コロストリニン、およびその使用方法
【課題】哺乳動物の初乳から得られるポリペプチドであり、免疫向性活性、精神向性活性を有するコロストリニンの使用方法を提供する。
【解決手段】コロストリニンを栄養補助剤として使用し、固体又は液体の形態で供せられるコロストリニンの使用方法。特に、生理的に許容可能な賦形剤と組み合わせて生成された、隔離した形態でのコロストリニンを包含する経口薬としての使用方法。該栄養補助剤は、化学療法の対象にされた乳児、小児、成人、及び／又は悪液質に羅漢した成人、又は慢性疾患により体重減少した成人のための栄養補助食品として有用である。
【解決手段】コロストリニンを栄養補助剤として使用し、固体又は液体の形態で供せられるコロストリニンの使用方法。特に、生理的に許容可能な賦形剤と組み合わせて生成された、隔離した形態でのコロストリニンを包含する経口薬としての使用方法。該栄養補助剤は、化学療法の対象にされた乳児、小児、成人、及び／又は悪液質に羅漢した成人、又は慢性疾患により体重減少した成人のための栄養補助食品として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロストリニン、および医薬品としてのその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
初乳は、分娩後数日中に哺乳動物の母乳房より産生される濃厚な、黄色の液体である。初乳は、分娩後、約４日乃至５日で成熟母乳に取って代わる。成熟母乳に比べ、初乳に含まれる糖は少ない。しかし、初乳には脂質、蛋白質、無機塩類、ビタミンおよび免疫グロブリンが豊富である。また、顆粒細胞および間質細胞など各種浮遊細胞、好中球、単球／マクロファージおよびリンパ球を含むとともに、成長因子、ホルモンおよびサイトカインを含んでいる。
【０００３】
各種因子は哺乳動物の初乳から分離され、特徴づけられている。１９７４年、ヤヌツ（Ｊａｎｕｓｚ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９，２７６−２７９）は、ヒツジの初乳からプロリンが豊富なポリペプチド（ＰＲＰ）を分離した。この引例の内容は本願中に引例によって組み込まれている。以来、ヒツジ以外の哺乳動物はそれらの初乳の成分としてＰＲＰの類似物を有することが発見されている。ＰＲＰはそれ以来、コロストリニンと呼ばれており、新しいクラスのサイトカインとして暫定的に同定されている。
【非特許文献１】１９７４年、ヤヌツ（Ｊａｎｕｓｚ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９，２７６−２７９）
【非特許文献２】「プロリンが豊富なペプチド（ＰＲＰ）−ヒツジ初乳からの免疫修飾ペプチド」（Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ，１９９３，４１，２７５−２７９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヤヌツらは「プロリンが豊富なペプチド（ＰＲＰ）−ヒツジ初乳からの免疫修飾ペプチド」（Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ，１９９３，４１，２７５−２７９）において、ヒツジ初乳からのＰＲＰはマウスにおいて免疫向性活性を有することを指摘した。しかし、この文書にはＰＲＰが他の動物に対する治療的効果があることは示されていない。組成物がマウスに対して治療的効果があるということが、他の動物に対する治療的効果があると示しているとみなすことはできないと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
われわれは現在、コロストリニンにはこれまでに未知の多くの治療的効果があることを見出している。特に、われわれはコロストリニンによって免疫向性活性が得られるとともに、精神向性活性が得られることを見出している。
【０００６】
本発明の１つの態様により、われわれは医薬品として使用するためのコロストリニンを提供する。このコロストリニンは非げっ歯哺乳動物用の医薬品としても使用することができ、われわれはコロストリニンが特にヒトの治療用医薬品として有用であることを見出した。
【０００７】
本発明の別の態様により、中枢神経系の障害または免疫系の障害を治療するための医薬品の製造におけるコロストリニンの使用方法が得られる。
【０００８】
本発明の有利な実施例において、コロストリニンは中枢神経系の障害、特に中枢神経系の慢性疾患の治療のために使用される。コロストリニンで治療できる中枢神経系の障害として、神経障害および精神障害が挙げられる。
【０００９】
コロストリニンにより有利に治療できる神経障害の例として、痴呆、および神経変性障害など痴呆の原因となる障害が挙げられる。神経変性障害として、たとえば、老年性痴呆および運動ニューロン疾患が挙げられ、パーキンソン病はコロストリニンで治療できる運動ニューロン疾患の例である。コロストリニンは特にアルツハイマー病として知られる神経変性疾患の治療において有効であることが明らかにされている。
【００１０】
コロストリニンにより有利に治療できる精神障害の例として、精神病および神経症が挙げられる。たとえば、コロストリニンを用いて、情動障害、特にうつ状態の精神病患者の情動障害を治療することができ、コロストリニンの使用は、福利の感情の改善および気分安定化により患者を助けることが明らかにされている。コロストリニンは、解毒期間後の薬物依存症、および興奮薬依存患者における補助回収としても用いることができる。
【００１１】
本発明の別の有利な実施例において、コロストリニンは免疫系、特に免疫系の慢性疾患の治療において使用される。したがって、われわれはコロストリニンが免疫調節を必要とする疾患の治療において使用できることを見出した。特に、われわれはコロストリニンがヒトを含む非げっ歯動物のこのような疾患の治療に有用であることを見出した。コロストリニンは免疫および感染基礎の各種疾患の治療において有用である。たとえば、コロストリニンを用いて、細菌性およびウイルス性病因の慢性疾患を治療するとともに、たとえば、腫瘍の化学療法または放射線療法後に進展した後天性免疫不全を治療することができる。本発明は特に非特異的免疫刺激および免疫矯正を必要とする慢性細菌性およびウイルス性感染症の治療に有用である。
【００１２】
一般に、慢性疾患は、通常少なくとも１週間、さらに通常１カ月、および多くの場合、少なくとも３カ月または少なくとも６カ月の長期間にわたって持続する疾患である。
【００１３】
新生児の免疫系の進展を改善するためにコロストリニンを使用することが本発明の特徴である。さらに、コロストリニンを用いて小児における免疫不全を矯正することが本発明の特徴である。コロストリニンのこれらの使用は特に初乳が失われた乳児または小児に適用可能である。これは、たとえば、出産から母乳が供給されなかった乳児および小児においてみられ、このような乳児および小児に与えられる人工栄養はコロストリニンを含有しない。
【００１４】
本発明の別の態様により、われわれは栄養補助剤としてのコロストリニンの使用方法を提供する。コロストリニンは特に免疫系の進展における不足を矯正するために乳児および小児用の栄養補助剤として有利に使用される。上述したように、これらの不足は出産から母乳が供給されなかった乳児および小児において生じるとみられる。コロストリニンは化学療法の対象となった成人、または悪液質に罹患した成人、または慢性疾患により体重減少した成人用の栄養補助剤としても用いることができる。本発明の態様において、われわれは生理的に許容可能な賦形剤と組み合わせた経口摂取可能な併用を含む栄養補助剤を提供する。この栄養補助剤は液体または固体の形で提供され、またこの栄養補助剤は錠剤の形で適切に提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に従って、コロストリニンは中枢神経系および免疫系の疾患の進展を予防するために予防的に投与することができる。
【００１６】
上述した本発明の態様に用いられるコロストリニンはヒツジのコロストリニンであること、またはヒツジ以外のコロストリニンであることもできる。ヒツジ以外のコロストリニンは、たとえば、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヤク、ラマおよびロバから由来されるものとされる。初乳は通常、分娩後１日乃至４日間、これらの動物の初乳に存在する。
【００１７】
本願中で用いられる用語「コロストリニン」は、その天然の形状において、哺乳動物の初乳から得られるポリペプチドを指す。コロストリニンはときに「コロストリニン」として知られ、以下の特性を有する：
（ｉ）１６，０００ダルトン乃至２６，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。
【００１８】
（ｉｉ）５，０００ダルトン乃至１０，０００ダルトン、好ましくは６，０００ダルトンの範囲の分子量を有する各サブユニットの二量体または三量体のサブユニットである。
【００１９】
（ｉｉｉ）プロリンを含有し、プロリンの量はその他のいずれの単一アミノ酸の量を上回る。
【００２０】
われわれは、コロストリニン、およびコロストリニンを生成するサブユニットも無極性であるあることを見出した。
【００２１】
分子量は、ＳＤＳの存在下に電気泳動により測定することができ、二量体または三量体の存在は、同じ方法により示すことができる。サブユニット間の結合は還元状態および非還元状態における電気泳動により非共有結合である。プロリンの存在は在来のアミノ酸分析により確認することができる。
【００２２】
無極性は無極条件下にクロマトグラフィにより証明することができる。
【００２３】
本発明に使用されるコロストリニンはヒツジのコロストリニンまたはヒツジ以外のコロストリニンであってもよい。ヒツジのコロストリニンは分子量が約１８，０００ダルトンであり、約６，０００ダルトンの分子量を有するそれぞれ３つの非共有結合サブユニットで形成され、約２２ｗｔ％プロリンを含む。このアミノ酸組成物はサブユニット当たり以下の数の残基で形成されている： リシン−２、ヒスチジン−１、アルギニン−０、アスパラギン酸−２、トレオニン−４、セリン−３、グルタミン酸−６、プロリン−１１、グリシン−２、アラニン−０、バリン−５、メチオニン−２、イソロイシン−２、ロイシン−６、チロシン−１、フェニルアラニン−３、およびシステイン−０。
【００２４】
上述した通り、その天然形態におけるコロストリニンは哺乳動物の初乳から誘導される。コロストリニンは初乳から脂質および大部分の蛋白質を除去することにより哺乳動物の初乳から誘導することができる。概して、コロストリニンは、たとえば、カラムクロマトグラフィ法および他の生化学的方法を用いて大型飼育動物の初乳から得ることができ、または遺伝子工学法により得ることができる。
【００２５】
特に、コロストリニンは以下のステップを用いることにより哺乳動物の初乳から分離することができる。
【００２６】
（ｉ）たとえば遠心分離により脂質を除去するステップ、
（ｉｉ）たとえば、ｐＨを低下させることにより、カゼインなど蛋白質を除去するステップ、
（ｉｉｉ）たとえば、
（ａ）イオン交換クロマトグラフィによる脂質および蛋白質の除去後に形成されるホエーを処理するステップと、
（ｂ）リン酸緩衝食塩水で溶出し、免疫グロブリン、たとえばヒツジのＩｇＧ２に結合したコロストリニンを含有する画分を採集するステップと、により免疫グロブリンに結合したコロストリニンを分離するステップと、
（ｉｖ）免疫グロブリンから、たとえばクロマトグラフィをふるい分けすることによりコロストリニンを分離するステップと、
（ｖ）さらに免疫グロブリンからコロストリニンを分離し、
（ａ）分子量３０，０００ダルトン以下の画分を脱塩するステップと、
（ｂ）免疫グロブリンに抗体に導入することにより、このクラスの蛋白質を除去し、最終産物を得るステップと、によりコロストリニンを精製するステップ。
【００２７】
上の規定は天然に発生する哺乳動物のコロストリニンに関するものであるが、本願中で用いるコロストリニンという用語は、実質的に同じ生物学的活性を有するその類似物および断片、および哺乳動物のコロストリニン、組換え型ＤＮＡ法により産生されるその類似物およびその断片をも含む。本願中で用いられるコロストリニンは、ポリペプチド合成により生成された天然コロストリニンと実質的に同じ組成の生物学的に活性のポリペプチドをも含む。
【００２８】
本発明の別の態様において、コロストリニンを用いた中枢神経系および免疫系の疾患を治療する方法が提供される。本発明による方法を用いて有利に治療することができる疾患は上述されている。好ましい実施例において、コロストリニンは毎日約１乃至２治療単位で第１の期間に投与し、その後はコロストリニンが投与されない第２の期間とする。第１の期間は約２週乃至４週であることが好ましく、さらに好ましくは約３週であり、第２の期間は約２週乃至５週が好ましく、さらに好ましくは約４週である。この周期は少なくとも１回反復されることが好ましく、さらに好ましくは１回以上反復されることである。
【００２９】
本発明の方法において使用するための治療単位は２５μｇ乃至１，０００μｇの範囲のコロストリニンが好ましく、さらに好ましくは５０μｇ乃至１００μｇである。
【００３０】
コロストリニンは適切な形態における投与のために調製することができる。たとえば、経口、直腸または非経口投与のために調製することができる。特に、コロストリニンは、注射、または、好ましくは、食道または他の粘膜表面から口／鼻咽腔の粘膜を通じた吸収に適した形状における投与のために調製することができる。経口調製液は嚥下用の形状、または好ましくは唾液中で溶解するための形状で提供されることにより、調製液は口／鼻咽腔の粘膜において吸収される。経口調製液は、経口投与用の錠剤、バッカル剤（すなわち、口内に保持され、吸引されるために適した形状の甘味様錠剤）、ガム質にすり込むための粘着性ゲルの形状であってもよい。コロストリニンはガム質に適用される粘着性硬膏またはパッチとして調製することができる。コロストリニンは尿生殖器の粘膜に適用するために調製することもできる。
【００３１】
もちろん、コロストリニンを全初乳の形で投与することは可能であるが、全初乳には不快な味があり、保存が困難であるため、これは好ましくない。
【００３２】
本発明において使用するためのコロストリニンは、ヒト源またはウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヤク、ラマまたはロバ、ラクダ等など動物を含む哺乳動物から得ることができる。
【００３３】
コロストリニンの試験はヒツジおよびヒトのコロストリニンを用いて実施された。ヒツジのコロストリニンはコロストリニンＴＭの商標で市販されている。
【００３４】
実験動物での試験時、コロストリニンは、活性Ｔ細胞に対する胸腺細胞の転調の特性、分化の進展および成熟、および胸腺細胞での各種表面マーカーの発現の誘導に基づきｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫向性活性により特徴づけられることがわかった。マウスの腹腔内投与において、コロストリニンはＮＺＢ系のマウスにおける溶血性貧血の発生を抑制し、マウスの肉腫１８０の増殖を抑制するとともに、γ線に暴露したマウスにおいてＸ線宿酔から動物を保護する。マウスでの毒性学的試験では、経口および非経口投与後にきわめて低い毒性を示したが、ＬＤ５０は体重の１．２５ｇ／ｋｇである。コロストリニンはヒトおよび実験動物における免疫活性細胞の増殖、成熟および分化の刺激能を示す。ヒト抹消血のリンパ球の培養（臍帯血から分離したリンパ球の培養を含む）において、コロストリニンはサイトカイン、特にγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（たとえば、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）および各種増殖因子の産生を刺激するという点で特徴づけられる。産生されるサイトカインは既知の方法により量的に測定される。
【００３５】
天然状態において、その生化学的特性を処理したヒツジのコロストリニンの類似物は、分娩後１〜４日間にヒトの初乳および全動物、特にウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヤク、ヒツジ、ラマまたロバ、ラクダ等など大型飼育動物の初乳に存在する。コロストリニンは母初乳の吸引および嚥下時に新生動物の体内に入る。低分子量のため、コロストリニンは細胞受容体を介して口／鼻咽腔の粘膜に対して作用することが可能であり、通常の拡散の結果としても可能である。消化管上部の粘膜および上皮は一定の免疫調節薬のための受容体を含むため、研究において、吸引のための錠剤および舌下錠剤、嚥下のための錠剤およびカプセルの形状、粘着性ゲルの形状、およびガム質に固着するための粘着性硬膏の形状で投与することができる。コロストリニンは尿生殖器官の粘膜に適用することもできる。
【００３６】
コロストリニンにより誘発される生化学的活性を明らかにするための科学的研究では、分娩後１〜７日後の期間に女性から採集したヒト初乳を用いた場合に同様の生物学的活性の存在が示された。ヒト源のコロストリニンを分離するために用いた方法は、飼育動物の初乳、特にヒツジ初乳から得る方法と類似したものであった。分娩後１〜７日の女性の乳腺により分泌される初乳はポリペプチドコロストリニンを含み、その量は授乳によって決まり、約３００ｍｇが１ｌ（リットル）の初乳中に検出される場合、２〜３日が最適である。ヒトのコロストリニンのこの量はヒツジ初乳に見られる範囲である。ヒトのコロストリニンは、たとえばヒツジの類似物と同様の多くの生物学的特性を有することが証明された。ヒト初乳から由来のコロストリニンは初乳に存在するリンパ球、および臍帯血リンパ球を刺激し、主にインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α、インターロイキン（ＩＬ−１０およびＩＬ−６）および他のサイトカインを刺激することが明らかにされた。
【００３７】
ヒトおよび動物源のコロストリニンの生物学的活性は、ポーランド特許（ＰＬ １７０５９２ Ｂ１）および欧州特許ＥＰ−Ｂ−０６０９２２５，ｐｔ：免疫学試験によって既知の方法により測定された。
【００３８】
ボランティア被験者の試験において、毎日少なくとも１回の用量での少なくとも２５μｇコロストリニンを含む吸引用錠剤の投与後、約３週間にわたり、有害な反応が確認されないことがわかった。一方、インターフェロンＩＦＮ−γおよび部分的に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの誘発に対する反応性低下の状態が生じる。コロストリニンの投与中止後、反応性低下の状態は正常に戻る。こうして得られた反応は、Ｔｈ１およびＴｈ２リンパ球およびヘルパー細胞により産生されるサイトカインが関わった結果である。
【００３９】
また、臨床試験時、コロストリニンは免疫調節効果および中枢神経系に対する効果を示し、これらは以下の疾患において予防的および治療的に利用することができる。すなわち、たとえばアルツハイマー病の発生、進行の予防のため、および寛解のため、一部の他の原因の老年性痴呆および免疫的および感染基礎の慢性疾患の治療においてである。
【００４０】
コロストリニンの代わりに、以下の組成およびアミノ酸配列を有するノナペプチド指定ＮＰを用いることができる：Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ。ＮＰはキモトリプシンによる消化およびカラムクロマトグラフィによる分離、または化学合成の手段によりコロストリニンから得ることができる。ＮＰはコロストリニンの有用なフラグメントの例である。コロストリニンに対する同様の生物学的効果を示し、特に、上述した慢性免疫障害および中枢神経系障害、特にアルツハイマー病を治療するために有用であることが明らかにされている。ＮＰを用いて上述した障害のいずれも治療することができる。栄養補助においても使用することができる。これはコロストリニンと同じやり方で調製することができる。ＮＰは哺乳動物、特にヒトの治療のために有用である。
【００４１】
本発明をさらに完全に理解するために、例として添付実施例のみに引例を作成する。
【実施例】
【００４２】
＜実施例Ｉ＞
分子量６０００ダルトンの３つの非共有結合サブユニットから構成される分子量１８０００ダルトンのヒツジのコロストリニンにおいて、各サブユニットは以下のアミノ酸組成を有した：
コロストリニンは、授乳開始後２４時間までの分娩後に取られるヒツジ初乳から得た。脂肪およびカゼインの一部を除去するために、３５０００ｘｇで材料を遠心分離した。得られたＩｇ画分をＤＥＡＥセルロースカラムにかけ、ポリペプチドコロストリニンと複合した免疫グロブリンＩｇＧ２を分離し、カラムからの溶出時にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００でのカラムクロマトグラフィによりＩｇＧ２からコロストリニンを分離し、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００でクロマトグラフィを行った。次に、このペプチドの画分をヒツジＩｇＧ２に対する抗体と結合したセファロースのカラムにかけ、ＩｇＧ２汚染の痕跡を除去した。得られた製剤をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５により脱塩し、凍結乾燥させたのち、温度＋４℃または−２０℃で保存した。
【００４３】
こうして得られたコロストリニンは、商標コロストリニンＴＭで示されている。
【００４４】
ＳＤＳ存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量５８００ダルトンに対応する強い結合が１つ確認され、分子量１２４００ダルトンおよび１８２００ダルトンに対応する弱い結合が２つ確認された。
【００４５】
＜実施例ＩＩ＞
組成およびアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏを有するノナペプチドＮＰは、実施例Ｉで生成されたコロストリニンから得た。
【００４６】
５０ｍｇのコロストリニンを温度３０℃下に２０時間、蛋白分解酵素キモトリプシンの１０活性単位により消化した。消化産物からの分離は、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０を用いた少なくとも１サイクルのカラムクロマトグラフィにより行った。得られた製剤を凍結乾燥させ、温度＋４℃または−２０℃で保存した。分離ノナペプチドをＮ末端アミノ酸を決定する手段により分離した。
【００４７】
＜実施例ＩＩＩ＞
以下の組成物による吸引用の錠剤型における投与単位
組成：
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたコロストリニン
（Colostrinin（登録商標））ポリペプチド ０．０００１ｇ
安定剤： 不純物として主にＩ．Ｐ．Ｓ．を
含まないアルブミン ０．０００１３５ｇ
潤滑剤／結合剤：ステアリン酸マグネシウム ０．００３ｇ
賦形剤： マニトール ０．１５ｇ（０．１４９７ｇ）
上の成分を０．０００１Ｍ ＮａＣｌ中に懸濁した。吸引用錠剤は、アルツハイマー病を含む主に初期および後期の痴呆、および各種病期の老年性痴呆の治療、非特異的免疫刺激および免疫矯正を必要とする慢性細菌性およびウイルス性感染症および各種薬剤が原因の後天性免疫不全の治療のために使用される。また、特に精神病患者のうつ状態における情動障害で使用し、福利の一般的感情を改善して気分を安定化させるとともに、解毒期間後の薬物依存症、および興奮薬依存患者における補助回収としても用いられる。コロストリニンＴＭは人工栄養と関連した栄養不全を矯正するために新生児および小児において用いることもできる。
【００４８】
＜実施例ＩＶ＞
以下の組成物により粘膜に適用するためのゲルの形状での製剤
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたコロストリニンＴＭポリペプチド
安定剤： アルブミン
ゲル賦形剤： ペクチン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースの
ナトリウム塩および炭化水素ゲルを含有するオラバーゼ−
プレイン（Orabase-Plain（登録商標）
ポリペプチドコロストリニンＴＭ０．０００３ｇおよびアルブミン０．００１５ｇをゲル賦形剤１ｍｌ当たりで使用した。こうして調製された投与単位は、主に口腔および上気道の細菌性およびウイルス性感染症の周期性治療のために使用される。
【００４９】
＜実施例Ｖ＞
筋内、皮下または静脈内注射の形状での製剤。
【００５０】
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたコロストリニンＴＭポリペプチド
安定剤： 不純物を含まないヒトアルブミン
賦形剤： 滅菌、非発熱水
ポリペプチドコロストリニンＴＭ０．０００３ｇ、アルブミン０．００１５ｇおよび抗菌剤として、０．００１％Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ、すなわちethylmercurithiosalicylic asidのナトリウム塩を１ｍｌアンプル当たりで使用した。こうして得られた投与単位は主に細菌性感染症およびウイルス性感染症の周期的治療のために用いられる。
【００５１】
＜実施例ＶＩ＞
筋内、皮下または静脈内注射の形状での製剤。
【００５２】
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたＮＰ
安定剤： 不純物を含まないヒトアルブミン
賦形剤： 滅菌、非発熱水
ＮＰ０．０００３ｇ、アルブミン０．００１５ｇおよび抗菌剤として、０．００１％Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ、すなわちethylmercurithiosalicylic asidのナトリウム塩を１ｍｌアンプル当たりで使用した。こうして得られた投与単位は主に細菌性感染症およびウイルス性感染症の周期的治療のために用いられる。
【００５３】
＜実施例ＶＩＩ＞
周期的治療で実施例ＩＩＩにおける状態の剤型の薬剤を服用したボランティア健常者および患者から採取した血液のｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリペプチドコロストリニンＴＭによるサイトカインの誘導を以下の通り実施する。
【００５４】
保存剤を含まないヘパリン１ｍｌ当たり１０単位を含む全血をＲＰＭＩ１６４０培地で１：１０の比で希釈する。培養はインデューサー（陰性対照）のない同じ培地、またはポリペプチドコロストリニンＴＭ１〜１００μｇ／ｍｌの存在下またはフィトヘムアグルチン（ＰＨＡ）の２μｇ／ｍｌ血およびリポ多糖体（ＬＰＳ）の２μｇ／ｍｌ血の存在下、温度３７℃、５％炭酸ガスの環境下、２０時間にわたって行う。ＰＨＡとＬＰＳの混合液を含む試料が陽性対照であり、それらにより最大量のサイトカインが刺激される。試験結果を表１および表２に示す。それらは濃度１〜１００μｇ／ｍｌでコロストリニンＴＭが用量依存的にサイトカインの産生を刺激することを示している。陰性対照（インデューサーなし）に対して、これらの結果は統計的に有意である（Ｐ＜０．０００１）。アルツハイマー病患者はＩＦＮ産生能の低下を示し、わずかな程度にＴＮＦ産生能の低下も示している。
【００５５】
（表１）
健常ボランティアおよびアルツハイマー病患者の全血中に存在するリンパ球の培養におけるヒツジからのコロストリニンＴＭ（シリーズＡ１９９３）によるサイトカインの誘導。
【００５６】
健常ボランティア群（２２人）は異種であった（年齢範囲２０〜６４歳）。アルツハイマー患者群（５０人）も異種であった（年齢６３±７．５歳）。高い標準偏差（±ＳＤ）にもかかわらず、インデューサーなしの対照（欠）とコロストリニンＴＭ間の差は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）
（表２）
健常ボランティアおよび各種疾患患者の全血を用いた実験におけるヒツジからのコロストリニンＴＭ（シリーズＡ１９９３）によるインターフェロン（ＩＦＮ）の産生刺激の例
────────────────────────────────────
注：ＩＦＮ の存在についてのバイオ試験では各種類のインターフェロンの濃度を測定するが、ＥＬＩＳＡ試験では免疫活性ＩＦＮ−γの濃度のみを測定する。
【００５７】
＜実施例ＶＩＩＩ＞
ウロルワフの専門家地区病院婦人産科より得た臍帯血。分娩後４〜６時間に採取した臍帯血のリンパ球におけるｉｎ ｖｉｔｒｏコロストリニンＴＭによるサイトカインの誘導を以下のようにして実施する。
【００５８】
１００ｍｌ当たり５．７ｇの成分フィコール４００および９．０ｇの成分Ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍを含むＦｉｓｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）グラジエントを用いてリンパ球を分離する。分離したリンパ球を培地１ｍｌ当たり２×１０６リンパ球の密度でのＲＰＭＩ培地に懸濁する。濃度１〜２０μｇ／ｍｌのコロストリニンＴＭまたは濃度１０μｇ／ｍｌでのフィトヘムアグルチンをリンパ球懸濁液に添加する。培地を温度３７℃で２０時間培養する。次に培養液中のサイトカイン濃度を生化学的方法により測定する。典型的な例を表３に示す。濃度１〜１００μｇ／ｍｌでのコロストリニンＴＭは、古典的ＩＦＮ−γインデューサー−フィトヘムアグルチンにより示されたのとほぼ同じサイトカイン（ＩＦＮおよびＴＮＦ）の刺激能を有する。
【００５９】
（表３）
臍帯血（ＣＢＬ）から分離したリンパ球の培養におけるコロストリニンＴＭ（シリーズＡ１９９６）によるサイトカインの誘導
Ｎ−試験したＣＢＬ試料の数
スチューデントｔ検定における差コロストリニンＴＭの有意性の確率
−「欠」はＩＦＮおよびＴＮＦについてｐ＜０．００１。
【００６０】
臍帯血は未熟幹細胞が豊富であり、これらには造血細胞および各種免疫活性細胞の再生能があるため、得られた結果は、コロストリニンＴＭは幹細胞の成熟を大幅に促進することを示している。得られた結果は、各種類の免疫不全の治療や、たとえば損傷、感染、化学療法および放射線治療後に造血系を刺激するために、コロストリニンＴＭを使用することが可能である。生物医学的試験において、同様の活性の天然源の物質はきわめて稀にしか見られない。
【００６１】
＜実施例ＩＸ＞
中枢神経系の障害を治療する方法は、アルツハイマー病の初期および中期のボランティア患者群で試験した。投与単位を実施例Ｉおよび実施例ＩＩＩにおいて規定したコロストリニンＴＭ０．０００１５ｇを含む吸引用の錠剤型で食間に投与した。最初に、１日１錠を３週間使用し、２〜４週間治療を中断し、１日２錠を３週間投与することにより治療を反復した。コロストリニンＴＭ治療により低反応性または耐性の状態が誘発された。これはＩＦＮおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの合成能がないことで明らかにされる。この現象により活性剤の活動を量的に測定することができる。
【００６２】
これらの薬の投与を中止すると、耐性の状態は自然に逆転する。コロストリニンＴＭに対する一時的耐性の状態はＴｈ１およびＴｈ２リンパ球のほか、単球、マクロファージ、樹状細胞、および内皮細胞やそれらの産物などヘルパー細胞により産生されるサイトカインが関わった結果である。その結果、接触や気分の改善がアルツハイマー病患者において確認された。
【００６３】
図１は、３週間１日おきに１００μｇ錠のコロストリニンＴＭが投与された女性のアルツハイマー病患者（Ｊ．Ｍ．）におけるγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を誘導する低反応性（部分的耐性）の状態の出現および自然消失を示す。このあと、治療は３週間休止した（休止時、インデューサーに対する耐性は正常に戻る）。コロストリニンＴＭおよび対照インデューサー（ＰＨＡ−１０μｇ／ｍｌ）によるＩＦＮ−γの刺激を試験するための血液試料を毎日採取した。サイトカインの誘導およびそれらの量的測定のための試験を実施する方法は前節に述べた。
【００６４】
誘導ＩＦＮ−γ濃度の測定結果は、低反応性がコロストリニンＴＭ（１日おきに１００μｇ錠）を投与した第１週の間に出現し、治療の第３週で最大であることを示した。ＩＦＮ−γの誘導に対する耐性状態の逆転は、治療を休止した３週間（すなわち治療開始後６週目）に自然に生じた。さらに、このチャートはヒツジのコロストリニンＴＭ（ＯｖＣａｌ）に対して「特異的」である低反応性が観察の６週間に維持されていたが、ＰＨＡに対する低反応性は完全に消失したことを示す。
【００６５】
＜実施例Ｘ＞
中枢神経系の障害を治療する方法は、アルツハイマー病の初期および中期のボランティア患者群で試験した。投与単位を実施例ＩＩにおいて規定したＮＰ０．０００１５ｇを含む吸引用の錠剤型で食間に投与した。最初に、１日１錠を３週間使用し、３週間治療を中断し、１日２錠を３週間投与することにより治療を反復した。ＮＰ治療により低反応性または耐性の状態が誘発された。これはＩＦＮおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの合成能がないことで明らかにされる。この現象により活性剤の活動を量的に測定することができる。
【００６６】
これらの薬の投与を中止すると、耐性の状態は自然に逆転する。ＮＰに対する一時的耐性の状態はＴｈ１およびＴｈ２リンパ球のほか、単球、マクロファージ、樹状細胞、および内皮細胞やそれらの産物などヘルパー細胞により産生されるサイトカインが関わった結果である。その結果、接触や気分の改善がアルツハイマー病患者において確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】３週間１日おきに１００μｇ錠のコロストリニンＴＭが投与された女性のアルツハイマー病患者（Ｊ．Ｍ．）におけるγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を誘導する低反応性（部分的耐性）の状態の出現および自然消失を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロストリニン、および医薬品としてのその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
初乳は、分娩後数日中に哺乳動物の母乳房より産生される濃厚な、黄色の液体である。初乳は、分娩後、約４日乃至５日で成熟母乳に取って代わる。成熟母乳に比べ、初乳に含まれる糖は少ない。しかし、初乳には脂質、蛋白質、無機塩類、ビタミンおよび免疫グロブリンが豊富である。また、顆粒細胞および間質細胞など各種浮遊細胞、好中球、単球／マクロファージおよびリンパ球を含むとともに、成長因子、ホルモンおよびサイトカインを含んでいる。
【０００３】
各種因子は哺乳動物の初乳から分離され、特徴づけられている。１９７４年、ヤヌツ（Ｊａｎｕｓｚ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９，２７６−２７９）は、ヒツジの初乳からプロリンが豊富なポリペプチド（ＰＲＰ）を分離した。この引例の内容は本願中に引例によって組み込まれている。以来、ヒツジ以外の哺乳動物はそれらの初乳の成分としてＰＲＰの類似物を有することが発見されている。ＰＲＰはそれ以来、コロストリニンと呼ばれており、新しいクラスのサイトカインとして暫定的に同定されている。
【非特許文献１】１９７４年、ヤヌツ（Ｊａｎｕｓｚ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９，２７６−２７９）
【非特許文献２】「プロリンが豊富なペプチド（ＰＲＰ）−ヒツジ初乳からの免疫修飾ペプチド」（Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ，１９９３，４１，２７５−２７９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヤヌツらは「プロリンが豊富なペプチド（ＰＲＰ）−ヒツジ初乳からの免疫修飾ペプチド」（Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ，１９９３，４１，２７５−２７９）において、ヒツジ初乳からのＰＲＰはマウスにおいて免疫向性活性を有することを指摘した。しかし、この文書にはＰＲＰが他の動物に対する治療的効果があることは示されていない。組成物がマウスに対して治療的効果があるということが、他の動物に対する治療的効果があると示しているとみなすことはできないと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
われわれは現在、コロストリニンにはこれまでに未知の多くの治療的効果があることを見出している。特に、われわれはコロストリニンによって免疫向性活性が得られるとともに、精神向性活性が得られることを見出している。
【０００６】
本発明の１つの態様により、われわれは医薬品として使用するためのコロストリニンを提供する。このコロストリニンは非げっ歯哺乳動物用の医薬品としても使用することができ、われわれはコロストリニンが特にヒトの治療用医薬品として有用であることを見出した。
【０００７】
本発明の別の態様により、中枢神経系の障害または免疫系の障害を治療するための医薬品の製造におけるコロストリニンの使用方法が得られる。
【０００８】
本発明の有利な実施例において、コロストリニンは中枢神経系の障害、特に中枢神経系の慢性疾患の治療のために使用される。コロストリニンで治療できる中枢神経系の障害として、神経障害および精神障害が挙げられる。
【０００９】
コロストリニンにより有利に治療できる神経障害の例として、痴呆、および神経変性障害など痴呆の原因となる障害が挙げられる。神経変性障害として、たとえば、老年性痴呆および運動ニューロン疾患が挙げられ、パーキンソン病はコロストリニンで治療できる運動ニューロン疾患の例である。コロストリニンは特にアルツハイマー病として知られる神経変性疾患の治療において有効であることが明らかにされている。
【００１０】
コロストリニンにより有利に治療できる精神障害の例として、精神病および神経症が挙げられる。たとえば、コロストリニンを用いて、情動障害、特にうつ状態の精神病患者の情動障害を治療することができ、コロストリニンの使用は、福利の感情の改善および気分安定化により患者を助けることが明らかにされている。コロストリニンは、解毒期間後の薬物依存症、および興奮薬依存患者における補助回収としても用いることができる。
【００１１】
本発明の別の有利な実施例において、コロストリニンは免疫系、特に免疫系の慢性疾患の治療において使用される。したがって、われわれはコロストリニンが免疫調節を必要とする疾患の治療において使用できることを見出した。特に、われわれはコロストリニンがヒトを含む非げっ歯動物のこのような疾患の治療に有用であることを見出した。コロストリニンは免疫および感染基礎の各種疾患の治療において有用である。たとえば、コロストリニンを用いて、細菌性およびウイルス性病因の慢性疾患を治療するとともに、たとえば、腫瘍の化学療法または放射線療法後に進展した後天性免疫不全を治療することができる。本発明は特に非特異的免疫刺激および免疫矯正を必要とする慢性細菌性およびウイルス性感染症の治療に有用である。
【００１２】
一般に、慢性疾患は、通常少なくとも１週間、さらに通常１カ月、および多くの場合、少なくとも３カ月または少なくとも６カ月の長期間にわたって持続する疾患である。
【００１３】
新生児の免疫系の進展を改善するためにコロストリニンを使用することが本発明の特徴である。さらに、コロストリニンを用いて小児における免疫不全を矯正することが本発明の特徴である。コロストリニンのこれらの使用は特に初乳が失われた乳児または小児に適用可能である。これは、たとえば、出産から母乳が供給されなかった乳児および小児においてみられ、このような乳児および小児に与えられる人工栄養はコロストリニンを含有しない。
【００１４】
本発明の別の態様により、われわれは栄養補助剤としてのコロストリニンの使用方法を提供する。コロストリニンは特に免疫系の進展における不足を矯正するために乳児および小児用の栄養補助剤として有利に使用される。上述したように、これらの不足は出産から母乳が供給されなかった乳児および小児において生じるとみられる。コロストリニンは化学療法の対象となった成人、または悪液質に罹患した成人、または慢性疾患により体重減少した成人用の栄養補助剤としても用いることができる。本発明の態様において、われわれは生理的に許容可能な賦形剤と組み合わせた経口摂取可能な併用を含む栄養補助剤を提供する。この栄養補助剤は液体または固体の形で提供され、またこの栄養補助剤は錠剤の形で適切に提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に従って、コロストリニンは中枢神経系および免疫系の疾患の進展を予防するために予防的に投与することができる。
【００１６】
上述した本発明の態様に用いられるコロストリニンはヒツジのコロストリニンであること、またはヒツジ以外のコロストリニンであることもできる。ヒツジ以外のコロストリニンは、たとえば、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヤク、ラマおよびロバから由来されるものとされる。初乳は通常、分娩後１日乃至４日間、これらの動物の初乳に存在する。
【００１７】
本願中で用いられる用語「コロストリニン」は、その天然の形状において、哺乳動物の初乳から得られるポリペプチドを指す。コロストリニンはときに「コロストリニン」として知られ、以下の特性を有する：
（ｉ）１６，０００ダルトン乃至２６，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。
【００１８】
（ｉｉ）５，０００ダルトン乃至１０，０００ダルトン、好ましくは６，０００ダルトンの範囲の分子量を有する各サブユニットの二量体または三量体のサブユニットである。
【００１９】
（ｉｉｉ）プロリンを含有し、プロリンの量はその他のいずれの単一アミノ酸の量を上回る。
【００２０】
われわれは、コロストリニン、およびコロストリニンを生成するサブユニットも無極性であるあることを見出した。
【００２１】
分子量は、ＳＤＳの存在下に電気泳動により測定することができ、二量体または三量体の存在は、同じ方法により示すことができる。サブユニット間の結合は還元状態および非還元状態における電気泳動により非共有結合である。プロリンの存在は在来のアミノ酸分析により確認することができる。
【００２２】
無極性は無極条件下にクロマトグラフィにより証明することができる。
【００２３】
本発明に使用されるコロストリニンはヒツジのコロストリニンまたはヒツジ以外のコロストリニンであってもよい。ヒツジのコロストリニンは分子量が約１８，０００ダルトンであり、約６，０００ダルトンの分子量を有するそれぞれ３つの非共有結合サブユニットで形成され、約２２ｗｔ％プロリンを含む。このアミノ酸組成物はサブユニット当たり以下の数の残基で形成されている： リシン−２、ヒスチジン−１、アルギニン−０、アスパラギン酸−２、トレオニン−４、セリン−３、グルタミン酸−６、プロリン−１１、グリシン−２、アラニン−０、バリン−５、メチオニン−２、イソロイシン−２、ロイシン−６、チロシン−１、フェニルアラニン−３、およびシステイン−０。
【００２４】
上述した通り、その天然形態におけるコロストリニンは哺乳動物の初乳から誘導される。コロストリニンは初乳から脂質および大部分の蛋白質を除去することにより哺乳動物の初乳から誘導することができる。概して、コロストリニンは、たとえば、カラムクロマトグラフィ法および他の生化学的方法を用いて大型飼育動物の初乳から得ることができ、または遺伝子工学法により得ることができる。
【００２５】
特に、コロストリニンは以下のステップを用いることにより哺乳動物の初乳から分離することができる。
【００２６】
（ｉ）たとえば遠心分離により脂質を除去するステップ、
（ｉｉ）たとえば、ｐＨを低下させることにより、カゼインなど蛋白質を除去するステップ、
（ｉｉｉ）たとえば、
（ａ）イオン交換クロマトグラフィによる脂質および蛋白質の除去後に形成されるホエーを処理するステップと、
（ｂ）リン酸緩衝食塩水で溶出し、免疫グロブリン、たとえばヒツジのＩｇＧ２に結合したコロストリニンを含有する画分を採集するステップと、により免疫グロブリンに結合したコロストリニンを分離するステップと、
（ｉｖ）免疫グロブリンから、たとえばクロマトグラフィをふるい分けすることによりコロストリニンを分離するステップと、
（ｖ）さらに免疫グロブリンからコロストリニンを分離し、
（ａ）分子量３０，０００ダルトン以下の画分を脱塩するステップと、
（ｂ）免疫グロブリンに抗体に導入することにより、このクラスの蛋白質を除去し、最終産物を得るステップと、によりコロストリニンを精製するステップ。
【００２７】
上の規定は天然に発生する哺乳動物のコロストリニンに関するものであるが、本願中で用いるコロストリニンという用語は、実質的に同じ生物学的活性を有するその類似物および断片、および哺乳動物のコロストリニン、組換え型ＤＮＡ法により産生されるその類似物およびその断片をも含む。本願中で用いられるコロストリニンは、ポリペプチド合成により生成された天然コロストリニンと実質的に同じ組成の生物学的に活性のポリペプチドをも含む。
【００２８】
本発明の別の態様において、コロストリニンを用いた中枢神経系および免疫系の疾患を治療する方法が提供される。本発明による方法を用いて有利に治療することができる疾患は上述されている。好ましい実施例において、コロストリニンは毎日約１乃至２治療単位で第１の期間に投与し、その後はコロストリニンが投与されない第２の期間とする。第１の期間は約２週乃至４週であることが好ましく、さらに好ましくは約３週であり、第２の期間は約２週乃至５週が好ましく、さらに好ましくは約４週である。この周期は少なくとも１回反復されることが好ましく、さらに好ましくは１回以上反復されることである。
【００２９】
本発明の方法において使用するための治療単位は２５μｇ乃至１，０００μｇの範囲のコロストリニンが好ましく、さらに好ましくは５０μｇ乃至１００μｇである。
【００３０】
コロストリニンは適切な形態における投与のために調製することができる。たとえば、経口、直腸または非経口投与のために調製することができる。特に、コロストリニンは、注射、または、好ましくは、食道または他の粘膜表面から口／鼻咽腔の粘膜を通じた吸収に適した形状における投与のために調製することができる。経口調製液は嚥下用の形状、または好ましくは唾液中で溶解するための形状で提供されることにより、調製液は口／鼻咽腔の粘膜において吸収される。経口調製液は、経口投与用の錠剤、バッカル剤（すなわち、口内に保持され、吸引されるために適した形状の甘味様錠剤）、ガム質にすり込むための粘着性ゲルの形状であってもよい。コロストリニンはガム質に適用される粘着性硬膏またはパッチとして調製することができる。コロストリニンは尿生殖器の粘膜に適用するために調製することもできる。
【００３１】
もちろん、コロストリニンを全初乳の形で投与することは可能であるが、全初乳には不快な味があり、保存が困難であるため、これは好ましくない。
【００３２】
本発明において使用するためのコロストリニンは、ヒト源またはウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヤク、ラマまたはロバ、ラクダ等など動物を含む哺乳動物から得ることができる。
【００３３】
コロストリニンの試験はヒツジおよびヒトのコロストリニンを用いて実施された。ヒツジのコロストリニンはコロストリニンＴＭの商標で市販されている。
【００３４】
実験動物での試験時、コロストリニンは、活性Ｔ細胞に対する胸腺細胞の転調の特性、分化の進展および成熟、および胸腺細胞での各種表面マーカーの発現の誘導に基づきｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫向性活性により特徴づけられることがわかった。マウスの腹腔内投与において、コロストリニンはＮＺＢ系のマウスにおける溶血性貧血の発生を抑制し、マウスの肉腫１８０の増殖を抑制するとともに、γ線に暴露したマウスにおいてＸ線宿酔から動物を保護する。マウスでの毒性学的試験では、経口および非経口投与後にきわめて低い毒性を示したが、ＬＤ５０は体重の１．２５ｇ／ｋｇである。コロストリニンはヒトおよび実験動物における免疫活性細胞の増殖、成熟および分化の刺激能を示す。ヒト抹消血のリンパ球の培養（臍帯血から分離したリンパ球の培養を含む）において、コロストリニンはサイトカイン、特にγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（たとえば、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）および各種増殖因子の産生を刺激するという点で特徴づけられる。産生されるサイトカインは既知の方法により量的に測定される。
【００３５】
天然状態において、その生化学的特性を処理したヒツジのコロストリニンの類似物は、分娩後１〜４日間にヒトの初乳および全動物、特にウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヤク、ヒツジ、ラマまたロバ、ラクダ等など大型飼育動物の初乳に存在する。コロストリニンは母初乳の吸引および嚥下時に新生動物の体内に入る。低分子量のため、コロストリニンは細胞受容体を介して口／鼻咽腔の粘膜に対して作用することが可能であり、通常の拡散の結果としても可能である。消化管上部の粘膜および上皮は一定の免疫調節薬のための受容体を含むため、研究において、吸引のための錠剤および舌下錠剤、嚥下のための錠剤およびカプセルの形状、粘着性ゲルの形状、およびガム質に固着するための粘着性硬膏の形状で投与することができる。コロストリニンは尿生殖器官の粘膜に適用することもできる。
【００３６】
コロストリニンにより誘発される生化学的活性を明らかにするための科学的研究では、分娩後１〜７日後の期間に女性から採集したヒト初乳を用いた場合に同様の生物学的活性の存在が示された。ヒト源のコロストリニンを分離するために用いた方法は、飼育動物の初乳、特にヒツジ初乳から得る方法と類似したものであった。分娩後１〜７日の女性の乳腺により分泌される初乳はポリペプチドコロストリニンを含み、その量は授乳によって決まり、約３００ｍｇが１ｌ（リットル）の初乳中に検出される場合、２〜３日が最適である。ヒトのコロストリニンのこの量はヒツジ初乳に見られる範囲である。ヒトのコロストリニンは、たとえばヒツジの類似物と同様の多くの生物学的特性を有することが証明された。ヒト初乳から由来のコロストリニンは初乳に存在するリンパ球、および臍帯血リンパ球を刺激し、主にインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α、インターロイキン（ＩＬ−１０およびＩＬ−６）および他のサイトカインを刺激することが明らかにされた。
【００３７】
ヒトおよび動物源のコロストリニンの生物学的活性は、ポーランド特許（ＰＬ １７０５９２ Ｂ１）および欧州特許ＥＰ−Ｂ−０６０９２２５，ｐｔ：免疫学試験によって既知の方法により測定された。
【００３８】
ボランティア被験者の試験において、毎日少なくとも１回の用量での少なくとも２５μｇコロストリニンを含む吸引用錠剤の投与後、約３週間にわたり、有害な反応が確認されないことがわかった。一方、インターフェロンＩＦＮ−γおよび部分的に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの誘発に対する反応性低下の状態が生じる。コロストリニンの投与中止後、反応性低下の状態は正常に戻る。こうして得られた反応は、Ｔｈ１およびＴｈ２リンパ球およびヘルパー細胞により産生されるサイトカインが関わった結果である。
【００３９】
また、臨床試験時、コロストリニンは免疫調節効果および中枢神経系に対する効果を示し、これらは以下の疾患において予防的および治療的に利用することができる。すなわち、たとえばアルツハイマー病の発生、進行の予防のため、および寛解のため、一部の他の原因の老年性痴呆および免疫的および感染基礎の慢性疾患の治療においてである。
【００４０】
コロストリニンの代わりに、以下の組成およびアミノ酸配列を有するノナペプチド指定ＮＰを用いることができる：Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ。ＮＰはキモトリプシンによる消化およびカラムクロマトグラフィによる分離、または化学合成の手段によりコロストリニンから得ることができる。ＮＰはコロストリニンの有用なフラグメントの例である。コロストリニンに対する同様の生物学的効果を示し、特に、上述した慢性免疫障害および中枢神経系障害、特にアルツハイマー病を治療するために有用であることが明らかにされている。ＮＰを用いて上述した障害のいずれも治療することができる。栄養補助においても使用することができる。これはコロストリニンと同じやり方で調製することができる。ＮＰは哺乳動物、特にヒトの治療のために有用である。
【００４１】
本発明をさらに完全に理解するために、例として添付実施例のみに引例を作成する。
【実施例】
【００４２】
＜実施例Ｉ＞
分子量６０００ダルトンの３つの非共有結合サブユニットから構成される分子量１８０００ダルトンのヒツジのコロストリニンにおいて、各サブユニットは以下のアミノ酸組成を有した：
コロストリニンは、授乳開始後２４時間までの分娩後に取られるヒツジ初乳から得た。脂肪およびカゼインの一部を除去するために、３５０００ｘｇで材料を遠心分離した。得られたＩｇ画分をＤＥＡＥセルロースカラムにかけ、ポリペプチドコロストリニンと複合した免疫グロブリンＩｇＧ２を分離し、カラムからの溶出時にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００でのカラムクロマトグラフィによりＩｇＧ２からコロストリニンを分離し、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００でクロマトグラフィを行った。次に、このペプチドの画分をヒツジＩｇＧ２に対する抗体と結合したセファロースのカラムにかけ、ＩｇＧ２汚染の痕跡を除去した。得られた製剤をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５により脱塩し、凍結乾燥させたのち、温度＋４℃または−２０℃で保存した。
【００４３】
こうして得られたコロストリニンは、商標コロストリニンＴＭで示されている。
【００４４】
ＳＤＳ存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量５８００ダルトンに対応する強い結合が１つ確認され、分子量１２４００ダルトンおよび１８２００ダルトンに対応する弱い結合が２つ確認された。
【００４５】
＜実施例ＩＩ＞
組成およびアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏを有するノナペプチドＮＰは、実施例Ｉで生成されたコロストリニンから得た。
【００４６】
５０ｍｇのコロストリニンを温度３０℃下に２０時間、蛋白分解酵素キモトリプシンの１０活性単位により消化した。消化産物からの分離は、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０を用いた少なくとも１サイクルのカラムクロマトグラフィにより行った。得られた製剤を凍結乾燥させ、温度＋４℃または−２０℃で保存した。分離ノナペプチドをＮ末端アミノ酸を決定する手段により分離した。
【００４７】
＜実施例ＩＩＩ＞
以下の組成物による吸引用の錠剤型における投与単位
組成：
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたコロストリニン
（Colostrinin（登録商標））ポリペプチド ０．０００１ｇ
安定剤： 不純物として主にＩ．Ｐ．Ｓ．を
含まないアルブミン ０．０００１３５ｇ
潤滑剤／結合剤：ステアリン酸マグネシウム ０．００３ｇ
賦形剤： マニトール ０．１５ｇ（０．１４９７ｇ）
上の成分を０．０００１Ｍ ＮａＣｌ中に懸濁した。吸引用錠剤は、アルツハイマー病を含む主に初期および後期の痴呆、および各種病期の老年性痴呆の治療、非特異的免疫刺激および免疫矯正を必要とする慢性細菌性およびウイルス性感染症および各種薬剤が原因の後天性免疫不全の治療のために使用される。また、特に精神病患者のうつ状態における情動障害で使用し、福利の一般的感情を改善して気分を安定化させるとともに、解毒期間後の薬物依存症、および興奮薬依存患者における補助回収としても用いられる。コロストリニンＴＭは人工栄養と関連した栄養不全を矯正するために新生児および小児において用いることもできる。
【００４８】
＜実施例ＩＶ＞
以下の組成物により粘膜に適用するためのゲルの形状での製剤
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたコロストリニンＴＭポリペプチド
安定剤： アルブミン
ゲル賦形剤： ペクチン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースの
ナトリウム塩および炭化水素ゲルを含有するオラバーゼ−
プレイン（Orabase-Plain（登録商標）
ポリペプチドコロストリニンＴＭ０．０００３ｇおよびアルブミン０．００１５ｇをゲル賦形剤１ｍｌ当たりで使用した。こうして調製された投与単位は、主に口腔および上気道の細菌性およびウイルス性感染症の周期性治療のために使用される。
【００４９】
＜実施例Ｖ＞
筋内、皮下または静脈内注射の形状での製剤。
【００５０】
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたコロストリニンＴＭポリペプチド
安定剤： 不純物を含まないヒトアルブミン
賦形剤： 滅菌、非発熱水
ポリペプチドコロストリニンＴＭ０．０００３ｇ、アルブミン０．００１５ｇおよび抗菌剤として、０．００１％Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ、すなわちethylmercurithiosalicylic asidのナトリウム塩を１ｍｌアンプル当たりで使用した。こうして得られた投与単位は主に細菌性感染症およびウイルス性感染症の周期的治療のために用いられる。
【００５１】
＜実施例ＶＩ＞
筋内、皮下または静脈内注射の形状での製剤。
【００５２】
活性成分： 実施例Ｉに従って得られたＮＰ
安定剤： 不純物を含まないヒトアルブミン
賦形剤： 滅菌、非発熱水
ＮＰ０．０００３ｇ、アルブミン０．００１５ｇおよび抗菌剤として、０．００１％Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ、すなわちethylmercurithiosalicylic asidのナトリウム塩を１ｍｌアンプル当たりで使用した。こうして得られた投与単位は主に細菌性感染症およびウイルス性感染症の周期的治療のために用いられる。
【００５３】
＜実施例ＶＩＩ＞
周期的治療で実施例ＩＩＩにおける状態の剤型の薬剤を服用したボランティア健常者および患者から採取した血液のｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリペプチドコロストリニンＴＭによるサイトカインの誘導を以下の通り実施する。
【００５４】
保存剤を含まないヘパリン１ｍｌ当たり１０単位を含む全血をＲＰＭＩ１６４０培地で１：１０の比で希釈する。培養はインデューサー（陰性対照）のない同じ培地、またはポリペプチドコロストリニンＴＭ１〜１００μｇ／ｍｌの存在下またはフィトヘムアグルチン（ＰＨＡ）の２μｇ／ｍｌ血およびリポ多糖体（ＬＰＳ）の２μｇ／ｍｌ血の存在下、温度３７℃、５％炭酸ガスの環境下、２０時間にわたって行う。ＰＨＡとＬＰＳの混合液を含む試料が陽性対照であり、それらにより最大量のサイトカインが刺激される。試験結果を表１および表２に示す。それらは濃度１〜１００μｇ／ｍｌでコロストリニンＴＭが用量依存的にサイトカインの産生を刺激することを示している。陰性対照（インデューサーなし）に対して、これらの結果は統計的に有意である（Ｐ＜０．０００１）。アルツハイマー病患者はＩＦＮ産生能の低下を示し、わずかな程度にＴＮＦ産生能の低下も示している。
【００５５】
（表１）
健常ボランティアおよびアルツハイマー病患者の全血中に存在するリンパ球の培養におけるヒツジからのコロストリニンＴＭ（シリーズＡ１９９３）によるサイトカインの誘導。
【００５６】
健常ボランティア群（２２人）は異種であった（年齢範囲２０〜６４歳）。アルツハイマー患者群（５０人）も異種であった（年齢６３±７．５歳）。高い標準偏差（±ＳＤ）にもかかわらず、インデューサーなしの対照（欠）とコロストリニンＴＭ間の差は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）
（表２）
健常ボランティアおよび各種疾患患者の全血を用いた実験におけるヒツジからのコロストリニンＴＭ（シリーズＡ１９９３）によるインターフェロン（ＩＦＮ）の産生刺激の例
────────────────────────────────────
注：ＩＦＮ の存在についてのバイオ試験では各種類のインターフェロンの濃度を測定するが、ＥＬＩＳＡ試験では免疫活性ＩＦＮ−γの濃度のみを測定する。
【００５７】
＜実施例ＶＩＩＩ＞
ウロルワフの専門家地区病院婦人産科より得た臍帯血。分娩後４〜６時間に採取した臍帯血のリンパ球におけるｉｎ ｖｉｔｒｏコロストリニンＴＭによるサイトカインの誘導を以下のようにして実施する。
【００５８】
１００ｍｌ当たり５．７ｇの成分フィコール４００および９．０ｇの成分Ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍを含むＦｉｓｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）グラジエントを用いてリンパ球を分離する。分離したリンパ球を培地１ｍｌ当たり２×１０６リンパ球の密度でのＲＰＭＩ培地に懸濁する。濃度１〜２０μｇ／ｍｌのコロストリニンＴＭまたは濃度１０μｇ／ｍｌでのフィトヘムアグルチンをリンパ球懸濁液に添加する。培地を温度３７℃で２０時間培養する。次に培養液中のサイトカイン濃度を生化学的方法により測定する。典型的な例を表３に示す。濃度１〜１００μｇ／ｍｌでのコロストリニンＴＭは、古典的ＩＦＮ−γインデューサー−フィトヘムアグルチンにより示されたのとほぼ同じサイトカイン（ＩＦＮおよびＴＮＦ）の刺激能を有する。
【００５９】
（表３）
臍帯血（ＣＢＬ）から分離したリンパ球の培養におけるコロストリニンＴＭ（シリーズＡ１９９６）によるサイトカインの誘導
Ｎ−試験したＣＢＬ試料の数
スチューデントｔ検定における差コロストリニンＴＭの有意性の確率
−「欠」はＩＦＮおよびＴＮＦについてｐ＜０．００１。
【００６０】
臍帯血は未熟幹細胞が豊富であり、これらには造血細胞および各種免疫活性細胞の再生能があるため、得られた結果は、コロストリニンＴＭは幹細胞の成熟を大幅に促進することを示している。得られた結果は、各種類の免疫不全の治療や、たとえば損傷、感染、化学療法および放射線治療後に造血系を刺激するために、コロストリニンＴＭを使用することが可能である。生物医学的試験において、同様の活性の天然源の物質はきわめて稀にしか見られない。
【００６１】
＜実施例ＩＸ＞
中枢神経系の障害を治療する方法は、アルツハイマー病の初期および中期のボランティア患者群で試験した。投与単位を実施例Ｉおよび実施例ＩＩＩにおいて規定したコロストリニンＴＭ０．０００１５ｇを含む吸引用の錠剤型で食間に投与した。最初に、１日１錠を３週間使用し、２〜４週間治療を中断し、１日２錠を３週間投与することにより治療を反復した。コロストリニンＴＭ治療により低反応性または耐性の状態が誘発された。これはＩＦＮおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの合成能がないことで明らかにされる。この現象により活性剤の活動を量的に測定することができる。
【００６２】
これらの薬の投与を中止すると、耐性の状態は自然に逆転する。コロストリニンＴＭに対する一時的耐性の状態はＴｈ１およびＴｈ２リンパ球のほか、単球、マクロファージ、樹状細胞、および内皮細胞やそれらの産物などヘルパー細胞により産生されるサイトカインが関わった結果である。その結果、接触や気分の改善がアルツハイマー病患者において確認された。
【００６３】
図１は、３週間１日おきに１００μｇ錠のコロストリニンＴＭが投与された女性のアルツハイマー病患者（Ｊ．Ｍ．）におけるγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を誘導する低反応性（部分的耐性）の状態の出現および自然消失を示す。このあと、治療は３週間休止した（休止時、インデューサーに対する耐性は正常に戻る）。コロストリニンＴＭおよび対照インデューサー（ＰＨＡ−１０μｇ／ｍｌ）によるＩＦＮ−γの刺激を試験するための血液試料を毎日採取した。サイトカインの誘導およびそれらの量的測定のための試験を実施する方法は前節に述べた。
【００６４】
誘導ＩＦＮ−γ濃度の測定結果は、低反応性がコロストリニンＴＭ（１日おきに１００μｇ錠）を投与した第１週の間に出現し、治療の第３週で最大であることを示した。ＩＦＮ−γの誘導に対する耐性状態の逆転は、治療を休止した３週間（すなわち治療開始後６週目）に自然に生じた。さらに、このチャートはヒツジのコロストリニンＴＭ（ＯｖＣａｌ）に対して「特異的」である低反応性が観察の６週間に維持されていたが、ＰＨＡに対する低反応性は完全に消失したことを示す。
【００６５】
＜実施例Ｘ＞
中枢神経系の障害を治療する方法は、アルツハイマー病の初期および中期のボランティア患者群で試験した。投与単位を実施例ＩＩにおいて規定したＮＰ０．０００１５ｇを含む吸引用の錠剤型で食間に投与した。最初に、１日１錠を３週間使用し、３週間治療を中断し、１日２錠を３週間投与することにより治療を反復した。ＮＰ治療により低反応性または耐性の状態が誘発された。これはＩＦＮおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの合成能がないことで明らかにされる。この現象により活性剤の活動を量的に測定することができる。
【００６６】
これらの薬の投与を中止すると、耐性の状態は自然に逆転する。ＮＰに対する一時的耐性の状態はＴｈ１およびＴｈ２リンパ球のほか、単球、マクロファージ、樹状細胞、および内皮細胞やそれらの産物などヘルパー細胞により産生されるサイトカインが関わった結果である。その結果、接触や気分の改善がアルツハイマー病患者において確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】３週間１日おきに１００μｇ錠のコロストリニンＴＭが投与された女性のアルツハイマー病患者（Ｊ．Ｍ．）におけるγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を誘導する低反応性（部分的耐性）の状態の出現および自然消失を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
隔離した形態でのコロストリニンの栄養補助剤としての使用。
【請求項２】
請求項１に記載した使用において、化学療法の対象にされた乳児、小児、成人、及び／又は悪液質に羅漢した成人、又は慢性疾患により体重減少した成人のための栄養補助剤としてのコロストリニンの使用。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載した使用において、前記栄養補助剤が固体又は液体の形態で供せられることを特徴とするコロストリニンの栄養補助剤としての使用。
【請求項４】
生理的に許容可能な賦形剤と組み合わせて生成された、隔離した形態でのコロストリニンを包含する経口薬を有することを特徴とする栄養補助剤。
【請求項１】
隔離した形態でのコロストリニンの栄養補助剤としての使用。
【請求項２】
請求項１に記載した使用において、化学療法の対象にされた乳児、小児、成人、及び／又は悪液質に羅漢した成人、又は慢性疾患により体重減少した成人のための栄養補助剤としてのコロストリニンの使用。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載した使用において、前記栄養補助剤が固体又は液体の形態で供せられることを特徴とするコロストリニンの栄養補助剤としての使用。
【請求項４】
生理的に許容可能な賦形剤と組み合わせて生成された、隔離した形態でのコロストリニンを包含する経口薬を有することを特徴とする栄養補助剤。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１７４５６１（Ｐ２００８−１７４５６１Ａ）
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１５１３（Ｐ２００８−３１５１３）
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【分割の表示】特願平１０−５１６３２９の分割
【原出願日】平成９年１０月３日（１９９７．１０．３）
【出願人】（５０８０４５５３８）ルートヴィック ヒルシフェルト インスティテュート オブ イミュノロジー アンド エクスペリメンタル セラピー ポゥリッシュ アカデミー オブ サイエンシズ (1)
【出願人】（５０８０４５２３９）ジョージアディス バイオテック リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【分割の表示】特願平１０−５１６３２９の分割
【原出願日】平成９年１０月３日（１９９７．１０．３）
【出願人】（５０８０４５５３８）ルートヴィック ヒルシフェルト インスティテュート オブ イミュノロジー アンド エクスペリメンタル セラピー ポゥリッシュ アカデミー オブ サイエンシズ (1)
【出願人】（５０８０４５２３９）ジョージアディス バイオテック リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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