コクシジウム原虫のモノクローナル抗体及びその利用
【課題】コクシジウム原虫の鶏卵細胞への侵入を阻害するモノクローナル抗体の提供。
【解決手段】コクシジウム原虫アイメリア・テネラのスポロゾイトステージの虫体を免疫したマウスから得られた脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて作製したハイブリドーマから、コクシジウム原虫アイメリア・テネラに反応するモノクローナル抗体であって、コクシジウム原虫アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるモノクローナル抗体を得た。ハイブリドーマとしては、（１）１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）、（２）３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）、（３）４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）、（４）７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）、（５）９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）。
【解決手段】コクシジウム原虫アイメリア・テネラのスポロゾイトステージの虫体を免疫したマウスから得られた脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて作製したハイブリドーマから、コクシジウム原虫アイメリア・テネラに反応するモノクローナル抗体であって、コクシジウム原虫アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるモノクローナル抗体を得た。ハイブリドーマとしては、（１）１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）、（２）３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）、（３）４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）、（４）７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）、（５）９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コクシジウム原虫アイメリア・テネラに対するモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の養鶏業界において経済的損失をもたらす疾病のひとつにコクシジウム感染症が挙げられる。この疾病の原因はコクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）である。鶏に感染し、病原性を示すコクシジウム原虫は７種類が知られている（Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１））。この中でも４種類のコクシジウム原虫感染が問題となっている。問題となっている４種類の原虫はＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ（アイメリア・テネラ）、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（アイメリア・アッセルブリナ）、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ（アイメリア・マキシマ）、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ（アイメリア・ネカトリックス）である。この中でも、アイメリア・テネラとアイメリア・アッセルブリナが最も大きな被害をもたらしている。コクシジウム病は幼雛期から中雛期において主に発生する。感染した雛は、下痢症状を起こし、濃厚感染の場合は死亡にいたるが、通常は一時的に極度の増体効果の低下を招く。また、異なるコクシジウム原虫の感染により、増体低下が長期間に亘ることも知られている。鶏の生活において、この時期は肥育・育成期間であり、このような増体効果の低下は飼料効率に影響し、深刻な経済損失を招く。特に飼育期間が短いブロイラー産業においては、コクシジウム感染は重大な問題となっている。現在、コクシジウム感染の予防に対しては抗コクシジウム剤が用いられている。抗コクシジウム剤は全コクシジウムに対して効果があるが、コクシジウム剤耐性原虫の出現や、残留薬剤の問題などから、使用量や使用期間が限られ、休薬期間も設けられている。また、鶏舎が一旦コクシジウムに汚染されると、完全に清浄化することは至難の業で、汚染防止のためには、薬剤を使いつづけなければならない。また、近年、コクシジウム症予防に効果があるとして、生ワクチンが使用されるようになってきた。しかし、生ワクチンの有効成分であるワクチン株が変異して強毒化した場合には、鶏舎を汚染することもある。また、変異しない場合でも、ワクチンとして投与されたコクシジウムは、抗コクシジウム剤によって殺されるため、薬剤の併用が不可能である。そのため、従来、少量の抗コクシジウム剤で抑えられてきた他の原虫感染症が発生する場合もある。
【０００３】
こうしたワクチンの研究や、治療薬の研究においては、病原体の、感染、増殖、発症に関与するタンパク質から多くの情報を得ている。
ウイルスの場合、発現するタンパク質の種類が少ないため、何らかの機能を有するモノクローナル抗体が比較的容易に得られ、このモノクローナル抗体を用いて何らかの機能を有するタンパク質や遺伝子を得ることが容易である。しかしながら、コクシジウム原虫の場合、発現するタンパク質の種類も莫大であり、しかも、生活環により、発現するタンパク質が異なり、各ステージにおいて形態も、発現する抗原も異なっている。このため、目的とする機能を有するモノクローナル抗体を得ることが極めて困難であり、モノクローナル抗体を用いない同定法、例えば、原虫タンパク質を精製して調べる方法、ｃＤＮＡからλｇｔ１１ライブラリーを作製してコクシジウム原虫感染血清でスクリーニングする方法、他のアイメリア属で既知の感染防御抗原遺伝子と高いホモロジーを持つコクシジウム原虫遺伝子から抗原を見いだす方法など（特許第３０５１１３０号公報、特表平９−５０４６０４号公報、特開平１０−１８２４８３号公報など）、煩雑な操作を伴う方法によって、タンパク質の同定がなされているのが現状である。
しかし、上述した通り、コクシジウムに関しては、機能性のタンパク質を同定することが困難であり、従来のコクシジウムワクチンやコクシジウム感染治療薬の開発を阻んでいた。
【０００４】
【特許文献１】特許第３０５１１３０号公報
【特許文献２】特表平９−５０４６０４号公報
【特許文献３】特開平１０−１８２４８３号公報
【非特許文献１】Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、かかる従来技術の下で新たな抗原タンパク質を得るべく鋭意検討した結果、コクシジウム原虫の腸管細胞への侵入時期が、スポロゾイトステージもしくはメロゾイトステージであることに着目し、スポロゾイトステージの虫体を用いてハイブリドーマの作製を試みた結果、このハイブリドーマが、抗体がコクシジウム原虫の鶏細胞への侵入を強力に抑制する活性を有するモノクローナル抗体を産生することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かくして本発明によれば、
（１）コクシジウム原虫アイメリア・テネラに反応するモノクローナル抗体であって、コクシジウム原虫アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるモノクローナル抗体、
（２）コクシジウム原虫アイメリア・テネラのスポロゾイトステージの虫体を免疫したマウスから得られた脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて作製した、請求項１または２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（３）前記モノクローナル抗体を用いたコクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の抗原タンパク質の同定方法、
（４）前記モノクローナル抗体が認識するコクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の化合物、
（５）前記（１）記載のモノクローナル抗体を有効成分とするコクシジウム原虫アイメリア・テネラ感染症治療薬、
が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
かくして本発明によれば、アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入阻止活性のある新規なモノクローナル抗体、およびこれを産生するハイブリドーマが得られる。コクシジウム原虫の感染防御抗原を認識する本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫の抗原の同定に用いることができる。また、同定された抗原はワクチン抗原として利用できると期待されるほか、当該モノクローナル抗体自体をコクシジウム原虫感染症の治療薬として用いることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（１）モノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫であるアイメリア・テネラに反応し、
かつアイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるものである。本発明において「アイメリア・テネラに反応する」とは、アイメリア・テネラ由来のタンパク質をモノクローナル抗体が認識し、抗原抗体反応を呈することを言う。抗原抗体反応の確認は、ハイブリドーマ培養上清を用いた間接酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により行う。具体的な条件は、実施例の（２）に記載された通りである。この実施例の条件下での培養上清の吸光度が０．１以上であるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が好ましい。
【０００９】
本発明において「アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻止する」とは、上記アイメリア・テネラのスポロゾイトステージである原虫の鶏胚繊維芽細胞への侵入を阻止することをいい、具体的には、以下の方法により侵入を阻止することを確認する。
アイメリアのスポロゾイト虫体をモノクローナル抗体を含む腹水の希釈液と混合した後に鶏胎児繊維芽細胞に加え、細胞へ侵入するコクシジウム虫体数の減少率で阻止効果を測定し、コクシジウム虫体と全く無関係な抗原と反応するモノクローナル抗体を含む腹水と虫体とを混合した場合の細胞への侵入数を１００％とした場合の侵入虫体数の減少が有意に認められた（即ち、実施例の（４）において得られる侵入阻止率が２０％を超えた）場合に活性があると判断する。
【００１０】
このようなモノクローナル抗体としては、本願明細書実施例において感染防御抗体として確認された１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）、３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）、４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）、７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）、９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）が挙げられる。これらのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のサブクラスはＩｇＧ１である。ハイブリドーマ３Ａ５から産生されるモノクローナル抗体はアイメリア・テネラが発現する９０〜１２０キロダルトンのアイメリア・テネラの抗原タンパク質のエピトープを認識するものである。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、スポロゾイトステージにある、アイメリア・テネラを免疫したマウスなどから得られた脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて作製したハイブリドーマから産生される。
免疫に用いるコクシジウム原虫の具体例としては、アイメリア・テネラ、アイメリア・アッセルブリナ、アイメリア・マキシマ、アイメリア・ネカトリックス、アイメリア・ブルネッティ、アイメリア・ミティスなどの、攻撃株や野外分離株などが例示される。免疫虫体量は通常１０４〜１０１０／ｍｌの濃度に調製したものを用いる。
【００１２】
免疫に際して、虫体は凍結融解によって殺しても良いが、特にマウスに接種する場合は、感染の危険がないので、そのままアジュバンドと混合して免疫しても良い。この虫体を免疫する際に用いられるアジュバントは特に限定されるものではないが、フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）のほか、アラム、アラセル、ミョウバンなどが用いられる。虫体とアジュバントとの混合比率は免疫が成立する限りにおいて特に制限されないが、通常１：１である。コクシジウム原虫によって免疫される動物はマウスのほか、ラットやハムスターなどが例示され、これらの動物の系統についても特に制限されないが、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスを用いる。またこれらの動物の他、ヒトのリンパ節細胞や末梢リンパ球などを用いることができる。
【００１３】
本発明において用いられるマウスミエローマ細胞はＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ８．６５３、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）などが挙げられるが、好ましくはＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）である。また、融合する脾臓細胞は動物種を問わないが、融合後の細胞の生育状況から考えるとミエローマと同一種の細胞が好ましい。
【００１４】
細胞融合時に用いるポリエチレングリコールは重合平均分子量１，０００〜４，０００、好ましくは１，０００〜２，０００を用いる。このときジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を３０（ｗ／ｖ）％加えると、尚好ましい。
【００１５】
融合細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生性を確認する方法は、通常、細胞培養上清と抗マウスイムノグロブリンとのゲル沈降反応または間接酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）を用い、抗体産生性を確認したハイブリドーマについては、コクシジウム虫体を固定化したＥＬＩＳＡ法または、コクシジウム虫体が侵入している鶏胎児繊維芽細胞を固定化したＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマの産生する抗体が、コクシジウム虫体に反応することを確認する。得られたハイブリドーマは、対数増殖期にある細胞１０５〜１０９個を、１０％ＤＭＳＯ、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む１〜２ｍｌのダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）に懸濁させ、−８０℃で２時間以上凍結して液体窒素中で保存するなど、通常の培養細胞の保存方法によって保存できる。
【００１６】
また、本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫より抽出したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開し、フィルターメンブレンにブロットした後モノクローナル抗体を反応させるウエスタンブロット法や、コクシジウム原虫のゲノムＤＮＡ断片を挿入して作製したλｇｔ−１１ライブラリーからモノクローナル抗体が反応する抗原を発現するファージを選択する方法などに用いることで、コクシジウム原虫由来の抗原タンパク質を同定することができる。
【００１７】
上述した方法により得られるモノクローナル抗体は、いずれもコクシジウム原虫由来の化合物を認識するものであるが、エピトープ等の認識部位を有する化合物を得るための通常の方法、例えば、本発明で得られたモノクローナル抗体を固定化したカラムに、コクシジウム原虫の破砕抽出物を吸着させるアフィニティーカラムクロマトグラフィーや、モノクローナル抗体とプロテインＡなどのイムノグロブリン吸着タンパク質との複合体を用いて、マコクシジウム原虫由来の化合物を吸着させる免疫沈降法などが挙げられる。
【００１８】
さらに本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫感染症に対する治療薬として用いることができる。このモノクローナル抗体は、薬学的に許容されるキャリアー（生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など）と混合して用いることができ、経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、ニワトリの週齢、投与形態等により異なるが、通常、１羽あたり１〜５００μｇ程度である。
【実施例】
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体について、以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は、これら実施例に限られるものではない。
【００２０】
（１）コクシジウム原虫のマウスへの免疫
１０８個のアイメリア・テネラ野外分離株 Ｒｔ株のオーシストを試験感染鶏の糞便より回収し、オーシストを精製した後、１０ｍｌのＰＢＳを加えて、オーシスト懸濁液を作製した。このオーシスト懸濁液に約３倍量の３０％次亜塩素酸ナトリウム液を加え、滅菌した遠心管に移し、１０分間、室温に放置して殺菌処理した後、１５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心した。上清部分を取り除いたあと、沈殿を５０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、１５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心し上清を取り除いた。この洗浄操作を三回繰り返して次亜塩素酸を取り除いたあと、オーシストを約３ｍｌの滅菌ＰＢＳに浮遊させた後、これをテフロン（登録商標）製ホモジナイザー（５ｍｌ）に入れ、１２０から１５０ｒ．ｐ．ｍ．の速さで１０から１５分間処理して、オーシストの外壁を壊してスポロシストにした。次に遊離させたスポロシストに２５ｍｌのトリプシン液（０．３％トリプシン−ＰＢＳ）を加え、更に３ｍｌの雛胆汁を加えて、４０℃で１．５時間インキュベートした。スポロゾイトの脱殻率が８０〜９０％以上に達したところで加温を中止し、１０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離した。沈殿をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに懸濁し、免疫用コクシジウム原虫のスポロゾイト抗原とした。１０６個／ｍｌにＰＢＳで調製したスポロゾイトを−８０℃の超低温冷凍庫で一度凍らせた後解凍し、等量のフロイントコンプリートアジュバンド（ＦＣＡ）と混合し、１／４量を１匹の七週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの背部皮下に免疫した。４週間後に同様に調製したスポロゾイト抗原を、フロイントインコンプリートアジュバント（ＦＩＡ）と混合し、１／４量を背部皮下に追加免疫した。
【００２１】
（２）ハイブリドーマの作製
追加免疫後３日目にマウスから脾臓を摘出し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中でピンセットとハサミでほぐした後、滅菌した１００μｍ径のステンレスメッシュを通して、単離した脾臓細胞を得た。この細胞は、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭでさらに３回洗浄した。
一方、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１は、１０−８ Ｍの８−アザグアニン（２−アミノ−６−オキシ−８−アザプリン）を含む１０％ＦＢＳ添加のＤＭＥＭで増殖させ、１０７個以上回収できるまで培養し、８−アザグアニンとＦＢＳを含まないＤＭＥＭでさらに３回洗浄して回収した。
次に、１０７個のＰ３Ｕ１と１０８個の脾臓細胞を滅菌したスピッツ管に加えて混合し、１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を完全に取り除き、ボルテックスをかけてから、細胞融合用ポリエチレングリコール溶液｛ポリエチレングリコール１ｇ（平均分子量１，０００）、ＤＭＳＯ ０．３ｍｌ、ＤＭＥＭ ０．９ｍｌ｝を加えて２〜３回ピペッティングした。その後、スピッツ管が傾斜した状態で軽く振盪しながら、３０秒間隔でＦＢＳを含まないＤＭＥＭを１ｍｌずつ９回に分けて加えた。この細胞浮遊液を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上清を捨て、Ｐ３Ｕ１細胞が１０５〜１０６個／ｍｌになるように１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを添加した。この細胞懸濁液を平底の９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルで分注し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日、０．１ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ・ＨＡＴ（ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭを含むＤＭＥＭ）を添加し、さらに２日後、４日後に各ウェルから０．１ｍｌずつ培地を吸引し、代わりに０．１ｍｌ／ウェルでＤＭＥＭ・ＨＡＴを添加して培地交換を行って、これ以降は２〜３日おきに培地交換を行った。融合しなかったミエローマ細胞や脾臓細胞は、１週間以内に死滅し、各ウェルには融合細胞だけが増殖してコロニーを形成した。融合後１０日目からはＤＭＥＭ・ＨＡＴからアミノプテリンのみを取り除いた培地（ＤＭＥＭ・ＨＴ）で培養して、脾臓細胞とミエローマ細胞を融合した融合細胞（ハイブリドーマ）が得られた。
【００２２】
（３）コクシジウム原虫に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選択
このようにして得られたハイブリドーマが、ウェルの４０％以上の面積を占めた時点で培養上清を１００μｌとり、一次スクリーニングとしてハイブリドーマの抗体産生性を間接酵素抗体法で調べた。まず、抗マウスイムノグロブリンをバイカーボネートバッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．８）に２０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈して、９６ウェルプレートに５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．３以下、ＰＢＳ−ＴＷという）で各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）でウェルを満たし、室温で１時間インキュベートしてウェルのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌずつ加えて、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳで１，０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンを５０μｌ分注し室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、パーオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ｛２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）｝を加え、室温で１０分間インキュベートした。
【００２３】
これを、イムノリーダーを用いて、波長４０５ｎｍに対する吸光度を測定し、０．１以上の吸光度を示したウェルに対応するハイブリドーマ培養上清について、二次スクリーニングとして、コクシジウム原虫に対する反応性を以下のように調べた。アイメリア・テネラのスポロゾイト虫体１０６個を凍結融解し、生存虫体がいないことを確認した後、ＰＢＳで３回洗浄し、バイカーボネートバッファーに１μｇ／ｍｌになるように希釈して９６ウェルプレートに５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエースでウェルを満たし、室温で１時間インキュベートしてウェルのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌずつ加えて、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳで１，０００倍に希釈したビオチン化抗マウスイムノグロブリンを５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、アビジン結合パーオキシダーゼをＰＢＳで１，０００倍希釈して５０μｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＡＢＴＳ｛２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）｝を加え、室温で１０分間インキュベートした。これをイムノリーダーを用いて、波長４０５ｎｍに対する吸光度を測定し、０．１以上の吸光度を示したウェルに対応するハイブリドーマについて、限界希釈法によりクローニングした。
【００２４】
（３）ハイブリドーマの腹水化
次に、クローニングしたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を大量に得る目的で、４週間前にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを腹腔内投与したマウスに、約１０８個のハイブリドーマを移植した。１〜３週間後に腹腔内にたまった腹水を注射器で採取した。採取した腹水は、３，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を採取し、５６℃で３０分間処理して非働化した。これらは、使用するまで−８０℃で保存した。
【００２５】
（４）モノクローナル抗体のコクシジウムの鶏胎児繊維芽細胞への侵入阻害活性
上記（１）で調製したアイメリア・テネラのスポロゾイト虫体をイーグルＭＥＭ培地で１０００スポロゾイト／ｍｌとなるように調製した。上記（３）で取得し、保存している腹水を、１０倍、５０倍、２５０倍に希釈した。調製した１ｍｌのテネラスポロゾイトと腹水１ｍｌをよく混合し、４１℃、１時間インキュベートした。ネガティブコントロールとしては、コクシジウムと関係のない抗原であるマイコプラズマ・ガリセプティカム抗原に反応する３５Ａ６ハイブリドーマ（特開平９−１０３２９４号公報）の腹水を同様の混合比でテネラスポロゾイトと混合させたものと、イーグルＭＥＭで５００スポロゾイト／ｍｌとなるように調製したスポロゾイト懸濁液２ｍｌを用いた。インキュベート後、９ｃｍ径の細胞培養用ディッシュにコンフルエントになった培養鶏胎児繊維芽細胞に加えた。４１℃、１時間、細胞用炭酸ガス孵卵器においてインキュベートした後に、牛胎児血清を含まないイーグルＭＥＭ培地で三回洗浄し、細胞に吸着しなかったスポロゾイトを洗い流した。洗浄後、細胞に−２０℃のメタノール１０ｍｌを加え、１０分インキュベートした。メタノールを捨てた後、風乾したプレートに、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエースでディッシュを満たし、室温で１時間インキュベートしてウェルのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、１０ｍｌの６Ｄ１２抗コクシジウムモノクローナル抗体（ニワトリ型）（Ｊ． Ｐａｓｉｔｏｌ．、８４、６５４−６５６（１９９８））でディッシュを満たし、３７℃、１時間インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄した後、ＰＢＳで１００倍に希釈したＦＩＴＣラベル抗ニワトリＩｇＧ（シグマ社製）抗体を添加し、３７℃、３０分インキュベートした。ＰＢＳで４回十分にラベル抗体を洗い流し、倒立位相差蛍光顕微鏡を用いて蛍光を発する虫体の数をカウントした。ディッシュ全体の鶏胚繊維芽細胞に侵入したスポロゾイト虫体の数をカウントし、ネガティブコントロールの侵入スポロゾイト数を１００とした場合のモノクローナル抗体処理した場合の数の割合を１００％から引いた％を阻止率とした。その結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
１Ｇ４、３Ａ５、４Ｃ８、７Ｂ１２、９Ｄ６が産生するモノクローナル抗体を含む腹水では、アイメリア・テネラのスポロゾイト虫体の鶏胎児繊維芽細胞への侵入が非常に強く阻止された。これらの結果から、ハイブリドーマ１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）、ハイブリドーマ３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）、ハイブリドーマ４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）、ハイブリドーマ７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）、ハイブリドーマ９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）が産生するモノクローナル抗体が感染防御抗体であって、その認識する抗原が感染防御抗原であることが判った。
【００２８】
（５）各ハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプの決定
次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体のクラスまたはサブクラスを、ＩＳＯＴＹＰＥ Ａｂ−ＳＴＡＴＴＭ （ＳａｎｇＳｔａｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により決定した。その結果、全てのハイブリドーマはは、ＩｇＧ１抗体を産生することが確認された。
【００２９】
（６）モノクローナル抗体の認識する抗原の分子量測定
上記モノクローナル抗体が認識するアイメリア・テネラのスポロゾイト抗原の分子量を測定するために、ウェスタンブロッティングを、以下に示す通りに行った。まず、前記（１）記載の方法で取得したアイメリア・テネラのスポロゾイト抗原１００μｇをＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５，１９７０）に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、菌体タンパク質を分子量に応じて展開した。次に、ポリアクリルアミドゲル上に展開されたタンパク質を、トランスファーバッファー（１０％メタノール、０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン）にてウェッティング処理をした疎水性フィルターメンブレン（孔径０．２２μｍ）に電気的にブロッティングした。このフィルターメンブレンをＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ブロックエースに室温で１時間浸して、メンブレンのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳにて１，０００倍に希釈した各モノクローナル抗体を含む腹水にメンブレンを浸し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳにて１，０００倍に希釈したビオチン化抗マウスイムノグロブリンにメンブレンを浸し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳにて１，０００倍に希釈したアビジン結合アルカリフォスファターゼにメンブレンを浸し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色性基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）中にメンブレンを浸し、室温で１０分間インキュベートした。その結果、４Ｃ８が産生するモノクローナル抗体は、分子量約５０キロダルトンのタンパク質に反応した。この結果から、この分子量約５０キロダルトンのタンパク質は、アイメリア・テネラの感染防御抗原であると推定された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コクシジウム原虫アイメリア・テネラに対するモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の養鶏業界において経済的損失をもたらす疾病のひとつにコクシジウム感染症が挙げられる。この疾病の原因はコクシジウム原虫（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）である。鶏に感染し、病原性を示すコクシジウム原虫は７種類が知られている（Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１））。この中でも４種類のコクシジウム原虫感染が問題となっている。問題となっている４種類の原虫はＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ（アイメリア・テネラ）、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（アイメリア・アッセルブリナ）、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ（アイメリア・マキシマ）、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ（アイメリア・ネカトリックス）である。この中でも、アイメリア・テネラとアイメリア・アッセルブリナが最も大きな被害をもたらしている。コクシジウム病は幼雛期から中雛期において主に発生する。感染した雛は、下痢症状を起こし、濃厚感染の場合は死亡にいたるが、通常は一時的に極度の増体効果の低下を招く。また、異なるコクシジウム原虫の感染により、増体低下が長期間に亘ることも知られている。鶏の生活において、この時期は肥育・育成期間であり、このような増体効果の低下は飼料効率に影響し、深刻な経済損失を招く。特に飼育期間が短いブロイラー産業においては、コクシジウム感染は重大な問題となっている。現在、コクシジウム感染の予防に対しては抗コクシジウム剤が用いられている。抗コクシジウム剤は全コクシジウムに対して効果があるが、コクシジウム剤耐性原虫の出現や、残留薬剤の問題などから、使用量や使用期間が限られ、休薬期間も設けられている。また、鶏舎が一旦コクシジウムに汚染されると、完全に清浄化することは至難の業で、汚染防止のためには、薬剤を使いつづけなければならない。また、近年、コクシジウム症予防に効果があるとして、生ワクチンが使用されるようになってきた。しかし、生ワクチンの有効成分であるワクチン株が変異して強毒化した場合には、鶏舎を汚染することもある。また、変異しない場合でも、ワクチンとして投与されたコクシジウムは、抗コクシジウム剤によって殺されるため、薬剤の併用が不可能である。そのため、従来、少量の抗コクシジウム剤で抑えられてきた他の原虫感染症が発生する場合もある。
【０００３】
こうしたワクチンの研究や、治療薬の研究においては、病原体の、感染、増殖、発症に関与するタンパク質から多くの情報を得ている。
ウイルスの場合、発現するタンパク質の種類が少ないため、何らかの機能を有するモノクローナル抗体が比較的容易に得られ、このモノクローナル抗体を用いて何らかの機能を有するタンパク質や遺伝子を得ることが容易である。しかしながら、コクシジウム原虫の場合、発現するタンパク質の種類も莫大であり、しかも、生活環により、発現するタンパク質が異なり、各ステージにおいて形態も、発現する抗原も異なっている。このため、目的とする機能を有するモノクローナル抗体を得ることが極めて困難であり、モノクローナル抗体を用いない同定法、例えば、原虫タンパク質を精製して調べる方法、ｃＤＮＡからλｇｔ１１ライブラリーを作製してコクシジウム原虫感染血清でスクリーニングする方法、他のアイメリア属で既知の感染防御抗原遺伝子と高いホモロジーを持つコクシジウム原虫遺伝子から抗原を見いだす方法など（特許第３０５１１３０号公報、特表平９−５０４６０４号公報、特開平１０−１８２４８３号公報など）、煩雑な操作を伴う方法によって、タンパク質の同定がなされているのが現状である。
しかし、上述した通り、コクシジウムに関しては、機能性のタンパク質を同定することが困難であり、従来のコクシジウムワクチンやコクシジウム感染治療薬の開発を阻んでいた。
【０００４】
【特許文献１】特許第３０５１１３０号公報
【特許文献２】特表平９−５０４６０４号公報
【特許文献３】特開平１０−１８２４８３号公報
【非特許文献１】Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、かかる従来技術の下で新たな抗原タンパク質を得るべく鋭意検討した結果、コクシジウム原虫の腸管細胞への侵入時期が、スポロゾイトステージもしくはメロゾイトステージであることに着目し、スポロゾイトステージの虫体を用いてハイブリドーマの作製を試みた結果、このハイブリドーマが、抗体がコクシジウム原虫の鶏細胞への侵入を強力に抑制する活性を有するモノクローナル抗体を産生することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かくして本発明によれば、
（１）コクシジウム原虫アイメリア・テネラに反応するモノクローナル抗体であって、コクシジウム原虫アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるモノクローナル抗体、
（２）コクシジウム原虫アイメリア・テネラのスポロゾイトステージの虫体を免疫したマウスから得られた脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて作製した、請求項１または２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（３）前記モノクローナル抗体を用いたコクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の抗原タンパク質の同定方法、
（４）前記モノクローナル抗体が認識するコクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の化合物、
（５）前記（１）記載のモノクローナル抗体を有効成分とするコクシジウム原虫アイメリア・テネラ感染症治療薬、
が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
かくして本発明によれば、アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入阻止活性のある新規なモノクローナル抗体、およびこれを産生するハイブリドーマが得られる。コクシジウム原虫の感染防御抗原を認識する本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫の抗原の同定に用いることができる。また、同定された抗原はワクチン抗原として利用できると期待されるほか、当該モノクローナル抗体自体をコクシジウム原虫感染症の治療薬として用いることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（１）モノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫であるアイメリア・テネラに反応し、
かつアイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるものである。本発明において「アイメリア・テネラに反応する」とは、アイメリア・テネラ由来のタンパク質をモノクローナル抗体が認識し、抗原抗体反応を呈することを言う。抗原抗体反応の確認は、ハイブリドーマ培養上清を用いた間接酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により行う。具体的な条件は、実施例の（２）に記載された通りである。この実施例の条件下での培養上清の吸光度が０．１以上であるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が好ましい。
【０００９】
本発明において「アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻止する」とは、上記アイメリア・テネラのスポロゾイトステージである原虫の鶏胚繊維芽細胞への侵入を阻止することをいい、具体的には、以下の方法により侵入を阻止することを確認する。
アイメリアのスポロゾイト虫体をモノクローナル抗体を含む腹水の希釈液と混合した後に鶏胎児繊維芽細胞に加え、細胞へ侵入するコクシジウム虫体数の減少率で阻止効果を測定し、コクシジウム虫体と全く無関係な抗原と反応するモノクローナル抗体を含む腹水と虫体とを混合した場合の細胞への侵入数を１００％とした場合の侵入虫体数の減少が有意に認められた（即ち、実施例の（４）において得られる侵入阻止率が２０％を超えた）場合に活性があると判断する。
【００１０】
このようなモノクローナル抗体としては、本願明細書実施例において感染防御抗体として確認された１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）、３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）、４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）、７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）、９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）が挙げられる。これらのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のサブクラスはＩｇＧ１である。ハイブリドーマ３Ａ５から産生されるモノクローナル抗体はアイメリア・テネラが発現する９０〜１２０キロダルトンのアイメリア・テネラの抗原タンパク質のエピトープを認識するものである。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、スポロゾイトステージにある、アイメリア・テネラを免疫したマウスなどから得られた脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて作製したハイブリドーマから産生される。
免疫に用いるコクシジウム原虫の具体例としては、アイメリア・テネラ、アイメリア・アッセルブリナ、アイメリア・マキシマ、アイメリア・ネカトリックス、アイメリア・ブルネッティ、アイメリア・ミティスなどの、攻撃株や野外分離株などが例示される。免疫虫体量は通常１０４〜１０１０／ｍｌの濃度に調製したものを用いる。
【００１２】
免疫に際して、虫体は凍結融解によって殺しても良いが、特にマウスに接種する場合は、感染の危険がないので、そのままアジュバンドと混合して免疫しても良い。この虫体を免疫する際に用いられるアジュバントは特に限定されるものではないが、フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）のほか、アラム、アラセル、ミョウバンなどが用いられる。虫体とアジュバントとの混合比率は免疫が成立する限りにおいて特に制限されないが、通常１：１である。コクシジウム原虫によって免疫される動物はマウスのほか、ラットやハムスターなどが例示され、これらの動物の系統についても特に制限されないが、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスを用いる。またこれらの動物の他、ヒトのリンパ節細胞や末梢リンパ球などを用いることができる。
【００１３】
本発明において用いられるマウスミエローマ細胞はＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ８．６５３、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）などが挙げられるが、好ましくはＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）である。また、融合する脾臓細胞は動物種を問わないが、融合後の細胞の生育状況から考えるとミエローマと同一種の細胞が好ましい。
【００１４】
細胞融合時に用いるポリエチレングリコールは重合平均分子量１，０００〜４，０００、好ましくは１，０００〜２，０００を用いる。このときジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を３０（ｗ／ｖ）％加えると、尚好ましい。
【００１５】
融合細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生性を確認する方法は、通常、細胞培養上清と抗マウスイムノグロブリンとのゲル沈降反応または間接酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）を用い、抗体産生性を確認したハイブリドーマについては、コクシジウム虫体を固定化したＥＬＩＳＡ法または、コクシジウム虫体が侵入している鶏胎児繊維芽細胞を固定化したＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマの産生する抗体が、コクシジウム虫体に反応することを確認する。得られたハイブリドーマは、対数増殖期にある細胞１０５〜１０９個を、１０％ＤＭＳＯ、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む１〜２ｍｌのダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）に懸濁させ、−８０℃で２時間以上凍結して液体窒素中で保存するなど、通常の培養細胞の保存方法によって保存できる。
【００１６】
また、本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫より抽出したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開し、フィルターメンブレンにブロットした後モノクローナル抗体を反応させるウエスタンブロット法や、コクシジウム原虫のゲノムＤＮＡ断片を挿入して作製したλｇｔ−１１ライブラリーからモノクローナル抗体が反応する抗原を発現するファージを選択する方法などに用いることで、コクシジウム原虫由来の抗原タンパク質を同定することができる。
【００１７】
上述した方法により得られるモノクローナル抗体は、いずれもコクシジウム原虫由来の化合物を認識するものであるが、エピトープ等の認識部位を有する化合物を得るための通常の方法、例えば、本発明で得られたモノクローナル抗体を固定化したカラムに、コクシジウム原虫の破砕抽出物を吸着させるアフィニティーカラムクロマトグラフィーや、モノクローナル抗体とプロテインＡなどのイムノグロブリン吸着タンパク質との複合体を用いて、マコクシジウム原虫由来の化合物を吸着させる免疫沈降法などが挙げられる。
【００１８】
さらに本発明のモノクローナル抗体は、コクシジウム原虫感染症に対する治療薬として用いることができる。このモノクローナル抗体は、薬学的に許容されるキャリアー（生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など）と混合して用いることができ、経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、ニワトリの週齢、投与形態等により異なるが、通常、１羽あたり１〜５００μｇ程度である。
【実施例】
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体について、以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は、これら実施例に限られるものではない。
【００２０】
（１）コクシジウム原虫のマウスへの免疫
１０８個のアイメリア・テネラ野外分離株 Ｒｔ株のオーシストを試験感染鶏の糞便より回収し、オーシストを精製した後、１０ｍｌのＰＢＳを加えて、オーシスト懸濁液を作製した。このオーシスト懸濁液に約３倍量の３０％次亜塩素酸ナトリウム液を加え、滅菌した遠心管に移し、１０分間、室温に放置して殺菌処理した後、１５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心した。上清部分を取り除いたあと、沈殿を５０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、１５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心し上清を取り除いた。この洗浄操作を三回繰り返して次亜塩素酸を取り除いたあと、オーシストを約３ｍｌの滅菌ＰＢＳに浮遊させた後、これをテフロン（登録商標）製ホモジナイザー（５ｍｌ）に入れ、１２０から１５０ｒ．ｐ．ｍ．の速さで１０から１５分間処理して、オーシストの外壁を壊してスポロシストにした。次に遊離させたスポロシストに２５ｍｌのトリプシン液（０．３％トリプシン−ＰＢＳ）を加え、更に３ｍｌの雛胆汁を加えて、４０℃で１．５時間インキュベートした。スポロゾイトの脱殻率が８０〜９０％以上に達したところで加温を中止し、１０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離した。沈殿をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに懸濁し、免疫用コクシジウム原虫のスポロゾイト抗原とした。１０６個／ｍｌにＰＢＳで調製したスポロゾイトを−８０℃の超低温冷凍庫で一度凍らせた後解凍し、等量のフロイントコンプリートアジュバンド（ＦＣＡ）と混合し、１／４量を１匹の七週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの背部皮下に免疫した。４週間後に同様に調製したスポロゾイト抗原を、フロイントインコンプリートアジュバント（ＦＩＡ）と混合し、１／４量を背部皮下に追加免疫した。
【００２１】
（２）ハイブリドーマの作製
追加免疫後３日目にマウスから脾臓を摘出し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中でピンセットとハサミでほぐした後、滅菌した１００μｍ径のステンレスメッシュを通して、単離した脾臓細胞を得た。この細胞は、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭでさらに３回洗浄した。
一方、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１は、１０−８ Ｍの８−アザグアニン（２−アミノ−６−オキシ−８−アザプリン）を含む１０％ＦＢＳ添加のＤＭＥＭで増殖させ、１０７個以上回収できるまで培養し、８−アザグアニンとＦＢＳを含まないＤＭＥＭでさらに３回洗浄して回収した。
次に、１０７個のＰ３Ｕ１と１０８個の脾臓細胞を滅菌したスピッツ管に加えて混合し、１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を完全に取り除き、ボルテックスをかけてから、細胞融合用ポリエチレングリコール溶液｛ポリエチレングリコール１ｇ（平均分子量１，０００）、ＤＭＳＯ ０．３ｍｌ、ＤＭＥＭ ０．９ｍｌ｝を加えて２〜３回ピペッティングした。その後、スピッツ管が傾斜した状態で軽く振盪しながら、３０秒間隔でＦＢＳを含まないＤＭＥＭを１ｍｌずつ９回に分けて加えた。この細胞浮遊液を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上清を捨て、Ｐ３Ｕ１細胞が１０５〜１０６個／ｍｌになるように１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを添加した。この細胞懸濁液を平底の９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルで分注し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日、０．１ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ・ＨＡＴ（ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭを含むＤＭＥＭ）を添加し、さらに２日後、４日後に各ウェルから０．１ｍｌずつ培地を吸引し、代わりに０．１ｍｌ／ウェルでＤＭＥＭ・ＨＡＴを添加して培地交換を行って、これ以降は２〜３日おきに培地交換を行った。融合しなかったミエローマ細胞や脾臓細胞は、１週間以内に死滅し、各ウェルには融合細胞だけが増殖してコロニーを形成した。融合後１０日目からはＤＭＥＭ・ＨＡＴからアミノプテリンのみを取り除いた培地（ＤＭＥＭ・ＨＴ）で培養して、脾臓細胞とミエローマ細胞を融合した融合細胞（ハイブリドーマ）が得られた。
【００２２】
（３）コクシジウム原虫に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選択
このようにして得られたハイブリドーマが、ウェルの４０％以上の面積を占めた時点で培養上清を１００μｌとり、一次スクリーニングとしてハイブリドーマの抗体産生性を間接酵素抗体法で調べた。まず、抗マウスイムノグロブリンをバイカーボネートバッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．８）に２０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈して、９６ウェルプレートに５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．３以下、ＰＢＳ−ＴＷという）で各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）でウェルを満たし、室温で１時間インキュベートしてウェルのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌずつ加えて、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳで１，０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンを５０μｌ分注し室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、パーオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ｛２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）｝を加え、室温で１０分間インキュベートした。
【００２３】
これを、イムノリーダーを用いて、波長４０５ｎｍに対する吸光度を測定し、０．１以上の吸光度を示したウェルに対応するハイブリドーマ培養上清について、二次スクリーニングとして、コクシジウム原虫に対する反応性を以下のように調べた。アイメリア・テネラのスポロゾイト虫体１０６個を凍結融解し、生存虫体がいないことを確認した後、ＰＢＳで３回洗浄し、バイカーボネートバッファーに１μｇ／ｍｌになるように希釈して９６ウェルプレートに５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエースでウェルを満たし、室温で１時間インキュベートしてウェルのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌずつ加えて、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳで１，０００倍に希釈したビオチン化抗マウスイムノグロブリンを５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、アビジン結合パーオキシダーゼをＰＢＳで１，０００倍希釈して５０μｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＡＢＴＳ｛２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）｝を加え、室温で１０分間インキュベートした。これをイムノリーダーを用いて、波長４０５ｎｍに対する吸光度を測定し、０．１以上の吸光度を示したウェルに対応するハイブリドーマについて、限界希釈法によりクローニングした。
【００２４】
（３）ハイブリドーマの腹水化
次に、クローニングしたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を大量に得る目的で、４週間前にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを腹腔内投与したマウスに、約１０８個のハイブリドーマを移植した。１〜３週間後に腹腔内にたまった腹水を注射器で採取した。採取した腹水は、３，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を採取し、５６℃で３０分間処理して非働化した。これらは、使用するまで−８０℃で保存した。
【００２５】
（４）モノクローナル抗体のコクシジウムの鶏胎児繊維芽細胞への侵入阻害活性
上記（１）で調製したアイメリア・テネラのスポロゾイト虫体をイーグルＭＥＭ培地で１０００スポロゾイト／ｍｌとなるように調製した。上記（３）で取得し、保存している腹水を、１０倍、５０倍、２５０倍に希釈した。調製した１ｍｌのテネラスポロゾイトと腹水１ｍｌをよく混合し、４１℃、１時間インキュベートした。ネガティブコントロールとしては、コクシジウムと関係のない抗原であるマイコプラズマ・ガリセプティカム抗原に反応する３５Ａ６ハイブリドーマ（特開平９−１０３２９４号公報）の腹水を同様の混合比でテネラスポロゾイトと混合させたものと、イーグルＭＥＭで５００スポロゾイト／ｍｌとなるように調製したスポロゾイト懸濁液２ｍｌを用いた。インキュベート後、９ｃｍ径の細胞培養用ディッシュにコンフルエントになった培養鶏胎児繊維芽細胞に加えた。４１℃、１時間、細胞用炭酸ガス孵卵器においてインキュベートした後に、牛胎児血清を含まないイーグルＭＥＭ培地で三回洗浄し、細胞に吸着しなかったスポロゾイトを洗い流した。洗浄後、細胞に−２０℃のメタノール１０ｍｌを加え、１０分インキュベートした。メタノールを捨てた後、風乾したプレートに、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエースでディッシュを満たし、室温で１時間インキュベートしてウェルのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、１０ｍｌの６Ｄ１２抗コクシジウムモノクローナル抗体（ニワトリ型）（Ｊ． Ｐａｓｉｔｏｌ．、８４、６５４−６５６（１９９８））でディッシュを満たし、３７℃、１時間インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄した後、ＰＢＳで１００倍に希釈したＦＩＴＣラベル抗ニワトリＩｇＧ（シグマ社製）抗体を添加し、３７℃、３０分インキュベートした。ＰＢＳで４回十分にラベル抗体を洗い流し、倒立位相差蛍光顕微鏡を用いて蛍光を発する虫体の数をカウントした。ディッシュ全体の鶏胚繊維芽細胞に侵入したスポロゾイト虫体の数をカウントし、ネガティブコントロールの侵入スポロゾイト数を１００とした場合のモノクローナル抗体処理した場合の数の割合を１００％から引いた％を阻止率とした。その結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
１Ｇ４、３Ａ５、４Ｃ８、７Ｂ１２、９Ｄ６が産生するモノクローナル抗体を含む腹水では、アイメリア・テネラのスポロゾイト虫体の鶏胎児繊維芽細胞への侵入が非常に強く阻止された。これらの結果から、ハイブリドーマ１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）、ハイブリドーマ３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）、ハイブリドーマ４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）、ハイブリドーマ７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）、ハイブリドーマ９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）が産生するモノクローナル抗体が感染防御抗体であって、その認識する抗原が感染防御抗原であることが判った。
【００２８】
（５）各ハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプの決定
次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体のクラスまたはサブクラスを、ＩＳＯＴＹＰＥ Ａｂ−ＳＴＡＴＴＭ （ＳａｎｇＳｔａｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により決定した。その結果、全てのハイブリドーマはは、ＩｇＧ１抗体を産生することが確認された。
【００２９】
（６）モノクローナル抗体の認識する抗原の分子量測定
上記モノクローナル抗体が認識するアイメリア・テネラのスポロゾイト抗原の分子量を測定するために、ウェスタンブロッティングを、以下に示す通りに行った。まず、前記（１）記載の方法で取得したアイメリア・テネラのスポロゾイト抗原１００μｇをＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５，１９７０）に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、菌体タンパク質を分子量に応じて展開した。次に、ポリアクリルアミドゲル上に展開されたタンパク質を、トランスファーバッファー（１０％メタノール、０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン）にてウェッティング処理をした疎水性フィルターメンブレン（孔径０．２２μｍ）に電気的にブロッティングした。このフィルターメンブレンをＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ブロックエースに室温で１時間浸して、メンブレンのタンパク質未吸着部分をブロッキングした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳにて１，０００倍に希釈した各モノクローナル抗体を含む腹水にメンブレンを浸し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳにて１，０００倍に希釈したビオチン化抗マウスイムノグロブリンにメンブレンを浸し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、ＰＢＳにて１，０００倍に希釈したアビジン結合アルカリフォスファターゼにメンブレンを浸し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色性基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）中にメンブレンを浸し、室温で１０分間インキュベートした。その結果、４Ｃ８が産生するモノクローナル抗体は、分子量約５０キロダルトンのタンパク質に反応した。この結果から、この分子量約５０キロダルトンのタンパク質は、アイメリア・テネラの感染防御抗原であると推定された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コクシジウム原虫アイメリア・テネラに反応するモノクローナル抗体であって、コクシジウム原虫アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるモノクローナル抗体。
【請求項２】
サブクラスがＩｇＧ１である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
コクシジウム原虫アイメリア・テネラのスポロゾイトステージの虫体を免疫したマウスから得られた脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞とを融合させて作製した、請求項１または２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
次の（１）〜（５）のハイブリドーマ。
（１）１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）
（２）３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）
（３）４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）
（４）７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）
（５）９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）
【請求項５】
請求項１または２記載のモノクローナル抗体を用いた、コクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の抗原タンパク質の同定方法。
【請求項６】
請求項１または２記載のモノクローナル抗体が認識するコクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の化合物。
【請求項７】
コクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の化合物がタンパク質である請求項６記載の化合物。
【請求項８】
請求項５記載の方法により取得されたものである請求項６又は７記載の化合物。
【請求項９】
請求項１または２記載のモノクローナル抗体を有効成分とするコクシジウム原虫アイメリア・テネラ感染症治療薬。
【請求項１】
コクシジウム原虫アイメリア・テネラに反応するモノクローナル抗体であって、コクシジウム原虫アイメリア・テネラの鶏細胞への侵入を阻害することのできるモノクローナル抗体。
【請求項２】
サブクラスがＩｇＧ１である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
コクシジウム原虫アイメリア・テネラのスポロゾイトステージの虫体を免疫したマウスから得られた脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞とを融合させて作製した、請求項１または２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
次の（１）〜（５）のハイブリドーマ。
（１）１Ｇ４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１１）
（２）３Ａ５（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１２）
（３）４Ｃ８（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１３）
（４）７Ｂ１２（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１４）
（５）９Ｄ６（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８１５）
【請求項５】
請求項１または２記載のモノクローナル抗体を用いた、コクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の抗原タンパク質の同定方法。
【請求項６】
請求項１または２記載のモノクローナル抗体が認識するコクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の化合物。
【請求項７】
コクシジウム原虫アイメリア・テネラ由来の化合物がタンパク質である請求項６記載の化合物。
【請求項８】
請求項５記載の方法により取得されたものである請求項６又は７記載の化合物。
【請求項９】
請求項１または２記載のモノクローナル抗体を有効成分とするコクシジウム原虫アイメリア・テネラ感染症治療薬。
【公開番号】特開２００７−２６１９５９（Ｐ２００７−２６１９５９Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８６００５（Ｐ２００６−８６００５）
【出願日】平成１８年３月２７日（２００６．３．２７）
【出願人】（０００２２９１１７）日本ゼオン株式会社 (1,870)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２７日（２００６．３．２７）
【出願人】（０００２２９１１７）日本ゼオン株式会社 (1,870)
【Ｆターム（参考）】
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