センサ及びセンサを用いた検出方法
【課題】検出対象物質の検出に要する時間を短縮する。
【解決手段】定在波を発生する振動板１１０３及びピエゾ素子１１０２と、定在波の節の位置に配置され標的物体を捕捉するための捕捉部と、捕捉部に捕捉した標的物体を検出するためのＴＭＲ素子１１０１とを有する。
【解決手段】定在波を発生する振動板１１０３及びピエゾ素子１１０２と、定在波の節の位置に配置され標的物体を捕捉するための捕捉部と、捕捉部に捕捉した標的物体を検出するためのＴＭＲ素子１１０１とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物体から検出対象物質を検出するためのセンサ及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量的なイムノアッセイ（免疫測定法）として、放射免疫測定法（ＲＩＡ：radio immunoassay もしくは、ＩＲＭＡ：immunoradiometric assay）が古くから知られている。この方法は、放射性核種によって、競合抗原あるいは抗体を標識し、比放射能の測定結果から抗原を定量的に測定する。つまり、イムノアッセイは、抗原等の標的物体を、標識して間接的に測定を行う。この方法は感度が高いことから、臨床診断において大きな貢献を果たしたが、放射性核種の安全性を確保する必要があり、専用の施設や装置が必要となるという欠点がある。そこで、より扱い易い方法として、例えば、蛍光物質、酵素、電気化学発光分子、磁性粒子等の標識（特許文献１参照）が提案されている。標識に酵素を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme Immunoassay）は、抗原−抗体反応を起こさせた後に、酵素標識抗体を反応させ、その酵素に対する基質を添加して発色させ、その吸光度によって比色定量する方法である。
【０００３】
上述したように、イムノアッセイとしては種々の検出方法が知られているが、検出を行う際には、前処理する工程、測定試料を作製する工程、検出する工程等のいくつかの工程が採られている。それらの工程の中で、測定試料を作製する際に、例えば抗原−抗体反応等のように標的物体を特異的に反応させる工程は、いずれの検出方法においても必須である。
【特許文献１】特公平０５−００４０２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、検出対象物質としての標的物体を特異的に反応させる工程は、検出のための全工程にかかる時間の中で大きなウエイトを占めている。標的物体の反応は、現状では例えばブラウン運動や対流によって、標的物体が検出するための所望の検出領域に偶然到達することによって達成されている。したがって、特に標的物体が検体溶液中に著しく低密度で存在する場合には、検出可能となる数量の標的物体が検出領域に固定されるまでに著しく長い時間を要するという問題がある。すなわち、標的物体を検出するために長時間を要している。
【０００５】
そこで、本発明は、検出対象物質を検出領域内に形成された捕捉部近傍に集めることを可能にし、比較的短時間に検出対象物質を捕捉部に固定することで、検出対象物質の検出に要する時間を短縮することができるセンサ及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成するため、本発明に係るセンサは、定在波を発生する発生手段と、定在波の節の位置に配置され検出対象物質を捕捉するための捕捉部と、捕捉部に捕捉した検出対象物質を検出するための検出手段とを有する。
【０００７】
また、本発明に係る検出方法は、本発明に係るセンサを用いた検出方法であって、検体に定常波を与えながら検出対象物質を所定の領域に集める第１ステップと、捕捉部に検出対象物質を捕捉させる第２ステップと、検出対象物質の検出を行う第３ステップとを有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、検出対象物質を捕捉部近傍に集めることが可能になり、比較的短時間で検出対象物質の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の具体的な実施例について説明する。
【００１０】
まず、本実施例について、定常波を用いる原理を説明する。図８は、定常波が形成されている領域の端がどちらも固定端である場合の定常波の状態を示す。固定端の場合、図８に示すように、端は必ず定常波の節となる。したがって、定常波の両端が固定端４００１である場合、一端から他端までの距離をＸとすれば、定常波の周波数ｆは、Ｖ／２Ｘの整数倍で与えられる。
【００１１】
また、図９は、一方が自由端で、他方が固定端である場合の定常波の状態を示す。自由端４００２では、端は定常波の腹となるが、厳密には、端のやや外側に腹が形成される。一方の端が自由端であり、他方が固定端であるならば、周波数ｆはＶ／４(Ｘ＋ΔＸ)の
整数倍で与えられる。ここで、Ｖは波の速度で、ΔＸは自由端４００２から外側に形成さ
れる腹までの距離、すなわち開口端補正の距離である。
【００１２】
検体に定常波を付与する空間の中で、検出対象物質としての標的物体を捕捉して固定する捕捉部を、定常波によって標的物体の密度が高くなる位置に形成する。すなわち、定常波の節に対応する位置に、標的物体を捕捉して固定する捕捉部を形成する。また、複数の捕捉部を形成する場合には、各捕捉部を波の進行方向に沿ってλ／２の間隔で配置する。ただし、与える波のエネルギーが大き過ぎると、捕捉部に一度固定された標的物体が引き剥がされることもあるので、定常波のエネルギーは適当に選択する。また、捕捉部に固定された標的物体が簡単に引き剥がされる場合には、一旦、定常波によって標的物体を所定の領域に集め、その後、定常波の付与を停止した状態で固定化を行っても良い。
【００１３】
また、与える定在波は周波数が一定にされても良いが、捕捉部の検出領域内に標的物体を均一に固定させるために、定在波の周波数を時間的に変調し、標的物体が高密度に存在する領域が、捕捉部近傍の領域の表面を往復するようにしても良い。また、定常波を発生する発生手段としては、特に限定されないが、例えばピエゾ素子や、スピーカーに類似する電磁石によって振動板を振動させる構造等が挙げられる。
【００１４】
標的物体を捕捉部に固定化する過程が終了した後に、検体中に存在する何らかの物体（非標的物体）が標的物体の検出に悪影響を及ぼす場合には、非標的物体を除去した後に標的物体の検出を行う。非標的物体を除去する方法としては、洗浄液や気体を流しても良く、また定常波の周波数を少しずらして、非標的物体を排出する方向に波を移動させても良い。あるいは遠心力を与えて非標的物体を除去しても良い。
【００１５】
標的物体は、種々の方法で検出可能であり、例えば、表面プラズモン効果、電荷の変化量等によって、標的物体を直接検出可能である。また、標的物体に標識物体を固定させ、間接的に標的物体を検出することも可能である。標識物体には、蛍光、酵素、電気化学発光、放射性、磁性等の様々なものが存在し、標識物体に応じて検出手段を適宜選択して用いて、標的物体の数量や濃度を検出する。例えば、蛍光標識、酵素標識、電気化学発光標識等は、光学的な測定方法に用いられる。この測定方法は、標識物体が固定された標的物体を捕捉することによって捕捉部に光学的変化が生じ、光の吸収率や透過率や発光光量を計測することによって、標的物体を検出する方法である。また、放射性同位元素を含有する放射性標識は、比放射能を測定することによって、標的物体の定量を行う測定方法に用いられる。
【００１６】
次に、具体的な実施例を挙げてさらに詳細に説明する。
【００１７】
（実施例１）
近年、磁気抵抗効果膜を用いることによって、標識物体として用いた微量の磁性粒子を容易に検出する方法が提案されている（引用文献１：David R. Baselt, et al. Biosensors & Bioelectronics 13, 731 (1998)、引用文献２：D. L. Graham, et al. Biosensors & Bioelectronics 18, 483 (2003)）。
【００１８】
引用文献１には、８０μｍ×５μｍ及び２０μｍ×５μｍのサイズの巨大磁気抵抗効果（ＧＭＲ：Giant Magnetic Resistance effect）膜を用いて、直径２．８μｍの複数個の磁性粒子１００４の検出を行なっている。
【００１９】
ＧＭＲ膜で用いられている磁性膜は、面内磁化膜であり、図２に示すように、磁性粒子１００４に印加される印加磁界１００５は、磁性膜に対して膜面垂直方向に印加されている。したがって、磁界の印加によって磁化された磁性粒子１００４から生じる浮遊磁界１００６が、ＧＭＲ膜の磁性膜に概略膜面内方向に印加され、磁性膜の磁化はこの磁界方向に揃う。磁気抵抗効果膜の電気抵抗の大きさは、２つの磁性膜の相対的な磁化方向に依存しており、磁化方向が平行であると電気抵抗が比較的小さく、反平行であると比較的大きいという特徴を有する。平行、反平行という磁化状態を実現させるために、磁気抵抗効果膜の２つの磁性膜は、一方の磁性膜であるピンド層１００１の磁化方向が固定され、他方の磁性膜であるフリー層１００２が、磁性粒子からの浮遊磁界によって磁化反転が可能な保磁力を有している。このような保磁力を有する磁性材料によって、磁気抵抗効果膜の２つの磁性膜を形成する。
【００２０】
また、ピンド層１００１は、強磁性膜に反強磁性膜を交換結合させることによって構成することも可能である。ピンド層１００１とフリー層１００２の間には非磁性金属膜１００３が形成される。初期状態として、フリー層１００２とピンド層１００１の磁化を完全平行状態あるいは完全反平行状態としておく。磁性粒子１００４がＧＭＲセンサの上に存在しない場合には、印加磁界１００５を印加してもフリー層１００２に膜面内方向の磁界が印加されないので磁化反転が生じない。しかしながら、磁性粒子１００４がＧＭＲセンサ上部に存在する場合には、上述のようにフリー層１００２の磁化状態が変化するので、ＧＭＲセンサの電気抵抗値が変化し、その結果、磁性粒子１００４が検出される。図３に示すように、抗原１０１１（標的物体）と一次抗体１０１２及び二次抗体１０１３の特異的な結合を用いることで、抗原１０１１が存在する場合にのみ磁性粒子１００４がＧＭＲセンサ上部に固定される。これによって、間接的に抗原１０１１の有無を検出することが可能である。
【００２１】
また、検出回路は、２つの固定抵抗と磁性粒子１００４が固定されないＧＭＲセンサ、及び磁性粒子１００４が固定し得るＧＭＲセンサによってブリッジ回路を構成し、このブリッジ回路に誘起される電位差をロックインアンプで検出する構成となっている。引用文献２では２μｍ×６μｍのサイズのＧＭＲセンサを用い、直径２μｍの磁性粒子の検出を行っている。引用文献１と同様にＧＭＲセンサは、磁性粒子１００４が固定し得るものと固定されないものを並べて形成し、この２つのＧＭＲセンサの出力信号を比較することで磁性粒子１００４の検出を行っている。ただし、磁性膜は面内磁化膜であり、かつ磁性粒子１００４に印加する印加磁界１００５は、磁性膜に対して膜面内長手方向である。
【００２２】
以上のように磁気抵抗効果膜を用いた磁性粒子の検出方法は、磁性粒子１００４を所望の方向に磁化し、磁性粒子から発する浮遊磁界によって磁気抵抗効果膜の磁化方向を変化させて検出を行うものであり、取り扱いが簡単で著しく短い時間で検出が可能である。
【００２３】
磁気抵抗効果膜としては、ＧＭＲ膜の他にＴＭＲ（Tunneling Magnetic Resistance）膜や、ＢＭＲ（Ballistic Magnetic Resistance）膜がある。これらＴＭＲ膜、ＢＭＲ膜は、ＧＭＲ膜よりも大きな抵抗変化を示すので、センサ素子としてより好ましい。ＴＭＲ膜（スピントンネル効果膜）は、基本構造がＧＭＲ膜と同様に、２つの磁性膜の間に非磁性体が形成された構造を有するが、非磁性体が薄い誘電体膜であり、この誘電体膜を電子がトンネリングする点でＧＭＲ膜と異なる。また、ＢＭＲ膜は、２つの磁性体が局所的に著しく狭い領域で結合した構造を持つ。
【００２４】
上述のいずれの磁気抵抗効果膜もセンサ素子（磁気抵抗効果素子）として使用可能であるが、本実施例においては、磁気抵抗効果素子としてＴＭＲ素子１１０１を用いる。ＴＭＲ素子１１０１の作製方法は以下の通りである。
【００２５】
シリコンウエハ表面に、膜厚２０ｎｍのＣｒ膜、膜厚２０nmのＰｔ膜、膜厚１０nmのＭｎＩｒ膜、膜厚５nmのＦｅＣｏ膜、膜厚１．６ｎｍのＭｇＯ膜をマグネトロンスパッタリングによって順次積層する。さらに、シリコンウエハ表面に、膜厚５nmのＦｅＣｏ膜、膜厚２０nmのＮｉＦｅ膜、膜厚５ｎｍのＰｔ膜をマグネトロンスパッタリングによって順次積層する。ＭｇＯ膜は、Ｍｇターゲットを用いてＡｒとＯ2の混合ガスを用いて成膜が行われる。シリコンウエハ側から順に、Ｃｒ／Ｐｔ多層膜は下部電極となり、ＭｎＩｒ／ＦｅＣｏ多層膜はＴＭＲ膜のピンド層１００１（磁化方向が固定されている層）であり、ＭｇＯ膜はトンネル膜である。また、ＦｅＣｏ／ＮｉＦｅ多層膜はフリー層１００２（磁化方向が印加磁界によって変化しやすい層）であり、Ｐｔ膜は加工時の磁性膜の変質を防ぐための保護層である。
【００２６】
上述の多層膜の表面に、レジスト膜をスピンコーターによって１μｍ程度の均一な膜厚で塗布し、ベーキング処理した後に紫外線によって所望の形状にパターニングする。その後、再度、ベーキング処理を行い、現像液内に浸漬した後に純水によって洗浄し、所望のパターン形状のレジスト膜を得る。本実施例では、レジストパターニング形状は２μｍ×２０μｍの長方形とする。
【００２７】
続いて、試料を、Ａｒガスを用いたドライエッチングによって、試料表面からＭｇＯ膜表面までエッチングを行う。さらに、ＭｇターゲットをＡｒとＯ2の混合ガスを導入してマグネトロンスパッタし、ＭｇＯからなる層間絶縁膜を形成する。その後、試料をレジスト剥離液中に浸漬した状態で超音波洗浄し、レジスト膜及びその上部に形成されるＭｇＯ膜を除去する。
【００２８】
微細加工された試料の表面に、所望のレジストパターニングを施し、その後、膜厚２０ｎｍのＰｔ膜を成膜し、レジスト膜及びその上部に付着したＰｔ膜を除去してＴＭＲ素子１１０１の上部電極を形成する。さらに、標的物体を捕捉するための捕捉部として、ＴＭＲ素子１１０１上部に、パターニングされた膜厚が２０nmのＡｕ膜を形成すると共に、その周りの領域を２０nmの膜厚のＳｉＮ膜で覆い非固定領域とする。検出対象物（磁性粒子１００４）と磁気センサとの距離は、感度において重要であり、その距離が短いほど高い検出信号が期待される。したがって、ＴＭＲ素子１１０１のフリー層１００２上部に形成される多層膜は、各膜がそれぞれの機能を発揮する範囲で薄くされているのが好ましく、各膜厚は本実施例で示した値に限定されるものではない。
【００２９】
図１に、本実施例のセンサの模式的な断面図を示す。本実施例のセンサは、図１に示すように、長さ２ｃｍ×幅１００μｍ×深さ３０μｍの流路１１００を備えている。流路１１００の底面、すなわち流路形成基板１１０６上には、ＴＭＲ素子１１０１が、流路１１００の横方向（流路１１００の幅方向）に対して３２個、流路１１００の縦方向（流路１１００の長手方向）に対して２５６個が配列されている。ＴＭＲ素子１１０１の長手方向は、流路１１００の縦方向と一致している。流路１１００の横方向に配列された３２個のＴＭＲ素子１１０１は、図４に示すように、電気的に直列に接続され、さらに選択トランジスタ１１１０に接続されている。ただし、検出電流はＴＭＲ素子１１０１の膜面垂直方向に流れるように配線されている。また、流路の縦方向に沿って配列されたＴＭＲ素子１１０１は、定常波の節が形成される箇所に配置されている。直列に接続された３２個のＴＭＲ素子１１０１は、それぞれセンスアンプ１１０８と定電流源１１０９に電気的に接続されている。
【００３０】
図１に示すように、流路１１００の一端には、振動板１１０３を介して、定常波を発生するためのピエゾ素子１１０２が固定されている。流路１１００の一端には、検体を注入するための注入孔が形成されており、他端には、検体を排出するための排出孔が形成される。定常波を印加するときには、これら注入孔及び排出孔は、詮１１０７が取り付けられてそれぞれ塞がれている。
【００３１】
本実施例では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）１０１１を標的物体とし、磁性粒子１００４を標識物体とする。
【００３２】
標的物体の検出領域に一次抗体１０１２を担持するために、捕捉部としてのＡｕ膜の表面は、まず親水化処理が施された後、アミノシランカップリング剤で処理される。さらに、一次抗体１０１２を固定化させるためのグルタルアルデヒド等架橋剤を用いて、アミノシランカップリング剤由来のアミノ基とペプチド鎖間とを化学結合させ、所望の抗原１０１１を捕捉する一次抗体１０１２が固定されている。
【００３３】
次に、ＰＳＡを含む検体を流路１１００内に注入し、注入孔と排出孔を詮１１０７で塞いだ後に、定常波を印加する。定常波の周波数は、例えば１２．５ＭＨｚ程度である。ただし、検体の種類によって最適な周波数がずれるため、ＴＭＲ素子１１０１付近で標的物体１０１１の密度が高くなるように周波数を調節する。定常波を印加することによってセンサ素子１１０１表面におけるＰＳＡの密度を高められ、ＰＳＡの固定時間を短縮することができる。
【００３４】
ＰＳＡを固定させた後、二次抗体１０１３が修飾された磁性粒子１００４を流路１１００内に注入し、インキュベート（保温）する。続いて、磁性粒子１００４をＰＳＡに固定させた後、流路１１００内をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、固定されていない磁性粒子１００４を流路１１００内から除去する。以上の過程を経ることにより、検体中にＰＳＡが存在する場合にのみ、磁性粒子１００４がＴＭＲ素子１１０１の表面に固定される。
【００３５】
続いて、ＰＳＡの検出は以下の方法で行われる。図５に示すように、磁性粒子１００４に印加磁界１００５を印加して、磁性粒子１００４の磁化方向を所望の方向に向けることで、浮遊磁界１００６を発生させる。この浮遊磁界１００６と外部磁界である印加磁界１００５とは逆の方向でＴＭＲ素子１１０１に印加されるため、ＴＭＲ素子１１０１のフリー層１００２の磁化方向は、印加磁界１００５と浮遊磁界１００６の合成磁界によって決定される。つまり、初期状態においてフリー層１００２とピンド層１００１の磁化状態を平行としておき、このとき、センスアンプ１１０８からの出力信号が零となるようにリファレンス電圧を調整しておく。
【００３６】
ＰＳＡが検体中に存在する場合には、ＴＭＲ素子１１０１の抵抗値が高くなり、リファレンス電圧よりもＴＭＲ素子１１０１にかかる電圧が高くなるので、センスアンプ１１０８から検出信号が得られる。一方、ＰＳＡが検体中に存在しない場合には、ＴＭＲ素子１１０１表面に磁性粒子１００４が固定されないので、検出信号が生じない。また、検出は選択トランジスタ１１１０を切り替えて、各ブロックの信号を順次センスアンプ１１０８へ送るようにする。このようにすることによって、ＰＳＡの含有量が僅かなときであっても、より感度良く検出することが可能である。また、検体中のＰＳＡの濃度も検出することが可能である。
【００３７】
以上のように、センス素子としてＴＭＲ素子を用いることが可能である。本実施例では、ＰＳＡの検出に関するものであるが、本発明で検出可能である標的物体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。さらに、本実施例は、生体分子の検出に限定されるものではなく、何らかの方法で検出可能であり、定常波の印加によって集められる物質であれば、他のいかなる物質を検出するために用いられてもよい。また、磁気抵抗効果膜としては、ＴＭＲ素子以外にも上述のように、ＧＭＲ素子やＢＭＲ素子等が使用可能である。
【００３８】
（実施例２）
上述した実施例１では、センサ素子としてＴＭＲ素子を用いた例について述べたが、ホール素子を用いても同様に実施可能である。Pierre-A. Besse, et al.Appl. Phys. Let. 22, 4199 (2002) （引用文献３）には、ホール素子を磁気センサとして用いた磁性粒子検出方法が提案されている。
【００３９】
引用文献３では、ＤＣ磁界を印加してホール素子の直上に置かれた直径２．８μｍの磁性粒子を磁化し、さらにＡＣ磁界を印加することによって磁性粒子の磁化方向を変化させ、磁性粒子の検出を行っている。ホール素子の膜面内方向に電流を流しながら、Ｚ軸方向に磁界を印加したとき、電子がローレンツ力を受けるので、膜面内で電流と直交する方向に電位差が生じる。その電位差は、磁界強度に比例するので、磁性粒子から生じる浮遊磁界の変化に伴って、ホール効果による電位差が変化する。磁性粒子が無ければ浮遊磁界が生じないので、磁性粒子の有無によってホール素子に印加される磁界の大きさが異なり、電位差の大きさが異なる。つまり、磁性粒子の有無をホール素子によって検出することが可能である。
【００４０】
本実施例では、図６に示すように、実施例1と同様に３２個×２５６個のホール素子をＧａＳｂ基板上に配する。ホール素子２１０１は、３００nmのＩｎＳｂを分子線エピタキシャルによって成膜する。横方向に対して配列された３２個のホール素子２１０１は、電気的に直列に接続されており、ホール素子２１０１内を検出電流が膜面内方向に流れる。この検出電流が流れる方向に対して膜面内垂直方向に検出信号である起電力を検出するための配線が各ホール素子２１０１に設けられている。検出電流は、定電流源２１０９から選択トランジスタ２１１０を介してホール素子２１０１に供給される。検出信号はホール素子２１０１の両端に接続された選択トランジスタ２１１０を介してセンスアンプ２１０８入力される。さらに、検出信号はロックインアンプ２１１１に入力される。ロックインアンプ２１１１の参照周波数はＡＣ磁界の周波数とする。
【００４１】
実施例１における固定化と同様に行って、標的物体として前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を、標識物体として磁性粒子を固定化する。
【００４２】
信号検出時には、ホール素子２１０１の膜面内方向に５０［Ｏｅ］のＡＣ磁界を印加しながら、膜面垂直方向に５００［Ｏｅ］の大きさの磁界を印加する。ただし、垂直方向の磁界は周期的に極性を変化させる。以上のように磁界を印加しながらホール素子２１０１の膜面内方向に検出電流を流す。ホール素子２１０１上に磁性粒２００４が存在している場合には、ロックインアンプ２１１１から得られる信号の大きさが、膜面垂直方向に印加する磁界方向と同期して変化する。また、選択トランジスタ２１１０を順次切り替えて３２個×２５６個のホール素子２１０１の信号をすべて検出する。全ホール素子２１０１の検出信号を積算することによって、ＰＳＡの濃度が比較的低い検体も検出可能である。また、検体中のＰＳＡの濃度も検出することが可能である。
【００４３】
以上のように、センス素子としてホール素子を適用することでも可能である。なお、本実施例では、ＰＳＡの検出に関するものであるが、本発明で検出可能である標的物体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。さらに、本実施例は、生体分子の検出に限定されるものではなく、何らかの方法で検出可能であり、定常波の印加によって集められる物質であれば、他のいかなる物質を検出するために用いられてもよい。
【００４４】
（実施例３）
上述の実施例１、２では、標識粒子を用いた例について述べたが、本実施例は標識粒子を用いずに、標的物体を直接検出する点が異なる。
【００４５】
図７に示すように、素子形成筐体（透明ガラス基板）３１０５上には、定常波の節に対応する位置に、幅５０nm、長さ３００nmのＡｕ素子３１０１が複数配置されている。Ａｕ素子３１０１は、流路３１００の縦方向に対して１００nmの間隔で１００個を配列し、流路３１００の横方向に対して５０nmの間隔で４００個を配列して形成する。この領域は、長さ１ｃｍ×幅５０μｍ×深さ３０μｍの流路３１００の中央部分に形成する。また、流路３１００は流路形成筐体（透明ガラス基板）３１０６に形成されている。流路３１００の一端側には、振動板３１０３を介してピエゾ素子３１０２が取り付けられている。実施例１及び実施例２と同様に、流路３１００の両端部には、検体を注入及び排出するための注入孔と排出孔がそれぞれ設けられている。定在波を印加するときには、これら注入孔と排出孔は、詮３１０７が取り付けられてそれぞれ塞がれている。
【００４６】
実施例１と同様に、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的物体とし、Ａｕ素子３１０１表面に一次抗体を固定させた後、ＰＳＡを含む検体を流路３１００内へ注入し、９４０ＭＨｚ程度の定常波を印加する。ただし、定常波の周波数は、Ａｕ素子３１０１が定常波の節の部分に位置するように微調整される。ＰＳＡは、Ａｕ素子３１０１周辺で高濃度となり、比較的短時間にＡｕ素子３１０１の表面に固定される。Ａｕ素子３１０１表面に固定されたＰＳＡは、局所表面プラズモン（Localized Surface Plasmon Resonance）によって検出可能である。このＬＳＰＲでは、光源３１０８から白色光３１０４をＡｕ素子３１０１に照射し、Ａｕ素子３１０１からの透過光を分光器３１１１により分光した後に、受光素子３１１２によって受光して、各周波数成分の強度の測定を行う。Ａｕ素子３１０１上に一次抗体のみが固定されている場合と、ＰＳＡが固定されている場合とでは、光強度が最も高くなる周波数が異なるので、検体溶液中に存在するＰＳＡの存在を検出することが可能である。ただし、白色光３１０４は、Ａｕ素子３１０１が形成されている４０μｍ×４０μｍの領域よりも小さな領域内にのみ照射されることが、感度の点から好ましい。つまり、レンズ３１０９によって検出領域内に白色光３１０４を収束させ、その後、レンズ３１１０を通して白色光３１０４を分光器３１１１へ導く。
【００４７】
以上のように、標識物体を使用することなく、例えばＬＳＰＲによってＰＳＡを検出することが可能である。本実施例は、ＰＳＡの検出に関するものであるが、検出可能な標的物体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。さらに、本発明は、生体分子の検出に限らず、何らかの方法で検出でき、定常波を印加することによって集められる物質であれば、どのようなものでも実施可能である。
【００４８】
なお、本発明は、特にバイオセンサとして利用されて好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１のセンサの構成を説明するための模式図である。
【図２】引用文献１における検出原理を説明するための概念図である。
【図３】抗原−抗体反応を用いた磁性粒子の固定化を説明するための概念図である。
【図４】実施例１のＴＭＲ素子を用いたセンサの検出回路を示す図である。
【図５】実施例１のＴＭＲ素子を用いたセンサの検出原理を説明するための概念図である。
【図６】実施例２のホール素子を用いたセンサの検出回路を示す図である。
【図７】実施例３のセンサの構成を説明するための模式図である。
【図８】両端が固定端の位置における定在波の状態を説明するための概念図である。
【図９】一端が固定端で他端が自由端の位置における定在波の状態を説明するための概念図である。
【符号の説明】
【００５０】
１１００ 流路
１１０１ ＴＭＲ素子
１１０２ ピエゾ素子
１１０３ 振動板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物体から検出対象物質を検出するためのセンサ及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量的なイムノアッセイ（免疫測定法）として、放射免疫測定法（ＲＩＡ：radio immunoassay もしくは、ＩＲＭＡ：immunoradiometric assay）が古くから知られている。この方法は、放射性核種によって、競合抗原あるいは抗体を標識し、比放射能の測定結果から抗原を定量的に測定する。つまり、イムノアッセイは、抗原等の標的物体を、標識して間接的に測定を行う。この方法は感度が高いことから、臨床診断において大きな貢献を果たしたが、放射性核種の安全性を確保する必要があり、専用の施設や装置が必要となるという欠点がある。そこで、より扱い易い方法として、例えば、蛍光物質、酵素、電気化学発光分子、磁性粒子等の標識（特許文献１参照）が提案されている。標識に酵素を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme Immunoassay）は、抗原−抗体反応を起こさせた後に、酵素標識抗体を反応させ、その酵素に対する基質を添加して発色させ、その吸光度によって比色定量する方法である。
【０００３】
上述したように、イムノアッセイとしては種々の検出方法が知られているが、検出を行う際には、前処理する工程、測定試料を作製する工程、検出する工程等のいくつかの工程が採られている。それらの工程の中で、測定試料を作製する際に、例えば抗原−抗体反応等のように標的物体を特異的に反応させる工程は、いずれの検出方法においても必須である。
【特許文献１】特公平０５−００４０２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、検出対象物質としての標的物体を特異的に反応させる工程は、検出のための全工程にかかる時間の中で大きなウエイトを占めている。標的物体の反応は、現状では例えばブラウン運動や対流によって、標的物体が検出するための所望の検出領域に偶然到達することによって達成されている。したがって、特に標的物体が検体溶液中に著しく低密度で存在する場合には、検出可能となる数量の標的物体が検出領域に固定されるまでに著しく長い時間を要するという問題がある。すなわち、標的物体を検出するために長時間を要している。
【０００５】
そこで、本発明は、検出対象物質を検出領域内に形成された捕捉部近傍に集めることを可能にし、比較的短時間に検出対象物質を捕捉部に固定することで、検出対象物質の検出に要する時間を短縮することができるセンサ及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成するため、本発明に係るセンサは、定在波を発生する発生手段と、定在波の節の位置に配置され検出対象物質を捕捉するための捕捉部と、捕捉部に捕捉した検出対象物質を検出するための検出手段とを有する。
【０００７】
また、本発明に係る検出方法は、本発明に係るセンサを用いた検出方法であって、検体に定常波を与えながら検出対象物質を所定の領域に集める第１ステップと、捕捉部に検出対象物質を捕捉させる第２ステップと、検出対象物質の検出を行う第３ステップとを有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、検出対象物質を捕捉部近傍に集めることが可能になり、比較的短時間で検出対象物質の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の具体的な実施例について説明する。
【００１０】
まず、本実施例について、定常波を用いる原理を説明する。図８は、定常波が形成されている領域の端がどちらも固定端である場合の定常波の状態を示す。固定端の場合、図８に示すように、端は必ず定常波の節となる。したがって、定常波の両端が固定端４００１である場合、一端から他端までの距離をＸとすれば、定常波の周波数ｆは、Ｖ／２Ｘの整数倍で与えられる。
【００１１】
また、図９は、一方が自由端で、他方が固定端である場合の定常波の状態を示す。自由端４００２では、端は定常波の腹となるが、厳密には、端のやや外側に腹が形成される。一方の端が自由端であり、他方が固定端であるならば、周波数ｆはＶ／４(Ｘ＋ΔＸ)の
整数倍で与えられる。ここで、Ｖは波の速度で、ΔＸは自由端４００２から外側に形成さ
れる腹までの距離、すなわち開口端補正の距離である。
【００１２】
検体に定常波を付与する空間の中で、検出対象物質としての標的物体を捕捉して固定する捕捉部を、定常波によって標的物体の密度が高くなる位置に形成する。すなわち、定常波の節に対応する位置に、標的物体を捕捉して固定する捕捉部を形成する。また、複数の捕捉部を形成する場合には、各捕捉部を波の進行方向に沿ってλ／２の間隔で配置する。ただし、与える波のエネルギーが大き過ぎると、捕捉部に一度固定された標的物体が引き剥がされることもあるので、定常波のエネルギーは適当に選択する。また、捕捉部に固定された標的物体が簡単に引き剥がされる場合には、一旦、定常波によって標的物体を所定の領域に集め、その後、定常波の付与を停止した状態で固定化を行っても良い。
【００１３】
また、与える定在波は周波数が一定にされても良いが、捕捉部の検出領域内に標的物体を均一に固定させるために、定在波の周波数を時間的に変調し、標的物体が高密度に存在する領域が、捕捉部近傍の領域の表面を往復するようにしても良い。また、定常波を発生する発生手段としては、特に限定されないが、例えばピエゾ素子や、スピーカーに類似する電磁石によって振動板を振動させる構造等が挙げられる。
【００１４】
標的物体を捕捉部に固定化する過程が終了した後に、検体中に存在する何らかの物体（非標的物体）が標的物体の検出に悪影響を及ぼす場合には、非標的物体を除去した後に標的物体の検出を行う。非標的物体を除去する方法としては、洗浄液や気体を流しても良く、また定常波の周波数を少しずらして、非標的物体を排出する方向に波を移動させても良い。あるいは遠心力を与えて非標的物体を除去しても良い。
【００１５】
標的物体は、種々の方法で検出可能であり、例えば、表面プラズモン効果、電荷の変化量等によって、標的物体を直接検出可能である。また、標的物体に標識物体を固定させ、間接的に標的物体を検出することも可能である。標識物体には、蛍光、酵素、電気化学発光、放射性、磁性等の様々なものが存在し、標識物体に応じて検出手段を適宜選択して用いて、標的物体の数量や濃度を検出する。例えば、蛍光標識、酵素標識、電気化学発光標識等は、光学的な測定方法に用いられる。この測定方法は、標識物体が固定された標的物体を捕捉することによって捕捉部に光学的変化が生じ、光の吸収率や透過率や発光光量を計測することによって、標的物体を検出する方法である。また、放射性同位元素を含有する放射性標識は、比放射能を測定することによって、標的物体の定量を行う測定方法に用いられる。
【００１６】
次に、具体的な実施例を挙げてさらに詳細に説明する。
【００１７】
（実施例１）
近年、磁気抵抗効果膜を用いることによって、標識物体として用いた微量の磁性粒子を容易に検出する方法が提案されている（引用文献１：David R. Baselt, et al. Biosensors & Bioelectronics 13, 731 (1998)、引用文献２：D. L. Graham, et al. Biosensors & Bioelectronics 18, 483 (2003)）。
【００１８】
引用文献１には、８０μｍ×５μｍ及び２０μｍ×５μｍのサイズの巨大磁気抵抗効果（ＧＭＲ：Giant Magnetic Resistance effect）膜を用いて、直径２．８μｍの複数個の磁性粒子１００４の検出を行なっている。
【００１９】
ＧＭＲ膜で用いられている磁性膜は、面内磁化膜であり、図２に示すように、磁性粒子１００４に印加される印加磁界１００５は、磁性膜に対して膜面垂直方向に印加されている。したがって、磁界の印加によって磁化された磁性粒子１００４から生じる浮遊磁界１００６が、ＧＭＲ膜の磁性膜に概略膜面内方向に印加され、磁性膜の磁化はこの磁界方向に揃う。磁気抵抗効果膜の電気抵抗の大きさは、２つの磁性膜の相対的な磁化方向に依存しており、磁化方向が平行であると電気抵抗が比較的小さく、反平行であると比較的大きいという特徴を有する。平行、反平行という磁化状態を実現させるために、磁気抵抗効果膜の２つの磁性膜は、一方の磁性膜であるピンド層１００１の磁化方向が固定され、他方の磁性膜であるフリー層１００２が、磁性粒子からの浮遊磁界によって磁化反転が可能な保磁力を有している。このような保磁力を有する磁性材料によって、磁気抵抗効果膜の２つの磁性膜を形成する。
【００２０】
また、ピンド層１００１は、強磁性膜に反強磁性膜を交換結合させることによって構成することも可能である。ピンド層１００１とフリー層１００２の間には非磁性金属膜１００３が形成される。初期状態として、フリー層１００２とピンド層１００１の磁化を完全平行状態あるいは完全反平行状態としておく。磁性粒子１００４がＧＭＲセンサの上に存在しない場合には、印加磁界１００５を印加してもフリー層１００２に膜面内方向の磁界が印加されないので磁化反転が生じない。しかしながら、磁性粒子１００４がＧＭＲセンサ上部に存在する場合には、上述のようにフリー層１００２の磁化状態が変化するので、ＧＭＲセンサの電気抵抗値が変化し、その結果、磁性粒子１００４が検出される。図３に示すように、抗原１０１１（標的物体）と一次抗体１０１２及び二次抗体１０１３の特異的な結合を用いることで、抗原１０１１が存在する場合にのみ磁性粒子１００４がＧＭＲセンサ上部に固定される。これによって、間接的に抗原１０１１の有無を検出することが可能である。
【００２１】
また、検出回路は、２つの固定抵抗と磁性粒子１００４が固定されないＧＭＲセンサ、及び磁性粒子１００４が固定し得るＧＭＲセンサによってブリッジ回路を構成し、このブリッジ回路に誘起される電位差をロックインアンプで検出する構成となっている。引用文献２では２μｍ×６μｍのサイズのＧＭＲセンサを用い、直径２μｍの磁性粒子の検出を行っている。引用文献１と同様にＧＭＲセンサは、磁性粒子１００４が固定し得るものと固定されないものを並べて形成し、この２つのＧＭＲセンサの出力信号を比較することで磁性粒子１００４の検出を行っている。ただし、磁性膜は面内磁化膜であり、かつ磁性粒子１００４に印加する印加磁界１００５は、磁性膜に対して膜面内長手方向である。
【００２２】
以上のように磁気抵抗効果膜を用いた磁性粒子の検出方法は、磁性粒子１００４を所望の方向に磁化し、磁性粒子から発する浮遊磁界によって磁気抵抗効果膜の磁化方向を変化させて検出を行うものであり、取り扱いが簡単で著しく短い時間で検出が可能である。
【００２３】
磁気抵抗効果膜としては、ＧＭＲ膜の他にＴＭＲ（Tunneling Magnetic Resistance）膜や、ＢＭＲ（Ballistic Magnetic Resistance）膜がある。これらＴＭＲ膜、ＢＭＲ膜は、ＧＭＲ膜よりも大きな抵抗変化を示すので、センサ素子としてより好ましい。ＴＭＲ膜（スピントンネル効果膜）は、基本構造がＧＭＲ膜と同様に、２つの磁性膜の間に非磁性体が形成された構造を有するが、非磁性体が薄い誘電体膜であり、この誘電体膜を電子がトンネリングする点でＧＭＲ膜と異なる。また、ＢＭＲ膜は、２つの磁性体が局所的に著しく狭い領域で結合した構造を持つ。
【００２４】
上述のいずれの磁気抵抗効果膜もセンサ素子（磁気抵抗効果素子）として使用可能であるが、本実施例においては、磁気抵抗効果素子としてＴＭＲ素子１１０１を用いる。ＴＭＲ素子１１０１の作製方法は以下の通りである。
【００２５】
シリコンウエハ表面に、膜厚２０ｎｍのＣｒ膜、膜厚２０nmのＰｔ膜、膜厚１０nmのＭｎＩｒ膜、膜厚５nmのＦｅＣｏ膜、膜厚１．６ｎｍのＭｇＯ膜をマグネトロンスパッタリングによって順次積層する。さらに、シリコンウエハ表面に、膜厚５nmのＦｅＣｏ膜、膜厚２０nmのＮｉＦｅ膜、膜厚５ｎｍのＰｔ膜をマグネトロンスパッタリングによって順次積層する。ＭｇＯ膜は、Ｍｇターゲットを用いてＡｒとＯ2の混合ガスを用いて成膜が行われる。シリコンウエハ側から順に、Ｃｒ／Ｐｔ多層膜は下部電極となり、ＭｎＩｒ／ＦｅＣｏ多層膜はＴＭＲ膜のピンド層１００１（磁化方向が固定されている層）であり、ＭｇＯ膜はトンネル膜である。また、ＦｅＣｏ／ＮｉＦｅ多層膜はフリー層１００２（磁化方向が印加磁界によって変化しやすい層）であり、Ｐｔ膜は加工時の磁性膜の変質を防ぐための保護層である。
【００２６】
上述の多層膜の表面に、レジスト膜をスピンコーターによって１μｍ程度の均一な膜厚で塗布し、ベーキング処理した後に紫外線によって所望の形状にパターニングする。その後、再度、ベーキング処理を行い、現像液内に浸漬した後に純水によって洗浄し、所望のパターン形状のレジスト膜を得る。本実施例では、レジストパターニング形状は２μｍ×２０μｍの長方形とする。
【００２７】
続いて、試料を、Ａｒガスを用いたドライエッチングによって、試料表面からＭｇＯ膜表面までエッチングを行う。さらに、ＭｇターゲットをＡｒとＯ2の混合ガスを導入してマグネトロンスパッタし、ＭｇＯからなる層間絶縁膜を形成する。その後、試料をレジスト剥離液中に浸漬した状態で超音波洗浄し、レジスト膜及びその上部に形成されるＭｇＯ膜を除去する。
【００２８】
微細加工された試料の表面に、所望のレジストパターニングを施し、その後、膜厚２０ｎｍのＰｔ膜を成膜し、レジスト膜及びその上部に付着したＰｔ膜を除去してＴＭＲ素子１１０１の上部電極を形成する。さらに、標的物体を捕捉するための捕捉部として、ＴＭＲ素子１１０１上部に、パターニングされた膜厚が２０nmのＡｕ膜を形成すると共に、その周りの領域を２０nmの膜厚のＳｉＮ膜で覆い非固定領域とする。検出対象物（磁性粒子１００４）と磁気センサとの距離は、感度において重要であり、その距離が短いほど高い検出信号が期待される。したがって、ＴＭＲ素子１１０１のフリー層１００２上部に形成される多層膜は、各膜がそれぞれの機能を発揮する範囲で薄くされているのが好ましく、各膜厚は本実施例で示した値に限定されるものではない。
【００２９】
図１に、本実施例のセンサの模式的な断面図を示す。本実施例のセンサは、図１に示すように、長さ２ｃｍ×幅１００μｍ×深さ３０μｍの流路１１００を備えている。流路１１００の底面、すなわち流路形成基板１１０６上には、ＴＭＲ素子１１０１が、流路１１００の横方向（流路１１００の幅方向）に対して３２個、流路１１００の縦方向（流路１１００の長手方向）に対して２５６個が配列されている。ＴＭＲ素子１１０１の長手方向は、流路１１００の縦方向と一致している。流路１１００の横方向に配列された３２個のＴＭＲ素子１１０１は、図４に示すように、電気的に直列に接続され、さらに選択トランジスタ１１１０に接続されている。ただし、検出電流はＴＭＲ素子１１０１の膜面垂直方向に流れるように配線されている。また、流路の縦方向に沿って配列されたＴＭＲ素子１１０１は、定常波の節が形成される箇所に配置されている。直列に接続された３２個のＴＭＲ素子１１０１は、それぞれセンスアンプ１１０８と定電流源１１０９に電気的に接続されている。
【００３０】
図１に示すように、流路１１００の一端には、振動板１１０３を介して、定常波を発生するためのピエゾ素子１１０２が固定されている。流路１１００の一端には、検体を注入するための注入孔が形成されており、他端には、検体を排出するための排出孔が形成される。定常波を印加するときには、これら注入孔及び排出孔は、詮１１０７が取り付けられてそれぞれ塞がれている。
【００３１】
本実施例では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）１０１１を標的物体とし、磁性粒子１００４を標識物体とする。
【００３２】
標的物体の検出領域に一次抗体１０１２を担持するために、捕捉部としてのＡｕ膜の表面は、まず親水化処理が施された後、アミノシランカップリング剤で処理される。さらに、一次抗体１０１２を固定化させるためのグルタルアルデヒド等架橋剤を用いて、アミノシランカップリング剤由来のアミノ基とペプチド鎖間とを化学結合させ、所望の抗原１０１１を捕捉する一次抗体１０１２が固定されている。
【００３３】
次に、ＰＳＡを含む検体を流路１１００内に注入し、注入孔と排出孔を詮１１０７で塞いだ後に、定常波を印加する。定常波の周波数は、例えば１２．５ＭＨｚ程度である。ただし、検体の種類によって最適な周波数がずれるため、ＴＭＲ素子１１０１付近で標的物体１０１１の密度が高くなるように周波数を調節する。定常波を印加することによってセンサ素子１１０１表面におけるＰＳＡの密度を高められ、ＰＳＡの固定時間を短縮することができる。
【００３４】
ＰＳＡを固定させた後、二次抗体１０１３が修飾された磁性粒子１００４を流路１１００内に注入し、インキュベート（保温）する。続いて、磁性粒子１００４をＰＳＡに固定させた後、流路１１００内をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、固定されていない磁性粒子１００４を流路１１００内から除去する。以上の過程を経ることにより、検体中にＰＳＡが存在する場合にのみ、磁性粒子１００４がＴＭＲ素子１１０１の表面に固定される。
【００３５】
続いて、ＰＳＡの検出は以下の方法で行われる。図５に示すように、磁性粒子１００４に印加磁界１００５を印加して、磁性粒子１００４の磁化方向を所望の方向に向けることで、浮遊磁界１００６を発生させる。この浮遊磁界１００６と外部磁界である印加磁界１００５とは逆の方向でＴＭＲ素子１１０１に印加されるため、ＴＭＲ素子１１０１のフリー層１００２の磁化方向は、印加磁界１００５と浮遊磁界１００６の合成磁界によって決定される。つまり、初期状態においてフリー層１００２とピンド層１００１の磁化状態を平行としておき、このとき、センスアンプ１１０８からの出力信号が零となるようにリファレンス電圧を調整しておく。
【００３６】
ＰＳＡが検体中に存在する場合には、ＴＭＲ素子１１０１の抵抗値が高くなり、リファレンス電圧よりもＴＭＲ素子１１０１にかかる電圧が高くなるので、センスアンプ１１０８から検出信号が得られる。一方、ＰＳＡが検体中に存在しない場合には、ＴＭＲ素子１１０１表面に磁性粒子１００４が固定されないので、検出信号が生じない。また、検出は選択トランジスタ１１１０を切り替えて、各ブロックの信号を順次センスアンプ１１０８へ送るようにする。このようにすることによって、ＰＳＡの含有量が僅かなときであっても、より感度良く検出することが可能である。また、検体中のＰＳＡの濃度も検出することが可能である。
【００３７】
以上のように、センス素子としてＴＭＲ素子を用いることが可能である。本実施例では、ＰＳＡの検出に関するものであるが、本発明で検出可能である標的物体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。さらに、本実施例は、生体分子の検出に限定されるものではなく、何らかの方法で検出可能であり、定常波の印加によって集められる物質であれば、他のいかなる物質を検出するために用いられてもよい。また、磁気抵抗効果膜としては、ＴＭＲ素子以外にも上述のように、ＧＭＲ素子やＢＭＲ素子等が使用可能である。
【００３８】
（実施例２）
上述した実施例１では、センサ素子としてＴＭＲ素子を用いた例について述べたが、ホール素子を用いても同様に実施可能である。Pierre-A. Besse, et al.Appl. Phys. Let. 22, 4199 (2002) （引用文献３）には、ホール素子を磁気センサとして用いた磁性粒子検出方法が提案されている。
【００３９】
引用文献３では、ＤＣ磁界を印加してホール素子の直上に置かれた直径２．８μｍの磁性粒子を磁化し、さらにＡＣ磁界を印加することによって磁性粒子の磁化方向を変化させ、磁性粒子の検出を行っている。ホール素子の膜面内方向に電流を流しながら、Ｚ軸方向に磁界を印加したとき、電子がローレンツ力を受けるので、膜面内で電流と直交する方向に電位差が生じる。その電位差は、磁界強度に比例するので、磁性粒子から生じる浮遊磁界の変化に伴って、ホール効果による電位差が変化する。磁性粒子が無ければ浮遊磁界が生じないので、磁性粒子の有無によってホール素子に印加される磁界の大きさが異なり、電位差の大きさが異なる。つまり、磁性粒子の有無をホール素子によって検出することが可能である。
【００４０】
本実施例では、図６に示すように、実施例1と同様に３２個×２５６個のホール素子をＧａＳｂ基板上に配する。ホール素子２１０１は、３００nmのＩｎＳｂを分子線エピタキシャルによって成膜する。横方向に対して配列された３２個のホール素子２１０１は、電気的に直列に接続されており、ホール素子２１０１内を検出電流が膜面内方向に流れる。この検出電流が流れる方向に対して膜面内垂直方向に検出信号である起電力を検出するための配線が各ホール素子２１０１に設けられている。検出電流は、定電流源２１０９から選択トランジスタ２１１０を介してホール素子２１０１に供給される。検出信号はホール素子２１０１の両端に接続された選択トランジスタ２１１０を介してセンスアンプ２１０８入力される。さらに、検出信号はロックインアンプ２１１１に入力される。ロックインアンプ２１１１の参照周波数はＡＣ磁界の周波数とする。
【００４１】
実施例１における固定化と同様に行って、標的物体として前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を、標識物体として磁性粒子を固定化する。
【００４２】
信号検出時には、ホール素子２１０１の膜面内方向に５０［Ｏｅ］のＡＣ磁界を印加しながら、膜面垂直方向に５００［Ｏｅ］の大きさの磁界を印加する。ただし、垂直方向の磁界は周期的に極性を変化させる。以上のように磁界を印加しながらホール素子２１０１の膜面内方向に検出電流を流す。ホール素子２１０１上に磁性粒２００４が存在している場合には、ロックインアンプ２１１１から得られる信号の大きさが、膜面垂直方向に印加する磁界方向と同期して変化する。また、選択トランジスタ２１１０を順次切り替えて３２個×２５６個のホール素子２１０１の信号をすべて検出する。全ホール素子２１０１の検出信号を積算することによって、ＰＳＡの濃度が比較的低い検体も検出可能である。また、検体中のＰＳＡの濃度も検出することが可能である。
【００４３】
以上のように、センス素子としてホール素子を適用することでも可能である。なお、本実施例では、ＰＳＡの検出に関するものであるが、本発明で検出可能である標的物体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。さらに、本実施例は、生体分子の検出に限定されるものではなく、何らかの方法で検出可能であり、定常波の印加によって集められる物質であれば、他のいかなる物質を検出するために用いられてもよい。
【００４４】
（実施例３）
上述の実施例１、２では、標識粒子を用いた例について述べたが、本実施例は標識粒子を用いずに、標的物体を直接検出する点が異なる。
【００４５】
図７に示すように、素子形成筐体（透明ガラス基板）３１０５上には、定常波の節に対応する位置に、幅５０nm、長さ３００nmのＡｕ素子３１０１が複数配置されている。Ａｕ素子３１０１は、流路３１００の縦方向に対して１００nmの間隔で１００個を配列し、流路３１００の横方向に対して５０nmの間隔で４００個を配列して形成する。この領域は、長さ１ｃｍ×幅５０μｍ×深さ３０μｍの流路３１００の中央部分に形成する。また、流路３１００は流路形成筐体（透明ガラス基板）３１０６に形成されている。流路３１００の一端側には、振動板３１０３を介してピエゾ素子３１０２が取り付けられている。実施例１及び実施例２と同様に、流路３１００の両端部には、検体を注入及び排出するための注入孔と排出孔がそれぞれ設けられている。定在波を印加するときには、これら注入孔と排出孔は、詮３１０７が取り付けられてそれぞれ塞がれている。
【００４６】
実施例１と同様に、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的物体とし、Ａｕ素子３１０１表面に一次抗体を固定させた後、ＰＳＡを含む検体を流路３１００内へ注入し、９４０ＭＨｚ程度の定常波を印加する。ただし、定常波の周波数は、Ａｕ素子３１０１が定常波の節の部分に位置するように微調整される。ＰＳＡは、Ａｕ素子３１０１周辺で高濃度となり、比較的短時間にＡｕ素子３１０１の表面に固定される。Ａｕ素子３１０１表面に固定されたＰＳＡは、局所表面プラズモン（Localized Surface Plasmon Resonance）によって検出可能である。このＬＳＰＲでは、光源３１０８から白色光３１０４をＡｕ素子３１０１に照射し、Ａｕ素子３１０１からの透過光を分光器３１１１により分光した後に、受光素子３１１２によって受光して、各周波数成分の強度の測定を行う。Ａｕ素子３１０１上に一次抗体のみが固定されている場合と、ＰＳＡが固定されている場合とでは、光強度が最も高くなる周波数が異なるので、検体溶液中に存在するＰＳＡの存在を検出することが可能である。ただし、白色光３１０４は、Ａｕ素子３１０１が形成されている４０μｍ×４０μｍの領域よりも小さな領域内にのみ照射されることが、感度の点から好ましい。つまり、レンズ３１０９によって検出領域内に白色光３１０４を収束させ、その後、レンズ３１１０を通して白色光３１０４を分光器３１１１へ導く。
【００４７】
以上のように、標識物体を使用することなく、例えばＬＳＰＲによってＰＳＡを検出することが可能である。本実施例は、ＰＳＡの検出に関するものであるが、検出可能な標的物体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。さらに、本発明は、生体分子の検出に限らず、何らかの方法で検出でき、定常波を印加することによって集められる物質であれば、どのようなものでも実施可能である。
【００４８】
なお、本発明は、特にバイオセンサとして利用されて好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１のセンサの構成を説明するための模式図である。
【図２】引用文献１における検出原理を説明するための概念図である。
【図３】抗原−抗体反応を用いた磁性粒子の固定化を説明するための概念図である。
【図４】実施例１のＴＭＲ素子を用いたセンサの検出回路を示す図である。
【図５】実施例１のＴＭＲ素子を用いたセンサの検出原理を説明するための概念図である。
【図６】実施例２のホール素子を用いたセンサの検出回路を示す図である。
【図７】実施例３のセンサの構成を説明するための模式図である。
【図８】両端が固定端の位置における定在波の状態を説明するための概念図である。
【図９】一端が固定端で他端が自由端の位置における定在波の状態を説明するための概念図である。
【符号の説明】
【００５０】
１１００ 流路
１１０１ ＴＭＲ素子
１１０２ ピエゾ素子
１１０３ 振動板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
定在波を発生する発生手段と、該定在波の節の位置に配置され検出対象物質を捕捉するための捕捉部と、該捕捉部に捕捉した検出対象物質を検出するための検出手段とを有するセンサ。
【請求項２】
前記捕捉部は、前記検出対象物質を捕捉することによって光学的変化が生じる請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記捕捉部に捕捉された前記検出対象物質に、標識粒子を特異的に固定することによって、前記検出対象物質を間接的に検出する請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記標識粒子は光を発する物質である請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
前記標識粒子は磁界を発する物質である請求項３に記載のセンサ。
【請求項６】
前記捕捉部には前記検出手段が配置され、
前記検出手段は、前記検出対象物質を検出するためのセンサ素子を有する請求項１、３、５のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項７】
前記検出手段は、前記検出対象物に光を照射する光源と、前記検出対象物からの光を受光する受光素子とを有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項８】
前記検出手段はホール素子である請求項１、３、５、６のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項９】
前記検出手段は磁気抵抗効果素子である請求項１、３、５、６のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記磁気抵抗効果素子はスピントンネル効果膜である請求項９に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記検出対象物質は生体分子である請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のセンサを用いた検出方法であって、
検体に定常波を与えながら検出対象物質を所定の領域に集める第１ステップと、捕捉部に検出対象物質を捕捉させる第２ステップと、前記検出対象物質の検出を行う第３ステップとを有する検出方法。
【請求項１３】
前記第２ステップでは、定在波の付与を停止した状態で、前記捕捉部に前記検出対象物質を固定する請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記第２ステップでは、定在波を時間的に変調させる請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１】
定在波を発生する発生手段と、該定在波の節の位置に配置され検出対象物質を捕捉するための捕捉部と、該捕捉部に捕捉した検出対象物質を検出するための検出手段とを有するセンサ。
【請求項２】
前記捕捉部は、前記検出対象物質を捕捉することによって光学的変化が生じる請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記捕捉部に捕捉された前記検出対象物質に、標識粒子を特異的に固定することによって、前記検出対象物質を間接的に検出する請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記標識粒子は光を発する物質である請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
前記標識粒子は磁界を発する物質である請求項３に記載のセンサ。
【請求項６】
前記捕捉部には前記検出手段が配置され、
前記検出手段は、前記検出対象物質を検出するためのセンサ素子を有する請求項１、３、５のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項７】
前記検出手段は、前記検出対象物に光を照射する光源と、前記検出対象物からの光を受光する受光素子とを有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項８】
前記検出手段はホール素子である請求項１、３、５、６のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項９】
前記検出手段は磁気抵抗効果素子である請求項１、３、５、６のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記磁気抵抗効果素子はスピントンネル効果膜である請求項９に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記検出対象物質は生体分子である請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のセンサを用いた検出方法であって、
検体に定常波を与えながら検出対象物質を所定の領域に集める第１ステップと、捕捉部に検出対象物質を捕捉させる第２ステップと、前記検出対象物質の検出を行う第３ステップとを有する検出方法。
【請求項１３】
前記第２ステップでは、定在波の付与を停止した状態で、前記捕捉部に前記検出対象物質を固定する請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記第２ステップでは、定在波を時間的に変調させる請求項１２に記載の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
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【公開番号】特開２００９−８４７５（Ｐ２００９−８４７５Ａ）
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６８８９４（Ｐ２００７−１６８８９４）
【出願日】平成１９年６月２７日（２００７．６．２７）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２７日（２００７．６．２７）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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