRL)２．５ｍｌと混合したＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（商標）(Invitrogen)６２．４６μｌを含有する。溶液Ｂを室温で５分間静置させた後、２つの溶液を一緒に混合した。混合した溶液Ａ及びＢを室温で２０分間インキュベートした後、それらをＣＯＳ−７細胞に添加した。続いて、ＣＯＳ−７細胞／Ｔ７５ｃｍ２フラスコを、３７℃で５％ＣＯ２中で少なくとも４８時間インキュベートした。
【０１３４】
トランスフェクションの４８時間後、培地を収集して、ＣＯＳ−７トランスフェクト細胞を細胞スクラッパーで回収して、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１活性を決定した。これに続いて、ウェスタンブロット分析を行った。掻きだした細胞をエッペンドルフチューブに移して、１×ＰＢＳを用いた３回の洗浄工程の間に低速（６００×ｇ）でスピンした。続いて、細胞を０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．１％トリトンＸ−１００中に溶解させて、本明細書中に記載する標準的なコア２アッセイを用いて、５μｌをコア２
ＧｌｃＮＡｃＴ１活性に関してアッセイした。同様に、培地もまた低速（６００×ｇ）でスピンさせて、死細胞片を取り出した。
【０１３５】
トランスフェクトした培地１ミリリットルを１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）緩衝液（商標）(Novagen)２ｍｌ及びＳ−タンパク質（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム中の５０％スラリー）アガロース（商標）(Novagen)１ｍｌと混合した。混合物を穏やかに振とうしながら室温でインキュベートして、Ｎ末端Ｓタグ標識した野生型又は変異体（Ｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１とＳ−タンパク質アガロースとの間の効率的な結合を確実にした。混合物を、１×１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)１０ｍｌを用いた３回の洗浄工程の間に低速（５００×ｇ）でスピンした。Ｓ−プロテインアガロースを１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)５００μｌ中に再懸濁させて、２５μｌをウェスタンブロット分析に供した。
【０１３６】
Ｓ−タンパク質アガロース／コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１懸濁液およそ２００μｌを透明なエッペンドルフチューブへ分離して、ビオチン化トロンビン（商標）(Novagen)を利用して、トロンビン反応を設定した。最適条件は、振とう機上で室温で最大２時間インキュベートしたビオチン化トロンビン（商標）(Novagen)２．５ユニット／３μｌ（１×ストック濃度、０．８３ユニット／μｌ）であることを予め決定した。２時間のインキュベート後、反応混合物を低速（５００×ｇ）で５分間スピンさせて、上清（溶出液）を透明なチューブに移した。低速（５００×ｇ）でスピンしている間にペレットを１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)４００μｌで２回洗浄して、洗浄液すべてを溶出液に添加した。ビオチン化トロンビン（商標）(Novagen)の除去は、ストレプトアビジン（リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０２％アジ化ナトリウム中の５０％スラリー）アガロース（商標）(Novagen)２００μｌを、プールした上清へ添加することにより達成して、１０分間振とうしながら室温でインキュベートした。ストレプトアビジンアガロース（商標）(Novagen)を、低速（５００ｇ×ｇ）で懸濁液をスピンさせることにより除去した後、上清を２ｍｌのエッペンドルフチューブへ移した。ペレット／ストレプトアビジンアガロース（商標）(Novagen)は、低速（５００×ｇ）でスピンしている間に１×Ｂｉｎｄ／Ｗａｓｈ緩衝液（商標）(Novagen)２００μｌで２回洗浄して、再び上清はすべて、同じ２ｍｌのエッペンドルフチューブに一緒にプールした。野生型及び変異体（Ｃｙｓ２１７Ｓｅｒ）ヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１酵素の両方の特徴化分析を行った。
【０１３７】
マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体
マウスコア２ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を、ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ挿入部位でｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクター(Sigma, St.Louis, MO, USA)へサブクローニングした。
【０１３８】
マウスＣ２１７Ｓ変異体をコードする核酸を生成するために、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターへサブクローニングしたマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を塩基対６５０で変異させた。Ｇヌクレオチドは、Stratagene(La Jolla, CA)からのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを用いて、セリン残基をコードするようにＣヌクレオチドで交換した。変異誘発性プライマーは、以下の配列：５’−ＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ（配列番号２６）を有していた。下線を付した配列は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ交換をコードする。
【０１３９】
マウスＣ２１７Ｔ変異体をコードする核酸を生成するために、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターへサブクローニングしたマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を塩基対６４９及び６５０で変異させた。Ｔ及びＧヌクレオチドは、StratageneからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを用いて、Ａ及びＣヌクレオチドで交換した。変異誘発性プライマーは、以下の配列：５’−ＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ（配列番号２７）を有していた。下線を付した配列は、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ交換をコードする。
【０１４０】
マウスＣ２１７Ａ変異体をコードする核酸を生成するために、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３発現ベクターへサブクローニングしたマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１コード配列であるヌクレオチド１００〜１２８７を塩基対６４９及び６５０で変異させた。Ｔ及びＧヌクレオチドは、StratageneからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを用いて、アラニン残基をコードするようにＧ及びＣヌクレオチドで交換した。変異誘発性プライマーは、以下の配列：５’−ＴＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ（配列番号２８）を有していた。下線を付した配列は、Ｃｙｓ−Ａｌａ交換をコードする。
【０１４１】
変異体構築物はそれぞれ、ＣＨＯ−Ｓ又はＣＯＳ−７細胞においてトランスフェクトして、発現させた。１０％ＦＢＳ及び０．１ｍＭ 非必須アミノ酸(Invitrogen, Burlington, CA)を含有するＤＭＥＭ培養培地(Invitrogen, Burlington, CA)とともに細胞をインキュベートして、確実に細胞がコンフルエントとなるようにした。トランスフェクションの１時間前に培養培地を交換して、細胞を活性化させた。同一容量の２つの溶液をトランスフェクション用に調製した。第１の溶液（溶液Ａ）は、７３０ｎｇ／ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（商標）(GIBCO, BRL)中のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３（商標）(Sigma)Ｎ−末端ＦＬＡＧタグ標識した野生型又は変異体（Ｃ２１７Ｓ）マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡのいずれかであった。第２の溶液（溶液Ｂ）は、１．３７μｌ／ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（商標）(GIBCO, BRL)中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）(Invitrogen)であった。溶液Ｂを室温で５分間インキュベートした後、溶液Ａと混合した。混合した溶液Ａ及びＢを室温で２０分間インキュベートした後、それらをＣＯＳ−７又はＣＨＯ−Ｓ細胞へ添加した。続いて、ＣＯＳ−７細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞を３７℃で５％ＣＯ２中で少なくとも２０時間インキュベートした。ＦＬＡＧタグ標識した野生型又は変異体（Ｃ２１７Ｓ）マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）の量は、トランスフェクションの規模に依存するが、ＦＬＡＧタグ標識した野生型又は変異体（Ｃ２１７Ｓ）マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ ｃＤＮＡ ３２０ｎｇ〜６４０ｎｇに対するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）０．６μｌの比は維持した。
【０１４２】
細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄した後、培養培地をＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ(Invitrogen Burlington, CA)で交換した。細胞を２４時間インキュンベートして、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型又はＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチドを含有する無血清培養上清を収集した。ＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ上清を２４時間毎に収集して、細胞が、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型又はＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチドのそれらの生産性が損なわれるまで、新鮮なＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ培地を添加した。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１活性を、細胞培養上清中で同定し、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの存在は、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びペルオキシダーゼ結合抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体(Sigma)を用いたウェスタンブロットにより確認した。
【０１４３】
ＦＬＡＧタグ標識Ｃ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドを精製するために、無血清培養上清１Ｌ〜５Ｌを、ＣＨＯ−Ｓ細胞又はＣＯＳ−７細胞の大規模なトランスフェクションから収集した。収集した培養上清を２５ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ１親和性ビーズ(Sigma)に適用した。ビーズ及び上清を穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。続いて、ビーズ及び上清をカラムに移して、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）でビーズを洗浄した。カラムの流れを止めて、溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ツイーン２０）３５ｍｌをビーズに添加して、穏やかに混合しながら３０分間インキュベートして、ビーズから変異体ポリペプチドを脱離させた。ＦＬＡＧタグ標識した変異体ポリペプチドを含む溶出液を、カラムの流れを開放させることにより収集した。溶出手順を３回繰り返した。溶出液総計１０５ｍｌを収集した後、濃縮した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ８０(Millipore, Billerica, MA, USA)を用いて、溶媒を１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で取り替えた。
【０１４４】
ＦＬＡＧタグ標識Ｃ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの純度は、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen)及びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ(Bio-Rad)の両方により９９％を超えると推定された。ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドは、４８ｋＤａで単一バンドとして移動した。ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドのタンパク質定量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて実施した。
【０１４５】
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１活性は、実施例２及び実施例３の酵素アッセイにより確認された。特に、反応は、３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）、１．０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１．０μＣｉ ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、０．５ｍＭ Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び精製したＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチド０．５ｎｇを含有する溶液４０μｌ中で行った。反応液を３７℃で３０分間インキュベートして、水５００μｌの添加により停止させた。反応生成物Ｇａｌβ１−３（［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐを、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムを用いた固相抽出により未反応ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃから分離した。サンプルを、エタノールを用いてカラムから溶出させて、シンチレーション液体１０ｍｌに添加して、放射能（ＤＰＭ）を測定した。比活性は、１分間の反応当たり且つポリペプチド１ｍｇ当たりの反応生成物の量として算出した。
【０１４６】
最大１５．７マイクロモル／分／ｍｇの比活性を有する精製したＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドが得られた。比較用に、１ｍＭ
１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下でのＦＬＡＧタグ標識したマウス野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの比活性は、類似しており、９．２マイクロモ
ル／分／ｍｇであった。ＦＬＡＧタグ標識した野生型マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの精製は、細胞培養上清４０ｍｌを用いて、ＦＬＡＧタグ標識したマウスＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１変異体ポリペプチドに関して上述する方法に従った。ＦＬＡＧタグ標識したマウス野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドの純度を図３Ａ及び図３Ｂに提供する。
【０１４７】
［実施例２］
ヒト及びマウス野生型並びに変異体コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチド
Ａ．ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型特性。
野生型ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の活性は、発現及び精製された組換え酵素の貯蔵に続く１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は他の還元剤の添加後に増大することが観察された。ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮ−エチルマレイミドは、野生型ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の阻害を引き起こす。重金属Ｈｇ２＋及びＺｎ２＋もまた、野生型ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害する。これらの結果は、野生型ヒト及びマウスコア２
ＧｌｃＮＡｃＴ１が、適正な酵素機能に必要である還元されたシステインアミノ酸残基を有することを示す。酸化、アルキル化又は重金属結合によるこの残基の遮断は、酵素の阻害を引き起こす。
【０１４８】
Ｂ．マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に対するスルフヒドリル試薬の影響
野生型及びＣ２１７Ｓのヒト並びにマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を、３０ｍＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．７）及び１．０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する水溶液中に溶解した。ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ＨｇＣｌ２及びＺｎＳＯ４を、図１及び図２に列挙した濃度で添加した。１．０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．５０ｍＭ Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐｎｐ、（３Ｈ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（０．５０μＣｉ）及び３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）も同様に添加した。溶液を３７℃で２時間インキュベートした。（３Ｈ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び（３Ｈ）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐｎｐを固相抽出により分離して、（３Ｈ）Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐｎｐのＤＰＭを液体シンチレーションによりカウントした。酵素を除くすべての構成成分を含有する溶液を調製して、バックグラウンドレベルを測定した。活性％は、以下の通りに算出した：（ＤＰＭ阻害剤−ＤＰＭバックグラウンド）／（ＤＰＭ対照−ＤＰＭバックグラウンド）×１００。アッセイはすべて、二重に行った。結果を図１及び図２にプロットしている。
【０１４９】
Ｃ２１７Ｓヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の活性は、比較的高濃度のチオール反応性試薬ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）により阻害されなかった。同様に、比較的高濃度のＨｇ２＋及びＺｎ２＋は、マウス酵素に影響を及ぼさなかったのに対して、ヒト酵素は、Ｈｇ２＋のみに対して非感受性であった。これらの結果は、チオール酸化、アルキル化又は幾つかの重金属結合は、Ｃ２１７Ｓヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１をもはや阻害しないことを示している。
【０１５０】
野生型及びＣ２１７Ｓのヒト並びにマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に対する抗チオール試薬の影響を示すデータを図１及び図２に示す。
【０１５１】
Ｃ．ヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃ２１７Ｓ特性。
方法：
標準的な酵素アッセイ
野生型及び変異体（２１７Ｃｙｓ→Ｓｅｒ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１に関する標準的な酵素アッセイを、アッセイ１回につき３０ｍＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．７）、１．０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（供与体基質）、１．０μＣｉ ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、０．５０ｍＭ（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（受容体基質、すなわちＡＳ）、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び１５〜２５μＵ（１ユニット＝１マイクロモル／分）の組換えコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１タンパク質を含有する溶液３０μｌ中で行った。反応は３７℃で２．０時間インキュベートして、水４６０μｌの添加により停止させた。反応は即座に進行しない場合には−２０℃で凍結させた。反応生成物Ｇａｌβ１，３［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（β１，６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐを、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムを用いた固相抽出により未反応ＵＤＰ−６［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃと分離した。サンプルを、エタノールを用いてカラムから溶出させて、シンチレーション液体１０ｍｌに添加して、放射能（ＤＰＭ）を測定した。
【０１５２】
動力学特徴化アッセイ
供与体基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度（Ｋｍ，ＤＳに関する）又はＡＳ濃度（Ｋｍ，ＡＳに関する）の滴定を除いて標準的なアッセイ条件を実行することにより、Ｋｍ値を決定した。標準的なアッセイ条件を実行すること、及び滴定した生成物を添加することにより、生成物ＵＤＰ及びＧｌｃＮＡｃ（β１−６）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関するＩＣ５０値を決定した。供与体及び受容体基質を同時に滴定することにより、メカニズムを決定した。
【０１５３】
結果：
野生型及びＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の動力学的比較
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１供与体基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して１．５ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して１．５ｍＭである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１受容体基質であるＧａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して０．１５ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して０．１３ｍＭである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｂｉ Ｂｉメカニズムを維持し、供与体基質に関するＫＤは、両方の酵素に関して０．１１ｍＭである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１生成物であるＵＤＰ及びＧａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関する阻害能力は、両方の酵素に関して同じである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを利用しない。ＤＴＴの存在下で野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害する化合物はまた、Ｃ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１も阻害する。ＤＴＴの存在下で野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害しない化合物は、Ｃ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１を阻害しない。
【０１５４】
ヒト野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の動力学的比較
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１供与体基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して１．２ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して１．１ｍＭである。コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１受容体基質であるＧａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関するＫｍ値は、野生型酵素に関して０．３４ｍＭであり、Ｃ２１７Ｓ酵素に関して０．３２ｍＭである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、同じ動力学的メカニズムを維持し、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１生成物であるＵＤＰ及びＧａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−６）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐに関する阻害能力は、両方の酵素に関して同じである。野生型及びＣ２１７Ｓコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを利用しない。
【０１５５】
［実施例３］
スクリーニング方法
コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから受容体基質Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−ｐニトロフェニルへの、３Ｈ放射標識したＧｌｃＮＡｃのグリコシル転移反応を触媒する。放射標識した生成物は、固相抽出により単離して、液体シンチレーションによりカウントされる。次に生成物形成の割合を算出する。試験化合物をコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ反応混合物に添加して、それらの阻害能力を決定する。グリコシル転移の割合を測定して、非阻害対照と比較して、対照活性％、すなわち「阻害率％」を得る。本発明の組換え変異体酵素を使用して、固有の阻害剤能力をアッセイする。
【０１５６】
特定のハイスループットプロトコルを以下に記載する。
【０１５７】
コア２受容体であるＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−ｐニトロフェニル（ＧＧＣＡＮ）のストック溶液は、水中に受容体を再懸濁させること、及び溶液を混合するようにボルテックスすることにより調製した。受容体溶液を−２０℃で貯蔵した。９６ウェルマイクロタイタープレート(MicroWell Plates, V-Bottom, Nalge Nunc)。組換えＣ２１７Ｓヒト及びマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１は、本明細書中に記載するように調製した。
【０１５８】
酵素の阻害剤に関してスクリーニングするためのコア２トランスフェラーゼアッセイは、ウェル又はマイクロタイタープレート中での反応１回毎に組換えアッセイ混合物の添加を包含した。アッセイ混合物は、反応ウェルにつき試験化合物１０μｌ、３×アッセイ混合物（１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．７ ０．９ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ０．３ｍｌ、１００ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ０．３ｍｌ、１ｍＣｉ ＵＤＰ−６−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＧＧＮＡＮ ３ｍｌ及び水５．５ｍｌから構成されるストック溶液１０ｍｌとして作製される）１０μｌ、及び組換えＣ２１７Ｓヒト又はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１（１５〜２５μＵ［１ユニット＝１マイクロモル／分］）から構成されていた。プレートを攪拌しながら３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルに水２００μｌを添加することにより、反応を停止させた。生成物の単離を１時間以内に実施しない場合は、プレートを−２０℃で貯蔵した。
【０１５９】
生成物は、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ９６ウェルプレート(Waters)を用いて、製造業者の指示書に従って単離した。溶出は、エタノールを用いて行い、その後プレートを完全に乾燥させた後に、シンチレーション液体を用いて放射性生成物を再懸濁させた。溶出液における放射能は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘマイクロプレート液体シンチレーションカウンター(Wallac)を用いてカウントした。
【０１６０】
酵素活性（ｎｍｏｌ生成物／ｈｒ）は、以下の式を用いて決定した：
酵素活性＝ＤＰＭ−バックグラウンド／２．２２×１０６×３０ｎＭｏｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ／インキュベーション時間
阻害率％：（試験化合物の存在下での酵素活性／試験化合物の非存在下での酵素活性）×１００
【０１６１】
本発明は、本明細書中に記載する特定の実施形態により範囲が限定されない。というのは、かかる実施形態は、本発明の一態様の単なる一つの説明として意図されるものであり、任意の機能的に等価な実施形態が、本発明の範囲内であるためである。実際に、本明細書中に示し、且つ記載するもののほかに、本発明の様々な変更が、上述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。かかる修飾は、添付の特許請求の範囲の範疇にあると意図される。
【０１６２】
本明細書中で言及する刊行物、特許及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許又は特許出願それぞれが、その全体が参照により援用されるように具体的且つ個々に示されるのと同程度に、それらの全体が参照により援用される。本明細書中で言及する刊行物、特許
及び特許出願は、本発明と関連して使用され得るそれらの中で報告されている細胞系、ベクター、方法論等を記載及び開示する目的で、参照により本明細書中に援用される。本明細書中のいずれも、本発明は、先行発明によりかかる開示に先行する資格がないという承認として解釈されない。
【０１６３】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形"a","an"及び"the"は、文脈が明らかに別記しない限り、複数形の言及を包含することに留意されるべきである。したがって、例えば、「宿主細胞(a host cell)」に対する言及は、かかる複数のかかる宿主細胞を包含し、「抗体(the antibody)」に対する言及は、１つ又はそれ以上の抗体及び当業者に既知のそれらの等価物等に対する言及である。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
本発明は、以下の図面を参照してより理解されよう。
【図１】図１は、Ｃ２変異体マウスＣ２１７Ｓは、遊離チオール基を標的とする試薬により阻害されないことを示すグラフである。
【図２】図２は、Ｃ２変異体ヒトＣ２１７Ｓは、遊離チオール基を標的とする試薬により阻害されないことを示すグラフである。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより（図３Ａ）及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより（図３Ｂ）、ＦＬＡＧタグ標識した野生型マウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１及びＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の小規模精製の分析を提供する。図３Ａ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：野生型マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清２０μＬ、レーン３：精製した野生マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド３μｇ、レーン４：Ｃ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清２０μＬ、レーン５：精製したＣ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド３μｇ。図３Ｂ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：野生型マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清１０μＬ、レーン３：精製した野生マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド０．１μＬ、レーン４：Ｃ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧ構築物でトランスフェクトした細胞からの培養上清１０μＬ、レーン５：精製したＣ２１７Ｓ変異体マウスコア２Ｌ−ＦＬＡＧポリペプチド０．１μｇ。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（図４Ａ）及びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ（商標）（図４Ｂ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の大規模精製の分析を提供する。図４Ａ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。図４Ｂ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（図４Ａ）及びＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ（商標）（図４Ｂ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦＬＡＧタグ標識したＣ２１７Ｓマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１の大規模精製の分析を提供する。図４Ａ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。図４Ｂ：レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（商標））、レーン２：精製したマウスＣ２１７Ｓ変異体ポリペプチド２μｇ。
【配列表フリーテキスト】
【０１６５】
［配列の簡単な説明］
配列番号１はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１をコードする核酸配列である（GenBankア
クセス番号Ｍ９７３４７）。
配列番号２はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物をコードする核酸配列である。
配列番号３はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１のアミノ酸配列である（GenBankアクセス番号ＡＡＡ３５９１９）。
配列番号４はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物のアミノ酸配列である。
配列番号５はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１をコードする核酸配列である（GenBankアクセス番号Ｕ１９２６５）。
配列番号６はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物をコードする核酸配列である。
配列番号７はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１のアミノ酸配列である（GenBankアクセス番号Ｑ０９３２４）。
配列番号８はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１融合構築物のアミノ酸配列である。
配列番号９はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１／Ｓ−タグ融合タンパク質のアミノ酸配列である（太字のＴａｇ及びＥＫ部位を、及び大活字のＣｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異を含む）。
配列番号１１はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１２はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異／ＦＬＡＧ−タグ融合タンパク質のアミノ酸配列である（太字のＴａｇ及びＥＫ部位を、及び大活字のＣｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異を含む）。
配列番号１３はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号１４はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号１５はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異体ポリペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号１６はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ｓｅｒ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号１７はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１８はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物のアミノ酸配列である。
配列番号１９はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２０はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物のアミノ酸配列である。
配列番号２１はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドをコードする核酸配列である。
配列番号２２はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号２３はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異体ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２４はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ Ｃｙｓ２１７→Ａｌａ変異構築物をコードする核酸配列である。
配列番号２５は本発明の変異体コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１ポリペプチドにおいて同定されたアミノ酸配列である。
配列番号２６はマウスＣｙｓ２１７Ｓ変異体ポリペプチドの調製に用いられる変異原性プライマーである。
配列番号２７はマウスＣｙｓ２１７Ｔ変異体ポリペプチドの調製に用いられる変異原性プライマーである。
配列番号２８はマウスＣｙｓ２１７Ａ変異体ポリペプチドの調製に用いられる変異原性プライマーである。
配列番号２９はヒトコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型構築物をコードする核酸配列である。
配列番号３０はマウスコア２ ＧｌｃＮＡｃＴ１野生型構築物をコードする核酸配列である。
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【表１−１０】
【表１−１１】
【表１−１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２１７位のアミノ酸残基が、システイン以外の任意のアミノ酸である単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項２】
第２１７位のアミノ酸残基が、システイン又はセリン以外の任意のアミノ酸である、請求項１に記載の単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項３】
第２１７位のアミノ酸残基が、セリン、スレオニン又はアラニンである、請求項１に記載の単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項４】
第２１７位のアミノ酸残基において配列番号３又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項５】
前記第２１７位のアミノ酸残基が、セリンではない、請求項３に記載の単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ５はそれぞれ独立して、任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４は、システイン以外の任意の残基である、アミノ酸配列ＷＸ１ＹＸ２ＩＮＸ３Ｘ４ＧＸ５ＤＦＰ（配列番号３１）を含む単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｘ４が、セリンではない、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｘ４が、セリン、スレオニン又はアラニンからなる群から選択される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列が、ＷＫＹＬＩＮＬＸ４ＧＭＤＦＰ（配列番号３２）である、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｘ４が、セリン、スレオニン又はアラニンからなる群から選択される、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、マウスポリペプチドである、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号９、１１、１７又は１９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有する、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
システイン２１７で改変され、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項１６】
２１７位のシステイン残基が、セリン残基で置き換えられ、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと比較して、増大された安定性を有する、アミノ酸置換を含むコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
前記増大された安定性が、酸化、アルキル化又は重金属結合により引き起こされる不活性化に対する非感受性を特徴とする、請求項１６に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
２１７位のシステイン残基が、アラニン残基で置き換えられ、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと比較して、増大された安定性を有する、アミノ酸置換を含むコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記増大された安定性が、酸化、アルキル化又は重金属結合により引き起こされる不活性化に対する非感受性を特徴とする、請求項１８に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
融合分子に操作可能に連結される請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合分子が、免疫グロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、ＨＩ、赤血球凝集素、Ｓ−タグ、ＦＬＡＧ、β−ガラクトシダーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、ＧＡＬ、ＨＳＰ、ＬａｃＺ、Ｈｉｓ−タグ、アビジン及び短縮型(truncated)ｍｙｃからなる群から選択される、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１０、１２、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを特異的に結合する抗体。
【請求項２４】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２５】
融合分子に操作可能に連結される請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド、及び配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドからなる群から選択される融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号１３、１５、２１又は２３から本質的に構成される単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項２９】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子からなる群から選択される核酸分子を、ベクターに挿入することを含む、組換えベクターを生産する方法。
【請求項３０】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチ
ドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３１】
前記核酸分子が、遺伝子発現を制御する異種調節配列と操作可能に結合される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子を含む組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
宿主細胞を請求項２８に記載の組換えベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクトすることを含む、宿主細胞を生産する方法。
【請求項３４】
核酸分子によりコードされるポリペプチドを生産するのに適した条件下で、請求項２８に記載の宿主細胞を培養すること、及び
細胞培養物から前記ポリペプチドを回収すること
を含む、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を調節する物質に関してアッセイすることを含む、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼの発現又は生物学的活性を調節する物質を同定する方法。
【請求項３６】
物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその能力に関して評価する方法であって、以下の
（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴに対する受容体及び糖供与体を、試験物質の存在下で請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させること、
（ｂ）前記受容体へ転移した前記糖供与体の量を測定すること、及び
（ｃ）前記物質が、前記ポリペプチドによる前記受容体への前記糖供与体の転移を妨害するか、又は増強するかどうかを決定するために、試験物質の非存在下で工程（ａ）及び工程（ｂ）を実施すること
を含む方法。
【請求項３７】
試験物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその活性に関して評価する方法であって、以下の
（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ受容体及び糖供与体を、前記試験物質の存在下で前記いずれかの請求項に記載のポリペプチドと接触させること、及び
（ｂ）工程（ａ）における受容体へ転移した糖供与体の量を、前記試験物質の非存在下で受容体へ転移した糖供与体の量と比較すること
を含む方法。
【請求項３８】
ハイスループット方法である請求項３５、３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記受容体が、固相キャリア又は支持体にカップリングされる、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記受容体が、ポリマーにカップリングされ、且つ前記ポリマーがキャリア又は支持体上にコーティングされる、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖供与体が、検出可能な物質で標識される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４２】
受容体へ転移した糖供与体の量が、前記固相キャリア又は支持体にカップリングされた前記検出可能な物質を検出することにより測定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記いずれかの請求項に記載のポリペプチドを、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ受容体及び糖供与体と、前記受容体及び前記糖供与体を連結するのに適切な条件下で接触させることを含む、オリゴ糖を調製する方法。
【請求項４４】
前記糖供与体が、活性化ＧｌｃＮＡｃである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１、３、４、６、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８及び１９のいずれか１項に記載のポリペプチド及びコア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼに対する基質を含むキット。
【請求項１】
第２１７位のアミノ酸残基が、システイン以外の任意のアミノ酸である単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項２】
第２１７位のアミノ酸残基が、システイン又はセリン以外の任意のアミノ酸である、請求項１に記載の単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項３】
第２１７位のアミノ酸残基が、セリン、スレオニン又はアラニンである、請求項１に記載の単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項４】
第２１７位のアミノ酸残基において配列番号３又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項５】
前記第２１７位のアミノ酸残基が、セリンではない、請求項３に記載の単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ５はそれぞれ独立して、任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４は、システイン以外の任意の残基である、アミノ酸配列ＷＸ１ＹＸ２ＩＮＸ３Ｘ４ＧＸ５ＤＦＰ（配列番号３１）を含む単離されたコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｘ４が、セリンではない、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｘ４が、セリン、スレオニン又はアラニンからなる群から選択される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列が、ＷＫＹＬＩＮＬＸ４ＧＭＤＦＰ（配列番号３２）である、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｘ４が、セリン、スレオニン又はアラニンからなる群から選択される、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、マウスポリペプチドである、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号９、１１、１７又は１９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有する、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
システイン２１７で改変され、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ活性を有するコア２ ＧｌｃＮＡｃＴポリペプチド。
【請求項１６】
２１７位のシステイン残基が、セリン残基で置き換えられ、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと比較して、増大された安定性を有する、アミノ酸置換を含むコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
前記増大された安定性が、酸化、アルキル化又は重金属結合により引き起こされる不活性化に対する非感受性を特徴とする、請求項１６に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
２１７位のシステイン残基が、アラニン残基で置き換えられ、野生型コア２ ＧｌｃＮＡｃＴと比較して、増大された安定性を有する、アミノ酸置換を含むコア２ ＧｌｃＮＡｃＴの変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記増大された安定性が、酸化、アルキル化又は重金属結合により引き起こされる不活性化に対する非感受性を特徴とする、請求項１８に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
融合分子に操作可能に連結される請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合分子が、免疫グロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、ＨＩ、赤血球凝集素、Ｓ−タグ、ＦＬＡＧ、β−ガラクトシダーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、ＧＡＬ、ＨＳＰ、ＬａｃＺ、Ｈｉｓ−タグ、アビジン及び短縮型(truncated)ｍｙｃからなる群から選択される、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１０、１２、１８又は２０に記載のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを特異的に結合する抗体。
【請求項２４】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２５】
融合分子に操作可能に連結される請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド、及び配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドからなる群から選択される融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号１３、１５、２１又は２３から本質的に構成される単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項２９】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子からなる群から選択される核酸分子を、ベクターに挿入することを含む、組換えベクターを生産する方法。
【請求項３０】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチ
ドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３１】
前記核酸分子が、遺伝子発現を制御する異種調節配列と操作可能に結合される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸、請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、配列番号１０、１２、１８又は２０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１３、１５、２１又は２３を含む単離された核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子を含む組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
宿主細胞を請求項２８に記載の組換えベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクトすることを含む、宿主細胞を生産する方法。
【請求項３４】
核酸分子によりコードされるポリペプチドを生産するのに適した条件下で、請求項２８に記載の宿主細胞を培養すること、及び
細胞培養物から前記ポリペプチドを回収すること
を含む、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を調節する物質に関してアッセイすることを含む、コア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼの発現又は生物学的活性を調節する物質を同定する方法。
【請求項３６】
物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその能力に関して評価する方法であって、以下の
（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴに対する受容体及び糖供与体を、試験物質の存在下で請求項１〜１０、１３、１５、１７、１８又は１９のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させること、
（ｂ）前記受容体へ転移した前記糖供与体の量を測定すること、及び
（ｃ）前記物質が、前記ポリペプチドによる前記受容体への前記糖供与体の転移を妨害するか、又は増強するかどうかを決定するために、試験物質の非存在下で工程（ａ）及び工程（ｂ）を実施すること
を含む方法。
【請求項３７】
試験物質を、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴの活性を調節するその活性に関して評価する方法であって、以下の
（ａ）コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ受容体及び糖供与体を、前記試験物質の存在下で前記いずれかの請求項に記載のポリペプチドと接触させること、及び
（ｂ）工程（ａ）における受容体へ転移した糖供与体の量を、前記試験物質の非存在下で受容体へ転移した糖供与体の量と比較すること
を含む方法。
【請求項３８】
ハイスループット方法である請求項３５、３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記受容体が、固相キャリア又は支持体にカップリングされる、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記受容体が、ポリマーにカップリングされ、且つ前記ポリマーがキャリア又は支持体上にコーティングされる、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖供与体が、検出可能な物質で標識される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４２】
受容体へ転移した糖供与体の量が、前記固相キャリア又は支持体にカップリングされた前記検出可能な物質を検出することにより測定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記いずれかの請求項に記載のポリペプチドを、コア２ ＧｌｃＮＡｃＴ受容体及び糖供与体と、前記受容体及び前記糖供与体を連結するのに適切な条件下で接触させることを含む、オリゴ糖を調製する方法。
【請求項４４】
前記糖供与体が、活性化ＧｌｃＮＡｃである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１、３、４、６、８、９、１０、１３、１５、１６、１７、１８及び１９のいずれか１項に記載のポリペプチド及びコア２ β−１，６−Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼに対する基質を含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５２０２０８（Ｐ２００７−５２０２０８Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３６９４（Ｐ２００６−５３３６９４）
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１１９６
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【出願人】（５０５４５９３９０）グリコデザイン ホールディングス リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１１９６
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【出願人】（５０５４５９３９０）グリコデザイン ホールディングス リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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