コーヒー中のスクロース分解と関連している核酸及びタンパク質
種々のスクロース代謝酵素をコードする配列を含む、コーヒー（コフィア種）から単離された核酸分子及びそのコードされるタンパク質が本明細書に開示される。具体的には、コーヒー由来の、３種のインベルターゼ及び４種のインベルターゼ阻害剤及びそれらのコードするポリヌクレオチドが開示されている。また、コーヒー豆の風味、香り及びその他の特徴に影響を及ぼすために、コーヒーノキの遺伝子調節及び糖プロフィールの操作に、これらのポリヌクレオチドを用いる方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、農業バイオ技術の分野に関する。より詳しくは、本発明は、植物、特に、コーヒーにおいてスクロース代謝に関与している酵素並びにこれらの酵素をコードする遺伝子及び核酸配列、並びにこれらの酵素によるスクロース代謝を調節する調節機構に関する。
【０００２】
（発明の背景）
本明細書を通じて引用される、特許、公開された出願及び学術論文をはじめとする種々の刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。本明細書内に十分に示されていない引用は、本明細書の最後に見ることができる。
【０００３】
スクロースは、コーヒーの子実又は豆によって送達される最終的な香り及び風味において重要な役割を果たしている。スクロースは、コーヒー中の総遊離還元糖の主要な寄与因子であり、還元糖は、コーヒーにおける重要な風味前駆体である。還元糖は、コーヒーの子実を焙煎する間に、メイラード型反応でアミノ基含有分子と反応し、これにより、通常、コーヒーの風味と関連しているカラメルの香り、甘い香り及び焦げた種類の香り並びに暗い色を含む相当な数の生成物が生じる（Ｒｕｓｓｗｕｒｍ、１９６９年；Ｈｏｌｓｃｈｅｒ及びＳｔｅｉｎｈａｒｔ、１９９５年；Ｂａｄｏｕｄ、２０００年）。最高品質のアラビカの子実（コフィア・アラビカ（ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ））（７．３％から１１．４％の間）は、最低品質のロブスタの子実（コフィア・カネフォラ（ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ））（４から５％の間）よりもかなり高レベルのスクロースを有することがわかった（Ｒｕｓｓｗｕｒｍ、１９６９年；Ｉｌｌｙ及びＶｉａｎｉ、１９９５年； Ｃｈａｈａｎら、２００２年；Ｂａｄｏｕｄ、２０００年）。スクロースは、焙煎の間に著しく分解されるにもかかわらず、焙煎された子実の中に、０．４〜２．８％乾燥重量（ＤＷ）という濃度でまだ残っており、このため、コーヒーの甘味に直接的に寄与している。子実中のスクロースのレベルとコーヒーの風味の間には明確な相関関係が存在する。したがって、スクロース代謝に預かる主要な酵素を同定し、単離すること及びスクロース代謝のばらつきの根底にある遺伝的機序によって、コーヒーの品質の改良の技術分野における進歩が可能となる。
【０００４】
現在、コーヒーにおけるスクロース代謝に関与している遺伝子又は酵素に関して公開された報告はない。しかし、スクロース代謝は、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（コーヒーの近縁種、両方ともキク類（ａｓｔｅｒｉｄ）Ｉのクラスのメンバーである）において、特にトマトの果実形成の間、研究されている。トマトにおけるスクロース代謝に直接関与している酵素の概説が図１に示されている（Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃら、２００１年）。この経路における重要な反応として、（１）スクロースシンターゼ（ＳｕＳｙ）及び細胞質型インベルターゼ（Ｉ）によるサイトゾルにおけるスクロースの連続迅速分解、（２）ＳｕＳｙ又はスクロース−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）によるスクロース合成、（３）酸性インベルターゼ（液胞型又は細胞壁結合型）による、液胞における、又はアポプラスト（原形質膜の外側の領域、細胞壁、木部導管などを含む）におけるスクロース加水分解、並びに（４）アミロプラストにおけるデンプンの迅速な合成及び分解がある。
【０００５】
その他のシンク器官においてと同様に、スクロース負荷軽減のパターンはトマトの果実形成の間一定ではない。果実形成の初期段階では、スクロースは、シンプラスト経路（細胞間の直接的な連絡）によって師部からそのまま負荷軽減され、負荷軽減の間はその複合ヘキソースに分解されない。この段階でＳｕＳｙの発現及び酵素活性の両方が最大であり、師部からのスクロース負荷軽減能と直接の相関がある（シンク強度とも呼ばれる現象；Ｓｕｎら、１９９２年；Ｚｒｅｎｎｅｒら、１９９５年）。果実形成の後期に、シンプラスト連絡が失われる。負荷軽減のこれらの条件下では、スクロースは、細胞壁結合型インベルターゼによって果実細胞の外側で迅速に加水分解され、次いで、グルコース及びフルクトース生成物がヘキソーストランスポーターによって細胞内に運び入れられる。その後、細胞質においてＳｕＳｙ又はＳＰＳによってｄｅ ｎｏｖｏでスクロースが合成される（図１）。ＳＰＳは、酵素スクロースホスフェートホスファターゼとのその密接な関係によって、ｉｎ ｖｉｖｏで本質的に不可逆な反応を触媒する（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら、１９９７年）。シンプラスト連絡の喪失と平行して、果実において、ＳｕＳｙ活性が低下し、熟成の開始時に最終的に検出不能となる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら１９９８年；Ｗａｎｇら、１９９３年）。したがって、トマトの果実形成の後期では、ＳＰＳ酵素は、ＳＰと関連して、スクロース合成のための主要な酵素と思われる。
【０００６】
植物インベルターゼは、活性のための至適ｐＨに基づいて２つの群に分けられている。第１群のインベルターゼは、中性インベルターゼとして同定されており、７〜８．５の範囲に至適ｐＨを有することを特徴とする。中性インベルターゼは、植物細胞のサイトゾルに局在することがわかっている。第２群のインベルターゼは、酸性インベルターゼとして同定されており、ｐＨ４．５と５．５の間に活性のための至適ｐＨを有することを特徴とする。酸性インベルターゼは、可溶性型及び不溶性型の両方で存在することがわかっている（Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）。不溶性酸性インベルターゼは、不可逆的に、細胞壁と共有結合しているのに対し、可溶性酸性インベルターゼは、液胞及びアポプラストの両方に局在している。
【０００７】
過去１０年にわたる研究により、液胞型及び細胞壁結合型インベルターゼは、種々の種の果実形成の間のスクロース代謝の調節において重要な酵素であるということがわかった。トマトの赤い果実の種、例えば、市販の種、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）及び野生種Ｌ．ピンピネリフォリウム（Ｌ． ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）は、例えば、高レベルのスクロースを貯蔵しないが、代わりに、ヘキソースをグルコース及びフルクトースの形で蓄積する。赤い果実の種と、スクロース蓄積性の緑の果実の種との交雑から得た証拠により、赤い果実のトマト種における最終スクロース蓄積の阻止における酸性インベルターゼの重大な役割がわかった（Ｙｅｌｌｅら、１９９１年）。遺伝子分析研究により、Ｌ．ピンピネリフォリウムの果実中の高レベルの可溶性固体を付与する遺伝子座が、液胞型インベルターゼＴＩＶ１の既知の位置に位置づけられた（Ｔａｎｋｓｌｅｙら、１９９６年；Ｇｒａｎｄｉｌｌｏ及びＴａｎｋｓｌｅｙ、１９９６年）。トランスジェニックトマトにおけるアンチセンスＴＩＶ１ ｃＤＮＡ構築物の発現の分析からも、同様の結論に到達した（Ｋｌａｎｎら、１９９３年；Ｋｌａｎｎら、１９９６年）。したがって、液胞型のインベルターゼは、成熟果実におけるヘキソースレベルの調節と液胞に貯蔵されるスクロースの流動の調節の両方において主要な役割を果たすと考えられる（Ｋｌａｎｎら、１９９３年；Ｙａｕ及びＳｉｍｏｎ、２００３年）。細胞壁結合型アイソフォームは、師部負荷軽減及びスクロース分配に関与していると考えられている（Ｓｃｈｏｌｅｓら、１９９６年）。
【０００８】
細胞壁結合型インベルターゼの重要性は、細胞壁型インベルターゼを構成的に過剰発現するトランスジェニックトマト（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、１９９１年）及びタバコ（ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎら、１９９０年）植物を用いる研究によって実証されている。このような植物におけるインベルターゼ活性レベルの上昇は、シンク及びソース組織間のスクロース輸送レベルの低下を引き起こし、これは発育不全及び植物形態の全体的な変更をもたらした。細胞外インベルターゼ活性の低下はまた、種々の種における植物及び種子の発達に著しい効果を有することがわかっている。アンチセンス細胞壁型インベルターゼ構築物の構成的発現のために細胞壁型インベルターゼのレベルが低いトランスジェニックニンジンの分析によって（Ｔａｎｇら、１９９９年）、初期植物発達に対する、及び初期伸長相の間の主根形成に対して著しい結果が示された。
【０００９】
ｍｉｎｉａｔｕｒｅ−１（ｍｎ１）（Ｌｏｗｅ及びＮｅｌｓｏｎ、１９４６年）、異常な小花柄及び胚乳の大きさの著しい減少を特徴とするトウモロコシの種子突然変異体の研究により、Ｍｎ１種子遺伝子座は細胞壁型インベルターゼ、ＣＷＩ−２をコードすることがわかった（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣｈｏｕｒｅｙ、１９９２年；Ｃｈｅｎｇら、１９９６年）。興味深いことに、ｍｎ１突然変異体では、全体的な酸性インベルターゼ（液胞型及び細胞壁結合型）活性が著しく低下し、これは、液胞型及び細胞壁型酵素活性両方の協調制御を示唆する。
【００１０】
高品質コーヒーの風味にとってのスクロースの重要性のために、スクロース豆の代謝及びその代謝に関与している遺伝子の相互作用を調べる必要性が存在する。また、コーヒー中のこれらの酵素をコードする遺伝子を同定及び単離する必要性もあり、それによってコーヒーの風味及び香りを操作するためにコーヒー豆中のスクロース産生を改変するための遺伝子ツール及び生化学的ツールを提供する。
【００１１】
（発明の概要）
本発明の一態様は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするコード配列を含む、コーヒー（コフィア種）から単離された核酸分子を特徴とする。一実施形態では、コード配列はインベルターゼをコードし、これは細胞壁型インベルターゼであっても、液胞型インベルターゼであっても、中性インベルターゼであってもよい。特定の実施形態では、細胞壁型インベルターゼは、アミノ酸配列ＷＥＣＰＤＦを有する保存されたドメインを含む。種々の実施形態では、インベルターゼは、配列番号９又は配列番号１３と５５％を超えて同一のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号９又は配列番号１３を含む。例示的な実施形態では、核酸分子は、配列番号１又は配列番号４を含む。
【００１２】
別の実施形態では、インベルターゼは液胞型インベルターゼであり、アミノ酸配列ＷＥＣＶＤＦを有する保存されたドメインを含む。液胞型インベルターゼは、配列番号１０と７０％以上同一のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１０を含むことが好ましい。例示的一実施形態では、液胞型インベルターゼをコードする核酸分子は、配列番号２を含む。
【００１３】
別の実施形態では、インベルターゼは中性インベルターゼであり、配列番号１１と８４％以上同一のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１１を含むことが好ましい。例示的一実施形態では、中性インベルターゼをコードする核酸分子は、配列番号３を含む。
【００１４】
その他の実施形態では、コード配列はインベルターゼ阻害剤をコードする。特定の実施形態では、インベルターゼ阻害剤は、そのアミノ酸配列中に４個の保存されたシステイン残基を含む。インベルターゼ阻害剤は、配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つと２５％以上同一であるアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１３、１４、１５又は１６のいずれか１種を含むことが好ましい。例示的実施形態では、インベルターゼ阻害剤をコードする核酸分子は、配列番号５、６、７又は８のうちいずれか１つを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、上記のコード配列は、遺伝子のオープンリーディングフレームである。その他の実施形態では、その遺伝子の転写によって生じたｍＲＮＡ分子、又は特許請求されるｍＲＮＡ分子の逆転写によって生じたｃＤＮＡ分子である。別の実施形態は、前記の核酸分子のセグメントと相補的である、８〜１００の間の塩基長のオリゴヌクレオチドを対象とする。
【００１６】
本発明の別の態様は、上記の核酸分子をコードするインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤のコード配列を含むベクターを特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである。種々の実施形態は、核酸分子のコード配列が、構成的プロモーターと、又は誘導性プロモーターと、又は組織特異的プロモーターと作動可能に連結されているベクターを含み、後者の実施形態では、種子特異的プロモーターが好ましい。
【００１７】
本発明の別の態様では、上記のベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞も提供する。宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞であり得る。本発明の形質転換された植物細胞から生じた稔性（ｆｅｒｔｉｌｅ）も提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、コーヒー種子内の１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を調節することを含む、コーヒー豆の風味又は香りを調節する方法を特徴とする。特定の実施形態では、本方法は、１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させることを含む。特定の実施形態では、これは、コーヒー種子内の１種又は複数の内因性インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤遺伝子の発現を増大させることによって達成される。その他の実施形態は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする導入遺伝子を植物に導入することを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本方法は１種又は複数のインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させることを含む。この実施形態では、植物中の内因性インベルターゼ活性を、インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物と比較して低減させることができる。さらに、植物は、その種子に、インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含み得る。
【００２０】
その他の実施形態では、本方法は、１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を低減させることを含む。これは、１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒーに導入することによって達成できる。特定の実施形態では、インベルターゼの発現又は活性が低減される。この実施形態では、植物は、その種子に、インベルターゼの産生又は活性が低減されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含み得る。
【００２１】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の図、詳細な説明及び実施例を参照することによって理解される。
【００２２】
（例示的実施形態の詳細な説明）
定義：
本発明の生体分子及びその他の態様に関する種々の用語が、本明細書及び特許請求の範囲を通じて用いられている。これらの用語は、本明細書において特に断りのない限り、分子生物学及び生化学の分野におけるそれらの通常の意味を有すると見なされる。
【００２３】
用語「スクロース代謝酵素」とは、主にスクロースを植物体内に蓄積するよう、又はスクロースを分解するよう機能する植物中の酵素を指し、これとしては、例えば、スクロースシンターゼ（ＳｕＳｙ）、スクロースホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）及びスクロースホスファターゼ（ＳＰ）並びに種々の種類のインベルターゼ（Ｉｎｖ）及びインベルターゼ阻害剤（Ｉｎｖ Ｉ）が挙げられる。種々のスクロース代謝酵素が一緒になって、貯蔵又はエネルギー需要のいずれかのための植物による必要に応じてスクロースの代謝を制御するよう働く。
【００２４】
「単離された」とは、天然の状態から「人の手によって」変えられたことを意味する。組成物又は物質が天然に生じる場合には、その最初の環境から変更されるか、又は取り出されている、或いはその両方である場合に「単離されている」。例えば、生存している植物又は動物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチエ（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｅ）は「単離されて」いないが、その天然状態の共存する物質から分離されている同一ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書においてこの用語が用いられるように「単離されている」。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」はまた「核酸分子」とも呼ばれ、通常、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、制限するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、より通常は、二本鎖であってもよく、又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドとはまた、１個又は複数の修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ及び安定性のため、若しくはその他の理由のために主鎖が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡを含む。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの異常な塩基が挙げられる。ＤＮＡ及びＲＮＡには、さまざまな修飾を行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、通常天然に見られるポリヌクレオチドの化学的に、酵素的に、又は代謝的に修飾された形、並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、これはオリゴヌクレオチドと呼ばれることも多い。
【００２６】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに結合している、２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーとよく呼ばれる短い鎖と、一般に、タンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸も含み得る。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによってか、又は当技術分野で周知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教本に、より詳細な研究論文に、並びに多量の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端をはじめ、ポリペプチド中のどこでも起こり得る。当然のことながら、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に、同種の修飾が、同程度に又はさまざまな程度に存在し得る。所与のポリペプチドはまた、多数の種類の修飾を含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐している場合もあり、分岐を含むか含まない、環状である場合もある。環状、分岐及び分岐環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスの結果である場合もあるし、合成法によって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、例えば、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が挙げられる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ −Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ． Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ． Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年及びＰｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年中、Ｗｏｌｄ， Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０年）１８２：６２６〜６４６頁及びＲａｔｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２年）６６３：４８〜６２頁参照のこと。
【００２７】
本明細書において「変異体」とは、それぞれ、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、本質的特性は保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの通常の変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するものである場合もそうでない場合もある。ヌクレオチドの変化は、以下に論じるように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び末端切断をもたらし得る。ポリペプチドの通常の変異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、相違は、参照ポリペプチドの配列と変異体の配列が全体的に極めて類似しており、多くの領域では、同一であるよう限定される。変異体及び参照ポリペプチドは、任意の組合せの、１つ又は複数の置換、付加又は欠失によってアミノ酸配列で異なり得る。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものである場合もそうではない場合もある。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は天然に存在する、例えば、対立遺伝子変異体である場合もあり、又は天然に存在することがわかっていない変異体である場合もある。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術によって、又は直接合成によって作製できる。
【００２８】
突然変異植物に関連して、用語「ヌル突然変異体」又は「機能喪失型突然変異体」とは、遺伝子産物を機能しないように又は大部分存在しないようにさせる突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を示すよう用いられる。このような突然変異は、遺伝子のコード領域及び／又は調節領域において起こり得、個々の残基の変化である場合も、核酸の領域の挿入又は欠失である場合もある。これらの突然変異はまた、遺伝子及び／又はコードされるタンパク質を、そのタンパク質を機能しないように又は大部分存在しないようにさせるよう調節又は制御し得るその他の遺伝子のコード領域及び／又は調節領域において起こり得る。
【００２９】
用語「実質的に同一」とは、タンパク質の性質（すなわち、タンパク質の構造、安定性特性、基質特異性及び／又は生物活性）に大きくは影響を及ぼさない配列変化を有する核酸又はアミノ酸配列を指す。核酸配列に特に関連して、用語「実質的に同一」とは、コード領域及び発現を支配する保存された配列を指すものとし、主として、コードされるポリペプチドにおいて同一アミノ酸をコードする縮重コドン又は保存的代替アミノ酸をコードする代替コドンを指す。アミノ酸配列に関連して、用語「実質的に同一」とは、通常、構造又は機能の決定に関与していないポリペプチドの領域中の保存的置換及び／又は変化を指す。
【００３０】
また、本明細書において用語「同一性パーセント」及び「類似性パーセント」とは、アミノ酸及び核酸配列間の比較において用いられる。アミノ酸配列を参照する場合に、「同一性」又は「同一性パーセント」とは、配列分析プログラムによって比較されるアミノ酸配列中の同一アミノ酸にマッチされた対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。「類似性パーセント」とは、同一又は保存されたアミノ酸とマッチされた対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存されたアミノ酸とは、構造は異なっているが、物理的特性は類似しており、その結果、互いの交換が、得られるタンパク質の三次構造を大きくは変えないものである。保存的置換は、Ｔａｙｌｏｒ（１９８６年、Ｊ． Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９：２０５）において定義されている。核酸分子に関連して、「同一性パーセント」とは、配列分析プログラムによって同一ヌクレオチドとマッチされた対象核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。
【００３１】
「同一性」及び「類似性」は、既知の方法によって容易に算出できる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の類似配列をアラインし、そのようにして相違を規定するコンピュータプログラムを用いて比較できる。好ましい方法論では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びそれに用いられるパラメータが用いられ、ゲノムＤＮＡ配列の配列断片をアラインするためには、ＤＮＡｓｔａｒシステム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が用いられる。しかし、標準的なアラインメントソフトウェアのいずれを用いても同等のアラインメント及び類似性／同一性評価を得ることができる。例えば、ウィスコンシン州、マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能である、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．１及びそのプログラムによって用いられるデフォルトパラメータ（ギャップ作製ペナルティ＝ｌ２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）を用いて、配列同一性及び類似性を比較することができる。
【００３２】
本明細書において「抗体」としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）が挙げられ、Ｆａｂ又はその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物も含む。抗体に関連して、用語「免疫学的に特異的」又は「特異的」とは、注目するタンパク質の１種又は複数のエピトープと結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含むサンプル中のその他の分子を実質的に認識し、結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を調べるスクリーニングアッセイは、当技術分野では周知であり、日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８年）、第６章参照のこと。
【００３３】
用語「実質的に純粋」とは、少なくとも５０〜６０重量％の注目する化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。調製物が注目する化合物を少なくとも７５重量％を含むことがより好ましく、９０〜９９重量％が最も好ましい。純度は、注目する化合物にとって適当な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００３４】
一本鎖核酸分子に関連して、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、当技術分野で通常用いられる所定の条件下でのこのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子間の結合を指す（「実質的に相補的」と呼ばれることもある）。特に、この用語は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指し、非相補的配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な排除を指す。
【００３５】
「コード配列」又は「コード領域」とは、配列が発現される場合に、遺伝子産物を産生するために必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内の非翻訳配列（例えば、イントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域）を含む場合もあり、又はこのような介在非翻訳配列を欠く場合もある（例えば、ｃＤＮＡにおけるように）。
【００３６】
「イントロン」とは、タンパク質合成と関連している情報をコードしない核酸中のポリヌクレオチド配列を指す。このような配列はｍＲＮＡに転写されるが、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の前に除去される。
【００３７】
用語「作動可能に連結している」又は「作動可能に挿入された」とは、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を可能にするようコード配列と関連する適当な位置で核酸分子中に位置していることを意味する。例として、プロモーターは、プロモーターがそのコード配列の転写又は発現を制御できる場合に、コード配列を作動可能に連結している。コード配列は、プロモーター又は調節配列と、センス又はアンチセンス方向で作動可能に連結し得る。用語「作動可能に連結している」とは、発現ベクター中のその他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に適用される場合もある。
【００３８】
転写及び翻訳制御配列とは、ＤＮＡ調節配列であり、例えば、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどがある。
【００３９】
用語「プロモーター」、「プロモーター領域」又は「プロモーター配列」とは、通常、コード領域の５’又は３’側に、又はコード領域内に、又はイントロン内に見ることができる遺伝子の転写調節領域を指す。通常、プロモーターは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することを可能にするＤＮＡ調節領域である。通常の５’プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合されており、上流（５’方向）に伸び、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルでの転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含んでいる。プロモーター配列内に、転写開始部位（好都合なことに、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングによって規定される）及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。
【００４０】
「ベクター」とは、別の核酸セグメントが、そのセグメントの複製又は発現を引き起こすよう作動可能に挿入され得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスである。
【００４１】
用語「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」とは、コード配列を、又は適当な調節配列と作動可能に連結しており、細胞を形質転換するためにベクターに挿入されている配列を指すよう用いられることもある。この用語は、用語「形質転換用ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」と同じ意味で使用できる。このような核酸構築物は、注目する遺伝子産物のコード配列を、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子とともに含み得る。
【００４２】
「マーカー遺伝子」又は「選択マーカー遺伝子」とは、コードされる遺伝子産物が、遺伝子を含む細胞が、遺伝子を含まない細胞の中から選択されることを可能にする特徴を付与する遺伝子である。遺伝子工学に用いられるベクターは、通常、１種又は複数の選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子の種類としては、（１）抗生物質耐性遺伝子、（２）除草剤耐容性又は耐性遺伝子及び（３）形質転換された細胞が、そうでなければ細胞が産生できない必須成分、通常、アミノ酸を合成するのを可能にする代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子が挙げられる。
【００４３】
「リポーター遺伝子」もまた、マーカー遺伝子の１種である。これは通常、標準的な実験室手段によってアッセイ可能な又は検出可能な遺伝子産物（例えば、酵素活性、蛍光）をコードする。
【００４４】
用語、遺伝子を「発現する」、「発現された」又は遺伝子の「発現」とは、遺伝子産物の生合成を指す。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写と、それに次ぐ、ｍＲＮＡの１種又は複数のポリペプチドへの翻訳を含み、すべての天然に存在する翻訳後修飾を包含する。
【００４５】
「内因性」とは、指定の生物内に天然に見ることができる任意の成分、例えば、遺伝子若しくは核酸又はポリペプチドを指す。
【００４６】
核酸構築物の「異種」領域とは、本来は大きな分子と関連して見られない、大きな分子内の核酸分子の同定可能なセグメント（又は複数のセグメント）である。したがって、異種領域が遺伝子を含む場合には、この遺伝子は通常、供給源生物のゲノム中でゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接される。もう１つの実施例では、異種領域は、コード配列自体が本来見られない（すなわち、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ又は天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。対立遺伝子変異又は天然に存在する突然変異事象は、本明細書に定義されるＤＮＡの異種領域を生じさせない。上記で定義される用語「ＤＮＡ構築物」とはまた、異種領域、特に、細胞の形質転換において使用するために構築されたものを指すよう用いられる。
【００４７】
細胞は、外因性又は異種ＤＮＡが細胞の内側に導入されている場合に、このようなＤＮＡによって「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれている（共有結合されている）場合もそうでない場合もある。例えば、原核生物、酵母及び哺乳類細胞では、形質転換用ＤＮＡは、エピソームエレメント、例えば、プラスミド上で維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換用ＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、染色体複製を介して嬢細胞によって遺伝されるようになったものである。この安定性は、真核細胞の、形質転換用ＤＮＡを含む嬢細胞の集団を含む細胞株又はクローンを確立する能力によって実証される。「クローン」とは、有糸分裂によって単一細胞又は共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」とは、多世代にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで安定増殖できる一次細胞のクローンである。
【００４８】
「子実」、「種子」又は「豆」とは、別のこのような植物に発達できる顕花植物の繁殖単位を指す。本明細書において、特に、コーヒーノキに関して、この用語は同意語として及び同じ意味で用いられる。
【００４９】
本明細書において、用語「植物」は、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、芽、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官及びその子孫への言及を含む。トランスジェニック植物の一部とは、本発明の範囲内では、例えば、トランスジェニック植物又はその子孫に由来する植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚及び花、茎、種子、花粉、果実、葉又は根を含むと理解される。
【００５０】
説明：
スクロースは、コーヒーの子実の焙煎中に起こるメイラード反応に関与する遊離還元糖の主な寄与因子である。したがって、緑色のコーヒーの子実中の重要な風味前駆体分子であると広く考えられている。この考えに一致して、最高品質のアラビカの子実は、最低品質のロブスタの子実（４〜５％の間）よりも、かなり高レベルのスクロースを有している（７．３〜１１．４％の間）。また、スクロースは、焙煎の間に著しく分解されるが、焙煎された子実中に０．４〜２．８％乾燥重量（ＤＷ）という濃度で残存することができ、その結果、コーヒーの甘味に直接関与する。子実中のスクロースのレベルとコーヒーの風味の間の明確な相関関係のために、コーヒーの子実におけるスクロース代謝及び炭素分配における変動について、根底にある遺伝的機序を理解し、操作する能力が重要である。
【００５１】
スクロース代謝に関与している重要な酵素は、モデル生物（例えば、トマト、ジャガイモ、シロイヌナズナ）において特性決定されている。実施例に詳細に記載されるように、本発明に従って、これらの酵素のタンパク質配列を用い、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いてコフィア・カネフォラ及びコフィア・アラビカｃＤＮＡライブラリー及びＥＳＴデータベースにおいて類似性検索を実施した。ＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型インベルターゼ）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型インベルターゼ）及びＣａＩｎｖ３（細胞質型インベルターぜ）をコードする全長ｃＤＮＡを単離した。部分ｃＤＮＡ配列（ＣｃＩｎｖ４）もまた、単離し、細胞壁結合型インベルターゼに相当すると考えられる。さらに、インベルターゼ阻害剤ＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４をコードする可能性のある４種の全長ｃＤＮＡ配列を同定し特性決定した。
【００５２】
本発明の一態様は、種々のインベルターゼ：細胞壁型インベルターゼＣｃＩｎｖ１（配列番号１）及びＣｃＩｎｖ４（配列番号４−部分配列）、液胞型インベルターゼＣｃＩｎｖ２（配列番号２）及び中性インベルターゼＣａＩｎｖ３（配列番号３）並びに４種の全長インベルターゼ阻害剤：ＣｃＩｎｖＩ１（配列番号５）、ＣｃＩｎｖＩ２（配列番号６）、ＣｃＩｎｖＩ３（配列番号７）及びＣｃＩｎｖＩ４（配列番号８）をコードするコーヒーに由来する核酸分子に関する。
【００５３】
本発明の別の態様は、これらの核酸分子の発現によって産生されるタンパク質及びその使用に関する。配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８の発現によって産生されるタンパク質の推定アミノ酸配列が、それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６として本明細書に示されている。本発明のさらにその他の態様は、植物育種における、また植物の遺伝子操作における、最終的には、コーヒーの風味、香り及びその他の品質の操作における核酸分子及びコードされるポリペプチドの使用に関する。
【００５４】
本明細書には、コフィア・カネフォラに由来するインベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチドが記載され例示されているが、本発明は、以下に記載される目的で、Ｃ．カネフォラ ポリヌクレオチド及びタンパク質と互換的に用いられるよう十分に類似しているその他のコフィア種に由来する核酸及びコードされるタンパク質を包含するものとする。したがって、本明細書において用語「インベルターゼ」及び「インベルターゼ阻害剤」を用いる場合には、特に断りのない限り、それらは、本明細書に記載される全体的な物理的特徴、生化学的特徴及び機能的特徴を有するすべてのコフィア種インベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤並びにそれらをコードするポリヌクレオチドを包含するものとする。
【００５５】
それらの配列の点から考えると、本発明のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤ポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８の対立遺伝子変異体及び天然突然変異体を含み、これらはＣ．カネフォラの種々の品種において見られる可能性があり、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６の相同体は種々のコフィア種において見られる可能性がある。このような変異体及び相同体は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列に特定の相違を有すると予測されるので、本発明は（１）配列番号９、１０、１１又は１２のうちいずれか１つのコードされるポリペプチドと、少なくとも７０％（より好ましくなる順に、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、７０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％）の同一性を有するそれぞれのポリペプチドをコードする、単離されたインベルターゼをコードする核酸分子、並びに（２）配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つのコードされるポリペプチドと少なくとも約２５％（より好ましくなる順に、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％ ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、７０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％）の同一性を有するそれぞれのポリペプチドをコードし、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１種に対して同等の範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたインベルターゼ阻害剤をコードする核酸分子を提供する。種々のコーヒー品種及び種において、インベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤並びにそれらをコードする遺伝子間に存在する可能性がある天然配列変異のために、当業者ならば、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの独特の特性を依然として維持しながら、このレベルの変異を見出すことは予想する。このような予想は、一部は、コードされるタンパク質の性質を大きくは変更しない、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列変異の既知の進化的成功による。したがって、このような変異体及び相同体は、互いに実質的同一と考えられ、本発明の範囲内に含まれる。
【００５６】
以下の節は、本発明の実施に関与する一般的な手順を示す。具体的な材料が記載される限り、単に例示目的であり、本発明を制限しようとするものではない。特に断りのない限り、一般的な生化学及び分子生物学の手順、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９年）又はＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （２００５年）に示されるものを用いる。
【００５７】
核酸分子、タンパク質及び抗体：
本発明の核酸分子は、２つの一般的な方法によって調製できる：（１）適当なヌクレオチド三リン酸から合成できるか、又は（２）生物学的供給源から単離することができる。両方法とも、当技術分野で周知のプロトコールを利用する。
ヌクレオチド配列情報、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８を有するｃＤＮＡを利用できることによって、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離された核酸分子の調製が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又は類似の装置において用いられるホスホルアミダイト法によって調製できる。得られた構築物は、当技術分野で公知の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に従って精製できる。長い、二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、本発明のＤＮＡ分子は、現在のオリゴヌクレオチド合成法に固有の大きさ制限のために段階で合成しなくてはならない。したがって、例えば、長い、二本鎖分子は、適当な相補性のいくつかの小さなセグメントとして合成すればよい。このように製造された相補的セグメントを、各セグメントが隣接するセグメントの連結のための適当な付着末端を有するようアニーリングすることができる。隣接するセグメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下でアニーリングする付着末端によって連結し、長い二本鎖分子の全体を構築することができる。次いで、そのように構築された合成ＤＮＡ分子をクローニングし、適当なベクター中で増幅させることができる。
【００５８】
本発明に従って、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤ポリヌクレオチドのコード領域及び／又は調節領域の一部又はすべてと、適当なレベルの配列相同性を有する核酸を、適当なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いることによって同定できる。当業者には当然のことながら、前述の戦略は、ゲノム配列に適用する場合には、スクロース代謝酵素をコードする配列の単離を可能にすることに加え、スクロース代謝酵素遺伝子と関連しているプロモーター及びその他の遺伝子調節配列の単離も、たとえ、調節配列自体が適したハイブリダイゼーションを可能にする十分な相同性を共有していない場合であっても可能にする。
【００５９】
代表的な例示として、ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法に従い、５×ＳＳＣ、５×デンハルトの試薬、１．０％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性、断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び最大５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて実施できる。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間実施する。ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下の通りに洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分、（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分、（３）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間、（４）溶液を３０分毎に変更しながら、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、４５〜５５℃で２時間。
【００６０】
指定の配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を算出するための１つの共通する式は以下の通りである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃二本鎖でのｂｐ
【００６１】
上記の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドとともに４２％というＧＣ含量及び２００塩基という平均プローブサイズを用いると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは、相同性が１％低下する毎に１〜１．５℃低下する。したがって、４２℃というハイブリダイゼーション温度を用いると、約７５％を超える配列同一性を有する標的が観察される。一実施形態では、上記のハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を用い、ハイブリダイゼーションは３７℃、最終洗浄は４２℃であり、別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃であり、最終洗浄は５０℃であり、さらに別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃、最終洗浄は６５℃である。高ストリンジェンシーの条件として、上記のハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１０分間の最終洗浄が挙げられる。
【００６２】
本発明の核酸は、任意の簡便なクローニングベクター中でＤＮＡとして維持できる。好ましい実施形態では、クローンは、プラスミドクローニング／発現ベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）又はｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で維持し、それらのすべては適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 宿主細胞中で増殖させることができる。
【００６３】
本発明の核酸分子としては、一本鎖であっても、二本鎖であっても、さらに三本鎖であってもよい、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片が挙げられる。したがって、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１種の配列とハイブリダイズできる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ増幅によって、植物組織の試験サンプル中のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子又はｍＲＮＡを検出するためのプローブとして、又はインベルターゼ若しくはインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳時若しくは翻訳前の発現の正若しくは負の調節のために有用である。インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド類を、このようなアッセイのためのプローブとして利用できる方法としては、それだけには限らないが、（１）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション及び（４）取り揃えられた増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。
【００６４】
本発明の核酸分子の少なくとも１種の配列とハイブリダイズできる配列を有するオリゴヌクレオチドとして、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの特定の領域を標的とし、用いることができる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用は、当技術分野では公知である。アンチセンス分子は、植物細胞を、転写時にアンチセンスＲＮＡ配列を生じるＤＮＡ構築物で形質転換することによってｉｎ ｓｉｔｕで提供できる。このような構築物は、全長又は部分アンチセンス配列を生じるよう設計できる。この遺伝子サイレンシング効果は、遺伝子をコードする配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両方を遺伝子組換えによって過剰に産生させ、その結果、多量のｄｓＲＮＡが産生されることによって増強できる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８年、ＰＮＡＳ ９５：１３９５９〜１３９６４頁参照のこと）。この関連で、少なくとも１つのイントロンの一部又はすべてに相当するｄｓＲＮＡを含有する配列が特に有効であるとわかっている。一実施形態では、スクロースインベルターゼをコードする配列アンチセンス鎖の一部又はすべてが、導入遺伝子によって発現される。別の実施形態では、インベルターゼをコードする配列の一部又はすべてのハイブリダイズするセンス及びアンチセンス鎖が、遺伝子組換えによって発現される。別の実施形態では、市販の材料及び方法を用い（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；ＥＩｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５（２）：１８８〜２００頁）の使用によって、インベルターゼ遺伝子をサイレンシングすることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インベルターゼｍＲＮＡ又はインベルターゼ発現を認識し、サイレンシングすることが好ましい。
【００６５】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、既知の方法に従って、種々の方法で調製できる。ポリペプチドは、ｉｎ ｓｉｔｕで産生される場合には、適当な供給源、例えば、種子、果皮又はその他の植物の部分から精製できる。
【００６６】
或いは、ポリペプチドをコードする核酸分子を利用できることによって、当技術分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現法を用いるタンパク質の製造が可能となる。例えば、ｃＤＮＡ又は遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためにｐＳＰ６４又はｐＳＰ６５のような適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターにクローニングし、続いて、適した無細胞翻訳系、例えば、コムギ胚芽又はウサギ網状赤血球において無細胞翻訳できる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販されている。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、多量のポリペプチドを、適した原核生物又は真核生物系における発現によって製造できる。例えば、ＤＮＡ分子、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８を有するｃＤＮＡの一部又はすべてを、細菌細胞（例えば、大腸菌）又は酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））における発現に適合しているプラスミドベクターに、又は昆虫細胞における発現のためにバキュロウイルスベクターに挿入することができる。このようなベクターは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を可能にするように位置している、宿主細胞におけるＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを含む。このような発現に必要な調節エレメントとして、プロモーター配列、転写開始配列及び、場合により、エンハンサー配列が挙げられる。
【００６８】
組換え原核生物又は真核生物系において遺伝子発現によって産生されるポリペプチドは、当技術分野で公知の方法に従って精製できる。好ましい実施形態では、組換えタンパク質が発現され、その後、宿主細胞から分泌され、その後、周囲の培地から精製される、市販の発現／分泌系を使用できる。代替アプローチは、親和性分離によって、例えば、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体を用いる免疫学的相互作用を介して組換えタンパク質を精製することを含む。
【００６９】
前述の方法によって調製された本発明のポリペプチドは、標準的な手順に従って分析できる。
【００７０】
コーヒーから精製されたか、又は組換えによって製造されたポリペプチドを用いて、公知の方法に従って、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、抗体フラグメント又は本明細書に定義される誘導体を作製することができる。完全組換えタンパク質に対する抗体を作製することに加え、タンパク質の分析又はサザン及びクローニング分析（下記参照のこと）が、クローニングされた遺伝子がマルチジーンファミリーに属することを示す場合には、タンパク質の非保存領域に相当する合成ペプチドに対して作製されたメンバー特異的抗体を作製できる。
【００７１】
本明細書に記載されるあらゆる目的のための、本発明の抗体を含むキットも、本発明の範囲内に含まれる。通常、このようなキットは、抗体が免疫特異的である対照抗原を含む。
【００７２】
ベクター、細胞、組織及び植物体：
本発明によれば、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、又はセンス又はアンチセンス方向のその変異体、又はレポーター遺伝子、及びスクロース代謝酵素プロモーター及びその他の調節配列の制御下にあるその他の構築物を含む、トランスジェニック宿主細胞を製造するためのベクター及びキットも特徴とする。適した宿主細胞としては、それだけには限らないが、植物細胞、細菌細胞、酵母及びその他の真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞が挙げられる。さまざまなこれらの宿主細胞を形質転換するためのベクターが当業者には周知である。それらとしては、それだけには限らないが、プラスミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びにその他の細菌、酵母及びウイルスベクターが挙げられる。通常、トランスジェニック宿主細胞を製造するためのキットは、１種又は複数の適当なベクターと、ベクターを用いてトランスジェニック細胞を製造するための使用説明書とを含む。キットは、１種又は複数のさらなる構成要素、例えば、２、３例を挙げると、細胞を培養するための培養培地、細胞の形質転換を実施するための試薬及び遺伝子発現についてトランスジェニック細胞を試験するための試薬をさらに含み得る。
【００７３】
本発明は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の１つ又は複数のコピー、又は植物の内因性インベルターゼの産生若しくは機能を阻害する核酸配列を含むトランスジェニック植物を含む。これは、以下に記載されるように、天然又は組換え調節配列のいずれかによって制御された、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤コード配列の一部又はすべて、又はその突然変異体、アンチセンス又はその変異体、例えばＲＮＡを含む導入遺伝子を用いて植物細胞を形質転換することによって達成される。トランスジェニック植物体コーヒー種としては、例えば、制限するものではないが、Ｃ．アベオクテ（Ｃ．ａｂｅｏｋｕｔａｅ）、Ｃ．アラビカ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）、Ｃ．アルノルディアナ（Ｃ．ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）、Ｃ．アルウェミエンシス（Ｃ．ａｒｕｗｅｍｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ベンガレンシス（Ｃ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、Ｃ．カネフォラ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、Ｃ．コンゲンシス（Ｃ． ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｃ．デウェブレイ（Ｃ．Ｄｅｗｅｖｒｅｉ）、Ｃ．エクセルサ（Ｃ．ｅｘｃｅｌｓａ）、Ｃ．ユージェニオイデス（Ｃ．ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）及びＣ．ヘテロカリックス（ｃ．ｈｅｔｅｒｏｃａｌｙｘ）、Ｃ．カパカタ（Ｃ．ｋａｐａｋａｔａ）、Ｃ．カシアナ（Ｃ．ｋｈａｓｉａｎａ）、Ｃ．リベリカ（Ｃ．ｌｉｂｅｒｉｃａ）、Ｃ．モロウンドウ（Ｃ．ｍｏｌｏｕｎｄｏｕ）、Ｃ．ラセモサ（Ｃ．ｒａｓｅｍｏｓａ）、Ｃ．サルバトリックス（Ｃ．ｓａｌｖａｔｒｉｘ）、Ｃ．セシフロラ（Ｃ．ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ）、Ｃ．ステノフィラ（Ｃ． ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、Ｃ．トラベンコレンシス（Ｃ．ｔｒａｖｅｎｃｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ウェイチアナ（Ｃ．ｗｉｇｈｔｉａｎａ）及びＣ．ザングエバリエ（Ｃ．ｚａｎｇｕｅｂａｒｉａｅ）が好ましい。任意の種の植物も本発明に含まれ、これとしては、それだけには限らないが、タバコ、シロイヌナズナ及びその他の「実験室で利用しやすい」種、禾穀類、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガム、アルファルファ、クローバなど、オイル産生植物、例えば、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、カカオなど、野菜作物、例えば、トマトトマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメなど、園芸植物、例えば、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ペチュニア、ヒャクニチソウ、シバフ及びシバクサなどが挙げられる。
【００７４】
トランスジェニック植物は、当業者に公知の標準的な植物形質転換法を用いて作製することができる。これらとしては、それだけには限らないが、アグロバクテリウムベクター、プロトプラストのポリエチレングリコール処理、遺伝子銃ＤＮＡ送達、ＵＶレーザーマイクロビーム、ジェミニウイルスベクター又はその他の植物ウイルスベクター、プロトプラストのリン酸カルシウム処理、単離プロトプラストのエレクトロポレーション、形質転換用ＤＮＡでコーティングしたマイクロビーズを含む溶液中での細胞懸濁液の撹拌、形質転換用ＤＮＡでコーティングしたシリコンファイバーを含む溶液中での細胞懸濁液の撹拌、直接ＤＮＡ取り込み、リポソーム媒介性ＤＮＡ取り込みなどが挙げられる。このような方法は、当技術分野では公開されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、１９８８年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ＆ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ編、１９８９年）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、Ｖｅｒｍａ編、１９９３年）及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｌｉｇａ、Ｋｌｅｓｓｉｇ、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｇｒｕｉｓｓｅｍ ＆ Ｖａｒｎｅｒ編、１９９４年）参照のこと。
【００７５】
形質転換法は、形質転換される植物に応じて変わる。双子葉植物種を形質転換するにはアグロバクテリウムベクターを用いることが多い。アグロバクテリウムバイナリーベクターとしては、それだけには限らないが、ＢＩＮ１９及びその誘導体、ｐＢＩベクターシリーズ及びバイナリーベクターｐＧＡ４８２、ｐＧＡ４９２、ｐＬＨ７０００（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ２３４３３０）及びｐＣＡＭＢＩＡベクターのうち任意の適したもの（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ、Ｓｖａｂ ＆ Ｍａｌｉｇａ、（１９９４年） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：９８９〜９９４頁によって構築されたｐＰＺＰベクターに由来、ＣＡＭＢＩＡ、ＧＰＯ Ｂｏｘ ３２００、Ｃａｎｂｅｒｒａ ＡＣＴ ２６０１、Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手可能又はＣＡＭＢＩＡ．ｏｒｇでワールドワイドウェブによって入手可能）が挙げられる。単子葉植物種の形質転換には、形質転換用ＤＮＡでコーティングした粒子及び形質転換用ＤＮＡでコーティングしたシリコンファイバーを用いる遺伝子銃照射が、核の形質転換に有用であることが多い。或いは、コメ、トウモロコシ及び種々のその他の単子葉植物種の形質転換には、アグロバクテリウム「スーパーバイナリー」ベクターが、うまく用いられている。
【００７６】
選択された植物を形質転換するためのＤＮＡ構築物は、適当な５’調節配列（例えば、プロモーター及び翻訳調節配列）及び３’調節配列（例えば、ターミネーター）と作動可能に連結された注目するコード配列を含む。好ましい実施形態では、その天然５’及び３’調節エレメントの制御下にあるデヒドリン又はＬＥＡタンパク質コード配列を用いる。その他の実施形態では、デヒドリン又はＬＥＡタンパク質コード配列及び調節配列を取り替えて（例えば、ＣｃＤＨ２プロモーターと作動可能に連結しているＣｃＬＥＡ１コード配列）、表現型の、例えば、風味、香り又はその他の特徴の改良のために形質転換された植物の種子の水分含量又はタンパク質含量を変更する。
【００７７】
代替実施形態では、遺伝子のコード領域は、強力な構成的プロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター又はゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下に位置する。本発明において使用するために考慮されるその他の構成的プロモーターとしては、それだけには限らないが、Ｔ−ＤＮＡマンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンセターゼ、ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられる。その他の実施形態では、強力な単子葉植物プロモーター、例えば、トウモロコシユビキチンプロモーター、コメアクチンプロモーター又はコメチューブリンプロモーターを用いる（Ｊｅｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１２３：１００５〜１４頁、２０００年）。
【００７８】
誘導性プロモーターの下でインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤コード配列を発現するトランスジェニック植物も、本発明の範囲内にあると考えられる。誘導性植物プロモーターとしては、２、３例と挙げると、テトラサイクリンリプレッサー／オペレーター制御プロモーター、熱ショック遺伝子プロモーター、ストレス（例えば、損傷）誘導性プロモーター、防御反応性遺伝子プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害誘導性遺伝子プロモーター（例えば、ヒドロキシプロリンリッチ細胞壁タンパク質遺伝子）、化学誘導性遺伝子プロモーター（例えば、硝酸塩レダクターゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子など）及び暗所誘導性遺伝子プロモーター（例えば、アスパラギンシンセターゼ遺伝子）が挙げられる。
【００７９】
本発明の種子特異的デヒドリン又はＬＥＡタンパク質プロモーターの他に、組織特異的及び発達特異的プロモーターもまた、本発明において使用するために考慮される。その他の種子特異的プロモーターの限定されない例として、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導性メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）（米国特許出願公開第０９／３７７，６４８号明細書）、マメβファゼオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２及びグロブリン１、ダイズ１１Ｓレグミン（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９２年）及びＣ．カネフォラ １１Ｓ種子貯蔵タンパク質（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：２７３〜２８２頁）が挙げられる。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の種子優先プロモーターが開示されている国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照のこと。その他のコフィア種子特異的プロモーター、例えば、それだけには限らないが、所有者共通の、同時係属ＰＣＴ出願番号［まだ割り当てられていない］に記載されるオレオシン遺伝子プロモーター及び所有者共通の、同時係属ＰＣＴ出願番号［まだ割り当てられていない］に記載されるデヒドリン遺伝子プロモーターも利用できる。その他の組織特異的プロモーターの例として、それだけには限らないが、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子プロモーター（例えば、Ｍａｒｒａｃｉｎｉら、２００３年によって記載されるコーヒー小サブユニットプロモーター）又は光合成組織における発現のためのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター及び根での発現が望ましい場合の根特異的グルタミンシンターゼ遺伝子プロモーターが挙げられる。
【００８０】
コード領域はまた、適当な３’調節配列と作動可能に連結している。天然３’調節配列が用いられない実施形態では、ノパリンシンセターゼポリアデニル化領域を使用できる。その他の有用な３’調節領域としては、それだけには限らないが、オクトピンシンターゼポリアデニル化領域が挙げられる。
【００８１】
選択されたコード領域は、適当な調節エレメントの制御下で、核薬剤耐性マーカー、例えば、カナマイシン耐性と作動可能に連結している。その他の有用な選択マーカーシステムとしては、抗生物質又は除草剤耐性（例えば、ハイグロマイシン、スルホニル尿素、ホスフィノトリシン又はグリフォセートに対する耐性）を付与する遺伝子又は選択的増殖を付与する遺伝子（例えば、マンノースでの植物細胞の増殖を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ）が挙げられる。選択マーカー遺伝子としては、制限するものではないが、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、並びに除草化合物に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、グリフォセート耐性ＥＰＳＰＳ及び／又はグリフォセート酸化還元酵素（ＧＯＸ）、ブロモキシニルに対する耐性のためのブロモキシニルニトリラーゼ（ＢＸＮ）、イミダゾリノンに対する耐性のためのＡＨＡＳ遺伝子、スルホニル尿素耐性遺伝子及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性遺伝子が挙げられる。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明に包含されるプロモーター及びその他の発現調節配列は、リポーター遺伝子と作動可能に連結している。本発明における使用のために考慮されるリポーター遺伝子としては、それだけには限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、セリアンサスオレンジ（Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓ Ｏｒａｎｇｅ）蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（α−ガラクトシダーゼをコードする）及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、β−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又はホタル若しくは細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子が挙げられる。当業者ならば、本発明の実施と関連している多数の標準手順と同様に、マーカー又はレポーターの機能を果たし得るさらなる配列は認識するであろう。
【００８３】
細胞宿主における遺伝子発現を増強するためのさらなる配列修飾は、当技術分野で公知である。これらの修飾としては、過剰なポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート及びその他のこのようなはっきりと特徴付けられた、遺伝子発現にとって有害であり得る配列をコードする配列の排除が挙げられる。或いは、必要に応じて、コード配列のＧ／Ｃ含量を、コーヒーノキ細胞において発現される既知遺伝子を参照することによって算出される所与のコーヒーノキ細胞宿主のレベル平均に調節することができる。また、可能であれば、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるようコード配列を修飾する。遺伝子発現を増強するためのもう１つの代替法として、５’リーダー配列を使用することがある。翻訳リーダー配列は当技術分野で周知であり、これとしては、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（ω）のシス作用誘導体（ω’）、ブロムモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス及びカブ黄斑モザイクウイルス由来の５’リーダー配列が挙げられる。
【００８４】
植物を形質転換し、その後、１又は複数の特性、例えば、導入遺伝子産物、導入遺伝子をコードするｍＲＮＡ又は導入遺伝子の発現と関連している表現型の変更の存在についてスクリーニングする。形質転換された植物における導入遺伝子の発現量並びに発現の組織及び時間特異的パターンは、核ゲノム中へのその挿入の位置に応じて変わり得るということは認識されなくてはならない。このような位置の効果は当技術分野では周知である。このために、いくつかの核形質転換体は再生され、導入遺伝子の発現について試験されなければならない。
【００８５】
方法：
本発明の核酸及びポリペプチドは多数の方法のうちいずれにおいても使用でき、それによって、タンパク質を発現するコーヒーノキの豆から最終的に製造されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は香りの増強においてタンパク質が役割を果たし得るために、コーヒーノキにおいてタンパク質産物を発現させることができる。
【００８６】
緑色豆中のスクロース濃度と高品質のコーヒーの間には強力な相関関係がある（Ｒｕｓｓｗｕｒｍ、１９６９年；Ｈｏｌｓｃｈｅｒ及びＳｔｅｉｎｈａｒｔ、１９９５年；Ｂａｄｏｕｄ、２０００年；Ｉｌｌｙ及びＶｉａｎｉ、１９９５年；Ｌｅｌｏｕｐら、２００３年）。コーヒー子実スクロース含量の改良は、（１）従来の育種又は（２）遺伝子工学技術によって、及びこれら２つのアプローチを組み合わせることによって得ることができる。両アプローチは、本発明に従うコーヒー中のスクロース代謝関連遺伝子の単離及び特性決定によって大幅に改善された。例えば、スクロース代謝酵素をコードする遺伝子を遺伝学的にマッピングすることができ、コーヒー風味に関与している量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を同定できる。次いで、このようなＱＴＬがスクロース関連遺伝子の位置と相関しているかどうかを調べることが可能である。スクロース代謝に影響を及ぼす遺伝子の対立遺伝子（ハプロタイプ）もまた、同定し、特異的ハプロタイプの存在が高スクロースと強力に相関しているかどうかを調べることができる。これらの「高スクロース」マーカーを用いてマーカー利用育種プログラムを促進することができる。スクロース代謝に関与しているポリヌクレオチドを単離することの第３の利点は、高スクロースレベル及び低スクロースレベルを有する品種におけるコーヒー豆熟成の間のこれらの遺伝子の発現データを作成することであり、その例が以下の実施例において論じられている。この情報は、以下に詳細に記載される、成熟豆中のスクロースレベルが増大した新規トランスジェニックコーヒーノキを作製することを目的とした遺伝子操作において使用する遺伝子の選択を導くために用いられる。
【００８７】
一態様では、本発明は、植物体中の１種又は複数のスクロース代謝酵素の量又は活性を増大させること又は低減させることを含む、植物体、好ましくは、コーヒーにおけるスクロース代謝酵素プロフィール又は糖プロフィールを変更する方法を特徴とする。本発明の具体的な実施形態は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生を増大させること又は低減させることによって植物体の糖プロフィールを変更する方法を提供する。
【００８８】
本発明に従って得られたデータは、コーヒー子実成熟の最終段階でのインベルターゼ活性（酸性又は中性インベルターゼ）の低下が、子実中のスクロース蓄積の増大をもたらすということを強力に示す。したがって、本発明の好ましい一実施形態は、インベルターゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号５、６、７又は８に対応するｃＤＮＡを用い、コーヒーの種々の組織においてその阻害剤を過剰産生させることを目的としてコーヒーノキを形質転換することを含む。一実施形態では、例えば、インベルターゼ阻害剤遺伝子と機能的に連結している、ＲｕＢｉｓＣｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのプロモーターの使用を介して、インベルターゼ阻害剤産生の全体的な増大のためにコーヒーノキを操作する。インベルターゼ阻害剤の過剰産生を注目するシンク器官、すなわち、子実のみに制限するよう設計された別の実施形態では、子実特異的プロモーター、特に、上記のコフィア子実特異的プロモーターの１種を使用できる。
【００８９】
植物体のスクロースプロフィールは、植物体、例えば、コーヒー中の１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を調節することによって増強することができる。さらに、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の天然に存在する変異体について、増強されたスクロースレベルを発現する植物をスクリーニングすることができる。例えば、機能喪失型（ヌル）突然変異植物を、作製できるか、又は現在入手可能な植物体突然変異体の集団から選択できる。当業者には当然のことながら、突然変異植物集団はまた、本明細書に記載される方法のうち１種又は複数を用いて特定のスクロース代謝酵素を低発現又は過剰発現する突然変異体についてスクリーニングできる。突然変異集団は、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発及びトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡ挿入又はターゲッティング・インデュースド・ローカル・リーションズ・イン・ゲノムズ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＴＩＬＬＩＮＧ、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、２００４年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５（２）：６３０〜６３６頁； Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ＆ Ｈａｕｇｈｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．８（２）：２１１〜２１５頁参照のこと）によって作製できる。突然変異集団を作製する方法は、当技術分野では周知である。
【００９０】
本発明の核酸を用いて、種々の植物種におけるスクロース代謝酵素の突然変異型を同定できる。トランスポゾン挿入株が利用可能であるトウモロコシ又はシロイヌナズナなどの種では、オリゴヌクレオチドプライマーを、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤遺伝子中の挿入について株をスクリーニングするよう設計できる。次いで、育種によって、中断された遺伝子にとってヘテロ接合性であるかホモ接合性である植物株を発達させることができる。
【００９１】
植物体はまた、突然変異誘発技術によって作製されたヌル突然変異体において見られるものと類似の表現型を示すよう操作できる。トランスジェニックヌル突然変異体は、「ドミナントネガティブ効果」を出すために、選択されたインベルターゼタンパク質の突然変異型を発現させることによって作製できる。本発明をいずれか１つの機構に制限するものではないが、この突然変異タンパク質は、相互作用タンパク質又はその他の細胞因子について野生型タンパク質と競合する。この種の「ドミナントネガティブ」効果の例は、昆虫システム及び脊椎動物システムの両方についてよく知られている（Ｒａｄｋｅら、１９９７年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４５：１６３〜１７１頁；Ｋｏｌｃｈら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：４２６〜４２８頁）。
【００９２】
「転写後遺伝子サイレンシング」によってスクロース代謝酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、もう１つの種類のトランスジェニックヌル突然変異体を作製できる。これらの技術を用いて、植物子実においてインベルターゼをダウンレギュレートするのを促進し、それによってスクロース蓄積を促進することができる。例えば、ダウンレギュレーションの標的とされた種に由来するインベルターゼをコードする遺伝子、又はその断片を利用してコードされるタンパク質の産生を制御することができる。この目的には、全長アンチセンス分子を使用できる。或いは、翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの特定の領域に対して標的とされるアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用できる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用は、当技術分野では公知である。アンチセンス分子は、転写されるとアンチセンスＲＮＡ配列を生じるＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換することによってｉｎ ｓｉｔｕで提供できる。このような構築物は、全長又は部分アンチセンス配列を生じるよう設計できる。この遺伝子サイレンシング効果は、遺伝子をコードする配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両方を遺伝子組換えによって過剰産生させ、その結果、多量のｄｓＲＮＡが産生されることによって増強できる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８年、ＰＮＡＳ ９５：１３９５９〜１３９６４頁参照のこと）。この関連で、少なくとも１つのイントロンの一部又はすべてに相当するｄｓＲＮＡを含有する配列が特に有効であるとわかっている。一実施形態では、インベルターゼをコードする配列アンチセンス鎖の一部又はすべてが、導入遺伝子によって発現される。別の実施形態では、コード配列の一部又はすべてのハイブリダイズするセンス及びアンチセンス鎖が、遺伝子組換えによって発現される。
【００９３】
別の実施形態では、植物システムに対して現在利用可能な種々のその他の転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技術の使用によって、遺伝子をサイレンシングすることができる。ＲＮＡサイレンシングは、ＲＮアーゼＨをベースとする酵素（「ダイサー」又は「ダイサー様」）による、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の小さな２１〜２８ヌクレオチド断片へのプロセシングを含む。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である切断生成物は、タンパク質エフェクター複合体中に組み込まれ、これが配列特異的に遺伝子発現を調節する（植物におけるＲＮＡサイレンシングの総説については、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ、２００４年、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７２：６５〜７３頁；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３５６〜３６３頁；Ｈｅｒｒ、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３２：９４６〜９５１頁参照のこと）。
【００９４】
低分子干渉ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学合成し、転写させ、増幅させ、次いで細胞に送達することができる。送達は、マイクロインジェクション（Ｔｕｓｃｈｌ Ｔら、２００２年）、化学トランスフェクション（Ａｇｒａｗａｌ Ｎら、２００３年）、エレクトロポレーション又は陽イオン性リポソーム媒介性トランスフェクション（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲら、２００２年；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭら、２００２年）、又は当技術分野で利用可能な任意のその他の手段によってであり得、当業者には理解される。或いは、ｓｉＲＮＡのＤＮＡ鋳型を、例えば、プラスミドによって注目する細胞に挿入することによってｓｉＲＮＡを細胞内に発現させることができ（Ｔｕｓｃｈｌ Ｔら、２００２年）、細胞を選択するために特異的に標的とされ得る。低分子干渉ＲＮＡは、植物中にうまく導入されている（Ｋｌａｈｒｅ Ｕら、２００２年）。
【００９５】
本発明におけるＲＮＡサイレンシングの好ましい方法は、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。個々の所望のｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを、一般的な手段によって標的細胞に送達する。ＤＮＡ配列は、一度、細胞に入ると、ＲＮＡ分子に連続的に転写され、これが分子内塩基対形成によって自身で折り曲がり、ヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、ひとたび細胞によってプロセシングされると、ｓｉＲＮＡ分子に相当し、所望のタンパク質のＲＮＡサイレンシングを媒介するために細胞によって使用される。植物におけるＲＮＡサイレンシングのための特定の有用性を有する種々の構築物は、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ、２００４年、前掲によって記載されている。通常、このような構築物は、プロモーター、「センス」方向のサイレンシングされる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス及びターミネーターを含む。
【００９６】
「コサプレッション（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という技術によって、さらにもう１つの種類の合成ヌル突然変異体を作製することもできる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６（６）．６５１〜６５９頁）。抑制のために標的とされる内因性遺伝子コピーを用いて植物細胞を形質転換する。多くの場合、これが、天然遺伝子並びに導入遺伝子の完全抑制をもたらす。一実施形態では、注目する植物種由来のインベルターゼをコードする遺伝子を単離し、その同種の細胞を形質転換するために用いる。
【００９７】
本発明に従って、任意の前記方法によって製造された突然変異植物又はトランスジェニック植物もまた特徴とする。植物は稔性であり、そのために育種目的にとって有用であることが好ましい。したがって、突然変異体又は前記の所望の表現型のうち１種又は複数を示す植物を、農業又は園芸適用において植物育種のために、又は直接的に使用できる。それらはまた、スクロース代謝酵素の関与及びコーヒー種子の風味、香り及びその他の特徴に影響を及ぼすスクロースレベルに対するその作用についてのさらなる解明のための研究ツールとしても有用である。また、表現型の増強された、又は組み合わされた植物を作製するために、ある導入遺伝子又は指定の突然変異を含む植物を、相補的な導入遺伝子又は遺伝子型を含む植物体と交雑させることもできる。
【００９８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供する。実施例は例示目的であって、本発明を制限しようとするものではない。
【００９９】
（実施例１）
以下の実施例のための材料及び方法
植物材料。温室条件（２５℃、７０％ＲＨ）下で増殖させたコフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ） Ｌ．ｃｖ．ＣａｔｕｒｒａＴ２３０８から、又はＩｎｄｏｎｅｓｉａｎ Ｃｏｆｆｅｅ ａｎｄ Ｃａｃａｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＩＣＣＲＩ）、インドネシアで屋外で成長させたコフィア・カネフォラ ＢＰ４０９（ロブスタ）から、葉、花、茎、根又は種々の発達段階の果実のいずれかから組織を採取した。果実は、規定の段階で採取し、液体窒素中で直ちに凍結し、次いで、輸送のためにドライアイス中に詰めた。キト（Ｑｕｉｔｏ）、エクアドル（Ｅｃｕａｄｏｒ）において栽培した木から、ＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４（ロブスタ）及びＣＣＣＡ１２（アラビカ）由来の果実を得た。サンプルを、輸送のために−２５℃で凍結し、次いで、使用まで−８０℃で保存した。
【０１００】
ユニバーサルゲノムウォーカー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ）。Ｃｒｏｕｚｉｌｌａｔら、１９９６年に従い、ＢＰ４０９由来のゲノムＤＮＡを、温室で成長した木から採取した葉から抽出した。ゲノムＤＮＡを４種の異なる制限酵素（ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩ、ＳｔｕＩ）で消化し、得られた断片を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって提供されるＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ａｄａｐｔｏｒと平滑末端に連結した。両セットの反応は、キットユーザーマニュアルに従って実施した。次いで、４種のライブラリーを、Ｇｅｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＳＰ）を用いるＰＣＲ反応の鋳型として用いた（表１）。反応混合物は、Ｔａｋａｒａ製の適当なバッファーを含む５０μｌの最終容積中、１μｌのＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒライブラリー鋳型、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌの各プライマー及び１ＵのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃｏｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含んでいた。第１のＰＣＲには以下の条件を用いた：９５℃で２分間のプレ変性後、最初の７サイクルは、９５℃で３０秒間の変性温度と、それに続く、７２℃で３分間のアニーリング及び伸長ステップで実施した。さらなる３５サイクルは、９５℃で３０秒間の変性ステップと、それに続く、６７℃で３分間のアニーリング／伸長ステップを用いて実施した。プライマー対ＡＰ１／ＧＳＰ−ＧＷ１を用いる最初の増幅から得られた産物が、プライマーとしてＡＰ２／ＧＳＰ−ＧＷＮ１及びＡＰ２及びＧＳＰ−ＧＷＮを用いる第２のＰＣＲの鋳型として役割を果たした。第２のＰＣＲは、２μｌの最初の増幅反応物（未希釈のもの及び１：５０までの種々の希釈）を用い、第２の反応が２５サイクルのみの増幅を用いたという点を除いて最初の反応について上記に記載されるように実施した。得られたＰＣＲ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。主要なバンドから得られたＰＣＲ断片を精製し、クローニングし、配列決定した。
【０１０１】
【表１】
表１． Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ実験に用いたプライマーの一覧
【０１０２】
ＤＮＡ配列分析。ＤＮＡ配列決定のために、組換えプラスミドＤＮＡを調製し、標準的な方法に従って配列決定した。ＤＮＡ Ｓｔａｒ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ソフトウェアを用いてコンピュータ分析を実施した。配列相同性は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して確認した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）。
【０１０３】
ｃＤＮＡ調製。ＲＮＡは、種々の組織、すなわち、根、茎、葉、花、果皮及び先に記載したように（Ｂｅｎａｍｏｒ及びＭｃ Ｃａｒｔｈｙ、２００３年）、４つの異なる成熟段階ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）の子実から抽出した。ｃＤＮＡは、以下のように、全ＲＮＡ及びオリゴｄＴ（１８）（Ｓｉｇｍａ）から調製した：１μｇの全ＲＮＡサンプル及び５０ｎｇのオリゴｄＴを、ＤＥＰＣ処理水を用いて１２μｌの最終容積とした。この混合物を、続いて、７０℃で１０分間インキュベートし、次いで、氷上で迅速に冷却した。次いで、４μｌの第１鎖バッファー（５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。これらの反応混合物を、４２℃で２分間プレインキュベートし、その後、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｒｎアーゼ Ｈ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。続いて、この試験管を、４２℃で５０分間インキュベートし、続いて、７０℃で１０分間加熱することによって酵素を不活化した。次いで、作製したｃＤＮＡサンプルを１００倍希釈し、５μｌの希釈したｃＤＮＡをＱ−ＰＣＲに用いた。
【０１０４】
ＣｃＩＮＶ１ ｃＤＮＡ単離物の３’ＲＡＣＥ（３’ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）。ＲＮＡを、先に記載される（Ｂｅｎａｍｏｒ及びＭｃ Ｃａｒｔｈｙ、２００３年；Ｂｅｎａｍｏｒら、報告書準備中）、４つの異なる成熟段階ＳＧ、ＬＧ、Ｙ、Ｒの果皮及び子実から抽出した。次いで、ｄＴ（１８）テール（５’ｃｔｔｃｃｇａｔｃｃｃｔａｃｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ３’）（配列番号４５）プライマーを用い、以下のように全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した：１μｇの全ＲＮＡサンプル及び５０ｎｇのｄＴ（１８）テールプライマーを、ＤＥＰＣ処理水を用いて１２μｌとした。続いて、この混合物を、７０℃で１０分間インキュベートし、次いで、氷上で迅速に冷却した。次いで、４μｌの第１鎖バッファー（５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。これらの反応混合物を、４２℃で２分間プレインキュベートし、その後、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｎアーゼ−Ｈ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。続いて、この試験管を、４２℃で５０分間インキュベートし、続いて、７０℃で１０分間加熱することによって酵素を不活化した。次いで、作製したｃＤＮＡサンプルを、第１のＰＣＲのプライマーとしてＩｎｖ１−３’ａ１（５’ｇａｃｇｔｇａａｔｇｇｔｔｇｃｔｇｇｔｃａｇｇ３’）（配列番号４６）とテール−３’ＲＡＣＥ（５’ｃｔｔｃｃｇａｔｃｃｃｔａｃｇｃ３’）（配列番号４７）とを用い、第２のＰＣＲのプライマーとしてＩｎｖ１−３’ａ２（５’ｔａｃａｇｔｇｇｇｔｇｃｔｇａｇｃｔｔｔｇｇｔ３’）（配列番号４８）とテール−３’ＲＡＣＥとを用いるＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応は、以下のように５０μｌの反応液中で実施した：５μｌのｃＤＮＡ；１×ＰＣＲバッファー（Ｌａ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ Ｍｇ＋＋プラス）、８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で５分間変性させた後、増幅は、９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間の３５サイクルからなっていた。さらなる最終伸長ステップは、７２℃で７分間行った。
【０１０５】
全長ＩＮＶ１及びＩＮＶ３ ｃＤＮＡ増幅。全長ＩＮＶ１及びＩＮＶ３ ｃＤＮＡを増幅するために、２セットのプライマー：ＩＮＶ１−ＡＴＧ（５’ａｔｇｇｃｔａｇｃｔｔｔｔａｃｃｔｃｔｇｇｃｔａａｔｇｔｇ３’）（配列番号４９）、ＩＮＶ１−ＳＴＯＰ（５’ｔｃａａｔｔｃｔｔｔｃｇａｔｔｇａｔａｃｔｇｇｃａｔｔｃｔ３’）（配列番号５０）及びＩＮＶ３−ＡＴＧ（５’ａｔｇｇａｇｔｇｔｇｔｔａｇａｇａａｔａｔｃａａｃｔ３’）（配列番号５１）、ＩＮＶ３−ＳＴＯＰ（５’ｔｃａｇｃａｇｇｔｃｃａｃｇａｇｇａｇｇａｔｃｔｃｔ３’）（配列番号５２）をそれぞれ、プライマーウォーキング又は３’ＲＡＣＥ実験から得たＩＮＶ１又はＩＮＶ３配列で設計した。これら２種のプライマーセットを用い、上記のｃＤＮＡサンプルを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は、以下のように５０μｌの反応液中で実施した：５μｌのｃＤＮＡ；１×ＰＣＲバッファー（Ｌａ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ Ｍｇ＋＋プラス）、８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で５分間変性させた後、増幅は、９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間の３５サイクルからなっていた。さらなる最終伸長ステップは、７２℃で７分間行った。得られた断片を、アガロースゲルから精製し、クローニングし、配列決定した。
【０１０６】
定量的−ＲＴ−ＰＣＲ。ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲは、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によって推奨されるように実施した。この実験に用いたｃＤＮＡサンプルは、先に記載されている。すべての反応は、１×ＴａｑＭａｎバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μｌのｃＤＮＡ及び０．６２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲは、８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、フォワード及びリバース並びに２００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブを用いて実施した。プライマー及びプローブは、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、表２）を用いて設計した。反応混合物を、５０℃で２分間、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒間／６０℃で１分間の４０増幅サイクルを行った。ＧｅｎｅＡｍｐ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサンプルを定量化した。転写物レベルは、比較の基準としてｒｐｌ３９を用いて調べた。
【０１０７】
【表２】
表２． Ｑ−ＰＣＲ実験に用いるプライマー及びプローブの一覧
ＭＧＢプローブは、５’を蛍光レポーター色素６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を用いて、３’をクエンチャー色素６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用いて標識した。ｒｐｌ３９プローブは、５’を蛍光レポーター色素ＶＩＣを用いて、３’末端をクエンチャーＴＡＭＲＡを用いて標識した。すべての配列は５’から３’に示されている。
【０１０８】
可溶性糖質定量化。子実組織を果皮及び外皮から分離した。子実を液体窒素を用い低温粉砕機でホモジナイズし、得られた粉末を４８時間凍結乾燥した（Ｌｙｏｌａｂ ｂＩＩ、Ｓｅｃｆｒｏｉｄ）。各サンプルを秤量し、７０ｍｌの、７０℃に予め加熱しておいた再蒸留水に懸濁し、次いで、激しく振盪し、７０℃で３０分間インキュベートした。室温に冷却した後、再蒸留水を加えることによってサンプルを１００ｍｌとし、次いで、濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌフィルターペーパー５９７．５）で濾過した。抽出したコーヒー子実組織の糖質を、Ｌｏｃｈｅｒら、１９９８年に従ってＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００（４×２５０ｍｍ）カラムを用いてＨＰＡＥ−ＰＥＤによって分離した。糖濃度は、ｇ／１００ｇＤＷ（乾燥重量）で表した。
【０１０９】
酵素活性分析。中性及び酸性インベルターゼ活性は、Ｋｉｎｇら、１９９７年に従って測定した。
【０１１０】
（実施例２）
Ｃ．カネフォラにおけるインベルターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡの同定
若い葉から単離した、また、異なる発達段階で収穫した果実の子実及び果皮組織から単離したＲＮＡを用いて作製したいくつかのコーヒーライブラリーから、４７，０００を超えるＥＳＴ配列を同定した。続いて、重複するＥＳＴを「ユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）」（すなわち、コンティグ）に「クラスタリングし」、ＮＣＢＩ非重複タンパク質データベースに対して個々の配列各々のＢＬＡＳＴ検索を行うことによってユニジーン配列に注釈を付けた。
【０１１１】
スクロースの合成及び分解に直接関与している酵素は植物では、特に、果実、塊茎及び種子発達の間、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））及びトウモロコシ（ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））などの植物で広く研究されている。いくつかの種では、スクロース合成及び分解に関与しているすべての既知の重要なタンパク質をコードするＤＮＡ配列が同定されており、特性決定されており、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能である。したがって、植物酵素の既知の配列、特に、コーヒーと密接に関連している生物（例えば、トマト及びジャガイモ）から得た配列を用いて、上記のＥＳＴライブラリー中、及びその他のコーヒーｃＤＮＡライブラリー中に存在する類似の配列を見出すことができた。実施例１に記載されるように、上記のＥＳＴ収集物を検索するために、「ユニジーン」セット５のｔＢＬＡＳＴｎ検索においてトマト及びジャガイモのタンパク質配列を用いた。オープンリーディングフレームが、「クエリー」配列と最高程度の同一性を示したインシリコの「ユニジーン」を、さらなる研究のために選択した。いくつかの場合では、選択した「ユニジーン」は、全長ｃＤＮＡクローンに相当する可能性がある少なくとも１種のＥＳＴ配列を含んでおり、次いで、そのクローンを再配列決定のために選択し、同一性及び「ユニジーン」配列の両方を確認した。
【０１１２】
可溶性、細胞内局在、至適ｐＨ及び等電点に基づいて、３種の異なる種類のインベルターゼアイソザイムを区別することができる：液胞型（ＩｎｖＶ）、細胞壁結合型（ＩｎｖＣＷ）及び中性（ＩｎｖＮ）インベルターゼ。ＩｎｖＶ及びＩｎｖＣＷは類似の酵素特性及び生化学的特性を有し、高度の配列全体の相同性及び２種の保存されたアミノ酸モチーフを共有している。１つの共通の特徴は、ペンタペプチドＮ−ＤＰＮ−Ｇ／Ａ（配列番号７７）（β−フルクトフラノシダーゼ−モチーフ；Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年；Ｒｏｉｔｓｃｈ及びＧｏｎｚａｌｅｚ、２００４年）。第２の保存された特徴は、高度に保存されたシステイン配列ＷＥＣＸ（Ｐ／Ｖ）ＤＦ（配列番号７８）（Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）（式中、Ｖ及びＰはそれぞれ、液胞型及び細胞壁型（ペリプラズム）インベルターゼを区別する）である。
【０１１３】
コーヒーにおいて３種のインベルターゼアイソザイムをコードするｃＤＮＡを見出すために、（１）トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１、（２）トマト細胞壁型インベルターゼＬＩＮ６及び（３）シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）中性（細胞質）インベルターゼ様タンパク質に相当するタンパク質配列を用い、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いてユニジーンセットの類似性検索を実施した。
【０１１４】
Ａ．ＣｃＩｎｖ２（配列番号１０）
ユニジーン１２７３３６のＯＲＦが、トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１（ＮＣＢＩタンパク質識別子番号Ｐ２９０００；Ｋｌａｎｎら、１９９２年）と高度の相同性を有することがわかった。このユニジーン中の単一のＥＳＴ、クローンｃｃｃｌ２０ｆ１１を単離し、その挿入断片を完全に配列決定した。ｃＤＮＡ挿入断片は２２１２ｂｐの長さであることがわかった。このクローンの完全ＯＲＦ配列は、位置１９２で始まり位置１９５２で終わる１７６１ｂｐの長さであった。推定されるタンパク質は５８６ａａの長さであり、予測分子量は６４ｋＤａであった。ｃｃｃｌ２０ｆ１１によってコードされるタンパク質は、ＣｃＩｎｖ２（コフィア・カネフォラ インベルターゼ２）と注釈を付けた。ＣｃＩｎｖ２は、トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１と６９．６％同一であり、ジャガイモＳＴＶＩｎｖに特徴付けられるインベルターゼと６８．５％同一である（図２）。Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉらは、最近、液胞型インベルターゼをコードしている可能性のあるＣ・アラビカ由来の部分ｃＤＮＡ配列を、公開データベースに入れた（ＮＣＢＩヌクレオチド識別子番号ＡＪ５７５２５８）。彼らは、この部分タンパク質配列をＩｎｖ２（ＮＣＢＩタンパク質識別子番号ＣＡＥ０１３１８）と呼んだ。ＣｃＩｎｖ２とｉｎｖ２の間の部分アラインメントは９３．８％の同一性を示した（図２）。このロブスタインベルターゼの提案される液胞局在は、高度に保存されたＷＥＣＶＤＦドメイン中のＶの存在によって支持されるが（図２、Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）、ｉｎｖ２タンパク質配列は、このドメイン中のＰの存在を特徴とし、このことは、ｉｎｖ２が細胞壁結合型インベルターゼであり得るということを示唆する。図２中のアラインメントは、ＣｃＩｎｖ２のＮ末端領域は、その他の植物から得た２種の相同体について見られるものよりも短いということを示す。しかし、ｃｃｃｌ２０ｆ１１のｃＤＮＡ挿入断片は、実際には、図２においてＣｃＩｎｖ２について示される最初のアミノ酸を１９０ｂｐ超えて始まる。この１９０ｂｐの配列は２つのオープンリーディングフレームを含むが、どちらも、主要なＯＲＦとインフレームではない。さらに、短いＯＲＦのアミノ酸配列は、その他の２種の相同配列において見られる配列に対応しない（図２）。これらの結果は、このコフィア・カネフォラタンパク質のＮ末端領域が、その他の植物の相同タンパク質中の匹敵する領域よりも短いこと、又はｃＤＮＡクローンのこの領域におけるイントロンの存在のいずれかによって説明できる。
【０１１５】
Ｂ．ＣｃＩｎｖ３（配列番号１１）
クローンｃｃｃｐ２８ｐ２２（ユニジーン９６０９５）によってコードされるタンパク質は、シロイヌナズナ由来の中性細胞質型インベルターゼ（タンパク質識別子番号ＮＰ＿５６７３４７）に対して高い相同性を有する。ｃｃｃｐ２８ｐ２２クローンによってコードされるタンパク質は、ＣｃＩｎｖ３（コフィア・カネフォラ インベルターゼ３）と注釈を付けた。得られた最適アラインメントによれば、ｃｃｃｐ２８ｐ２２のｃＤＮＡ挿入断片は、全長ではなく、すなわち、全タンパク質をコードしていない（約１５００個の塩基が失われている）。本発明者らは、数ラウンドのプライマー指向性ゲノムウォーキングを用い、ｃｃｃｐ２８ｐ２２配列５’領域上流に相当するＣ．カネフォラ由来のゲノム配列を増幅することができた。本発明者らは、特異的プライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲによって全長ｃＤＮＡを増幅した。Ｃ・アラビカ及びＣ．カネフォラ由来のいくつかのＲＮＡサンプルを用いたが、全長ｃＤＮＡ配列に相当する陽性の増幅は、黄色段階のアラビカ子実から抽出したＲＮＡを用いてのみ得られた。この新規ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質は、ＣａＩｎｖ３（コフィア・アラビカ インベルターゼ３）と注釈を付けた。ＣａＩｎｖ３ ｃＤＮＡは１６７５ｂｐの長さである。推定タンパク質は５５８ａａの長さであり、予測分子量は６３．８ｋＤａである。ＣａＩｎｖ３ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質配列は、シロイヌナズナ由来の中性細胞質型インベルターゼと極めて高レベルの相同性（８３．７％）を示す（図３）。
【０１１６】
Ｃ．ＣｃＩｎｖ４（配列番号１２）
クローンｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０（ユニジーン１２３７０５）によってコードされるタンパク質は、トマト細胞壁結合型インベルターゼＬＩＮ６（ＮＣＢＩタンパク質識別子番号ＡＡＭ２８８２３）とかなりの程度の同一性を有している（６２．７％）。アラインメントは図４に示されている。得られた最適アラインメントによれば、ｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０のｃＤＮＡ挿入断片は、全長ではなく、すなわち、全タンパク質をコードしていない（約１５００個の塩基が失われている）。ｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０によってコードされるタンパク質がまた、トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１とも３８％の同一性を共有することに留意することは重要である（Ｋｌａｎｎら、１９９２年）。ｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０クローンによってコードされるタンパク質は、ＣｃＩｎｖ４（コフィア・カネフォラ インベルターゼ４）と注釈を付けた。このタンパク質は、細胞壁結合型インベルターゼよりも液胞型インベルターゼと高い相同性を共有している。５’末端の失われている領域を単離するために、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ及び５’ＲＡＣＥを実施した。
【０１１７】
本発明者らは、上記に示したデータに基づいて、Ｃ．カネフォラ データベースから各種類のインベルターゼアイソザイムをコードする１種のｃＤＮＡを単離した。
【０１１８】
Ｄ．ＣｃＩｎｖ１（配列番号９）
コフィア・アラビカ由来の細胞壁型インベルターゼをコードする部分ｃＤＮＡ配列（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉらによって入手可能になった：ＮＣＢＩヌクレオチド識別子番号ＡＪ５７５２５７、コードされる部分タンパク質配列（Ｉｎｖ１）ＮＣＢＩタンパク質識別子番号ＣＡＥ１３１７．１）を用いて、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ）から相同全長ｃＤＮＡ配列を単離した。部分ｃＤＮＡ配列及び３’ＲＡＣＥ、並びに実施例１に記載される「プライマー利用」ゲノムウォーキング実験を用いて、相同全長ｃＤＮＡが１７３１ｂｐの長さであることがわかり、推定タンパク質は５７６ａａの長さであり、予測分子量は６４．６ｋＤａであった。このタンパク質にはＣｃＩｎｖ１（コフィア・カネフォラ インベルターゼ１）と注釈を付けた。
【０１１９】
ＣｃＩｎｖ１について得られたタンパク質配列は、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉらによって得られた配列と同一ではなく、部分アラビカｃＤＮＡ配列の既知の１６３個のアミノ酸にわたって４つのアミノ酸の相違を有している。ＣｃＩｎｖ１の、いくつかの高度に相同なデータベース配列とのアラインメントは、ＣｃＩｎｖ１がトマト細胞壁結合型ＬＩＮ６と５５．２％の同一性及びＤＣＣＷ Ｉｎｖ、すなわちニンジンにおいて同定された細胞壁結合型インベルターゼと５４．３％の同一性を有するということを示す（図５）。ＣｃＩｎｖの提案される細胞内局在は、高度に保存されたＷＥＣＰＤＦドメイン中のＰの存在によって支持される（図５、Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）。
【０１２０】
（実施例３）
Ｃ．カネフォラにおけるインベルターゼ阻害剤タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定
過去１０年の最近の刊行物は、インベルターゼの活性は、インベルターゼ阻害剤と呼ばれる小分子量タンパク質（＜２０ｋＤａ）の群との相互作用によって翻訳後レベルで調節できるということを示した（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８；Ｇｒｅｉｎｅｒら、２０００；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年；Ｂａｔｅら、２００４年）。公開データベースにおいて、いくつかの植物種から多数の配列が同定されたが、そのうち生化学的に特性決定されたものはほとんどない。最近、２種のインベルターゼ阻害剤、タバコ由来のＮｔＩＮＶＩＮＨ１（タンパク質識別子番号ＣＡＡ７３３３３；Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８年）及びトウモロコシ由来のＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１（ヌクレオチド同定番号ＡＸ２１４３３３；Ｂａｔｅら、２００４年、Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年のタンパク質ＩＤ．１に相当する）が、生化学的に特性決定された。例えば、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１は、スクロースセンサーとして作用するその能力によってスクロース代謝を直接制御することがわかった（Ｂａｔｅら、２００４年）。高スクロース濃度の存在下では、インベルターゼ阻害剤ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１は不活性のままであり、初期果実形成の間のスクロース加水分解が可能となる。このインベルターゼ阻害剤は、スクロースレベルが指定のレベルを下回って低下すると、活性となり、インベルターゼ活性を阻害する（Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年；Ｂａｔｅら、２００４年）。
【０１２１】
さまざまな生物（トマト、タバコ、トウモロコシ及びシロイヌナズナ）に由来するインベルターゼ阻害剤配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能であるが、そのほとんどは単純に、ＢＬＡＳＴを用いて得られた相同性結果に基づいて注釈が付けられており、その生化学的活性の直接的特性決定によってではない。生化学的に特性決定されている比較的少数のインベルターゼ阻害剤は、概して、互いに弱い相同性しか示さず（Ｂａｔｅら、２００４年）、今日まで、このクラスのタンパク質は、明確な高度に保存された配列モチーフを有さない（Ｂａｔｅら、２００４年）ということは留意される。したがって、「インベルターゼ阻害剤」又は「インベルターゼ阻害剤様タンパク質」として注釈が付けられたデータベース登録は、注意して解釈されなければならない。本発明者らは、コーヒーデータベースにおいて、コーヒーインベルターゼについてｂｌａｓｔ検索を実施するために、生化学的に特性決定されたインベルターゼ阻害剤ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１をコードする配列、ＮｔＩｎｖＩ及びＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年中のタンパク質ＩＤ．３１（タンパク質識別子番号ＣＡＣ６９３４５）を用いた。
【０１２２】
この検索に基づいて、ＥＳＴデータベースにおいて、データベースインベルターゼ阻害剤と類似性を有する、４種のクローンｃｃｃｐ２ｄ１（ユニジーン１２４２０９）、ｃｃｃｓ３０ｗ１４ｉ２４（ユニジーン１２５３３２）、ｃｃｃｓ３０ｗ２４ｎ８（ユニジーン１２２７０５）及びＡ５−１４６２を同定した。
【０１２３】
Ａ．ＣｃＩｎｖＩ１（配列番号１３）
ｃｃｃｐ２ｄ１クローンの６７０ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、２０．７ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする５５８ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。ｃｃｃｐ２ｄ１のタンパク質配列は、トウモロコシにおいて特性決定されたインベルターゼ阻害剤ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１（Ｂａｔｅら、２００４年）と３１．２％同一である（図６）。このｃＤＮＡは、ＣｃＩｎｖＩ１（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤１）と注釈を付けた。
【０１２４】
Ｂ．ＣｃＩｎｖＩ２（配列番号１４）
ｃｃｃｓ３０ｗｌ４ｉ２４クローンの６２９ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、１９．６ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする５３７ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。ｃｃｃｓ３０ｗｌ４ｉ２４のタンパク質配列は、タバコにおいて特性決定されたインベルターゼ阻害剤ＮｔＩｎｖＩ（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８年；Ｗｅｉｌら、１９９４年）と３４．６％同一である（図６）。このｃＤＮＡはＣｃＩｎｖＩ２（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤２）と注釈を付けた。
【０１２５】
Ｃ．ＣｃＩｎｖＩ３（配列番号１５）
ＰＣＴ出願ＰＴＣ／ＥＰ２００４／００６８０５に記載されるｃＤＮＡライブラリーのＢｌａｓｔスクリーニングの結果、ｃＤＮＡクローンＡ５−１４６２が発見された。Ａ５−１４６２クローンの７０４ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、１８．４ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする４９５ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。Ａ５−１４６２のタンパク質配列は、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１と１３％しか同一でないが（図６）、タンパク質ＩＤ．３１（ヌクレオチド同定番号ＡＸ２１４３６３；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年）とは２４．４％同一である。このｃＤＮＡは、ＣｃＩｎｖＩ３（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤３）と注釈を付けた。
【０１２６】
Ｄ．ＣｃＩｎｖＩ４（配列番号１６）
ｃｃｃｓ３０ｗ２４ｎ８クローンの６４０ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、２０．２ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする５５５ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。ｃｃｃｓ３０ｗ２４ｎ８のタンパク質配列は、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１と２０．５％同一であり（図６）、タンパク質ＩＤ．３１（ヌクレオチド同定番号ＡＸ２１４３６３；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年）と２５．７％同一である。このｃＤＮＡは、ＣｃＩｎｖＩ４（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤４）と注釈を付けた。
【０１２７】
先に記載したように、ＣｃＩｎｖＩタンパク質はあまり保存されておらず、例えば、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１又はＮｔＩｎｖＩと弱い相同性しか共有していない。機能に必須であると知られている４つの「保存された」Ｃｙｓ残基（Ｒａｕｓｃｈ及びＧｒｅｉｎｅｒ、２００３年；Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏら、２００３年；Ｈｏｔｈｏｒｎら、２００３年；Ｈｏｔｈｏｍら、２００４年）は、各タンパク質中に存在している（図６）。
【０１２８】
（実施例４）
コーヒー豆成熟の間の酸性及び中性インベルターゼ活性
ＦＲＴ０５（ロブスタ）及びＣＣＣＡ１２（アラビカ）から得た全粒において、コーヒー子実成熟の間のグルコース、フルクトース及びスクロースの濃度を調べた。本発明者らは、これまでにこれら２種の遺伝子型が大幅に異なるレベルのスクロースを有するとわかっていたので、分析するよう選択した（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌａｍｂｏｔ、公開されていないデータ）。本発明者らは、この相違の機序を理解するために、これら２種の品種の子実発達の間のスクロースの蓄積、並びにグルコース及びフルクトースのレベルを分析した。同時に、酸性及び中性インベルターゼ活性を、遊離糖蓄積とこれらの特定の活性の間に相関関係があり得るかどうかを調べるために調べた。同様の実験は、第２のロブスタ品種、ＦＲＴ６４から得たサンプルを用いて実施した。結果は表３及び図７に示されている。
【０１２９】
表３．コーヒー豆成熟の間の酸性及び中性インベルターゼ活性。
この研究には大きさ及び色を特徴とする４つの異なる成熟段階のコーヒー果実を用いた：すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）。コーヒー子実中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を、インベルターゼ活性のアッセイのために採取したものと同時に採取したサンプルにおいて測定した。糖濃度は、ｇ／１００ｇＤＷ（乾重）で表されているのに対し、酵素活性は、μモル．ｈ−１．ｍｇ−１タンパク質で表されている。
【表３】
【０１３０】
Ａ．コーヒー子実成熟の間の糖レベル
調べた成熟度の最初期段階（ＳＧ段階）では、主要な遊離糖はグルコースであったが、その濃度は、ＣＣＣＡ１２（１４％）において、ＦＲＴ０５（１．５％）よりも１０倍高かった。同じ段階で、フルクトース濃度もアラビカ（１．５％）において、ＦＲＴ０５（０．３％）よりも高かったが、フルクトースはグルコースよりも蓄積されないことは明らかであった。子実発達の最後までに、両種の、グルコースとフルクトースの濃度が極めて低いレベルに低下し、成熟した赤い段階（Ｒ）では微量しか検出されなかった。これら２種の糖の減少はスクロースの増大と同時に起こり、これは成熟した子実中の全遊離糖の１００％に迫り、やはり、アラビカ（９．８２％）において、ロブスタ（６．７１％）よりも高い。スクロース、グルコース及びフルクトース変動に関する同様の全体的な所見は、ＦＲＴ６４コーヒー豆成熟の間にもなされ得る。最初期段階では、グルコースが、フルクトースよりも蓄積される。発達の最後では、スクロースが主要な蓄積される糖であった。興味深いことに、ＦＲＴ６４及びＦＲＴ０５が、Ｒ段階において同様の最終スクロース濃度（およそ６．６％ＤＷ）を有する場合であっても、スクロースは、すべてのそれまでの段階、すなわち、ＳＧ（６０％多く）、ＬＧ（２５％多く）及びＹ（３０％多く）では、ＦＲＴ６４において、ＦＲＴ０５サンプルよりも蓄積された。これらの結果は遊離糖蓄積のみを表すものであって、スクロース代謝に直接関与しているＵＤＰ−Ｇ、Ｆ６−Ｐ及びＳ６−Ｐのようなその修飾された形を含まないことを留意することは重要である。
【０１３１】
Ｂ．コーヒー子実成熟の間のインベルターゼ活性（酸性及び中性）
酸性及び中性酵素活性は、ＣＣＣＡ１２コーヒー子実成熟間に同様に展開した。ＣＣＣＡ１２のＳＧ段階において低い酸性（０．１７Ｕ）及び中性（０．０９Ｕ）インベルターゼ活性が観察された。両酵素活性は、ＳＧとＬＧ段階の間に劇的に増大し、酸性インベルターゼについては１．７０Ｕ、中性インベルターゼについては０．４９Ｕという活性に到達した。発達の後期段階では、ＡＩ及びＮＩ活性は劇的に低下し、Ｙ段階でほぼ同様の低いレベルの活性に到達した（それぞれ、０．１９Ｕ及び０．２０Ｕ）。ＹとＲ段階の間に、ＡＩ活性が最大０．３４Ｕに増大したのに対し、ＮＩ活性は０．１４Ｕに低下した。興味深いことに、ＡＩ及びＮＩ活性は、同じサンプルについて先に観察されたＳｕＳｙ活性よりも類似の変動を有している（所有者共通の、同時係属仮出願［まだ、割り当てられていない］参照のこと）。ＣＣＣＡ１２子実成熟の最後の段階における両インベルターゼ活性の低下とスクロース蓄積には明確な相関関係がある。
【０１３２】
ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４のＡＩ及びＮＩ活性が、ＣＣＣＡ１２について観察されるものに対して極めて異なる様式で展開することは明白である。ＡＩ（１．５０Ｕ）及びＮＩ（０．４３Ｕ）酵素は、ＦＲＴ０５発達の初期（ＳＧ段階）に高度に活性であった。ＡＩ活性は、ＳＧとＹ段階の間に劇的に低下し、０．２６Ｕに達した（Ｙ段階でＣＣＣＡ１２について観察されるものとほとんど同じ活性）。ＦＲＴ０５ではＡＩ活性はＹとＲ段階の間に上がり、１．４４Ｕに達した。中性インベルターゼの活性の低下も観察されたが、ＳＧとＬＧ段階の間のみにおいて観察された。中性インベルターゼの活性の上昇は、ＬＧとＲ段階の間に観察された。ＮＩは、その最大活性０．５４Ｕに達した。ＦＲＴ０５後期子実発達段階は、高いＡＩ及びＮＩ活性を特徴とする。ＦＲＴ６４遺伝子型については、ＡＩ活性及びＮＩ活性は、ＳＧ ＦＲＴ６４子実において低かった。両活性はＳＧ及びＬＧ段階の間は安定なままであり、ＬＧとＲ段階の間に増大し、増大はＮＩについて、ＡＩよりもより高かった。ＦＲＴ６４は、ＬＧとＲ段階の間にＦＲＴ０５と同様の中性インベルターゼ活性増大を有していたが、同時に、酸性インベルターゼ活性もＦＲＴ０５において、ＦＲＴ６４ Ｒ段階よりも２．５倍高かった。結論として、ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４は、成熟子実において同様の最終スクロース濃度を有するが、インベルターゼ、主に酸性の活性は大きく異なる。
【０１３３】
全体に、ＣＣＣＡ１２は、成熟の最終段階でのより弱い全体的なインベルターゼ活性のために、ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４よりも、ある程度より多くのスクロースを蓄積し得るようである。後期発達においてスクロースが師部から運び入れられた後に合成される場合であっても、両ロブスタではインベルターゼ活性が即時分解によってスクロース蓄積を妨げている。
【０１３４】
（実施例５）
コーヒー豆成熟の間のインベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤ｍＲＮＡ蓄積
Ｔ２３０８（コフィア・アラビカ）及びＢＰ４０９（Ｃ．カネフォラ）子実発達の間のインベルターゼ遺伝子、ＣｃＩｎｖ１、ＣｃＩｎｖ２及びＣｃＩｎｖ３並びにインベルターゼ阻害剤遺伝子ＣｃＩｎｖＩ１、２、３及び４の発現を特性決定した。本発明者らは、比較目的のため、種々のコーヒー組織、例えば、葉、花及び根におけるこれらの遺伝子の発現も特性決定した。これらの遺伝子発現研究は、酵素活性分析実験に用いられたものとは異なる品種と関連していることは留意される。それにもかかわらず、この発現データは、アラビカ対ロブスタにおけるこれらの遺伝子の発現間の全体的な比較を可能にする。
【０１３５】
ＲＮＡは、大きさ及び色を特徴とする４つの異なる成熟段階、すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色又は成熟）のＢＰ４０９及びＴ２３０８コーヒー果実から抽出した。実施例１に記載されるように、各段階について、果皮及び子実を分離し、その後、ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡはまた、その他の組織（葉、根及び花）からも抽出した。遺伝子発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実施することによって分析した。相対的な転写物レベルを、内因性構成的転写物ｒｐｌ３９に対して定量化した。用いた遺伝子特異的プライマー及びＴａｑＭａｎプローブが、上記の表２に列挙されている。
【０１３６】
ＣｃＩｎｖ遺伝子発現に関する最初の全体的な所見は、これらの遺伝子は、特に、子実では、すべての成熟段階で、両遺伝子型についてあまり発現されないということがわかったということである（図８）。ＣｃＩｎｖ１転写物（細胞壁型インベルターゼ）は、いずれの遺伝子型の子実でも検出されなかった。興味深いことに、ＣｃＩｎｖ１の転写物は、Ｔ２３０８果皮では検出されなかったのに対し、同じ段階でＢＰ４０９の果皮では相当なレベルが検出され得た。反対に、ＢＰ４０９の根及び葉組織では、相対的にかなりのレベルのＣｃＩｎｖ１が検出されたが、Ｔ２３０８から得た同一組織では検出されなかった。このインベルターゼ発現は、これらの相違は、ＢＰ４０９及びＴ２３０８遺伝子をコードするこれらの転写物における対立遺伝子の相違によるものではなく、おそらく、各遺伝子型におけるこれらの遺伝子の転写物レベルの相違によるものであるということを強力に示唆する。Ｔ２３０８の花において、ＢＰ４０９における発現と比較して、極めて高レベルのＣｃＩｎｖ２発現が検出された（図８、パネルＡ：およそ１０倍の相違、Ｔ２３０８（４．８ＲＱ）対ＢＰ４０９（０．３８ＲＱ））。
【０１３７】
これまでは、本明細書において用いられるＴ２３０８及びＢＰ４０９の全花サンプル中のいくつかのその他の遺伝子（例えば、ＣｃＨＱＴ、ＣｃＰＡＬ１及びＣｃＰＡＬ３、未公開データ）の発現に有意差があることが留意され、これがこれらの全花サンプルは正確に同じ発達段階ではない可能性があるという考えをもたらしてきた。ＣｃＩｎｖ２の発現データをより詳細に調べたところ（図８、パネルＢ）、ＣｃＩｎｖ２は、ロブスタの小さい緑色の子実とは別に、アラビカ又はロブスタの子実において極めて低レベルで発現されるということがわかった。しかし、子実におけるＣｃＩｎｖ２の弱い発現については、成熟へ向けた増大への極めて小さい傾向であるようであるということは留意される。アラビカ及びロブスタ果皮組織において、ＣｃＩｎｖ２の相対的にかなりの発現が検出されたが、この発現のパターンは異なっていた。
【０１３８】
試験したすべてのアラビカ果皮段階において、相対的に類似の発現があったのに対し、ロブスタでは、ＣｃＩｎｖ２の発現は、小さな緑色果皮では極めて低く、次いで、徐々に増大し、最高発現は成熟果皮組織において検出された。低ＣｃＩｎｖ２発現はまた、ＢＰ４０９の根及び葉において検出されたが、Ｔ２３０８では検出されなかった。
【０１３９】
中性（細胞質型）インベルターゼをコードすると考えられているＣｃＩｎｖ３の最高発現は、アラビカ及びロブスタの花において見られた。かなり低いレベルのＣｃＩｎｖ３発現がその他の組織で検出された。子実では、すべての段階において、ＣｃＩｎｖ３転写物のレベルは、アラビカにおいてロブスタよりもわずかに高いようであったが、果皮では、反対であるようであり、大きな緑色から赤い段階ではロブスタにおける発現が、アラビカにおいてよりもわずかに高い。
【０１４０】
転写レベルでのインベルターゼの制御は重要であるが、大幅な制御はまた、インベルターゼタンパク質と、インベルターゼ阻害剤と呼ばれる小分子量タンパク質（＜２０ｋＤａ）の群との相互作用によって転写後レベルでも行うことができる（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８年；Ｇｒｅｉｎｅｒら、２０００年；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年；Ｂａｔｅら、２００４年）。上記のように、インベルターゼ阻害剤をコードすると考えられる４種の全長ｃＤＮＡを、ＥＳＴライブラリーから単離した。これらの遺伝子の発現分析の結果は、図９に示されている。
【０１４１】
ＣｃＩｎｖ１は、アラビカでは、もっぱら、小さな緑色段階の子実において発現され、大きな緑色の段階ではかなり少ない程度に発現されるのに対し、この遺伝子は、ロブスタでは、主に大きな緑色の子実において発現されることがわかった（図９）。極めて低いレベルのＣｃＩｎｖＩ１発現が、アラビカ及びロブスタ黄色子実の両方において検出されたが、成熟子実（赤）においては検出されなかった。
【０１４２】
ＣｃＩｎｖＩ２の発現についてはあまり特異性は見られなかった（図９）。この遺伝子は、アラビカ及びロブスタ両方の全花において相対的に高レベルで発現される。アラビカ及びロブスタ果皮では、小さな緑色段階の間、ＣｃＩｎｖＩ２発現を比較的低レベルで検出できたが、果実成熟につれて両種において大幅に増大することは明らかである。ＣｃＩｎｖＩ２は、すべての段階の子実において、並びに根及び葉において極めて低レベルで発現されるようである。
【０１４３】
ＣｃＩｎｖＩ１同様、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４の発現は高レベルの組織特異性を示した。ＣｃＩｎｖＩ３はもっぱら、アラビカの小さな緑色の子実において、またロブスタの黄色の子実において発現されるようである。ＣｃＩｎｖＩ４発現は、ほぼ例外なく、アラビカ子実の小さな緑色組織において検出されたのに対し、ロブスタでは、大きな緑色の子実において、及びより低い程度で葉において発現された。
【０１４４】
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Ｙａｕ Ｙ−Ｙ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ Ｐ．Ｗ． ２００３． Ａ ２．５ ｋｂ ｉｎｓｅｒｔ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ （Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．） ｒｏｏｔｓ， ｃａｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ５３： １５１−１６２．
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Ｚｒｅｎｎｅｒ， Ｒ．， Ｓａｌａｎｏｕｂａｔ， Ｍ．， Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｌ．， ａｎｄ Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ， Ｕ． １９９５． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｎｋ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ７：９７−１０７．
【０１４５】
本発明は、上記で記載され、例示される実施形態に制限されないが、添付の特許請求の範囲内で改変及び修正が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】トマト果実におけるスクロース代謝のモデル。Ｓ（スクロース）は、シンプラスト経路によって師部から移入されるか、又は細胞壁型インベルターゼによって加水分解される。グルコース及びフルクトースは、特異的糖輸送体タンパク質によってサイトゾル中に移入される。スクロースは、サイトゾルでＳＳ（スクロースシンターゼ）によって分解され、その再合成は、ＳＰ（スクロースホスファターゼ）又はＳＳと関連して、ＳＰＳ（スクロースホスフェートシンターゼ）によって触媒される。スクロースは、液胞中に運び出され、液胞型インベルターゼによって加水分解される。修飾後、ＵＤＰ−グルコースは、有色体においてデンプン合成に用いられ得る。略語：Ｇ、グルコース；Ｆ、フルクトース；Ｆ６−Ｐ、フルクトース６−リン酸；ＵＤＰ−Ｇ、ＵＤＰ−グルコース；Ｇ６−Ｐ、グルコース６−リン酸；Ｓ６−Ｐ、スクロース６−リン酸；Ｉ、インベルターゼ；ＳＰ、スクロースホスファターゼ、ＳＰＰスクロースホスフェートシンターゼ。
【図２】液胞型酸性インベルターゼタンパク質との、ＣｃＩｎｖ２のタンパク質配列アラインメント。タンパク質配列は、ＣｃＩｎｖ２（コフィア・カネフォラ インベルターゼ２、配列番号１０）を用いたＢＬＡＳＴｐ相同性検索に基づいて選択した。トマトＴＩＶ１（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））由来の酸性インベルターゼ（配列番号１７）のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＰ２９０００であり、ニンジン（ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ））由来の酸性インベルターゼ（配列番号１８）についてはＣＡＡ４７６３６．１であり、ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））由来の酸性インベルターゼ（配列番号１９）についてはＡＡＱ１７０７４であり、コフィア・アラビカ由来のｉｎｖ２（配列番号２０）についてはＣＡＥ０１３１８である。ＣｃＩｎｖ２配列のものとは異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。アミノ酸配列ＮＤＰＮＧは、植物酸性インベルターゼ（βＦ−モチーフ）の顕著な特徴である。配列ＷＥＣＶＤＦは、液胞型インベルターゼに特異的である。
【図３】液胞型酸性インベルターゼタンパク質との、ＣａＩｎｖ３のタンパク質配列アラインメント。タンパク質配列は、ＣａＩｎｖ３（コフィア・アラビカ インベルターゼ３、配列番号１１）を用いたＢＬＡＳＴｐ相同性検索に基づいて選択した。ＡＴ ＮＩｎｖ（シロイヌナズナ由来の中性細胞質型インベルターゼ）（配列番号２１）のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＮＰ＿５６７３４７であり、ＬＪＮＩｎｖ１（ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の中性細胞質型インベルターゼ）（配列番号２２）についてはＣＡＧ３０５７７である。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。ＣａＩｎｖ３配列のものと異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。
【図４】ＴＩＶ１及びＬＩＮ６酸性インベルターゼタンパク質との、ＣｃＩｎｖ４の部分タンパク質配列アラインメント。ＣｃＩｎｖ４（配列番号１２）、ＴＩＶ１（液胞型インベルターゼ）（配列番号１７）及びＬＩＮ６（細胞壁結合型インベルターゼ）（配列番号２３）間の部分タンパク質アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。ＴＩＶ１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｐ２９０００であり、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））由来のＬＩＮ６についてはＡＡＭ２８８２３である。ＣｃＩｎｖ４配列のものとは異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。
【図５】細胞壁結合型インベルターゼタンパク質との、ＣｃＩｎｖ１のタンパク質配列アラインメント。タンパク質配列は、ＣｃＩｎｖ１（コフィア・カネフォラ インベルターゼ１、配列番号９）を用いたＢＬＡＳＴｐ相同性検索に基づいて選択した。ＬＩＮ５（配列番号２４）のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＣＡＢ８５８９７であり、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（配列番号２３）由来のＬＩＮ６についてはＡＡＭ２８８２３であり、ニンジン（ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ））由来のＤＣＣＷＩｎｖインベルターゼ（配列番号２５）についてはＣＡＡ４９１６２．１であり、コフィア・アラビカ由来のｉｎｖ１（配列番号２６）についてはＣＡＥ０１３１７である。ＣｃＩｎｖ１配列のものとは異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。アミノ酸配列ＮＤＰＮＧ（配列番号２７）は、植物酸性インベルターゼ（βＦ−モチーフ）の顕著な特徴である。配列ＷＥＣＰＤＦ（配列番号２８）はペリプラズム又は細胞壁結合型インベルターゼに特異的である。
【図６】インベルターゼ阻害剤タンパク質との、ＣｃＩｎｖＩのタンパク質配列アラインメント。トウモロコシ（ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））由来のＺＭ−ＩｎｖＩ（ＣＡＣ６９３３５．１）（配列番号２９）及びタバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））由来のＮｔ ＩｎｖＩ（ＡＡＴ０１６４０）（配列番号３０）との、ＣｃＩｎｖＩ１、２、３及び４タンパク質（それぞれ、配列番号１３、１４、１５及び１６）のアラインメントを示す図である。コンセンサス配列と同一のアミノ酸は、灰色で色付けしてある。４個の保存されたＣｙｓ残基が注目される。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。
【図７Ａ】ＣＣＣＡ１２（コフィア・アラビカ）及びＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４（Ｃ．カネフォラ）の間の、全子実（果皮及び房から分離した）中の酸性及び中性インベルターゼ活性の変化。この研究には、大きさ及び色によって特徴付けられる４つの異なる成熟段階でのコーヒー果実、すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）を用いた。酵素活性は、μモル．ｈ−１．ｍｇ−１タンパク質で表されている。
【図７Ｂ】ＣＣＣＡ１２（コフィア・アラビカ）及びＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４（Ｃ．カネフォラ）の間の、全子実（果皮及び房から分離した）中の酸性及び中性インベルターゼ活性の変化。この研究には、大きさ及び色によって特徴付けられる４つの異なる成熟段階でのコーヒー果実、すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）を用いた。酵素活性は、μモル．ｈ−１．ｍｇ−１タンパク質で表されている。
【図８Ａ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型）（Ａ及びＢ）並びにＣｃＩｎｖ３（細胞質型）インベルターゼの組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。示されるデータは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図８Ｂ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型）（Ａ及びＢ）並びにＣｃＩｎｖ３（細胞質型）インベルターゼの組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。示されるデータは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図８Ｃ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型）（Ａ及びＢ）並びにＣｃＩｎｖ３（細胞質型）インベルターゼの組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。示されるデータは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ａ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ｂ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ｃ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ｄ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、農業バイオ技術の分野に関する。より詳しくは、本発明は、植物、特に、コーヒーにおいてスクロース代謝に関与している酵素並びにこれらの酵素をコードする遺伝子及び核酸配列、並びにこれらの酵素によるスクロース代謝を調節する調節機構に関する。
【０００２】
（発明の背景）
本明細書を通じて引用される、特許、公開された出願及び学術論文をはじめとする種々の刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。本明細書内に十分に示されていない引用は、本明細書の最後に見ることができる。
【０００３】
スクロースは、コーヒーの子実又は豆によって送達される最終的な香り及び風味において重要な役割を果たしている。スクロースは、コーヒー中の総遊離還元糖の主要な寄与因子であり、還元糖は、コーヒーにおける重要な風味前駆体である。還元糖は、コーヒーの子実を焙煎する間に、メイラード型反応でアミノ基含有分子と反応し、これにより、通常、コーヒーの風味と関連しているカラメルの香り、甘い香り及び焦げた種類の香り並びに暗い色を含む相当な数の生成物が生じる（Ｒｕｓｓｗｕｒｍ、１９６９年；Ｈｏｌｓｃｈｅｒ及びＳｔｅｉｎｈａｒｔ、１９９５年；Ｂａｄｏｕｄ、２０００年）。最高品質のアラビカの子実（コフィア・アラビカ（ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ））（７．３％から１１．４％の間）は、最低品質のロブスタの子実（コフィア・カネフォラ（ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ））（４から５％の間）よりもかなり高レベルのスクロースを有することがわかった（Ｒｕｓｓｗｕｒｍ、１９６９年；Ｉｌｌｙ及びＶｉａｎｉ、１９９５年； Ｃｈａｈａｎら、２００２年；Ｂａｄｏｕｄ、２０００年）。スクロースは、焙煎の間に著しく分解されるにもかかわらず、焙煎された子実の中に、０．４〜２．８％乾燥重量（ＤＷ）という濃度でまだ残っており、このため、コーヒーの甘味に直接的に寄与している。子実中のスクロースのレベルとコーヒーの風味の間には明確な相関関係が存在する。したがって、スクロース代謝に預かる主要な酵素を同定し、単離すること及びスクロース代謝のばらつきの根底にある遺伝的機序によって、コーヒーの品質の改良の技術分野における進歩が可能となる。
【０００４】
現在、コーヒーにおけるスクロース代謝に関与している遺伝子又は酵素に関して公開された報告はない。しかし、スクロース代謝は、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（コーヒーの近縁種、両方ともキク類（ａｓｔｅｒｉｄ）Ｉのクラスのメンバーである）において、特にトマトの果実形成の間、研究されている。トマトにおけるスクロース代謝に直接関与している酵素の概説が図１に示されている（Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃら、２００１年）。この経路における重要な反応として、（１）スクロースシンターゼ（ＳｕＳｙ）及び細胞質型インベルターゼ（Ｉ）によるサイトゾルにおけるスクロースの連続迅速分解、（２）ＳｕＳｙ又はスクロース−ホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）によるスクロース合成、（３）酸性インベルターゼ（液胞型又は細胞壁結合型）による、液胞における、又はアポプラスト（原形質膜の外側の領域、細胞壁、木部導管などを含む）におけるスクロース加水分解、並びに（４）アミロプラストにおけるデンプンの迅速な合成及び分解がある。
【０００５】
その他のシンク器官においてと同様に、スクロース負荷軽減のパターンはトマトの果実形成の間一定ではない。果実形成の初期段階では、スクロースは、シンプラスト経路（細胞間の直接的な連絡）によって師部からそのまま負荷軽減され、負荷軽減の間はその複合ヘキソースに分解されない。この段階でＳｕＳｙの発現及び酵素活性の両方が最大であり、師部からのスクロース負荷軽減能と直接の相関がある（シンク強度とも呼ばれる現象；Ｓｕｎら、１９９２年；Ｚｒｅｎｎｅｒら、１９９５年）。果実形成の後期に、シンプラスト連絡が失われる。負荷軽減のこれらの条件下では、スクロースは、細胞壁結合型インベルターゼによって果実細胞の外側で迅速に加水分解され、次いで、グルコース及びフルクトース生成物がヘキソーストランスポーターによって細胞内に運び入れられる。その後、細胞質においてＳｕＳｙ又はＳＰＳによってｄｅ ｎｏｖｏでスクロースが合成される（図１）。ＳＰＳは、酵素スクロースホスフェートホスファターゼとのその密接な関係によって、ｉｎ ｖｉｖｏで本質的に不可逆な反応を触媒する（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら、１９９７年）。シンプラスト連絡の喪失と平行して、果実において、ＳｕＳｙ活性が低下し、熟成の開始時に最終的に検出不能となる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら１９９８年；Ｗａｎｇら、１９９３年）。したがって、トマトの果実形成の後期では、ＳＰＳ酵素は、ＳＰと関連して、スクロース合成のための主要な酵素と思われる。
【０００６】
植物インベルターゼは、活性のための至適ｐＨに基づいて２つの群に分けられている。第１群のインベルターゼは、中性インベルターゼとして同定されており、７〜８．５の範囲に至適ｐＨを有することを特徴とする。中性インベルターゼは、植物細胞のサイトゾルに局在することがわかっている。第２群のインベルターゼは、酸性インベルターゼとして同定されており、ｐＨ４．５と５．５の間に活性のための至適ｐＨを有することを特徴とする。酸性インベルターゼは、可溶性型及び不溶性型の両方で存在することがわかっている（Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）。不溶性酸性インベルターゼは、不可逆的に、細胞壁と共有結合しているのに対し、可溶性酸性インベルターゼは、液胞及びアポプラストの両方に局在している。
【０００７】
過去１０年にわたる研究により、液胞型及び細胞壁結合型インベルターゼは、種々の種の果実形成の間のスクロース代謝の調節において重要な酵素であるということがわかった。トマトの赤い果実の種、例えば、市販の種、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）及び野生種Ｌ．ピンピネリフォリウム（Ｌ． ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）は、例えば、高レベルのスクロースを貯蔵しないが、代わりに、ヘキソースをグルコース及びフルクトースの形で蓄積する。赤い果実の種と、スクロース蓄積性の緑の果実の種との交雑から得た証拠により、赤い果実のトマト種における最終スクロース蓄積の阻止における酸性インベルターゼの重大な役割がわかった（Ｙｅｌｌｅら、１９９１年）。遺伝子分析研究により、Ｌ．ピンピネリフォリウムの果実中の高レベルの可溶性固体を付与する遺伝子座が、液胞型インベルターゼＴＩＶ１の既知の位置に位置づけられた（Ｔａｎｋｓｌｅｙら、１９９６年；Ｇｒａｎｄｉｌｌｏ及びＴａｎｋｓｌｅｙ、１９９６年）。トランスジェニックトマトにおけるアンチセンスＴＩＶ１ ｃＤＮＡ構築物の発現の分析からも、同様の結論に到達した（Ｋｌａｎｎら、１９９３年；Ｋｌａｎｎら、１９９６年）。したがって、液胞型のインベルターゼは、成熟果実におけるヘキソースレベルの調節と液胞に貯蔵されるスクロースの流動の調節の両方において主要な役割を果たすと考えられる（Ｋｌａｎｎら、１９９３年；Ｙａｕ及びＳｉｍｏｎ、２００３年）。細胞壁結合型アイソフォームは、師部負荷軽減及びスクロース分配に関与していると考えられている（Ｓｃｈｏｌｅｓら、１９９６年）。
【０００８】
細胞壁結合型インベルターゼの重要性は、細胞壁型インベルターゼを構成的に過剰発現するトランスジェニックトマト（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、１９９１年）及びタバコ（ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎら、１９９０年）植物を用いる研究によって実証されている。このような植物におけるインベルターゼ活性レベルの上昇は、シンク及びソース組織間のスクロース輸送レベルの低下を引き起こし、これは発育不全及び植物形態の全体的な変更をもたらした。細胞外インベルターゼ活性の低下はまた、種々の種における植物及び種子の発達に著しい効果を有することがわかっている。アンチセンス細胞壁型インベルターゼ構築物の構成的発現のために細胞壁型インベルターゼのレベルが低いトランスジェニックニンジンの分析によって（Ｔａｎｇら、１９９９年）、初期植物発達に対する、及び初期伸長相の間の主根形成に対して著しい結果が示された。
【０００９】
ｍｉｎｉａｔｕｒｅ−１（ｍｎ１）（Ｌｏｗｅ及びＮｅｌｓｏｎ、１９４６年）、異常な小花柄及び胚乳の大きさの著しい減少を特徴とするトウモロコシの種子突然変異体の研究により、Ｍｎ１種子遺伝子座は細胞壁型インベルターゼ、ＣＷＩ−２をコードすることがわかった（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣｈｏｕｒｅｙ、１９９２年；Ｃｈｅｎｇら、１９９６年）。興味深いことに、ｍｎ１突然変異体では、全体的な酸性インベルターゼ（液胞型及び細胞壁結合型）活性が著しく低下し、これは、液胞型及び細胞壁型酵素活性両方の協調制御を示唆する。
【００１０】
高品質コーヒーの風味にとってのスクロースの重要性のために、スクロース豆の代謝及びその代謝に関与している遺伝子の相互作用を調べる必要性が存在する。また、コーヒー中のこれらの酵素をコードする遺伝子を同定及び単離する必要性もあり、それによってコーヒーの風味及び香りを操作するためにコーヒー豆中のスクロース産生を改変するための遺伝子ツール及び生化学的ツールを提供する。
【００１１】
（発明の概要）
本発明の一態様は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするコード配列を含む、コーヒー（コフィア種）から単離された核酸分子を特徴とする。一実施形態では、コード配列はインベルターゼをコードし、これは細胞壁型インベルターゼであっても、液胞型インベルターゼであっても、中性インベルターゼであってもよい。特定の実施形態では、細胞壁型インベルターゼは、アミノ酸配列ＷＥＣＰＤＦを有する保存されたドメインを含む。種々の実施形態では、インベルターゼは、配列番号９又は配列番号１３と５５％を超えて同一のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号９又は配列番号１３を含む。例示的な実施形態では、核酸分子は、配列番号１又は配列番号４を含む。
【００１２】
別の実施形態では、インベルターゼは液胞型インベルターゼであり、アミノ酸配列ＷＥＣＶＤＦを有する保存されたドメインを含む。液胞型インベルターゼは、配列番号１０と７０％以上同一のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１０を含むことが好ましい。例示的一実施形態では、液胞型インベルターゼをコードする核酸分子は、配列番号２を含む。
【００１３】
別の実施形態では、インベルターゼは中性インベルターゼであり、配列番号１１と８４％以上同一のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１１を含むことが好ましい。例示的一実施形態では、中性インベルターゼをコードする核酸分子は、配列番号３を含む。
【００１４】
その他の実施形態では、コード配列はインベルターゼ阻害剤をコードする。特定の実施形態では、インベルターゼ阻害剤は、そのアミノ酸配列中に４個の保存されたシステイン残基を含む。インベルターゼ阻害剤は、配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つと２５％以上同一であるアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１３、１４、１５又は１６のいずれか１種を含むことが好ましい。例示的実施形態では、インベルターゼ阻害剤をコードする核酸分子は、配列番号５、６、７又は８のうちいずれか１つを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、上記のコード配列は、遺伝子のオープンリーディングフレームである。その他の実施形態では、その遺伝子の転写によって生じたｍＲＮＡ分子、又は特許請求されるｍＲＮＡ分子の逆転写によって生じたｃＤＮＡ分子である。別の実施形態は、前記の核酸分子のセグメントと相補的である、８〜１００の間の塩基長のオリゴヌクレオチドを対象とする。
【００１６】
本発明の別の態様は、上記の核酸分子をコードするインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤のコード配列を含むベクターを特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである。種々の実施形態は、核酸分子のコード配列が、構成的プロモーターと、又は誘導性プロモーターと、又は組織特異的プロモーターと作動可能に連結されているベクターを含み、後者の実施形態では、種子特異的プロモーターが好ましい。
【００１７】
本発明の別の態様では、上記のベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞も提供する。宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞であり得る。本発明の形質転換された植物細胞から生じた稔性（ｆｅｒｔｉｌｅ）も提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、コーヒー種子内の１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を調節することを含む、コーヒー豆の風味又は香りを調節する方法を特徴とする。特定の実施形態では、本方法は、１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させることを含む。特定の実施形態では、これは、コーヒー種子内の１種又は複数の内因性インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤遺伝子の発現を増大させることによって達成される。その他の実施形態は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする導入遺伝子を植物に導入することを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本方法は１種又は複数のインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させることを含む。この実施形態では、植物中の内因性インベルターゼ活性を、インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物と比較して低減させることができる。さらに、植物は、その種子に、インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含み得る。
【００２０】
その他の実施形態では、本方法は、１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を低減させることを含む。これは、１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒーに導入することによって達成できる。特定の実施形態では、インベルターゼの発現又は活性が低減される。この実施形態では、植物は、その種子に、インベルターゼの産生又は活性が低減されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含み得る。
【００２１】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の図、詳細な説明及び実施例を参照することによって理解される。
【００２２】
（例示的実施形態の詳細な説明）
定義：
本発明の生体分子及びその他の態様に関する種々の用語が、本明細書及び特許請求の範囲を通じて用いられている。これらの用語は、本明細書において特に断りのない限り、分子生物学及び生化学の分野におけるそれらの通常の意味を有すると見なされる。
【００２３】
用語「スクロース代謝酵素」とは、主にスクロースを植物体内に蓄積するよう、又はスクロースを分解するよう機能する植物中の酵素を指し、これとしては、例えば、スクロースシンターゼ（ＳｕＳｙ）、スクロースホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）及びスクロースホスファターゼ（ＳＰ）並びに種々の種類のインベルターゼ（Ｉｎｖ）及びインベルターゼ阻害剤（Ｉｎｖ Ｉ）が挙げられる。種々のスクロース代謝酵素が一緒になって、貯蔵又はエネルギー需要のいずれかのための植物による必要に応じてスクロースの代謝を制御するよう働く。
【００２４】
「単離された」とは、天然の状態から「人の手によって」変えられたことを意味する。組成物又は物質が天然に生じる場合には、その最初の環境から変更されるか、又は取り出されている、或いはその両方である場合に「単離されている」。例えば、生存している植物又は動物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチエ（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｅ）は「単離されて」いないが、その天然状態の共存する物質から分離されている同一ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書においてこの用語が用いられるように「単離されている」。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」はまた「核酸分子」とも呼ばれ、通常、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、制限するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、より通常は、二本鎖であってもよく、又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドとはまた、１個又は複数の修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ及び安定性のため、若しくはその他の理由のために主鎖が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡを含む。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの異常な塩基が挙げられる。ＤＮＡ及びＲＮＡには、さまざまな修飾を行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、通常天然に見られるポリヌクレオチドの化学的に、酵素的に、又は代謝的に修飾された形、並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、これはオリゴヌクレオチドと呼ばれることも多い。
【００２６】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに結合している、２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーとよく呼ばれる短い鎖と、一般に、タンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸も含み得る。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによってか、又は当技術分野で周知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教本に、より詳細な研究論文に、並びに多量の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端をはじめ、ポリペプチド中のどこでも起こり得る。当然のことながら、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に、同種の修飾が、同程度に又はさまざまな程度に存在し得る。所与のポリペプチドはまた、多数の種類の修飾を含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐している場合もあり、分岐を含むか含まない、環状である場合もある。環状、分岐及び分岐環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスの結果である場合もあるし、合成法によって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、例えば、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が挙げられる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ −Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ． Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ． Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年及びＰｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年中、Ｗｏｌｄ， Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０年）１８２：６２６〜６４６頁及びＲａｔｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２年）６６３：４８〜６２頁参照のこと。
【００２７】
本明細書において「変異体」とは、それぞれ、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、本質的特性は保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの通常の変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するものである場合もそうでない場合もある。ヌクレオチドの変化は、以下に論じるように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び末端切断をもたらし得る。ポリペプチドの通常の変異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、相違は、参照ポリペプチドの配列と変異体の配列が全体的に極めて類似しており、多くの領域では、同一であるよう限定される。変異体及び参照ポリペプチドは、任意の組合せの、１つ又は複数の置換、付加又は欠失によってアミノ酸配列で異なり得る。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものである場合もそうではない場合もある。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は天然に存在する、例えば、対立遺伝子変異体である場合もあり、又は天然に存在することがわかっていない変異体である場合もある。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術によって、又は直接合成によって作製できる。
【００２８】
突然変異植物に関連して、用語「ヌル突然変異体」又は「機能喪失型突然変異体」とは、遺伝子産物を機能しないように又は大部分存在しないようにさせる突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を示すよう用いられる。このような突然変異は、遺伝子のコード領域及び／又は調節領域において起こり得、個々の残基の変化である場合も、核酸の領域の挿入又は欠失である場合もある。これらの突然変異はまた、遺伝子及び／又はコードされるタンパク質を、そのタンパク質を機能しないように又は大部分存在しないようにさせるよう調節又は制御し得るその他の遺伝子のコード領域及び／又は調節領域において起こり得る。
【００２９】
用語「実質的に同一」とは、タンパク質の性質（すなわち、タンパク質の構造、安定性特性、基質特異性及び／又は生物活性）に大きくは影響を及ぼさない配列変化を有する核酸又はアミノ酸配列を指す。核酸配列に特に関連して、用語「実質的に同一」とは、コード領域及び発現を支配する保存された配列を指すものとし、主として、コードされるポリペプチドにおいて同一アミノ酸をコードする縮重コドン又は保存的代替アミノ酸をコードする代替コドンを指す。アミノ酸配列に関連して、用語「実質的に同一」とは、通常、構造又は機能の決定に関与していないポリペプチドの領域中の保存的置換及び／又は変化を指す。
【００３０】
また、本明細書において用語「同一性パーセント」及び「類似性パーセント」とは、アミノ酸及び核酸配列間の比較において用いられる。アミノ酸配列を参照する場合に、「同一性」又は「同一性パーセント」とは、配列分析プログラムによって比較されるアミノ酸配列中の同一アミノ酸にマッチされた対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。「類似性パーセント」とは、同一又は保存されたアミノ酸とマッチされた対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存されたアミノ酸とは、構造は異なっているが、物理的特性は類似しており、その結果、互いの交換が、得られるタンパク質の三次構造を大きくは変えないものである。保存的置換は、Ｔａｙｌｏｒ（１９８６年、Ｊ． Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９：２０５）において定義されている。核酸分子に関連して、「同一性パーセント」とは、配列分析プログラムによって同一ヌクレオチドとマッチされた対象核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。
【００３１】
「同一性」及び「類似性」は、既知の方法によって容易に算出できる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の類似配列をアラインし、そのようにして相違を規定するコンピュータプログラムを用いて比較できる。好ましい方法論では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びそれに用いられるパラメータが用いられ、ゲノムＤＮＡ配列の配列断片をアラインするためには、ＤＮＡｓｔａｒシステム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が用いられる。しかし、標準的なアラインメントソフトウェアのいずれを用いても同等のアラインメント及び類似性／同一性評価を得ることができる。例えば、ウィスコンシン州、マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能である、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．１及びそのプログラムによって用いられるデフォルトパラメータ（ギャップ作製ペナルティ＝ｌ２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）を用いて、配列同一性及び類似性を比較することができる。
【００３２】
本明細書において「抗体」としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）が挙げられ、Ｆａｂ又はその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物も含む。抗体に関連して、用語「免疫学的に特異的」又は「特異的」とは、注目するタンパク質の１種又は複数のエピトープと結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含むサンプル中のその他の分子を実質的に認識し、結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を調べるスクリーニングアッセイは、当技術分野では周知であり、日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８年）、第６章参照のこと。
【００３３】
用語「実質的に純粋」とは、少なくとも５０〜６０重量％の注目する化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。調製物が注目する化合物を少なくとも７５重量％を含むことがより好ましく、９０〜９９重量％が最も好ましい。純度は、注目する化合物にとって適当な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００３４】
一本鎖核酸分子に関連して、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、当技術分野で通常用いられる所定の条件下でのこのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子間の結合を指す（「実質的に相補的」と呼ばれることもある）。特に、この用語は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指し、非相補的配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な排除を指す。
【００３５】
「コード配列」又は「コード領域」とは、配列が発現される場合に、遺伝子産物を産生するために必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内の非翻訳配列（例えば、イントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域）を含む場合もあり、又はこのような介在非翻訳配列を欠く場合もある（例えば、ｃＤＮＡにおけるように）。
【００３６】
「イントロン」とは、タンパク質合成と関連している情報をコードしない核酸中のポリヌクレオチド配列を指す。このような配列はｍＲＮＡに転写されるが、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の前に除去される。
【００３７】
用語「作動可能に連結している」又は「作動可能に挿入された」とは、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を可能にするようコード配列と関連する適当な位置で核酸分子中に位置していることを意味する。例として、プロモーターは、プロモーターがそのコード配列の転写又は発現を制御できる場合に、コード配列を作動可能に連結している。コード配列は、プロモーター又は調節配列と、センス又はアンチセンス方向で作動可能に連結し得る。用語「作動可能に連結している」とは、発現ベクター中のその他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に適用される場合もある。
【００３８】
転写及び翻訳制御配列とは、ＤＮＡ調節配列であり、例えば、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどがある。
【００３９】
用語「プロモーター」、「プロモーター領域」又は「プロモーター配列」とは、通常、コード領域の５’又は３’側に、又はコード領域内に、又はイントロン内に見ることができる遺伝子の転写調節領域を指す。通常、プロモーターは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することを可能にするＤＮＡ調節領域である。通常の５’プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合されており、上流（５’方向）に伸び、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルでの転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含んでいる。プロモーター配列内に、転写開始部位（好都合なことに、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングによって規定される）及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。
【００４０】
「ベクター」とは、別の核酸セグメントが、そのセグメントの複製又は発現を引き起こすよう作動可能に挿入され得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスである。
【００４１】
用語「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」とは、コード配列を、又は適当な調節配列と作動可能に連結しており、細胞を形質転換するためにベクターに挿入されている配列を指すよう用いられることもある。この用語は、用語「形質転換用ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」と同じ意味で使用できる。このような核酸構築物は、注目する遺伝子産物のコード配列を、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子とともに含み得る。
【００４２】
「マーカー遺伝子」又は「選択マーカー遺伝子」とは、コードされる遺伝子産物が、遺伝子を含む細胞が、遺伝子を含まない細胞の中から選択されることを可能にする特徴を付与する遺伝子である。遺伝子工学に用いられるベクターは、通常、１種又は複数の選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子の種類としては、（１）抗生物質耐性遺伝子、（２）除草剤耐容性又は耐性遺伝子及び（３）形質転換された細胞が、そうでなければ細胞が産生できない必須成分、通常、アミノ酸を合成するのを可能にする代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子が挙げられる。
【００４３】
「リポーター遺伝子」もまた、マーカー遺伝子の１種である。これは通常、標準的な実験室手段によってアッセイ可能な又は検出可能な遺伝子産物（例えば、酵素活性、蛍光）をコードする。
【００４４】
用語、遺伝子を「発現する」、「発現された」又は遺伝子の「発現」とは、遺伝子産物の生合成を指す。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写と、それに次ぐ、ｍＲＮＡの１種又は複数のポリペプチドへの翻訳を含み、すべての天然に存在する翻訳後修飾を包含する。
【００４５】
「内因性」とは、指定の生物内に天然に見ることができる任意の成分、例えば、遺伝子若しくは核酸又はポリペプチドを指す。
【００４６】
核酸構築物の「異種」領域とは、本来は大きな分子と関連して見られない、大きな分子内の核酸分子の同定可能なセグメント（又は複数のセグメント）である。したがって、異種領域が遺伝子を含む場合には、この遺伝子は通常、供給源生物のゲノム中でゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接される。もう１つの実施例では、異種領域は、コード配列自体が本来見られない（すなわち、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ又は天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。対立遺伝子変異又は天然に存在する突然変異事象は、本明細書に定義されるＤＮＡの異種領域を生じさせない。上記で定義される用語「ＤＮＡ構築物」とはまた、異種領域、特に、細胞の形質転換において使用するために構築されたものを指すよう用いられる。
【００４７】
細胞は、外因性又は異種ＤＮＡが細胞の内側に導入されている場合に、このようなＤＮＡによって「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれている（共有結合されている）場合もそうでない場合もある。例えば、原核生物、酵母及び哺乳類細胞では、形質転換用ＤＮＡは、エピソームエレメント、例えば、プラスミド上で維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換用ＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、染色体複製を介して嬢細胞によって遺伝されるようになったものである。この安定性は、真核細胞の、形質転換用ＤＮＡを含む嬢細胞の集団を含む細胞株又はクローンを確立する能力によって実証される。「クローン」とは、有糸分裂によって単一細胞又は共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」とは、多世代にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで安定増殖できる一次細胞のクローンである。
【００４８】
「子実」、「種子」又は「豆」とは、別のこのような植物に発達できる顕花植物の繁殖単位を指す。本明細書において、特に、コーヒーノキに関して、この用語は同意語として及び同じ意味で用いられる。
【００４９】
本明細書において、用語「植物」は、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、芽、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官及びその子孫への言及を含む。トランスジェニック植物の一部とは、本発明の範囲内では、例えば、トランスジェニック植物又はその子孫に由来する植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚及び花、茎、種子、花粉、果実、葉又は根を含むと理解される。
【００５０】
説明：
スクロースは、コーヒーの子実の焙煎中に起こるメイラード反応に関与する遊離還元糖の主な寄与因子である。したがって、緑色のコーヒーの子実中の重要な風味前駆体分子であると広く考えられている。この考えに一致して、最高品質のアラビカの子実は、最低品質のロブスタの子実（４〜５％の間）よりも、かなり高レベルのスクロースを有している（７．３〜１１．４％の間）。また、スクロースは、焙煎の間に著しく分解されるが、焙煎された子実中に０．４〜２．８％乾燥重量（ＤＷ）という濃度で残存することができ、その結果、コーヒーの甘味に直接関与する。子実中のスクロースのレベルとコーヒーの風味の間の明確な相関関係のために、コーヒーの子実におけるスクロース代謝及び炭素分配における変動について、根底にある遺伝的機序を理解し、操作する能力が重要である。
【００５１】
スクロース代謝に関与している重要な酵素は、モデル生物（例えば、トマト、ジャガイモ、シロイヌナズナ）において特性決定されている。実施例に詳細に記載されるように、本発明に従って、これらの酵素のタンパク質配列を用い、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いてコフィア・カネフォラ及びコフィア・アラビカｃＤＮＡライブラリー及びＥＳＴデータベースにおいて類似性検索を実施した。ＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型インベルターゼ）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型インベルターゼ）及びＣａＩｎｖ３（細胞質型インベルターぜ）をコードする全長ｃＤＮＡを単離した。部分ｃＤＮＡ配列（ＣｃＩｎｖ４）もまた、単離し、細胞壁結合型インベルターゼに相当すると考えられる。さらに、インベルターゼ阻害剤ＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４をコードする可能性のある４種の全長ｃＤＮＡ配列を同定し特性決定した。
【００５２】
本発明の一態様は、種々のインベルターゼ：細胞壁型インベルターゼＣｃＩｎｖ１（配列番号１）及びＣｃＩｎｖ４（配列番号４−部分配列）、液胞型インベルターゼＣｃＩｎｖ２（配列番号２）及び中性インベルターゼＣａＩｎｖ３（配列番号３）並びに４種の全長インベルターゼ阻害剤：ＣｃＩｎｖＩ１（配列番号５）、ＣｃＩｎｖＩ２（配列番号６）、ＣｃＩｎｖＩ３（配列番号７）及びＣｃＩｎｖＩ４（配列番号８）をコードするコーヒーに由来する核酸分子に関する。
【００５３】
本発明の別の態様は、これらの核酸分子の発現によって産生されるタンパク質及びその使用に関する。配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８の発現によって産生されるタンパク質の推定アミノ酸配列が、それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６として本明細書に示されている。本発明のさらにその他の態様は、植物育種における、また植物の遺伝子操作における、最終的には、コーヒーの風味、香り及びその他の品質の操作における核酸分子及びコードされるポリペプチドの使用に関する。
【００５４】
本明細書には、コフィア・カネフォラに由来するインベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチドが記載され例示されているが、本発明は、以下に記載される目的で、Ｃ．カネフォラ ポリヌクレオチド及びタンパク質と互換的に用いられるよう十分に類似しているその他のコフィア種に由来する核酸及びコードされるタンパク質を包含するものとする。したがって、本明細書において用語「インベルターゼ」及び「インベルターゼ阻害剤」を用いる場合には、特に断りのない限り、それらは、本明細書に記載される全体的な物理的特徴、生化学的特徴及び機能的特徴を有するすべてのコフィア種インベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤並びにそれらをコードするポリヌクレオチドを包含するものとする。
【００５５】
それらの配列の点から考えると、本発明のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤ポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８の対立遺伝子変異体及び天然突然変異体を含み、これらはＣ．カネフォラの種々の品種において見られる可能性があり、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６の相同体は種々のコフィア種において見られる可能性がある。このような変異体及び相同体は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列に特定の相違を有すると予測されるので、本発明は（１）配列番号９、１０、１１又は１２のうちいずれか１つのコードされるポリペプチドと、少なくとも７０％（より好ましくなる順に、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、７０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％）の同一性を有するそれぞれのポリペプチドをコードする、単離されたインベルターゼをコードする核酸分子、並びに（２）配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つのコードされるポリペプチドと少なくとも約２５％（より好ましくなる順に、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％ ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、７０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％）の同一性を有するそれぞれのポリペプチドをコードし、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１種に対して同等の範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたインベルターゼ阻害剤をコードする核酸分子を提供する。種々のコーヒー品種及び種において、インベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤並びにそれらをコードする遺伝子間に存在する可能性がある天然配列変異のために、当業者ならば、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの独特の特性を依然として維持しながら、このレベルの変異を見出すことは予想する。このような予想は、一部は、コードされるタンパク質の性質を大きくは変更しない、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列変異の既知の進化的成功による。したがって、このような変異体及び相同体は、互いに実質的同一と考えられ、本発明の範囲内に含まれる。
【００５６】
以下の節は、本発明の実施に関与する一般的な手順を示す。具体的な材料が記載される限り、単に例示目的であり、本発明を制限しようとするものではない。特に断りのない限り、一般的な生化学及び分子生物学の手順、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９年）又はＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （２００５年）に示されるものを用いる。
【００５７】
核酸分子、タンパク質及び抗体：
本発明の核酸分子は、２つの一般的な方法によって調製できる：（１）適当なヌクレオチド三リン酸から合成できるか、又は（２）生物学的供給源から単離することができる。両方法とも、当技術分野で周知のプロトコールを利用する。
ヌクレオチド配列情報、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８を有するｃＤＮＡを利用できることによって、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離された核酸分子の調製が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又は類似の装置において用いられるホスホルアミダイト法によって調製できる。得られた構築物は、当技術分野で公知の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に従って精製できる。長い、二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、本発明のＤＮＡ分子は、現在のオリゴヌクレオチド合成法に固有の大きさ制限のために段階で合成しなくてはならない。したがって、例えば、長い、二本鎖分子は、適当な相補性のいくつかの小さなセグメントとして合成すればよい。このように製造された相補的セグメントを、各セグメントが隣接するセグメントの連結のための適当な付着末端を有するようアニーリングすることができる。隣接するセグメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下でアニーリングする付着末端によって連結し、長い二本鎖分子の全体を構築することができる。次いで、そのように構築された合成ＤＮＡ分子をクローニングし、適当なベクター中で増幅させることができる。
【００５８】
本発明に従って、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤ポリヌクレオチドのコード領域及び／又は調節領域の一部又はすべてと、適当なレベルの配列相同性を有する核酸を、適当なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いることによって同定できる。当業者には当然のことながら、前述の戦略は、ゲノム配列に適用する場合には、スクロース代謝酵素をコードする配列の単離を可能にすることに加え、スクロース代謝酵素遺伝子と関連しているプロモーター及びその他の遺伝子調節配列の単離も、たとえ、調節配列自体が適したハイブリダイゼーションを可能にする十分な相同性を共有していない場合であっても可能にする。
【００５９】
代表的な例示として、ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法に従い、５×ＳＳＣ、５×デンハルトの試薬、１．０％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性、断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び最大５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて実施できる。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間実施する。ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下の通りに洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分、（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分、（３）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間、（４）溶液を３０分毎に変更しながら、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、４５〜５５℃で２時間。
【００６０】
指定の配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を算出するための１つの共通する式は以下の通りである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃二本鎖でのｂｐ
【００６１】
上記の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドとともに４２％というＧＣ含量及び２００塩基という平均プローブサイズを用いると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは、相同性が１％低下する毎に１〜１．５℃低下する。したがって、４２℃というハイブリダイゼーション温度を用いると、約７５％を超える配列同一性を有する標的が観察される。一実施形態では、上記のハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を用い、ハイブリダイゼーションは３７℃、最終洗浄は４２℃であり、別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃であり、最終洗浄は５０℃であり、さらに別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃、最終洗浄は６５℃である。高ストリンジェンシーの条件として、上記のハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１０分間の最終洗浄が挙げられる。
【００６２】
本発明の核酸は、任意の簡便なクローニングベクター中でＤＮＡとして維持できる。好ましい実施形態では、クローンは、プラスミドクローニング／発現ベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）又はｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で維持し、それらのすべては適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 宿主細胞中で増殖させることができる。
【００６３】
本発明の核酸分子としては、一本鎖であっても、二本鎖であっても、さらに三本鎖であってもよい、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片が挙げられる。したがって、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１種の配列とハイブリダイズできる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ増幅によって、植物組織の試験サンプル中のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子又はｍＲＮＡを検出するためのプローブとして、又はインベルターゼ若しくはインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳時若しくは翻訳前の発現の正若しくは負の調節のために有用である。インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド類を、このようなアッセイのためのプローブとして利用できる方法としては、それだけには限らないが、（１）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション及び（４）取り揃えられた増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。
【００６４】
本発明の核酸分子の少なくとも１種の配列とハイブリダイズできる配列を有するオリゴヌクレオチドとして、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの特定の領域を標的とし、用いることができる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用は、当技術分野では公知である。アンチセンス分子は、植物細胞を、転写時にアンチセンスＲＮＡ配列を生じるＤＮＡ構築物で形質転換することによってｉｎ ｓｉｔｕで提供できる。このような構築物は、全長又は部分アンチセンス配列を生じるよう設計できる。この遺伝子サイレンシング効果は、遺伝子をコードする配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両方を遺伝子組換えによって過剰に産生させ、その結果、多量のｄｓＲＮＡが産生されることによって増強できる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８年、ＰＮＡＳ ９５：１３９５９〜１３９６４頁参照のこと）。この関連で、少なくとも１つのイントロンの一部又はすべてに相当するｄｓＲＮＡを含有する配列が特に有効であるとわかっている。一実施形態では、スクロースインベルターゼをコードする配列アンチセンス鎖の一部又はすべてが、導入遺伝子によって発現される。別の実施形態では、インベルターゼをコードする配列の一部又はすべてのハイブリダイズするセンス及びアンチセンス鎖が、遺伝子組換えによって発現される。別の実施形態では、市販の材料及び方法を用い（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；ＥＩｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５（２）：１８８〜２００頁）の使用によって、インベルターゼ遺伝子をサイレンシングすることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インベルターゼｍＲＮＡ又はインベルターゼ発現を認識し、サイレンシングすることが好ましい。
【００６５】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、既知の方法に従って、種々の方法で調製できる。ポリペプチドは、ｉｎ ｓｉｔｕで産生される場合には、適当な供給源、例えば、種子、果皮又はその他の植物の部分から精製できる。
【００６６】
或いは、ポリペプチドをコードする核酸分子を利用できることによって、当技術分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現法を用いるタンパク質の製造が可能となる。例えば、ｃＤＮＡ又は遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためにｐＳＰ６４又はｐＳＰ６５のような適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターにクローニングし、続いて、適した無細胞翻訳系、例えば、コムギ胚芽又はウサギ網状赤血球において無細胞翻訳できる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販されている。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、多量のポリペプチドを、適した原核生物又は真核生物系における発現によって製造できる。例えば、ＤＮＡ分子、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８を有するｃＤＮＡの一部又はすべてを、細菌細胞（例えば、大腸菌）又は酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））における発現に適合しているプラスミドベクターに、又は昆虫細胞における発現のためにバキュロウイルスベクターに挿入することができる。このようなベクターは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を可能にするように位置している、宿主細胞におけるＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを含む。このような発現に必要な調節エレメントとして、プロモーター配列、転写開始配列及び、場合により、エンハンサー配列が挙げられる。
【００６８】
組換え原核生物又は真核生物系において遺伝子発現によって産生されるポリペプチドは、当技術分野で公知の方法に従って精製できる。好ましい実施形態では、組換えタンパク質が発現され、その後、宿主細胞から分泌され、その後、周囲の培地から精製される、市販の発現／分泌系を使用できる。代替アプローチは、親和性分離によって、例えば、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体を用いる免疫学的相互作用を介して組換えタンパク質を精製することを含む。
【００６９】
前述の方法によって調製された本発明のポリペプチドは、標準的な手順に従って分析できる。
【００７０】
コーヒーから精製されたか、又は組換えによって製造されたポリペプチドを用いて、公知の方法に従って、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、抗体フラグメント又は本明細書に定義される誘導体を作製することができる。完全組換えタンパク質に対する抗体を作製することに加え、タンパク質の分析又はサザン及びクローニング分析（下記参照のこと）が、クローニングされた遺伝子がマルチジーンファミリーに属することを示す場合には、タンパク質の非保存領域に相当する合成ペプチドに対して作製されたメンバー特異的抗体を作製できる。
【００７１】
本明細書に記載されるあらゆる目的のための、本発明の抗体を含むキットも、本発明の範囲内に含まれる。通常、このようなキットは、抗体が免疫特異的である対照抗原を含む。
【００７２】
ベクター、細胞、組織及び植物体：
本発明によれば、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、又はセンス又はアンチセンス方向のその変異体、又はレポーター遺伝子、及びスクロース代謝酵素プロモーター及びその他の調節配列の制御下にあるその他の構築物を含む、トランスジェニック宿主細胞を製造するためのベクター及びキットも特徴とする。適した宿主細胞としては、それだけには限らないが、植物細胞、細菌細胞、酵母及びその他の真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞が挙げられる。さまざまなこれらの宿主細胞を形質転換するためのベクターが当業者には周知である。それらとしては、それだけには限らないが、プラスミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びにその他の細菌、酵母及びウイルスベクターが挙げられる。通常、トランスジェニック宿主細胞を製造するためのキットは、１種又は複数の適当なベクターと、ベクターを用いてトランスジェニック細胞を製造するための使用説明書とを含む。キットは、１種又は複数のさらなる構成要素、例えば、２、３例を挙げると、細胞を培養するための培養培地、細胞の形質転換を実施するための試薬及び遺伝子発現についてトランスジェニック細胞を試験するための試薬をさらに含み得る。
【００７３】
本発明は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の１つ又は複数のコピー、又は植物の内因性インベルターゼの産生若しくは機能を阻害する核酸配列を含むトランスジェニック植物を含む。これは、以下に記載されるように、天然又は組換え調節配列のいずれかによって制御された、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤コード配列の一部又はすべて、又はその突然変異体、アンチセンス又はその変異体、例えばＲＮＡを含む導入遺伝子を用いて植物細胞を形質転換することによって達成される。トランスジェニック植物体コーヒー種としては、例えば、制限するものではないが、Ｃ．アベオクテ（Ｃ．ａｂｅｏｋｕｔａｅ）、Ｃ．アラビカ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）、Ｃ．アルノルディアナ（Ｃ．ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）、Ｃ．アルウェミエンシス（Ｃ．ａｒｕｗｅｍｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ベンガレンシス（Ｃ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、Ｃ．カネフォラ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、Ｃ．コンゲンシス（Ｃ． ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｃ．デウェブレイ（Ｃ．Ｄｅｗｅｖｒｅｉ）、Ｃ．エクセルサ（Ｃ．ｅｘｃｅｌｓａ）、Ｃ．ユージェニオイデス（Ｃ．ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）及びＣ．ヘテロカリックス（ｃ．ｈｅｔｅｒｏｃａｌｙｘ）、Ｃ．カパカタ（Ｃ．ｋａｐａｋａｔａ）、Ｃ．カシアナ（Ｃ．ｋｈａｓｉａｎａ）、Ｃ．リベリカ（Ｃ．ｌｉｂｅｒｉｃａ）、Ｃ．モロウンドウ（Ｃ．ｍｏｌｏｕｎｄｏｕ）、Ｃ．ラセモサ（Ｃ．ｒａｓｅｍｏｓａ）、Ｃ．サルバトリックス（Ｃ．ｓａｌｖａｔｒｉｘ）、Ｃ．セシフロラ（Ｃ．ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ）、Ｃ．ステノフィラ（Ｃ． ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、Ｃ．トラベンコレンシス（Ｃ．ｔｒａｖｅｎｃｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ウェイチアナ（Ｃ．ｗｉｇｈｔｉａｎａ）及びＣ．ザングエバリエ（Ｃ．ｚａｎｇｕｅｂａｒｉａｅ）が好ましい。任意の種の植物も本発明に含まれ、これとしては、それだけには限らないが、タバコ、シロイヌナズナ及びその他の「実験室で利用しやすい」種、禾穀類、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガム、アルファルファ、クローバなど、オイル産生植物、例えば、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、カカオなど、野菜作物、例えば、トマトトマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメなど、園芸植物、例えば、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ペチュニア、ヒャクニチソウ、シバフ及びシバクサなどが挙げられる。
【００７４】
トランスジェニック植物は、当業者に公知の標準的な植物形質転換法を用いて作製することができる。これらとしては、それだけには限らないが、アグロバクテリウムベクター、プロトプラストのポリエチレングリコール処理、遺伝子銃ＤＮＡ送達、ＵＶレーザーマイクロビーム、ジェミニウイルスベクター又はその他の植物ウイルスベクター、プロトプラストのリン酸カルシウム処理、単離プロトプラストのエレクトロポレーション、形質転換用ＤＮＡでコーティングしたマイクロビーズを含む溶液中での細胞懸濁液の撹拌、形質転換用ＤＮＡでコーティングしたシリコンファイバーを含む溶液中での細胞懸濁液の撹拌、直接ＤＮＡ取り込み、リポソーム媒介性ＤＮＡ取り込みなどが挙げられる。このような方法は、当技術分野では公開されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、１９８８年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ＆ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ編、１９８９年）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、Ｖｅｒｍａ編、１９９３年）及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｌｉｇａ、Ｋｌｅｓｓｉｇ、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｇｒｕｉｓｓｅｍ ＆ Ｖａｒｎｅｒ編、１９９４年）参照のこと。
【００７５】
形質転換法は、形質転換される植物に応じて変わる。双子葉植物種を形質転換するにはアグロバクテリウムベクターを用いることが多い。アグロバクテリウムバイナリーベクターとしては、それだけには限らないが、ＢＩＮ１９及びその誘導体、ｐＢＩベクターシリーズ及びバイナリーベクターｐＧＡ４８２、ｐＧＡ４９２、ｐＬＨ７０００（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ２３４３３０）及びｐＣＡＭＢＩＡベクターのうち任意の適したもの（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ、Ｓｖａｂ ＆ Ｍａｌｉｇａ、（１９９４年） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：９８９〜９９４頁によって構築されたｐＰＺＰベクターに由来、ＣＡＭＢＩＡ、ＧＰＯ Ｂｏｘ ３２００、Ｃａｎｂｅｒｒａ ＡＣＴ ２６０１、Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手可能又はＣＡＭＢＩＡ．ｏｒｇでワールドワイドウェブによって入手可能）が挙げられる。単子葉植物種の形質転換には、形質転換用ＤＮＡでコーティングした粒子及び形質転換用ＤＮＡでコーティングしたシリコンファイバーを用いる遺伝子銃照射が、核の形質転換に有用であることが多い。或いは、コメ、トウモロコシ及び種々のその他の単子葉植物種の形質転換には、アグロバクテリウム「スーパーバイナリー」ベクターが、うまく用いられている。
【００７６】
選択された植物を形質転換するためのＤＮＡ構築物は、適当な５’調節配列（例えば、プロモーター及び翻訳調節配列）及び３’調節配列（例えば、ターミネーター）と作動可能に連結された注目するコード配列を含む。好ましい実施形態では、その天然５’及び３’調節エレメントの制御下にあるデヒドリン又はＬＥＡタンパク質コード配列を用いる。その他の実施形態では、デヒドリン又はＬＥＡタンパク質コード配列及び調節配列を取り替えて（例えば、ＣｃＤＨ２プロモーターと作動可能に連結しているＣｃＬＥＡ１コード配列）、表現型の、例えば、風味、香り又はその他の特徴の改良のために形質転換された植物の種子の水分含量又はタンパク質含量を変更する。
【００７７】
代替実施形態では、遺伝子のコード領域は、強力な構成的プロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター又はゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下に位置する。本発明において使用するために考慮されるその他の構成的プロモーターとしては、それだけには限らないが、Ｔ−ＤＮＡマンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンセターゼ、ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられる。その他の実施形態では、強力な単子葉植物プロモーター、例えば、トウモロコシユビキチンプロモーター、コメアクチンプロモーター又はコメチューブリンプロモーターを用いる（Ｊｅｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１２３：１００５〜１４頁、２０００年）。
【００７８】
誘導性プロモーターの下でインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤コード配列を発現するトランスジェニック植物も、本発明の範囲内にあると考えられる。誘導性植物プロモーターとしては、２、３例と挙げると、テトラサイクリンリプレッサー／オペレーター制御プロモーター、熱ショック遺伝子プロモーター、ストレス（例えば、損傷）誘導性プロモーター、防御反応性遺伝子プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害誘導性遺伝子プロモーター（例えば、ヒドロキシプロリンリッチ細胞壁タンパク質遺伝子）、化学誘導性遺伝子プロモーター（例えば、硝酸塩レダクターゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子など）及び暗所誘導性遺伝子プロモーター（例えば、アスパラギンシンセターゼ遺伝子）が挙げられる。
【００７９】
本発明の種子特異的デヒドリン又はＬＥＡタンパク質プロモーターの他に、組織特異的及び発達特異的プロモーターもまた、本発明において使用するために考慮される。その他の種子特異的プロモーターの限定されない例として、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導性メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）（米国特許出願公開第０９／３７７，６４８号明細書）、マメβファゼオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２及びグロブリン１、ダイズ１１Ｓレグミン（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９２年）及びＣ．カネフォラ １１Ｓ種子貯蔵タンパク質（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：２７３〜２８２頁）が挙げられる。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の種子優先プロモーターが開示されている国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照のこと。その他のコフィア種子特異的プロモーター、例えば、それだけには限らないが、所有者共通の、同時係属ＰＣＴ出願番号［まだ割り当てられていない］に記載されるオレオシン遺伝子プロモーター及び所有者共通の、同時係属ＰＣＴ出願番号［まだ割り当てられていない］に記載されるデヒドリン遺伝子プロモーターも利用できる。その他の組織特異的プロモーターの例として、それだけには限らないが、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子プロモーター（例えば、Ｍａｒｒａｃｉｎｉら、２００３年によって記載されるコーヒー小サブユニットプロモーター）又は光合成組織における発現のためのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター及び根での発現が望ましい場合の根特異的グルタミンシンターゼ遺伝子プロモーターが挙げられる。
【００８０】
コード領域はまた、適当な３’調節配列と作動可能に連結している。天然３’調節配列が用いられない実施形態では、ノパリンシンセターゼポリアデニル化領域を使用できる。その他の有用な３’調節領域としては、それだけには限らないが、オクトピンシンターゼポリアデニル化領域が挙げられる。
【００８１】
選択されたコード領域は、適当な調節エレメントの制御下で、核薬剤耐性マーカー、例えば、カナマイシン耐性と作動可能に連結している。その他の有用な選択マーカーシステムとしては、抗生物質又は除草剤耐性（例えば、ハイグロマイシン、スルホニル尿素、ホスフィノトリシン又はグリフォセートに対する耐性）を付与する遺伝子又は選択的増殖を付与する遺伝子（例えば、マンノースでの植物細胞の増殖を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ）が挙げられる。選択マーカー遺伝子としては、制限するものではないが、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、並びに除草化合物に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、グリフォセート耐性ＥＰＳＰＳ及び／又はグリフォセート酸化還元酵素（ＧＯＸ）、ブロモキシニルに対する耐性のためのブロモキシニルニトリラーゼ（ＢＸＮ）、イミダゾリノンに対する耐性のためのＡＨＡＳ遺伝子、スルホニル尿素耐性遺伝子及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性遺伝子が挙げられる。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明に包含されるプロモーター及びその他の発現調節配列は、リポーター遺伝子と作動可能に連結している。本発明における使用のために考慮されるリポーター遺伝子としては、それだけには限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、セリアンサスオレンジ（Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓ Ｏｒａｎｇｅ）蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（α−ガラクトシダーゼをコードする）及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、β−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又はホタル若しくは細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子が挙げられる。当業者ならば、本発明の実施と関連している多数の標準手順と同様に、マーカー又はレポーターの機能を果たし得るさらなる配列は認識するであろう。
【００８３】
細胞宿主における遺伝子発現を増強するためのさらなる配列修飾は、当技術分野で公知である。これらの修飾としては、過剰なポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート及びその他のこのようなはっきりと特徴付けられた、遺伝子発現にとって有害であり得る配列をコードする配列の排除が挙げられる。或いは、必要に応じて、コード配列のＧ／Ｃ含量を、コーヒーノキ細胞において発現される既知遺伝子を参照することによって算出される所与のコーヒーノキ細胞宿主のレベル平均に調節することができる。また、可能であれば、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるようコード配列を修飾する。遺伝子発現を増強するためのもう１つの代替法として、５’リーダー配列を使用することがある。翻訳リーダー配列は当技術分野で周知であり、これとしては、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（ω）のシス作用誘導体（ω’）、ブロムモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス及びカブ黄斑モザイクウイルス由来の５’リーダー配列が挙げられる。
【００８４】
植物を形質転換し、その後、１又は複数の特性、例えば、導入遺伝子産物、導入遺伝子をコードするｍＲＮＡ又は導入遺伝子の発現と関連している表現型の変更の存在についてスクリーニングする。形質転換された植物における導入遺伝子の発現量並びに発現の組織及び時間特異的パターンは、核ゲノム中へのその挿入の位置に応じて変わり得るということは認識されなくてはならない。このような位置の効果は当技術分野では周知である。このために、いくつかの核形質転換体は再生され、導入遺伝子の発現について試験されなければならない。
【００８５】
方法：
本発明の核酸及びポリペプチドは多数の方法のうちいずれにおいても使用でき、それによって、タンパク質を発現するコーヒーノキの豆から最終的に製造されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は香りの増強においてタンパク質が役割を果たし得るために、コーヒーノキにおいてタンパク質産物を発現させることができる。
【００８６】
緑色豆中のスクロース濃度と高品質のコーヒーの間には強力な相関関係がある（Ｒｕｓｓｗｕｒｍ、１９６９年；Ｈｏｌｓｃｈｅｒ及びＳｔｅｉｎｈａｒｔ、１９９５年；Ｂａｄｏｕｄ、２０００年；Ｉｌｌｙ及びＶｉａｎｉ、１９９５年；Ｌｅｌｏｕｐら、２００３年）。コーヒー子実スクロース含量の改良は、（１）従来の育種又は（２）遺伝子工学技術によって、及びこれら２つのアプローチを組み合わせることによって得ることができる。両アプローチは、本発明に従うコーヒー中のスクロース代謝関連遺伝子の単離及び特性決定によって大幅に改善された。例えば、スクロース代謝酵素をコードする遺伝子を遺伝学的にマッピングすることができ、コーヒー風味に関与している量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を同定できる。次いで、このようなＱＴＬがスクロース関連遺伝子の位置と相関しているかどうかを調べることが可能である。スクロース代謝に影響を及ぼす遺伝子の対立遺伝子（ハプロタイプ）もまた、同定し、特異的ハプロタイプの存在が高スクロースと強力に相関しているかどうかを調べることができる。これらの「高スクロース」マーカーを用いてマーカー利用育種プログラムを促進することができる。スクロース代謝に関与しているポリヌクレオチドを単離することの第３の利点は、高スクロースレベル及び低スクロースレベルを有する品種におけるコーヒー豆熟成の間のこれらの遺伝子の発現データを作成することであり、その例が以下の実施例において論じられている。この情報は、以下に詳細に記載される、成熟豆中のスクロースレベルが増大した新規トランスジェニックコーヒーノキを作製することを目的とした遺伝子操作において使用する遺伝子の選択を導くために用いられる。
【００８７】
一態様では、本発明は、植物体中の１種又は複数のスクロース代謝酵素の量又は活性を増大させること又は低減させることを含む、植物体、好ましくは、コーヒーにおけるスクロース代謝酵素プロフィール又は糖プロフィールを変更する方法を特徴とする。本発明の具体的な実施形態は、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生を増大させること又は低減させることによって植物体の糖プロフィールを変更する方法を提供する。
【００８８】
本発明に従って得られたデータは、コーヒー子実成熟の最終段階でのインベルターゼ活性（酸性又は中性インベルターゼ）の低下が、子実中のスクロース蓄積の増大をもたらすということを強力に示す。したがって、本発明の好ましい一実施形態は、インベルターゼ阻害剤をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号５、６、７又は８に対応するｃＤＮＡを用い、コーヒーの種々の組織においてその阻害剤を過剰産生させることを目的としてコーヒーノキを形質転換することを含む。一実施形態では、例えば、インベルターゼ阻害剤遺伝子と機能的に連結している、ＲｕＢｉｓＣｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのプロモーターの使用を介して、インベルターゼ阻害剤産生の全体的な増大のためにコーヒーノキを操作する。インベルターゼ阻害剤の過剰産生を注目するシンク器官、すなわち、子実のみに制限するよう設計された別の実施形態では、子実特異的プロモーター、特に、上記のコフィア子実特異的プロモーターの１種を使用できる。
【００８９】
植物体のスクロースプロフィールは、植物体、例えば、コーヒー中の１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を調節することによって増強することができる。さらに、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の天然に存在する変異体について、増強されたスクロースレベルを発現する植物をスクリーニングすることができる。例えば、機能喪失型（ヌル）突然変異植物を、作製できるか、又は現在入手可能な植物体突然変異体の集団から選択できる。当業者には当然のことながら、突然変異植物集団はまた、本明細書に記載される方法のうち１種又は複数を用いて特定のスクロース代謝酵素を低発現又は過剰発現する突然変異体についてスクリーニングできる。突然変異集団は、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発及びトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡ挿入又はターゲッティング・インデュースド・ローカル・リーションズ・イン・ゲノムズ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＴＩＬＬＩＮＧ、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、２００４年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５（２）：６３０〜６３６頁； Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ＆ Ｈａｕｇｈｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．８（２）：２１１〜２１５頁参照のこと）によって作製できる。突然変異集団を作製する方法は、当技術分野では周知である。
【００９０】
本発明の核酸を用いて、種々の植物種におけるスクロース代謝酵素の突然変異型を同定できる。トランスポゾン挿入株が利用可能であるトウモロコシ又はシロイヌナズナなどの種では、オリゴヌクレオチドプライマーを、インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤遺伝子中の挿入について株をスクリーニングするよう設計できる。次いで、育種によって、中断された遺伝子にとってヘテロ接合性であるかホモ接合性である植物株を発達させることができる。
【００９１】
植物体はまた、突然変異誘発技術によって作製されたヌル突然変異体において見られるものと類似の表現型を示すよう操作できる。トランスジェニックヌル突然変異体は、「ドミナントネガティブ効果」を出すために、選択されたインベルターゼタンパク質の突然変異型を発現させることによって作製できる。本発明をいずれか１つの機構に制限するものではないが、この突然変異タンパク質は、相互作用タンパク質又はその他の細胞因子について野生型タンパク質と競合する。この種の「ドミナントネガティブ」効果の例は、昆虫システム及び脊椎動物システムの両方についてよく知られている（Ｒａｄｋｅら、１９９７年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４５：１６３〜１７１頁；Ｋｏｌｃｈら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：４２６〜４２８頁）。
【００９２】
「転写後遺伝子サイレンシング」によってスクロース代謝酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、もう１つの種類のトランスジェニックヌル突然変異体を作製できる。これらの技術を用いて、植物子実においてインベルターゼをダウンレギュレートするのを促進し、それによってスクロース蓄積を促進することができる。例えば、ダウンレギュレーションの標的とされた種に由来するインベルターゼをコードする遺伝子、又はその断片を利用してコードされるタンパク質の産生を制御することができる。この目的には、全長アンチセンス分子を使用できる。或いは、翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの特定の領域に対して標的とされるアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用できる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるためのアンチセンス分子の使用は、当技術分野では公知である。アンチセンス分子は、転写されるとアンチセンスＲＮＡ配列を生じるＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換することによってｉｎ ｓｉｔｕで提供できる。このような構築物は、全長又は部分アンチセンス配列を生じるよう設計できる。この遺伝子サイレンシング効果は、遺伝子をコードする配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両方を遺伝子組換えによって過剰産生させ、その結果、多量のｄｓＲＮＡが産生されることによって増強できる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８年、ＰＮＡＳ ９５：１３９５９〜１３９６４頁参照のこと）。この関連で、少なくとも１つのイントロンの一部又はすべてに相当するｄｓＲＮＡを含有する配列が特に有効であるとわかっている。一実施形態では、インベルターゼをコードする配列アンチセンス鎖の一部又はすべてが、導入遺伝子によって発現される。別の実施形態では、コード配列の一部又はすべてのハイブリダイズするセンス及びアンチセンス鎖が、遺伝子組換えによって発現される。
【００９３】
別の実施形態では、植物システムに対して現在利用可能な種々のその他の転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技術の使用によって、遺伝子をサイレンシングすることができる。ＲＮＡサイレンシングは、ＲＮアーゼＨをベースとする酵素（「ダイサー」又は「ダイサー様」）による、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の小さな２１〜２８ヌクレオチド断片へのプロセシングを含む。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である切断生成物は、タンパク質エフェクター複合体中に組み込まれ、これが配列特異的に遺伝子発現を調節する（植物におけるＲＮＡサイレンシングの総説については、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ、２００４年、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ７２：６５〜７３頁；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３５６〜３６３頁；Ｈｅｒｒ、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３２：９４６〜９５１頁参照のこと）。
【００９４】
低分子干渉ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学合成し、転写させ、増幅させ、次いで細胞に送達することができる。送達は、マイクロインジェクション（Ｔｕｓｃｈｌ Ｔら、２００２年）、化学トランスフェクション（Ａｇｒａｗａｌ Ｎら、２００３年）、エレクトロポレーション又は陽イオン性リポソーム媒介性トランスフェクション（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲら、２００２年；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭら、２００２年）、又は当技術分野で利用可能な任意のその他の手段によってであり得、当業者には理解される。或いは、ｓｉＲＮＡのＤＮＡ鋳型を、例えば、プラスミドによって注目する細胞に挿入することによってｓｉＲＮＡを細胞内に発現させることができ（Ｔｕｓｃｈｌ Ｔら、２００２年）、細胞を選択するために特異的に標的とされ得る。低分子干渉ＲＮＡは、植物中にうまく導入されている（Ｋｌａｈｒｅ Ｕら、２００２年）。
【００９５】
本発明におけるＲＮＡサイレンシングの好ましい方法は、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。個々の所望のｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを、一般的な手段によって標的細胞に送達する。ＤＮＡ配列は、一度、細胞に入ると、ＲＮＡ分子に連続的に転写され、これが分子内塩基対形成によって自身で折り曲がり、ヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、ひとたび細胞によってプロセシングされると、ｓｉＲＮＡ分子に相当し、所望のタンパク質のＲＮＡサイレンシングを媒介するために細胞によって使用される。植物におけるＲＮＡサイレンシングのための特定の有用性を有する種々の構築物は、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ、２００４年、前掲によって記載されている。通常、このような構築物は、プロモーター、「センス」方向のサイレンシングされる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス及びターミネーターを含む。
【００９６】
「コサプレッション（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という技術によって、さらにもう１つの種類の合成ヌル突然変異体を作製することもできる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６（６）．６５１〜６５９頁）。抑制のために標的とされる内因性遺伝子コピーを用いて植物細胞を形質転換する。多くの場合、これが、天然遺伝子並びに導入遺伝子の完全抑制をもたらす。一実施形態では、注目する植物種由来のインベルターゼをコードする遺伝子を単離し、その同種の細胞を形質転換するために用いる。
【００９７】
本発明に従って、任意の前記方法によって製造された突然変異植物又はトランスジェニック植物もまた特徴とする。植物は稔性であり、そのために育種目的にとって有用であることが好ましい。したがって、突然変異体又は前記の所望の表現型のうち１種又は複数を示す植物を、農業又は園芸適用において植物育種のために、又は直接的に使用できる。それらはまた、スクロース代謝酵素の関与及びコーヒー種子の風味、香り及びその他の特徴に影響を及ぼすスクロースレベルに対するその作用についてのさらなる解明のための研究ツールとしても有用である。また、表現型の増強された、又は組み合わされた植物を作製するために、ある導入遺伝子又は指定の突然変異を含む植物を、相補的な導入遺伝子又は遺伝子型を含む植物体と交雑させることもできる。
【００９８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供する。実施例は例示目的であって、本発明を制限しようとするものではない。
【００９９】
（実施例１）
以下の実施例のための材料及び方法
植物材料。温室条件（２５℃、７０％ＲＨ）下で増殖させたコフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ） Ｌ．ｃｖ．ＣａｔｕｒｒａＴ２３０８から、又はＩｎｄｏｎｅｓｉａｎ Ｃｏｆｆｅｅ ａｎｄ Ｃａｃａｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＩＣＣＲＩ）、インドネシアで屋外で成長させたコフィア・カネフォラ ＢＰ４０９（ロブスタ）から、葉、花、茎、根又は種々の発達段階の果実のいずれかから組織を採取した。果実は、規定の段階で採取し、液体窒素中で直ちに凍結し、次いで、輸送のためにドライアイス中に詰めた。キト（Ｑｕｉｔｏ）、エクアドル（Ｅｃｕａｄｏｒ）において栽培した木から、ＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４（ロブスタ）及びＣＣＣＡ１２（アラビカ）由来の果実を得た。サンプルを、輸送のために−２５℃で凍結し、次いで、使用まで−８０℃で保存した。
【０１００】
ユニバーサルゲノムウォーカー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ）。Ｃｒｏｕｚｉｌｌａｔら、１９９６年に従い、ＢＰ４０９由来のゲノムＤＮＡを、温室で成長した木から採取した葉から抽出した。ゲノムＤＮＡを４種の異なる制限酵素（ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩ、ＳｔｕＩ）で消化し、得られた断片を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって提供されるＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ａｄａｐｔｏｒと平滑末端に連結した。両セットの反応は、キットユーザーマニュアルに従って実施した。次いで、４種のライブラリーを、Ｇｅｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＳＰ）を用いるＰＣＲ反応の鋳型として用いた（表１）。反応混合物は、Ｔａｋａｒａ製の適当なバッファーを含む５０μｌの最終容積中、１μｌのＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒライブラリー鋳型、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌの各プライマー及び１ＵのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃｏｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含んでいた。第１のＰＣＲには以下の条件を用いた：９５℃で２分間のプレ変性後、最初の７サイクルは、９５℃で３０秒間の変性温度と、それに続く、７２℃で３分間のアニーリング及び伸長ステップで実施した。さらなる３５サイクルは、９５℃で３０秒間の変性ステップと、それに続く、６７℃で３分間のアニーリング／伸長ステップを用いて実施した。プライマー対ＡＰ１／ＧＳＰ−ＧＷ１を用いる最初の増幅から得られた産物が、プライマーとしてＡＰ２／ＧＳＰ−ＧＷＮ１及びＡＰ２及びＧＳＰ−ＧＷＮを用いる第２のＰＣＲの鋳型として役割を果たした。第２のＰＣＲは、２μｌの最初の増幅反応物（未希釈のもの及び１：５０までの種々の希釈）を用い、第２の反応が２５サイクルのみの増幅を用いたという点を除いて最初の反応について上記に記載されるように実施した。得られたＰＣＲ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、精製した。主要なバンドから得られたＰＣＲ断片を精製し、クローニングし、配列決定した。
【０１０１】
【表１】
表１． Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ実験に用いたプライマーの一覧
【０１０２】
ＤＮＡ配列分析。ＤＮＡ配列決定のために、組換えプラスミドＤＮＡを調製し、標準的な方法に従って配列決定した。ＤＮＡ Ｓｔａｒ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ソフトウェアを用いてコンピュータ分析を実施した。配列相同性は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して確認した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）。
【０１０３】
ｃＤＮＡ調製。ＲＮＡは、種々の組織、すなわち、根、茎、葉、花、果皮及び先に記載したように（Ｂｅｎａｍｏｒ及びＭｃ Ｃａｒｔｈｙ、２００３年）、４つの異なる成熟段階ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）の子実から抽出した。ｃＤＮＡは、以下のように、全ＲＮＡ及びオリゴｄＴ（１８）（Ｓｉｇｍａ）から調製した：１μｇの全ＲＮＡサンプル及び５０ｎｇのオリゴｄＴを、ＤＥＰＣ処理水を用いて１２μｌの最終容積とした。この混合物を、続いて、７０℃で１０分間インキュベートし、次いで、氷上で迅速に冷却した。次いで、４μｌの第１鎖バッファー（５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。これらの反応混合物を、４２℃で２分間プレインキュベートし、その後、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｒｎアーゼ Ｈ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。続いて、この試験管を、４２℃で５０分間インキュベートし、続いて、７０℃で１０分間加熱することによって酵素を不活化した。次いで、作製したｃＤＮＡサンプルを１００倍希釈し、５μｌの希釈したｃＤＮＡをＱ−ＰＣＲに用いた。
【０１０４】
ＣｃＩＮＶ１ ｃＤＮＡ単離物の３’ＲＡＣＥ（３’ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）。ＲＮＡを、先に記載される（Ｂｅｎａｍｏｒ及びＭｃ Ｃａｒｔｈｙ、２００３年；Ｂｅｎａｍｏｒら、報告書準備中）、４つの異なる成熟段階ＳＧ、ＬＧ、Ｙ、Ｒの果皮及び子実から抽出した。次いで、ｄＴ（１８）テール（５’ｃｔｔｃｃｇａｔｃｃｃｔａｃｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ３’）（配列番号４５）プライマーを用い、以下のように全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した：１μｇの全ＲＮＡサンプル及び５０ｎｇのｄＴ（１８）テールプライマーを、ＤＥＰＣ処理水を用いて１２μｌとした。続いて、この混合物を、７０℃で１０分間インキュベートし、次いで、氷上で迅速に冷却した。次いで、４μｌの第１鎖バッファー（５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。これらの反応混合物を、４２℃で２分間プレインキュベートし、その後、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｎアーゼ−Ｈ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。続いて、この試験管を、４２℃で５０分間インキュベートし、続いて、７０℃で１０分間加熱することによって酵素を不活化した。次いで、作製したｃＤＮＡサンプルを、第１のＰＣＲのプライマーとしてＩｎｖ１−３’ａ１（５’ｇａｃｇｔｇａａｔｇｇｔｔｇｃｔｇｇｔｃａｇｇ３’）（配列番号４６）とテール−３’ＲＡＣＥ（５’ｃｔｔｃｃｇａｔｃｃｃｔａｃｇｃ３’）（配列番号４７）とを用い、第２のＰＣＲのプライマーとしてＩｎｖ１−３’ａ２（５’ｔａｃａｇｔｇｇｇｔｇｃｔｇａｇｃｔｔｔｇｇｔ３’）（配列番号４８）とテール−３’ＲＡＣＥとを用いるＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応は、以下のように５０μｌの反応液中で実施した：５μｌのｃＤＮＡ；１×ＰＣＲバッファー（Ｌａ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ Ｍｇ＋＋プラス）、８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で５分間変性させた後、増幅は、９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間の３５サイクルからなっていた。さらなる最終伸長ステップは、７２℃で７分間行った。
【０１０５】
全長ＩＮＶ１及びＩＮＶ３ ｃＤＮＡ増幅。全長ＩＮＶ１及びＩＮＶ３ ｃＤＮＡを増幅するために、２セットのプライマー：ＩＮＶ１−ＡＴＧ（５’ａｔｇｇｃｔａｇｃｔｔｔｔａｃｃｔｃｔｇｇｃｔａａｔｇｔｇ３’）（配列番号４９）、ＩＮＶ１−ＳＴＯＰ（５’ｔｃａａｔｔｃｔｔｔｃｇａｔｔｇａｔａｃｔｇｇｃａｔｔｃｔ３’）（配列番号５０）及びＩＮＶ３−ＡＴＧ（５’ａｔｇｇａｇｔｇｔｇｔｔａｇａｇａａｔａｔｃａａｃｔ３’）（配列番号５１）、ＩＮＶ３−ＳＴＯＰ（５’ｔｃａｇｃａｇｇｔｃｃａｃｇａｇｇａｇｇａｔｃｔｃｔ３’）（配列番号５２）をそれぞれ、プライマーウォーキング又は３’ＲＡＣＥ実験から得たＩＮＶ１又はＩＮＶ３配列で設計した。これら２種のプライマーセットを用い、上記のｃＤＮＡサンプルを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は、以下のように５０μｌの反応液中で実施した：５μｌのｃＤＮＡ；１×ＰＣＲバッファー（Ｌａ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ Ｍｇ＋＋プラス）、８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で５分間変性させた後、増幅は、９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間の３５サイクルからなっていた。さらなる最終伸長ステップは、７２℃で７分間行った。得られた断片を、アガロースゲルから精製し、クローニングし、配列決定した。
【０１０６】
定量的−ＲＴ−ＰＣＲ。ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲは、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によって推奨されるように実施した。この実験に用いたｃＤＮＡサンプルは、先に記載されている。すべての反応は、１×ＴａｑＭａｎバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μｌのｃＤＮＡ及び０．６２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲは、８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、フォワード及びリバース並びに２００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブを用いて実施した。プライマー及びプローブは、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、表２）を用いて設計した。反応混合物を、５０℃で２分間、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒間／６０℃で１分間の４０増幅サイクルを行った。ＧｅｎｅＡｍｐ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサンプルを定量化した。転写物レベルは、比較の基準としてｒｐｌ３９を用いて調べた。
【０１０７】
【表２】
表２． Ｑ−ＰＣＲ実験に用いるプライマー及びプローブの一覧
ＭＧＢプローブは、５’を蛍光レポーター色素６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を用いて、３’をクエンチャー色素６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用いて標識した。ｒｐｌ３９プローブは、５’を蛍光レポーター色素ＶＩＣを用いて、３’末端をクエンチャーＴＡＭＲＡを用いて標識した。すべての配列は５’から３’に示されている。
【０１０８】
可溶性糖質定量化。子実組織を果皮及び外皮から分離した。子実を液体窒素を用い低温粉砕機でホモジナイズし、得られた粉末を４８時間凍結乾燥した（Ｌｙｏｌａｂ ｂＩＩ、Ｓｅｃｆｒｏｉｄ）。各サンプルを秤量し、７０ｍｌの、７０℃に予め加熱しておいた再蒸留水に懸濁し、次いで、激しく振盪し、７０℃で３０分間インキュベートした。室温に冷却した後、再蒸留水を加えることによってサンプルを１００ｍｌとし、次いで、濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌフィルターペーパー５９７．５）で濾過した。抽出したコーヒー子実組織の糖質を、Ｌｏｃｈｅｒら、１９９８年に従ってＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００（４×２５０ｍｍ）カラムを用いてＨＰＡＥ−ＰＥＤによって分離した。糖濃度は、ｇ／１００ｇＤＷ（乾燥重量）で表した。
【０１０９】
酵素活性分析。中性及び酸性インベルターゼ活性は、Ｋｉｎｇら、１９９７年に従って測定した。
【０１１０】
（実施例２）
Ｃ．カネフォラにおけるインベルターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡの同定
若い葉から単離した、また、異なる発達段階で収穫した果実の子実及び果皮組織から単離したＲＮＡを用いて作製したいくつかのコーヒーライブラリーから、４７，０００を超えるＥＳＴ配列を同定した。続いて、重複するＥＳＴを「ユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）」（すなわち、コンティグ）に「クラスタリングし」、ＮＣＢＩ非重複タンパク質データベースに対して個々の配列各々のＢＬＡＳＴ検索を行うことによってユニジーン配列に注釈を付けた。
【０１１１】
スクロースの合成及び分解に直接関与している酵素は植物では、特に、果実、塊茎及び種子発達の間、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））及びトウモロコシ（ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））などの植物で広く研究されている。いくつかの種では、スクロース合成及び分解に関与しているすべての既知の重要なタンパク質をコードするＤＮＡ配列が同定されており、特性決定されており、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能である。したがって、植物酵素の既知の配列、特に、コーヒーと密接に関連している生物（例えば、トマト及びジャガイモ）から得た配列を用いて、上記のＥＳＴライブラリー中、及びその他のコーヒーｃＤＮＡライブラリー中に存在する類似の配列を見出すことができた。実施例１に記載されるように、上記のＥＳＴ収集物を検索するために、「ユニジーン」セット５のｔＢＬＡＳＴｎ検索においてトマト及びジャガイモのタンパク質配列を用いた。オープンリーディングフレームが、「クエリー」配列と最高程度の同一性を示したインシリコの「ユニジーン」を、さらなる研究のために選択した。いくつかの場合では、選択した「ユニジーン」は、全長ｃＤＮＡクローンに相当する可能性がある少なくとも１種のＥＳＴ配列を含んでおり、次いで、そのクローンを再配列決定のために選択し、同一性及び「ユニジーン」配列の両方を確認した。
【０１１２】
可溶性、細胞内局在、至適ｐＨ及び等電点に基づいて、３種の異なる種類のインベルターゼアイソザイムを区別することができる：液胞型（ＩｎｖＶ）、細胞壁結合型（ＩｎｖＣＷ）及び中性（ＩｎｖＮ）インベルターゼ。ＩｎｖＶ及びＩｎｖＣＷは類似の酵素特性及び生化学的特性を有し、高度の配列全体の相同性及び２種の保存されたアミノ酸モチーフを共有している。１つの共通の特徴は、ペンタペプチドＮ−ＤＰＮ−Ｇ／Ａ（配列番号７７）（β−フルクトフラノシダーゼ−モチーフ；Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年；Ｒｏｉｔｓｃｈ及びＧｏｎｚａｌｅｚ、２００４年）。第２の保存された特徴は、高度に保存されたシステイン配列ＷＥＣＸ（Ｐ／Ｖ）ＤＦ（配列番号７８）（Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）（式中、Ｖ及びＰはそれぞれ、液胞型及び細胞壁型（ペリプラズム）インベルターゼを区別する）である。
【０１１３】
コーヒーにおいて３種のインベルターゼアイソザイムをコードするｃＤＮＡを見出すために、（１）トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１、（２）トマト細胞壁型インベルターゼＬＩＮ６及び（３）シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）中性（細胞質）インベルターゼ様タンパク質に相当するタンパク質配列を用い、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いてユニジーンセットの類似性検索を実施した。
【０１１４】
Ａ．ＣｃＩｎｖ２（配列番号１０）
ユニジーン１２７３３６のＯＲＦが、トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１（ＮＣＢＩタンパク質識別子番号Ｐ２９０００；Ｋｌａｎｎら、１９９２年）と高度の相同性を有することがわかった。このユニジーン中の単一のＥＳＴ、クローンｃｃｃｌ２０ｆ１１を単離し、その挿入断片を完全に配列決定した。ｃＤＮＡ挿入断片は２２１２ｂｐの長さであることがわかった。このクローンの完全ＯＲＦ配列は、位置１９２で始まり位置１９５２で終わる１７６１ｂｐの長さであった。推定されるタンパク質は５８６ａａの長さであり、予測分子量は６４ｋＤａであった。ｃｃｃｌ２０ｆ１１によってコードされるタンパク質は、ＣｃＩｎｖ２（コフィア・カネフォラ インベルターゼ２）と注釈を付けた。ＣｃＩｎｖ２は、トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１と６９．６％同一であり、ジャガイモＳＴＶＩｎｖに特徴付けられるインベルターゼと６８．５％同一である（図２）。Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉらは、最近、液胞型インベルターゼをコードしている可能性のあるＣ・アラビカ由来の部分ｃＤＮＡ配列を、公開データベースに入れた（ＮＣＢＩヌクレオチド識別子番号ＡＪ５７５２５８）。彼らは、この部分タンパク質配列をＩｎｖ２（ＮＣＢＩタンパク質識別子番号ＣＡＥ０１３１８）と呼んだ。ＣｃＩｎｖ２とｉｎｖ２の間の部分アラインメントは９３．８％の同一性を示した（図２）。このロブスタインベルターゼの提案される液胞局在は、高度に保存されたＷＥＣＶＤＦドメイン中のＶの存在によって支持されるが（図２、Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）、ｉｎｖ２タンパク質配列は、このドメイン中のＰの存在を特徴とし、このことは、ｉｎｖ２が細胞壁結合型インベルターゼであり得るということを示唆する。図２中のアラインメントは、ＣｃＩｎｖ２のＮ末端領域は、その他の植物から得た２種の相同体について見られるものよりも短いということを示す。しかし、ｃｃｃｌ２０ｆ１１のｃＤＮＡ挿入断片は、実際には、図２においてＣｃＩｎｖ２について示される最初のアミノ酸を１９０ｂｐ超えて始まる。この１９０ｂｐの配列は２つのオープンリーディングフレームを含むが、どちらも、主要なＯＲＦとインフレームではない。さらに、短いＯＲＦのアミノ酸配列は、その他の２種の相同配列において見られる配列に対応しない（図２）。これらの結果は、このコフィア・カネフォラタンパク質のＮ末端領域が、その他の植物の相同タンパク質中の匹敵する領域よりも短いこと、又はｃＤＮＡクローンのこの領域におけるイントロンの存在のいずれかによって説明できる。
【０１１５】
Ｂ．ＣｃＩｎｖ３（配列番号１１）
クローンｃｃｃｐ２８ｐ２２（ユニジーン９６０９５）によってコードされるタンパク質は、シロイヌナズナ由来の中性細胞質型インベルターゼ（タンパク質識別子番号ＮＰ＿５６７３４７）に対して高い相同性を有する。ｃｃｃｐ２８ｐ２２クローンによってコードされるタンパク質は、ＣｃＩｎｖ３（コフィア・カネフォラ インベルターゼ３）と注釈を付けた。得られた最適アラインメントによれば、ｃｃｃｐ２８ｐ２２のｃＤＮＡ挿入断片は、全長ではなく、すなわち、全タンパク質をコードしていない（約１５００個の塩基が失われている）。本発明者らは、数ラウンドのプライマー指向性ゲノムウォーキングを用い、ｃｃｃｐ２８ｐ２２配列５’領域上流に相当するＣ．カネフォラ由来のゲノム配列を増幅することができた。本発明者らは、特異的プライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲによって全長ｃＤＮＡを増幅した。Ｃ・アラビカ及びＣ．カネフォラ由来のいくつかのＲＮＡサンプルを用いたが、全長ｃＤＮＡ配列に相当する陽性の増幅は、黄色段階のアラビカ子実から抽出したＲＮＡを用いてのみ得られた。この新規ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質は、ＣａＩｎｖ３（コフィア・アラビカ インベルターゼ３）と注釈を付けた。ＣａＩｎｖ３ ｃＤＮＡは１６７５ｂｐの長さである。推定タンパク質は５５８ａａの長さであり、予測分子量は６３．８ｋＤａである。ＣａＩｎｖ３ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質配列は、シロイヌナズナ由来の中性細胞質型インベルターゼと極めて高レベルの相同性（８３．７％）を示す（図３）。
【０１１６】
Ｃ．ＣｃＩｎｖ４（配列番号１２）
クローンｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０（ユニジーン１２３７０５）によってコードされるタンパク質は、トマト細胞壁結合型インベルターゼＬＩＮ６（ＮＣＢＩタンパク質識別子番号ＡＡＭ２８８２３）とかなりの程度の同一性を有している（６２．７％）。アラインメントは図４に示されている。得られた最適アラインメントによれば、ｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０のｃＤＮＡ挿入断片は、全長ではなく、すなわち、全タンパク質をコードしていない（約１５００個の塩基が失われている）。ｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０によってコードされるタンパク質がまた、トマト液胞型インベルターゼＴＩＶ−１とも３８％の同一性を共有することに留意することは重要である（Ｋｌａｎｎら、１９９２年）。ｃｃｃｓ４６ｗ２７ｄ２０クローンによってコードされるタンパク質は、ＣｃＩｎｖ４（コフィア・カネフォラ インベルターゼ４）と注釈を付けた。このタンパク質は、細胞壁結合型インベルターゼよりも液胞型インベルターゼと高い相同性を共有している。５’末端の失われている領域を単離するために、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ及び５’ＲＡＣＥを実施した。
【０１１７】
本発明者らは、上記に示したデータに基づいて、Ｃ．カネフォラ データベースから各種類のインベルターゼアイソザイムをコードする１種のｃＤＮＡを単離した。
【０１１８】
Ｄ．ＣｃＩｎｖ１（配列番号９）
コフィア・アラビカ由来の細胞壁型インベルターゼをコードする部分ｃＤＮＡ配列（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉらによって入手可能になった：ＮＣＢＩヌクレオチド識別子番号ＡＪ５７５２５７、コードされる部分タンパク質配列（Ｉｎｖ１）ＮＣＢＩタンパク質識別子番号ＣＡＥ１３１７．１）を用いて、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ）から相同全長ｃＤＮＡ配列を単離した。部分ｃＤＮＡ配列及び３’ＲＡＣＥ、並びに実施例１に記載される「プライマー利用」ゲノムウォーキング実験を用いて、相同全長ｃＤＮＡが１７３１ｂｐの長さであることがわかり、推定タンパク質は５７６ａａの長さであり、予測分子量は６４．６ｋＤａであった。このタンパク質にはＣｃＩｎｖ１（コフィア・カネフォラ インベルターゼ１）と注釈を付けた。
【０１１９】
ＣｃＩｎｖ１について得られたタンパク質配列は、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉらによって得られた配列と同一ではなく、部分アラビカｃＤＮＡ配列の既知の１６３個のアミノ酸にわたって４つのアミノ酸の相違を有している。ＣｃＩｎｖ１の、いくつかの高度に相同なデータベース配列とのアラインメントは、ＣｃＩｎｖ１がトマト細胞壁結合型ＬＩＮ６と５５．２％の同一性及びＤＣＣＷ Ｉｎｖ、すなわちニンジンにおいて同定された細胞壁結合型インベルターゼと５４．３％の同一性を有するということを示す（図５）。ＣｃＩｎｖの提案される細胞内局在は、高度に保存されたＷＥＣＰＤＦドメイン中のＰの存在によって支持される（図５、Ｓｔｕｒｍ及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９９０年）。
【０１２０】
（実施例３）
Ｃ．カネフォラにおけるインベルターゼ阻害剤タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定
過去１０年の最近の刊行物は、インベルターゼの活性は、インベルターゼ阻害剤と呼ばれる小分子量タンパク質（＜２０ｋＤａ）の群との相互作用によって翻訳後レベルで調節できるということを示した（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８；Ｇｒｅｉｎｅｒら、２０００；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年；Ｂａｔｅら、２００４年）。公開データベースにおいて、いくつかの植物種から多数の配列が同定されたが、そのうち生化学的に特性決定されたものはほとんどない。最近、２種のインベルターゼ阻害剤、タバコ由来のＮｔＩＮＶＩＮＨ１（タンパク質識別子番号ＣＡＡ７３３３３；Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８年）及びトウモロコシ由来のＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１（ヌクレオチド同定番号ＡＸ２１４３３３；Ｂａｔｅら、２００４年、Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年のタンパク質ＩＤ．１に相当する）が、生化学的に特性決定された。例えば、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１は、スクロースセンサーとして作用するその能力によってスクロース代謝を直接制御することがわかった（Ｂａｔｅら、２００４年）。高スクロース濃度の存在下では、インベルターゼ阻害剤ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１は不活性のままであり、初期果実形成の間のスクロース加水分解が可能となる。このインベルターゼ阻害剤は、スクロースレベルが指定のレベルを下回って低下すると、活性となり、インベルターゼ活性を阻害する（Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年；Ｂａｔｅら、２００４年）。
【０１２１】
さまざまな生物（トマト、タバコ、トウモロコシ及びシロイヌナズナ）に由来するインベルターゼ阻害剤配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能であるが、そのほとんどは単純に、ＢＬＡＳＴを用いて得られた相同性結果に基づいて注釈が付けられており、その生化学的活性の直接的特性決定によってではない。生化学的に特性決定されている比較的少数のインベルターゼ阻害剤は、概して、互いに弱い相同性しか示さず（Ｂａｔｅら、２００４年）、今日まで、このクラスのタンパク質は、明確な高度に保存された配列モチーフを有さない（Ｂａｔｅら、２００４年）ということは留意される。したがって、「インベルターゼ阻害剤」又は「インベルターゼ阻害剤様タンパク質」として注釈が付けられたデータベース登録は、注意して解釈されなければならない。本発明者らは、コーヒーデータベースにおいて、コーヒーインベルターゼについてｂｌａｓｔ検索を実施するために、生化学的に特性決定されたインベルターゼ阻害剤ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１をコードする配列、ＮｔＩｎｖＩ及びＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年中のタンパク質ＩＤ．３１（タンパク質識別子番号ＣＡＣ６９３４５）を用いた。
【０１２２】
この検索に基づいて、ＥＳＴデータベースにおいて、データベースインベルターゼ阻害剤と類似性を有する、４種のクローンｃｃｃｐ２ｄ１（ユニジーン１２４２０９）、ｃｃｃｓ３０ｗ１４ｉ２４（ユニジーン１２５３３２）、ｃｃｃｓ３０ｗ２４ｎ８（ユニジーン１２２７０５）及びＡ５−１４６２を同定した。
【０１２３】
Ａ．ＣｃＩｎｖＩ１（配列番号１３）
ｃｃｃｐ２ｄ１クローンの６７０ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、２０．７ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする５５８ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。ｃｃｃｐ２ｄ１のタンパク質配列は、トウモロコシにおいて特性決定されたインベルターゼ阻害剤ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１（Ｂａｔｅら、２００４年）と３１．２％同一である（図６）。このｃＤＮＡは、ＣｃＩｎｖＩ１（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤１）と注釈を付けた。
【０１２４】
Ｂ．ＣｃＩｎｖＩ２（配列番号１４）
ｃｃｃｓ３０ｗｌ４ｉ２４クローンの６２９ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、１９．６ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする５３７ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。ｃｃｃｓ３０ｗｌ４ｉ２４のタンパク質配列は、タバコにおいて特性決定されたインベルターゼ阻害剤ＮｔＩｎｖＩ（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８年；Ｗｅｉｌら、１９９４年）と３４．６％同一である（図６）。このｃＤＮＡはＣｃＩｎｖＩ２（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤２）と注釈を付けた。
【０１２５】
Ｃ．ＣｃＩｎｖＩ３（配列番号１５）
ＰＣＴ出願ＰＴＣ／ＥＰ２００４／００６８０５に記載されるｃＤＮＡライブラリーのＢｌａｓｔスクリーニングの結果、ｃＤＮＡクローンＡ５−１４６２が発見された。Ａ５−１４６２クローンの７０４ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、１８．４ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする４９５ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。Ａ５−１４６２のタンパク質配列は、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１と１３％しか同一でないが（図６）、タンパク質ＩＤ．３１（ヌクレオチド同定番号ＡＸ２１４３６３；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年）とは２４．４％同一である。このｃＤＮＡは、ＣｃＩｎｖＩ３（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤３）と注釈を付けた。
【０１２６】
Ｄ．ＣｃＩｎｖＩ４（配列番号１６）
ｃｃｃｓ３０ｗ２４ｎ８クローンの６４０ｂｐのｃＤＮＡ挿入断片は、おそらく全長であり、２０．２ｋＤａという分子量を有する可能性があるタンパク質をコードする５５５ｂｐの完全ＯＲＦ配列を含む。ｃｃｃｓ３０ｗ２４ｎ８のタンパク質配列は、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１と２０．５％同一であり（図６）、タンパク質ＩＤ．３１（ヌクレオチド同定番号ＡＸ２１４３６３；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年）と２５．７％同一である。このｃＤＮＡは、ＣｃＩｎｖＩ４（コフィア・カネフォラ インベルターゼ阻害剤４）と注釈を付けた。
【０１２７】
先に記載したように、ＣｃＩｎｖＩタンパク質はあまり保存されておらず、例えば、ＺＭ−ＩＮＶＩＮＨ１又はＮｔＩｎｖＩと弱い相同性しか共有していない。機能に必須であると知られている４つの「保存された」Ｃｙｓ残基（Ｒａｕｓｃｈ及びＧｒｅｉｎｅｒ、２００３年；Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏら、２００３年；Ｈｏｔｈｏｒｎら、２００３年；Ｈｏｔｈｏｍら、２００４年）は、各タンパク質中に存在している（図６）。
【０１２８】
（実施例４）
コーヒー豆成熟の間の酸性及び中性インベルターゼ活性
ＦＲＴ０５（ロブスタ）及びＣＣＣＡ１２（アラビカ）から得た全粒において、コーヒー子実成熟の間のグルコース、フルクトース及びスクロースの濃度を調べた。本発明者らは、これまでにこれら２種の遺伝子型が大幅に異なるレベルのスクロースを有するとわかっていたので、分析するよう選択した（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌａｍｂｏｔ、公開されていないデータ）。本発明者らは、この相違の機序を理解するために、これら２種の品種の子実発達の間のスクロースの蓄積、並びにグルコース及びフルクトースのレベルを分析した。同時に、酸性及び中性インベルターゼ活性を、遊離糖蓄積とこれらの特定の活性の間に相関関係があり得るかどうかを調べるために調べた。同様の実験は、第２のロブスタ品種、ＦＲＴ６４から得たサンプルを用いて実施した。結果は表３及び図７に示されている。
【０１２９】
表３．コーヒー豆成熟の間の酸性及び中性インベルターゼ活性。
この研究には大きさ及び色を特徴とする４つの異なる成熟段階のコーヒー果実を用いた：すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）。コーヒー子実中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を、インベルターゼ活性のアッセイのために採取したものと同時に採取したサンプルにおいて測定した。糖濃度は、ｇ／１００ｇＤＷ（乾重）で表されているのに対し、酵素活性は、μモル．ｈ−１．ｍｇ−１タンパク質で表されている。
【表３】
【０１３０】
Ａ．コーヒー子実成熟の間の糖レベル
調べた成熟度の最初期段階（ＳＧ段階）では、主要な遊離糖はグルコースであったが、その濃度は、ＣＣＣＡ１２（１４％）において、ＦＲＴ０５（１．５％）よりも１０倍高かった。同じ段階で、フルクトース濃度もアラビカ（１．５％）において、ＦＲＴ０５（０．３％）よりも高かったが、フルクトースはグルコースよりも蓄積されないことは明らかであった。子実発達の最後までに、両種の、グルコースとフルクトースの濃度が極めて低いレベルに低下し、成熟した赤い段階（Ｒ）では微量しか検出されなかった。これら２種の糖の減少はスクロースの増大と同時に起こり、これは成熟した子実中の全遊離糖の１００％に迫り、やはり、アラビカ（９．８２％）において、ロブスタ（６．７１％）よりも高い。スクロース、グルコース及びフルクトース変動に関する同様の全体的な所見は、ＦＲＴ６４コーヒー豆成熟の間にもなされ得る。最初期段階では、グルコースが、フルクトースよりも蓄積される。発達の最後では、スクロースが主要な蓄積される糖であった。興味深いことに、ＦＲＴ６４及びＦＲＴ０５が、Ｒ段階において同様の最終スクロース濃度（およそ６．６％ＤＷ）を有する場合であっても、スクロースは、すべてのそれまでの段階、すなわち、ＳＧ（６０％多く）、ＬＧ（２５％多く）及びＹ（３０％多く）では、ＦＲＴ６４において、ＦＲＴ０５サンプルよりも蓄積された。これらの結果は遊離糖蓄積のみを表すものであって、スクロース代謝に直接関与しているＵＤＰ−Ｇ、Ｆ６−Ｐ及びＳ６−Ｐのようなその修飾された形を含まないことを留意することは重要である。
【０１３１】
Ｂ．コーヒー子実成熟の間のインベルターゼ活性（酸性及び中性）
酸性及び中性酵素活性は、ＣＣＣＡ１２コーヒー子実成熟間に同様に展開した。ＣＣＣＡ１２のＳＧ段階において低い酸性（０．１７Ｕ）及び中性（０．０９Ｕ）インベルターゼ活性が観察された。両酵素活性は、ＳＧとＬＧ段階の間に劇的に増大し、酸性インベルターゼについては１．７０Ｕ、中性インベルターゼについては０．４９Ｕという活性に到達した。発達の後期段階では、ＡＩ及びＮＩ活性は劇的に低下し、Ｙ段階でほぼ同様の低いレベルの活性に到達した（それぞれ、０．１９Ｕ及び０．２０Ｕ）。ＹとＲ段階の間に、ＡＩ活性が最大０．３４Ｕに増大したのに対し、ＮＩ活性は０．１４Ｕに低下した。興味深いことに、ＡＩ及びＮＩ活性は、同じサンプルについて先に観察されたＳｕＳｙ活性よりも類似の変動を有している（所有者共通の、同時係属仮出願［まだ、割り当てられていない］参照のこと）。ＣＣＣＡ１２子実成熟の最後の段階における両インベルターゼ活性の低下とスクロース蓄積には明確な相関関係がある。
【０１３２】
ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４のＡＩ及びＮＩ活性が、ＣＣＣＡ１２について観察されるものに対して極めて異なる様式で展開することは明白である。ＡＩ（１．５０Ｕ）及びＮＩ（０．４３Ｕ）酵素は、ＦＲＴ０５発達の初期（ＳＧ段階）に高度に活性であった。ＡＩ活性は、ＳＧとＹ段階の間に劇的に低下し、０．２６Ｕに達した（Ｙ段階でＣＣＣＡ１２について観察されるものとほとんど同じ活性）。ＦＲＴ０５ではＡＩ活性はＹとＲ段階の間に上がり、１．４４Ｕに達した。中性インベルターゼの活性の低下も観察されたが、ＳＧとＬＧ段階の間のみにおいて観察された。中性インベルターゼの活性の上昇は、ＬＧとＲ段階の間に観察された。ＮＩは、その最大活性０．５４Ｕに達した。ＦＲＴ０５後期子実発達段階は、高いＡＩ及びＮＩ活性を特徴とする。ＦＲＴ６４遺伝子型については、ＡＩ活性及びＮＩ活性は、ＳＧ ＦＲＴ６４子実において低かった。両活性はＳＧ及びＬＧ段階の間は安定なままであり、ＬＧとＲ段階の間に増大し、増大はＮＩについて、ＡＩよりもより高かった。ＦＲＴ６４は、ＬＧとＲ段階の間にＦＲＴ０５と同様の中性インベルターゼ活性増大を有していたが、同時に、酸性インベルターゼ活性もＦＲＴ０５において、ＦＲＴ６４ Ｒ段階よりも２．５倍高かった。結論として、ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４は、成熟子実において同様の最終スクロース濃度を有するが、インベルターゼ、主に酸性の活性は大きく異なる。
【０１３３】
全体に、ＣＣＣＡ１２は、成熟の最終段階でのより弱い全体的なインベルターゼ活性のために、ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４よりも、ある程度より多くのスクロースを蓄積し得るようである。後期発達においてスクロースが師部から運び入れられた後に合成される場合であっても、両ロブスタではインベルターゼ活性が即時分解によってスクロース蓄積を妨げている。
【０１３４】
（実施例５）
コーヒー豆成熟の間のインベルターゼ及びインベルターゼ阻害剤ｍＲＮＡ蓄積
Ｔ２３０８（コフィア・アラビカ）及びＢＰ４０９（Ｃ．カネフォラ）子実発達の間のインベルターゼ遺伝子、ＣｃＩｎｖ１、ＣｃＩｎｖ２及びＣｃＩｎｖ３並びにインベルターゼ阻害剤遺伝子ＣｃＩｎｖＩ１、２、３及び４の発現を特性決定した。本発明者らは、比較目的のため、種々のコーヒー組織、例えば、葉、花及び根におけるこれらの遺伝子の発現も特性決定した。これらの遺伝子発現研究は、酵素活性分析実験に用いられたものとは異なる品種と関連していることは留意される。それにもかかわらず、この発現データは、アラビカ対ロブスタにおけるこれらの遺伝子の発現間の全体的な比較を可能にする。
【０１３５】
ＲＮＡは、大きさ及び色を特徴とする４つの異なる成熟段階、すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色又は成熟）のＢＰ４０９及びＴ２３０８コーヒー果実から抽出した。実施例１に記載されるように、各段階について、果皮及び子実を分離し、その後、ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡはまた、その他の組織（葉、根及び花）からも抽出した。遺伝子発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実施することによって分析した。相対的な転写物レベルを、内因性構成的転写物ｒｐｌ３９に対して定量化した。用いた遺伝子特異的プライマー及びＴａｑＭａｎプローブが、上記の表２に列挙されている。
【０１３６】
ＣｃＩｎｖ遺伝子発現に関する最初の全体的な所見は、これらの遺伝子は、特に、子実では、すべての成熟段階で、両遺伝子型についてあまり発現されないということがわかったということである（図８）。ＣｃＩｎｖ１転写物（細胞壁型インベルターゼ）は、いずれの遺伝子型の子実でも検出されなかった。興味深いことに、ＣｃＩｎｖ１の転写物は、Ｔ２３０８果皮では検出されなかったのに対し、同じ段階でＢＰ４０９の果皮では相当なレベルが検出され得た。反対に、ＢＰ４０９の根及び葉組織では、相対的にかなりのレベルのＣｃＩｎｖ１が検出されたが、Ｔ２３０８から得た同一組織では検出されなかった。このインベルターゼ発現は、これらの相違は、ＢＰ４０９及びＴ２３０８遺伝子をコードするこれらの転写物における対立遺伝子の相違によるものではなく、おそらく、各遺伝子型におけるこれらの遺伝子の転写物レベルの相違によるものであるということを強力に示唆する。Ｔ２３０８の花において、ＢＰ４０９における発現と比較して、極めて高レベルのＣｃＩｎｖ２発現が検出された（図８、パネルＡ：およそ１０倍の相違、Ｔ２３０８（４．８ＲＱ）対ＢＰ４０９（０．３８ＲＱ））。
【０１３７】
これまでは、本明細書において用いられるＴ２３０８及びＢＰ４０９の全花サンプル中のいくつかのその他の遺伝子（例えば、ＣｃＨＱＴ、ＣｃＰＡＬ１及びＣｃＰＡＬ３、未公開データ）の発現に有意差があることが留意され、これがこれらの全花サンプルは正確に同じ発達段階ではない可能性があるという考えをもたらしてきた。ＣｃＩｎｖ２の発現データをより詳細に調べたところ（図８、パネルＢ）、ＣｃＩｎｖ２は、ロブスタの小さい緑色の子実とは別に、アラビカ又はロブスタの子実において極めて低レベルで発現されるということがわかった。しかし、子実におけるＣｃＩｎｖ２の弱い発現については、成熟へ向けた増大への極めて小さい傾向であるようであるということは留意される。アラビカ及びロブスタ果皮組織において、ＣｃＩｎｖ２の相対的にかなりの発現が検出されたが、この発現のパターンは異なっていた。
【０１３８】
試験したすべてのアラビカ果皮段階において、相対的に類似の発現があったのに対し、ロブスタでは、ＣｃＩｎｖ２の発現は、小さな緑色果皮では極めて低く、次いで、徐々に増大し、最高発現は成熟果皮組織において検出された。低ＣｃＩｎｖ２発現はまた、ＢＰ４０９の根及び葉において検出されたが、Ｔ２３０８では検出されなかった。
【０１３９】
中性（細胞質型）インベルターゼをコードすると考えられているＣｃＩｎｖ３の最高発現は、アラビカ及びロブスタの花において見られた。かなり低いレベルのＣｃＩｎｖ３発現がその他の組織で検出された。子実では、すべての段階において、ＣｃＩｎｖ３転写物のレベルは、アラビカにおいてロブスタよりもわずかに高いようであったが、果皮では、反対であるようであり、大きな緑色から赤い段階ではロブスタにおける発現が、アラビカにおいてよりもわずかに高い。
【０１４０】
転写レベルでのインベルターゼの制御は重要であるが、大幅な制御はまた、インベルターゼタンパク質と、インベルターゼ阻害剤と呼ばれる小分子量タンパク質（＜２０ｋＤａ）の群との相互作用によって転写後レベルでも行うことができる（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８年；Ｇｒｅｉｎｅｒら、２０００年；Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓら、２００１年；Ｂａｔｅら、２００４年）。上記のように、インベルターゼ阻害剤をコードすると考えられる４種の全長ｃＤＮＡを、ＥＳＴライブラリーから単離した。これらの遺伝子の発現分析の結果は、図９に示されている。
【０１４１】
ＣｃＩｎｖ１は、アラビカでは、もっぱら、小さな緑色段階の子実において発現され、大きな緑色の段階ではかなり少ない程度に発現されるのに対し、この遺伝子は、ロブスタでは、主に大きな緑色の子実において発現されることがわかった（図９）。極めて低いレベルのＣｃＩｎｖＩ１発現が、アラビカ及びロブスタ黄色子実の両方において検出されたが、成熟子実（赤）においては検出されなかった。
【０１４２】
ＣｃＩｎｖＩ２の発現についてはあまり特異性は見られなかった（図９）。この遺伝子は、アラビカ及びロブスタ両方の全花において相対的に高レベルで発現される。アラビカ及びロブスタ果皮では、小さな緑色段階の間、ＣｃＩｎｖＩ２発現を比較的低レベルで検出できたが、果実成熟につれて両種において大幅に増大することは明らかである。ＣｃＩｎｖＩ２は、すべての段階の子実において、並びに根及び葉において極めて低レベルで発現されるようである。
【０１４３】
ＣｃＩｎｖＩ１同様、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４の発現は高レベルの組織特異性を示した。ＣｃＩｎｖＩ３はもっぱら、アラビカの小さな緑色の子実において、またロブスタの黄色の子実において発現されるようである。ＣｃＩｎｖＩ４発現は、ほぼ例外なく、アラビカ子実の小さな緑色組織において検出されたのに対し、ロブスタでは、大きな緑色の子実において、及びより低い程度で葉において発現された。
【０１４４】
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【０１４５】
本発明は、上記で記載され、例示される実施形態に制限されないが、添付の特許請求の範囲内で改変及び修正が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】トマト果実におけるスクロース代謝のモデル。Ｓ（スクロース）は、シンプラスト経路によって師部から移入されるか、又は細胞壁型インベルターゼによって加水分解される。グルコース及びフルクトースは、特異的糖輸送体タンパク質によってサイトゾル中に移入される。スクロースは、サイトゾルでＳＳ（スクロースシンターゼ）によって分解され、その再合成は、ＳＰ（スクロースホスファターゼ）又はＳＳと関連して、ＳＰＳ（スクロースホスフェートシンターゼ）によって触媒される。スクロースは、液胞中に運び出され、液胞型インベルターゼによって加水分解される。修飾後、ＵＤＰ−グルコースは、有色体においてデンプン合成に用いられ得る。略語：Ｇ、グルコース；Ｆ、フルクトース；Ｆ６−Ｐ、フルクトース６−リン酸；ＵＤＰ−Ｇ、ＵＤＰ−グルコース；Ｇ６−Ｐ、グルコース６−リン酸；Ｓ６−Ｐ、スクロース６−リン酸；Ｉ、インベルターゼ；ＳＰ、スクロースホスファターゼ、ＳＰＰスクロースホスフェートシンターゼ。
【図２】液胞型酸性インベルターゼタンパク質との、ＣｃＩｎｖ２のタンパク質配列アラインメント。タンパク質配列は、ＣｃＩｎｖ２（コフィア・カネフォラ インベルターゼ２、配列番号１０）を用いたＢＬＡＳＴｐ相同性検索に基づいて選択した。トマトＴＩＶ１（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））由来の酸性インベルターゼ（配列番号１７）のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＰ２９０００であり、ニンジン（ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ））由来の酸性インベルターゼ（配列番号１８）についてはＣＡＡ４７６３６．１であり、ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））由来の酸性インベルターゼ（配列番号１９）についてはＡＡＱ１７０７４であり、コフィア・アラビカ由来のｉｎｖ２（配列番号２０）についてはＣＡＥ０１３１８である。ＣｃＩｎｖ２配列のものとは異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。アミノ酸配列ＮＤＰＮＧは、植物酸性インベルターゼ（βＦ−モチーフ）の顕著な特徴である。配列ＷＥＣＶＤＦは、液胞型インベルターゼに特異的である。
【図３】液胞型酸性インベルターゼタンパク質との、ＣａＩｎｖ３のタンパク質配列アラインメント。タンパク質配列は、ＣａＩｎｖ３（コフィア・アラビカ インベルターゼ３、配列番号１１）を用いたＢＬＡＳＴｐ相同性検索に基づいて選択した。ＡＴ ＮＩｎｖ（シロイヌナズナ由来の中性細胞質型インベルターゼ）（配列番号２１）のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＮＰ＿５６７３４７であり、ＬＪＮＩｎｖ１（ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来の中性細胞質型インベルターゼ）（配列番号２２）についてはＣＡＧ３０５７７である。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。ＣａＩｎｖ３配列のものと異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。
【図４】ＴＩＶ１及びＬＩＮ６酸性インベルターゼタンパク質との、ＣｃＩｎｖ４の部分タンパク質配列アラインメント。ＣｃＩｎｖ４（配列番号１２）、ＴＩＶ１（液胞型インベルターゼ）（配列番号１７）及びＬＩＮ６（細胞壁結合型インベルターゼ）（配列番号２３）間の部分タンパク質アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。ＴＩＶ１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｐ２９０００であり、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））由来のＬＩＮ６についてはＡＡＭ２８８２３である。ＣｃＩｎｖ４配列のものとは異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。
【図５】細胞壁結合型インベルターゼタンパク質との、ＣｃＩｎｖ１のタンパク質配列アラインメント。タンパク質配列は、ＣｃＩｎｖ１（コフィア・カネフォラ インベルターゼ１、配列番号９）を用いたＢＬＡＳＴｐ相同性検索に基づいて選択した。ＬＩＮ５（配列番号２４）のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＣＡＢ８５８９７であり、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（配列番号２３）由来のＬＩＮ６についてはＡＡＭ２８８２３であり、ニンジン（ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ））由来のＤＣＣＷＩｎｖインベルターゼ（配列番号２５）についてはＣＡＡ４９１６２．１であり、コフィア・アラビカ由来のｉｎｖ１（配列番号２６）についてはＣＡＥ０１３１７である。ＣｃＩｎｖ１配列のものとは異なるアミノ酸は、灰色で色付けしてある。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。アミノ酸配列ＮＤＰＮＧ（配列番号２７）は、植物酸性インベルターゼ（βＦ−モチーフ）の顕著な特徴である。配列ＷＥＣＰＤＦ（配列番号２８）はペリプラズム又は細胞壁結合型インベルターゼに特異的である。
【図６】インベルターゼ阻害剤タンパク質との、ＣｃＩｎｖＩのタンパク質配列アラインメント。トウモロコシ（ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））由来のＺＭ−ＩｎｖＩ（ＣＡＣ６９３３５．１）（配列番号２９）及びタバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））由来のＮｔ ＩｎｖＩ（ＡＡＴ０１６４０）（配列番号３０）との、ＣｃＩｎｖＩ１、２、３及び４タンパク質（それぞれ、配列番号１３、１４、１５及び１６）のアラインメントを示す図である。コンセンサス配列と同一のアミノ酸は、灰色で色付けしてある。４個の保存されたＣｙｓ残基が注目される。アラインメントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＮＡ ＳＴＡＲ）中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行った。
【図７Ａ】ＣＣＣＡ１２（コフィア・アラビカ）及びＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４（Ｃ．カネフォラ）の間の、全子実（果皮及び房から分離した）中の酸性及び中性インベルターゼ活性の変化。この研究には、大きさ及び色によって特徴付けられる４つの異なる成熟段階でのコーヒー果実、すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）を用いた。酵素活性は、μモル．ｈ−１．ｍｇ−１タンパク質で表されている。
【図７Ｂ】ＣＣＣＡ１２（コフィア・アラビカ）及びＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４（Ｃ．カネフォラ）の間の、全子実（果皮及び房から分離した）中の酸性及び中性インベルターゼ活性の変化。この研究には、大きさ及び色によって特徴付けられる４つの異なる成熟段階でのコーヒー果実、すなわち、ＳＧ（小さく緑色）、ＬＧ（大きく緑色）、Ｙ（黄色）及びＲ（赤色）を用いた。酵素活性は、μモル．ｈ−１．ｍｇ−１タンパク質で表されている。
【図８Ａ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型）（Ａ及びＢ）並びにＣｃＩｎｖ３（細胞質型）インベルターゼの組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。示されるデータは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図８Ｂ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型）（Ａ及びＢ）並びにＣｃＩｎｖ３（細胞質型）インベルターゼの組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。示されるデータは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図８Ｃ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる、Ｃ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖ１（細胞壁結合型）、ＣｃＩｎｖ２（液胞型）（Ａ及びＢ）並びにＣｃＩｎｖ３（細胞質型）インベルターゼの組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。示されるデータは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ａ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ｂ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ｃ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【図９Ｄ】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いるＣ．カネフォラ（ロブスタ、ＢＰ４０９）及びＣ・アラビカ（アラビカ、Ｔ２３０８）におけるＣｃＩｎｖＩ１、ＣｃＩｎｖＩ２、ＣｃＩｎｖＩ３及びＣｃＩｎｖＩ４インベルターゼ阻害剤の組織特異的発現プロフィール。根、花、葉並びに４つの異なる成熟段階、すなわち、小さく緑色（ＳＧ）、大きく緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫されたコーヒー豆から全ＲＮＡを単離した。各成熟段階について、コーヒー果実を果皮（Ｐ）と子実（Ｇ）に分離した。全ＲＮＡを逆転写し、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブを用いるリアルタイムＰＣＲに付した。ｒｐｌ３９転写物レベルに対して相対量を算出し、正規化した。データは、３回の増幅反応から得られた平均値を表し、エラーバーは平均のＳＤを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするコード配列を含む、コーヒー（コフィア種）から単離された核酸分子。
【請求項２】
コード配列がインベルターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
インベルターゼが細胞壁型インベルターゼ、液胞型インベルターゼ又は中性インベルターゼである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
インベルターゼが細胞壁型インベルターゼであり、アミノ酸配列ＷＥＣＰＤＦを有する保存されたドメインを含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
インベルターゼが、配列番号９又は配列番号１３と５５％を超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
インベルターゼが配列番号９又は配列番号１３を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号１又は配列番号４を含む、配列番号６に記載の核酸分子。
【請求項８】
インベルターゼが液胞型インベルターゼであり、アミノ酸配列ＷＥＣＶＤＦを有する保存されたドメインを含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項９】
インベルターゼが、配列番号１０と７０％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
インベルターゼが配列番号１０を含む、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
配列番号２を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
インベルターゼが中性インベルターゼである、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項１３】
インベルターゼが、配列番号１１と８４％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１４】
インベルターゼが配列番号１１を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
配列番号３を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
コード配列がインベルターゼ阻害剤をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
インベルターゼ阻害剤が、そのアミノ酸配列中に４個の保存されたシステイン残基を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
インベルターゼ阻害剤が、配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つと２５％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
インベルターゼ阻害剤が、配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つを含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号５、６、７又は８のうちいずれか１つを含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
コード配列が遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の遺伝子の転写によって生じるｍＲＮＡ分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載のｍＲＮＡ分子の逆転写によって生じるｃＤＮＡ分子。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子のセグメントと相補的である、８〜１００の間の塩基長のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１に記載の核酸分子のコード配列を含むベクター。
【請求項２６】
プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
核酸分子のコード配列が、構成的プロモーターと作動可能に連結している、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２８】
核酸分子のコード配列が、誘導性プロモーターと作動可能に連結している、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２９】
核酸分子のコード配列が、組織特異的プロモーターと作動可能に連結している、請求項２５に記載のベクター。
【請求項３０】
組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
種子特異的プロモーターがコーヒー種子特異的プロモーターである、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
請求項２５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガム、アルファルファ、クローバ、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、カカオ、トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ヒャクニチソウ及びシバクサからなる植物の群から選択される植物細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３４に記載の植物細胞から生じる稔性植物。
【請求項３６】
コーヒー豆の風味又は香りを調節する方法であって、コーヒー種子内の１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を調節するステップを含む方法。
【請求項３７】
１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させるステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
コーヒー種子内の１種又は複数の内因性インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤遺伝子の発現を増大させるステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする導入遺伝子を、植物に導入するステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
１種又は複数のインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させるステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物と比較して、植物中の内因性インベルターゼ活性が低下している、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
植物が、その種子に、インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を低減させるステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒーに導入するステップを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
インベルターゼの発現又は活性が低減される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
植物が、その種子中に、インベルターゼの産生又は活性が低減されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項１】
インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードするコード配列を含む、コーヒー（コフィア種）から単離された核酸分子。
【請求項２】
コード配列がインベルターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
インベルターゼが細胞壁型インベルターゼ、液胞型インベルターゼ又は中性インベルターゼである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
インベルターゼが細胞壁型インベルターゼであり、アミノ酸配列ＷＥＣＰＤＦを有する保存されたドメインを含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
インベルターゼが、配列番号９又は配列番号１３と５５％を超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
インベルターゼが配列番号９又は配列番号１３を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号１又は配列番号４を含む、配列番号６に記載の核酸分子。
【請求項８】
インベルターゼが液胞型インベルターゼであり、アミノ酸配列ＷＥＣＶＤＦを有する保存されたドメインを含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項９】
インベルターゼが、配列番号１０と７０％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
インベルターゼが配列番号１０を含む、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
配列番号２を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
インベルターゼが中性インベルターゼである、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項１３】
インベルターゼが、配列番号１１と８４％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１４】
インベルターゼが配列番号１１を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
配列番号３を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
コード配列がインベルターゼ阻害剤をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
インベルターゼ阻害剤が、そのアミノ酸配列中に４個の保存されたシステイン残基を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
インベルターゼ阻害剤が、配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つと２５％以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
インベルターゼ阻害剤が、配列番号１３、１４、１５又は１６のうちいずれか１つを含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号５、６、７又は８のうちいずれか１つを含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
コード配列が遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の遺伝子の転写によって生じるｍＲＮＡ分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載のｍＲＮＡ分子の逆転写によって生じるｃＤＮＡ分子。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子のセグメントと相補的である、８〜１００の間の塩基長のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１に記載の核酸分子のコード配列を含むベクター。
【請求項２６】
プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
核酸分子のコード配列が、構成的プロモーターと作動可能に連結している、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２８】
核酸分子のコード配列が、誘導性プロモーターと作動可能に連結している、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２９】
核酸分子のコード配列が、組織特異的プロモーターと作動可能に連結している、請求項２５に記載のベクター。
【請求項３０】
組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
種子特異的プロモーターがコーヒー種子特異的プロモーターである、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
請求項２５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガム、アルファルファ、クローバ、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、カカオ、トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ヒャクニチソウ及びシバクサからなる植物の群から選択される植物細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３４に記載の植物細胞から生じる稔性植物。
【請求項３６】
コーヒー豆の風味又は香りを調節する方法であって、コーヒー種子内の１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を調節するステップを含む方法。
【請求項３７】
１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させるステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
コーヒー種子内の１種又は複数の内因性インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤遺伝子の発現を増大させるステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
インベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする導入遺伝子を、植物に導入するステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
１種又は複数のインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を増大させるステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物と比較して、植物中の内因性インベルターゼ活性が低下している、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
植物が、その種子に、インベルターゼ阻害剤の産生又は活性が増大されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤の産生又は活性を低減させるステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
１種又は複数のインベルターゼ又はインベルターゼ阻害剤をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒーに導入するステップを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
インベルターゼの発現又は活性が低減される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
植物が、その種子中に、インベルターゼの産生又は活性が低減されていない同等の植物よりも多くのスクロースを含む、請求項４５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【公表番号】特表２００９−５０９５０９（Ｐ２００９−５０９５０９Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３２５０２（Ｐ２００８−５３２５０２）
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３７６００
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８５６６
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０８０６５７３２）コーネル ユニヴァーシティー (4)
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３７６００
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８５６６
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０８０６５７３２）コーネル ユニヴァーシティー (4)
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
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