サイモシンβ４、類似体、アイソフォーム及び他の誘導体を送達するための組成物及び方法
組成物及び方法は、接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含有するポリペプチド又はそれらの保存的変異型とを含む、実質的に精製された組成物を利用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮出願番号第６０／４５８，３９９号（２００３年３月３１日出願）の利益を請求する。
（技術分野）
本発明は、ポリペプチド医薬品を送達するための組成物及び方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチド医薬品は、種々の病弊の処置において特に有効な薬剤である場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ポリペプチド医薬品を製造するのが非常に高価である場合があるため、ポリペプチド医薬品を送達するための改良された組成物及び方法の必要性が当該技術分野で存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明に従って、組成物は、接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むポリペプチド又はそれらの保存的変異型とを含む、実質的に精製された組成物を含む。ポリペプチドを部位に送達する方法は、上記組成物を部位に導入する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、サイモシンβ４（Ｔβ４）のようなアクチン重合抑制ペプチド及び他のアクチン重合抑制ペプチド又はアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ又はそれらの保存的変異型を含有するペプチドフラグメントを利用する組成物及び方法を提供する。ＮＢ又はＫＬＫＫＴＥＴ及びＬＫＫＴＥＴＱのようなＣ−末端変異型が含まれる。これらのペプチド及びペプチドフラグメントは、創傷の治癒及び他の生理学的使用の促進において有用である。
【０００６】
サイモシンβ４は、インビトロでの内皮細胞の移動及び分化中にアップレギュレートされるタンパク質として最初に同定された。サイモシンβ４は、４３アミノ酸の、種々の組織において同定された４．９ｋＤａのユビキタスポリペプチドである。内皮細胞の分化及び移動、Ｔ細胞分化、アクチン重合抑制及び血管新生における役割を含むいくつかの役割がこのタンパク質に起因している。
【０００７】
サイモシンβ４は、種々の組織及び細胞型において見出される、高度に保存された極性５−ｋＤａポリペプチドを有するβ−サイモシンファミリーのメンバーである。サイモシンβ４は、胸腺から元々精製され、胸腺ホルモンとみなされ、その後、複数の生物学的プロセスに関与することがわかった。主なＧ−アクチン重合抑制ペプチドとして、サイモシンβ４は、細胞増殖、遊走、及び分化の間にアクチンアセンブリの制御において重要な役割を果たす。多くの研究から、発癌、炎症、血管新生、及び創傷治癒の調整においてサイモシンβ４が関与していることがわかった。悪性腫瘍細胞株において、アクチンベースの細胞骨格の組織化を介してサイモシンβ４発現が腫瘍発生及び転移活性を調整することがわかった。サイモシンβ４は、管形成内皮細胞において増大していることがわかり；それらの結合を増加させ、広げ、移動させ、血管新生を促進する。サイモシンβ４はさらに、潰瘍抽出物及び創傷液中でも高濃度で見出され、抗菌因子としての機能が示唆された。創傷治癒におけるサイモシンβ４による刺激の役割は、動物モデルを用いた種々の研究において示された。局所的に添加又は腹腔内投与される場合、サイモシンβ４は、ラット全層
モデルにおいて皮膚の創傷治癒を高めた。皮膚の創傷治癒を促進する能力はさらに、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス、ステロイド免疫抑制されたマウス及び高齢のマウスにおいても観察された。サイモシンβ４はさらに、火傷後の角膜上皮の治癒を促進し、炎症性応答を低減させる多くの角膜サイトカイン及びケモカインをダウンレギュレートすることも示された。
【０００８】
血管障害における凝集カスケードの活性化は、フィブリノーゲンをフィブリンへと変換するトロンビンの生成を生じる。フィブリンは、自発的に重合して、損傷箇所を密閉する血餅を形成し、血液の流出を防ぐ。フィブリンはさらに、種々の細胞型が接着し、移動し、増殖する仮のマトリックスとしても役立ち、後に続く創傷治癒プロセス中に、フィブリンと正常組織とが交換される。因子ＸＩＩＩａ（血漿トランスグルタミナーゼ）は、フィブリン血餅と共有結合的に架橋しその構造を強化する。それに加えて、因子ＸＩＩＩａはさらに、フィブリンに対して、フィブリンマトリックスの性質を調整し得る多くの生理学的に活性なタンパク質も架橋する。例えば、α2−抗プラスミンの共有取り込みは、フィブリン溶解現象に対するマトリックスの抵抗を高め、フィブロネクチンの組み込みは、細胞接着及び移動をサポートする能力に影響を与える場合がある。組織トランスグルタミナーゼは、フィブリンサイモシンβ４に選択的に取り込まれることが可能である。
【０００９】
サイモシンβ４は、組織トランスグルタミナーゼのための特定の基質として役立ち、コラーゲン、アクチン、フィブリノーゲン及びフィブリン、上述のプロセスにおいても関与するタンパク質に対して選択的に架橋可能である。トロンビンを用いた血小板の活性化の後、サイモシンβ４が放出され、時間依存様式及びカルシウム依存様式でフィブリンに架橋する。血小板因子ＸＩＩＩａは、刺激された血小板から同時に放出される。血小板から放出されたサイモシンβ４のフィブリンに対する架橋は因子ＸＩＩＩａによって媒介されると考えられ、創傷治癒、血管新生及び炎症性応答の促進のために、血餅及び組織損傷に近い部位でサイモシンβ４の局所濃度を高める機構を提供する。
【００１０】
フィブリノーゲンは、２個の同じサブユニットを含む化学ダイマーであり、それぞれは多くのジスルフィド結合によって共に保持される３個のポリペプチド鎖Ａα、Ｂβ及びγで構成される。６個全ての鎖のジスルフィドで結合されたＮＨ2−末端部分は中心Ｅ領域を形成する一方、ＣＯＯＨ−末端部分は２個の末端Ｄ領域及び２個のαＣ−ドメインを形成する。フィブリノーゲンのフィブリンへの変換の際に、トロンビンで媒介されるフィブリノーゲンからのＮＨ2−末端フィブリノペプチドＡ及びＢの除去及びフィブリノーゲンＡα及びＢβ鎖からのＮＨ2−末端フィブリノペプチドＡ及びＢの除去はそれぞれ、活性配列（重合部位）を露出させ、近接する分子のＥ及びＤ領域間の相互作用（ＤＤ：Ｅ相互作用）を可能にし、フィブリンポリマーを形成する。このポリマーは、フィブリンα鎖及びγ鎖のＣＯＯＨ−末端部分を介する因子ＸＩＩＩａによって、架橋される。隣接するＤ領域のγ鎖の分子間架橋が迅速に起こりγ−γダイマーを形成する一方、αポリマー（αＣ−ドメイン）間の架橋はより遅く起こり、αポリマーの形成を生じる。それに加えて、α鎖は、フィブロネクチン、α2−抗プラスミン、及びＰＡＩ−２のようなタンパク質のフィブリンに対する架橋に役立つ。従って、これらの鎖はさらにサイモシンβ４の架橋に関与するという仮説が立てられる。
【００１１】
サイモシンβ４がフィブリン（フィブリノーゲン）に組み込まれる機構を明確にするために、因子ＸＩＩＩａの存在下及び非存在下で、その相互作用をフィブリノーゲン、フィブリン及びそれらの組み換えフラグメント（ドメイン）を用いて研究した。この研究によりフィブリン（フィブリノーゲン）とサイモシンβ４との実質的な非共有相互作用は存在しないと考えられるが、因子ＸＩＩＩａはフィブリノーゲン及びフィブリンの両方に対してサイモシンβ４を効果的に架橋し、残基３９２〜６１０を含むそれらのαＣドメインのＣＯＯＨ−末端部分を主に介して架橋が起こることがわかった。
【００１２】
１つの実施形態によれば、接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むポリペプチド又はそれらの保存的変異型とを含む、実質的に精製された組成物を含む組成物が提供される。１つの実施形態によれば、上記接着剤は、ステントのような医療用デバイスに接着可能である。特に好ましい実施形態では、上記接着剤は、ヒトのような生存被検体の組織に接着可能である。
【００１３】
好ましい実施形態では、上記接着剤は生分解性の接着剤である。本明細書中で使用される場合、生分解性の接着剤との用語は、生体吸収性又は腐食可能な接着剤を包含すると意図される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は最初は流動体状態又は半流動体状態であり、最も好ましくは液体状態又は半液体状態である。特に好ましい実施形態では、適用後に、組織に接着しつつ、上記接着剤の粘度が上昇するか、少なくとも部分的に固化する。上記組成物は、層中の領域に、最も好ましくは噴霧又はブラシを用いて塗布されることによって導入されてもよい。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明において利用される接着剤は、フィブリンシーラントマトリックス（フィブリングルー）である。フィブリングルーは、フィブリノーゲン及びトロンビン／カルシウムの別個の溶液の２成分系である。２つの溶液が混合される場合、得られた混合物は、血餅形成カスケードの最終段階を模倣し、フィブリン血餅を形成する。フィブリノーゲン成分は、自己由来の、単一ドナーの、又はプールされた血液から即時に調製することできる。フィブリングルーは、商品名Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ（登録商標）、Ｔｉｓｓｅｌ（登録商標）、及びＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）としてヨーロッパにおいて入手可能である。フィブリングルーは、種々の解剖部位において組織を修復し、封鎖し、及び結合するために広範囲の外科手段において使用されてきた。
【００１５】
従って、本発明は、ＬＫＫＴＥＴポリペプチドを生存被検体の部位に送達する方法を提供する。好ましい実施形態では、この部位は表面である。本発明の方法は、本発明の組成物を部位に適用する工程を含む。好ましい実施形態では、この部位は、創傷、例えば、急性創傷又は慢性創傷である。
【００１６】
好ましい実施形態では、上記接着剤は、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブリングルー、コラーゲン、上述のいずれかのフラグメント、又は上述のいずれかの混合物である。使用されてもよいコラーゲン接着剤としては、１型、２型、３型、４型及び／又は５型のコラーゲンが挙げられる。他の接着剤は、アクチン又はインテグリン接着剤を含んでもよい。
【００１７】
他の実施形態では、本発明の組成物において利用される生分解性の接着剤は、ゲル（例えば、接着剤コラーゲンゲル）、ゲル／フィブリン混合物、粉末等である。
【００１８】
好ましい実施形態では、上記接着剤は、ＬＫＫＴＥＴペプチドに共有結合し、最も好ましくは因子ＸＩＩＩａによってＬＫＫＴＥＴペプチドに共有結合する。特に好ましい実施形態では、上記接着剤はフィブリン又はフィブリノーゲンのフラグメントである。
【００１９】
好ましい実施形態では、ＬＫＫＴＥＴポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ−末端変異型、Ｔβ４のＣ−末端変異型、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のスプライス変異型、酸化されたＴβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ球系Ｔβ４、ポリエチレングリコール付加Ｔβ４、又はアクチン結合ドメインを有する任意の他のアクチン重合抑制タンパク質もしくはアクチン結合タンパク質、又はアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むかもしくはアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴから本質的になるペプチドフラグメント又はそれらの保存的変異型を含む。国際出願番号
第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（参考として本明細書中に組み込まれる）は、本発明にしたがって有用であり得るＴβ４のアイソフォーム、ならびに本発明で利用され得るアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ及びそれらの保存的変異型を開示する。国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ９９／００８３３（ＷＯ９９／４９８８３）（本明細書中に参考として組み込まれる）は、本発明に従って利用され得る酸化されたサイモシンβ４を開示する。本発明は主として以下でＴβ４及びＴβ４アイソフォームに関して記載するけれども、以下の記載は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴＱ、ＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱを含むか又はこれらから本質的になるペプチド及びフラグメント、それらの保存的変異型、並びに酸化されたサイモシンβ４に等しく適用可能であると意図されることが理解される。
【００２０】
損傷した部位に接触させることの例としては、接着剤／Ｔβ４単独、又はＴβ４浸透を高めるか、又は処置される領域へのＴβ４ペプチドの放出を遅らせるか又はゆっくりにする少なくとも１つの薬剤と組み合わせた組成物と部位とを接触させることが挙げられる。被検体は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【００２１】
Ｔβ４、又はその類似体、アイソフォーム又は誘導体は、好適な有効量で投与されてもよい。例えば、Ｔβ４は、約０．１〜５０μｇの範囲内のＴβ４、さらに好ましくは約１〜２５μｇの範囲内の投薬量で投与されてもよい。
【００２２】
本発明に従う組成物は、投与１日あたり単回投与又は複数回投与で、毎日、１日ごと等、たとえば、投与１日あたり２回、３回、４回又はそれ以上の回数の適用で投与することができる。
【００２３】
Ｔβ４アイソフォームが同定され、Ｔβ４の既知のアミノ酸配列に対して約７０％、又は約７５％、又は約８０％又はそれ以上のホモロジーを有する。このようなアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４及びＴβ１５が挙げられる。Ｔβ４に類似して、Ｔβ１０及びＴβ１５アイソフォーム、ならびにＴβ４スプライス変異型は、アクチンを重合抑制することが知られている。Ｔβ４、Ｔβ１０及びＴβ１５、ならびにこれらの他のアイソフォームは、アクチン重合抑制又は結合の媒介に関与すると考えられる共通のアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを有している。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、Ｔβ４アイソフォームの活性は、部分的に、アクチンの重合化を制御する能力に起因する場合がある。β−サイモシンは、遊離のＧ−アクチンを重合抑制することによってＦ−アクチンを脱重合すると考えられる。それ故に、アクチン重合化を調整するＴβ４の能力は、ＬＫＫＴＥＴ配列を介してアクチンに結合又はアクチンを重合抑制する能力にすべて、又は部分的に起因する場合がある。従って、Ｔβ４を用いる場合と同様、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを有するＴβ４アイソフォームを含む、アクチンに結合もしくはアクチンを重合抑制する他のタンパク質又はアクチン重合化を調整する他のタンパク質は、本明細書中で記載されるように、単独で又はＴβ４との組み合わせて有効であると考えられる。
【００２４】
従って、既知のＴβ４アイソフォーム、例えば、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４及びＴβ１５、ならびにまだ同定されていないＴβ４アイソフォーム及びＴβ４スプライス変異型は、本発明の方法において有用であることが特に考えられる。そのようにして、このようなＴβ４アイソフォームは、被検体において実施される方法を含む、本発明の方法において有用である。それ故に、本発明はさらに、Ｔβ４、ならびにＴβ４アイソフォームＴβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４及びＴβ１５と、医薬的に受容可能なキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
それに加えて、アクチン重合抑制能力又は結合能力を有するか、あるいはアクチンを動
かし得るか又はアクチン重合化を調整し得る他のタンパク質は、適切な捕捉アッセイ、結合アッセイ、移動アッセイ又は重合化アッセイにおいて示されるか、又はアクチン結合を媒介するアミノ酸配列の存在、例えばＬＫＫＴＥＴの存在によって同定され、例えば、本発明の方法において同様に使用することができる。このようなタンパク質としては、例えば、ゲルソリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、アドセべルチン（ａｄｓｅｖｅｒｔｉｎ）、プロポミオシン（ｐｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）、フィンシリン（ｆｉｎｃｉｌｉｎ）、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニン及びアクメンチン（ａｃｕｍｅｎｔｉｎ）が挙げられる。被検体において実施される方法を含むこのような方法として、本発明はさらに、本明細書中に記載されるようなゲルソリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニン及びアクメンチンを含む医薬組成物を提供する。従って、本発明は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ（その一次アミノ酸配列内にあり得る）及びそれらの保存的変異型を含むポリペプチドの使用を含む。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「保存的変異型」またはそれらの文法的変化は、別の生物学的に類似の残基によってアミノ酸残基が交換されていることを示す。保存的変異型の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような疎水性残基を別の残基と交換すること、極性残基を別の残基と交換すること、例えば、アルギニンをリシンと置換すること、グルタミン酸をアスパラギン酸と置換すること、又はグルタミンをアスパラギンと置換すること等が挙げられる。
【００２７】
Ｔβ４は多くの組織及び細胞型に局在化しており、従って、Ｔβ４の産生を刺激する薬剤は、組織及び／又は細胞からのＴβ４産生に影響を与える組成物に添加されるか、又はそれらを含むことができる。このような薬剤としては、増殖因子のファミリーのメンバー、例えば、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、サイモシンα１（Ｔα１）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。さらに好ましくは、上記薬剤は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）又はＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーである。
【００２８】
さらに、治癒を助けるか又は刺激する薬剤を、Ｔβ４又はＴβ４アイソフォームとともに組成物に添加してもよい。このような薬剤としては、血管新生薬剤、増殖因子、細胞の分化に指向する薬剤が挙げられる。例えば、限定の目的ではないが、Ｔβ４又はＴβ４アイソフォームは、単独又は以下の薬剤の１つ以上と組み合わせて添加することができる：有効量のＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＬ−１、プロサイモシンα及びサイモシンα１１。
【００２９】
炎症、損傷及び変性を治癒又は防ぐ実際の投薬量、処方物又は組成物は、被検体の大きさ及び健康状態を含む多くの因子に依存する場合がある。しかし、当業者は、使用するための適切な投薬量を決定するために、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（上出）及び本明細書中に引用される参考文献に開示されるような臨床での投薬量を決定するための方法及び技術を記載する教示を使用するとができる。
【００３０】
好ましい実施形態では、ポリペプチドの濃度は、前記接着剤１モルあたり前記ポリペプチドが約０．０１〜１モルの範囲内、さらに好ましくは前記接着剤１モルあたり前記ポリペプチドが約０．１〜０．５モルの範囲内、最も好ましくは前記接着剤１モルあたり前記ポリペプチドが約０．２〜０．４モルの範囲内にある。
【００３１】
好適な処方物は、Ｔβ４又はＴβ４アイソフォームを約０．００１〜１０重量％の範囲
内の濃度で、約０．０１〜０．１重量％の範囲内の濃度で、又はさらには約０．０５重量％の濃度で含んでもよい。
【００３２】
本発明は、Ｔβ４ペプチド又はそれらの機能性フラグメントと相互作用する抗体の使用を含む。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、及び別個のモノクローナル抗体調製物から本質的になる抗体が提供される。モノクローナル抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（上出）に記載されるような当業者に周知の方法によってタンパク質のフラグメントを含有する抗原から製造される。本発明において使用されるような抗体との用語は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含むことを意味する。
【００３３】
なお別の実施形態では、本発明は、Ｔβ４遺伝子発現を調整する有効量の薬剤を投与することによって被検体を処置する方法を提供する。用語「調整する」は、Ｔβ４が過剰発現される場合、Ｔβ４発現の阻害又は抑制を意味し、Ｔβ４の発現が抑えられている場合には発現の誘発を意味する。用語「有効量」は、Ｔβ４遺伝子発現を調整して有効な処置を生じるのに有効なＴβ４薬剤の量を意味する。Ｔβ４又はＴβ４アイソフォーム遺伝子の発現を調整する薬剤は、例えばポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、アンチセンス、三重らせん物質、又はリボザイムであってもよい。例えば、Ｔβ４の構造遺伝子領域又はプロモーター領域に向けられたアンチセンスを使用してもよい。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、Ｔβ４活性を調整する化合物を使用するための方法を提供する。Ｔβ４活性に影響を与える化合物（例えば、アンタゴニスト及びアゴニスト）としては、ペプチド、ペプチドミメティック、ポリペプチド、化合物、亜鉛のような鉱物、及び生物学的薬剤が挙げられる。
【００３５】
いかなる特定の理論にも束縛されないが、本発明は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を誘発することによって、１つ以上の炎症性サイトカイン又はケモカインの濃度を下げ、内皮細胞に対する走化性因子として作用し、炎症又は損傷を治癒又は防ぐことを促進し、それによって傷害又は他の変性因子もしくは環境因子によってもたらされる組織の変性変化を治癒又は防ぐことを促進する場合がある。
【００３６】
本発明をさらに以下の実施例によって説明するが、これは限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００３７】
タンパク質及び試薬
プラスミノーゲン、フィブロネクチン及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が存在しないヒトフィブリノーゲンをＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から購入した。ヒトフィブリノーゲンαＣ−ドメインに対応する組み換えαＣ−フラグメント（残基Ａα２２１〜６１０）及びそのＮＨ2及びＣＯＯＨ−末端の半分に対応する切断された変異型（それぞれ残基Ａα２２１〜３９１及びＡα３９２〜６１０）をｐＥＴ２０ｂ発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生した。ヒトフィブリノーゲンγ鎖の残基１４８〜４１１を含む組み換えγ−モジュールを、同じ発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生した。
【００３８】
ウシトロンビン（１，０００ＮＩＨｕ／ｍｇ）、アプロチニン（４．４ＴＩＵ／ｍｇ）、抗ウサギＩｇＧ−セイヨウワサビ接合体及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をＳｉｇｍａから購入した。組み換え因子ＸＩＩＩは、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）による寄贈として提供された。合成サイモシンβ４は、Ｒｅｇｅｎｅｒｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ，ＭＤ）による寄贈として提供された。抗−サイモシンβ４血清を、公開された方法に従って調製した。
【００３９】
因子ＸＩＩＩの活性化
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ＴＢＳ）、ｐＨ８．０中の因子ＸＩＩＩを、トロンビン又はＣａＣｌ2のいずれかを用いて活性化し；後者はフィブリノーゲンを潜在的に活性化し得るトロンビンの存在を避けるために行われた。トロンビンで活性化されたＦＦＸＩＩＩ［ＦＸＩＩＩａ（ＴＨｒ）］を、最終濃度が２５ＮＩＨｕ／ｍｌ及び２．５ ＣａＣｌ2ｍＭになるまでウシトロンビンを添加することによって製造した。Ｃａ2+−活性化トロンビン［ＦＸＩＩＩａ（Ｃａ）］を、最終濃度５０ｍＭになるまでＣａＣｌ2を添加することによって製造した。両混合物中のＦＸＩＩＩの最終濃度は１．５ｍｇ／ｍｌであった；両混合物を実験前に１０分間室温でインキュベートした。
【００４０】
ＦＩＴＣを用いたサイモシンβ４の標識化
蛍光標識されたサイモシンβ４を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）との反応によって調製した。サイモシンβ４をＮＡＰ５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でゲルろ過することによって０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ９．５に移した後、１．２モル過剰のＦＩＴＣを添加し、暗所で３７℃で２時間混合物をインキュベートした。未反応のＦＩＴＣをＮＡＰ５カラムで除去した。標識化度を記載のように光学的に決定し、サイモシンβ４ １モルあたりＦＩＴＣ ０．９モルであることがわかった。
【００４１】
固相結合アッセイ
ＦＸＩＩＩａの存在下又は非存在下での、サイモシンβ４とフィブリン（フィブリノーゲン）及びそのフラグメントとの相互作用を、プラスチックマイクロリットルプレートを用いてＥＬＩＳＡによって試験した。マイクロリットルプレートのウェルを、全て０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８．３中で、フィブリノーゲン及びフィブリン１０μｇ／ｍＬ又は組み換えフラグメント２０μｇ／ｍｌで−４℃で一晩コーティングした。１０μｇ／ｍＬフィブリノーゲン、１ＮＩＨ ｕ／ｍｌトロンビン及び４００ｕ／ｍｌアプロチニンを含有する混合物のウェルに添加した後、＋４℃で一晩インキュベートすることによってフィブリンを製造した。次いで、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて３７℃で１時間インキュベートすることによってウェルをブロックした。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、指示濃度のサイモシンβ４、ＦＸＩＩＩ、ＦＸＩＩＩａ（Ｔｈｒ）及びＦＸＩＩＩａ（Ｃａ）をウェルに添加し、３７℃で２〜２．５時間インキュベートした。ウサギ抗−サイモシンβ４血清及びペルオキシダーゼ結合抗−ウサギＩｇＧを用いた反応によって、結合した（組み込まれた）サイモシンβ４を検出した。ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｓｅをウェルに添加し、組み込まれたサイモシンβ４を４５０ｎｍで分光学的に測定した。
【００４２】
フィブリノーゲン及びフィブリンへのサイモシンβ４の組み込み
フィブリノーゲン及びフィブリンへのＦＩＴＣ−標識されたサイモシンβ４及び標識されていないサイモシンβ４の組み込み反応を、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む１００μＬ
ＴＢＳ中のフィブリノーゲン３ｍｇ／ｍＬ（９μＭ）及びサイモシンβ４又はＦＩＴＣ標識されたサイモシンβ４ １５０μｇ／Ｌ（３０Ｍ）の混合物を含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で行った。ＦＸＩＩＩａ（Ｃａ）又はＦＸＩＩＩａ（Ｔｈｒ）を最終濃度が３０μｇ／ｍＬになるように添加することによって反応を開始させた。ＦＸＩＩＩａ（Ｔｈｒ）を含有する混合物中のトロンビンの最終濃度を、視覚的に観察されるフィブリン血餅が迅速に形成するのに十分な濃度の２．５ＮＩＨ ｕ／ｍＬにした。ＦＩＴＣ−標識化サイモシンβ４との反応を暗所で３７℃で４時間続け、沸騰水中で５分間酵素を熱失活させ
るによって停止させ、その間にフィブリノーゲン及びフィブリンが変性し、沈殿した。ペレットを遠心分離し、ＴＢＳで３回洗浄し、次いで可溶化させた。可溶化ペレット中のフィブリン（フィブリノーゲン）及びＦＩＴＣ−標識化サイモシンβ４の量を、それぞれモル吸収係数Ｅ280,1%＝１５．０及びε495＝７２，０００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて分光学的に決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる分析のために標識化されていないサイモシンβ４を用いてサンプルを調製するために、反応混合物を上述のように指示時間で熱失活させ、ＳＤＳ及び還元剤を含有するサンプルバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって可溶化した。
【００４３】
速度論的分析
異なるフィブリン（フィブリノーゲン）フラグメントへのサイモシンβ４の組み込みの速度論を分析するために、マイクロリットルプレート（上に記載されるもの、但し全てのフラグメントの濃度は２０μｇ／ｍＬ）のウェルに固定化し、トロンビンで活性化された因子ＸＩＩＩａ １０μｇ／Ｌの存在下で、種々の濃度のサイモシンβ４を用いてインキュベートした。インキュベーション混合物を、最終濃度１０ｍＭになるまでヨードアセトアミドを添加することによってインキュベーション１時間の間に１５分ごとに阻害し、各時点での組み込まれたサイモシンβ４をウサギ抗−サイモシンβ４血清を用いて上述のように検出した。異なる濃度のサイモシンβ４での組み込み反応の初期速度（Ｖ）を反応時間経過プロットの勾配から決定し、タンジェントα：＝Ａ450／ｔ（分）（ここで、Ａ450は組み込まれたサイモシンβ４の量に比例する、光学単位（ｏ．ｕ．）での４５０ｎｍでの吸光度を表す）として表した。見かけ上のＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数ＫmをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ− Ｂｕｒｋプロット１／Ｖ（分／ｏ．ｕ．） 対 １／［Ｓ］（μＭ-1）（ここで［Ｓ］はサイモシンβ４の濃度である）から得た。
【００４４】
ウエスタンブロット分析
フィブリン（フィブリノーゲン）及びそのフラグメント内に組み込まれたサイモシンβ４の検出を以下のように行った。上述のように調製されたサンプルを電気泳動させ、上に記載したようにニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気的に移動させた。膜をカゼインブロッカーで１時間ブロックし、サイモシンβ４をウサギ抗−サイモシンβ４血清及びペルオキシダーゼ結合抗−ウサギＩｇＧを用いた反応によって検出した。スーパーシグナルウェストピコケミルネッセント基質を用いて製造業者によって推奨される手順によって、ペルオキシダーゼ標識されたタンパク質バンドの視覚化を行った。
【００４５】
ＥＬＩＳＡで検出されるフィブリノーゲン及びフィブリンへのサイモシンβ４の組み込み
因子ＸＩＩＩａがフィブリン（フィブリノーゲン）に対するサイモシンβ４の架橋を媒介し得ることを試験するために、及びこのような架橋の機構を明らかにするために、本願発明者らは組み換え因子ＸＩＩＩの存在下及び非存在下での、サイモシンβ４とフィブリノーゲン及びフィブリンとの相互作用の直接研究を行った。因子ＸＩＩＩの血小板形態と対応する血漿因子ＸＩＩＩとは対照的に、組み換え因子は、２つのサブユニット（ａ2）を含むことが注記されるべきである。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ実験において、サイモシンβ４ １５０μｇ／ｍＬ（３０μｍ）を固定化フィブリノーゲンとともにインキュベートしたが、因子ＸＩＩＩの非存在下及び非活性化因子ＸＩＩＩ存在下では低いシグナルのみが検出され、このことは、それらとの相互作用はあったとしても非常に低いことを示唆している。非活性化因子ＸＩＩＩａの非存在下又は存在下でサイモシンβ４を固定化フィブリンとともにインキュベートした場合、これはＣａＣｌ2の添加によって活性化されウェル中でフィブリノーゲンがフィブリンに変換するのを防ぎ、シグナルはかなり増加し、このことは、因子ＸＩＩＩａがサイモシンβ４のフィブリノーゲンへの結合（組み込み）を媒介することを示唆する。同様の状況が固定化フ
ィブリンを用いて観察されたが、組み込みの濃度はフィブリノーゲンへの組み込みの濃度よりも高かった。両方の場合における組み込みは用量依存であった。フィブリンに対する組み込みは、因子ＸＩＩＩがＣａ2+の代わりにトロンビンで活性化された場合、さらに増加した。このような違いは、これらの２つの因子ＸＩＩＩａ種の異なる特定の活性に起因し得る。これらの結果は、活性化ＸＩＩＩが組織トランスグルタミナーゼと同様に、フィブリノーゲンおよびフィブリンの両方へのサイモシンβ４の組み込みを媒介することを示す。これらのことは、サイモシンβ４とフィブリノーゲン及びフィブリンの両方との顕著な非共有的相互作用は存在しないことも示唆する。
【００４７】
フィブリノーゲン及びフィブリンへのサイモシンβ４の組み込みのさらなる分析
因子ＸＩＩＩａで媒介されるフィブリン（フィブリノーゲン）へのサイモシンβ４の組み込みをさらに特徴決定するために、免疫ブロッティングによって、トロンビン、因子ＸＩＩＩ、サイモシンβ４及びフィブリンの混合物を異なる時点で分析した。分析のための混合物及びサンプルを実験手順において記載されるように調製した。サンプルをニトロセルロース膜に電気的に移動させ、抗−サイモシンβ４血清を用いてプローブした。免疫ブロッティングの結果は、因子ＸＩＩＩａが組織トランスグルタミナーゼと同様にフィブリンにサイモシンβ４を共有結合的に組み込ませ、組み込まれた（架橋した）サイモシンβ４の量は４時間後に飽和に達するようであることを示す。この時間を組み込み度を評価するために選択した。この目的のために、サイモシンβ４をフィブリノーゲン／サイモシンβ４混合物及びフィブリン／サイモシンβ４混合物において直接測定が可能なＦＩＴＣ発色基で標識化した。このような改変は、ウエスタンブロット分析によって評価された組み込みパターンに基づいて、フィブリノーゲン又はフィブリンのいずれかへの組み込みに影響を与えなかった。上記と同様の混合物であるがＦＩＴＣ標識化されたサイモシンβ４を含む混合物を４時間インキュベートし、その後に組み込み度を分光学的に決定されたフィブリン（フィブリノーゲン）の量及び各サンプル中の組み込まれたＦＩＴＣ−サイモシンβ４の量に基づいて概算した。この結果から、生理学的濃度のフィブリノーゲン（９μＭ）を含む選択された条件下で、因子ＸＩＩＩａがかなりの量のＦＩＴＣ−サイモシンβ４、フィブリノーゲン及びフィブリン１モルあたりそれぞれ約０．２及び０．４モルを組み込むことがわかった。
【００４８】
個々のフィブリン（フィブリノーゲン）鎖へのサイモシンβ４の組み込み
３つのフィブリン（フィブリノーゲン）鎖がサイモシンβ４との架橋に関与することを確立するために、本願発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、サイモシンβ４の存在下及び非存在下でのフィブリノーゲン及びフィブリンの因子ＸＩＩＩａ媒介性架橋の経時変化を分析した。フィブリン因子において、ＸＩＩＩａがγ鎖のＣＯＯＨ−末端部分を迅速に架橋してγ−γダイマーを生成し、α鎖の架橋によってα−αダイマー、トリマー、及びα−ポリマーを精製し；フィブリノーゲンは、同様の様式で架橋されるが速度が遅いことはよく知られている。還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される場合、フィブリノーゲン及びフィブリン、Ａα、Ｂβ、γ及びα、β、γそれぞれの個々のポリペプチド鎖に対応するバンドは十分に分離されていた。因子ＸＩＩＩａを用いたフィブリノーゲンのインキュベーションにより、γ−γダイマー及びＡα−Ａαダイマー及びトリマーに対応するバンドの欠失が進み；おそらくＡαポリマーに対応するいくつかの物質の出現が開始時にも観察された。フィブリノーゲンをサイモシンβ４の存在下で因子ＸＩＩＩａを用いてインキュベートする場合、個々の鎖及びそれらの架橋された変異型に対応するバンドの強度における実質的な違いは見られなかった。同様の結果が得られたが、フィブリンでは、α鎖及びγ鎖の架橋は予想されるようにさらに迅速に生じ、開始時の物質の量もさらに高かった。さらなるウエスタンブロット実験により、インキュベーション３０分後に、かなりの量のサイモシンβ４がフィブリノーゲンＡα鎖に組み込まれ、インキュベーション１５０分後に、いくらかのサイモシンβ４もＡα−Ａαダイマーに組み込まれていることがわかった。フィブリンα鎖及びそれらのα−αダイマ
ーへのサイモシンβ４の組み込みは非常に迅速に起こり、インキュベーション１５０分後に、サイモシンβ４の物質はα鎖のさらにより高い分子量の形態（α−ポリマー）中でも観察された。これらの結果は、フィブリノーゲンＡα及びフィブリンα鎖はサイモシンβ４の共有的組み込みにおいて主要な部位を含有することを示す。同時に、γ−γダイマー及びα−αダイマーの間の移動性を有する低い強度のバンドのインキュベーション１５０分後の外観は、サイモシンβ４がさらにフィブリンγ鎖（γ−γダイマー）に組み込まれることを示唆する。あるいは、このバンドは、α−αダイマーのタンパク分解的に切断された的変異型に対応する場合がある。
【００４９】
組み換えフィブリン（フィブリノーゲン）フラグメントへのサイモシンβ４の組み込み
αＣドメイン及びγ−モジュールを形成するフィブリノーゲンＡα及びγ鎖のＣＯＯＨ−末端タンパク質は、フィブリン中の因子ＸＩＩＩａによって架橋される反応性Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基を含有することが十分に確立されており、それ故に、サイモシンβ４との架橋に潜在的に関与し得る。このことを試験し、フィブリン（フィブリノーゲン）中のサイモシンβ４のための架橋部位をさらに局在化させるために、組み換えγ−モジュール（残基γ１４８〜４１１）及びαＣ−ドメイン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって、Ａα２２１〜３９１及びＡα３９２〜６１０サブフラグメント）へのサイモシンβ４の組み込みを分析した。サイモシンβ４の存在下での因子ＸＩＩＩａを用いたαＣ−ドメイン及びγ−モジュールのインキュベーションによって効果的な架橋が生じ、それらのより高い分子量形態、ダイマー、トリマー及びオリゴマーの概観を表す。同時に、主にそれぞれアクセプターＧｌｎ及びドナーＬｙｓ残基を含有するＡα２２１〜３９１及びＡα３９２〜６１０サブフラグメントの架橋は、ほとんど有効ではなかった。サンプルをニトロセルロース膜に電気的に移動し、抗−サイモシンβ４血清でプローブした場合、かなりの量のサイモシンβ４がαＣ−ドメイン、γ−モジュール及びそれらのさらに高い分子量変異型、ダイマー、トリマー及びオリゴマー中に検出された。Ａα３９２〜６１０サブフラグメントモノマー及びオリゴマーへの組み込みはさらにかなりの量である一方、非常に少量のサイモシンβ４のみがＡα２２１〜３９１オリゴマー中で検出された。これらの結果は、サイモシンβ４がαＣ−ドメイン及びγ−モジュールの両方に架橋され得、前者のＡα３９２〜６１０領域の反応性Ｌｙｓ残基が架橋に含まれることが示唆された。
【００５０】
上の観察をＥＬＩＳＡによって確認した。サイモシンβ４が固定されたγ−モジュール又が因子ＸＩＩＩａの存在下でαＣ−ドメイン変異型を用いてインキュベートされた場合、γ−モジュール内に効果的に組み込まれ、αＣ−ドメイン及びＡα３９２〜６１０サブフラグメント内に効果的に組み込まれる一方、Ａα２２１〜３９１への組み込みは非常に低かった。γ−モジュールの組み込みが、試験される全ての濃度でαＣ−ドメイン変異型の組み込みよりもほぼ２倍低いことが注記されるべきである。非活性化因子ＸＩＩＩ存在下で又は非存在下でサイモシンβ４が同じ固定された種を用いてインキュベートされた場合、全ての場合において組み込みが非常に低かった。このことは、フィブリノーゲン及びフィブリンの場合におけるように、サイモシンβ４と組み換えフラグメントとの間の顕著な非共有性相互作用が存在しないことを示唆する。
【００５１】
フィブリンのγ鎖の因子ＸＩＩＩａ架橋が見かけ上Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ挙動を示すことは以前に示された。固定化されたγ−モジュール及びαＣ−ドメイン変異型に対してサイモシンβ４を架橋する場合、因子ＸＩＩＩａがＭｉｃｈａｅｌｉｓ酵素として挙動するという推定から、このような架橋の速度論的パラメータを決定し得た。速度論的データの分析により、組み込み反応について、見かけ上のＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数（Ｋm）の以下の値、サイモシンβ４のγ−モジュールへの組み込みについて１８３±２９μＭ、及びαＣ−ドメイン及びそのＡα３９２〜６１０サブフラグメントへの組み込みについてそれぞれ１７．６±２．５μＭ及び８．６±３．７μＭがわかった。αＣ−ドメイン及びそのサブ
フラグメントについての値よりもγ−モジュールについてのＫm値がかなり高いことは、αＣ−ドメイン変異型に対するサイモシンβ４の架橋が非常に効率的であることを示す。この関係において、Ａα３９２〜６１０フラグメントについてのＫmは、因子ＸＩＩＩａで媒介されるγ−γ架橋について以前に決定されたＫm＝６．２μＭに匹敵する。αＣ−ドメイン及びＡα３９２〜６１０サブフラグメントについてのＫm値における２倍の差は、サイモシンβ４及びＡα３９２〜６１０領域の反応性Ｇｌｎ残基の間の競合、すなわち、αＣ−対−αＣ及びサイモシンβ４−対−αＣ架橋の間の競合によって説明され得た。これと一致して、αＣ−ドメイン及びＡα３９６２〜６１０サブフラグメントについての二重逆数プロットは、拮抗阻害の特徴的なパターンを示す。
【００５２】
けれども、この結果は、因子ＸＩＩＩａが、残基Ａα３９６２〜６１０を含む単離されたαＣ−ドメインのＣＯＯＨ−末端部分に対してサイモシンβ４を効果的に架橋すること、単離されたγ−モジュールへの組み込みは効果的ではないこと、およびフィブリノーゲン又はフィブリンにおいて、組み込みは主にαＣ−ドメインで起こることを示した。
【００５３】
フィブリン（フィブリノーゲン）は、生理学的に活性なタンパク質と細胞レセプターとの間の相互作用を介して創傷治癒において重要な役割を果たす。特に、フィブリンマトリックスは炎症性応答及び内皮細胞による毛細管形成（血管新生）を刺激し、これは、それぞれ白血球インテグリンＭａｃ−１及び内皮細胞レセプターＶＥ−カドヘリンとの相互作用を介する、創傷治癒プロセスにおいて必須の工程である。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と高いアフィニティーを有して相互作用し、フィブリン分解の部位での血管新生及び創傷治癒に対するそれらの貢献のこれらの強力な刺激剤の共局在化を提供する。フィブリンはさらに、インスリン様増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＰＢ−３）でも保持可能であり、ＩＧＦ−１と複合体を形成する。サイモシンβ4（強力な血管新生及び創傷治癒因子）はさらに、組織トランスグルタミナーゼによってフィブリンへと組み込むことができ、フィブリンマトリックスの創傷治癒能力を明らかにさらに高める。
【００５４】
全てのトランスグルタミナーゼは同じ反応を触媒するけれども、共有結合性γ−グルタミル−ε−リシルイソペプチド結合が反応性Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基の間に形成され、基質に対するそれらの特異性は異なっていてもよい。例えば、因子ＸＩＩＩａ（血漿トランスグルタミナーゼ）がフィブリンにおいてγ鎖及びα鎖に特異的に架橋し、γ−γダイマー及びα−ポリマーをそれぞれ生じ、組織トランスグルタミナーゼは特異的でなく、またα−γ鎖架橋を生じ得る。セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）ＰＡＩ−２についてのフィブリン（フィブリノーゲン）に対する架橋パターンはさらに、組織トランスグルタミナーゼ及び因子ＸＩＩＩａについて異なっていることもわかった。サイモシンβ4がテンジクネズミ肝臓組織トランスグルタミナーゼによってフィブリンに組み込まれることが最初に示され；因子ＸＩＩＩａによるフィブリンへのその組み込みは、トロンビンで活性化された血小板が因子ＸＩＩＩ及びサイモシンβ4を共に放出し、後者がフィブリンに対して架橋するという事実に基づいて仮説が立てられた。この試験において、サイモシンβ4がフィブリノーゲンおよびフィブリンの両方に対して因子ＸＩＩＩａによって組み込まれることが直接的に示された。さらに、組み込み度がそれぞれ高く、フィブリノーゲン及びフィブリン１モルあたりサイモシンβ4が０．２及び０．４モルであることがわかった。血漿中のフィブリノーゲンの濃度が約９μＭであるため、フィブリン分解の位置でのフィブリンの局所的濃度は、かなり高くあるべきである。サイモシンβ4が０．１ｎＭ〜１μＭで血管新生前の活性を示すことを考慮すると、組み込み度は明らかに生理学的に有意であり、フィブリン血餅の創傷治癒能力を高めるのに十分であるべきである。
【００５５】
因子ＸＩＩＩａがフィブリン内に多くの血漿タンパク質、α2−抗プラスミン、ＰＡＩ−２、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子
を組み込むことが知られている。組み込みの機構は、それらのいくつかについてのみ確立されている。例えば、フィブロネクチンは、因子ＸＩＩＩａと共有結合的に架橋する前に、高いアフィニティーを有して非共有結合的にフィブリンαＣ−ドメインに結合し；各タンパク質中の認識部位及び反応性Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基は、異なる領域に位置しており、架橋部位の適切な配向を与える。それに加えて、因子ＸＩＩＩａは、αＣ−ドメインと相互作用し、反応の特異性をさらに高める。サイモシンβ4の非共有性結合がフィブリンに対する架橋に優先するか否かを試験するために、その相互作用を非活性化因子ＸＩＩＩの存在下及び非存在下で、固定化されたフィブリノーゲン及びフィブリンを用いて試験した。フィブリンに対する高い親和性を示すｂＦＧＦ及びＶＥＧＦのような他の血管新生前因子とは対照的に、注目すべき非共有性相互作用は、全てのケースにおいてサイモシンβ4を用いて観察されなかった。組み込みは活性化因子ＸＩＩＩａの存在下でのみ観察され、このことは、共有性架橋がフィブリン血餅におけるサイモシンβ4を保持する唯一の機構であり得ることを示唆する。
【００５６】
この結果は、サイモシンβ4が因子ＸＩＩＩａによって単離されたγ−モジュール及びαＣ−ドメイン変異型に組み込まれ得るけれども、フィブリン（フィブリノーゲン）において、αＣ−ドメイン、つまりそれらのＡα３９２〜６１０領域に主に架橋することを明らかに示す。サイモシンβ4及びフィブリン（フィブリノーゲン）において同定された反応性Ｌｙｓ及びＧｌｎ残基の分布の分析は、この発見について合理的な説明を提供する。サイモシンβ４は、反応性アミンドナーであるＬｙｓ３８、ならびに２つのアミンレセプターであるＧｌｎ２３及びＧｌｎ３６を含有し、これらは他のタンパク質との架橋反応に関与し得る。分子間γ−γ架橋に関与するγ鎖において２つの反応性残基Ｇｌｎ３９８（又はＧｌｎ３９９）及びＬｙｓ４０６のみが存在し、両者はγ−モジュール中に位置する。単離されたγ−モジュールが因子ＸＩＩＩａで処理される場合、架橋はランダムに起こりダイマー、トリマー／オリゴマーを形成すると思われ；サイモシンβ4は全てのこれらの種に組み込まれていた。フィブリンにおいて、これらの領域は、１つの鎖のＧｌｎ３９８／３９９及び別の鎖のＬｙｓ４０６の間の架橋を容易にする逆平行様式でＤＤ：Ｅ相互作用によって整列し、γ−γダイマーを形成する。この架橋反応の効率は、これらの残基とサイモシンβ4との架橋反応の効率よりも非常に高く、それ故に、サイモシンβ4がフィブリンγ鎖へほとんど組み込まれないか又は全く組み込まれないことが本試験において観察されたことは驚くべきことではない。
【００５７】
γ鎖とは対照的に、Ａα鎖は複数の反応性グルタミン及びリシン残基を含有する。以下の残基は、フィブリン又は組み換えαＣ−ドメイン、Ｇｌｎ２２１、２３７、３２８及び３６６、ならびにＬｙｓ５０８、５３９、５５６、５８０及び６０１中のα鎖間の架橋に関与することがわかった。Ａα鎖Ｌｙｓ３０３は、因子ＸＩＩＩａで媒介されるセルピンα2−抗プラスミンのフィブリン（フィブリノーゲン）に対する架橋におけるアミンドナーとして作用することが示された。このＬｙｓは別のセルピン、組織トランスグルタミナーゼ及び因子ＸＩＩＩａによって他のＡα鎖リシン残基、１４８、１７６、１８３、２３０、４１３及び４５７を介して架橋するＰＡＩ−２に対して反応性ではない。α2−抗プラスミンの架橋領域を模倣する合成ペプチドを用いた試験により、１２の反応性リシン残基、Ｌｙｓ４１８、４４８、５０８、５３９、５５６及び５８０を介してフィブリンα鎖に組み込まれ、これは全活性の７８％を占め、Ｌｙｓ２０８、Ｌｙｓ２１９及び／又は２２４、Ｌｙｓ４２７、４２９、６０１及び６０６は反応性がほとんどないことが明らかである。フィブリン（フィブリノーゲン）Ａα３６８〜６１０領域内の少なくとも１０のリシン残基は、フィブロネクチンとの架橋反応にかかわる。上記分析により、フィブリン中の同定された反応性残基のほとんどがαＣ−ドメイン中に位置し、サイモシンβ4が優先的に架橋するαＣ−ドメインの３９２〜６１０領域が、少なくとも１１の反応性Ｌｙｓ残基を含有し、これらの残基の中で半分のみがα−α架橋において利用されることがわかった。サイモシンβ4がα−α架橋に関与する反応性リシン残基について競合するけれども
、αＣ−ドメインに対する架橋が独立してそれらの分子間α−α架橋を有して生じ、フィブリン内に効率よく組み込まれることも示唆される。従って、αＣ−ドメインの反応性リシン残基はα−α架橋に役立つだけでなく、同時に、創傷治癒及び他の生理学的プロセス及び病態プロセスに関与するフィブリンマトリックスの性質を調整し得る、サイモシンβ4を含む生理学的に活性なタンパク質を収容する。
【００５８】
フィブリノーゲンは、制御可能な様式で重合し、異なる細胞に容易に接着し、非免疫性で生分解性の血餅を生成する。これらは、出血の阻止のための止血剤として、ならびに組織封鎖及び創傷治癒を助けるために、多くの外科適用においてますます使用されている理想的な止血及び生体接着剤（フィブリンシーラント）になる。創傷治癒及び他の治療におけるフィブリンシーラントの使用は、生体活性薬剤を含むことによって高めることができる。例えば、細胞モデル及び動物モデルにおいて、フィブリンが抗生物質及び増殖因子の局在化送達のためのビヒクルとして役立ち得ることが示された。フィブリンに包接された抗生物質は低い溶解性に起因してゆっくりと放出されるが、フィブリンシーラント中の増殖因子の保持は、フィブリンとの高いアフィニティー相互作用を介してか、又は直接的な共有性架橋を介して達成された。サイモシンβ4が因子ＸＩＩＩａを用いた架橋によってフィブリン（フィブリノーゲン）に組み込まれる能力は、サイモシンβ4のフィブリンシーラント上への固定化のために使用可能であった。この試験は、フィブリノーゲン及びフィブリンの両方へのこのような組み込みの高い効力を示し、このアプローチを支持する。
【００５９】
まとめると、実験的研究は、生体活性ペプチドであるサイモシンβ4が、因子ＸＩＩＩａを用いて共有的に架橋することによってフィブリンに組み込まれ得ることを確認し、このことは成分の生理学的濃度でフィブリノーゲン及びフィブリンの両方への組み込みの高い効率を示し、フィブリン（フィブリノーゲン）αＣ−ドメインのＡα３９２〜６１０領域内の組み込み部位を局在化させることを示した。実験データは、創傷治癒の場所に対して送達するための、生理学的に顕著な量のサイモシンβ4のフィブリンシーラントへの組み込みを支持する。
【００６０】
組織トランスグルタミナーゼ及び推定血漿トランスグルタミナーゼ、因子ＸＩＩＩａは、フィブリン（フィブリノーゲン）に生理学的に活性なペプチドであるサイモシンβ4を共有的に組み込むことができる。この組み込みの機構を明らかにするために、サイモシンβ4とフィブリノーゲン、フィブリン、及びそれらの組み換えフラグメント、γ−モジュール（γ鎖残基１４８〜４１１）、ならびにαＣ−ドメイン（Ａα鎖残基２２１〜６１０）及びその切断された変異型を用いて免疫ブロット及びＥＬＩＳＡによって相互作用を試験した。それらの間の顕著な非共有性相互作用は、活性化因子ＸＩＩＩの非存在下では検出されなかったが、サイモシンβ４の存在下では、フィブリン及びより低い程度でフィブリノーゲンに効果的に組み込まれた。フィブリン（フィブリノーゲン）及び因子ＸＩＩＩの生理学的濃度での組み込みは、フィブリノーゲン及びフィブリンに対するサイモシンβ4のモル組み込み比がそれぞれ０．２及び０．４で有意であった。さらなる実験から、活性化因子ＸＩＩＩは単離されたγ−モジュール及びαＣ−ドメインにサイモシンβ4を組み込むが、フィブリンにおいて、後者は主要な組み込み部位として働くことがわかった。この部位はさらに、残基３９２〜６１０を含むαＣ−ドメインのＣＯＯＨ−末端部分に局在化していた。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮出願番号第６０／４５８，３９９号（２００３年３月３１日出願）の利益を請求する。
（技術分野）
本発明は、ポリペプチド医薬品を送達するための組成物及び方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチド医薬品は、種々の病弊の処置において特に有効な薬剤である場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ポリペプチド医薬品を製造するのが非常に高価である場合があるため、ポリペプチド医薬品を送達するための改良された組成物及び方法の必要性が当該技術分野で存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明に従って、組成物は、接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むポリペプチド又はそれらの保存的変異型とを含む、実質的に精製された組成物を含む。ポリペプチドを部位に送達する方法は、上記組成物を部位に導入する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、サイモシンβ４（Ｔβ４）のようなアクチン重合抑制ペプチド及び他のアクチン重合抑制ペプチド又はアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ又はそれらの保存的変異型を含有するペプチドフラグメントを利用する組成物及び方法を提供する。ＮＢ又はＫＬＫＫＴＥＴ及びＬＫＫＴＥＴＱのようなＣ−末端変異型が含まれる。これらのペプチド及びペプチドフラグメントは、創傷の治癒及び他の生理学的使用の促進において有用である。
【０００６】
サイモシンβ４は、インビトロでの内皮細胞の移動及び分化中にアップレギュレートされるタンパク質として最初に同定された。サイモシンβ４は、４３アミノ酸の、種々の組織において同定された４．９ｋＤａのユビキタスポリペプチドである。内皮細胞の分化及び移動、Ｔ細胞分化、アクチン重合抑制及び血管新生における役割を含むいくつかの役割がこのタンパク質に起因している。
【０００７】
サイモシンβ４は、種々の組織及び細胞型において見出される、高度に保存された極性５−ｋＤａポリペプチドを有するβ−サイモシンファミリーのメンバーである。サイモシンβ４は、胸腺から元々精製され、胸腺ホルモンとみなされ、その後、複数の生物学的プロセスに関与することがわかった。主なＧ−アクチン重合抑制ペプチドとして、サイモシンβ４は、細胞増殖、遊走、及び分化の間にアクチンアセンブリの制御において重要な役割を果たす。多くの研究から、発癌、炎症、血管新生、及び創傷治癒の調整においてサイモシンβ４が関与していることがわかった。悪性腫瘍細胞株において、アクチンベースの細胞骨格の組織化を介してサイモシンβ４発現が腫瘍発生及び転移活性を調整することがわかった。サイモシンβ４は、管形成内皮細胞において増大していることがわかり；それらの結合を増加させ、広げ、移動させ、血管新生を促進する。サイモシンβ４はさらに、潰瘍抽出物及び創傷液中でも高濃度で見出され、抗菌因子としての機能が示唆された。創傷治癒におけるサイモシンβ４による刺激の役割は、動物モデルを用いた種々の研究において示された。局所的に添加又は腹腔内投与される場合、サイモシンβ４は、ラット全層
モデルにおいて皮膚の創傷治癒を高めた。皮膚の創傷治癒を促進する能力はさらに、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス、ステロイド免疫抑制されたマウス及び高齢のマウスにおいても観察された。サイモシンβ４はさらに、火傷後の角膜上皮の治癒を促進し、炎症性応答を低減させる多くの角膜サイトカイン及びケモカインをダウンレギュレートすることも示された。
【０００８】
血管障害における凝集カスケードの活性化は、フィブリノーゲンをフィブリンへと変換するトロンビンの生成を生じる。フィブリンは、自発的に重合して、損傷箇所を密閉する血餅を形成し、血液の流出を防ぐ。フィブリンはさらに、種々の細胞型が接着し、移動し、増殖する仮のマトリックスとしても役立ち、後に続く創傷治癒プロセス中に、フィブリンと正常組織とが交換される。因子ＸＩＩＩａ（血漿トランスグルタミナーゼ）は、フィブリン血餅と共有結合的に架橋しその構造を強化する。それに加えて、因子ＸＩＩＩａはさらに、フィブリンに対して、フィブリンマトリックスの性質を調整し得る多くの生理学的に活性なタンパク質も架橋する。例えば、α2−抗プラスミンの共有取り込みは、フィブリン溶解現象に対するマトリックスの抵抗を高め、フィブロネクチンの組み込みは、細胞接着及び移動をサポートする能力に影響を与える場合がある。組織トランスグルタミナーゼは、フィブリンサイモシンβ４に選択的に取り込まれることが可能である。
【０００９】
サイモシンβ４は、組織トランスグルタミナーゼのための特定の基質として役立ち、コラーゲン、アクチン、フィブリノーゲン及びフィブリン、上述のプロセスにおいても関与するタンパク質に対して選択的に架橋可能である。トロンビンを用いた血小板の活性化の後、サイモシンβ４が放出され、時間依存様式及びカルシウム依存様式でフィブリンに架橋する。血小板因子ＸＩＩＩａは、刺激された血小板から同時に放出される。血小板から放出されたサイモシンβ４のフィブリンに対する架橋は因子ＸＩＩＩａによって媒介されると考えられ、創傷治癒、血管新生及び炎症性応答の促進のために、血餅及び組織損傷に近い部位でサイモシンβ４の局所濃度を高める機構を提供する。
【００１０】
フィブリノーゲンは、２個の同じサブユニットを含む化学ダイマーであり、それぞれは多くのジスルフィド結合によって共に保持される３個のポリペプチド鎖Ａα、Ｂβ及びγで構成される。６個全ての鎖のジスルフィドで結合されたＮＨ2−末端部分は中心Ｅ領域を形成する一方、ＣＯＯＨ−末端部分は２個の末端Ｄ領域及び２個のαＣ−ドメインを形成する。フィブリノーゲンのフィブリンへの変換の際に、トロンビンで媒介されるフィブリノーゲンからのＮＨ2−末端フィブリノペプチドＡ及びＢの除去及びフィブリノーゲンＡα及びＢβ鎖からのＮＨ2−末端フィブリノペプチドＡ及びＢの除去はそれぞれ、活性配列（重合部位）を露出させ、近接する分子のＥ及びＤ領域間の相互作用（ＤＤ：Ｅ相互作用）を可能にし、フィブリンポリマーを形成する。このポリマーは、フィブリンα鎖及びγ鎖のＣＯＯＨ−末端部分を介する因子ＸＩＩＩａによって、架橋される。隣接するＤ領域のγ鎖の分子間架橋が迅速に起こりγ−γダイマーを形成する一方、αポリマー（αＣ−ドメイン）間の架橋はより遅く起こり、αポリマーの形成を生じる。それに加えて、α鎖は、フィブロネクチン、α2−抗プラスミン、及びＰＡＩ−２のようなタンパク質のフィブリンに対する架橋に役立つ。従って、これらの鎖はさらにサイモシンβ４の架橋に関与するという仮説が立てられる。
【００１１】
サイモシンβ４がフィブリン（フィブリノーゲン）に組み込まれる機構を明確にするために、因子ＸＩＩＩａの存在下及び非存在下で、その相互作用をフィブリノーゲン、フィブリン及びそれらの組み換えフラグメント（ドメイン）を用いて研究した。この研究によりフィブリン（フィブリノーゲン）とサイモシンβ４との実質的な非共有相互作用は存在しないと考えられるが、因子ＸＩＩＩａはフィブリノーゲン及びフィブリンの両方に対してサイモシンβ４を効果的に架橋し、残基３９２〜６１０を含むそれらのαＣドメインのＣＯＯＨ−末端部分を主に介して架橋が起こることがわかった。
【００１２】
１つの実施形態によれば、接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むポリペプチド又はそれらの保存的変異型とを含む、実質的に精製された組成物を含む組成物が提供される。１つの実施形態によれば、上記接着剤は、ステントのような医療用デバイスに接着可能である。特に好ましい実施形態では、上記接着剤は、ヒトのような生存被検体の組織に接着可能である。
【００１３】
好ましい実施形態では、上記接着剤は生分解性の接着剤である。本明細書中で使用される場合、生分解性の接着剤との用語は、生体吸収性又は腐食可能な接着剤を包含すると意図される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は最初は流動体状態又は半流動体状態であり、最も好ましくは液体状態又は半液体状態である。特に好ましい実施形態では、適用後に、組織に接着しつつ、上記接着剤の粘度が上昇するか、少なくとも部分的に固化する。上記組成物は、層中の領域に、最も好ましくは噴霧又はブラシを用いて塗布されることによって導入されてもよい。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明において利用される接着剤は、フィブリンシーラントマトリックス（フィブリングルー）である。フィブリングルーは、フィブリノーゲン及びトロンビン／カルシウムの別個の溶液の２成分系である。２つの溶液が混合される場合、得られた混合物は、血餅形成カスケードの最終段階を模倣し、フィブリン血餅を形成する。フィブリノーゲン成分は、自己由来の、単一ドナーの、又はプールされた血液から即時に調製することできる。フィブリングルーは、商品名Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ（登録商標）、Ｔｉｓｓｅｌ（登録商標）、及びＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）としてヨーロッパにおいて入手可能である。フィブリングルーは、種々の解剖部位において組織を修復し、封鎖し、及び結合するために広範囲の外科手段において使用されてきた。
【００１５】
従って、本発明は、ＬＫＫＴＥＴポリペプチドを生存被検体の部位に送達する方法を提供する。好ましい実施形態では、この部位は表面である。本発明の方法は、本発明の組成物を部位に適用する工程を含む。好ましい実施形態では、この部位は、創傷、例えば、急性創傷又は慢性創傷である。
【００１６】
好ましい実施形態では、上記接着剤は、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブリングルー、コラーゲン、上述のいずれかのフラグメント、又は上述のいずれかの混合物である。使用されてもよいコラーゲン接着剤としては、１型、２型、３型、４型及び／又は５型のコラーゲンが挙げられる。他の接着剤は、アクチン又はインテグリン接着剤を含んでもよい。
【００１７】
他の実施形態では、本発明の組成物において利用される生分解性の接着剤は、ゲル（例えば、接着剤コラーゲンゲル）、ゲル／フィブリン混合物、粉末等である。
【００１８】
好ましい実施形態では、上記接着剤は、ＬＫＫＴＥＴペプチドに共有結合し、最も好ましくは因子ＸＩＩＩａによってＬＫＫＴＥＴペプチドに共有結合する。特に好ましい実施形態では、上記接着剤はフィブリン又はフィブリノーゲンのフラグメントである。
【００１９】
好ましい実施形態では、ＬＫＫＴＥＴポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ−末端変異型、Ｔβ４のＣ−末端変異型、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のスプライス変異型、酸化されたＴβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ球系Ｔβ４、ポリエチレングリコール付加Ｔβ４、又はアクチン結合ドメインを有する任意の他のアクチン重合抑制タンパク質もしくはアクチン結合タンパク質、又はアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むかもしくはアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴから本質的になるペプチドフラグメント又はそれらの保存的変異型を含む。国際出願番号
第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（参考として本明細書中に組み込まれる）は、本発明にしたがって有用であり得るＴβ４のアイソフォーム、ならびに本発明で利用され得るアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ及びそれらの保存的変異型を開示する。国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ９９／００８３３（ＷＯ９９／４９８８３）（本明細書中に参考として組み込まれる）は、本発明に従って利用され得る酸化されたサイモシンβ４を開示する。本発明は主として以下でＴβ４及びＴβ４アイソフォームに関して記載するけれども、以下の記載は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴＱ、ＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱを含むか又はこれらから本質的になるペプチド及びフラグメント、それらの保存的変異型、並びに酸化されたサイモシンβ４に等しく適用可能であると意図されることが理解される。
【００２０】
損傷した部位に接触させることの例としては、接着剤／Ｔβ４単独、又はＴβ４浸透を高めるか、又は処置される領域へのＴβ４ペプチドの放出を遅らせるか又はゆっくりにする少なくとも１つの薬剤と組み合わせた組成物と部位とを接触させることが挙げられる。被検体は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【００２１】
Ｔβ４、又はその類似体、アイソフォーム又は誘導体は、好適な有効量で投与されてもよい。例えば、Ｔβ４は、約０．１〜５０μｇの範囲内のＴβ４、さらに好ましくは約１〜２５μｇの範囲内の投薬量で投与されてもよい。
【００２２】
本発明に従う組成物は、投与１日あたり単回投与又は複数回投与で、毎日、１日ごと等、たとえば、投与１日あたり２回、３回、４回又はそれ以上の回数の適用で投与することができる。
【００２３】
Ｔβ４アイソフォームが同定され、Ｔβ４の既知のアミノ酸配列に対して約７０％、又は約７５％、又は約８０％又はそれ以上のホモロジーを有する。このようなアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４及びＴβ１５が挙げられる。Ｔβ４に類似して、Ｔβ１０及びＴβ１５アイソフォーム、ならびにＴβ４スプライス変異型は、アクチンを重合抑制することが知られている。Ｔβ４、Ｔβ１０及びＴβ１５、ならびにこれらの他のアイソフォームは、アクチン重合抑制又は結合の媒介に関与すると考えられる共通のアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを有している。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、Ｔβ４アイソフォームの活性は、部分的に、アクチンの重合化を制御する能力に起因する場合がある。β−サイモシンは、遊離のＧ−アクチンを重合抑制することによってＦ−アクチンを脱重合すると考えられる。それ故に、アクチン重合化を調整するＴβ４の能力は、ＬＫＫＴＥＴ配列を介してアクチンに結合又はアクチンを重合抑制する能力にすべて、又は部分的に起因する場合がある。従って、Ｔβ４を用いる場合と同様、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを有するＴβ４アイソフォームを含む、アクチンに結合もしくはアクチンを重合抑制する他のタンパク質又はアクチン重合化を調整する他のタンパク質は、本明細書中で記載されるように、単独で又はＴβ４との組み合わせて有効であると考えられる。
【００２４】
従って、既知のＴβ４アイソフォーム、例えば、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４及びＴβ１５、ならびにまだ同定されていないＴβ４アイソフォーム及びＴβ４スプライス変異型は、本発明の方法において有用であることが特に考えられる。そのようにして、このようなＴβ４アイソフォームは、被検体において実施される方法を含む、本発明の方法において有用である。それ故に、本発明はさらに、Ｔβ４、ならびにＴβ４アイソフォームＴβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４及びＴβ１５と、医薬的に受容可能なキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
それに加えて、アクチン重合抑制能力又は結合能力を有するか、あるいはアクチンを動
かし得るか又はアクチン重合化を調整し得る他のタンパク質は、適切な捕捉アッセイ、結合アッセイ、移動アッセイ又は重合化アッセイにおいて示されるか、又はアクチン結合を媒介するアミノ酸配列の存在、例えばＬＫＫＴＥＴの存在によって同定され、例えば、本発明の方法において同様に使用することができる。このようなタンパク質としては、例えば、ゲルソリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、アドセべルチン（ａｄｓｅｖｅｒｔｉｎ）、プロポミオシン（ｐｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）、フィンシリン（ｆｉｎｃｉｌｉｎ）、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニン及びアクメンチン（ａｃｕｍｅｎｔｉｎ）が挙げられる。被検体において実施される方法を含むこのような方法として、本発明はさらに、本明細書中に記載されるようなゲルソリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニン及びアクメンチンを含む医薬組成物を提供する。従って、本発明は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ（その一次アミノ酸配列内にあり得る）及びそれらの保存的変異型を含むポリペプチドの使用を含む。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「保存的変異型」またはそれらの文法的変化は、別の生物学的に類似の残基によってアミノ酸残基が交換されていることを示す。保存的変異型の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような疎水性残基を別の残基と交換すること、極性残基を別の残基と交換すること、例えば、アルギニンをリシンと置換すること、グルタミン酸をアスパラギン酸と置換すること、又はグルタミンをアスパラギンと置換すること等が挙げられる。
【００２７】
Ｔβ４は多くの組織及び細胞型に局在化しており、従って、Ｔβ４の産生を刺激する薬剤は、組織及び／又は細胞からのＴβ４産生に影響を与える組成物に添加されるか、又はそれらを含むことができる。このような薬剤としては、増殖因子のファミリーのメンバー、例えば、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、サイモシンα１（Ｔα１）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。さらに好ましくは、上記薬剤は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）又はＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーである。
【００２８】
さらに、治癒を助けるか又は刺激する薬剤を、Ｔβ４又はＴβ４アイソフォームとともに組成物に添加してもよい。このような薬剤としては、血管新生薬剤、増殖因子、細胞の分化に指向する薬剤が挙げられる。例えば、限定の目的ではないが、Ｔβ４又はＴβ４アイソフォームは、単独又は以下の薬剤の１つ以上と組み合わせて添加することができる：有効量のＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＬ−１、プロサイモシンα及びサイモシンα１１。
【００２９】
炎症、損傷及び変性を治癒又は防ぐ実際の投薬量、処方物又は組成物は、被検体の大きさ及び健康状態を含む多くの因子に依存する場合がある。しかし、当業者は、使用するための適切な投薬量を決定するために、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（上出）及び本明細書中に引用される参考文献に開示されるような臨床での投薬量を決定するための方法及び技術を記載する教示を使用するとができる。
【００３０】
好ましい実施形態では、ポリペプチドの濃度は、前記接着剤１モルあたり前記ポリペプチドが約０．０１〜１モルの範囲内、さらに好ましくは前記接着剤１モルあたり前記ポリペプチドが約０．１〜０．５モルの範囲内、最も好ましくは前記接着剤１モルあたり前記ポリペプチドが約０．２〜０．４モルの範囲内にある。
【００３１】
好適な処方物は、Ｔβ４又はＴβ４アイソフォームを約０．００１〜１０重量％の範囲
内の濃度で、約０．０１〜０．１重量％の範囲内の濃度で、又はさらには約０．０５重量％の濃度で含んでもよい。
【００３２】
本発明は、Ｔβ４ペプチド又はそれらの機能性フラグメントと相互作用する抗体の使用を含む。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、及び別個のモノクローナル抗体調製物から本質的になる抗体が提供される。モノクローナル抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（上出）に記載されるような当業者に周知の方法によってタンパク質のフラグメントを含有する抗原から製造される。本発明において使用されるような抗体との用語は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含むことを意味する。
【００３３】
なお別の実施形態では、本発明は、Ｔβ４遺伝子発現を調整する有効量の薬剤を投与することによって被検体を処置する方法を提供する。用語「調整する」は、Ｔβ４が過剰発現される場合、Ｔβ４発現の阻害又は抑制を意味し、Ｔβ４の発現が抑えられている場合には発現の誘発を意味する。用語「有効量」は、Ｔβ４遺伝子発現を調整して有効な処置を生じるのに有効なＴβ４薬剤の量を意味する。Ｔβ４又はＴβ４アイソフォーム遺伝子の発現を調整する薬剤は、例えばポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、アンチセンス、三重らせん物質、又はリボザイムであってもよい。例えば、Ｔβ４の構造遺伝子領域又はプロモーター領域に向けられたアンチセンスを使用してもよい。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、Ｔβ４活性を調整する化合物を使用するための方法を提供する。Ｔβ４活性に影響を与える化合物（例えば、アンタゴニスト及びアゴニスト）としては、ペプチド、ペプチドミメティック、ポリペプチド、化合物、亜鉛のような鉱物、及び生物学的薬剤が挙げられる。
【００３５】
いかなる特定の理論にも束縛されないが、本発明は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を誘発することによって、１つ以上の炎症性サイトカイン又はケモカインの濃度を下げ、内皮細胞に対する走化性因子として作用し、炎症又は損傷を治癒又は防ぐことを促進し、それによって傷害又は他の変性因子もしくは環境因子によってもたらされる組織の変性変化を治癒又は防ぐことを促進する場合がある。
【００３６】
本発明をさらに以下の実施例によって説明するが、これは限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００３７】
タンパク質及び試薬
プラスミノーゲン、フィブロネクチン及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が存在しないヒトフィブリノーゲンをＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から購入した。ヒトフィブリノーゲンαＣ−ドメインに対応する組み換えαＣ−フラグメント（残基Ａα２２１〜６１０）及びそのＮＨ2及びＣＯＯＨ−末端の半分に対応する切断された変異型（それぞれ残基Ａα２２１〜３９１及びＡα３９２〜６１０）をｐＥＴ２０ｂ発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生した。ヒトフィブリノーゲンγ鎖の残基１４８〜４１１を含む組み換えγ−モジュールを、同じ発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生した。
【００３８】
ウシトロンビン（１，０００ＮＩＨｕ／ｍｇ）、アプロチニン（４．４ＴＩＵ／ｍｇ）、抗ウサギＩｇＧ−セイヨウワサビ接合体及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をＳｉｇｍａから購入した。組み換え因子ＸＩＩＩは、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）による寄贈として提供された。合成サイモシンβ４は、Ｒｅｇｅｎｅｒｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ，ＭＤ）による寄贈として提供された。抗−サイモシンβ４血清を、公開された方法に従って調製した。
【００３９】
因子ＸＩＩＩの活性化
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ＴＢＳ）、ｐＨ８．０中の因子ＸＩＩＩを、トロンビン又はＣａＣｌ2のいずれかを用いて活性化し；後者はフィブリノーゲンを潜在的に活性化し得るトロンビンの存在を避けるために行われた。トロンビンで活性化されたＦＦＸＩＩＩ［ＦＸＩＩＩａ（ＴＨｒ）］を、最終濃度が２５ＮＩＨｕ／ｍｌ及び２．５ ＣａＣｌ2ｍＭになるまでウシトロンビンを添加することによって製造した。Ｃａ2+−活性化トロンビン［ＦＸＩＩＩａ（Ｃａ）］を、最終濃度５０ｍＭになるまでＣａＣｌ2を添加することによって製造した。両混合物中のＦＸＩＩＩの最終濃度は１．５ｍｇ／ｍｌであった；両混合物を実験前に１０分間室温でインキュベートした。
【００４０】
ＦＩＴＣを用いたサイモシンβ４の標識化
蛍光標識されたサイモシンβ４を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）との反応によって調製した。サイモシンβ４をＮＡＰ５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でゲルろ過することによって０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ９．５に移した後、１．２モル過剰のＦＩＴＣを添加し、暗所で３７℃で２時間混合物をインキュベートした。未反応のＦＩＴＣをＮＡＰ５カラムで除去した。標識化度を記載のように光学的に決定し、サイモシンβ４ １モルあたりＦＩＴＣ ０．９モルであることがわかった。
【００４１】
固相結合アッセイ
ＦＸＩＩＩａの存在下又は非存在下での、サイモシンβ４とフィブリン（フィブリノーゲン）及びそのフラグメントとの相互作用を、プラスチックマイクロリットルプレートを用いてＥＬＩＳＡによって試験した。マイクロリットルプレートのウェルを、全て０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８．３中で、フィブリノーゲン及びフィブリン１０μｇ／ｍＬ又は組み換えフラグメント２０μｇ／ｍｌで−４℃で一晩コーティングした。１０μｇ／ｍＬフィブリノーゲン、１ＮＩＨ ｕ／ｍｌトロンビン及び４００ｕ／ｍｌアプロチニンを含有する混合物のウェルに添加した後、＋４℃で一晩インキュベートすることによってフィブリンを製造した。次いで、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて３７℃で１時間インキュベートすることによってウェルをブロックした。その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、指示濃度のサイモシンβ４、ＦＸＩＩＩ、ＦＸＩＩＩａ（Ｔｈｒ）及びＦＸＩＩＩａ（Ｃａ）をウェルに添加し、３７℃で２〜２．５時間インキュベートした。ウサギ抗−サイモシンβ４血清及びペルオキシダーゼ結合抗−ウサギＩｇＧを用いた反応によって、結合した（組み込まれた）サイモシンβ４を検出した。ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｓｅをウェルに添加し、組み込まれたサイモシンβ４を４５０ｎｍで分光学的に測定した。
【００４２】
フィブリノーゲン及びフィブリンへのサイモシンβ４の組み込み
フィブリノーゲン及びフィブリンへのＦＩＴＣ−標識されたサイモシンβ４及び標識されていないサイモシンβ４の組み込み反応を、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む１００μＬ
ＴＢＳ中のフィブリノーゲン３ｍｇ／ｍＬ（９μＭ）及びサイモシンβ４又はＦＩＴＣ標識されたサイモシンβ４ １５０μｇ／Ｌ（３０Ｍ）の混合物を含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で行った。ＦＸＩＩＩａ（Ｃａ）又はＦＸＩＩＩａ（Ｔｈｒ）を最終濃度が３０μｇ／ｍＬになるように添加することによって反応を開始させた。ＦＸＩＩＩａ（Ｔｈｒ）を含有する混合物中のトロンビンの最終濃度を、視覚的に観察されるフィブリン血餅が迅速に形成するのに十分な濃度の２．５ＮＩＨ ｕ／ｍＬにした。ＦＩＴＣ−標識化サイモシンβ４との反応を暗所で３７℃で４時間続け、沸騰水中で５分間酵素を熱失活させ
るによって停止させ、その間にフィブリノーゲン及びフィブリンが変性し、沈殿した。ペレットを遠心分離し、ＴＢＳで３回洗浄し、次いで可溶化させた。可溶化ペレット中のフィブリン（フィブリノーゲン）及びＦＩＴＣ−標識化サイモシンβ４の量を、それぞれモル吸収係数Ｅ280,1%＝１５．０及びε495＝７２，０００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて分光学的に決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる分析のために標識化されていないサイモシンβ４を用いてサンプルを調製するために、反応混合物を上述のように指示時間で熱失活させ、ＳＤＳ及び還元剤を含有するサンプルバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって可溶化した。
【００４３】
速度論的分析
異なるフィブリン（フィブリノーゲン）フラグメントへのサイモシンβ４の組み込みの速度論を分析するために、マイクロリットルプレート（上に記載されるもの、但し全てのフラグメントの濃度は２０μｇ／ｍＬ）のウェルに固定化し、トロンビンで活性化された因子ＸＩＩＩａ １０μｇ／Ｌの存在下で、種々の濃度のサイモシンβ４を用いてインキュベートした。インキュベーション混合物を、最終濃度１０ｍＭになるまでヨードアセトアミドを添加することによってインキュベーション１時間の間に１５分ごとに阻害し、各時点での組み込まれたサイモシンβ４をウサギ抗−サイモシンβ４血清を用いて上述のように検出した。異なる濃度のサイモシンβ４での組み込み反応の初期速度（Ｖ）を反応時間経過プロットの勾配から決定し、タンジェントα：＝Ａ450／ｔ（分）（ここで、Ａ450は組み込まれたサイモシンβ４の量に比例する、光学単位（ｏ．ｕ．）での４５０ｎｍでの吸光度を表す）として表した。見かけ上のＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数ＫmをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ− Ｂｕｒｋプロット１／Ｖ（分／ｏ．ｕ．） 対 １／［Ｓ］（μＭ-1）（ここで［Ｓ］はサイモシンβ４の濃度である）から得た。
【００４４】
ウエスタンブロット分析
フィブリン（フィブリノーゲン）及びそのフラグメント内に組み込まれたサイモシンβ４の検出を以下のように行った。上述のように調製されたサンプルを電気泳動させ、上に記載したようにニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気的に移動させた。膜をカゼインブロッカーで１時間ブロックし、サイモシンβ４をウサギ抗−サイモシンβ４血清及びペルオキシダーゼ結合抗−ウサギＩｇＧを用いた反応によって検出した。スーパーシグナルウェストピコケミルネッセント基質を用いて製造業者によって推奨される手順によって、ペルオキシダーゼ標識されたタンパク質バンドの視覚化を行った。
【００４５】
ＥＬＩＳＡで検出されるフィブリノーゲン及びフィブリンへのサイモシンβ４の組み込み
因子ＸＩＩＩａがフィブリン（フィブリノーゲン）に対するサイモシンβ４の架橋を媒介し得ることを試験するために、及びこのような架橋の機構を明らかにするために、本願発明者らは組み換え因子ＸＩＩＩの存在下及び非存在下での、サイモシンβ４とフィブリノーゲン及びフィブリンとの相互作用の直接研究を行った。因子ＸＩＩＩの血小板形態と対応する血漿因子ＸＩＩＩとは対照的に、組み換え因子は、２つのサブユニット（ａ2）を含むことが注記されるべきである。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ実験において、サイモシンβ４ １５０μｇ／ｍＬ（３０μｍ）を固定化フィブリノーゲンとともにインキュベートしたが、因子ＸＩＩＩの非存在下及び非活性化因子ＸＩＩＩ存在下では低いシグナルのみが検出され、このことは、それらとの相互作用はあったとしても非常に低いことを示唆している。非活性化因子ＸＩＩＩａの非存在下又は存在下でサイモシンβ４を固定化フィブリンとともにインキュベートした場合、これはＣａＣｌ2の添加によって活性化されウェル中でフィブリノーゲンがフィブリンに変換するのを防ぎ、シグナルはかなり増加し、このことは、因子ＸＩＩＩａがサイモシンβ４のフィブリノーゲンへの結合（組み込み）を媒介することを示唆する。同様の状況が固定化フ
ィブリンを用いて観察されたが、組み込みの濃度はフィブリノーゲンへの組み込みの濃度よりも高かった。両方の場合における組み込みは用量依存であった。フィブリンに対する組み込みは、因子ＸＩＩＩがＣａ2+の代わりにトロンビンで活性化された場合、さらに増加した。このような違いは、これらの２つの因子ＸＩＩＩａ種の異なる特定の活性に起因し得る。これらの結果は、活性化ＸＩＩＩが組織トランスグルタミナーゼと同様に、フィブリノーゲンおよびフィブリンの両方へのサイモシンβ４の組み込みを媒介することを示す。これらのことは、サイモシンβ４とフィブリノーゲン及びフィブリンの両方との顕著な非共有的相互作用は存在しないことも示唆する。
【００４７】
フィブリノーゲン及びフィブリンへのサイモシンβ４の組み込みのさらなる分析
因子ＸＩＩＩａで媒介されるフィブリン（フィブリノーゲン）へのサイモシンβ４の組み込みをさらに特徴決定するために、免疫ブロッティングによって、トロンビン、因子ＸＩＩＩ、サイモシンβ４及びフィブリンの混合物を異なる時点で分析した。分析のための混合物及びサンプルを実験手順において記載されるように調製した。サンプルをニトロセルロース膜に電気的に移動させ、抗−サイモシンβ４血清を用いてプローブした。免疫ブロッティングの結果は、因子ＸＩＩＩａが組織トランスグルタミナーゼと同様にフィブリンにサイモシンβ４を共有結合的に組み込ませ、組み込まれた（架橋した）サイモシンβ４の量は４時間後に飽和に達するようであることを示す。この時間を組み込み度を評価するために選択した。この目的のために、サイモシンβ４をフィブリノーゲン／サイモシンβ４混合物及びフィブリン／サイモシンβ４混合物において直接測定が可能なＦＩＴＣ発色基で標識化した。このような改変は、ウエスタンブロット分析によって評価された組み込みパターンに基づいて、フィブリノーゲン又はフィブリンのいずれかへの組み込みに影響を与えなかった。上記と同様の混合物であるがＦＩＴＣ標識化されたサイモシンβ４を含む混合物を４時間インキュベートし、その後に組み込み度を分光学的に決定されたフィブリン（フィブリノーゲン）の量及び各サンプル中の組み込まれたＦＩＴＣ−サイモシンβ４の量に基づいて概算した。この結果から、生理学的濃度のフィブリノーゲン（９μＭ）を含む選択された条件下で、因子ＸＩＩＩａがかなりの量のＦＩＴＣ−サイモシンβ４、フィブリノーゲン及びフィブリン１モルあたりそれぞれ約０．２及び０．４モルを組み込むことがわかった。
【００４８】
個々のフィブリン（フィブリノーゲン）鎖へのサイモシンβ４の組み込み
３つのフィブリン（フィブリノーゲン）鎖がサイモシンβ４との架橋に関与することを確立するために、本願発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、サイモシンβ４の存在下及び非存在下でのフィブリノーゲン及びフィブリンの因子ＸＩＩＩａ媒介性架橋の経時変化を分析した。フィブリン因子において、ＸＩＩＩａがγ鎖のＣＯＯＨ−末端部分を迅速に架橋してγ−γダイマーを生成し、α鎖の架橋によってα−αダイマー、トリマー、及びα−ポリマーを精製し；フィブリノーゲンは、同様の様式で架橋されるが速度が遅いことはよく知られている。還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される場合、フィブリノーゲン及びフィブリン、Ａα、Ｂβ、γ及びα、β、γそれぞれの個々のポリペプチド鎖に対応するバンドは十分に分離されていた。因子ＸＩＩＩａを用いたフィブリノーゲンのインキュベーションにより、γ−γダイマー及びＡα−Ａαダイマー及びトリマーに対応するバンドの欠失が進み；おそらくＡαポリマーに対応するいくつかの物質の出現が開始時にも観察された。フィブリノーゲンをサイモシンβ４の存在下で因子ＸＩＩＩａを用いてインキュベートする場合、個々の鎖及びそれらの架橋された変異型に対応するバンドの強度における実質的な違いは見られなかった。同様の結果が得られたが、フィブリンでは、α鎖及びγ鎖の架橋は予想されるようにさらに迅速に生じ、開始時の物質の量もさらに高かった。さらなるウエスタンブロット実験により、インキュベーション３０分後に、かなりの量のサイモシンβ４がフィブリノーゲンＡα鎖に組み込まれ、インキュベーション１５０分後に、いくらかのサイモシンβ４もＡα−Ａαダイマーに組み込まれていることがわかった。フィブリンα鎖及びそれらのα−αダイマ
ーへのサイモシンβ４の組み込みは非常に迅速に起こり、インキュベーション１５０分後に、サイモシンβ４の物質はα鎖のさらにより高い分子量の形態（α−ポリマー）中でも観察された。これらの結果は、フィブリノーゲンＡα及びフィブリンα鎖はサイモシンβ４の共有的組み込みにおいて主要な部位を含有することを示す。同時に、γ−γダイマー及びα−αダイマーの間の移動性を有する低い強度のバンドのインキュベーション１５０分後の外観は、サイモシンβ４がさらにフィブリンγ鎖（γ−γダイマー）に組み込まれることを示唆する。あるいは、このバンドは、α−αダイマーのタンパク分解的に切断された的変異型に対応する場合がある。
【００４９】
組み換えフィブリン（フィブリノーゲン）フラグメントへのサイモシンβ４の組み込み
αＣドメイン及びγ−モジュールを形成するフィブリノーゲンＡα及びγ鎖のＣＯＯＨ−末端タンパク質は、フィブリン中の因子ＸＩＩＩａによって架橋される反応性Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基を含有することが十分に確立されており、それ故に、サイモシンβ４との架橋に潜在的に関与し得る。このことを試験し、フィブリン（フィブリノーゲン）中のサイモシンβ４のための架橋部位をさらに局在化させるために、組み換えγ−モジュール（残基γ１４８〜４１１）及びαＣ−ドメイン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって、Ａα２２１〜３９１及びＡα３９２〜６１０サブフラグメント）へのサイモシンβ４の組み込みを分析した。サイモシンβ４の存在下での因子ＸＩＩＩａを用いたαＣ−ドメイン及びγ−モジュールのインキュベーションによって効果的な架橋が生じ、それらのより高い分子量形態、ダイマー、トリマー及びオリゴマーの概観を表す。同時に、主にそれぞれアクセプターＧｌｎ及びドナーＬｙｓ残基を含有するＡα２２１〜３９１及びＡα３９２〜６１０サブフラグメントの架橋は、ほとんど有効ではなかった。サンプルをニトロセルロース膜に電気的に移動し、抗−サイモシンβ４血清でプローブした場合、かなりの量のサイモシンβ４がαＣ−ドメイン、γ−モジュール及びそれらのさらに高い分子量変異型、ダイマー、トリマー及びオリゴマー中に検出された。Ａα３９２〜６１０サブフラグメントモノマー及びオリゴマーへの組み込みはさらにかなりの量である一方、非常に少量のサイモシンβ４のみがＡα２２１〜３９１オリゴマー中で検出された。これらの結果は、サイモシンβ４がαＣ−ドメイン及びγ−モジュールの両方に架橋され得、前者のＡα３９２〜６１０領域の反応性Ｌｙｓ残基が架橋に含まれることが示唆された。
【００５０】
上の観察をＥＬＩＳＡによって確認した。サイモシンβ４が固定されたγ−モジュール又が因子ＸＩＩＩａの存在下でαＣ−ドメイン変異型を用いてインキュベートされた場合、γ−モジュール内に効果的に組み込まれ、αＣ−ドメイン及びＡα３９２〜６１０サブフラグメント内に効果的に組み込まれる一方、Ａα２２１〜３９１への組み込みは非常に低かった。γ−モジュールの組み込みが、試験される全ての濃度でαＣ−ドメイン変異型の組み込みよりもほぼ２倍低いことが注記されるべきである。非活性化因子ＸＩＩＩ存在下で又は非存在下でサイモシンβ４が同じ固定された種を用いてインキュベートされた場合、全ての場合において組み込みが非常に低かった。このことは、フィブリノーゲン及びフィブリンの場合におけるように、サイモシンβ４と組み換えフラグメントとの間の顕著な非共有性相互作用が存在しないことを示唆する。
【００５１】
フィブリンのγ鎖の因子ＸＩＩＩａ架橋が見かけ上Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ挙動を示すことは以前に示された。固定化されたγ−モジュール及びαＣ−ドメイン変異型に対してサイモシンβ４を架橋する場合、因子ＸＩＩＩａがＭｉｃｈａｅｌｉｓ酵素として挙動するという推定から、このような架橋の速度論的パラメータを決定し得た。速度論的データの分析により、組み込み反応について、見かけ上のＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数（Ｋm）の以下の値、サイモシンβ４のγ−モジュールへの組み込みについて１８３±２９μＭ、及びαＣ−ドメイン及びそのＡα３９２〜６１０サブフラグメントへの組み込みについてそれぞれ１７．６±２．５μＭ及び８．６±３．７μＭがわかった。αＣ−ドメイン及びそのサブ
フラグメントについての値よりもγ−モジュールについてのＫm値がかなり高いことは、αＣ−ドメイン変異型に対するサイモシンβ４の架橋が非常に効率的であることを示す。この関係において、Ａα３９２〜６１０フラグメントについてのＫmは、因子ＸＩＩＩａで媒介されるγ−γ架橋について以前に決定されたＫm＝６．２μＭに匹敵する。αＣ−ドメイン及びＡα３９２〜６１０サブフラグメントについてのＫm値における２倍の差は、サイモシンβ４及びＡα３９２〜６１０領域の反応性Ｇｌｎ残基の間の競合、すなわち、αＣ−対−αＣ及びサイモシンβ４−対−αＣ架橋の間の競合によって説明され得た。これと一致して、αＣ−ドメイン及びＡα３９６２〜６１０サブフラグメントについての二重逆数プロットは、拮抗阻害の特徴的なパターンを示す。
【００５２】
けれども、この結果は、因子ＸＩＩＩａが、残基Ａα３９６２〜６１０を含む単離されたαＣ−ドメインのＣＯＯＨ−末端部分に対してサイモシンβ４を効果的に架橋すること、単離されたγ−モジュールへの組み込みは効果的ではないこと、およびフィブリノーゲン又はフィブリンにおいて、組み込みは主にαＣ−ドメインで起こることを示した。
【００５３】
フィブリン（フィブリノーゲン）は、生理学的に活性なタンパク質と細胞レセプターとの間の相互作用を介して創傷治癒において重要な役割を果たす。特に、フィブリンマトリックスは炎症性応答及び内皮細胞による毛細管形成（血管新生）を刺激し、これは、それぞれ白血球インテグリンＭａｃ−１及び内皮細胞レセプターＶＥ−カドヘリンとの相互作用を介する、創傷治癒プロセスにおいて必須の工程である。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と高いアフィニティーを有して相互作用し、フィブリン分解の部位での血管新生及び創傷治癒に対するそれらの貢献のこれらの強力な刺激剤の共局在化を提供する。フィブリンはさらに、インスリン様増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＰＢ−３）でも保持可能であり、ＩＧＦ−１と複合体を形成する。サイモシンβ4（強力な血管新生及び創傷治癒因子）はさらに、組織トランスグルタミナーゼによってフィブリンへと組み込むことができ、フィブリンマトリックスの創傷治癒能力を明らかにさらに高める。
【００５４】
全てのトランスグルタミナーゼは同じ反応を触媒するけれども、共有結合性γ−グルタミル−ε−リシルイソペプチド結合が反応性Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基の間に形成され、基質に対するそれらの特異性は異なっていてもよい。例えば、因子ＸＩＩＩａ（血漿トランスグルタミナーゼ）がフィブリンにおいてγ鎖及びα鎖に特異的に架橋し、γ−γダイマー及びα−ポリマーをそれぞれ生じ、組織トランスグルタミナーゼは特異的でなく、またα−γ鎖架橋を生じ得る。セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）ＰＡＩ−２についてのフィブリン（フィブリノーゲン）に対する架橋パターンはさらに、組織トランスグルタミナーゼ及び因子ＸＩＩＩａについて異なっていることもわかった。サイモシンβ4がテンジクネズミ肝臓組織トランスグルタミナーゼによってフィブリンに組み込まれることが最初に示され；因子ＸＩＩＩａによるフィブリンへのその組み込みは、トロンビンで活性化された血小板が因子ＸＩＩＩ及びサイモシンβ4を共に放出し、後者がフィブリンに対して架橋するという事実に基づいて仮説が立てられた。この試験において、サイモシンβ4がフィブリノーゲンおよびフィブリンの両方に対して因子ＸＩＩＩａによって組み込まれることが直接的に示された。さらに、組み込み度がそれぞれ高く、フィブリノーゲン及びフィブリン１モルあたりサイモシンβ4が０．２及び０．４モルであることがわかった。血漿中のフィブリノーゲンの濃度が約９μＭであるため、フィブリン分解の位置でのフィブリンの局所的濃度は、かなり高くあるべきである。サイモシンβ4が０．１ｎＭ〜１μＭで血管新生前の活性を示すことを考慮すると、組み込み度は明らかに生理学的に有意であり、フィブリン血餅の創傷治癒能力を高めるのに十分であるべきである。
【００５５】
因子ＸＩＩＩａがフィブリン内に多くの血漿タンパク質、α2−抗プラスミン、ＰＡＩ−２、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子
を組み込むことが知られている。組み込みの機構は、それらのいくつかについてのみ確立されている。例えば、フィブロネクチンは、因子ＸＩＩＩａと共有結合的に架橋する前に、高いアフィニティーを有して非共有結合的にフィブリンαＣ−ドメインに結合し；各タンパク質中の認識部位及び反応性Ｇｌｎ及びＬｙｓ残基は、異なる領域に位置しており、架橋部位の適切な配向を与える。それに加えて、因子ＸＩＩＩａは、αＣ−ドメインと相互作用し、反応の特異性をさらに高める。サイモシンβ4の非共有性結合がフィブリンに対する架橋に優先するか否かを試験するために、その相互作用を非活性化因子ＸＩＩＩの存在下及び非存在下で、固定化されたフィブリノーゲン及びフィブリンを用いて試験した。フィブリンに対する高い親和性を示すｂＦＧＦ及びＶＥＧＦのような他の血管新生前因子とは対照的に、注目すべき非共有性相互作用は、全てのケースにおいてサイモシンβ4を用いて観察されなかった。組み込みは活性化因子ＸＩＩＩａの存在下でのみ観察され、このことは、共有性架橋がフィブリン血餅におけるサイモシンβ4を保持する唯一の機構であり得ることを示唆する。
【００５６】
この結果は、サイモシンβ4が因子ＸＩＩＩａによって単離されたγ−モジュール及びαＣ−ドメイン変異型に組み込まれ得るけれども、フィブリン（フィブリノーゲン）において、αＣ−ドメイン、つまりそれらのＡα３９２〜６１０領域に主に架橋することを明らかに示す。サイモシンβ4及びフィブリン（フィブリノーゲン）において同定された反応性Ｌｙｓ及びＧｌｎ残基の分布の分析は、この発見について合理的な説明を提供する。サイモシンβ４は、反応性アミンドナーであるＬｙｓ３８、ならびに２つのアミンレセプターであるＧｌｎ２３及びＧｌｎ３６を含有し、これらは他のタンパク質との架橋反応に関与し得る。分子間γ−γ架橋に関与するγ鎖において２つの反応性残基Ｇｌｎ３９８（又はＧｌｎ３９９）及びＬｙｓ４０６のみが存在し、両者はγ−モジュール中に位置する。単離されたγ−モジュールが因子ＸＩＩＩａで処理される場合、架橋はランダムに起こりダイマー、トリマー／オリゴマーを形成すると思われ；サイモシンβ4は全てのこれらの種に組み込まれていた。フィブリンにおいて、これらの領域は、１つの鎖のＧｌｎ３９８／３９９及び別の鎖のＬｙｓ４０６の間の架橋を容易にする逆平行様式でＤＤ：Ｅ相互作用によって整列し、γ−γダイマーを形成する。この架橋反応の効率は、これらの残基とサイモシンβ4との架橋反応の効率よりも非常に高く、それ故に、サイモシンβ4がフィブリンγ鎖へほとんど組み込まれないか又は全く組み込まれないことが本試験において観察されたことは驚くべきことではない。
【００５７】
γ鎖とは対照的に、Ａα鎖は複数の反応性グルタミン及びリシン残基を含有する。以下の残基は、フィブリン又は組み換えαＣ−ドメイン、Ｇｌｎ２２１、２３７、３２８及び３６６、ならびにＬｙｓ５０８、５３９、５５６、５８０及び６０１中のα鎖間の架橋に関与することがわかった。Ａα鎖Ｌｙｓ３０３は、因子ＸＩＩＩａで媒介されるセルピンα2−抗プラスミンのフィブリン（フィブリノーゲン）に対する架橋におけるアミンドナーとして作用することが示された。このＬｙｓは別のセルピン、組織トランスグルタミナーゼ及び因子ＸＩＩＩａによって他のＡα鎖リシン残基、１４８、１７６、１８３、２３０、４１３及び４５７を介して架橋するＰＡＩ−２に対して反応性ではない。α2−抗プラスミンの架橋領域を模倣する合成ペプチドを用いた試験により、１２の反応性リシン残基、Ｌｙｓ４１８、４４８、５０８、５３９、５５６及び５８０を介してフィブリンα鎖に組み込まれ、これは全活性の７８％を占め、Ｌｙｓ２０８、Ｌｙｓ２１９及び／又は２２４、Ｌｙｓ４２７、４２９、６０１及び６０６は反応性がほとんどないことが明らかである。フィブリン（フィブリノーゲン）Ａα３６８〜６１０領域内の少なくとも１０のリシン残基は、フィブロネクチンとの架橋反応にかかわる。上記分析により、フィブリン中の同定された反応性残基のほとんどがαＣ−ドメイン中に位置し、サイモシンβ4が優先的に架橋するαＣ−ドメインの３９２〜６１０領域が、少なくとも１１の反応性Ｌｙｓ残基を含有し、これらの残基の中で半分のみがα−α架橋において利用されることがわかった。サイモシンβ4がα−α架橋に関与する反応性リシン残基について競合するけれども
、αＣ−ドメインに対する架橋が独立してそれらの分子間α−α架橋を有して生じ、フィブリン内に効率よく組み込まれることも示唆される。従って、αＣ−ドメインの反応性リシン残基はα−α架橋に役立つだけでなく、同時に、創傷治癒及び他の生理学的プロセス及び病態プロセスに関与するフィブリンマトリックスの性質を調整し得る、サイモシンβ4を含む生理学的に活性なタンパク質を収容する。
【００５８】
フィブリノーゲンは、制御可能な様式で重合し、異なる細胞に容易に接着し、非免疫性で生分解性の血餅を生成する。これらは、出血の阻止のための止血剤として、ならびに組織封鎖及び創傷治癒を助けるために、多くの外科適用においてますます使用されている理想的な止血及び生体接着剤（フィブリンシーラント）になる。創傷治癒及び他の治療におけるフィブリンシーラントの使用は、生体活性薬剤を含むことによって高めることができる。例えば、細胞モデル及び動物モデルにおいて、フィブリンが抗生物質及び増殖因子の局在化送達のためのビヒクルとして役立ち得ることが示された。フィブリンに包接された抗生物質は低い溶解性に起因してゆっくりと放出されるが、フィブリンシーラント中の増殖因子の保持は、フィブリンとの高いアフィニティー相互作用を介してか、又は直接的な共有性架橋を介して達成された。サイモシンβ4が因子ＸＩＩＩａを用いた架橋によってフィブリン（フィブリノーゲン）に組み込まれる能力は、サイモシンβ4のフィブリンシーラント上への固定化のために使用可能であった。この試験は、フィブリノーゲン及びフィブリンの両方へのこのような組み込みの高い効力を示し、このアプローチを支持する。
【００５９】
まとめると、実験的研究は、生体活性ペプチドであるサイモシンβ4が、因子ＸＩＩＩａを用いて共有的に架橋することによってフィブリンに組み込まれ得ることを確認し、このことは成分の生理学的濃度でフィブリノーゲン及びフィブリンの両方への組み込みの高い効率を示し、フィブリン（フィブリノーゲン）αＣ−ドメインのＡα３９２〜６１０領域内の組み込み部位を局在化させることを示した。実験データは、創傷治癒の場所に対して送達するための、生理学的に顕著な量のサイモシンβ4のフィブリンシーラントへの組み込みを支持する。
【００６０】
組織トランスグルタミナーゼ及び推定血漿トランスグルタミナーゼ、因子ＸＩＩＩａは、フィブリン（フィブリノーゲン）に生理学的に活性なペプチドであるサイモシンβ4を共有的に組み込むことができる。この組み込みの機構を明らかにするために、サイモシンβ4とフィブリノーゲン、フィブリン、及びそれらの組み換えフラグメント、γ−モジュール（γ鎖残基１４８〜４１１）、ならびにαＣ−ドメイン（Ａα鎖残基２２１〜６１０）及びその切断された変異型を用いて免疫ブロット及びＥＬＩＳＡによって相互作用を試験した。それらの間の顕著な非共有性相互作用は、活性化因子ＸＩＩＩの非存在下では検出されなかったが、サイモシンβ４の存在下では、フィブリン及びより低い程度でフィブリノーゲンに効果的に組み込まれた。フィブリン（フィブリノーゲン）及び因子ＸＩＩＩの生理学的濃度での組み込みは、フィブリノーゲン及びフィブリンに対するサイモシンβ4のモル組み込み比がそれぞれ０．２及び０．４で有意であった。さらなる実験から、活性化因子ＸＩＩＩは単離されたγ−モジュール及びαＣ−ドメインにサイモシンβ4を組み込むが、フィブリンにおいて、後者は主要な組み込み部位として働くことがわかった。この部位はさらに、残基３９２〜６１０を含むαＣ−ドメインのＣＯＯＨ−末端部分に局在化していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むポリペプチド又はそれらの保存的変異とを含む、実質的に精製された組成物を含む組成物。
【請求項２】
前記接着剤が、生存被検体の組織に接着可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記接着剤が生分解性である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記接着剤が、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブリングルー、コラーゲン、それらのフラグメント、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記接着剤及び前記ポリペプチドが共に共有結合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記接着剤及び前記ポリペプチドが因子ＸＩＩＩａによって共有結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記接着剤がフィブリン又はフィブリノーゲンのフラグメントである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ−末端変異型、Ｔβ４のＣ−末端変異型、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のスプライス変異型、酸化されたＴβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ球系Ｔβ４又はポリエチレングリコール付加Ｔβ４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが組み換え又は合成である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドの濃度が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．０１〜１モルの範囲内にある、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．１〜０．５モルである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．２〜０．４モルである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物を部位に導入する工程を含む、ポリペプチドを部位に送達する方法。
【請求項１６】
前記組成物が噴霧によって前記部位に適用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記部位が創傷である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記接着剤が、生存被検体の組織に接着可能である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記接着剤が生分解性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記接着剤が、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブリングルー、コラーゲン、それらのフラグメント、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記接着剤が前記ポリペプチドに共有結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接着剤が因子ＸＩＩＩａによって前記ポリペプチドに共有結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接着剤がフィブリン又はフィブリノーゲンのフラグメントである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ−末端変異型、Ｔβ４のＣ−末端変異型、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のスプライス変異型、酸化されたＴβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ球系Ｔβ４又はポリエチレングリコール付加Ｔβ４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが組み換え又は合成である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．１〜１モルの範囲内の濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．１〜０．５モルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．２〜０．４モルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
接着剤と、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを含むポリペプチド又はそれらの保存的変異とを含む、実質的に精製された組成物を含む組成物。
【請求項２】
前記接着剤が、生存被検体の組織に接着可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記接着剤が生分解性である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記接着剤が、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブリングルー、コラーゲン、それらのフラグメント、又はそれらの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記接着剤及び前記ポリペプチドが共に共有結合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記接着剤及び前記ポリペプチドが因子ＸＩＩＩａによって共有結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記接着剤がフィブリン又はフィブリノーゲンのフラグメントである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ−末端変異型、Ｔβ４のＣ−末端変異型、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のスプライス変異型、酸化されたＴβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ球系Ｔβ４又はポリエチレングリコール付加Ｔβ４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが組み換え又は合成である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドの濃度が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．０１〜１モルの範囲内にある、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．１〜０．５モルである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．２〜０．４モルである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物を部位に導入する工程を含む、ポリペプチドを部位に送達する方法。
【請求項１６】
前記組成物が噴霧によって前記部位に適用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記部位が創傷である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記接着剤が、生存被検体の組織に接着可能である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記接着剤が生分解性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記接着剤が、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブリングルー、コラーゲン、それらのフラグメント、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記接着剤が前記ポリペプチドに共有結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接着剤が因子ＸＩＩＩａによって前記ポリペプチドに共有結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接着剤がフィブリン又はフィブリノーゲンのフラグメントである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ又はＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ−末端変異型、Ｔβ４のＣ−末端変異型、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のスプライス変異型、酸化されたＴβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ球系Ｔβ４又はポリエチレングリコール付加Ｔβ４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが組み換え又は合成である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．１〜１モルの範囲内の濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．１〜０．５モルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記範囲が、前記接着剤１モルあたり、前記ポリペプチドが約０．２〜０．４モルである、請求項２９に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２５４４５（Ｐ２００７−５２５４４５Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９４４６（Ｐ２００６−５０９４４６）
【出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９６１４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１５５０
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０３３３４７６９）リジェナークス・バイオファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９６１４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１５５０
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０３３３４７６９）リジェナークス・バイオファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
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