本発明は、コンビナトリアルターゲティング法を使用した、標的細胞の選択的な殺滅を通して様々な疾病を治療するための方法および組成物を提供する。本発明は、細胞を標的とする部分を含むプロトキシン融合タンパク質と、自然に作用可能には、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍において認められない活性化部分により活性化される修飾可能な活性部分とを特徴とする。これらの方法はまた、特定の細胞集団を標的にし、破壊するための、プロトキシンおよびプロトキシン活性化因子を少なくとも含む、２つ以上の治療薬の併用使用を含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分、１つの選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および１つの毒素ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質であって、前記修飾可能な活性化ドメインが、外因性酵素に対する基質を含む、プロトキシン融合タンパク質。
【請求項２】
前記酵素が、プロテアーゼである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項４】
前記プロテアーゼが、非ヒトプロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、非哺乳類プロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項７】
前記修飾可能な活性化ドメインが、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾を含む、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項８】
前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含む、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項９】
前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な外因性酵素に対する基質を含む、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１０】
前記１つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分が、癌細胞を認識する、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１１】
前記１つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分が、造血細胞、リンパ球、および侵害受容ニューロンから成る群から選択される細胞を認識する、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１２】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、ポリペプチドである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１３】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１４】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１５】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１６】
前記プロトキシンが、活性化可能な毒素である、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１７】
前記活性化可能な毒素が、活性化可能な孔形成毒素または活性化可能な酵素毒素から成る群から選択される、請求項１６に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１８】
前記毒素が、ＡＢ毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素から成る群から選択される、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１９】
前記毒素が、アエロリジン、コレラ菌外毒素、緑膿菌外毒素、およびジフテリア毒素から成る群から選択される、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項２０】
前記毒素が、アエロリジンである、請求項１９に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項２１】
前記毒素が、コレラ菌外毒素である、請求項１９に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項２２】
１つ以上の、細胞を標的とする部分、１つの天然で活性化可能なドメイン、および１つの修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質であって、前記修飾ドメインが、前記天然で活性化可能なドメインの活性化前には、不活性である、プロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２３】
前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質が、標的細胞に対して非毒性である、請求項２２に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２４】
１つ以上の、細胞を標的とする部分および１つの修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質であって、標的細胞に対して非毒性である、プロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２５】
前記修飾ドメインが、プロテアーゼドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２６】
前記プロテアーゼドメインが、ヒトプロテアーゼの触媒ドメインである、請求項２５に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ヒトプロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項２６に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２８】
前記プロテアーゼドメインが、非ヒトプロテアーゼの触媒ドメインである、請求項２５に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２９】
前記非ヒトプロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項２８に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３０】
前記ウイルスプロテアーゼが、レトロウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスプロテアーゼ、ピコルナウイルスプロテアーゼ、およびコロナウイルスプロテアーゼから成る群から選択される、請求項２９に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３１】
前記修飾ドメインが、ホスファターゼドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３２】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３３】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３４】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、細菌源に由来する結合ドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３５】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、細菌毒素に由来する結合ドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３６】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３７】
記プロトキシン活性化因子融合タンパク質と、プロトキシン活性化因子融合タンパク質が作用するプロトキシンとの組み合わせの、１０％未満の細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３８】
１つ以上の、細胞を標的とする部分、１つの選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および１つの活性化因子ドメインを含む、プロアクチベーター融合タンパク質であって、前記修飾可能な活性化ドメインが、酵素に対する基質を含む、プロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項３９】
前記酵素が、プロテアーゼである、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４０】
前記修飾可能な活性化ドメインが、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾を含む、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４１】
前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含む、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４２】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、癌細胞を認識する、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４３】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、造血細胞、および侵害受容ニューロンから成る群から選択される細胞を認識する、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４４】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、リンパ球を認識する、請求項４３に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４６】
前記プロテアーゼが、非ヒトプロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４７】
前記プロテアーゼが、非哺乳類プロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４８】
前記非哺乳類プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４９】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、ポリペプチドである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５０】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５１】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５２】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５３】
標的細胞を、（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒素ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質に接触させるステップを含む、標的細胞を破壊または抑制する方法であって、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第１の細胞標的ドメインおよび前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第２の細胞標的ドメインが、それぞれ、前記標的細胞を認識し、それに結合し、前記標的細胞への双方の融合タンパク質の結合後、前記修飾可能な活性化部分が、前記修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する、方法。
【請求項５４】
前記選択的に修飾可能な活性化ドメインが、前記標的細胞とは異種であるプロテアーゼの切断部位である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記毒素が、ＡＢ毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記毒素が、活性化可能な孔形成毒素および活性化可能な酵素毒素から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記毒素が、コレラ菌外毒素である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記毒素が、アエロリジンである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記毒素が、カスパーゼ、リシン、アブリン、およびモデッシン（Ｍｏｄｅｃｃｉｎ）から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記修飾ドメインが、前記細胞とは異種のプロテアーゼを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記異種プロテアーゼが、ヒトプロテアーゼを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記異種プロテアーゼが、ヒトグランザイムＢである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記異種プロテアーゼが、アミノ酸２１〜２４７を含む、前記ヒトグランザイムＢプロテアーゼのタンパク質分解ドメインを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記選択的に修飾可能な活性化ドメインが、ＩＥＰＤである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記異種プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記毒素が、ジフテリア毒素である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ジフテリア毒素フリン切断部位が、前記標的細胞とは異種であるプロテアーゼの切断部位により置き換えられる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記毒素ドメインが、ジフテリア毒素のアミノ酸１〜３８９を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
融合タンパク質のうちの１つまたは両方が、ＰＥＧ化、グリコシル化、またはその両方により修飾される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１の細胞を標的とする部分もしくは前記第２の細胞を標的とする部分、またはその両方が、抗体、抗体様分子、抗体フラグメント、および単一抗体ドメインから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第２の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、可溶性メディエーター、サイトカイン、成長因子、可溶性受容体フラグメント、人工的に多様化されたポリペプチドバインダー、およびマトリックスフラグメントから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第２の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、糖質、脂質、および合成リガンドから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第２の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、抗ＣＤ５ ＳｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖ、およびＣＤ２２ ＳｃＦｖから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７４】
前記標的細胞を、前記プロトキシン融合タンパク質および前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質に同時に接触させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的細胞を、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質との接触の前に、前記プロトキシン融合タンパク質に接触させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的細胞を、前記プロトキシン融合タンパク質との接触の前に、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質に接触させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７９】
前記修飾可能な活性化ドメインの選択的活性化がない場合、前記プロトキシン融合タンパク質は、前記標的細胞または前記標的細胞を取り囲む環境により天然に活性化可能ではなく、前記修飾可能な活性化ドメインの前記選択的活性化が、前記プロトキシン融合タンパク質を天然に活性化可能にする、請求項５３に記載の方法。
【請求項８０】
（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒性ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、対象における標的細胞を破壊または抑制する方法であって、前記天然で活性化可能なドメインが、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質を前記対象へ投与すると活性化し、それにより、前記天然で活性化可能なドメインの活性が、前記修飾ドメインの活性化をもたらし、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第１の細胞標的ドメインおよび前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第２の細胞標的ドメインが、それぞれ、前記標的細胞を認識して結合し、両方の融合タンパク質が前記標的細胞に結合すると、前記修飾可能な活性化部分が、前記修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する、方法。
【請求項８１】
（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒性ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を含む、組成物であって、前記修飾ドメインが、前記天然で活性化可能なドメインの活性化前には、不活性であり、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第１の細胞標的ドメインおよび前記活性なプロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第２の細胞標的ドメインが、それぞれ、標的細胞を認識して結合し、両方の融合タンパク質が前記標的細胞に結合すると、前記修飾ドメインが、前記選択的に修飾可能な活性化ドメインを活性化し、毒素活性をもたらす、組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【公表番号】特表２０１０−５００９６７（Ｐ２０１０−５００９６７Ａ）
【公表日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２０８５５（Ｐ２００９−５２０８５５）
【出願日】平成１９年７月２０日（２００７．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１１５７
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５９２０１７６３３）ザ　ジェネラル　ホスピタル　コーポレイション (177)
【Ｆターム（参考）】