ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターおよびその中間体を製造する方法および化合物
【課題】ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造のための方法および化合物の提供。
【解決手段】次式で表される化合物。
【解決手段】次式で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、2002年12月9日に出願された米国仮特許出願第60/431,814号の優先権を主張し、該出願を参照のため本明細書に引用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造のための方法および該方法に使用するための化合物を提供する。また、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造に用いる中間体化合物である(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸の不斉還元的アミノ化の方法も提供される。さらなる中間体化合物およびその製造方法も提供される。本発明の化合物および方法によって製造されるジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターは、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、肥満、およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫調節疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶは、膜に結合した非古典的なセリンアミノペプチダーゼであり、腸、肝臓、肺、および腎臓を含む（これらに限られるものではない）様々な組織に存在している。この酵素はまた循環しているT-リンパ球にも存在しており、その場合はCD-26と呼ばれる。ジペプチジルペプチダーゼＩＶはインビボで内生のペプチドGLP-1(7-36)およびグルカゴンの代謝的開裂を担っており、他のペプチド、たとえばGHRH、NPY、GLP-2およびVIPに対してインビトロでタンパク質分解活性を示す。
【０００４】
GLP-1(7-36)は、小腸でのプログルカゴンの翻訳後プロセシングの結果生じる29アミノ酸のペプチドである。このペプチドはインビボで複数の作用を有する。たとえば、GLP-1(7-36)は、インスリンの分泌を刺激し、グルカゴンの分泌を抑制する。このペプチドは満腹感（satiety）を促進し、胃の空白化（gastric emptying）を遅らせる。GLP-1(7-36)の連続注入による外部からの投与は糖尿病患者に有効であることが示されている。しかしながら、外部からのペプチドは連続して治療に用いるには余りにも速く分解されてしまう。
【０００５】
GLP-1(7,36)の内生レベルを増強すべく、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのインヒビターが開発されている。米国特許第号6,395,767号は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを開示している。これらインヒビターを化学的に合成する方法は、米国特許第号6,395,767号並びに文献に開示されている。たとえば、Sagnardら、Tet-Lett. 1995 36: 3148-3152；Tverezovskyら、Tetrahedron 1997 53: 14773-14792；およびHanessianら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998 8: 2123-2128を参照。米国特許第6,395,767号に開示されている好ましいインヒビターは、遊離塩基の(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシ-トリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ-[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル(Ｍ')およびその水和物(Ｍ'')である。
【化１】
遊離の塩基Ｍ'
【０００６】
このジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターの製造に用いる中間体を製造すべく適合させた方法がEP 0 808 824 A2に開示されている。ImashiroおよびKuroda Tetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315、Reetzら、Chem. Int. Ed. Engl. 1979 18: 72、ReetzおよびHeimbach Chem. Ber. 1983 116: 3702-3707、Reetzら、Chem. Ber. 1983 116: 3708-3724も参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造に用いる新規な製造方法および化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造において中間体として有用な化合物を提供することである。
【０００９】
一つの態様において、本発明の中間体は、式ＩＡ：
【化２】
（式中、
R1は、HおよびOHよりなる群から選ばれる；
R2は、-C(=O)-COR4、-C(=O)NR5R6、-C(X)n-COR4および-C-NR7R8COR4よりなる群から選ばれる、ここでXはハロゲン、nは1-2、R4はO-アルキル、NH2およびOHよりなる群から選ばれる、およびR5、R6、R7およびR8は、それぞれ、HおよびCOOR9（式中、R9は置換されたまたは非置換のアルキル）；および
R3は、H、OHおよびR10よりなる群から選ばれる、ここで、R10は、NHR11C(=O)R12、R11はR13COOH、R12は、式：
【化３】
により示される基、
R13はアルキルまたはアリールである）で示される化合物を含む。
【００１０】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造において中間体として有用な本発明の式ＩＡで示される好ましい化合物の例としては、式Ｉ：
【化４】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル、
式ＩＩ：
【化５】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、
式Ｖ：
【化６】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、
式ＶＩ：
【化７】
で示される(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、
(またはそのDABCO塩ＶＩＡ)、
式ＶII：
【化８】
で示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル、
式ＶIII：
【化９】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル、
および式ＩＸ：
【化１０】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル-酢酸が挙げられる。
【００１１】
他の態様において、本発明の中間体は、式III：
【化１１】
（式中、R1は、O-アルキル、NH2およびOHよりなる群から選ばれる、および
R2は、t-BOCおよびCBzよりなる群から選ばれる）で示される化合物4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル、および式ＩＶ：
【化１２】
で示される(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルを含む。
【００１２】
好ましい態様において、これら化合物は、式Ｍ：
【化１３】
で示されるジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)またはその遊離塩基である式Ｍ'（上記）、およびその一水和物Ｍ''
【化１４】
の製造における中間体として用いる。
【００１３】
本発明の他の目的は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造方法を提供することである。好ましい態様において、製造されるインヒビターは、それぞれ式ＭおよびＭ'に示す(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)またはその対応遊離塩基である。これらインヒビターは、最終的に２つの断片、式Ｖ：
【化１５】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸と式Ｊ：
【化１６】
で示される(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド酸塩、たとえば塩酸塩またはメタンスルホン酸塩（メシルまたはＭＳＡ塩）とのカップリングによって生成される。
【００１４】
出発物質として選択した中間体化合物に依存して、これら断片を製造およびカップリングするための種々の方法を本明細書に開示する。たとえば、本発明の一つの態様において、式ＩＩで示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。本発明の他の態様において、式Ｖで示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。本発明の他の態様において、式ＶＩで示される(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。本発明のさらに他の態様において、式ＩＶで示される(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルからシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。
【００１５】
本発明の他の目的は、シクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造に有用な中間体の合成方法を提供することである。本発明の一つの態様において、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を不斉還元的アミノ化またはトランスアミノ化して(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）とする方法が提供される。本発明の他の態様において、トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）から(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を化学合成する方法が提供される。本発明の他の態様において、アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）、およびジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）から3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を製造する方法が提供される。アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）、およびジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）を製造する方法もまた提供される。本発明の他の態様において、4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式III）から(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）を製造する方法が提供される。この態様において、ついで(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）を(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の製造の中間体として用いることができる。
【００１６】
本発明の他の目的は、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の不斉還元的アミノ化またはトランスアミノ化によって (αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を産生することのできる細胞株を提供することである。好ましい態様において、この細胞株はホルメートデヒドロゲナーゼおよびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現するプラスミドを含む細胞を包含する。最も好ましいのは、ATCC受託番号PTA-4520の細胞株である。
【００１７】
(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)およびその対応遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル融合ピロリジンベースの化合物は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満、およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫調節疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである。本発明において、(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)およびその対応遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル融合ピロリジンベースの化合物の製造に用いるための新規な化合物および方法が提供される。
【００１８】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)は下記式Ｍ：
【化１７】
で示され、好ましくはその対応遊離塩基は下記式Ｍ'：
【化１８】
で示され、その一水和物は上記Ｍ''で示される。
【００１９】
本発明において、２つの断片のアセンブリーによって(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル（式Ｍ'）を製造する方法が提供される。これら断片は、式Ｖ：
【化１９】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸および式Ｊ：
【化２０】
で示される(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドの塩酸塩やＭＳＡ塩などの酸塩である。本発明はまた、これら断片の製造方法並びにこれら断片の製造に有用な中間体化合物をも提供する。
【００２０】
本発明の一つの側面において、中間体化合物である3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の還元的アミノ化またはトランスアミノ化によって断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を製造する方法が提供される。この方法の好ましい態様において、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）がフェニルアラニンデヒドロゲナーゼやケト酸で活性な他のアミノ酸デヒドロゲナーゼを用いて酵素的に行う還元的アミノ化により(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）に変換される。本発明において有用なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの例としては、これらに限られるものではないが、Sporosarcina種からのもの、またはThermoactinomyces intermediusなどのThermoactinomyces種からのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが挙げられる。還元的アミノ化は、大腸菌またはPichia pastorisにおいて発現されるThermoactinomyces intermedius、ATCC 33205のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを用いて行うのが好ましい。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼThermoactinomyces intermedius、ATCC 33205を発現する大腸菌およびPichia pastorisの組換え株の構築および増殖は、Hansonら（Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358）によって記載されている。メタノール上でのPichia pastorisの増殖はまた、ホルメートデヒドロゲナーゼの産生を含む（Hansonら、Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358）。
【００２１】
Pichia pastoris（ATCC 20864）ホルメートデヒドロゲナーゼおよびThermoactinomyces intermedius（ATCC 33205）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の改変形を発現するプラスミドを含む大腸菌は、ブダペスト条約の規定のもと、国際寄託当局に寄託および受領されている。寄託は、２００２年６月２５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard in Manassas、バージニア、20110-2209）に対して行った。ATCC受託番号はPTA-4520である。この細胞株への公的アクセスに対する全ての制限は、本件特許出願の権利化により非撤回的に除かれるであろう。寄託は、公的寄託機関において寄託の日から３０年の期間または試料の最新の請求から５年間または特許の有効期間のいずれか遅い日まで維持されるであろう。上記細胞株は寄託の際には生存していた。もしも生存した試料が寄託機関によって分配することができない場合には、該寄託は交換されるであろう。
【００２２】
(<aS)-<a-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）への3-ヒドロキシ-<a-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の還元的アミノ化を下記スキームＩに示す。
【００２３】
スキームＩ
【化２１】
【００２４】
スキームＩに示すように、この反応にはアンモニアおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が必要である。この反応で生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、ホルメートデヒドロゲナーゼによるギ酸の二酸化炭素への酸化によってＮＡＤＨにリサイクルされる。この反応からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の予測収率は80〜100%であり、予測エナンシオマー過剰は99%を超える。本明細書の実施例１〜１０をも参照のこと。
【００２５】
同変換はまたスキームＩＩに示すようにトランスアミナーゼを用いても行うことができる。
スキームＩＩ
【化２２】
【００２６】
スキームＩＩに示すように、この酵素的変換においてグルタミン酸はアミノドナーとして作用する。この変換に用いるトランスアミナーゼの例は、本明細書の実施例１１に示す分枝鎖トランスアミナーゼである。
【００２７】
他の態様において、(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）は化学的に合成される。(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の化学的合成法の例をスキームIIIに示す。
スキームIII
【化２３】
【００２８】
スキームIIIに示すように、(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のラセミ混合物は、まずトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸をα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）に臭素化することによってトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）から化学的に合成される。この臭素化において、出発物質であるトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）を塩化チオニルに懸濁する。ついでジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加え、懸濁液を室温で1.5時間攪拌する。この反応の完了はガスクロマトグラフィーにより確認する。ついで、固体の無水Ｎ−ブロモコハク酸（ＮＢＳ）を反応混合物に少しずつ加え、反応混合物を60℃に加熱する。反応液を３時間攪拌する間、温度を60〜65℃に維持する。再び、反応の完了をガスクロマトグラフィーにより確認する。ついで、ヘプタンを反応混合物に加え、過剰の塩化チオニルを78〜80℃で留去する。水を加えて反応を停止させ、ヘプタンをさらに加える。ついで、水性層を有機層から分離し、有機層を水洗する。洗浄後、水をさらにヘプタン層に加え、ヘプタンを留去する。ついで、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を残りの水性層に加え、混合物を室温で数時間激しく攪拌する。この加水分解をスピードアップするため水をさらに加えてもよい。ついで、ＴＨＦを留去し、２相（水および油）反応混合物とする。ついで、種晶（seeds）を加え、反応液を室温に達するようにすると、その間にα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）が重い固体として生成する。懸濁液を攪拌可能にするため、水およびアセトニトリルを加える。数時間攪拌した後、α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）を含む固体を濾去し、アセトニトリルで数回洗浄する。本明細書の実施例１７をも参照のこと。
【００２９】
ついで、α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）をH2SO4およびHNO3と反応させてα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を得る。さらに詳細には、α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）は、まずエーレンマイヤーフラスコにH2SO4を充填することによりα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）から調製される。ついで、このフラスコを氷浴で冷却し、フラスコに50%HNO3を加える。ついで、固体のα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）を混合物に少しずつ加えて温度を28℃未満に保持する。ついで、透明な溶液が得られるまで反応液を攪拌しながら60℃に加熱する。反応が完了したら室温に冷却し、保持する。ついで、水を加えて反応を停止させる。得られたスラリーを氷浴で冷却し、ついで濾過してα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を得る。本明細書の実施例１８をも参照のこと。
【００３０】
ついで、α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を水酸化アンモニウム、好ましくは30%水酸化アンモニウムに溶解し、反応混合物を好ましくは65℃に加熱する。ついで、反応混合物を濃縮固化する。ついでEtOHを加え、反応液を再び濃縮して(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を含むラセミ混合物を得る。本明細書の実施例１９をも参照のこと。
【００３１】
ラセミ混合物から(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖのラセミ混合物）を単離するため、テトラヒドロフラン中の無水Ｂｏｃおよび水酸化ナトリウムを用いた典型的なＢｏｃ保護により混合物を処理してα-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-]3]ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｑ）を得る。ついで、α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-]3]ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｑ）を[1R,2S]-(-)-1,2-ジフェニルヒドロキシエチルアミン、1,7,7-トリメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-アミンまたはS-(-)-1-1(1-ナフチル)エチルアミンなどのキラルな塩基と混合し、混合物を蒸発乾固する。乾燥した混合物を溶媒に再懸濁し、再懸濁した混合物を数時間攪拌しながらシェーカーに入れる。室温に冷却すると(αS)-α-[[ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｓ）の結晶化が起こる。本明細書の実施例２０をも参照のこと。
【００３２】
Ｂｏｃ基を除去すると(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を生成する。
【００３３】
本発明の他の側面は、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の合成に用いる中間体化合物3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の製造方法に関する。中間体化合物3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）は、スキームＩＶに示す方法に従って製造することができる。
【００３４】
スキームＩＶ
【化２４】
【００３５】
スキームＩＶに示すように、この方法ではアダマンチルブロマイド（式Ａ）を塩化亜鉛触媒でアルキル化してα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）を生成する。ついで、α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）をメタノール中の塩化アセチルを用いてエステル化してα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）を生成する。ついで、α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）をスワーン酸化によりα-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）に変換する。ついで、α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）をヒドロキシル化して３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）を生成し、これを加水分解して３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を生成する。本明細書の実施例２１〜２５をも参照のこと。
【００３６】
別法として、中間体化合物である３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）はまたスキームＶに示す方法に従って製造することができる。
スキームＶ
【化２５】
【００３７】
スキームＶに示すように、(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシラン（１）をKurodaら（EP 08 08 824A3；Imashiro and Kuroda Tetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315）の方法をわずかに改変することにより調製する。ブロモアダマンタンを化合物１で塩化亜鉛の影響下で処理すると（Reetzら、Chem. Int. Ed. Engl. 1979 18:72, Reetz and Heimbach Chem. Ber. 1983 116: 3702-3707、Reetzら、Chem. Ber. 1983 116: 3708-3724）、式ＶIIで示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステルが得られる。ついで、式ＶIIで示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステルを濃硫酸中の一酸化窒素でヒドロキシル化して式ＶIIIで示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステルを定量的収量で得る。式ＶIIIの化合物をメタノール中の水酸化ナトリウム水溶液で室温にて加水分解すると式ＩＸで示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸が得られる。引き続きジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）を弱塩基、好ましくは重炭酸ナトリウムで処理すると中間体化合物である３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）のみが生成する。本明細書の実施例２６〜２９をも参照のこと。
【００３８】
スキームＶＡ
【化２６】
【００３９】
スキームＶＡに示すように、中間体化合物である３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）は１ポット手順で調製できる。示すように、式ＶIIIの化合物をアルゴンなどの不活性雰囲気中、テトラヒドロフラン（または水酸化カリウムや水酸化リチウムなどの他の塩基）中の水酸化ナトリウム水溶液で処理して対応のナトリウム塩を得る。このナトリウム塩を回収することなく、このナトリウム塩を含有する反応混合物を塩酸などの酸で処理してｐＨを約0.50、好ましくは約0.20まで下げて対応のケト酸ＩＩを生成し、このものは水から再結晶させてケト酸ＩＩの結晶を生成させることができる。
【００４０】
本発明の他の側面は、断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）の製造方法に関する。(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニルの製造に用いるこの断片は、下記スキームＶＩに示す方法に従って製造することができる。
【００４１】
スキームＶＩ
【化２７】
【００４２】
スキームＶＩに示すように、L-ピログルタミン酸（式Ｅ）をまずエステル化してL-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ；SQ 7539）を得る。ついで、このL-ピログルタミン酸エチルエステルを窒素原子上でBOC-保護して(5S)-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式Ｇ）を得る。ついでSuperHydride還元および脱離を行って4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式III）を生成する。ついでBOC-DHPEE IIIを水酸化リチウムを用いた鹸化により加水分解してBOC-DHPを生成する。ついで、塩化メシルおよびその後のアンモニアを用いた混合無水物によりBOC-DHP上でアミドを生成させて(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）を製造する。ついで、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）をSimmons-Smith反応によりシクロプロパン化して(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）を生成する。ついで、BOCを除去して、断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）の塩酸塩やメタンスルホン酸塩などの酸塩の生成という結果となる。実施例２９〜３５をも参照のこと。
【００４３】
スキームＶＩにも示す本発明の他の側面は、Simmons-Smith反応でのシクロプロパン化による(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）の(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）への変換に関する。この反応では、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルを第一のリアクター中で塩化メチレンに溶解する。第二のリアクターでは塩化メチレンを-30℃に冷却し、ジメトキシエタンおよびトルエン中のジエチル亜鉛の30%溶液を加え、ついでジヨードメタンを加える。ついで、この混合物を第一のリアクターに加え、ついで飽和重炭酸塩溶液を加える。得られた反応混合物を沈殿が生成するまで攪拌する。ついで、沈殿を濾過し、洗浄し、塩化メチレンに２回またはそれ以上再懸濁する。ついで、濾液を水性相と有機相とに分離し、有機相を半飽和食塩水で洗浄する。溶媒を除去し、ヘプタンと交換してヘプタン中の(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の粗製の生成物のスラリーを得る。
【００４４】
別法として、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）はスキームＶＩＡに示すようにして調製できる。
スキームＶＩＡ
【化２８】
【００４５】
スキームＶＩＡに示すように、4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルのDCHA塩（Ｘ）を水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属塩基で処理してナトリウム塩などの対応の塩を生成させる。
【００４６】
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルのナトリウム塩（ＸＩ）もまた、対応のエチルエステルから該エチルエステル（好ましくはトルエン中の該エチルエステルの溶液）をエタノールおよび水酸化ナトリウムで処理することにより調製できる。
【００４７】
ナトリウム塩ＸＩの溶液を塩化アンモニウムやリン酸二水素ナトリウムなどの緩衝液で処理して溶液のｐＨを７未満、好ましくは約６〜６.５とし、ナトリウム塩の緩衝溶液を4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM）で処理して活性化DMT-エステル（ＸII）を生成し、これをアンモニアまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは水酸化アンモニウムなどの他の塩基で処理して(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（ＩＶ）を生成する。
【００４８】
4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM）は、スキームＶＩＡに示すように、2-Cl-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン（CDMT）およびN-メチルモルホリンを約0〜約10℃の低下した温度にて反応させてDMT-MMを生成することによって調製できる。
【００４９】
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルのDCHA塩（Ｘ）は、対応のナトリウム塩（ＸＩ）から、前もって調製したDCHA塩（Ｘ）の水溶液をメチルt-ブチルエーテル（MTBE）で処理し、反応混合物のｐＨをH3PO4などの酸を用いて2.5〜3に調節することで調製できる。有機層を分離し、食塩で洗浄して対応のナトリウム塩（ＸＩ）を生成する。得られた反応混合物を冷却し、DCHAで処理して対応のDCHA塩（Ｘ）を生成する。
【００５０】
スキームＶＩＢ
【化２９】
【００５１】
スキームＶＩ中の化合物Ｈはまた、スキームＶＩＢに示すように、N-BOC 4,5-デヒドロプロリンエチルエステル（III）のシクロプロパン化により以下のようにして調製できる。
【００５２】
N-BOC 4,5-デヒドロプロリンエチルエステル（III）をトルエン、塩化メチレンまたはジクロロエタンなどの乾燥有機溶媒の存在下、約-30℃〜約0℃の範囲の低下した温度にてジエチル亜鉛で処理してN-BOC 4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶ）を得る。
【００５３】
得られたBOC 4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶ）（シン異性体とアンチ異性体との混合物（8:1））をアルゴン雰囲気などの不活性雰囲気下でメチルアミン水溶液で処理することにより分離し、シン(S)-BOC-4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶＩ）（ＸＶIIから分離）を回収する。
【００５４】
エタノールまたはトルエンやＴＨＦなどの他の有機溶媒中のs-BOC-4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶＩ）を、水酸化リチウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液などの塩基で処理して対応のs-BOC-4,5-メタノプロリン遊離酸（ＸＶIII）を生成する。
【００５５】
N-メチルモルホリンの存在下、約-8℃を超えないような低下した温度でＴＨＦまたは塩化メチレン；クロロギ酸イソブチルまたは塩化メシルなどの有機溶媒に溶解した遊離酸（ＸＶIII）を処理し、ついで反応混合物をアンモニアで処理してs-BOC-メタノプロリンアミド（Ｈ）を生成することにより、遊離酸（ＸＶIII）を対応s-BOC-メタノプロリンアミド（Ｈ）に変換する。
【００５６】
本発明の他の側面は、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）および断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）をカップリングして(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）を生成するカップリング方法に関する。これら断片のカップリングを下記スキームＶIIに示す。
【００５７】
スキームＶII
【化３０】
【００５８】
スキームＶIIに示すように、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下、BOC2Oで処理し、酢酸エチル（EtOAc）抽出により分離して(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を分離することにより、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）をまずBOC保護して(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を生成する。別法として、酢酸エチルの代わりに酢酸イソプロピル／ヘプタンを用いて遊離の酸（ＶＩ）を結晶化することができる。他の態様において、実施例８Ａに示すように、式Ｖの化合物を単離PDH/FDH酵素濃縮物を用いた生物変換から単離することなく用いる。
【００５９】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの適当な有機溶媒（約-10℃〜約0℃の範囲の温度に冷却）中の式ＶＩの化合物の溶液をメタンスルホニルクロライド（塩化メシル）、およびHunig塩基（ジイソプロピルエチルアミンまたはDIPEA）で処理して式ＶＩの化合物の対応のメタンスルホン酸塩を生成する。
【００６０】
ついで、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）または他の公知のカップリング剤の存在下、カップリング反応を用いて(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）メタンスルホン酸塩を(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）にカップリングして3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成する。式Ｋの化合物をピリジンやトリエチルアミンなどの有機塩基および無水トリフルオロ酢酸で処理することにより脱水に供し、ついで約0℃〜約10℃に冷却し、水酸化ナトリウムまたはKOHやLiOHなどの他の強塩基を加えることにより加水分解に供して化合物（Ｌ）を生成する。ついで、3-シアノ-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を脱保護（および安息香酸ナトリウムで処理）してジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）（式Ｍ）を生成する。本明細書の実施例３７〜３９をも参照のこと。
【００６１】
スキームＶIIＡ
【化３１】
【００６２】
スキームＶIIＡに示すように、化合物（Ｋ）はまた以下のようにして化合物（ＶＩＡ）（DABCO塩）から調製できる。
【００６３】
式ＶＩの酸を1,4-ジアザビシクロ[2,2,2]オクタン（DABCO）で処理して(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）を生成する。ついで、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）または他の公知のカップリング剤の存在下、カップリング反応（スキームＶIIＡに記載）を用いて(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）を(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドHClまたはMSA塩（式Ｊ）にカップリングして3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成する。
【００６４】
スキームＶIIに戻ると、化合物（Ｌ）をスキームＶIIＢに記載するように塩酸などの強酸で処理することにより脱保護できる。
【００６５】
スキームＶIIＢ
【化３２】
【００６６】
スキームＶIIＢを参照すると、遊離塩基一水和物（Ｍ''）をBOC-保護中間体（Ｌ）から以下のようにして生成できる。
【００６７】
BOC-保護中間体（Ｌ）を、反応温度を約20〜25℃の範囲に保持しながら塩化メチレンおよびメタノールの存在下、濃塩酸で処理して塩酸塩（Ｌ'）を生成する。塩酸塩（Ｌ'）を水酸化ナトリウムまたは他の強塩基で処理して遊離塩基（Ｍ'）を生成する。ついで、遊離塩基（Ｍ'）を水で処理して遊離塩基一水和物（Ｍ''）を生成する。
【００６８】
本明細書の開示を読んだ当業者には理解されるであろうように、最終生成物ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）（式Ｍ）またはその対応の遊離塩基（Ｍ'）または遊離塩基一水和物（Ｍ''）は、出発物質としてどの中間体を選択するかによって、スキームＩ、ＩＩ、またはIIIおよびＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶIIおよびＶIIＡに示すすべての工程またはスキームＩ、ＩＩ、またはIIIおよびＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶIIおよびＶIIＡのいずれかに示す一部の工程のみを用いて製造することができる。たとえば、本発明の技術を用い、当業者であれば出発物質として式ＩＩの３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式Ｖの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式ＶＩＡの(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩、または式ＩＶの(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルを用いて、シクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）（式Ｍ）またはその対応の遊離塩基（Ｍ'）を常法により製造することができる。
【００６９】
それゆえ、当業者であれば、単に(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）（またはそのDABCO塩（式ＶＩＡ））を(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）にカップリングして3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成し、3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を脱水して3-シアノ-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を生成し、ついで3-シアノ-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を加水分解してジペプチジルペプチダーゼＩＶを生成することによって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造することができる。この方法において、出発物質は、断片である(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）（またはそのDABCO塩（式ＶＩＡ））および(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）を含む。
【００７０】
しかしながら、本発明の方法は、断片(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を中間体(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）からBOC保護により製造することをさらに含む。この態様において、この方法は、酵素的アミノ化またはトランスアミノ化により３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を不斉還元することによって(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を製造することをさらに含む（スキームＩまたはＩＩを参照）。別法として、この方法は、スキームIIIに従ってトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の化学合成をさらに含む。
【００７１】
さらに、または別法として、この方法は、中間体(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）からのBOCの除去により、断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）を製造する工程をさらに含む。この態様において、この方法は、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）の好ましくはSimmons-Smith反応によるシクロプロパン化によって(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）を製造する工程をさらに含む。
【００７２】
本発明の他の側面は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造における有用な中間体として本明細書において同定される新規な化合物に関する。ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造における中間体として有用な本発明の化合物としては、式Ｉ：
【化３３】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル、式ＩＩ：
【化３４】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式ＩＶ：
【化３５】
で示される(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル、式Ｖ：
【化３６】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式ＶＩ：
【化３７】
で示される(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、(またはそのDABCO塩ＶＩＡ)、式ＶII：
【化３８】
で示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル、式ＶIII：
【化３９】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル、および式ＩＸ：
【化４０】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル-酢酸が挙げられる。
【００７３】
好ましい態様において、本明細書に示すように、これら化合物は、式Ｍ：
【化４１】
で示されるジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)および好ましくはそれぞれ式Ｍ'およびＭ''で示されるその対応の遊離塩基またはその一水和物Ｍ''
【化４２】
またはその一水和物Ｍ''（上記に記載）の製造における中間体として用いる。
【００７４】
本発明の化合物および方法を用いて製造したジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターは、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満、およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫調節疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用である。
【００７５】
以下の実施例は本発明の好ましい態様を表す。
【００７６】
実施例
実施例１
Thermoactinomyces intermediusからのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現し内生のホルメートデヒドロゲナーゼを産生する組換えPichia pastorisからの抽出物を用いた還元的アミノ化
Thermoactinomyces intermediusからのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現する組換えPichia pastoris凍結細胞（2.25kg）を、ギ酸アンモニウム（28.65g、0.454モル）を含む脱イオン水（6.75L）に加えた。解凍後、細胞をJanke and Kunkel Ultra-turrax T25ホモジナイザーを用いて浮遊させ、濃NH4OHでpH7に調節し、粉砕した氷で冷却して50mMギ酸アンモニウム中の25%w/v細胞浮遊液を得た。細胞をマイクロ流動床（microfluidizer）に12000psiで２回通すことにより破砕し、細胞破砕物を20,000xgで4℃にて遠心分離することにより除去した。アッセイＡ（実施例９）またはアッセイＢ（実施例１０）によってそれぞれ決定されるように230998単位または124641単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ活性を含み80080単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む上澄み液7024mlを、New Brunswick Scientific Bioflo IVバイオリアクターの16L容の容器に加えた。
【００７７】
ギ酸アンモニウム（442.5g、7.017モル）および(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸（786.7g、3.510モル）を含む7024mlの溶液を調製した。この溶液のｐＨを276mlの濃水酸化アンモニウムを用いて8.0に調節した。ついで、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD；9.834g、14.82ミリモル）およびジチオトレイトール（2.163g、14.027ミリモル）を加え、この溶液をPichia pastoris抽出物を含むバイオリアクターに加えた。溶液を40℃に保持し、150rpmで攪拌した。反応開始後、それぞれ0、3および18時間で45、25および27mlの濃水酸化アンモニウムのアリコートを加えてｐＨを8.0に調節した。25時間後、この溶液にはHPLC分析（実施例８、方法２参照）によって測定されるように818.9g（3.637モル、100%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸が含まれていたが、検出可能なケト酸または該アミノ酸のR-エナンシオマーは含まれていなかった。
【００７８】
(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を、アンモニアを飛ばすための酵素的変換混合物の沸騰、ギ酸によるｐＨ３への調節、沈殿したタンパク質を除去するための濾過、該アミノ酸のDowex 50 (H+)樹脂への吸着、1.5Mアンモニアによる溶出、およびリッチ溶出液の濃縮からなる手順により単離して、(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸を結晶性固体として得た。この単離手順を用いた最後の操作（787gのケト酸の投入）は、804gの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸を94.3%の効力および3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からの96.0%の収率で与えた。この手順により単離された(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸のすべてのバッチは、(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩までのその後の反応において、うまく扱うことができた。
【００７９】
実施例２
組換えPichia pastorisからの加熱乾燥細胞を用いた還元的アミノ化
0.50Mギ酸アンモニウム、0.25M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1.06mM NAD、1.00mMジチオトレイトール、およびアッセイＡにより決定されるように32.7単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび24.6単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む250mgの組換えPichia pastoris加熱乾燥細胞を最終容量4.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。Pichia pastoris加熱乾燥細胞の調製はHansonら（Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358）によって記載されている。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、100rpmにて4日間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は45.02mg/ml（80%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８０】
実施例３
組換えPichia pastorisからの湿潤細胞を用いた還元的アミノ化
0.415Mギ酸アンモニウム、0.208M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、0.88mM NAD、0.84mMジチオトレイトール、およびアッセイＡにより決定されるように6.06単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび12.8単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む12.5% w/vのPichia pastoris湿潤細胞を最終容量3.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、200rpmにて68時間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は31.9mg/ml（68%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８１】
実施例４
Thermoactinomyces intermediusからのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現する組換え大腸菌加熱乾燥細胞およびCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化
0.50Mギ酸アンモニウム、0.25M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1.06mM NAD、1.00mMジチオトレイトール、2.55単位/ml（0.51単位/mg）のCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim）、およびアッセイＡにより決定されるように76単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含む250mgの組換え大腸菌加熱乾燥細胞を最終容量4.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、100rpmにて4日間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は7.69mg/ml（13.7%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８２】
実施例５
組換え大腸菌湿潤細胞およびCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化
0.415Mギ酸アンモニウム、0.208M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、0.88mM NAD、0.84mMジチオトレイトール、1単位/ml（0.51単位/mg）のCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim）、およびアッセイＡにより決定されるように97単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含む12.5%w/vの大腸菌湿潤細胞を最終容量3.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、200rpmにて68時間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は5.16mg/ml（11.0%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８３】
実施例６
Sporosarcina種からのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化
0.15Mギ酸アンモニウム、0.05M（11.2mg/ml） (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1mM NAD、1mMジチオトレイトール、0.51単位/ml（0.51単位/mg）のCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim）および1.01単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（14.5単位/mg；Sigma Chemical Co.）を最終容量1.0ml、ｐＨ8.5（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を30℃にて20時間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は0.31mg/ml（2.74%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８４】
実施例７
プラスミドpBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築
発現ベクターpBMS2000-PPFDH-PDHmodの２工程構築を用いた。適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにP. pastorisのFDH遺伝子の5'末端および3'末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
5' TCGTCATGAAAATCGTTCTCGTTTTG 3' (5'末端；センス；配列番号1)
BspHI
5' TACTGTTTTTCCAGCGTATTCCTAGGCT 3' (3'末端；アンチセンス；配列番号2)
BamHI
を用い、P. pastorisのFDH遺伝子を発現ベクターpBMS2000（pBMS2000はS. W. Liuらの米国特許第6,068,991号（2000年5月30日発行）に開示されている）にサブクローニングした。
【００８５】
それぞれ1×TaqPlus反応緩衝液（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）、0.2mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP）、0.4nMの各オリゴヌクレオチド、2.5UのTaqPlus DNAポリメラーゼ（Stratagene）、およびP. pastorisのFDH遺伝子を含む10pgのプラスミドDNAを含有する４つの100μlアリコートでP. pastorisのFDH遺伝子の高信頼性PCR増幅を行った。増幅条件は、自動伸長Perkin-Elmer Model 480サーモサイクラーを用い、94℃で4分間インキュベートした後、94℃で1分間；50℃で1分間；および72℃で1.5分間の25サイクルを含んでいた。
【００８６】
このPCR反応混合物を等容量の1:1フェノール:クロロホルム（GibcoBRL、ゲイサーズバーグ、メリーランド）で抽出し、13,000×gで5分間遠心した。上部の水性相をとり、新たなマイクロ遠心管に入れた。0.1容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の氷冷エタノールを加えてDNAを沈殿させた。13,000×gで5分間遠心分離後、液体を管から吸引し、ペレットを0.5mlの氷冷70%エタノールで洗浄した。液体を再び吸引し、ペレットを室温で30分間空気乾燥させた。
【００８７】
増幅したDNAを各20単位のBspHIおよびBamHIで3時間、37℃にて全量50μlで消化した。これと平行してpBMS2000ベクター（2μg）をBspHIおよびBamHIで消化した。消化した試料を1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。FDH遺伝子（1100-塩基対断片）および線状化ベクター（4700-塩基対断片）に対応するバンドを別々にゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen、チャッツワース、カリフォルニア）を用いて精製した。これら単離断片の濃度を低分子量ラダー（Invitrogen Corp.、カールスバード、カリフォルニア）に対する電気泳動により推定し、5:1（挿入：ベクター）のモル比にて全量10μlで22℃にて2時間ライゲートした。15μlのdH2Oおよび250μlの1-ブタノールを加えてDNAを沈殿させ、マイクロ遠心管中で13,000×gにて5分間ペレット化した。液体を吸引除去し、DNAをSpeedVac（Savant Instruments、ファーミングデール、ニューヨーク）で5分間、低加熱下で乾燥させた。ペレットを5μlのdH2Oに再懸濁した。
【００８８】
再懸濁したDNAをエレクトロポレーションにより0.04mlの大腸菌DH10Bコンピテント細胞（Invitrogen）に25μFおよび250Ωにて形質転換した。SOC培地を直ちに加え（0.96ml；SOC＝1リットル当たり0.5%酵母抽出物、2%トリプトン、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、および20mMグルコース）、細胞をシェーカー中で1時間、37℃および225rpmにてインキュベートした。プラスミドDNAを含むコロニーを、50μg/mlの硫酸カナマイシン（Sigma Chemicals、セントルイス、ミズーリ）を含むLBアガープレートで選択した。所望の挿入を有するプラスミドは、RapidCycler（Idaho Technology、ソールトレイクシティー、ユタ）を用いたキャピラリー管でのコロニーＰＣＲにより同定した。各反応混合物は、50mM Tris-HCl（pH 8.3）、4mM MgCl2、0.25mg/mlのウシ血清アルブミン、2%スクロース400、0.1mMクレゾールレッド、0.4nMの各プライマー（配列番号1および配列番号2）、および2.5UのTaq DNAポリメラーゼ（Promega Corp.、マジソン、ウィスコンシン）を含んでいた。反応混合物を10μlのアリコートに分け、丸底マイクロタイタープレートのウエルにピペッティングした。カナマイシン耐性コロニーを使い捨てプラスチック播種針を用いて拾い、反応混合物に掻き混ぜて入れ、LB-カナマイシンアガーに移した。各反応混合物アリコートを30μl容キャピラリー管に入れ、管の両端をフレームシールした。細胞を溶解し、94℃で30秒インキュベートしてDNAを変性し、RapidCycler（Idaho Technology、ソールトレイクシティー、ユタ）を用いて94℃で0秒間、40℃で0秒間、および72℃で60秒間の30サイクルを用いて増幅を行った。試料を1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。17の試験した試料のうち7つの試料が1100塩基対で強いバンドを示した。このプラスミド（本明細書でpBMS2000-PPFDHと称する）を含む1つのコロニーをプラスミド構築における次の工程のために選択した。
【００８９】
「PDHmod」は、(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸への完全な変換に必要な最後の２つのアミノ酸およびカルボキシル末端のさらなる１２アミノ酸の変化により刊行されたDNA配列（Takadaら、J. Biochem. 109, pp. 371-376 [1991]）とは異なっている改変したThermoactinomycetes intermediusフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをいう。この変化をプラスミドpPDH9K/10（Donovanらの特許WO200004179（2000年1月27日発行）に詳細が記載されている）に導入し、ついでこのプラスミドをP. pastoris SMD1168（株ATCC 74408として寄託）に形質転換した。
【００９０】
天然のPDH遺伝子の3'末端および対応アミノ酸は以下のとおりである：
AAC AGC GCA AGG AGG TAA
Asn Ser Ala Arg Arg 停止
【００９１】
PDHmod遺伝子の3'末端および対応アミノ酸は以下のとおりである（変化したまたは新規なアミノ酸は強調してある）：
AAC AGC GCG GAG GGG TAC CTC GAG CCG CGG
Asn Ser Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Pro Arg
CGG CCG CGA ATT AAT TCG CCT TAG（配列番号5）
Arg Pro Arg Ile Asn Ser Pro 停止
【００９２】
適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにPDHmod遺伝子の5'末端および3'末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
GATGCTCATATGCGCGACGTGTTTGAAATGATG（5'末端、センス；配列番号3）
NdeI
GATCCCGGGCTAAGGCGAATTAATAATTCG（3'末端、アンチセンス；配列番号4）
SmaI
を調製した。
【００９３】
ＰＣＲによるPDHmodの増幅および精製のための反応条件は、ATCC 74408から調製した染色体ＤＮＡを反応のための鋳型として含めた他はP. pastorisのFDH遺伝子に用いたものと同一であった。得られた断片を各20単位のNdeIおよびSmaIで25℃にて1時間、ついで37℃にて2時間、全容量50μlで消化した。これと平行して開始コドンにNdeI部位を有するpBMS2000ベクターのバージョン（2μg）を同一条件を用いてNdeIおよびSmaIで消化した。これら消化した試料を別々に1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。PDHmod遺伝子（1200-塩基対断片）および線状化ベクター（4700-塩基対断片）に対応するバンドをゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。これら２つの断片のライゲーション、大腸菌の形質転換、およびPDHmod遺伝子を有する挿入（pBMS2000-PDHmodを形成）を含むコロニーのスクリーニングは上記と同様にして行った。
【００９４】
pBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築のため、pBMS2000-PDHmod（2μg）を50μLの反応液中、各10単位のHindIIIおよびSmaIで25℃にて1時間、ついで37℃にて1時間開裂させた。10単位のT4DNAポリメラーゼ（Invitrogen）および4つのすべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の2.5mM混合物2μLを加え、試料を11℃で20分間インキュベートした。反応液を1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。1800-塩基対断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて単離した。この断片は、順にtacプロモーター、groES遺伝子、およびPDHmod遺伝子（転写融合物として）を含んでいる。つぎに、pBMS2000-PPFDH（2μg）を10単位の制限エンドヌクレアーゼSmaIで50μL容量にて2時間、25℃で消化し、ついで0.4単位のエビアルカリホスファターゼ（United States Biochemicals、クリーブランド、オハイオ）で1時間、37℃にて処理した。プラスミドDNAを1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動し、単離し、QIAquickキットを用いて抽出した。これら２つの断片を6.5：1（挿入：ベクター）のモル比で16℃にて4時間、10μLの最終容量でライゲートした。1-ブタノール抽出および遠心分離後、DNAをエレクトロコンピテントDH10B細胞に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを、FDHについて記載したのと同様にして２つのPDHmod-特異的プライマーを用いてPDHmod遺伝子の存在についてスクリーニングした。第二ラウンドのＰＣＲスクリーニングは、それぞれPPFDH遺伝子の5'末端およびPDHmodの3'末端に相同なプライマーを用いて行った。1400-塩基対断片の増幅を支持することのできた構築物のみが２つの遺伝子を正しい方向で有していた。一つのそのようなプラスミドが見出され、方向性がKpnIを用いた診断的制限消化によって確認された（この消化により5422塩基対および1826塩基対の予期された断片が得られた）。このプラスミドを「pBMS2000-PPFDH-PDHmod」と称した。
【００９５】
実施例８
FDHおよびPDHmodの発現
pBMS2000-PPFDH-PDHmodを大腸菌JM110に形質転換した。シェークフラスコ研究においてJM110（pBMS2000-PPFDH-PDHmod）をMT5培地（2.0%Yeastamine、4.0%グリセリン、0.6%リン酸ナトリウム［二塩基性］、0.3%リン酸カリウム［一塩基性］、0.125%硫酸アンモニウム、0.0256%硫酸マグネシウム［七水和物；滅菌1M溶液からオートクレーブ後に添加］、および50μg/mlの硫酸カナマイシン［濾過滅菌した50mg/ml溶液からオートクレーブ後に添加］）中、28℃、250rpmで18時間増殖させた。600nmでの光学密度（OD600）を記録し、0.35の開始OD600を与えるに充分な細胞を新鮮なMT5/カナマイシン培地に加えた。OD600が0.8〜1.0となるまで、フラスコを250rpm、28℃にて振盪した。両遺伝子の発現を滅菌濾過した1Mイソプロピルチオ-β-Dガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度35μMで加えることによって誘発し、発酵を24〜48時間続けた。細胞を6,500×gで5分間遠心分離することによってペレット化し、等容量の50mMギ酸アンモニウム（pH7.0）で１回洗浄し、再度ペレット化した。細胞を-20℃で貯蔵するか、または直ちに用いた。ペレットを50mMリン酸アンモニウム（pH7.0）中、10mL/g（湿細胞重量）にて再懸濁し、Fisher Scientific Model 50 Sonic Dismembrator（Fisher Scientific、ピッツバーグ、ペンシルベニア）、マイクロチップで動力設定15を用いて3×15秒間超音波処理した。細胞破砕物は、13,000×gにて室温で5分間遠心分離することによりペレット化した。
【００９６】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により発現を調べた。1μLの細胞抽出物を5μLの4X NuPAGETM LDS緩衝液（Invitrogen）と混合し、蒸留水で19mLとした。試料を70℃で10分間加熱した。1mLの1Mジチオトレイトール溶液を混合物に加え、10μLを10%NuPAGETM Bis-Trisポリアクリルアミドミニゲルに適用した。電気泳動を200vで50〜60分間行い、ゲルを0.1%（w/v）クーマシーブルー（Sigma）、40%（v/v）エタノール、および10%（v/v）酢酸からなる溶液で染色した。染色液に浸漬したゲルを沸騰が明らかとなるまでマイクロ波オーブンで加熱し、ついでオービタルシェーカーで40rpmにて15分間振盪した。ゲルを脱イオン水で充分に洗浄し、脱色溶液（GelClearTM；Invitrogen）で覆った。この溶液を再び沸点ちょうどまで加熱し、少なくとも2時間穏やかに振盪した。インキュベートするとMr 43,000および40,000に２つの顕著なバンドが認められ、FDHおよびPDHmodのサブユニットの予期された分子量に対応していた。試料はまた、実施例１０に記載するようにして試験したときにFDHおよびPDHの両活性を有していることがわかった。この組換え大腸菌株にSC16496の内部表示を与えた。
【００９７】
SC16496を引き続き15-リットルおよび250-リットル容量で発酵させた。15-リットル発酵の場合、1mLの凍結SC16496を入れた一つのバイアルを室温で解凍し、4-リットルフラスコ中の50μg/mlのカナマイシンを含む1リットルのMT5培地に加えた。フラスコを28℃、250rpmにて24時間インキュベートし、Braun発酵曹中の13リットルのMT5培地（15Lの最終容量に基づいて成分をバッチ)に移した。それぞれ50μg/mlおよび0.0246%の最終濃度を与えるのに充分な硫酸カナマイシンおよび硫酸マグネシウム七水和物を500mLの蒸留水に溶解し、0.2ミクロン酢酸セルロース濾過ユニットにより濾過滅菌した。この溶液をタンクに加え、直ちに播種した。最初のOD600は約0.35であった。
【００９８】
発酵作業パラメーターは以下のとおりであった：
16リットルの作業容量
温度：28℃
換気：1.0vvm
圧力：690mbar
攪拌：500rpm
必要に応じてNH4OHを用いてpHを6.8に調節
フォーミング（foaming）は必要に応じてUCON（Dow Chemical Companyによって製造されたフルオロカーボン溶媒ブレンド）を添加して調節した。
【００９９】
OD600 0.8〜1.0（播種後約２時間）にて濾過滅菌したIPTG（500mLのdH2Oに溶解）を無菌的に加えて最終濃度を35μMとした。発酵をさらに48時間続けた時点でタンクの内容物を10℃に過冷した。細胞を遠心分離により回収し、0.1vol 50mMギ酸アンモニウム、pH7.0で１回濯いだ。細胞ペーストをプラスチック容器に入れ、必要なときまで-70℃で貯蔵した。
【０１００】
250-Lタンクについては、播種物は以下のようにして調製した：1mLの凍結SC16496を解凍し、50μg/mlのカナマイシンを含む300mLのMT5培地に加えた。フラスコを28℃、250rpmにて24時間増殖させた。OD600を決定し、80OD単位を与える細胞の適当な容量を除去し、250mLの新鮮なMT5培地に加えた。細胞をBraun発酵曹中の10LのMT5/カナマイシン培地に無菌的に加え（最初のOD600 〜0.008）、上記の発酵作業パラメーター下で16時間増殖させた。ついで、培養液を適当な濃度のカナマイシンおよび硫酸マグネシウムを含む250LのMT5に移した。これら条件下でのSC16496の倍加時間が90分であることに基づき、250L中の10Lの播種物は0.30〜0.35の開始OD600を与えるはずである。誘発、増殖、回収、および貯蔵は、15-L発酵について記載したのと同様にして行った。
【０１０１】
実施例８Ａ
単離したPDH/FDH酵素濃縮物を用いた3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ-[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を介した(αS)-α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）の短縮（telescoped）製造
【０１０２】
工程１：PDH/FDH酵素濃縮物の単離
大腸菌JM110（pBMS2000-PPFDH-PDHmod）の発酵ブロス（30リットル）を4000Lタンクから得、マイクロ流動床（MicrofluidicsモデルM-110Y、作動圧力12,000〜20,000psi）に通し（1回）、ブロスの温度を40℃未満に保ちながら細胞から活性を放出させた。マイクロ流動床ブロスのPDH/FDH活性は、PDHについては32I単位/ML、FDHについては8I単位/mlであった。
【０１０３】
ブロス全体を清澄化するため、4.5kgのCeliteを充分に攪拌したブロスに加えた。ついで、0.201リットルの30%水性ポリエチレンイミンを加え、30分間混合した。ついで、混合物を濾過プレス（Ertel Alsopモデル8-ESSC-10）を用いて濾過し、18リットルの濾液を得た。濾過ケーキを12リットルの水で洗浄して容量を30リットルに戻した。この工程の収率は、PDHの97%の活性の回復であり、活性は31IU/ml、FDHの活性は8IU/mlであった。
【０１０４】
清澄化したブロスを100,000 MWCOフィルターカセット（Millipore Pellicon 2ユニット、ポリエーテルスルホン低タンパク質結合カセット、0.5m2濾過面積）により限外濾過した。ポンプの循環速度は400mL/分であった。清澄化した濾液を1.5リットルに濃縮し、PDH力価が567IU/mlでFDH力価が136IU/mlの酵素濃縮物を得た。浸透液をアッセイしたところ、活性は認められなかった。濃縮物中の全体の酵素活性回収は84%であった。
【０１０５】
工程２：還元的アミノ化
3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ-[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）（1.00kg；4.46モル）を20L容器に加え、ついで水（5L）を加えた。混合物を攪拌し、10N NaOHでpHを調節してpH〜8として溶液を得た。Darco KBBカーボン（100g）を加え、混合物を5分間攪拌し、ついで5μの濾紙を用いてブフナー漏斗で濾過した。濾紙を水洗し（2×1L）、濾液および洗浄液をコンバインして透明な溶液を得た。
【０１０６】
攪拌しながらギ酸アンモニウム（0.562Kg；8.92モル）を加え、10N NaOHを用いてpHを再び〜7.5に調節した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（2.65g）およびジチオトレイトール（1.54g）を加えた。固形分が溶解したときにPDH/FDH酵素濃縮物を加えた（1.03L；PDHを500,000IU)。10N NaOHを用いてpHを室温で〜8.0に再調節した。
【０１０７】
ついで、混合物を〜40℃に温め、水で全容量10Lまで希釈した。42時間攪拌する間、pHを7.7〜8.3に保持した。得られた溶液は、0.955Kg（95.1%）の生成物(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を含んでいた。
【０１０８】
工程３：BOC-保護
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の溶液の一部（477.5g；2.12モル）にジカルボン酸ジ-tert-ブチル（1.022kg；4.68モル）を加えた。この混合物を、10N NaOHを用いてpHスタット滴定器で10に調節し保持しながら周囲温度で攪拌した。反応はBoc2Oの添加後4時間で完了し、このとき出発物質は1.0%未満しか残っていなかった。
【０１０９】
混合物のpHを35%H2SO4で〜8に調節し、混合物にi-PrOAc（5.0L）を加えた。ついで、混合物のpHを35%H2SO4で2.0に調節し、このpHで5〜10分間保持した。Dicalite（250g）を加え、混合物を〜10分間攪拌し、ついでブフナー漏斗中の濾紙上のDicalite（250g）のパッドで濾過した。Dicaliteのパッドを2.5Lのi-PrOAcでさらに洗浄した。
【０１１０】
濾液を10N NaOHでpH8に調節した。1時間沈降させた後、界面を含む有機層を廃棄した。水性層にi-PrOAc（7.5L）を加えた。混合物を35%H2SO4でpH〜2.0の酸性にし、ついで〜40℃に加熱し、穏やかに攪拌しながら4時間保持した。層を分離し、有機抽出物を残した。界面を含む水性層をi-PrOAc（3.75L）で抽出し、40℃で2時間後に層を再び分離した。界面を含む水性層をi-PrOAc（3.75L）で再び抽出し、40℃で2時間後に層を分離した。
【０１１１】
コンバインした有機抽出物（〜15L）を蒸留により〜4.5Lに濃縮した。ついで、この溶液にヘプタン（〜10L）を10〜15分間かけて加え、その間温度を〜82-89℃に保持した。リアクタージャケットの温度を70℃に設定し、この温度に1時間保持した。冷却するとほどなく結晶化が生じた。ついで、リアクタージャケットの温度を40℃に設定し、この温度に30分間保持した。
【０１１２】
懸濁液を周囲温度に冷却し、ついでさらに0〜5℃に冷却した。0〜5℃で1時間攪拌した後、生成物を濾過した。生成物をヘプタン（2.5L）で洗浄し、ついで40℃で真空乾燥して607.0g（88%収率）の(αS)-α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を得た。
【０１１３】
実施例９
組換え大腸菌SC16496 JM110[pBMS2000-PPFDH-PDHmod]（ATCC受託番号PTA-4520）からの抽出物を用いた還元的アミノ化
組換え大腸菌の凍結細胞（25g）を脱イオン水（最終容量を100mlとするに充分であり、5mlの1Mギ酸アンモニウムを含有）に加えた。解凍後、細胞をJanke and Kunkel Ultra-turrax T8ホモジナイザーを用いて浮遊させ、ついで濃NH4OHでpH7に調節し、破砕した氷で冷却して50mMギ酸アンモニウム中の25%w/v細胞浮遊液を得た。細胞を12000psiにてマイクロ流動床に２回通すことにより破砕し、細胞破砕物を20,000×g、4℃にて遠心分離により除去した。2456単位（アッセイＡ）または768単位（アッセイＢ）のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび8801単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む266mlの上澄み液を1-L容器に加えた。
【０１１４】
ギ酸アンモニウム（16.74g、0.2654モル）および(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸（29.76g、0.1327モル）を含む266mlの溶液を調製し、12.7mlの濃水酸化アンモニウムでpH8.0とした。NAD（372mg、0.561ミリモル）およびジチオトレイトール（81.8mg、0.530ミリモル）を加え、ついでこの溶液を大腸菌抽出物を入れた容器に加えた。容器を40rpmのシェーカー上、40℃に保持した。濃水酸化アンモニウムを定期的に加えてpH8.0に保持した。38時間後、HPLC分析によって測定されるように、溶液は31.5g（0.140モル、100%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでおり、該アミノ酸のR-エナンシオマーは含んでいなかった。
【０１１５】
実施例１０
組換え大腸菌SC16496 JM110[pBMS2000-PPFDH-PDHmod]（ATCC Deposit PTA-4520）からの凍結乾燥細胞を用いた還元的アミノ化
溶液には10.0mlの最終容量にpH8.0（pHはNH4OHで調節）にて、以下のものが含まれていた：0.50Mギ酸アンモニウム、0.237M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1.00mM NAD、1.00mMジチオトレイトール、および975mgの凍結乾燥した組換え大腸菌。細胞を湿重量の26%まで乾燥させた。乾燥前に細胞は65.04単位/g（アッセイＡ）のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、（またはアッセイＣにより12.79単位/gのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ）、および133.32単位/gのホルメートデヒドロゲナーゼを含んでいた。この溶液を緊密に密封した50ml容エーレンマイヤーフラスコ中で40℃、100rpmにて3日間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は49.06mg/ml（92.13.0%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【０１１６】
実施例１１
分枝鎖トランスアミナーゼを用いたトランスアミノ化
50mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）中、1.0mlの最終容量に以下のものを含む溶液を調製した：0.10Mグルタミン酸ナトリウム、0.05M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸（0.05M NaOHで中和）、0.1mMピリドキサールリン酸、および1mgの分枝鎖トランスアミナーゼ（Biocatalytics）。この溶液をマイクロ管で37℃にて68時間インキュベートした。この溶液は5.53mg/ml（49.2%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸および7.05mg/mlの残留する(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸を含んでいた。
【０１１７】
実施例１２
(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸のエナンシオマー過剰および量のHPLCアッセイ
試料を水で約2mg/mlの濃度に希釈し、沸騰水浴に1分間入れて反応を停止させ、タンパク質を沈殿させた。冷却後、試料を0.2ミクロンのナイロンフィルターでHPLCバイアル中に濾過した。２つの分離法を用いた。
【０１１８】
方法１：
カラム：Chiralpak WH 25×0.46cm（Daicel Industries, Ltd.）
移動相：0.3mM CuSO4
流速：1ml/分
カラム温度：50℃
検出：240nmに設定したダイオードアレイ検出器（DAD）
注入量：10μl
S-エナンシオマー（(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸）保持時間：79.9分
R-エナンシオマー保持時間：32.8分
【０１１９】
方法２：
カラム：Regis Davankov Ligand Exchange 15×0.46cm
移動相：25%メタノール/75%6mM CuSO4
流速：1ml/分
カラム温度：40℃
検出：240nmに設定したDAD
注入量：10μl
S-エナンシオマー（(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸）保持時間：3.2分
R-エナンシオマー保持時間：11.2分
ケト酸（3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸）保持時間：5.2分
【０１２０】
実施例１３
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：0.4mM NADH、5mMフェニルピルビン酸ナトリウム、HClでpH8.75に調節した0.75M NH4OH。吸光度の低下を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２１】
実施例１４
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：0.4mM NAD、10mM L-フェニルアラニン、1N NaOHでpH10.0に調節した0.1M K2HPO4。吸光度の増加を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２２】
実施例１５
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：0.4mM NADH、50mM 3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（1当量のNaOH溶液に溶解）、HClでpH8.75に調節した0.75M NH4OH。吸光度の低下を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２３】
実施例１６
ホルメートデヒドロゲナーゼアッセイ
ホルメートデヒドロゲナーゼアッセイは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：1mM NAD、100mMギ酸アンモニウム、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）。吸光度の増加を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２４】
実施例１７
α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）へのトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）の臭素化
固体のトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）（288g；1.48モル）を冷却器を備えた３つ首丸底フラスコ中で塩化チオニル（465mL）に懸濁した。ジメチルホルムアミド（DMF；0.3mL）を加え、懸濁液を室温で1.5時間攪拌した。反応の完了をガスクロマトグラフィーによりチェックした。ついで、固体のNBS（307g）を反応混合物に少しずつ加え、反応混合物を60℃に加熱した。反応混合物を3時間攪拌し、その間温度を60〜65℃に保持した。ガスクロマトグラフィーによるモニターを行って反応の完了を確実にした。ヘプタン（900mL）を反応混合物に加えた。過剰の塩化チオニルを78〜80℃で留去した。ついで、水を注意深く加えて（激しい反応）反応を停止させた（全量1050mL）。ついで、ヘプタン（500mL）および水（600mL）を加え、水性層を有機層から分離した。有機層をさらなる水（600mL）で洗浄し、水性層を再び有機層から分離した。さらなる水（150mL）を有機ヘプタン層に加え、ヘプタンを水性層から留去した。特に、70mLの水をヘプタン共蒸留した。ヘプタンを留去した後、テトラヒドロフラン（THF；1200mL）を水性層に加え、その結果得られた混合物を室温で16時間激しく攪拌してゆっくりと加水分解させた。ガスクロマトグラフィーによるモニタリングは若干の未反応の酸クロライドの存在を示した。ついで、さらなる水（150mL）を加えて加水分解のスピードを上げ、反応をガスクロマトグラフィーによりモニターして反応の完了を確実にした。ついでTHFを留去して二相（水および油）反応混合物を得た。ついで種晶を加え、反応液を静置して室温とし、重い固体を出現させた。懸濁液を室温にて2時間攪拌したときに攪拌できるようにするため、水（250mL）およびアセトニトリル（500mL）を加えた。ついで、固形分を濾去し、アセトニトリル（2×250mL）で洗浄した。この濾液にはα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）の最初の収穫；264gがAP95とともに室温での真空乾燥後の66%収率にて含まれていた。ついで、母液（113g残渣）を水およびアセトニトリル（250mL/250mL）で室温にて1〜2時間、残渣粉砕した。ついで、反応液を濾過し、固形分を乾燥させてα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）の第二の収穫；64gをAP90とともに16%収率にて得た。
【０１２５】
実施例１８
α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）からのα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）の調製
エーレンマイヤーフラスコに315mlの95〜98%H2SO4を充填し、ついで氷浴で8℃に冷却した。ついで、HNO3（30mlの水に50mlの70%HNO3を加えることによって調製した50%を35ml）をフラスコに加え、その間混合物を氷浴で8℃に保持した。ついで、温度が28℃よりも低いままでいるように固形のα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）（92g、0.338モル）を約30〜60分かけて少しずつ混合物に加えた。ついで、透明な溶液が得られるまで60℃に加熱しながら反応液を攪拌した。
【０１２６】
反応の進行を薄層クロマトグラフィー（TLC）かまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかでモニターした。TLCは、KMnO4とともに酢酸エチル/メタノール/ヘキサンを9：1：10の比で用いたシリカゲルで行った。HPLCは、ODSカラム、C18 S-3 120A、4.6×50mm、10%アセトニトリル/H2Oから100%アセトニトリルへの7分間での線状勾配、および2.5ml/分の流速を用いて行った。検出波長は220nmであった。
【０１２７】
反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、約16時間そのまま保持した。ついで、褐色のガスが発生しなくなるまで水（700mL）を加えて反応を停止させた。得られたスラリーを氷浴で約5℃に冷却し、ついで濾過した。固形の濾過物を200mLの水で洗浄し、空気乾燥して90gのα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を薄黄色の固体として得た（92%収率）。
【０１２８】
実施例１９
α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の調製
α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）（75g、0.278モル）を225mLの30%水酸化アンモニウム（4.08モル、14.6当量）に溶解した。ついで、反応混合物を65℃に16時間加熱した。ついで、反応混合物を回転蒸発（rotovap）で固体に濃縮した。この濃縮固体にEtOH（200mL）を加え、ついで再び回転蒸発で濃縮した。収量は、黄色の固体としての71gのヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のキラルな混合物であった（90%）。
【０１２９】
実施例２０
ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の分割
実施例１９のキラル混合物のBoc保護を、テトラヒドロフラン中のBoc無水物および水酸化ナトリウムを用いて行った。得られた化合物α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-]3]ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｒ）（EA中に0.25M、80μl、＝6.52mg）をキラルな塩基([1R,2S]-(-)-1,2-ジフェニルヒドロキシエチルアミン）（0.25M、80μl）とバイアル中で混合し、混合物をSpeedVac中で蒸発乾固した。溶媒（200μl）を加えた。混合物を入れたバイアルを50℃に加熱したシェーカーに1.5時間置いた。ついで、(αS)-α-[[ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｓ）の結晶化のために混合物を室温に冷却した。
【０１３０】
実施例２１
ZnCl2触媒したアダマンチルブロマイド（式Ａ）カップリング
乾燥容器に7.5kgのアダマンチルブロマイドを充填した。ついで、塩化メチレン（22.5リットル）を室温にて加えて固形のアダマンチルブロマイドを溶解した。溶解は吸熱性であるので、次の工程の前に反応混合物の温度を20℃に戻した。ついで、反応混合物に塩化亜鉛（1.05kg）を入れ、20℃で約5分攪拌した。ついで、反応温度を20〜25℃に保持しながら反応混合物にトリス(トリメチルシリルオキシ)-エチレン（15.3kg）を入れ、得られた混合物を2時間攪拌した。この混合の後にトリス(トリメチルシリルオキシ)-エチレン（5.10kg）を加えた。この添加の間、温度を30℃未満に保持した。反応液をさらに12〜15時間、20〜25℃に保持し、この時点で反応混合物を塩化メチレン（15リットル）で希釈し、0〜5℃に冷却した。ついで、反応混合物を半飽和NH4Cl溶液で、最初は滴下の仕方で処理した。添加の間、温度を30℃未満に保持した。濃い懸濁液が得られた。この懸濁液に酢酸エチル（93.75リットル）を加えた。混合物を激しく15分間攪拌すると、有機相と水性相は分離した。有機層を貯蔵し、水性層を酢酸エチル（各洗浄で18.75リットル）で２回洗浄した。ついで、酢酸エチル洗浄液および有機層をコンバインし、水（37.5リットル）ついで水で半飽和した食塩水（37.5リットル）で洗浄した。有機層を再び分離し、蒸発させて結晶を生成させた。ついで、22.5リットルの最終容量でヘプタンへの溶媒交換を行った。ついで、得られた懸濁液を5〜10℃に1時間冷却し、生成物のα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）を濾過により得た。α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）の収量は6.96kg（33.11モル、95%）であった。
【０１３１】
実施例２１Ａ
α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）のエステル化
まず不活性雰囲気をリアクター内に生成した。ついで、リアクターにメタノール（35.00リットル）、ついでα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）（14.00kg）を入れて懸濁液を生成した。懸濁液を0〜5℃に冷却し、塩化アセチルを反応混合物の温度が5〜10℃に保持されるような仕方で加えた。塩化アセチルの添加完了後、反応混合物を20〜25℃に温め、20〜25℃で2時間攪拌した。ついで、反応混合物を真空下、40℃で濃縮すると薄い油状物が得られた。この油状物を酢酸エチル（71.96リットル）に溶解し、室温に戻した。得られた混合物を水（各洗浄で28.78リットル）で２回洗浄し、各洗浄後に有機層と水性層とを分離した。有機層を貯蔵し、一方、水性層はコンバインして3N NaOH溶液でpH9.5に調節した。ついで、コンバインした水性層を酢酸エチル（各抽出に14.39リットル）で２回抽出した。各抽出後の有機層を分離し、貯蔵した有機層とコンバインした。ついで、これらコンバインした有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（28.78リットル）ついで食塩水（43.18リットル）で洗浄した。ついで、すべての揮発成分を真空下、40℃で除去し、静置する結晶化する無色から薄黄色の油状物が得られた。この油状物は、13.29kg（59.26モル、89%）のα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）を含んでいた。
【０１３２】
実施例２２
α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）のスワーン酸化
三つ首フラスコ（22リットル）は、メカニカルスターラー、温度プローブおよび添加漏斗を備えており、窒素ガスを一夜パージした。ついで、塩化オキザリル（500ml、5.73モル）を加え、ついでCH2Cl2（8リットル）を加えた。得られた溶液をアセトン/ドライアイス浴で-69℃に冷却した。ついで、内部温度を-60℃未満に保持しながら、ジメチルスルホキシド（DMSO；700ml、9.86モル）の溶液を約30分かけてゆっくり加えた。温度を-60〜-70℃に保持しながら、溶液を20分間攪拌した。内部温度を-60℃未満に保持しながら、CH2Cl2（1.7リットル）中のα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）（990g、4.42モル）の溶液を約30分間かけてゆっくりと加えた。得られた溶液を30分間攪拌した。ついで、NEt3（3リットル、21.5モル）を加えてトリエチルアミン塩酸塩の重いスラリーを生成した。反応混合物を室温に温め、水（1リットル）を加えてトリエチルアンモニウム塩（TEA塩）を溶解させた。ついで、反応混合物を丸底フラスコに移し、濃縮減量してジクロロメタン（DCM）およびNEt3を除去した。EtOAc（12リットル）を加え、得られた水性層および有機層を分離した。有機層を水（各洗浄に2リットル）で３回洗浄し、ついで食塩水で洗浄した（2リットル）。ついで、有機相を無水Na2SO4で蒸発乾燥させてα-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）のわずかに黄色の固体を得た。収率は約104%であった。
【０１３３】
実施例２３
α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）の3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）へのヒドロキシル化
エーレンマイヤーフラスコに95〜98%H2SO4（495ml）を充填し、氷浴で8℃に冷却した。ついで、HNO3（30mlの水に50mlの70%HNO3を加えることによって調製した50%を47.5ml）をフラスコに加え、混合物を再び氷浴で8℃に冷却した。28℃未満の温度を保持すべく、固形のα-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）（100g、0.45モル）を約30〜60分かけて少しずつ混合物に加えた。氷浴で冷却しながら、反応混合物を攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー（TLC）かまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかでモニターした。TLCについては、シリカゲルを用い、溶媒はEtOAc/MeOH/ヘキサン（9/1/10）；KMnO4であった。HPLCについては、4.6×50mm、C18、3ミクロン、120オングストロームカラムを、10%アセトニトリル/H2Oから100%アセトニトリルへの7分間での線状勾配、および2.5ml/分の流速で用いた。モニター波長は220nmであった。反応が完了したら（約1時間）、冷水（1.5リットル）およびEtOAc（500ml）を加えて反応を停止させた。さらなる水およびEtOAc（各500ml）を加えて水性層と有機層との分離を助けた。ついで、水性層を3アリコート（各500ml）のEtOAcで抽出した。有機層をコンバインし、ついで減圧下で濃縮して3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）を含む130gの黄色の油状物を得た。
【０１３４】
実施例２４
3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）への3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）の加水分解
実施例２３の黄色の油状物をテトラヒドロフラン（300ml）に溶解し、氷浴で5℃に冷却した。温度を30℃に保持しながら、1リットルの1N水酸化ナトリウムを溶液にゆっくりと加えてpHを約7に調節した。ついで、さらに500mlの1N NaOHを加えてpHを約14に調節した。ついで、氷浴で冷却しながら反応混合物を攪拌し、反応の進行を実施例２３に記載のようにTLCまたはHPLCによりモニターした。約30分後に反応が完了したら、EtOAc（500ml）を加え、水性層と有機層とを分離した。水性層をさらに500mlのEtOAcで洗浄した。水性層を濃HClで酸性にした。溶液がpH7に達したときにEtOAc（500ml）を加え、ついでpHが0.7に達するまでさらに濃HClを加えた。添加した濃HClの全量は150mlであった。ついで、水性層をEtOAc（4×400ml）で抽出し、コンバインした有機層を400mlの水、ついで400mlの食塩水で洗浄した。ついで、洗浄した有機層をMgSO4で乾燥させ、濃縮した。収量は薄黄色の固体が88gであった。この固体を100mlのEtOAcおよび300mlのヘプタンに30分間攪拌しながら溶解し、ついで濾過および空気乾燥すると85gの褐色の固体（85%；3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ））が得られた。
【０１３５】
実施例２５
アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）の調製
2-リットル容フラスコ（メカニカルスターラー、温度計、冷却器、圧均等化添加漏斗およびアルゴン導入口を備えている）に亜鉛末（78.0g、1.19モル）を入れ、ついで無水テトラヒドロフラン（400ml）を加えた。この混合物に1,2-ジブロモエタン（2ml）を加えて亜鉛を活性化した。得られた混合物を穏やかな還流にて25分間加熱した。-55℃に冷却した後、反応温度を-55〜-60℃に保持する速度にて（1時間必要）トリクロロ酢酸メチル（100.3g、0.565モル）およびクロロトリメチルシラン（80ml、0.648モル）の溶液を加えた。添加完了後、混合物を室温にて約90分攪拌した。得られた混合物をヘプタン（700ml）で希釈し、窒素雰囲気下、Celite 545パッドで濾過した。濾過ケーキをさらなるヘプタン（1×300ml、3×200ml）で洗浄した。ついで、濾液をロータリーエバポレーター（22〜27℃の水浴で約10〜15mmHg）上、減圧下で濃縮して粗製の(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシランを濃厚な油状物（129.2g）として得た。定量的プロトンNMRは、この粗製物質が0.389モル（68.8%）の(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシランを含むことを示した。
【０１３６】
アルゴン導入口を備えた1リットルフラスコに、粗製の(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシラン（129.1g、約0.389モル）および無水ジクロロメタン（100ml）を入れた。得られた溶液に1-ブロモアダマンタン（75.2g、0.349モル）および無水塩化亜鉛（6.56g、48ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で一夜攪拌した。得られた赤−褐色の混合物をヘプタン（600ml）および水（300ml）で希釈した。有機層を分離し、水（2×100ml）、1N重炭酸ナトリウム（3×150ml）、および水（2×200ml）で洗浄した。得られた溶液をCelite 545のパッドで濾過し、濾液を減圧下で濃縮して無色の固体を得た。この物質を沸騰したメタノール（250ml）に溶解した。得られた溶液を1時間、室温に冷却した。約5℃に2時間冷却した後、固体を濾過により回収し、冷メタノール：水（94：6；4×50ml）で洗浄してアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）を無色固体として得た：75.0g（1-ブロモアダマンタンに基づいて77.3%);mp 76.3℃。
【０１３７】
元素分析値：C13Hl8Cl2O2：
計算値：C, 56.33；H, 6.55；Cl, 25.58%
実測値：C, 56.49；H, 6.59；Cl, 25.72%
1H NMR（500.16MHz、CDCl3）δ 3.855 (s, 3H), 2.069 (br s, 3 H), 1.866 (d, J=2.75 Hz, 6 H), 1.683, 1.612 (AB q, J=12.1 Hz) ppm
13C NMR（127.78 MHz、CDCl3)δ 166.130, 95.805, 53.969, 43.980, 36.842, 36.256, 28.309 ppm
【０１３８】
実施例２６
ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）の調製
10N HNO3の調製：100mL容の容積測定フラスコに濃HNO3（88.25g、〜62.58mL、〜1.0モル）を入れ、氷浴で冷却した。水（35mL）を加えた。混合の熱が分散した後、溶液を室温に温めた。ついで、フラスコに水をマークのところまで満たして10N HNO3を得た。
【０１３９】
250mL容の熱電対温度計を備えた三つ首フラスコに、濃H2SO4（103g、〜56mL）を入れた。氷浴で0.4℃に冷却した後、10N HNO3（5.68mL、56.8ミリモル）を〜30分かけて加えた。この酸混合物の温度が〜1.0℃に下がったら冷浴を除いた。式ＶIIのアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（15.0g、54.11ミリモル；乳鉢/乳棒で軽く砕いて大きな塊/結晶を破砕）を少しずつ（10分毎に1.25g；1時間50分の添加時間）加えた。〜5時間後、反応混合物は透明で薄黄色の溶液であった。
【０１４０】
〜24時間攪拌後、反応混合物は非常に薄い黄色の溶液であった。メカニカルスターラーおよび熱電対温度計を備えた四つ首フラスコ（1L）に、水（250mL）および尿素（8.0g、0.133モル、HNO3に対して〜2.34当量）を入れた。得られた溶液に酢酸エチル（230mL）を加えた。得られた２相混合物を氷浴で〜1.0℃に冷却した。上記の反応混合物を冷却したEtOAc/水/尿素混合物に〜15分かけて加えた。さらに酢酸エチルおよび水（各〜50mL）を用いて移すのを完了した。〜45分間攪拌した後、冷浴を除き、混合物を攪拌して温めた。4.5時間後に（反応停止の開始から）、得られた混合物をさらなる酢酸エチル（〜100mL）を用いて分別漏斗（1L）に移し、移すのを完了した。水性画分を除き、酢酸エチル（1×80mL）で抽出した。有機画分をコンバインし、水（2×90mL）、1N NaHCO3（4×90mL）、および食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下で除去して式ＶIIIのジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステルを無色に近い固体として得た：15.67g（98.7%粗製収率）。この粗製の物質は、精製することなく式ＩＸのジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を調製するのに用いることができる。しかしながら、所望なら、この粗製の物質（15.65g）をメタノール（102mL）および水（85mL）から再結晶して綿毛状の固体（mp 114.8-115.0℃）を91%の収率で得ることができる。
【０１４１】
元素分析値：C13H18Cl2O3：
計算値：C, 53.25; H, 6.18; Cl, 24.18%
実測値：C, 53.24; H, 6.24; Cl, 24.31%
1H NMR (500.16MHz, CDCl3)δ3.857 (s, 3H), 2.298 (br m, 2 H), 1.824 (s, 2 H), 1.793 (d, 4 H, =2.75 Hz), 1.682, 1.629 (br AB q, 4 H), 1.529 (m, 3 H) ppm
13C NMR (127.78 MHz, CDCl3)δ165.929, 94.281, 68.932, 54.150, 44.478, 44.529, 44.020, 35.750, 34.759, 30.149 ppm
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120オングストローム (4.6×50mm),λ=200nm, 2.5ml/分
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
【０１４２】
勾配：20%Ａから100%Ｂへ10分かけて
保持時間 面積% 同定
2.06分 1.19 未知
4.54分 98.16 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチル
エステル
5.09分 0.65 未知
8.35分 アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル
【０１４３】
実施例２７
ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）の調製
500ml容丸底フラスコにメタノール（200ml）および1N NaOH（194ml、194ミリモル、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）の投入量に対して約1.36当量）を入れた。その結果得られた溶液を温度が<9℃になるまで氷浴で冷却した。冷浴を除き、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）（41.68g、142.1ミリモル）を加えた。その結果得られた懸濁液をアルゴン下、周囲温度にて攪拌した。さらに6時間攪拌した後、さらなるメタノール（10ml）を用いて容器壁を濯いだ。約17時間攪拌した後、反応混合物を濾過して少量の粒状物質を除去した。その結果得られた溶液をメカニカルスターラーを備えた2-リットル容の三つ首フラスコに移した。水（900ml）を用いて反応混合物を希釈し、移すのを完了させた。その結果得られた溶液を濃HCl（38ml、約456ミリモル）を加えて酸性にした。白色の固体が速やかに生成した。混合物を約20分間穏やかに攪拌し、ついで氷浴に置いた。約90分間穏やかに攪拌した後、スターラーを停止し、混合物をさらに2時間氷浴に静置した。その結果得られた懸濁液を濾過し、濾過ケーキを氷冷水で洗浄した。濾過ケーキから空気を引くことにより固形分から水の大部分を除去した。ついで、この物質を真空下、周囲温度で22時間乾燥させてジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）を無色粉末の固体として得た：39.19g（98.7%収率）；mp238℃（分解）
【０１４４】
元素分析値：C12Hl6Cl2O3：
計算値：C, 51.63; H, 5.77; Cl, 25.40%
実測値：C, 51.43; H, 5.74; Cl, 25.48%
Lab HPLC：
YMC ODS-A S3 120オングストローム (4.6×50mm), λ200nm, 2.5ml/分
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
【０１４５】
勾配：20%Ａから100%Ｂへ10分かけて
保持時間 面積% 同定
0.53分 0.95 未知
2.65分 97.27 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸
4.54分 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチル
エステル
【０１４６】
1H NMR (500.16MHz, CD3OD)δ2.258 (br s, 2 H), 1.858 (s, 6 H), 1.674, 1.615 (br AB q, J=l 1.54 Hz, 4 H)), 1.588-1.526 (m, 2 H) ppm
13H NMR (125.77MHz, CD30D)δ167.957, 96.356, 69.322, 48.070, 45.360, 44.794, 37.050, 36.039, 31.631 ppm
【０１４７】
実施例２８
3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の調製
500ml容の三つ首フラスコにジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）（38.67g、138.5ミリモル）を入れた。この物質に水（160ml）および1N NaOH（138ml、138ミリモル；固体のNaHCO3を用いたときに生じることがあるフォーミングを避けるため、1N NaOHを用いてジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸のナトリウム塩を生成させた）を加えて濁った溶液を得た。この溶液に固体のNaHCO3（29.10g、346ミリモル、2.50当量）を加えた。NaHCO3を添加後、反応混合物はジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸のナトリウム塩が溶液から生成するにつれて懸濁液となった。反応容器を還流冷却器/アルゴン導入に適合させ、約80℃に加熱した。約6時間加熱した後、混合物を室温に冷却した。反応混合物（pH7.22）に濃HCl（32mlが必要）を加えることにより注意深く（CO2の発生）pH0.15の酸性にした。得られた混合物を酢酸エチル（4×300ml）で抽出した。酢酸エチルで抽出後の水性層（pH0.37）に濃HCl（約2ml）を加えることによりpH0.18までpHを下げた。酢酸エチル画分をコンバインし、食塩水（100ml）で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下で除去して3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を無色の顆粒状固体として得た：30.77g（99%）。
【０１４８】
元素分析値：C12H16O4：
計算値：C, 64.27; H, 7.19%
実測値：C, 64.30; H, 7.13%
1H NMR (500.16MHz, D2O)δ2.288 (br s, 1.33 H), 2.227 (br s, 0.67 H), 1.819-1.575 (m, 12 H) ppm - 部分的に水和
13C NMR (125.77MHz, D2O)δ207.704, 174.583, 169.608, 98.109, 69.618, 68.830, 47.538, 43.716, 43.251, 43.190, 42.907, 42.563, 36.073, 34.677, 34.232, 30.006, 29.865 ppm - 部分的に水和
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120オングストローム (4.6×50mm), λ = 200nm, 2.5ml/分
【０１４９】
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
勾配：10%Ａから60%Ｂへ10分かけて
保持時間 面積% 同定
1.39分 100% 3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸
4.95分 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸
【０１５０】
実施例２８Ａ
１ポット手順を用いた3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の調製
圧均等化添加漏斗およびアルゴン導入口を備えた250-mL容三つ首フラスコに、実施例２６に記載の方法により調製したジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）（15g、51.16ミリモル）を入れ、ついでテトラヒドロフラン（30mL、不安定化）を加えた。数分攪拌した後、式ＶIIIのメチルエステルの大部分は溶解して濁った溶液を生成した。この溶液に蒸留水（30mL）を加えると、ゆるい（loose）懸濁液が生成した。添加漏斗に1N NaOH（69ml、69ミリモル、式ＶIIIの化合物の投入量に対して〜1.35当量）を入れた。NaOHを70分かけて滴下して加えてほぼ無色の溶液を得、これを周囲温度で攪拌した。
【０１５１】
〜16時間でのHPLC分析は、式ＶIIIの化合物の加水分解が完了したことを示した。この反応混合物はpHが13.24の透明な無色溶液であり、これに〜6N HCl（2.8mL）を加えてpH7.40に調節した。固体のNaHCO3（11.2g、0.133モル、2.60当量）を加えて懸濁液を生成した。
【０１５２】
4時間15分加熱した後のHPLC分析は、反応が完了したことを示す。5時間加熱した後、熱源を除き、反応混合物（透明で無色な溶液）を冷却した。室温に冷却した後、反応混合物を冷蔵庫（+4℃）で4日間貯蔵した。
【０１５３】
冷所で4日間貯蔵した後、反応混合物は依然として透明で無色な溶液であり、HPLC分析は貯蔵による変化を殆ど（もしあったとしても）示さない。室温に温めた後、混合物（pH7.77）に濃HCl（11mL必要、CO2発生；pH〜1.40にて無色の固体が沈殿し始めた）を注意深く加えてpH0.20の酸性にした。その結果得られた懸濁液をEtOAc（×4、全量〜500mL；各EtOAc抽出後に水性画分についてHPLC分析を行った）で抽出した。１回目のEtOAc抽出後の水性層（pH0.38）に濃HCl（〜1.6mL必要）を加えてpH0.18に調節した。２回目のEtOAc抽出後の水性層（pH0.37）に濃HCl（〜0.8mL必要）を加えてpH0.17に調節した。水性層は、残りのEtOAc抽出（抽出#3、pH0.19；抽出#4、pH0.19）の後にさらなるpHは必要なかった。有機画分をコンバインした。乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下で除去して粗製の表題の式ＩＩの化合物を無色に近い顆粒状の固体として得、これを真空（ポンプ）下で16時間乾燥させた：11.42g（99.53%収率）；HPLC, 100%（面積%）。
【０１５４】
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-020-31, TR46373]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.19%; H, 7.09%
【０１５５】
粗製の式ＩＩの化合物（5.0g）を蒸留水（19mL）中で〜85℃に加熱しながら溶解し、ついで熱源から取り出し、冷却した。この物質は〜53℃で結晶化し始めた。室温で〜2時間静置した後、固形分を濾過により回収し、氷冷水で洗浄した。濾過ケーキに窒素を引くことにより水の大部分を除去した。この物質を真空下（ポンプ）で乾燥させて表題の式ＩＩの化合物を大きな無色針状晶として得た：4.33g（86.6%収率）；mp164.5〜165.6℃（Mettler FP800システムにて）；HPLC, 100%（面積%）。
【０１５６】
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-023-15, TR46905]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.42%; H, 7.04%
【０１５７】
実施例２９
L-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）を生成するL-ピログルタミン酸（式Ｅ）のエステル化
反応容器にエタノール（49.0リットル）を入れ、-5℃に冷却した。ついで、混合物の温度が0℃を超えないような仕方で反応容器に塩化チオニル（4.97kg）を入れた。塩化チオニルの添加完了後、混合物を再び-5℃に冷却し、添加の温度が0℃と-5℃との間に保持されるようにL-ピログルタミン酸（式Ｅ）を少しずつ加えた。酸添加後、反応混合物を20〜25℃に加熱し、5時間攪拌した。ついで、反応混合物を最初の容量の約15%まで真空下（Tmax 45℃）で蒸発させた。ついで、残留する油状物をトルエン（49リットル）に溶解した。ついで、トルエン溶液を約10℃に冷却し、最大温度が20〜25℃となるようにトリエチルアミン（8.45kg）をゆっくりと加えた。得られた懸濁液を30分間攪拌し、ついで濾過した。濾過ケーキをトルエン（約5リットル）で洗浄した。濾液を50℃、真空下で全量約10リットルまで減らした。シクロヘキサン（8リットル）を50℃でゆっくりと加え、その後に約30℃に冷却することによって結晶化を開始した。種晶生成後、混合物を20〜25℃に冷却し、シクロヘキサンの第二の8リットルを入れた。ついで、混合物を6〜8℃に冷却し、1時間攪拌し、生成した結晶を濾去した。この結晶をシクロヘキサン（各4リットル）で２回洗浄した。収量は、無色針状晶としての4.89kg（82%）のL-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）であった。
【０１５８】
実施例３０
L-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）のBOC-保護
L-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）（5.00kg）を室温にてトルエン（24.97リットル）に溶解した。ついで、この溶液に4-ジメチルアミノピリジン（0.19kg）を加えた。ついで、反応混合物に、反応混合物の温度が25℃を超えないような仕方でトルエン（24.97リットル）に溶解した無水BOC（7.29kg）の溶液を入れた。完全に添加した後、反応混合物を25℃で3時間攪拌した。ついで、反応混合物に半飽和NaHCO3溶液（49.94リットル）を入れ、10分間激しく攪拌し、その後に有機相と水性相とを分離した。分離した有機層を水（24.97リットル）で２回洗浄した。ついで、有機層を真空下、最高50℃にて溶媒から蒸発させた。残留する無色からわずかに黄色がかった油状物は静置すると結晶化した。理論的収量は、8.18kg（31.81モル）の(5S)-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式Ｇ）であった。
【０１５９】
実施例３１
SuperHydride還元および脱離
(5S)-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式Ｇ）（4.80kg）をトルエン（30.97リットル；Kfmax 0.01%水）に溶解し、-50℃に冷却した。この溶液に反応温度が-45℃を超えないようにしてSuperHydride（LiEt3BH：THF中に1M；19.96リットル)を入れた。添加完了後、混合物を-45〜-50℃で30分間攪拌した。ついで、温度が-45℃を超えないようにして反応混合物にN-エチルジイソプロピルアミン（DIPEA；14.47リットル）を加えた。ジメチルアミノピリジン（0.030kg）を固体として混合物に加えた。ついで、反応温度が-45℃を超えないようにして反応混合物に無水トリフルオロ酢酸（TFAA）（4.70kg）を加えた。添加完了後、反応混合物を20〜25℃に1時間温め、この温度でさらに2時間保持した。ついで、反応混合物を0℃に冷却し、反応温度が5℃を超えないようにしてゆっくりと水（48.00リットル）を入れた。ついで、水性相と有機相を分離し、有機相を再び48リットルの水（0〜5℃）で洗浄した。ついで、有機層を蒸発させ、40℃で脱気した。黄色がかった油状物が4.5kg（18.66モル、100%）の4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（BOC-DHPEE）（式III）の収量で得られた。
【０１６０】
実施例３２
BOC-DHPEE（式III）の加水分解
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（BOC-DHPEE）（式III）（6.00kg）およびエタノール（24.00リットル）から調製した溶液を0〜5℃に冷却し、この温度で水（20.87リットル）中の水酸化リチウム水和物（2.09kg）の溶液でゆっくりと処理して濁った溶液を生成した。ついで、この濁った溶液を20〜25℃に温め、この温度で2時間攪拌した。ついで、反応混合物を最高温度40℃、真空下で約10.5リットルまで蒸発させ、水（24.00リットル）およびt-ブチルメチルエーテル（TBMEまたはMTBE、24リットル）を入れ、10分間混合した。得られた有機相と水性相を分離し、水性相に再び24リットルのTMBEを入れた。ついで、この混合物を5〜10℃に冷却し、激しく攪拌しながらH3PO4 85%-水（1：4）を用いてpHを2.3〜2.3に調節した。このプロセスの間、安定のために温度を5〜10℃に保持した。得られた有機層と水性層を分離した。有機層を貯蔵し、水性層を再び前もって5〜10℃に冷却した24リットルのTBMEで抽出した。得られた有機層を貯蔵していた有機層とコンバインし、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（4.82kg）を入れた。ついで、溶液を蒸発させ、最高温度30℃、真空下で脱気した。収量は7.84kg（22.88モル、92%）[N-BOCデヒドロプロリン*DIPEA（BOC-DHP)]であった。
【０１６１】
実施例３３
BOC-DHPのアミド生成
実施例３２に記載の鹸化によって合成したBOC-DHPは水を含んでいてよい。それゆえ、反応を行う前にトルエンとの共沸蒸留を適用した。しかしながら、試薬が過剰なため、原料の計算は水を除去する前のBOC-DHPの量に基づいた。共沸蒸留では、BOC-DHPをトルエンとともに約30%溶液まで希釈した。トルエンを真空下、40℃で除いた。ついで、処理したBOC-DHP（6.00kg）をTHF（48.0リットル）に溶解した。この溶液にDIPEA（2.26kg）を入れ、反応混合物を-20〜-25℃に冷却した。ついで、塩化メシル（3.01kg）をゆっくりと加えた。この添加の間に塩酸DIPEAが沈殿した。ついで、得られた懸濁液を-20℃で2時間攪拌し、ついで表面下の気体導入口によりアンモニアで飽和させた。アンモニアを添加する間、反応液を0℃に加熱した。飽和後、反応混合物を20℃に加熱し、3時間攪拌した。攪拌後、反応混合物を濾過して塩酸塩を除去した。濾過ケーキを幾つかの部分のTHF（12リットル）で洗浄した。濾液を真空下、最高温度40℃で濃縮し、塩化メチレン（33.33リットル）に溶解した。この溶液を水（26.66リットル）で洗浄した。得られた有機相と水性相を分離し、水性相を塩化メチレン（各20リットル）で２回抽出した。得られた有機層をコンバインし、真空濃縮および脱気して過剰のHunigs塩基を除去した。収量は3.35kg（15.77モル、90%）の(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（BOC-DHPA）（式ＩＶ）であった。
【０１６２】
実施例３４
(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）のシクロプロパン化
第一のリアクター（リアクターＡ）には塩化メチレン（18.0リットル）に溶解した（BOC-DHPA）（式ＩＶ）（4kg）を入れ、20℃に保持した。第二のリアクター（リアクターＢ）には塩化メチレン（18.00リットル）を入れ、-30℃に冷却した。ついで、リアクターＢにジメトキシエタン（DME）（3.36kg）、ついでトルエン中のジエチル亜鉛（15.36kg）の30%溶液を温度を-30〜-25℃に保持しながら入れた。ついで、リアクターＢにジヨードメタン（19.99kg）を反応温度を-30〜-25℃に保持しながら入れた。ジヨードメタンの添加完了後、混合物を-30〜-25℃で45分間攪拌した。ついで、この混合物を冷却パイプ（-20〜-25℃によりリアクターＡに入れた。反応が完了するまでリアクターＡの反応温度が22〜24℃に保持されるように、入れるのは約5%の部分にてゆっくりと行った。反応完了後、リアクターＡの混合物を5〜10℃に冷却した。ついで、反応混合物に飽和重炭酸塩溶液（21.6リットル）を反応温度が15℃を超えないようにしてゆっくりと入れた。この添加の後、反応混合物を少なくとも1時間攪拌すると、その間に沈殿が生成した。懸濁液を濾過した。得られた濾過ケーキを容器に戻し、塩化メチレン（14.4リットル）で30分間再スラリー化し、再度濾過した。この第二の濾過の後、濾過ケーキをさらなる塩化メチレン（7.2リットル）で洗浄した。ついで、濾液を有機相と水性相に分離し、有機相を半飽和食塩水（21.6リットル）で洗浄した。ついで、溶媒を最高温度30℃にて真空除去し、ヘプタンと交換した。ヘプタン中の粗製の生成物のスラリーが得られた。溶媒交換後のこの懸濁液の最終容量は14.4リットルであった。粗製の生成物を濾過により単離した。濾過ケーキをヘプタン（2.9リットル）で洗浄し、ついで真空乾燥して一定の重量とした。粗収量は2.76kg（12.2モル、72%）(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。精製するため、この粗製の物質を8倍量の酢酸ブチル/ヘプタンの1：1混合物中に20〜22℃で4時間スラリー化した。この物質を濾過し、濾過ケーキを約1倍量のヘプタンで洗浄した。収量は2.11kg（9.33モル、55%）(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。
【０１６３】
実施例３５
(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）を生成する(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の脱保護
メカニカルスターラーおよび熱電対を備えた100ml容の2つ首フラスコに(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）（5.0g、22.1ミリモル）およびTHF（20ml）を入れた。ついで、HCl（EtOAc中に2.5M、25ml、62.5ミリモル）を懸濁液に加えた。得られた溶液を室温にて18時間攪拌すると、その間に沈殿が観察された。反応の完了はHPLCによりモニターした。メチルt-ブチルエーテル（MTBE）（30ml）を懸濁液に加え、攪拌をさらに30分間続けた。ついで、懸濁液をN2保護下に濾過して白色固体を得、これをMTBE（20ml）で洗浄した。この固体をオーブン中、減圧下で48時間乾燥させて(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドの塩酸塩（式Ｊ；3.6g、100%）を得た。
【０１６４】
実施例３５Ａ
(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）の他の製造法
Ａ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)の変換
30mLの水、40mLのトルエンおよび10mLのMTBEの混合物中の10.4g（25.86ミリモル）の固体ジシクロヘキシルアミン（DCHA）塩の懸濁液に2.7mLの10N NaOH水溶液（27ミリモル）（過剰のNaOHは1.05当量またはそれ以下に限るべきである）を加えた。攪拌すると透明な層を有する二相混合物が得られ、すべての固体が溶解した相を分離した。4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)ナトリウム塩を含む有機相を4mLの水で抽出し、これを最初の水性相に加えた。HPLC定量は、水性相中に12.55%（w/w）の「遊離のオレフィン酸」含量すなわち96%の収率を与えた。
【０１６５】
Ｂ．DMT-MMの生成
室温の水浴に保持した70mLのEtOAc中の2-Cl-4,6-ジMeO-1,3,5-トリアゼン（CDMT）（6.2mg、35ミリモル；1.5当量）の溶液に4mL（36.38ミリモル）のN-メチルモルホリン（MM）をそのまま加えた。固体の4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM）が沈殿し始めた。DMT-MMを含む懸濁液を室温で30分間攪拌すると、懸濁液は濃厚なペーストとなった。反応の間に温度は23℃から28〜29℃に上昇した。ジ-MeO-N モルホリノ-トリアゼン（DMMT）を生成する競合脱メチル反応を最小にするため、反応液の温度を低く保持した。
【０１６６】
Ｃ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のナトリウム塩の(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）への変換
HPLC定量（V=25mL）により5g（23.5ミリモル）の遊離オレフィン酸に等価な工程Ａのナトリウム塩の溶液に固体のNH4Cl（3.75g、70ミリモル、3当量）を加えたところ、pHは14から8.9に下がった。この溶液に充分なNaH2PO4×H2Oを加えてpHをpH=6.20に調節した。リン酸塩の量はDCHA塩をNa塩に変換するのに用いたNaOHの最初の過剰量によって変わってよいことに注意。ナトリウム塩の緩衝溶液は、上記工程Ｂで調製したDMT-MMへの懸濁液に処理した。
【０１６７】
二相混合物を室温で4時間攪拌すると、最初のエマルジョンは懸濁液となり、若干のDMHTが沈殿し始めた。HPLCにより反応は完了し、活性化DMT-エステルも酸もともにいずれの相にも認められなかった。
【０１６８】
当該反応条件下、DMT-MMとDMHTとの反応により12〜15重量%の4,6-ジMeO-1,3,5-トリアゼンエーテル（DMT-エーテル）もまた生成する。懸濁液を濾過して4,6-ジMeO-1,3,5-トリアゼン（DMHT）を除去し、相を分離した。高純度の（rich）有機相を2N NaH2PO4×H2O水溶液（2×25mL）で、またはpH（水性）<6まで（殆どのN-メチルモルホリンが有機相から除かれたことを意味する）洗浄した。相を分離し、高純度の有機相を25mLの食塩水で洗浄した。
【０１６９】
典型的に、表記化合物ＩＶの溶液収率は87〜90%である；未反応の出発オレフィンは1〜0%。高純度の有機相を回転蒸発させ、新たなEtOAc（2×250mL）とともに共沸乾燥させた。この物質は部分的に結晶化した。混合物を8mLの熱EtOAcに溶解し、10mLのn-ヘプタンと混合した。固体が生成し始めた。懸濁液を50℃で30分間攪拌し、さらに10mLのn-ヘプタンを加えた。加熱浴から取り出した後、懸濁液を室温にて30分間攪拌し、30分毎にさらに２回のヘプタン導入を行い、懸濁液を室温で一夜攪拌して結晶化を完了する。固体を濾過し、乾燥する。典型的な結晶化の収率は90%に近い；表記化合物ＩＶの効力は90%であり、DMT-エーテルが残りの10重量%を占める。
【０１７０】
生成した固体は表記化合物ＩＶとDMT-エーテルとの真の共晶であり、DSCによるアミドの89.7℃のmpに対して97.4℃の単一のシャープなmpを与えた。この共晶形は結晶性が高く、溶液から容易に析出する。
【０１７１】
実施例３５Ｂ
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のジシクロヘキシルアミン塩の調製
Ａ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のナトリウム塩の調製
3容量のエタノールを4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)（約15wt%〜25wt%）（1g/mL）のトルエン溶液に加えた。この溶液を0〜5℃に冷却した。温度を<5℃に保持しながら（わずかに発熱反応）、この溶液にNaOH-水の5N溶液（2当量）をゆっくりと加えた。反応混合物を20〜25℃に温め、反応が完了するまで攪拌した。
【０１７２】
4容量の水を反応混合物に加え、反応混合物を真空下で蒸留して（浴温40℃）エタノールを除去した。残渣に0.5容量のトルエン（0.865g/mL）を加え、混合物を10分間攪拌した。水性層と有機層が生成した。ナトリウム塩を含む水性層を分離し、工程Ｂに用いた。
【０１７３】
Ｂ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のジシクロヘキシルアミン塩の調製
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のナトリウム塩の水溶液に1容量のMTBE（0.74g/mL）を加えた。この溶液に0.2容量のヘプタン（0.684g/mL）を加え、得られた溶液を0〜5℃に冷却した。温度を<5℃に保持しながら（わずかに発熱反応）、この溶液に85%H3PO4（1g/mL）をゆっくりと加えてpHを〜2.5-3とした。得られた層を分離し、生成物を含む有機層に1容量の75%食塩水を加えた。混合物を10分間攪拌し、得られた層を分離した。生成物は有機層に含まれていた。
【０１７４】
有機層を0〜5℃に冷却し、温度を<10℃に保持しながらジシクロヘキシルアミン（0.91g/mL）をゆっくりと加えた。反応混合物を0〜5℃で3時間攪拌した。固形分を濾去し、0.5容量の1：1 MTBE/ヘプタンで洗浄した。得られたDCHA塩（1g/mL）を乾燥し、回収した。
【０１７５】
実施例３５Ｃ
(1S,3S,5S)-3-(アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸,1,1-ジメチルエチル,エチルエステル（式Ｈ）（シン-N-BOC-4,5-メタノプロリンとも称する）の他の製造方法
Ａ．(s)-BOC-4,5-メタノプロリンエチルエステルの調製
【化４３】
【０１７６】
炎乾燥した三つ首フラスコ（マグネチックスターラー）に2.2gの4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（2.20g、9.12ミリモル、1当量）および22mlの乾燥トルエンを入れた。得られた溶液を-30℃に冷却し、さらに16.58ml（18.24ミリモル）のジエチル亜鉛（トルエン中の1.1m溶液）を滴下して入れた。
【０１７７】
反応温度を-25℃〜-30℃に保持しながら、2.2mlのトルエン中の2.66ml（6.43g、36.47ミリモル）のクロロヨードメタンの溶液を滴下して加えた。反応液を-20℃に16時間保持した。ついで、22mlの半飽和重炭酸塩溶液で反応停止させ、室温に温めた。白色の沈殿が生成し、これをHyflow（濾過補助具）で濾去し、トルエン（約10ml）で洗浄した。有機層を二相濾液から分離し、水（各11ml）で２回洗浄した。有機層を蒸発乾固して黄色がかった油状物（2.33g）を得たが、これはN-BOC-メタノプロリンエチルエステル（シン-異性体とアンチ-異性体との混合物(8：1)）であった。
【０１７８】
上記手順を用いて次の工程に使用するのに充分な大量の異性体の上記混合物を製造した。20〜25℃で、3.40kgのN-BOC-メタノプロリンエチルエステル（シン-異性体とアンチ-異性体との混合物）を5.17kg（66.59gmol）の40.0%メチルアミン（水中の溶液）とともに窒素雰囲気下で激しく攪拌した。
【０１７９】
反応完了後、混合物を5.17 lの水および5.17 lのMTBEで希釈し、相分離が生じる前にさらに5分間攪拌した。有機層を5.17 lの水で洗浄した。得られた有機層を蒸発させて（真空、Tmax 40℃）一定重量とした。
【０１８０】
2.52kgのシン-N-Boc-4,5-メタノプロリンエチルエステル（9.85モル、74%）の収量が得られた。
【０１８１】
Ｂ．s-Boc-4,5-メタノプロリンの調製
【化４４】
【０１８２】
10.28 lのエタノール中の2.57kgのシン-N-Boc-4,5-メタノプロリンエチルエステル（s-BOC-MPEE）の溶液を調製する。この溶液に、20〜28℃にて5.07 lの水中の0.51kgの水酸化リチウム水和物からなる溶液を加える。反応を不活性ガス保護下（窒素）で行った。反応混合物を20〜25℃（IPC）で14時間攪拌する。反応完了後、混合物を40℃（真空）で蒸発させた。得られた油状物を25.70 lの水および25.70 lのMTBEに取り、30分間攪拌した。有機相を分離し、水性層を12.85 lのMTBEで再び抽出する。水性相に25.70 lのMTBEを加え、混合物のpHを1N HCl（約12 l）を加えてpH2に調節する。有機層を分離し、水性相を12.85 lのMTBEで再抽出する。上記工程からのコンバインした有機層を蒸発乾固して1.88kgのシン-Boc-4,5-メタノプロリン（8.25モル%、82%）。
【０１８３】
Ｃ．(1S,3S,5S)-3-(アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸,1,1-ジメチルエチルエステルの調製
【化４５】
【０１８４】
2.00kgのシン-N-BOC-4,5-メタノプロリンを40.00 lのTHFに溶解し、-15℃に冷却する。この溶液に1.07kgのN-メチルモルホリン（P0）を加える。反応混合物に反応温度が-8℃を超えないようにして1.32kgのクロロギ酸イソブチルを入れる。添加完了後、混合物を-10℃（P1、IPC 1）で30分間攪拌する。N-メチルモルホリン塩酸塩が反応混合物から沈殿する。
【０１８５】
反応混合物を-5℃に温め、気体導入管によりアンモニア（0.79kg、理論値、5.00当量）をパージする。ついで、反応混合物を20〜25℃に温め、この温度で4時間（P2、IPC 2）攪拌する。反応混合物に40.00 lの飽和食塩水を加える。ついで、飽和重硫酸カリウム溶液を加えて混合物のpHをpH4〜4.5に調節する。ついで、有機層を分離し、水性相を20.00 lのMTBEで再び抽出する。コンバインした有機層を蒸発乾固する。粗製の生成物を還流温度で8.00 lの酢酸ブチルに溶解する。生成物は約30℃で沈殿する。結晶化が始まったら混合物を20.00 lのヘプタンでゆっくりと処理し、さらに2時間攪拌する。生成物を濾過により単離する。濾過ケーキを冷酢酸ブチル/ヘプタン（1：4）で２回に分けて洗浄し（各1.6 l）、各2.00 lのヘプタンで２回洗浄し、30〜35℃（真空）で乾燥させて1.64kg（7.22モル、82%）のシン-N-BOC-4,5-メタノプロリンアミド（s-BOC-MPA）を得る。
【０１８６】
実施例３６
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のBOC保護による(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（ＶＩ）の調製
式ＶＩの酸
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）（469g、2.08ミリモル）を、温度プローブおよびpHプローブを備えた相分離器中、氷冷1N NaOH（5リットル、5モル、2.4当量）に溶解した。THF（2.5リットル）を溶液に加えた。ついで、固体のBoc2Oを加え、反応混合物を周囲温度で約1時間攪拌した。ついで、EtOAc（4リットル）を攪拌しながら加え、得られた有機層と水性層とを分離した。水性層のpHを濃HClで7に調節した。ついで、EtOAc（4リットル）を加え、さらなるHClを加えてpHを約1に下げた。添加した濃HClの全量は510mlであった。有機層と水性層とを再び分離し、水性層をEtOAc（3×3リットル）で抽出した。ついで、有機層をコンバインし、水（3リットル）および食塩水（3リットル）で洗浄した。ついで、洗浄した有機層をNa2SO4で乾燥し、回転蒸発で室温にて濃縮乾固した。収量は542gの(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（ＶＩ）であった。
【０１８７】
実施例３７
3-アミノカルボニル-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成するカップリング反応
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた2L容の三つ首フラスコに、(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）（50g、153.8ミリモル）を入れた。THF（200ml）を加え、攪拌して透明な溶液を得た。この溶液をアセトン-ドライアイス-水浴で-6℃に冷却した。ついで、メタンスルホニルクロライド（Mes-Cl）（13.1ml、169ミリモル、1.1当量）を一度に加え、ついでジイソプロピルエチルアミン（94ml、539ミリモル、1.1当量）を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約4分かけてゆっくりと加えて内部温度を8℃未満に保持した。すべての酸が混合無水物に変換するまで、反応混合物を0℃で攪拌した。ついで、(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド塩酸塩（32.5g、200ミリモル、1.1当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（1.04g、7.6ミリモル、0.05当量）を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、ついで室温で一夜静置した。
【０１８８】
実施例３８
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のBOC保護による(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）の調製
式ＶＩＡ（DABCO塩）
1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）（15g；125.1ミリモル）を、300mlの酢酸イソプロピル中の約30g（135ミリモル）の実施例３６の式ＶＩの酸の溶液に入れた。上記反応混合物に酢酸エチル（150mL）を入れた（酢酸エチル：酢酸イソプロピルの容量比(150mL/300mL)）。反応混合物に式ＶＩＡのDABCO塩（200mg）を種晶として入れた。反応混合物を室温で激しく攪拌した。水（5mL）を反応混合物にゆっくりと入れ、反応混合物を室温で激しく攪拌して15〜20分後に結晶生成を引き起こした。反応混合物を室温で16時間攪拌し、反応生成物をブフナー漏斗で濾過した。固形分を室温にて酢酸エチルで洗浄し、50℃で真空乾燥させて47g（79%）の式ＶＩＡのDABCO塩を得た。
【０１８９】
実施例３９
3-アミノカルボニル-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成するカップリング反応
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた250L容の三つ首フラスコに、(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）（5g、11.44ミリモル）を入れた。THF（25ml）を加え、攪拌してスラリーを得た。このスラリーを氷-水浴で0℃に冷却した。ついで、メタンスルホニルクロライド（Mes-Cl）（1.15ml、14.85ミリモル、1.3当量）を一度に加え、ついでジイソプロピルエチルアミン（94ml、40ミリモル、3.5当量）を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約4分かけてゆっくりと加えて内部温度を5℃未満に保持した。すべての酸が混合無水物に変換するまで、反応混合物を0℃で10分間攪拌した。ついで、(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド塩酸塩（2.42g、14.9ミリモル、1.3当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（77mg、0.57ミリモル、0.05当量）を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、ついで室温で一夜静置した。
【０１９０】
実施例４０
3-シアノ-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を生成する脱水および加水分解
実施例３９の反応混合物にピリジン（6当量、922ミリモル、74.6ml）を加え、反応混合物を冷浴で-8℃に冷却した。ついで、温度を10℃未満に保持しながら、無水トリフルオロ酢酸（TFAA）（4当量、616ミリモル、87ml）を6分かけてゆっくりと加えた。反応液を24℃で0.5時間攪拌し、HPLC（30ml、0.5ml AcN、0.5ml H2O)で実施例３７の化合物（Ｋ）の消失についてチェックした。
【０１９１】
ついで、反応液を冷浴で約-3℃に冷却した、温度を10℃未満に保持しながら、NaOH（5N、6当量、0.925モル、185ml）を反応液に10分かけて加えた（水性pH=9.9）。水性のK2CO3（319g、15当量、510mlのH2Oに溶解）を5分かけて加えた（温度=8℃、水性pH11.1）。反応液を7時間40分処理した。HPLC（30μl、0.5ml AcN、0.5ml H2O）によって決定されるようにすべての中間体が後ろから２番目に加水分解されたときに反応は完了した。
【０１９２】
ついでEtOAc（500ml）を反応混合物に加え、得られた水性層と有機層とを分離した。有機層を500mlの緩衝溶液（2M H3PO4、1M NaH2PO4）洗浄した。温度は15℃から23℃に上昇した；添加時間：5分、水性V=560ml、pH=4.5、HPLCにより32mgの生成物；有機V=1,080ml。有機層を第二の500ml緩衝溶液で洗浄した；水性V=780ml、pH=2.5、HPLC により415mgの生成物；有機V=800ml、1.02v/v%ピリジン。有機層を300mlの食塩水で洗浄した；水性V=350ml、pH=1.8、HPLCにより20mgの生成物。有機層を130mlの飽和NaHCO3溶液で洗浄した；水性V=176ml、pH=6.0、780mgの生成物。有機層を300mlの半飽和食塩水で洗浄した；水性V=330ml、pH=5.2、25mgの生成物；有機V=650ml、ピリジン0.045v/v%。5gのDarcoを有機層に加え、5分間攪拌し、50gのシリカで濾過し、4×25mlのEtOAcで洗浄、有機V=750ml、ピリジン0.04v/v%。
【０１９３】
ついで、有機層を約133mlまで蒸留した。溶液が曇るまで有機層を1時間攪拌した。133mlのヘプタンを15分かけて加え、スラリーを一夜攪拌した。133mlのヘプタンを一夜かけて加えた。混合物をメカニカルスターラーで20分間激しく攪拌した。固形分を濾去し、濾過ケーキを50mlの5%EtOAc/ヘプタンで洗浄した；母液からの溶媒除去後に3.4gの生成物が8.86gの粗製生成物で認められた。乾燥生成物の結晶を真空下、50℃で一夜加熱した。467gの生成物が得られた、〜73%、96.6 AP。
【０１９４】
実施例４１
(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1：1）（式Ｍ）を生成する脱保護
3-シアノ-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）（5.0g、12.04ミリモル）を、三つ首フラスコ（温度計、メカニカルスターラー、および気体導入口を備える）に入れた。EtOAc（約45〜50ml）を加えて透明な溶液とした。濃HCl（3.00ml、37%w/w%、36.14ミリモル、3当量）を室温にて加え、固体が生成するまで反応混合物を攪拌した。ついで、水（30ml）を加え、混合物を1〜2分間攪拌した。反応混合物を分別漏斗に移し、反応混合物の層を静置して明確な相分離に分離した。温度を25℃未満に保持しながら、水性層を25%NaOHで約6の低pHに調節した。
【０１９５】
ついで、水性層にイソプロピルアルコール（IPA；2〜3ml）を加え、ついで安息香酸ナトリウム（6.5mlの水に2.6gの安息香酸ナトリウムを溶解することによって調製した安息香酸ナトリウム溶液を0.65ml）を加えることによって、塩交換を行った。ついで、残りの安息香酸ナトリウム溶液を添加漏斗で滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で16〜24時間攪拌した。ついで、反応混合物中の固形分をブフナー漏斗で濾過し、AgNO3を用いたCl-テストで固形分が陰性となるまで水で洗浄した。ついで、固形分をヘプタン（10ml）で洗浄して水を飛ばし、漏斗上で空気乾燥し、KF<5%まで真空オーブンで35℃にて乾燥させた。収率は79%、4.1gであった。
【０１９６】
実施例４２
遊離塩基Ｍ'
【化４６】
を生成する化合物（Ｌ）
【化４７】
の脱保護
実施例４０の化合物（Ｌ）（300g、0.723モル、効力90.6%）、塩化メチレン（3L）、メタノール（288ml、7.23モル）および濃（36%）塩酸（288ml、7.23モル）を三つ首の12L容フラスコ（メカニカルスターラー、温度プローブおよびN2ガス導入口を備える）に入れた。反応は反応温度を約20〜約25℃の範囲に保持しながら行った。反応混合物を18時間攪拌し、2相に分離し、上部の水性層を回収した。水性層に塩化メチレン（6L）および水（720ml）を加え、5N NaOH（〜600ml）を滴下して加えてpHを9.0〜10.5に調節した。
【０１９７】
式：
【化４８】
の塩酸塩（HPLCにより同定）（式Ｌ'）を含む有機相を塩化メチレン（6L）および水（720ml）で処理し、反応温度を20〜25℃に保持しながら5N水酸化ナトリウム溶液（〜600ml）を滴下して加えてpHを9〜10.5に調節した。NaCl（120g）を加え、混合物を20分間攪拌して相分離を生成した。有機層（6.2L）を回収し（〜174gの化合物Ｍ'を含有）、水性層（1.75L）は廃棄した（6.5gの化合物Ｍ'を含有）。
【０１９８】
有機層を1%NH4Cl食塩水溶液（450ml）で洗浄した（1%NH4Cl食塩水溶液は1gのNH4Cl、25gのNaClおよび74gのH2Oを含んでいた）。得られた相分離から6.0Lの有機層を回収し（溶液中に〜176gの化合物Ｍ'を含んでいた）、1.4gの化合物Ｍ'（〜0.4%）を含む水性層（0.45L）は廃棄した。
【０１９９】
CH2Cl2を25℃/50mmHgで蒸留しながら酢酸エチル（〜4L）を有機層に加えた。最終容量が2.5Lに達したら蒸留を停止した。有機層をポリッシュ（polish）濾過して固形のNaClを除去し、〜1Kg（1Lの酢酸エチル中に化合物Ｍ'が〜170g）GC分析：DCM<0.1%まで濃縮した。水（17ml）を滴下して加え、10分後に結晶化が始まった。17mlの水を加え、得られたスラリーを30分間攪拌し、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄し、室温で乾燥させて186gの一水和物化合物Ｍ''、収率81%を得た。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、2002年12月9日に出願された米国仮特許出願第60/431,814号の優先権を主張し、該出願を参照のため本明細書に引用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造のための方法および該方法に使用するための化合物を提供する。また、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造に用いる中間体化合物である(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸の不斉還元的アミノ化の方法も提供される。さらなる中間体化合物およびその製造方法も提供される。本発明の化合物および方法によって製造されるジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターは、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、肥満、およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫調節疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶは、膜に結合した非古典的なセリンアミノペプチダーゼであり、腸、肝臓、肺、および腎臓を含む（これらに限られるものではない）様々な組織に存在している。この酵素はまた循環しているT-リンパ球にも存在しており、その場合はCD-26と呼ばれる。ジペプチジルペプチダーゼＩＶはインビボで内生のペプチドGLP-1(7-36)およびグルカゴンの代謝的開裂を担っており、他のペプチド、たとえばGHRH、NPY、GLP-2およびVIPに対してインビトロでタンパク質分解活性を示す。
【０００４】
GLP-1(7-36)は、小腸でのプログルカゴンの翻訳後プロセシングの結果生じる29アミノ酸のペプチドである。このペプチドはインビボで複数の作用を有する。たとえば、GLP-1(7-36)は、インスリンの分泌を刺激し、グルカゴンの分泌を抑制する。このペプチドは満腹感（satiety）を促進し、胃の空白化（gastric emptying）を遅らせる。GLP-1(7-36)の連続注入による外部からの投与は糖尿病患者に有効であることが示されている。しかしながら、外部からのペプチドは連続して治療に用いるには余りにも速く分解されてしまう。
【０００５】
GLP-1(7,36)の内生レベルを増強すべく、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのインヒビターが開発されている。米国特許第号6,395,767号は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを開示している。これらインヒビターを化学的に合成する方法は、米国特許第号6,395,767号並びに文献に開示されている。たとえば、Sagnardら、Tet-Lett. 1995 36: 3148-3152；Tverezovskyら、Tetrahedron 1997 53: 14773-14792；およびHanessianら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998 8: 2123-2128を参照。米国特許第6,395,767号に開示されている好ましいインヒビターは、遊離塩基の(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシ-トリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ-[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル(Ｍ')およびその水和物(Ｍ'')である。
【化１】
遊離の塩基Ｍ'
【０００６】
このジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターの製造に用いる中間体を製造すべく適合させた方法がEP 0 808 824 A2に開示されている。ImashiroおよびKuroda Tetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315、Reetzら、Chem. Int. Ed. Engl. 1979 18: 72、ReetzおよびHeimbach Chem. Ber. 1983 116: 3702-3707、Reetzら、Chem. Ber. 1983 116: 3708-3724も参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造に用いる新規な製造方法および化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造において中間体として有用な化合物を提供することである。
【０００９】
一つの態様において、本発明の中間体は、式ＩＡ：
【化２】
（式中、
R1は、HおよびOHよりなる群から選ばれる；
R2は、-C(=O)-COR4、-C(=O)NR5R6、-C(X)n-COR4および-C-NR7R8COR4よりなる群から選ばれる、ここでXはハロゲン、nは1-2、R4はO-アルキル、NH2およびOHよりなる群から選ばれる、およびR5、R6、R7およびR8は、それぞれ、HおよびCOOR9（式中、R9は置換されたまたは非置換のアルキル）；および
R3は、H、OHおよびR10よりなる群から選ばれる、ここで、R10は、NHR11C(=O)R12、R11はR13COOH、R12は、式：
【化３】
により示される基、
R13はアルキルまたはアリールである）で示される化合物を含む。
【００１０】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造において中間体として有用な本発明の式ＩＡで示される好ましい化合物の例としては、式Ｉ：
【化４】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル、
式ＩＩ：
【化５】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、
式Ｖ：
【化６】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、
式ＶＩ：
【化７】
で示される(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、
(またはそのDABCO塩ＶＩＡ)、
式ＶII：
【化８】
で示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル、
式ＶIII：
【化９】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル、
および式ＩＸ：
【化１０】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル-酢酸が挙げられる。
【００１１】
他の態様において、本発明の中間体は、式III：
【化１１】
（式中、R1は、O-アルキル、NH2およびOHよりなる群から選ばれる、および
R2は、t-BOCおよびCBzよりなる群から選ばれる）で示される化合物4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル、および式ＩＶ：
【化１２】
で示される(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルを含む。
【００１２】
好ましい態様において、これら化合物は、式Ｍ：
【化１３】
で示されるジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)またはその遊離塩基である式Ｍ'（上記）、およびその一水和物Ｍ''
【化１４】
の製造における中間体として用いる。
【００１３】
本発明の他の目的は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造方法を提供することである。好ましい態様において、製造されるインヒビターは、それぞれ式ＭおよびＭ'に示す(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)またはその対応遊離塩基である。これらインヒビターは、最終的に２つの断片、式Ｖ：
【化１５】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸と式Ｊ：
【化１６】
で示される(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド酸塩、たとえば塩酸塩またはメタンスルホン酸塩（メシルまたはＭＳＡ塩）とのカップリングによって生成される。
【００１４】
出発物質として選択した中間体化合物に依存して、これら断片を製造およびカップリングするための種々の方法を本明細書に開示する。たとえば、本発明の一つの態様において、式ＩＩで示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。本発明の他の態様において、式Ｖで示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。本発明の他の態様において、式ＶＩで示される(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。本発明のさらに他の態様において、式ＩＶで示される(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルからシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造する方法が提供される。
【００１５】
本発明の他の目的は、シクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造に有用な中間体の合成方法を提供することである。本発明の一つの態様において、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を不斉還元的アミノ化またはトランスアミノ化して(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）とする方法が提供される。本発明の他の態様において、トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）から(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を化学合成する方法が提供される。本発明の他の態様において、アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）、およびジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）から3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を製造する方法が提供される。アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）、およびジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）を製造する方法もまた提供される。本発明の他の態様において、4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式III）から(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）を製造する方法が提供される。この態様において、ついで(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）を(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の製造の中間体として用いることができる。
【００１６】
本発明の他の目的は、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の不斉還元的アミノ化またはトランスアミノ化によって (αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を産生することのできる細胞株を提供することである。好ましい態様において、この細胞株はホルメートデヒドロゲナーゼおよびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現するプラスミドを含む細胞を包含する。最も好ましいのは、ATCC受託番号PTA-4520の細胞株である。
【００１７】
(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)およびその対応遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル融合ピロリジンベースの化合物は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満、およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫調節疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである。本発明において、(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)およびその対応遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル融合ピロリジンベースの化合物の製造に用いるための新規な化合物および方法が提供される。
【００１８】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)は下記式Ｍ：
【化１７】
で示され、好ましくはその対応遊離塩基は下記式Ｍ'：
【化１８】
で示され、その一水和物は上記Ｍ''で示される。
【００１９】
本発明において、２つの断片のアセンブリーによって(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル（式Ｍ'）を製造する方法が提供される。これら断片は、式Ｖ：
【化１９】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸および式Ｊ：
【化２０】
で示される(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドの塩酸塩やＭＳＡ塩などの酸塩である。本発明はまた、これら断片の製造方法並びにこれら断片の製造に有用な中間体化合物をも提供する。
【００２０】
本発明の一つの側面において、中間体化合物である3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の還元的アミノ化またはトランスアミノ化によって断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を製造する方法が提供される。この方法の好ましい態様において、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）がフェニルアラニンデヒドロゲナーゼやケト酸で活性な他のアミノ酸デヒドロゲナーゼを用いて酵素的に行う還元的アミノ化により(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）に変換される。本発明において有用なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの例としては、これらに限られるものではないが、Sporosarcina種からのもの、またはThermoactinomyces intermediusなどのThermoactinomyces種からのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが挙げられる。還元的アミノ化は、大腸菌またはPichia pastorisにおいて発現されるThermoactinomyces intermedius、ATCC 33205のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを用いて行うのが好ましい。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼThermoactinomyces intermedius、ATCC 33205を発現する大腸菌およびPichia pastorisの組換え株の構築および増殖は、Hansonら（Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358）によって記載されている。メタノール上でのPichia pastorisの増殖はまた、ホルメートデヒドロゲナーゼの産生を含む（Hansonら、Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358）。
【００２１】
Pichia pastoris（ATCC 20864）ホルメートデヒドロゲナーゼおよびThermoactinomyces intermedius（ATCC 33205）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の改変形を発現するプラスミドを含む大腸菌は、ブダペスト条約の規定のもと、国際寄託当局に寄託および受領されている。寄託は、２００２年６月２５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard in Manassas、バージニア、20110-2209）に対して行った。ATCC受託番号はPTA-4520である。この細胞株への公的アクセスに対する全ての制限は、本件特許出願の権利化により非撤回的に除かれるであろう。寄託は、公的寄託機関において寄託の日から３０年の期間または試料の最新の請求から５年間または特許の有効期間のいずれか遅い日まで維持されるであろう。上記細胞株は寄託の際には生存していた。もしも生存した試料が寄託機関によって分配することができない場合には、該寄託は交換されるであろう。
【００２２】
(<aS)-<a-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）への3-ヒドロキシ-<a-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の還元的アミノ化を下記スキームＩに示す。
【００２３】
スキームＩ
【化２１】
【００２４】
スキームＩに示すように、この反応にはアンモニアおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が必要である。この反応で生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、ホルメートデヒドロゲナーゼによるギ酸の二酸化炭素への酸化によってＮＡＤＨにリサイクルされる。この反応からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の予測収率は80〜100%であり、予測エナンシオマー過剰は99%を超える。本明細書の実施例１〜１０をも参照のこと。
【００２５】
同変換はまたスキームＩＩに示すようにトランスアミナーゼを用いても行うことができる。
スキームＩＩ
【化２２】
【００２６】
スキームＩＩに示すように、この酵素的変換においてグルタミン酸はアミノドナーとして作用する。この変換に用いるトランスアミナーゼの例は、本明細書の実施例１１に示す分枝鎖トランスアミナーゼである。
【００２７】
他の態様において、(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）は化学的に合成される。(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の化学的合成法の例をスキームIIIに示す。
スキームIII
【化２３】
【００２８】
スキームIIIに示すように、(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のラセミ混合物は、まずトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸をα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）に臭素化することによってトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）から化学的に合成される。この臭素化において、出発物質であるトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）を塩化チオニルに懸濁する。ついでジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加え、懸濁液を室温で1.5時間攪拌する。この反応の完了はガスクロマトグラフィーにより確認する。ついで、固体の無水Ｎ−ブロモコハク酸（ＮＢＳ）を反応混合物に少しずつ加え、反応混合物を60℃に加熱する。反応液を３時間攪拌する間、温度を60〜65℃に維持する。再び、反応の完了をガスクロマトグラフィーにより確認する。ついで、ヘプタンを反応混合物に加え、過剰の塩化チオニルを78〜80℃で留去する。水を加えて反応を停止させ、ヘプタンをさらに加える。ついで、水性層を有機層から分離し、有機層を水洗する。洗浄後、水をさらにヘプタン層に加え、ヘプタンを留去する。ついで、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を残りの水性層に加え、混合物を室温で数時間激しく攪拌する。この加水分解をスピードアップするため水をさらに加えてもよい。ついで、ＴＨＦを留去し、２相（水および油）反応混合物とする。ついで、種晶（seeds）を加え、反応液を室温に達するようにすると、その間にα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）が重い固体として生成する。懸濁液を攪拌可能にするため、水およびアセトニトリルを加える。数時間攪拌した後、α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）を含む固体を濾去し、アセトニトリルで数回洗浄する。本明細書の実施例１７をも参照のこと。
【００２９】
ついで、α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）をH2SO4およびHNO3と反応させてα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を得る。さらに詳細には、α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）は、まずエーレンマイヤーフラスコにH2SO4を充填することによりα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）から調製される。ついで、このフラスコを氷浴で冷却し、フラスコに50%HNO3を加える。ついで、固体のα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）を混合物に少しずつ加えて温度を28℃未満に保持する。ついで、透明な溶液が得られるまで反応液を攪拌しながら60℃に加熱する。反応が完了したら室温に冷却し、保持する。ついで、水を加えて反応を停止させる。得られたスラリーを氷浴で冷却し、ついで濾過してα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を得る。本明細書の実施例１８をも参照のこと。
【００３０】
ついで、α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を水酸化アンモニウム、好ましくは30%水酸化アンモニウムに溶解し、反応混合物を好ましくは65℃に加熱する。ついで、反応混合物を濃縮固化する。ついでEtOHを加え、反応液を再び濃縮して(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を含むラセミ混合物を得る。本明細書の実施例１９をも参照のこと。
【００３１】
ラセミ混合物から(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖのラセミ混合物）を単離するため、テトラヒドロフラン中の無水Ｂｏｃおよび水酸化ナトリウムを用いた典型的なＢｏｃ保護により混合物を処理してα-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-]3]ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｑ）を得る。ついで、α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-]3]ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｑ）を[1R,2S]-(-)-1,2-ジフェニルヒドロキシエチルアミン、1,7,7-トリメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-アミンまたはS-(-)-1-1(1-ナフチル)エチルアミンなどのキラルな塩基と混合し、混合物を蒸発乾固する。乾燥した混合物を溶媒に再懸濁し、再懸濁した混合物を数時間攪拌しながらシェーカーに入れる。室温に冷却すると(αS)-α-[[ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｓ）の結晶化が起こる。本明細書の実施例２０をも参照のこと。
【００３２】
Ｂｏｃ基を除去すると(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を生成する。
【００３３】
本発明の他の側面は、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の合成に用いる中間体化合物3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の製造方法に関する。中間体化合物3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）は、スキームＩＶに示す方法に従って製造することができる。
【００３４】
スキームＩＶ
【化２４】
【００３５】
スキームＩＶに示すように、この方法ではアダマンチルブロマイド（式Ａ）を塩化亜鉛触媒でアルキル化してα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）を生成する。ついで、α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）をメタノール中の塩化アセチルを用いてエステル化してα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）を生成する。ついで、α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）をスワーン酸化によりα-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）に変換する。ついで、α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）をヒドロキシル化して３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）を生成し、これを加水分解して３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を生成する。本明細書の実施例２１〜２５をも参照のこと。
【００３６】
別法として、中間体化合物である３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）はまたスキームＶに示す方法に従って製造することができる。
スキームＶ
【化２５】
【００３７】
スキームＶに示すように、(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシラン（１）をKurodaら（EP 08 08 824A3；Imashiro and Kuroda Tetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315）の方法をわずかに改変することにより調製する。ブロモアダマンタンを化合物１で塩化亜鉛の影響下で処理すると（Reetzら、Chem. Int. Ed. Engl. 1979 18:72, Reetz and Heimbach Chem. Ber. 1983 116: 3702-3707、Reetzら、Chem. Ber. 1983 116: 3708-3724）、式ＶIIで示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステルが得られる。ついで、式ＶIIで示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステルを濃硫酸中の一酸化窒素でヒドロキシル化して式ＶIIIで示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステルを定量的収量で得る。式ＶIIIの化合物をメタノール中の水酸化ナトリウム水溶液で室温にて加水分解すると式ＩＸで示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸が得られる。引き続きジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）を弱塩基、好ましくは重炭酸ナトリウムで処理すると中間体化合物である３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）のみが生成する。本明細書の実施例２６〜２９をも参照のこと。
【００３８】
スキームＶＡ
【化２６】
【００３９】
スキームＶＡに示すように、中間体化合物である３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）は１ポット手順で調製できる。示すように、式ＶIIIの化合物をアルゴンなどの不活性雰囲気中、テトラヒドロフラン（または水酸化カリウムや水酸化リチウムなどの他の塩基）中の水酸化ナトリウム水溶液で処理して対応のナトリウム塩を得る。このナトリウム塩を回収することなく、このナトリウム塩を含有する反応混合物を塩酸などの酸で処理してｐＨを約0.50、好ましくは約0.20まで下げて対応のケト酸ＩＩを生成し、このものは水から再結晶させてケト酸ＩＩの結晶を生成させることができる。
【００４０】
本発明の他の側面は、断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）の製造方法に関する。(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニルの製造に用いるこの断片は、下記スキームＶＩに示す方法に従って製造することができる。
【００４１】
スキームＶＩ
【化２７】
【００４２】
スキームＶＩに示すように、L-ピログルタミン酸（式Ｅ）をまずエステル化してL-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ；SQ 7539）を得る。ついで、このL-ピログルタミン酸エチルエステルを窒素原子上でBOC-保護して(5S)-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式Ｇ）を得る。ついでSuperHydride還元および脱離を行って4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式III）を生成する。ついでBOC-DHPEE IIIを水酸化リチウムを用いた鹸化により加水分解してBOC-DHPを生成する。ついで、塩化メシルおよびその後のアンモニアを用いた混合無水物によりBOC-DHP上でアミドを生成させて(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）を製造する。ついで、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）をSimmons-Smith反応によりシクロプロパン化して(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）を生成する。ついで、BOCを除去して、断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）の塩酸塩やメタンスルホン酸塩などの酸塩の生成という結果となる。実施例２９〜３５をも参照のこと。
【００４３】
スキームＶＩにも示す本発明の他の側面は、Simmons-Smith反応でのシクロプロパン化による(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）の(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）への変換に関する。この反応では、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルを第一のリアクター中で塩化メチレンに溶解する。第二のリアクターでは塩化メチレンを-30℃に冷却し、ジメトキシエタンおよびトルエン中のジエチル亜鉛の30%溶液を加え、ついでジヨードメタンを加える。ついで、この混合物を第一のリアクターに加え、ついで飽和重炭酸塩溶液を加える。得られた反応混合物を沈殿が生成するまで攪拌する。ついで、沈殿を濾過し、洗浄し、塩化メチレンに２回またはそれ以上再懸濁する。ついで、濾液を水性相と有機相とに分離し、有機相を半飽和食塩水で洗浄する。溶媒を除去し、ヘプタンと交換してヘプタン中の(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の粗製の生成物のスラリーを得る。
【００４４】
別法として、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）はスキームＶＩＡに示すようにして調製できる。
スキームＶＩＡ
【化２８】
【００４５】
スキームＶＩＡに示すように、4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルのDCHA塩（Ｘ）を水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属塩基で処理してナトリウム塩などの対応の塩を生成させる。
【００４６】
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルのナトリウム塩（ＸＩ）もまた、対応のエチルエステルから該エチルエステル（好ましくはトルエン中の該エチルエステルの溶液）をエタノールおよび水酸化ナトリウムで処理することにより調製できる。
【００４７】
ナトリウム塩ＸＩの溶液を塩化アンモニウムやリン酸二水素ナトリウムなどの緩衝液で処理して溶液のｐＨを７未満、好ましくは約６〜６.５とし、ナトリウム塩の緩衝溶液を4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM）で処理して活性化DMT-エステル（ＸII）を生成し、これをアンモニアまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは水酸化アンモニウムなどの他の塩基で処理して(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（ＩＶ）を生成する。
【００４８】
4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM）は、スキームＶＩＡに示すように、2-Cl-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン（CDMT）およびN-メチルモルホリンを約0〜約10℃の低下した温度にて反応させてDMT-MMを生成することによって調製できる。
【００４９】
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルのDCHA塩（Ｘ）は、対応のナトリウム塩（ＸＩ）から、前もって調製したDCHA塩（Ｘ）の水溶液をメチルt-ブチルエーテル（MTBE）で処理し、反応混合物のｐＨをH3PO4などの酸を用いて2.5〜3に調節することで調製できる。有機層を分離し、食塩で洗浄して対応のナトリウム塩（ＸＩ）を生成する。得られた反応混合物を冷却し、DCHAで処理して対応のDCHA塩（Ｘ）を生成する。
【００５０】
スキームＶＩＢ
【化２９】
【００５１】
スキームＶＩ中の化合物Ｈはまた、スキームＶＩＢに示すように、N-BOC 4,5-デヒドロプロリンエチルエステル（III）のシクロプロパン化により以下のようにして調製できる。
【００５２】
N-BOC 4,5-デヒドロプロリンエチルエステル（III）をトルエン、塩化メチレンまたはジクロロエタンなどの乾燥有機溶媒の存在下、約-30℃〜約0℃の範囲の低下した温度にてジエチル亜鉛で処理してN-BOC 4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶ）を得る。
【００５３】
得られたBOC 4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶ）（シン異性体とアンチ異性体との混合物（8:1））をアルゴン雰囲気などの不活性雰囲気下でメチルアミン水溶液で処理することにより分離し、シン(S)-BOC-4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶＩ）（ＸＶIIから分離）を回収する。
【００５４】
エタノールまたはトルエンやＴＨＦなどの他の有機溶媒中のs-BOC-4,5-メタノプロリンエチルエステル（ＸＶＩ）を、水酸化リチウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液などの塩基で処理して対応のs-BOC-4,5-メタノプロリン遊離酸（ＸＶIII）を生成する。
【００５５】
N-メチルモルホリンの存在下、約-8℃を超えないような低下した温度でＴＨＦまたは塩化メチレン；クロロギ酸イソブチルまたは塩化メシルなどの有機溶媒に溶解した遊離酸（ＸＶIII）を処理し、ついで反応混合物をアンモニアで処理してs-BOC-メタノプロリンアミド（Ｈ）を生成することにより、遊離酸（ＸＶIII）を対応s-BOC-メタノプロリンアミド（Ｈ）に変換する。
【００５６】
本発明の他の側面は、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）および断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）をカップリングして(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）を生成するカップリング方法に関する。これら断片のカップリングを下記スキームＶIIに示す。
【００５７】
スキームＶII
【化３０】
【００５８】
スキームＶIIに示すように、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下、BOC2Oで処理し、酢酸エチル（EtOAc）抽出により分離して(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を分離することにより、断片(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）をまずBOC保護して(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を生成する。別法として、酢酸エチルの代わりに酢酸イソプロピル／ヘプタンを用いて遊離の酸（ＶＩ）を結晶化することができる。他の態様において、実施例８Ａに示すように、式Ｖの化合物を単離PDH/FDH酵素濃縮物を用いた生物変換から単離することなく用いる。
【００５９】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの適当な有機溶媒（約-10℃〜約0℃の範囲の温度に冷却）中の式ＶＩの化合物の溶液をメタンスルホニルクロライド（塩化メシル）、およびHunig塩基（ジイソプロピルエチルアミンまたはDIPEA）で処理して式ＶＩの化合物の対応のメタンスルホン酸塩を生成する。
【００６０】
ついで、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）または他の公知のカップリング剤の存在下、カップリング反応を用いて(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）メタンスルホン酸塩を(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）にカップリングして3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成する。式Ｋの化合物をピリジンやトリエチルアミンなどの有機塩基および無水トリフルオロ酢酸で処理することにより脱水に供し、ついで約0℃〜約10℃に冷却し、水酸化ナトリウムまたはKOHやLiOHなどの他の強塩基を加えることにより加水分解に供して化合物（Ｌ）を生成する。ついで、3-シアノ-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を脱保護（および安息香酸ナトリウムで処理）してジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）（式Ｍ）を生成する。本明細書の実施例３７〜３９をも参照のこと。
【００６１】
スキームＶIIＡ
【化３１】
【００６２】
スキームＶIIＡに示すように、化合物（Ｋ）はまた以下のようにして化合物（ＶＩＡ）（DABCO塩）から調製できる。
【００６３】
式ＶＩの酸を1,4-ジアザビシクロ[2,2,2]オクタン（DABCO）で処理して(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）を生成する。ついで、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）または他の公知のカップリング剤の存在下、カップリング反応（スキームＶIIＡに記載）を用いて(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）を(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドHClまたはMSA塩（式Ｊ）にカップリングして3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成する。
【００６４】
スキームＶIIに戻ると、化合物（Ｌ）をスキームＶIIＢに記載するように塩酸などの強酸で処理することにより脱保護できる。
【００６５】
スキームＶIIＢ
【化３２】
【００６６】
スキームＶIIＢを参照すると、遊離塩基一水和物（Ｍ''）をBOC-保護中間体（Ｌ）から以下のようにして生成できる。
【００６７】
BOC-保護中間体（Ｌ）を、反応温度を約20〜25℃の範囲に保持しながら塩化メチレンおよびメタノールの存在下、濃塩酸で処理して塩酸塩（Ｌ'）を生成する。塩酸塩（Ｌ'）を水酸化ナトリウムまたは他の強塩基で処理して遊離塩基（Ｍ'）を生成する。ついで、遊離塩基（Ｍ'）を水で処理して遊離塩基一水和物（Ｍ''）を生成する。
【００６８】
本明細書の開示を読んだ当業者には理解されるであろうように、最終生成物ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）（式Ｍ）またはその対応の遊離塩基（Ｍ'）または遊離塩基一水和物（Ｍ''）は、出発物質としてどの中間体を選択するかによって、スキームＩ、ＩＩ、またはIIIおよびＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶIIおよびＶIIＡに示すすべての工程またはスキームＩ、ＩＩ、またはIIIおよびＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶIIおよびＶIIＡのいずれかに示す一部の工程のみを用いて製造することができる。たとえば、本発明の技術を用い、当業者であれば出発物質として式ＩＩの３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式Ｖの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式ＶＩＡの(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩、または式ＩＶの(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステルを用いて、シクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1:1）（式Ｍ）またはその対応の遊離塩基（Ｍ'）を常法により製造することができる。
【００６９】
それゆえ、当業者であれば、単に(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）（またはそのDABCO塩（式ＶＩＡ））を(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）にカップリングして3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成し、3-(アミノカルボニル)-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を脱水して3-シアノ-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を生成し、ついで3-シアノ-αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を加水分解してジペプチジルペプチダーゼＩＶを生成することによって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターを製造することができる。この方法において、出発物質は、断片である(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）（またはそのDABCO塩（式ＶＩＡ））および(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）を含む。
【００７０】
しかしながら、本発明の方法は、断片(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を中間体(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）からBOC保護により製造することをさらに含む。この態様において、この方法は、酵素的アミノ化またはトランスアミノ化により３−ヒドロキシ-α-オキサトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を不斉還元することによって(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を製造することをさらに含む（スキームＩまたはＩＩを参照）。別法として、この方法は、スキームIIIに従ってトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の化学合成をさらに含む。
【００７１】
さらに、または別法として、この方法は、中間体(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）からのBOCの除去により、断片(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）を製造する工程をさらに含む。この態様において、この方法は、(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）の好ましくはSimmons-Smith反応によるシクロプロパン化によって(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）を製造する工程をさらに含む。
【００７２】
本発明の他の側面は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造における有用な中間体として本明細書において同定される新規な化合物に関する。ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル融合ピロリジンベースのインヒビターの製造における中間体として有用な本発明の化合物としては、式Ｉ：
【化３３】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル、式ＩＩ：
【化３４】
で示される3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式ＩＶ：
【化３５】
で示される(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル、式Ｖ：
【化３６】
で示される(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、式ＶＩ：
【化３７】
で示される(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸、(またはそのDABCO塩ＶＩＡ)、式ＶII：
【化３８】
で示されるアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル、式ＶIII：
【化３９】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル、および式ＩＸ：
【化４０】
で示されるジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル-酢酸が挙げられる。
【００７３】
好ましい態様において、本明細書に示すように、これら化合物は、式Ｍ：
【化４１】
で示されるジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターである(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩(1:1)および好ましくはそれぞれ式Ｍ'およびＭ''で示されるその対応の遊離塩基またはその一水和物Ｍ''
【化４２】
またはその一水和物Ｍ''（上記に記載）の製造における中間体として用いる。
【００７４】
本発明の化合物および方法を用いて製造したジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビターは、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満、およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫調節疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用である。
【００７５】
以下の実施例は本発明の好ましい態様を表す。
【００７６】
実施例
実施例１
Thermoactinomyces intermediusからのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現し内生のホルメートデヒドロゲナーゼを産生する組換えPichia pastorisからの抽出物を用いた還元的アミノ化
Thermoactinomyces intermediusからのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現する組換えPichia pastoris凍結細胞（2.25kg）を、ギ酸アンモニウム（28.65g、0.454モル）を含む脱イオン水（6.75L）に加えた。解凍後、細胞をJanke and Kunkel Ultra-turrax T25ホモジナイザーを用いて浮遊させ、濃NH4OHでpH7に調節し、粉砕した氷で冷却して50mMギ酸アンモニウム中の25%w/v細胞浮遊液を得た。細胞をマイクロ流動床（microfluidizer）に12000psiで２回通すことにより破砕し、細胞破砕物を20,000xgで4℃にて遠心分離することにより除去した。アッセイＡ（実施例９）またはアッセイＢ（実施例１０）によってそれぞれ決定されるように230998単位または124641単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ活性を含み80080単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む上澄み液7024mlを、New Brunswick Scientific Bioflo IVバイオリアクターの16L容の容器に加えた。
【００７７】
ギ酸アンモニウム（442.5g、7.017モル）および(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸（786.7g、3.510モル）を含む7024mlの溶液を調製した。この溶液のｐＨを276mlの濃水酸化アンモニウムを用いて8.0に調節した。ついで、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD；9.834g、14.82ミリモル）およびジチオトレイトール（2.163g、14.027ミリモル）を加え、この溶液をPichia pastoris抽出物を含むバイオリアクターに加えた。溶液を40℃に保持し、150rpmで攪拌した。反応開始後、それぞれ0、3および18時間で45、25および27mlの濃水酸化アンモニウムのアリコートを加えてｐＨを8.0に調節した。25時間後、この溶液にはHPLC分析（実施例８、方法２参照）によって測定されるように818.9g（3.637モル、100%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸が含まれていたが、検出可能なケト酸または該アミノ酸のR-エナンシオマーは含まれていなかった。
【００７８】
(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を、アンモニアを飛ばすための酵素的変換混合物の沸騰、ギ酸によるｐＨ３への調節、沈殿したタンパク質を除去するための濾過、該アミノ酸のDowex 50 (H+)樹脂への吸着、1.5Mアンモニアによる溶出、およびリッチ溶出液の濃縮からなる手順により単離して、(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸を結晶性固体として得た。この単離手順を用いた最後の操作（787gのケト酸の投入）は、804gの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸を94.3%の効力および3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸からの96.0%の収率で与えた。この手順により単離された(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸のすべてのバッチは、(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩までのその後の反応において、うまく扱うことができた。
【００７９】
実施例２
組換えPichia pastorisからの加熱乾燥細胞を用いた還元的アミノ化
0.50Mギ酸アンモニウム、0.25M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1.06mM NAD、1.00mMジチオトレイトール、およびアッセイＡにより決定されるように32.7単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび24.6単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む250mgの組換えPichia pastoris加熱乾燥細胞を最終容量4.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。Pichia pastoris加熱乾燥細胞の調製はHansonら（Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358）によって記載されている。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、100rpmにて4日間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は45.02mg/ml（80%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８０】
実施例３
組換えPichia pastorisからの湿潤細胞を用いた還元的アミノ化
0.415Mギ酸アンモニウム、0.208M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、0.88mM NAD、0.84mMジチオトレイトール、およびアッセイＡにより決定されるように6.06単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび12.8単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む12.5% w/vのPichia pastoris湿潤細胞を最終容量3.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、200rpmにて68時間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は31.9mg/ml（68%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８１】
実施例４
Thermoactinomyces intermediusからのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現する組換え大腸菌加熱乾燥細胞およびCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化
0.50Mギ酸アンモニウム、0.25M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1.06mM NAD、1.00mMジチオトレイトール、2.55単位/ml（0.51単位/mg）のCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim）、およびアッセイＡにより決定されるように76単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含む250mgの組換え大腸菌加熱乾燥細胞を最終容量4.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、100rpmにて4日間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は7.69mg/ml（13.7%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８２】
実施例５
組換え大腸菌湿潤細胞およびCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化
0.415Mギ酸アンモニウム、0.208M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、0.88mM NAD、0.84mMジチオトレイトール、1単位/ml（0.51単位/mg）のCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim）、およびアッセイＡにより決定されるように97単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含む12.5%w/vの大腸菌湿潤細胞を最終容量3.0ml、ｐＨ8.0（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を50ml容のエーレンマイヤーフラスコ中で40℃、200rpmにて68時間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は5.16mg/ml（11.0%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８３】
実施例６
Sporosarcina種からのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化
0.15Mギ酸アンモニウム、0.05M（11.2mg/ml） (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1mM NAD、1mMジチオトレイトール、0.51単位/ml（0.51単位/mg）のCandida boidiniiからのホルメートデヒドロゲナーゼ（Boehringer Mannheim）および1.01単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（14.5単位/mg；Sigma Chemical Co.）を最終容量1.0ml、ｐＨ8.5（NH4OHでｐＨ調節）にて含有する溶液を調製した。この溶液を30℃にて20時間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は0.31mg/ml（2.74%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【００８４】
実施例７
プラスミドpBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築
発現ベクターpBMS2000-PPFDH-PDHmodの２工程構築を用いた。適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにP. pastorisのFDH遺伝子の5'末端および3'末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
5' TCGTCATGAAAATCGTTCTCGTTTTG 3' (5'末端；センス；配列番号1)
BspHI
5' TACTGTTTTTCCAGCGTATTCCTAGGCT 3' (3'末端；アンチセンス；配列番号2)
BamHI
を用い、P. pastorisのFDH遺伝子を発現ベクターpBMS2000（pBMS2000はS. W. Liuらの米国特許第6,068,991号（2000年5月30日発行）に開示されている）にサブクローニングした。
【００８５】
それぞれ1×TaqPlus反応緩衝液（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）、0.2mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP）、0.4nMの各オリゴヌクレオチド、2.5UのTaqPlus DNAポリメラーゼ（Stratagene）、およびP. pastorisのFDH遺伝子を含む10pgのプラスミドDNAを含有する４つの100μlアリコートでP. pastorisのFDH遺伝子の高信頼性PCR増幅を行った。増幅条件は、自動伸長Perkin-Elmer Model 480サーモサイクラーを用い、94℃で4分間インキュベートした後、94℃で1分間；50℃で1分間；および72℃で1.5分間の25サイクルを含んでいた。
【００８６】
このPCR反応混合物を等容量の1:1フェノール:クロロホルム（GibcoBRL、ゲイサーズバーグ、メリーランド）で抽出し、13,000×gで5分間遠心した。上部の水性相をとり、新たなマイクロ遠心管に入れた。0.1容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の氷冷エタノールを加えてDNAを沈殿させた。13,000×gで5分間遠心分離後、液体を管から吸引し、ペレットを0.5mlの氷冷70%エタノールで洗浄した。液体を再び吸引し、ペレットを室温で30分間空気乾燥させた。
【００８７】
増幅したDNAを各20単位のBspHIおよびBamHIで3時間、37℃にて全量50μlで消化した。これと平行してpBMS2000ベクター（2μg）をBspHIおよびBamHIで消化した。消化した試料を1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。FDH遺伝子（1100-塩基対断片）および線状化ベクター（4700-塩基対断片）に対応するバンドを別々にゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen、チャッツワース、カリフォルニア）を用いて精製した。これら単離断片の濃度を低分子量ラダー（Invitrogen Corp.、カールスバード、カリフォルニア）に対する電気泳動により推定し、5:1（挿入：ベクター）のモル比にて全量10μlで22℃にて2時間ライゲートした。15μlのdH2Oおよび250μlの1-ブタノールを加えてDNAを沈殿させ、マイクロ遠心管中で13,000×gにて5分間ペレット化した。液体を吸引除去し、DNAをSpeedVac（Savant Instruments、ファーミングデール、ニューヨーク）で5分間、低加熱下で乾燥させた。ペレットを5μlのdH2Oに再懸濁した。
【００８８】
再懸濁したDNAをエレクトロポレーションにより0.04mlの大腸菌DH10Bコンピテント細胞（Invitrogen）に25μFおよび250Ωにて形質転換した。SOC培地を直ちに加え（0.96ml；SOC＝1リットル当たり0.5%酵母抽出物、2%トリプトン、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、および20mMグルコース）、細胞をシェーカー中で1時間、37℃および225rpmにてインキュベートした。プラスミドDNAを含むコロニーを、50μg/mlの硫酸カナマイシン（Sigma Chemicals、セントルイス、ミズーリ）を含むLBアガープレートで選択した。所望の挿入を有するプラスミドは、RapidCycler（Idaho Technology、ソールトレイクシティー、ユタ）を用いたキャピラリー管でのコロニーＰＣＲにより同定した。各反応混合物は、50mM Tris-HCl（pH 8.3）、4mM MgCl2、0.25mg/mlのウシ血清アルブミン、2%スクロース400、0.1mMクレゾールレッド、0.4nMの各プライマー（配列番号1および配列番号2）、および2.5UのTaq DNAポリメラーゼ（Promega Corp.、マジソン、ウィスコンシン）を含んでいた。反応混合物を10μlのアリコートに分け、丸底マイクロタイタープレートのウエルにピペッティングした。カナマイシン耐性コロニーを使い捨てプラスチック播種針を用いて拾い、反応混合物に掻き混ぜて入れ、LB-カナマイシンアガーに移した。各反応混合物アリコートを30μl容キャピラリー管に入れ、管の両端をフレームシールした。細胞を溶解し、94℃で30秒インキュベートしてDNAを変性し、RapidCycler（Idaho Technology、ソールトレイクシティー、ユタ）を用いて94℃で0秒間、40℃で0秒間、および72℃で60秒間の30サイクルを用いて増幅を行った。試料を1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。17の試験した試料のうち7つの試料が1100塩基対で強いバンドを示した。このプラスミド（本明細書でpBMS2000-PPFDHと称する）を含む1つのコロニーをプラスミド構築における次の工程のために選択した。
【００８９】
「PDHmod」は、(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸への完全な変換に必要な最後の２つのアミノ酸およびカルボキシル末端のさらなる１２アミノ酸の変化により刊行されたDNA配列（Takadaら、J. Biochem. 109, pp. 371-376 [1991]）とは異なっている改変したThermoactinomycetes intermediusフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをいう。この変化をプラスミドpPDH9K/10（Donovanらの特許WO200004179（2000年1月27日発行）に詳細が記載されている）に導入し、ついでこのプラスミドをP. pastoris SMD1168（株ATCC 74408として寄託）に形質転換した。
【００９０】
天然のPDH遺伝子の3'末端および対応アミノ酸は以下のとおりである：
AAC AGC GCA AGG AGG TAA
Asn Ser Ala Arg Arg 停止
【００９１】
PDHmod遺伝子の3'末端および対応アミノ酸は以下のとおりである（変化したまたは新規なアミノ酸は強調してある）：
AAC AGC GCG GAG GGG TAC CTC GAG CCG CGG
Asn Ser Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Pro Arg
CGG CCG CGA ATT AAT TCG CCT TAG（配列番号5）
Arg Pro Arg Ile Asn Ser Pro 停止
【００９２】
適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにPDHmod遺伝子の5'末端および3'末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
GATGCTCATATGCGCGACGTGTTTGAAATGATG（5'末端、センス；配列番号3）
NdeI
GATCCCGGGCTAAGGCGAATTAATAATTCG（3'末端、アンチセンス；配列番号4）
SmaI
を調製した。
【００９３】
ＰＣＲによるPDHmodの増幅および精製のための反応条件は、ATCC 74408から調製した染色体ＤＮＡを反応のための鋳型として含めた他はP. pastorisのFDH遺伝子に用いたものと同一であった。得られた断片を各20単位のNdeIおよびSmaIで25℃にて1時間、ついで37℃にて2時間、全容量50μlで消化した。これと平行して開始コドンにNdeI部位を有するpBMS2000ベクターのバージョン（2μg）を同一条件を用いてNdeIおよびSmaIで消化した。これら消化した試料を別々に1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。PDHmod遺伝子（1200-塩基対断片）および線状化ベクター（4700-塩基対断片）に対応するバンドをゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。これら２つの断片のライゲーション、大腸菌の形質転換、およびPDHmod遺伝子を有する挿入（pBMS2000-PDHmodを形成）を含むコロニーのスクリーニングは上記と同様にして行った。
【００９４】
pBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築のため、pBMS2000-PDHmod（2μg）を50μLの反応液中、各10単位のHindIIIおよびSmaIで25℃にて1時間、ついで37℃にて1時間開裂させた。10単位のT4DNAポリメラーゼ（Invitrogen）および4つのすべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の2.5mM混合物2μLを加え、試料を11℃で20分間インキュベートした。反応液を1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。1800-塩基対断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて単離した。この断片は、順にtacプロモーター、groES遺伝子、およびPDHmod遺伝子（転写融合物として）を含んでいる。つぎに、pBMS2000-PPFDH（2μg）を10単位の制限エンドヌクレアーゼSmaIで50μL容量にて2時間、25℃で消化し、ついで0.4単位のエビアルカリホスファターゼ（United States Biochemicals、クリーブランド、オハイオ）で1時間、37℃にて処理した。プラスミドDNAを1.0%TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動し、単離し、QIAquickキットを用いて抽出した。これら２つの断片を6.5：1（挿入：ベクター）のモル比で16℃にて4時間、10μLの最終容量でライゲートした。1-ブタノール抽出および遠心分離後、DNAをエレクトロコンピテントDH10B細胞に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを、FDHについて記載したのと同様にして２つのPDHmod-特異的プライマーを用いてPDHmod遺伝子の存在についてスクリーニングした。第二ラウンドのＰＣＲスクリーニングは、それぞれPPFDH遺伝子の5'末端およびPDHmodの3'末端に相同なプライマーを用いて行った。1400-塩基対断片の増幅を支持することのできた構築物のみが２つの遺伝子を正しい方向で有していた。一つのそのようなプラスミドが見出され、方向性がKpnIを用いた診断的制限消化によって確認された（この消化により5422塩基対および1826塩基対の予期された断片が得られた）。このプラスミドを「pBMS2000-PPFDH-PDHmod」と称した。
【００９５】
実施例８
FDHおよびPDHmodの発現
pBMS2000-PPFDH-PDHmodを大腸菌JM110に形質転換した。シェークフラスコ研究においてJM110（pBMS2000-PPFDH-PDHmod）をMT5培地（2.0%Yeastamine、4.0%グリセリン、0.6%リン酸ナトリウム［二塩基性］、0.3%リン酸カリウム［一塩基性］、0.125%硫酸アンモニウム、0.0256%硫酸マグネシウム［七水和物；滅菌1M溶液からオートクレーブ後に添加］、および50μg/mlの硫酸カナマイシン［濾過滅菌した50mg/ml溶液からオートクレーブ後に添加］）中、28℃、250rpmで18時間増殖させた。600nmでの光学密度（OD600）を記録し、0.35の開始OD600を与えるに充分な細胞を新鮮なMT5/カナマイシン培地に加えた。OD600が0.8〜1.0となるまで、フラスコを250rpm、28℃にて振盪した。両遺伝子の発現を滅菌濾過した1Mイソプロピルチオ-β-Dガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度35μMで加えることによって誘発し、発酵を24〜48時間続けた。細胞を6,500×gで5分間遠心分離することによってペレット化し、等容量の50mMギ酸アンモニウム（pH7.0）で１回洗浄し、再度ペレット化した。細胞を-20℃で貯蔵するか、または直ちに用いた。ペレットを50mMリン酸アンモニウム（pH7.0）中、10mL/g（湿細胞重量）にて再懸濁し、Fisher Scientific Model 50 Sonic Dismembrator（Fisher Scientific、ピッツバーグ、ペンシルベニア）、マイクロチップで動力設定15を用いて3×15秒間超音波処理した。細胞破砕物は、13,000×gにて室温で5分間遠心分離することによりペレット化した。
【００９６】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により発現を調べた。1μLの細胞抽出物を5μLの4X NuPAGETM LDS緩衝液（Invitrogen）と混合し、蒸留水で19mLとした。試料を70℃で10分間加熱した。1mLの1Mジチオトレイトール溶液を混合物に加え、10μLを10%NuPAGETM Bis-Trisポリアクリルアミドミニゲルに適用した。電気泳動を200vで50〜60分間行い、ゲルを0.1%（w/v）クーマシーブルー（Sigma）、40%（v/v）エタノール、および10%（v/v）酢酸からなる溶液で染色した。染色液に浸漬したゲルを沸騰が明らかとなるまでマイクロ波オーブンで加熱し、ついでオービタルシェーカーで40rpmにて15分間振盪した。ゲルを脱イオン水で充分に洗浄し、脱色溶液（GelClearTM；Invitrogen）で覆った。この溶液を再び沸点ちょうどまで加熱し、少なくとも2時間穏やかに振盪した。インキュベートするとMr 43,000および40,000に２つの顕著なバンドが認められ、FDHおよびPDHmodのサブユニットの予期された分子量に対応していた。試料はまた、実施例１０に記載するようにして試験したときにFDHおよびPDHの両活性を有していることがわかった。この組換え大腸菌株にSC16496の内部表示を与えた。
【００９７】
SC16496を引き続き15-リットルおよび250-リットル容量で発酵させた。15-リットル発酵の場合、1mLの凍結SC16496を入れた一つのバイアルを室温で解凍し、4-リットルフラスコ中の50μg/mlのカナマイシンを含む1リットルのMT5培地に加えた。フラスコを28℃、250rpmにて24時間インキュベートし、Braun発酵曹中の13リットルのMT5培地（15Lの最終容量に基づいて成分をバッチ)に移した。それぞれ50μg/mlおよび0.0246%の最終濃度を与えるのに充分な硫酸カナマイシンおよび硫酸マグネシウム七水和物を500mLの蒸留水に溶解し、0.2ミクロン酢酸セルロース濾過ユニットにより濾過滅菌した。この溶液をタンクに加え、直ちに播種した。最初のOD600は約0.35であった。
【００９８】
発酵作業パラメーターは以下のとおりであった：
16リットルの作業容量
温度：28℃
換気：1.0vvm
圧力：690mbar
攪拌：500rpm
必要に応じてNH4OHを用いてpHを6.8に調節
フォーミング（foaming）は必要に応じてUCON（Dow Chemical Companyによって製造されたフルオロカーボン溶媒ブレンド）を添加して調節した。
【００９９】
OD600 0.8〜1.0（播種後約２時間）にて濾過滅菌したIPTG（500mLのdH2Oに溶解）を無菌的に加えて最終濃度を35μMとした。発酵をさらに48時間続けた時点でタンクの内容物を10℃に過冷した。細胞を遠心分離により回収し、0.1vol 50mMギ酸アンモニウム、pH7.0で１回濯いだ。細胞ペーストをプラスチック容器に入れ、必要なときまで-70℃で貯蔵した。
【０１００】
250-Lタンクについては、播種物は以下のようにして調製した：1mLの凍結SC16496を解凍し、50μg/mlのカナマイシンを含む300mLのMT5培地に加えた。フラスコを28℃、250rpmにて24時間増殖させた。OD600を決定し、80OD単位を与える細胞の適当な容量を除去し、250mLの新鮮なMT5培地に加えた。細胞をBraun発酵曹中の10LのMT5/カナマイシン培地に無菌的に加え（最初のOD600 〜0.008）、上記の発酵作業パラメーター下で16時間増殖させた。ついで、培養液を適当な濃度のカナマイシンおよび硫酸マグネシウムを含む250LのMT5に移した。これら条件下でのSC16496の倍加時間が90分であることに基づき、250L中の10Lの播種物は0.30〜0.35の開始OD600を与えるはずである。誘発、増殖、回収、および貯蔵は、15-L発酵について記載したのと同様にして行った。
【０１０１】
実施例８Ａ
単離したPDH/FDH酵素濃縮物を用いた3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ-[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を介した(αS)-α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）の短縮（telescoped）製造
【０１０２】
工程１：PDH/FDH酵素濃縮物の単離
大腸菌JM110（pBMS2000-PPFDH-PDHmod）の発酵ブロス（30リットル）を4000Lタンクから得、マイクロ流動床（MicrofluidicsモデルM-110Y、作動圧力12,000〜20,000psi）に通し（1回）、ブロスの温度を40℃未満に保ちながら細胞から活性を放出させた。マイクロ流動床ブロスのPDH/FDH活性は、PDHについては32I単位/ML、FDHについては8I単位/mlであった。
【０１０３】
ブロス全体を清澄化するため、4.5kgのCeliteを充分に攪拌したブロスに加えた。ついで、0.201リットルの30%水性ポリエチレンイミンを加え、30分間混合した。ついで、混合物を濾過プレス（Ertel Alsopモデル8-ESSC-10）を用いて濾過し、18リットルの濾液を得た。濾過ケーキを12リットルの水で洗浄して容量を30リットルに戻した。この工程の収率は、PDHの97%の活性の回復であり、活性は31IU/ml、FDHの活性は8IU/mlであった。
【０１０４】
清澄化したブロスを100,000 MWCOフィルターカセット（Millipore Pellicon 2ユニット、ポリエーテルスルホン低タンパク質結合カセット、0.5m2濾過面積）により限外濾過した。ポンプの循環速度は400mL/分であった。清澄化した濾液を1.5リットルに濃縮し、PDH力価が567IU/mlでFDH力価が136IU/mlの酵素濃縮物を得た。浸透液をアッセイしたところ、活性は認められなかった。濃縮物中の全体の酵素活性回収は84%であった。
【０１０５】
工程２：還元的アミノ化
3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ-[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）（1.00kg；4.46モル）を20L容器に加え、ついで水（5L）を加えた。混合物を攪拌し、10N NaOHでpHを調節してpH〜8として溶液を得た。Darco KBBカーボン（100g）を加え、混合物を5分間攪拌し、ついで5μの濾紙を用いてブフナー漏斗で濾過した。濾紙を水洗し（2×1L）、濾液および洗浄液をコンバインして透明な溶液を得た。
【０１０６】
攪拌しながらギ酸アンモニウム（0.562Kg；8.92モル）を加え、10N NaOHを用いてpHを再び〜7.5に調節した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（2.65g）およびジチオトレイトール（1.54g）を加えた。固形分が溶解したときにPDH/FDH酵素濃縮物を加えた（1.03L；PDHを500,000IU)。10N NaOHを用いてpHを室温で〜8.0に再調節した。
【０１０７】
ついで、混合物を〜40℃に温め、水で全容量10Lまで希釈した。42時間攪拌する間、pHを7.7〜8.3に保持した。得られた溶液は、0.955Kg（95.1%）の生成物(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）を含んでいた。
【０１０８】
工程３：BOC-保護
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の溶液の一部（477.5g；2.12モル）にジカルボン酸ジ-tert-ブチル（1.022kg；4.68モル）を加えた。この混合物を、10N NaOHを用いてpHスタット滴定器で10に調節し保持しながら周囲温度で攪拌した。反応はBoc2Oの添加後4時間で完了し、このとき出発物質は1.0%未満しか残っていなかった。
【０１０９】
混合物のpHを35%H2SO4で〜8に調節し、混合物にi-PrOAc（5.0L）を加えた。ついで、混合物のpHを35%H2SO4で2.0に調節し、このpHで5〜10分間保持した。Dicalite（250g）を加え、混合物を〜10分間攪拌し、ついでブフナー漏斗中の濾紙上のDicalite（250g）のパッドで濾過した。Dicaliteのパッドを2.5Lのi-PrOAcでさらに洗浄した。
【０１１０】
濾液を10N NaOHでpH8に調節した。1時間沈降させた後、界面を含む有機層を廃棄した。水性層にi-PrOAc（7.5L）を加えた。混合物を35%H2SO4でpH〜2.0の酸性にし、ついで〜40℃に加熱し、穏やかに攪拌しながら4時間保持した。層を分離し、有機抽出物を残した。界面を含む水性層をi-PrOAc（3.75L）で抽出し、40℃で2時間後に層を再び分離した。界面を含む水性層をi-PrOAc（3.75L）で再び抽出し、40℃で2時間後に層を分離した。
【０１１１】
コンバインした有機抽出物（〜15L）を蒸留により〜4.5Lに濃縮した。ついで、この溶液にヘプタン（〜10L）を10〜15分間かけて加え、その間温度を〜82-89℃に保持した。リアクタージャケットの温度を70℃に設定し、この温度に1時間保持した。冷却するとほどなく結晶化が生じた。ついで、リアクタージャケットの温度を40℃に設定し、この温度に30分間保持した。
【０１１２】
懸濁液を周囲温度に冷却し、ついでさらに0〜5℃に冷却した。0〜5℃で1時間攪拌した後、生成物を濾過した。生成物をヘプタン（2.5L）で洗浄し、ついで40℃で真空乾燥して607.0g（88%収率）の(αS)-α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）を得た。
【０１１３】
実施例９
組換え大腸菌SC16496 JM110[pBMS2000-PPFDH-PDHmod]（ATCC受託番号PTA-4520）からの抽出物を用いた還元的アミノ化
組換え大腸菌の凍結細胞（25g）を脱イオン水（最終容量を100mlとするに充分であり、5mlの1Mギ酸アンモニウムを含有）に加えた。解凍後、細胞をJanke and Kunkel Ultra-turrax T8ホモジナイザーを用いて浮遊させ、ついで濃NH4OHでpH7に調節し、破砕した氷で冷却して50mMギ酸アンモニウム中の25%w/v細胞浮遊液を得た。細胞を12000psiにてマイクロ流動床に２回通すことにより破砕し、細胞破砕物を20,000×g、4℃にて遠心分離により除去した。2456単位（アッセイＡ）または768単位（アッセイＢ）のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび8801単位のホルメートデヒドロゲナーゼを含む266mlの上澄み液を1-L容器に加えた。
【０１１４】
ギ酸アンモニウム（16.74g、0.2654モル）および(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸（29.76g、0.1327モル）を含む266mlの溶液を調製し、12.7mlの濃水酸化アンモニウムでpH8.0とした。NAD（372mg、0.561ミリモル）およびジチオトレイトール（81.8mg、0.530ミリモル）を加え、ついでこの溶液を大腸菌抽出物を入れた容器に加えた。容器を40rpmのシェーカー上、40℃に保持した。濃水酸化アンモニウムを定期的に加えてpH8.0に保持した。38時間後、HPLC分析によって測定されるように、溶液は31.5g（0.140モル、100%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでおり、該アミノ酸のR-エナンシオマーは含んでいなかった。
【０１１５】
実施例１０
組換え大腸菌SC16496 JM110[pBMS2000-PPFDH-PDHmod]（ATCC Deposit PTA-4520）からの凍結乾燥細胞を用いた還元的アミノ化
溶液には10.0mlの最終容量にpH8.0（pHはNH4OHで調節）にて、以下のものが含まれていた：0.50Mギ酸アンモニウム、0.237M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸、1.00mM NAD、1.00mMジチオトレイトール、および975mgの凍結乾燥した組換え大腸菌。細胞を湿重量の26%まで乾燥させた。乾燥前に細胞は65.04単位/g（アッセイＡ）のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、（またはアッセイＣにより12.79単位/gのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ）、および133.32単位/gのホルメートデヒドロゲナーゼを含んでいた。この溶液を緊密に密封した50ml容エーレンマイヤーフラスコ中で40℃、100rpmにて3日間インキュベートし、ついでHPLCにより分析した。この溶液は49.06mg/ml（92.13.0%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を含んでいた。
【０１１６】
実施例１１
分枝鎖トランスアミナーゼを用いたトランスアミノ化
50mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）中、1.0mlの最終容量に以下のものを含む溶液を調製した：0.10Mグルタミン酸ナトリウム、0.05M (3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸（0.05M NaOHで中和）、0.1mMピリドキサールリン酸、および1mgの分枝鎖トランスアミナーゼ（Biocatalytics）。この溶液をマイクロ管で37℃にて68時間インキュベートした。この溶液は5.53mg/ml（49.2%収率）の(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸および7.05mg/mlの残留する(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-オキソ-酢酸を含んでいた。
【０１１７】
実施例１２
(S)-アミノ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸のエナンシオマー過剰および量のHPLCアッセイ
試料を水で約2mg/mlの濃度に希釈し、沸騰水浴に1分間入れて反応を停止させ、タンパク質を沈殿させた。冷却後、試料を0.2ミクロンのナイロンフィルターでHPLCバイアル中に濾過した。２つの分離法を用いた。
【０１１８】
方法１：
カラム：Chiralpak WH 25×0.46cm（Daicel Industries, Ltd.）
移動相：0.3mM CuSO4
流速：1ml/分
カラム温度：50℃
検出：240nmに設定したダイオードアレイ検出器（DAD）
注入量：10μl
S-エナンシオマー（(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸）保持時間：79.9分
R-エナンシオマー保持時間：32.8分
【０１１９】
方法２：
カラム：Regis Davankov Ligand Exchange 15×0.46cm
移動相：25%メタノール/75%6mM CuSO4
流速：1ml/分
カラム温度：40℃
検出：240nmに設定したDAD
注入量：10μl
S-エナンシオマー（(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸）保持時間：3.2分
R-エナンシオマー保持時間：11.2分
ケト酸（3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸）保持時間：5.2分
【０１２０】
実施例１３
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：0.4mM NADH、5mMフェニルピルビン酸ナトリウム、HClでpH8.75に調節した0.75M NH4OH。吸光度の低下を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２１】
実施例１４
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：0.4mM NAD、10mM L-フェニルアラニン、1N NaOHでpH10.0に調節した0.1M K2HPO4。吸光度の増加を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２２】
実施例１５
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：0.4mM NADH、50mM 3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（1当量のNaOH溶液に溶解）、HClでpH8.75に調節した0.75M NH4OH。吸光度の低下を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２３】
実施例１６
ホルメートデヒドロゲナーゼアッセイ
ホルメートデヒドロゲナーゼアッセイは、1ml中に40℃にて以下のものを含んでいた：1mM NAD、100mMギ酸アンモニウム、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）。吸光度の増加を340nmでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル/分として計算した。
【０１２４】
実施例１７
α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）へのトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）の臭素化
固体のトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｎ）（288g；1.48モル）を冷却器を備えた３つ首丸底フラスコ中で塩化チオニル（465mL）に懸濁した。ジメチルホルムアミド（DMF；0.3mL）を加え、懸濁液を室温で1.5時間攪拌した。反応の完了をガスクロマトグラフィーによりチェックした。ついで、固体のNBS（307g）を反応混合物に少しずつ加え、反応混合物を60℃に加熱した。反応混合物を3時間攪拌し、その間温度を60〜65℃に保持した。ガスクロマトグラフィーによるモニターを行って反応の完了を確実にした。ヘプタン（900mL）を反応混合物に加えた。過剰の塩化チオニルを78〜80℃で留去した。ついで、水を注意深く加えて（激しい反応）反応を停止させた（全量1050mL）。ついで、ヘプタン（500mL）および水（600mL）を加え、水性層を有機層から分離した。有機層をさらなる水（600mL）で洗浄し、水性層を再び有機層から分離した。さらなる水（150mL）を有機ヘプタン層に加え、ヘプタンを水性層から留去した。特に、70mLの水をヘプタン共蒸留した。ヘプタンを留去した後、テトラヒドロフラン（THF；1200mL）を水性層に加え、その結果得られた混合物を室温で16時間激しく攪拌してゆっくりと加水分解させた。ガスクロマトグラフィーによるモニタリングは若干の未反応の酸クロライドの存在を示した。ついで、さらなる水（150mL）を加えて加水分解のスピードを上げ、反応をガスクロマトグラフィーによりモニターして反応の完了を確実にした。ついでTHFを留去して二相（水および油）反応混合物を得た。ついで種晶を加え、反応液を静置して室温とし、重い固体を出現させた。懸濁液を室温にて2時間攪拌したときに攪拌できるようにするため、水（250mL）およびアセトニトリル（500mL）を加えた。ついで、固形分を濾去し、アセトニトリル（2×250mL）で洗浄した。この濾液にはα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）の最初の収穫；264gがAP95とともに室温での真空乾燥後の66%収率にて含まれていた。ついで、母液（113g残渣）を水およびアセトニトリル（250mL/250mL）で室温にて1〜2時間、残渣粉砕した。ついで、反応液を濾過し、固形分を乾燥させてα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）の第二の収穫；64gをAP90とともに16%収率にて得た。
【０１２５】
実施例１８
α-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）からのα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）の調製
エーレンマイヤーフラスコに315mlの95〜98%H2SO4を充填し、ついで氷浴で8℃に冷却した。ついで、HNO3（30mlの水に50mlの70%HNO3を加えることによって調製した50%を35ml）をフラスコに加え、その間混合物を氷浴で8℃に保持した。ついで、温度が28℃よりも低いままでいるように固形のα-ブロモトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｏ）（92g、0.338モル）を約30〜60分かけて少しずつ混合物に加えた。ついで、透明な溶液が得られるまで60℃に加熱しながら反応液を攪拌した。
【０１２６】
反応の進行を薄層クロマトグラフィー（TLC）かまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかでモニターした。TLCは、KMnO4とともに酢酸エチル/メタノール/ヘキサンを9：1：10の比で用いたシリカゲルで行った。HPLCは、ODSカラム、C18 S-3 120A、4.6×50mm、10%アセトニトリル/H2Oから100%アセトニトリルへの7分間での線状勾配、および2.5ml/分の流速を用いて行った。検出波長は220nmであった。
【０１２７】
反応が完了したら、混合物を室温に冷却し、約16時間そのまま保持した。ついで、褐色のガスが発生しなくなるまで水（700mL）を加えて反応を停止させた。得られたスラリーを氷浴で約5℃に冷却し、ついで濾過した。固形の濾過物を200mLの水で洗浄し、空気乾燥して90gのα-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）を薄黄色の固体として得た（92%収率）。
【０１２８】
実施例１９
α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）からの(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の調製
α-ブロモ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｑ）（75g、0.278モル）を225mLの30%水酸化アンモニウム（4.08モル、14.6当量）に溶解した。ついで、反応混合物を65℃に16時間加熱した。ついで、反応混合物を回転蒸発（rotovap）で固体に濃縮した。この濃縮固体にEtOH（200mL）を加え、ついで再び回転蒸発で濃縮した。収量は、黄色の固体としての71gのヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のキラルな混合物であった（90%）。
【０１２９】
実施例２０
ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）の分割
実施例１９のキラル混合物のBoc保護を、テトラヒドロフラン中のBoc無水物および水酸化ナトリウムを用いて行った。得られた化合物α-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-]3]ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｒ）（EA中に0.25M、80μl、＝6.52mg）をキラルな塩基([1R,2S]-(-)-1,2-ジフェニルヒドロキシエチルアミン）（0.25M、80μl）とバイアル中で混合し、混合物をSpeedVac中で蒸発乾固した。溶媒（200μl）を加えた。混合物を入れたバイアルを50℃に加熱したシェーカーに1.5時間置いた。ついで、(αS)-α-[[ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（化合物Ｓ）の結晶化のために混合物を室温に冷却した。
【０１３０】
実施例２１
ZnCl2触媒したアダマンチルブロマイド（式Ａ）カップリング
乾燥容器に7.5kgのアダマンチルブロマイドを充填した。ついで、塩化メチレン（22.5リットル）を室温にて加えて固形のアダマンチルブロマイドを溶解した。溶解は吸熱性であるので、次の工程の前に反応混合物の温度を20℃に戻した。ついで、反応混合物に塩化亜鉛（1.05kg）を入れ、20℃で約5分攪拌した。ついで、反応温度を20〜25℃に保持しながら反応混合物にトリス(トリメチルシリルオキシ)-エチレン（15.3kg）を入れ、得られた混合物を2時間攪拌した。この混合の後にトリス(トリメチルシリルオキシ)-エチレン（5.10kg）を加えた。この添加の間、温度を30℃未満に保持した。反応液をさらに12〜15時間、20〜25℃に保持し、この時点で反応混合物を塩化メチレン（15リットル）で希釈し、0〜5℃に冷却した。ついで、反応混合物を半飽和NH4Cl溶液で、最初は滴下の仕方で処理した。添加の間、温度を30℃未満に保持した。濃い懸濁液が得られた。この懸濁液に酢酸エチル（93.75リットル）を加えた。混合物を激しく15分間攪拌すると、有機相と水性相は分離した。有機層を貯蔵し、水性層を酢酸エチル（各洗浄で18.75リットル）で２回洗浄した。ついで、酢酸エチル洗浄液および有機層をコンバインし、水（37.5リットル）ついで水で半飽和した食塩水（37.5リットル）で洗浄した。有機層を再び分離し、蒸発させて結晶を生成させた。ついで、22.5リットルの最終容量でヘプタンへの溶媒交換を行った。ついで、得られた懸濁液を5〜10℃に1時間冷却し、生成物のα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）を濾過により得た。α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）の収量は6.96kg（33.11モル、95%）であった。
【０１３１】
実施例２１Ａ
α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）のエステル化
まず不活性雰囲気をリアクター内に生成した。ついで、リアクターにメタノール（35.00リットル）、ついでα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｂ）（14.00kg）を入れて懸濁液を生成した。懸濁液を0〜5℃に冷却し、塩化アセチルを反応混合物の温度が5〜10℃に保持されるような仕方で加えた。塩化アセチルの添加完了後、反応混合物を20〜25℃に温め、20〜25℃で2時間攪拌した。ついで、反応混合物を真空下、40℃で濃縮すると薄い油状物が得られた。この油状物を酢酸エチル（71.96リットル）に溶解し、室温に戻した。得られた混合物を水（各洗浄で28.78リットル）で２回洗浄し、各洗浄後に有機層と水性層とを分離した。有機層を貯蔵し、一方、水性層はコンバインして3N NaOH溶液でpH9.5に調節した。ついで、コンバインした水性層を酢酸エチル（各抽出に14.39リットル）で２回抽出した。各抽出後の有機層を分離し、貯蔵した有機層とコンバインした。ついで、これらコンバインした有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（28.78リットル）ついで食塩水（43.18リットル）で洗浄した。ついで、すべての揮発成分を真空下、40℃で除去し、静置する結晶化する無色から薄黄色の油状物が得られた。この油状物は、13.29kg（59.26モル、89%）のα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）を含んでいた。
【０１３２】
実施例２２
α-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）のスワーン酸化
三つ首フラスコ（22リットル）は、メカニカルスターラー、温度プローブおよび添加漏斗を備えており、窒素ガスを一夜パージした。ついで、塩化オキザリル（500ml、5.73モル）を加え、ついでCH2Cl2（8リットル）を加えた。得られた溶液をアセトン/ドライアイス浴で-69℃に冷却した。ついで、内部温度を-60℃未満に保持しながら、ジメチルスルホキシド（DMSO；700ml、9.86モル）の溶液を約30分かけてゆっくり加えた。温度を-60〜-70℃に保持しながら、溶液を20分間攪拌した。内部温度を-60℃未満に保持しながら、CH2Cl2（1.7リットル）中のα-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｃ）（990g、4.42モル）の溶液を約30分間かけてゆっくりと加えた。得られた溶液を30分間攪拌した。ついで、NEt3（3リットル、21.5モル）を加えてトリエチルアミン塩酸塩の重いスラリーを生成した。反応混合物を室温に温め、水（1リットル）を加えてトリエチルアンモニウム塩（TEA塩）を溶解させた。ついで、反応混合物を丸底フラスコに移し、濃縮減量してジクロロメタン（DCM）およびNEt3を除去した。EtOAc（12リットル）を加え、得られた水性層および有機層を分離した。有機層を水（各洗浄に2リットル）で３回洗浄し、ついで食塩水で洗浄した（2リットル）。ついで、有機相を無水Na2SO4で蒸発乾燥させてα-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）のわずかに黄色の固体を得た。収率は約104%であった。
【０１３３】
実施例２３
α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）の3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）へのヒドロキシル化
エーレンマイヤーフラスコに95〜98%H2SO4（495ml）を充填し、氷浴で8℃に冷却した。ついで、HNO3（30mlの水に50mlの70%HNO3を加えることによって調製した50%を47.5ml）をフラスコに加え、混合物を再び氷浴で8℃に冷却した。28℃未満の温度を保持すべく、固形のα-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｄ）（100g、0.45モル）を約30〜60分かけて少しずつ混合物に加えた。氷浴で冷却しながら、反応混合物を攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー（TLC）かまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかでモニターした。TLCについては、シリカゲルを用い、溶媒はEtOAc/MeOH/ヘキサン（9/1/10）；KMnO4であった。HPLCについては、4.6×50mm、C18、3ミクロン、120オングストロームカラムを、10%アセトニトリル/H2Oから100%アセトニトリルへの7分間での線状勾配、および2.5ml/分の流速で用いた。モニター波長は220nmであった。反応が完了したら（約1時間）、冷水（1.5リットル）およびEtOAc（500ml）を加えて反応を停止させた。さらなる水およびEtOAc（各500ml）を加えて水性層と有機層との分離を助けた。ついで、水性層を3アリコート（各500ml）のEtOAcで抽出した。有機層をコンバインし、ついで減圧下で濃縮して3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）を含む130gの黄色の油状物を得た。
【０１３４】
実施例２４
3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）への3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸メチルエステル（式Ｉ）の加水分解
実施例２３の黄色の油状物をテトラヒドロフラン（300ml）に溶解し、氷浴で5℃に冷却した。温度を30℃に保持しながら、1リットルの1N水酸化ナトリウムを溶液にゆっくりと加えてpHを約7に調節した。ついで、さらに500mlの1N NaOHを加えてpHを約14に調節した。ついで、氷浴で冷却しながら反応混合物を攪拌し、反応の進行を実施例２３に記載のようにTLCまたはHPLCによりモニターした。約30分後に反応が完了したら、EtOAc（500ml）を加え、水性層と有機層とを分離した。水性層をさらに500mlのEtOAcで洗浄した。水性層を濃HClで酸性にした。溶液がpH7に達したときにEtOAc（500ml）を加え、ついでpHが0.7に達するまでさらに濃HClを加えた。添加した濃HClの全量は150mlであった。ついで、水性層をEtOAc（4×400ml）で抽出し、コンバインした有機層を400mlの水、ついで400mlの食塩水で洗浄した。ついで、洗浄した有機層をMgSO4で乾燥させ、濃縮した。収量は薄黄色の固体が88gであった。この固体を100mlのEtOAcおよび300mlのヘプタンに30分間攪拌しながら溶解し、ついで濾過および空気乾燥すると85gの褐色の固体（85%；3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ））が得られた。
【０１３５】
実施例２５
アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）の調製
2-リットル容フラスコ（メカニカルスターラー、温度計、冷却器、圧均等化添加漏斗およびアルゴン導入口を備えている）に亜鉛末（78.0g、1.19モル）を入れ、ついで無水テトラヒドロフラン（400ml）を加えた。この混合物に1,2-ジブロモエタン（2ml）を加えて亜鉛を活性化した。得られた混合物を穏やかな還流にて25分間加熱した。-55℃に冷却した後、反応温度を-55〜-60℃に保持する速度にて（1時間必要）トリクロロ酢酸メチル（100.3g、0.565モル）およびクロロトリメチルシラン（80ml、0.648モル）の溶液を加えた。添加完了後、混合物を室温にて約90分攪拌した。得られた混合物をヘプタン（700ml）で希釈し、窒素雰囲気下、Celite 545パッドで濾過した。濾過ケーキをさらなるヘプタン（1×300ml、3×200ml）で洗浄した。ついで、濾液をロータリーエバポレーター（22〜27℃の水浴で約10〜15mmHg）上、減圧下で濃縮して粗製の(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシランを濃厚な油状物（129.2g）として得た。定量的プロトンNMRは、この粗製物質が0.389モル（68.8%）の(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシランを含むことを示した。
【０１３６】
アルゴン導入口を備えた1リットルフラスコに、粗製の(2,2-ジクロロ-1-メトキシ-ビニルオキシ)-トリメチルシラン（129.1g、約0.389モル）および無水ジクロロメタン（100ml）を入れた。得られた溶液に1-ブロモアダマンタン（75.2g、0.349モル）および無水塩化亜鉛（6.56g、48ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で一夜攪拌した。得られた赤−褐色の混合物をヘプタン（600ml）および水（300ml）で希釈した。有機層を分離し、水（2×100ml）、1N重炭酸ナトリウム（3×150ml）、および水（2×200ml）で洗浄した。得られた溶液をCelite 545のパッドで濾過し、濾液を減圧下で濃縮して無色の固体を得た。この物質を沸騰したメタノール（250ml）に溶解した。得られた溶液を1時間、室温に冷却した。約5℃に2時間冷却した後、固体を濾過により回収し、冷メタノール：水（94：6；4×50ml）で洗浄してアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（式ＶII）を無色固体として得た：75.0g（1-ブロモアダマンタンに基づいて77.3%);mp 76.3℃。
【０１３７】
元素分析値：C13Hl8Cl2O2：
計算値：C, 56.33；H, 6.55；Cl, 25.58%
実測値：C, 56.49；H, 6.59；Cl, 25.72%
1H NMR（500.16MHz、CDCl3）δ 3.855 (s, 3H), 2.069 (br s, 3 H), 1.866 (d, J=2.75 Hz, 6 H), 1.683, 1.612 (AB q, J=12.1 Hz) ppm
13C NMR（127.78 MHz、CDCl3)δ 166.130, 95.805, 53.969, 43.980, 36.842, 36.256, 28.309 ppm
【０１３８】
実施例２６
ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）の調製
10N HNO3の調製：100mL容の容積測定フラスコに濃HNO3（88.25g、〜62.58mL、〜1.0モル）を入れ、氷浴で冷却した。水（35mL）を加えた。混合の熱が分散した後、溶液を室温に温めた。ついで、フラスコに水をマークのところまで満たして10N HNO3を得た。
【０１３９】
250mL容の熱電対温度計を備えた三つ首フラスコに、濃H2SO4（103g、〜56mL）を入れた。氷浴で0.4℃に冷却した後、10N HNO3（5.68mL、56.8ミリモル）を〜30分かけて加えた。この酸混合物の温度が〜1.0℃に下がったら冷浴を除いた。式ＶIIのアダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル（15.0g、54.11ミリモル；乳鉢/乳棒で軽く砕いて大きな塊/結晶を破砕）を少しずつ（10分毎に1.25g；1時間50分の添加時間）加えた。〜5時間後、反応混合物は透明で薄黄色の溶液であった。
【０１４０】
〜24時間攪拌後、反応混合物は非常に薄い黄色の溶液であった。メカニカルスターラーおよび熱電対温度計を備えた四つ首フラスコ（1L）に、水（250mL）および尿素（8.0g、0.133モル、HNO3に対して〜2.34当量）を入れた。得られた溶液に酢酸エチル（230mL）を加えた。得られた２相混合物を氷浴で〜1.0℃に冷却した。上記の反応混合物を冷却したEtOAc/水/尿素混合物に〜15分かけて加えた。さらに酢酸エチルおよび水（各〜50mL）を用いて移すのを完了した。〜45分間攪拌した後、冷浴を除き、混合物を攪拌して温めた。4.5時間後に（反応停止の開始から）、得られた混合物をさらなる酢酸エチル（〜100mL）を用いて分別漏斗（1L）に移し、移すのを完了した。水性画分を除き、酢酸エチル（1×80mL）で抽出した。有機画分をコンバインし、水（2×90mL）、1N NaHCO3（4×90mL）、および食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下で除去して式ＶIIIのジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステルを無色に近い固体として得た：15.67g（98.7%粗製収率）。この粗製の物質は、精製することなく式ＩＸのジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸を調製するのに用いることができる。しかしながら、所望なら、この粗製の物質（15.65g）をメタノール（102mL）および水（85mL）から再結晶して綿毛状の固体（mp 114.8-115.0℃）を91%の収率で得ることができる。
【０１４１】
元素分析値：C13H18Cl2O3：
計算値：C, 53.25; H, 6.18; Cl, 24.18%
実測値：C, 53.24; H, 6.24; Cl, 24.31%
1H NMR (500.16MHz, CDCl3)δ3.857 (s, 3H), 2.298 (br m, 2 H), 1.824 (s, 2 H), 1.793 (d, 4 H, =2.75 Hz), 1.682, 1.629 (br AB q, 4 H), 1.529 (m, 3 H) ppm
13C NMR (127.78 MHz, CDCl3)δ165.929, 94.281, 68.932, 54.150, 44.478, 44.529, 44.020, 35.750, 34.759, 30.149 ppm
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120オングストローム (4.6×50mm),λ=200nm, 2.5ml/分
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
【０１４２】
勾配：20%Ａから100%Ｂへ10分かけて
保持時間 面積% 同定
2.06分 1.19 未知
4.54分 98.16 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチル
エステル
5.09分 0.65 未知
8.35分 アダマンタン-1-イル-ジクロロ-酢酸メチルエステル
【０１４３】
実施例２７
ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）の調製
500ml容丸底フラスコにメタノール（200ml）および1N NaOH（194ml、194ミリモル、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）の投入量に対して約1.36当量）を入れた。その結果得られた溶液を温度が<9℃になるまで氷浴で冷却した。冷浴を除き、ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）（41.68g、142.1ミリモル）を加えた。その結果得られた懸濁液をアルゴン下、周囲温度にて攪拌した。さらに6時間攪拌した後、さらなるメタノール（10ml）を用いて容器壁を濯いだ。約17時間攪拌した後、反応混合物を濾過して少量の粒状物質を除去した。その結果得られた溶液をメカニカルスターラーを備えた2-リットル容の三つ首フラスコに移した。水（900ml）を用いて反応混合物を希釈し、移すのを完了させた。その結果得られた溶液を濃HCl（38ml、約456ミリモル）を加えて酸性にした。白色の固体が速やかに生成した。混合物を約20分間穏やかに攪拌し、ついで氷浴に置いた。約90分間穏やかに攪拌した後、スターラーを停止し、混合物をさらに2時間氷浴に静置した。その結果得られた懸濁液を濾過し、濾過ケーキを氷冷水で洗浄した。濾過ケーキから空気を引くことにより固形分から水の大部分を除去した。ついで、この物質を真空下、周囲温度で22時間乾燥させてジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）を無色粉末の固体として得た：39.19g（98.7%収率）；mp238℃（分解）
【０１４４】
元素分析値：C12Hl6Cl2O3：
計算値：C, 51.63; H, 5.77; Cl, 25.40%
実測値：C, 51.43; H, 5.74; Cl, 25.48%
Lab HPLC：
YMC ODS-A S3 120オングストローム (4.6×50mm), λ200nm, 2.5ml/分
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
【０１４５】
勾配：20%Ａから100%Ｂへ10分かけて
保持時間 面積% 同定
0.53分 0.95 未知
2.65分 97.27 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸
4.54分 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチル
エステル
【０１４６】
1H NMR (500.16MHz, CD3OD)δ2.258 (br s, 2 H), 1.858 (s, 6 H), 1.674, 1.615 (br AB q, J=l 1.54 Hz, 4 H)), 1.588-1.526 (m, 2 H) ppm
13H NMR (125.77MHz, CD30D)δ167.957, 96.356, 69.322, 48.070, 45.360, 44.794, 37.050, 36.039, 31.631 ppm
【０１４７】
実施例２８
3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の調製
500ml容の三つ首フラスコにジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸（式ＩＸ）（38.67g、138.5ミリモル）を入れた。この物質に水（160ml）および1N NaOH（138ml、138ミリモル；固体のNaHCO3を用いたときに生じることがあるフォーミングを避けるため、1N NaOHを用いてジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸のナトリウム塩を生成させた）を加えて濁った溶液を得た。この溶液に固体のNaHCO3（29.10g、346ミリモル、2.50当量）を加えた。NaHCO3を添加後、反応混合物はジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸のナトリウム塩が溶液から生成するにつれて懸濁液となった。反応容器を還流冷却器/アルゴン導入に適合させ、約80℃に加熱した。約6時間加熱した後、混合物を室温に冷却した。反応混合物（pH7.22）に濃HCl（32mlが必要）を加えることにより注意深く（CO2の発生）pH0.15の酸性にした。得られた混合物を酢酸エチル（4×300ml）で抽出した。酢酸エチルで抽出後の水性層（pH0.37）に濃HCl（約2ml）を加えることによりpH0.18までpHを下げた。酢酸エチル画分をコンバインし、食塩水（100ml）で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下で除去して3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）を無色の顆粒状固体として得た：30.77g（99%）。
【０１４８】
元素分析値：C12H16O4：
計算値：C, 64.27; H, 7.19%
実測値：C, 64.30; H, 7.13%
1H NMR (500.16MHz, D2O)δ2.288 (br s, 1.33 H), 2.227 (br s, 0.67 H), 1.819-1.575 (m, 12 H) ppm - 部分的に水和
13C NMR (125.77MHz, D2O)δ207.704, 174.583, 169.608, 98.109, 69.618, 68.830, 47.538, 43.716, 43.251, 43.190, 42.907, 42.563, 36.073, 34.677, 34.232, 30.006, 29.865 ppm - 部分的に水和
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120オングストローム (4.6×50mm), λ = 200nm, 2.5ml/分
【０１４９】
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
勾配：10%Ａから60%Ｂへ10分かけて
保持時間 面積% 同定
1.39分 100% 3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸
4.95分 ジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸
【０１５０】
実施例２８Ａ
１ポット手順を用いた3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＩＩ）の調製
圧均等化添加漏斗およびアルゴン導入口を備えた250-mL容三つ首フラスコに、実施例２６に記載の方法により調製したジクロロ-(3-ヒドロキシ-アダマンタン-1-イル)-酢酸メチルエステル（式ＶIII）（15g、51.16ミリモル）を入れ、ついでテトラヒドロフラン（30mL、不安定化）を加えた。数分攪拌した後、式ＶIIIのメチルエステルの大部分は溶解して濁った溶液を生成した。この溶液に蒸留水（30mL）を加えると、ゆるい（loose）懸濁液が生成した。添加漏斗に1N NaOH（69ml、69ミリモル、式ＶIIIの化合物の投入量に対して〜1.35当量）を入れた。NaOHを70分かけて滴下して加えてほぼ無色の溶液を得、これを周囲温度で攪拌した。
【０１５１】
〜16時間でのHPLC分析は、式ＶIIIの化合物の加水分解が完了したことを示した。この反応混合物はpHが13.24の透明な無色溶液であり、これに〜6N HCl（2.8mL）を加えてpH7.40に調節した。固体のNaHCO3（11.2g、0.133モル、2.60当量）を加えて懸濁液を生成した。
【０１５２】
4時間15分加熱した後のHPLC分析は、反応が完了したことを示す。5時間加熱した後、熱源を除き、反応混合物（透明で無色な溶液）を冷却した。室温に冷却した後、反応混合物を冷蔵庫（+4℃）で4日間貯蔵した。
【０１５３】
冷所で4日間貯蔵した後、反応混合物は依然として透明で無色な溶液であり、HPLC分析は貯蔵による変化を殆ど（もしあったとしても）示さない。室温に温めた後、混合物（pH7.77）に濃HCl（11mL必要、CO2発生；pH〜1.40にて無色の固体が沈殿し始めた）を注意深く加えてpH0.20の酸性にした。その結果得られた懸濁液をEtOAc（×4、全量〜500mL；各EtOAc抽出後に水性画分についてHPLC分析を行った）で抽出した。１回目のEtOAc抽出後の水性層（pH0.38）に濃HCl（〜1.6mL必要）を加えてpH0.18に調節した。２回目のEtOAc抽出後の水性層（pH0.37）に濃HCl（〜0.8mL必要）を加えてpH0.17に調節した。水性層は、残りのEtOAc抽出（抽出#3、pH0.19；抽出#4、pH0.19）の後にさらなるpHは必要なかった。有機画分をコンバインした。乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下で除去して粗製の表題の式ＩＩの化合物を無色に近い顆粒状の固体として得、これを真空（ポンプ）下で16時間乾燥させた：11.42g（99.53%収率）；HPLC, 100%（面積%）。
【０１５４】
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-020-31, TR46373]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.19%; H, 7.09%
【０１５５】
粗製の式ＩＩの化合物（5.0g）を蒸留水（19mL）中で〜85℃に加熱しながら溶解し、ついで熱源から取り出し、冷却した。この物質は〜53℃で結晶化し始めた。室温で〜2時間静置した後、固形分を濾過により回収し、氷冷水で洗浄した。濾過ケーキに窒素を引くことにより水の大部分を除去した。この物質を真空下（ポンプ）で乾燥させて表題の式ＩＩの化合物を大きな無色針状晶として得た：4.33g（86.6%収率）；mp164.5〜165.6℃（Mettler FP800システムにて）；HPLC, 100%（面積%）。
【０１５６】
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-023-15, TR46905]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.42%; H, 7.04%
【０１５７】
実施例２９
L-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）を生成するL-ピログルタミン酸（式Ｅ）のエステル化
反応容器にエタノール（49.0リットル）を入れ、-5℃に冷却した。ついで、混合物の温度が0℃を超えないような仕方で反応容器に塩化チオニル（4.97kg）を入れた。塩化チオニルの添加完了後、混合物を再び-5℃に冷却し、添加の温度が0℃と-5℃との間に保持されるようにL-ピログルタミン酸（式Ｅ）を少しずつ加えた。酸添加後、反応混合物を20〜25℃に加熱し、5時間攪拌した。ついで、反応混合物を最初の容量の約15%まで真空下（Tmax 45℃）で蒸発させた。ついで、残留する油状物をトルエン（49リットル）に溶解した。ついで、トルエン溶液を約10℃に冷却し、最大温度が20〜25℃となるようにトリエチルアミン（8.45kg）をゆっくりと加えた。得られた懸濁液を30分間攪拌し、ついで濾過した。濾過ケーキをトルエン（約5リットル）で洗浄した。濾液を50℃、真空下で全量約10リットルまで減らした。シクロヘキサン（8リットル）を50℃でゆっくりと加え、その後に約30℃に冷却することによって結晶化を開始した。種晶生成後、混合物を20〜25℃に冷却し、シクロヘキサンの第二の8リットルを入れた。ついで、混合物を6〜8℃に冷却し、1時間攪拌し、生成した結晶を濾去した。この結晶をシクロヘキサン（各4リットル）で２回洗浄した。収量は、無色針状晶としての4.89kg（82%）のL-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）であった。
【０１５８】
実施例３０
L-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）のBOC-保護
L-ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）（5.00kg）を室温にてトルエン（24.97リットル）に溶解した。ついで、この溶液に4-ジメチルアミノピリジン（0.19kg）を加えた。ついで、反応混合物に、反応混合物の温度が25℃を超えないような仕方でトルエン（24.97リットル）に溶解した無水BOC（7.29kg）の溶液を入れた。完全に添加した後、反応混合物を25℃で3時間攪拌した。ついで、反応混合物に半飽和NaHCO3溶液（49.94リットル）を入れ、10分間激しく攪拌し、その後に有機相と水性相とを分離した。分離した有機層を水（24.97リットル）で２回洗浄した。ついで、有機層を真空下、最高50℃にて溶媒から蒸発させた。残留する無色からわずかに黄色がかった油状物は静置すると結晶化した。理論的収量は、8.18kg（31.81モル）の(5S)-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式Ｇ）であった。
【０１５９】
実施例３１
SuperHydride還元および脱離
(5S)-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（式Ｇ）（4.80kg）をトルエン（30.97リットル；Kfmax 0.01%水）に溶解し、-50℃に冷却した。この溶液に反応温度が-45℃を超えないようにしてSuperHydride（LiEt3BH：THF中に1M；19.96リットル)を入れた。添加完了後、混合物を-45〜-50℃で30分間攪拌した。ついで、温度が-45℃を超えないようにして反応混合物にN-エチルジイソプロピルアミン（DIPEA；14.47リットル）を加えた。ジメチルアミノピリジン（0.030kg）を固体として混合物に加えた。ついで、反応温度が-45℃を超えないようにして反応混合物に無水トリフルオロ酢酸（TFAA）（4.70kg）を加えた。添加完了後、反応混合物を20〜25℃に1時間温め、この温度でさらに2時間保持した。ついで、反応混合物を0℃に冷却し、反応温度が5℃を超えないようにしてゆっくりと水（48.00リットル）を入れた。ついで、水性相と有機相を分離し、有機相を再び48リットルの水（0〜5℃）で洗浄した。ついで、有機層を蒸発させ、40℃で脱気した。黄色がかった油状物が4.5kg（18.66モル、100%）の4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（BOC-DHPEE）（式III）の収量で得られた。
【０１６０】
実施例３２
BOC-DHPEE（式III）の加水分解
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（BOC-DHPEE）（式III）（6.00kg）およびエタノール（24.00リットル）から調製した溶液を0〜5℃に冷却し、この温度で水（20.87リットル）中の水酸化リチウム水和物（2.09kg）の溶液でゆっくりと処理して濁った溶液を生成した。ついで、この濁った溶液を20〜25℃に温め、この温度で2時間攪拌した。ついで、反応混合物を最高温度40℃、真空下で約10.5リットルまで蒸発させ、水（24.00リットル）およびt-ブチルメチルエーテル（TBMEまたはMTBE、24リットル）を入れ、10分間混合した。得られた有機相と水性相を分離し、水性相に再び24リットルのTMBEを入れた。ついで、この混合物を5〜10℃に冷却し、激しく攪拌しながらH3PO4 85%-水（1：4）を用いてpHを2.3〜2.3に調節した。このプロセスの間、安定のために温度を5〜10℃に保持した。得られた有機層と水性層を分離した。有機層を貯蔵し、水性層を再び前もって5〜10℃に冷却した24リットルのTBMEで抽出した。得られた有機層を貯蔵していた有機層とコンバインし、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（4.82kg）を入れた。ついで、溶液を蒸発させ、最高温度30℃、真空下で脱気した。収量は7.84kg（22.88モル、92%）[N-BOCデヒドロプロリン*DIPEA（BOC-DHP)]であった。
【０１６１】
実施例３３
BOC-DHPのアミド生成
実施例３２に記載の鹸化によって合成したBOC-DHPは水を含んでいてよい。それゆえ、反応を行う前にトルエンとの共沸蒸留を適用した。しかしながら、試薬が過剰なため、原料の計算は水を除去する前のBOC-DHPの量に基づいた。共沸蒸留では、BOC-DHPをトルエンとともに約30%溶液まで希釈した。トルエンを真空下、40℃で除いた。ついで、処理したBOC-DHP（6.00kg）をTHF（48.0リットル）に溶解した。この溶液にDIPEA（2.26kg）を入れ、反応混合物を-20〜-25℃に冷却した。ついで、塩化メシル（3.01kg）をゆっくりと加えた。この添加の間に塩酸DIPEAが沈殿した。ついで、得られた懸濁液を-20℃で2時間攪拌し、ついで表面下の気体導入口によりアンモニアで飽和させた。アンモニアを添加する間、反応液を0℃に加熱した。飽和後、反応混合物を20℃に加熱し、3時間攪拌した。攪拌後、反応混合物を濾過して塩酸塩を除去した。濾過ケーキを幾つかの部分のTHF（12リットル）で洗浄した。濾液を真空下、最高温度40℃で濃縮し、塩化メチレン（33.33リットル）に溶解した。この溶液を水（26.66リットル）で洗浄した。得られた有機相と水性相を分離し、水性相を塩化メチレン（各20リットル）で２回抽出した。得られた有機層をコンバインし、真空濃縮および脱気して過剰のHunigs塩基を除去した。収量は3.35kg（15.77モル、90%）の(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（BOC-DHPA）（式ＩＶ）であった。
【０１６２】
実施例３４
(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）のシクロプロパン化
第一のリアクター（リアクターＡ）には塩化メチレン（18.0リットル）に溶解した（BOC-DHPA）（式ＩＶ）（4kg）を入れ、20℃に保持した。第二のリアクター（リアクターＢ）には塩化メチレン（18.00リットル）を入れ、-30℃に冷却した。ついで、リアクターＢにジメトキシエタン（DME）（3.36kg）、ついでトルエン中のジエチル亜鉛（15.36kg）の30%溶液を温度を-30〜-25℃に保持しながら入れた。ついで、リアクターＢにジヨードメタン（19.99kg）を反応温度を-30〜-25℃に保持しながら入れた。ジヨードメタンの添加完了後、混合物を-30〜-25℃で45分間攪拌した。ついで、この混合物を冷却パイプ（-20〜-25℃によりリアクターＡに入れた。反応が完了するまでリアクターＡの反応温度が22〜24℃に保持されるように、入れるのは約5%の部分にてゆっくりと行った。反応完了後、リアクターＡの混合物を5〜10℃に冷却した。ついで、反応混合物に飽和重炭酸塩溶液（21.6リットル）を反応温度が15℃を超えないようにしてゆっくりと入れた。この添加の後、反応混合物を少なくとも1時間攪拌すると、その間に沈殿が生成した。懸濁液を濾過した。得られた濾過ケーキを容器に戻し、塩化メチレン（14.4リットル）で30分間再スラリー化し、再度濾過した。この第二の濾過の後、濾過ケーキをさらなる塩化メチレン（7.2リットル）で洗浄した。ついで、濾液を有機相と水性相に分離し、有機相を半飽和食塩水（21.6リットル）で洗浄した。ついで、溶媒を最高温度30℃にて真空除去し、ヘプタンと交換した。ヘプタン中の粗製の生成物のスラリーが得られた。溶媒交換後のこの懸濁液の最終容量は14.4リットルであった。粗製の生成物を濾過により単離した。濾過ケーキをヘプタン（2.9リットル）で洗浄し、ついで真空乾燥して一定の重量とした。粗収量は2.76kg（12.2モル、72%）(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。精製するため、この粗製の物質を8倍量の酢酸ブチル/ヘプタンの1：1混合物中に20〜22℃で4時間スラリー化した。この物質を濾過し、濾過ケーキを約1倍量のヘプタンで洗浄した。収量は2.11kg（9.33モル、55%）(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。
【０１６３】
実施例３５
(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド（式Ｊ）を生成する(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の脱保護
メカニカルスターラーおよび熱電対を備えた100ml容の2つ首フラスコに(1S,3S,5S)-3-アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｈ）（5.0g、22.1ミリモル）およびTHF（20ml）を入れた。ついで、HCl（EtOAc中に2.5M、25ml、62.5ミリモル）を懸濁液に加えた。得られた溶液を室温にて18時間攪拌すると、その間に沈殿が観察された。反応の完了はHPLCによりモニターした。メチルt-ブチルエーテル（MTBE）（30ml）を懸濁液に加え、攪拌をさらに30分間続けた。ついで、懸濁液をN2保護下に濾過して白色固体を得、これをMTBE（20ml）で洗浄した。この固体をオーブン中、減圧下で48時間乾燥させて(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドの塩酸塩（式Ｊ；3.6g、100%）を得た。
【０１６４】
実施例３５Ａ
(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）の他の製造法
Ａ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)の変換
30mLの水、40mLのトルエンおよび10mLのMTBEの混合物中の10.4g（25.86ミリモル）の固体ジシクロヘキシルアミン（DCHA）塩の懸濁液に2.7mLの10N NaOH水溶液（27ミリモル）（過剰のNaOHは1.05当量またはそれ以下に限るべきである）を加えた。攪拌すると透明な層を有する二相混合物が得られ、すべての固体が溶解した相を分離した。4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)ナトリウム塩を含む有機相を4mLの水で抽出し、これを最初の水性相に加えた。HPLC定量は、水性相中に12.55%（w/w）の「遊離のオレフィン酸」含量すなわち96%の収率を与えた。
【０１６５】
Ｂ．DMT-MMの生成
室温の水浴に保持した70mLのEtOAc中の2-Cl-4,6-ジMeO-1,3,5-トリアゼン（CDMT）（6.2mg、35ミリモル；1.5当量）の溶液に4mL（36.38ミリモル）のN-メチルモルホリン（MM）をそのまま加えた。固体の4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMT-MM）が沈殿し始めた。DMT-MMを含む懸濁液を室温で30分間攪拌すると、懸濁液は濃厚なペーストとなった。反応の間に温度は23℃から28〜29℃に上昇した。ジ-MeO-N モルホリノ-トリアゼン（DMMT）を生成する競合脱メチル反応を最小にするため、反応液の温度を低く保持した。
【０１６６】
Ｃ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のナトリウム塩の(5S)-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)エステル（式ＩＶ）への変換
HPLC定量（V=25mL）により5g（23.5ミリモル）の遊離オレフィン酸に等価な工程Ａのナトリウム塩の溶液に固体のNH4Cl（3.75g、70ミリモル、3当量）を加えたところ、pHは14から8.9に下がった。この溶液に充分なNaH2PO4×H2Oを加えてpHをpH=6.20に調節した。リン酸塩の量はDCHA塩をNa塩に変換するのに用いたNaOHの最初の過剰量によって変わってよいことに注意。ナトリウム塩の緩衝溶液は、上記工程Ｂで調製したDMT-MMへの懸濁液に処理した。
【０１６７】
二相混合物を室温で4時間攪拌すると、最初のエマルジョンは懸濁液となり、若干のDMHTが沈殿し始めた。HPLCにより反応は完了し、活性化DMT-エステルも酸もともにいずれの相にも認められなかった。
【０１６８】
当該反応条件下、DMT-MMとDMHTとの反応により12〜15重量%の4,6-ジMeO-1,3,5-トリアゼンエーテル（DMT-エーテル）もまた生成する。懸濁液を濾過して4,6-ジMeO-1,3,5-トリアゼン（DMHT）を除去し、相を分離した。高純度の（rich）有機相を2N NaH2PO4×H2O水溶液（2×25mL）で、またはpH（水性）<6まで（殆どのN-メチルモルホリンが有機相から除かれたことを意味する）洗浄した。相を分離し、高純度の有機相を25mLの食塩水で洗浄した。
【０１６９】
典型的に、表記化合物ＩＶの溶液収率は87〜90%である；未反応の出発オレフィンは1〜0%。高純度の有機相を回転蒸発させ、新たなEtOAc（2×250mL）とともに共沸乾燥させた。この物質は部分的に結晶化した。混合物を8mLの熱EtOAcに溶解し、10mLのn-ヘプタンと混合した。固体が生成し始めた。懸濁液を50℃で30分間攪拌し、さらに10mLのn-ヘプタンを加えた。加熱浴から取り出した後、懸濁液を室温にて30分間攪拌し、30分毎にさらに２回のヘプタン導入を行い、懸濁液を室温で一夜攪拌して結晶化を完了する。固体を濾過し、乾燥する。典型的な結晶化の収率は90%に近い；表記化合物ＩＶの効力は90%であり、DMT-エーテルが残りの10重量%を占める。
【０１７０】
生成した固体は表記化合物ＩＶとDMT-エーテルとの真の共晶であり、DSCによるアミドの89.7℃のmpに対して97.4℃の単一のシャープなmpを与えた。この共晶形は結晶性が高く、溶液から容易に析出する。
【０１７１】
実施例３５Ｂ
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のジシクロヘキシルアミン塩の調製
Ａ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のナトリウム塩の調製
3容量のエタノールを4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)（約15wt%〜25wt%）（1g/mL）のトルエン溶液に加えた。この溶液を0〜5℃に冷却した。温度を<5℃に保持しながら（わずかに発熱反応）、この溶液にNaOH-水の5N溶液（2当量）をゆっくりと加えた。反応混合物を20〜25℃に温め、反応が完了するまで攪拌した。
【０１７２】
4容量の水を反応混合物に加え、反応混合物を真空下で蒸留して（浴温40℃）エタノールを除去した。残渣に0.5容量のトルエン（0.865g/mL）を加え、混合物を10分間攪拌した。水性層と有機層が生成した。ナトリウム塩を含む水性層を分離し、工程Ｂに用いた。
【０１７３】
Ｂ．4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のジシクロヘキシルアミン塩の調製
4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸1-(1,1-ジメチルエチル)のナトリウム塩の水溶液に1容量のMTBE（0.74g/mL）を加えた。この溶液に0.2容量のヘプタン（0.684g/mL）を加え、得られた溶液を0〜5℃に冷却した。温度を<5℃に保持しながら（わずかに発熱反応）、この溶液に85%H3PO4（1g/mL）をゆっくりと加えてpHを〜2.5-3とした。得られた層を分離し、生成物を含む有機層に1容量の75%食塩水を加えた。混合物を10分間攪拌し、得られた層を分離した。生成物は有機層に含まれていた。
【０１７４】
有機層を0〜5℃に冷却し、温度を<10℃に保持しながらジシクロヘキシルアミン（0.91g/mL）をゆっくりと加えた。反応混合物を0〜5℃で3時間攪拌した。固形分を濾去し、0.5容量の1：1 MTBE/ヘプタンで洗浄した。得られたDCHA塩（1g/mL）を乾燥し、回収した。
【０１７５】
実施例３５Ｃ
(1S,3S,5S)-3-(アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸,1,1-ジメチルエチル,エチルエステル（式Ｈ）（シン-N-BOC-4,5-メタノプロリンとも称する）の他の製造方法
Ａ．(s)-BOC-4,5-メタノプロリンエチルエステルの調製
【化４３】
【０１７６】
炎乾燥した三つ首フラスコ（マグネチックスターラー）に2.2gの4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-(1,1-ジメチルエチル),5-エチルエステル（2.20g、9.12ミリモル、1当量）および22mlの乾燥トルエンを入れた。得られた溶液を-30℃に冷却し、さらに16.58ml（18.24ミリモル）のジエチル亜鉛（トルエン中の1.1m溶液）を滴下して入れた。
【０１７７】
反応温度を-25℃〜-30℃に保持しながら、2.2mlのトルエン中の2.66ml（6.43g、36.47ミリモル）のクロロヨードメタンの溶液を滴下して加えた。反応液を-20℃に16時間保持した。ついで、22mlの半飽和重炭酸塩溶液で反応停止させ、室温に温めた。白色の沈殿が生成し、これをHyflow（濾過補助具）で濾去し、トルエン（約10ml）で洗浄した。有機層を二相濾液から分離し、水（各11ml）で２回洗浄した。有機層を蒸発乾固して黄色がかった油状物（2.33g）を得たが、これはN-BOC-メタノプロリンエチルエステル（シン-異性体とアンチ-異性体との混合物(8：1)）であった。
【０１７８】
上記手順を用いて次の工程に使用するのに充分な大量の異性体の上記混合物を製造した。20〜25℃で、3.40kgのN-BOC-メタノプロリンエチルエステル（シン-異性体とアンチ-異性体との混合物）を5.17kg（66.59gmol）の40.0%メチルアミン（水中の溶液）とともに窒素雰囲気下で激しく攪拌した。
【０１７９】
反応完了後、混合物を5.17 lの水および5.17 lのMTBEで希釈し、相分離が生じる前にさらに5分間攪拌した。有機層を5.17 lの水で洗浄した。得られた有機層を蒸発させて（真空、Tmax 40℃）一定重量とした。
【０１８０】
2.52kgのシン-N-Boc-4,5-メタノプロリンエチルエステル（9.85モル、74%）の収量が得られた。
【０１８１】
Ｂ．s-Boc-4,5-メタノプロリンの調製
【化４４】
【０１８２】
10.28 lのエタノール中の2.57kgのシン-N-Boc-4,5-メタノプロリンエチルエステル（s-BOC-MPEE）の溶液を調製する。この溶液に、20〜28℃にて5.07 lの水中の0.51kgの水酸化リチウム水和物からなる溶液を加える。反応を不活性ガス保護下（窒素）で行った。反応混合物を20〜25℃（IPC）で14時間攪拌する。反応完了後、混合物を40℃（真空）で蒸発させた。得られた油状物を25.70 lの水および25.70 lのMTBEに取り、30分間攪拌した。有機相を分離し、水性層を12.85 lのMTBEで再び抽出する。水性相に25.70 lのMTBEを加え、混合物のpHを1N HCl（約12 l）を加えてpH2に調節する。有機層を分離し、水性相を12.85 lのMTBEで再抽出する。上記工程からのコンバインした有機層を蒸発乾固して1.88kgのシン-Boc-4,5-メタノプロリン（8.25モル%、82%）。
【０１８３】
Ｃ．(1S,3S,5S)-3-(アミノカルボニル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸,1,1-ジメチルエチルエステルの調製
【化４５】
【０１８４】
2.00kgのシン-N-BOC-4,5-メタノプロリンを40.00 lのTHFに溶解し、-15℃に冷却する。この溶液に1.07kgのN-メチルモルホリン（P0）を加える。反応混合物に反応温度が-8℃を超えないようにして1.32kgのクロロギ酸イソブチルを入れる。添加完了後、混合物を-10℃（P1、IPC 1）で30分間攪拌する。N-メチルモルホリン塩酸塩が反応混合物から沈殿する。
【０１８５】
反応混合物を-5℃に温め、気体導入管によりアンモニア（0.79kg、理論値、5.00当量）をパージする。ついで、反応混合物を20〜25℃に温め、この温度で4時間（P2、IPC 2）攪拌する。反応混合物に40.00 lの飽和食塩水を加える。ついで、飽和重硫酸カリウム溶液を加えて混合物のpHをpH4〜4.5に調節する。ついで、有機層を分離し、水性相を20.00 lのMTBEで再び抽出する。コンバインした有機層を蒸発乾固する。粗製の生成物を還流温度で8.00 lの酢酸ブチルに溶解する。生成物は約30℃で沈殿する。結晶化が始まったら混合物を20.00 lのヘプタンでゆっくりと処理し、さらに2時間攪拌する。生成物を濾過により単離する。濾過ケーキを冷酢酸ブチル/ヘプタン（1：4）で２回に分けて洗浄し（各1.6 l）、各2.00 lのヘプタンで２回洗浄し、30〜35℃（真空）で乾燥させて1.64kg（7.22モル、82%）のシン-N-BOC-4,5-メタノプロリンアミド（s-BOC-MPA）を得る。
【０１８６】
実施例３６
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のBOC保護による(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（ＶＩ）の調製
式ＶＩの酸
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）（469g、2.08ミリモル）を、温度プローブおよびpHプローブを備えた相分離器中、氷冷1N NaOH（5リットル、5モル、2.4当量）に溶解した。THF（2.5リットル）を溶液に加えた。ついで、固体のBoc2Oを加え、反応混合物を周囲温度で約1時間攪拌した。ついで、EtOAc（4リットル）を攪拌しながら加え、得られた有機層と水性層とを分離した。水性層のpHを濃HClで7に調節した。ついで、EtOAc（4リットル）を加え、さらなるHClを加えてpHを約1に下げた。添加した濃HClの全量は510mlであった。有機層と水性層とを再び分離し、水性層をEtOAc（3×3リットル）で抽出した。ついで、有機層をコンバインし、水（3リットル）および食塩水（3リットル）で洗浄した。ついで、洗浄した有機層をNa2SO4で乾燥し、回転蒸発で室温にて濃縮乾固した。収量は542gの(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（ＶＩ）であった。
【０１８７】
実施例３７
3-アミノカルボニル-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成するカップリング反応
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた2L容の三つ首フラスコに、(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式ＶＩ）（50g、153.8ミリモル）を入れた。THF（200ml）を加え、攪拌して透明な溶液を得た。この溶液をアセトン-ドライアイス-水浴で-6℃に冷却した。ついで、メタンスルホニルクロライド（Mes-Cl）（13.1ml、169ミリモル、1.1当量）を一度に加え、ついでジイソプロピルエチルアミン（94ml、539ミリモル、1.1当量）を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約4分かけてゆっくりと加えて内部温度を8℃未満に保持した。すべての酸が混合無水物に変換するまで、反応混合物を0℃で攪拌した。ついで、(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド塩酸塩（32.5g、200ミリモル、1.1当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（1.04g、7.6ミリモル、0.05当量）を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、ついで室温で一夜静置した。
【０１８８】
実施例３８
(αS)-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸（式Ｖ）のBOC保護による(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）の調製
式ＶＩＡ（DABCO塩）
1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）（15g；125.1ミリモル）を、300mlの酢酸イソプロピル中の約30g（135ミリモル）の実施例３６の式ＶＩの酸の溶液に入れた。上記反応混合物に酢酸エチル（150mL）を入れた（酢酸エチル：酢酸イソプロピルの容量比(150mL/300mL)）。反応混合物に式ＶＩＡのDABCO塩（200mg）を種晶として入れた。反応混合物を室温で激しく攪拌した。水（5mL）を反応混合物にゆっくりと入れ、反応混合物を室温で激しく攪拌して15〜20分後に結晶生成を引き起こした。反応混合物を室温で16時間攪拌し、反応生成物をブフナー漏斗で濾過した。固形分を室温にて酢酸エチルで洗浄し、50℃で真空乾燥させて47g（79%）の式ＶＩＡのDABCO塩を得た。
【０１８９】
実施例３９
3-アミノカルボニル-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成するカップリング反応
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた250L容の三つ首フラスコに、(αS)-α[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-酢酸1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン塩（式ＶＩＡ）（5g、11.44ミリモル）を入れた。THF（25ml）を加え、攪拌してスラリーを得た。このスラリーを氷-水浴で0℃に冷却した。ついで、メタンスルホニルクロライド（Mes-Cl）（1.15ml、14.85ミリモル、1.3当量）を一度に加え、ついでジイソプロピルエチルアミン（94ml、40ミリモル、3.5当量）を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約4分かけてゆっくりと加えて内部温度を5℃未満に保持した。すべての酸が混合無水物に変換するまで、反応混合物を0℃で10分間攪拌した。ついで、(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド塩酸塩（2.42g、14.9ミリモル、1.3当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（77mg、0.57ミリモル、0.05当量）を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、ついで室温で一夜静置した。
【０１９０】
実施例４０
3-シアノ-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を生成する脱水および加水分解
実施例３９の反応混合物にピリジン（6当量、922ミリモル、74.6ml）を加え、反応混合物を冷浴で-8℃に冷却した。ついで、温度を10℃未満に保持しながら、無水トリフルオロ酢酸（TFAA）（4当量、616ミリモル、87ml）を6分かけてゆっくりと加えた。反応液を24℃で0.5時間攪拌し、HPLC（30ml、0.5ml AcN、0.5ml H2O)で実施例３７の化合物（Ｋ）の消失についてチェックした。
【０１９１】
ついで、反応液を冷浴で約-3℃に冷却した、温度を10℃未満に保持しながら、NaOH（5N、6当量、0.925モル、185ml）を反応液に10分かけて加えた（水性pH=9.9）。水性のK2CO3（319g、15当量、510mlのH2Oに溶解）を5分かけて加えた（温度=8℃、水性pH11.1）。反応液を7時間40分処理した。HPLC（30μl、0.5ml AcN、0.5ml H2O）によって決定されるようにすべての中間体が後ろから２番目に加水分解されたときに反応は完了した。
【０１９２】
ついでEtOAc（500ml）を反応混合物に加え、得られた水性層と有機層とを分離した。有機層を500mlの緩衝溶液（2M H3PO4、1M NaH2PO4）洗浄した。温度は15℃から23℃に上昇した；添加時間：5分、水性V=560ml、pH=4.5、HPLCにより32mgの生成物；有機V=1,080ml。有機層を第二の500ml緩衝溶液で洗浄した；水性V=780ml、pH=2.5、HPLC により415mgの生成物；有機V=800ml、1.02v/v%ピリジン。有機層を300mlの食塩水で洗浄した；水性V=350ml、pH=1.8、HPLCにより20mgの生成物。有機層を130mlの飽和NaHCO3溶液で洗浄した；水性V=176ml、pH=6.0、780mgの生成物。有機層を300mlの半飽和食塩水で洗浄した；水性V=330ml、pH=5.2、25mgの生成物；有機V=650ml、ピリジン0.045v/v%。5gのDarcoを有機層に加え、5分間攪拌し、50gのシリカで濾過し、4×25mlのEtOAcで洗浄、有機V=750ml、ピリジン0.04v/v%。
【０１９３】
ついで、有機層を約133mlまで蒸留した。溶液が曇るまで有機層を1時間攪拌した。133mlのヘプタンを15分かけて加え、スラリーを一夜攪拌した。133mlのヘプタンを一夜かけて加えた。混合物をメカニカルスターラーで20分間激しく攪拌した。固形分を濾去し、濾過ケーキを50mlの5%EtOAc/ヘプタンで洗浄した；母液からの溶媒除去後に3.4gの生成物が8.86gの粗製生成物で認められた。乾燥生成物の結晶を真空下、50℃で一夜加熱した。467gの生成物が得られた、〜73%、96.6 AP。
【０１９４】
実施例４１
(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-アミノ-2-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩（1：1）（式Ｍ）を生成する脱保護
3-シアノ-(αS)-α-(3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.13,7]デス-1-イル)-β-オキソ-(1S,3S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル（式Ｌ）（5.0g、12.04ミリモル）を、三つ首フラスコ（温度計、メカニカルスターラー、および気体導入口を備える）に入れた。EtOAc（約45〜50ml）を加えて透明な溶液とした。濃HCl（3.00ml、37%w/w%、36.14ミリモル、3当量）を室温にて加え、固体が生成するまで反応混合物を攪拌した。ついで、水（30ml）を加え、混合物を1〜2分間攪拌した。反応混合物を分別漏斗に移し、反応混合物の層を静置して明確な相分離に分離した。温度を25℃未満に保持しながら、水性層を25%NaOHで約6の低pHに調節した。
【０１９５】
ついで、水性層にイソプロピルアルコール（IPA；2〜3ml）を加え、ついで安息香酸ナトリウム（6.5mlの水に2.6gの安息香酸ナトリウムを溶解することによって調製した安息香酸ナトリウム溶液を0.65ml）を加えることによって、塩交換を行った。ついで、残りの安息香酸ナトリウム溶液を添加漏斗で滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で16〜24時間攪拌した。ついで、反応混合物中の固形分をブフナー漏斗で濾過し、AgNO3を用いたCl-テストで固形分が陰性となるまで水で洗浄した。ついで、固形分をヘプタン（10ml）で洗浄して水を飛ばし、漏斗上で空気乾燥し、KF<5%まで真空オーブンで35℃にて乾燥させた。収率は79%、4.1gであった。
【０１９６】
実施例４２
遊離塩基Ｍ'
【化４６】
を生成する化合物（Ｌ）
【化４７】
の脱保護
実施例４０の化合物（Ｌ）（300g、0.723モル、効力90.6%）、塩化メチレン（3L）、メタノール（288ml、7.23モル）および濃（36%）塩酸（288ml、7.23モル）を三つ首の12L容フラスコ（メカニカルスターラー、温度プローブおよびN2ガス導入口を備える）に入れた。反応は反応温度を約20〜約25℃の範囲に保持しながら行った。反応混合物を18時間攪拌し、2相に分離し、上部の水性層を回収した。水性層に塩化メチレン（6L）および水（720ml）を加え、5N NaOH（〜600ml）を滴下して加えてpHを9.0〜10.5に調節した。
【０１９７】
式：
【化４８】
の塩酸塩（HPLCにより同定）（式Ｌ'）を含む有機相を塩化メチレン（6L）および水（720ml）で処理し、反応温度を20〜25℃に保持しながら5N水酸化ナトリウム溶液（〜600ml）を滴下して加えてpHを9〜10.5に調節した。NaCl（120g）を加え、混合物を20分間攪拌して相分離を生成した。有機層（6.2L）を回収し（〜174gの化合物Ｍ'を含有）、水性層（1.75L）は廃棄した（6.5gの化合物Ｍ'を含有）。
【０１９８】
有機層を1%NH4Cl食塩水溶液（450ml）で洗浄した（1%NH4Cl食塩水溶液は1gのNH4Cl、25gのNaClおよび74gのH2Oを含んでいた）。得られた相分離から6.0Lの有機層を回収し（溶液中に〜176gの化合物Ｍ'を含んでいた）、1.4gの化合物Ｍ'（〜0.4%）を含む水性層（0.45L）は廃棄した。
【０１９９】
CH2Cl2を25℃/50mmHgで蒸留しながら酢酸エチル（〜4L）を有機層に加えた。最終容量が2.5Lに達したら蒸留を停止した。有機層をポリッシュ（polish）濾過して固形のNaClを除去し、〜1Kg（1Lの酢酸エチル中に化合物Ｍ'が〜170g）GC分析：DCM<0.1%まで濃縮した。水（17ml）を滴下して加え、10分後に結晶化が始まった。17mlの水を加え、得られたスラリーを30分間攪拌し、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄し、室温で乾燥させて186gの一水和物化合物Ｍ''、収率81%を得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ｍ'：
【化１】
で示される遊離塩基化合物の製造方法であって、構造Ｌ：
【化２】
で示される保護化合物を用意し、該化合物（Ｌ）を塩酸で処理して構造Ｌ'：
【化３】
で示される対応の塩酸塩（Ｌ'）を生成し、ついで該化合物（Ｌ'）を水酸化ナトリウムで処理して遊離塩基化合物（Ｍ'）を生成する、ことを含む方法。
【請求項２】
該化合物（Ｌ）が、構造：
【化４】
で示される中間体（Ｋ）をピリジンおよび無水トリフルオロ酢酸の存在下で脱水し、ついで反応生成物を強塩基の存在下で加水分解して化合物（Ｌ）を生成することによって製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造Ｍ''：
【化５】
で示される一水和物の製造方法であって、構造：
【化６】
で示される遊離塩基を水で処理して一水和物Ｍ''を生成する、ことを含む方法。
【請求項４】
下記構造：
【化７】
で示される化合物。
【請求項５】
下記構造：
【化８】
で示される化合物。
【請求項１】
構造Ｍ'：
【化１】
で示される遊離塩基化合物の製造方法であって、構造Ｌ：
【化２】
で示される保護化合物を用意し、該化合物（Ｌ）を塩酸で処理して構造Ｌ'：
【化３】
で示される対応の塩酸塩（Ｌ'）を生成し、ついで該化合物（Ｌ'）を水酸化ナトリウムで処理して遊離塩基化合物（Ｍ'）を生成する、ことを含む方法。
【請求項２】
該化合物（Ｌ）が、構造：
【化４】
で示される中間体（Ｋ）をピリジンおよび無水トリフルオロ酢酸の存在下で脱水し、ついで反応生成物を強塩基の存在下で加水分解して化合物（Ｌ）を生成することによって製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造Ｍ''：
【化５】
で示される一水和物の製造方法であって、構造：
【化６】
で示される遊離塩基を水で処理して一水和物Ｍ''を生成する、ことを含む方法。
【請求項４】
下記構造：
【化７】
で示される化合物。
【請求項５】
下記構造：
【化８】
で示される化合物。
【公開番号】特開２０１１−６４４１（Ｐ２０１１−６４４１Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１８１５５９（Ｐ２０１０−１８１５５９）
【出願日】平成２２年８月１６日（２０１０．８．１６）
【分割の表示】特願２００４−５５９２８２（Ｐ２００４−５５９２８２）の分割
【原出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８１５５９（Ｐ２０１０−１８１５５９）
【出願日】平成２２年８月１６日（２０１０．８．１６）
【分割の表示】特願２００４−５５９２８２（Ｐ２００４−５５９２８２）の分割
【原出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]