スクロースからグリセリンおよびグリセリン由来生産物を生産するための組換え細菌
スクロースからグリセリンおよびグリセリン由来生産物を生産する能力を有する組換え細菌について記載される。組換え細菌は、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む。これらのヌクレオチド配列はそれぞれ、同じかまたは異なるプロモーターに作動可能に連結される。これらの組換え細菌は、スクロースを代謝し、グリセロールおよび／またはグリセリン由来生産物、例えば１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および分子生物学の分野に関する。より詳細には、炭素源としてスクロースを用いてグリセリンおよびグリセリン由来生産物（ＧＬＹＣＥＲＯＬ−ＤＥＲＩＶＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ）を生産する能力を有する組換え細菌、ならびにかかる組換え細菌を利用する方法、が提供される。
【背景技術】
【０００２】
多くの商業的に有用な微生物は、それらの主な炭水化物源としてグルコースを使用する。しかし、商業的に望ましい生成物の生産のために開発された微生物によるグルコースの使用における欠点は、高コストのグルコースである。微生物生産系における炭水化物源としてのスクロースやスクロースおよび他の糖類を含有する混合供給原料の使用であれば、これらの材料がより低コストで容易に入手可能であることから、商業的により望ましいことになる。
【０００３】
生成微生物は、混合供給原料中に存在する任意のスクロースを利用できる場合、より効率的に機能しうる。したがって、生成微生物がスクロースを主要な炭素源として効率的に利用する能力を有しない場合、それは効率的に機能することができない。例えば、細菌細胞は、典型的には、優先的な糖の使用を示し、ここではグルコースが最も好ましい。典型的には、グルコースは、糖類の混合物を含有する人工培地中で、他の糖類に先立ち、その全体に至るまで代謝される。さらに、多くの細菌には、スクロースの利用能が欠如している。例えば、スクロースの利用能を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は５０％未満である。したがって、生成微生物が炭水化物源としてスクロースを利用できない場合、微生物を、それがスクロースを利用できるように改変することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，９６０，４５５号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｌｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：１０３１−１０４０頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スクロース利用遺伝子の組み込みにより、スクロースを利用するように改変されている組換え細菌が報告されている。例えば、Ｌｉｖｓｈｉｔｓら（特許文献１）では、スクロース利用における代謝経路をコードする遺伝子を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）株を用いたアミノ酸の生産についての記載がなされている。さらに、非特許文献１では、炭素源としてスクロースを使用してＬ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを生産する、スクロース分解に関与する遺伝子を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株についての記載がなされている。しかし、炭素源としてスクロースを使用し、グリセリンおよびグリセリン由来生産物を生産する能力を有する細菌株に対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、組換え細菌であって、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、
（ａ）スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列、
（ｂ）フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｃ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ、同じかまたは異なるプロモーターに作動可能に連結され、さらに、前記組換え細菌は、スクロースを代謝し、グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸からなる群から選択される生成物を生産する能力を有する、組換え細菌を提供する。
【０００８】
第２の実施形態では、本発明は、グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するための方法であって、
ａ）スクロースの存在下で、本明細書で開示される組換え細菌を培養するステップと、
ｂ）場合により、生成されたグリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、
を含む、方法を提供する。
【０００９】
簡単な配列の説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１ １．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ-ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で示される規則に従う。
【００１０】
【表１】
【００１１】
配列番号７１は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＸ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列である。
【００１２】
配列番号７２は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０１のヌクレオチド配列である。
【００１３】
配列番号７３は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０３のヌクレオチド配列である。
【００１４】
配列番号７４は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０６のヌクレオチド配列である。
【００１５】
配列番号７５は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０９のヌクレオチド配列である。
【００１６】
配列番号７６は、プラスミドｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯのヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号７７は、本明細書中の実施例１に記載のプラスミドｐＳｃｒ１のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号７８は、本明細書中の実施例１に記載のプラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号７９は、本明細書中の実施例１に記載のプラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号８０〜８３は、本明細書中の実施例２〜４に記載の株ＴＴａｂの作成に使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書中に示される各参照の開示内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、１つもしくは複数の細胞および当業者に既知のそれらの均等物などを含む。
【００２３】
本開示との関連で、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００２４】
「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と略される。
【００２５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略される。
【００２６】
「アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は、「ＡＴＣＣ」と略される。
【００２７】
用語「組換えグリセリン生成細菌」は、グリセリンおよび／またはグリセリン由来生産物、例えば１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有するように遺伝子操作された細菌を示す。
【００２８】
用語「スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体」は、スクロースの細菌細胞への輸送を媒介する能力を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を示す。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドの例として、限定はされないが、スクロース：Ｈ＋シンポーターが挙げられる。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体の例として、限定はされないが、ＡＢＣ型トランスポーターが挙げられる。スクロース：Ｈ＋シンポーターは、例えば、ＥＣ３１３２（Ｊａｈｒｅｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０７−５３１６頁、２００２年）またはＡＴＣＣ１３２８１（Ｏｌｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：１０３１−１０４０頁、２００７年）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）株ＤＳＭ１０１４０Ｔ（Ｅｈｒｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（６）：３９１−３９７頁、２００３年）において見出されるｃｓｃＢ遺伝子によってコードされる。スクロースに対する活性を有するＡＢＣ型トランスポーターの例として、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株ＴＩＧＲ４で遺伝子ｓｕｓＴ１、ｓｕｓＴ２およびｓｕｓＸによってコードされる複合体がある（ＩｙｅｒおよびＣａｍｉｌｌｉ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６：１−１３頁、２００７年）。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体はまた、他の糖類に対する活性を有しうる。例として、ｍａｌＥＦＧＫ（Ｋｉｌｉｃら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２６６：２１８頁、２００７年）によってコードされるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のマルトーストランスポーター複合体が挙げられる。
【００２９】
用語「フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド」は、Ｄ−フルクトース＋ＡＴＰのフルクトース−リン酸＋ＡＤＰへの変換を触媒する能力を有するポリペプチドを示す。フルクトキナーゼの典型がＥＣ２．７．１．４である。フルクトースをリン酸化するいくらかの能力を有する酵素は、この活性がその主要な活性であるか否かにかかわらず、フルクトキナーゼと称される場合がある。フルクトキナーゼをコードする遺伝子およびフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質のために使用される略語として、例えば、「Ｆｒｋ」、「ｓｃｒＫ」、「ｃｓｃＫ」、「ＦＫ」、および「ＫＨＫ」が挙げられる。フルクトキナーゼは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）におけるｓｃｒＫ遺伝子、および特定の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株におけるｃｓｃＫ遺伝子によってコードされる。
【００３０】
用語「スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド」は、スクロースの加水分解を触媒し、グルコースおよびフルクトースを生産する能力を有するポリペプチドを示す。かかるポリペプチドは、「インベルターゼ」または「βフルクトフラノシダーゼ」と称されることが多い。これらの酵素の典型がＥＣ３．２．１．２６である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＣ３１３２（Ｊａｈｒｅｉｓら、上記）またはＡＴＣＣ１３２８１（Ｏｌｓｏｎら、上記）において見出されるｃｓｃＡ遺伝子、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）株ＤＳＭ１０１４０Ｔ由来のｂｆｒＡ遺伝子、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳＵＣ２遺伝子、が挙げられる（ＣａｒｌｓｏｎおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ ２８：１４５頁、１９８２年）。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドはまた、スクロースリン酸ヒドロラーゼ活性を有しうる。かかるペプチドの一例が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるｓｃｒＢによってコードされる（Ｅｎｇｅｌｓら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２８９：８０−８９頁、２００８年）。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドはまた、スクロースホスホリラーゼ活性を有しうる。かかる酵素の典型がＥＣ２．４．１．７である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子の一例が、特に、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ２０１９３（Ｇｏｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２９：７７−８６頁、２００７年）およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＤＳＭ２００８３（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２１９−２２７頁、２００４年）において見出される。
【００３１】
用語「グリセリン誘導体」および「グリセリン由来生産物」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、グリセリンから、またはグリセリンを含む経路内で合成される化合物を示す。かかる生成物の例として、３−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサル、１，２−プロパンジオール、および１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【００３２】
用語「微生物生成物」は、微生物によって生産される生成物、すなわち微生物による物質の代謝の結果物を示す。生成物は、微生物によって自然に生成されうるか、または微生物を遺伝子操作することで、生成物は生産されうる。
【００３３】
用語「ホスホエノールピルビン酸・糖ホスホトランスフェラーゼ系」、「ＰＴＳ系」、および「ＰＴＳ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ホスホエノールピルビン酸依存性の糖取り込み系を示す。
【００３４】
用語「ホスホキャリアータンパク質ＨＰｒ」および「ＰｔｓＨ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｔｓＨによってコードされるホスホキャリアータンパク質を示す。用語「ホスホエノールピルビン酸−タンパク質ホスホトランスフェラーゼ」および「ＰｔｓＩ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｔｓＩによってコードされるホスホトランスフェラーゼのＥＣ２．７．３．９を示す。用語「グルコース特異的ＩＩＡ成分」および「Ｃｒｒ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｃｒｒによってコードされる、ＥＣ２．７．１．６９と称される酵素を示す。ＰｔｓＨ、ＰｔｓＩ、およびＣｒｒは、ＰＴＳ系を含む。
【００３５】
用語「ＰＴＳ陰性」は、天然状態でＰＴＳ系を有しない微生物、またはＰＴＳ系がＰＴＳ遺伝子の不活性化を通じて不活性化されている微生物を示す。
【００３６】
用語「グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「Ｇ３ＰＤＨ」は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセリン３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への変換を触媒する酵素活性に関与するポリペプチドを示す。インビボでのＧ３ＰＤＨは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性でありうる。特に補因子に特異的なグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼに言及する場合、用語「ＮＡＤ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＮＡＤＰ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」が使用されることになる。ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼでは、（例えば、ｇｐｓＡによってコードされる酵素により）ＮＡＤおよびＮＡＤＰを交換可能に使用できる場合が一般的であることから、ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼの用語は、交換可能に使用されることになる。ＮＡＤ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．８）は、例えば、ＧＰＤ１（本明細書中でＤＡＲ１とも称される）（配列番号１で示されるコード配列；配列番号２で示されるコードされたタンパク質配列）、またはＧＰＤ２（配列番号３で示されるコード配列；配列番号４で示されるコードされたタンパク質配列）、またはＧＰＤ３を含む数種の遺伝子によってコードされる。ＮＡＤＰ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．９４）は、例えばｇｐｓＡによってコードされる。
【００３７】
用語「グリセリン３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセリン３−ホスファターゼ」、「Ｄ，Ｌ−グリセリンホスファターゼ」、および「Ｇ３Ｐホスファターゼ」は、グリセリン３−リン酸および水のグリセリンおよび無機リン酸塩への変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示す。Ｇ３Ｐホスファターゼは、例えば、ＧＰＰ１（配列番号５で示されるコード配列；配列番号６で示されるコードされたタンパク質配列）、またはＧＰＰ２（配列番号７で示されるコード配列；配列番号８で示されるコードされたタンパク質配列）によってコードされる。
【００３８】
用語「グリセリンデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」は、グリセリン分子の生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）への変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示す。
【００３９】
本発明の目的として、デヒドラターゼ酵素は、グリセリンおよび１，２−プロパンジオールの好ましい基質をそれぞれ有するグリセリンデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を含む。デヒドラターゼ酵素における遺伝子は、特に、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パスツリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）において同定されている。各場合において、デヒドラターゼは、３つのサブユニット、すなわち、大型または「α」サブユニット、中型または「β」サブユニット、および小型または「γ」サブユニットから構成される。遺伝子はまた、例えば、Ｄａｎｉｅｌら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２、５５３頁（１９９９年））ならびにＴｏｒａｙａおよびＭｏｒｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３３７２頁（１９９９年））において記載されている。グリセリンデヒドラターゼの大型または「α」（アルファ）サブユニットをコードする遺伝子は、ｄｈａＢ１（配列番号９で示されるコード配列、配列番号１０で示されるコードされたタンパク質配列）、ｇｌｄＡおよびｄｈａＢを含み、中型または「β」（ベータ）サブユニットをコードする遺伝子は、ｄｈａＢ２（配列番号１１で示されるコード配列、配列番号１２で示されるコードされたタンパク質配列）、ｇｌｄＢ、およびｄｈａＣを含み、小型または「γ」（ガンマ）サブユニットをコードする遺伝子は、ｄｈａＢ３（配列番号１３で示されるコード配列、配列番号１４で示されるコードされたタンパク質配列）、ｇｌｄＣ、およびｄｈａＥを含む。ジオールデヒドラターゼの大型または「α」サブユニットをコードする他の遺伝子は、ｐｄｕＣおよびｐｄｄＡを含み、中型または「β」サブユニットをコードする他の遺伝子は、ｐｄｕＤおよびｐｄｄＢを含み、また小型または「γ」サブユニットをコードする他の遺伝子は、ｐｄｕＥおよびｐｄｄＣを含む。
【００４０】
グリセリンおよびジオールデヒドラターゼは、グリセリンおよび一部の他の基質により、機序に基づく自殺不活性化を受ける（Ｄａｎｉｅｌら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２、５５３頁（１９９９年））。用語「デヒドラターゼ再活性化因子」は、デヒドラターゼ活性の再活性化に関与するタンパク質を示す。用語「デヒドラターゼを再活性化する活性」、「デヒドラターゼ活性を再活性化する」および「デヒドラターゼ活性を再生する」は、交換可能に使用され、反応の触媒作用能を有しないデヒドラターゼを反応の触媒作用能を有するものに変換する現象、あるいはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象またはインビボでデヒドラターゼ酵素の有効な半減期を延長する現象を示す。２つのタンパク質が、デヒドラターゼ再活性化因子として関与するものとして同定されている（例えば、米国特許第６，０１３，４９４号明細書およびその中の参考文献；Ｄａｎｉｅｌら、上記；ＴｏｒａｙａおよびＭｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３３７２頁（１９９９年）；ならびにＴｏｂｉｍａｔｓｕら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、４１１０頁（１９９９年）を参照）。タンパク質の１つをコードする遺伝子として、例えば、ｏｒｆＺ、ｄｈａＢ４、ｇｄｒＡ、ｐｄｕＧおよびｄｄｒＡが挙げられる。２つのタンパク質の２番目をコードする遺伝子として、例えば、ｏｒｆＸ、ｏｒｆ２ｂ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＨおよびｄｄｒＢが挙げられる。
【００４１】
用語「１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ」、「１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」および「ＤｈａＴ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示し、但し、かかる活性をコードする遺伝子が、その天然（すなわち野生型）の状況において、デヒドラターゼ酵素に物理的または転写的に連結されていることが見出され、例えば遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＴの場合と同様、ｄｈａレギュロン内部に見出されることが条件である。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、限定はされないが、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、およびクロストリジウム・パスツリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）に由来するｄｈａＴを含む。これらの遺伝子の各々は、ＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼのファミリーに属し、保存された鉄結合モチーフを示し、かつ３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨに関連した相互変換を好ましいとするポリペプチドをコードする（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＬｉｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９、２０５０頁（１９８７年）；Ｄａｎｉｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７、２１５１頁（１９９５年）；およびＬｅｕｒｓら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４、３３７頁（１９９７年））。同様の物理特性を有する酵素は、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）およびラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されている（Ｖｅｉｇａ ｄａ ＤｕｎｈａおよびＦｏｓｔｅｒ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８、２００５頁（１９９２年））。
【００４２】
用語「ｄｈａレギュロン」は、限定はされないが、デヒドラターゼ活性、再活性化活性、および１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む様々な生物学的活性を有するポリペプチドをコードする関連のポリヌクレオチドまたはオープンリーディングフレームのセットを示す。典型的には、ｄｈａレギュロンは、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載のように、オープンリーディングフレームｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、およびｏｒｆＺを含む。
【００４３】
用語「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」および「Ａｌｄ」は、アルデヒドのカルボキシル酸への変換を触媒するポリペプチドを示す。アルデヒドデヒドロゲナーゼでは、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤ、またはＰＱＱなどの酸化還元補因子（ｒｅｄｏｘ ｃｏｆａｃｔｏｒ）が使用される。アルデヒドデヒドロゲナーゼの典型が、ＥＣ１．２．１．３（ＮＡＤ依存性）；ＥＣ１．２．１．４（ＮＡＤＰ依存性）；ＥＣ１．２．９９．３（ＰＱＱ依存性）；またはＥＣ１．２．９９．７（ＦＡＤ依存性）である。ＮＡＤＰ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＢ（配列番号１５で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＢ（配列番号１６）が挙げられる。ＮＡＤ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＡ（配列番号１７で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＡ（配列番号１８）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＨ（配列番号１９で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＨ（配列番号２０）、が挙げられる。
【００４４】
用語「グルコキナーゼ」および「Ｇｌｋ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、Ｄ−グルコース＋ＡＴＰのグルコース６−リン酸＋ＡＤＰへの変換を触媒するタンパク質を示す。グルコキナーゼの典型がＥＣ２．７．１．２である。グルコキナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｇｌｋによってコードされる。
【００４５】
用語「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」および「Ｐｐｃ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ホスホエノールピルビン酸＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２のリン酸塩＋オキサロ酢酸への変換を触媒するタンパク質を示す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの典型がＥＣ４．１．１．３１である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｐｃによってコードされる。
【００４６】
用語「グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＧａｐＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、グリセルアルデヒド３−リン酸＋リン酸塩＋ＮＡＤ＋の３−ホスホ−Ｄ−グリセロイル−リン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋への変換を触媒可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの典型がＥＣ１．２．１．１２である。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｇａｐＡによってコードされる。
【００４７】
用語「好気的呼吸制御タンパク質」および「ＡｒｃＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、グローバルな（ｇｌｏｂａｌ）調節タンパク質を示す。好気的呼吸制御タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるａｒｃＡによってコードされる。
【００４８】
用語「メチルグリオキサルシンターゼ」および「ＭｇｓＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ジヒドロキシアセトンリン酸のメチルグリオキサル＋リン酸塩への変換を触媒可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。メチルグリオキサルシンターゼの典型がＥＣ４．２．３．３である。メチルグリオキサルシンターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｍｇｓＡによってコードされる。
【００４９】
用語「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ」および「Ｅｄｄ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、６−ホスホ−グルコン酸の２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−グルコン酸＋Ｈ２Ｏへの変換を触媒可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。ホスホグルコン酸デヒドラターゼの典型がＥＣ４．２．１．１２である。ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｅｄｄによってコードされる。
【００５０】
用語「ＹｃｉＫ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｂｔｕＲに翻訳的にカップリングされたｙｃｉＫによってコードされる推定上の酵素を示す。
【００５１】
用語「Ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ」は、デオキシアデノシル部分をＡＴＰから還元コリノイドへ転移可能な酵素を示す。Ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの典型がＥＣ２．５．１．１７である。Ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における遺伝子「ｂｔｕＲ」、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）における「ｃｏｂＡ」、およびシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）における「ｃｏｂＯ」によってコードされる。
【００５２】
用語「ガラクトース−プロトンシンポーター」および「ＧａｌＰ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、糖およびプロトンをペリプラズムから細胞質へ移動可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。Ｄ−グルコースは、ＧａｌＰに対して好ましい基質である。ガラクトース−プロトンシンポーターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるｇａｌＰによってコードされる（配列番号２１で示されるコード配列、配列番号２２で示されるコードされたタンパク質配列）。
【００５３】
用語「非特異的な触媒活性」は、３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示し、詳細には１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを除外する。典型的には、これらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。かかる酵素では、限定はされないが、ＦＡＤまたはＦＭＮなどのフラビンを含む、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ以外の補因子が使用されうる。非特異的アルコールデヒドロゲナーゼに対する遺伝子（ｙｑｈＤ）は、例えば、内因性にコードされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株中で機能的に発現されることが見出されている。
【００５４】
用語「１．６の長いＧＩプロモーター」、「１．２０の短い／長いＧＩプロモーター」、および「１．５の長いＧＩプロモーター」は、米国特許第７，１３２，５２７号明細書中に記載のストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ遺伝子に由来するプロモーターを有するポリヌクレオチドまたは断片を示す。これらのプロモーター断片は、その活性を、野生型ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ遺伝子プロモーターに比べて低下させる突然変異を含む。
【００５５】
用語「機能」および「酵素機能」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、特異的化学反応が、酵素自体が反応によって消費されることなく生じる際の速度を変更する場合での酵素の触媒活性を示す。生成物または基質のいずれかの生成が好適な条件下で行われうる場合、かかる活性が平衡状態での反応に適用可能であることは理解されている。
【００５６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００５７】
用語「炭素基質」および「炭素源」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、本明細書で開示される組換え細菌によって代謝可能な炭素源、特にフルクトースおよびグルコースを含む炭素源を示す。炭素源は、他の単糖類；二糖類、例えばスクロース；オリゴ糖；または多糖類をさらに含んでもよい。
【００５８】
用語「宿主細胞」および「宿主細菌」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、外来または異種遺伝子を受け取ることができ、かつそれら遺伝子を発現し、活性のある遺伝子産物を生産できる細菌を示す。
【００５９】
用語「生成微生物」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、１，３−プロパンジオール、グリセリン、３−ヒドロキシプロピオン酸、ポリ不飽和脂肪酸などの特異的生成物の作製のために使用される、組換え体であるものを含む微生物を示す。
【００６０】
「核酸」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および修飾ヌクレオチドを含んでもよい。したがって、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸形態で見出される）は、次のようなその一文字名称によって参照される。すなわち、アデニル酸塩またはデオキシアデニル酸塩（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡに対応）に対する「Ａ」、シチジル酸塩またはデオキシシチジル酸塩に対する「Ｃ」、グアニル酸塩またはデオキシグアニル酸塩に対する「Ｇ」、ウリジル酸塩に対する「Ｕ」、デオキシチミジル酸塩に対する「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対する「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対する「Ｙ」、ＧまたはＴに対する「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対する「Ｈ」、イノシンに対する「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対する「Ｎ」。
【００６１】
ポリヌクレオチドは、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態でのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはその混合物の１つもしくは複数のセグメントから構成されてもよい。
【００６２】
「遺伝子」は、特異的タンパク質を発現する核酸断片を示し、また、単独でコード領域を示すか、またはコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびそれに後続する調節配列（３’非コード配列）を含んでもよい。「天然遺伝子」は、それ固有の調節配列とともに天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、調節およびコード配列（共に天然に見出されない）を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される場合と異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその天然の位置での天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された遺伝子、天然宿主内部の新しい位置に導入された遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでもよい。
【００６３】
用語「天然ヌクレオチド配列」は、宿主微生物において通常見出されるヌクレオチド配列を示す。
【００６４】
用語「非天然ヌクレオチド配列」は、宿主微生物において通常見出されないヌクレオチド配列を示す。
【００６５】
用語「天然ポリペプチド」は、宿主微生物において通常見出されるポリペプチドを示す。
【００６６】
用語「非天然ポリペプチド」は、宿主微生物において通常見出されないポリペプチドを示す。
【００６７】
用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、遺伝子が転写および翻訳の機序を通じてアミノ酸配列を生成するプロセスを示す。
【００６８】
用語「コード配列」は、特異的なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００６９】
「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与える。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’未翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含んでもよい。
【００７０】
用語「発現カセット」は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現にとって必要とされる、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）および後続する調節配列（３’非コード配列）と、を含むＤＮＡの断片を示す。したがって、発現カセットは、典型的には、１）プロモーター配列；２）コード配列（すなわちＯＲＦ）、および３）真核生物では通常ポリアデニル化部位を有する、３’未翻訳領域（例えばターミネーター）、から構成される。発現カセットは通常、ベクター内部に含まれ、クローニングおよび形質転換を促進する。細菌、酵母、および真菌を含む異なる生物は、正確な調節配列が各宿主に対して使用される限り、異なる発現カセットで形質転換されうる。
【００７１】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸分子の宿主生物への導入を示す。核酸分子は、例えば自己複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込んでよい。核酸断片で形質転換された宿主生物は、「組換え体」または「形質転換」生物または「形質転換体」と称される。「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸断片の、宿主生物のゲノム（核およびオルガネラゲノムの双方を含む）への導入を示す。それに対し、「一過性形質転換」は、組み込みを伴わない遺伝子発現または安定な遺伝的形質をもたらす、核酸断片の、宿主生物の核、またはＤＮＡを有するオルガネラへの導入を示す。
【００７２】
「コドンの縮退」は、ヌクレオチド配列の変異を許容し、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に効果を及ぼすことのない、遺伝コードにおける性質を示す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において、特異的な宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、遺伝子を宿主細胞内での改善された発現を意図して合成する場合、遺伝子を、そのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように設計することは望ましい。
【００７３】
用語「機能的に等価である小断片」および「機能的に等価な小断片」は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、遺伝子発現を改変するかまたは特定の表現型を生成する能力が、断片または小断片が活性酵素をコードするか否かに無関係に保持される場合の単離核酸断片の一部または部分配列を示す。キメラ遺伝子は、核酸断片またはその小断片に、それが活性酵素をプロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向でコードするか否かに無関係に結合することにより、抑制的な使用を意図して設計してもよい。
【００７４】
用語「保存ドメイン」または「モチーフ」は、進化的に関連したタンパク質の整列された配列に沿った特異的位置で保存されるアミノ酸セットを意味する。他の位置でのアミノ酸が相同性タンパク質間で変異しうる一方、特異的位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須であるアミノ酸を示す。
【００７５】
用語「実質的に類似した」および「実質的に相当する」は、本明細書中で交換可能に使用される。それらは、１つもしくは複数のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片の、遺伝子発現を媒介するかまたは特定の表現型を生成する能力に影響を与えない場合の核酸断片を示す。これらの用語はまた、得られた核酸断片の機能特性を初期の未修飾断片に対して実質的に改変しない、１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾を示す。したがって、本発明が、特定の典型的な配列以上のものを包含することは、当業者が理解するように理解されている。さらに、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した核酸配列がまた、（中等度にストリンジェントな条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ（標準のクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、６０℃）で、本明細書中に例示される配列または本明細書で開示されるヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズするそれらの能力によって規定され、本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に等価であることを理解している。ストリンジェンシー条件を調節し、中等度に類似した断片、例えば遠縁生物由来の相同性配列、高度に類似した断片、例えば近縁生物由来の機能酵素を複製する遺伝子についてスクリーニングすることが可能である。ハイブリダイゼーション後洗浄により、ストリンジェンシー条件が決定される。
【００７６】
用語「選択的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、核酸配列の、特異的な核酸標的配列に対する、非標的核酸配列や実質的に排除した（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ）非標的核酸に対するそのハイブリダイゼーションの場合に比べて検出可能により大きい程度（例えばバックグラウンドより少なくとも２倍大きい）でのハイブリダイゼーションへの言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、ヌクレオチド配列の一方の相補体が、典型的には、他方のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％を含むそれ以下の配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する場合の２つのヌクレオチド配列である。
【００７７】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズすることになる条件への言及を含む。プローブは、典型的には、検出されるべき核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出されるべき核酸配列に対して「ハイブリダイズ可能」である。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満、場合により、５００ヌクレオチド長未満である。
【００７８】
ハイブリダイゼーション方法は、十分に定義されている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される。これは、プローブおよび試料を、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下で接触させることを含む。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい。核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイフォーマットに適用可能である。最適なものの１つが、サンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチ型アッセイの主要構成要素が、固体支持体である。固体支持体は、未標識でかつ配列の一部に相補的である固定化核酸プローブを、それに吸着させるかまたはそれに共有結合させている。
【００７９】
ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下で異なることになる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、標的配列は、プローブに対して１００％相補的である（相同プロービング）と同定されうる。あるいは、ストリンジェンシー条件を調節し、配列における、類似性の程度がより低いことが検出されるような一部の不一致（異種プロービング）が許容されうる。
【００８０】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ 未満のＮａイオン、典型的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、かつ、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）に対して少なくとも約６０℃であるような場合となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって得られうる。典型的な低いストリンジェンシー条件は、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および、５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄、を含む。典型的な中等度のストリンジェンシー条件は、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および、５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣでの洗浄、を含む。典型的な高いストリンジェンシー条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および、６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄、を含む。
【００８１】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、ここで重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおいては、熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４頁（１９８４年）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％形式）−５００／Ｌ（式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％形式はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、かつＬは塩基対でのハイブリッドの長さである）の方程式から概算可能である。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全一致プローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。Ｔｍは、不一致の各１％につき約１℃低下することから、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節することで、所望される同一性を有する配列とのハイブリダイズが可能である。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃低下しうる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列およびその相補体において、Ｔｍより約５℃低いように選択される。しかし、厳密にストリンジェントな条件では、Ｔｍより１、２、３、もしくは４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が利用可能であり；中等度にストリンジェントな条件では、Ｔｍより６、７、８、９、もしくは１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が利用可能であり；低いストリンジェンシー条件では、Ｔｍより１１、１２、１３、１４、１５、もしくは２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が利用可能である。当業者は、方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望されるＴｍを用い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に説明されることを理解するであろう。所望される不一致の程度により、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）より低いＴｍが得られる場合、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ」、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ２ 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｈａｐｔｅｒ ２、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５年）において見出される。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０、もしくは２４０分間適用してもよい。
【００８２】
核酸またはポリペプチド配列との関連での「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウインドウ上の最大一致性（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）について整列される場合に同じである２つの配列間での核酸塩基またはアミノ酸残基を示す。
【００８３】
したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を示し、ここで比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントについて、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を判定し、合致する位置の数を出し、合致した位置の数を、比較のウインドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を出すことにより計算される。パーセント配列同一性の有用例として、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数の百分率が挙げられる。これらの同一性は、本明細書中に記載のプログラムのいずれかを用いて決定されうる。
【００８４】
配列アラインメントおよびパーセント同一性または類似性の計算は、限定はされないが、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を含む相同性配列を検出するように設計された種々の比較方法を用いて判定されうる。本願の関連の中で、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、他に規定がなければ、分析の結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことになることは理解されるであろう。本明細書で使用される「デフォルト値」は、最初に初期化される場合に最初にソフトウェアに読み込まれる任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。
【００８５】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと称されるアラインメント法に対応し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））において見出される。複数のアラインメントにおいては、デフォルト値は、ギャップペナルティ＝１０およびギャップ長ペナルティ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法を用いる、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよびパーセント同一性の計算におけるデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸においては、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ギャップペナルティ＝５、ウインドウ＝４およびダイアゴナルズセイブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム中の「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見ることにより「パーセント同一性」を得ることが可能である。
【００８６】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと称されるアラインメント法に対応し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、上記；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、上記で記載）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））において見出される。複数のアラインメントにおけるデフォルトパラメータは、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイ・ディバージェン配列（Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジション・ウェイト（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質重み行列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ）、ＤＮＡ重み行列（Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢに相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００８７】
「アラインメントのＢＬＡＳＴＮ法」は、デフォルトパラメータを使用してヌクレオチド配列を比較するための、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））によって提供されるアルゴリズムである。
【００８８】
配列同一性の多数のレベルが、同一または類似の機能または活性を有するポリペプチドを他の種から同定するのに有用であることが当業者により十分に理解されている。パーセント同一性の有用な例として、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数の百分率が挙げられる。確かに、５０％〜１００％の任意の整数、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸同一性は、本発明を説明する上で有用でありうる。また、この単離されたヌクレオチド断片の任意の完全長または部分的相補体は興味深い。
【００８９】
したがって、本発明は、本明細書で開示される特定の典型的なヌクレオチド配列以上のものを包含する。例えば、遺伝コードの縮退に反映する、遺伝子配列における改変が考慮される。また、所与の部位での化学的に等価なアミノ酸の生産をもたらすが、コードされたタンパク質の機能特性に作用しない、遺伝子における改変が一般的であることは当該技術分野で周知である。置換は、次の５つの基のうちの１つの中での変化として、本明細書中の考察において定義されている。
１． 小さい脂肪族、非極性またはやや極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２． 極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３． 極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４． 大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５． 大きい芳香族性残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００９０】
したがって、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸におけるコドンは、別のより疎水性が低い残基（グリシンなど）またはより疎水性が高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されうる。同様に、１つの負に帯電した残基と別の残基（例えばアスパラギン酸とグルタミン酸）との置換または１つの正に帯電した残基と別の残基（例えばリジンとアルギニン）との置換をもたらす変化はまた、機能的に等価な生成物を生成することが想定されうる。さらに、多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部の改変をもたらすヌクレオチド変化は、タンパク質の活性を改変することが想定されないことになる。
【００９１】
提起される修飾の各々は、コードされた生成物の生物学的活性の保持を決定づけるものとして、十分に当業者の理解の範囲内にある。さらに、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した配列がまた、上で規定されたように、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって規定されることを理解している。
【００９２】
本発明の好ましい実質的に類似した核酸断片は、ヌクレオチド配列が、本明細書中に報告される核酸断片のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、本明細書中に報告される核酸断片のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一である。本明細書中に報告される核酸断片のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である核酸断片が最も好ましい。
【００９３】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、そのポリペプチドまたは遺伝子を、当業者による配列のマニュアル評価か、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用するコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって推定的に同定するための、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に対して相同なものとして推定的に同定するため、１０以上の隣接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定の配列依存的方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列依存的方法で使用してもよい。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用してもよい。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するため、配列を十分に含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書中に報告される配列の便益を有する当業者は、ここでは、当業者に既知の目的のため、開示される配列の全部または実質的部分を使用できる。
【００９４】
用語「相補的」は、逆平行方向に整列される場合にワトソン−クリック型塩基対を形成する能力を有する２つのヌクレオチド塩基の配列間の関係について説明する。例えば、ＤＮＡに関しては、チミンおよびシトシンと塩基対を形成する能力を有するアデノシンは、グアニンと塩基対を形成する能力を有する。したがって、本発明では、添付の配列表および本明細書において報告される完全な配列ならびにそれらの実質的に類似した核酸配列に対して相補的な単離された核酸分子を使用することができる。
【００９５】
用語「単離される」は、少なくとも１つの成分から取り出されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列（それら成分と天然に関連する）を示す。
【００９６】
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御する能力を有するＤＮＡ配列を示す。プロモーター配列は、近位の上流因子とより遠位の上流因子からなり、ここで後者の因子は、エンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激しうるＤＮＡ配列であり、プロモーターに固有の因子またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を促進するように挿入される異種因子でありうる。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞種において、または異なる発生の段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を駆動しうることは、当業者によって理解されている。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に画定されていないことから、いくつかの変異のあるＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうることは理解されている。ほとんどの時期に大部分の細胞種において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００９７】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」および「終結配列」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列および他の配列を含む、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化シグナルは通常、ポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に作用することによって特徴づけられる。
【００９８】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方による作用を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を示す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に作用可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結されうる。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側または標的ｍＲＮＡの３’側または標的ｍＲＮＡ内部に、直接的または間接的に作動可能に連結されうるか、あるいは最初の相補的領域は、標的ｍＲＮＡに対し、５’側であり、かつその相補体は、３’側である。
【００９９】
本明細書で使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）においてより十分に記載されている。形質転換方法は、当業者に周知であり、以下に記載される。
【０１００】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特異的ＤＮＡセグメントを合成するための技術であり、一連の反復サイクルからなる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））。典型的には、二本鎖ＤＮＡは、熱変性され、標的セグメントの３’側境界に相補的な２つのプライマーは、低温でアニールされ、次いで中温で伸長される。これら３つの連続ステップ一式は、「サイクル」と称される。
【０１０１】
「プラスミド」または「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を有することが多く、また通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をなす、染色体外因子である。かかる因子は、任意の供給源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってもよく、ここでは、多数のヌクレオチド配列が、発現カセットを細胞に導入することができる特有の作成物に結合または再結合されている。
【０１０２】
用語「遺伝的に改変される」は、遺伝子工学、形質転換および／または突然変異によって遺伝材料を変化させるプロセスを示す。
【０１０３】
用語「組換え体」は、例えば、化学合成または核酸の単離されたセグメントの遺伝子工学技術による操作による、配列の他の場合には分離された２つのセグメントの人工的組み合わせを示す。「組換え体」はまた、異種核酸の導入によって修飾されている細胞またはベクター、またはそのように修飾された細胞由来の細胞への言及を含むが、意図的なヒトの介入を伴わずに生じるものなど、天然事象（例えば、自発的突然変異、自然形質転換、自然形質導入、自然転位）による細胞またはベクターの改変を包含しない。
【０１０４】
用語「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書中で交換可能に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片、例えば共に天然に見出されない調節およびコード配列の人工的組み合わせを含む。例えば、組換えコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される場合と異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでもよい。かかるコンストラクトは、単独で使用するか、またはベクターと併用してもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知の、宿主細胞を形質転換するために用いられることになる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用してもよい。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功させるため、ベクター上に存在する必要がある遺伝的要素について十分に理解している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が異なるレベルおよびパターンの発現をもたらす場合があり（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８頁（１９８５年）；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６頁（１９８９年））、それ故、所望される発現レベルおよびパターンを示す系統を得るため、複数の事象のスクリーニングが必要な場合があることを理解するであろう。かかるスクリーニングは、特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析により、行ってもよい。
【０１０５】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、機能最終産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆体または成熟体のいずれか］）の生産を示す。
【０１０６】
用語「導入される」は、核酸（例えば発現コンストラクト）またはタンパク質を細胞に提供することを意味する。導入されるは、核酸が細胞のゲノムに組み込み可能である場合の、核酸の真核または原核生物細胞への組み込みへの言及を含み、また、核酸またはタンパク質の細胞への一過性の供給（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）への言及を含む。導入されるは、安定な形質転換方法または一過性形質転換方法、ならびに性的交配（ｓｅｘｕａｌｌｙ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）への言及を含む。したがって、核酸断片（例えば、組換えコンストラクト／発現コンストラクト）の細胞への挿入に関連した「導入される」は、「形質移入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、また、核酸断片が、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自己レプリコンに変換されるか、または一過性発現（例えば形質移入ｍＲＮＡ）されうる場合、核酸断片の真核または原核生物細胞への組み込みへの言及を含む。
【０１０７】
用語「相同な」は、同様の触媒機能を有する、共通の進化上の起源のタンパク質またはポリペプチドを示す。本発明は、組換え技術によって相同性タンパク質を生産する細菌を含んでもよい。
【０１０８】
組換え細菌であって、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列；フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え細菌が本明細書で開示される。これらのヌクレオチド配列はそれぞれ、同じかまたは異なるプロモーターに作動可能に連結される。これらの組換え細菌は、スクロースを代謝し、グリセリンおよび／またはグリセリン由来生産物、例えば１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有する。グリセリンおよび／またはグリセリン由来生産物を生産する能力を有する細菌株は、本明細書中、下記のように、高度に改変された株である。
【０１０９】
本明細書で開示される組換え細菌の作成における使用に適した宿主細菌は、限定はされないが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、の生物を含む。
【０１１０】
一実施形態では、宿主細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、およびアエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属から選択される。
【０１１１】
別の実施形態では、宿主細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【０１１２】
一部の実施形態では、宿主細菌は、ＰＴＳ陰性である。これらの実施形態では、宿主細菌は、その天然状態でＰＴＳ陰性であるか、または下記のように、ＰＴＳ遺伝子の不活性化を通じてＰＴＳ陰性にされる場合がある。
【０１１３】
生成微生物においては、場合により、糖類の輸送および輸送されている糖類のリン酸化のためのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の使用と分けることが望ましい。
【０１１４】
用語「下方制御される」は、活性タンパク質の活性の、野生型タンパク質の活性と比較した場合の低下または除去を示す。ＰＴＳは、このタイプの輸送において必要とされるタンパク質をコードする１つもしくは複数の内因性遺伝子の発現を下方調節することにより、不活性化されうる（「ＰＴＳ陰性」生物をもたらす）。下方調節は、典型的には、１つもしくは複数のこれらの遺伝子が、その遺伝子の一部の内部での挿入、欠失、または標的化された突然変異に関して「破壊」を有することで、遺伝子がゲノムから欠失されかつタンパク質が全く翻訳されないような完全な遺伝子ノックアウトか、またはタンパク質が、挿入、欠失、アミノ酸置換もしくは他の標的化された突然変異を有する程度に翻訳されていないという結果をもたらす場合に生じる。タンパク質における破壊の位置は、例えば、タンパク質のＮ末端部内またはタンパク質のＣ末端部内でありうる。破壊されたタンパク質は、破壊されていないタンパク質に対して低下した活性を有することになり、非機能的でありうる。また、タンパク質の発現の低下または欠如をもたらす下方調節であれば、調節配列、転写および翻訳因子、ならびに／またはシグナル形質導入経路を操作することによるか、あるいはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術などの使用により、生じうる。
【０１１５】
スクローストランスポーターポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、スクロースの微生物細胞への輸送を媒介する能力を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体である。スクロース輸送ポリペプチドおよびポリペプチド複合体は、上記のように既知である。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドの例として、限定はされないが、遺伝子ＣｓｃＢ（配列番号２３で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号２４で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型株ＥＣ３１３２由来のＣｓｃＢ；遺伝子ｃｓｃＢ（配列番号２５で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号２６で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１３２８１由来のＣｓｃＢ；ならびに、遺伝子ｃｓｃＢ（配列番号２７で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号２８で示される）ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）由来のＣｓｃＢ、が挙げられる。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体の例として、限定はされないが、遺伝子ｓｕｓＴ１（配列番号２９で示されるコード配列）、ｓｕｓＴ２（配列番号３１で示されるコード配列）、およびｓｕｓＸ（配列番号３３で示されるコード配列）によってコードされる、配列番号３０、３２、および３４によって示される３つのポリペプチドサブユニットを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株ＴＩＧＲ４由来のスクロースＡＢＣ型トランスポーター複合体；ならびに、遺伝子ｍａｌＥ（配列番号３５で示されるコード配列）、ｍａｌＦ（配列番号３７で示されるコード配列）、ｍａｌＧ（配列番号３９で示されるコード配列）、およびｍａｌＫ（配列番号４１で示されるコード配列）によってそれぞれコードされる、配列番号３６、３８、４０、および４２で示される４つのポリペプチドサブユニットを含む、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のマルトーストランスポーター複合体、が挙げられる。
【０１１６】
一実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１１７】
別の実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット；配列番号３２で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット；および、配列番号３４で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット、を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット；配列番号３８で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット；配列番号４０で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット；および、配列番号４２で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第４のサブユニット、を含む。
【０１１９】
別の実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、配列番号２６で示されるアミノ酸配列に実質的に相当する。
【０１２０】
フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４と称される）およびフルクトースリン酸化活性を有する様々なヘキソースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３およびＥＣ２．７．１．１）を含む。フルクトースリン酸化活性は、ヘキソキナーゼおよびケトヘキソキナーゼによって示されうる。種々の微生物由来のポリペプチドをコードする代表的な遺伝子は、本明細書で開示される組換え細菌の作成に使用可能であり、表１中に列挙される。当業者は、（例えば表１中に列挙される遺伝子によってコードされる）フルクトースをリン酸化可能なタンパク質に実質的に類似したタンパク質も使用可能であることを理解するであろう。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
一実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号８５、または配列番号８７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１２３】
別の実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４８で示される配列に実質的に相当する。
【０１２４】
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、スクロースの加水分解を触媒し、フルクトースおよびグルコースを生産する能力を有する。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、上記のように既知であり、また、限定はされないが、遺伝子ＣｓｃＡ（配列番号５５で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号５６で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型株ＥＣ３１３２由来のＣｓｃＡ、遺伝子ｃｓｃＡ（配列番号５７で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号５８で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１３８２１由来のＣｓｃＡ；遺伝子ｂｆｒＡ（配列番号５９で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６０で示される）ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）株ＤＳＭ１０１４０Ｔ由来のＢｆｒＡ；遺伝子ＳＵＣ２（配列番号６１で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６２で示される）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳｕｃ２ｐ；遺伝子ｓｃｒＢ（配列番号６３で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６４で示される）コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＳｃｒＢ；（配列番号６６で示される）ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ２０１９３由来のスクロースホスホリラーゼ（配列番号６５で示される遺伝子をコードするコード配列）；ならびに、遺伝子ｓｕｃＰ（配列番号６７で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６８で示される）ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＤＳＭ２００８３由来のスクロースホスホリラーゼ、が挙げられる。
【０１２５】
一実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１２６】
別の実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５８で示されるアミノ酸配列に実質的に相当する。
【０１２７】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列を使用し、相同性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、同じかまたは他の微生物種から単離することが可能である。例えば、遺伝子の相同体は、公的に利用可能な核酸配列データベースを探索するための配列分析ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮを使用して同定してもよい。さらに、配列依存性プロトコルを用いての相同性遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例として、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに、核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ， Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、１０７４頁、１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２頁（１９９２年））の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられる。例えば、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、相同性を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。
【０１２８】
当業者は、他の供給源から単離されたこれらのポリペプチドをコードする遺伝子が、本明細書で開示される組換え細菌においても使用可能であることを理解するであろう。さらに、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における変異は、コドンの縮退により、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく施すことができ、その上、実質的に類似したタンパク質を生成するアミノ酸置換、欠失または付加は、コードされたタンパク質に含めてもよい。
【０１２９】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照）および所望される配列（この配列が既知である場合）に結合する（ｂｏｕｎｄ）ように設計されたプライマーを使用し、単離してもよい。例えば、変性プライマーまたは異種プローブハイブリダイゼーションを使用することによる遺伝子単離の他の方法は、当業者に周知である。ヌクレオチド配列はまた、化学的に合成するか、またはＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）などのベンダーから購入してもよい。さらに、ｃｓｃオペロン全体は、本明細書中の実施例１に詳述のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ１３２８１のゲノムＤＮＡから単離してもよい。
【０１３０】
ポリペプチドの発現は、当業者に既知の多くの方法のうちの１つを用いて行ってもよい。例えば、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細菌に、少なくとも１つのマルチコピープラスミド上に、またはコード配列の１つもしくは複数のコピーを宿主ゲノムに組み込むことにより、導入してもよい。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、宿主細菌に、別々に（例えば、別々のプラスミド上に）、または任意の組み合わせで（例えば、本明細書中の実施例に記載のように、単一のプラスミド上に）導入してもよい。宿主細菌がポリヌクレオチドのうちの１つをコードする遺伝子を有する場合、残りのヌクレオチド配列のみが細菌に導入される必要がある。例えば、宿主細菌がフルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する場合、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のみを細菌に導入し、スクロース利用を可能にする必要がある。プラスミド上またはゲノム内のいずれかに存在する導入されたコード領域は、少なくとも１つの活性の高いプロモーターから発現されうる。組み込まれたコード領域は、キメラ遺伝子（それ自身のプロモーターを有する）の一部として導入するか、あるいは、ゲノムに対して内因性であるかまたは高度に発現されたオペロン内の活性の高いプロモーターに隣接するように組み込んでもよい。好適なプロモーターとして、限定はされないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現にとって有用）、ならびに、ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現にとって有用）が挙げられる。プロモーターはまた、Ｐａｙｎｅらによって記載の（米国特許第７，１３２，５２７号明細書）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモーターまたはその変異体であってもよい。
【０１３１】
一実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、グリセリンを生産する能力を有する。炭水化物または糖類を使用してグリセリンを調製するための生物学的プロセスは、酵母および一部の細菌、他の真菌、および藻類において既知である。細菌および酵母の双方は、解糖系においてフルクトース−１，６−二リン酸経路を通じてグルコースまたは他の炭水化物を変換することにより、グリセリンを生産する。本明細書で開示されるグリセリンを生産する方法においては、グリセリンを天然に生成する宿主細菌を使用してもよい。さらに、細菌は、グリセリンおよびグリセリン誘導体を生成するように改変してもよい。種々の基質からのグリセリン生成能は、米国特許第７，００５，２９１号明細書中に記載のように、グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）および／またはグリセリン−３−ホスファターゼの酵素活性の発現を通じて提供されうる。宿主細菌における酵素活性の発現のために使用可能なこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、米国特許第７，００５，２９１号明細書中に記載されている。グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の好適例として、限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＤ１（配列番号１で示されるコード配列、配列番号２で示されるコードされたタンパク質配列）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＤ２（配列番号３で示されるコード配列、配列番号４で示されるコードされたタンパク質配列）が挙げられる。グリセリン−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の好適例として、限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＰ１（配列番号５で示されるコード配列、配列番号６で示されるコードされたタンパク質配列）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＰ２（配列番号７で示されるコード配列、配列番号８で示されるコードされたタンパク質配列）が挙げられる。
【０１３２】
グリセリンの生産の増大は、標的内因性遺伝子の発現の低下を通じてなされうる。グリセリンキナーゼおよびグリセリンデヒドロゲナーゼ活性をコードする内因性遺伝子の下方調節は、米国特許第７，００５，２９１号明細書中に記載のように、グリセリンの生産をさらに促進する。炭素のグリセリンへのチャネリングの増大は、米国特許第７，３７１，５５８号明細書中に記載のように、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子の発現を低下させることによってなされうる。下方調節は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えばＰＴＳ系の遺伝子の下方調節についての上記の方法を用いることによってなされうる。
【０１３３】
グリセリンは、有用な生成物の微生物生成のための基質を提供する。かかる生成物、すなわちグリセリン誘導体の例として、限定はされないが、３−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサル、１，２−プロパンジオール、および１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【０１３４】
別の実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、１，３−プロパンジオールを生産する能力を有する。グリセリン誘導体１，３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の生産ならびにポリウレタンおよび環式化合物の製造において潜在的有用性を有する単量体である。１，３−プロパンジオールは、米国特許第５，６８６，２７６号明細書に記載のように、単一の微生物により、グリセリンまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基質の生物変換によって生成してもよい。この生物変換においては、グリセリンは、上記のように炭素基質から生成される。グリセリンは、宿主細菌によってコードされうるかまたは組換えによって宿主に導入されうるデヒドラターゼ酵素により、中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。デヒドラターゼは、グリセリンデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）、またはこの変換を触媒可能な任意の他の酵素であってもよい。グリセリンデヒドラターゼの「α」（アルファ）、「β」（ベータ）、および「γ」（ガンマ）サブユニットをコードする遺伝子の好適例として、限定はされないが、ｄｈａＢ１（配列番号９で示されるコード配列）、ｄｈａＢ２（配列番号１１で示されるコード配列）、およびｄｈａＢ３（配列番号１３で示されるコード配列）（それぞれ、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来）が挙げられる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオール（ｐｒｏｐａｎｄｅｉｏｌ）へのさらなる変換は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の好適例は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＴである（配列番号６９で示されるコード配列、配列番号７０で示されるコードされたタンパク質配列）。
【０１３５】
細菌は、組換え操作により、グリセリンおよびグリセリン誘導体１，３−プロパンジオールのより効率的な生産をもたらしうる。例えば、米国特許第７，００５，２９１号明細書は、グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセリン−３−リン酸ホスファターゼの一方もしくは双方の外因性活性を発現する一方、グリセリンキナーゼおよびグリセリンデヒドロゲナーゼの一方もしくは双方の内因性活性を破壊することから得られる利点を有する、グリセリンおよび１，３−プロパンジオールを生産するための形質転換微生物および方法を開示している。
【０１３６】
米国特許第６，０１３，４９４号明細書は、外因性のグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン−３−リン酸ホスファターゼ、デヒドラターゼ、および１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（例えば、ｄｈａＴ）を含む単一の微生物を使用する、１，３−プロパンジオールを生産するためのプロセスについて記載している。米国特許第６，１３６，５７６号明細書は、デヒドラターゼおよびタンパク質Ｘ（後にデヒドラターゼ再活性化因子ペプチドであることが同定された）をさらに含む組換え微生物を含む、１，３−プロパンジオールを生産するための方法を開示している。
【０１３７】
米国特許第６，５１４，７３３号明細書は、タイター（生成物のグラム／リットル）における有意な増加が、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに変換するための（ｄｈａＴによってコードされる１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼと区別される）非特異的触媒活性によって得られる場合の、プロセスに対する改善について記載している。さらに、米国特許第７，１３２，５２７号明細書は、１，３−プロパンジオールの生産にとって有用なベクターおよびプラスミドを開示している。
【０１３８】
１，３−プロパンジオールの生産の増大は、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載のように、一部の標的遺伝子の発現を下方調節し、かつその他の標的遺伝子の発現を上方調節するなど、宿主細菌に対するさらなる修飾によって達成されうる。ＰＴＳ陰性宿主における炭素源としてのグルコースの利用においては、グルコキナーゼ活性の発現が増大しうる。
【０１３９】
発現の増大または上方調節が１，３−プロパンジオールの生産を増大させる、追加的な遺伝子は、
・典型的にはＥＣ４．１．１．３１として特徴づけられるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
・典型的にはＥＣ２．５．１．１７として特徴づけられるＣｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ
・３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒するのに十分な非特異的触媒活性
をコードする遺伝子を含み、また詳細には、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを除外し、典型的には、これらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。
【０１４０】
発現の低下または下方制御が１，３−プロパンジオールの生産を増大させる、遺伝子は、
・好気的呼吸制御タンパク質
・メチルグリオキサルシンターゼ
・酢酸キナーゼ
・ホスホトランスアセチラーゼ
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ
・トリオースリン酸イソメラーゼ
・ホスホグルコン酸デヒドラターゼ
をコードする遺伝子を含む。
【０１４１】
別の実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有する。３−ヒドロキシプロピオン酸は、特殊合成（ｓｐｅｃｉａｌｔｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）としての有用性を有し、化学工業における既知の技術によって商業上重要な中間体に、例えば、脱水によってアクリル酸に、酸化によってマロン酸に、アルコールとのエステル化反応によってエステルに、また還元によって１，３−プロパンジオールに変換されうる。３−ヒドロキシプロピオン酸は、同時係属中の共同所有される米国特許出願第６１／１８７４７６号明細書に記載のように、単一の微生物により、発酵性炭素源から生物学的に生産されうる。１つの代表的な生合成経路においては、炭素基質は、１，３−プロパンジオールの生産について先に記載のように、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼにより、３−ヒドロキシプロピオン酸に変換される。アルデヒドデヒドロゲナーゼの好適例として、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＢ（配列番号１５で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＢ（配列番号１６）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＡ（配列番号１７で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＡ（配列番号１８）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＨ（配列番号１９で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＨ（配列番号２０）、が挙げられる。
【０１４２】
また、組換え細菌によって１，３−プロパンジオールの生産を改善するための上記の修飾の多くを行うことにより、３−ヒドロキシプロピオン酸の生産を改善することが可能である。例えば、グリセリンキナーゼの除去により、Ｇ３Ｐホスファターゼの作用によってＧ３Ｐから形成されるグリセリンが、ＡＴＰを消費してＧ３Ｐに再変換されることが阻止される。また、グリセリンデヒドロゲナーゼ（例えば、ｇｌｄＡ）の除去により、ＮＡＤ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってＤＨＡＰから形成されるグリセリンが、ジヒドロキシアセトンに変換されることが阻止される。突然変異は、酵素活性の活性を阻害または改善するように、構造遺伝子に対して特異的であるか、あるいは、酵素活性の発現レベルを調節するように、プロモーター領域およびリボソーム結合部位を含む調節遺伝子に対して特異的でありうる。
【０１４３】
上方調節または下方調節は、当業者に既知の種々の方法によって行ってもよい。遺伝子の上方調節または下方調節が、その遺伝子によってコードされるタンパク質に由来する、細胞内に存在する活性のレベルの、活性の（例えば、対応する（または非改変）野生型遺伝子によってコードされるタンパク質の活性による）対照レベルに対しての改変を示すことは十分に理解されている。
【０１４４】
酵素経路に関与する特異的遺伝子は、上方調節により、それらのコードされた機能の活性を高めることが可能である。例えば、選択された遺伝子の追加的なコピーを、ｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミド上の宿主細胞に導入してもよい。また、かかる遺伝子を、そのコードされた機能の活性の増大をもたらす適切な調節配列を有する染色体に組み込んでもよい。標的遺伝子は、非天然プロモーターまたは改変された天然プロモーターの制御下に置かれるように、修飾してもよい。内因性プロモーターは、突然変異、欠失、および／または置換により、インビボで改変してもよい。
【０１４５】
あるいは、特定の遺伝子の発現を、所与の活性レベルに対し、低下させるかまたは失わせることは有用でありうる。遺伝子を下方調節する（破壊する）方法は、当業者に既知である。
【０１４６】
下方調節は、コード領域および／または調節（プロモーター）領域の欠失、挿入、または改変により生じうる。特異的な下方調節は、ランダム突然変異とそれに続くスクリーニングまたは選択により、あるいは、遺伝子配列が既知である場合、当業者に既知の分子生物学的方法による直接的介入により、得ることができる。限定はされないが、特に有用である下方調節を行うための方法は、プロモーター長を変更することである。
【０１４７】
さらに、遺伝子発現の下方調節を用い、目的のタンパク質の発現を阻止するか、または非機能的なタンパク質の発現をもたらすことが可能である。これは、例えば、１）コード領域および／または調節（プロモーター）領域を欠失させ、２）外因性核酸配列をコード領域および／調節（プロモーター）領域に挿入し、また３）コード領域および／または調節（プロモーター）領域を（例えば、ＤＮＡ塩基対変化を行うことにより）改変することにより、行ってもよい。特異的な破壊は、ランダム突然変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって得ることができるか、あるいは、特異的な破壊は、遺伝子配列が既知である場合、当業者に既知の（ｋｎｏｗ）分子生物学的方法を用いる直接的介入により、得ることができる。特に有用な方法は、大量のコード領域および／または調節（プロモーター）領域の欠失である。
【０１４８】
組換えタンパク質の発現を改変する方法は、当業者に既知であり、Ｂａｎｅｙｘ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９年）１０：４１１頁；Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８年）１８０：５３７５頁；ｄｅＨａｓｅｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８年）１８０：３０１９頁；ＳｍｏｌｋｅおよびＫｅａｓｌｉｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００２年）８０：７６２頁；Ｓｗａｒｔｚ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１年）１２：１９５頁；およびＭａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２年）１８４：５７３３頁において一部考察がなされている。
【０１４９】
上記のように、グリセリンおよびグリセリン誘導体を含む微生物生成物の生産における、スクロースを代謝するための遺伝子発現における必要な変化を有する組換え細菌は、当該技術分野で周知の技術（その一部は本明細書の実施例において例示される）を用いて作成してもよい。
【０１５０】
本明細書で開示される組換え細菌の作成は、好適な宿主微生物におけるグリセリンおよびその誘導体の生産においてスクロースの利用能を与える、コード領域のクローニング、形質転換および発現に適した種々のベクターならびに形質転換および発現カセットを使用して行ってもよい。好適なベクターは、使用される細菌に適合しうるものである。好適なベクターは、例えば、細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７もしくはＭ−１３由来ファージなど）、コスミド、酵母または植物に由来しうる。かかるベクターを入手し、使用するプロトコルは、当業者に既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。
【０１５１】
所望される宿主細菌において本発明におけるコード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは、極めて多数存在し、当業者にとって周知である。発現を駆動する能力を有する仮想的に任意のプロモーターは、本明細書での使用に適している。例えば、上掲のプロモーターのいずれかを使用してもよい。
【０１５２】
終結制御領域もまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子に由来しうる。場合により、終結部位は不要でありうるが、それは含められる場合が最も好ましい。
【０１５３】
本ポリペプチドの有効な発現においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを介して選択された発現制御領域に作動可能に連結される。
【０１５４】
米国特許第７，３７１，５５８号明細書中に記載のベクターｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、およびｐＳＹＣＯ１０９、および米国特許第７，５２４，６６０号明細書中に記載のｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯは、本発明において得に有用である。これらのベクターの本質的要素は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたｄｈａレギュロンに由来する。各ベクターは、３つの別々のオペロン内に配列されたオープンリーディングフレームｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、ｄｈａＸ（配列番号７１で示されるコード配列）、ｏｒｆＸ、ＤＡＲ１、およびＧＰＰ２を有する。ｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、ｐＳＹＣＯ１０９、およびｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯのヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、および配列番号７６で示される。ベクター間の差異は、下の表中に図示される［接頭辞「ｐ−」は、プロモーターを示し、各「（ ）」内に含まれるオープンリーディングフレームは、オペロンの組成物を示す］：
ｐＳＹＣＯ１０１（配列番号７２）：
他の２つの経路オペロンに比べて逆方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）
ｐＳＹＣＯ１０３（配列番号７３）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．５の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．５の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）
ｐＳＹＣＯ１０６（配列番号７４）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）
ｐＳＹＣＯ１０９（配列番号７５）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）
ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ（配列番号７６）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）
経路オペロンに比べて逆方向のｐ−１．２０の短い／長いＧＩ（ｓｃｒＫ）
【０１５５】
一旦好適な発現カセットが作成されると、それらを使用し、適切な宿主細菌が形質転換される。コード領域を有するカセットの宿主細菌への導入は、例えば形質転換（例えば、カルシウム透過性細胞またはエレクトロポレーションを用いる）または組換えファージウイルスを用いる形質移入による既知の手順により、行ってもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。発現カセットは、宿主細胞内の安定なプラスミド上で維持されうる。さらに、発現カセットは、当業者に周知のベクターおよび方法を用いる相同またはランダム組換えを通じて宿主細菌のゲノムに組み込んでもよい。発現カセットのゲノム組み込みにおいては、部位特異的組換え系もまた使用可能である。
【０１５６】
例示される細胞に加え、グリセリンおよび／またはその誘導体を含む微生物生成物の生産を促進するように専用設計された単一または複数の突然変異を有する細胞もまた使用可能である。炭素供給原料を非生産的経路に通常的に転換するか、または有意な異化代謝産物抑制を示す細胞は、突然変異を受けることで、これらの表現型の欠損が回避されうる。
【０１５７】
突然変異体を作製する方法は、当該技術分野で一般的でかつ周知である。一部の方法の概要が、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に提示されている。放射線または化学剤を使用して突然変異体を作製するための特定の方法は、当該技術分野で十分に立証されている。例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６、２２７頁（１９９２年）を参照のこと。
【０１５８】
突然変異誘発が生じている上で、所望される表現型を有する突然変異体は、種々の方法によって選択してもよい。ランダムスクリーニングは、突然変異細胞が所望される生成物または中間体を生産する能力について選択される場合に最も一般的である。あるいは、突然変異体の選択的単離は、突然変異集団を、耐性コロニーのみが発生しうる場合の選択培地上で成長させることによって実施可能である。突然変異体の選択方法は、高度に発達し、工業微生物学の当該技術分野で周知である。例えば、Ｂｒｏｃｋ、上記；ＤｅＭａｎｃｉｌｈａら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１４、３１３頁（１９８４年）を参照のこと。
【０１５９】
本発明における発酵培地は、炭素基質としてスクロースを含む。グルコースおよびフルクトースなどの他の炭素基質もまた、存在しうる。
【０１６０】
炭素基質に加え、好適な発酵培地は、培養物の成長ならびにグリセリンおよびその誘導体、例えば１，３−プロパンジオールの生産にとって必要な酵素経路の促進に適した、当業者に既知の、例えば、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有する。１，３−プロパンジオールの生産においては、Ｃｏ（ＩＩ）塩および／またはビタミンＢ１２またはその前駆体に対して特別な注意が払われる。
【０１６１】
アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ１２）は、デヒドラターゼ活性における重要な補因子である。補酵素Ｂ１２の合成は、原核生物において見出され、その一部、例えば、エシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種は、化合物をデノボ合成することができる一方、それ以外は、部分的な反応を行うことができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、コリン環構造を作製できないが、コビナミドのコリノイドへの変換を触媒可能であり、かつ５’−デオキシアデノシル基を導入することができる。したがって、補酵素Ｂ１２前駆体、例えばビタミンＢ１２が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵物に提供される必要があることは当該技術分野で既知である。ビタミンＢ１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵物に一定速度で連続的に添加するか、または細胞塊の生成と一致するように段階分けするか、または単回もしくは複数回ボーラス添加で添加してもよい。
【０１６２】
ビタミンＢ１２は本明細書中に記載の形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に添加されるが、ビタミンＢ１２のデノボ生合成が可能な他の細菌もまた好適な生成細胞になり、かつビタミンＢ１２のこれらの細菌への添加が不要になると考えられる。
【０１６３】
典型的には、細菌細胞は、スクロースを含有する適切な培地中で、２５〜４０℃で成長される。本明細書中での使用に適した成長培地の例として、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）培養液などの一般的な商業的に調製された培地が挙げられる。また、他の限定または合成成長培地を使用してもよく、特定の細菌の成長に適した培地は、微生物学または発酵科学の一部の当業者にとって既知であろう。また、異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られた使用される作用剤、例えば環式アデノシン２’：３’−一リン酸を、反応培地に取り込ませてもよい。同様に、１，３−プロパンジオールの生産の促進をもたらす酵素活性を調節することで知られた使用される作用剤（例えばメチルビオロゲン）を、１，３−プロパンジオール生産株と併せて、またはそれを用いる遺伝子操作の代わりとして使用してもよい。
【０１６４】
発酵に適したｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の間であり、ここでｐＨ６．０〜ｐＨ８．０は、初期条件として典型的である。
【０１６５】
反応は、組換え細菌の要件に依存し、好気性、無酸素、または嫌気性条件下で行ってもよい。流加発酵は、限定されたまたは過剰の、炭素供給物、例えば炭素基質を用いて実施してもよい。
【０１６６】
バッチ発酵は、一般に使用される方法である。古典的なバッチ発酵は、培地の組成物が発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的改変を受けない場合の閉鎖系である。したがって、発酵の開始時、培地には所望される細菌が接種され、発酵では系に何も添加しない事態が許容される。しかし、典型的には、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、またｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、発酵が停止される時間に至るまで常に変化する。バッチ培養物中で、細胞は、静止遅滞期（ｓｔａｔｉｃ ｌａｇ ｐｈａｓｅ）から高い対数増殖期まで、そして最終的に静止期まで抑制され、ここで増殖速度は低下または停止される。未処理の場合、静止期における細胞は最終的に死滅する。対数期における細胞は、一般に最終生成物または中間体の生産の大部分に関与する。
【０１６７】
標準のバッチ系に対する変形は、流加系である。流加発酵プロセスはまた、本明細書中での使用に適しており、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加されること以外では典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や、倍地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合、有用である。流加系における実際の基質濃度の測定は、困難であることから、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて評価されている。バッチおよび流加発酵は、当該技術分野で一般的でかつ周知であり、Ｂｒｏｃｋ、上記において事例を見出すことができる。
【０１６８】
連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、かつ等量のならし培地が処理と同時に除去される場合、開放系である。連続発酵では、細胞が主に対数増殖期にある場合、一般に培養物は一定の高密度で維持される。
【０１６９】
連続発酵では、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を与える１つの要素またはいくつもの要素の調節が許容される。例えば、１つの方法は、限られた栄養素、例えば炭素源または窒素レベルを一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを適度にすることを可能にする。他の系では、増殖に影響を与える多数の要素を連続的に変更することが可能である一方、培地の濁度によって測定される細胞濃度は一定に保持される。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとすることから、培地が除去されることによる細胞消失は、発酵における細胞増殖速度に対して均衡を保つ必要がある。連続発酵プロセスにおける栄養素および増殖因子ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術を調節する方法は、工業微生物学の当該技術分野で周知であり、種々の方法が、Ｂｒｏｃｋ（上記）において詳述される。
【０１７０】
本発明は、バッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、また任意の既知の発酵方法であれば好適となることが考えられる。さらに、細胞を、全細胞触媒としての基質上に固定化し、またグリセリンおよびグリセリン誘導体、例えば１，３−プロパンジオールの生産のための発酵条件下に置くことが可能であると考えられる。
【０１７１】
一実施形態では、グリセリン、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するためのプロセスが提供される。同プロセスは、スクロースの存在下で上記の組換え細菌を培養するステップと、場合により、生産されたグリセリン、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、を含む。生成物は、当該技術分野で既知の方法を用いて回収してもよい。例えば、固体は、遠心分離、濾過、デカンテーション、またはそれに類するものにより、発酵培地から取り出してもよい。次いで、生成物は、蒸留、液体−液体抽出、または膜に基づく分離などの方法を用い、固体を上記のように取り出すように処理されている発酵培地から単離してもよい。
【実施例】
【０１７２】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方、あくまで例示として提供されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認し、かつ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改良を行い、それを様々な用途および条件に適合させることができる。
【０１７３】
一般的方法
実施例に記載される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｎｎａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４年）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる発行（１９８７年）により、記載がなされている。
【０１７４】
細菌培養物の維持および成長に適した材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適した技術は、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４年））中に、またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ 「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）により提示されたものとして見出されうる。細菌細胞の成長および維持について記載のすべての試薬、制限酵素および材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。
【０１７５】
略語の意味は、次の通りである。「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｒｐｍ」は回転毎分を意味し、「ＡＴＣＣ」はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「ｄＨ２Ｏ」は蒸留水を意味する。
【０１７６】
実施例１
ｃｓｃオペロン発現プラスミドの作成
本実施例では、ｃｓｃオペロン発現プラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡおよびｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢの作成について例示する。
【０１７７】
ゲノムＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ１３２８１から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。長さ約４ｋｂｐの断片を、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡアガロースゲル電気泳動によって単離し、プラスミドベクターｐＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））（これも予めＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した）とライゲートした。得られたプラスミドを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａｌｐｈａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を形質転換し、スクロース利用に必要な遺伝子を有する形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙスクロース寒天（Ｄｉｆｃｏ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）製のＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天基材）上での成長によって同定した。プラスミドＤＮＡを、スクロースの代謝能を得たコロニーから単離し、プラスミド（ｐＳｃｒ１と称される；配列番号７７で示される）を、配列決定し、スクロース利用に必要なＤＮＡの領域を同定した。挿入物は、長さ４１４０ｂｐであり、既知の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）スクロース利用遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＡに相同な推定上のオープンリーディングフレームを有した（Ｊａｈｒｅｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０７−５３１６頁、２００２年）。
【０１７８】
その後、以下の手順を用い、ｃｓｃオペロンを、プラスミドｐＢＨＲ１（ＭｏｂｉＴｅｃ ＧｍｂＨ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移した。プラスミドｐＳｃｒ１を、ＸｈｏＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、平滑末端を得た後、ＡｇｅＩで消化した。得られたｃｓｃ遺伝子を有する４１７５ｂｐの断片を、ゲル精製によって単離した。プラスミドｐＢＨＲ１を、ＡｇｅＩおよびＮａｅＩで消化し、得られた５１４２ｂｐの断片を、ゲル精製によって単離した。次いで、２つのゲル精製断片をライゲートし、得られたプラスミドを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａｌｐｈａを形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上での成長によって選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単離し、プラスミドの配列を検証した。プラスミドは、ｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡ（配列番号７８で示される）と称した。
【０１７９】
別の発現プラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を使用し、ｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡにおける単一の塩基対置換を行うことによって生成した。位置４２６３のチミン塩基をグアノシンで置換し、得られたプラスミドをｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢ（配列番号７９で示される）と称した。この置換の結果、ｃｓｃＢによってコードされるポリペプチドにおいて、グルタミン残基がヒスチジンと置換され、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＣ３１３２（Ｊａｈｒｅｉｓら、上記）由来の相同性タンパク質の輸送能を改変することが報告された変化であった。
【０１８０】
実施例２〜４
ｃｓｃオペロンを含む組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の作成
これらの実施例では、ｃｓｃオペロンを含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の作成について例示する。スクロースの消費およびこれらの組換え株によるスクロースからの最終生成物１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）およびグリセリンの生産について実証した。
【０１８１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＴａｂ ｐＳＹＣＯ１０９
株ＴＴａｂを、米国特許第７，３７１，５５８号明細書（実施例１７）に記載された、株ＴＴ ａｌｄＡ由来のａｌｄＢ遺伝子の欠失によって生成した。要するに、ａｌｄＢの欠失を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ番号：７００９２６としてＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能）におけるａｌｄＢの１．５ｋｂｐのコード領域をｐＫＤ３プラスミドのＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットとまず置換することによって行った（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５頁、２０００年）。置換カセットを、鋳型としてｐＫＤ３を使用するプライマー対の配列番号８０および配列番号８１を用いて増幅した。プライマー配列番号８０は、ａｌｄＢの５’末端に対して８０ｂｐの相同性およびｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を有する。プライマー配列番号８１は、ａｌｄＢの３’末端に対して８０ｂｐの相同性およびｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を有する。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６コンピテント細胞にエレクトロポレートした（米国特許第７，３７１，５５８号明細書）。組換え株を、１２．５ｍｇ／Ｌのクロロアムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を有するＬＢプレート上で選択した。ａｌｄＢ遺伝子の欠失を、プライマー対の配列番号８２および配列番号８３を使用するＰＣＲによって確認した。野生型株から１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物を得る一方、組換え株から特徴的な１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。Ｐ１溶解物を調製し、それを使用して突然変異をＴＴ ａｌｄＡ株に生じさせ、ＴＴ ａｌｄＡΔａｌｄＢ：：Ｃｍ株を形成した。クロラムフェニコール耐性クローンを、プライマー対の配列番号８２および配列番号８３を使用するゲノムＰＣＲによって検査し、突然変異が存在することを確認した。クロラムフェニコール耐性マーカーを、ＦＬＰリコンビナーゼ（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、上記）を使用して除去し、株ＴＴａｂを作製した。次いで、株ＴＴａｂを、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載のｐＳＹＣＯ１０９（配列番号７５で示される）で形質転換し、株ＴＴａｂｐＳＹＣＯ１０９を生成した。
【０１８２】
引用した参考文献に記載のように、株ＴＴａｂは、
ｇｌｐＫ、ｇｌｄＡ、ｐｔｓＨＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ａｒｃＡ、ｍｇｓＡ、ｑｏｒ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子の欠失；
ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｂｔｕＲ、ｐｐｃ、およびｙｑｈＤ遺伝子の上方調節；および
ｇａｐＡ遺伝子の下方調節、
の修飾を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＦＭ５（ＡＴＣＣ番号５３９１１）の誘導体である。
【０１８３】
プラスミドｐＳＹＣＯ１０９は、グリセリン生成経路をコードする遺伝子（ＤＡＲ１およびＧＰＰ２）ならびにグリセリンデヒドラターゼおよびそれに関連する再活性化因子をコードする遺伝子（ｄｈａＢ１２３、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ）を有する。
【０１８４】
株ＴＴａｂ／ｐＳＹＣＯ１０９を、実施例１に記載の、２つのｃｓｃオペロン過剰発現プラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡおよびｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢの各々で形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上での成長により、選択した。個々のコロニーを、採取し、同じ抗生物質を有するＬＢ培養液中、振とう下（２５０ｒｐｍ）、３４℃で一晩成長させた。対照株ＴＴａｂ／ｐＳＹＣＯ１０９を、カナマイシンを別として同一条件下で成長させた。
【０１８５】
これらの一晩培養物を、１０．５ｇ／Ｌのスクロースを含有するＴＭ３培地に、０．０１単位の光学密度（５５０ｎｍで測定）まで希釈した。ＴＭ３は、６．８の最終ｐＨを提供するための、１３．６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．０４ｇ／Ｌのクエン酸二水和物、２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、０．３３ｇ／Ｌのクエン酸第２鉄アンモニウム、０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ＬのＨ３ＢＯ４、０．１ｍｇ／ＬのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏおよび十分なＮＨ４ＯＨを含有する最少培地である。ビタミンＢ１２を、０．１ｍｇ／Ｌの濃度になるまで培地に添加した。培養物を、振とう下（２２５ｒｐｍ）、３４℃で２４時間インキュベートした。一定分量を、接種の０、５、８、１１、１４、１７、２０および２３時間後に除去し、培養液中のスクロース、グリセリンおよび１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）の濃度を、高性能液体クロマトグラフィーによって測定した。
【０１８６】
クロマトグラフ分離を、０．５ｍＬ／分の流速および６０℃のカラム温度でのｄＨ２Ｏ
のイソクラティック移動相を有するＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して行った。溶出化合物を、ＴＭ３培地に既知の濃度になるまで溶解した市販購入した純粋化合物から調製された標準曲線を参照する屈折率検出により、定量した。保持時間は、スクロースで１２．２分、１，３−プロパンジオールで１７．９分、およびグリセリンで２３．６分であった。
【０１８７】
両方のｃｓｃ発現プラスミド（実施例３および４）が、スクロースの代謝とＰＤＯおよびグリセリンの生産をもたらす一方、親対照株（実施例２、比較）は、これらの条件下で、スクロースを代謝するか、あるいはＰＤＯまたはグリセリンを生成することができなかった（表２〜４を参照）。表中に示されるデータ点は、２通りの培養物に対して作成した測定値の平均を表す。
【０１８８】
【表３】
【０１８９】
【表４】
【０１９０】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および分子生物学の分野に関する。より詳細には、炭素源としてスクロースを用いてグリセリンおよびグリセリン由来生産物（ＧＬＹＣＥＲＯＬ−ＤＥＲＩＶＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ）を生産する能力を有する組換え細菌、ならびにかかる組換え細菌を利用する方法、が提供される。
【背景技術】
【０００２】
多くの商業的に有用な微生物は、それらの主な炭水化物源としてグルコースを使用する。しかし、商業的に望ましい生成物の生産のために開発された微生物によるグルコースの使用における欠点は、高コストのグルコースである。微生物生産系における炭水化物源としてのスクロースやスクロースおよび他の糖類を含有する混合供給原料の使用であれば、これらの材料がより低コストで容易に入手可能であることから、商業的により望ましいことになる。
【０００３】
生成微生物は、混合供給原料中に存在する任意のスクロースを利用できる場合、より効率的に機能しうる。したがって、生成微生物がスクロースを主要な炭素源として効率的に利用する能力を有しない場合、それは効率的に機能することができない。例えば、細菌細胞は、典型的には、優先的な糖の使用を示し、ここではグルコースが最も好ましい。典型的には、グルコースは、糖類の混合物を含有する人工培地中で、他の糖類に先立ち、その全体に至るまで代謝される。さらに、多くの細菌には、スクロースの利用能が欠如している。例えば、スクロースの利用能を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は５０％未満である。したがって、生成微生物が炭水化物源としてスクロースを利用できない場合、微生物を、それがスクロースを利用できるように改変することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，９６０，４５５号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｌｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：１０３１−１０４０頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スクロース利用遺伝子の組み込みにより、スクロースを利用するように改変されている組換え細菌が報告されている。例えば、Ｌｉｖｓｈｉｔｓら（特許文献１）では、スクロース利用における代謝経路をコードする遺伝子を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）株を用いたアミノ酸の生産についての記載がなされている。さらに、非特許文献１では、炭素源としてスクロースを使用してＬ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを生産する、スクロース分解に関与する遺伝子を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株についての記載がなされている。しかし、炭素源としてスクロースを使用し、グリセリンおよびグリセリン由来生産物を生産する能力を有する細菌株に対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、組換え細菌であって、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、
（ａ）スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列、
（ｂ）フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｃ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ、同じかまたは異なるプロモーターに作動可能に連結され、さらに、前記組換え細菌は、スクロースを代謝し、グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸からなる群から選択される生成物を生産する能力を有する、組換え細菌を提供する。
【０００８】
第２の実施形態では、本発明は、グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するための方法であって、
ａ）スクロースの存在下で、本明細書で開示される組換え細菌を培養するステップと、
ｂ）場合により、生成されたグリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、
を含む、方法を提供する。
【０００９】
簡単な配列の説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１ １．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ-ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で示される規則に従う。
【００１０】
【表１】
【００１１】
配列番号７１は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＸ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列である。
【００１２】
配列番号７２は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０１のヌクレオチド配列である。
【００１３】
配列番号７３は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０３のヌクレオチド配列である。
【００１４】
配列番号７４は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０６のヌクレオチド配列である。
【００１５】
配列番号７５は、プラスミドｐＳＹＣＯ１０９のヌクレオチド配列である。
【００１６】
配列番号７６は、プラスミドｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯのヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号７７は、本明細書中の実施例１に記載のプラスミドｐＳｃｒ１のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号７８は、本明細書中の実施例１に記載のプラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号７９は、本明細書中の実施例１に記載のプラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号８０〜８３は、本明細書中の実施例２〜４に記載の株ＴＴａｂの作成に使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書中に示される各参照の開示内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、１つもしくは複数の細胞および当業者に既知のそれらの均等物などを含む。
【００２３】
本開示との関連で、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００２４】
「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と略される。
【００２５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略される。
【００２６】
「アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は、「ＡＴＣＣ」と略される。
【００２７】
用語「組換えグリセリン生成細菌」は、グリセリンおよび／またはグリセリン由来生産物、例えば１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有するように遺伝子操作された細菌を示す。
【００２８】
用語「スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体」は、スクロースの細菌細胞への輸送を媒介する能力を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を示す。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドの例として、限定はされないが、スクロース：Ｈ＋シンポーターが挙げられる。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体の例として、限定はされないが、ＡＢＣ型トランスポーターが挙げられる。スクロース：Ｈ＋シンポーターは、例えば、ＥＣ３１３２（Ｊａｈｒｅｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０７−５３１６頁、２００２年）またはＡＴＣＣ１３２８１（Ｏｌｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：１０３１−１０４０頁、２００７年）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）株ＤＳＭ１０１４０Ｔ（Ｅｈｒｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（６）：３９１−３９７頁、２００３年）において見出されるｃｓｃＢ遺伝子によってコードされる。スクロースに対する活性を有するＡＢＣ型トランスポーターの例として、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株ＴＩＧＲ４で遺伝子ｓｕｓＴ１、ｓｕｓＴ２およびｓｕｓＸによってコードされる複合体がある（ＩｙｅｒおよびＣａｍｉｌｌｉ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６：１−１３頁、２００７年）。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体はまた、他の糖類に対する活性を有しうる。例として、ｍａｌＥＦＧＫ（Ｋｉｌｉｃら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２６６：２１８頁、２００７年）によってコードされるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のマルトーストランスポーター複合体が挙げられる。
【００２９】
用語「フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド」は、Ｄ−フルクトース＋ＡＴＰのフルクトース−リン酸＋ＡＤＰへの変換を触媒する能力を有するポリペプチドを示す。フルクトキナーゼの典型がＥＣ２．７．１．４である。フルクトースをリン酸化するいくらかの能力を有する酵素は、この活性がその主要な活性であるか否かにかかわらず、フルクトキナーゼと称される場合がある。フルクトキナーゼをコードする遺伝子およびフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質のために使用される略語として、例えば、「Ｆｒｋ」、「ｓｃｒＫ」、「ｃｓｃＫ」、「ＦＫ」、および「ＫＨＫ」が挙げられる。フルクトキナーゼは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）におけるｓｃｒＫ遺伝子、および特定の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株におけるｃｓｃＫ遺伝子によってコードされる。
【００３０】
用語「スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド」は、スクロースの加水分解を触媒し、グルコースおよびフルクトースを生産する能力を有するポリペプチドを示す。かかるポリペプチドは、「インベルターゼ」または「βフルクトフラノシダーゼ」と称されることが多い。これらの酵素の典型がＥＣ３．２．１．２６である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＣ３１３２（Ｊａｈｒｅｉｓら、上記）またはＡＴＣＣ１３２８１（Ｏｌｓｏｎら、上記）において見出されるｃｓｃＡ遺伝子、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）株ＤＳＭ１０１４０Ｔ由来のｂｆｒＡ遺伝子、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳＵＣ２遺伝子、が挙げられる（ＣａｒｌｓｏｎおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ ２８：１４５頁、１９８２年）。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドはまた、スクロースリン酸ヒドロラーゼ活性を有しうる。かかるペプチドの一例が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるｓｃｒＢによってコードされる（Ｅｎｇｅｌｓら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２８９：８０−８９頁、２００８年）。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドはまた、スクロースホスホリラーゼ活性を有しうる。かかる酵素の典型がＥＣ２．４．１．７である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子の一例が、特に、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ２０１９３（Ｇｏｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２９：７７−８６頁、２００７年）およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＤＳＭ２００８３（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２１９−２２７頁、２００４年）において見出される。
【００３１】
用語「グリセリン誘導体」および「グリセリン由来生産物」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、グリセリンから、またはグリセリンを含む経路内で合成される化合物を示す。かかる生成物の例として、３−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサル、１，２−プロパンジオール、および１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【００３２】
用語「微生物生成物」は、微生物によって生産される生成物、すなわち微生物による物質の代謝の結果物を示す。生成物は、微生物によって自然に生成されうるか、または微生物を遺伝子操作することで、生成物は生産されうる。
【００３３】
用語「ホスホエノールピルビン酸・糖ホスホトランスフェラーゼ系」、「ＰＴＳ系」、および「ＰＴＳ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ホスホエノールピルビン酸依存性の糖取り込み系を示す。
【００３４】
用語「ホスホキャリアータンパク質ＨＰｒ」および「ＰｔｓＨ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｔｓＨによってコードされるホスホキャリアータンパク質を示す。用語「ホスホエノールピルビン酸−タンパク質ホスホトランスフェラーゼ」および「ＰｔｓＩ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｔｓＩによってコードされるホスホトランスフェラーゼのＥＣ２．７．３．９を示す。用語「グルコース特異的ＩＩＡ成分」および「Ｃｒｒ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｃｒｒによってコードされる、ＥＣ２．７．１．６９と称される酵素を示す。ＰｔｓＨ、ＰｔｓＩ、およびＣｒｒは、ＰＴＳ系を含む。
【００３５】
用語「ＰＴＳ陰性」は、天然状態でＰＴＳ系を有しない微生物、またはＰＴＳ系がＰＴＳ遺伝子の不活性化を通じて不活性化されている微生物を示す。
【００３６】
用語「グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「Ｇ３ＰＤＨ」は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセリン３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への変換を触媒する酵素活性に関与するポリペプチドを示す。インビボでのＧ３ＰＤＨは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性でありうる。特に補因子に特異的なグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼに言及する場合、用語「ＮＡＤ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＮＡＤＰ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」が使用されることになる。ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼでは、（例えば、ｇｐｓＡによってコードされる酵素により）ＮＡＤおよびＮＡＤＰを交換可能に使用できる場合が一般的であることから、ＮＡＤ依存性およびＮＡＤＰ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼの用語は、交換可能に使用されることになる。ＮＡＤ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．８）は、例えば、ＧＰＤ１（本明細書中でＤＡＲ１とも称される）（配列番号１で示されるコード配列；配列番号２で示されるコードされたタンパク質配列）、またはＧＰＤ２（配列番号３で示されるコード配列；配列番号４で示されるコードされたタンパク質配列）、またはＧＰＤ３を含む数種の遺伝子によってコードされる。ＮＡＤＰ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．９４）は、例えばｇｐｓＡによってコードされる。
【００３７】
用語「グリセリン３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセリン３−ホスファターゼ」、「Ｄ，Ｌ−グリセリンホスファターゼ」、および「Ｇ３Ｐホスファターゼ」は、グリセリン３−リン酸および水のグリセリンおよび無機リン酸塩への変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示す。Ｇ３Ｐホスファターゼは、例えば、ＧＰＰ１（配列番号５で示されるコード配列；配列番号６で示されるコードされたタンパク質配列）、またはＧＰＰ２（配列番号７で示されるコード配列；配列番号８で示されるコードされたタンパク質配列）によってコードされる。
【００３８】
用語「グリセリンデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」は、グリセリン分子の生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）への変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示す。
【００３９】
本発明の目的として、デヒドラターゼ酵素は、グリセリンおよび１，２−プロパンジオールの好ましい基質をそれぞれ有するグリセリンデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を含む。デヒドラターゼ酵素における遺伝子は、特に、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パスツリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）において同定されている。各場合において、デヒドラターゼは、３つのサブユニット、すなわち、大型または「α」サブユニット、中型または「β」サブユニット、および小型または「γ」サブユニットから構成される。遺伝子はまた、例えば、Ｄａｎｉｅｌら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２、５５３頁（１９９９年））ならびにＴｏｒａｙａおよびＭｏｒｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３３７２頁（１９９９年））において記載されている。グリセリンデヒドラターゼの大型または「α」（アルファ）サブユニットをコードする遺伝子は、ｄｈａＢ１（配列番号９で示されるコード配列、配列番号１０で示されるコードされたタンパク質配列）、ｇｌｄＡおよびｄｈａＢを含み、中型または「β」（ベータ）サブユニットをコードする遺伝子は、ｄｈａＢ２（配列番号１１で示されるコード配列、配列番号１２で示されるコードされたタンパク質配列）、ｇｌｄＢ、およびｄｈａＣを含み、小型または「γ」（ガンマ）サブユニットをコードする遺伝子は、ｄｈａＢ３（配列番号１３で示されるコード配列、配列番号１４で示されるコードされたタンパク質配列）、ｇｌｄＣ、およびｄｈａＥを含む。ジオールデヒドラターゼの大型または「α」サブユニットをコードする他の遺伝子は、ｐｄｕＣおよびｐｄｄＡを含み、中型または「β」サブユニットをコードする他の遺伝子は、ｐｄｕＤおよびｐｄｄＢを含み、また小型または「γ」サブユニットをコードする他の遺伝子は、ｐｄｕＥおよびｐｄｄＣを含む。
【００４０】
グリセリンおよびジオールデヒドラターゼは、グリセリンおよび一部の他の基質により、機序に基づく自殺不活性化を受ける（Ｄａｎｉｅｌら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２、５５３頁（１９９９年））。用語「デヒドラターゼ再活性化因子」は、デヒドラターゼ活性の再活性化に関与するタンパク質を示す。用語「デヒドラターゼを再活性化する活性」、「デヒドラターゼ活性を再活性化する」および「デヒドラターゼ活性を再生する」は、交換可能に使用され、反応の触媒作用能を有しないデヒドラターゼを反応の触媒作用能を有するものに変換する現象、あるいはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象またはインビボでデヒドラターゼ酵素の有効な半減期を延長する現象を示す。２つのタンパク質が、デヒドラターゼ再活性化因子として関与するものとして同定されている（例えば、米国特許第６，０１３，４９４号明細書およびその中の参考文献；Ｄａｎｉｅｌら、上記；ＴｏｒａｙａおよびＭｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、３３７２頁（１９９９年）；ならびにＴｏｂｉｍａｔｓｕら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、４１１０頁（１９９９年）を参照）。タンパク質の１つをコードする遺伝子として、例えば、ｏｒｆＺ、ｄｈａＢ４、ｇｄｒＡ、ｐｄｕＧおよびｄｄｒＡが挙げられる。２つのタンパク質の２番目をコードする遺伝子として、例えば、ｏｒｆＸ、ｏｒｆ２ｂ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＨおよびｄｄｒＢが挙げられる。
【００４１】
用語「１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ」、「１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」および「ＤｈａＴ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示し、但し、かかる活性をコードする遺伝子が、その天然（すなわち野生型）の状況において、デヒドラターゼ酵素に物理的または転写的に連結されていることが見出され、例えば遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＴの場合と同様、ｄｈａレギュロン内部に見出されることが条件である。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、限定はされないが、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、およびクロストリジウム・パスツリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）に由来するｄｈａＴを含む。これらの遺伝子の各々は、ＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼのファミリーに属し、保存された鉄結合モチーフを示し、かつ３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨに関連した相互変換を好ましいとするポリペプチドをコードする（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＬｉｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９、２０５０頁（１９８７年）；Ｄａｎｉｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７、２１５１頁（１９９５年）；およびＬｅｕｒｓら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４、３３７頁（１９９７年））。同様の物理特性を有する酵素は、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）およびラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）から単離されている（Ｖｅｉｇａ ｄａ ＤｕｎｈａおよびＦｏｓｔｅｒ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８、２００５頁（１９９２年））。
【００４２】
用語「ｄｈａレギュロン」は、限定はされないが、デヒドラターゼ活性、再活性化活性、および１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む様々な生物学的活性を有するポリペプチドをコードする関連のポリヌクレオチドまたはオープンリーディングフレームのセットを示す。典型的には、ｄｈａレギュロンは、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載のように、オープンリーディングフレームｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、およびｏｒｆＺを含む。
【００４３】
用語「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」および「Ａｌｄ」は、アルデヒドのカルボキシル酸への変換を触媒するポリペプチドを示す。アルデヒドデヒドロゲナーゼでは、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤ、またはＰＱＱなどの酸化還元補因子（ｒｅｄｏｘ ｃｏｆａｃｔｏｒ）が使用される。アルデヒドデヒドロゲナーゼの典型が、ＥＣ１．２．１．３（ＮＡＤ依存性）；ＥＣ１．２．１．４（ＮＡＤＰ依存性）；ＥＣ１．２．９９．３（ＰＱＱ依存性）；またはＥＣ１．２．９９．７（ＦＡＤ依存性）である。ＮＡＤＰ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＢ（配列番号１５で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＢ（配列番号１６）が挙げられる。ＮＡＤ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＡ（配列番号１７で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＡ（配列番号１８）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＨ（配列番号１９で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＨ（配列番号２０）、が挙げられる。
【００４４】
用語「グルコキナーゼ」および「Ｇｌｋ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、Ｄ−グルコース＋ＡＴＰのグルコース６−リン酸＋ＡＤＰへの変換を触媒するタンパク質を示す。グルコキナーゼの典型がＥＣ２．７．１．２である。グルコキナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｇｌｋによってコードされる。
【００４５】
用語「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」および「Ｐｐｃ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ホスホエノールピルビン酸＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２のリン酸塩＋オキサロ酢酸への変換を触媒するタンパク質を示す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの典型がＥＣ４．１．１．３１である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐｐｃによってコードされる。
【００４６】
用語「グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「ＧａｐＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、グリセルアルデヒド３−リン酸＋リン酸塩＋ＮＡＤ＋の３−ホスホ−Ｄ−グリセロイル−リン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋への変換を触媒可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの典型がＥＣ１．２．１．１２である。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｇａｐＡによってコードされる。
【００４７】
用語「好気的呼吸制御タンパク質」および「ＡｒｃＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、グローバルな（ｇｌｏｂａｌ）調節タンパク質を示す。好気的呼吸制御タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるａｒｃＡによってコードされる。
【００４８】
用語「メチルグリオキサルシンターゼ」および「ＭｇｓＡ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ジヒドロキシアセトンリン酸のメチルグリオキサル＋リン酸塩への変換を触媒可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。メチルグリオキサルシンターゼの典型がＥＣ４．２．３．３である。メチルグリオキサルシンターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｍｇｓＡによってコードされる。
【００４９】
用語「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ」および「Ｅｄｄ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、６−ホスホ−グルコン酸の２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−グルコン酸＋Ｈ２Ｏへの変換を触媒可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。ホスホグルコン酸デヒドラターゼの典型がＥＣ４．２．１．１２である。ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｅｄｄによってコードされる。
【００５０】
用語「ＹｃｉＫ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｂｔｕＲに翻訳的にカップリングされたｙｃｉＫによってコードされる推定上の酵素を示す。
【００５１】
用語「Ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ」は、デオキシアデノシル部分をＡＴＰから還元コリノイドへ転移可能な酵素を示す。Ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの典型がＥＣ２．５．１．１７である。Ｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における遺伝子「ｂｔｕＲ」、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）における「ｃｏｂＡ」、およびシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）における「ｃｏｂＯ」によってコードされる。
【００５２】
用語「ガラクトース−プロトンシンポーター」および「ＧａｌＰ」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、糖およびプロトンをペリプラズムから細胞質へ移動可能な酵素活性を有するタンパク質を示す。Ｄ−グルコースは、ＧａｌＰに対して好ましい基質である。ガラクトース−プロトンシンポーターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるｇａｌＰによってコードされる（配列番号２１で示されるコード配列、配列番号２２で示されるコードされたタンパク質配列）。
【００５３】
用語「非特異的な触媒活性」は、３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒可能な酵素活性を有するポリペプチドを示し、詳細には１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを除外する。典型的には、これらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。かかる酵素では、限定はされないが、ＦＡＤまたはＦＭＮなどのフラビンを含む、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ以外の補因子が使用されうる。非特異的アルコールデヒドロゲナーゼに対する遺伝子（ｙｑｈＤ）は、例えば、内因性にコードされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株中で機能的に発現されることが見出されている。
【００５４】
用語「１．６の長いＧＩプロモーター」、「１．２０の短い／長いＧＩプロモーター」、および「１．５の長いＧＩプロモーター」は、米国特許第７，１３２，５２７号明細書中に記載のストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ遺伝子に由来するプロモーターを有するポリヌクレオチドまたは断片を示す。これらのプロモーター断片は、その活性を、野生型ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼ遺伝子プロモーターに比べて低下させる突然変異を含む。
【００５５】
用語「機能」および「酵素機能」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、特異的化学反応が、酵素自体が反応によって消費されることなく生じる際の速度を変更する場合での酵素の触媒活性を示す。生成物または基質のいずれかの生成が好適な条件下で行われうる場合、かかる活性が平衡状態での反応に適用可能であることは理解されている。
【００５６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００５７】
用語「炭素基質」および「炭素源」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、本明細書で開示される組換え細菌によって代謝可能な炭素源、特にフルクトースおよびグルコースを含む炭素源を示す。炭素源は、他の単糖類；二糖類、例えばスクロース；オリゴ糖；または多糖類をさらに含んでもよい。
【００５８】
用語「宿主細胞」および「宿主細菌」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、外来または異種遺伝子を受け取ることができ、かつそれら遺伝子を発現し、活性のある遺伝子産物を生産できる細菌を示す。
【００５９】
用語「生成微生物」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、１，３−プロパンジオール、グリセリン、３−ヒドロキシプロピオン酸、ポリ不飽和脂肪酸などの特異的生成物の作製のために使用される、組換え体であるものを含む微生物を示す。
【００６０】
「核酸」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および修飾ヌクレオチドを含んでもよい。したがって、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸形態で見出される）は、次のようなその一文字名称によって参照される。すなわち、アデニル酸塩またはデオキシアデニル酸塩（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡに対応）に対する「Ａ」、シチジル酸塩またはデオキシシチジル酸塩に対する「Ｃ」、グアニル酸塩またはデオキシグアニル酸塩に対する「Ｇ」、ウリジル酸塩に対する「Ｕ」、デオキシチミジル酸塩に対する「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対する「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対する「Ｙ」、ＧまたはＴに対する「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対する「Ｈ」、イノシンに対する「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対する「Ｎ」。
【００６１】
ポリヌクレオチドは、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態でのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはその混合物の１つもしくは複数のセグメントから構成されてもよい。
【００６２】
「遺伝子」は、特異的タンパク質を発現する核酸断片を示し、また、単独でコード領域を示すか、またはコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびそれに後続する調節配列（３’非コード配列）を含んでもよい。「天然遺伝子」は、それ固有の調節配列とともに天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、調節およびコード配列（共に天然に見出されない）を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される場合と異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその天然の位置での天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された遺伝子、天然宿主内部の新しい位置に導入された遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでもよい。
【００６３】
用語「天然ヌクレオチド配列」は、宿主微生物において通常見出されるヌクレオチド配列を示す。
【００６４】
用語「非天然ヌクレオチド配列」は、宿主微生物において通常見出されないヌクレオチド配列を示す。
【００６５】
用語「天然ポリペプチド」は、宿主微生物において通常見出されるポリペプチドを示す。
【００６６】
用語「非天然ポリペプチド」は、宿主微生物において通常見出されないポリペプチドを示す。
【００６７】
用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、遺伝子が転写および翻訳の機序を通じてアミノ酸配列を生成するプロセスを示す。
【００６８】
用語「コード配列」は、特異的なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００６９】
「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与える。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’未翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含んでもよい。
【００７０】
用語「発現カセット」は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現にとって必要とされる、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）および後続する調節配列（３’非コード配列）と、を含むＤＮＡの断片を示す。したがって、発現カセットは、典型的には、１）プロモーター配列；２）コード配列（すなわちＯＲＦ）、および３）真核生物では通常ポリアデニル化部位を有する、３’未翻訳領域（例えばターミネーター）、から構成される。発現カセットは通常、ベクター内部に含まれ、クローニングおよび形質転換を促進する。細菌、酵母、および真菌を含む異なる生物は、正確な調節配列が各宿主に対して使用される限り、異なる発現カセットで形質転換されうる。
【００７１】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸分子の宿主生物への導入を示す。核酸分子は、例えば自己複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込んでよい。核酸断片で形質転換された宿主生物は、「組換え体」または「形質転換」生物または「形質転換体」と称される。「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸断片の、宿主生物のゲノム（核およびオルガネラゲノムの双方を含む）への導入を示す。それに対し、「一過性形質転換」は、組み込みを伴わない遺伝子発現または安定な遺伝的形質をもたらす、核酸断片の、宿主生物の核、またはＤＮＡを有するオルガネラへの導入を示す。
【００７２】
「コドンの縮退」は、ヌクレオチド配列の変異を許容し、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に効果を及ぼすことのない、遺伝コードにおける性質を示す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において、特異的な宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、遺伝子を宿主細胞内での改善された発現を意図して合成する場合、遺伝子を、そのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように設計することは望ましい。
【００７３】
用語「機能的に等価である小断片」および「機能的に等価な小断片」は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、遺伝子発現を改変するかまたは特定の表現型を生成する能力が、断片または小断片が活性酵素をコードするか否かに無関係に保持される場合の単離核酸断片の一部または部分配列を示す。キメラ遺伝子は、核酸断片またはその小断片に、それが活性酵素をプロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向でコードするか否かに無関係に結合することにより、抑制的な使用を意図して設計してもよい。
【００７４】
用語「保存ドメイン」または「モチーフ」は、進化的に関連したタンパク質の整列された配列に沿った特異的位置で保存されるアミノ酸セットを意味する。他の位置でのアミノ酸が相同性タンパク質間で変異しうる一方、特異的位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須であるアミノ酸を示す。
【００７５】
用語「実質的に類似した」および「実質的に相当する」は、本明細書中で交換可能に使用される。それらは、１つもしくは複数のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片の、遺伝子発現を媒介するかまたは特定の表現型を生成する能力に影響を与えない場合の核酸断片を示す。これらの用語はまた、得られた核酸断片の機能特性を初期の未修飾断片に対して実質的に改変しない、１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾を示す。したがって、本発明が、特定の典型的な配列以上のものを包含することは、当業者が理解するように理解されている。さらに、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した核酸配列がまた、（中等度にストリンジェントな条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ（標準のクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、６０℃）で、本明細書中に例示される配列または本明細書で開示されるヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズするそれらの能力によって規定され、本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に等価であることを理解している。ストリンジェンシー条件を調節し、中等度に類似した断片、例えば遠縁生物由来の相同性配列、高度に類似した断片、例えば近縁生物由来の機能酵素を複製する遺伝子についてスクリーニングすることが可能である。ハイブリダイゼーション後洗浄により、ストリンジェンシー条件が決定される。
【００７６】
用語「選択的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、核酸配列の、特異的な核酸標的配列に対する、非標的核酸配列や実質的に排除した（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ）非標的核酸に対するそのハイブリダイゼーションの場合に比べて検出可能により大きい程度（例えばバックグラウンドより少なくとも２倍大きい）でのハイブリダイゼーションへの言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、ヌクレオチド配列の一方の相補体が、典型的には、他方のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％を含むそれ以下の配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する場合の２つのヌクレオチド配列である。
【００７７】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズすることになる条件への言及を含む。プローブは、典型的には、検出されるべき核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出されるべき核酸配列に対して「ハイブリダイズ可能」である。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満、場合により、５００ヌクレオチド長未満である。
【００７８】
ハイブリダイゼーション方法は、十分に定義されている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される。これは、プローブおよび試料を、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下で接触させることを含む。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい。核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイフォーマットに適用可能である。最適なものの１つが、サンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチ型アッセイの主要構成要素が、固体支持体である。固体支持体は、未標識でかつ配列の一部に相補的である固定化核酸プローブを、それに吸着させるかまたはそれに共有結合させている。
【００７９】
ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下で異なることになる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、標的配列は、プローブに対して１００％相補的である（相同プロービング）と同定されうる。あるいは、ストリンジェンシー条件を調節し、配列における、類似性の程度がより低いことが検出されるような一部の不一致（異種プロービング）が許容されうる。
【００８０】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ 未満のＮａイオン、典型的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、かつ、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）に対して少なくとも約６０℃であるような場合となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって得られうる。典型的な低いストリンジェンシー条件は、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および、５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄、を含む。典型的な中等度のストリンジェンシー条件は、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および、５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣでの洗浄、を含む。典型的な高いストリンジェンシー条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および、６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄、を含む。
【００８１】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、ここで重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおいては、熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４頁（１９８４年）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％形式）−５００／Ｌ（式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％形式はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、かつＬは塩基対でのハイブリッドの長さである）の方程式から概算可能である。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全一致プローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。Ｔｍは、不一致の各１％につき約１℃低下することから、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節することで、所望される同一性を有する配列とのハイブリダイズが可能である。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃低下しうる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列およびその相補体において、Ｔｍより約５℃低いように選択される。しかし、厳密にストリンジェントな条件では、Ｔｍより１、２、３、もしくは４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が利用可能であり；中等度にストリンジェントな条件では、Ｔｍより６、７、８、９、もしくは１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が利用可能であり；低いストリンジェンシー条件では、Ｔｍより１１、１２、１３、１４、１５、もしくは２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が利用可能である。当業者は、方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望されるＴｍを用い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に説明されることを理解するであろう。所望される不一致の程度により、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）より低いＴｍが得られる場合、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ」、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ２ 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｈａｐｔｅｒ ２、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５年）において見出される。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０、もしくは２４０分間適用してもよい。
【００８２】
核酸またはポリペプチド配列との関連での「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウインドウ上の最大一致性（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）について整列される場合に同じである２つの配列間での核酸塩基またはアミノ酸残基を示す。
【００８３】
したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を示し、ここで比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントについて、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。この百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を判定し、合致する位置の数を出し、合致した位置の数を、比較のウインドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を出すことにより計算される。パーセント配列同一性の有用例として、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数の百分率が挙げられる。これらの同一性は、本明細書中に記載のプログラムのいずれかを用いて決定されうる。
【００８４】
配列アラインメントおよびパーセント同一性または類似性の計算は、限定はされないが、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を含む相同性配列を検出するように設計された種々の比較方法を用いて判定されうる。本願の関連の中で、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、他に規定がなければ、分析の結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことになることは理解されるであろう。本明細書で使用される「デフォルト値」は、最初に初期化される場合に最初にソフトウェアに読み込まれる任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。
【００８５】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと称されるアラインメント法に対応し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））において見出される。複数のアラインメントにおいては、デフォルト値は、ギャップペナルティ＝１０およびギャップ長ペナルティ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法を用いる、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよびパーセント同一性の計算におけるデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸においては、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ギャップペナルティ＝５、ウインドウ＝４およびダイアゴナルズセイブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム中の「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見ることにより「パーセント同一性」を得ることが可能である。
【００８６】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと称されるアラインメント法に対応し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、上記；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、上記で記載）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））において見出される。複数のアラインメントにおけるデフォルトパラメータは、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイ・ディバージェン配列（Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジション・ウェイト（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質重み行列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ）、ＤＮＡ重み行列（Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢに相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００８７】
「アラインメントのＢＬＡＳＴＮ法」は、デフォルトパラメータを使用してヌクレオチド配列を比較するための、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））によって提供されるアルゴリズムである。
【００８８】
配列同一性の多数のレベルが、同一または類似の機能または活性を有するポリペプチドを他の種から同定するのに有用であることが当業者により十分に理解されている。パーセント同一性の有用な例として、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数の百分率が挙げられる。確かに、５０％〜１００％の任意の整数、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸同一性は、本発明を説明する上で有用でありうる。また、この単離されたヌクレオチド断片の任意の完全長または部分的相補体は興味深い。
【００８９】
したがって、本発明は、本明細書で開示される特定の典型的なヌクレオチド配列以上のものを包含する。例えば、遺伝コードの縮退に反映する、遺伝子配列における改変が考慮される。また、所与の部位での化学的に等価なアミノ酸の生産をもたらすが、コードされたタンパク質の機能特性に作用しない、遺伝子における改変が一般的であることは当該技術分野で周知である。置換は、次の５つの基のうちの１つの中での変化として、本明細書中の考察において定義されている。
１． 小さい脂肪族、非極性またはやや極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２． 極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３． 極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４． 大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５． 大きい芳香族性残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００９０】
したがって、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸におけるコドンは、別のより疎水性が低い残基（グリシンなど）またはより疎水性が高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されうる。同様に、１つの負に帯電した残基と別の残基（例えばアスパラギン酸とグルタミン酸）との置換または１つの正に帯電した残基と別の残基（例えばリジンとアルギニン）との置換をもたらす変化はまた、機能的に等価な生成物を生成することが想定されうる。さらに、多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部の改変をもたらすヌクレオチド変化は、タンパク質の活性を改変することが想定されないことになる。
【００９１】
提起される修飾の各々は、コードされた生成物の生物学的活性の保持を決定づけるものとして、十分に当業者の理解の範囲内にある。さらに、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した配列がまた、上で規定されたように、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって規定されることを理解している。
【００９２】
本発明の好ましい実質的に類似した核酸断片は、ヌクレオチド配列が、本明細書中に報告される核酸断片のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、本明細書中に報告される核酸断片のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一である。本明細書中に報告される核酸断片のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である核酸断片が最も好ましい。
【００９３】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、そのポリペプチドまたは遺伝子を、当業者による配列のマニュアル評価か、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用するコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって推定的に同定するための、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に対して相同なものとして推定的に同定するため、１０以上の隣接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定の配列依存的方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列依存的方法で使用してもよい。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用してもよい。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するため、配列を十分に含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書中に報告される配列の便益を有する当業者は、ここでは、当業者に既知の目的のため、開示される配列の全部または実質的部分を使用できる。
【００９４】
用語「相補的」は、逆平行方向に整列される場合にワトソン−クリック型塩基対を形成する能力を有する２つのヌクレオチド塩基の配列間の関係について説明する。例えば、ＤＮＡに関しては、チミンおよびシトシンと塩基対を形成する能力を有するアデノシンは、グアニンと塩基対を形成する能力を有する。したがって、本発明では、添付の配列表および本明細書において報告される完全な配列ならびにそれらの実質的に類似した核酸配列に対して相補的な単離された核酸分子を使用することができる。
【００９５】
用語「単離される」は、少なくとも１つの成分から取り出されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列（それら成分と天然に関連する）を示す。
【００９６】
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御する能力を有するＤＮＡ配列を示す。プロモーター配列は、近位の上流因子とより遠位の上流因子からなり、ここで後者の因子は、エンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激しうるＤＮＡ配列であり、プロモーターに固有の因子またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を促進するように挿入される異種因子でありうる。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞種において、または異なる発生の段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を駆動しうることは、当業者によって理解されている。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に画定されていないことから、いくつかの変異のあるＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうることは理解されている。ほとんどの時期に大部分の細胞種において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００９７】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」および「終結配列」は、本明細書中で交換可能に使用され、また、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列および他の配列を含む、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化シグナルは通常、ポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に作用することによって特徴づけられる。
【００９８】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方による作用を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を示す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に作用可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結されうる。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側または標的ｍＲＮＡの３’側または標的ｍＲＮＡ内部に、直接的または間接的に作動可能に連結されうるか、あるいは最初の相補的領域は、標的ｍＲＮＡに対し、５’側であり、かつその相補体は、３’側である。
【００９９】
本明細書で使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）においてより十分に記載されている。形質転換方法は、当業者に周知であり、以下に記載される。
【０１００】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特異的ＤＮＡセグメントを合成するための技術であり、一連の反復サイクルからなる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））。典型的には、二本鎖ＤＮＡは、熱変性され、標的セグメントの３’側境界に相補的な２つのプライマーは、低温でアニールされ、次いで中温で伸長される。これら３つの連続ステップ一式は、「サイクル」と称される。
【０１０１】
「プラスミド」または「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を有することが多く、また通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をなす、染色体外因子である。かかる因子は、任意の供給源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってもよく、ここでは、多数のヌクレオチド配列が、発現カセットを細胞に導入することができる特有の作成物に結合または再結合されている。
【０１０２】
用語「遺伝的に改変される」は、遺伝子工学、形質転換および／または突然変異によって遺伝材料を変化させるプロセスを示す。
【０１０３】
用語「組換え体」は、例えば、化学合成または核酸の単離されたセグメントの遺伝子工学技術による操作による、配列の他の場合には分離された２つのセグメントの人工的組み合わせを示す。「組換え体」はまた、異種核酸の導入によって修飾されている細胞またはベクター、またはそのように修飾された細胞由来の細胞への言及を含むが、意図的なヒトの介入を伴わずに生じるものなど、天然事象（例えば、自発的突然変異、自然形質転換、自然形質導入、自然転位）による細胞またはベクターの改変を包含しない。
【０１０４】
用語「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書中で交換可能に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片、例えば共に天然に見出されない調節およびコード配列の人工的組み合わせを含む。例えば、組換えコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される場合と異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでもよい。かかるコンストラクトは、単独で使用するか、またはベクターと併用してもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知の、宿主細胞を形質転換するために用いられることになる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用してもよい。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功させるため、ベクター上に存在する必要がある遺伝的要素について十分に理解している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が異なるレベルおよびパターンの発現をもたらす場合があり（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８頁（１９８５年）；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６頁（１９８９年））、それ故、所望される発現レベルおよびパターンを示す系統を得るため、複数の事象のスクリーニングが必要な場合があることを理解するであろう。かかるスクリーニングは、特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析により、行ってもよい。
【０１０５】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、機能最終産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆体または成熟体のいずれか］）の生産を示す。
【０１０６】
用語「導入される」は、核酸（例えば発現コンストラクト）またはタンパク質を細胞に提供することを意味する。導入されるは、核酸が細胞のゲノムに組み込み可能である場合の、核酸の真核または原核生物細胞への組み込みへの言及を含み、また、核酸またはタンパク質の細胞への一過性の供給（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）への言及を含む。導入されるは、安定な形質転換方法または一過性形質転換方法、ならびに性的交配（ｓｅｘｕａｌｌｙ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）への言及を含む。したがって、核酸断片（例えば、組換えコンストラクト／発現コンストラクト）の細胞への挿入に関連した「導入される」は、「形質移入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、また、核酸断片が、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自己レプリコンに変換されるか、または一過性発現（例えば形質移入ｍＲＮＡ）されうる場合、核酸断片の真核または原核生物細胞への組み込みへの言及を含む。
【０１０７】
用語「相同な」は、同様の触媒機能を有する、共通の進化上の起源のタンパク質またはポリペプチドを示す。本発明は、組換え技術によって相同性タンパク質を生産する細菌を含んでもよい。
【０１０８】
組換え細菌であって、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列；フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え細菌が本明細書で開示される。これらのヌクレオチド配列はそれぞれ、同じかまたは異なるプロモーターに作動可能に連結される。これらの組換え細菌は、スクロースを代謝し、グリセリンおよび／またはグリセリン由来生産物、例えば１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有する。グリセリンおよび／またはグリセリン由来生産物を生産する能力を有する細菌株は、本明細書中、下記のように、高度に改変された株である。
【０１０９】
本明細書で開示される組換え細菌の作成における使用に適した宿主細菌は、限定はされないが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、の生物を含む。
【０１１０】
一実施形態では、宿主細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、およびアエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属から選択される。
【０１１１】
別の実施形態では、宿主細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【０１１２】
一部の実施形態では、宿主細菌は、ＰＴＳ陰性である。これらの実施形態では、宿主細菌は、その天然状態でＰＴＳ陰性であるか、または下記のように、ＰＴＳ遺伝子の不活性化を通じてＰＴＳ陰性にされる場合がある。
【０１１３】
生成微生物においては、場合により、糖類の輸送および輸送されている糖類のリン酸化のためのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の使用と分けることが望ましい。
【０１１４】
用語「下方制御される」は、活性タンパク質の活性の、野生型タンパク質の活性と比較した場合の低下または除去を示す。ＰＴＳは、このタイプの輸送において必要とされるタンパク質をコードする１つもしくは複数の内因性遺伝子の発現を下方調節することにより、不活性化されうる（「ＰＴＳ陰性」生物をもたらす）。下方調節は、典型的には、１つもしくは複数のこれらの遺伝子が、その遺伝子の一部の内部での挿入、欠失、または標的化された突然変異に関して「破壊」を有することで、遺伝子がゲノムから欠失されかつタンパク質が全く翻訳されないような完全な遺伝子ノックアウトか、またはタンパク質が、挿入、欠失、アミノ酸置換もしくは他の標的化された突然変異を有する程度に翻訳されていないという結果をもたらす場合に生じる。タンパク質における破壊の位置は、例えば、タンパク質のＮ末端部内またはタンパク質のＣ末端部内でありうる。破壊されたタンパク質は、破壊されていないタンパク質に対して低下した活性を有することになり、非機能的でありうる。また、タンパク質の発現の低下または欠如をもたらす下方調節であれば、調節配列、転写および翻訳因子、ならびに／またはシグナル形質導入経路を操作することによるか、あるいはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術などの使用により、生じうる。
【０１１５】
スクローストランスポーターポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、スクロースの微生物細胞への輸送を媒介する能力を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体である。スクロース輸送ポリペプチドおよびポリペプチド複合体は、上記のように既知である。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドの例として、限定はされないが、遺伝子ＣｓｃＢ（配列番号２３で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号２４で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型株ＥＣ３１３２由来のＣｓｃＢ；遺伝子ｃｓｃＢ（配列番号２５で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号２６で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１３２８１由来のＣｓｃＢ；ならびに、遺伝子ｃｓｃＢ（配列番号２７で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号２８で示される）ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）由来のＣｓｃＢ、が挙げられる。スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体の例として、限定はされないが、遺伝子ｓｕｓＴ１（配列番号２９で示されるコード配列）、ｓｕｓＴ２（配列番号３１で示されるコード配列）、およびｓｕｓＸ（配列番号３３で示されるコード配列）によってコードされる、配列番号３０、３２、および３４によって示される３つのポリペプチドサブユニットを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株ＴＩＧＲ４由来のスクロースＡＢＣ型トランスポーター複合体；ならびに、遺伝子ｍａｌＥ（配列番号３５で示されるコード配列）、ｍａｌＦ（配列番号３７で示されるコード配列）、ｍａｌＧ（配列番号３９で示されるコード配列）、およびｍａｌＫ（配列番号４１で示されるコード配列）によってそれぞれコードされる、配列番号３６、３８、４０、および４２で示される４つのポリペプチドサブユニットを含む、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のマルトーストランスポーター複合体、が挙げられる。
【０１１６】
一実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１１７】
別の実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット；配列番号３２で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット；および、配列番号３４で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット、を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット；配列番号３８で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット；配列番号４０で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット；および、配列番号４２で示されるアミノ酸配列と比較される場合、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第４のサブユニット、を含む。
【０１１９】
別の実施形態では、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、配列番号２６で示されるアミノ酸配列に実質的に相当する。
【０１２０】
フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４と称される）およびフルクトースリン酸化活性を有する様々なヘキソースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３およびＥＣ２．７．１．１）を含む。フルクトースリン酸化活性は、ヘキソキナーゼおよびケトヘキソキナーゼによって示されうる。種々の微生物由来のポリペプチドをコードする代表的な遺伝子は、本明細書で開示される組換え細菌の作成に使用可能であり、表１中に列挙される。当業者は、（例えば表１中に列挙される遺伝子によってコードされる）フルクトースをリン酸化可能なタンパク質に実質的に類似したタンパク質も使用可能であることを理解するであろう。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
一実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号８５、または配列番号８７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１２３】
別の実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４８で示される配列に実質的に相当する。
【０１２４】
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、スクロースの加水分解を触媒し、フルクトースおよびグルコースを生産する能力を有する。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、上記のように既知であり、また、限定はされないが、遺伝子ＣｓｃＡ（配列番号５５で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号５６で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型株ＥＣ３１３２由来のＣｓｃＡ、遺伝子ｃｓｃＡ（配列番号５７で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号５８で示される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１３８２１由来のＣｓｃＡ；遺伝子ｂｆｒＡ（配列番号５９で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６０で示される）ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）株ＤＳＭ１０１４０Ｔ由来のＢｆｒＡ；遺伝子ＳＵＣ２（配列番号６１で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６２で示される）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳｕｃ２ｐ；遺伝子ｓｃｒＢ（配列番号６３で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６４で示される）コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＳｃｒＢ；（配列番号６６で示される）ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ２０１９３由来のスクロースホスホリラーゼ（配列番号６５で示される遺伝子をコードするコード配列）；ならびに、遺伝子ｓｕｃＰ（配列番号６７で示されるコード配列）によってコードされる（配列番号６８で示される）ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＤＳＭ２００８３由来のスクロースホスホリラーゼ、が挙げられる。
【０１２５】
一実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１２６】
別の実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５８で示されるアミノ酸配列に実質的に相当する。
【０１２７】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列を使用し、相同性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、同じかまたは他の微生物種から単離することが可能である。例えば、遺伝子の相同体は、公的に利用可能な核酸配列データベースを探索するための配列分析ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮを使用して同定してもよい。さらに、配列依存性プロトコルを用いての相同性遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例として、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに、核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ， Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、１０７４頁、１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２頁（１９９２年））の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられる。例えば、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、相同性を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。
【０１２８】
当業者は、他の供給源から単離されたこれらのポリペプチドをコードする遺伝子が、本明細書で開示される組換え細菌においても使用可能であることを理解するであろう。さらに、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における変異は、コドンの縮退により、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく施すことができ、その上、実質的に類似したタンパク質を生成するアミノ酸置換、欠失または付加は、コードされたタンパク質に含めてもよい。
【０１２９】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照）および所望される配列（この配列が既知である場合）に結合する（ｂｏｕｎｄ）ように設計されたプライマーを使用し、単離してもよい。例えば、変性プライマーまたは異種プローブハイブリダイゼーションを使用することによる遺伝子単離の他の方法は、当業者に周知である。ヌクレオチド配列はまた、化学的に合成するか、またはＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）などのベンダーから購入してもよい。さらに、ｃｓｃオペロン全体は、本明細書中の実施例１に詳述のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ１３２８１のゲノムＤＮＡから単離してもよい。
【０１３０】
ポリペプチドの発現は、当業者に既知の多くの方法のうちの１つを用いて行ってもよい。例えば、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、細菌に、少なくとも１つのマルチコピープラスミド上に、またはコード配列の１つもしくは複数のコピーを宿主ゲノムに組み込むことにより、導入してもよい。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、宿主細菌に、別々に（例えば、別々のプラスミド上に）、または任意の組み合わせで（例えば、本明細書中の実施例に記載のように、単一のプラスミド上に）導入してもよい。宿主細菌がポリヌクレオチドのうちの１つをコードする遺伝子を有する場合、残りのヌクレオチド配列のみが細菌に導入される必要がある。例えば、宿主細菌がフルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する場合、スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のみを細菌に導入し、スクロース利用を可能にする必要がある。プラスミド上またはゲノム内のいずれかに存在する導入されたコード領域は、少なくとも１つの活性の高いプロモーターから発現されうる。組み込まれたコード領域は、キメラ遺伝子（それ自身のプロモーターを有する）の一部として導入するか、あるいは、ゲノムに対して内因性であるかまたは高度に発現されたオペロン内の活性の高いプロモーターに隣接するように組み込んでもよい。好適なプロモーターとして、限定はされないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現にとって有用）、ならびに、ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現にとって有用）が挙げられる。プロモーターはまた、Ｐａｙｎｅらによって記載の（米国特許第７，１３２，５２７号明細書）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）グルコースイソメラーゼプロモーターまたはその変異体であってもよい。
【０１３１】
一実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、グリセリンを生産する能力を有する。炭水化物または糖類を使用してグリセリンを調製するための生物学的プロセスは、酵母および一部の細菌、他の真菌、および藻類において既知である。細菌および酵母の双方は、解糖系においてフルクトース−１，６−二リン酸経路を通じてグルコースまたは他の炭水化物を変換することにより、グリセリンを生産する。本明細書で開示されるグリセリンを生産する方法においては、グリセリンを天然に生成する宿主細菌を使用してもよい。さらに、細菌は、グリセリンおよびグリセリン誘導体を生成するように改変してもよい。種々の基質からのグリセリン生成能は、米国特許第７，００５，２９１号明細書中に記載のように、グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）および／またはグリセリン−３−ホスファターゼの酵素活性の発現を通じて提供されうる。宿主細菌における酵素活性の発現のために使用可能なこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、米国特許第７，００５，２９１号明細書中に記載されている。グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の好適例として、限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＤ１（配列番号１で示されるコード配列、配列番号２で示されるコードされたタンパク質配列）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＤ２（配列番号３で示されるコード配列、配列番号４で示されるコードされたタンパク質配列）が挙げられる。グリセリン−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の好適例として、限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＰ１（配列番号５で示されるコード配列、配列番号６で示されるコードされたタンパク質配列）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＰＰ２（配列番号７で示されるコード配列、配列番号８で示されるコードされたタンパク質配列）が挙げられる。
【０１３２】
グリセリンの生産の増大は、標的内因性遺伝子の発現の低下を通じてなされうる。グリセリンキナーゼおよびグリセリンデヒドロゲナーゼ活性をコードする内因性遺伝子の下方調節は、米国特許第７，００５，２９１号明細書中に記載のように、グリセリンの生産をさらに促進する。炭素のグリセリンへのチャネリングの増大は、米国特許第７，３７１，５５８号明細書中に記載のように、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子の発現を低下させることによってなされうる。下方調節は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えばＰＴＳ系の遺伝子の下方調節についての上記の方法を用いることによってなされうる。
【０１３３】
グリセリンは、有用な生成物の微生物生成のための基質を提供する。かかる生成物、すなわちグリセリン誘導体の例として、限定はされないが、３−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサル、１，２−プロパンジオール、および１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【０１３４】
別の実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、１，３−プロパンジオールを生産する能力を有する。グリセリン誘導体１，３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の生産ならびにポリウレタンおよび環式化合物の製造において潜在的有用性を有する単量体である。１，３−プロパンジオールは、米国特許第５，６８６，２７６号明細書に記載のように、単一の微生物により、グリセリンまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基質の生物変換によって生成してもよい。この生物変換においては、グリセリンは、上記のように炭素基質から生成される。グリセリンは、宿主細菌によってコードされうるかまたは組換えによって宿主に導入されうるデヒドラターゼ酵素により、中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。デヒドラターゼは、グリセリンデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）、またはこの変換を触媒可能な任意の他の酵素であってもよい。グリセリンデヒドラターゼの「α」（アルファ）、「β」（ベータ）、および「γ」（ガンマ）サブユニットをコードする遺伝子の好適例として、限定はされないが、ｄｈａＢ１（配列番号９で示されるコード配列）、ｄｈａＢ２（配列番号１１で示されるコード配列）、およびｄｈａＢ３（配列番号１３で示されるコード配列）（それぞれ、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来）が挙げられる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオール（ｐｒｏｐａｎｄｅｉｏｌ）へのさらなる変換は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の好適例は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＴである（配列番号６９で示されるコード配列、配列番号７０で示されるコードされたタンパク質配列）。
【０１３５】
細菌は、組換え操作により、グリセリンおよびグリセリン誘導体１，３−プロパンジオールのより効率的な生産をもたらしうる。例えば、米国特許第７，００５，２９１号明細書は、グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセリン−３−リン酸ホスファターゼの一方もしくは双方の外因性活性を発現する一方、グリセリンキナーゼおよびグリセリンデヒドロゲナーゼの一方もしくは双方の内因性活性を破壊することから得られる利点を有する、グリセリンおよび１，３−プロパンジオールを生産するための形質転換微生物および方法を開示している。
【０１３６】
米国特許第６，０１３，４９４号明細書は、外因性のグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン−３−リン酸ホスファターゼ、デヒドラターゼ、および１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（例えば、ｄｈａＴ）を含む単一の微生物を使用する、１，３−プロパンジオールを生産するためのプロセスについて記載している。米国特許第６，１３６，５７６号明細書は、デヒドラターゼおよびタンパク質Ｘ（後にデヒドラターゼ再活性化因子ペプチドであることが同定された）をさらに含む組換え微生物を含む、１，３−プロパンジオールを生産するための方法を開示している。
【０１３７】
米国特許第６，５１４，７３３号明細書は、タイター（生成物のグラム／リットル）における有意な増加が、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに変換するための（ｄｈａＴによってコードされる１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼと区別される）非特異的触媒活性によって得られる場合の、プロセスに対する改善について記載している。さらに、米国特許第７，１３２，５２７号明細書は、１，３−プロパンジオールの生産にとって有用なベクターおよびプラスミドを開示している。
【０１３８】
１，３−プロパンジオールの生産の増大は、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載のように、一部の標的遺伝子の発現を下方調節し、かつその他の標的遺伝子の発現を上方調節するなど、宿主細菌に対するさらなる修飾によって達成されうる。ＰＴＳ陰性宿主における炭素源としてのグルコースの利用においては、グルコキナーゼ活性の発現が増大しうる。
【０１３９】
発現の増大または上方調節が１，３−プロパンジオールの生産を増大させる、追加的な遺伝子は、
・典型的にはＥＣ４．１．１．３１として特徴づけられるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
・典型的にはＥＣ２．５．１．１７として特徴づけられるＣｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ
・３−ＨＰＡおよび１，３−プロパンジオールの相互変換を触媒するのに十分な非特異的触媒活性
をコードする遺伝子を含み、また詳細には、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを除外し、典型的には、これらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。
【０１４０】
発現の低下または下方制御が１，３−プロパンジオールの生産を増大させる、遺伝子は、
・好気的呼吸制御タンパク質
・メチルグリオキサルシンターゼ
・酢酸キナーゼ
・ホスホトランスアセチラーゼ
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ
・アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ
・トリオースリン酸イソメラーゼ
・ホスホグルコン酸デヒドラターゼ
をコードする遺伝子を含む。
【０１４１】
別の実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、３−ヒドロキシプロピオン酸を生産する能力を有する。３−ヒドロキシプロピオン酸は、特殊合成（ｓｐｅｃｉａｌｔｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）としての有用性を有し、化学工業における既知の技術によって商業上重要な中間体に、例えば、脱水によってアクリル酸に、酸化によってマロン酸に、アルコールとのエステル化反応によってエステルに、また還元によって１，３−プロパンジオールに変換されうる。３−ヒドロキシプロピオン酸は、同時係属中の共同所有される米国特許出願第６１／１８７４７６号明細書に記載のように、単一の微生物により、発酵性炭素源から生物学的に生産されうる。１つの代表的な生合成経路においては、炭素基質は、１，３−プロパンジオールの生産について先に記載のように、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼにより、３−ヒドロキシプロピオン酸に変換される。アルデヒドデヒドロゲナーゼの好適例として、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＢ（配列番号１５で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＢ（配列番号１６）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＡ（配列番号１７で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＡ（配列番号１８）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ａｌｄＨ（配列番号１９で示されるコード配列）によってコードされるＡｌｄＨ（配列番号２０）、が挙げられる。
【０１４２】
また、組換え細菌によって１，３−プロパンジオールの生産を改善するための上記の修飾の多くを行うことにより、３−ヒドロキシプロピオン酸の生産を改善することが可能である。例えば、グリセリンキナーゼの除去により、Ｇ３Ｐホスファターゼの作用によってＧ３Ｐから形成されるグリセリンが、ＡＴＰを消費してＧ３Ｐに再変換されることが阻止される。また、グリセリンデヒドロゲナーゼ（例えば、ｇｌｄＡ）の除去により、ＮＡＤ依存性グリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってＤＨＡＰから形成されるグリセリンが、ジヒドロキシアセトンに変換されることが阻止される。突然変異は、酵素活性の活性を阻害または改善するように、構造遺伝子に対して特異的であるか、あるいは、酵素活性の発現レベルを調節するように、プロモーター領域およびリボソーム結合部位を含む調節遺伝子に対して特異的でありうる。
【０１４３】
上方調節または下方調節は、当業者に既知の種々の方法によって行ってもよい。遺伝子の上方調節または下方調節が、その遺伝子によってコードされるタンパク質に由来する、細胞内に存在する活性のレベルの、活性の（例えば、対応する（または非改変）野生型遺伝子によってコードされるタンパク質の活性による）対照レベルに対しての改変を示すことは十分に理解されている。
【０１４４】
酵素経路に関与する特異的遺伝子は、上方調節により、それらのコードされた機能の活性を高めることが可能である。例えば、選択された遺伝子の追加的なコピーを、ｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミド上の宿主細胞に導入してもよい。また、かかる遺伝子を、そのコードされた機能の活性の増大をもたらす適切な調節配列を有する染色体に組み込んでもよい。標的遺伝子は、非天然プロモーターまたは改変された天然プロモーターの制御下に置かれるように、修飾してもよい。内因性プロモーターは、突然変異、欠失、および／または置換により、インビボで改変してもよい。
【０１４５】
あるいは、特定の遺伝子の発現を、所与の活性レベルに対し、低下させるかまたは失わせることは有用でありうる。遺伝子を下方調節する（破壊する）方法は、当業者に既知である。
【０１４６】
下方調節は、コード領域および／または調節（プロモーター）領域の欠失、挿入、または改変により生じうる。特異的な下方調節は、ランダム突然変異とそれに続くスクリーニングまたは選択により、あるいは、遺伝子配列が既知である場合、当業者に既知の分子生物学的方法による直接的介入により、得ることができる。限定はされないが、特に有用である下方調節を行うための方法は、プロモーター長を変更することである。
【０１４７】
さらに、遺伝子発現の下方調節を用い、目的のタンパク質の発現を阻止するか、または非機能的なタンパク質の発現をもたらすことが可能である。これは、例えば、１）コード領域および／または調節（プロモーター）領域を欠失させ、２）外因性核酸配列をコード領域および／調節（プロモーター）領域に挿入し、また３）コード領域および／または調節（プロモーター）領域を（例えば、ＤＮＡ塩基対変化を行うことにより）改変することにより、行ってもよい。特異的な破壊は、ランダム突然変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって得ることができるか、あるいは、特異的な破壊は、遺伝子配列が既知である場合、当業者に既知の（ｋｎｏｗ）分子生物学的方法を用いる直接的介入により、得ることができる。特に有用な方法は、大量のコード領域および／または調節（プロモーター）領域の欠失である。
【０１４８】
組換えタンパク質の発現を改変する方法は、当業者に既知であり、Ｂａｎｅｙｘ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９年）１０：４１１頁；Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８年）１８０：５３７５頁；ｄｅＨａｓｅｔｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８年）１８０：３０１９頁；ＳｍｏｌｋｅおよびＫｅａｓｌｉｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００２年）８０：７６２頁；Ｓｗａｒｔｚ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１年）１２：１９５頁；およびＭａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２年）１８４：５７３３頁において一部考察がなされている。
【０１４９】
上記のように、グリセリンおよびグリセリン誘導体を含む微生物生成物の生産における、スクロースを代謝するための遺伝子発現における必要な変化を有する組換え細菌は、当該技術分野で周知の技術（その一部は本明細書の実施例において例示される）を用いて作成してもよい。
【０１５０】
本明細書で開示される組換え細菌の作成は、好適な宿主微生物におけるグリセリンおよびその誘導体の生産においてスクロースの利用能を与える、コード領域のクローニング、形質転換および発現に適した種々のベクターならびに形質転換および発現カセットを使用して行ってもよい。好適なベクターは、使用される細菌に適合しうるものである。好適なベクターは、例えば、細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７もしくはＭ−１３由来ファージなど）、コスミド、酵母または植物に由来しうる。かかるベクターを入手し、使用するプロトコルは、当業者に既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。
【０１５１】
所望される宿主細菌において本発明におけるコード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは、極めて多数存在し、当業者にとって周知である。発現を駆動する能力を有する仮想的に任意のプロモーターは、本明細書での使用に適している。例えば、上掲のプロモーターのいずれかを使用してもよい。
【０１５２】
終結制御領域もまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子に由来しうる。場合により、終結部位は不要でありうるが、それは含められる場合が最も好ましい。
【０１５３】
本ポリペプチドの有効な発現においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを介して選択された発現制御領域に作動可能に連結される。
【０１５４】
米国特許第７，３７１，５５８号明細書中に記載のベクターｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、およびｐＳＹＣＯ１０９、および米国特許第７，５２４，６６０号明細書中に記載のｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯは、本発明において得に有用である。これらのベクターの本質的要素は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたｄｈａレギュロンに由来する。各ベクターは、３つの別々のオペロン内に配列されたオープンリーディングフレームｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、ｄｈａＸ（配列番号７１で示されるコード配列）、ｏｒｆＸ、ＤＡＲ１、およびＧＰＰ２を有する。ｐＳＹＣＯ１０１、ｐＳＹＣＯ１０３、ｐＳＹＣＯ１０６、ｐＳＹＣＯ１０９、およびｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯのヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、および配列番号７６で示される。ベクター間の差異は、下の表中に図示される［接頭辞「ｐ−」は、プロモーターを示し、各「（ ）」内に含まれるオープンリーディングフレームは、オペロンの組成物を示す］：
ｐＳＹＣＯ１０１（配列番号７２）：
他の２つの経路オペロンに比べて逆方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）
ｐＳＹＣＯ１０３（配列番号７３）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．５の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．５の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）
ｐＳＹＣＯ１０６（配列番号７４）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ＿ｏｒｆＷ）
ｐＳＹＣＯ１０９（配列番号７５）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）
ｐＳＹＣＯ４００／ＡＧＲＯ（配列番号７６）：
他の２つの経路オペロンに比べて同方向のｐ−ｔｒｃ（Ｄａｒ１＿ＧＰＰ２）、
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｄｈａＢ１＿ｄｈａＢ２＿ｄｈａＢ３＿ｄｈａＸ）、および
ｐ−１．６の長いＧＩ（ｏｒｆＹ＿ｏｒｆＸ）
経路オペロンに比べて逆方向のｐ−１．２０の短い／長いＧＩ（ｓｃｒＫ）
【０１５５】
一旦好適な発現カセットが作成されると、それらを使用し、適切な宿主細菌が形質転換される。コード領域を有するカセットの宿主細菌への導入は、例えば形質転換（例えば、カルシウム透過性細胞またはエレクトロポレーションを用いる）または組換えファージウイルスを用いる形質移入による既知の手順により、行ってもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。発現カセットは、宿主細胞内の安定なプラスミド上で維持されうる。さらに、発現カセットは、当業者に周知のベクターおよび方法を用いる相同またはランダム組換えを通じて宿主細菌のゲノムに組み込んでもよい。発現カセットのゲノム組み込みにおいては、部位特異的組換え系もまた使用可能である。
【０１５６】
例示される細胞に加え、グリセリンおよび／またはその誘導体を含む微生物生成物の生産を促進するように専用設計された単一または複数の突然変異を有する細胞もまた使用可能である。炭素供給原料を非生産的経路に通常的に転換するか、または有意な異化代謝産物抑制を示す細胞は、突然変異を受けることで、これらの表現型の欠損が回避されうる。
【０１５７】
突然変異体を作製する方法は、当該技術分野で一般的でかつ周知である。一部の方法の概要が、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に提示されている。放射線または化学剤を使用して突然変異体を作製するための特定の方法は、当該技術分野で十分に立証されている。例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６、２２７頁（１９９２年）を参照のこと。
【０１５８】
突然変異誘発が生じている上で、所望される表現型を有する突然変異体は、種々の方法によって選択してもよい。ランダムスクリーニングは、突然変異細胞が所望される生成物または中間体を生産する能力について選択される場合に最も一般的である。あるいは、突然変異体の選択的単離は、突然変異集団を、耐性コロニーのみが発生しうる場合の選択培地上で成長させることによって実施可能である。突然変異体の選択方法は、高度に発達し、工業微生物学の当該技術分野で周知である。例えば、Ｂｒｏｃｋ、上記；ＤｅＭａｎｃｉｌｈａら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１４、３１３頁（１９８４年）を参照のこと。
【０１５９】
本発明における発酵培地は、炭素基質としてスクロースを含む。グルコースおよびフルクトースなどの他の炭素基質もまた、存在しうる。
【０１６０】
炭素基質に加え、好適な発酵培地は、培養物の成長ならびにグリセリンおよびその誘導体、例えば１，３−プロパンジオールの生産にとって必要な酵素経路の促進に適した、当業者に既知の、例えば、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有する。１，３−プロパンジオールの生産においては、Ｃｏ（ＩＩ）塩および／またはビタミンＢ１２またはその前駆体に対して特別な注意が払われる。
【０１６１】
アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ１２）は、デヒドラターゼ活性における重要な補因子である。補酵素Ｂ１２の合成は、原核生物において見出され、その一部、例えば、エシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種は、化合物をデノボ合成することができる一方、それ以外は、部分的な反応を行うことができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、コリン環構造を作製できないが、コビナミドのコリノイドへの変換を触媒可能であり、かつ５’−デオキシアデノシル基を導入することができる。したがって、補酵素Ｂ１２前駆体、例えばビタミンＢ１２が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵物に提供される必要があることは当該技術分野で既知である。ビタミンＢ１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵物に一定速度で連続的に添加するか、または細胞塊の生成と一致するように段階分けするか、または単回もしくは複数回ボーラス添加で添加してもよい。
【０１６２】
ビタミンＢ１２は本明細書中に記載の形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に添加されるが、ビタミンＢ１２のデノボ生合成が可能な他の細菌もまた好適な生成細胞になり、かつビタミンＢ１２のこれらの細菌への添加が不要になると考えられる。
【０１６３】
典型的には、細菌細胞は、スクロースを含有する適切な培地中で、２５〜４０℃で成長される。本明細書中での使用に適した成長培地の例として、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）培養液などの一般的な商業的に調製された培地が挙げられる。また、他の限定または合成成長培地を使用してもよく、特定の細菌の成長に適した培地は、微生物学または発酵科学の一部の当業者にとって既知であろう。また、異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られた使用される作用剤、例えば環式アデノシン２’：３’−一リン酸を、反応培地に取り込ませてもよい。同様に、１，３−プロパンジオールの生産の促進をもたらす酵素活性を調節することで知られた使用される作用剤（例えばメチルビオロゲン）を、１，３−プロパンジオール生産株と併せて、またはそれを用いる遺伝子操作の代わりとして使用してもよい。
【０１６４】
発酵に適したｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の間であり、ここでｐＨ６．０〜ｐＨ８．０は、初期条件として典型的である。
【０１６５】
反応は、組換え細菌の要件に依存し、好気性、無酸素、または嫌気性条件下で行ってもよい。流加発酵は、限定されたまたは過剰の、炭素供給物、例えば炭素基質を用いて実施してもよい。
【０１６６】
バッチ発酵は、一般に使用される方法である。古典的なバッチ発酵は、培地の組成物が発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的改変を受けない場合の閉鎖系である。したがって、発酵の開始時、培地には所望される細菌が接種され、発酵では系に何も添加しない事態が許容される。しかし、典型的には、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、またｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、発酵が停止される時間に至るまで常に変化する。バッチ培養物中で、細胞は、静止遅滞期（ｓｔａｔｉｃ ｌａｇ ｐｈａｓｅ）から高い対数増殖期まで、そして最終的に静止期まで抑制され、ここで増殖速度は低下または停止される。未処理の場合、静止期における細胞は最終的に死滅する。対数期における細胞は、一般に最終生成物または中間体の生産の大部分に関与する。
【０１６７】
標準のバッチ系に対する変形は、流加系である。流加発酵プロセスはまた、本明細書中での使用に適しており、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加されること以外では典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や、倍地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合、有用である。流加系における実際の基質濃度の測定は、困難であることから、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて評価されている。バッチおよび流加発酵は、当該技術分野で一般的でかつ周知であり、Ｂｒｏｃｋ、上記において事例を見出すことができる。
【０１６８】
連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、かつ等量のならし培地が処理と同時に除去される場合、開放系である。連続発酵では、細胞が主に対数増殖期にある場合、一般に培養物は一定の高密度で維持される。
【０１６９】
連続発酵では、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を与える１つの要素またはいくつもの要素の調節が許容される。例えば、１つの方法は、限られた栄養素、例えば炭素源または窒素レベルを一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを適度にすることを可能にする。他の系では、増殖に影響を与える多数の要素を連続的に変更することが可能である一方、培地の濁度によって測定される細胞濃度は一定に保持される。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとすることから、培地が除去されることによる細胞消失は、発酵における細胞増殖速度に対して均衡を保つ必要がある。連続発酵プロセスにおける栄養素および増殖因子ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術を調節する方法は、工業微生物学の当該技術分野で周知であり、種々の方法が、Ｂｒｏｃｋ（上記）において詳述される。
【０１７０】
本発明は、バッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、また任意の既知の発酵方法であれば好適となることが考えられる。さらに、細胞を、全細胞触媒としての基質上に固定化し、またグリセリンおよびグリセリン誘導体、例えば１，３−プロパンジオールの生産のための発酵条件下に置くことが可能であると考えられる。
【０１７１】
一実施形態では、グリセリン、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するためのプロセスが提供される。同プロセスは、スクロースの存在下で上記の組換え細菌を培養するステップと、場合により、生産されたグリセリン、１，３−プロパンジオール、および／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、を含む。生成物は、当該技術分野で既知の方法を用いて回収してもよい。例えば、固体は、遠心分離、濾過、デカンテーション、またはそれに類するものにより、発酵培地から取り出してもよい。次いで、生成物は、蒸留、液体−液体抽出、または膜に基づく分離などの方法を用い、固体を上記のように取り出すように処理されている発酵培地から単離してもよい。
【実施例】
【０１７２】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方、あくまで例示として提供されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認し、かつ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改良を行い、それを様々な用途および条件に適合させることができる。
【０１７３】
一般的方法
実施例に記載される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｎｎａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４年）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる発行（１９８７年）により、記載がなされている。
【０１７４】
細菌培養物の維持および成長に適した材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適した技術は、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４年））中に、またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ 「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）により提示されたものとして見出されうる。細菌細胞の成長および維持について記載のすべての試薬、制限酵素および材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。
【０１７５】
略語の意味は、次の通りである。「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｒｐｍ」は回転毎分を意味し、「ＡＴＣＣ」はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「ｄＨ２Ｏ」は蒸留水を意味する。
【０１７６】
実施例１
ｃｓｃオペロン発現プラスミドの作成
本実施例では、ｃｓｃオペロン発現プラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡおよびｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢの作成について例示する。
【０１７７】
ゲノムＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ１３２８１から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。長さ約４ｋｂｐの断片を、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡアガロースゲル電気泳動によって単離し、プラスミドベクターｐＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））（これも予めＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した）とライゲートした。得られたプラスミドを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａｌｐｈａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を形質転換し、スクロース利用に必要な遺伝子を有する形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙスクロース寒天（Ｄｉｆｃｏ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）製のＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天基材）上での成長によって同定した。プラスミドＤＮＡを、スクロースの代謝能を得たコロニーから単離し、プラスミド（ｐＳｃｒ１と称される；配列番号７７で示される）を、配列決定し、スクロース利用に必要なＤＮＡの領域を同定した。挿入物は、長さ４１４０ｂｐであり、既知の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）スクロース利用遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＡに相同な推定上のオープンリーディングフレームを有した（Ｊａｈｒｅｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５３０７−５３１６頁、２００２年）。
【０１７８】
その後、以下の手順を用い、ｃｓｃオペロンを、プラスミドｐＢＨＲ１（ＭｏｂｉＴｅｃ ＧｍｂＨ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移した。プラスミドｐＳｃｒ１を、ＸｈｏＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、平滑末端を得た後、ＡｇｅＩで消化した。得られたｃｓｃ遺伝子を有する４１７５ｂｐの断片を、ゲル精製によって単離した。プラスミドｐＢＨＲ１を、ＡｇｅＩおよびＮａｅＩで消化し、得られた５１４２ｂｐの断片を、ゲル精製によって単離した。次いで、２つのゲル精製断片をライゲートし、得られたプラスミドを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａｌｐｈａを形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上での成長によって選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単離し、プラスミドの配列を検証した。プラスミドは、ｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡ（配列番号７８で示される）と称した。
【０１７９】
別の発現プラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を使用し、ｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡにおける単一の塩基対置換を行うことによって生成した。位置４２６３のチミン塩基をグアノシンで置換し、得られたプラスミドをｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢ（配列番号７９で示される）と称した。この置換の結果、ｃｓｃＢによってコードされるポリペプチドにおいて、グルタミン残基がヒスチジンと置換され、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＣ３１３２（Ｊａｈｒｅｉｓら、上記）由来の相同性タンパク質の輸送能を改変することが報告された変化であった。
【０１８０】
実施例２〜４
ｃｓｃオペロンを含む組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の作成
これらの実施例では、ｃｓｃオペロンを含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の作成について例示する。スクロースの消費およびこれらの組換え株によるスクロースからの最終生成物１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）およびグリセリンの生産について実証した。
【０１８１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＴａｂ ｐＳＹＣＯ１０９
株ＴＴａｂを、米国特許第７，３７１，５５８号明細書（実施例１７）に記載された、株ＴＴ ａｌｄＡ由来のａｌｄＢ遺伝子の欠失によって生成した。要するに、ａｌｄＢの欠失を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ番号：７００９２６としてＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能）におけるａｌｄＢの１．５ｋｂｐのコード領域をｐＫＤ３プラスミドのＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴカセットとまず置換することによって行った（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５頁、２０００年）。置換カセットを、鋳型としてｐＫＤ３を使用するプライマー対の配列番号８０および配列番号８１を用いて増幅した。プライマー配列番号８０は、ａｌｄＢの５’末端に対して８０ｂｐの相同性およびｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を有する。プライマー配列番号８１は、ａｌｄＢの３’末端に対して８０ｂｐの相同性およびｐＫＤ３に対して２０ｂｐの相同性を有する。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６コンピテント細胞にエレクトロポレートした（米国特許第７，３７１，５５８号明細書）。組換え株を、１２．５ｍｇ／Ｌのクロロアムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を有するＬＢプレート上で選択した。ａｌｄＢ遺伝子の欠失を、プライマー対の配列番号８２および配列番号８３を使用するＰＣＲによって確認した。野生型株から１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物を得る一方、組換え株から特徴的な１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。Ｐ１溶解物を調製し、それを使用して突然変異をＴＴ ａｌｄＡ株に生じさせ、ＴＴ ａｌｄＡΔａｌｄＢ：：Ｃｍ株を形成した。クロラムフェニコール耐性クローンを、プライマー対の配列番号８２および配列番号８３を使用するゲノムＰＣＲによって検査し、突然変異が存在することを確認した。クロラムフェニコール耐性マーカーを、ＦＬＰリコンビナーゼ（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、上記）を使用して除去し、株ＴＴａｂを作製した。次いで、株ＴＴａｂを、米国特許第７，３７１，５５８号明細書に記載のｐＳＹＣＯ１０９（配列番号７５で示される）で形質転換し、株ＴＴａｂｐＳＹＣＯ１０９を生成した。
【０１８２】
引用した参考文献に記載のように、株ＴＴａｂは、
ｇｌｐＫ、ｇｌｄＡ、ｐｔｓＨＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ａｒｃＡ、ｍｇｓＡ、ｑｏｒ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子の欠失；
ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｂｔｕＲ、ｐｐｃ、およびｙｑｈＤ遺伝子の上方調節；および
ｇａｐＡ遺伝子の下方調節、
の修飾を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＦＭ５（ＡＴＣＣ番号５３９１１）の誘導体である。
【０１８３】
プラスミドｐＳＹＣＯ１０９は、グリセリン生成経路をコードする遺伝子（ＤＡＲ１およびＧＰＰ２）ならびにグリセリンデヒドラターゼおよびそれに関連する再活性化因子をコードする遺伝子（ｄｈａＢ１２３、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ）を有する。
【０１８４】
株ＴＴａｂ／ｐＳＹＣＯ１０９を、実施例１に記載の、２つのｃｓｃオペロン過剰発現プラスミドｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡおよびｐＢＨＲｃｓｃＢＫＡｍｕｔＢの各々で形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上での成長により、選択した。個々のコロニーを、採取し、同じ抗生物質を有するＬＢ培養液中、振とう下（２５０ｒｐｍ）、３４℃で一晩成長させた。対照株ＴＴａｂ／ｐＳＹＣＯ１０９を、カナマイシンを別として同一条件下で成長させた。
【０１８５】
これらの一晩培養物を、１０．５ｇ／Ｌのスクロースを含有するＴＭ３培地に、０．０１単位の光学密度（５５０ｎｍで測定）まで希釈した。ＴＭ３は、６．８の最終ｐＨを提供するための、１３．６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．０４ｇ／Ｌのクエン酸二水和物、２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、０．３３ｇ／Ｌのクエン酸第２鉄アンモニウム、０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ＬのＨ３ＢＯ４、０．１ｍｇ／ＬのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏおよび十分なＮＨ４ＯＨを含有する最少培地である。ビタミンＢ１２を、０．１ｍｇ／Ｌの濃度になるまで培地に添加した。培養物を、振とう下（２２５ｒｐｍ）、３４℃で２４時間インキュベートした。一定分量を、接種の０、５、８、１１、１４、１７、２０および２３時間後に除去し、培養液中のスクロース、グリセリンおよび１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）の濃度を、高性能液体クロマトグラフィーによって測定した。
【０１８６】
クロマトグラフ分離を、０．５ｍＬ／分の流速および６０℃のカラム温度でのｄＨ２Ｏ
のイソクラティック移動相を有するＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して行った。溶出化合物を、ＴＭ３培地に既知の濃度になるまで溶解した市販購入した純粋化合物から調製された標準曲線を参照する屈折率検出により、定量した。保持時間は、スクロースで１２．２分、１，３−プロパンジオールで１７．９分、およびグリセリンで２３．６分であった。
【０１８７】
両方のｃｓｃ発現プラスミド（実施例３および４）が、スクロースの代謝とＰＤＯおよびグリセリンの生産をもたらす一方、親対照株（実施例２、比較）は、これらの条件下で、スクロースを代謝するか、あるいはＰＤＯまたはグリセリンを生成することができなかった（表２〜４を参照）。表中に示されるデータ点は、２通りの培養物に対して作成した測定値の平均を表す。
【０１８８】
【表３】
【０１８９】
【表４】
【０１９０】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え細菌であって、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、
（ａ）スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列、
（ｂ）フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｃ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ、同一のまたは異なるプロモーターに作動可能に連結され、
さらに、上記組換え細菌は、スクロースを代謝して、グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸からなる群から選択される生産物を生産する能力を有する、組換え細菌。
【請求項２】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項３】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、
ａ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット、
ｂ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット、および
ｃ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット、
を含む、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項４】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、
ａ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット、
ｂ）配列番号３８で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット、
ｃ）配列番号４０で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット、および
ｄ）配列番号４２で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第４のサブユニット、
を含む、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項５】
フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号８５、または配列番号８７で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項６】
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項７】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、配列番号２６で示される配列に実質的に相当する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項８】
フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４８で示される配列に実質的に相当する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項９】
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５８で示される配列に実質的に相当する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１０】
前記細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、およびアエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細菌。
【請求項１１】
前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１０に記載の組換え細菌。
【請求項１２】
グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するための方法であって、
ａ）スクロースの存在下で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細菌を培養するステップと、
ｂ）場合により、生産されたグリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１３】
グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するための方法であって、
ａ）スクロースの存在下で、請求項１０に記載の組換え細菌を培養するステップと、
ｂ）場合により、生産されたグリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１】
組換え細菌であって、そのゲノム内または少なくとも１つの組換えコンストラクト上に、
（ａ）スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列、
（ｂ）フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｃ）スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ、同一のまたは異なるプロモーターに作動可能に連結され、
さらに、上記組換え細菌は、スクロースを代謝して、グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび３−ヒドロキシプロピオン酸からなる群から選択される生産物を生産する能力を有する、組換え細菌。
【請求項２】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項３】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、
ａ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット、
ｂ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット、および
ｃ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット、
を含む、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項４】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチド複合体は、
ａ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のサブユニット、
ｂ）配列番号３８で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のサブユニット、
ｃ）配列番号４０で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のサブユニット、および
ｄ）配列番号４２で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する第４のサブユニット、
を含む、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項５】
フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号８５、または配列番号８７で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項６】
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８で示されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法に基づき、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項７】
スクローストランスポーター活性を有するポリペプチドは、配列番号２６で示される配列に実質的に相当する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項８】
フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４８で示される配列に実質的に相当する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項９】
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５８で示される配列に実質的に相当する、請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項１０】
前記細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、およびアエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細菌。
【請求項１１】
前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１０に記載の組換え細菌。
【請求項１２】
グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するための方法であって、
ａ）スクロースの存在下で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細菌を培養するステップと、
ｂ）場合により、生産されたグリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１３】
グリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸をスクロースから作製するための方法であって、
ａ）スクロースの存在下で、請求項１０に記載の組換え細菌を培養するステップと、
ｂ）場合により、生産されたグリセリン、１，３−プロパンジオールおよび／または３−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップと、
を含む、上記方法。
【公表番号】特表２０１３−５１２６７５（Ｐ２０１３−５１２６７５Ａ）
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２２１２（Ｐ２０１２−５４２２１２）
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８８３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９０３３
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８８３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９０３３
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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