スギ花粉症検査方法
【課題】従来の全身系免疫の活性化に伴う抗体産生による一連のアレルギー診断法と異なり、苦痛を伴うことなく、スギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険性を判断することができる検査方法の提供。
【解決手段】被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・インテスティナリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ）、およびバクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）からなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とするスギ花粉症検査方法。
【解決手段】被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・インテスティナリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ）、およびバクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）からなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とするスギ花粉症検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便を用いたスギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査する方法、該方法に好適なスギ花粉症検査用キット、およびスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本におけるアレルギー性疾患の有病率は３８％であり、最も頻度の高い生活習慣関連病と認識されている。特にスギ花粉症は、ＩｇＥが関与するI型アレルギーであり、日本人の約２０％が罹患し、今や深刻な社会問題となりつつある。
【０００３】
先進諸国を中心としたアレルギー疾患の増加原因のひとつとして、１９８９年にイギリスのＳｔｒａｃｈａｎ博士によって提唱された衛生仮説が挙げられる。これは、過度の衛生状態で育った子どもたちは、微生物による刺激を充分に受けていないため、免疫系が正常に発達せずにアレルギーを発症する、という説である。最近では、抗生物質の使用や食生活の変化に伴い腸内細菌叢が撹乱され、正常な免疫寛容が行われなくなるという「腸内細菌叢仮説」も提唱され、腸内細菌叢とアレルギー疾患との関連性が示唆されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
例えば、本発明者らは、２年間に渡るスギ花粉シーズンにおいて、スギ花粉症患者および健常者の腸内細菌叢を解析し、バクテロイデス・フラギリスグループが花粉飛散後にスギ花粉症患者のみで増加することを見出している（例えば、非特許文献２参照。）。その他、スギ花粉症以外にも、アトピー等の他のアレルギー疾患との関与が疑われる腸内細菌について、属レベルでの報告がある（例えば、非特許文献３参照。）。但し、これらの報告は、調査した国や研究グループによって異なる結果が示される場合も多く、疾患に関連すると疑われる腸内細菌の菌種の特定には至っていない。この理由の一つとして、腸内には数百種類、百兆以上の細菌が棲息しているうえ、毎年多くの新種が提唱されていることが考えられる。
【０００５】
現在、アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。また、アレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法や、血液等の生体試料を用いる試験方法も実施されている。
【０００６】
前者の例として、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法等がある。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、または誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査である。
一方、後者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、またはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明であるが、患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法であるが、これらの方法は、操作が煩雑である。
また、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。例えば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。
【非特許文献１】Ｍ．Ｃ．ノヴェール（M.C. Noverr）、他１名、クリニカル・エクスペリメンタル・アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）、第３５巻、第１５１１〜１５２０ページ、２００５年
【非特許文献２】小田巻 俊孝、他１０名、ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第５６巻、第１３０１〜１３０８ページ、２００７年
【非特許文献３】Ｐ．ソンジンダ（P. Songjinda）、他7名、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３５巻、第１５１１〜１５２０ページ、２００５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
患者のＱＯＬを考えた場合、患者に苦痛を与えずにアレルギー治療に有効な情報を得ることが出来れば非常に有用である。しかしながら、これら従来の診断方法は、採血、皮内注射等の人体にとって苦痛を伴う処置を行わなければならない、という問題があり、患者のＱＯＬの点からは好ましいものではなかった。
一方で、スギ花粉症患者において特異的に増減する腸内細菌をスギ花粉症マーカーとすることにより、糞便を用いて非侵襲的にスギ花粉症の診断を行うことができると考えられるが、良好な疾患マーカーとするためには、疾患に関連する腸内細菌を、属レベルではなく、菌種レベルで特定していることが好ましい。しかしながら、例えば非特許文献２においても、バクテロイデス・フラギリスグループのうち、スギ花粉症に関連している特定の菌種は明らかにされてはいない。また、バクテロイデス・フラギリスグループに属する菌全体の菌数は、スギ花粉飛散前の時点では健常者との間に違いが認められない。つまり、スギ花粉飛散前に採取された糞便中の、バクテロイデス・フラギリスグループに属する菌全体の菌数は、スギ花粉症との相関性が低く、スギ花粉症の指標としては不十分であった。
【０００８】
本発明は、従来の全身系免疫の活性化に伴う抗体産生による一連のアレルギー診断法と異なり、苦痛を伴うことなく、スギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険性を判断することができる検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、菌種レベルに至るまでの詳細な腸内細菌叢解析から、花粉症の自覚症状および血中マーカーを併せて解析・測定することにより、花粉が飛散する以前において、自覚症状および血中スギ花粉特異的ＩｇＥ量と正または負の相関を示す菌種を新たに見出し、糞便中の該菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無や重症度を判断し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・インテスティナリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ）、およびバクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）からなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とするスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、前記糞便が、スギ花粉飛散開始時期前に被験者から採便されたものであることを特徴とする前記記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万未満である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、糞便１ｇ当たりの、下記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、０．０６以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
式（１） （バクテロイデス・フラギリス菌数＋バクテロイデス・インテスティナリス菌数＋バクテロイデス・スターコリス菌数）／（バクテロイデス・ユニフォルミス菌数＋バクテロイデス・カッカエ菌数）
また、本発明は、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、増大した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、減少した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、減少した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、増大した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、糞便中の菌数の測定を、各菌種の遺伝子配列に対し特異的なプライマーを用いて行うことを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、前記記載のスギ花粉症検査方法に用いられる、下記（ａ）〜（ｅ）に記載のプライマーセットのうち、少なくとも１以上を有することを特徴とするスギ花粉症検査用キットを提供するものである。
（ａ）配列番号１１の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的フォワードプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｂ）配列番号１５の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的フォワードプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的フォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的フォワードプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｅ）配列番号１３の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的フォワードプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
また、本発明は、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有するスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法であって、被験物質の摂取により、糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が減少した場合、および／またはバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が増大した場合に、当該被験物質が、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有すると判断することを特徴とするスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、前記被験物質が、医薬品または食品であることを特徴とする、前記記載のスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスギ花粉症検査方法は、糞便中の腸内細菌のうち、スギ花粉症の症状に強い相関を示す特定の菌種の菌数を指標とする方法である。このため、本発明のスギ花粉症検査方法を用いることにより、従来の抗体産生に関する方法と異なり、患者に苦痛を与えることなく、簡便に、スギ花粉症の罹患の有無や重症度を判断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスギ花粉症検査方法は、被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とする。このように、バクテロイデス・フラギリスグループに属する腸内細菌のうち、スギ花粉症の症状と相関性の高い５種類の菌種の、被験者由来の糞便中の菌数を測定し、これらの菌数の多寡により、被験者のスギ花粉症の罹患の有無や、罹患している場合の重症度を判断し評価することができる。
【００１３】
これらのスギ花粉症と相関性の高いバクテロイデス・フラギリスグループに属する菌種は、以下の手法により求めることができる。
１．バクテロイデス・フラギリスグループに属する菌種特異的プライマーの設計および合成
まず、ヒト糞便からの検出が報告されているバクテロイデス・フラギリスグループに属する菌種に関して、各菌種特異的なＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマーを設計し、合成した。具体的には、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ等の公知の国際的な塩基配列データベースにより得られた各細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基にして、公知の塩基配列解析ソフトであるＣＬＵＳＴＡＬＷ ｖｅｒ１．８３を用いて、特異的配列部位を特定し、この部分をターゲットとして、各プライマーを設計した。このようにして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した。設計された各プライマーの塩基配列を表１に示す。表中のプライマー名のうち、「ＢａＯＶＡ−Ｆ」等の末尾が「Ｆ」のものはフォワードプライマーであり、「ＢａＯＶＡ−Ｒ」等の末尾が「Ｒ」のものはリバースプライマーである。また、「産物の長さ（ｂｐ）」とは、各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、それが特異的に認識する菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の塩基対長を示している。
【００１４】
【表１】
【００１５】
２．菌種特異的プライマーの特異性の確認
上記１で設計・合成したプライマーが、実際に各菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異性を有しているかを確認するため、近縁種（標準株および基準株）由来遺伝子を鋳型とした場合のプライマー反応性を検討した。
まず、表２に示す４属１８菌種の細菌を、ＧＡＭ培地（Ｎｉｓｓｕｉ社製）にて嫌気的に一晩純粋培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、２００μＬのキットに付属のＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに溶かして濃度を測定し、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
次に、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ (タカラ社製)を用いて、各菌種特異的プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）と、１μＬの各鋳型ＤＮＡ溶液（１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ）とを含む総液量を２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃１０秒間の後、９４℃５秒間、６０℃３０秒間を１サイクルとし、これを３５サイクル行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。その後、メルティングカーブをデフォルト条件で作成し、非特異的増幅の有無を確認した。
各ＰＣＲの結果を表３に示す。表中、「＋」はＰＣＲ陽性、すなわちＰＣＲ産物が得られたことを、「−」はＰＣＲ陰性、すなわちＰＣＲ産物が得られなかったことを、それぞれ示している。この結果、上記１で得られたプライマーは、各菌種特異的にバンドを形成し、非特異的な増幅は認められなかった。
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】
３．スギ花粉症患者および非花粉症者におけるバクテロイデス菌数と花粉症症状との相関解析
スギ花粉特異的ＩｇＥ陽性かつ自覚症状を有するスギ花粉症患者３３名、および試験開始時点でスギ花粉特異的ＩｇＥ陰性である非花粉症者１４名を被験者とし、スギ花粉飛散前に採取された糞便中のバクテロイデス・フラギリスグループに属する菌の菌種ごとの菌数と花粉症症状との相関性を解析した。花粉症症状としては、くしゃみ等の自覚症状と、血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量を調べた。具体的には、以下のようにして行った。
（１） 糞便中の各菌種の菌数の測定
後記試験例２において各被験者の糞便から調製されたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡ溶液とし、表１記載のプライマーセットを用いて、上記２と同様の反応条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物量から、各ＤＮＡ溶液中の各菌種の菌数を測定した。菌数の測定は、予め菌数を計数した基準株から同様に抽出したＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲを行うことにより作成した検量線を用いて行った。
【００１９】
（２） 各菌種の菌数と花粉症症状との相関解析
上記（１）で測定した菌数と、後記試験例１で得られた各被験者の花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のデータに基づき、公知の統計解析ソフトＳＰＳＳ ｖｅｒ１４．０を用いて相関解析を行った。Ｓｐｅａｒｍａｎ法にて相関係数を算出したところ、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスにおいて、花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量の両方またはいずれか一方と、正または負の有意な相関を示すことが判明した。なお、表中、「花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ」とは、試験開始時点の１月２０日に採血した血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量を意味し、「花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ」とは、試験終了時点の４月２１日に採血した血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量を意味する。
【００２０】
具体的には、表４に示すように、バクテロイデス・フラギリスは、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれとも有意な正の相関を示した。また、バクテロイデス・インテスティナリスは、表５に示すように、特に花粉症自覚症状のスコアと花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対して有意な正の相関を示した。同様に、表８に示すように、バクテロイデス・スターコリスは、花粉症自覚症状のスコアに対して有意な正の相関を示した。一方、バクテロイデス・ユニフォルミスとバクテロイデス・カッカエは、表６および７に示すように、花粉症自覚症状のスコア等と負の相関を示した。特に、バクテロイデス・ユニフォルミスは、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量および花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対して有意な負の相関を示し、バクテロイデス・カッカエは、スギ花粉特異的ＩｇＥ量に対して有意な負の相関を示した。
【００２１】
【表４】
【００２２】
【表５】
【００２３】
【表６】
【００２４】
【表７】
【００２５】
【表８】
【００２６】
また、これらの菌種を組み合わせた場合の菌数は、各菌種単独の菌数よりも、花粉症症状に対してより強く、かつ有意な相関を示した。例えば、表９に示すように、花粉症症状と正の相関を示したバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスの３菌種の菌数の和（表中、「バクテロイデス合算菌数」）は、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれに対しても、各菌種単独の場合よりも強い相関を示し、かつＰ値も０．０１未満と非常に有意性も高いことが判明した。一方、表１０に示すように、下記式（１）で表される、花粉症症状と正の相関を示した３菌種（バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリス）の菌数の和を、花粉症症状と負の相関を示した２菌種（バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエ）の菌数の和で除した比率（表中、「バクテロイデス菌数比率」）は、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれに対しても相関係数が０．５以上、Ｐ値が０．０１未満であり、花粉症症状に対して、最も強くかつ有意な相関を示した。
式（１） （バクテロイデス・フラギリス菌数＋バクテロイデス・インテスティナリス菌数＋バクテロイデス・スターコリス菌数）／（バクテロイデス・ユニフォルミス菌数＋バクテロイデス・カッカエ菌数）
【００２７】
【表９】
【００２８】
【表１０】
【００２９】
また、表４〜１０より明らかであるように、上記５菌種の菌数およびこれらを適宜組み合わせた場合の菌数の、スギ花粉特異的ＩｇＥ量との相関係数は、いずれの場合も、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対するものよりも、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対するもののほうが、絶対値が大きい。つまり、各菌種の菌数は、軽度の花粉症症状に対してよりも、より重度の花粉症症状に対して強い相関を示した。したがって、これらの結果から、花粉飛散前に採取された糞便中の、上記５菌種の菌数を指標として、スギ花粉症の罹患の有無だけではなく、重症化の危険性をも判断し得ることが明らかである。
【００３０】
なお、上記５菌種の糞便中の菌数が花粉症症状に相関することから、これらの菌種の腸内における増殖が花粉症症状の有無や重症度に影響を受ける可能性に加えて、これらの菌種が、スギ花粉症の発症に深く関与している可能性もある。したがって、これらの５菌種は、スギ花粉症の診断マーカーとしてのみならず、花粉症症状のコントロールにおいても重要なターゲットとなる可能性がある。
【００３１】
（３）各菌種の総菌数と花粉症症状との相関解析
上記（１）で菌数を測定した１８菌種のうち、バクテロイデス・フラギリスグループに属する１４菌種の菌数を合計し、バクテロイデス・フラギリスグループの総菌数を算出した。得られた総菌数と、後記試験例１で得られた各被験者の花粉症自覚症状のスコア、および血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のデータに基づき、上記（２）と同様にして相関解析を行い、Ｓｐｅａｒｍａｎ法にて相関係数を算出した。この結果、表１１に示すように、バクテロイデス・フラギリスグループの総菌数は、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれとも有意な相関を示さなかった。以上の結果から、花粉飛散前に採取された糞便中のバクテロイデス・フラギリスグループの総菌数は、スギ花粉症との相関性が低く、スギ花粉症の指標としては不十分であることが明らかである。
【００３２】
【表１１】
【００３３】
本発明のスギ花粉症検査方法に供される糞便は、被験者より採便されたものであれば、特に限定されるものではなく、採便直後のものであってもよく、採便後保存されたものであってもよい。糞便の保存は、臨床検査用検体等において通常行われている方法により行うことができる。例えば、室温保存でもよく、冷蔵保存でもよく、冷凍保存でもよい。糞便中の微生物量の変動を抑え、より信頼性の高い結果を得ることが期待できるため、採取直後の糞便であることが好ましく、保存後の糞便である場合には、冷蔵または冷凍保存されたものであることが好ましい。
【００３４】
本発明のスギ花粉症検査方法に供される糞便の採取時期は特に限定されるものではなく、
スギ花粉飛散開始時期前に採取されたものであってもよく、スギ花粉飛散時期に採取されたものであってもよい。なお、本発明において、「スギ花粉飛散開始時期前」とは、前年のスギ花粉が飛散時期の終了時期から、次年度のスギ花粉の飛散が開始する時期の前までを意味する。スギ花粉の飛散時期は、スギの生育地からの距離や地域、気象状況等により変動するものであるが、日本では一般的には１月下旬〜４月下旬頃までである。
【００３５】
本発明のスギ花粉症検査方法は、スギ花粉症症状と非常に強い相関を有する特定の腸内細菌種の菌数を指標とするものである。したがって、上記１〜３において示したように、本発明のスギ花粉症検査方法は、実際にスギ花粉に暴露し、アレルギー反応が生じている時期（スギ花粉飛散時期）に採取した糞便のみならず、アレルギー反応が生じている可能性の低いスギ花粉飛散開始時期前に採取した糞便を用いた場合であっても、被験者のスギ花粉症の罹患の有無や、罹患している場合の重症度を判断し評価することができる。
【００３６】
本発明において、糞便中の各菌種の菌数を測定する方法は、特に限定されるものではなく、糞便または糞便を常法により処理した試料中の特定の微生物の数や密度、濃度等を測定するために通常用いられている方法のいずれを用いて行ってもよい。例えば、上記３（１）において行ったように、糞便から常法により核酸を抽出し、該核酸を鋳型とし、各菌種の遺伝子を特異的に認識するプライマーを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物量から菌数を算出することができる。該核酸増幅反応として、通常のＰＣＲの他に、リアルタイムＰＣＲを行ってもよく、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行ってもよい。ＲＴ−ＰＣＲを行い、糞便から回収された核酸中のＲＮＡをｃＤＮＡとして鋳型として用いることにより、１０００倍程度検出感度をあげることが可能である。その他、各菌種の細菌自体を特異的に認識する抗体を用いて、希釈した糞便中の微生物数を直接計数してもよく、各菌種の遺伝子を特異的に認識するプローブを用いて、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法等を行うことにより菌数を測定することもできる。糞便中の細菌を高精度かつ高感度に検出し測定得るため、糞便中の菌数の測定は、各菌種の遺伝子配列に対し特異的なプライマー（菌種特異的プライマー）を用いて行うことが好ましく、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物量から菌数を算出して行うことがより好ましい。
【００３７】
ここで、菌種特異的プライマーは、各菌種の遺伝子配列を特異的に認識する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであれば、特に限定されるものではない。例えば、公知のプライマーを用いてもよく、新たに設計・合成したプライマーであってもよい。なお、菌種特異的プライマー等の設計や合成は、遺伝子解析等の分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。例えば、標的の菌種の遺伝子配列情報を用いて、ＣＬＵＳＴＡＬＷやＰｒｉｍｅｒ３等の公知のプライマー設計ソフトを利用して設計することができる。各菌種の遺伝子配列情報は、公知の塩基配列解析法による解析や、ＤＤＢＪ等の公知の塩基配列データベースより入手することもできる。
【００３８】
本発明において、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの各菌種の菌数の測定に用いられる菌種特異的プライマーとしては、表１記載の塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。これらのプライマーを用いることにより、標的の菌種を、近縁種であるバクテロイデス・フラギリスグループの他の菌種と明確に識別して、検出することができるためである。なお、各菌種特異的プライマーは、標的の遺伝子に対する特異的な認識能を阻害しない限り、表１記載の塩基配列以外の付加的な塩基配列を有していてもよい。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列等がある。また、菌種特異的プライマーを、蛍光物質等により標識しておくことにより、得られた増幅産物の検出等を容易にすることもできる。なお、プライマーの標識は常法により行うことができる。
【００３９】
その他、表１記載の各菌種特異的プライマーセットの１種または２種以上を、キット化することも好ましい。該キットを用いることにより、簡便にスギ花粉症の検査を行うことができるためである。該キットには、プライマーセットの他に、ＰＣＲ用試薬等の、該プライマーセットを用いて菌数を測定する場合に用いられる試薬等を含めることができる。
【００４０】
本発明のスギ花粉症検査方法においては、糞便中のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスをスギ花粉症マーカーとするものであり、被験者由来の糞便中の、スギ花粉症マーカーである菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症を検査する方法である。すなわち、糞便中の菌数が花粉症症状と正の相関を有するバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が多い場合や、糞便中の菌数が花粉症症状と負の相関を有するバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が少ない場合には、被験者がスギ花粉症に罹患している可能性が高い、と判断することができる。
【００４１】
具体的には、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便１ｇ当たりの菌数が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便１ｇ当たりの菌数よりも多い場合や、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便１ｇ当たりの菌数が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便１ｇ当たりの菌数よりも少ない場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することができる。
【００４２】
また、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万以上である場合や、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万未満である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することができる。
【００４３】
これら５菌種の菌数のデータを適宜組み合わせて、被験者のスギ花粉症の罹患の可能性や重症度を判断することができる。特に、上記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率を用いることにより、非常に高精度にスギ花粉症を検査することができる。例えば、糞便１ｇ当たりの、上記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、０．０６以上である場合、好ましくは、０．６以上である場合、好ましくは０．７７以上である場合に、被験者が花粉症に罹患していると判断することができる。その他、糞便１ｇ当たりの、上記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便よりも大きい場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することもできる。
【００４４】
また、糞便１ｇ当たりのバクテロイデス・フラギリス菌数とバクテロイデス・インテスティナリス菌数とバクテロイデス・スターコリス菌数との和を用いることによっても、精度よくスギ花粉症を検査することができる。例えば、糞便１ｇ当たりのバクテロイデス・フラギリス菌数とバクテロイデス・インテスティナリス菌数とバクテロイデス・スターコリス菌数との和が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便よりも多い場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することができる。
【００４５】
また、これらの菌種の菌数のデータを用いて、スギ花粉症に罹患している場合の重症度を判断することもできる。例えば、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、増大した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、減少した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することができる。同様に、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、減少した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、増大した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することもできる。
【００４６】
その他、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスの菌数のうち、３種とも多い場合、いずれか２種が多い場合、いずれか１種のみが多い場合、いずれも多くない場合の順に、スギ花粉症に罹患している可能性が高い、またはスギ花粉症の症状が重症である可能性が高い、と判断することもできる。同様に、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエの菌数のうち、２種とも少ない場合、いずれか１種のみが少ない場合、いずれも少なくない場合の順に、スギ花粉症に罹患している可能性が高い、またはスギ花粉症の症状が重症である可能性が高い、と判断することもできる。
【００４７】
このように、本発明のスギ花粉症検査方法を用いることにより、採血やアレルゲン感作といった侵襲敵な処置を要することなく、安全かつ簡便にスギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険度等を検査することができる。特に、スギ花粉飛散前であっても、検査が可能であるため、被験者は、スギ花粉飛散開始前に検査を行うことにより、スギ花粉飛散時期までに十分な予防措置を講ずることができる。また、本発明のスギ花粉症検査方法を継続的に行い、各検査時に得られた上記５菌種の菌数データを比較することにより、スギ花粉症の症状の重症化または緩解を、被験者に検査のためのアレルゲン感作という負担を強いることなく、安全に調べることができる。
【００４８】
その他、本発明のスギ花粉症検査方法を利用することにより、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有するスギ花粉症治療用組成物のスクリーニングを簡便かつ安全に行うことができる。具体的には、被験物質の摂取前と摂取後に採取した糞便に対して、上記５菌種のうちの少なくとも１以上の菌種の菌数を測定し、摂取前後により各菌種の菌数が変動するかどうかを調べることにより、スギ花粉症治療用組成物のスクリーニングを行うことができる。例えば、被験物質の摂取により、糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が減少した場合、および／またはバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が増大した場合に、摂取した被験物質が、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有すると判断することができる。このような、スクリーニングの結果に得られたスギ花粉症治療用組成物は、医薬品や食品等の成分とすることができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［試験例１］スギ花粉症自覚症状のスコアおよびスギ花粉特異的ＩｇＥレベルの測定
スギ花粉特異的ＩｇＥ陽性かつ自覚症状を有するスギ花粉症患者３３名および試験開始時点でスギ花粉特異的ＩｇＥ陰性である非花粉症者１４名を対象に、１月２０日〜４月２１日までの間、臨床試験を実施した。試験期間中は「鼻アレルギー診療ガイドライン２００２」に従い、くしゃみ、水性鼻汁、鼻閉、鼻掻痒感、目の症状、のどの症状を日誌に記入させ、自覚症状変化を調査した。週ごとにこれらのスコアを合計し、得られた曲線下面積を自覚症症状の指標とした。また、試験期間前後（１月２０日と４月２１日）に採血を行った。スギ花粉特異的ＩｇＥ抗体量は、ＥＬＩＳＡ測定用プラスティック９６穴プレートに、市販のスギ花粉抗原（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）をコートし、そこに被験者の血液を添加して洗浄後、ＨＲＰ標識した抗ヒトスギ花粉特異的ＩｇＥ抗体（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を添加して反応させた後、さらに洗浄した。さらに、ＴＭＢ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）にて発色させた後、１０％硫酸を加えて反応を停止させてから、プレートリーダーにて４５２〜５９５ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値から、濃度既知の対照試料を用いて作成した検量線を用いて、各血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ抗体量を算出した。
【００５１】
［試験例２］糞便中からのＤＮＡ抽出
試験開始時点（１月２０日）に、試験例１で示した被験者４７名から採便を行い、糞便からフェノール・ビーズ法（非特許文献２参照。）によりＤＮＡを抽出した。すなわち、２０ｍｇの糞便を１ｍＬのＰＢＳにて２回洗浄後、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ４０ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｐＨ９．０) ４５０μＬ、１０％ＳＤＳ５０μＬ、０．１ｍｍ径のグラスビーズ３００ｍｇ、ＴＥ飽和フェノール５００μＬを加え、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて、パワーレベル５で３０秒間激しく振盪した。氷上で１０分静置した後、１４０００×ｇ、５分間の遠心で得られた上清に、フェノール・クロロホルムを４００μＬ加えて、よく攪拌した。さらに氷上で１０分静置した後、１４０００×ｇ、５分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。その後、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ロシュ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを精製した。最終的に２００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした溶液を、ＤＮＡ溶液とした。
【００５２】
［実施例１］
（１）スギ花粉症患者および非花粉症者における、バクテロイデス・フラギリスグループの各菌種の定性分析
上記試験例２において各被験者の糞便から調製されたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡ溶液とし、表１記載の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの菌種特異的プライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ溶液中に上記５菌種が存在しているかどうかを分析した。
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ (タカラ社製)を用いて、各菌種特異的プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）と、１μＬの各鋳型ＤＮＡ溶液とを含む総液量を２５μＬのＰＣＲ反応液を調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃２０秒間、５０℃２０秒間、７２℃３０秒間を１サイクルとし、これを３０サイクル行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。その後、得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無により、糞便中にバクテロイデス・フラギリスグループの各菌種が存在しているかどうかを判定した。具体的には、電気泳動は、１％アガロースゲル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ;バイオラッド社製）を用いて、Ｍｕｐｉｄ（コスモ・バイオ社製）により１００Ｖ、３０分間電気泳動し、エチジウムブロミド（０．５ｍｇ／ｍＬ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察することにより行った。なお、該方法では、糞便１ｇ当り１００万以上の菌数がいる場合に、ＰＣＲ後にバンドが検出される。
【００５３】
（２）バクテロイデス・フラギリスグループの各菌種の有無と花粉症症状との群間解析
上記（１）で得られたバクテロイデス・フラギリスグループの５菌種の有無の結果と、試験例１で得られた各被験者の花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のデータに基づき、統計解析ソフトＳＰＳＳ ｖｅｒ１４．０を用いて群間解析を行った。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストを実施した結果を、表１２〜１６に示した。表中、「ＰＣＲ陽性被験者」とは、上記（１）においてバンドが検出され、標的の菌種が糞便１ｇ当たり１００万以上存在すると判定された糞便が採取された被験者を意味し、「ＰＣＲ陰性被験者」とは、バンドが検出されず、標的の菌種が糞便１ｇ当たり１００万未満であると判定された糞便が採取された被験者を意味する。また、表中の「花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ」および「花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ」は、表４等と同じである。
【００５４】
【表１２】
【００５５】
【表１３】
【００５６】
【表１４】
【００５７】
【表１５】
【００５８】
【表１６】
【００５９】
これらの結果から明らかであるように、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの有無により、花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量の両方またはいずれか一方が有意に異なることが判明した。
また、例えばバクテロイデス・インテスティナリスの結果（表１３参照。）にあるように、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量においては認められなかった有意差が、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量において認められたことから、本発明のスギ花粉症検査方法において指標とされる５菌種（バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリス）が、重症化の危険性を判断する指標になることが明らかとなった。
【００６０】
（３）バクテロイデス・フラギリスグループの各菌種の有無によるスギ花粉症検出精度
上記（１）で得られたバクテロイデス・フラギリスグループの５菌種の有無の結果から、糞便中の各菌種の検出の有無による、スギ花粉症の罹患の有無の検出精度を調べた。
各菌種の検出の有無、すなわち、ＰＣＲ陽性被験者とＰＣＲ陰性被験者における、花粉症罹患者と非罹患者の人数を、表１７に示した。
【００６１】
【表１７】
【００６２】
この結果、バクテロイデス・フラギリスにおいては、ＰＣＲ陽性被験者中、約８４％が花粉症罹患者であった。また、バクテロイデス・インテスティナリスにおいては、ＰＣＲ陽性被験者中、約９３％が花粉症罹患者であり、バクテロイデス・スターコリスにおいては、ＰＣＲ陽性被験者の全員が花粉症罹患者であった。
一方、バクテロイデス・カッカエにおいては、ＰＣＲ陰性被験者中、約８５％が花粉症罹患者であり、バクテロイデス・ユニフォルミスにおいては、ＰＣＲ陰性被験者の全員が花粉症罹患者であった。
つまり、糞便中のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの５菌種の検出の有無により、スギ花粉症の罹患の有無を８０％以上の特異度で検査することが可能であることが示唆された。すなわち、これらの結果から、これらの５菌種が、スギ花粉症マーカーとして利用し得ることが明らかである。
【００６３】
［比較例１］ スギ花粉症患者および非花粉症者における、バクテロイデス・フラギリスグループに属する全ての菌種による定性分析
表１記載の各菌種特異的プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）、およびバクテロイデス・フラギリスグループの全ての菌を検出するプライマーである、配列番号２９の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリスグループ検出用フォワードプライマーｇ−Ｂｆｒａ−Ｆと、配列番号３０の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリスグループ検出用リバースプライマーｇ−Ｂｆｒａ−Ｒからなるプライマーセット（非特許文献２参照。）を用いた以外は、全て実施例１（１）と同様にして、ＰＣＲ後のバンドの検出の有無より、各ＤＮＡ溶液中にバクテロイデス・フラギリスグループの菌種が存在しているかどうかを分析した。
この結果、バクテロイデス・フラギリスグループ検出用プライマーセットを用いた場合には、全ての被験者の糞便からバンドが検出され、バクテロイデス・フラギリスグループの検出率は１００％となった。また、全ての被験者の糞便において、表１記載のいずれかの菌種特異的プライマーセットを用いた場合にバンドが検出された。これらの結果から、バクテロイデス・フラギリスグループの総菌数は、スギ花粉症との相関性が低く、スギ花粉症の診断に用いるには不適であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のスギ花粉症検査方法は、糞便中のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスをスギ花粉症マーカーとし、非侵襲的かつ簡便にスギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険性を判断することができるため、特にスギ花粉症の診断および治療の分野において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便を用いたスギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査する方法、該方法に好適なスギ花粉症検査用キット、およびスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本におけるアレルギー性疾患の有病率は３８％であり、最も頻度の高い生活習慣関連病と認識されている。特にスギ花粉症は、ＩｇＥが関与するI型アレルギーであり、日本人の約２０％が罹患し、今や深刻な社会問題となりつつある。
【０００３】
先進諸国を中心としたアレルギー疾患の増加原因のひとつとして、１９８９年にイギリスのＳｔｒａｃｈａｎ博士によって提唱された衛生仮説が挙げられる。これは、過度の衛生状態で育った子どもたちは、微生物による刺激を充分に受けていないため、免疫系が正常に発達せずにアレルギーを発症する、という説である。最近では、抗生物質の使用や食生活の変化に伴い腸内細菌叢が撹乱され、正常な免疫寛容が行われなくなるという「腸内細菌叢仮説」も提唱され、腸内細菌叢とアレルギー疾患との関連性が示唆されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
例えば、本発明者らは、２年間に渡るスギ花粉シーズンにおいて、スギ花粉症患者および健常者の腸内細菌叢を解析し、バクテロイデス・フラギリスグループが花粉飛散後にスギ花粉症患者のみで増加することを見出している（例えば、非特許文献２参照。）。その他、スギ花粉症以外にも、アトピー等の他のアレルギー疾患との関与が疑われる腸内細菌について、属レベルでの報告がある（例えば、非特許文献３参照。）。但し、これらの報告は、調査した国や研究グループによって異なる結果が示される場合も多く、疾患に関連すると疑われる腸内細菌の菌種の特定には至っていない。この理由の一つとして、腸内には数百種類、百兆以上の細菌が棲息しているうえ、毎年多くの新種が提唱されていることが考えられる。
【０００５】
現在、アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。また、アレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法や、血液等の生体試料を用いる試験方法も実施されている。
【０００６】
前者の例として、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法等がある。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、または誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査である。
一方、後者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、またはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明であるが、患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法であるが、これらの方法は、操作が煩雑である。
また、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。例えば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。
【非特許文献１】Ｍ．Ｃ．ノヴェール（M.C. Noverr）、他１名、クリニカル・エクスペリメンタル・アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）、第３５巻、第１５１１〜１５２０ページ、２００５年
【非特許文献２】小田巻 俊孝、他１０名、ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第５６巻、第１３０１〜１３０８ページ、２００７年
【非特許文献３】Ｐ．ソンジンダ（P. Songjinda）、他7名、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３５巻、第１５１１〜１５２０ページ、２００５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
患者のＱＯＬを考えた場合、患者に苦痛を与えずにアレルギー治療に有効な情報を得ることが出来れば非常に有用である。しかしながら、これら従来の診断方法は、採血、皮内注射等の人体にとって苦痛を伴う処置を行わなければならない、という問題があり、患者のＱＯＬの点からは好ましいものではなかった。
一方で、スギ花粉症患者において特異的に増減する腸内細菌をスギ花粉症マーカーとすることにより、糞便を用いて非侵襲的にスギ花粉症の診断を行うことができると考えられるが、良好な疾患マーカーとするためには、疾患に関連する腸内細菌を、属レベルではなく、菌種レベルで特定していることが好ましい。しかしながら、例えば非特許文献２においても、バクテロイデス・フラギリスグループのうち、スギ花粉症に関連している特定の菌種は明らかにされてはいない。また、バクテロイデス・フラギリスグループに属する菌全体の菌数は、スギ花粉飛散前の時点では健常者との間に違いが認められない。つまり、スギ花粉飛散前に採取された糞便中の、バクテロイデス・フラギリスグループに属する菌全体の菌数は、スギ花粉症との相関性が低く、スギ花粉症の指標としては不十分であった。
【０００８】
本発明は、従来の全身系免疫の活性化に伴う抗体産生による一連のアレルギー診断法と異なり、苦痛を伴うことなく、スギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険性を判断することができる検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、菌種レベルに至るまでの詳細な腸内細菌叢解析から、花粉症の自覚症状および血中マーカーを併せて解析・測定することにより、花粉が飛散する以前において、自覚症状および血中スギ花粉特異的ＩｇＥ量と正または負の相関を示す菌種を新たに見出し、糞便中の該菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無や重症度を判断し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・インテスティナリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ）、およびバクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）からなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とするスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、前記糞便が、スギ花粉飛散開始時期前に被験者から採便されたものであることを特徴とする前記記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万未満である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、糞便１ｇ当たりの、下記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、０．０６以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
式（１） （バクテロイデス・フラギリス菌数＋バクテロイデス・インテスティナリス菌数＋バクテロイデス・スターコリス菌数）／（バクテロイデス・ユニフォルミス菌数＋バクテロイデス・カッカエ菌数）
また、本発明は、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、増大した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、減少した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、減少した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、増大した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、糞便中の菌数の測定を、各菌種の遺伝子配列に対し特異的なプライマーを用いて行うことを特徴とする前記いずれか記載のスギ花粉症検査方法を提供するものである。
また、本発明は、前記記載のスギ花粉症検査方法に用いられる、下記（ａ）〜（ｅ）に記載のプライマーセットのうち、少なくとも１以上を有することを特徴とするスギ花粉症検査用キットを提供するものである。
（ａ）配列番号１１の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的フォワードプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｂ）配列番号１５の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的フォワードプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的フォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的フォワードプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｅ）配列番号１３の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的フォワードプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
また、本発明は、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有するスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法であって、被験物質の摂取により、糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が減少した場合、および／またはバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が増大した場合に、当該被験物質が、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有すると判断することを特徴とするスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、前記被験物質が、医薬品または食品であることを特徴とする、前記記載のスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスギ花粉症検査方法は、糞便中の腸内細菌のうち、スギ花粉症の症状に強い相関を示す特定の菌種の菌数を指標とする方法である。このため、本発明のスギ花粉症検査方法を用いることにより、従来の抗体産生に関する方法と異なり、患者に苦痛を与えることなく、簡便に、スギ花粉症の罹患の有無や重症度を判断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスギ花粉症検査方法は、被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とする。このように、バクテロイデス・フラギリスグループに属する腸内細菌のうち、スギ花粉症の症状と相関性の高い５種類の菌種の、被験者由来の糞便中の菌数を測定し、これらの菌数の多寡により、被験者のスギ花粉症の罹患の有無や、罹患している場合の重症度を判断し評価することができる。
【００１３】
これらのスギ花粉症と相関性の高いバクテロイデス・フラギリスグループに属する菌種は、以下の手法により求めることができる。
１．バクテロイデス・フラギリスグループに属する菌種特異的プライマーの設計および合成
まず、ヒト糞便からの検出が報告されているバクテロイデス・フラギリスグループに属する菌種に関して、各菌種特異的なＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマーを設計し、合成した。具体的には、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ等の公知の国際的な塩基配列データベースにより得られた各細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基にして、公知の塩基配列解析ソフトであるＣＬＵＳＴＡＬＷ ｖｅｒ１．８３を用いて、特異的配列部位を特定し、この部分をターゲットとして、各プライマーを設計した。このようにして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した。設計された各プライマーの塩基配列を表１に示す。表中のプライマー名のうち、「ＢａＯＶＡ−Ｆ」等の末尾が「Ｆ」のものはフォワードプライマーであり、「ＢａＯＶＡ−Ｒ」等の末尾が「Ｒ」のものはリバースプライマーである。また、「産物の長さ（ｂｐ）」とは、各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、それが特異的に認識する菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の塩基対長を示している。
【００１４】
【表１】
【００１５】
２．菌種特異的プライマーの特異性の確認
上記１で設計・合成したプライマーが、実際に各菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異性を有しているかを確認するため、近縁種（標準株および基準株）由来遺伝子を鋳型とした場合のプライマー反応性を検討した。
まず、表２に示す４属１８菌種の細菌を、ＧＡＭ培地（Ｎｉｓｓｕｉ社製）にて嫌気的に一晩純粋培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、２００μＬのキットに付属のＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに溶かして濃度を測定し、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
次に、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ (タカラ社製)を用いて、各菌種特異的プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）と、１μＬの各鋳型ＤＮＡ溶液（１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ）とを含む総液量を２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃１０秒間の後、９４℃５秒間、６０℃３０秒間を１サイクルとし、これを３５サイクル行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。その後、メルティングカーブをデフォルト条件で作成し、非特異的増幅の有無を確認した。
各ＰＣＲの結果を表３に示す。表中、「＋」はＰＣＲ陽性、すなわちＰＣＲ産物が得られたことを、「−」はＰＣＲ陰性、すなわちＰＣＲ産物が得られなかったことを、それぞれ示している。この結果、上記１で得られたプライマーは、各菌種特異的にバンドを形成し、非特異的な増幅は認められなかった。
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】
３．スギ花粉症患者および非花粉症者におけるバクテロイデス菌数と花粉症症状との相関解析
スギ花粉特異的ＩｇＥ陽性かつ自覚症状を有するスギ花粉症患者３３名、および試験開始時点でスギ花粉特異的ＩｇＥ陰性である非花粉症者１４名を被験者とし、スギ花粉飛散前に採取された糞便中のバクテロイデス・フラギリスグループに属する菌の菌種ごとの菌数と花粉症症状との相関性を解析した。花粉症症状としては、くしゃみ等の自覚症状と、血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量を調べた。具体的には、以下のようにして行った。
（１） 糞便中の各菌種の菌数の測定
後記試験例２において各被験者の糞便から調製されたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡ溶液とし、表１記載のプライマーセットを用いて、上記２と同様の反応条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物量から、各ＤＮＡ溶液中の各菌種の菌数を測定した。菌数の測定は、予め菌数を計数した基準株から同様に抽出したＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲを行うことにより作成した検量線を用いて行った。
【００１９】
（２） 各菌種の菌数と花粉症症状との相関解析
上記（１）で測定した菌数と、後記試験例１で得られた各被験者の花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のデータに基づき、公知の統計解析ソフトＳＰＳＳ ｖｅｒ１４．０を用いて相関解析を行った。Ｓｐｅａｒｍａｎ法にて相関係数を算出したところ、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスにおいて、花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量の両方またはいずれか一方と、正または負の有意な相関を示すことが判明した。なお、表中、「花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ」とは、試験開始時点の１月２０日に採血した血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量を意味し、「花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ」とは、試験終了時点の４月２１日に採血した血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量を意味する。
【００２０】
具体的には、表４に示すように、バクテロイデス・フラギリスは、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれとも有意な正の相関を示した。また、バクテロイデス・インテスティナリスは、表５に示すように、特に花粉症自覚症状のスコアと花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対して有意な正の相関を示した。同様に、表８に示すように、バクテロイデス・スターコリスは、花粉症自覚症状のスコアに対して有意な正の相関を示した。一方、バクテロイデス・ユニフォルミスとバクテロイデス・カッカエは、表６および７に示すように、花粉症自覚症状のスコア等と負の相関を示した。特に、バクテロイデス・ユニフォルミスは、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量および花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対して有意な負の相関を示し、バクテロイデス・カッカエは、スギ花粉特異的ＩｇＥ量に対して有意な負の相関を示した。
【００２１】
【表４】
【００２２】
【表５】
【００２３】
【表６】
【００２４】
【表７】
【００２５】
【表８】
【００２６】
また、これらの菌種を組み合わせた場合の菌数は、各菌種単独の菌数よりも、花粉症症状に対してより強く、かつ有意な相関を示した。例えば、表９に示すように、花粉症症状と正の相関を示したバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスの３菌種の菌数の和（表中、「バクテロイデス合算菌数」）は、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれに対しても、各菌種単独の場合よりも強い相関を示し、かつＰ値も０．０１未満と非常に有意性も高いことが判明した。一方、表１０に示すように、下記式（１）で表される、花粉症症状と正の相関を示した３菌種（バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリス）の菌数の和を、花粉症症状と負の相関を示した２菌種（バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエ）の菌数の和で除した比率（表中、「バクテロイデス菌数比率」）は、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれに対しても相関係数が０．５以上、Ｐ値が０．０１未満であり、花粉症症状に対して、最も強くかつ有意な相関を示した。
式（１） （バクテロイデス・フラギリス菌数＋バクテロイデス・インテスティナリス菌数＋バクテロイデス・スターコリス菌数）／（バクテロイデス・ユニフォルミス菌数＋バクテロイデス・カッカエ菌数）
【００２７】
【表９】
【００２８】
【表１０】
【００２９】
また、表４〜１０より明らかであるように、上記５菌種の菌数およびこれらを適宜組み合わせた場合の菌数の、スギ花粉特異的ＩｇＥ量との相関係数は、いずれの場合も、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対するものよりも、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量に対するもののほうが、絶対値が大きい。つまり、各菌種の菌数は、軽度の花粉症症状に対してよりも、より重度の花粉症症状に対して強い相関を示した。したがって、これらの結果から、花粉飛散前に採取された糞便中の、上記５菌種の菌数を指標として、スギ花粉症の罹患の有無だけではなく、重症化の危険性をも判断し得ることが明らかである。
【００３０】
なお、上記５菌種の糞便中の菌数が花粉症症状に相関することから、これらの菌種の腸内における増殖が花粉症症状の有無や重症度に影響を受ける可能性に加えて、これらの菌種が、スギ花粉症の発症に深く関与している可能性もある。したがって、これらの５菌種は、スギ花粉症の診断マーカーとしてのみならず、花粉症症状のコントロールにおいても重要なターゲットとなる可能性がある。
【００３１】
（３）各菌種の総菌数と花粉症症状との相関解析
上記（１）で菌数を測定した１８菌種のうち、バクテロイデス・フラギリスグループに属する１４菌種の菌数を合計し、バクテロイデス・フラギリスグループの総菌数を算出した。得られた総菌数と、後記試験例１で得られた各被験者の花粉症自覚症状のスコア、および血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のデータに基づき、上記（２）と同様にして相関解析を行い、Ｓｐｅａｒｍａｎ法にて相関係数を算出した。この結果、表１１に示すように、バクテロイデス・フラギリスグループの総菌数は、花粉症自覚症状のスコア、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のいずれとも有意な相関を示さなかった。以上の結果から、花粉飛散前に採取された糞便中のバクテロイデス・フラギリスグループの総菌数は、スギ花粉症との相関性が低く、スギ花粉症の指標としては不十分であることが明らかである。
【００３２】
【表１１】
【００３３】
本発明のスギ花粉症検査方法に供される糞便は、被験者より採便されたものであれば、特に限定されるものではなく、採便直後のものであってもよく、採便後保存されたものであってもよい。糞便の保存は、臨床検査用検体等において通常行われている方法により行うことができる。例えば、室温保存でもよく、冷蔵保存でもよく、冷凍保存でもよい。糞便中の微生物量の変動を抑え、より信頼性の高い結果を得ることが期待できるため、採取直後の糞便であることが好ましく、保存後の糞便である場合には、冷蔵または冷凍保存されたものであることが好ましい。
【００３４】
本発明のスギ花粉症検査方法に供される糞便の採取時期は特に限定されるものではなく、
スギ花粉飛散開始時期前に採取されたものであってもよく、スギ花粉飛散時期に採取されたものであってもよい。なお、本発明において、「スギ花粉飛散開始時期前」とは、前年のスギ花粉が飛散時期の終了時期から、次年度のスギ花粉の飛散が開始する時期の前までを意味する。スギ花粉の飛散時期は、スギの生育地からの距離や地域、気象状況等により変動するものであるが、日本では一般的には１月下旬〜４月下旬頃までである。
【００３５】
本発明のスギ花粉症検査方法は、スギ花粉症症状と非常に強い相関を有する特定の腸内細菌種の菌数を指標とするものである。したがって、上記１〜３において示したように、本発明のスギ花粉症検査方法は、実際にスギ花粉に暴露し、アレルギー反応が生じている時期（スギ花粉飛散時期）に採取した糞便のみならず、アレルギー反応が生じている可能性の低いスギ花粉飛散開始時期前に採取した糞便を用いた場合であっても、被験者のスギ花粉症の罹患の有無や、罹患している場合の重症度を判断し評価することができる。
【００３６】
本発明において、糞便中の各菌種の菌数を測定する方法は、特に限定されるものではなく、糞便または糞便を常法により処理した試料中の特定の微生物の数や密度、濃度等を測定するために通常用いられている方法のいずれを用いて行ってもよい。例えば、上記３（１）において行ったように、糞便から常法により核酸を抽出し、該核酸を鋳型とし、各菌種の遺伝子を特異的に認識するプライマーを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物量から菌数を算出することができる。該核酸増幅反応として、通常のＰＣＲの他に、リアルタイムＰＣＲを行ってもよく、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行ってもよい。ＲＴ−ＰＣＲを行い、糞便から回収された核酸中のＲＮＡをｃＤＮＡとして鋳型として用いることにより、１０００倍程度検出感度をあげることが可能である。その他、各菌種の細菌自体を特異的に認識する抗体を用いて、希釈した糞便中の微生物数を直接計数してもよく、各菌種の遺伝子を特異的に認識するプローブを用いて、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法等を行うことにより菌数を測定することもできる。糞便中の細菌を高精度かつ高感度に検出し測定得るため、糞便中の菌数の測定は、各菌種の遺伝子配列に対し特異的なプライマー（菌種特異的プライマー）を用いて行うことが好ましく、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物量から菌数を算出して行うことがより好ましい。
【００３７】
ここで、菌種特異的プライマーは、各菌種の遺伝子配列を特異的に認識する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであれば、特に限定されるものではない。例えば、公知のプライマーを用いてもよく、新たに設計・合成したプライマーであってもよい。なお、菌種特異的プライマー等の設計や合成は、遺伝子解析等の分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。例えば、標的の菌種の遺伝子配列情報を用いて、ＣＬＵＳＴＡＬＷやＰｒｉｍｅｒ３等の公知のプライマー設計ソフトを利用して設計することができる。各菌種の遺伝子配列情報は、公知の塩基配列解析法による解析や、ＤＤＢＪ等の公知の塩基配列データベースより入手することもできる。
【００３８】
本発明において、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの各菌種の菌数の測定に用いられる菌種特異的プライマーとしては、表１記載の塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。これらのプライマーを用いることにより、標的の菌種を、近縁種であるバクテロイデス・フラギリスグループの他の菌種と明確に識別して、検出することができるためである。なお、各菌種特異的プライマーは、標的の遺伝子に対する特異的な認識能を阻害しない限り、表１記載の塩基配列以外の付加的な塩基配列を有していてもよい。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列等がある。また、菌種特異的プライマーを、蛍光物質等により標識しておくことにより、得られた増幅産物の検出等を容易にすることもできる。なお、プライマーの標識は常法により行うことができる。
【００３９】
その他、表１記載の各菌種特異的プライマーセットの１種または２種以上を、キット化することも好ましい。該キットを用いることにより、簡便にスギ花粉症の検査を行うことができるためである。該キットには、プライマーセットの他に、ＰＣＲ用試薬等の、該プライマーセットを用いて菌数を測定する場合に用いられる試薬等を含めることができる。
【００４０】
本発明のスギ花粉症検査方法においては、糞便中のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスをスギ花粉症マーカーとするものであり、被験者由来の糞便中の、スギ花粉症マーカーである菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症を検査する方法である。すなわち、糞便中の菌数が花粉症症状と正の相関を有するバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が多い場合や、糞便中の菌数が花粉症症状と負の相関を有するバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が少ない場合には、被験者がスギ花粉症に罹患している可能性が高い、と判断することができる。
【００４１】
具体的には、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便１ｇ当たりの菌数が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便１ｇ当たりの菌数よりも多い場合や、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便１ｇ当たりの菌数が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便１ｇ当たりの菌数よりも少ない場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することができる。
【００４２】
また、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万以上である場合や、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万未満である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することができる。
【００４３】
これら５菌種の菌数のデータを適宜組み合わせて、被験者のスギ花粉症の罹患の可能性や重症度を判断することができる。特に、上記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率を用いることにより、非常に高精度にスギ花粉症を検査することができる。例えば、糞便１ｇ当たりの、上記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、０．０６以上である場合、好ましくは、０．６以上である場合、好ましくは０．７７以上である場合に、被験者が花粉症に罹患していると判断することができる。その他、糞便１ｇ当たりの、上記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便よりも大きい場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することもできる。
【００４４】
また、糞便１ｇ当たりのバクテロイデス・フラギリス菌数とバクテロイデス・インテスティナリス菌数とバクテロイデス・スターコリス菌数との和を用いることによっても、精度よくスギ花粉症を検査することができる。例えば、糞便１ｇ当たりのバクテロイデス・フラギリス菌数とバクテロイデス・インテスティナリス菌数とバクテロイデス・スターコリス菌数との和が、スギ花粉症非罹患者由来の糞便よりも多い場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することができる。
【００４５】
また、これらの菌種の菌数のデータを用いて、スギ花粉症に罹患している場合の重症度を判断することもできる。例えば、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、増大した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、減少した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することができる。同様に、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、減少した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、増大した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することもできる。
【００４６】
その他、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスの菌数のうち、３種とも多い場合、いずれか２種が多い場合、いずれか１種のみが多い場合、いずれも多くない場合の順に、スギ花粉症に罹患している可能性が高い、またはスギ花粉症の症状が重症である可能性が高い、と判断することもできる。同様に、バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエの菌数のうち、２種とも少ない場合、いずれか１種のみが少ない場合、いずれも少なくない場合の順に、スギ花粉症に罹患している可能性が高い、またはスギ花粉症の症状が重症である可能性が高い、と判断することもできる。
【００４７】
このように、本発明のスギ花粉症検査方法を用いることにより、採血やアレルゲン感作といった侵襲敵な処置を要することなく、安全かつ簡便にスギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険度等を検査することができる。特に、スギ花粉飛散前であっても、検査が可能であるため、被験者は、スギ花粉飛散開始前に検査を行うことにより、スギ花粉飛散時期までに十分な予防措置を講ずることができる。また、本発明のスギ花粉症検査方法を継続的に行い、各検査時に得られた上記５菌種の菌数データを比較することにより、スギ花粉症の症状の重症化または緩解を、被験者に検査のためのアレルゲン感作という負担を強いることなく、安全に調べることができる。
【００４８】
その他、本発明のスギ花粉症検査方法を利用することにより、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有するスギ花粉症治療用組成物のスクリーニングを簡便かつ安全に行うことができる。具体的には、被験物質の摂取前と摂取後に採取した糞便に対して、上記５菌種のうちの少なくとも１以上の菌種の菌数を測定し、摂取前後により各菌種の菌数が変動するかどうかを調べることにより、スギ花粉症治療用組成物のスクリーニングを行うことができる。例えば、被験物質の摂取により、糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が減少した場合、および／またはバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が増大した場合に、摂取した被験物質が、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有すると判断することができる。このような、スクリーニングの結果に得られたスギ花粉症治療用組成物は、医薬品や食品等の成分とすることができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［試験例１］スギ花粉症自覚症状のスコアおよびスギ花粉特異的ＩｇＥレベルの測定
スギ花粉特異的ＩｇＥ陽性かつ自覚症状を有するスギ花粉症患者３３名および試験開始時点でスギ花粉特異的ＩｇＥ陰性である非花粉症者１４名を対象に、１月２０日〜４月２１日までの間、臨床試験を実施した。試験期間中は「鼻アレルギー診療ガイドライン２００２」に従い、くしゃみ、水性鼻汁、鼻閉、鼻掻痒感、目の症状、のどの症状を日誌に記入させ、自覚症状変化を調査した。週ごとにこれらのスコアを合計し、得られた曲線下面積を自覚症症状の指標とした。また、試験期間前後（１月２０日と４月２１日）に採血を行った。スギ花粉特異的ＩｇＥ抗体量は、ＥＬＩＳＡ測定用プラスティック９６穴プレートに、市販のスギ花粉抗原（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）をコートし、そこに被験者の血液を添加して洗浄後、ＨＲＰ標識した抗ヒトスギ花粉特異的ＩｇＥ抗体（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を添加して反応させた後、さらに洗浄した。さらに、ＴＭＢ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）にて発色させた後、１０％硫酸を加えて反応を停止させてから、プレートリーダーにて４５２〜５９５ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値から、濃度既知の対照試料を用いて作成した検量線を用いて、各血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ抗体量を算出した。
【００５１】
［試験例２］糞便中からのＤＮＡ抽出
試験開始時点（１月２０日）に、試験例１で示した被験者４７名から採便を行い、糞便からフェノール・ビーズ法（非特許文献２参照。）によりＤＮＡを抽出した。すなわち、２０ｍｇの糞便を１ｍＬのＰＢＳにて２回洗浄後、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ４０ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｐＨ９．０) ４５０μＬ、１０％ＳＤＳ５０μＬ、０．１ｍｍ径のグラスビーズ３００ｍｇ、ＴＥ飽和フェノール５００μＬを加え、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて、パワーレベル５で３０秒間激しく振盪した。氷上で１０分静置した後、１４０００×ｇ、５分間の遠心で得られた上清に、フェノール・クロロホルムを４００μＬ加えて、よく攪拌した。さらに氷上で１０分静置した後、１４０００×ｇ、５分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。その後、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ロシュ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを精製した。最終的に２００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした溶液を、ＤＮＡ溶液とした。
【００５２】
［実施例１］
（１）スギ花粉症患者および非花粉症者における、バクテロイデス・フラギリスグループの各菌種の定性分析
上記試験例２において各被験者の糞便から調製されたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡ溶液とし、表１記載の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの菌種特異的プライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ溶液中に上記５菌種が存在しているかどうかを分析した。
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ (タカラ社製)を用いて、各菌種特異的プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）と、１μＬの各鋳型ＤＮＡ溶液とを含む総液量を２５μＬのＰＣＲ反応液を調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃２０秒間、５０℃２０秒間、７２℃３０秒間を１サイクルとし、これを３０サイクル行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。その後、得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無により、糞便中にバクテロイデス・フラギリスグループの各菌種が存在しているかどうかを判定した。具体的には、電気泳動は、１％アガロースゲル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ;バイオラッド社製）を用いて、Ｍｕｐｉｄ（コスモ・バイオ社製）により１００Ｖ、３０分間電気泳動し、エチジウムブロミド（０．５ｍｇ／ｍＬ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察することにより行った。なお、該方法では、糞便１ｇ当り１００万以上の菌数がいる場合に、ＰＣＲ後にバンドが検出される。
【００５３】
（２）バクテロイデス・フラギリスグループの各菌種の有無と花粉症症状との群間解析
上記（１）で得られたバクテロイデス・フラギリスグループの５菌種の有無の結果と、試験例１で得られた各被験者の花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量のデータに基づき、統計解析ソフトＳＰＳＳ ｖｅｒ１４．０を用いて群間解析を行った。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストを実施した結果を、表１２〜１６に示した。表中、「ＰＣＲ陽性被験者」とは、上記（１）においてバンドが検出され、標的の菌種が糞便１ｇ当たり１００万以上存在すると判定された糞便が採取された被験者を意味し、「ＰＣＲ陰性被験者」とは、バンドが検出されず、標的の菌種が糞便１ｇ当たり１００万未満であると判定された糞便が採取された被験者を意味する。また、表中の「花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ」および「花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ」は、表４等と同じである。
【００５４】
【表１２】
【００５５】
【表１３】
【００５６】
【表１４】
【００５７】
【表１５】
【００５８】
【表１６】
【００５９】
これらの結果から明らかであるように、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの有無により、花粉症自覚症状のスコアおよび血液中のスギ花粉特異的ＩｇＥ量の両方またはいずれか一方が有意に異なることが判明した。
また、例えばバクテロイデス・インテスティナリスの結果（表１３参照。）にあるように、花粉飛散前のスギ花粉特異的ＩｇＥ量においては認められなかった有意差が、花粉飛散後のスギ花粉特異的ＩｇＥ量において認められたことから、本発明のスギ花粉症検査方法において指標とされる５菌種（バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリス）が、重症化の危険性を判断する指標になることが明らかとなった。
【００６０】
（３）バクテロイデス・フラギリスグループの各菌種の有無によるスギ花粉症検出精度
上記（１）で得られたバクテロイデス・フラギリスグループの５菌種の有無の結果から、糞便中の各菌種の検出の有無による、スギ花粉症の罹患の有無の検出精度を調べた。
各菌種の検出の有無、すなわち、ＰＣＲ陽性被験者とＰＣＲ陰性被験者における、花粉症罹患者と非罹患者の人数を、表１７に示した。
【００６１】
【表１７】
【００６２】
この結果、バクテロイデス・フラギリスにおいては、ＰＣＲ陽性被験者中、約８４％が花粉症罹患者であった。また、バクテロイデス・インテスティナリスにおいては、ＰＣＲ陽性被験者中、約９３％が花粉症罹患者であり、バクテロイデス・スターコリスにおいては、ＰＣＲ陽性被験者の全員が花粉症罹患者であった。
一方、バクテロイデス・カッカエにおいては、ＰＣＲ陰性被験者中、約８５％が花粉症罹患者であり、バクテロイデス・ユニフォルミスにおいては、ＰＣＲ陰性被験者の全員が花粉症罹患者であった。
つまり、糞便中のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスの５菌種の検出の有無により、スギ花粉症の罹患の有無を８０％以上の特異度で検査することが可能であることが示唆された。すなわち、これらの結果から、これらの５菌種が、スギ花粉症マーカーとして利用し得ることが明らかである。
【００６３】
［比較例１］ スギ花粉症患者および非花粉症者における、バクテロイデス・フラギリスグループに属する全ての菌種による定性分析
表１記載の各菌種特異的プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）、およびバクテロイデス・フラギリスグループの全ての菌を検出するプライマーである、配列番号２９の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリスグループ検出用フォワードプライマーｇ−Ｂｆｒａ−Ｆと、配列番号３０の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリスグループ検出用リバースプライマーｇ−Ｂｆｒａ−Ｒからなるプライマーセット（非特許文献２参照。）を用いた以外は、全て実施例１（１）と同様にして、ＰＣＲ後のバンドの検出の有無より、各ＤＮＡ溶液中にバクテロイデス・フラギリスグループの菌種が存在しているかどうかを分析した。
この結果、バクテロイデス・フラギリスグループ検出用プライマーセットを用いた場合には、全ての被験者の糞便からバンドが検出され、バクテロイデス・フラギリスグループの検出率は１００％となった。また、全ての被験者の糞便において、表１記載のいずれかの菌種特異的プライマーセットを用いた場合にバンドが検出された。これらの結果から、バクテロイデス・フラギリスグループの総菌数は、スギ花粉症との相関性が低く、スギ花粉症の診断に用いるには不適であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のスギ花粉症検査方法は、糞便中のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・カッカエ、およびバクテロイデス・スターコリスをスギ花粉症マーカーとし、非侵襲的かつ簡便にスギ花粉症の罹患の有無や重症化の危険性を判断することができるため、特にスギ花粉症の診断および治療の分野において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・インテスティナリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ）、およびバクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）からなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とするスギ花粉症検査方法。
【請求項２】
前記糞便が、スギ花粉飛散開始時期前に被験者から採便されたものであることを特徴とする、請求項１記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項３】
バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項４】
バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万未満である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項５】
糞便１ｇ当たりの、下記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、０．０６以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
式（１） （バクテロイデス・フラギリス菌数＋バクテロイデス・インテスティナリス菌数＋バクテロイデス・スターコリス菌数）／（バクテロイデス・ユニフォルミス菌数＋バクテロイデス・カッカエ菌数）
【請求項６】
バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、増大した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、減少した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項７】
バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、減少した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、増大した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項８】
糞便中の菌数の測定を、各菌種の遺伝子配列に対し特異的なプライマーを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項９】
請求項８記載のスギ花粉症検査方法に用いられる、下記（ａ）〜（ｅ）に記載のプライマーセットのうち、少なくとも１以上を有することを特徴とするスギ花粉症検査用キット。
（ａ）配列番号１１の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的フォワードプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｂ）配列番号１５の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的フォワードプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的フォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的フォワードプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｅ）配列番号１３の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的フォワードプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
【請求項１０】
スギ花粉症に対する予防または治療効果を有するスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法であって、
被験物質の摂取により、糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が減少した場合、および／またはバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が増大した場合に、当該被験物質が、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有すると判断することを特徴とするスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記被験物質が、医薬品または食品であることを特徴とする、請求項１０記載のスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法。
【請求項１】
被験者から採便された糞便中の、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・インテスティナリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ）、およびバクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）からなる群より選択される１種以上の菌種の菌数を指標とし、スギ花粉症の罹患の有無または重症度を検査することを特徴とするスギ花粉症検査方法。
【請求項２】
前記糞便が、スギ花粉飛散開始時期前に被験者から採便されたものであることを特徴とする、請求項１記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項３】
バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項４】
バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が、糞便１ｇ当たり１００万未満である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項５】
糞便１ｇ当たりの、下記式（１）で表されるバクテロイデス菌数比率が、０．０６以上である場合に、被験者がスギ花粉症に罹患していると判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
式（１） （バクテロイデス・フラギリス菌数＋バクテロイデス・インテスティナリス菌数＋バクテロイデス・スターコリス菌数）／（バクテロイデス・ユニフォルミス菌数＋バクテロイデス・カッカエ菌数）
【請求項６】
バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、増大した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、減少した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項７】
バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の、糞便中の菌数が、減少した場合にスギ花粉症の重症度が上がったと判断し、増大した場合にスギ花粉症の重症度が下がったと判断することを特徴とする、請求項１または２記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項８】
糞便中の菌数の測定を、各菌種の遺伝子配列に対し特異的なプライマーを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載のスギ花粉症検査方法。
【請求項９】
請求項８記載のスギ花粉症検査方法に用いられる、下記（ａ）〜（ｅ）に記載のプライマーセットのうち、少なくとも１以上を有することを特徴とするスギ花粉症検査用キット。
（ａ）配列番号１１の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的フォワードプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するバクテロイデス・フラギリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｂ）配列番号１５の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的フォワードプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するバクテロイデス・インテスティナリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的フォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を有するバクテロイデス・ユニフォルミス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的フォワードプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するバクテロイデス・カッカエ特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
（ｅ）配列番号１３の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的フォワードプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するバクテロイデス・スターコリス特異的リバースプライマーからなるプライマーセット。
【請求項１０】
スギ花粉症に対する予防または治療効果を有するスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法であって、
被験物質の摂取により、糞便中の、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・インテスティナリス、およびバクテロイデス・スターコリスからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が減少した場合、および／またはバクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・カッカエからなる群より選択される１種以上の菌種の菌数が増大した場合に、当該被験物質が、スギ花粉症に対する予防または治療効果を有すると判断することを特徴とするスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記被験物質が、医薬品または食品であることを特徴とする、請求項１０記載のスギ花粉症治療用組成物のスクリーニング方法。
【公開番号】特開２００９−２３２６８９（Ｐ２００９−２３２６８９Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７９４１８（Ｐ２００８−７９４１８）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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