サルビアノール酸Ｂを有効成分とする神経幹細胞増殖剤
【課題】 神経幹細胞増殖剤、当該増殖剤による神経幹細胞増殖方法、当該方法により増殖した神経幹細胞の含有液、当該神経幹細胞含有液または当該増殖剤を有効成分とする神経疾病治療剤を提供すること。
【解決手段】 サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物に神経幹細胞増殖作用を見つけ、この作用を適用して、これら化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、当該増殖剤による神経幹細胞増殖方法、当該方法による神経幹細胞の含有液、当該含有液を有効成分とする神経疾病治療剤および当該増殖剤を有効成分とし、神経幹細胞増殖作用の機序による神経疾病治療剤を開発した。
【解決手段】 サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物に神経幹細胞増殖作用を見つけ、この作用を適用して、これら化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、当該増殖剤による神経幹細胞増殖方法、当該方法による神経幹細胞の含有液、当該含有液を有効成分とする神経疾病治療剤および当該増殖剤を有効成分とし、神経幹細胞増殖作用の機序による神経疾病治療剤を開発した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）サルビアノール酸B（英語名：Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ・Ａｃｉｄ・Ｂ、中国名：丹フン酸Ｂ又は丹フン酸乙、なお、フンに該当する中国字は酉偏に分と書くが、日本の漢字には無い）等を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、（２）当該神経幹細胞増殖剤を，要すれば賦活化後，体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法、（３）当該神経幹細胞増殖方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液、（４）血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、別名：繊維芽細胞増殖因子２：ＦＧＦ２）および神経成長因子（ＮＧＦ）を含まない当該神経幹細胞含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤、（５）当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする当該疾病の治療剤、（６）サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）に記載する神経幹細胞増殖剤と（２）に記載する神経幹細胞増殖方法と（３）に記載する神経幹細胞含有液と（４）と（５）に記載する治療剤を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経疾病、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性症、交通性水頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射、多発性硬化症、正常圧水頭症、パーキンソン病、ピック病、進行性多巣性白質脳症、進行性核上麻痺、拳闘家痴呆、脳外傷、外科手術、脳腫瘍、慢性硬膜下血腫、脳卒中（脳梗塞または脳出血）、脳血管性痴呆、ウィルソン病細菌性心内膜炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、HIV関連疾病、神経梅毒、結核性および真菌性髄膜炎、ウイルス性脳炎、無酸素症、B１２欠乏症、慢性的な薬物-アルコール-栄養性乱用、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、低血糖、甲状腺機能低下症、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の臓器系不全、ペラグラ等は繊維化、免疫反応、血管傷害、栄養と酸素欠乏、感染等により、神経細胞が退化、減少、細胞死し、または傷害、除外されることにより、組織や臓器がその機能を失い発症すると考えられている。したがって、これらの疾病を治療の１つの方法として失われた神経細胞を何らかの方法で補充するか再生することが考えられ、その効果が多数報告されている。
【０００３】
例えば、パーキンソン病は黒質線条体のドパミン作動性神経の退化に起因するが、後期有糸分裂ドパミン作動性神経に富んだヒト胎児性中脳組織の脳内移植により病状が改善されたという報告がある（非特許文献１−７）。しかし、この間、移植に伴う拒絶反応を避けるため、免疫抑制剤を使用している（非特許文献８）。
【０００４】
脳梗塞は中枢神経系に重大な虚血をもたらし、神経やグリア細胞を退化させる。脳梗塞部位にヒトエヌティ２（ＮＴ‐２）奇形癌細胞由来の神経を移植したところ、改善が見られたという報告がある（非特許文献９）。移植細胞が神経細胞になったことを移植細胞に神経マーカーが出現したことにより確認したという報告もある（非特許文献１０）。
【０００５】
これら補充すべき神経細胞の供給源として、ＥＳ細胞、神経幹細胞または骨髄間質細胞が注目される。ＥＳ細胞は種々の細胞に分化しうる細胞だからである。神経幹細胞は未分化の細胞であり、神経細胞が死滅すると、その失われた細胞を補うように自然に分化を始め、生体機能の維持に大きく貢献する可能性があるからである。骨髄間質細胞はすでにある程度分化しているので、自然には神経細胞に分化しないが、最近、種々の生体因子または化合物処理により人工的に神経細胞に分化しうる（特許文献１−２、非特許文献１１−１５）ことが明らかになったからである。
【０００６】
しかし、補充すべき神経細胞の供給源として注目されるＥＳ細胞は胚性幹細胞であり、ヒトの胚を原料に用いるという倫理性の問題と移植抗原性の問題を有する。一方、神経幹細胞の場合も内在性の神経幹細胞は神経に分化する（非特許文献１６）が、内在性の神経幹細胞の数は極わずかで、脳梗塞等により退化する細胞を充分に補充することはできない（非特許文献１７）。外部からの入手は胎児由来の神経幹細胞しか困難であり、胎児由来の神経幹細胞は倫理性の問題と移植抗原性の問題を有する。骨髄間質細胞は自分自身の骨髄から充分量を採取可能であるから、他人の細胞を用いるという倫理性の問題と移植抗原性の問題はない。しかし、骨髄間質細胞は自然には神経細胞に分化しない細胞である。したがって、内在性の神経幹細胞を増殖する方法が開発されるなどして、自家の神経幹細胞が供給源として使えるようになれば、その方がより望ましい。したがって、内在性の神経幹細胞を増殖する方法の開発が強く望まれる。
【０００７】
胎児性および成人性神経幹細胞は既に齧歯類の中枢神経系から（胎児性：非特許文献１８、成人性：非特許文献１９−２０）のみならず、ヒトの中枢神経系から（胎児性：非特許文献２１−２２、成人性：非特許文献２３−２４）から分離されている。神経幹細胞は神経、アストロサイト、オリゴデントロサイトに分化し、興奮性神経シナプスと抑制性神経シナプスに分化し（非特許文献２５−２６）、活性の神経系ネットワークを形成する（非特許文献２７）という。
【０００８】
近年、機能を失った組織に対して、神経幹細胞を移植し、個々の生体機能を発現する細胞へ特異的に分化させることにより、当該病態を改善・治療する試みが行われている。例えば、パーキンソン病に関し、神経幹細胞を線条体内部へ移植すると、細胞が生き残り臨床効果を得る（非特許文献２８）、神経幹細胞移植によりパーキンソン病の作動性システムのシナプスおよび末端機能が保持される（非特許文献２９）、１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン起因パーキンソン病のマウスの脳に神経幹細胞を移植すると生き残り、機能性のあるドパミン作動性神経になる（非特許文献３０）という報告がある。また、脳梗塞の場合は、神経幹細胞の移植により脳梗塞の改善が見られという（非特許文献３１）。多くの神経幹細胞の脳内移植データー（前述の非特許文献３１と非特許文献３２−３５）は神経幹細胞の移植または増殖により、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病が治療できることを示唆している。最大の課題は移植可能な質と量の神経幹細胞を生産する方法を確立することまたは脳内で内在する神経細胞を増殖することが可能な低毒性の神経幹細胞増殖剤を開発することである。
【０００９】
最近、ラットの脳動脈を一時的に止めて脳虚血にして海馬の神経細胞に傷害を与えた後に、ＮＧＦを注入すると、失われた神経細胞の4割が回復したという報告がある（非特許文献３６）。この環境で、ＮＧＦが神経幹細胞を増殖させることを示唆している。研究としては素晴らしいが、ＮＧＦというタンパク質を臨床的に脳内に注入することは可能な限り避けた方がよい。したがって、このＮＧＦ等生物学的因子の代わりになる低分子化合物の探索が望まれる。
【００１０】
非神経細胞や神経幹細胞を神経細胞に分化させる低分子はすでに報告されている（前述の特許文献２と非特許文献３７）。骨髄間質細胞等非神経細胞を神経疾病の神経細胞の補充の供給源として用いる目的のためには、神経細胞への分化剤は重要である。しかし、神経細胞に分化した細胞は増殖しないので、神経幹細胞を神経疾病の神経細胞の補充の供給源として用いる目的のためには、神経幹細胞の神経への分化剤よりは神経幹細胞を神経に分化させないで、神経幹細胞のまま増殖させる神経幹細胞増殖剤がより重要である。神経幹細胞分化剤は神経幹細胞を増殖させた後に要すれば考慮すべき問題である。
【００１１】
一方、サルビアノール酸Bはシソ科の植物の１種である丹参（学名：Ｌａｂｉａｔａｅ・Ｓａｌｖｉａ・ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ・Ｂｕｎｇｅ）の水溶性成分の一つ（非特許文献３８）であり、高速ティ・エル・シ（ＨＰＴＬＣ）（非特許文献３９）、樹脂カラムのアルコール展開（特許文献３）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（非特許文献４０）または高速カウンター・カレント・クロマトグラフィー（非特許文献４１）、カラムクロマトグラフィー（特許文献４）等により分離される。分子量７１８、分子式Ｃ３６Ｈ３０Ｏ１６で、その平面構造式は非特許文献４２に示され、その立体構造式は図１で表される（非特許文献４３）。山東省天然薬物工程技術研究中心の曲桂武らによれば、水溶液中のサルビアノール酸Bは高温で不安定で、摂氏８０度で72時間加温すると３５％変化し、チオ硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ヒドロ亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ＥＤＴＡ２ナトリウム塩を添加しても一部変化するという。ビタミンＣを添加した時のみ摂氏８０度で72時間加温してもサルビアノール酸Bは安定であるいう（非特許文献４４）。
【００１２】
サルビアノール酸Bは非常に強い抗酸化作用（非特許文献４５）、脂肪過酸化阻止作用、脱水酸化ラジカル作用（非特許文献４６）を有する。この抗過酸化作用に基づき、以下の生理作用を有する。すなわち、四塩化炭素またはジ・メチルニトサミンによる肝臓の繊維化予防作用（非特許文献４７−４８）、脳虚血による記憶喪失の予防作用（非特許文献４９）、アテロム性動脈硬化症縮小作用（非特許文献５０）、抗虚血作用（非特許文献５１）、心臓血管系に対する保護作用（非特許文献５２）、抗ウイルス作用（特許文献５−７）、虚血による脳障害の予防作用（非特許文献５３）、子牛大動脈内皮細胞の血管内皮細胞成長因子（VEGF）により誘導される高透過性の阻止作用（非特許文献５４）、アミロイド・ベーターたんぱく質の凝集阻止作用と繊維化形成阻止作用（前述の非特許文献４２）、新生細胞のアポトーシス誘導作用（非特許文献５５）、肝星細胞増殖阻止作用とコラーゲン産生阻止作用とトランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）ベーター１・有糸分裂活性化タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰＲ）系のシグナルトランスダクション阻止作用（非特許文献５６）、神経退化に関与する前立腺アポトーシス反応４（Ｐａｒ‐４）関与によるアミロイド・ベーターたんぱく質の凝集阻止作用（非特許文献５７）、コレスタン・３ベーター・５アルファー・６ベータートリオールによるヒトへそ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）傷害の緩和作用（非特許文献５８）、酸化低密度リポたんぱく質による心臓血管系炎症障害の治療作用（特許文献８−９）を有する。また、サルビアノール酸Bとサポニンの混合物が心臓血管疾病および脳血管疾病部位を縮小させ（特許文献１０）、サルビアノール酸Bとリソスペルミン酸（英語名：Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ・ａｃｉｄ）の混合物がアテローマ動脈硬化症または動脈再狭窄症に有効である（特許文献１１−１２）。サルビアノール酸Bの構成成分がリパーゼ阻害作用を有する（特許文献１３）。
【００１３】
要約すると、サルビアノール酸Bは非常に強い抗過酸化作用を有し、この抗過酸化作用により、心臓血管系や脳神経系や肝臓細胞での過酸化による細胞死予防作用と抗ウイルス作用を有する。また、サルビアノール酸Bは新生細胞のアポトーシスを誘導することにより、アテローマ動脈硬化症等の血管内皮細胞の増殖を阻害する。つまり、サルビアノール酸Bの基本作用は抗過酸化作用、抗ウイルス作用ならびに新生細胞のアポトーシス誘導作用である。したがって、脳梗塞に起因する虚血による脳神経細胞の予防やウイルス性脳炎の予防および脳神経細胞の補充ないし増殖を要しない極初期の脳神経疾病の治療の可能性は考えられる。しかし、サルビアノール酸Bの効果は抗過酸化作用や抗ウイルス作用によるので、当該疾病の治療はできても、神経幹細胞を増殖させて、すでに脳神経細胞の退化または減少してしまったことに起因する脳神経疾病を治療することはできないと思われた。サルビアノール酸Bは新生細胞のアポトーシスを誘導し、細胞増殖を阻害するので、神経幹細胞の増殖には、むしろ不利に働くと思われた。実際、サルビアノール酸B関連化合物のアセチルサルビアノール酸Ａは抗血栓作用を有するので、その作用により脳梗塞予防に有益な効果があるであろうと推定し（非特許文献５９）、サルビアノール酸Ａは、その抗酸化作用により過酸化による肝細胞障害を予防し（非特許文献６０）、繊維芽細胞の増殖を阻害し（非特許文献６１）、神経幹細胞の生存率を上昇させるが、神経幹細胞の増殖を促進させないことが確認されている（非特許文献６２）。
なお、最近神経幹細胞の分離、増殖、分化に関し、多くの特許が出願され、公開されている（特許文献１４−７２）。いずれも、生物学的因子を用いる方法である。低分子の神経幹細胞増殖剤としてはベンゼン環縮合５員複素環式化合物（特許文献７３）、または薬用人参中のサポニン類等、例えば、ギンセノシドＲｇ１（英語名：Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｇ１）（特許文献７４および前述の非特許文献６２）が報告されているに過ぎない。また、サルビアノール酸Bの抽出もとの丹参の薬効に関する特許も多いが、その多くは丹参の主薬効から類推可能な血管系に関する薬効である。痴呆薬に関する特許公開公報が存在するが、丹参の他、種々の生薬の配合剤に関する特許出願である（特許文献７５）。これらの特許文献から本発明は予見できない。
【００１４】
以下に先行文献を特許文献と非特許文献に分けて表示する。
【特許文献１】特表２００２−５１３５４５号公報
【特許文献２】特開２００４−９１３４４号公報
【特許文献３】米国特許２００１年６，２９９，９１０号公報
【特許文献４】中国特許２００３年１４２５６５９号公報
【特許文献５】カナダ特許１９９９年２３３５９５６号公報
【特許文献６】カナダ特許２０００年２３７６９２２号公報
【特許文献７】米国特許２０００年６，０４３，２７６号公報
【特許文献８】カナダ特許２００３年２４５９４０６号公報
【特許文献９】米国特許２００３年２００３０８６９８７号公報
【特許文献１０】中国特許２００３年１４２５４３０号公報
【特許文献１１】米国特許２００２年２００２１９７２７４号公報
【特許文献１２】国開ＷＯ２００２年０２０８５３９８号国際公報
【特許文献１３】欧州特許２００３年１３７１３６８号公報
【特許文献１４】特開２００４−２３６６０７号公報
【特許文献１５】特開２００４−２２９５２３号公報
【特許文献１６】特開２００４−１６６６０４号公報
【特許文献１７】特開２００４−１２９５６１号公報
【特許文献１８】特開２００３−３２５１６７号公報
【特許文献１９】特開２００３−１８９８４７号公報
【特許文献２０】特開２００３−１２５７５９号公報
【特許文献２１】特開２００３−０８１９５９号公報
【特許文献２２】特開２００２−３４８２３９号公報
【特許文献２３】特開２００２−２９１４６９号公報
【特許文献２４】特開２００２−２８１９６２号公報
【特許文献２５】特開２００２−０５１７７５号公報
【特許文献２６】特開２００２−０３４５８０号公報
【特許文献２７】特開２００１−３１６２８５号公報
【特許文献２８】特開２００１−２９２７６８号公報
【特許文献２９】特開２００１−１８６８２９号公報
【特許文献３０】特表２００４−５２３２１６号公報
【特許文献３１】特表２００４−５２２４１４号公報
【特許文献３２】特表２００４−５１７６２０号公報
【特許文献３３】特表２００４−５００１０３号公報
【特許文献３４】特表２００３−５２５０３４号公報
【特許文献３５】特表２００３−５２３１６６号公報
【特許文献３６】特表２００３−５２１４７４号公報
【特許文献３７】特表２００３−５１６１４１号公報
【特許文献３８】特表２００３−５１４５６５号公報
【特許文献３９】特表２００３−５１４５５０号公報
【特許文献４０】特表２００３−５１２３３３号公報
【特許文献４１】特表２００３−５１１３５２号公報
【特許文献４２】特表２００３−５０７３４９号公報
【特許文献４３】特表２００３−５０５０２３号公報
【特許文献４４】特表２００２−５４４２３５号公報
【特許文献４５】特表２００２−５３７８０２号公報
【特許文献４６】特表２００２−５３６９９１号公報
【特許文献４７】特表２００２−５３６０２３号公報
【特許文献４８】特表２００２−５３０３５１号公報
【特許文献４９】特表２００２−５３００６８号公報
【特許文献５０】特表２００２−５２６１０４号公報
【特許文献５１】特表２００２−５２６０６５号公報
【特許文献５２】特表２００２−５１８９９０号公報
【特許文献５３】特表２００２−５１８０４３号公報
【特許文献５４】特表２００２−５１７９８２号公報
【特許文献５５】特表２００２−５１２８４２号公報
【特許文献５６】特表２００２−５０８６６６号公報
【特許文献５７】特表２００２−５００８７９号公報
【特許文献５８】特表２００１−５２０８７８号公報
【特許文献５９】特表２００１−５１８２８９号公報
【特許文献６０】特表２００１−５１１７８８号公報
【特許文献６１】特表２００１−５１１４５６号公報
【特許文献６２】特表２００１−５０４１２３号公報
【特許文献６３】特表平１０−５０９５９２号公報
【特許文献６４】特表平１０−５０９３１９号公報
【特許文献６５】特表平１０−５０５７５４号公報
【特許文献６６】特表平０９−５００００４号公報
【特許文献６７】特表平０８−５０５７６２号公報
【特許文献６８】特表平０８−５０２６５２号公報
【特許文献６９】特表平０８−５０２１７２号公報
【特許文献７０】特表平０８−５００２４５号公報
【特許文献７１】国開ＷＯ０２／０５８１１号国際公報
【特許文献７２】国開ＷＯ０１／８８１００号国際公報
【特許文献７３】特開２００３−０８１９５９号公報
【特許文献７４】特開２００１−１３９４８３号公報
【特許文献７５】特開平６−５６６８４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９５年３３２巻１１１８頁
【非特許文献２】Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９６年３７０巻２０３頁
【非特許文献３】Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．、１９９８年１３巻３８３頁
【非特許文献４】Ｐ．Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９９９年２巻１１３７頁
【非特許文献５】Ｐ．Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒａｌ．、２０００年４８巻６８９頁
【非特許文献６】Ｏ．Ｌｉｎｄｖａｉｌら、Ｐｒｏｇ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．、２０００年１２７巻２９９頁
【非特許文献７】Ｓ．Ｐｏｌｇａｒら、ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｂｕｌｌ．、２００３年６０巻１頁
【非特許文献８】Ｃ．Ｗ．Ｃｌａｎｏｗら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００３年５４巻４０３頁
【非特許文献９】Ｄ．Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００年５５巻５６５頁
【非特許文献１０】Ｐ．Ｔ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００２年１６０巻１２０１頁
【非特許文献１１】Ｍ．Ｄｅｚａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００１年１４巻１７７１頁
【非特許文献１２】Ｗ．Ｄｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１年２８２巻１４８頁
【非特許文献１３】Ｄ．Ｗｏｏｄｂｕｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、２０００年６１巻３６３頁
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００年１６４巻２４７頁
【非特許文献１５】Ｊ．Ｋｏｈｙｙａｍａら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、２００１年６８巻２３５頁
【非特許文献１６】Ｊ．Ｍ．Ｐａｔｅｎｔら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００２年５２巻８０２頁
【非特許文献１７】Ａ．Ａｒｖｉｄｓｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００２年８巻９６３頁
【非特許文献１８】Ｋ．Ｋ．Ｊｏｈｅら、Ｇｅｎｅｓ・Ｄｅｖ．、１９９６年１０巻３１２９頁
【非特許文献１９】Ａ．Ｇｒｉｔｔｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９６年１６巻１０９１頁
【非特許文献２０】Ｔ．Ｄ．Ｐａｌｍｅｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９７年８巻３８９頁
【非特許文献２１】Ｏ．Ｂｒｕｓｔｌｅら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９８年１６巻１０４０頁
【非特許文献２２】Ｃ．Ｎ．Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、Ｂｒａｉｎ・Ｐａｔｈｏｌ．、１９９９年９巻４９９頁
【非特許文献２３】Ｖ．Ｇ．Ｋｕｋｅｋｐｖら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９９年１５６巻３３３頁
【非特許文献２４】Ａ．Ｆ．Ｐａｇａｎｏら、Ｓｔｅｍ・ｃｅｌｌｓ、２０００年１８巻２９５頁
【非特許文献２５】Ｃ．Ｖｉｃａｒｉｏ‐Ａｂｅｊｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年１２巻６７７頁
【非特許文献２６】Ｈ．Ｔｏｄａら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００年１６５巻６６頁
【非特許文献２７】Ｓ．Ｋ．Ｍｉｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００２年９９巻１６２１頁
【非特許文献２８】Ｐ．Ｈａｇｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００１年６０巻７４１頁
【非特許文献２９】Ｏ．Ｉｓａｃｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００３年５３巻ｓ１３５頁
【非特許文献３０】Ｘ．Ｌｉら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ、２００３年２４巻１１９２頁
【非特許文献３１】Ｔ．Ｖｅｉｚｏｖｉｃら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００１年３２巻１０１２頁
【非特許文献３２】Ｆ．Ｈ．Ｇｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９５年９２巻１１８７９頁
【非特許文献３３】Ｔ．Ｑｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９５年９２巻１１８７９頁
【非特許文献３４】Ａ．Ｅ．Ｒｏｓｓｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年１２巻２４０５頁
【非特許文献３５】Ｊ．Ｗ．Ｍｃｄｏｎａｌｄら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９９年５巻１４１０頁
【非特許文献３６】Ｈ．Ｎａｋａｔｏｍｉら、Ｃｅｌｌ、２００２年１１０巻４２９頁
【非特許文献３７】Ｓ．Ｄｉｎｇら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００３年１００巻７６３２頁
【非特許文献３８】Ｚ．Ｘ．Ｃｈｅｎら、Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８１年１６巻２４頁
【非特許文献３９】Ｊ．Ｌｉら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍ．Ｓｉｎ．、１９９３年２８巻５４３頁
【非特許文献４０】Ｑ．Ｗ．Ｚｈａｎｇら、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ・Ｚｈｏｎｇ・Ｙａｏ・Ｚａ・Ｚｈｉ、２００１年２６巻８４８頁
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【非特許文献４３】Ｉｖｙ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ・Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ番号ＮＥ０１‐００４
【非特許文献４４】曲桂武ら、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｄｃｅｎｔｅｒ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｔｏｎｇｘｕｎ／２／ｑｕｇｕｉｗｕ２．ｐｄｆ．
【非特許文献４５】Ｌ．Ｎ．Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９７年６巻５７頁
【非特許文献４６】Ｇ．Ｈ．Ｄｕら、Ｂａｓｉｃ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｃｌｉｎ．、２０００年２０巻１０頁
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【非特許文献５２】Ｌ．Ｙ．Ｍａら、Ｃｈｉｎ．Ｔｒａｄｉｔ．Ｈｅｒｂ・Ｄｒｕｇｓ、１９９９年３０巻３９１頁
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【非特許文献５６】Ｐ．Ｌｉｕら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２００２年２３巻７３３頁
【非特許文献５７】Ｍ．Ｔａｎｇら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００２年８８巻４２２頁
【非特許文献５８】Ｄ．Ｒｅｎら、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．、２００３年１１６巻６３０頁
【非特許文献５９】Ｊ．Ｃ．Ｄｏｎｇら、Ｙａｏ・Ｘｕｅ・Ｘｕｅ・Ｂａｏ、１９９６年３１巻６頁
【非特許文献６０】Ｙ．Ｙ．Ｈｕら、Ｗｏｒｌｄ・Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０００年６巻４０２頁
【非特許文献６１】Ｃ．Ｈ．Ｌｉｕら、Ｗｏｒｌｄ・Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０００年６巻３６１頁
【非特許文献６２】Ｌ．Ｈ．Ｓｈｅｎら、Ｙａｏ・Ｘｕｅ・Ｘｕｅ・Ｂａｏ、２００３年３８巻７３５頁
【非特許文献６３】Ｇ．Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１９９３年３５巻５６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、（１）サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、（２）当該神経幹細胞増殖剤を、要すれば賦活化後、体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法、（３）当該神経幹細胞増殖方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液、（４）血清、ｂＦＧＦおよびＮＧＦを含まない当該神経幹細胞含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤、（５）当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする当該疾病の治療剤、（６）サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）に記載する神経幹細胞増殖剤と（２）に記載する神経幹細胞増殖方法と（３）に記載する神経幹細胞含有液と（４）と（５）に記載する治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、神経幹細胞を血清、ｂＦＧＦおよびＮＧＦで処理することなく増殖させる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を種々探索した結果、驚くべきことに、サルビアノール酸Ａと異なり、サルビアノール酸Ｂに、公知の抗過酸化作用、抗ウイルス、新生細胞アポトーシス誘導作用とは全く異なる、神経幹細胞を増殖させる作用があることを見出し、さらに種々研究した結果、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、（１）サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、（２）前記化合物が、サルビアノール酸Bおよびそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする（１）に記載する神経幹細胞増殖剤、（３）前記化合物が、サルビアノール酸Bおよび薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする（２）に記載する神経幹細胞増殖剤、（４）当該神経幹細胞増殖剤を、要すれば賦活化後、体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法、（５）血清、ｂＦＧＦおよびＮＧＦを含まない細胞培養液を用いることを特徴とする（４）に記載する神経幹細胞増殖方法、（６）（４）または（５）に記載する神経幹細胞増殖方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液、（７）（５）に記載する方法で増殖することを特徴とする当該神経幹細胞の含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤、（８）当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする当該疾病の治療剤、（９）サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）、（２）または（３）に記載する神経幹細胞増殖剤と（４）または（５）に記載する神経幹細胞増殖方法と（６）に記載する神経幹細胞含有液と（７）記載する神経幹細胞含有液含有治療剤または（８）に記載する神経幹細胞増殖作用機序による治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の神経幹細胞増殖剤は、（１）体外での神経幹細胞の増殖剤として有用であり、（２）後述の神経幹細胞増殖方法においてその方法を特徴付ける薬剤として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液の液質を特徴付ける薬剤として有用であり、（４）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の性質を特徴付ける薬剤として有用であり、（５）後述の当該神経幹細胞増殖作用機序による療剤の有効成分としても有用である。本発明の神経幹細胞増殖方法は、（１）体外での神経幹細胞の増殖方法として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液の生産方法として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の生産方法またはその一工程として有用である。本発明の神経幹細胞含有液は、（１）神経幹細胞の供給源として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の有効成分として有用である。本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤と神経幹細胞増殖剤を含有し、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の２剤は神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤として有用である。本発明のサルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）、（２）または（３）に記載する神経幹細胞増殖剤と（４）または（５）に記載する神経幹細胞増殖方法と（６）に記載する神経幹細胞含有液と（７）記載する神経幹細胞含有液含有治療剤または（８）に記載する神経幹細胞増殖作用機序による治療剤は各々前述の有用性の上に、より安定性に優れているという性質を有し、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の１つは新しい神経幹細胞増殖剤である。本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分はサルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物である。サルビアノール酸Bの光学または幾何異性体の中で、サルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有しないものは、本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることはできない。これに対し、サルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するサルビアノール酸Bの光学または幾何異性体は本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることができる。しかし、サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものの中でサルビアノール酸Bに関するデーターが一番蓄積されているので、サルビアノール酸Bおよびそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物がより望ましく、サルビアノール酸Bおよび薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物が更により望ましい。
【００２０】
最も望ましい有効成分の１つであるサルビアノール酸Bは、目下、シソ科の植物の１種である丹参（Ｌａｂｉａｔａｅ・Ｓａｌｖｉａ・ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ・Ｂｕｎｇｅ）から分離精製される。しかし、丹参以外のサルビアノール酸B含有植物があれば、その植物から分離してもよく、合成が可能な場合は合成品でもよい。現在サルビアノール酸Bは中国（景天生物工程有限公司）と米国（Ｉｖｙ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ・Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）等で市販されている。サルビアノール酸Bの構造式から多くの光学または幾何異性体の存在が想定される。サルビアノール酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、イソサルビアノール酸B等がすでに分離されている。前述したように、これらのうち、サルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞を増殖させる作用を有しないものは本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることが出来ないが、サルビアノール酸Bと同様に神経幹細胞を増殖させる作用を有するものは本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることが出来る。
【００２１】
サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するもののプロドラッグは加水分解等分解を受けてサルビアノール酸Bまたはその光学または幾何異性体に成るものであれば、薬学的に許容することのできる限り、どのようなものでもよい。当該プロドラッグの一つとしてサルビアノール酸B分子中のカルボキシル基でのメチルまたはエチルエステル誘導体やサルビアノール酸B分子中のフェノール基でのアセチル誘導体等が挙げられるが、それらに限らない。将来合成されるものでも差し支えない。
【００２２】
サルビアノール酸Bの塩およびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものの塩、およびそれらのプロドラッグの塩は薬学的に許容することのできる塩に限られる。薬学的に許容することのできる塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、トリエチルアミン、リジン、アルギニン等の有機アミンの塩、塩酸、臭化水素酸、硫酸等鉱酸との酸付加塩等が挙げられるが、それらに限らない。薬学的に許容することのできる塩であればよく、薬学的に許容することのできる限り、将来合成される有機化合物との塩でも差し支えない。
【００２３】
サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩の水和物も本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることができる。
【００２４】
本発明の神経幹細胞増殖剤または後述の当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病治療剤の有効成分は酸素および湿気のない状態では比較的安定である。しかし、抗酸化剤であるので、空中および水溶液中で比較的不安定である。特にプロドラッグ化していない有効成分は水溶液中80度72時間の加温で３５％変化する。保存する時は酸素や湿気の無い状態で保存することが望ましい。長期保存を考慮に入れると、本発明の神経幹細胞増殖剤または当該疾病治療剤には有効成分の安定のため、他の抗酸化剤を添加剤として添加することが望ましい。抗酸化剤としては薬学的に許容することのできる抗酸化剤に限られる。薬学的に許容することのできる抗酸化剤としては、アルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオン、エンゾジノール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は高温の水溶液中のサルビアノール酸Bの変化を抑える。亜硝酸塩はサルビアノール酸Bの変化を完全には抑えない。したがって、亜硝酸塩は、単独では安定剤としては不十分である。ビタミンＣはサルビアノール酸Bの変化を抑える。したがって、ビタミンＣはサルビアノール酸B等の安定剤として使用は可能であるが、ビタミンＣ自体が空中および水溶液中で比較的不安定であり、ビタミンＣを多量に添加するか他の抗酸化剤との併用が必要になる。
【００２５】
本発明の神経幹細胞増殖剤は、（１）体外での神経幹細胞の増殖剤として有用であり、（２）後述の神経幹細胞増殖方法においてその方法を特徴付ける薬剤として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液の液質を特徴付ける薬剤として有用であり、（４）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の性質を特徴付ける薬剤として有用であるばかりで無く、（５）体内の内在性の神経幹細胞をそのまま体内で増殖させることにも用いることが出来る。本発明の神経幹細胞増殖剤を、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病に対して投与した場合、内在する神経幹細胞を増殖させ、神経細胞に分化することにより、欠落した神経細胞の補充がされ、病状が改善されるので、本発明の神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の有効成分としても有用である。
【００２６】
本発明のもう１つは、新しい神経幹細胞増殖方法である。前述の本発明の神経幹細胞増殖剤を用い、体外で神経幹細胞を増殖することを特徴とする。本発明の神経幹細胞増殖剤を添加する以外は、例えば、２％の培養用サプルメントＮ２含有ダルベッコ修正イーグル最少必須培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭとF12を１：１で混合したもの）の無血清培養液等公知の培養液、５％炭酸ガス中、摂氏３７度で数日間培養等公知の培養条件を用いることができる。前述の先行文献には神経幹細胞増殖剤として、胎児性牛血清（ＦＢＳ）、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ等神経細胞等のたんぱく質性の生体因子を用いている。これらの血清または生体因子の代わりに、本発明の神経幹細胞増殖剤を用いるところに特徴がある。もちろん、目的によってはこれらの血清や生体因子を含有しても良いが、本発明の治療剤に用いる神経幹細胞含有液を作成する場合は、神経幹細胞を増殖する培養液にこれらを培養液に加えてはならない。血清や生体因子を添加せずに、本発明の神経幹細胞増殖剤を加えて培養することが肝要である。なお、本発明の神経幹細胞増殖剤としてプロドラッグを用いる場合には、プロドラッグによっては、培養中の細胞によりマスクが除かれ、活性体になるので、賦活化の必要が無い場合もあるが、プロドラッグによっては培養細胞により活性体にならない場合もある。したがって、要すれば、投与前に賦活化する必要がある。最後に基本培養液の１例として、培養用サプルメントＮ２、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地等の組成を示す。神経幹細胞が増殖する限り、組成は変更してもかまわない。また、細胞の分離や細胞の洗浄に用いる緩衝液の１例としてＤ‐ハンクス液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）等の組成を示す。後の操作に悪い影響を与えない限り、これ以外の緩衝液も用いることができる。
【００２７】
培養用サプルメント、培地、緩衝液の組成の例示
培養用サプルメントＮ２の組成（ミリグラム／リットル）：インスリン：５、ヒトトランスフェリン：１００、プロゲステロン：０．００６３、プトレッシン１６．１１、亜セレン酸塩：０．００５２．
ＤＭＥＭの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：２００、硝酸鉄（三価）９水和物：０．１、塩化カリウム：４００、硫酸マグネシウム：９７．６、塩化ナトリウム：６，４００、リン酸二水素ナトリウム２水和物：１２５、Ｌ‐アルギニン塩酸塩：８４、Ｌ‐シスチン２塩酸塩：６２．６、Ｌ‐グルタミン：５８４、Ｌ‐グリシン：３０、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩１水和物：４２、Ｌ‐イソロイシン：１０４．８、Ｌ‐ロイシン：１０４．８、Ｌ‐リジン塩酸：１４６．２、Ｌ‐メチオニン：３０、Ｌ‐フェニルアラニン：６６、Ｌ‐セリン：４２、Ｌ‐スレオニン：９５．２、Ｌ‐トリプトファン：１６、Ｌ‐チロシン二ナトリウム塩：８９．５、Ｌ‐バリン：９３．６、パントテン酸カルシウム：４、コリン酒石酸水素塩：７．２、葉酸：４、イノシトール：７．２、ニコチンアアミド：４、ピリドキサール塩酸塩：４、リボフラビン：０．４、チアミン塩酸塩：４、デキストロース：１，０００、ピルビン酸ナトリウム：１１０、フェノール・レッド：５。
培養用サプルメントＢ２７の成分（Ｂ２７の組成は開示されていないので、Ｂ２７そのものを使用する場合は市販品を購入せざるを得ないが、開示されている成分（非特許文献６３）より、似たような効果を有する培養用サプルメントは作ることは可能である）：ビオチン、Ｌ‐カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）ガラクトース、還元型グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン、レチニル酢酸、セレン、トリオド‐ｌ‐チロミン、ビタミンＥ、ビタミンＥ酢酸塩、ウシアルブミン、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、トランスフェリン。
ハムＦ１２培地の組成：塩化カルシウム：３３．３、硫酸銅（ニ価）５水和物：０．００２５、硫酸鉄（ニ価）７水和物：０．８３４、塩化カリウム：２２４、塩化マグネシウム：５７．１、塩化ナトリウム：７，６００、リン酸水素二ナトリウム：１４２、硫酸亜鉛７水和物、Ｌ‐アラニン：８．９、Ｌ‐アルギニン塩酸塩：２１１、Ｌ‐アスパラギン１水和物：１５．０、Ｌ‐アスパラギン酸：１３．３、Ｌ‐システイン塩酸塩１水和物：３５．１、Ｌ‐グルタミン酸：１４．７、Ｌ‐グルタミン：１４６、Ｌ‐グリシ：７．５、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩１水和物：２１．０、Ｌ‐イソロイシン：３．９４、Ｌ‐ロイシン：１３．１、Ｌ‐リジン塩酸塩：３６．５、Ｌ‐メチオニン：４．４８、Ｌ‐フェニルアラニン：４．９６、Ｌ‐プロリン：３４．５、Ｌ‐セリン：１０．５、Ｌ‐スレオニン：１１．９、Ｌ‐トリプトファ：２．０４、Ｌ‐チロシン：５．４４、Ｌ‐バリン：１１．７、ビオチン：０．００７３、パントテン酸カルシウム：０．４７７、塩化コリン：１４．０、シアノコバラミン：１．３５５、葉酸：１．３２４、イノシトール：１８．０、リポ酸：０．２０６、ニコチンアミド：０．０３６６、ピリドキシン塩酸塩：０．０６１７、リボフラビン：０．０３７６、チアミン塩酸塩：０．３３７、デキストロース：１，８０２、ヒポキサンチン：４．０８、リノレイン酸：０．０８４１、ピルビン酸ナトリウム：１１０、チミジン：０．７２７、プトレッシン２塩酸塩：０．６１、フェノール・レッド：１．２４２。
Ｄ‐ハンクス液の組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１８５．５、塩化カリウム：４００、リン酸二水素カリウム：６０、硫酸マグネシウム：９７．７、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：４７．５、Ｄ‐グルコース：１，０００。
ＰＢＳの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１３２．５、塩化カリウム：２００、リン酸二水素カリウム：２００、硫酸マグネシウム：５９．２、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：１１５０。
ＤＰＢＳの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１００、塩化カリウム：２００、リン酸二水素カリウム：２００、塩化マグネシウム：１００、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：１１５０。
ＲＰＭＩ１６４０の組成（ミリグラム／リットル）：硝酸カルシウム：６９．５、塩化カリウム：４００、硫酸マグネシウム：４８．８、塩化ナトリウム：６，０００、リン酸水素二ナトリウム：８０１、Ｌ‐アルギニン：２００、Ｌ‐アスパラギン１水和物：５６．８、Ｌ‐アスパラギン酸：２０、Ｌ‐システイン２塩酸塩：６５．２、Ｌ‐グルタミン酸：２０、Ｌ‐グルタミン：３００、Ｌ‐グリシ：１０、Ｌ‐ヒスチジン：１５、Ｌ‐ヒドロキシプロリン：２０、Ｌ‐イソロイシン：５０、Ｌ‐ロイシン：５０、Ｌ‐リジン塩酸塩：４０、Ｌ‐メチオニン：１５、Ｌ‐フェニルアラニン：１５、Ｌ‐プロリン：２０、Ｌ‐セリン：３０、Ｌ‐スレオニン：２０、Ｌ‐トリプトファ：５、Ｌ‐チロシン：２０、Ｌ‐バリン：２０、ｐ‐アモノ安息香酸：１、パラビオチン：０．２、パントテン酸カルシウム：０．２５、塩化コリン：３、シアノコバラミン：０．００５、葉酸：１、イノシトール：３５、ニコチンアミド：１、ピリドキシン塩酸塩：１、リボフラビン：０．２、チアミン塩酸塩：１、デキストロース：２，０００、還元型グルタチオン：１、フェノール・レッド：５。
２０倍ＳＳＣの組成（モル／リットル）：塩化ナトリウム：３、クエン酸ナトリウム：０．３。
本発明の神経幹細胞増殖方法は、（１）体外での神経幹細胞の増殖方法として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液の生産方法として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の生産方法またはその一工程として有用である。
【００２８】
本発明の更にもう1つは、体外で増殖した神経幹細胞の含有液である。神経幹細胞の増殖に本発明の神経幹細胞増殖方法を用いることを特徴とする。体外で増殖した神経幹細胞含有液は神経細胞培養液としてどのような培養液を用いたか、或いは神経幹細胞の増殖剤としてどのような神経細胞増殖剤を用いたかに異なる。例えば、神経細胞培養液として血清含有培養液を用いた場合、或いは神経細胞増殖剤としてｂＦＧＦやＮＧＦを加えて培養した場合は、増殖した神経幹細胞含有液に血清やｂＦＧＦやＮＧＦが混入する。本発明の神経幹細胞含有液には本発明の神経幹細胞増殖剤が混入している。移植免疫の問題があるので、血清やｂＦＧＦやＮＧＦ等が混入する神経幹細胞含有液は、次に説明する神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤に用いることはできない。公知の無血清の神経細胞培養液には血清は存在しないが、ｂＦＧＦやＮＧＦは一般には添加する。したがって、神経幹細胞含有液製造の最終工程ではこれらの因子を添加しないことが肝要である。培養用サプルメントＮ２中にたんぱく質としてインスリンとヒトトランスフェリンが存在する。インスリンまたはヒトトランスフェリン投与によりインスリン抗体やヒトトランスフェリン抗体が出現するものの、臨床上の抗原抗体反応としてはあまり問題にならない。もし、インスリンとヒトトランスフェリンの混入が問題になる場合は、本発明方法で培養した後に、培養液を捨て、インスリンとヒトトランスフェリンを除いたＮ２サプルメントと本発明の細胞幹細胞増殖剤を添加した細胞培養液で１日間培養することにより、混入するインスリンとヒトトランスフェリンを消化し尽くす方法を取ればよい。いずれにしろ、本発明の神経幹細胞含有液に本発明の神経幹細胞増殖剤が混入するが、本発明の神経幹細胞増殖剤はサルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を含有するが、これらは抗原性は無い。
本発明の神経幹細胞含有液は、（１）神経幹細胞の供給源として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の有効成分として有用である。
【００２９】
本発明の更にもう1つは、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤である。本発明の神経幹細胞含有液を含有することを特徴とする治療剤と、本発明の神経幹細胞増殖剤を含有し、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によりことを特徴とする治療剤と２種類存在する。本発明の治療剤を神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病患者に投与されると、神経幹細胞含有液含有治療剤の場合は、治療剤に含有される神経幹細胞含有液中の神経幹細胞が疾病により失われた神経細胞部位に移動し、そこで、神経細胞に分化し、失われた神経細胞が補充されることにより病状が改善され、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の場合は、その治療剤に含まれる神経幹細胞増殖剤が体内に内在する神経幹細胞の存在部位に浸透し、その内在神経幹細胞を増殖する。内在神経幹細胞は増殖しつつ、失われた神経細胞部位に移動し、そこで、神経細胞に分化し、失われた神経細胞が補充されることにより病状が改善される。後者の治療剤の方が前者の治療剤の方より患者に対する負担が少ないので、通常、先ず、後者を投与して有効かどうかを調べ、無効の場合に前者の神経幹細胞含有液含有治療剤を投与する方がよい。神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の例としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性症、交通性水頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射、多発性硬化症、正常圧水頭症、パーキンソン病、ピック病、進行性多巣性白質脳症、進行性核上麻痺、拳闘家痴呆、脳外傷、外科手術、脳腫瘍、慢性硬膜下血腫、脳卒中（脳梗塞または脳出血）、脳血管性痴呆、ウィルソン病細菌性心内膜炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、HIV関連疾病、神経梅毒、結核性および真菌性髄膜炎、ウイルス性脳炎、無酸素症、B１２欠乏症、慢性的な薬物-アルコール-栄養性乱用、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、低血糖、甲状腺機能低下症、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の臓器系不全、ペラグラ等の神経疾病、繊維化、免疫反応、血管傷害、栄養と酸素欠乏、感染等による神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病が挙げられるが、これに限らない。神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病であればよい。
【００３０】
本発明の神経幹細胞増殖剤または神経幹細胞増殖作用機序による治療剤は、有効成分が低分子であることから、体外投与は勿論、経口投与または非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、脳内、坐薬など）のいずれでも投与できる。体外投与の場合は本発明の組成物中にプロドラッグが含まれているときは、既に述べたが、適宜の方法で活性化してから用いた方がより大きな効果を得るので好ましい。プロドラッグが含まれていないときはそのまま用いてよい。体内投与の場合は多くの場合体内でプロドラッグが活性化するので、プロドラッグを予め活性化しておく必要は少ない。
【００３１】
経口用製剤を調製する場合、賦形剤、さらに必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性または水性の懸濁液剤などとする。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルーロスなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００３２】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン未、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものが使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが使用できる。これらの錠剤は、顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
【００３３】
注射剤を調製する場合、必要により、グルコースや生理的食塩水等の等調液、pH調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤などを添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内、脳内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用事調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、多投与量を同一の容器に収納してもよい。溶液の場合、酸素や湿気を遮断する方がよい。そのため、場合によってはアンプル型の容器に入れ、空気を抜くか、窒素ガス等で空気を置換しておく方がよい。公知の方法でよい。
【００３４】
本発明の神経幹細胞増殖剤の試薬としての使用濃度は通常０．００１から１００マイクロモル濃度、好ましくは、０．０１〜１０マイクロモル濃度で使用し、本発明の神経幹細胞増殖剤の医薬としての投与量または神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の投与量は、ヒトの場合、成人１日当たり通常０．０１〜１０００ミリグラム、好ましくは、０．１〜１００ミリグラムの範囲で、１日量を１日１回、あるいは２〜４回に分けて投与する。なお、年齢、症状により適宜増減する。
【００３５】
本発明の神経幹細胞増殖方法に用いる神経幹細胞の入手先は使用目的によって限定の度合いが異なるが、適合する限りどこから入手しても良い。使用目的がヒトを対象としない場合には限定が少ないが、神経幹細胞含有液含有治療剤に用いる神経幹細胞含有液用の場合は、後述するように、ヒトの胎児の脳または治療対象の患者またはその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒトの脳内より無菌的に採取するのが好ましい。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内より無菌的に採取するのが一番好ましい。
【００３６】
本発明の神経幹細胞含有液に含有される神経幹細胞は本発明の神経幹細胞増殖方法によって体外で増殖した神経幹細胞である。神経幹細胞の入手先は、 この神経幹細胞含有液の使用目的によって限定の度合いが異なるが、適合する限りどこから入手しても良い。使用目的がヒトを対象としない場合には限定が少ないが、神経幹細胞含有液含有治療剤用の場合はヒトの胎児の脳または治療対象の患者またはその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒトの脳内より無菌的に採取するのが好ましい。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内より無菌的に採取するのが一番好ましい。同治療剤用には、更に神経幹細胞増殖の際に、血清やｂＦＧＦやＮＧＦ等を添加せずに増殖させる必要がある。
【００３７】
本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤は神経幹細胞を含有しているため、動脈内、静脈内または脳内注射剤に限られる。この中で、静脈内注射が一番安全性に優れている。但し、後述するように、静脈内注射により効果が期待される場合は限られている。一般には脳内注射が適用される。本発明に用いる神経幹細胞の入手先は、ヒトの胎児の脳または治療対象の患者またはその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒトの脳に限られる。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内に内在する神経幹細胞を無菌的に採取して、本発明の神経幹細胞増殖方法において、ｂＦＧＦやＮＧＦ等高分子を添加せずに増殖させて得られる神経幹細胞含有液を用いる必要がある。本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤は静脈内注射する場合は、脳血管バリアの問題があるので、脳障害直後または脳炎症中等脳血管バリアが壊れている時か、将来、人工的に中等脳血管バリアを壊した場合に限られる。脳内注射の場合は、そのような制限はない。中枢神経系に移植するのに適切であるように様々な方法で投与されうる。これに限定されるわけではないが、くも膜下腔投与、脳室内投与および黒質内投与等が挙げられる。
【００３８】
本発明の細胞幹細胞増殖剤、細胞幹細胞増殖作用機序による治療剤、細胞幹細胞含有液または当該液含有治療剤および細胞幹細胞増殖方法は、いずれも、本発明の細胞幹細胞増殖剤の有効成分に特徴があるだけである。本発明の特徴以外の操作や工程は公知の操作や工程でよく、それらは前述の先行文献に開示されている。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
海馬、線条体と大脳皮質を２週齢のスプラグ‐ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ））系の雄のラットの脳から取り出した。これらを直ちにＤ‐ハンクス液（ＨｙＣｌｏｎｅ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ・Ｉｎｃ社製）の中に入れ、０．１２５％のトリプシンと混合させ、これらを静かにピペットで吸い込み、吐き出す方法で、迅速に4回もみほぐして組織を個々の細胞にし、もみほぐした細胞を、最初網目の大きさが１８０マイクロメーターのナイロン性の網でろ過し、次いで網目の大きさが７５マイクロメーターのナイロン性の網でろ過した。ろ過した細胞を回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿した細胞を分離し、分離した細胞を２％の培養用サプルメントＮ２（ＧＩＢＣＯ社製）と１リットル当たり２０マイクログラムのｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯ・ＴＥＣＨ社製）と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリン（ＳＩＧＭＡ社製）と１００マイクログラムのストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含むダルベッコ修正イーグル最少必須培地／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭとF12を１：１で混合したもの、ＧＩＢＣＯ社製）の無血清培養液で洗浄後、当該培養液中に、１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、この懸濁した細胞を摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で培養し、２日毎に培養液の半量を新しい培養液で置き換えた。１週間後に球形の最初の細胞塊が形成された。この第１次球形細胞塊を集め、これらをピペットで吸い込み、吐き出す方法で機械的に個々の細胞にばらし、前述の培養液で、１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度で、再び培養した。５日後に再び球形細胞塊が形成された。この操作を繰り返し、第５次の球形細胞塊を得た。
【実施例２】
【００４０】
実施例１で得られた第５次の球形細胞塊の性質を調べるために、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）免疫蛍光染色試験を行った。ネスチンは神経幹細胞に発現し、神経細胞には発現しない。したがって、この球形細胞塊がネスチン免疫蛍光染色試験陽性であれば、神経幹細胞を取得したことを意味する。そこで、得られた第５次の球形細胞塊を前述の方法により個々の細胞にばらし、その一部を５％の胎児性牛血清（ＦＢＳ）を含む前述のＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で１ミリリットル当たり２００，０００個の細胞密度になるように懸濁し、スライドグラスの上の中央に１００マイクロリットルだけ小分けし、２時間放置したところ、細胞がスライドグラスに付着した。この付着細胞を、付着した状態で、Ｄ‐ハンクス液で洗浄し、洗浄後の付着細胞を４％パラホルムアルデヒド含有０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（フナコシ社製）１００マイクロリットルに摂氏４度で３０分間浸す方法で固定した。この固定した細胞をＰＢＳに室温で３０分間浸す方法で３回洗浄した後、自然に乾燥させた。この乾燥させた固定化細胞に１ミリリットル当たり０．０５マイクログラムのタンパク分解酵素を加え、摂氏３７度で２分反応させた。引き続き、タンパク分解酵素処理をした固定化細胞を０．５％トリトン・エックス１００（ｔｒｉｔｏｎＸ１００）と５％ヤギ正常血清含有Ｄ‐ハンクス液（Ｄ‐ハンクスＴＳ液）１５０マイクロリットルで摂氏３７度で３０分間浸した。次にこの固定した細胞に同液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体（大日本製薬製）を加え、摂氏４度で一晩放置した。翌日、第１次抗体反応をさせた固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を同液に１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で、室温で２時間浸した。この第２次抗体処理した固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この洗浄した固定化細胞を使用直前にアビジン‐ビオチン複合体（Ａｖｉｄｉｎ‐Ｂｉｏｔｉｎ・Ｃｏｍｐｌｅｘ）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ社のＶｅｃｔａｓｔａｉｎ・Ｅｌｉｔｅ・ＡＢＣ・Ｋｉｔ・Ｓｔａｎｄａｒｄ使用）用の溶液Ａ（アビジン）１０マイクロリットルと溶液Ｂ（ビオチン）１０マイクロリットルとＰＢＳ５００マイクロリットルを混合した液に室温で１時間浸し、直ちにＰＢＳで3回洗浄した。このＡＢＣ処理した固定化細胞を０．０５％３，３‘‐ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（３，３’‐ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ・ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＡＢ、ＤｏｊｉｎＤｏ社製）と０．１％過酸化水素を含むＰＢＳ２００マイクロリットルで室温で１０分間反応させた。ＤＡＢ処理をした固定化細胞をＰＢＳで室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を７０度のエチルアルコールに浸し、８０度、９０度、９５度、１００度のエチルアルコールに順次浸し、固定化細胞を脱水させた。キシレン１、キシレン２で各１０分処理した後にエンテランおよびカバーグラスで細胞を封入し、標本を作製した。この標本を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、標本が陽性に染色していることより、神経幹細胞を分離したことを確認した。一方、実施例１で得られた第５次の球形細胞塊について、前述の１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、１ミリリットル当たり５マイクログラムの第２次抗体であるインドカルボシアニン（Ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ：Ｃｙ３）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、Ｃｙ‐３標識免疫染色も行った。
【実施例３】
【００４１】
実施例１で得られた球状細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方を繰り返して、機械的に個々の細胞にばらばらにし、この細胞（神経幹細胞）を０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（実験群）または２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、サルビアノール酸Ｂと血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（対照群）に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、５枚の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央の各２０穴（ｗｅｌｌ）に１００マイクロリットルずつ小分けした。
【実施例４】
【００４２】
神経幹細胞を小分けした実施例３の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの１枚について対照群と実験群の培養前の神経幹細胞の細胞賦活評価試験（ＭＴＴアッセイ）を行った。ＭＴＴアッセイの原理は生きた細胞の糸粒体のコハク酸脱水素酵素が外来のＭＴＴを酸化して細胞中に蓄積して、水不溶のロイヤル・パープル色のフォルマザンを形成するのに対し、死んだ細胞ではそのような現象が絶対に起こらないことにある。そこで、この神経幹細胞を懸濁したばかりの９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、実験群と対照群各２０個の穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清の培養液を捨て、摂氏３７度に暖めたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ‐１６４０液（フナコシ社製）で穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を洗浄した。１ミリリットル当たり０．５ミリグラムの濃度のメチルチアゾールテトラゾリウム（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅｔｅｔｏｒａｚｏｌｉｕｍｕ：ＭＴＴ）１００マイクロリットルを洗浄後の各穴（ｗｅｌｌ）に加え、炭酸ガス細胞培養器で摂氏３７度で４時間反応させた。倒立顕微鏡で細胞を観察したところ、青みかかった紫色（ロイヤル・パープル色）の針状のフォルマザンが生きた細胞に見られた。そこで、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清を捨て、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）を１００マイクロリットルずつ各穴（ｗｅｌｌ）に加え、各穴（ｗｅｌｌ）中でピペットで細胞とＤＭＳＯを吸い込み、吸い出すやり方で、細胞中の色素の結晶を溶解した。このプレートを回転速度１，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。各穴（ｗｅｌｌ）中の上清を新しい９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）に移し、ムルティスカン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）プレート・リーダーを用いて、５７０ナノメーターの波長で各穴（ｗｅｌｌ）の溶液の吸光度を測定した。対照群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度と実験群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度は共に平均値が０．０６５で標準偏差がプラスマイナス０．００５であった。このことは、実験群２０穴（ｗｅｌｌ）と対照群２０穴（ｗｅｌｌ）に小分けした神経幹細胞の中で、生きた細胞は各穴（ｗｅｌｌ）に約同数存在することを示している。
【実施例５】
【００４３】
実施例４の培養前ＭＴＴアッセイ操作と並行して、神経幹細胞を小分けした実施例３の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの残りの４枚を摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養した。６日間培養した細胞の形態は実験群と対照群共に球状で神経細胞状の突起は出ていなかった。３枚のプラスチックプレートの実験群と対照群各５つの穴（ｗｅｌｌ）の細胞につぃて、実施例２に記載の方法で、これらの細胞のネスチン陽性の有無を調べたところ、いずれも、ネスチン陽性であり、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で培養した場合、神経幹細胞は神経細胞に分化せずに神経幹細胞として存在すること確認した。図２参照。
【実施例６】
【００４４】
実施例５で６日間培養した９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレート中の神経幹細胞の増殖の程度を測定するために、この培養した９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレーの１枚を用いて実施例４と同様の操作により、６日間培養した対照群と実験群の神経幹細胞のＭＴＴアッセイを行った。対照群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度が平均値が０．２０４で標準偏差がプラスマイナス０．０５９に対し、実験群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度は平均値が０．３７５で標準偏差がプラスマイナス０．０７０、両群間でｔ検定でＰが０．０１以下で有意に差が認められた。ＭＴＴアッセイ自体は生きた細胞の数を測定するに過ぎないが、培養前と培養後の細胞のＭＴＴアッセイをすることにより、細胞の増殖の度合いを測定することができる。本実施例の場合、培養後の対照群の吸光度は培養前に比べ、約３．１倍に増えたが、培養後の実験群の吸光度は培養前に比べ、約５．７倍に増えた。このことは、Ｎ２サプルメン添加培地により、神経幹細胞はある程度増殖するが、サルビアノール酸Ｂの添加により、増殖が促進したことを意味する。図３参照。
【実施例７】
【００４５】
サルビアノール酸Ｂの細胞増殖作用をＤＮＡの複製レベルで観測するために、実施例３と同様の操作により得られた２枚の神経幹細胞を小分けした９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で３日間培養した。その中の１枚のプラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）に静かに１０マイクロリットルの１ミリモル濃度のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）のＤＰＢＳ溶液を加え、他の１枚のプラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）には１０マイクロリットルのＤＰＢＳ溶液を加え、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で４０分間培養した。プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清捨て、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を各穴（ｗｅｌｌ）中でＤＰＢＳ溶液で洗浄した。これらの細胞中のＢｒｄＵｒｄの取り込み量を抗ＢｒｄＵｒｄ抗体法で測定した。即ち、実施例２において、スライドグラスに付着した細胞の代わりに各穴（ｗｅｌｌ）の底に付着した洗浄細胞を用い、実施例２と同様の操作を行い、細胞を固定化し、タンパク質分解酵素処理をする代わりにＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）処理を行い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりにＤ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスのフルオレセイン・イソチオシャネート（ＦＩＴＣ‐）標識アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作を行い、細胞を免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、ＢｒｄＵｒｄの量を測定した。ＢｒｄＵｒｄを加えないプラスチックプレートについても同様の操作を行い、バックグランド値とした。実験群（サルビアノール酸Ｂ添加群）の細胞のＢｒｄＵｒｄの取り込み量は対照群（サルビアノール酸Ｂ無添加群）に比較し、約２倍多かった。
【実施例８】
【００４６】
実施例５で６日間培養したが、実施例６でＭＴＴアッセイに用いなかった残りの２枚の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの実験群の各穴（ｗｅｌｌ）の培養液を０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２を含み、血清やｂＦＧＦを含まない新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で入れ替えて、引続き炭酸ガス細胞培養器で摂氏３７度で１週間培養した。実験群の細胞は培養液中で浮遊したまま集まり、数十個から数百個の細胞の球状集落を形成した。この細胞の一部を実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、細胞はネスチン陽性であった。
【実施例９】
【００４７】
実施例８で得られた球状細胞塊を集め、この細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方を繰り返して、機械的に個々の細胞にばらばらにし、この細胞（神経幹細胞）を１０％ＦＢＳと１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央の２０穴（ｗｅｌｌ）に１００マイクロリットルずつ小分けした。このプレートを摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養した。最初は細胞集落を形成したが、細胞集落の幾つかは自然に穴（ｗｅｌｌ）の底に付着し、突起を出し、神経細胞やアストロサイト状の形態に変化した。
【実施例１０】
【００４８】
実施例９で得られた神経細胞状の形態を有する細胞とアストロサイト状の形態を有する細胞について、実施例２と同様の操作により免疫染色し、顕微鏡および共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、両者の細胞は共にネスチン陰性であった。このことは神経細胞状の形態を有する細胞はもはや神経幹細胞でないことを意味する。そこで、神経細胞状の形態を有する細胞につぃて、実施例２において、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で２００倍に希釈したマウスの抗ラット神経特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉｃ・ｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ）抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、当該細胞はＮＳＥ陽性であった。ＮＳＥは神経特異的マーカーである。したがって、この神経細胞状の形態を有する細胞は神経細胞であり、神経幹細胞が神経に分化したことを意味する。次に、アストロサイト状の形態を有する細胞について、実施例２において、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットグリア繊維性酸性たんぱく質（ｇｌｉａｌ・ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ・ａｃｉｄｉｃ・ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＡＰ）抗体を用い、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、当該細胞はＧＦＡＰ陽性であった。ＧＦＡＰはアストロサイト特異的マーカーである。したがって、このアストロサイト状の形態を有する細胞はアストロサイトであり、神経幹細胞がアストロサイトに分化したことを意味する。すなわち、サルビアノール酸Ｂで増殖した神経幹細胞は生体外で、１０％胎児性牛血清存在下で神経細胞とアストロサイトに分化したことを意味する。
【実施例１１】
【００４９】
実施例１で得られた第５次の球形細胞塊で、未使用の細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方で個々の細胞に分散させ、この細胞（神経幹細胞）を実施例３に記載の０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養し、サルビアノール酸Ｂによる増殖神経幹細胞を得た。
【実施例１２】
【００５０】
実施例１１で得られたサルビアノール酸Ｂによる増殖神経幹細胞を１０マイクロモル濃度のＢｒｄＵｒｄと０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で４日間培養した。培養プレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、細胞を分離した。トリプシン処理をして細胞を個々の細胞にばらし、ＤＰＢＳで洗浄し、１マイクロリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂを含有するＤＰＢＳに懸濁した。
【実施例１３】
【００５１】
実施例１２で得られたＢｒｄＵｒｄで標識した神経幹細胞を５マイクロリットル容量の２６ゲイジのメモリが付いたハミルトン注射器で細胞懸濁液１マイクロリットルを麻酔した大人の雌のＳＤラットの背面の海馬にゆっくりと注入した。細胞懸濁液注入後１、４、８、１２週間後にラットを３匹ずつ麻酔し、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液で還流した。脳を取り出し、５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ溶液中で摂氏６５度で２時間加温し、引続き、２モル濃度の塩酸中摂氏３７度で３０分反応させた後に、脳冠状凍結ミクロトームで、脳組織を２ミリメートル間隔で７等分の環状ブロックに切断した。前頭面で各切断ブロックから６マイクロメートルの厚さの切片を作成した。
【実施例１４】
【００５２】
実施例１０において、固定した神経細胞の代わりに、実施例１３で得られたラットの固定した脳切片を用い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で２００倍に希釈したマウスの抗ラットＮＳＥ抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスのＦＩＴＣ‐アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と２００倍に希釈したマウスの抗ラットＮＳＥ抗体を用い、その他は実施例１０における固定した神経細胞に対する操作と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、ＮＳＥ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞の他にＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞が観察された。ＮＳＥ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞は内在性の神経細胞であることを意味し、ＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞は外来性の神経細胞であること意味する。したがって、ＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞の存在は脳内に注入した神経幹細胞が脳内で神経細胞に分化したことを示している。
【実施例１５】
【００５３】
実施例１０において、固定したアストサイトの代わりに、実施例１３で得られたラットの固定した脳切片を用い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットＧＦＡＰ抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスの蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ‐）標識アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットＧＦＡＰ抗体を用い、その他は実施例１０における固定したアストサイトに対する操作と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、ＧＦＡＰ陽性でＦＩＴＣ陰性のアストロサイトの他にＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性のアストロサイトが観察された。ＧＦＡＰ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞は内在性のアストロサイトであることを意味し、ＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞は外来性のアストロサイトであること意味する。したがって、ＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性のアストロサイトの存在は脳内に注入した神経幹細胞が脳内でアストロサイトに分化したことを示している。神経幹細胞が神経細胞に分化するかアストロサイトに分化するかは、脳内の部位の環境によると思われる。
【実施例１６】
【００５４】
体重３００グラム前後の大人のＳＤラット１０匹を４％イソフルラン、６６％Ｎ２Ｏ、３０％酸素の混合ガスで麻酔し、１．５％のイソフルラン、６８．５％Ｎ２Ｏ、３０％酸素の混合ガスで麻酔を維持した。血圧、血液冲のガス分圧、血糖値を左の大腿骨動脈でモニターした。直腸温度、中大脳動脈閉塞の反対側の側頭筋温度を常時モニターして、加熱パッドで摂氏３７．０−３７．５度に維持した。左外頚動脈を６−０絹縫合糸で結び、遠位を切開し、左内頚動脈を分離し、迷走神経から離した。左内頚動脈の頭蓋外枝をその枝分れの根元のところで、６−０絹縫合糸で結んだ。円形チップの付いた３−０外科用単層ナイロン縫合糸を外頚動脈断片を通して左内頚動脈に導き、その頚動脈の枝分れ部分より２０ミリメートル過ぎたところで、９０分間結び、その後直ぐ解き、縫合糸による閉塞による中大脳動脈閉塞を起したラットを作成した。このラット１０匹に実施例１２で得られたＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞をハミルトン注射器で細胞懸濁液１マイクロリットルを麻酔下で背面の海馬にゆっくりと注入した。
【実施例１７】
【００５５】
実施例１６でＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞を海馬に注入した中大脳動脈閉塞ラットに対して、即日より殺す日まで毎日２ミリグラム／キログラムの割合でサルビアノール酸Ｂを腹腔内投与した。対照として別のＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞を海馬に注入した中大脳動脈閉塞ラット１０匹に対してサルビアノール酸Ｂを投与しなかった。中大脳動脈閉塞後第１，３，７，１４日にこれらのラット２匹ずつをキシラジン１０ミリグラム／キログラムとケタミン８０ミリグラム／キログラムで麻酔して殺した。直ちに、生理的食塩水で還流し、続いて４％パラホルムアルデヒドで還流した。脳組織を２ミリメートル間隔で７等分の環状ブロックに切断した。前頭面で各切断ブロックから６マイクロメートルの厚さの切片を作成した。
【実施例１８】
【００５６】
実施例１４において、実施例１３で作成した切片の代わりに、実施例１７で作成した切片を用い、その他は実施例１４と同様の操作をして、ＮＳＥとＦＩＴＣに対する二重免疫標識した。サルビアノール酸Ｂを投与したラットは中大脳動脈閉塞後第２日に殺した群からＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性が認められ、日数に比例して二重陽性が強くなった。サルビアノール酸Ｂを投与しなかったラットは中大脳動脈閉塞後第２日に殺した群からＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性が認められなかったが、第４日になってＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性は確認できた。このことから、脳内に注入した神経幹細胞はサルビアノール酸Ｂが存在しなくとも、脳内で神経細胞に分化するが、サルビアノール酸Ｂの投与により脳内で神経幹細胞が増殖し、その結果として神経幹細胞の神経への分化が促進されたと思われる。
【実施例１９】
【００５７】
実施例１６と同様の操作により、中大脳動脈閉塞ラットを４０匹作成し、その中で２０匹の背面の海馬に実施例１２においてＢｒｄＵｒｄを添加せずに他は実施例１２と同様の操作をして得られたＢｒｄＵｒｄ非標識の神経幹細胞を１マイクロリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように、０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂを含有するＤＰＢＳ（サルビアノール酸Ｂ投与群用）またはサルビアノール酸Ｂを含有しないＤＰＢＳ（サルビアノール酸Ｂ非投与群用）に懸濁した神経幹細胞含有液１マイクロリットルを５マイクロリットル容量のハミルトン注射器でゆっくりと注入した。増殖神経幹細胞含有液を注入したラット１０匹と注入しないラット１０匹に毎日２ミリグラム／キログラムの割合でサルビアノール酸Ｂを３ヶ月間腹腔内投与した。一方、残りの増殖神経幹細胞含有液を注入したラット１０匹と注入しないラット１０匹にはサルビアノール酸Ｂを投与しなかった。このラットについて高架式十字迷路試験を行った。高架式十字迷路試験とは高架式の十字形の細長い平板の一方にラットの餌を置き、他方の一つにラットを放すと、ラットは最初は試行錯誤で十字路の一方の行き止まりまで行き、そこに餌が無いことを知って、十字路にもどり、別の道を行く、そうこうしているうちにラットが餌の置いてある端にたどりつく。もう一度実験をすると記憶力のあるラットは迷うことなく、餌がおいてある道を進み餌にありつく。しかし、記憶力の悪いラットは１回目と同様に試行錯誤を繰返す。この試験によりラットの記憶力が測定できる。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しなかった対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要し、記憶力が極度に低下していた。これに対し、サルビアノール酸Ｂだけを投与した群は餌にたどり着くまでの時間が短くなり、神経幹細胞含有液を注入した群は餌にたどり着くまでの時間が更に短くなり、神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与し続けた群が餌にたどり着くまでの時間が一番短くなった。ラットが餌にたどり着くまでの時間が短くなったということは記憶力の回復を意味し、神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で神経細胞が再生し、かつ再生した神経細胞が機能していることを示している。
【実施例２０】
【００５８】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、２４ヶ月齢の老齢のラット４０匹を用いて同様の操作により、老齢のラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２１】
【００５９】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、脳外傷のあるラット４０匹を用いて同様の操作により、脳外傷のあるラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２２】
【００６０】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）をキログラム当たり４０ミリグラムを１６時間間隔で２度投与して作成したパーキンソン病モデルラット４０匹を用いて同様の操作により、パーキンソン病モデルラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２３】
【００６１】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、臭化水素酸スコポラミン（メルク社製）の０．９％食塩水を臭化水素酸スコポラミン換算でキログラム当たり２ミリグラムを投与して作成したアルツハイマー病モデルラット４０匹を用いて同様の操作により、アルツハイマー病モデルラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２４】
【００６２】
実施例３において、サルビアノール酸Ｂの代わりに、サルビアノール酸Ｂマグネシウム、サルビアノール酸Ｂエチルエステルをそれぞれ用い、その他は実施例３から実施例６と同様の操作を行い、サルビアノール酸Ｂについての結果と同様の結果を得た。
【実施例２５】
【００６３】
サルビアノール酸ＢのＰＢＳ溶液（１ミリグラム／２．５ミリリットル）を５０マイクロリットルずつ、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央１６穴（ｗｅｌｌ）に入れ、更に各々０．２％のアルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオンまたはエンゾジノールのＰＢＳ溶液または抗酸化剤が入ってないＰＢＳ溶液を５０マイクロリットルずつ加え、摂氏８０度で７２時間加温し、加温前後の穴（ｗｅｌｌ）中の溶液を２８６ナノメータで吸光度を測定した。抗酸化剤を加えたサルビアノール酸Ｂの溶液の２８６ナノメータでの吸光度は加温前後で変化しなかったが、抗酸化剤を加えないサルビアノール酸Ｂの溶液の吸光度は３０％減少した。
【実施例２６】
【００６４】
実施例３において、実施例１で得られたラット神経細胞塊の代わりに、正常ヒト神経前駆細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）１バイアルを用い、実施例３と同様の操作を行い、実施例４から実施例１０までにおいて、ラット神経幹細胞の代わりに、購入した正常ヒト神経前駆細胞の増殖細胞を用い、実施例４から実施例１０までと同様の操作を行い、正常ヒト神経前駆細胞もラット神経幹細胞と同様に、無血清培地中でサルビアノール酸Ｂにより増殖し、血清培地中で神経細胞とアストロサイトに分化することを確認した。
【実施例２７】
【００６５】
アルツハイマー病に対する薬効評価。日本語で読み書きができ、自分の意志を医者に伝えることが可能であるがアルツハイマー病の可能性ありという臨床診断を受けている患者で、サルビアノール酸Ｂナトリウムに過敏症の既往歴がなく、腎機能と肝代謝が低下している疑いがなく、かつ妊娠または妊娠している可能性のある人および授乳婦以外の人に対して、下記ミニメンタルステート試験を行う。なお、患者は重症度の指標が２５以下であることを確認し、重症度の指標が２５以上の患者はいる場合は、重症度の指標が２５以下である患者と入れ替える。また、測定前４ヶ月以内に治験薬を使用していた患者は除外する。また、シメチジン、プロプラノロール等親油性６遮断剤やクロニジン、抗コリン作動薬、および抗コリン活性を有する抗うつ剤、神経弛緩剤、推定認識力増強物質および中枢神経刺激物質、または半減期が長いベンゾジアゼピンは投与を禁止する。
【００６６】
ミニメンタルステート試験の内容：見当識（１．今の年は？１点、季節は？１点、曜日は？１点、日付は？１点、月は？１点、２．私たちが今いる県の名前は？１点、郡の名前は？１点、市／町の名前は？１点、階数は？１点、は？１点、住所／建物の名前は？１点）、記銘力（３．医師が３つの物の名前を書く秒かけて言う。医師が言った後で次に患者に３つ全部の名前を尋ねる。患者が３つ全てを正しく言えるまで答えを繰返させる。３点）、注意と計算（４．１００から続けて７を引かせる。正しい答え１つにつき１点与える。５回答えたところで終える。５点）、想起（５．質問３で覚えた３つの物の名前を尋ねる。正しい答え１つにつき１点与える。３点）、言語（６．医師が鉛筆と時計を指す。患者に医師が指した物の名前を言わせる。２点、７．患者に「いいえ、もし、そして、しかし」と言わせる。１点、８．患者に３段階の命令を与え、それにしたがってもらう。「右手で紙をつまみ上げてください。紙を半分に折ってください。紙を机の上に置いてください。」３点、９．患者に次の指示を読ませ、それにしたがってもらう。「目を閉じてください。」１点、１０．患者に自由に１つの文章を書いてもらう。文章には守護つと目的語１つを含み、しかも意味をなしている必要がある。得点には書字の誤りは考慮しない。１点、１１．１辺が約５センチメートルの２つの五角形が１頂点だけ重なった図形を見せ、患者に書き写させる。全ての角および角度が保たれており、しかも交わった領域が四角形をなしていれば１点をあたえる。１点）、合計３０点。
【００６７】
医師の管理下に被験者にサルビアノール酸Ｂナトリウム２ミリグラム錠を１日２回、６ヶ月間投与する。６ヵ月後にミニメンタルステート試験を行う。ミニメンタルステート試験によりサルビアノール酸Ｂナトリウム投与による見当識、記銘力、注意と計算、想起、言語の改善を確認できる。
【実施例２８】
【００６８】
実施例２７において、アルツハイマー病が疑われる患者の代わりに、パーキンソン病、脳外傷、脳梗塞または脳血管性痴呆が疑われる患者に対しても、実施例２７と同様な薬効評価を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の神経幹細胞増殖剤、神経幹細胞増殖方法、神経幹細胞含有液、神経幹細胞含有液含有治療剤および神経幹細胞増殖剤を含有し、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤は、種々の産業に利用可能性があるが、特に、医療においては、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の２剤は神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤として、またはその有効成分として、またはその製造方法として適用される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】サルビアノール酸Ｂの立体構造式。構造式中で三角形状の太い実線ないし一部が太い実線で示す結合は紙面の上に突き出た結合を表し、点線で示す結合は紙面の下に突き出た結合を表す。
【図２】実施例５において、０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂにより増殖したスプラグ・ダウレイ（ＳＤ）ラット脳の神経幹細胞のネスチンに対するインドカルボシアニン（Ｃｙ３）標識標本の共焦点レーザー走査顕微鏡写真（倍率１００倍）。写真中央の明るい部分がネスチン陽性部分である。
【図３】実施例４と６において、０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂを加えた群（実験群）と加えない群（対照群）の６日間培養前（実施例４）と培養後（実施例６）の神経幹細胞の細胞賦活評価試験値（ＭＴＴアッセイ）。縦軸は５７０ナノメーターにおける吸光度（ＯＤ）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）サルビアノール酸B（英語名：Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ・Ａｃｉｄ・Ｂ、中国名：丹フン酸Ｂ又は丹フン酸乙、なお、フンに該当する中国字は酉偏に分と書くが、日本の漢字には無い）等を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、（２）当該神経幹細胞増殖剤を，要すれば賦活化後，体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法、（３）当該神経幹細胞増殖方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液、（４）血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、別名：繊維芽細胞増殖因子２：ＦＧＦ２）および神経成長因子（ＮＧＦ）を含まない当該神経幹細胞含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤、（５）当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする当該疾病の治療剤、（６）サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）に記載する神経幹細胞増殖剤と（２）に記載する神経幹細胞増殖方法と（３）に記載する神経幹細胞含有液と（４）と（５）に記載する治療剤を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経疾病、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性症、交通性水頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射、多発性硬化症、正常圧水頭症、パーキンソン病、ピック病、進行性多巣性白質脳症、進行性核上麻痺、拳闘家痴呆、脳外傷、外科手術、脳腫瘍、慢性硬膜下血腫、脳卒中（脳梗塞または脳出血）、脳血管性痴呆、ウィルソン病細菌性心内膜炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、HIV関連疾病、神経梅毒、結核性および真菌性髄膜炎、ウイルス性脳炎、無酸素症、B１２欠乏症、慢性的な薬物-アルコール-栄養性乱用、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、低血糖、甲状腺機能低下症、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の臓器系不全、ペラグラ等は繊維化、免疫反応、血管傷害、栄養と酸素欠乏、感染等により、神経細胞が退化、減少、細胞死し、または傷害、除外されることにより、組織や臓器がその機能を失い発症すると考えられている。したがって、これらの疾病を治療の１つの方法として失われた神経細胞を何らかの方法で補充するか再生することが考えられ、その効果が多数報告されている。
【０００３】
例えば、パーキンソン病は黒質線条体のドパミン作動性神経の退化に起因するが、後期有糸分裂ドパミン作動性神経に富んだヒト胎児性中脳組織の脳内移植により病状が改善されたという報告がある（非特許文献１−７）。しかし、この間、移植に伴う拒絶反応を避けるため、免疫抑制剤を使用している（非特許文献８）。
【０００４】
脳梗塞は中枢神経系に重大な虚血をもたらし、神経やグリア細胞を退化させる。脳梗塞部位にヒトエヌティ２（ＮＴ‐２）奇形癌細胞由来の神経を移植したところ、改善が見られたという報告がある（非特許文献９）。移植細胞が神経細胞になったことを移植細胞に神経マーカーが出現したことにより確認したという報告もある（非特許文献１０）。
【０００５】
これら補充すべき神経細胞の供給源として、ＥＳ細胞、神経幹細胞または骨髄間質細胞が注目される。ＥＳ細胞は種々の細胞に分化しうる細胞だからである。神経幹細胞は未分化の細胞であり、神経細胞が死滅すると、その失われた細胞を補うように自然に分化を始め、生体機能の維持に大きく貢献する可能性があるからである。骨髄間質細胞はすでにある程度分化しているので、自然には神経細胞に分化しないが、最近、種々の生体因子または化合物処理により人工的に神経細胞に分化しうる（特許文献１−２、非特許文献１１−１５）ことが明らかになったからである。
【０００６】
しかし、補充すべき神経細胞の供給源として注目されるＥＳ細胞は胚性幹細胞であり、ヒトの胚を原料に用いるという倫理性の問題と移植抗原性の問題を有する。一方、神経幹細胞の場合も内在性の神経幹細胞は神経に分化する（非特許文献１６）が、内在性の神経幹細胞の数は極わずかで、脳梗塞等により退化する細胞を充分に補充することはできない（非特許文献１７）。外部からの入手は胎児由来の神経幹細胞しか困難であり、胎児由来の神経幹細胞は倫理性の問題と移植抗原性の問題を有する。骨髄間質細胞は自分自身の骨髄から充分量を採取可能であるから、他人の細胞を用いるという倫理性の問題と移植抗原性の問題はない。しかし、骨髄間質細胞は自然には神経細胞に分化しない細胞である。したがって、内在性の神経幹細胞を増殖する方法が開発されるなどして、自家の神経幹細胞が供給源として使えるようになれば、その方がより望ましい。したがって、内在性の神経幹細胞を増殖する方法の開発が強く望まれる。
【０００７】
胎児性および成人性神経幹細胞は既に齧歯類の中枢神経系から（胎児性：非特許文献１８、成人性：非特許文献１９−２０）のみならず、ヒトの中枢神経系から（胎児性：非特許文献２１−２２、成人性：非特許文献２３−２４）から分離されている。神経幹細胞は神経、アストロサイト、オリゴデントロサイトに分化し、興奮性神経シナプスと抑制性神経シナプスに分化し（非特許文献２５−２６）、活性の神経系ネットワークを形成する（非特許文献２７）という。
【０００８】
近年、機能を失った組織に対して、神経幹細胞を移植し、個々の生体機能を発現する細胞へ特異的に分化させることにより、当該病態を改善・治療する試みが行われている。例えば、パーキンソン病に関し、神経幹細胞を線条体内部へ移植すると、細胞が生き残り臨床効果を得る（非特許文献２８）、神経幹細胞移植によりパーキンソン病の作動性システムのシナプスおよび末端機能が保持される（非特許文献２９）、１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン起因パーキンソン病のマウスの脳に神経幹細胞を移植すると生き残り、機能性のあるドパミン作動性神経になる（非特許文献３０）という報告がある。また、脳梗塞の場合は、神経幹細胞の移植により脳梗塞の改善が見られという（非特許文献３１）。多くの神経幹細胞の脳内移植データー（前述の非特許文献３１と非特許文献３２−３５）は神経幹細胞の移植または増殖により、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病が治療できることを示唆している。最大の課題は移植可能な質と量の神経幹細胞を生産する方法を確立することまたは脳内で内在する神経細胞を増殖することが可能な低毒性の神経幹細胞増殖剤を開発することである。
【０００９】
最近、ラットの脳動脈を一時的に止めて脳虚血にして海馬の神経細胞に傷害を与えた後に、ＮＧＦを注入すると、失われた神経細胞の4割が回復したという報告がある（非特許文献３６）。この環境で、ＮＧＦが神経幹細胞を増殖させることを示唆している。研究としては素晴らしいが、ＮＧＦというタンパク質を臨床的に脳内に注入することは可能な限り避けた方がよい。したがって、このＮＧＦ等生物学的因子の代わりになる低分子化合物の探索が望まれる。
【００１０】
非神経細胞や神経幹細胞を神経細胞に分化させる低分子はすでに報告されている（前述の特許文献２と非特許文献３７）。骨髄間質細胞等非神経細胞を神経疾病の神経細胞の補充の供給源として用いる目的のためには、神経細胞への分化剤は重要である。しかし、神経細胞に分化した細胞は増殖しないので、神経幹細胞を神経疾病の神経細胞の補充の供給源として用いる目的のためには、神経幹細胞の神経への分化剤よりは神経幹細胞を神経に分化させないで、神経幹細胞のまま増殖させる神経幹細胞増殖剤がより重要である。神経幹細胞分化剤は神経幹細胞を増殖させた後に要すれば考慮すべき問題である。
【００１１】
一方、サルビアノール酸Bはシソ科の植物の１種である丹参（学名：Ｌａｂｉａｔａｅ・Ｓａｌｖｉａ・ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ・Ｂｕｎｇｅ）の水溶性成分の一つ（非特許文献３８）であり、高速ティ・エル・シ（ＨＰＴＬＣ）（非特許文献３９）、樹脂カラムのアルコール展開（特許文献３）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（非特許文献４０）または高速カウンター・カレント・クロマトグラフィー（非特許文献４１）、カラムクロマトグラフィー（特許文献４）等により分離される。分子量７１８、分子式Ｃ３６Ｈ３０Ｏ１６で、その平面構造式は非特許文献４２に示され、その立体構造式は図１で表される（非特許文献４３）。山東省天然薬物工程技術研究中心の曲桂武らによれば、水溶液中のサルビアノール酸Bは高温で不安定で、摂氏８０度で72時間加温すると３５％変化し、チオ硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ヒドロ亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ＥＤＴＡ２ナトリウム塩を添加しても一部変化するという。ビタミンＣを添加した時のみ摂氏８０度で72時間加温してもサルビアノール酸Bは安定であるいう（非特許文献４４）。
【００１２】
サルビアノール酸Bは非常に強い抗酸化作用（非特許文献４５）、脂肪過酸化阻止作用、脱水酸化ラジカル作用（非特許文献４６）を有する。この抗過酸化作用に基づき、以下の生理作用を有する。すなわち、四塩化炭素またはジ・メチルニトサミンによる肝臓の繊維化予防作用（非特許文献４７−４８）、脳虚血による記憶喪失の予防作用（非特許文献４９）、アテロム性動脈硬化症縮小作用（非特許文献５０）、抗虚血作用（非特許文献５１）、心臓血管系に対する保護作用（非特許文献５２）、抗ウイルス作用（特許文献５−７）、虚血による脳障害の予防作用（非特許文献５３）、子牛大動脈内皮細胞の血管内皮細胞成長因子（VEGF）により誘導される高透過性の阻止作用（非特許文献５４）、アミロイド・ベーターたんぱく質の凝集阻止作用と繊維化形成阻止作用（前述の非特許文献４２）、新生細胞のアポトーシス誘導作用（非特許文献５５）、肝星細胞増殖阻止作用とコラーゲン産生阻止作用とトランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）ベーター１・有糸分裂活性化タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰＲ）系のシグナルトランスダクション阻止作用（非特許文献５６）、神経退化に関与する前立腺アポトーシス反応４（Ｐａｒ‐４）関与によるアミロイド・ベーターたんぱく質の凝集阻止作用（非特許文献５７）、コレスタン・３ベーター・５アルファー・６ベータートリオールによるヒトへそ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）傷害の緩和作用（非特許文献５８）、酸化低密度リポたんぱく質による心臓血管系炎症障害の治療作用（特許文献８−９）を有する。また、サルビアノール酸Bとサポニンの混合物が心臓血管疾病および脳血管疾病部位を縮小させ（特許文献１０）、サルビアノール酸Bとリソスペルミン酸（英語名：Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ・ａｃｉｄ）の混合物がアテローマ動脈硬化症または動脈再狭窄症に有効である（特許文献１１−１２）。サルビアノール酸Bの構成成分がリパーゼ阻害作用を有する（特許文献１３）。
【００１３】
要約すると、サルビアノール酸Bは非常に強い抗過酸化作用を有し、この抗過酸化作用により、心臓血管系や脳神経系や肝臓細胞での過酸化による細胞死予防作用と抗ウイルス作用を有する。また、サルビアノール酸Bは新生細胞のアポトーシスを誘導することにより、アテローマ動脈硬化症等の血管内皮細胞の増殖を阻害する。つまり、サルビアノール酸Bの基本作用は抗過酸化作用、抗ウイルス作用ならびに新生細胞のアポトーシス誘導作用である。したがって、脳梗塞に起因する虚血による脳神経細胞の予防やウイルス性脳炎の予防および脳神経細胞の補充ないし増殖を要しない極初期の脳神経疾病の治療の可能性は考えられる。しかし、サルビアノール酸Bの効果は抗過酸化作用や抗ウイルス作用によるので、当該疾病の治療はできても、神経幹細胞を増殖させて、すでに脳神経細胞の退化または減少してしまったことに起因する脳神経疾病を治療することはできないと思われた。サルビアノール酸Bは新生細胞のアポトーシスを誘導し、細胞増殖を阻害するので、神経幹細胞の増殖には、むしろ不利に働くと思われた。実際、サルビアノール酸B関連化合物のアセチルサルビアノール酸Ａは抗血栓作用を有するので、その作用により脳梗塞予防に有益な効果があるであろうと推定し（非特許文献５９）、サルビアノール酸Ａは、その抗酸化作用により過酸化による肝細胞障害を予防し（非特許文献６０）、繊維芽細胞の増殖を阻害し（非特許文献６１）、神経幹細胞の生存率を上昇させるが、神経幹細胞の増殖を促進させないことが確認されている（非特許文献６２）。
なお、最近神経幹細胞の分離、増殖、分化に関し、多くの特許が出願され、公開されている（特許文献１４−７２）。いずれも、生物学的因子を用いる方法である。低分子の神経幹細胞増殖剤としてはベンゼン環縮合５員複素環式化合物（特許文献７３）、または薬用人参中のサポニン類等、例えば、ギンセノシドＲｇ１（英語名：Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｇ１）（特許文献７４および前述の非特許文献６２）が報告されているに過ぎない。また、サルビアノール酸Bの抽出もとの丹参の薬効に関する特許も多いが、その多くは丹参の主薬効から類推可能な血管系に関する薬効である。痴呆薬に関する特許公開公報が存在するが、丹参の他、種々の生薬の配合剤に関する特許出願である（特許文献７５）。これらの特許文献から本発明は予見できない。
【００１４】
以下に先行文献を特許文献と非特許文献に分けて表示する。
【特許文献１】特表２００２−５１３５４５号公報
【特許文献２】特開２００４−９１３４４号公報
【特許文献３】米国特許２００１年６，２９９，９１０号公報
【特許文献４】中国特許２００３年１４２５６５９号公報
【特許文献５】カナダ特許１９９９年２３３５９５６号公報
【特許文献６】カナダ特許２０００年２３７６９２２号公報
【特許文献７】米国特許２０００年６，０４３，２７６号公報
【特許文献８】カナダ特許２００３年２４５９４０６号公報
【特許文献９】米国特許２００３年２００３０８６９８７号公報
【特許文献１０】中国特許２００３年１４２５４３０号公報
【特許文献１１】米国特許２００２年２００２１９７２７４号公報
【特許文献１２】国開ＷＯ２００２年０２０８５３９８号国際公報
【特許文献１３】欧州特許２００３年１３７１３６８号公報
【特許文献１４】特開２００４−２３６６０７号公報
【特許文献１５】特開２００４−２２９５２３号公報
【特許文献１６】特開２００４−１６６６０４号公報
【特許文献１７】特開２００４−１２９５６１号公報
【特許文献１８】特開２００３−３２５１６７号公報
【特許文献１９】特開２００３−１８９８４７号公報
【特許文献２０】特開２００３−１２５７５９号公報
【特許文献２１】特開２００３−０８１９５９号公報
【特許文献２２】特開２００２−３４８２３９号公報
【特許文献２３】特開２００２−２９１４６９号公報
【特許文献２４】特開２００２−２８１９６２号公報
【特許文献２５】特開２００２−０５１７７５号公報
【特許文献２６】特開２００２−０３４５８０号公報
【特許文献２７】特開２００１−３１６２８５号公報
【特許文献２８】特開２００１−２９２７６８号公報
【特許文献２９】特開２００１−１８６８２９号公報
【特許文献３０】特表２００４−５２３２１６号公報
【特許文献３１】特表２００４−５２２４１４号公報
【特許文献３２】特表２００４−５１７６２０号公報
【特許文献３３】特表２００４−５００１０３号公報
【特許文献３４】特表２００３−５２５０３４号公報
【特許文献３５】特表２００３−５２３１６６号公報
【特許文献３６】特表２００３−５２１４７４号公報
【特許文献３７】特表２００３−５１６１４１号公報
【特許文献３８】特表２００３−５１４５６５号公報
【特許文献３９】特表２００３−５１４５５０号公報
【特許文献４０】特表２００３−５１２３３３号公報
【特許文献４１】特表２００３−５１１３５２号公報
【特許文献４２】特表２００３−５０７３４９号公報
【特許文献４３】特表２００３−５０５０２３号公報
【特許文献４４】特表２００２−５４４２３５号公報
【特許文献４５】特表２００２−５３７８０２号公報
【特許文献４６】特表２００２−５３６９９１号公報
【特許文献４７】特表２００２−５３６０２３号公報
【特許文献４８】特表２００２−５３０３５１号公報
【特許文献４９】特表２００２−５３００６８号公報
【特許文献５０】特表２００２−５２６１０４号公報
【特許文献５１】特表２００２−５２６０６５号公報
【特許文献５２】特表２００２−５１８９９０号公報
【特許文献５３】特表２００２−５１８０４３号公報
【特許文献５４】特表２００２−５１７９８２号公報
【特許文献５５】特表２００２−５１２８４２号公報
【特許文献５６】特表２００２−５０８６６６号公報
【特許文献５７】特表２００２−５００８７９号公報
【特許文献５８】特表２００１−５２０８７８号公報
【特許文献５９】特表２００１−５１８２８９号公報
【特許文献６０】特表２００１−５１１７８８号公報
【特許文献６１】特表２００１−５１１４５６号公報
【特許文献６２】特表２００１−５０４１２３号公報
【特許文献６３】特表平１０−５０９５９２号公報
【特許文献６４】特表平１０−５０９３１９号公報
【特許文献６５】特表平１０−５０５７５４号公報
【特許文献６６】特表平０９−５００００４号公報
【特許文献６７】特表平０８−５０５７６２号公報
【特許文献６８】特表平０８−５０２６５２号公報
【特許文献６９】特表平０８−５０２１７２号公報
【特許文献７０】特表平０８−５００２４５号公報
【特許文献７１】国開ＷＯ０２／０５８１１号国際公報
【特許文献７２】国開ＷＯ０１／８８１００号国際公報
【特許文献７３】特開２００３−０８１９５９号公報
【特許文献７４】特開２００１−１３９４８３号公報
【特許文献７５】特開平６−５６６８４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９５年３３２巻１１１８頁
【非特許文献２】Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９６年３７０巻２０３頁
【非特許文献３】Ｊ．Ｈ．Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．、１９９８年１３巻３８３頁
【非特許文献４】Ｐ．Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９９９年２巻１１３７頁
【非特許文献５】Ｐ．Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒａｌ．、２０００年４８巻６８９頁
【非特許文献６】Ｏ．Ｌｉｎｄｖａｉｌら、Ｐｒｏｇ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．、２０００年１２７巻２９９頁
【非特許文献７】Ｓ．Ｐｏｌｇａｒら、ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｂｕｌｌ．、２００３年６０巻１頁
【非特許文献８】Ｃ．Ｗ．Ｃｌａｎｏｗら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００３年５４巻４０３頁
【非特許文献９】Ｄ．Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００年５５巻５６５頁
【非特許文献１０】Ｐ．Ｔ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００２年１６０巻１２０１頁
【非特許文献１１】Ｍ．Ｄｅｚａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００１年１４巻１７７１頁
【非特許文献１２】Ｗ．Ｄｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１年２８２巻１４８頁
【非特許文献１３】Ｄ．Ｗｏｏｄｂｕｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、２０００年６１巻３６３頁
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００年１６４巻２４７頁
【非特許文献１５】Ｊ．Ｋｏｈｙｙａｍａら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、２００１年６８巻２３５頁
【非特許文献１６】Ｊ．Ｍ．Ｐａｔｅｎｔら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００２年５２巻８０２頁
【非特許文献１７】Ａ．Ａｒｖｉｄｓｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００２年８巻９６３頁
【非特許文献１８】Ｋ．Ｋ．Ｊｏｈｅら、Ｇｅｎｅｓ・Ｄｅｖ．、１９９６年１０巻３１２９頁
【非特許文献１９】Ａ．Ｇｒｉｔｔｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９６年１６巻１０９１頁
【非特許文献２０】Ｔ．Ｄ．Ｐａｌｍｅｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９７年８巻３８９頁
【非特許文献２１】Ｏ．Ｂｒｕｓｔｌｅら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９８年１６巻１０４０頁
【非特許文献２２】Ｃ．Ｎ．Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、Ｂｒａｉｎ・Ｐａｔｈｏｌ．、１９９９年９巻４９９頁
【非特許文献２３】Ｖ．Ｇ．Ｋｕｋｅｋｐｖら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９９年１５６巻３３３頁
【非特許文献２４】Ａ．Ｆ．Ｐａｇａｎｏら、Ｓｔｅｍ・ｃｅｌｌｓ、２０００年１８巻２９５頁
【非特許文献２５】Ｃ．Ｖｉｃａｒｉｏ‐Ａｂｅｊｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年１２巻６７７頁
【非特許文献２６】Ｈ．Ｔｏｄａら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００年１６５巻６６頁
【非特許文献２７】Ｓ．Ｋ．Ｍｉｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００２年９９巻１６２１頁
【非特許文献２８】Ｐ．Ｈａｇｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００１年６０巻７４１頁
【非特許文献２９】Ｏ．Ｉｓａｃｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００３年５３巻ｓ１３５頁
【非特許文献３０】Ｘ．Ｌｉら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ、２００３年２４巻１１９２頁
【非特許文献３１】Ｔ．Ｖｅｉｚｏｖｉｃら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００１年３２巻１０１２頁
【非特許文献３２】Ｆ．Ｈ．Ｇｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９５年９２巻１１８７９頁
【非特許文献３３】Ｔ．Ｑｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９５年９２巻１１８７９頁
【非特許文献３４】Ａ．Ｅ．Ｒｏｓｓｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年１２巻２４０５頁
【非特許文献３５】Ｊ．Ｗ．Ｍｃｄｏｎａｌｄら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９９年５巻１４１０頁
【非特許文献３６】Ｈ．Ｎａｋａｔｏｍｉら、Ｃｅｌｌ、２００２年１１０巻４２９頁
【非特許文献３７】Ｓ．Ｄｉｎｇら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００３年１００巻７６３２頁
【非特許文献３８】Ｚ．Ｘ．Ｃｈｅｎら、Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８１年１６巻２４頁
【非特許文献３９】Ｊ．Ｌｉら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍ．Ｓｉｎ．、１９９３年２８巻５４３頁
【非特許文献４０】Ｑ．Ｗ．Ｚｈａｎｇら、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ・Ｚｈｏｎｇ・Ｙａｏ・Ｚａ・Ｚｈｉ、２００１年２６巻８４８頁
【非特許文献４１】Ｈ．Ｂ．Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．、２００２年９４３巻２３５頁
【非特許文献４２】Ｍ‐Ｋ．Ｔａｎｇら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２００１年２２巻３８０頁
【非特許文献４３】Ｉｖｙ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ・Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ番号ＮＥ０１‐００４
【非特許文献４４】曲桂武ら、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｄｃｅｎｔｅｒ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｔｏｎｇｘｕｎ／２／ｑｕｇｕｉｗｕ２．ｐｄｆ．
【非特許文献４５】Ｌ．Ｎ．Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９７年６巻５７頁
【非特許文献４６】Ｇ．Ｈ．Ｄｕら、Ｂａｓｉｃ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｃｌｉｎ．、２０００年２０巻１０頁
【非特許文献４７】Ｐ．Ｌｉｕら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｍｅｄ．、１９９３年１３巻３５２頁
【非特許文献４８】Ｙ．Ｙ．Ｈｕら、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ａｂｓｔｒ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１９９７年１４巻１３９頁
【非特許文献４９】Ｇ．Ｈ．Ｄｕら、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．、１９９７年１１０巻６５頁
【非特許文献５０】Y-J．Wｕら、Ａｒｔｅｒｏｓｃｈｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年１８巻４８１頁
【非特許文献５１】J．Wangら、Ｃｈｉｎ．Pharmacol．Bull．、１９９９年１５巻１６４頁
【非特許文献５２】Ｌ．Ｙ．Ｍａら、Ｃｈｉｎ．Ｔｒａｄｉｔ．Ｈｅｒｂ・Ｄｒｕｇｓ、１９９９年３０巻３９１頁
【非特許文献５３】Ｙ．Ｈ．Ｃｈｅｎｇら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２０００年２１巻４６３頁
【非特許文献５４】Ｙ．Ｑｉｕら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２００１年２２巻１１７頁
【非特許文献５５】Ｈ．Ｈ．Ｈｕｎｇら、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２００１年１６巻１７５頁
【非特許文献５６】Ｐ．Ｌｉｕら、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２００２年２３巻７３３頁
【非特許文献５７】Ｍ．Ｔａｎｇら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００２年８８巻４２２頁
【非特許文献５８】Ｄ．Ｒｅｎら、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．、２００３年１１６巻６３０頁
【非特許文献５９】Ｊ．Ｃ．Ｄｏｎｇら、Ｙａｏ・Ｘｕｅ・Ｘｕｅ・Ｂａｏ、１９９６年３１巻６頁
【非特許文献６０】Ｙ．Ｙ．Ｈｕら、Ｗｏｒｌｄ・Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０００年６巻４０２頁
【非特許文献６１】Ｃ．Ｈ．Ｌｉｕら、Ｗｏｒｌｄ・Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０００年６巻３６１頁
【非特許文献６２】Ｌ．Ｈ．Ｓｈｅｎら、Ｙａｏ・Ｘｕｅ・Ｘｕｅ・Ｂａｏ、２００３年３８巻７３５頁
【非特許文献６３】Ｇ．Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１９９３年３５巻５６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、（１）サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、（２）当該神経幹細胞増殖剤を、要すれば賦活化後、体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法、（３）当該神経幹細胞増殖方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液、（４）血清、ｂＦＧＦおよびＮＧＦを含まない当該神経幹細胞含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤、（５）当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする当該疾病の治療剤、（６）サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）に記載する神経幹細胞増殖剤と（２）に記載する神経幹細胞増殖方法と（３）に記載する神経幹細胞含有液と（４）と（５）に記載する治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、神経幹細胞を血清、ｂＦＧＦおよびＮＧＦで処理することなく増殖させる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を種々探索した結果、驚くべきことに、サルビアノール酸Ａと異なり、サルビアノール酸Ｂに、公知の抗過酸化作用、抗ウイルス、新生細胞アポトーシス誘導作用とは全く異なる、神経幹細胞を増殖させる作用があることを見出し、さらに種々研究した結果、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、（１）サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤、（２）前記化合物が、サルビアノール酸Bおよびそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする（１）に記載する神経幹細胞増殖剤、（３）前記化合物が、サルビアノール酸Bおよび薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする（２）に記載する神経幹細胞増殖剤、（４）当該神経幹細胞増殖剤を、要すれば賦活化後、体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法、（５）血清、ｂＦＧＦおよびＮＧＦを含まない細胞培養液を用いることを特徴とする（４）に記載する神経幹細胞増殖方法、（６）（４）または（５）に記載する神経幹細胞増殖方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液、（７）（５）に記載する方法で増殖することを特徴とする当該神経幹細胞の含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤、（８）当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする当該疾病の治療剤、（９）サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）、（２）または（３）に記載する神経幹細胞増殖剤と（４）または（５）に記載する神経幹細胞増殖方法と（６）に記載する神経幹細胞含有液と（７）記載する神経幹細胞含有液含有治療剤または（８）に記載する神経幹細胞増殖作用機序による治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の神経幹細胞増殖剤は、（１）体外での神経幹細胞の増殖剤として有用であり、（２）後述の神経幹細胞増殖方法においてその方法を特徴付ける薬剤として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液の液質を特徴付ける薬剤として有用であり、（４）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の性質を特徴付ける薬剤として有用であり、（５）後述の当該神経幹細胞増殖作用機序による療剤の有効成分としても有用である。本発明の神経幹細胞増殖方法は、（１）体外での神経幹細胞の増殖方法として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液の生産方法として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の生産方法またはその一工程として有用である。本発明の神経幹細胞含有液は、（１）神経幹細胞の供給源として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の有効成分として有用である。本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤と神経幹細胞増殖剤を含有し、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の２剤は神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤として有用である。本発明のサルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする（１）、（２）または（３）に記載する神経幹細胞増殖剤と（４）または（５）に記載する神経幹細胞増殖方法と（６）に記載する神経幹細胞含有液と（７）記載する神経幹細胞含有液含有治療剤または（８）に記載する神経幹細胞増殖作用機序による治療剤は各々前述の有用性の上に、より安定性に優れているという性質を有し、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の１つは新しい神経幹細胞増殖剤である。本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分はサルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物である。サルビアノール酸Bの光学または幾何異性体の中で、サルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有しないものは、本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることはできない。これに対し、サルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するサルビアノール酸Bの光学または幾何異性体は本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることができる。しかし、サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものの中でサルビアノール酸Bに関するデーターが一番蓄積されているので、サルビアノール酸Bおよびそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物がより望ましく、サルビアノール酸Bおよび薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物が更により望ましい。
【００２０】
最も望ましい有効成分の１つであるサルビアノール酸Bは、目下、シソ科の植物の１種である丹参（Ｌａｂｉａｔａｅ・Ｓａｌｖｉａ・ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ・Ｂｕｎｇｅ）から分離精製される。しかし、丹参以外のサルビアノール酸B含有植物があれば、その植物から分離してもよく、合成が可能な場合は合成品でもよい。現在サルビアノール酸Bは中国（景天生物工程有限公司）と米国（Ｉｖｙ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ・Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）等で市販されている。サルビアノール酸Bの構造式から多くの光学または幾何異性体の存在が想定される。サルビアノール酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、イソサルビアノール酸B等がすでに分離されている。前述したように、これらのうち、サルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞を増殖させる作用を有しないものは本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることが出来ないが、サルビアノール酸Bと同様に神経幹細胞を増殖させる作用を有するものは本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることが出来る。
【００２１】
サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するもののプロドラッグは加水分解等分解を受けてサルビアノール酸Bまたはその光学または幾何異性体に成るものであれば、薬学的に許容することのできる限り、どのようなものでもよい。当該プロドラッグの一つとしてサルビアノール酸B分子中のカルボキシル基でのメチルまたはエチルエステル誘導体やサルビアノール酸B分子中のフェノール基でのアセチル誘導体等が挙げられるが、それらに限らない。将来合成されるものでも差し支えない。
【００２２】
サルビアノール酸Bの塩およびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものの塩、およびそれらのプロドラッグの塩は薬学的に許容することのできる塩に限られる。薬学的に許容することのできる塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、トリエチルアミン、リジン、アルギニン等の有機アミンの塩、塩酸、臭化水素酸、硫酸等鉱酸との酸付加塩等が挙げられるが、それらに限らない。薬学的に許容することのできる塩であればよく、薬学的に許容することのできる限り、将来合成される有機化合物との塩でも差し支えない。
【００２３】
サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩の水和物も本発明の神経幹細胞増殖剤の有効成分として用いることができる。
【００２４】
本発明の神経幹細胞増殖剤または後述の当該神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病治療剤の有効成分は酸素および湿気のない状態では比較的安定である。しかし、抗酸化剤であるので、空中および水溶液中で比較的不安定である。特にプロドラッグ化していない有効成分は水溶液中80度72時間の加温で３５％変化する。保存する時は酸素や湿気の無い状態で保存することが望ましい。長期保存を考慮に入れると、本発明の神経幹細胞増殖剤または当該疾病治療剤には有効成分の安定のため、他の抗酸化剤を添加剤として添加することが望ましい。抗酸化剤としては薬学的に許容することのできる抗酸化剤に限られる。薬学的に許容することのできる抗酸化剤としては、アルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオン、エンゾジノール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は高温の水溶液中のサルビアノール酸Bの変化を抑える。亜硝酸塩はサルビアノール酸Bの変化を完全には抑えない。したがって、亜硝酸塩は、単独では安定剤としては不十分である。ビタミンＣはサルビアノール酸Bの変化を抑える。したがって、ビタミンＣはサルビアノール酸B等の安定剤として使用は可能であるが、ビタミンＣ自体が空中および水溶液中で比較的不安定であり、ビタミンＣを多量に添加するか他の抗酸化剤との併用が必要になる。
【００２５】
本発明の神経幹細胞増殖剤は、（１）体外での神経幹細胞の増殖剤として有用であり、（２）後述の神経幹細胞増殖方法においてその方法を特徴付ける薬剤として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液の液質を特徴付ける薬剤として有用であり、（４）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の性質を特徴付ける薬剤として有用であるばかりで無く、（５）体内の内在性の神経幹細胞をそのまま体内で増殖させることにも用いることが出来る。本発明の神経幹細胞増殖剤を、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病に対して投与した場合、内在する神経幹細胞を増殖させ、神経細胞に分化することにより、欠落した神経細胞の補充がされ、病状が改善されるので、本発明の神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の有効成分としても有用である。
【００２６】
本発明のもう１つは、新しい神経幹細胞増殖方法である。前述の本発明の神経幹細胞増殖剤を用い、体外で神経幹細胞を増殖することを特徴とする。本発明の神経幹細胞増殖剤を添加する以外は、例えば、２％の培養用サプルメントＮ２含有ダルベッコ修正イーグル最少必須培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭとF12を１：１で混合したもの）の無血清培養液等公知の培養液、５％炭酸ガス中、摂氏３７度で数日間培養等公知の培養条件を用いることができる。前述の先行文献には神経幹細胞増殖剤として、胎児性牛血清（ＦＢＳ）、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ等神経細胞等のたんぱく質性の生体因子を用いている。これらの血清または生体因子の代わりに、本発明の神経幹細胞増殖剤を用いるところに特徴がある。もちろん、目的によってはこれらの血清や生体因子を含有しても良いが、本発明の治療剤に用いる神経幹細胞含有液を作成する場合は、神経幹細胞を増殖する培養液にこれらを培養液に加えてはならない。血清や生体因子を添加せずに、本発明の神経幹細胞増殖剤を加えて培養することが肝要である。なお、本発明の神経幹細胞増殖剤としてプロドラッグを用いる場合には、プロドラッグによっては、培養中の細胞によりマスクが除かれ、活性体になるので、賦活化の必要が無い場合もあるが、プロドラッグによっては培養細胞により活性体にならない場合もある。したがって、要すれば、投与前に賦活化する必要がある。最後に基本培養液の１例として、培養用サプルメントＮ２、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地等の組成を示す。神経幹細胞が増殖する限り、組成は変更してもかまわない。また、細胞の分離や細胞の洗浄に用いる緩衝液の１例としてＤ‐ハンクス液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）等の組成を示す。後の操作に悪い影響を与えない限り、これ以外の緩衝液も用いることができる。
【００２７】
培養用サプルメント、培地、緩衝液の組成の例示
培養用サプルメントＮ２の組成（ミリグラム／リットル）：インスリン：５、ヒトトランスフェリン：１００、プロゲステロン：０．００６３、プトレッシン１６．１１、亜セレン酸塩：０．００５２．
ＤＭＥＭの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：２００、硝酸鉄（三価）９水和物：０．１、塩化カリウム：４００、硫酸マグネシウム：９７．６、塩化ナトリウム：６，４００、リン酸二水素ナトリウム２水和物：１２５、Ｌ‐アルギニン塩酸塩：８４、Ｌ‐シスチン２塩酸塩：６２．６、Ｌ‐グルタミン：５８４、Ｌ‐グリシン：３０、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩１水和物：４２、Ｌ‐イソロイシン：１０４．８、Ｌ‐ロイシン：１０４．８、Ｌ‐リジン塩酸：１４６．２、Ｌ‐メチオニン：３０、Ｌ‐フェニルアラニン：６６、Ｌ‐セリン：４２、Ｌ‐スレオニン：９５．２、Ｌ‐トリプトファン：１６、Ｌ‐チロシン二ナトリウム塩：８９．５、Ｌ‐バリン：９３．６、パントテン酸カルシウム：４、コリン酒石酸水素塩：７．２、葉酸：４、イノシトール：７．２、ニコチンアアミド：４、ピリドキサール塩酸塩：４、リボフラビン：０．４、チアミン塩酸塩：４、デキストロース：１，０００、ピルビン酸ナトリウム：１１０、フェノール・レッド：５。
培養用サプルメントＢ２７の成分（Ｂ２７の組成は開示されていないので、Ｂ２７そのものを使用する場合は市販品を購入せざるを得ないが、開示されている成分（非特許文献６３）より、似たような効果を有する培養用サプルメントは作ることは可能である）：ビオチン、Ｌ‐カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）ガラクトース、還元型グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン、レチニル酢酸、セレン、トリオド‐ｌ‐チロミン、ビタミンＥ、ビタミンＥ酢酸塩、ウシアルブミン、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、トランスフェリン。
ハムＦ１２培地の組成：塩化カルシウム：３３．３、硫酸銅（ニ価）５水和物：０．００２５、硫酸鉄（ニ価）７水和物：０．８３４、塩化カリウム：２２４、塩化マグネシウム：５７．１、塩化ナトリウム：７，６００、リン酸水素二ナトリウム：１４２、硫酸亜鉛７水和物、Ｌ‐アラニン：８．９、Ｌ‐アルギニン塩酸塩：２１１、Ｌ‐アスパラギン１水和物：１５．０、Ｌ‐アスパラギン酸：１３．３、Ｌ‐システイン塩酸塩１水和物：３５．１、Ｌ‐グルタミン酸：１４．７、Ｌ‐グルタミン：１４６、Ｌ‐グリシ：７．５、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩１水和物：２１．０、Ｌ‐イソロイシン：３．９４、Ｌ‐ロイシン：１３．１、Ｌ‐リジン塩酸塩：３６．５、Ｌ‐メチオニン：４．４８、Ｌ‐フェニルアラニン：４．９６、Ｌ‐プロリン：３４．５、Ｌ‐セリン：１０．５、Ｌ‐スレオニン：１１．９、Ｌ‐トリプトファ：２．０４、Ｌ‐チロシン：５．４４、Ｌ‐バリン：１１．７、ビオチン：０．００７３、パントテン酸カルシウム：０．４７７、塩化コリン：１４．０、シアノコバラミン：１．３５５、葉酸：１．３２４、イノシトール：１８．０、リポ酸：０．２０６、ニコチンアミド：０．０３６６、ピリドキシン塩酸塩：０．０６１７、リボフラビン：０．０３７６、チアミン塩酸塩：０．３３７、デキストロース：１，８０２、ヒポキサンチン：４．０８、リノレイン酸：０．０８４１、ピルビン酸ナトリウム：１１０、チミジン：０．７２７、プトレッシン２塩酸塩：０．６１、フェノール・レッド：１．２４２。
Ｄ‐ハンクス液の組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１８５．５、塩化カリウム：４００、リン酸二水素カリウム：６０、硫酸マグネシウム：９７．７、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：４７．５、Ｄ‐グルコース：１，０００。
ＰＢＳの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１３２．５、塩化カリウム：２００、リン酸二水素カリウム：２００、硫酸マグネシウム：５９．２、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：１１５０。
ＤＰＢＳの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１００、塩化カリウム：２００、リン酸二水素カリウム：２００、塩化マグネシウム：１００、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：１１５０。
ＲＰＭＩ１６４０の組成（ミリグラム／リットル）：硝酸カルシウム：６９．５、塩化カリウム：４００、硫酸マグネシウム：４８．８、塩化ナトリウム：６，０００、リン酸水素二ナトリウム：８０１、Ｌ‐アルギニン：２００、Ｌ‐アスパラギン１水和物：５６．８、Ｌ‐アスパラギン酸：２０、Ｌ‐システイン２塩酸塩：６５．２、Ｌ‐グルタミン酸：２０、Ｌ‐グルタミン：３００、Ｌ‐グリシ：１０、Ｌ‐ヒスチジン：１５、Ｌ‐ヒドロキシプロリン：２０、Ｌ‐イソロイシン：５０、Ｌ‐ロイシン：５０、Ｌ‐リジン塩酸塩：４０、Ｌ‐メチオニン：１５、Ｌ‐フェニルアラニン：１５、Ｌ‐プロリン：２０、Ｌ‐セリン：３０、Ｌ‐スレオニン：２０、Ｌ‐トリプトファ：５、Ｌ‐チロシン：２０、Ｌ‐バリン：２０、ｐ‐アモノ安息香酸：１、パラビオチン：０．２、パントテン酸カルシウム：０．２５、塩化コリン：３、シアノコバラミン：０．００５、葉酸：１、イノシトール：３５、ニコチンアミド：１、ピリドキシン塩酸塩：１、リボフラビン：０．２、チアミン塩酸塩：１、デキストロース：２，０００、還元型グルタチオン：１、フェノール・レッド：５。
２０倍ＳＳＣの組成（モル／リットル）：塩化ナトリウム：３、クエン酸ナトリウム：０．３。
本発明の神経幹細胞増殖方法は、（１）体外での神経幹細胞の増殖方法として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液の生産方法として有用であり、（３）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の生産方法またはその一工程として有用である。
【００２８】
本発明の更にもう1つは、体外で増殖した神経幹細胞の含有液である。神経幹細胞の増殖に本発明の神経幹細胞増殖方法を用いることを特徴とする。体外で増殖した神経幹細胞含有液は神経細胞培養液としてどのような培養液を用いたか、或いは神経幹細胞の増殖剤としてどのような神経細胞増殖剤を用いたかに異なる。例えば、神経細胞培養液として血清含有培養液を用いた場合、或いは神経細胞増殖剤としてｂＦＧＦやＮＧＦを加えて培養した場合は、増殖した神経幹細胞含有液に血清やｂＦＧＦやＮＧＦが混入する。本発明の神経幹細胞含有液には本発明の神経幹細胞増殖剤が混入している。移植免疫の問題があるので、血清やｂＦＧＦやＮＧＦ等が混入する神経幹細胞含有液は、次に説明する神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤に用いることはできない。公知の無血清の神経細胞培養液には血清は存在しないが、ｂＦＧＦやＮＧＦは一般には添加する。したがって、神経幹細胞含有液製造の最終工程ではこれらの因子を添加しないことが肝要である。培養用サプルメントＮ２中にたんぱく質としてインスリンとヒトトランスフェリンが存在する。インスリンまたはヒトトランスフェリン投与によりインスリン抗体やヒトトランスフェリン抗体が出現するものの、臨床上の抗原抗体反応としてはあまり問題にならない。もし、インスリンとヒトトランスフェリンの混入が問題になる場合は、本発明方法で培養した後に、培養液を捨て、インスリンとヒトトランスフェリンを除いたＮ２サプルメントと本発明の細胞幹細胞増殖剤を添加した細胞培養液で１日間培養することにより、混入するインスリンとヒトトランスフェリンを消化し尽くす方法を取ればよい。いずれにしろ、本発明の神経幹細胞含有液に本発明の神経幹細胞増殖剤が混入するが、本発明の神経幹細胞増殖剤はサルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を含有するが、これらは抗原性は無い。
本発明の神経幹細胞含有液は、（１）神経幹細胞の供給源として有用であり、（２）後述の神経幹細胞含有液含有治療剤の有効成分として有用である。
【００２９】
本発明の更にもう1つは、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤である。本発明の神経幹細胞含有液を含有することを特徴とする治療剤と、本発明の神経幹細胞増殖剤を含有し、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によりことを特徴とする治療剤と２種類存在する。本発明の治療剤を神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病患者に投与されると、神経幹細胞含有液含有治療剤の場合は、治療剤に含有される神経幹細胞含有液中の神経幹細胞が疾病により失われた神経細胞部位に移動し、そこで、神経細胞に分化し、失われた神経細胞が補充されることにより病状が改善され、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の場合は、その治療剤に含まれる神経幹細胞増殖剤が体内に内在する神経幹細胞の存在部位に浸透し、その内在神経幹細胞を増殖する。内在神経幹細胞は増殖しつつ、失われた神経細胞部位に移動し、そこで、神経細胞に分化し、失われた神経細胞が補充されることにより病状が改善される。後者の治療剤の方が前者の治療剤の方より患者に対する負担が少ないので、通常、先ず、後者を投与して有効かどうかを調べ、無効の場合に前者の神経幹細胞含有液含有治療剤を投与する方がよい。神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の例としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性症、交通性水頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射、多発性硬化症、正常圧水頭症、パーキンソン病、ピック病、進行性多巣性白質脳症、進行性核上麻痺、拳闘家痴呆、脳外傷、外科手術、脳腫瘍、慢性硬膜下血腫、脳卒中（脳梗塞または脳出血）、脳血管性痴呆、ウィルソン病細菌性心内膜炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、HIV関連疾病、神経梅毒、結核性および真菌性髄膜炎、ウイルス性脳炎、無酸素症、B１２欠乏症、慢性的な薬物-アルコール-栄養性乱用、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、低血糖、甲状腺機能低下症、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の臓器系不全、ペラグラ等の神経疾病、繊維化、免疫反応、血管傷害、栄養と酸素欠乏、感染等による神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病が挙げられるが、これに限らない。神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病であればよい。
【００３０】
本発明の神経幹細胞増殖剤または神経幹細胞増殖作用機序による治療剤は、有効成分が低分子であることから、体外投与は勿論、経口投与または非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、脳内、坐薬など）のいずれでも投与できる。体外投与の場合は本発明の組成物中にプロドラッグが含まれているときは、既に述べたが、適宜の方法で活性化してから用いた方がより大きな効果を得るので好ましい。プロドラッグが含まれていないときはそのまま用いてよい。体内投与の場合は多くの場合体内でプロドラッグが活性化するので、プロドラッグを予め活性化しておく必要は少ない。
【００３１】
経口用製剤を調製する場合、賦形剤、さらに必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性または水性の懸濁液剤などとする。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルーロスなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００３２】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン未、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものが使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが使用できる。これらの錠剤は、顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
【００３３】
注射剤を調製する場合、必要により、グルコースや生理的食塩水等の等調液、pH調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤などを添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内、脳内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用事調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、多投与量を同一の容器に収納してもよい。溶液の場合、酸素や湿気を遮断する方がよい。そのため、場合によってはアンプル型の容器に入れ、空気を抜くか、窒素ガス等で空気を置換しておく方がよい。公知の方法でよい。
【００３４】
本発明の神経幹細胞増殖剤の試薬としての使用濃度は通常０．００１から１００マイクロモル濃度、好ましくは、０．０１〜１０マイクロモル濃度で使用し、本発明の神経幹細胞増殖剤の医薬としての投与量または神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の投与量は、ヒトの場合、成人１日当たり通常０．０１〜１０００ミリグラム、好ましくは、０．１〜１００ミリグラムの範囲で、１日量を１日１回、あるいは２〜４回に分けて投与する。なお、年齢、症状により適宜増減する。
【００３５】
本発明の神経幹細胞増殖方法に用いる神経幹細胞の入手先は使用目的によって限定の度合いが異なるが、適合する限りどこから入手しても良い。使用目的がヒトを対象としない場合には限定が少ないが、神経幹細胞含有液含有治療剤に用いる神経幹細胞含有液用の場合は、後述するように、ヒトの胎児の脳または治療対象の患者またはその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒトの脳内より無菌的に採取するのが好ましい。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内より無菌的に採取するのが一番好ましい。
【００３６】
本発明の神経幹細胞含有液に含有される神経幹細胞は本発明の神経幹細胞増殖方法によって体外で増殖した神経幹細胞である。神経幹細胞の入手先は、 この神経幹細胞含有液の使用目的によって限定の度合いが異なるが、適合する限りどこから入手しても良い。使用目的がヒトを対象としない場合には限定が少ないが、神経幹細胞含有液含有治療剤用の場合はヒトの胎児の脳または治療対象の患者またはその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒトの脳内より無菌的に採取するのが好ましい。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内より無菌的に採取するのが一番好ましい。同治療剤用には、更に神経幹細胞増殖の際に、血清やｂＦＧＦやＮＧＦ等を添加せずに増殖させる必要がある。
【００３７】
本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤は神経幹細胞を含有しているため、動脈内、静脈内または脳内注射剤に限られる。この中で、静脈内注射が一番安全性に優れている。但し、後述するように、静脈内注射により効果が期待される場合は限られている。一般には脳内注射が適用される。本発明に用いる神経幹細胞の入手先は、ヒトの胎児の脳または治療対象の患者またはその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒトの脳に限られる。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内に内在する神経幹細胞を無菌的に採取して、本発明の神経幹細胞増殖方法において、ｂＦＧＦやＮＧＦ等高分子を添加せずに増殖させて得られる神経幹細胞含有液を用いる必要がある。本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤は静脈内注射する場合は、脳血管バリアの問題があるので、脳障害直後または脳炎症中等脳血管バリアが壊れている時か、将来、人工的に中等脳血管バリアを壊した場合に限られる。脳内注射の場合は、そのような制限はない。中枢神経系に移植するのに適切であるように様々な方法で投与されうる。これに限定されるわけではないが、くも膜下腔投与、脳室内投与および黒質内投与等が挙げられる。
【００３８】
本発明の細胞幹細胞増殖剤、細胞幹細胞増殖作用機序による治療剤、細胞幹細胞含有液または当該液含有治療剤および細胞幹細胞増殖方法は、いずれも、本発明の細胞幹細胞増殖剤の有効成分に特徴があるだけである。本発明の特徴以外の操作や工程は公知の操作や工程でよく、それらは前述の先行文献に開示されている。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
海馬、線条体と大脳皮質を２週齢のスプラグ‐ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ））系の雄のラットの脳から取り出した。これらを直ちにＤ‐ハンクス液（ＨｙＣｌｏｎｅ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ・Ｉｎｃ社製）の中に入れ、０．１２５％のトリプシンと混合させ、これらを静かにピペットで吸い込み、吐き出す方法で、迅速に4回もみほぐして組織を個々の細胞にし、もみほぐした細胞を、最初網目の大きさが１８０マイクロメーターのナイロン性の網でろ過し、次いで網目の大きさが７５マイクロメーターのナイロン性の網でろ過した。ろ過した細胞を回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿した細胞を分離し、分離した細胞を２％の培養用サプルメントＮ２（ＧＩＢＣＯ社製）と１リットル当たり２０マイクログラムのｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯ・ＴＥＣＨ社製）と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリン（ＳＩＧＭＡ社製）と１００マイクログラムのストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含むダルベッコ修正イーグル最少必須培地／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭとF12を１：１で混合したもの、ＧＩＢＣＯ社製）の無血清培養液で洗浄後、当該培養液中に、１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、この懸濁した細胞を摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で培養し、２日毎に培養液の半量を新しい培養液で置き換えた。１週間後に球形の最初の細胞塊が形成された。この第１次球形細胞塊を集め、これらをピペットで吸い込み、吐き出す方法で機械的に個々の細胞にばらし、前述の培養液で、１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度で、再び培養した。５日後に再び球形細胞塊が形成された。この操作を繰り返し、第５次の球形細胞塊を得た。
【実施例２】
【００４０】
実施例１で得られた第５次の球形細胞塊の性質を調べるために、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）免疫蛍光染色試験を行った。ネスチンは神経幹細胞に発現し、神経細胞には発現しない。したがって、この球形細胞塊がネスチン免疫蛍光染色試験陽性であれば、神経幹細胞を取得したことを意味する。そこで、得られた第５次の球形細胞塊を前述の方法により個々の細胞にばらし、その一部を５％の胎児性牛血清（ＦＢＳ）を含む前述のＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で１ミリリットル当たり２００，０００個の細胞密度になるように懸濁し、スライドグラスの上の中央に１００マイクロリットルだけ小分けし、２時間放置したところ、細胞がスライドグラスに付着した。この付着細胞を、付着した状態で、Ｄ‐ハンクス液で洗浄し、洗浄後の付着細胞を４％パラホルムアルデヒド含有０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（フナコシ社製）１００マイクロリットルに摂氏４度で３０分間浸す方法で固定した。この固定した細胞をＰＢＳに室温で３０分間浸す方法で３回洗浄した後、自然に乾燥させた。この乾燥させた固定化細胞に１ミリリットル当たり０．０５マイクログラムのタンパク分解酵素を加え、摂氏３７度で２分反応させた。引き続き、タンパク分解酵素処理をした固定化細胞を０．５％トリトン・エックス１００（ｔｒｉｔｏｎＸ１００）と５％ヤギ正常血清含有Ｄ‐ハンクス液（Ｄ‐ハンクスＴＳ液）１５０マイクロリットルで摂氏３７度で３０分間浸した。次にこの固定した細胞に同液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体（大日本製薬製）を加え、摂氏４度で一晩放置した。翌日、第１次抗体反応をさせた固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を同液に１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で、室温で２時間浸した。この第２次抗体処理した固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この洗浄した固定化細胞を使用直前にアビジン‐ビオチン複合体（Ａｖｉｄｉｎ‐Ｂｉｏｔｉｎ・Ｃｏｍｐｌｅｘ）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ社のＶｅｃｔａｓｔａｉｎ・Ｅｌｉｔｅ・ＡＢＣ・Ｋｉｔ・Ｓｔａｎｄａｒｄ使用）用の溶液Ａ（アビジン）１０マイクロリットルと溶液Ｂ（ビオチン）１０マイクロリットルとＰＢＳ５００マイクロリットルを混合した液に室温で１時間浸し、直ちにＰＢＳで3回洗浄した。このＡＢＣ処理した固定化細胞を０．０５％３，３‘‐ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（３，３’‐ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ・ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＡＢ、ＤｏｊｉｎＤｏ社製）と０．１％過酸化水素を含むＰＢＳ２００マイクロリットルで室温で１０分間反応させた。ＤＡＢ処理をした固定化細胞をＰＢＳで室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を７０度のエチルアルコールに浸し、８０度、９０度、９５度、１００度のエチルアルコールに順次浸し、固定化細胞を脱水させた。キシレン１、キシレン２で各１０分処理した後にエンテランおよびカバーグラスで細胞を封入し、標本を作製した。この標本を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、標本が陽性に染色していることより、神経幹細胞を分離したことを確認した。一方、実施例１で得られた第５次の球形細胞塊について、前述の１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、１ミリリットル当たり５マイクログラムの第２次抗体であるインドカルボシアニン（Ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ：Ｃｙ３）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、Ｃｙ‐３標識免疫染色も行った。
【実施例３】
【００４１】
実施例１で得られた球状細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方を繰り返して、機械的に個々の細胞にばらばらにし、この細胞（神経幹細胞）を０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（実験群）または２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、サルビアノール酸Ｂと血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（対照群）に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、５枚の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央の各２０穴（ｗｅｌｌ）に１００マイクロリットルずつ小分けした。
【実施例４】
【００４２】
神経幹細胞を小分けした実施例３の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの１枚について対照群と実験群の培養前の神経幹細胞の細胞賦活評価試験（ＭＴＴアッセイ）を行った。ＭＴＴアッセイの原理は生きた細胞の糸粒体のコハク酸脱水素酵素が外来のＭＴＴを酸化して細胞中に蓄積して、水不溶のロイヤル・パープル色のフォルマザンを形成するのに対し、死んだ細胞ではそのような現象が絶対に起こらないことにある。そこで、この神経幹細胞を懸濁したばかりの９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、実験群と対照群各２０個の穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清の培養液を捨て、摂氏３７度に暖めたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ‐１６４０液（フナコシ社製）で穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を洗浄した。１ミリリットル当たり０．５ミリグラムの濃度のメチルチアゾールテトラゾリウム（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅｔｅｔｏｒａｚｏｌｉｕｍｕ：ＭＴＴ）１００マイクロリットルを洗浄後の各穴（ｗｅｌｌ）に加え、炭酸ガス細胞培養器で摂氏３７度で４時間反応させた。倒立顕微鏡で細胞を観察したところ、青みかかった紫色（ロイヤル・パープル色）の針状のフォルマザンが生きた細胞に見られた。そこで、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清を捨て、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）を１００マイクロリットルずつ各穴（ｗｅｌｌ）に加え、各穴（ｗｅｌｌ）中でピペットで細胞とＤＭＳＯを吸い込み、吸い出すやり方で、細胞中の色素の結晶を溶解した。このプレートを回転速度１，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。各穴（ｗｅｌｌ）中の上清を新しい９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）に移し、ムルティスカン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）プレート・リーダーを用いて、５７０ナノメーターの波長で各穴（ｗｅｌｌ）の溶液の吸光度を測定した。対照群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度と実験群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度は共に平均値が０．０６５で標準偏差がプラスマイナス０．００５であった。このことは、実験群２０穴（ｗｅｌｌ）と対照群２０穴（ｗｅｌｌ）に小分けした神経幹細胞の中で、生きた細胞は各穴（ｗｅｌｌ）に約同数存在することを示している。
【実施例５】
【００４３】
実施例４の培養前ＭＴＴアッセイ操作と並行して、神経幹細胞を小分けした実施例３の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの残りの４枚を摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養した。６日間培養した細胞の形態は実験群と対照群共に球状で神経細胞状の突起は出ていなかった。３枚のプラスチックプレートの実験群と対照群各５つの穴（ｗｅｌｌ）の細胞につぃて、実施例２に記載の方法で、これらの細胞のネスチン陽性の有無を調べたところ、いずれも、ネスチン陽性であり、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で培養した場合、神経幹細胞は神経細胞に分化せずに神経幹細胞として存在すること確認した。図２参照。
【実施例６】
【００４４】
実施例５で６日間培養した９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレート中の神経幹細胞の増殖の程度を測定するために、この培養した９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレーの１枚を用いて実施例４と同様の操作により、６日間培養した対照群と実験群の神経幹細胞のＭＴＴアッセイを行った。対照群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度が平均値が０．２０４で標準偏差がプラスマイナス０．０５９に対し、実験群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度は平均値が０．３７５で標準偏差がプラスマイナス０．０７０、両群間でｔ検定でＰが０．０１以下で有意に差が認められた。ＭＴＴアッセイ自体は生きた細胞の数を測定するに過ぎないが、培養前と培養後の細胞のＭＴＴアッセイをすることにより、細胞の増殖の度合いを測定することができる。本実施例の場合、培養後の対照群の吸光度は培養前に比べ、約３．１倍に増えたが、培養後の実験群の吸光度は培養前に比べ、約５．７倍に増えた。このことは、Ｎ２サプルメン添加培地により、神経幹細胞はある程度増殖するが、サルビアノール酸Ｂの添加により、増殖が促進したことを意味する。図３参照。
【実施例７】
【００４５】
サルビアノール酸Ｂの細胞増殖作用をＤＮＡの複製レベルで観測するために、実施例３と同様の操作により得られた２枚の神経幹細胞を小分けした９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で３日間培養した。その中の１枚のプラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）に静かに１０マイクロリットルの１ミリモル濃度のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）のＤＰＢＳ溶液を加え、他の１枚のプラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）には１０マイクロリットルのＤＰＢＳ溶液を加え、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で４０分間培養した。プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清捨て、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を各穴（ｗｅｌｌ）中でＤＰＢＳ溶液で洗浄した。これらの細胞中のＢｒｄＵｒｄの取り込み量を抗ＢｒｄＵｒｄ抗体法で測定した。即ち、実施例２において、スライドグラスに付着した細胞の代わりに各穴（ｗｅｌｌ）の底に付着した洗浄細胞を用い、実施例２と同様の操作を行い、細胞を固定化し、タンパク質分解酵素処理をする代わりにＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）処理を行い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりにＤ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスのフルオレセイン・イソチオシャネート（ＦＩＴＣ‐）標識アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作を行い、細胞を免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、ＢｒｄＵｒｄの量を測定した。ＢｒｄＵｒｄを加えないプラスチックプレートについても同様の操作を行い、バックグランド値とした。実験群（サルビアノール酸Ｂ添加群）の細胞のＢｒｄＵｒｄの取り込み量は対照群（サルビアノール酸Ｂ無添加群）に比較し、約２倍多かった。
【実施例８】
【００４６】
実施例５で６日間培養したが、実施例６でＭＴＴアッセイに用いなかった残りの２枚の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの実験群の各穴（ｗｅｌｌ）の培養液を０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２を含み、血清やｂＦＧＦを含まない新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で入れ替えて、引続き炭酸ガス細胞培養器で摂氏３７度で１週間培養した。実験群の細胞は培養液中で浮遊したまま集まり、数十個から数百個の細胞の球状集落を形成した。この細胞の一部を実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、細胞はネスチン陽性であった。
【実施例９】
【００４７】
実施例８で得られた球状細胞塊を集め、この細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方を繰り返して、機械的に個々の細胞にばらばらにし、この細胞（神経幹細胞）を１０％ＦＢＳと１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央の２０穴（ｗｅｌｌ）に１００マイクロリットルずつ小分けした。このプレートを摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養した。最初は細胞集落を形成したが、細胞集落の幾つかは自然に穴（ｗｅｌｌ）の底に付着し、突起を出し、神経細胞やアストロサイト状の形態に変化した。
【実施例１０】
【００４８】
実施例９で得られた神経細胞状の形態を有する細胞とアストロサイト状の形態を有する細胞について、実施例２と同様の操作により免疫染色し、顕微鏡および共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、両者の細胞は共にネスチン陰性であった。このことは神経細胞状の形態を有する細胞はもはや神経幹細胞でないことを意味する。そこで、神経細胞状の形態を有する細胞につぃて、実施例２において、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で２００倍に希釈したマウスの抗ラット神経特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉｃ・ｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ）抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、当該細胞はＮＳＥ陽性であった。ＮＳＥは神経特異的マーカーである。したがって、この神経細胞状の形態を有する細胞は神経細胞であり、神経幹細胞が神経に分化したことを意味する。次に、アストロサイト状の形態を有する細胞について、実施例２において、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットグリア繊維性酸性たんぱく質（ｇｌｉａｌ・ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ・ａｃｉｄｉｃ・ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＡＰ）抗体を用い、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、当該細胞はＧＦＡＰ陽性であった。ＧＦＡＰはアストロサイト特異的マーカーである。したがって、このアストロサイト状の形態を有する細胞はアストロサイトであり、神経幹細胞がアストロサイトに分化したことを意味する。すなわち、サルビアノール酸Ｂで増殖した神経幹細胞は生体外で、１０％胎児性牛血清存在下で神経細胞とアストロサイトに分化したことを意味する。
【実施例１１】
【００４９】
実施例１で得られた第５次の球形細胞塊で、未使用の細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方で個々の細胞に分散させ、この細胞（神経幹細胞）を実施例３に記載の０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養し、サルビアノール酸Ｂによる増殖神経幹細胞を得た。
【実施例１２】
【００５０】
実施例１１で得られたサルビアノール酸Ｂによる増殖神経幹細胞を１０マイクロモル濃度のＢｒｄＵｒｄと０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で４日間培養した。培養プレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、細胞を分離した。トリプシン処理をして細胞を個々の細胞にばらし、ＤＰＢＳで洗浄し、１マイクロリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂを含有するＤＰＢＳに懸濁した。
【実施例１３】
【００５１】
実施例１２で得られたＢｒｄＵｒｄで標識した神経幹細胞を５マイクロリットル容量の２６ゲイジのメモリが付いたハミルトン注射器で細胞懸濁液１マイクロリットルを麻酔した大人の雌のＳＤラットの背面の海馬にゆっくりと注入した。細胞懸濁液注入後１、４、８、１２週間後にラットを３匹ずつ麻酔し、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液で還流した。脳を取り出し、５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ溶液中で摂氏６５度で２時間加温し、引続き、２モル濃度の塩酸中摂氏３７度で３０分反応させた後に、脳冠状凍結ミクロトームで、脳組織を２ミリメートル間隔で７等分の環状ブロックに切断した。前頭面で各切断ブロックから６マイクロメートルの厚さの切片を作成した。
【実施例１４】
【００５２】
実施例１０において、固定した神経細胞の代わりに、実施例１３で得られたラットの固定した脳切片を用い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で２００倍に希釈したマウスの抗ラットＮＳＥ抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスのＦＩＴＣ‐アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と２００倍に希釈したマウスの抗ラットＮＳＥ抗体を用い、その他は実施例１０における固定した神経細胞に対する操作と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、ＮＳＥ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞の他にＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞が観察された。ＮＳＥ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞は内在性の神経細胞であることを意味し、ＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞は外来性の神経細胞であること意味する。したがって、ＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞の存在は脳内に注入した神経幹細胞が脳内で神経細胞に分化したことを示している。
【実施例１５】
【００５３】
実施例１０において、固定したアストサイトの代わりに、実施例１３で得られたラットの固定した脳切片を用い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットＧＦＡＰ抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスの蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ‐）標識アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットＧＦＡＰ抗体を用い、その他は実施例１０における固定したアストサイトに対する操作と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、ＧＦＡＰ陽性でＦＩＴＣ陰性のアストロサイトの他にＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性のアストロサイトが観察された。ＧＦＡＰ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞は内在性のアストロサイトであることを意味し、ＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞は外来性のアストロサイトであること意味する。したがって、ＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性のアストロサイトの存在は脳内に注入した神経幹細胞が脳内でアストロサイトに分化したことを示している。神経幹細胞が神経細胞に分化するかアストロサイトに分化するかは、脳内の部位の環境によると思われる。
【実施例１６】
【００５４】
体重３００グラム前後の大人のＳＤラット１０匹を４％イソフルラン、６６％Ｎ２Ｏ、３０％酸素の混合ガスで麻酔し、１．５％のイソフルラン、６８．５％Ｎ２Ｏ、３０％酸素の混合ガスで麻酔を維持した。血圧、血液冲のガス分圧、血糖値を左の大腿骨動脈でモニターした。直腸温度、中大脳動脈閉塞の反対側の側頭筋温度を常時モニターして、加熱パッドで摂氏３７．０−３７．５度に維持した。左外頚動脈を６−０絹縫合糸で結び、遠位を切開し、左内頚動脈を分離し、迷走神経から離した。左内頚動脈の頭蓋外枝をその枝分れの根元のところで、６−０絹縫合糸で結んだ。円形チップの付いた３−０外科用単層ナイロン縫合糸を外頚動脈断片を通して左内頚動脈に導き、その頚動脈の枝分れ部分より２０ミリメートル過ぎたところで、９０分間結び、その後直ぐ解き、縫合糸による閉塞による中大脳動脈閉塞を起したラットを作成した。このラット１０匹に実施例１２で得られたＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞をハミルトン注射器で細胞懸濁液１マイクロリットルを麻酔下で背面の海馬にゆっくりと注入した。
【実施例１７】
【００５５】
実施例１６でＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞を海馬に注入した中大脳動脈閉塞ラットに対して、即日より殺す日まで毎日２ミリグラム／キログラムの割合でサルビアノール酸Ｂを腹腔内投与した。対照として別のＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞を海馬に注入した中大脳動脈閉塞ラット１０匹に対してサルビアノール酸Ｂを投与しなかった。中大脳動脈閉塞後第１，３，７，１４日にこれらのラット２匹ずつをキシラジン１０ミリグラム／キログラムとケタミン８０ミリグラム／キログラムで麻酔して殺した。直ちに、生理的食塩水で還流し、続いて４％パラホルムアルデヒドで還流した。脳組織を２ミリメートル間隔で７等分の環状ブロックに切断した。前頭面で各切断ブロックから６マイクロメートルの厚さの切片を作成した。
【実施例１８】
【００５６】
実施例１４において、実施例１３で作成した切片の代わりに、実施例１７で作成した切片を用い、その他は実施例１４と同様の操作をして、ＮＳＥとＦＩＴＣに対する二重免疫標識した。サルビアノール酸Ｂを投与したラットは中大脳動脈閉塞後第２日に殺した群からＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性が認められ、日数に比例して二重陽性が強くなった。サルビアノール酸Ｂを投与しなかったラットは中大脳動脈閉塞後第２日に殺した群からＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性が認められなかったが、第４日になってＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性は確認できた。このことから、脳内に注入した神経幹細胞はサルビアノール酸Ｂが存在しなくとも、脳内で神経細胞に分化するが、サルビアノール酸Ｂの投与により脳内で神経幹細胞が増殖し、その結果として神経幹細胞の神経への分化が促進されたと思われる。
【実施例１９】
【００５７】
実施例１６と同様の操作により、中大脳動脈閉塞ラットを４０匹作成し、その中で２０匹の背面の海馬に実施例１２においてＢｒｄＵｒｄを添加せずに他は実施例１２と同様の操作をして得られたＢｒｄＵｒｄ非標識の神経幹細胞を１マイクロリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように、０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂを含有するＤＰＢＳ（サルビアノール酸Ｂ投与群用）またはサルビアノール酸Ｂを含有しないＤＰＢＳ（サルビアノール酸Ｂ非投与群用）に懸濁した神経幹細胞含有液１マイクロリットルを５マイクロリットル容量のハミルトン注射器でゆっくりと注入した。増殖神経幹細胞含有液を注入したラット１０匹と注入しないラット１０匹に毎日２ミリグラム／キログラムの割合でサルビアノール酸Ｂを３ヶ月間腹腔内投与した。一方、残りの増殖神経幹細胞含有液を注入したラット１０匹と注入しないラット１０匹にはサルビアノール酸Ｂを投与しなかった。このラットについて高架式十字迷路試験を行った。高架式十字迷路試験とは高架式の十字形の細長い平板の一方にラットの餌を置き、他方の一つにラットを放すと、ラットは最初は試行錯誤で十字路の一方の行き止まりまで行き、そこに餌が無いことを知って、十字路にもどり、別の道を行く、そうこうしているうちにラットが餌の置いてある端にたどりつく。もう一度実験をすると記憶力のあるラットは迷うことなく、餌がおいてある道を進み餌にありつく。しかし、記憶力の悪いラットは１回目と同様に試行錯誤を繰返す。この試験によりラットの記憶力が測定できる。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しなかった対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要し、記憶力が極度に低下していた。これに対し、サルビアノール酸Ｂだけを投与した群は餌にたどり着くまでの時間が短くなり、神経幹細胞含有液を注入した群は餌にたどり着くまでの時間が更に短くなり、神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与し続けた群が餌にたどり着くまでの時間が一番短くなった。ラットが餌にたどり着くまでの時間が短くなったということは記憶力の回復を意味し、神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で神経細胞が再生し、かつ再生した神経細胞が機能していることを示している。
【実施例２０】
【００５８】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、２４ヶ月齢の老齢のラット４０匹を用いて同様の操作により、老齢のラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２１】
【００５９】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、脳外傷のあるラット４０匹を用いて同様の操作により、脳外傷のあるラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２２】
【００６０】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）をキログラム当たり４０ミリグラムを１６時間間隔で２度投与して作成したパーキンソン病モデルラット４０匹を用いて同様の操作により、パーキンソン病モデルラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２３】
【００６１】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、臭化水素酸スコポラミン（メルク社製）の０．９％食塩水を臭化水素酸スコポラミン換算でキログラム当たり２ミリグラムを投与して作成したアルツハイマー病モデルラット４０匹を用いて同様の操作により、アルツハイマー病モデルラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後サルビアノール酸Ｂを投与群、神経幹細胞含有液注入群、サルビアノール酸Ｂを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もサルビアノール酸Ｂも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２４】
【００６２】
実施例３において、サルビアノール酸Ｂの代わりに、サルビアノール酸Ｂマグネシウム、サルビアノール酸Ｂエチルエステルをそれぞれ用い、その他は実施例３から実施例６と同様の操作を行い、サルビアノール酸Ｂについての結果と同様の結果を得た。
【実施例２５】
【００６３】
サルビアノール酸ＢのＰＢＳ溶液（１ミリグラム／２．５ミリリットル）を５０マイクロリットルずつ、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央１６穴（ｗｅｌｌ）に入れ、更に各々０．２％のアルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオンまたはエンゾジノールのＰＢＳ溶液または抗酸化剤が入ってないＰＢＳ溶液を５０マイクロリットルずつ加え、摂氏８０度で７２時間加温し、加温前後の穴（ｗｅｌｌ）中の溶液を２８６ナノメータで吸光度を測定した。抗酸化剤を加えたサルビアノール酸Ｂの溶液の２８６ナノメータでの吸光度は加温前後で変化しなかったが、抗酸化剤を加えないサルビアノール酸Ｂの溶液の吸光度は３０％減少した。
【実施例２６】
【００６４】
実施例３において、実施例１で得られたラット神経細胞塊の代わりに、正常ヒト神経前駆細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）１バイアルを用い、実施例３と同様の操作を行い、実施例４から実施例１０までにおいて、ラット神経幹細胞の代わりに、購入した正常ヒト神経前駆細胞の増殖細胞を用い、実施例４から実施例１０までと同様の操作を行い、正常ヒト神経前駆細胞もラット神経幹細胞と同様に、無血清培地中でサルビアノール酸Ｂにより増殖し、血清培地中で神経細胞とアストロサイトに分化することを確認した。
【実施例２７】
【００６５】
アルツハイマー病に対する薬効評価。日本語で読み書きができ、自分の意志を医者に伝えることが可能であるがアルツハイマー病の可能性ありという臨床診断を受けている患者で、サルビアノール酸Ｂナトリウムに過敏症の既往歴がなく、腎機能と肝代謝が低下している疑いがなく、かつ妊娠または妊娠している可能性のある人および授乳婦以外の人に対して、下記ミニメンタルステート試験を行う。なお、患者は重症度の指標が２５以下であることを確認し、重症度の指標が２５以上の患者はいる場合は、重症度の指標が２５以下である患者と入れ替える。また、測定前４ヶ月以内に治験薬を使用していた患者は除外する。また、シメチジン、プロプラノロール等親油性６遮断剤やクロニジン、抗コリン作動薬、および抗コリン活性を有する抗うつ剤、神経弛緩剤、推定認識力増強物質および中枢神経刺激物質、または半減期が長いベンゾジアゼピンは投与を禁止する。
【００６６】
ミニメンタルステート試験の内容：見当識（１．今の年は？１点、季節は？１点、曜日は？１点、日付は？１点、月は？１点、２．私たちが今いる県の名前は？１点、郡の名前は？１点、市／町の名前は？１点、階数は？１点、は？１点、住所／建物の名前は？１点）、記銘力（３．医師が３つの物の名前を書く秒かけて言う。医師が言った後で次に患者に３つ全部の名前を尋ねる。患者が３つ全てを正しく言えるまで答えを繰返させる。３点）、注意と計算（４．１００から続けて７を引かせる。正しい答え１つにつき１点与える。５回答えたところで終える。５点）、想起（５．質問３で覚えた３つの物の名前を尋ねる。正しい答え１つにつき１点与える。３点）、言語（６．医師が鉛筆と時計を指す。患者に医師が指した物の名前を言わせる。２点、７．患者に「いいえ、もし、そして、しかし」と言わせる。１点、８．患者に３段階の命令を与え、それにしたがってもらう。「右手で紙をつまみ上げてください。紙を半分に折ってください。紙を机の上に置いてください。」３点、９．患者に次の指示を読ませ、それにしたがってもらう。「目を閉じてください。」１点、１０．患者に自由に１つの文章を書いてもらう。文章には守護つと目的語１つを含み、しかも意味をなしている必要がある。得点には書字の誤りは考慮しない。１点、１１．１辺が約５センチメートルの２つの五角形が１頂点だけ重なった図形を見せ、患者に書き写させる。全ての角および角度が保たれており、しかも交わった領域が四角形をなしていれば１点をあたえる。１点）、合計３０点。
【００６７】
医師の管理下に被験者にサルビアノール酸Ｂナトリウム２ミリグラム錠を１日２回、６ヶ月間投与する。６ヵ月後にミニメンタルステート試験を行う。ミニメンタルステート試験によりサルビアノール酸Ｂナトリウム投与による見当識、記銘力、注意と計算、想起、言語の改善を確認できる。
【実施例２８】
【００６８】
実施例２７において、アルツハイマー病が疑われる患者の代わりに、パーキンソン病、脳外傷、脳梗塞または脳血管性痴呆が疑われる患者に対しても、実施例２７と同様な薬効評価を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の神経幹細胞増殖剤、神経幹細胞増殖方法、神経幹細胞含有液、神経幹細胞含有液含有治療剤および神経幹細胞増殖剤を含有し、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤は、種々の産業に利用可能性があるが、特に、医療においては、神経幹細胞増殖作用機序による治療剤の２剤は神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤として、またはその有効成分として、またはその製造方法として適用される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】サルビアノール酸Ｂの立体構造式。構造式中で三角形状の太い実線ないし一部が太い実線で示す結合は紙面の上に突き出た結合を表し、点線で示す結合は紙面の下に突き出た結合を表す。
【図２】実施例５において、０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂにより増殖したスプラグ・ダウレイ（ＳＤ）ラット脳の神経幹細胞のネスチンに対するインドカルボシアニン（Ｃｙ３）標識標本の共焦点レーザー走査顕微鏡写真（倍率１００倍）。写真中央の明るい部分がネスチン陽性部分である。
【図３】実施例４と６において、０．０３５マイクロモル濃度のサルビアノール酸Ｂを加えた群（実験群）と加えない群（対照群）の６日間培養前（実施例４）と培養後（実施例６）の神経幹細胞の細胞賦活評価試験値（ＭＴＴアッセイ）。縦軸は５７０ナノメーターにおける吸光度（ＯＤ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤。
【請求項２】
化合物が、サルビアノール酸Bおよびそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする請求項１に記載する神経幹細胞増殖剤。
【請求項３】
化合物が、サルビアノール酸Bおよび薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする請求項２に記載する神経幹細胞増殖剤。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載する化合物を要すれば賦活化後体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法。
【請求項５】
血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子および神経成長因子を含まない細胞培養液を用いることを特徴とする請求項４に記載する神経幹細胞増殖方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載する方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液。
【請求項７】
請求項５に記載する方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤。
【請求項８】
請求項１、２または３に記載する神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤。
【請求項９】
サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする請求項１、２または３に記載する神経幹細胞増殖剤、請求項４または５に記載する神経幹細胞増殖方法、請求項６に記載する神経幹細胞含有液、請求項７に記載する神経幹細胞含有液含有治療剤または請求項８に記載する神経幹細胞増殖作用機序による治療剤。
【請求項１】
サルビアノール酸Bおよびその光学または幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の神経幹細胞増殖作用を有するものおよびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物またはそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とすることを特徴とする神経幹細胞増殖剤。
【請求項２】
化合物が、サルビアノール酸Bおよびそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする請求項１に記載する神経幹細胞増殖剤。
【請求項３】
化合物が、サルビアノール酸Bおよび薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする請求項２に記載する神経幹細胞増殖剤。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載する化合物を要すれば賦活化後体外で投与することを特徴とする体外での神経幹細胞増殖方法。
【請求項５】
血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子および神経成長因子を含まない細胞培養液を用いることを特徴とする請求項４に記載する神経幹細胞増殖方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載する方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液。
【請求項７】
請求項５に記載する方法で増殖することを特徴とする神経幹細胞の含有液を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤。
【請求項８】
請求項１、２または３に記載する神経幹細胞増殖剤を有効成分とし、当該有効成分の神経幹細胞増殖作用によることを特徴とする、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下または喪失により発症する疾病の治療剤。
【請求項９】
サルビアノール酸Bと亜硫酸塩とビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加剤として添加することを特徴とする請求項１、２または３に記載する神経幹細胞増殖剤、請求項４または５に記載する神経幹細胞増殖方法、請求項６に記載する神経幹細胞含有液、請求項７に記載する神経幹細胞含有液含有治療剤または請求項８に記載する神経幹細胞増殖作用機序による治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−７６９４８（Ｐ２００６−７６９４８Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６４０１６（Ｐ２００４−２６４０１６）
【出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【出願人】（３０００２７５１０）学校法人鈴鹿医療科学大学 (6)
【出願人】（３００００７２３５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【出願人】（３０００２７５１０）学校法人鈴鹿医療科学大学 (6)
【出願人】（３００００７２３５）
【Ｆターム（参考）】
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