スチレンアクリル樹脂を分解する微生物培養物
【課題】樹脂をより高い効率で、より安定的に、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解でき、該樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができる手段を提供すること。
【解決手段】シュードモナス ボレオポリスに属する微生物を含有した、スチレンアクリル化合物の生分解能を少なくとも呈する微生物培養物；該微生物培養物を含有した、スチレンアクリル化合物の分解用組成物；スチレンアクリル化合物を含む生産物若しくは廃棄物と、該微生物培養物又は分解用組成物とを接触させる、スチレンアクリル化合物の分解方法；並びに、スチレンアクリル化合物と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、該微生物培養物又は分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル化合物を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離する、廃棄物中の金属又は色素の回収方法。
【解決手段】シュードモナス ボレオポリスに属する微生物を含有した、スチレンアクリル化合物の生分解能を少なくとも呈する微生物培養物；該微生物培養物を含有した、スチレンアクリル化合物の分解用組成物；スチレンアクリル化合物を含む生産物若しくは廃棄物と、該微生物培養物又は分解用組成物とを接触させる、スチレンアクリル化合物の分解方法；並びに、スチレンアクリル化合物と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、該微生物培養物又は分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル化合物を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離する、廃棄物中の金属又は色素の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物、該樹脂の分解用組成物、並びに廃棄物中の金属又は色素の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、樹脂を含有する廃棄物、例えば、トナー等は、焼却炉等での焼却等により処理されている。しかしながら、前記焼却による処理を行なった場合、廃棄物中に含まれる有用資源の回収が困難になる場合があるという欠点がある。また、前記焼却による処理には、石油資源等を要し、ＣＯ2等の排気ガスの発生を伴うという欠点もある。
【０００３】
一方、加水分解反応により分解されやすいポリエステル樹脂については、特定の微生物により生分解させることができることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。しかしながら、ポリエステル樹脂を生分解することができる微生物では、ポリエステル樹脂以外の樹脂の生分解は困難であるのが現状である。
【非特許文献１】ユタカ トキワ（Ｙｕｔａｋａ Ｔｏｋｉｗａ）、Ｓｅｎ’ｉＧａｋｋａｉｓｈｉ、第７巻、第５２１頁〜第５２６頁（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、１つの側面では、樹脂、例えば、スチレンアクリル樹脂をより高い効率で分解すること、該樹脂をより安定的に分解すること、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解すること、該樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすること、分解により生じた産物を実質的に資化すること等の少なくとも１つを達成しうる、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物を提供することにある。さらに、本発明は、他の側面では、前記樹脂をより高い効率で分解すること、該樹脂をより安定的に分解すること、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解すること、該樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすること等の少なくとも１つを達成しうる、前記スチレンアクリル樹脂の分解用組成物を提供することにある。また、本発明は、別の側面では、前記樹脂を効率よく分解すること、該樹脂を安定的に分解すること、前記樹脂を安価に分解すること、前記樹脂を周辺環境に対し低影響で分解すること、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解すること等の少なくとも１つを達成しうる、スチレンアクリル樹脂の分解方法を提供することにある。本発明のさらに他の側面は、前記樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすること、該廃棄物から有用金属、有用化合物等を安価に回収すること、廃棄物中の有用金属、有用化合物等を、周辺環境に対し低影響で回収すること等の少なくとも１つを達成しうる、廃棄物中の金属又は色素の回収方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物、
〔２〕 シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物が、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０）である、前記〔１〕記載の微生物培養物、
〔３〕 ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物と、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）に属する微生物と、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）に属する微生物と、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物とをさらに含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載の微生物培養物、
〔４〕 前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の微生物培養物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の分解用組成物、
〔５〕 微生物培養物を保持するに適した固定用担体をさらに含有してなる、前記〔４〕記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物、
〔６〕 微生物の培養に適した培地をさらに含有してなる、前記〔４〕又は〔５〕記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物、
〔７〕 （Ａ）スチレンアクリル樹脂を含む生産物若しくは廃棄物と、（Ｂ）前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の微生物培養物又は前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させることを特徴とする、スチレンアクリル樹脂の分解方法、並びに
〔８〕 （ａ）スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、（ｂ）前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の微生物培養物又は前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル樹脂を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離することを特徴とする、廃棄物中の金属又は色素の回収方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の微生物培養物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができ、かつ分解により生じた産物を実質的に資化することができ、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができるという優れた効果を奏する。本発明のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができ、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のスチレンアクリル樹脂の分解方法によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、高い効率で、安定的に分解することができ、該樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルを容易にすることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の廃棄物中の金属又は色素の回収方法によれば、前記樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にし、該有用金属、有用化合物等を、周辺環境に対し低影響で安価に回収することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の１つの側面は、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物を含有した、スチレンアクリル樹脂の生分解能を少なくとも呈する微生物培養物である。
【０００８】
なお、本明細書において、「スチレンアクリル樹脂の生分解能を少なくとも呈する」とは、後述の分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂の生分解能が検出されることを意味し、他の化合物に対する分解活性の有無により限定されないことを意図する。したがって、別の側面では、本発明の微生物培養物には、ポリエステル樹脂、スチレンアクリル樹脂等の化学合成樹脂等に対する分解活性をさらに呈するものも含まれる。
【０００９】
本発明の微生物培養物は、前記微生物を含有しているため、従来、生分解することが困難であったスチレンアクリル樹脂を効率よく、安定的に生分解することができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の微生物培養物によれば、コピー機やプリンターのトナーに使用されている難分解性樹脂であるスチレンアクリル樹脂を生分解することができる。
【００１０】
また、本発明の微生物培養物は、前記微生物を含有しているため、前記樹脂の分解に基づくＣＯ2の発生が、実質的に抑制される。したがって、本発明の微生物培養物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含有する廃棄物を処理する際、大気中へのＣＯ2の放出を実質的に抑制することができるため、環境保護の点で優れた効果を発揮する。
【００１１】
さらに、本発明の微生物培養物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含有する廃棄物中の樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を分解することができ、該廃棄物中の未使用の有用金属又は有用色素の回収の容易化を図ることができる。したがって、本発明の微生物培養物によれば、廃棄物中の未使用の有用金属又は有用色素のリサイクルをより容易にすることができるため、資源の有効利用、環境保護等の点で優れた効果を発揮する。
【００１２】
また、本発明の微生物培養物は、分解により生じた産物を実質的に資化することができるという優れた性質を発現する。したがって、分解により生じた産物の蓄積が実質的に抑制されるため、環境保護等の点で優れた効果を発揮する。
【００１３】
なお、本明細書において、前記廃棄物とは、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む廃棄物をいい、具体的には、例えば、トナー、缶ラミネート、電子機器類の絶縁体、家電の廃棄物、自動車の廃棄物、産業廃棄物等が挙げられる。
【００１４】
前記スチレンアクリル樹脂としては、アクリル酸 ｎ−ブチルエステル等のアクリル酸化合物とスチレンとを重縮合させて得られる化合物等が挙げられる。具体的には、前記スチレンアクリル樹脂としては、特に限定されないが、アクリロニトリルアクリレートスチレン、スチレンブチルアクリレート等が挙げられる。なお、前記スチレンアクリル樹脂の平均分子量、重合度等は、本発明の微生物培養物による生分解能（スチレンアクリル樹脂の分解活性）を呈する範囲であればよい。
【００１５】
なお、本発明の微生物培養物によるスチレンアクリル樹脂の分解活性の評価法としては、例えば、
１） 終濃度５ｇ／Ｌのスチレンアクリル樹脂を含有したＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕に、微生物培養物を接種し、３７℃で７日間、１２５ストローク／分で振とう培養するステップ、
２） 得られた培養液に残存する樹脂成分を、ジクロロメタンで抽出し、ヘキサトリアコンタンを添加し、エバポレーターで減圧乾固させるステップ、
３） 得られた乾固物を、ｎ−ヘキサン：トルエン／２：８（体積比） ５ｍＬに溶解し、得られた試料 １μＬを、例えば、商品名：クロマロッドＳＩＩＩ（０．１×１０ｃｍ）（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いた薄層クロマトグラフィーに供し、ｎ−ヘキサンで展開させるステップ、及び
４） 例えば、商品名：イアトロスキャンＭｋ−６ｓ（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いて、検出器：ＦＩＤ、水素ガス：１６０ｍＬ／分、空気：２．０Ｌ／分、スキャン速度：３０秒／スキャンの条件で、培養液中のスチレンアクリル樹脂及びスチレンアクリル樹脂の分解産物それぞれに対応するピークを検出するステップ、
を含む方法等が挙がられる。
【００１６】
前記ステップ１）において、前記スチレンアクリル樹脂を含有したＦＹ培地は、ジクロロメタンに溶解したスチレンアクリル樹脂を終濃度５ｇ／Ｌになるように試験管に分注し、風乾させ、ＦＹ培地 ５ｍＬを添加し、１２１℃２０分間高圧滅菌することにより調製されうる。
【００１７】
前記ステップ３）において、薄層クロマトグラフィーは、恒湿槽（条件：６５％ＲＨ）で１０分間インキュベーションし、ついで、ｎ−ヘキサンが入った展開槽内で、３７℃で展開することにより行なわれうる。
【００１８】
なお、前記分解活性の評価において、対照として、微生物培養物非存在下の場合について同様に行なえばよい。前記分解活性は、微生物培養物存在下の場合の各ピークの面積と、対照の場合の各ピークの面積とを比較することにより評価される。スチレンアクリル樹脂に対応するピークの面積がゼロの場合、当該スチレンアクリル樹脂が１００％分解されたことの指標となり、前記分解活性は、〔｛（コントロールのスチレンアクリル樹脂に対応するピーク面積）−（培養液のスチレンアクリル樹脂に対応するピーク面積）｝／（コントロールのスチレンアクリル樹脂に対応するピーク面積）〕×１００（％）として算出された値で示される。
【００１９】
なお、前記スチレンアクリル樹脂の分解活性の評価において、スチレンアクリル樹脂の代わりに、他の樹脂化合物を適切な溶媒に溶解させて用いることにより、当該樹脂化合物に対する分解活性を評価することができる。
【００２０】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物としては、上記スチレンアクリル樹脂の分解活性の評価方法によりスチレンアクリル樹脂に対して分解活性を示すものであればよく、具体的には、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５等が挙げられる。なお、前記シュードモナス ボレオポリス Ｑ−５は、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ Ｑ−５」と命名・表示され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０（受託日：２００５年２月２８日）の下、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター〔郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８〕に寄託されている。
【００２１】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、１６Ｓ ｒＤＮＡ解析をした場合、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）との相同性が、９９．５％である。また、前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：粘質であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 有、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 有、オルニチンデカルボキシラーゼ 有、ウレアーゼ 有、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 有、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 無、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００２２】
なお、前記１６Ｓ ｒＤＮＡ解析は、Ｂｌａｓｔ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズム（条件：検索対象Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（バクテリア、ＧＡＰ計算あり、期待値１０）に基づき、デフォルトの条件で、例えば、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のデータを用いて、対象となる１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と、既知の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列とを比較することにより行なわれうる。
【００２３】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５によれば、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社供給〕の分解活性を測定した生分解率として、約４０％の生分解率を達成することができ、当該シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５非存在下の場合に比べ、安定的に、例えば、約２．０ｍｇ／５ｍＬ／７日の生分解率を達成するという優れた性質を示す。
【００２４】
なお、本発明においては、前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５に代えて、該シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５と進化系統樹上近い位置にある微生物であって、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂の分解活性が検出される微生物を用いることもできる。
【００２５】
かかるシュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５を含有した本発明の微生物培養物は、該シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５によりスチレンアクリル樹脂が分解され生成した分解産物を捕捉若しくは資化しうる他の微生物をさらに含有していてもよい。また、本発明の微生物培養物は、別の側面では、前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５と協調的に、樹脂、例えば、スチレンアクリル樹脂等を分解しうる他の微生物をさらに含有していてもよい。
【００２６】
本発明の微生物培養物は、好ましくは、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物と、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）に属する微生物と、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）に属する微生物と、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物とをさらに含有した微生物培養物である。かかる微生物培養物によれば、前記微生物が一群として、協調的に作用しうるため、スチレンアクリル樹脂に対して、より安定的に、より高い生分解能が維持されるという優れた効果を発揮する。また、本発明の微生物培養物によれば、前記微生物が一群として、協調的に前記スチレンアクリル樹脂を分解し、それぞれの生育における栄養素として用いることができる。したがって、本発明の微生物培養物によれば、周辺環境に対し低影響で前記スチレンアクリル樹脂を分解することができる。
【００２７】
より具体的には、混合微生物群ＡＭＯＣ２の微生物培養物が挙げられる。
【００２８】
なお、前記ＡＭＯＣ２は、ＡＭＯＣ２と命名・表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構〔郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８〕に安全寄託されている。また、前記ＡＭＯＣ２は、近畿大学農学部農芸化学科応用微生物研究室（郵便番号：６３１−８５０５ 奈良県奈良市中町３３２７−２０４）に保存されており、必要に応じ、「独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター」における分譲に関する取り扱いに準じて、特許法施行規則第２７条の３に規定される分譲が行なわれ、入手可能である。
【００２９】
前記ＡＭＯＣ２の微生物培養物によれば、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社供給〕の分解活性を測定した生分解率として、約４５％の生分解率を達成することができ、当該微生物培養物非存在下の場合に比べ、安定的に、少なくとも約２．３ｍｇ／５ｍＬ／７日の生分解率を達成するという優れた性質を示す。
【００３０】
前記ＡＭＯＣ２は、適切な希釈率で滅菌生理食塩水に希釈し、例えば、Ｒ２Ａ平板培地〔組成：０．０５重量％ 酵母エキス、０．０５重量％ ペプトン、０．０５重量％ カザミノ酸、０．０５重量％ グルコース、０．０５重量％ 可溶性スターチ、０．０３重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．００５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０３重量％ ピルビン酸ナトリウム、１．５重量％ 寒天；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に塗布し、３７℃で７〜１４日間培養し、生じたコロニーを均一になるまで選択することにより、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２、Ｑ−３株、Ｑ−４株、前記シュードモナス ボレオポリス Ｑ−５〔Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ Ｑ−５（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０、受託日：２００５年２月２８日）〕及びアルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６を含有することが確認される混合微生物の培養物である。
【００３１】
なお、本発明においては、前記ＡＭＯＣ２に含まれる各微生物に代えて、該微生物と進化系統樹上近い位置にある微生物であって、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂の分解活性が検出される微生物を用いることもできる。
【００３２】
ここで、前記ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＴＵＴ１２３８との相同性が、９８．６％である。また、前記ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：粘質であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 有、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 無、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 有、クエン酸の利用 無、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３３】
前記メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）との相同性が、９８．６％である。また、前記メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：赤色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 有、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 無、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３４】
前記Ｑ−３は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）との相同性が、９６．５％である。また、前記Ｑ−３は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：周縁部が緑色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 無、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３５】
前記Ｑ−４は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）との相同性が、９６．６％である。また、前記Ｑ−４は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：周縁部が赤色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 無、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３６】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５は、前記と同様である。
【００３７】
前記アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） ｍｐ−２との相同性が、９９．６％である。また、前記アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：無色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 有、ウレアーゼ 有、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３８】
本発明の微生物培養物は、炭素源として、前記スチレンアクリル樹脂等を含有し、窒素源として、例えば、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４等の存在下に維持されうる。前記窒素源は、微生物を生育させるに十分な窒素源を供給する観点から、好ましくは、０．５重量％以上、より好ましくは、０．６ 重量％以上、さらに好ましくは、１．０重量％以上であり、微生物に十分な生育能を発揮させる観点から、好ましくは、３．０重量％以下、より好ましくは、１．７重量％以下、さらに好ましくは、１．２重量％以下であることが望ましい。また、炭素源／窒素源重量比（Ｃ／Ｎ比）は、炭素源と窒素源とのバランスを調整する観点から、好ましくは、４０以上、より好ましくは、４３以上、さらに好ましくは、４８以上であり、微生物に十分な生育能を発揮させる観点から、好ましくは、６０以下、より好ましくは、５５以下、さらに好ましくは、５０以下であることが望ましい。また、培地のｐＨは、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５、より好ましくは、ｐＨ６．９〜７．１であることが望ましい。本発明の微生物培養物は、前記の条件下、好ましくは、３０〜４０℃、より好ましくは、３５〜３７℃で、１００〜１５０ストローク／分、好ましくは、１１０〜１３０ストローク／分培養することにより維持されうる。
【００３９】
本発明の微生物培養物は、具体的には、前記ＦＹ培地、スチレンアクリル樹脂添加ＦＹ培地（組成：０．５重量％スチレンアクリル樹脂、１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス）等により維持されうる。
【００４０】
本発明は、別の側面では、スチレンアクリル樹脂の分解用組成物に関する。
【００４１】
本発明の分解用組成物は、本発明の微生物培養物を含有する。したがって、本発明の分解用組成物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができ、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができる。
【００４２】
本発明の分解用組成物は、長期にわたって、微生物培養物を安定に保持させる観点から、微生物培養物を保持するに適した固定用担体をさらに含有してもよい。
【００４３】
前記固定用担体としては、微生物培養物に含まれる各微生物の生育を安定的に維持し、該生分解能を阻害しない担体であることが望ましく、長期にわたって、微生物培養物を安定に保持させる観点から、好ましくは、前記微生物により実質的に分解されない担体であることが望ましい。前記固定用担体としては、例えば、多孔質担体、不織布，活性炭、セラミックス、セルロース等が挙げられる。
【００４４】
また、本発明の分解用組成物は、微生物の培養に適した培地をさらに含有していてもよい。
【００４５】
本発明の分解用組成物においては、本発明の微生物培養物を前記不溶性担体の表面に固定化してもよく、内部に固定化若しくは保持させてもよい。本発明の微生物培養物を、かかる担体の内部に固定化若しくは保持させる場合、前記微生物の生育に必要な各種栄養素、分解対象の樹脂、例えば、スチレンアクリル樹脂等の授受が可能な担体であることが望ましい。
【００４６】
本発明の分解用組成物中に含まれる微生物細胞の数には、特に限定されるものではなく、微生物の生育状態、生分解能の発現の程度、当該分解用組成物の取り扱い方法等に応じて適宜設定されうる。
【００４７】
本発明は、他の側面では、（Ａ）スチレンアクリル樹脂を含む生産物若しくは廃棄物と、（Ｂ）本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物とを接触させることを特徴とする、スチレンアクリル樹脂の分解方法に関する。
【００４８】
なお、本明細書において、前記生産物は、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む生産物をいい、具体的には、成型ようの型枠等が挙げられる。
【００４９】
本発明の分解方法は、本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分解方法によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができる。また、本発明の分解方法によれば、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物の処理に適用することにより、該廃棄物中の樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を優先的に生分解し、残存する未使用の有用金属、有用化合物等を回収しやすい状態で分離及び／又は露呈させることができる。そのため、前記廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易に行なうことが可能になる。
【００５０】
本発明の分解方法においては、具体的には、本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物を、前記生産物又は廃棄物の存在下に、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持すること；本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物を、前記生産物又は廃棄物に散布又は混合し、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持すること等を行なえばよい。
【００５１】
前記廃棄物は、必要に応じ、適切な手段で粉砕して粉末状にしてもよく、本発明の微生物培養物の生育を妨げない適切な溶媒に溶解させてもよい。
【００５２】
本発明の分解方法の適用の具体例としては、トナー、缶ラミネート、電子機器類の絶縁体、家電・自動車の廃棄物、産業廃棄物等の廃棄物の処理；樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む廃液の処理；前記廃棄物中からの有用金属や有用化合物の回収；スチレンアクリル樹脂等の樹脂を成型加工等の際に利用した場合、例えば、スチレンアクリル樹脂等の樹脂から製造された型枠に材料を入れ、成型させした場合の目的の成型物の回収の容易化等が挙げられる。
【００５３】
本発明は、他の側面では、（ａ）スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、（ｂ）本発明の微生物培養物又は分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル樹脂を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離することを特徴とする、廃棄物中の金属又は色素の回収方法に関する。
【００５４】
本発明の回収方法によれば、本発明の微生物培養物又は分解用組成物が用いられているため、スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物中の樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を優先的に生分解し、残存する未使用の有用金属、有用化合物等を回収しやすい状態で分離及び／又は露呈させることができる。そのため、前記廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等を、周辺環境に対し低影響で、容易に、安価に回収することができ、前記有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易に行なうことが可能になる。
前記（ａ）の廃棄物と、前記（ｂ）の微生物培養物又は分解用組成物との接触は、
１） 必要に応じ、廃棄物を適切な手段で粉砕して粉末状にし、あるいは本発明の微生物培養物の生育を妨げない適切な溶媒に廃棄物を溶解させるステップ、及び
２） 本発明の微生物培養物又は分解用組成物を、前記廃棄物の存在下に、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持するステップ、又は、
２’）本発明の微生物培養物又は分解用組成物を、前記廃棄物に散布又は混合し、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持するステップ、
により行なわれうる。
【００５５】
廃棄物中に含まれるスチレンアクリル樹脂の分解後の産物は、スチレンアクリル樹脂から構成される成分が実質的に除去されている。したがって、前記産物から、回収対象の金属又は色素を、慣用の分画法、酸アルカリ処理、沈殿、有機溶媒抽出、遠心分離、各種クロマトグラフィー等で容易に回収することができる。
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
スチレンアクリル樹脂分解微生物のスクリーニング
終濃度５ｇ／Ｌになるようにジクロロメタンにスチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社、トナーインク用スチレンアクリル樹脂〕を溶解し、得られた溶液 １ｍＬを試験管に分注した。その後、ドラフト内で前記試験管を風乾させた。
【００５８】
前記試験管に、ＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕 ５ｍＬを添加し、１２１℃２０分間高圧滅菌した。
【００５９】
近畿大学農学部構内土壌、奈良県山中の土壌、石川県内の土壌、和歌山県から採取した海水、大阪府沿岸から採取した海水、近畿大学農学部応用微生物学研究室保存の重油分解微生物群及びコンポストのそれぞれを試料として用いた。前記土壌は、生理食塩水に懸濁後、超音波処理〔２８ｋＨｚ〕で均一に分散させて、試料とした。また、海水は、そのまま試料として用いた。さらに、コンポストは、生理食塩水に懸濁後、超音波処理〔２８ｋＨｚ〕で均一に分散させて、試料とした。
【００６０】
各試料を、前記高圧滅菌後の試験管に接種し、３７℃、１２５ストローク／分で振とう培養を行なった。なお、スチレンアクリル樹脂を分解する微生物を含む試料は、培養前において試験管壁にフィルム状に付着していたスチレンアクリル樹脂が培養液中に均一に分散し、菌が良好に生育して培養液が白濁することを指標として選抜した。スチレンアクリル樹脂を分解する微生物を含む試料の集積培養液の一部を新たなＦＹ培地に移し、継代培養を重ねた。
【００６１】
その結果、スクリーニングした試料のうち、コンポストに由来する試料について、図１に示されるように、試験管壁面に付着していたスチレンアクリル樹脂が、培養液中に均一に分散され、培養液が白濁した。かかる安定してスチレンアクリル樹脂を分解する微生物を含む培養物を、ＡＭＯＣ２という。なお、前記ＡＭＯＣ２は、ＡＭＯＣ２と命名・表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター〔郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８〕において、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０として、２００５年２月２８日（受託日）に寄託されている。
【００６２】
得られたＡＭＯＣ２を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈し、Ｒ２Ａ平板培地〔組成：０．０５重量％ 酵母エキス、０．０５重量％ ペプトン、０．０５重量％ カザミノ酸、０．０５重量％ グルコース、０．０５重量％ 可溶性スターチ、０．０３重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．００５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０３重量％ ピルビン酸ナトリウム、１．５重量％ 寒天；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に塗布し、３７℃で７〜１４日間培養した。その後、生じたコロニーの中から形態の異なるコロニーを選抜し、さらに、均一になるまで選抜した。
【００６３】
その結果、図２に示される６種類のコロニーの微生物が得られた。
【実施例２】
【００６４】
ＡＭＯＣ２の性質検討
前記実施例１で得られた各微生物を、終濃度５ｇ／Ｌのスチレンアクリル樹脂を含有したＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕に接種し、３７℃で７日間培養した。
【００６５】
培養後の各微生物を集菌し、滅菌水で洗浄した。その後、凍結融解により、各菌体を破砕し、破砕した菌体をＴＥ緩衝液〔組成：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕 ５００μＬに懸濁した。得られた懸濁液に、ドデシル硫酸ナトリウム（２００ｇ／Ｌ，和光純薬株式会社）溶液 ５０μＬと塩化ベンジル ３００μＬとを添加し、攪拌した。
【００６６】
その後、得られた産物を、５０℃ウォーターバス中で５分毎に攪拌しがら６０分間インキュベーションした。インキュベーション後に得られた産物に、ジルコニア／シリカ混合ビーズ〔外径０．１ｍｍ、バイオスペック プロダクツ インコーポレーティッド（ＢＩＯＳＰＥＣ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＩＮＣ．）〕 １００ｍｇを添加し、ボルテックスで１０秒間攪拌した。得られた産物に、３．０Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０） ３００μＬを添加し、氷水中で３０分間静置し、その後、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離し、上清を回収した。
【００６７】
得られた上清に、ＴＥ飽和フェノール溶液 ６００μＬを添加し、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、フェノール層を除去した。得られた水層にフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）（以下、ＰＣＩ） ６００μＬを添加し、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離し、上層（水層）を回収した。回収した水層に、クロロホルム：イソアミルアルコール／２４：１（ｖ／ｖ）（ＣＩＡ） ６００μＬを添加し、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、その上清を回収した。
【００６８】
得られた上清に、２−プロパノール ６００μＬを添加し、４℃で１０分間静置した。その後、得られた産物を、１７４００×ｇ、２０℃で２０分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿物を、７０％（ｖ／ｖ） エタノール ８００μＬで洗浄後、該エタノールを除去して沈殿物を風乾させた。得られた産物を滅菌水 ２０ｍＬに溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液を、滅菌水で５０倍希釈し、得られた溶液について、２６０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計〔商品名：ＤＵ．Ｓｅｒｉｅｓ ６５０、ベックマン（ＢＥＣＫＭＡＮ）社製〕で測定し、ＤＮＡ濃度を求めた。得られたＤＮＡを、鋳型ＤＮＡを用いた。
【００６９】
前記鋳型ＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により、１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ３領域（大腸菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの３４１位〜５３６位に相当）にあたる２００ｂｐの塩基配列を増幅した。具体的には、商品名：ＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔バイオラッド（ＢＩＯ ＲＡＤ）社製〕を用い、１０×Ｇｏｌｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ〔商品名、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕 ５μＬと、２．０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ６μＬと、フォワードプライマー ＧＣ−３４１Ｆ：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、シグマジェノシス社製、配列番号：１） １μＬとリバースプライマー ５３４Ｒ〔5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、シグマジェノシス社製、配列番号：２） １μＬと、５０ｎｇ相当量の鋳型ＤＮＡと、商品名：ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ〔５Ｕ／μＬ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ０．２μＬと、滅菌水 残部とを含む反応液 ５０μＬ中でＰＣＲを行なった。
【００７０】
ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃で１０分間のインキュベーション後、９３℃で６０秒の熱変性と４８℃で７０秒のアニーリングと、７２℃で７０秒の伸長とを１サイクルとする２５サイクル、７２℃で５分のインキュベーションとした。
【００７１】
得られた産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、目的配列の増幅を確認した。得られた産物を、商品名：ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕に供して濃縮し、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）解析対象試料を得た。
【００７２】
ついで、得られたＤＧＧＥ解析対象試料について、商品名：Ｄｃｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ６〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕を用いて、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動を行なった。
【００７３】
変性剤濃度勾配は、７．０Ｍ 尿素〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕と４０％（ｖ／ｖ） ホルムアミド〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕とを含む変性剤を、濃度１００％として、電気泳動方向に２０％〜５０％となるように調整した。また、アクリルアミド〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕濃度が、電気泳動方向に６〜９％（ｖ／ｖ）となるように勾配させたポリアクリルアミドゲルを用いた。泳動条件は、電圧２００Ｖ、泳動時間６時間、泳動温度６１℃とし、泳動用緩衝液として、０．５×ＴＡＥ緩衝液を用いた。
【００７４】
泳動終了後、ゲルを、商品名：Ｓｙｂｅｒ Ｇｏｌｄ（タカラバイオ株式会社製）で３０分間染色した。その後、ゲルに、紫外線（３１０ｎｍ）を照射し、染色されたＤＮＡに基づく励起光を、商品名：Ｋｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ〔コダック（Ｋｏｄａｋ）社製〕と商品名：ＫＯＤＡＫ ＧＬ Ｆｉｌｔｅｒ〔ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ用、コダック（Ｋｏｄａｋ）社製〕とを用いて撮影した。結果を図３に示す。
【００７５】
図３に示されるように、ＡＭＯＣ２から、複数のＤＮＡバンドが確認され、Ｑ−１〜Ｑ−６のＤＮＡバンドは、ＡＭＯＣ２に由来するＤＮＡバンドにそれぞれ帰属することができた。
【００７６】
また、前記Ｑ−１〜Ｑ−６に由来する鋳型ＤＮＡを用い、以下のように、ＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の解析を行なった。
【００７７】
商品名：ＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔バイオラッド（ＢＩＯ ＲＡＤ）社製〕を用い、１０×Ｇｏｌｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ〔商品名、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕 ５μＬと、各２．０ｍＭのｄＮＴＰ混合物 ５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６μＬと、フォワードプライマー２７ｆ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、東亜合成株式会社製、配列番号：３） １μＬと、リバースプライマー１５２５ｒ：5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、東亜合成株式会社製、配列番号：４） １μＬと、５０ｎｇ相当量の前記鋳型ＤＮＡと、商品名：ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ〔５Ｕ／μＬ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ０．５μＬと、滅菌水 残部とを含む反応液 ５０μＬ中でＰＣＲ反応液とした。
【００７８】
ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９４℃で７分間のインキュベーション後、９４℃で４５秒の熱変性と５５℃で４５秒のアニーリングと、７２℃で４５秒の伸長とを１サイクルとする２５サイクル、７２℃で１０分のインキュベーションとした。得られた産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、目的配列の増幅を確認した。得られた産物を、１．５重量％ 低融点アガロースゲル〔バイオプロダクツ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）製〕を用いて精製し、滅菌水 ２０μＬに溶解し、シークエンス用試料を得た。
【００７９】
前記シークエンス用試料を用い、ダイレクトシーケンスを行なった。伸長反応には、商品名：ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ〔アマシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を用い、下記１６Ｓ ｒＤＮＡシークエンスプライマー：
ｆ１Ｌ フォワードプライマー ９−２７ 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（配列番号：５）、
ｆ２Ｌ フォワードプライマー ５１８−５３６ 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATAC-3'（配列番号：６）、
ｆ２．５Ｌ フォワードプライマー ７７６−７９５ 5'-AGCAAACAGGATTAGATACC-3'（配列番号：７）、
ｆ３Ｌ フォワードプライマー １０９３−１１１１ 5'-GTCCCGCAACGAGCGCAAC-3'（配列番号：８）、
ｒ１Ｌ リバースプライマー ５３５−５１７ 5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3'（配列番号：９）、
ｒ２Ｌ リバースプライマー ８０４−７８５ 5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3'（配列番号：１０）、
ｒ３Ｌ リバースプライマー １１１０−１０９２ 5'-TTGCGCTCGTTGCGGGACT-3'（配列番号：１１）、
ｒ４Ｌ リバースプライマー １４０５−１３８８ 5'-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3'（配列番号：１２）、
ｒＥ１Ｌ リバースプライマー ３４４−３２６ 5'-GTAGGAGTCTGGACCGTGT-3'（配列番号：１３）、
を用いた。なお、シークエンス反応の条件は、９５℃２０秒と５０℃１５秒と６０℃１分とを１サイクルとする３０サイクルとした。ついで、ＤＮＡシーケンサー〔商品名：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕を用いて、各試料を解析した。
【００８０】
得られた解析対象の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列について、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のデータベースに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーについて、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、検索対象Ｄｉｖｉｓｉｏｎ バクテリア、ＧＡＰ計算あり、期待値１０、その他パラメータ デフォルト値の条件で、相同性の高い菌株を検索した。
【００８１】
その結果、前記Ｑ−１は、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＴＵＴ１２３８と９８．６％の相同性、前記Ｑ−２は、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）と９８．６％の相同性、前記Ｑ−３は、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）と９６．５％の相同性、前記Ｑ−４は、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）と９６．６％の相同性、前記Ｑ−５は、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）と９９．５％の相同性、前記Ｑ−６は、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） ｍｐ−２と９９．６％の相同性を示した。
【００８２】
そこで、前記Ｑ−１を、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１、前記Ｑ−２を、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２、前記Ｑ−５を、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５、前記Ｑ−６を、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６とした。
【００８３】
ついで、前記Ｑ−１〜Ｑ−６について、慣用の手法により、形態学的、生理生化学的特徴を調べた。前記Ｑ−１〜Ｑ−６について、位相差顕微鏡〔株式会社ニコン製〕で観察して、運動性を検討した。また、グラム染色とオキシターゼテストは、ホルムス（Ｂ.Ｈｏｌｍｅｓ）ら〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第３８巻、第４０６頁〜第４１６頁、（１９８８）〕に従って行なった。
【００８４】
その結果、Ｑ−１、Ｑ−２、Ｑ−３、Ｑ−４、Ｑ−５及びＱ−６は、全て運動性を有するグラム陰性の短桿菌であった。
【００８５】
また、その他の生理・生化学的性状は、商品名：Ａｐｉ ２０Ｅ同定キット〔バイオメリオ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）製〕を用いて検討した。表１に生理・生化学的性質を示す。
【００８６】
【表１】
【実施例３】
【００８７】
スチレンアクリル樹脂の分解活性
終濃度５ｇ／Ｌになるようにジクロロメタンに、前記スチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社、トナーインク用スチレンアクリル樹脂〕を溶解し、得られた溶液 １ｍＬを試験管に分注した。その後、ドラフト内で前記試験管を風乾させた。
【００８８】
前記試験管に、ＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕 ５ｍＬを添加し、１２１℃２０分間高圧滅菌した。
【００８９】
ついで、ＡＭＯＣ２、Ｑ−１〜Ｑ−６のそれぞれを前記高圧滅菌後の試験管に接種し、３７℃、１２５ストローク／分で振とう培養を行なった。なお、対照として、近畿大学農学部応用微生物学研究室に保存されているポリエステル化合物分解微生物群ＡＭＯＣ００１を用いた。
【００９０】
７日間培養後に得られた培養液に残存するスチレンアクリル樹脂及びそれに由来する分解生成物をジクロロメタンで抽出し、ヘキサトリアコンタン〔内部標準物質、シグマ−アルドリッヒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社製〕を添加し、エバポレーターで減圧乾固させた。得られた乾固物を、ヘキサン：トルエン／２：８（体積比） ５ｍＬに溶解した。
【００９１】
得られた試料 １μＬを、の石英ガラスの周りにシリカゲルを薄くコーティングしたロッド（商品名：クロマロッドＳＩＩＩ 株式会社三菱化学ヤトロン製）にスポットし、そのロッドを恒湿槽（条件：６５％ＲＨ）で１０分間インキュベーションした。その後、ｎ−ヘキサンが入った展開槽内で１０分間ハンギングしてから、１０ｃｍ展開させた。なお、ハンギング及び展開は３７℃の恒温槽内で行った。
【００９２】
展開が終わったロッドは、溶媒を除去させるため室温で乾燥させ、まず１０ｃｍ展開したロッドをＦＩＤ分析して内部標準ピークを検出した。
【００９３】
その後、部分測定が終了したロッドを、再び１０分間恒湿槽に保った。トルエンで１０ｃｍ展開させた。除去させるため室温で乾燥させて溶媒を除去した。展開後のロッドを、商品名：イアトロスキャンＭｋ−６ｓ（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いて、検出器：ＦＩＤ、水素ガス：１６０ｍＬ／分、空気：２．０Ｌ／分、スキャン速度：３０秒／スキャンの条件で分析し、スチレンアクリル樹脂に対応するピークと、それに由来する分解生成物に対応するピークとを検出した。また、継代培養は７日毎に行い分解率の経時変化も求めた。
【００９４】
なお、陰性対照として、微生物培養物非存在下の場合について同様に行なった。
【００９５】
前記分解活性は、微生物培養物存在下の場合の各ピークの面積と、対照の場合の各ピークの面積とを比較し、スチレンアクリル樹脂に対応するピークの面積がゼロの場合、当該スチレンアクリル樹脂が１００％分解されたことの指標として算出した。その結果を図４及び図５に示す。
【００９６】
その結果、図４に示されるように、ＡＭＯＣ２は、３代以上継代培養しても、安定して、分解率は、約４５％であり、スチレンアクリル樹脂を分解できることがわかる。また、生育も良好であった。しかしながら、図４に示されるように、ポリエステル分解微生物群ＡＭＯＣ００１は、スチレンアクリル樹脂の分解率は継代回数が増加するにつれて低下し、継代回数３回目（７日／回）で樹脂の分解も菌の生育が認められなくなった。
【００９７】
また、図５に示されるように、 Ｑ−１〜Ｑ−４株及びＱ−６株は、単独では、分解率は、２５％であったが、Ｑ−５株は、安定して、分解率は、約４０％であった。したがって、ＡＭＯＣ２において、Ｑ−５は、Ｑ−１〜Ｑ−４及びＱ−６と協調的に、互いに機能を補完しあって、高い分解率を維持していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、スチレンアクリル樹脂を含む廃棄物を、安価で、かつ環境に対して低影響で処理することができ、廃棄物中の金属又は色素の安価でかつ環境に対して低影響で回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、微生物培養物によるスチレンアクリルの分解を示す図である。レーン１は、対照であり、レーン２は、微生物培養物存在下のスチレンアクリルの分解を示す。
【０１００】
【図２】図２は、Ｑ−１〜Ｑ−６のコロニーの形状を示す図である。
【０１０１】
【図３】図３は、ＡＭＯＣ２及びＱ−１〜Ｑ−６それぞれの１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３領域の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動解析の結果を示す図である。レーン１は、ＡＭＯＣ２、レーン２〜レーン７は、それぞれＱ−１〜Ｑ−６である。
【０１０２】
【図４】図４は、ＡＭＯＣ２及びＡＭＯＣ００１によるスチレンアクリル樹脂の分解活性を調べた結果を示す図である。図中、四角が、ＡＭＯＣ２、三角が、ＡＭＯＣ００１である。
【０１０３】
【図５】図５は、ＡＭＯＣ２及びＱ−１〜Ｑ−６それぞれによるスチレンアクリル樹脂の分解活性を調べた結果を示す図である。図中、四角が、ＡＭＯＣ２、星印が、Ｑ−１、十字印が、Ｑ−２、五角形が、Ｑ−３、六角形が、Ｑ−４、ひし形が、Ｑ−５、三角が、Ｑ−６である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号：１は、プライマーの配列である。
【０１０５】
配列番号：２は、プライマーの配列である。
【０１０６】
配列番号：３は、プライマーの配列である。
【０１０７】
配列番号：４は、プライマーの配列である。
【０１０８】
配列番号：５は、プライマーの配列である。
【０１０９】
配列番号：６は、プライマーの配列である。
【０１１０】
配列番号：７は、プライマーの配列である。
【０１１１】
配列番号：８は、プライマーの配列である。
【０１１２】
配列番号：９は、プライマーの配列である。
【０１１３】
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
【０１１４】
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
【０１１５】
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
【０１１６】
配列番号：１３は、プライマーの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物、該樹脂の分解用組成物、並びに廃棄物中の金属又は色素の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、樹脂を含有する廃棄物、例えば、トナー等は、焼却炉等での焼却等により処理されている。しかしながら、前記焼却による処理を行なった場合、廃棄物中に含まれる有用資源の回収が困難になる場合があるという欠点がある。また、前記焼却による処理には、石油資源等を要し、ＣＯ2等の排気ガスの発生を伴うという欠点もある。
【０００３】
一方、加水分解反応により分解されやすいポリエステル樹脂については、特定の微生物により生分解させることができることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。しかしながら、ポリエステル樹脂を生分解することができる微生物では、ポリエステル樹脂以外の樹脂の生分解は困難であるのが現状である。
【非特許文献１】ユタカ トキワ（Ｙｕｔａｋａ Ｔｏｋｉｗａ）、Ｓｅｎ’ｉＧａｋｋａｉｓｈｉ、第７巻、第５２１頁〜第５２６頁（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、１つの側面では、樹脂、例えば、スチレンアクリル樹脂をより高い効率で分解すること、該樹脂をより安定的に分解すること、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解すること、該樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすること、分解により生じた産物を実質的に資化すること等の少なくとも１つを達成しうる、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物を提供することにある。さらに、本発明は、他の側面では、前記樹脂をより高い効率で分解すること、該樹脂をより安定的に分解すること、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解すること、該樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすること等の少なくとも１つを達成しうる、前記スチレンアクリル樹脂の分解用組成物を提供することにある。また、本発明は、別の側面では、前記樹脂を効率よく分解すること、該樹脂を安定的に分解すること、前記樹脂を安価に分解すること、前記樹脂を周辺環境に対し低影響で分解すること、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに該樹脂を分解すること等の少なくとも１つを達成しうる、スチレンアクリル樹脂の分解方法を提供することにある。本発明のさらに他の側面は、前記樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすること、該廃棄物から有用金属、有用化合物等を安価に回収すること、廃棄物中の有用金属、有用化合物等を、周辺環境に対し低影響で回収すること等の少なくとも１つを達成しうる、廃棄物中の金属又は色素の回収方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物、
〔２〕 シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物が、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０）である、前記〔１〕記載の微生物培養物、
〔３〕 ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物と、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）に属する微生物と、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）に属する微生物と、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物とをさらに含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載の微生物培養物、
〔４〕 前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の微生物培養物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の分解用組成物、
〔５〕 微生物培養物を保持するに適した固定用担体をさらに含有してなる、前記〔４〕記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物、
〔６〕 微生物の培養に適した培地をさらに含有してなる、前記〔４〕又は〔５〕記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物、
〔７〕 （Ａ）スチレンアクリル樹脂を含む生産物若しくは廃棄物と、（Ｂ）前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の微生物培養物又は前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させることを特徴とする、スチレンアクリル樹脂の分解方法、並びに
〔８〕 （ａ）スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、（ｂ）前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の微生物培養物又は前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル樹脂を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離することを特徴とする、廃棄物中の金属又は色素の回収方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の微生物培養物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができ、かつ分解により生じた産物を実質的に資化することができ、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができるという優れた効果を奏する。本発明のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができ、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のスチレンアクリル樹脂の分解方法によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、高い効率で、安定的に分解することができ、該樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルを容易にすることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の廃棄物中の金属又は色素の回収方法によれば、前記樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にし、該有用金属、有用化合物等を、周辺環境に対し低影響で安価に回収することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の１つの側面は、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物を含有した、スチレンアクリル樹脂の生分解能を少なくとも呈する微生物培養物である。
【０００８】
なお、本明細書において、「スチレンアクリル樹脂の生分解能を少なくとも呈する」とは、後述の分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂の生分解能が検出されることを意味し、他の化合物に対する分解活性の有無により限定されないことを意図する。したがって、別の側面では、本発明の微生物培養物には、ポリエステル樹脂、スチレンアクリル樹脂等の化学合成樹脂等に対する分解活性をさらに呈するものも含まれる。
【０００９】
本発明の微生物培養物は、前記微生物を含有しているため、従来、生分解することが困難であったスチレンアクリル樹脂を効率よく、安定的に生分解することができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の微生物培養物によれば、コピー機やプリンターのトナーに使用されている難分解性樹脂であるスチレンアクリル樹脂を生分解することができる。
【００１０】
また、本発明の微生物培養物は、前記微生物を含有しているため、前記樹脂の分解に基づくＣＯ2の発生が、実質的に抑制される。したがって、本発明の微生物培養物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含有する廃棄物を処理する際、大気中へのＣＯ2の放出を実質的に抑制することができるため、環境保護の点で優れた効果を発揮する。
【００１１】
さらに、本発明の微生物培養物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含有する廃棄物中の樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を分解することができ、該廃棄物中の未使用の有用金属又は有用色素の回収の容易化を図ることができる。したがって、本発明の微生物培養物によれば、廃棄物中の未使用の有用金属又は有用色素のリサイクルをより容易にすることができるため、資源の有効利用、環境保護等の点で優れた効果を発揮する。
【００１２】
また、本発明の微生物培養物は、分解により生じた産物を実質的に資化することができるという優れた性質を発現する。したがって、分解により生じた産物の蓄積が実質的に抑制されるため、環境保護等の点で優れた効果を発揮する。
【００１３】
なお、本明細書において、前記廃棄物とは、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む廃棄物をいい、具体的には、例えば、トナー、缶ラミネート、電子機器類の絶縁体、家電の廃棄物、自動車の廃棄物、産業廃棄物等が挙げられる。
【００１４】
前記スチレンアクリル樹脂としては、アクリル酸 ｎ−ブチルエステル等のアクリル酸化合物とスチレンとを重縮合させて得られる化合物等が挙げられる。具体的には、前記スチレンアクリル樹脂としては、特に限定されないが、アクリロニトリルアクリレートスチレン、スチレンブチルアクリレート等が挙げられる。なお、前記スチレンアクリル樹脂の平均分子量、重合度等は、本発明の微生物培養物による生分解能（スチレンアクリル樹脂の分解活性）を呈する範囲であればよい。
【００１５】
なお、本発明の微生物培養物によるスチレンアクリル樹脂の分解活性の評価法としては、例えば、
１） 終濃度５ｇ／Ｌのスチレンアクリル樹脂を含有したＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕に、微生物培養物を接種し、３７℃で７日間、１２５ストローク／分で振とう培養するステップ、
２） 得られた培養液に残存する樹脂成分を、ジクロロメタンで抽出し、ヘキサトリアコンタンを添加し、エバポレーターで減圧乾固させるステップ、
３） 得られた乾固物を、ｎ−ヘキサン：トルエン／２：８（体積比） ５ｍＬに溶解し、得られた試料 １μＬを、例えば、商品名：クロマロッドＳＩＩＩ（０．１×１０ｃｍ）（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いた薄層クロマトグラフィーに供し、ｎ−ヘキサンで展開させるステップ、及び
４） 例えば、商品名：イアトロスキャンＭｋ−６ｓ（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いて、検出器：ＦＩＤ、水素ガス：１６０ｍＬ／分、空気：２．０Ｌ／分、スキャン速度：３０秒／スキャンの条件で、培養液中のスチレンアクリル樹脂及びスチレンアクリル樹脂の分解産物それぞれに対応するピークを検出するステップ、
を含む方法等が挙がられる。
【００１６】
前記ステップ１）において、前記スチレンアクリル樹脂を含有したＦＹ培地は、ジクロロメタンに溶解したスチレンアクリル樹脂を終濃度５ｇ／Ｌになるように試験管に分注し、風乾させ、ＦＹ培地 ５ｍＬを添加し、１２１℃２０分間高圧滅菌することにより調製されうる。
【００１７】
前記ステップ３）において、薄層クロマトグラフィーは、恒湿槽（条件：６５％ＲＨ）で１０分間インキュベーションし、ついで、ｎ−ヘキサンが入った展開槽内で、３７℃で展開することにより行なわれうる。
【００１８】
なお、前記分解活性の評価において、対照として、微生物培養物非存在下の場合について同様に行なえばよい。前記分解活性は、微生物培養物存在下の場合の各ピークの面積と、対照の場合の各ピークの面積とを比較することにより評価される。スチレンアクリル樹脂に対応するピークの面積がゼロの場合、当該スチレンアクリル樹脂が１００％分解されたことの指標となり、前記分解活性は、〔｛（コントロールのスチレンアクリル樹脂に対応するピーク面積）−（培養液のスチレンアクリル樹脂に対応するピーク面積）｝／（コントロールのスチレンアクリル樹脂に対応するピーク面積）〕×１００（％）として算出された値で示される。
【００１９】
なお、前記スチレンアクリル樹脂の分解活性の評価において、スチレンアクリル樹脂の代わりに、他の樹脂化合物を適切な溶媒に溶解させて用いることにより、当該樹脂化合物に対する分解活性を評価することができる。
【００２０】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物としては、上記スチレンアクリル樹脂の分解活性の評価方法によりスチレンアクリル樹脂に対して分解活性を示すものであればよく、具体的には、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５等が挙げられる。なお、前記シュードモナス ボレオポリス Ｑ−５は、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ Ｑ−５」と命名・表示され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０（受託日：２００５年２月２８日）の下、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター〔郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８〕に寄託されている。
【００２１】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、１６Ｓ ｒＤＮＡ解析をした場合、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）との相同性が、９９．５％である。また、前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：粘質であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 有、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 有、オルニチンデカルボキシラーゼ 有、ウレアーゼ 有、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 有、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 無、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００２２】
なお、前記１６Ｓ ｒＤＮＡ解析は、Ｂｌａｓｔ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズム（条件：検索対象Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（バクテリア、ＧＡＰ計算あり、期待値１０）に基づき、デフォルトの条件で、例えば、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のデータを用いて、対象となる１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と、既知の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列とを比較することにより行なわれうる。
【００２３】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５によれば、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社供給〕の分解活性を測定した生分解率として、約４０％の生分解率を達成することができ、当該シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５非存在下の場合に比べ、安定的に、例えば、約２．０ｍｇ／５ｍＬ／７日の生分解率を達成するという優れた性質を示す。
【００２４】
なお、本発明においては、前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５に代えて、該シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５と進化系統樹上近い位置にある微生物であって、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂の分解活性が検出される微生物を用いることもできる。
【００２５】
かかるシュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５を含有した本発明の微生物培養物は、該シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５によりスチレンアクリル樹脂が分解され生成した分解産物を捕捉若しくは資化しうる他の微生物をさらに含有していてもよい。また、本発明の微生物培養物は、別の側面では、前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５と協調的に、樹脂、例えば、スチレンアクリル樹脂等を分解しうる他の微生物をさらに含有していてもよい。
【００２６】
本発明の微生物培養物は、好ましくは、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物と、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）に属する微生物と、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）に属する微生物と、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物とをさらに含有した微生物培養物である。かかる微生物培養物によれば、前記微生物が一群として、協調的に作用しうるため、スチレンアクリル樹脂に対して、より安定的に、より高い生分解能が維持されるという優れた効果を発揮する。また、本発明の微生物培養物によれば、前記微生物が一群として、協調的に前記スチレンアクリル樹脂を分解し、それぞれの生育における栄養素として用いることができる。したがって、本発明の微生物培養物によれば、周辺環境に対し低影響で前記スチレンアクリル樹脂を分解することができる。
【００２７】
より具体的には、混合微生物群ＡＭＯＣ２の微生物培養物が挙げられる。
【００２８】
なお、前記ＡＭＯＣ２は、ＡＭＯＣ２と命名・表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構〔郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８〕に安全寄託されている。また、前記ＡＭＯＣ２は、近畿大学農学部農芸化学科応用微生物研究室（郵便番号：６３１−８５０５ 奈良県奈良市中町３３２７−２０４）に保存されており、必要に応じ、「独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター」における分譲に関する取り扱いに準じて、特許法施行規則第２７条の３に規定される分譲が行なわれ、入手可能である。
【００２９】
前記ＡＭＯＣ２の微生物培養物によれば、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社供給〕の分解活性を測定した生分解率として、約４５％の生分解率を達成することができ、当該微生物培養物非存在下の場合に比べ、安定的に、少なくとも約２．３ｍｇ／５ｍＬ／７日の生分解率を達成するという優れた性質を示す。
【００３０】
前記ＡＭＯＣ２は、適切な希釈率で滅菌生理食塩水に希釈し、例えば、Ｒ２Ａ平板培地〔組成：０．０５重量％ 酵母エキス、０．０５重量％ ペプトン、０．０５重量％ カザミノ酸、０．０５重量％ グルコース、０．０５重量％ 可溶性スターチ、０．０３重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．００５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０３重量％ ピルビン酸ナトリウム、１．５重量％ 寒天；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に塗布し、３７℃で７〜１４日間培養し、生じたコロニーを均一になるまで選択することにより、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２、Ｑ−３株、Ｑ−４株、前記シュードモナス ボレオポリス Ｑ−５〔Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ Ｑ−５（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０、受託日：２００５年２月２８日）〕及びアルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６を含有することが確認される混合微生物の培養物である。
【００３１】
なお、本発明においては、前記ＡＭＯＣ２に含まれる各微生物に代えて、該微生物と進化系統樹上近い位置にある微生物であって、前記分解活性の評価方法により、スチレンアクリル樹脂の分解活性が検出される微生物を用いることもできる。
【００３２】
ここで、前記ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＴＵＴ１２３８との相同性が、９８．６％である。また、前記ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：粘質であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 有、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 無、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 有、クエン酸の利用 無、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３３】
前記メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）との相同性が、９８．６％である。また、前記メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：赤色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 有、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 無、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３４】
前記Ｑ−３は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）との相同性が、９６．５％である。また、前記Ｑ−３は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：周縁部が緑色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 無、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３５】
前記Ｑ−４は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）との相同性が、９６．６％である。また、前記Ｑ−４は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：周縁部が赤色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 無、ウレアーゼ 無、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３６】
前記シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５は、前記と同様である。
【００３７】
前記アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６は、ＤＤＢＪに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーに基づき、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） ｍｐ−２との相同性が、９９．６％である。また、前記アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６は、グラム陰性の運動性を有する短桿菌であり、コロニーの特徴：無色であり、オキシダーゼ 有、β−ガラクトシダーゼ 無、アルギニンジヒドロラーゼ 有、リジンデカルボキシラーゼ 無、オルニチンデカルボキシラーゼ 有、ウレアーゼ 有、トリプトファンデアミナーゼ 有、ゲラチナーゼ 無、クエン酸の利用 有、Ｈ2Ｓの産生 無、インドールの産生 無、アセトインの産生 有、グルコース資化性 無、Ｄ−マンニトール資化性 無、イノシトール資化性 無、Ｌ−ラムノース資化性 無、Ｄ−ソルビトール資化性 無、サッカロース資化性 無、Ｄ−メリビオース資化性 無、Ｄ−アミグダリン資化性 無、Ｌ−アラビノース資化性 無である。
【００３８】
本発明の微生物培養物は、炭素源として、前記スチレンアクリル樹脂等を含有し、窒素源として、例えば、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４等の存在下に維持されうる。前記窒素源は、微生物を生育させるに十分な窒素源を供給する観点から、好ましくは、０．５重量％以上、より好ましくは、０．６ 重量％以上、さらに好ましくは、１．０重量％以上であり、微生物に十分な生育能を発揮させる観点から、好ましくは、３．０重量％以下、より好ましくは、１．７重量％以下、さらに好ましくは、１．２重量％以下であることが望ましい。また、炭素源／窒素源重量比（Ｃ／Ｎ比）は、炭素源と窒素源とのバランスを調整する観点から、好ましくは、４０以上、より好ましくは、４３以上、さらに好ましくは、４８以上であり、微生物に十分な生育能を発揮させる観点から、好ましくは、６０以下、より好ましくは、５５以下、さらに好ましくは、５０以下であることが望ましい。また、培地のｐＨは、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５、より好ましくは、ｐＨ６．９〜７．１であることが望ましい。本発明の微生物培養物は、前記の条件下、好ましくは、３０〜４０℃、より好ましくは、３５〜３７℃で、１００〜１５０ストローク／分、好ましくは、１１０〜１３０ストローク／分培養することにより維持されうる。
【００３９】
本発明の微生物培養物は、具体的には、前記ＦＹ培地、スチレンアクリル樹脂添加ＦＹ培地（組成：０．５重量％スチレンアクリル樹脂、１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス）等により維持されうる。
【００４０】
本発明は、別の側面では、スチレンアクリル樹脂の分解用組成物に関する。
【００４１】
本発明の分解用組成物は、本発明の微生物培養物を含有する。したがって、本発明の分解用組成物によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができ、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易にすることができる。
【００４２】
本発明の分解用組成物は、長期にわたって、微生物培養物を安定に保持させる観点から、微生物培養物を保持するに適した固定用担体をさらに含有してもよい。
【００４３】
前記固定用担体としては、微生物培養物に含まれる各微生物の生育を安定的に維持し、該生分解能を阻害しない担体であることが望ましく、長期にわたって、微生物培養物を安定に保持させる観点から、好ましくは、前記微生物により実質的に分解されない担体であることが望ましい。前記固定用担体としては、例えば、多孔質担体、不織布，活性炭、セラミックス、セルロース等が挙げられる。
【００４４】
また、本発明の分解用組成物は、微生物の培養に適した培地をさらに含有していてもよい。
【００４５】
本発明の分解用組成物においては、本発明の微生物培養物を前記不溶性担体の表面に固定化してもよく、内部に固定化若しくは保持させてもよい。本発明の微生物培養物を、かかる担体の内部に固定化若しくは保持させる場合、前記微生物の生育に必要な各種栄養素、分解対象の樹脂、例えば、スチレンアクリル樹脂等の授受が可能な担体であることが望ましい。
【００４６】
本発明の分解用組成物中に含まれる微生物細胞の数には、特に限定されるものではなく、微生物の生育状態、生分解能の発現の程度、当該分解用組成物の取り扱い方法等に応じて適宜設定されうる。
【００４７】
本発明は、他の側面では、（Ａ）スチレンアクリル樹脂を含む生産物若しくは廃棄物と、（Ｂ）本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物とを接触させることを特徴とする、スチレンアクリル樹脂の分解方法に関する。
【００４８】
なお、本明細書において、前記生産物は、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む生産物をいい、具体的には、成型ようの型枠等が挙げられる。
【００４９】
本発明の分解方法は、本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分解方法によれば、樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を、ＣＯ2の発生を実質的に伴わずに、より高い効率で、より安定的に分解することができる。また、本発明の分解方法によれば、樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を含む廃棄物の処理に適用することにより、該廃棄物中の樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を優先的に生分解し、残存する未使用の有用金属、有用化合物等を回収しやすい状態で分離及び／又は露呈させることができる。そのため、前記廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易に行なうことが可能になる。
【００５０】
本発明の分解方法においては、具体的には、本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物を、前記生産物又は廃棄物の存在下に、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持すること；本発明の微生物培養物又は本発明の分解用組成物を、前記生産物又は廃棄物に散布又は混合し、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持すること等を行なえばよい。
【００５１】
前記廃棄物は、必要に応じ、適切な手段で粉砕して粉末状にしてもよく、本発明の微生物培養物の生育を妨げない適切な溶媒に溶解させてもよい。
【００５２】
本発明の分解方法の適用の具体例としては、トナー、缶ラミネート、電子機器類の絶縁体、家電・自動車の廃棄物、産業廃棄物等の廃棄物の処理；樹脂、特に、スチレンアクリル樹脂を含む廃液の処理；前記廃棄物中からの有用金属や有用化合物の回収；スチレンアクリル樹脂等の樹脂を成型加工等の際に利用した場合、例えば、スチレンアクリル樹脂等の樹脂から製造された型枠に材料を入れ、成型させした場合の目的の成型物の回収の容易化等が挙げられる。
【００５３】
本発明は、他の側面では、（ａ）スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、（ｂ）本発明の微生物培養物又は分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル樹脂を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離することを特徴とする、廃棄物中の金属又は色素の回収方法に関する。
【００５４】
本発明の回収方法によれば、本発明の微生物培養物又は分解用組成物が用いられているため、スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物中の樹脂、特にスチレンアクリル樹脂を優先的に生分解し、残存する未使用の有用金属、有用化合物等を回収しやすい状態で分離及び／又は露呈させることができる。そのため、前記廃棄物中の未使用の有用金属、有用化合物等を、周辺環境に対し低影響で、容易に、安価に回収することができ、前記有用金属、有用化合物等のリサイクルをより容易に行なうことが可能になる。
前記（ａ）の廃棄物と、前記（ｂ）の微生物培養物又は分解用組成物との接触は、
１） 必要に応じ、廃棄物を適切な手段で粉砕して粉末状にし、あるいは本発明の微生物培養物の生育を妨げない適切な溶媒に廃棄物を溶解させるステップ、及び
２） 本発明の微生物培養物又は分解用組成物を、前記廃棄物の存在下に、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持するステップ、又は、
２’）本発明の微生物培養物又は分解用組成物を、前記廃棄物に散布又は混合し、スチレンアクリル樹脂の分解活性を発現させるに適した条件、例えば、本発明の微生物培養物に含まれる各微生物の維持に適した条件下に維持するステップ、
により行なわれうる。
【００５５】
廃棄物中に含まれるスチレンアクリル樹脂の分解後の産物は、スチレンアクリル樹脂から構成される成分が実質的に除去されている。したがって、前記産物から、回収対象の金属又は色素を、慣用の分画法、酸アルカリ処理、沈殿、有機溶媒抽出、遠心分離、各種クロマトグラフィー等で容易に回収することができる。
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
スチレンアクリル樹脂分解微生物のスクリーニング
終濃度５ｇ／Ｌになるようにジクロロメタンにスチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社、トナーインク用スチレンアクリル樹脂〕を溶解し、得られた溶液 １ｍＬを試験管に分注した。その後、ドラフト内で前記試験管を風乾させた。
【００５８】
前記試験管に、ＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕 ５ｍＬを添加し、１２１℃２０分間高圧滅菌した。
【００５９】
近畿大学農学部構内土壌、奈良県山中の土壌、石川県内の土壌、和歌山県から採取した海水、大阪府沿岸から採取した海水、近畿大学農学部応用微生物学研究室保存の重油分解微生物群及びコンポストのそれぞれを試料として用いた。前記土壌は、生理食塩水に懸濁後、超音波処理〔２８ｋＨｚ〕で均一に分散させて、試料とした。また、海水は、そのまま試料として用いた。さらに、コンポストは、生理食塩水に懸濁後、超音波処理〔２８ｋＨｚ〕で均一に分散させて、試料とした。
【００６０】
各試料を、前記高圧滅菌後の試験管に接種し、３７℃、１２５ストローク／分で振とう培養を行なった。なお、スチレンアクリル樹脂を分解する微生物を含む試料は、培養前において試験管壁にフィルム状に付着していたスチレンアクリル樹脂が培養液中に均一に分散し、菌が良好に生育して培養液が白濁することを指標として選抜した。スチレンアクリル樹脂を分解する微生物を含む試料の集積培養液の一部を新たなＦＹ培地に移し、継代培養を重ねた。
【００６１】
その結果、スクリーニングした試料のうち、コンポストに由来する試料について、図１に示されるように、試験管壁面に付着していたスチレンアクリル樹脂が、培養液中に均一に分散され、培養液が白濁した。かかる安定してスチレンアクリル樹脂を分解する微生物を含む培養物を、ＡＭＯＣ２という。なお、前記ＡＭＯＣ２は、ＡＭＯＣ２と命名・表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター〔郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８〕において、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０として、２００５年２月２８日（受託日）に寄託されている。
【００６２】
得られたＡＭＯＣ２を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈し、Ｒ２Ａ平板培地〔組成：０．０５重量％ 酵母エキス、０．０５重量％ ペプトン、０．０５重量％ カザミノ酸、０．０５重量％ グルコース、０．０５重量％ 可溶性スターチ、０．０３重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．００５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０３重量％ ピルビン酸ナトリウム、１．５重量％ 寒天；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に塗布し、３７℃で７〜１４日間培養した。その後、生じたコロニーの中から形態の異なるコロニーを選抜し、さらに、均一になるまで選抜した。
【００６３】
その結果、図２に示される６種類のコロニーの微生物が得られた。
【実施例２】
【００６４】
ＡＭＯＣ２の性質検討
前記実施例１で得られた各微生物を、終濃度５ｇ／Ｌのスチレンアクリル樹脂を含有したＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕に接種し、３７℃で７日間培養した。
【００６５】
培養後の各微生物を集菌し、滅菌水で洗浄した。その後、凍結融解により、各菌体を破砕し、破砕した菌体をＴＥ緩衝液〔組成：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕 ５００μＬに懸濁した。得られた懸濁液に、ドデシル硫酸ナトリウム（２００ｇ／Ｌ，和光純薬株式会社）溶液 ５０μＬと塩化ベンジル ３００μＬとを添加し、攪拌した。
【００６６】
その後、得られた産物を、５０℃ウォーターバス中で５分毎に攪拌しがら６０分間インキュベーションした。インキュベーション後に得られた産物に、ジルコニア／シリカ混合ビーズ〔外径０．１ｍｍ、バイオスペック プロダクツ インコーポレーティッド（ＢＩＯＳＰＥＣ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＩＮＣ．）〕 １００ｍｇを添加し、ボルテックスで１０秒間攪拌した。得られた産物に、３．０Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０） ３００μＬを添加し、氷水中で３０分間静置し、その後、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離し、上清を回収した。
【００６７】
得られた上清に、ＴＥ飽和フェノール溶液 ６００μＬを添加し、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、フェノール層を除去した。得られた水層にフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）（以下、ＰＣＩ） ６００μＬを添加し、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離し、上層（水層）を回収した。回収した水層に、クロロホルム：イソアミルアルコール／２４：１（ｖ／ｖ）（ＣＩＡ） ６００μＬを添加し、１７４００×ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、その上清を回収した。
【００６８】
得られた上清に、２−プロパノール ６００μＬを添加し、４℃で１０分間静置した。その後、得られた産物を、１７４００×ｇ、２０℃で２０分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿物を、７０％（ｖ／ｖ） エタノール ８００μＬで洗浄後、該エタノールを除去して沈殿物を風乾させた。得られた産物を滅菌水 ２０ｍＬに溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液を、滅菌水で５０倍希釈し、得られた溶液について、２６０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計〔商品名：ＤＵ．Ｓｅｒｉｅｓ ６５０、ベックマン（ＢＥＣＫＭＡＮ）社製〕で測定し、ＤＮＡ濃度を求めた。得られたＤＮＡを、鋳型ＤＮＡを用いた。
【００６９】
前記鋳型ＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により、１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ３領域（大腸菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの３４１位〜５３６位に相当）にあたる２００ｂｐの塩基配列を増幅した。具体的には、商品名：ＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔バイオラッド（ＢＩＯ ＲＡＤ）社製〕を用い、１０×Ｇｏｌｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ〔商品名、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕 ５μＬと、２．０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ６μＬと、フォワードプライマー ＧＣ−３４１Ｆ：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、シグマジェノシス社製、配列番号：１） １μＬとリバースプライマー ５３４Ｒ〔5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、シグマジェノシス社製、配列番号：２） １μＬと、５０ｎｇ相当量の鋳型ＤＮＡと、商品名：ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ〔５Ｕ／μＬ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ０．２μＬと、滅菌水 残部とを含む反応液 ５０μＬ中でＰＣＲを行なった。
【００７０】
ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃で１０分間のインキュベーション後、９３℃で６０秒の熱変性と４８℃で７０秒のアニーリングと、７２℃で７０秒の伸長とを１サイクルとする２５サイクル、７２℃で５分のインキュベーションとした。
【００７１】
得られた産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、目的配列の増幅を確認した。得られた産物を、商品名：ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕に供して濃縮し、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）解析対象試料を得た。
【００７２】
ついで、得られたＤＧＧＥ解析対象試料について、商品名：Ｄｃｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ６〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕を用いて、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動を行なった。
【００７３】
変性剤濃度勾配は、７．０Ｍ 尿素〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕と４０％（ｖ／ｖ） ホルムアミド〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕とを含む変性剤を、濃度１００％として、電気泳動方向に２０％〜５０％となるように調整した。また、アクリルアミド〔バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）製〕濃度が、電気泳動方向に６〜９％（ｖ／ｖ）となるように勾配させたポリアクリルアミドゲルを用いた。泳動条件は、電圧２００Ｖ、泳動時間６時間、泳動温度６１℃とし、泳動用緩衝液として、０．５×ＴＡＥ緩衝液を用いた。
【００７４】
泳動終了後、ゲルを、商品名：Ｓｙｂｅｒ Ｇｏｌｄ（タカラバイオ株式会社製）で３０分間染色した。その後、ゲルに、紫外線（３１０ｎｍ）を照射し、染色されたＤＮＡに基づく励起光を、商品名：Ｋｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ〔コダック（Ｋｏｄａｋ）社製〕と商品名：ＫＯＤＡＫ ＧＬ Ｆｉｌｔｅｒ〔ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ用、コダック（Ｋｏｄａｋ）社製〕とを用いて撮影した。結果を図３に示す。
【００７５】
図３に示されるように、ＡＭＯＣ２から、複数のＤＮＡバンドが確認され、Ｑ−１〜Ｑ−６のＤＮＡバンドは、ＡＭＯＣ２に由来するＤＮＡバンドにそれぞれ帰属することができた。
【００７６】
また、前記Ｑ−１〜Ｑ−６に由来する鋳型ＤＮＡを用い、以下のように、ＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の解析を行なった。
【００７７】
商品名：ＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔バイオラッド（ＢＩＯ ＲＡＤ）社製〕を用い、１０×Ｇｏｌｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ〔商品名、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕 ５μＬと、各２．０ｍＭのｄＮＴＰ混合物 ５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６μＬと、フォワードプライマー２７ｆ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、東亜合成株式会社製、配列番号：３） １μＬと、リバースプライマー１５２５ｒ：5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'（１０ｐｍｏｌ／μＬ、東亜合成株式会社製、配列番号：４） １μＬと、５０ｎｇ相当量の前記鋳型ＤＮＡと、商品名：ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ〔５Ｕ／μＬ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕 ０．５μＬと、滅菌水 残部とを含む反応液 ５０μＬ中でＰＣＲ反応液とした。
【００７８】
ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９４℃で７分間のインキュベーション後、９４℃で４５秒の熱変性と５５℃で４５秒のアニーリングと、７２℃で４５秒の伸長とを１サイクルとする２５サイクル、７２℃で１０分のインキュベーションとした。得られた産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、目的配列の増幅を確認した。得られた産物を、１．５重量％ 低融点アガロースゲル〔バイオプロダクツ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）製〕を用いて精製し、滅菌水 ２０μＬに溶解し、シークエンス用試料を得た。
【００７９】
前記シークエンス用試料を用い、ダイレクトシーケンスを行なった。伸長反応には、商品名：ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ〔アマシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を用い、下記１６Ｓ ｒＤＮＡシークエンスプライマー：
ｆ１Ｌ フォワードプライマー ９−２７ 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（配列番号：５）、
ｆ２Ｌ フォワードプライマー ５１８−５３６ 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATAC-3'（配列番号：６）、
ｆ２．５Ｌ フォワードプライマー ７７６−７９５ 5'-AGCAAACAGGATTAGATACC-3'（配列番号：７）、
ｆ３Ｌ フォワードプライマー １０９３−１１１１ 5'-GTCCCGCAACGAGCGCAAC-3'（配列番号：８）、
ｒ１Ｌ リバースプライマー ５３５−５１７ 5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3'（配列番号：９）、
ｒ２Ｌ リバースプライマー ８０４−７８５ 5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3'（配列番号：１０）、
ｒ３Ｌ リバースプライマー １１１０−１０９２ 5'-TTGCGCTCGTTGCGGGACT-3'（配列番号：１１）、
ｒ４Ｌ リバースプライマー １４０５−１３８８ 5'-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3'（配列番号：１２）、
ｒＥ１Ｌ リバースプライマー ３４４−３２６ 5'-GTAGGAGTCTGGACCGTGT-3'（配列番号：１３）、
を用いた。なお、シークエンス反応の条件は、９５℃２０秒と５０℃１５秒と６０℃１分とを１サイクルとする３０サイクルとした。ついで、ＤＮＡシーケンサー〔商品名：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕を用いて、各試料を解析した。
【００８０】
得られた解析対象の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列について、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のデータベースに登録されている１６Ｓ ｒＤＮＡライブラリーについて、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、検索対象Ｄｉｖｉｓｉｏｎ バクテリア、ＧＡＰ計算あり、期待値１０、その他パラメータ デフォルト値の条件で、相同性の高い菌株を検索した。
【００８１】
その結果、前記Ｑ−１は、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＴＵＴ１２３８と９８．６％の相同性、前記Ｑ−２は、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）と９８．６％の相同性、前記Ｑ−３は、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）と９６．５％の相同性、前記Ｑ−４は、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）と９６．６％の相同性、前記Ｑ−５は、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）と９９．５％の相同性、前記Ｑ−６は、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） ｍｐ−２と９９．６％の相同性を示した。
【００８２】
そこで、前記Ｑ−１を、ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ−１、前記Ｑ−２を、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ） Ｑ−２、前記Ｑ−５を、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５、前記Ｑ−６を、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） Ｑ−６とした。
【００８３】
ついで、前記Ｑ−１〜Ｑ−６について、慣用の手法により、形態学的、生理生化学的特徴を調べた。前記Ｑ−１〜Ｑ−６について、位相差顕微鏡〔株式会社ニコン製〕で観察して、運動性を検討した。また、グラム染色とオキシターゼテストは、ホルムス（Ｂ.Ｈｏｌｍｅｓ）ら〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第３８巻、第４０６頁〜第４１６頁、（１９８８）〕に従って行なった。
【００８４】
その結果、Ｑ−１、Ｑ−２、Ｑ−３、Ｑ−４、Ｑ−５及びＱ−６は、全て運動性を有するグラム陰性の短桿菌であった。
【００８５】
また、その他の生理・生化学的性状は、商品名：Ａｐｉ ２０Ｅ同定キット〔バイオメリオ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）製〕を用いて検討した。表１に生理・生化学的性質を示す。
【００８６】
【表１】
【実施例３】
【００８７】
スチレンアクリル樹脂の分解活性
終濃度５ｇ／Ｌになるようにジクロロメタンに、前記スチレンアクリル樹脂〔三笠産業株式会社、トナーインク用スチレンアクリル樹脂〕を溶解し、得られた溶液 １ｍＬを試験管に分注した。その後、ドラフト内で前記試験管を風乾させた。
【００８８】
前記試験管に、ＦＹ培地〔組成：１重量％ ＮＨ4Ｃｌ、０．１重量％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％ ＮａＣｌ、０．００１重量％ ＺｎＣｌ2、０．００１重量％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１重量％ ＣａＣｌ2、０．１重量％ 酵母エキス〕 ５ｍＬを添加し、１２１℃２０分間高圧滅菌した。
【００８９】
ついで、ＡＭＯＣ２、Ｑ−１〜Ｑ−６のそれぞれを前記高圧滅菌後の試験管に接種し、３７℃、１２５ストローク／分で振とう培養を行なった。なお、対照として、近畿大学農学部応用微生物学研究室に保存されているポリエステル化合物分解微生物群ＡＭＯＣ００１を用いた。
【００９０】
７日間培養後に得られた培養液に残存するスチレンアクリル樹脂及びそれに由来する分解生成物をジクロロメタンで抽出し、ヘキサトリアコンタン〔内部標準物質、シグマ−アルドリッヒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社製〕を添加し、エバポレーターで減圧乾固させた。得られた乾固物を、ヘキサン：トルエン／２：８（体積比） ５ｍＬに溶解した。
【００９１】
得られた試料 １μＬを、の石英ガラスの周りにシリカゲルを薄くコーティングしたロッド（商品名：クロマロッドＳＩＩＩ 株式会社三菱化学ヤトロン製）にスポットし、そのロッドを恒湿槽（条件：６５％ＲＨ）で１０分間インキュベーションした。その後、ｎ−ヘキサンが入った展開槽内で１０分間ハンギングしてから、１０ｃｍ展開させた。なお、ハンギング及び展開は３７℃の恒温槽内で行った。
【００９２】
展開が終わったロッドは、溶媒を除去させるため室温で乾燥させ、まず１０ｃｍ展開したロッドをＦＩＤ分析して内部標準ピークを検出した。
【００９３】
その後、部分測定が終了したロッドを、再び１０分間恒湿槽に保った。トルエンで１０ｃｍ展開させた。除去させるため室温で乾燥させて溶媒を除去した。展開後のロッドを、商品名：イアトロスキャンＭｋ−６ｓ（株式会社三菱化学ヤトロン製）を用いて、検出器：ＦＩＤ、水素ガス：１６０ｍＬ／分、空気：２．０Ｌ／分、スキャン速度：３０秒／スキャンの条件で分析し、スチレンアクリル樹脂に対応するピークと、それに由来する分解生成物に対応するピークとを検出した。また、継代培養は７日毎に行い分解率の経時変化も求めた。
【００９４】
なお、陰性対照として、微生物培養物非存在下の場合について同様に行なった。
【００９５】
前記分解活性は、微生物培養物存在下の場合の各ピークの面積と、対照の場合の各ピークの面積とを比較し、スチレンアクリル樹脂に対応するピークの面積がゼロの場合、当該スチレンアクリル樹脂が１００％分解されたことの指標として算出した。その結果を図４及び図５に示す。
【００９６】
その結果、図４に示されるように、ＡＭＯＣ２は、３代以上継代培養しても、安定して、分解率は、約４５％であり、スチレンアクリル樹脂を分解できることがわかる。また、生育も良好であった。しかしながら、図４に示されるように、ポリエステル分解微生物群ＡＭＯＣ００１は、スチレンアクリル樹脂の分解率は継代回数が増加するにつれて低下し、継代回数３回目（７日／回）で樹脂の分解も菌の生育が認められなくなった。
【００９７】
また、図５に示されるように、 Ｑ−１〜Ｑ−４株及びＱ−６株は、単独では、分解率は、２５％であったが、Ｑ−５株は、安定して、分解率は、約４０％であった。したがって、ＡＭＯＣ２において、Ｑ−５は、Ｑ−１〜Ｑ−４及びＱ−６と協調的に、互いに機能を補完しあって、高い分解率を維持していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、スチレンアクリル樹脂を含む廃棄物を、安価で、かつ環境に対して低影響で処理することができ、廃棄物中の金属又は色素の安価でかつ環境に対して低影響で回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、微生物培養物によるスチレンアクリルの分解を示す図である。レーン１は、対照であり、レーン２は、微生物培養物存在下のスチレンアクリルの分解を示す。
【０１００】
【図２】図２は、Ｑ−１〜Ｑ−６のコロニーの形状を示す図である。
【０１０１】
【図３】図３は、ＡＭＯＣ２及びＱ−１〜Ｑ−６それぞれの１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３領域の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動解析の結果を示す図である。レーン１は、ＡＭＯＣ２、レーン２〜レーン７は、それぞれＱ−１〜Ｑ−６である。
【０１０２】
【図４】図４は、ＡＭＯＣ２及びＡＭＯＣ００１によるスチレンアクリル樹脂の分解活性を調べた結果を示す図である。図中、四角が、ＡＭＯＣ２、三角が、ＡＭＯＣ００１である。
【０１０３】
【図５】図５は、ＡＭＯＣ２及びＱ−１〜Ｑ−６それぞれによるスチレンアクリル樹脂の分解活性を調べた結果を示す図である。図中、四角が、ＡＭＯＣ２、星印が、Ｑ−１、十字印が、Ｑ−２、五角形が、Ｑ−３、六角形が、Ｑ−４、ひし形が、Ｑ−５、三角が、Ｑ−６である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号：１は、プライマーの配列である。
【０１０５】
配列番号：２は、プライマーの配列である。
【０１０６】
配列番号：３は、プライマーの配列である。
【０１０７】
配列番号：４は、プライマーの配列である。
【０１０８】
配列番号：５は、プライマーの配列である。
【０１０９】
配列番号：６は、プライマーの配列である。
【０１１０】
配列番号：７は、プライマーの配列である。
【０１１１】
配列番号：８は、プライマーの配列である。
【０１１２】
配列番号：９は、プライマーの配列である。
【０１１３】
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
【０１１４】
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
【０１１５】
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
【０１１６】
配列番号：１３は、プライマーの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物。
【請求項２】
シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物が、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０）である、請求項１記載の微生物培養物。
【請求項３】
ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物と、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）に属する微生物と、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）に属する微生物と、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物とをさらに含有してなる、請求項１又は２記載の微生物培養物。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物培養物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の分解用組成物。
【請求項５】
微生物培養物を保持するに適した固定用担体をさらに含有してなる、請求項４記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物。
【請求項６】
微生物の培養に適した培地をさらに含有してなる、請求項４又は５記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物。
【請求項７】
（Ａ）スチレンアクリル樹脂を含む生産物若しくは廃棄物と、（Ｂ）請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物培養物又は請求項４〜６いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させることを特徴とする、スチレンアクリル樹脂の分解方法。
【請求項８】
（ａ）スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、（ｂ）請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物培養物又は請求項４〜６いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル樹脂を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離することを特徴とする、廃棄物中の金属又は色素の回収方法。
【請求項１】
シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の生分解能を呈する微生物培養物。
【請求項２】
シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）に属する微生物が、シュードモナス ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ） Ｑ−５（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８０）である、請求項１記載の微生物培養物。
【請求項３】
ルテイモナス スピーシーズ（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物と、メソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）に属する微生物と、ロシャリメア エリザベザエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｅ）に属する微生物と、アルカリジェネス スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物とをさらに含有してなる、請求項１又は２記載の微生物培養物。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物培養物を含有してなる、スチレンアクリル樹脂の分解用組成物。
【請求項５】
微生物培養物を保持するに適した固定用担体をさらに含有してなる、請求項４記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物。
【請求項６】
微生物の培養に適した培地をさらに含有してなる、請求項４又は５記載のスチレンアクリル樹脂の分解用組成物。
【請求項７】
（Ａ）スチレンアクリル樹脂を含む生産物若しくは廃棄物と、（Ｂ）請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物培養物又は請求項４〜６いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させることを特徴とする、スチレンアクリル樹脂の分解方法。
【請求項８】
（ａ）スチレンアクリル樹脂と金属若しくは色素とを含む廃棄物と、（ｂ）請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物培養物又は請求項４〜６いずれか１項に記載の分解用組成物とを接触させ、廃棄物中のスチレンアクリル樹脂を分解させ、それにより、廃棄物中の金属又は色素を分離することを特徴とする、廃棄物中の金属又は色素の回収方法。
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−３４０６６８（Ｐ２００６−３４０６６８Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６９８７７（Ｐ２００５−１６９８７７）
【出願日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４００５０３５）三笠産業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４００５０３５）三笠産業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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