タイト結合を開放するための方法
本発明は、血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の一時的、可逆的かつ制御された開放のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の方法及び使用をに関する。この方法は、血液脳関門及び／又は血液網膜関門の開放を必要とする多くの疾病及び疾患の治療に用いることができる。このような方法は一般に、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生産することになるＲＮＡｉ誘導ベクターのような、タイト結合タンパク質を標的として血液脳関門及び／又は血液網膜関門を開放するＲＮＡｉ誘導剤の使用を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の一時的、可逆的かつ制御された開放のための、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生産することになるＲＮＡｉ誘導ベクターのような、タイト結合タンパク質を標的として血液脳関門及び／又は血液網膜関門を開放するＲＮＡｉ誘導剤を用いた方法及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、栄養及び酸素を必要とすると同時にこの敏感な組織への循環により送達され得る他の潜在的に有害な因子、例えばウイルスもしくは細菌粒子、またはアナフィラトキシン（免疫システムの副産物として生成される潜在的に破壊的な粒子）からの保護を必要とするエネルギー要求器官である。このため、脳に血液を供給する微細な毛細血管（血液脳関門（ＢＢＢ））の壁を覆うそれらの細胞は、その名前が意味するように、脳の微小血管系の微細な毛細血管を覆う隣接する内皮細胞間の空間を殆どゼロに小さくし、緊密なシールを形成する「タイト結合」を発生させている。しかしながら、酸素は依然としてこれらの細胞から拡散することができ、かつ他の必須物質は、内皮細胞の膜内にある特殊なトランスポーターにより脳に送達され得る。
【０００３】
血液脳関門を破壊したり、薬理的物質が脳毛細血管の内皮細胞を横切ることができるデリバリーシステムを設計するために、多くの試みがなされている（Pardridge et al., 2005）。しかしながら、血液脳関門の完全な破壊は、脳の機能にとって悲惨な結果をもたらすことになる。従来の試みは、タイト結合（ＴＪ）の構造を包括的に理解することなく、ＴＪタンパク質をエンコードする転写物を除去し得る技術無しで、そのような物質の脳または網膜毛細血管の内皮細胞への全身送達の手段無しで行われてきた（Miller, 2002）。
【０００４】
最近では、「ミクロのトロイの木馬」と呼ばれる遺伝子組み換えタンパク質が文献に記載されており、その称するところでは、内在の受容体介在による輸送プロセスを経てＢＢＢを横切るとされている（Pardridge et al., 2006）。２００７年には、修正されているがやはり類似の方法を使用し、レンチウイルスベクター系を用い、アポリポタンパク質Ｂのその受容体「低比重リポタンパク質受容体」（ＬＤＬＲ）への結合ドメインを活用したタンパク質のＢＢＢを横切る標的送達が報告されている。この報告は、経細胞通路を介したタンパク質の送達が実行可能であることを証明しているが、これらの方法は依然として、ＣＮＳへの送達による組み換えられた結合部位からのペプチド分解を目的としている（Spencer BJ and Verma M, 2007）。ＢＢＢを横切る分子の受容体介在の経細胞送達は、更なる研究にとって相変わらず面白い方法であるが、細胞間通路を含む利用可能な他の方法が存在する。
【０００５】
一般に、ＢＢＢの内皮細胞を横切る成分の輸送は、３つの経路を介して起こり得る。即ち、上述したように特別なトランスポーターが介在し得る経細胞経路、小胞輸送、又は隣接する内皮細胞間の輸送を可能にする細胞間通路である（Reese and Karnovsky, 1967; Edwards, 2001; Wolburg and Lippoldt, 2002）。脳の毛細血管は非常に低流量の液相トランスサイトーシスを呈し、ＢＢＢにおける個々の細胞間の細胞間経路が、体内の他のあらゆる微小血管におけるよりも相当緊密なＴＪにより閉じられている。従って、ＴＪは、ＢＢＢに関連する低透過率特性の重要な要素を代表するものである（Matter K and Balda MS, 2003）。
【０００６】
ＢＢＢに関連するＴＪは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、接合部接着分子、（ＪＡＭ）、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５、−１２及びＺＯ−１、−２、−３を含む細胞内及び膜貫通タンパク質の複合体から構成される（Fanning et al., 1998; Zahraoui et al., 2000）。
【０００７】
ｃｌａｕｄｉｎは、ＢＢＢ機能において重要な役割を果たす。ｃｌａｕｄｉｎファミリーの約２０のメンバーについても文献に記載されており、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５、−１２がＢＢＢのＴＪにおいて優勢である（Bazzoni, 2006）。ｃｌａｕｄｉｎは、ｏｃｃｌｕｄｉｎのように、内皮細胞膜を４度架橋して、それらのＣ末端を介してＺＯ−１と相互作用する（Kausalya et al., 2001）。繊維芽細胞におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ及びｃｌａｕｄｉｎ−１の同時発現は、ＴＪ上の鎖において細胞の周辺部に両タンパク質の共存を生じることを示している（Furuse et al., 1998）。メイデンダービー犬腎臓（ＭＤＣＫ）細胞におけるｃｌａｕｄｉｎ−１の過剰発現は、経細胞電気抵抗（ＴＥＲ）を増加させ、単層における蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストランの流れを減少させることが示されている（Inai et al., 1999）。
【０００８】
国際公開ＷＯ０２／０１４４９９（Immunex）は、ｃｌａｕｄｉｎファミリーの新たなメンバー、ｃｌａｕｄｉｎ−１９、−２１、−２２に関する。この用法は、これらｃｌａｕｄｉｎの細胞外結合ドメインを標的とするポリペプチドフラグメントの生成に関するものであるが、組み換えタンパク質の生産についても記述している。
【０００９】
ｃｌａｕｄｉｎ−５は、マウスにおいてノックアウトしたときに、８００Ｄａ未満の分子に対してＢＢＢをサイズ選択的に緩める４回膜貫通タンパク質である。ｃｌａｕｄｉｎ−５は、内皮細胞特異的であると考えられる（Turksen K and Troy TC, 2004）。ｃｌａｕｄｉｎ５−／−マウスが報告されており、ＢＢＢはこれらの動物において弱められる。一連のトレーサー分子実験及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を通じて、ｃｌａｕｄｉｎ−５の除去が、約８００Ｄａまでの分子に対してバリアーを透過可能にすることにより、バリアーの機能を弱めつつ、それより大きな分子に対してそのまま不透過であり、出血又は浮腫の形跡を全く示さないバリアーを形成できることが分かった（Nitta et al., 2003）。しかしながら、これらのノックアウトマウスは死亡率が非常に高く、数時間しか生存しなかった。そのようなことで、これらのノックアウトマウスはＢＢＢの生理学を研究するのに用いることはできず、別のモデルが必要である。
【００１０】
タイト結合を開いて、粘膜細胞間輸送を増進させる別のシステムが開発されている。例えば、国際公開ＷＯ０４／００３１４５(Nastech)及び国際公開ＷＯ０５／０５８３６２(Nastech)はいずれも、有効成分の必要な生物学的利用能を維持しつつ、注射に対する別の投与経路を提供する必要性を扱っている。国際公開ＷＯ０４／００３１４５(Nastech)は、生物学的活性剤、粘膜細胞間輸送を可逆的に増進し得るｃｌａｕｄｉｎ−５を標的とする透過増進剤の粘膜送達に関する。これらの透過増進剤は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の細胞外結合ドメインに対して作られたペプチドであり、これはこのタンパク質の隣接する細胞の類似のタンパク質との同型相互作用を仲介する。国際公開ＷＯ０５／０５８３６２(Nastech)は、鼻内のタイト結合を開くための方法に関し、これも同様にＪＡＭ１、ｃｌａｕｄｉｎ−４及びｏｃｃｌｕｄｉｎに対する広範な拮抗体の粘膜投与から構成される。
【００１１】
しかしながら、これらの進歩にも拘わらず、多くの薬剤は、ＢＢＢを横切ることができないので、依然として効果がない。そこで、ＢＢＢを横切る薬剤送達を増進するように操作し得る分子メカニズムを確認するために、脳毛細血管の内皮細胞及び網膜細胞のＴＪを理解することを目的とする多くの努力が行われている。
【００１２】
ＢＢＢを制御して開くことは、実現できれば、以前は不可能であった脳への薬剤の実験的送達の方法を提供し、かつ血液脳関門及び／又は血液網膜関門に関連する多くの状態の治療への扉を開くことができる。
【００１３】
更に、ＢＢＢを制御して開くことは、神経変性疾患及び精神神経疾患の実験動物モデルの確立を可能にし、かつ現在は有効な治療の見込みが殆ど又は全くない範囲の状態で治療剤を、例えば神経変性状態の範囲でＣＮＳへの神経機能を調節する薬剤を制御して送達するための道を作ることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、これらの問題の少なくとも一部を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の側面によれば、血液脳関門を一時的、可逆的かつサイズ選択的に開放するための方法であって、血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の一時的、可逆的かつ制御された開放のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用からなる方法が提供される。
【００１６】
相補的な二重鎖ＲＮＡのサイレンシング効果は、最初にRichard Joergensenにより１９９０年にペチュニアで観察され、共抑制と呼ばれた。ＲＮＡサイレンシングは次に、Andrew Fire及びその同僚によってＣエレガンス（線虫）で確認され、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の用語が生み出された。この遺伝子サイレンシング現象はその後に、多くの真核細胞内に高度に保存されることが分かった。このように、ＲＮＡｉは、哺乳類細胞及び動物双方において有効であることが示されている。
【００１７】
ｓｉＲＮＡの作用を受けたＲＮＡｉの重要な特徴は、ＲＮＡの二重鎖という特徴と、小さなオーバーハング及びＲＮＡの介在ループを有するｄｓＲＮＡが標的遺伝子の抑制をもたらすことが示されているにも拘わらず、一本鎖ＲＮＡの大きな突出（オーバーハング）部分が存在しないことである。本明細書では、本明細書中の用語ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉは互いに交換可能であるものと理解される。更に、当該技術分野で周知のように、ＲＮＡｉ技術はｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ誘導剤により実行することができる。本明細書では、一般にｓｉＲＮＡについて言及しているが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はその細胞内での存在が標的転写物を標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターを含むあらゆる他のＲＮＡ誘導剤を用い得ることが理解される。
【００１８】
ＲＮＡ干渉は多段階プロセスであり、一般に標的遺伝子に対して配列が相同な二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により活性化される。長いｄｓＲＮＡを器官の細胞内に導入することは、相同遺伝子転写物の配列特異的分解に繋がる。長いｄｓＲＮＡ分子は、Dicerとして知られる内在のリボヌクレアーゼの作用により小さな（例えば、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ））干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に変形される。ｓｉＲＮＡ分子は、ヘリカーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を有する、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体と結合する。ヘリカーゼ活性は、ＲＮＡ分子の二重鎖を巻き戻し、アンチセンス鎖が標的ＲＮＡ分子と結合することを可能にする。エンドヌクレアーゼ活性は、アンチセンス鎖が結合した部位で標的ＲＮＡを活性分解する。従って、ＲＮＡｉは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡ分子と結合して、標的ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼをリクルートするので、アンチセンス作用メカニズムである。
【００１９】
本発明では、「ＲＮＡｉ誘導剤」又は「ＲＮＡｉ分子」を使用するが、これには例えば、標的転写物を標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又はその細胞内での存在が標的転写物を標的とするｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡを生産することになるＲＮＡｉ誘導ベクターが含まれる。このようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、標的転写物の領域と相補的なＲＮＡの部分を有する。基本的に、「ＲＮＡｉ誘導剤」又は「ＲＮＡｉ分子」は、ＲＮＡ干渉を介して標的タイト結合タンパク質の発現を下方制御する。好ましくは、タイト結合タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用する。
【００２０】
特に、前記方法は、タイト結合タンパク質を標的とする有効量のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの対象への送達を含む。ｓｉＲＮＡのような有効量のＲＮＡｉ誘導剤を用いてＢＢＢを開き、目的の疾患を治療する活性剤の通過を可能にすることが理解される。好ましくは、送達が全身経路を介して行われる。
【００２１】
この本発明の側面によれば、前記方法は、脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞において血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一次的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、理想的には１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞を通して脳血管関門を横切る透過を可能にする。この範囲で血液バリアーを開くことは、一般に１０〜１５ｋＤＡ、好ましくは１３ｋＤａの最大分子量を有するｓｉＲＮＡ及び／又は一般に約２ｋＤＡ未満、好ましくは１ｋＤａ以下の分子量を有する低分子量の薬剤が血液脳関門を横切ることを可能にする。当然ながら、１５ｋＤａより大きい分子の分子が血液脳関門を横切ることができるように血液脳関門を開放し得ることが理解される。
【００２２】
理想的には、前記方法は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのようなＲＮＡｉ誘導剤の対象への全身ハイドロダイナミックデリバリーを含む。とは言え、非ハイドロダイナミック全身デリバリー法を用いることができる。
【００２３】
ＲＮＡｉ誘導剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどを含む）の送達に適した他の送達方法も使用することができる。例えば、ＲＮＡｉ誘導剤の幾つかの送達剤は、次のカチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、脂質、リポゾーム及び／又は非カチオン性ポリマーからなる非限定的な群から選択される。ウイルスベクター送達システムも使用することができる。例えば、別の送達経路には、ＲＮＡｉ誘導剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む）、及び組み換えＤＮＡ分子を生じることになる細胞の変換前の遺伝子構築物のアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）の直接送達が含まれる。これは、遺伝子構築物の転写を生じ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡだけでなく、ａｓＲＮＡのようなＲＮＡｉ誘導剤をエンコードし、細胞及び器官内にＲＮＡｉ誘導剤の一時的かつ安定な発現を提供する。例えば、このような別の送達経路は、タイト結合タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡ（又はｓｈＲＮＡ）をエンコードするヌクレオチド配列からなるレンチウイルスベクターの使用を含むことができる。このようなレンチウイルスベクターは、ウイルス粒子内に含まれ得るものである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も使用することができ、これらの送達ビヒクルとしての使用は詳細に後述する。
【００２４】
本発明の第二の側面によれば、本発明によるＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの送達が、細胞間通路の作用、ＢＢＢの生理学を研究し、かつ以前はＢＢＢを横切ることはできなかったがＢＢＢを横切る薬剤の作用を試験するための実験的モデルの生成において有用である。
【００２５】
本発明の第三の側面によれば、本発明は、血液脳関門又は血液網膜関門が関係する多くの疾患又は疾病の治療に適応可能である。
【００２６】
本発明の第四の側面によれば、タイト結合タンパク質を標的として、血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放を生じる、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどであるＲＮＡｉ誘導剤と、明確な疾病又は疾患の治療のための活性剤とからなる、好ましくは全身送達に適した医薬組成物が提供される。理想的には、前記活性剤は生物学的に活性な治療薬である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質及びｍＲＮＡのレベルの定量化の結果を示す。
【図２】図２は、脳の微小血管におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の発現及び局所化の免疫組織化学分析の結果を示す。
【図３】図３は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制後のｃｌａｕｄｉｎ−１、Ｔｉｅ−２及びｏｃｃｌｕｄｉｎの発現の結果を示す。
【図４】図４は、脳の凍結切片におけるｃｌａｕｄｉｎ−１及びｃｌａｕｄｉｎ−５の２重免疫染色の結果を示す。
【図５】図５は、４４３ダルトンの分子に対するＢＢＢ完全性の評価の結果を示す。
【図６】図６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間におけるHoechst３３３４２及びＦＤ−４の同時灌流を示す。
【図７】図７Ａは血液脳関門の完全性を生体内で評価する注射後のＭＲＩスキャンの結果を、図７Ｂはｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの全身投与後のマウス脳におけるＭＲＩ画像の濃度分析の結果を、図７Ｃは定量的なＭＲＩ画像の結果を示す。
【図８】図８は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質のアブレーション後のマウスへの２０ｍｇ／ｋｇのＴＲＷの投与の結果を示す。
【図９】図９は、肝臓結切片における内皮細胞の形態学を示す。
【図１０】図１０は、肺の凍結切片における上皮細胞形態学を示す。
【図１１】図１１は腎臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示す。
【図１２】図１２は、心臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示す。
【図１３】図１３は、脳凍結切片におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ発現の免疫組織化学分析を示す。
【図１４】図１４は、ｓｉＲＮＡ注射後の網膜におけるｃｌａｕｄｉｎ−５抑制の結果を示す。
【図１５】図１５は、網膜のフラットマウントにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の結果を示す。
【図１６】図１６は、ｉＢＲＢを横切るＧｄ−ＤＴＰＡ拡散のＭＲＩ分析の結果を示す。
【図１７】図１７は、Hoechst３３３５２（５６２Ｄａ）でのマウスの灌流後の網膜フラットマウントの結果を示す。
【図１８】図１８は、ＩＭＰＤＨ−／−マウスにおけるＧＴＰ注射後のＥＲＧ結果を示す。
【図１９】図１９は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈送達後のｏｃｃｌｕｄｉｎ発現のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図２０】図２０は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後のｏｃｃｌｕｄｉｎ免疫組織化学の結果を示す。
【図２１】図２１は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後のアルブミン免疫組織化学の結果を示す。
【図２２】図２２は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後の脳ビブラトーム切片における免疫グロブリン染色の結果を示す。
【図２３】図２３は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後のｃｌａｕｄｉｎ−１発現のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図２４】図２４は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４時間及び４８時間におけるHoechst（５６２Ｄａ）及びＦＤ−４（４４００Ｄａ）の灌流の結果を示す。
【図２５】図２５はハツカネズミｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡにおいて実験で使用した１種のｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの位置を示す。
【図２６】図２６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのデリバリー後４８時間におけるマウス脳の海馬領域のＴ１強調ＭＲＩ画像を示す。
【図２７】図２７は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの大容量尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内における血流量及び血液量に関係するＭＲＩ情報を示す。
【図２８】図２８は、試験した各実験群について実験データに適合させた脳血流量及び脳血液量の理論的モデルを示す。
【図２９】図２９は、Ｂ値（Ｘ軸）とその上にプロットしたＭＲＩ信号強度（Ｙ軸）を示す。
【図３０】図３０は、ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示す。
【図３１】図３１は、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書において、用語「血液脳関門」又はＢＢＢは、血液脳関門（ＢＢＢ）及び血液網膜関門（ＢＲＢ）の両方を含むものとして使用されている。詳細に上述したように、血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳の微小血管系の微細な毛細血管を覆う隣接する内皮細胞間の隙間を殆どゼロに小さくして、ＢＢＢを横切る栄養素及び酸素の輸送を可能にするが、それと同時に、他の潜在的に有害な物質のＢＢＢを横切る輸送を防止するタイト結合（ＴＪ）を有する。血液網膜関門（ＢＲＢ）は、所定の物質が網膜の組織に入ることを防止するために、緊密に一対に結合される細胞からなる血液眼関門の一部である。血液網膜関門は２つの構成部分、網膜血管内皮及び網膜色素上皮を有し、これらもまたタイト結合（ＴＪ）を有する。脳血管に類似する網膜血管は、内側血液眼関門を維持する。
【００２９】
更に、本明細書に開示される発明は、一般にＲＮＡｉ技術の使用に関する。理想的には、ＲＮＡｉ誘導剤は、標的転写物を標的としたｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又はその細胞内での存在が標的転写物を標的としたｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターを含んで使用される。このようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、標的転写物の領域に相補的な部分を有する。このように、ＲＮＡｉは、特にｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ双方を用いて実施することができる。
【００３０】
本発明のＲＮＡｉ誘導剤は、ｍＲＮＡの翻訳を干渉又は妨害する。このようなＲＮＡｉ誘導剤は、一本鎖又は二重鎖構造とすることができる。好ましくは、二重鎖構造のＲＮＡｉ誘導剤の１本の鎖が、少なくとも標的ｍＲＮＡに相補的な部分配列を有する。阻害性核酸のヌクレオチドは、化学的に修飾されたもの、天然又は人工のものとすることができる。ＲＮＡｉ誘導剤と標的とされたタイト結合標的ｍＲＮＡ間の配列相同性は１００％以下であってよいが、理想的には約５０％以上、一般には９０％以上、より好ましくは少なくとも９８％及び９９％である。ＲＮＡｉ誘導剤と標的ｍＲＮＡ間の配列相同性の割合は、好ましくは細胞質条件下で、ＲＮＡｉ誘導剤、例えば、ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡ間に配列特異的な会合を生じるのに十分なものとすべきであることが理解される。
【００３１】
このようなｓｉＲＮＡは、長さが約２０程度のヌクレオチドの相補性の領域を有する２つのＲＮＡ鎖を有し、更に任意に、１つ又は２つの一本鎖構造のオーバーハング又はループを有する。哺乳動物の細胞では、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡが、インターフェロン応答による非特異的な遺伝子抑制を生じる場合がある。しかしながら、両方の３’末端で突出する２つのヌクレオチドを有する２１ヌクレオチド合成二重鎖ｓｉＲＮＡを導入した細胞は、インターフェロン応答を回避して、配列特異的な遺伝子サイレンシング機能を有効に発揮することが分かっている。しかしながら、合成ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果は一時的なものである。二重鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを介して血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の発現を下方修正するが、その場合に前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独立して長さが約１８〜約２８ヌクレオチドであり、かつｓｉＲＮＡ分子の１本の鎖が、標的タイト結合タンパク質のＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して標的ＲＮＡの開裂を行うのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
ｓｈＲＮＡでは、単一のＲＮＡ鎖が、ステム及びループを有するヘアピン構造を形成し、任意にＲＮＡの５’及び／又は３’部分に１つ又は複数の非対合部分を形成することができる。
【００３３】
別の転写後遺伝子サイレンシングプロセスは、ミクロＲＮＡ即ちｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ翻訳を抑制するｓｓＲＮＡ種によって仲介される。ｓｉＲＮＡのように、ｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼDicerにより２１〜２５ヌクレオチド配列に処理されて配列特異的な
遺伝子サイレンシング複合体を形成するＲＮＡプリカーサーに由来する。
【００３４】
このように、本発明はＲＮＡｉ技術を対象とするものであり、理想的には、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡにより実施することができる。容易に参照できるように、以下の記載ではｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについて言及している。しかしながら、以下の方法にはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ又は他のあらゆるＲＮＡｉ誘導剤を使用できることが理解される。
【００３５】
本発明の第一の側面によれば、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの対象への送達、好ましくは全身送達により、血液脳関門の細胞間通路を可逆的、一時的及び制御されたサイズ選択的に開放するための方法において、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉの使用が提供される。
【００３６】
タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達が、血液脳関門の細胞間通路の制御された、可逆的かつ一時的開放を生じ、理想的には１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を横切る透過を可能にすると、好都合である。理想的には、約１ｋＤａ未満のような低分子量の薬剤の送達が容易になる。
【００３７】
この本発明の側面の特定の実施例によれば、血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的な開放のための方法であって、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達からなり、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合調節ペプチド転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を介して脳血液関門を横切る透過を可能にする方法におけるｓｉＲＮＡの使用が提供される。
【００３８】
タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ誘導剤の使用は、ＢＢＢの可逆的、一時的かつサイズ選択的な開放を達成した最初のものである。このＢＢＢの開放は、以下のものを含む多くの様々な用途を有するが、これらに限定されるものではない。
−条件付きＴＪ調節ペプチドノックアウトマウスの育生により細胞間システムを研究する実験モデルとしての使用。
−広範な医薬生成物の効能を試験する一般的な実験プラットフォームとして条件付きＴＪ調節ペプチドノックアウトマウスを使用すること。
−以前はＢＢＢを透過し得なかった活性剤に対するＢＢＢの透過率を向上させる使用。
−多くの様々なＴＪタンパク質を標的として、ＢＢＢを横断し得る分子サイズの柔軟性を提供すること。
−細胞間通路及び血液脳関門又は血液網膜関門が関連する多くの疾病又は疾患の治療における使用。
【００３９】
以下の記載はｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉ技術に関するものであるが、上述したように、これらの記載はｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ誘導剤を用いたＲＮＡｉ技術に同等に適用可能である。
【００４０】
本願発明者らは、ＢＢＢの細胞間通路の開放が、ｓｉＲＮＡ送達後約２４乃至４８時間で発生することを見出した。タイト結合タンパク質の発現のレベルは、ｓｉＲＮＡ送達後約７２時間で正常に戻り、従ってＢＢＢは、この時間経過後はもはや開放状態ではない。このように、ＲＮＡｉを用いたＢＢＢの開放は一時的かつ可逆的なものである。これが本発明の主な利点であり、ＢＢＢの完全性がｓｉＲＮＡ送達後に完全に復元される。このＢＢＢの完全性を一時的に弱めて小さい分子の脳内への通過を可能にするという特徴が、潜在的に有害で制御されない永久的な手法でＢＢＢを開放する公知の技術に対する本発明の主な利点を提供するものである。
【００４１】
更に、ＢＢＢの開放はサイズ選択的でありかつ制御され、理想的には１５ｋＤａ未満の分子のＢＢＢを横切る透過を可能にする。理想的には、１ｋＤａ未満、好ましくは８００Ｄａ未満の分子が、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を通過してＢＢＢの向こう側へ透過することができる。ＢＢＢのサイズ選択的な開放が、標的とした様々なＴＪタンパク質によって異なるものであり得ることは理解される。例えば、ｏｃｃｌｕｄｉｎが約６０ｋＤａ乃至８０ｋＤａまでの分子の透過を可能にするのに対し、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５、−１２は、約２ｋＤａ以下の分子の透過を可能にする。
【００４２】
理想的には、ＲＮＡｉを効果的にするには、多量のｓｉＲＮＡを対象に投与して、脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞における血液脳関門／血液網膜関門のタイト結合タンパク質転写物を除去／抑制する。好ましくは、送達されるｓｉＲＮＡの量は、対象の体重１μｇ当たりｓｉＲＮＡ約１μｇである。しかしながら、異なる量のｓｉＲＮＡが考えられることは理解される。例えば、マウスを含むげっ歯動物のような小さい哺乳動物については、この量は約５μｇから５０μｇまで少なくすることができる。理想的には、約２０μｇの量が使用される。一般に約７０ｋｇの体重を有する人間のような大型哺乳動物については、注入するべきｓｉＲＮＡの適当な量は、０．０７〜０．１５ｇの範囲であろう。繰り返すが、様々な量のｓｉＲＮＡが考えられる。
【００４３】
好ましくは、送達が、静脈内送達及び頸動脈内送達のような動脈内送達を含む全身送達により行われる。投与は、直接投与又はカテーテルを介して行うことができる。理想的には、ｓｉＲＮＡは全身ハイドロダイナミックデリバリーによって対象に投与される。
【００４４】
ハイドロダイナミックデリバリーは、広範囲の核酸を生体内で組織又は他の器官に送達するのに使用し得る効率的かつ安価な方法である。ハイドロダイナミックデリバリーを首尾良く適用することは、対象の血管構造内にオリゴヌクレオチドを含む大きな水相量を高速で注入することに依存する。
【００４５】
基本的に、本発明による全身ハイドロダイナミックデリバリーは、ｓｉＲＮＡの血管内投与を含む。マウスのようなげっ歯動物では、尾静脈送達を考えることができる。人間又は他の哺乳動物では、頸静脈を介して頸動脈又は心臓に対して直接行う頸動脈内投与が考えられる。人間におけるハイドロダイナミックデリバリーは、大腿静脈におけるラインの挿入後の肝臓門脈を介した投与により行うことも考えられる。特に、人間の脳毛細血管へのｓｉＲＮＡの送達は、潜在的に頸動脈内投与を介して仲介することができる。別の方法では、例えば３００〜４００ｍｌまでの量の高濃度のｓｉＲＮＡを人間の心臓に直接注入することにより、脳毛細血管への送達が増進されることが考えれる。非常に狭いカテーテルを対象の大腿動脈内に挿入し、かつそれを脳底部の一方の頸部動脈内に進ませることにより、投与を行うことができた。この場合、ｓｉＲＮＡはカテーテルを通して投与することができる。
【００４６】
全身ハイドロダイナミックデリバリーによるオリゴヌクレオチド（即ち、ｓｉＲＮＡ）の送達の効率は、組織の血管の容積及び圧力を、従って透過率を増加させることにより向上する。透過率は、次の
−血管内静水圧（物理的）又は浸透圧を増加させること、
−注射流体を高速で送達すること（注射流体を高速で注射すること）、
−大容量の注射を用いること、かつ／又は
−ＴＪタンパク質転写物の抑制後にタイト結合の透過率を増加させること
によって増加させることができる。
【００４７】
好都合なことに、本願発明者らは、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達のためにハイドロダイナミックデリバリーを用いて、脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ得ることを見出した。上述したように、これはＢＢＢを開いて、１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞への透過を可能にする。ＢＢＢの送達は、以前は達成されなかった。
【００４８】
理想的には、全身ハイドロダイナミック投与に関し、ｓｉＲＮＡは溶液にして、好ましくはリン酸緩衝食塩水溶液又は水で送達される。
【００４９】
理想的には、前記溶液は対象の体重の５〜１０％の間の容積を有する。本願発明者らは、この多量のｓｉＲＮＡを選択されたタイト結合タンパク質に対して送達することが、非標的化ｓｉＲＮＡと比較したとき、脳の微小血管系の透過率を増加させる。
【００５０】
理想的には、対象が大型哺乳動物の場合、対象の体重によって、数リットルの範囲内にすることができる。このような大容量は、他の利用可能な治療方法がなく、かつ更に治療介入しなければ対象が死ぬような外傷性脳損傷又は重傷の脳卒中の治療のような場合に望ましいと考えられる。対象がマウスのような小型哺乳動物の場合には、理想的には全量が１〜３ｍｌである。送達されるべき正確な量は、対象の体重に依存することになる。
【００５１】
特定の用量が特定の時間内に、例えば哺乳動物の体重の１グラム当たり毎秒０．０５ｍｌ未満の速度で送達されると好都合である。明確な容量を短時間で導入することが、この投与経路を補助する。
【００５２】
この本発明の側面のある実施例によれば、マウスの全身ハイドロダイナミックデリバリーは、約１ｍｌ／秒の流量でマウスの尾静脈内に約１〜３ｍｌの液体でｓｉＲＮＡを注入することを含む。
【００５３】
別の実施例では、ｓｉＲＮＡを、高濃度のｓｉＲＮＡの低容量溶液での使用を含む非ハイドロダイナミック方法を用いて投与することができる。同様の濃度のｓｉＲＮＡを全身ハイドロダイナミック方法に用いることができる。一般に、人間のような大型哺乳動物について全量で７０〜２００ｍｌが考えられる。このように、非ハイドロダイナミックデリバリーについて使用される体重に基づいた容積率は、ハイドロダイナミック方法の容積よりも非常に低い。
【００５４】
別の方法には、哺乳動物のｐｏｌ IIまたはｐｏｌ IIIプロモーター、及びＴ７ポリメラーゼを含む転写システムを用いて開発されたプラスミドＤＮＡ発現ｓｉＲＮＡが含まれる。ｓｉＲＮＡコード化プラスミドによる遺伝子サイレンシングの有効性は、ＤＮＡ導入効率に依存し、かつまた一時的なｓｉＲＮＡ発現を生じる。このような別の方法については、本明細書中に後述する。
【００５５】
本発明によるｓｉＲＮＡの送達は、ＢＢＢの一時的、可逆的かつサイズ選択的開放を生じる。この開放は、選択した特定のｓｉＲＮＡ及び送達条件によって制御することができる。例えば、特定のＴＪタンパク質ｓｉＲＮＡを選択することによって、ＢＢＢの脳内皮細胞又は網膜細胞に対する様々なサイズの分子の透過を可能にすることができる。
【００５６】
更に、本発明は、さもなければ除かれるであろう脳又は網膜のあらゆる領域への小分子の送達のための非侵襲的技術を意味している。従前、これは不可能であり、薬剤のＢＢＢへの送達に関する公知の方法は侵襲的なものであり、かつ多くの危険を伴っている。例えば、濃縮糖液によってＢＢＢ細胞を一時的に収縮させることは、脳腫瘍の治療においてＢＢＢを崩壊させるのに使用されている。これは一時的に化学療法剤が脳内に通過して腫瘍に到達することを可能にする。しかしながら、このような治療は重大なリスクを伴い、かつ所定の環境においてのみ使用することができる。しかしながら、ＢＢＢはサイズ選択的でないやり方で崩壊され、この方法は問題の薬剤を送達しようとする小さな時間枠だけを考慮している(http://www.ohsu.edu/bbb/bbbdtherapy.html）。このように、制御することができ、かつ血液脳関門を開くためにそのような深刻な副作用がない、別のＢＢＢを開くための治療を提供することが非常に望ましい。
【００５７】
更に、公知のＴＪ関連タンパク質ノックアウトマウスは、ＢＢＢ機能が弱められかつ有害であるという意味で多くの欠点を有し、これらノックアウトマウスに関連する死亡率は高い。本発明は、一時的なノックアウトを提供することによってこれらの問題を解消し、それにより公知のＴＪタンパク質ノックアウトマウスに関連する死亡率を解消する。
【００５８】
本発明のＲＮＡｉの技術は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ誘導剤であるかによらず、血液脳関門及び／又は血液網膜関門からのＴＪ関連タンパク質を標的とする。例えば、ＢＢＢを開くのに使用されるｓｉＲＮＡはＴＪタンパク質を標的とする。理想的には、タイト結合タンパク質は、脳微小血管系のタイト結合に関連する膜貫通タンパク質から選択される。一般に、標的ｍＲＮＡ、タイト結合タンパク質転写物に対する配列同一性を有するｓｉＲＮＡ配列の領域は、長さが１４〜３０ヌクレオチド、例えば１６〜２４ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２２ヌクレオチド、最も好ましくは長さが１９〜２１ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡによりコード化されたタンパク質の生成をｓｉＲＮＡ薬剤が抑制するのに十分な相補性をタイト結合タンパク質の標的ｍＲＮＡに対して有する。このｓｉＲＮＡは平滑末端構造のものでも、その３’又は５’端末に、好ましくはその両方の端末にオーバーハングを有するものでも良い。オーバーハングは、長さが短いことが好ましく、例えば３０ヌクレオチド未満、好ましくは２０ヌクレオチド未満、より好ましくは１０ヌクレオチド未満、更に好ましくは５ヌクレオチド未満、最も好ましくは３ヌクレオチド未満の長さである。一般に、オーバーハングは、長さが２ヌクレオチドである。
【００５９】
このように、本発明のｓｉＲＮＡは、一般に長さが３０ヌクレオチド未満であり、一本鎖又は二重鎖構造とすることができる。より長いｓｉＲＮＡは、酵素的に又は化学的に切断されて、３０ヌクレオチド未満、一般には上述したように２１〜２３ヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡを生成し得る開裂部位を有するものとすることができる。ｓｉＲＮＡが対応する標的ｍＲＮＡとの配列相同性を共有することが理解される。配列相同性は、１００％以下とすることができ、ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡ間での配列特異的会合を生じるのに十分なものとすべきである。典型的なｓｉＲＮＡは、インターフェロンシグナル伝達経路を活性化しない。本発明の最も好ましい実施例は、標的ｍＲＮＡ、タイト結合タンパク質との１００％配列同一性を有するｓｉＲＮＡからなる。しかしながら、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を標的ｍＲＮＡに分解のために案内するのに十分な相同性を有するような、１００％未満の相同性を有する他の配列（一般にＲＮＡｉ誘導剤に関連して上述したもの）を用いることができる。
【００６０】
標的ｍＲＮＡに関するｓｉＲＮＡの限定的変異もまた考えられる。本発明のｓｉＲＮＡは、理想的にはヌクレオチドオーバーハングを有することが理解される。例えば、ｓｉＲＮＡは２つのヌクレオチドオーバーハング（例えばＵＵ）を有することができ、従ってｓｉＲＮＡは、１９ヌクレオチド二重鎖領域を有するように対にした２１ヌクレオチドセンス鎖と２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有することになる。オーバーハングにおけるヌクレオチドの数は、５’及び３’末端のそれぞれにおいて約１乃至約６の範囲内の相同ヌクレオチドオーバーハングとすることができ、好ましくは５’及び３’末端のそれぞれにおいて約２〜４、より好ましくは約３の相同ヌクレオチドオーバーハングである。
【００６１】
更に、前記ｓｉＲＮＡは、例えば投与の際により安定であるように、化学的に修飾することができる。ヌクレオチドオーバーハングは、例えばヌクレアーゼ耐性を向上させるように修飾することができる。例えば、３’オーバーハングは、ヌクレアーゼ耐性を改善するために、２’デオキシヌクレオチド、例えばＴＴで構成することができる。
【００６２】
これら膜貫通タンパク質の一種には、接合部接着分子（ＪＡＭ）が含まれる。別の実施例では、タイト結合関連分子が、次のｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ及び／又はｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｉｎ（ＺＯ−１、ＺＯ−２、ＺＯ−３）の１種又は２種以上から選択される。
【００６３】
典型的なｓｉＲＮＡの配列及び関連する標的配列を以下に提供する。本発明のある特定の実施例によれば、タイト結合関連分子は、ｃｌａｕｄｉｎ−１乃至−１９及び／又は−２１の１種又は２種以上から選択される。好ましくは、タイト結合関連分子が、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５及び／又は−１２である。
【００６４】
本発明の好適実施例によれば、タイト結合関連分子は、ｃｌａｕｄｉｎ−５である。理想的には、前記ｓｉＲＮＡはｃｌａｕｄｉｎ−５遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｃｌａｕｄｉｎ−５
ｓｉＲＮＡは、以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００６５】
【化１】
【００６６】
本発明の別の好適実施例によれば、タイト結合関連分子はｃｌａｕｄｉｎ−１である。理想的には、前記ｓｉＲＮＡは、ｃｌａｕｄｉｎ−１遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｃｌａｕｄｉｎ−１
ｓｉＲＮＡは以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００６７】
【化２】
【００６８】
本発明の更に別の好適実施例によれば、タイト結合関連分子はｏｃｃｌｕｄｉｎである。理想的には、前記ｓｉＲＮＡは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｏｃｃｌｕｄｉｎ
ｓｉＲＮＡは以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００６９】
【化３】
【００７０】
本発明の好適実施例によれば、タイト結合関連分子はｃｌａｕｄｉｎ−１２である。理想的には、前記ｓｉＲＮＡは、ｃｌａｕｄｉｎ−１２遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｃｌａｕｄｉｎ−５
ｓｉＲＮＡは以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００７１】
【化４】
【００７２】
ｓｉＲＮＡを設計する技術は同業者によく知られているので、本明細書では詳細な説明を省略する。
【００７３】
本発明において使用するｓｉＲＮＡは、単一のＴＪ調節ペプチドを標的とし得ることが理解される。別の実施例では、異なるＴＪタンパク質を標的とした１種又は２種以上のｓｉＲＮＡを同時に用いることができる。例えば、数種類の異なるタイプのｃｌａｕｄｉｎタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡが考えられる。異なるＴＪタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの組み合わせを用いる場合、重要な側面は、タイト結合全体の完全性が維持されるべきことである。
【００７４】
本発明のこの側面のある実施例によれば、ｓｉＲＮＡの組み合わせには、ｃｌａｕｄｉｎ−１とｃｌａｕｄｉｎ−５、ｃｌａｕｄｉｎ−１２とｃｌａｕｄｉｎ−５、ｃｌａｕｄｉｎ−１２とｃｌａｕｄｉｎ−１を含むことができる。別の実施例では、ｃｌａｕｄｉｎ−１、ｃｌａｕｄｉｎ−５及びｃｌａｕｄｉｎ−１２を一緒に用いることができる。また、ｏｃｃｌｕｄｉｎも１種又は２種以上のｃｌａｕｄｉｎのタイプと組み合わせることができる。これらの組み合わせは、制御されかつサイズ選択的であるという特徴をもってＢＢＢにおける透過率を更に増加させると考えられる。
【００７５】
また、これらのＴＪタンパク質を標的として、ｓｈＲＮＡを選択することもできる。ＴＪタンパク質を標的とするｓｈＲＮＡは、結局前記ｓｉＲＮＡと同じセンス配列及びアンチセンス配列を有することになる。唯一の相違点は、それらが、ヘアピン構造を形成しかつ送達ベクターにそれらがクローン化されることを可能にする次のヌクレオチドＵＡＵＣＡＡＧＡＧからなる短いヘアスピンを有することである。
【００７６】
理想的には、誘導ベクターをｓｈＲＮＡ送達に用いて、さもなければ生じるであろう、問題のＴＪタンパク質を標的としたｓｈＲＮＡの連続的な発現及びその結果であるこれらＴＪ標的タンパク質の連続的な抑制を防止する。例えば、脳又は網膜の特定の領域に高度に局所化されることになるＡＡＶ仲介送達を用いてｓｈＲＮＡを送達することができる。好ましくは、特定の薬剤を投与したときにＴＪタンパク質を標的としたｓｈＲＮＡの誘導発現を可能にする誘導ＡＡＶベクターを使用する。このような誘導ＡＡＶベクターはｃｌａｕｄｉｎ−５のようなタイト結合標的タンパク質の一時的な抑制を可能にする。
【００７７】
本発明の第２の側面によれば、本発明によるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等のようなＲＮＡ誘導剤の送達が、ＢＢＢの細胞間通路及び生理学の作用を研究するために使用される実験動物モデルの生成において使用することができる。このタイプの動物モデルは、ＢＢＢの細胞間通路を可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的な手法で開くので、公知のＢＢＢノックアウトマウスに関連した高い死亡率を解消する。このような、一時的にＢＢＢタイト結合タンパク質を抑制してＢＢＢを開放する条件付きタイト結合タンパク質ノックアウトマウスを用いて、広範囲の薬理生成物（以前はＢＢＢを透過し得なかったような生成物を含む）の効果を試験し、かつ／又は細胞間システムを研究することができる。
【００７８】
そのようにして、この方法は、動物モデルにおいて、以前はＢＢＢを貫通し得なかった様々な活性剤を試験するために、及び脳及び網膜機能に影響を及ぼす疾病及び疾患の新たな治療を生成するために用いることができる。好ましくは、この方法によって、さもなければ血管脳関門を横断し得ない広範囲の薬物の評価のための理想的な実験プラットホームの生成が可能になる。このように、この方法は神経変性疾患及び精神神経疾患などについて、実験動物モデルの確立を考えることができる。
【００７９】
本発明の第３の側面によれば、脳又は網膜の疾病又は疾病の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ脳または網膜の疾病又は疾患の治療を目的として、１５ｋＤａ未満の活性剤の透過及び送達を可能にする、ｓｉＲＮＡ標的タイト結合タンパク質の送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなるような、タイト結合タンパク質を標的とした、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのようなＲＮＡｉ誘導剤の使用が提供される。
【００８０】
タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）は一時的に血液脳関門を開放して、血液脳関門を横切る活性剤の送達を可能にする。理想的には、前記方法は、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与後の前記活性剤の連続投与からなる。これによって、前記活性剤が投与されたときに細胞間通路が開放されることは確保され、前記活性剤は脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞を通過して、脳及び／又は網膜に到達することができる。しかしながら、活性剤の送達を、ＲＮＡｉ誘導剤より以前に又はそれと共に／同時に行うことも考えられる。
【００８１】
本発明のこの側面は、ＢＢＢ又はＢＲＢが関係する多くの疾病又は疾患の治療に適用することができる。これらには神経変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症などのような）、脳卒中及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、感染プロセス及び炎症性疼痛、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、緑内障及び糖尿病性網膜症を含む網膜疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば本発明は、現在は効果的は治療の見込みが殆ど又は全く提供されていない神経変性又は他の状態の範囲において治療薬を中枢神経系（ＣＮＳ）に制御して送達するために使用することができる。
【００８２】
本発明のこの側面によれば、特定の疾病の治療には一般に、ＢＢＢを横切る活性剤の送達と同時の又はそれ以前のＢＢＢの開放が含まれる。前記活性剤は、理想的には、ＢＢＢの開放後に、例えばｓｉＲＮＡ送達後２４時間又は４８時間後に送達される。別の実施例では、上述したように、前記活性剤はＲＮＡｉ誘導剤と同時に又はそれより前に投与することができる。
【００８３】
前記活性剤は、神経機能を調節する薬剤、化学療法薬、抗腫瘍剤、網膜機能を調節する薬剤及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のような従来の薬品から選択することができる。そのように、前記活性剤はあらゆる従来の生理活性治療薬とすることができる。
【００８４】
別の実施例では、前記活性剤が高張溶液、好ましくは高張食塩水又は糖液とすることができる。このような高張溶液は、外傷性脳損傷の治療において使用され、水分が障害後の脳から排除され得るようにすることができ、重要なことに、脳浮腫の発生を防止することができる。マンニトール、糖液を本発明に用いることもできる。マンニトールは従来の「マンニトール浸透圧療法」において使用されるが、マンニトールは、従来のように使用したとき、ＢＢＢを横断できない。マンニトールは、浸透圧利尿剤及び弱い腎臓の血管拡張剤として機能する。
【００８５】
前記活性剤はまた、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはタンパク質、ポリペプチド又はペプチドとし得ることが理解される。
【００８６】
好適実施例によれば、前記活性剤は、治療されている疾病又は疾患を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどを含む更なるＲＮＡｉ誘導剤とし、それによりＢＢＢの開放後に、更なるＲＮＡｉ誘導剤が脳内に送達されて、特定の疾病又は疾患を治療できるようにする。
【００８７】
この本発明の側面は、ここで幾つかの特定の疾病又は状態及び１つのＲＮＡｉ誘導剤ｓｉＲＮＡに関して検討するが、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのような他のＲＮＡｉ誘導剤をも使用することができる。
【００８８】
外傷性脳障害（ＴＢＩ）におけるストレス応答は、ＢＢＢを横切る水分の拡散の停止によって現れ、頭蓋内圧及び脳浮腫の急激な増加を招く。ＴＢＩ後の脳浮腫及び頭蓋内圧の上昇を管理する従来の治療には、食塩水又は糖治療を含む高浸透圧療法及び高張療法が含まれる。例えば、浸透圧利尿剤は一般に、血漿と脳細胞との間に浸透圧勾配を確立し、かつＢＢＢを越えて血管コンパートメント内に水分を引き込むので、ＴＢＩを治療するのに用いられている。別の実施例では、高張食塩水が、細胞内から水分を排除し、組織圧及び細胞のサイズを小さくすることによって、脳浮腫の減少を生じさせる。ＴＢＩの急性処置については、患者にマンニトール及び高張食塩水を与えて、脳内の水分拡散の浸透圧変化の解決を試みる。しかしながら、マンニトール及び高張食塩水は、２４時間まで有効なだけであり、この時間より長く腫張が発生した場合、患者は死亡するか恒久的な脳の障害が残ることになる。このように、マンニトール及び高張食塩水は、深刻な循環血流量の低下、低血圧及び過カリウム血症のような副作用の意味で重大な欠陥を有し、必要とされる正しい投与量を確認することに困難がある。更に、濃縮糖液により一時的にＢＢＢ細胞を収縮をさせることは、上述したように脳腫瘍の治療においてＢＢＢを崩壊させるのに使用されており、非常に有害な副作用を有する場合があり、最後の頼みとしてのみ使用され、全ての患者に適しているものではない。実際、ＢＢＢを開くマンニトールの使用は、ＢＢＢを選択的に制御して開くことにはならず、脳に更なる損傷を生じる場合がある。従って、ＴＢＩ又は脳卒中を取り扱う別の治療方法を提供する必要がある。
【００８９】
本発明のこの側面によれば、外傷性脳損傷又は脳卒中の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞における血液脳血管タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ任意に、高張食塩水又は糖液のような活性剤の投与後に血液脳関門を横切る水分の透過及び自由な拡散、頭蓋内圧の低下及び／又は脳浮腫の減少を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなる、ｓｉＲＮＡの使用が提供される。
【００９０】
この血液脳関門を横切る水分の一時的、可逆的かつ制御された自由な透過及び自由な拡散を可能にする能力は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は重傷の脳卒中のような状態において非常に重要である。これらの状態では、水分の脳から血液への拡散の停止が、頭蓋内圧の増加を生じさせ、脳浮腫及び場合によっては死又は重い廃疾を招くことがある。本発明は、水分の脳から血液への拡散を可能にし、かつ頭蓋内圧及び／又は脳浮腫の作用を低下させる新たな治療法を提供する。従って、予期しないことであるが好都合なことに、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの使用によって、ＢＢＢを越えた水分の拡散が増進される。これによって、ＴＢＩ、特に急性のＴＢＩに関連する脳浮腫における別の介入の手段が提供される。タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤を使用することは、ＢＢＢが開いている７２時間までの時間に制御された可逆的な方法でＴＢＩを有する対象の脳から水分の自由な拡散を可能にする。高張溶液（例えば、マンニトール又は高張食塩水）のような活性剤を任意にｓｉＲＮＡと共に用いて、２４〜４８時間後にＢＢＢが開くまでの初期に水分の拡散を容易にする浸透圧勾配を提供することができる。
【００９１】
このように、タイト結合タンパク質を標的とした前記ｓｉＲＮＡは、それ自体で又は高浸透圧療法及び高張食塩水／糖治療又はマンニトール浸透圧療法のような従来のＴＢＩ又は脳卒中療法と組み合わせて（連続的に又は同時に）使用できることが理解される。
【００９２】
特定の実施例によれば、本発明の方法は、高度に制御された方法で脳から血液への水分の流れを可能にし、マンニトール／高張食塩水又は糖療法と組み合わせて用いることができる。好都合なことに、ｓｉＲＮＡ及びマンニトール／高張食塩水療法は同時につぎ込むことができ、マンニトール／高張食塩水は約２４時間後に作用を停止するので、ＢＢＢの制御された開放は、更に水分の流れが脳からＢＢＢを通して可能であるように開始する。
【００９３】
本発明の別の側面によれば、神経変性疾患又は精神神経疾患の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、神経機能を調整する１５ｋＤａ未満の活性剤の脳毛細血管内皮細胞への透過及び送達を可能にするように、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなる、ｓｉＲＮＡの使用が提供される。神経機能を調整する前記薬剤は、従来の神経変性疾患又は精神神経疾患のためのあらゆる従来の治療とすることができる。
【００９４】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、米国の１７５万人以上の市民に影響を与えており、６０歳以上の人における視力障害及び失明の主な原因である。ＡＭＤを発生させるとして知られている最大の危険因子は加齢であるが、滲出型ＡＭＤの視覚上の危険因子には、軟性ドルーゼン、黄斑色素変化、及び脈絡膜新生血管が含まれる。ＡＭＤに関連する別の危険因子には、喫煙、肥満、高血圧及び家族歴陽性が含まれる。ＡＭＤは、２つの基本的な形態、即ち非滲出型ＡＭＤ又は滲出型ＡＭＤで現れ、後者は血管透過性及び出血が関連している。より深刻な滲出型では、脈絡毛細管床から生まれた新しい血管が網膜の斑の下側に発生し、網膜と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間の網膜下腔内に成長する。この新たに出芽した血管が、漿液及び血液を神経感覚網膜の下側に漏出させ、黄斑浮腫及び網膜剥離を招いて、視覚歪（変視症）及び霧視の症状を生じさせる。
【００９５】
緑内障は複合病であり、目の繊維柱帯網の変性及び／又は篩骨篩板が関係している場合があり、排水路の異状機能及び／又は視神経乳頭の変性を生じる。その結果、神経節（網膜の出力ニューロン）が死に、視野の狭窄及び／又は喪失を生じ、治療しない場合には、相当な割合で深刻な視覚障害を招く。
【００９６】
開放隅角緑内障の大部分の場合には、所謂正常眼圧緑内障の数が現在増えていることが確認されているにも拘わらず、眼圧の上昇が関係している。圧力の上昇を示すような場合には、減圧点眼薬が疾病の進行を遅らせる上で重要な価値を有する場合が多い。しかしながら、眼圧を軽減するのに外科的介入が必要な場合があり、かつ幾つかの開放隅角緑内障は治療不応性になる。
【００９７】
開放隅角緑内障は、現時点でイギリス諸島の最大１００万人に影響を与えている。この疾病の大部分は多重遺伝子性又は多因子性であるが、この疾病の幾つかは明らかなメンデル比に従って遺伝子、即ち常染色体優性の意味で遺伝している。このような幾つかの疾病では、所謂ミオシリン遺伝子内での変異が確認されている（Stone et al, Science, 275,1997, 668-670）。更に、多因子性の病気の最大４％では、同様の変異に遭遇している。従って、イギリス諸島の４万人又はそれ以上の人がミオシリン遺伝子内の変異により生じた緑内障を患っている。
【００９８】
糖尿病性網膜症、即ち糖尿病の結果としてしばしば発生する目の損傷は、血液網膜関門の破壊に関係している。血液網膜関門は、糖尿病性網膜症を有する患者ではより漏れやすくなる。
【００９９】
本発明のこの側面によれば、網膜の疾病の治療のための薬剤の製造において、その方法が、血液脳関門又は血液網膜関門の細胞間通路の可逆的、一次的かつ制御されたサイズ選択的開放からなり、該方法が、脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞における血液脳関門又は血液網膜関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ網膜機能を調節する１５ｋＤａ未満の活性剤の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達からなるＲＮＡｉの使用が提供される。本発明のこの側面には、ＢＢＢ又はＢＲＢを開放して、網膜機能を調節する活性剤の網膜毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にすることによる網膜の疾病の治療が含まれる。
【０１００】
網膜機能を調整する前記活性剤は、上述した状態のためのあらゆる従来の治療法であって良い。更に、例えば血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ）調節不全は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の重要なメディエータであり、従って網膜へのこれらの阻害剤の送達を増加させることが、ＡＭＤの進行を有意に阻害し得る。これまで、これらのＶＥＧＦ受容体の低分子阻害剤は、血液網膜関門を横切ることができなかった。これは、本発明の重要な利点である。
【０１０１】
本発明の更に別の実施例によれば、脳腫瘍の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一次的ＲＮＡｉ仲介抑制を生じかつ１５ｋＤａ未満の抗腫瘍薬又は化学療法薬の脳毛細血管内皮細胞への透過及び送達を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなる、ｓｉＲＮＡの使用が提供される。
【０１０２】
従って、本発明のこの側面により、脳腫瘍のような状態の治療にとって通常は余分なものとなり、今日までＢＢＢを横切ることができなかった従来の化学療法薬又は抗腫瘍薬の送達を増進させるために使用し得るＢＢＢ／ＢＲＢの一時的な開放が提供される。
【０１０３】
本発明のあらゆる側面の典型的な実施例では、前記対象が牛、馬、マウス、ラット、犬、豚、山羊、又は霊長動物（Macaque）のような哺乳動物である。より好適な実施例では、前記対象が人間、例えば健康な人間又は現在ではＢＢＢを横切る薬剤を利用できないことにより治療不応である疾病若しくは疾患と診断され又は予告された人である。
【０１０４】
本発明の第４の側面によれば、タイト結合タンパク質を標的として、送達に適した血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一次的かつ制御されたサイズ選択的開放を生じるｓｉＲＮＡの製薬上許容できる溶液と、特定された疾病又は疾患の治療のための活性剤からとなる医薬組成物が提供される。
【０１０５】
前記活性剤は、神経機能を調節する活性剤、化学療法薬、抗腫瘍薬、網膜機能を調節する薬剤、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）又は上述したような高張溶液のような従来の医薬から選択することができる。特定の例は、上記記載に示した通りである。
【０１０６】
別の実施例では又は更に加えて、前記活性剤はまた、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドとすることができる。理想的には、前記活性剤は、治療している疾病又は疾患を標的とする更なるｓｉＲＮＡであり、それによってＢＢＢの開放後に、更なるｓｉＲＮＡ分子が脳内に送達されて特定の疾病又は疾患を治療できるようにする。
【０１０７】
理想的には、前記医薬組成物は、全身ハイドロダイナミックデリバリーに適しており、製薬的に許容できる担体内に存在する。
【０１０８】
前記ｓｉＲＮＡ及び活性剤が同時投与又は連続投与に適したもので有り得ることは理解される。従って、ｓｉＲＮＡは単独で又は活性剤と組み合わせて投与することができる。にも拘わらず、ＢＢＢが開いた後の連続投与は、幾つかの活性剤にとって好ましい送達方法である。
【０１０９】
本発明の更に別の側面によれば、血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一次的かつ選択されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的な開放のために、脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞において血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の一時的かつ可逆的ＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞への透過を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ有効量の送達、好ましくは全身送達の過程からなる方法が提供される。
【０１１０】
本発明の更に別の側面によれば、血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的な開放からなる、疾病又は疾患の治療のための方法であって、前記方法が、
前記疾患又は疾病を発症する虞がある対象を識別する過程と、
ＲＮＡｉ誘導剤の送達好ましくは全身送達により、タイト結合タンパク質を標的とした有効量の、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤を投与して、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ理想的には１５ｋＤａ未満の、前記疾患又は疾病の治療に使用される活性剤の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞への透過を可能にする過程と、
前記疾患又は疾病の治療に適した活性剤を投与する過程とからなる方法が提供される。
【０１１１】
好都合なことに、この方法によって、薬剤又は他の活性剤に対するＢＢＢの透過率が増加する。
【０１１２】
本願発明者らは従前に、問題の領域即ちＢＢＢへのｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック及び非ハイドロダイナミックデリバリーの双方を論じてきた。
【０１１３】
ＢＢＢを横切る分子の経細胞、受容体仲介送達のような他の送達方法が考えられる。例えば、ｓｉＲＮＡは、エレクトロポレーション又は脂質媒介トランスフェクションを用いて送達することができる。別の送達方法には、カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、脂質、リボゾーム、非カチオン性ポリマー及び／又はウイルスベクターをＲＮＡｉ誘導剤の送達のために使用することが含まれる。
【０１１４】
更に別の送達方法には、ＢＢＢへの送達に作用するように前記ｓｉＲＮＡを封入すること又は共役化することがある。上述したように、「ミクロのトロイの木馬」と称される遺伝子組み換えタンパク質を用いて、ＢＢＢへの送達に作用させることができる。今では、細胞の形質膜を横切ってｓｉＲＡＮの拡散を可能にするために、ｓｉＲＮＡを例えばコレステロール部位で化学的に修飾する多くの方法がある。基本的に、これらのコレステロールで修飾した、ｃｌａｕｄｉｎ−５又はタイト結合タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡは、ハイドロダイナミック注入を必要とすることなく、投与することができる。
【０１１５】
他のウイルス仲介送達システムが考えらる。例えば、ＢＢＢを横切るタンパク質の標的送達は、レンチウイルスベクターシステムの影響を受ける場合がある。
【０１１６】
別の実施例では、モザイクベクター粒子について上述したが、これは特に脈管構造へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の標的送達に大きな見込みが有ることを示している（Stachler MD他、2006）。更に、Work LM他（2006）は、ＡＡＶ粒子上に独特のカプシド修飾を行うことによって、その脳に関連するものを含む特定のウイルス床にウイルスベクターを標的化することが可能になることを示している。この技術は、送達ベクターにクローン化するために短いヘアピンを用いる場合にｓｉＲＮＡを使用するときに必要である。上述したように、このような誘導ベクターシステムによって、血液脳関門の制御された一時的な抑制が得られる。
【０１１７】
このように、本発明のこの側面によれば、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制に特異的な抗生物質／薬物性ｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）配列を含む内皮細胞特異型ＡＡＶを生成して、ｃｌａｕｄｉｎ−５に対するｓｈＲＮＡを含むＡＡＶによる脳微小血管系内皮細胞の感染後にＢＢＢ又はＢＲＢを誘導開放するための方法を提供することができる。他のウイルスベクターも考えることができる。
【０１１８】
更に、最近では、Szymanski他（2007）が、ＦＤＡ承認の薬剤ミフェブリストン（ＭＦＰ）により制御され、かつ基本的にＡＡＶウイルス粒子内にパッケージ化されかつその後に送達されるのに十分小さい流動プラスミドｐＢＲＥＳの発生について報告している。ｐＢＲＥＳはモジュラーに設計され、トランス活性化誘導タンパク質、ＴＡからなり、薬剤ＭＦＰと相互作用して問題の導入遺伝子、即ちｓｈＲＮＡ（調節プロモーター（例えば、６×Ｇａｌ４／ＴＡＴ）から）の発現を可能にするプロモーターの選択により駆動される。この最小のプロモーターが標準的なＰｏｌ II要素を用いて設計されているので、Ｐｏｌ IIIプロモーターを必要とする従来のｓｈＲＮＡ遺伝子を駆動することは考えられず、ｓｈＲＮＡ配列をマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）バックボーン（ｓｈＲＮＡｍｉｒｓ）でｐｃＤＮＡ ６．２-ＧＷ／ＥｍＧＦＰ-ｍｉＲにクローン化すべきである（BLOCK-iT Pol Il miRNAi Expression Vector Kit; Invitrogen cat.
no.K4935-00）。得られたＥｍＧＦＰタグ付加ｓｈＲＮＡｍｉｒは次に切り取られて、調節プロモーターの後にｐＢＲＥＳ内に挿入することができる。更に、ｓｈＲＮＡの適当でない発現に対して更に保護を加えるために、ＴＡタンパク質（次にｓｈＲＮＡ発現誘導を招くことになる）は、脳内皮内で他の組織と比較して高度な発現を駆動するトランスフェリン、ｃｌａｕｄｉｎ−１２、Ｔｉｅ−２又はｐ糖プロテインのプロモーターを用いて駆動される。生物情報分析後に得られたこれらの遺伝子からの推定プロモーターは、次にＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ no．ＣＲＬ−１７３０）及びｂｅｎｄ．３（ＡＴＣＣ no．ＣＲＬ−２２９９）内皮細胞系におけるＥＧＦＰの発現を駆動するときに効率及び組織特異性を試験することができ、最も効率的なプロモーターが前記誘導システムに組み込まれてＴＡタンパク質を駆動することになる。最後に、得られたＭＦＰ−誘導、内皮特異型ｓｈＲＮＡ発現ｐＢＲＥＳプラスミドは、直線化され、かつＡＡＶシャトルベクターｐＡＡＶ２ ＣＭＶにクローン化され、血管内皮への送達のためにカプシド修飾ＡＡＶ１にパッケージされる。
【０１１９】
今日まで、ＡＡＶ−１の使用における主な制限は、しかしながら、効率的な小規模精製戦略がないことであった。しかしながら最近では、２つのＡＡＶ−１カプシドタンパク質修飾が、ベクター粒子の簡単な精製を容易にしつつ、血管遺伝子導入を大きく増進し得ることが開示されている。脈間系を覆う内皮細胞の内腔面上に存在するインデグリンを標的とするべく十分に特徴付けられたＲＧＤ４Ｃ修飾を含むカプシドタンパク質と、アビジンアフィニティークロマトグラフィーによるモザイク粒子の代謝的ゼオチン化及び効率的な精製を可能にする修飾を含むカプシドタンパク質とからなるモザイクベクター粒子を用いて、今では高効率で特異的に内皮細胞を導入する修飾ＡＡＶ−１粒子を生成することが可能である（Stachler & Bartlett, 2006）。このように、特にＢＢＢ及び／又はＢＲＢへのｓｈＲＮＡの送達のためにＡＡＶ−１を使用することが、今では実用的に実行可能である。
【０１２０】
本明細書中、「からなる」などの用語及びその活用形、及び用語「を含む」並びにそれらの活用形は、相対的に相互に変換可能であると解され、もっとも広く解釈すべきものと考えられる。
【０１２１】
本発明は上述した実施例に限定されるものでなく、その技術的範囲において様々に変形又は変更することができる。
【０１２２】
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【０１２３】
以下に本発明を、以下の非限定的な図面及び実施例を参照しつつ詳細に説明する。
図１は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質及びｍＲＮＡのレベルの定量化の結果を示している。
【０１２４】
図１Ａは、ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４、４８、７２時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現のウェスタンブロット分析である。使用したコントロールには、非注射のコントロール、ＰＢＳ注射のコントロール及び非標準化（ロドプシン）ｓｉＲＮＡ注射コントロールの各マウスが含まれる。ｓｉＲＮＡの送達後２４時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現のウェスタンプロット分析は、非注射、ＰＢＳ注射及び非標準化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、発現の現象を示した。この抑制はまた、注射後４８時間（ＣＬＤＮ５ Ａ＋Ｂ；２つの異なるマウスからのリゼイト）においても明確であった。ｃｌａｕｄｉｎ−５のレベルは、同じ列におけるβ−アクチンの対応するレベルと比較したとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後７２時間及び１週間におけるコントロール群に類似していた（図１Ａ）。
【０１２５】
図１Ｂは、コントロール群−非注射コントロール、ＰＢＦ注射コントロール及び非標準化（ロドプシン）ｓｉＲＮＡ注射コントロールのマウスと比較したｓｉＲＮＡの注射後におけるｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡのレベルが、検査後Tukey-Kramer法によるＡＮＯＶＡ後にＰ＝０．０４２７（＊）であるコントロール群と比較して、ｓｉＲＮＡの注射後２４時間で大きく減少したことを示しつつ、Ｐ＝０．０４７８（＊）であるｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間における抑制をも示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡのレベルは、注射後７２時間（Ｐ＝０．０６２７）及び１週間（Ｐ＝０．２２６４）において、非標準化コントロール群と比較して大きく変化しておらず、０．０５より大きいＰ値を示し、有意でないことを表している（図１Ｂ）。
【０１２６】
図２は、脳の微小血管におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の発現及び局所化の免疫組織化学分析の結果を示しており、非注射、ＰＢＳ注射及び非標準化コントロールのマウスの脳微小血管系における染色パターンが全ての時点において連続的かつ独特なことを表している（赤色＝ｃｌａｕｄｉｎ−５、青色−ＤＡＰＩ＝核）。この染色パターンは、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後２４時間において減少しかつ非連続的であることを示し、注射後４８時間には発現が顕著に減少している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後７２時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５染色の現れかたは明確であるが連続的ではなく、注射後１週間では、ｃｌａｕｄｉｎ−５の発現がコントロール群のそれに似ていることを示している。目盛は２０μｍである。これらの結果は、少なくとも５つの別個の実験の典型である。
【０１２７】
図３は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制後のｃｌａｕｄｉｎ−１、Ｔｉｅ−２及びｏｃｃｌｕｄｉｎの発現の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後２４、４８、７２時間及び１週間におけるｃｌａｕｄｉｎ−１（２３ｋＤａ）発現のウェスタンブロット分析は、いずれの時点においても変化がないことを示した。anti−Tie−２（１４０ｋＤａ）抗体でブロットをプローブした時、この内皮細胞特異型チロシンキナーゼ受容体の発現のレベルには、いずれの時点においても、いずれの処置によっても、全く顕著な変化が観察されなかった（図３Ａ）。また、タイト結合タンパク質ｏｃｃｌｕｄｉｎの発現のレべルは、ｓｉＲＮＡの送達後の全ての時点において変化しないままであることを示した（図３Ｂ）。
【０１２８】
図４は、脳の凍結切片におけるｃｌａｕｄｉｎ−１及びｃｌａｕｄｉｎ−５の２重免疫染色の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後に適当なコントロールを用いて脳の凍結切片をラットanti−ｃｌａｕｄｉｎ−１抗体及びラビットanti−ｃｌａｕｄｉｎ−５抗体で染色した。使用した２次抗体はラットＩｇＧ（Ｃｙ３；赤）及びラビットｌｇＧ（Ｃｙ２；緑）であった。図２における結果と同様に、ｃｌａｕｄｉｎ−５の染色パターンは、ｓｉＲＮＡの注射後４８時間（図４Ｂ）において非常にばらばらにかつ不連続に現れた。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後７２時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５染色の現れかたは明らかなものであったが、コントロール群（図４Ｃ）ほど強いものではなかった。注射後の各時点において、ｃｌａｕｄｉｎ−１の発現のレベルは、コントロール群において観察されたそれに似た状態で現れた。
【０１２９】
図５は、４４３ダルトンの分子に対するＢＢＢ完全性の評価の結果を示している。ＢＢＢ完全性は、全てのコントロール群の微小血管内における緑色蛍光として観察された。しかしながら、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間では、検出した蛍光が、同じ時点におけるコントロール群と対照して、拡散してかつ微小血管の外側にあった。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間では、ビオチン化分子の分布が脳実質において豊富であったが、この透過性は、コントロール群と比較したとき、ｓｉＲＮＡの送達後７２時間においても明らかであった。ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後１週間におけるマウスでは、ビオチン化試薬が５分間の灌流後に実質に沈着しないことが観察された。EZ-Link TM Sulfo-NHS-Biotinが、脳の微小血管内に観察された。２４時間及び４８時間における目盛は約２００μｍを示している。７２時間及び１週間の時点における目盛は約１００μｍを示している。全てのトレーサー実験は、マウスにおいて少なくとも５回繰り返した。
【０１３０】
図６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間におけるHoechst３３３４２及びＦＤ−４の同時灌流を示すことにより、脳及び網膜の微小血管からのHoechst Ｈ３３３４２染料の溢出の結果を示している。脳微小血管からのHoechst Ｈ３３３４２の溢出は、コントロール群と比較したとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間における周囲の神経細胞及びグリア細胞の核の顕著な染色により明示されている。この溢出は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間又は１週間における切片では明らかでなかった。ｓｉＲＮＡ注射後のあらゆる時点において又はコントロール群において脳実質組織には、ＦＤ−４の溢出が全く観察されなかった。これは、ｃｌａｕｄｉｎ−５のＲＮＡｉ仲介標的化のサイズ選択的な特徴を強調している。目盛は約２０μｍである（図６Ａ）。
【０１３１】
また、Hoechstの溢出は、１２μｍの網膜凍結切片において明らかであり、内顆粒層（ＩＮＬ）は、ＣＬＤＮ５ ｓｉＲＮＡの送達後２４時間において染色されたことを、外顆粒層（ＯＮＬ）は、４８時間において顕著に染色されたことを示している。全てのコントロール群において、Hoechst染色は、もっぱら網膜血管の核内に現れ、網膜内に外網状層（ＯＰＬ）まで拡散している。目盛は約２０μｍである。（ＩＰＬ）内網状層、（ＧＣＬ）神経節細胞層（図６Ｂ）。
【０１３２】
図７Ａは、血液脳関門の完全性を生体内で評価する注射後のＭＲＩスキャンの結果を示している。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡを用いて、ｃｌａｕｄｉｎ−５転写物のアブレーション後のマウスにおけるＢＢＢ完全性を、コントロール群−非注射コントロール、ＢＰＳ注射コントロール及び非標準化（ロデプシン）ｓｉＲＮＡ注射コントールのマウスと比較して確認した。同図の左側の画像は、Ｇｄ−ＤＴＰＡの注射前のマウス脳の映像であり、右側の画像はＧｄ−ＤＴＰＡの注射後のマウス脳の映像である。これらの画像は、冠状断像的に撮影され、脳の腹面から背面（下側の画像）に向けて移動し、その間の画像は、海馬領域及び皮質領域内の映像を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後２４時間及び４８時間において、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＢＢＢを横切り、脳内に沈着したことが観察された。また、目では動物のコントロール群と比較したとき、強いコントラストが４８時間の時点で観察されたが、他の時点ではそうではなかった。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（７４２Ｄａ）の実質内への最も大きな浸透及び沈着は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡ注射後２４時間及び４８時間において発生した。（全てのＭＲＩスキャンは最低で２回繰り返した）。この造影剤の浸透は、コントロール群のマウスには存在せず、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間又は１週間におけるマウスにも存在しなかった。
【０１３３】
図７Ｂは、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの全身投与後のマウス脳におけるＭＲＩ画像の濃度分析の結果を示している。各時点において及び各処置について、小脳、海馬及び皮質の選択した領域におけるＭＲＩスキャンの濃度分析は結合され、図７Ｂにおいて棒グラフとして表されている。これらの領域には、コントロール群と比較したとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後２４時間（＊＊Ｐ＜０．０５）及び４８時間（＊＊Ｐ＜０．０５）においてコントラストが大きく増加した。
【０１３４】
図７Ｃは、定量的なＭＲＩ画像の結果を示している。図７Ｃの画像は、以下を表している。即ち赤の端部はマウスのＭＲＩスキャンにおける各ピクセルについて決定される、線形回帰の傾斜の変化が非常に小さいことを示している。緑色の領域は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ沈着の速度に少し変化があることを示し、かつ青色の領域は大きな変化があることを表している。図７Ｃにおける定量的画像の下側のグラフは、Ｇｄ−ＤＴＰＡ注射後の２８分間に亘る左心室における強度の変化を示している。同グラフのデータは、Ｘ軸上の分単位の時間（Ｘ軸上の１単位は、１２８秒の長さ）に対する信号強度の自然対数（ｌｎ）（Ｙ軸）として描いた。赤線は、非標準化コントロールｓｉＲＮＡ注射マウスを表し、黄線はｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間の時点を表し、緑線はｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間の時点を表している。細線＝１４の時点における強度の生データ、太線＝各時点について数学的に計算した線形回帰、破線＝カイ２重評価法を用いた線形回帰の標準誤差。
【０１３５】
図８は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質のアブレーション後のマウスへの２０ｍｇ／ｋｇのＴＲＷの投与の結果を示している。このグラフは、非標的化ｓｉＲＮＡの尾静脈注射後４８時間マウスとｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間のマウスにおける２０ｍｇ／ｋｇのＴＲＨ投与時に観察された移動度の顕著な変化を描いている。ＢＢＢが弱められたとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間におけるＴＲＷ注射後の行動出力は、非標準化コントロールマウスにおいて観察されたそれ（＊＊Ｐ＝０．００４１）よりも５倍以上長い時間維持される移動度の有意な停止で現れた。
【０１３６】
図９は、肝臓結切片における内皮細胞の形態学を示している。マウス肝臓の１２μｍ凍結切片を、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後にかつ適当なコントロール群を用いて準備した。前記切片における茶色／紅バラ色の発色性染色は、肝臓微小血管及び特にこの微小血管を覆う内皮細胞において結合するGriffonia simplicifoliaイソレクチンを表している。全ての切片及び全ての処置において、前記肝臓の微小血管は類似しかつ崩壊していないことが表れている。各切片はヘマトキシリンで対比染色した。
【０１３７】
図１０は、肺の凍結切片における上皮細胞形態学を示している。マウス肺の凍結切片はＨＲＰ標識Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ-イソレクチンＢ４で染色した。肺組織を微小血管が広く覆っていることは明確であるが、これら血管の形態学は、全ての実験群においてかつ注射後の全ての時間において変わらないままである。切片は、ヘマキトシリン対比染色した。
【０１３８】
図１１は腎臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示している。マウス腎臓凍結切片は、ｓｉＲＮＡの注射後に、かつ適当なコントロール群を用いて準備し、次にＨＲＰ標識Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ
ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ-イソレクチンＢ４で染色した。茶色／紅バラ色の染色が、全ての処置においてかつｓｉＲＮＡ注射後の全ての時点において無傷の腎臓微小血管を示している。切片は、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１３９】
図１２は、心臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示している。マウス心臓をｓｉＲＮＡの送達後２４、４８、７２時間及び１週間で解剖し、かつ適当なコントロールを用いた。１２μｍ切片を準備し、かつＧｒｉｆｆｏｎｉａ
ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ-イソレクチンＢ４で染色したのち、心臓関連微小血管は、全ての時点でかつ全てのｓｉＲＮＡ処置について類似の形態学を示した。切片はヘマトキシリンで対比染色した。
【０１４０】
図１３は、脳凍結切片におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ発現の免疫組織化学分析を示している。脳の微小血管におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ発現及び局所化の免疫組織化学分析は、全てのマウスの微小血管系における全ての時点での連続的かつ独特の染色パターンを示した（赤；Ａｌｅｘａ５６８＝ｏｃｃｌｕｄｉｎ；青−ＤＡＰＩ＝核）。
【０１４１】
図１４は、ｓｉＲＮＡ注射後の網膜におけるｃｌａｕｄｉｎ−５抑制の結果を示している。網膜タンパク質リゼイトにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現のウェスタンブロット分析は、ｃｌａｕｄｉｎ−５に対するｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後４８時間における発現の減少を示した。発現のレベルは、非注射ＰＢＳ注射及び非標準化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと同様のレベルに戻ることが観察された。
【０１４２】
図１５は、網膜のフラットマウントにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の結果を示している。非標的化ｓｉＲＮＡを受けるマウス及びｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡ注射後２４、４８及び７２時間におけるマウスからの網膜フラットマウントにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の免疫組織化学分析は、網膜微小血管を覆う内皮細胞の周辺部におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の局所化の減少を示した。このｃｌａｕｄｉｎ−５の発現の減少は網膜微小血管透過率の増加を伴った。
【０１４３】
図１６は、ｉＢＲＢを横切るＧｄ−ＤＴＰＡ拡散のＭＲＩ分析の結果を示している。ＭＲＩ分析のコントラストを増強したのち、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間のマウスにおいてｉＢＲＢが弱められることが明らかである。これは、Ｇｄ−ＤＴＰＡが血管構造から血管外腔に通過したことから、目の硝子体内における影像コントラストの増加として説明される。
【０１４４】
図１７は、Hoechst３３３５２（５６２Ｄａ）でのマウスの灌流後の網膜フラットマウントの結果を示している。Hoechst３３３５２でのマウスの灌流後に、網膜を切り分けてフラットマウントした。Hoechst３３３５２は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの網膜において、非注射のマウス、ＰＢＳのみを受けたマウス又は非標的化ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射を受けたマウスと比較したとき、血管外核を染色したことが示された。
【０１４５】
図１８は、ＩＭＰＤＨ−／−マウスにおけるＧＴＰ注射後のＥＲＧ結果を示している。野生Ｃ−５７マウスにおける杆体応答が、左目及び右目双方において７９３ｕＶであることが観察された。生後１１カ月ＩＭＰＤＨ−／−では、しかしながら、杆体応答は、右目及び左目それぞれにおいて５０．８ｕＶ及び２．４８ｕＶであることが観察された。しかしながら、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制及び次のＥＲＧを行う時点でのＧＴＰの注射後に、杆体の記録は、右目及び左目についてそれぞれ１９３ｕＶ及び１２１ｕＶのｂ波を示し、大きく増加することを示した。この杆体応答における増加は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制及びＧＴＰの注射後の更に３つのＩＭＰDＨ−／−マウスにおいて観察された。
【０１４６】
図１９は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈送達後のｏｃｃｌｕｄｉｎ発現のウェスタンブロット分析の結果を示している。ｏｃｃｌｕｄｉｎの発現のレベルは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（４）の注射後２４時間にｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（２）よりも少ない程度まで減少することが示された。しかしながら、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（１）及びｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（２）の注射後４８時間では、ｏｃｃｌｕｄｉｎ発現のレベルが、非標的化ｓｉＲＮＡの注射を受けたマウスと比較して大きく減少した。
【０１４７】
図２０は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後のｏｃｃｌｕｄｉｎ免疫組織化学の結果を示している。脳微小血管系におけるｏｃｃｌｕｄｉｎの連続的な染色パターンは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡの注射後２４時間に崩壊することが観察された。この不連続な染色パターンはまた、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（１）及び（２）についても４８時間の時点で明らかであった。しかしながら、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（３）及び（４）の注射後４８時間の染色パターンは、非標的化コントロールにおいて観察されたそれと同様のレベルに戻っていた。
【０１４８】
図２１は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後のアルブミン免疫組織化学の結果を示している。脳ビブラトーム切片におけるアルブミンの免疫組織化学分析は、（３）及び（４）の番号を付したｓｉＲＮＡの注射後２４時間における血管外アルブミンを示した。これは、ｓｉＲＮＡ注射後２４時間において７０ｋＤａまでの分子のＢＢＢの通過を可能にする程度に細胞間通路が弱められていることを示唆している。Hoechstの灌流による青色の染色は、ＢＢＢが５６２Ｄａの分子に対して弱められた証拠を示している。
【０１４９】
図２２は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後の脳ビブラトーム切片における免疫グロブリン染色の結果を示している。ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後のマウス免疫グロブリンのためのマウス脳切片の染色は、ＩｇＧの脳内への通過が全くないことを示した。マウスＩｇＧは約１５００００Ｄａの分子量を有し、ｏｃｃｌｕｄｉｎを抑制したときも以前として脳から排除されていることが明らかである。
【０１５０】
図２３は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後のｃｌａｕｄｉｎ−１発現のウェスタンブロット分析の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−１を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後、注射後２４時間において、ｃｌａｕｄｉｎ−１のレベルが、ｓｉＲＮＡ（２）及び（４）を用いたときに減少したことが観察された。この抑制は、注射後４８時間の時点におけるｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡ（４）においてのみ明らかであり、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡ（１）については２４時間の時点において明確でないにも拘わらず、この特定のｓｉＲＮＡが注射後４８時間にｃｌａｕｄｉｎ−１発現を大きく減少させた。
【０１５１】
図２４は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４時間及び４８時間におけるHoechst（５６２Ｄａ）及びＦＤ−４（４４００Ｄａ）の灌流の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−１を標的としたある範囲のｓｉＲＮＡの送達後、Hoechst及びＦＤ−４の混合物が、マウス内で灌流し、脳のビブラトーム切片を準備した。使用した全てのｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡにおいて、周囲の神経細胞が、同じ時点における非標的化コントロールマウスと比較したとき、明らかに青色の蛍光を発していたことから、脳の微小血管からのHoechstの拡散の証拠があったことは明らかである。全ての場合において、ＦＤ−４は、血管内に残ることが観察された。
【０１５２】
図２５はハツカネズミｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡにおいて実験で使用した１種のｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの位置（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対応するｓｉＲＮＡ ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−５’−ＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＵＵＵＣＣＡＡＣＧＵＵ−３’）を示している。ハツカネズミｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡにおけるこのｓｉＲＮＡの標的配列は、３’−ＡＡＣＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴ−５’である。
【０１５３】
図２６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのデリバリー後４８時間におけるマウス脳の海馬領域のＴ１強調ＭＲＩ画像を示しており、Ｇｄ−ＤＴＰＡが脳微小血管から溢出している脳内のコントラストが強調して明確に示されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡは７４２ダルトンの分子量を有し、その脳内への透過は、ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間においてのみ観察された。
【０１５４】
図２７は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの大容量尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内における血流量及び血液量に関係するＭＲＩ情報を示している。このデータによって、２つの事柄に関する情報、即ち平均通過時間（ＭＴＴ）及び毛細血管通過時間（ＣＴＴ）が得られる。ＭＴＴは、ラベリングしたスピンがラベリング面（頸動脈の画像スライスから１ｃｍまで）から画像スライスまで移動するのに要する時間を表している。
【０１５５】
図２８は、試験した各実験群について実験データに適合させた脳血流量及び脳血液量の理論的モデルを示している。これらは、各グループについて殆ど同じであり、図２７に示した棒グラフの結果に一致している。
【０１５６】
図２９は、Ｂ値（Ｘ軸）とその上にプロットしたＭＲＩ信号強度（Ｙ軸）を示しており、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内の水分拡散の速度に変化がないこと示している。この脳から血液への水分の拡散が一定の速度であることは、一次的なＢＢＢの開放それ自体がマウス脳内における水分の拡散になんら強い影響を与えていないことを示唆している。
【０１５７】
図３０は、ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−１２の染色パターンは、非標的化コントロールｓｉＲＮＡ注射後４８時間における脳微小血管系に関係していることが観察された。しかしながら、ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間において、脳の微小血管における発現のレベルは、試験した両方のｓｉＲＮＡ（即ち、ＣＬＤＮ１２ ｓｉＲＮＡ（３）及びＣＬＤＮ１２ ｓｉＲＮＡ（４））において減少することを示した。
【０１５８】
図３１は、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示している。マウスは、左心室を通して、ＦＩＴＣ−デキストラン−４及びHoechst３３３４２（５６２Ｄａ）を含む溶液を灌流させた。ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後に、血管外の核の染色により明示されるように、微小血管系からHoechstの溢出があったことが観察された。ＦＴ−４は、非標的化ｓｉＲＮＡ及びｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後の双方において微小血管内に観察された。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの全身ハイドロダイナミック微小脈デリバリーを用いたＣ５７／ＢＬ−６マウスの血液脳関門におけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の生体内抑制
材料
ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
既知のｃＤＮＡ配列の保存領域を標的としたｓｉＲＮＡを選択した。これを行うため、マウスからのｃＤＮＡ配列は、Reynolds他（２００４）により概略が記述されている基準から元々引き出された最新のウェブベースのプロトコル（Dharmacon, Ambion, Genescript）を条件としてｃｌａｕｄｉｎ−５遺伝子及び完全な相同性を有する領域について整合させた。この検討において使用したｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの配列は以下の通りであった。
【０１６０】
【化５】
【０１６１】
ヒトロドプシンを標的とした非標的化コントロールｓｉＲＮＡを、ロドプシンが網膜の光受容体細胞においてのみ、かつ脳の松果腺において低レベルで発現する（O'Reilly、M他、２００７）ことから、非標的化コントロールとして用いた。
【０１６２】
【化６】
【０１６３】
プロトコル
大容量のハイドロダイナミック注射によるマウス（murine）ＢＢＢへのｓｉＲＮＡの生体内送達及びそれに続くＲＮＡ並びにタンパク質分析
高速高圧大容量尾静脈注射を行った（Kiang他、２００５）。体重２０〜３０ｇの野生C５７／Ｂｌ６マウスを、６０ｍｌ容量のプラスチック管内に個々に拘束した。突出する尾を６０Ｗのランプで注射前に５分間温め、尾静脈を下側からの照明で明確に見えるようにした。２０μｇの標的化ｓｉＲＮＡ、又はＰＢＳで体重のｇ量での１０％のｍｌ量での容積に調整した非標的化ｓｉＲＮＡ若しくはＰＢＳ単体を、２６ゲージ（２６Ｇ ３／８)の針を用いて１ｍｌ／秒の速度で尾静脈に注射した。２４、４８、７２時間及び１週間後、脳を液体窒素中で微粉末に粉砕し、かつ次に６２．５ｍＭのトリス（Tris）、２％ＳＤＳ、１０ｍＭのジチオトレイトール、１０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル／１００ｍｌを含むライシスバッファー（Sigma Aldrich、アイルランド)を用いることにより、タンパク質を全脳組織から分離した。ホモジネートを１０，０００ｇで２０分間４℃で遠心分離し、ｃｌａｕｄｉｎ−５分析のために上清を除去した。
【０１６４】
簡単に言えば、タンパク質サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ウェット式エレクトロブロッティング装置を用いてニトロセルロース膜に一晩転写した。タンパク質の転写の効率は、Ponceau-S溶液（Sigma Aldrich、アイルランド）を用いて決定した。非特異的結合部位は、前記膜を室温でトリス干渉生理食塩水（ＴＢＳ）（トリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、５％脱脂粉乳により２時間インキュベートすることによってブロックした。膜をＴＢＳで短時間洗浄し、かつポリクローナル・ラビット抗ｃｌａｕｄｉｎ−５（Zymed Laboratories、サンフランシスコ、ＣＡ）（１：５００）又はポリクローナル・ラビット抗β−アクチン（Abcam、ケンブリッジ、ＵＫ）（１：１０００）によりインキュベートした。抗体を膜で一晩４℃でインキュベートした。膜をＴＢＳで洗浄し、西洋わさびフェルオキシラーゼ（ＨＲＰ）共役を有する２次抗ラビット（ｌｇＧ）抗体により３時間室温でインキュベートした。増強化学ルミネセンス（ＥＣＬ）を用いて免疫複合体を検出した。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡの送達後の同じ時点で、トリゾール（インビトロジェン）を用いて全ＲＮＡを脳から分離した。次に、ＲＮＡをRNase-free DNase(Promega、マジソン、ＷＩ、米国)で処理し、かつ次にクロロフォルム抽出し、イソプロパノール沈澱させ、ＲＮＡグレードのエタノール７５％で洗浄し、かつRNase-フリー水１００μｌに再懸濁させた。
【０１６６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡを、Quantitect Sybr
Green Kitを用いて、製造者（Qiagen-Xeragon）が概略説明するように、LightCycler（Roche Diagnostics、ルイス、英国)上で以下の条件：５０℃２０分間；９５℃１５分間；９４℃１５秒間、５７℃２０秒間、７２℃１０秒間の３８サイクルで、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【０１６７】
増幅した配列のプライマー（Sigma-Genosys、ケンブリッジ、英国）は次のとおりであった。
【０１６８】
【化７】
【０１６９】
ｃＤＮＡフラグメントをｃｌａｕｄｉｎ−５及びβ−アクチンから、各ＲＮＡサンプルについて少なくとも４回増幅した。結果は、同様に標準化した適当な対照実験から得られた結果の割合として表した。非標的化コントロールｓｉＲＮＡと対比した逆数の値により、ｃｌａｕｄｉｎ−５発現の抑制の割合が得られた。平均値、標準偏差及びpooled t検定は、GraphPad Prism(登録商標)を用いて計算した。差はＰ＜０．０５において統計学的に有意と考えられる。
【０１７０】
分析のための共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いたｃｌａｕｄｉｎ−５の間接的免疫染色
脳凍結切片を、ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清で２０分間室温でブロックした。１次抗体（ラビット抗ｃｌａｕｄｉｎ−５、Zymed、カルフォルニア）を切片上で一晩４℃でインキュベートした。このインキュベーション後、切片をＰＢＳ中で３度洗浄し、かつ次に５％ＮＧＳで室温で再びブロックした。ラビットＩｇＧ−Ｃｙ３ ２次抗体を前記切片で２時間３７℃でインキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。全部の切片をＤＡＰＩにより原液１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：５０００の希釈率で３０秒間対比染色した。染色した切片の分析はOlympus FluoView TM FV1000共焦点顕微鏡により行った。
【０１７１】
ビオチン化トレーサー分子の灌流によるＢＢＢ完全性の評価
ｃｌａｕｄｉｎ−５をエンコードする転写物のＲＮＡｉ仲介アブレーション後、トレーサー分子を用いて、ＢＢＢのＴＪが影響を受けた範囲を決定した。ビオチン化試薬EZ-Link TM Sulfo-NHS-Biotin（Pierce）(２ｍｇ／ｍｌのEZ-Link TM Sulfo-NHS-Biotin,４４３Ｄａの体重１ｍｌ／ｇ)、をｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間におけるマウスの左心室を介して５分間灌流させた。トレーサー分子による灌流後脳全体を切り分けてｐＨ７．４の４％ＰＦＡ中に一晩４℃で置き、かつ次にＰＢＳで４×１５分間洗浄した。スクロースによる凍結保護の後、凍結切片をクリオスタット（凍結切片作成機）で−２０℃で切断し、蛍光プローブＦＩＴＣに共役化したストレプトアビジンによりインキュベートした。これによって、脳の微小血管からの分子量４４３Ｄａのビオチン化試薬の漏れの評価が可能となった。全切片を４’、６−ジアミジン−２−フェニルインドール−ジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ；Sigma Aldrich、アイルランド）により原液１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：５０００の希釈率で３０秒間対比染色し、かつ切片をOlympus FluoView TM FV1000共焦点顕微鏡を用いて可視化した。
【０１７２】
５６２ダルトン及び４４００ダルトンの分子に対するＢＢＢ／ＢＲＢ透過率の評価
５６２ダルトンの分子に対する脳及び網膜微小血管の透過率を測定するために、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間において、１００μｇ／ｍｌのHoechst染料Ｈ３３３４２(Sigma Aldrich、アイルランド)及び１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン−４（ＦＤ−４）を含むＰＢＳの体重当たり５００μｌ／ｇを用いてマウスを左心室を通して灌流させた。灌流後、脳全体を切り分けかつｐＨ７．４の４％ＰＦＡ中に一晩４℃で置き、かつ次にＰＢＳで４×１５分間洗浄した。次に、脳を４％アガロース中に包埋し、Vibratome(登録商標)を用いて５０μｍ切片を切断した。眼全体を取り除きかつ４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳによる洗浄及びショ糖勾配を用いた冷凍保護の後、クリオスタットを用いて１２μｍ冷凍切片を切断した。Olympus FluoView TM FV1000共焦点顕微鏡による網膜冷凍切片の分析後、アドビ（登録商標）Photoshop(登録商標)を用いて画像を正しく配向した。
【０１７３】
磁気共鳴イメ−ジング
ｓｉＲＮＡの注射に続いてかつ適当なコントロールを用いて、アクティブ磁気シールドＵＳＲ Magnetを有する小げっ歯類専用Bruker BioSpec70/30（即ち、７Ｔ、ボア径３０ｃｍ）を用いて、ＢＢＢ完全性をＭＲＩにより生体内で評価した。マウスをイソフルオランで麻酔し、生理学的にモニターし（ＥＣＧ、呼吸及び温度）、動物体温を３７℃に維持するためのシステムを組み込んだＭＲＩ互換型支持クレードル上に置いた。次に、前記クレードルをＭＲＩスキャナー内に配置した。正確な配置は、最初の高速パイロット画像を得ることによって確保され、次にこれを用いて正しいジオメトリーが後の全てのＭＲＩ実験においてスキャンされる。ＭＲＩスキャナー内に挿入すると、脳の高解像度解剖画像が得られた（平面１００μｍ及び交差面５００μｍ空間分解能）。次にＢＢＢ完全性を、尾静脈を介して投与したＧｄ−ＤＴＰＡ（ガドリニウム・ジエチレン−トリアミン五酢酸）の０．１ｍＭ／Ｌ／ｋｇボーラスの注射前後において高解像度Ｔ1強調ＭＲ画像に可視化した。
【０１７４】
ＩＭＰＤＨ−／−マウスの網膜電図検査分析及びＧＴＰ注射
ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック注射を受けたＩＭＰＤＨ−／−マウスを一晩暗順応させ、薄暗い赤ランプの下で網膜電図検査を準備した。１％シクロペントラート（cyclopentalate）及び２．５％フェニレフリンのインストールにより瞳孔散大を行った。ケタミン（体重１５ｇ当たり２．０８ｍｇ）及びキシラジン（体重１５ｇ当たり０．２１ｍｇ）の腹腔内注射により動物を麻酔させた。動物が一端麻酔されると、ＧＴＰを腹腔内に注射した。ＥＲＧは、麻酔薬の投与後１０分に開始した。ガンツフェルトボウル内で前記マウスに標準規格の光のフラッシュ照射を行って、網膜の均一な照明を確実にした。ＥＲＧ応答は、Vidisic(Dr Mann Pharma、ドイツ国)を導電剤としてかつ角膜水化を維持するために用いて金線電極（Roland
Consulting Gmbh）により両眼から同時に記録した。前記眼は、眼球の背後に配置した小さいプラスチックバンドにより検査の間中前方下垂した位置に保持した。基準電極及び接地電極を皮下に、側頭眼角から約１ｍｍ及び尾の前方へそれぞれ配置した。体温は、直腸温度探針により制御された加温装置を用いて３７℃に維持した。応答は、RetiScan RetiPort電子生理学装置（Roland Consulting
Gmbh）を用いて分析した。前記プロトコールは、人間の網膜電図検査に関してInternational
Clinical Standards Committeeが承認したものに基づいたものであった。
【０１７５】
フラットマウントした網膜の免疫組織化学分析
眼全体を４％パラホルムアルデヒド中で４時間固定し、その後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。網膜を眼から切り分け、かつ０．５％トリトンＸ−１００及び５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳを用いたインキュベーションによりブロック／透過化した。次に網膜を、１％ＮＧＳ及び希釈率１：５０のラビット抗ｃｌａｕｄｉｎ−５抗体（Zymed)を含む透過化バッファー中で一晩インキュベートした。２時間に亘ってＰＢＳで１０回洗浄した後、蛍光プローブＣｙ−３と共役化したラビットＩｇＧ抗体で網膜を６時間室温でインキュベートした。２時間に亘ってＰＢＳで１０回洗浄した後、網膜をフラットマウントし、かつ共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１７６】
主要器官の内皮細胞形態学
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック注射後、冷凍切片を心臓、肺及び腎臓の主要器官全部について準備した。器官の内皮細胞を染色するために、切片をＨＲＰ標識Griffonia simplicifoliaイソレクチンＢ４により一晩４℃でインキュベートした。
【０１７７】
結果
ＣＬＤＮ５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射がclaudin-５発現を減衰する
claudin-５ ｓｉＲＮＡ２０μｍの送達後、マウスを２４，４８，７２時間及び１週間そのままに置き、その後脳を切り開いてタンパク質及びＲＮＡを上述したように分離した。２４時間後、claudin-５の発現は、コントロール（非注射）、ＰＢＳ注射コントロール及び非標的化（ロドプシン）コントロールと比較したとき、著しく減少した。ＣＬＤＮ５
ｓｉＲＮＡを注射しかつその後４８時間置いたマウスも同様に、使用したコントロールと比較したとき、claudin-５発現の有意な減少を示した。注射後７２時間では、この観察されたclaudin-５発現の減少がそれより明確でなく、発現のレベルがコントロール群で観察されたそれと同様に現れた。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後１週間では、claudin-５発現のレベルが動物のコントロール群のそれと同様であった。全ブロットは、少なくとも３つの別々の実験を表したものである（図１Ａ）。
【０１７８】
claudin-５ ｍＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定し、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間に有意な減少を示した。この非常に有意な減少は後の時点で観察されず、claudin-５
ｍＲＮＡのレベルが非標的化コントロールｓｉＲＮＡに関して９５％まで抑制された（図１Ｂ）。注射後２４，４８，７２時間及び１週間におけるclaudin-５
ｍＲＮＡのレベルは、前記コントロール群において観察されたそれと同様であった（図１Ｂ）。
【０１７９】
claudin-５発現及び局所化は脳毛細血管内皮細胞においてclaudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後に変容する
脳毛細血管内皮細胞のＴＪにおけるclaudin-５の発現レベルは、claudin-５発現の抑制後に劇的に変化した。図２に示すように、脳の微小血管におけるclaudin-５発現及び局所化の免疫組織化学分析は、注射後の全時点で非注射、ＰＢＳ注射、及び非標的化コントロール（ロドプシン）マウスのＢＢＢの内皮細胞の周辺部における線形かつ顕著な染色パターンを示した。
【０１８０】
claudin-５発現は、非注射、ＰＢＳ注射、及び非標的化ｓｉＲＮＡ（ロドプシン）注射のコントロール群の微小血管を覆う内皮細胞の周辺部において線形かつ強かった。しかしながら、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後２４時間では、この染色パターンがそれほど強くなく現れ、かつ注射後４８時間までに、脳全体に亘って脳毛細血管内皮細胞の周辺部におけるclaudin-５発現の存在に、非注射、ＰＢＳ注射、又は非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、著しい低下があった。注射後７２時間に、claudin-５発現は以前として減衰していたが、線形の染色パターンは凍結切片において明らかであった（図２）。
【０１８１】
これらの結果は、少なくとも５つの別個の実験の典型である。
【０１８２】
claudin-５
ｓｉＲＮＡがＢＢＢにおける透過性を増進する
図５は、ビオチン化トレーサー分子の拡散による血液脳関門の評価結果を示している。ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinを、実験条件に晒した後にマウスの左心室を介して灌流させた。蛍光プローブＦＩＴＣに共役化したストレプトアビジンによる凍結切片のインキュベーションで、ＢＢＢの完全性をコントロール群（非注射、ＰＢＳ注射及び非標的化ｓｉＲＮＡ）の微小血管内における緑色蛍光として観察した。しかしながら、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間に、検出した蛍光が、同じ時点における前記コントロール群と対照して、拡散しかつ微小血管の外側にあることを観察した。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後４８時間に、ビオチン化分子の拡散は脳実質において豊富であったが、この透過性はｓｉＲＮＡの送達後７２時間に、同じ時点の前記コントロール群と比較したとき、以前として明確であった。claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後１週間のマウスにおいて、第一アミン反応性ビオチン化試薬が５分間の拡散後に脳実質に沈着しなかったことを観察した。ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の微小血管に残っていることが無傷のＢＢＢによって観察された。
【０１８３】
全トレーサー実験をマウスにおいて少なくとも５回繰り返した。
【０１８４】
要約すれば、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡを脳毛細血管内皮細胞に送達すると、ビオチン化小分子（４４３Ｄａ）に対する透過性の上昇が２４時間後に観察された。このＢＢＢを横切る分子の通過が注射後４８時間に非常に顕著になり、多量のＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の実質組織に浸透した。このＢＢＢを横切る分子の通過は、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後７２時間において以前として明確であったが、注射後１週間にＢＢＢ弱体化の証拠は無く、ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の微小血管内に残っていることを示した（図５）。
【０１８５】
図６は、ビオチン化トレーサー分子の拡散による血液脳関門の完全性の評価の結果を高倍率で示している。claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間における第一アミン反応性ビオチン化試薬（４４３Ｄａ）の５分間の拡散で、非注射、ＰＢＳ注射及び非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、前記分子の脳の実質内への浸透が生じたことを観察した。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後１週間に、ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の微小血管内に残って、実質内に沈着していないことを観察した。
【０１８６】
要約すれば、claudin-５ ｓｉＲＮＡの注射後１週間に、ＢＢＢが、ｓｉＲＮＡの注射後４８時間には非常に明確に示されたＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinの通過を不可能していることは、海馬の歯状回領域における高倍率での脳凍結切片の分析（識別を簡単にするため）に基づいて、明らかであった（図６）。
【０１８７】
claudin-５
ｓｉＲＮＡが６５２ダルトンの分子に対するＢＢＢ及びＢＲＢにおける透過性の増進を生じる
興味深いことに、核染料Hoechst
Ｈ３３３４２（５６２ダルトン）及びＦＩＴＣ標的デキストランＦＤ−４（４４００ダルトン）の拡散で、Hoechstの溢出がclaudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間までは観察されたが、この溢出が、ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinとは異なり、ｓｉＲＮＡ送達後７２時間には明確でなく、５６２ダルトンの分子に対するバリアー完全性の回復を示唆し、ＢＢＢの開放が時間依存型でサイズ選択的であることを意味している。Hoechst Ｈ３３３４２染料の脳微小血管からの溢出は、実質における周辺の神経細胞及びグリア細胞の核染色によって証明された。ＦＤ−４は脳血管構造の微小血管内に残り、ｓｉＲＮＡ注射後の全時点で溢出は明らかでなかった（図６Ｂ）。更に、網膜冷凍切片の分析で、本願発明者らは、Hoechst Ｈ３３３４２が網膜微小血管から溢出し、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間まで網膜の内網状層（ＩＮＬ）及び外網状層（ＯＰＬ）を染色していることを観察した（図６Ａ）。
【０１８８】
ＭＲＩ分析はclaudin-５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間にＢＢＢ完全性の減損を示した
図７Ａは、血液脳関門の完全性を評価する注射後のＭＲＩスキャンの結果を示している。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡを用いて、claudin-５転写物のアブレーション後のマウスのＢＢＢ完全性を確認した。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後４８時間に、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＢＢＢを通過しかつ脳の実質組織に沈着したことを観察した。前記図面の左側の画像はＧｄ−ＤＴＰＡの注射前のマウス脳の造影コントラストであり、右側の画像はＧｄ−ＤＴＰＡの注射後のマウス脳の造影コントラストである。前記画像は、脳の腹面から背面に移動して冠状断像に撮影したもので、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間におけるＧｄ−ＤＴＰＡ（７４２Ｄａ）の実質への有意な沈着を表している。
【０１８９】
この造影剤の浸透は、非注射、ＰＢＳ注射又は非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスでは存在せず、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間又は１週間のマウスにも存在しなかった。
【０１９０】
要約すれば、Ｇｄ−ＤＴＰＡの脳実質組織内への浸透は、非注射、ＰＢＳ注射及び非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、広範で強い造影コントラストとして観察され、サイズで７４２Ｄａの分子の通過を可能にする程度にＢＢＢが弱体化していることを示していた。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後７２時間及び１週間のマウスについて行ったＭＲＩスキャンは、実質組織にＧｄ−ＤＴＰＡの沈着が無い無傷のバリアーを示し、このＢＢＢの崩壊が一時的な事象であることを強調していた（図７Ａ）。
【０１９１】
結論
実施例１に示したように、脳微小血管系の内皮細胞へのｓｉＲＮＡの送達のハイドロダイナミック方法は、claudin-５発現を抑制するのに非常に有効である（図１Ａ及び図１Ｂ）。この送達方法は、ほとんど害を与えずかつマウスに十分な耐性があった。ウェスタン法のデータは、claudin-５発現抑制がｓｉＲＮＡの送達後４８時間に最大となり、claudin-５の発現レベルが注射後７２時間から１週間の間に正常に戻ることを示した。このように現在は、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡを用いたＢＢＢの可逆的なＲＮＡｉ仲介開放が可能である。
【０１９２】
次に、ＢＢＢが、claudin-５ノックアウトマウスと同様に、claudin-５発現を抑制したときに小分子に対して弱体化されたかどうかを測定した。脳微小血管系の内皮細胞の周辺部において、claudin-５のレベルは、使用した全コントロール群の免疫組織化学分析で強くかつ「線形状」であることを示した。しかしながら、claudin-５を標的としたとき、この線形に現れた発現が不連続かつばらばらになり、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後４８時間において劇的に低下するように現れた（図２）。更に、ビオチン化ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinによる５分間のマウスの灌流で、バリアー機能の有意な弱体化が、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後７２時間までは観察された。ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinは、分子量が４４３Ｄａであり、コントロール群で観察されたようにＴＪが無傷である場合、通常はＢＢＢを通過しない。興味深いことに、この分子は、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後１週間にはもはやＢＢＢを通過せず、このＢＢＢ機能の弱体化が、リアルタイムＰＣＲ及びウェスタン法の分析に矛盾することなく、一時的で可逆的なプロセスであることを示唆している。
【０１９３】
この研究の間、これらのマウスに顕著な又は目に付く行動の変化は無かったが、脳のビブラトーム切片及び凍結切片双方の肉眼組織学的検査は、全ての実験条件下で正常に現れた。
【０１９４】
claudin-５ノックアウトマウスと同様に、前記ＭＲＩ造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡもまた、ｓｉＲＮＡ注射後にＢＢＢを横切りかつ脳の実質組織に沈着することが分かった。実際、非常に大量のＧｄ−ＤＴＰＡがclaudin-５
ｓｉＲＮＡの送達後４８時間に脳に沈着した。この７４２Ｄａの分子に対するＢＢＢの崩壊は、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間及び１週間においてＧｄ−ＤＴＰＡの沈着が全く現れなかったことから、一時的な事象であった。これらの結果の有意性は、一時的な事象であることと同様に、４４３Ｄａの分子がｓｉＲＮＡの送達後７２時間にＢＢＢを横断したのに対し、同じ時点で７４２Ｄａの分子はそのようにできず（図７Ａ）、５６２Ｄａの分子はｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間にＢＢＢを横断したが、４４００Ｄａの分子はそのようにできなかった（図６Ａ及び図６Ｂ）ことが観察されたことで証明されるように、claudin-５の抑制がバリアーの透過性にサイズ選択的な変化を生じさせているように現れたことであった。
【０１９５】
ｓｉＲＮＡが尾静脈を介して投与され、かつclaudin-５が肺及び心臓の微小血管の内皮細胞に発現するという事実を考慮すると、本願発明者らは、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡが肝臓、肺、腎臓又は心臓の内皮細胞形態学に悪影響を与えるかどうか評価したいと考えた。これら器官のそれぞれの凍結切片を、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後の全時点でかつ適当なコントロールを組み入れて準備した。切片を、無傷の内皮細胞に結合するＨＲＰ標識Griffonia simplicifoliaイソレクチンＢ４で染色し、内皮細胞形態学が、コントロール群と比較したとき、ｓｉＲＮＡの注射後に全時点でかつ全部の主要器官で同様に現れた（図９〜図１２）ことを示した。脳及び眼以外の器官におけるclaudin-５の役割が十分には特徴付けられていないが、それがこれら他の器官に関連したタイト結合のサイズ選択的な特性を維持する上で根本的なことではないように見えることに注意することが重要である。
【０１９６】
最後に、今ではＢＢＢ及びＢＲＢの内皮細胞にｓｉＲＮＡ分子を全身送達することが可能である。ＴＪタンパク質claudin-５を標的とした抑制が、バリアーの細胞間透過性を一時的かつサイズ選択的に増加させ、これが、さもなければ脳から排除されていたであろう分子の送達を可能にすることがてきる。
【０１９７】
実施例２：甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）の血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ったclaudin-５抑制マウスへの送達
材料及び方法
甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）（Sigma Aldirich、アイルランド）
ＴＲＨは、顕著な神経保護作用を有するものとして提案した。これはまた、ラットに投与したとき、「wet dog shake」（全身の身震い）という行動出力を引き起こす。しかしながら、ＴＲＨは、その不安定性及びその結果である短い作用の持続時間、並びにＢＢＢを横切る透過が遅いことを含むいくつかの欠点を有する。
【０１９８】
ＴＲＨのclaudin-５抑制マウスへの送達
実施例１のプロトコルに従って、一時的にclaudin-５抑制したマウスを生産した。
【０１９９】
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡの送達後４８時間に、２０ｍｇ／ｋｇの甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）を含む溶液２００μｌをclaudin-５抑制マウスに注射した。ＴＲＨを尾静脈に注射しかつ即座に、マウスの行動出力を、それらを透明なPerspex（商品名）箱内で撮影することによって評価した。
【０２００】
結果及び結論
図８に示したように、claudin-１タンパク質のアブレーション後、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスがＴＲＨ２０ｍｇ／ｋｇの投与で動けない状態にある時間の長さの顕著な変化を観察した。
【０２０１】
この行動出力は、非標的化コントロールマウスにおいて観察された行動とは有意に異なり、ＢＢＢが弱まったときにＴＲＨの送達が有意に増進されたことを明確に示唆した。
【０２０２】
これらの結果は、実施例１のプロトコルを用いてＢＢＢを開放して、以前は可能でなかった成分のＢＢＢへの送達を可能にできることを示している。これらの結果は、ＢＢＢが制御されたサイズ選択的な手法で可逆的かつ一時的に開いたとき、ＴＲＨ（３５９．５Ｄａ）の送達が有意に増進したことを明確に示唆している。
【０２０３】
実施例３
claudin-１を標的としたｓｉＲＮＡの全身ハイドロダイナミック尾静脈デリバリーを用いたＣ５７／ＢＬ６マウスの血液脳関門におけるclaudin-１発現の生体内抑制
材料
claudin-１を標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
【０２０４】
【化８】
【０２０５】
方法
使用したプロトコルは、実施例１で使用したプロトコルと同一であった。
【０２０６】
結果及び結論
結果を図３Ａ、図２３及び図２４に示す。
【０２０７】
この実施例は、claudin-１に向けたｓｉＲＮＡがＢＢＢにおける細胞間透過性を５６２ダルトンの分子に対して増加させるが、４４００ダルトンの分子に対してはそうでないことを示している。claudin-１の抑制は、claudin-５が抑制されたときに観察されたそれと同様にしてＢＢＢのサイズ選択的に開放させるように現れている。
【０２０８】
実施例４
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの全身ハイドロダイナミック尾静脈デリバリーを用いたＣ５７／ＢＬ６マウスの血液脳関門におけるoccludin発現の生体内抑制
材料
occludinを標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
【０２０９】
【化９】
【０２１０】
方法
使用したプロトコルは、実施例１で使用したプロトコルと同一であった。
【０２１１】
結果及び結論
結果を図３Ｂ、図１９、図２０、図２１及び図２２に示す。
【０２１２】
この実施例は、occludinに向けたｓｉＲＮＡが、７０，０００ダルトン超の分子に対して、これが大凡アルブミンの分子量であることから、ＢＢＢにおける細胞間透過性を増加させることを示している。しかしながら、ＢＢＢにおけるoccludinの抑制が、より大きなサイズ篩い分け限界を生み出す。アルブミンの沈着はoccludin ｓｉＲＮＡ３及び４の注射後２４時間に発生したが、血液中の免疫グロブリン（ＩｇＧ）の溢出は無かったことが観察された。ＩｇＧは、分子量が約１２０，０００ダルトンである。
【０２１３】
材料
claudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
【０２１４】
【化１０】
【０２１５】
方法
使用したプロトコルは、実施例１で使用したプロトコルと同一であった。
【０２１６】
結果及び結論
claudin-１２のレベルは、claudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後に減少することを示した（図１２）。claudin-１２の染色パターンは、非標的化コントロールｓｉＲＮＡの注射後４８時間において脳微小血管系に関連していることが観察された。しかしながら、claudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間に、脳の微小血管における発現のレベルが、試験した両方のｓｉＲＮＡ（即ち、ＣＬＤＮ１２
ｓｉＲＮＡ（３）及びＣＬＤＮ１２
ｓｉＲＮＡ（４））において減少することを示した。
【０２１７】
非標的化ｓｉＲＮＡ又はclaudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後に、マウスは、左心室を通して、ＦＩＴＣ−デキストラン−４及びHoechst３３３４２（５６２Ｄａ）を含む溶液を灌流させた。ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後に、血管外の核の染色により明示されるように、微小血管系からHoechstの溢出があったことが観察された。ＦＴ−４は、非標的化ｓｉＲＮＡ及びｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後の双方において微小血管内に観察された（図３１）。
【０２１８】
実施例６
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間のＧｄ−ＤＴＰＡ
材料及び方法
実施例１のプロトコルに従って、一時的にclaudin-５抑制したマウスを生産した。
【０２１９】
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡの送達後４８時間に、Ｇｄ−ＤＴＰＡを含む溶液をclaudin-５抑制マウスに注射した。Ｇｄ−ＤＴＰＡを尾静脈に注射して、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＢＢＢを透過するかどうかを評価した。ｓｉＲＮＡの注射後にかつ適当なコントロールを用いて、７４２ダルトンの分子に対するＢＢＢ完全性をＭＲＩによって、アクティブ磁気シールドＵＳＲ
Magnetを有する小げっ歯類専用Bruker BioSpec70/30（即ち、７Ｔ、ボア径３０ｃｍ）を用いて評価した。マウスをイソフルオランで麻酔し、生理学的にモニターし（ＥＣＧ、呼吸及び温度）、動物体温を３７℃に維持するためのシステムを組み込んだＭＲＩ互換型支持クレードル上に置いた。次に、前記クレードルをＭＲＩスキャナー内に配置した。正確な配置は、最初の高速パイロット画像を得ることによって確保され、次にこれを用いて正しいジオメトリーが後の全てのＭＲＩ実験においてスキャンされる。ＭＲＩスキャナー内に挿入すると、脳の高解像度解剖画像が得られた（平面１００μｍ及び交差面５００μｍ空間分解能）。次にＢＢＢ完全性を、尾静脈を介して投与したＧｄ−ＤＴＰＡ（ガドリニウム・ジエチレン−トリアミン五酢酸）の０．１ｍＭ／Ｌ／ｋｇボーラスの注射前後において高解像度Ｔ1強調ＭＲ画像に可視化した。Ｇｄ−ＤＴＰＡの注射後、３分Ｔ1強調スキャンの繰り返しを３０分間に亘って行ったが、図示した画像は、この３０分間の最後のスキャンの典型的なものを表している。小脳、海馬及び皮質の結合領域の全濃度測定結果の統計学的分析をＡＮＯＶＡを用いて行い、有意をＰ値≦０．０５により示したが、結果は、図表と脳内のＧｄ−ＤＴＰＡ沈着の速度を示す定量的画像との両方で表している。全部のＭＲＩスキャンを各実験処置から２匹のマウスについて実行した。
【０２２０】
結果
図２６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのデリバリー後４８時間におけるマウス脳の海馬領域のＴ１強調ＭＲＩ画像を示しており、Ｇｄ−ＤＴＰＡが脳微小血管から溢出している脳内のコントラストが強調して明確に示されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡは７４２ダルトンの分子量を有し、その脳内への透過は、ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間においてのみ観察された。
【０２２１】
図２７は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの大容量尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内における血流量及び血液量に関係するＭＲＩ情報を示している。このデータによって、２つの事柄に関する情報、即ち平均通過時間（ＭＴＴ）及び毛細血管通過時間（ＣＴＴ）が得られる。ＭＴＴは、ラベリングしたスピンがラベリング面（頸動脈の画像スライスから１ｃｍまで）から画像スライスまで移動するのに要する時間を表している。
【０２２２】
これは曲線の１次モーメント又は平均から計算される。曲線の二次モーメント（分散）から、ラベリングしたスピンが毛細血管床から組織への変換により画像スライス全体に分散されるのに要する時間であるＣＴＴが得られる。群毎に８匹までの動物について、脳の主要な血管又は毛細血管内の血流に有意な差は見ていないが、これは、claudin-５
ｓｉＲＮＡを脳の微小血管内皮細胞に送達するのに大容量の注射が必要なことを考えると、相当有望である。
【０２２３】
図２８は、試験した各実験群について実験データに適合させた脳血流量及び脳血液量の理論的モデルを示している。これらは、各グループについて殆ど同じであり、図２７に示した棒グラフの結果に一致している。
【０２２４】
結論
最後に、これらの結果は、脳の大きな血管又は微小血管系における血流量又は血液量の差を全く観察していないことを示しており、脳浮腫の場合には、claudin-５
ｓｉＲＮＡが実際に、脳の外傷の部位における水分拡散の速度の増加を可能にできることを示唆している。
【０２２５】
実施例７
非標的化又はclaudin-５ ｓｉＲＮＡを受け取った後２４時間又は４８時間のマウスの脳内における水分拡散
材料及び方法
実施例１のプロトコルに従って、一時的にclaudin-５抑制したマウスを生産した。
【０２２６】
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間に、マウスをイソフルオランで麻酔し、生理学的にモニターし（ＥＣＧ、呼吸及び温度）、動物体温を３７℃に維持するためのシステムを組み込んだＭＲＩ互換型支持クレードル上に置いた。次に、前記クレードルをＭＲＩスキャナー内に配置した。正確な配置は、最初の高速パイロット画像を得ることによって確保され、次にこれを用いて正しいジオメトリーが後の全てのＭＲＩ実験においてスキャンされる。ＭＲＩスキャナー内に挿入すると、脳の高解像度解剖画像が得られた（平面１００μｍ及び交差面５００μｍ空間分解能）。水分拡散のスキャンに引き続き着手した。広範なｂ値について画像を得るために、拡散勾配（Stejskal-Taner勾配）を有するスピンエコーＥＰＩ画像シーケンスのような標準の拡散イメージングシーケンスを用いた。このようにして、血管コンパートメント内及び脳実質組織内における技術の効果を比較することができる。全実験は、最大磁気勾配強度４００ｍＴ／ｍの７Ｔ
Ｂｒｕｋｅｒ小口径システムで行った。画像処理及びＡＤＣの計算は、ＩＤＬを用いて行った。
【０２２７】
結果
図２９は、Ｂ値（Ｘ軸）とその上にプロットしたＭＲＩ信号強度（Ｙ軸）を示しており、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内の水分拡散の速度に変化がないこと示している。この脳から血液への水分の拡散が一定の速度であることは、一次的なＢＢＢの開放それ自体がマウス脳内における水分の拡散になんら強い影響を与えていないことを示唆している。
【０２２８】
最後に、図３０に示す結果は、非標的化ｓｉＲＮＡ又はclaudin-５ ｓｉＲＮＡを受け取った後２４時間又は４８時間のマウスの脳内における水分拡散の速度を示している。基本的に、これらの実験条件下でいずれのマウスも拡散に変化は無い。これは別の重要な観察結果であり、かつ実施例６のように、脳浮腫の場合には、claudin-５
ｓｉＲＮＡが実際に、脳の外傷の部位における水分拡散の速度の増加を可能にできることをも示唆している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の一時的、可逆的かつ制御された開放のための、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生産することになるＲＮＡｉ誘導ベクターのような、タイト結合タンパク質を標的として血液脳関門及び／又は血液網膜関門を開放するＲＮＡｉ誘導剤を用いた方法及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、栄養及び酸素を必要とすると同時にこの敏感な組織への循環により送達され得る他の潜在的に有害な因子、例えばウイルスもしくは細菌粒子、またはアナフィラトキシン（免疫システムの副産物として生成される潜在的に破壊的な粒子）からの保護を必要とするエネルギー要求器官である。このため、脳に血液を供給する微細な毛細血管（血液脳関門（ＢＢＢ））の壁を覆うそれらの細胞は、その名前が意味するように、脳の微小血管系の微細な毛細血管を覆う隣接する内皮細胞間の空間を殆どゼロに小さくし、緊密なシールを形成する「タイト結合」を発生させている。しかしながら、酸素は依然としてこれらの細胞から拡散することができ、かつ他の必須物質は、内皮細胞の膜内にある特殊なトランスポーターにより脳に送達され得る。
【０００３】
血液脳関門を破壊したり、薬理的物質が脳毛細血管の内皮細胞を横切ることができるデリバリーシステムを設計するために、多くの試みがなされている（Pardridge et al., 2005）。しかしながら、血液脳関門の完全な破壊は、脳の機能にとって悲惨な結果をもたらすことになる。従来の試みは、タイト結合（ＴＪ）の構造を包括的に理解することなく、ＴＪタンパク質をエンコードする転写物を除去し得る技術無しで、そのような物質の脳または網膜毛細血管の内皮細胞への全身送達の手段無しで行われてきた（Miller, 2002）。
【０００４】
最近では、「ミクロのトロイの木馬」と呼ばれる遺伝子組み換えタンパク質が文献に記載されており、その称するところでは、内在の受容体介在による輸送プロセスを経てＢＢＢを横切るとされている（Pardridge et al., 2006）。２００７年には、修正されているがやはり類似の方法を使用し、レンチウイルスベクター系を用い、アポリポタンパク質Ｂのその受容体「低比重リポタンパク質受容体」（ＬＤＬＲ）への結合ドメインを活用したタンパク質のＢＢＢを横切る標的送達が報告されている。この報告は、経細胞通路を介したタンパク質の送達が実行可能であることを証明しているが、これらの方法は依然として、ＣＮＳへの送達による組み換えられた結合部位からのペプチド分解を目的としている（Spencer BJ and Verma M, 2007）。ＢＢＢを横切る分子の受容体介在の経細胞送達は、更なる研究にとって相変わらず面白い方法であるが、細胞間通路を含む利用可能な他の方法が存在する。
【０００５】
一般に、ＢＢＢの内皮細胞を横切る成分の輸送は、３つの経路を介して起こり得る。即ち、上述したように特別なトランスポーターが介在し得る経細胞経路、小胞輸送、又は隣接する内皮細胞間の輸送を可能にする細胞間通路である（Reese and Karnovsky, 1967; Edwards, 2001; Wolburg and Lippoldt, 2002）。脳の毛細血管は非常に低流量の液相トランスサイトーシスを呈し、ＢＢＢにおける個々の細胞間の細胞間経路が、体内の他のあらゆる微小血管におけるよりも相当緊密なＴＪにより閉じられている。従って、ＴＪは、ＢＢＢに関連する低透過率特性の重要な要素を代表するものである（Matter K and Balda MS, 2003）。
【０００６】
ＢＢＢに関連するＴＪは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、接合部接着分子、（ＪＡＭ）、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５、−１２及びＺＯ−１、−２、−３を含む細胞内及び膜貫通タンパク質の複合体から構成される（Fanning et al., 1998; Zahraoui et al., 2000）。
【０００７】
ｃｌａｕｄｉｎは、ＢＢＢ機能において重要な役割を果たす。ｃｌａｕｄｉｎファミリーの約２０のメンバーについても文献に記載されており、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５、−１２がＢＢＢのＴＪにおいて優勢である（Bazzoni, 2006）。ｃｌａｕｄｉｎは、ｏｃｃｌｕｄｉｎのように、内皮細胞膜を４度架橋して、それらのＣ末端を介してＺＯ−１と相互作用する（Kausalya et al., 2001）。繊維芽細胞におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ及びｃｌａｕｄｉｎ−１の同時発現は、ＴＪ上の鎖において細胞の周辺部に両タンパク質の共存を生じることを示している（Furuse et al., 1998）。メイデンダービー犬腎臓（ＭＤＣＫ）細胞におけるｃｌａｕｄｉｎ−１の過剰発現は、経細胞電気抵抗（ＴＥＲ）を増加させ、単層における蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストランの流れを減少させることが示されている（Inai et al., 1999）。
【０００８】
国際公開ＷＯ０２／０１４４９９（Immunex）は、ｃｌａｕｄｉｎファミリーの新たなメンバー、ｃｌａｕｄｉｎ−１９、−２１、−２２に関する。この用法は、これらｃｌａｕｄｉｎの細胞外結合ドメインを標的とするポリペプチドフラグメントの生成に関するものであるが、組み換えタンパク質の生産についても記述している。
【０００９】
ｃｌａｕｄｉｎ−５は、マウスにおいてノックアウトしたときに、８００Ｄａ未満の分子に対してＢＢＢをサイズ選択的に緩める４回膜貫通タンパク質である。ｃｌａｕｄｉｎ−５は、内皮細胞特異的であると考えられる（Turksen K and Troy TC, 2004）。ｃｌａｕｄｉｎ５−／−マウスが報告されており、ＢＢＢはこれらの動物において弱められる。一連のトレーサー分子実験及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を通じて、ｃｌａｕｄｉｎ−５の除去が、約８００Ｄａまでの分子に対してバリアーを透過可能にすることにより、バリアーの機能を弱めつつ、それより大きな分子に対してそのまま不透過であり、出血又は浮腫の形跡を全く示さないバリアーを形成できることが分かった（Nitta et al., 2003）。しかしながら、これらのノックアウトマウスは死亡率が非常に高く、数時間しか生存しなかった。そのようなことで、これらのノックアウトマウスはＢＢＢの生理学を研究するのに用いることはできず、別のモデルが必要である。
【００１０】
タイト結合を開いて、粘膜細胞間輸送を増進させる別のシステムが開発されている。例えば、国際公開ＷＯ０４／００３１４５(Nastech)及び国際公開ＷＯ０５／０５８３６２(Nastech)はいずれも、有効成分の必要な生物学的利用能を維持しつつ、注射に対する別の投与経路を提供する必要性を扱っている。国際公開ＷＯ０４／００３１４５(Nastech)は、生物学的活性剤、粘膜細胞間輸送を可逆的に増進し得るｃｌａｕｄｉｎ−５を標的とする透過増進剤の粘膜送達に関する。これらの透過増進剤は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の細胞外結合ドメインに対して作られたペプチドであり、これはこのタンパク質の隣接する細胞の類似のタンパク質との同型相互作用を仲介する。国際公開ＷＯ０５／０５８３６２(Nastech)は、鼻内のタイト結合を開くための方法に関し、これも同様にＪＡＭ１、ｃｌａｕｄｉｎ−４及びｏｃｃｌｕｄｉｎに対する広範な拮抗体の粘膜投与から構成される。
【００１１】
しかしながら、これらの進歩にも拘わらず、多くの薬剤は、ＢＢＢを横切ることができないので、依然として効果がない。そこで、ＢＢＢを横切る薬剤送達を増進するように操作し得る分子メカニズムを確認するために、脳毛細血管の内皮細胞及び網膜細胞のＴＪを理解することを目的とする多くの努力が行われている。
【００１２】
ＢＢＢを制御して開くことは、実現できれば、以前は不可能であった脳への薬剤の実験的送達の方法を提供し、かつ血液脳関門及び／又は血液網膜関門に関連する多くの状態の治療への扉を開くことができる。
【００１３】
更に、ＢＢＢを制御して開くことは、神経変性疾患及び精神神経疾患の実験動物モデルの確立を可能にし、かつ現在は有効な治療の見込みが殆ど又は全くない範囲の状態で治療剤を、例えば神経変性状態の範囲でＣＮＳへの神経機能を調節する薬剤を制御して送達するための道を作ることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、これらの問題の少なくとも一部を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の側面によれば、血液脳関門を一時的、可逆的かつサイズ選択的に開放するための方法であって、血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の一時的、可逆的かつ制御された開放のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用からなる方法が提供される。
【００１６】
相補的な二重鎖ＲＮＡのサイレンシング効果は、最初にRichard Joergensenにより１９９０年にペチュニアで観察され、共抑制と呼ばれた。ＲＮＡサイレンシングは次に、Andrew Fire及びその同僚によってＣエレガンス（線虫）で確認され、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の用語が生み出された。この遺伝子サイレンシング現象はその後に、多くの真核細胞内に高度に保存されることが分かった。このように、ＲＮＡｉは、哺乳類細胞及び動物双方において有効であることが示されている。
【００１７】
ｓｉＲＮＡの作用を受けたＲＮＡｉの重要な特徴は、ＲＮＡの二重鎖という特徴と、小さなオーバーハング及びＲＮＡの介在ループを有するｄｓＲＮＡが標的遺伝子の抑制をもたらすことが示されているにも拘わらず、一本鎖ＲＮＡの大きな突出（オーバーハング）部分が存在しないことである。本明細書では、本明細書中の用語ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡｉは互いに交換可能であるものと理解される。更に、当該技術分野で周知のように、ＲＮＡｉ技術はｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ誘導剤により実行することができる。本明細書では、一般にｓｉＲＮＡについて言及しているが、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はその細胞内での存在が標的転写物を標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターを含むあらゆる他のＲＮＡ誘導剤を用い得ることが理解される。
【００１８】
ＲＮＡ干渉は多段階プロセスであり、一般に標的遺伝子に対して配列が相同な二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により活性化される。長いｄｓＲＮＡを器官の細胞内に導入することは、相同遺伝子転写物の配列特異的分解に繋がる。長いｄｓＲＮＡ分子は、Dicerとして知られる内在のリボヌクレアーゼの作用により小さな（例えば、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ））干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に変形される。ｓｉＲＮＡ分子は、ヘリカーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を有する、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体と結合する。ヘリカーゼ活性は、ＲＮＡ分子の二重鎖を巻き戻し、アンチセンス鎖が標的ＲＮＡ分子と結合することを可能にする。エンドヌクレアーゼ活性は、アンチセンス鎖が結合した部位で標的ＲＮＡを活性分解する。従って、ＲＮＡｉは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡ分子と結合して、標的ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼをリクルートするので、アンチセンス作用メカニズムである。
【００１９】
本発明では、「ＲＮＡｉ誘導剤」又は「ＲＮＡｉ分子」を使用するが、これには例えば、標的転写物を標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又はその細胞内での存在が標的転写物を標的とするｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡを生産することになるＲＮＡｉ誘導ベクターが含まれる。このようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、標的転写物の領域と相補的なＲＮＡの部分を有する。基本的に、「ＲＮＡｉ誘導剤」又は「ＲＮＡｉ分子」は、ＲＮＡ干渉を介して標的タイト結合タンパク質の発現を下方制御する。好ましくは、タイト結合タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用する。
【００２０】
特に、前記方法は、タイト結合タンパク質を標的とする有効量のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの対象への送達を含む。ｓｉＲＮＡのような有効量のＲＮＡｉ誘導剤を用いてＢＢＢを開き、目的の疾患を治療する活性剤の通過を可能にすることが理解される。好ましくは、送達が全身経路を介して行われる。
【００２１】
この本発明の側面によれば、前記方法は、脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞において血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一次的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、理想的には１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞を通して脳血管関門を横切る透過を可能にする。この範囲で血液バリアーを開くことは、一般に１０〜１５ｋＤＡ、好ましくは１３ｋＤａの最大分子量を有するｓｉＲＮＡ及び／又は一般に約２ｋＤＡ未満、好ましくは１ｋＤａ以下の分子量を有する低分子量の薬剤が血液脳関門を横切ることを可能にする。当然ながら、１５ｋＤａより大きい分子の分子が血液脳関門を横切ることができるように血液脳関門を開放し得ることが理解される。
【００２２】
理想的には、前記方法は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのようなＲＮＡｉ誘導剤の対象への全身ハイドロダイナミックデリバリーを含む。とは言え、非ハイドロダイナミック全身デリバリー法を用いることができる。
【００２３】
ＲＮＡｉ誘導剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどを含む）の送達に適した他の送達方法も使用することができる。例えば、ＲＮＡｉ誘導剤の幾つかの送達剤は、次のカチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、脂質、リポゾーム及び／又は非カチオン性ポリマーからなる非限定的な群から選択される。ウイルスベクター送達システムも使用することができる。例えば、別の送達経路には、ＲＮＡｉ誘導剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む）、及び組み換えＤＮＡ分子を生じることになる細胞の変換前の遺伝子構築物のアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）の直接送達が含まれる。これは、遺伝子構築物の転写を生じ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡだけでなく、ａｓＲＮＡのようなＲＮＡｉ誘導剤をエンコードし、細胞及び器官内にＲＮＡｉ誘導剤の一時的かつ安定な発現を提供する。例えば、このような別の送達経路は、タイト結合タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡ（又はｓｈＲＮＡ）をエンコードするヌクレオチド配列からなるレンチウイルスベクターの使用を含むことができる。このようなレンチウイルスベクターは、ウイルス粒子内に含まれ得るものである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も使用することができ、これらの送達ビヒクルとしての使用は詳細に後述する。
【００２４】
本発明の第二の側面によれば、本発明によるＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの送達が、細胞間通路の作用、ＢＢＢの生理学を研究し、かつ以前はＢＢＢを横切ることはできなかったがＢＢＢを横切る薬剤の作用を試験するための実験的モデルの生成において有用である。
【００２５】
本発明の第三の側面によれば、本発明は、血液脳関門又は血液網膜関門が関係する多くの疾患又は疾病の治療に適応可能である。
【００２６】
本発明の第四の側面によれば、タイト結合タンパク質を標的として、血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放を生じる、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどであるＲＮＡｉ誘導剤と、明確な疾病又は疾患の治療のための活性剤とからなる、好ましくは全身送達に適した医薬組成物が提供される。理想的には、前記活性剤は生物学的に活性な治療薬である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質及びｍＲＮＡのレベルの定量化の結果を示す。
【図２】図２は、脳の微小血管におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の発現及び局所化の免疫組織化学分析の結果を示す。
【図３】図３は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制後のｃｌａｕｄｉｎ−１、Ｔｉｅ−２及びｏｃｃｌｕｄｉｎの発現の結果を示す。
【図４】図４は、脳の凍結切片におけるｃｌａｕｄｉｎ−１及びｃｌａｕｄｉｎ−５の２重免疫染色の結果を示す。
【図５】図５は、４４３ダルトンの分子に対するＢＢＢ完全性の評価の結果を示す。
【図６】図６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間におけるHoechst３３３４２及びＦＤ−４の同時灌流を示す。
【図７】図７Ａは血液脳関門の完全性を生体内で評価する注射後のＭＲＩスキャンの結果を、図７Ｂはｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの全身投与後のマウス脳におけるＭＲＩ画像の濃度分析の結果を、図７Ｃは定量的なＭＲＩ画像の結果を示す。
【図８】図８は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質のアブレーション後のマウスへの２０ｍｇ／ｋｇのＴＲＷの投与の結果を示す。
【図９】図９は、肝臓結切片における内皮細胞の形態学を示す。
【図１０】図１０は、肺の凍結切片における上皮細胞形態学を示す。
【図１１】図１１は腎臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示す。
【図１２】図１２は、心臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示す。
【図１３】図１３は、脳凍結切片におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ発現の免疫組織化学分析を示す。
【図１４】図１４は、ｓｉＲＮＡ注射後の網膜におけるｃｌａｕｄｉｎ−５抑制の結果を示す。
【図１５】図１５は、網膜のフラットマウントにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の結果を示す。
【図１６】図１６は、ｉＢＲＢを横切るＧｄ−ＤＴＰＡ拡散のＭＲＩ分析の結果を示す。
【図１７】図１７は、Hoechst３３３５２（５６２Ｄａ）でのマウスの灌流後の網膜フラットマウントの結果を示す。
【図１８】図１８は、ＩＭＰＤＨ−／−マウスにおけるＧＴＰ注射後のＥＲＧ結果を示す。
【図１９】図１９は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈送達後のｏｃｃｌｕｄｉｎ発現のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図２０】図２０は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後のｏｃｃｌｕｄｉｎ免疫組織化学の結果を示す。
【図２１】図２１は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後のアルブミン免疫組織化学の結果を示す。
【図２２】図２２は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後の脳ビブラトーム切片における免疫グロブリン染色の結果を示す。
【図２３】図２３は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後のｃｌａｕｄｉｎ−１発現のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図２４】図２４は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４時間及び４８時間におけるHoechst（５６２Ｄａ）及びＦＤ−４（４４００Ｄａ）の灌流の結果を示す。
【図２５】図２５はハツカネズミｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡにおいて実験で使用した１種のｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの位置を示す。
【図２６】図２６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのデリバリー後４８時間におけるマウス脳の海馬領域のＴ１強調ＭＲＩ画像を示す。
【図２７】図２７は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの大容量尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内における血流量及び血液量に関係するＭＲＩ情報を示す。
【図２８】図２８は、試験した各実験群について実験データに適合させた脳血流量及び脳血液量の理論的モデルを示す。
【図２９】図２９は、Ｂ値（Ｘ軸）とその上にプロットしたＭＲＩ信号強度（Ｙ軸）を示す。
【図３０】図３０は、ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示す。
【図３１】図３１は、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書において、用語「血液脳関門」又はＢＢＢは、血液脳関門（ＢＢＢ）及び血液網膜関門（ＢＲＢ）の両方を含むものとして使用されている。詳細に上述したように、血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳の微小血管系の微細な毛細血管を覆う隣接する内皮細胞間の隙間を殆どゼロに小さくして、ＢＢＢを横切る栄養素及び酸素の輸送を可能にするが、それと同時に、他の潜在的に有害な物質のＢＢＢを横切る輸送を防止するタイト結合（ＴＪ）を有する。血液網膜関門（ＢＲＢ）は、所定の物質が網膜の組織に入ることを防止するために、緊密に一対に結合される細胞からなる血液眼関門の一部である。血液網膜関門は２つの構成部分、網膜血管内皮及び網膜色素上皮を有し、これらもまたタイト結合（ＴＪ）を有する。脳血管に類似する網膜血管は、内側血液眼関門を維持する。
【００２９】
更に、本明細書に開示される発明は、一般にＲＮＡｉ技術の使用に関する。理想的には、ＲＮＡｉ誘導剤は、標的転写物を標的としたｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又はその細胞内での存在が標的転写物を標的としたｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターを含んで使用される。このようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、標的転写物の領域に相補的な部分を有する。このように、ＲＮＡｉは、特にｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ双方を用いて実施することができる。
【００３０】
本発明のＲＮＡｉ誘導剤は、ｍＲＮＡの翻訳を干渉又は妨害する。このようなＲＮＡｉ誘導剤は、一本鎖又は二重鎖構造とすることができる。好ましくは、二重鎖構造のＲＮＡｉ誘導剤の１本の鎖が、少なくとも標的ｍＲＮＡに相補的な部分配列を有する。阻害性核酸のヌクレオチドは、化学的に修飾されたもの、天然又は人工のものとすることができる。ＲＮＡｉ誘導剤と標的とされたタイト結合標的ｍＲＮＡ間の配列相同性は１００％以下であってよいが、理想的には約５０％以上、一般には９０％以上、より好ましくは少なくとも９８％及び９９％である。ＲＮＡｉ誘導剤と標的ｍＲＮＡ間の配列相同性の割合は、好ましくは細胞質条件下で、ＲＮＡｉ誘導剤、例えば、ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡ間に配列特異的な会合を生じるのに十分なものとすべきであることが理解される。
【００３１】
このようなｓｉＲＮＡは、長さが約２０程度のヌクレオチドの相補性の領域を有する２つのＲＮＡ鎖を有し、更に任意に、１つ又は２つの一本鎖構造のオーバーハング又はループを有する。哺乳動物の細胞では、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡが、インターフェロン応答による非特異的な遺伝子抑制を生じる場合がある。しかしながら、両方の３’末端で突出する２つのヌクレオチドを有する２１ヌクレオチド合成二重鎖ｓｉＲＮＡを導入した細胞は、インターフェロン応答を回避して、配列特異的な遺伝子サイレンシング機能を有効に発揮することが分かっている。しかしながら、合成ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果は一時的なものである。二重鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを介して血液脳関門及び／又は血液網膜関門のタイト結合の発現を下方修正するが、その場合に前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独立して長さが約１８〜約２８ヌクレオチドであり、かつｓｉＲＮＡ分子の１本の鎖が、標的タイト結合タンパク質のＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して標的ＲＮＡの開裂を行うのに十分な相補性を有するヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
ｓｈＲＮＡでは、単一のＲＮＡ鎖が、ステム及びループを有するヘアピン構造を形成し、任意にＲＮＡの５’及び／又は３’部分に１つ又は複数の非対合部分を形成することができる。
【００３３】
別の転写後遺伝子サイレンシングプロセスは、ミクロＲＮＡ即ちｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ翻訳を抑制するｓｓＲＮＡ種によって仲介される。ｓｉＲＮＡのように、ｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼDicerにより２１〜２５ヌクレオチド配列に処理されて配列特異的な
遺伝子サイレンシング複合体を形成するＲＮＡプリカーサーに由来する。
【００３４】
このように、本発明はＲＮＡｉ技術を対象とするものであり、理想的には、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡにより実施することができる。容易に参照できるように、以下の記載ではｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについて言及している。しかしながら、以下の方法にはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ又は他のあらゆるＲＮＡｉ誘導剤を使用できることが理解される。
【００３５】
本発明の第一の側面によれば、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの対象への送達、好ましくは全身送達により、血液脳関門の細胞間通路を可逆的、一時的及び制御されたサイズ選択的に開放するための方法において、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉの使用が提供される。
【００３６】
タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達が、血液脳関門の細胞間通路の制御された、可逆的かつ一時的開放を生じ、理想的には１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を横切る透過を可能にすると、好都合である。理想的には、約１ｋＤａ未満のような低分子量の薬剤の送達が容易になる。
【００３７】
この本発明の側面の特定の実施例によれば、血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的な開放のための方法であって、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達からなり、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合調節ペプチド転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を介して脳血液関門を横切る透過を可能にする方法におけるｓｉＲＮＡの使用が提供される。
【００３８】
タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ誘導剤の使用は、ＢＢＢの可逆的、一時的かつサイズ選択的な開放を達成した最初のものである。このＢＢＢの開放は、以下のものを含む多くの様々な用途を有するが、これらに限定されるものではない。
−条件付きＴＪ調節ペプチドノックアウトマウスの育生により細胞間システムを研究する実験モデルとしての使用。
−広範な医薬生成物の効能を試験する一般的な実験プラットフォームとして条件付きＴＪ調節ペプチドノックアウトマウスを使用すること。
−以前はＢＢＢを透過し得なかった活性剤に対するＢＢＢの透過率を向上させる使用。
−多くの様々なＴＪタンパク質を標的として、ＢＢＢを横断し得る分子サイズの柔軟性を提供すること。
−細胞間通路及び血液脳関門又は血液網膜関門が関連する多くの疾病又は疾患の治療における使用。
【００３９】
以下の記載はｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉ技術に関するものであるが、上述したように、これらの記載はｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ誘導剤を用いたＲＮＡｉ技術に同等に適用可能である。
【００４０】
本願発明者らは、ＢＢＢの細胞間通路の開放が、ｓｉＲＮＡ送達後約２４乃至４８時間で発生することを見出した。タイト結合タンパク質の発現のレベルは、ｓｉＲＮＡ送達後約７２時間で正常に戻り、従ってＢＢＢは、この時間経過後はもはや開放状態ではない。このように、ＲＮＡｉを用いたＢＢＢの開放は一時的かつ可逆的なものである。これが本発明の主な利点であり、ＢＢＢの完全性がｓｉＲＮＡ送達後に完全に復元される。このＢＢＢの完全性を一時的に弱めて小さい分子の脳内への通過を可能にするという特徴が、潜在的に有害で制御されない永久的な手法でＢＢＢを開放する公知の技術に対する本発明の主な利点を提供するものである。
【００４１】
更に、ＢＢＢの開放はサイズ選択的でありかつ制御され、理想的には１５ｋＤａ未満の分子のＢＢＢを横切る透過を可能にする。理想的には、１ｋＤａ未満、好ましくは８００Ｄａ未満の分子が、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を通過してＢＢＢの向こう側へ透過することができる。ＢＢＢのサイズ選択的な開放が、標的とした様々なＴＪタンパク質によって異なるものであり得ることは理解される。例えば、ｏｃｃｌｕｄｉｎが約６０ｋＤａ乃至８０ｋＤａまでの分子の透過を可能にするのに対し、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５、−１２は、約２ｋＤａ以下の分子の透過を可能にする。
【００４２】
理想的には、ＲＮＡｉを効果的にするには、多量のｓｉＲＮＡを対象に投与して、脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞における血液脳関門／血液網膜関門のタイト結合タンパク質転写物を除去／抑制する。好ましくは、送達されるｓｉＲＮＡの量は、対象の体重１μｇ当たりｓｉＲＮＡ約１μｇである。しかしながら、異なる量のｓｉＲＮＡが考えられることは理解される。例えば、マウスを含むげっ歯動物のような小さい哺乳動物については、この量は約５μｇから５０μｇまで少なくすることができる。理想的には、約２０μｇの量が使用される。一般に約７０ｋｇの体重を有する人間のような大型哺乳動物については、注入するべきｓｉＲＮＡの適当な量は、０．０７〜０．１５ｇの範囲であろう。繰り返すが、様々な量のｓｉＲＮＡが考えられる。
【００４３】
好ましくは、送達が、静脈内送達及び頸動脈内送達のような動脈内送達を含む全身送達により行われる。投与は、直接投与又はカテーテルを介して行うことができる。理想的には、ｓｉＲＮＡは全身ハイドロダイナミックデリバリーによって対象に投与される。
【００４４】
ハイドロダイナミックデリバリーは、広範囲の核酸を生体内で組織又は他の器官に送達するのに使用し得る効率的かつ安価な方法である。ハイドロダイナミックデリバリーを首尾良く適用することは、対象の血管構造内にオリゴヌクレオチドを含む大きな水相量を高速で注入することに依存する。
【００４５】
基本的に、本発明による全身ハイドロダイナミックデリバリーは、ｓｉＲＮＡの血管内投与を含む。マウスのようなげっ歯動物では、尾静脈送達を考えることができる。人間又は他の哺乳動物では、頸静脈を介して頸動脈又は心臓に対して直接行う頸動脈内投与が考えられる。人間におけるハイドロダイナミックデリバリーは、大腿静脈におけるラインの挿入後の肝臓門脈を介した投与により行うことも考えられる。特に、人間の脳毛細血管へのｓｉＲＮＡの送達は、潜在的に頸動脈内投与を介して仲介することができる。別の方法では、例えば３００〜４００ｍｌまでの量の高濃度のｓｉＲＮＡを人間の心臓に直接注入することにより、脳毛細血管への送達が増進されることが考えれる。非常に狭いカテーテルを対象の大腿動脈内に挿入し、かつそれを脳底部の一方の頸部動脈内に進ませることにより、投与を行うことができた。この場合、ｓｉＲＮＡはカテーテルを通して投与することができる。
【００４６】
全身ハイドロダイナミックデリバリーによるオリゴヌクレオチド（即ち、ｓｉＲＮＡ）の送達の効率は、組織の血管の容積及び圧力を、従って透過率を増加させることにより向上する。透過率は、次の
−血管内静水圧（物理的）又は浸透圧を増加させること、
−注射流体を高速で送達すること（注射流体を高速で注射すること）、
−大容量の注射を用いること、かつ／又は
−ＴＪタンパク質転写物の抑制後にタイト結合の透過率を増加させること
によって増加させることができる。
【００４７】
好都合なことに、本願発明者らは、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達のためにハイドロダイナミックデリバリーを用いて、脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ得ることを見出した。上述したように、これはＢＢＢを開いて、１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞への透過を可能にする。ＢＢＢの送達は、以前は達成されなかった。
【００４８】
理想的には、全身ハイドロダイナミック投与に関し、ｓｉＲＮＡは溶液にして、好ましくはリン酸緩衝食塩水溶液又は水で送達される。
【００４９】
理想的には、前記溶液は対象の体重の５〜１０％の間の容積を有する。本願発明者らは、この多量のｓｉＲＮＡを選択されたタイト結合タンパク質に対して送達することが、非標的化ｓｉＲＮＡと比較したとき、脳の微小血管系の透過率を増加させる。
【００５０】
理想的には、対象が大型哺乳動物の場合、対象の体重によって、数リットルの範囲内にすることができる。このような大容量は、他の利用可能な治療方法がなく、かつ更に治療介入しなければ対象が死ぬような外傷性脳損傷又は重傷の脳卒中の治療のような場合に望ましいと考えられる。対象がマウスのような小型哺乳動物の場合には、理想的には全量が１〜３ｍｌである。送達されるべき正確な量は、対象の体重に依存することになる。
【００５１】
特定の用量が特定の時間内に、例えば哺乳動物の体重の１グラム当たり毎秒０．０５ｍｌ未満の速度で送達されると好都合である。明確な容量を短時間で導入することが、この投与経路を補助する。
【００５２】
この本発明の側面のある実施例によれば、マウスの全身ハイドロダイナミックデリバリーは、約１ｍｌ／秒の流量でマウスの尾静脈内に約１〜３ｍｌの液体でｓｉＲＮＡを注入することを含む。
【００５３】
別の実施例では、ｓｉＲＮＡを、高濃度のｓｉＲＮＡの低容量溶液での使用を含む非ハイドロダイナミック方法を用いて投与することができる。同様の濃度のｓｉＲＮＡを全身ハイドロダイナミック方法に用いることができる。一般に、人間のような大型哺乳動物について全量で７０〜２００ｍｌが考えられる。このように、非ハイドロダイナミックデリバリーについて使用される体重に基づいた容積率は、ハイドロダイナミック方法の容積よりも非常に低い。
【００５４】
別の方法には、哺乳動物のｐｏｌ IIまたはｐｏｌ IIIプロモーター、及びＴ７ポリメラーゼを含む転写システムを用いて開発されたプラスミドＤＮＡ発現ｓｉＲＮＡが含まれる。ｓｉＲＮＡコード化プラスミドによる遺伝子サイレンシングの有効性は、ＤＮＡ導入効率に依存し、かつまた一時的なｓｉＲＮＡ発現を生じる。このような別の方法については、本明細書中に後述する。
【００５５】
本発明によるｓｉＲＮＡの送達は、ＢＢＢの一時的、可逆的かつサイズ選択的開放を生じる。この開放は、選択した特定のｓｉＲＮＡ及び送達条件によって制御することができる。例えば、特定のＴＪタンパク質ｓｉＲＮＡを選択することによって、ＢＢＢの脳内皮細胞又は網膜細胞に対する様々なサイズの分子の透過を可能にすることができる。
【００５６】
更に、本発明は、さもなければ除かれるであろう脳又は網膜のあらゆる領域への小分子の送達のための非侵襲的技術を意味している。従前、これは不可能であり、薬剤のＢＢＢへの送達に関する公知の方法は侵襲的なものであり、かつ多くの危険を伴っている。例えば、濃縮糖液によってＢＢＢ細胞を一時的に収縮させることは、脳腫瘍の治療においてＢＢＢを崩壊させるのに使用されている。これは一時的に化学療法剤が脳内に通過して腫瘍に到達することを可能にする。しかしながら、このような治療は重大なリスクを伴い、かつ所定の環境においてのみ使用することができる。しかしながら、ＢＢＢはサイズ選択的でないやり方で崩壊され、この方法は問題の薬剤を送達しようとする小さな時間枠だけを考慮している(http://www.ohsu.edu/bbb/bbbdtherapy.html）。このように、制御することができ、かつ血液脳関門を開くためにそのような深刻な副作用がない、別のＢＢＢを開くための治療を提供することが非常に望ましい。
【００５７】
更に、公知のＴＪ関連タンパク質ノックアウトマウスは、ＢＢＢ機能が弱められかつ有害であるという意味で多くの欠点を有し、これらノックアウトマウスに関連する死亡率は高い。本発明は、一時的なノックアウトを提供することによってこれらの問題を解消し、それにより公知のＴＪタンパク質ノックアウトマウスに関連する死亡率を解消する。
【００５８】
本発明のＲＮＡｉの技術は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ誘導剤であるかによらず、血液脳関門及び／又は血液網膜関門からのＴＪ関連タンパク質を標的とする。例えば、ＢＢＢを開くのに使用されるｓｉＲＮＡはＴＪタンパク質を標的とする。理想的には、タイト結合タンパク質は、脳微小血管系のタイト結合に関連する膜貫通タンパク質から選択される。一般に、標的ｍＲＮＡ、タイト結合タンパク質転写物に対する配列同一性を有するｓｉＲＮＡ配列の領域は、長さが１４〜３０ヌクレオチド、例えば１６〜２４ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２２ヌクレオチド、最も好ましくは長さが１９〜２１ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡによりコード化されたタンパク質の生成をｓｉＲＮＡ薬剤が抑制するのに十分な相補性をタイト結合タンパク質の標的ｍＲＮＡに対して有する。このｓｉＲＮＡは平滑末端構造のものでも、その３’又は５’端末に、好ましくはその両方の端末にオーバーハングを有するものでも良い。オーバーハングは、長さが短いことが好ましく、例えば３０ヌクレオチド未満、好ましくは２０ヌクレオチド未満、より好ましくは１０ヌクレオチド未満、更に好ましくは５ヌクレオチド未満、最も好ましくは３ヌクレオチド未満の長さである。一般に、オーバーハングは、長さが２ヌクレオチドである。
【００５９】
このように、本発明のｓｉＲＮＡは、一般に長さが３０ヌクレオチド未満であり、一本鎖又は二重鎖構造とすることができる。より長いｓｉＲＮＡは、酵素的に又は化学的に切断されて、３０ヌクレオチド未満、一般には上述したように２１〜２３ヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡを生成し得る開裂部位を有するものとすることができる。ｓｉＲＮＡが対応する標的ｍＲＮＡとの配列相同性を共有することが理解される。配列相同性は、１００％以下とすることができ、ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡ間での配列特異的会合を生じるのに十分なものとすべきである。典型的なｓｉＲＮＡは、インターフェロンシグナル伝達経路を活性化しない。本発明の最も好ましい実施例は、標的ｍＲＮＡ、タイト結合タンパク質との１００％配列同一性を有するｓｉＲＮＡからなる。しかしながら、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を標的ｍＲＮＡに分解のために案内するのに十分な相同性を有するような、１００％未満の相同性を有する他の配列（一般にＲＮＡｉ誘導剤に関連して上述したもの）を用いることができる。
【００６０】
標的ｍＲＮＡに関するｓｉＲＮＡの限定的変異もまた考えられる。本発明のｓｉＲＮＡは、理想的にはヌクレオチドオーバーハングを有することが理解される。例えば、ｓｉＲＮＡは２つのヌクレオチドオーバーハング（例えばＵＵ）を有することができ、従ってｓｉＲＮＡは、１９ヌクレオチド二重鎖領域を有するように対にした２１ヌクレオチドセンス鎖と２１ヌクレオチドアンチセンス鎖を有することになる。オーバーハングにおけるヌクレオチドの数は、５’及び３’末端のそれぞれにおいて約１乃至約６の範囲内の相同ヌクレオチドオーバーハングとすることができ、好ましくは５’及び３’末端のそれぞれにおいて約２〜４、より好ましくは約３の相同ヌクレオチドオーバーハングである。
【００６１】
更に、前記ｓｉＲＮＡは、例えば投与の際により安定であるように、化学的に修飾することができる。ヌクレオチドオーバーハングは、例えばヌクレアーゼ耐性を向上させるように修飾することができる。例えば、３’オーバーハングは、ヌクレアーゼ耐性を改善するために、２’デオキシヌクレオチド、例えばＴＴで構成することができる。
【００６２】
これら膜貫通タンパク質の一種には、接合部接着分子（ＪＡＭ）が含まれる。別の実施例では、タイト結合関連分子が、次のｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ及び／又はｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｉｎ（ＺＯ−１、ＺＯ−２、ＺＯ−３）の１種又は２種以上から選択される。
【００６３】
典型的なｓｉＲＮＡの配列及び関連する標的配列を以下に提供する。本発明のある特定の実施例によれば、タイト結合関連分子は、ｃｌａｕｄｉｎ−１乃至−１９及び／又は−２１の１種又は２種以上から選択される。好ましくは、タイト結合関連分子が、ｃｌａｕｄｉｎ−１、−５及び／又は−１２である。
【００６４】
本発明の好適実施例によれば、タイト結合関連分子は、ｃｌａｕｄｉｎ−５である。理想的には、前記ｓｉＲＮＡはｃｌａｕｄｉｎ−５遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｃｌａｕｄｉｎ−５
ｓｉＲＮＡは、以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００６５】
【化１】
【００６６】
本発明の別の好適実施例によれば、タイト結合関連分子はｃｌａｕｄｉｎ−１である。理想的には、前記ｓｉＲＮＡは、ｃｌａｕｄｉｎ−１遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｃｌａｕｄｉｎ−１
ｓｉＲＮＡは以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００６７】
【化２】
【００６８】
本発明の更に別の好適実施例によれば、タイト結合関連分子はｏｃｃｌｕｄｉｎである。理想的には、前記ｓｉＲＮＡは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｏｃｃｌｕｄｉｎ
ｓｉＲＮＡは以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００６９】
【化３】
【００７０】
本発明の好適実施例によれば、タイト結合関連分子はｃｌａｕｄｉｎ−１２である。理想的には、前記ｓｉＲＮＡは、ｃｌａｕｄｉｎ−１２遺伝子の保存領域から選択される。特に、ｃｌａｕｄｉｎ−５
ｓｉＲＮＡは以下の配列（５’乃至３’）を有する。
【００７１】
【化４】
【００７２】
ｓｉＲＮＡを設計する技術は同業者によく知られているので、本明細書では詳細な説明を省略する。
【００７３】
本発明において使用するｓｉＲＮＡは、単一のＴＪ調節ペプチドを標的とし得ることが理解される。別の実施例では、異なるＴＪタンパク質を標的とした１種又は２種以上のｓｉＲＮＡを同時に用いることができる。例えば、数種類の異なるタイプのｃｌａｕｄｉｎタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡが考えられる。異なるＴＪタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの組み合わせを用いる場合、重要な側面は、タイト結合全体の完全性が維持されるべきことである。
【００７４】
本発明のこの側面のある実施例によれば、ｓｉＲＮＡの組み合わせには、ｃｌａｕｄｉｎ−１とｃｌａｕｄｉｎ−５、ｃｌａｕｄｉｎ−１２とｃｌａｕｄｉｎ−５、ｃｌａｕｄｉｎ−１２とｃｌａｕｄｉｎ−１を含むことができる。別の実施例では、ｃｌａｕｄｉｎ−１、ｃｌａｕｄｉｎ−５及びｃｌａｕｄｉｎ−１２を一緒に用いることができる。また、ｏｃｃｌｕｄｉｎも１種又は２種以上のｃｌａｕｄｉｎのタイプと組み合わせることができる。これらの組み合わせは、制御されかつサイズ選択的であるという特徴をもってＢＢＢにおける透過率を更に増加させると考えられる。
【００７５】
また、これらのＴＪタンパク質を標的として、ｓｈＲＮＡを選択することもできる。ＴＪタンパク質を標的とするｓｈＲＮＡは、結局前記ｓｉＲＮＡと同じセンス配列及びアンチセンス配列を有することになる。唯一の相違点は、それらが、ヘアピン構造を形成しかつ送達ベクターにそれらがクローン化されることを可能にする次のヌクレオチドＵＡＵＣＡＡＧＡＧからなる短いヘアスピンを有することである。
【００７６】
理想的には、誘導ベクターをｓｈＲＮＡ送達に用いて、さもなければ生じるであろう、問題のＴＪタンパク質を標的としたｓｈＲＮＡの連続的な発現及びその結果であるこれらＴＪ標的タンパク質の連続的な抑制を防止する。例えば、脳又は網膜の特定の領域に高度に局所化されることになるＡＡＶ仲介送達を用いてｓｈＲＮＡを送達することができる。好ましくは、特定の薬剤を投与したときにＴＪタンパク質を標的としたｓｈＲＮＡの誘導発現を可能にする誘導ＡＡＶベクターを使用する。このような誘導ＡＡＶベクターはｃｌａｕｄｉｎ−５のようなタイト結合標的タンパク質の一時的な抑制を可能にする。
【００７７】
本発明の第２の側面によれば、本発明によるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等のようなＲＮＡ誘導剤の送達が、ＢＢＢの細胞間通路及び生理学の作用を研究するために使用される実験動物モデルの生成において使用することができる。このタイプの動物モデルは、ＢＢＢの細胞間通路を可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的な手法で開くので、公知のＢＢＢノックアウトマウスに関連した高い死亡率を解消する。このような、一時的にＢＢＢタイト結合タンパク質を抑制してＢＢＢを開放する条件付きタイト結合タンパク質ノックアウトマウスを用いて、広範囲の薬理生成物（以前はＢＢＢを透過し得なかったような生成物を含む）の効果を試験し、かつ／又は細胞間システムを研究することができる。
【００７８】
そのようにして、この方法は、動物モデルにおいて、以前はＢＢＢを貫通し得なかった様々な活性剤を試験するために、及び脳及び網膜機能に影響を及ぼす疾病及び疾患の新たな治療を生成するために用いることができる。好ましくは、この方法によって、さもなければ血管脳関門を横断し得ない広範囲の薬物の評価のための理想的な実験プラットホームの生成が可能になる。このように、この方法は神経変性疾患及び精神神経疾患などについて、実験動物モデルの確立を考えることができる。
【００７９】
本発明の第３の側面によれば、脳又は網膜の疾病又は疾病の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ脳または網膜の疾病又は疾患の治療を目的として、１５ｋＤａ未満の活性剤の透過及び送達を可能にする、ｓｉＲＮＡ標的タイト結合タンパク質の送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなるような、タイト結合タンパク質を標的とした、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのようなＲＮＡｉ誘導剤の使用が提供される。
【００８０】
タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）は一時的に血液脳関門を開放して、血液脳関門を横切る活性剤の送達を可能にする。理想的には、前記方法は、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与後の前記活性剤の連続投与からなる。これによって、前記活性剤が投与されたときに細胞間通路が開放されることは確保され、前記活性剤は脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞を通過して、脳及び／又は網膜に到達することができる。しかしながら、活性剤の送達を、ＲＮＡｉ誘導剤より以前に又はそれと共に／同時に行うことも考えられる。
【００８１】
本発明のこの側面は、ＢＢＢ又はＢＲＢが関係する多くの疾病又は疾患の治療に適用することができる。これらには神経変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症などのような）、脳卒中及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、感染プロセス及び炎症性疼痛、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、緑内障及び糖尿病性網膜症を含む網膜疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば本発明は、現在は効果的は治療の見込みが殆ど又は全く提供されていない神経変性又は他の状態の範囲において治療薬を中枢神経系（ＣＮＳ）に制御して送達するために使用することができる。
【００８２】
本発明のこの側面によれば、特定の疾病の治療には一般に、ＢＢＢを横切る活性剤の送達と同時の又はそれ以前のＢＢＢの開放が含まれる。前記活性剤は、理想的には、ＢＢＢの開放後に、例えばｓｉＲＮＡ送達後２４時間又は４８時間後に送達される。別の実施例では、上述したように、前記活性剤はＲＮＡｉ誘導剤と同時に又はそれより前に投与することができる。
【００８３】
前記活性剤は、神経機能を調節する薬剤、化学療法薬、抗腫瘍剤、網膜機能を調節する薬剤及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のような従来の薬品から選択することができる。そのように、前記活性剤はあらゆる従来の生理活性治療薬とすることができる。
【００８４】
別の実施例では、前記活性剤が高張溶液、好ましくは高張食塩水又は糖液とすることができる。このような高張溶液は、外傷性脳損傷の治療において使用され、水分が障害後の脳から排除され得るようにすることができ、重要なことに、脳浮腫の発生を防止することができる。マンニトール、糖液を本発明に用いることもできる。マンニトールは従来の「マンニトール浸透圧療法」において使用されるが、マンニトールは、従来のように使用したとき、ＢＢＢを横断できない。マンニトールは、浸透圧利尿剤及び弱い腎臓の血管拡張剤として機能する。
【００８５】
前記活性剤はまた、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはタンパク質、ポリペプチド又はペプチドとし得ることが理解される。
【００８６】
好適実施例によれば、前記活性剤は、治療されている疾病又は疾患を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどを含む更なるＲＮＡｉ誘導剤とし、それによりＢＢＢの開放後に、更なるＲＮＡｉ誘導剤が脳内に送達されて、特定の疾病又は疾患を治療できるようにする。
【００８７】
この本発明の側面は、ここで幾つかの特定の疾病又は状態及び１つのＲＮＡｉ誘導剤ｓｉＲＮＡに関して検討するが、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのような他のＲＮＡｉ誘導剤をも使用することができる。
【００８８】
外傷性脳障害（ＴＢＩ）におけるストレス応答は、ＢＢＢを横切る水分の拡散の停止によって現れ、頭蓋内圧及び脳浮腫の急激な増加を招く。ＴＢＩ後の脳浮腫及び頭蓋内圧の上昇を管理する従来の治療には、食塩水又は糖治療を含む高浸透圧療法及び高張療法が含まれる。例えば、浸透圧利尿剤は一般に、血漿と脳細胞との間に浸透圧勾配を確立し、かつＢＢＢを越えて血管コンパートメント内に水分を引き込むので、ＴＢＩを治療するのに用いられている。別の実施例では、高張食塩水が、細胞内から水分を排除し、組織圧及び細胞のサイズを小さくすることによって、脳浮腫の減少を生じさせる。ＴＢＩの急性処置については、患者にマンニトール及び高張食塩水を与えて、脳内の水分拡散の浸透圧変化の解決を試みる。しかしながら、マンニトール及び高張食塩水は、２４時間まで有効なだけであり、この時間より長く腫張が発生した場合、患者は死亡するか恒久的な脳の障害が残ることになる。このように、マンニトール及び高張食塩水は、深刻な循環血流量の低下、低血圧及び過カリウム血症のような副作用の意味で重大な欠陥を有し、必要とされる正しい投与量を確認することに困難がある。更に、濃縮糖液により一時的にＢＢＢ細胞を収縮をさせることは、上述したように脳腫瘍の治療においてＢＢＢを崩壊させるのに使用されており、非常に有害な副作用を有する場合があり、最後の頼みとしてのみ使用され、全ての患者に適しているものではない。実際、ＢＢＢを開くマンニトールの使用は、ＢＢＢを選択的に制御して開くことにはならず、脳に更なる損傷を生じる場合がある。従って、ＴＢＩ又は脳卒中を取り扱う別の治療方法を提供する必要がある。
【００８９】
本発明のこの側面によれば、外傷性脳損傷又は脳卒中の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞における血液脳血管タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ任意に、高張食塩水又は糖液のような活性剤の投与後に血液脳関門を横切る水分の透過及び自由な拡散、頭蓋内圧の低下及び／又は脳浮腫の減少を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなる、ｓｉＲＮＡの使用が提供される。
【００９０】
この血液脳関門を横切る水分の一時的、可逆的かつ制御された自由な透過及び自由な拡散を可能にする能力は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は重傷の脳卒中のような状態において非常に重要である。これらの状態では、水分の脳から血液への拡散の停止が、頭蓋内圧の増加を生じさせ、脳浮腫及び場合によっては死又は重い廃疾を招くことがある。本発明は、水分の脳から血液への拡散を可能にし、かつ頭蓋内圧及び／又は脳浮腫の作用を低下させる新たな治療法を提供する。従って、予期しないことであるが好都合なことに、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの使用によって、ＢＢＢを越えた水分の拡散が増進される。これによって、ＴＢＩ、特に急性のＴＢＩに関連する脳浮腫における別の介入の手段が提供される。タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤を使用することは、ＢＢＢが開いている７２時間までの時間に制御された可逆的な方法でＴＢＩを有する対象の脳から水分の自由な拡散を可能にする。高張溶液（例えば、マンニトール又は高張食塩水）のような活性剤を任意にｓｉＲＮＡと共に用いて、２４〜４８時間後にＢＢＢが開くまでの初期に水分の拡散を容易にする浸透圧勾配を提供することができる。
【００９１】
このように、タイト結合タンパク質を標的とした前記ｓｉＲＮＡは、それ自体で又は高浸透圧療法及び高張食塩水／糖治療又はマンニトール浸透圧療法のような従来のＴＢＩ又は脳卒中療法と組み合わせて（連続的に又は同時に）使用できることが理解される。
【００９２】
特定の実施例によれば、本発明の方法は、高度に制御された方法で脳から血液への水分の流れを可能にし、マンニトール／高張食塩水又は糖療法と組み合わせて用いることができる。好都合なことに、ｓｉＲＮＡ及びマンニトール／高張食塩水療法は同時につぎ込むことができ、マンニトール／高張食塩水は約２４時間後に作用を停止するので、ＢＢＢの制御された開放は、更に水分の流れが脳からＢＢＢを通して可能であるように開始する。
【００９３】
本発明の別の側面によれば、神経変性疾患又は精神神経疾患の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、神経機能を調整する１５ｋＤａ未満の活性剤の脳毛細血管内皮細胞への透過及び送達を可能にするように、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなる、ｓｉＲＮＡの使用が提供される。神経機能を調整する前記薬剤は、従来の神経変性疾患又は精神神経疾患のためのあらゆる従来の治療とすることができる。
【００９４】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、米国の１７５万人以上の市民に影響を与えており、６０歳以上の人における視力障害及び失明の主な原因である。ＡＭＤを発生させるとして知られている最大の危険因子は加齢であるが、滲出型ＡＭＤの視覚上の危険因子には、軟性ドルーゼン、黄斑色素変化、及び脈絡膜新生血管が含まれる。ＡＭＤに関連する別の危険因子には、喫煙、肥満、高血圧及び家族歴陽性が含まれる。ＡＭＤは、２つの基本的な形態、即ち非滲出型ＡＭＤ又は滲出型ＡＭＤで現れ、後者は血管透過性及び出血が関連している。より深刻な滲出型では、脈絡毛細管床から生まれた新しい血管が網膜の斑の下側に発生し、網膜と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間の網膜下腔内に成長する。この新たに出芽した血管が、漿液及び血液を神経感覚網膜の下側に漏出させ、黄斑浮腫及び網膜剥離を招いて、視覚歪（変視症）及び霧視の症状を生じさせる。
【００９５】
緑内障は複合病であり、目の繊維柱帯網の変性及び／又は篩骨篩板が関係している場合があり、排水路の異状機能及び／又は視神経乳頭の変性を生じる。その結果、神経節（網膜の出力ニューロン）が死に、視野の狭窄及び／又は喪失を生じ、治療しない場合には、相当な割合で深刻な視覚障害を招く。
【００９６】
開放隅角緑内障の大部分の場合には、所謂正常眼圧緑内障の数が現在増えていることが確認されているにも拘わらず、眼圧の上昇が関係している。圧力の上昇を示すような場合には、減圧点眼薬が疾病の進行を遅らせる上で重要な価値を有する場合が多い。しかしながら、眼圧を軽減するのに外科的介入が必要な場合があり、かつ幾つかの開放隅角緑内障は治療不応性になる。
【００９７】
開放隅角緑内障は、現時点でイギリス諸島の最大１００万人に影響を与えている。この疾病の大部分は多重遺伝子性又は多因子性であるが、この疾病の幾つかは明らかなメンデル比に従って遺伝子、即ち常染色体優性の意味で遺伝している。このような幾つかの疾病では、所謂ミオシリン遺伝子内での変異が確認されている（Stone et al, Science, 275,1997, 668-670）。更に、多因子性の病気の最大４％では、同様の変異に遭遇している。従って、イギリス諸島の４万人又はそれ以上の人がミオシリン遺伝子内の変異により生じた緑内障を患っている。
【００９８】
糖尿病性網膜症、即ち糖尿病の結果としてしばしば発生する目の損傷は、血液網膜関門の破壊に関係している。血液網膜関門は、糖尿病性網膜症を有する患者ではより漏れやすくなる。
【００９９】
本発明のこの側面によれば、網膜の疾病の治療のための薬剤の製造において、その方法が、血液脳関門又は血液網膜関門の細胞間通路の可逆的、一次的かつ制御されたサイズ選択的開放からなり、該方法が、脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞における血液脳関門又は血液網膜関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ網膜機能を調節する１５ｋＤａ未満の活性剤の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達からなるＲＮＡｉの使用が提供される。本発明のこの側面には、ＢＢＢ又はＢＲＢを開放して、網膜機能を調節する活性剤の網膜毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にすることによる網膜の疾病の治療が含まれる。
【０１００】
網膜機能を調整する前記活性剤は、上述した状態のためのあらゆる従来の治療法であって良い。更に、例えば血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ）調節不全は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の重要なメディエータであり、従って網膜へのこれらの阻害剤の送達を増加させることが、ＡＭＤの進行を有意に阻害し得る。これまで、これらのＶＥＧＦ受容体の低分子阻害剤は、血液網膜関門を横切ることができなかった。これは、本発明の重要な利点である。
【０１０１】
本発明の更に別の実施例によれば、脳腫瘍の治療のための薬剤の製造において、その方法が、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一次的ＲＮＡｉ仲介抑制を生じかつ１５ｋＤａ未満の抗腫瘍薬又は化学療法薬の脳毛細血管内皮細胞への透過及び送達を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの送達、好ましくは全身送達による血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一時的かつ制御されたサイズ選択的開放からなる、ｓｉＲＮＡの使用が提供される。
【０１０２】
従って、本発明のこの側面により、脳腫瘍のような状態の治療にとって通常は余分なものとなり、今日までＢＢＢを横切ることができなかった従来の化学療法薬又は抗腫瘍薬の送達を増進させるために使用し得るＢＢＢ／ＢＲＢの一時的な開放が提供される。
【０１０３】
本発明のあらゆる側面の典型的な実施例では、前記対象が牛、馬、マウス、ラット、犬、豚、山羊、又は霊長動物（Macaque）のような哺乳動物である。より好適な実施例では、前記対象が人間、例えば健康な人間又は現在ではＢＢＢを横切る薬剤を利用できないことにより治療不応である疾病若しくは疾患と診断され又は予告された人である。
【０１０４】
本発明の第４の側面によれば、タイト結合タンパク質を標的として、送達に適した血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一次的かつ制御されたサイズ選択的開放を生じるｓｉＲＮＡの製薬上許容できる溶液と、特定された疾病又は疾患の治療のための活性剤からとなる医薬組成物が提供される。
【０１０５】
前記活性剤は、神経機能を調節する活性剤、化学療法薬、抗腫瘍薬、網膜機能を調節する薬剤、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）又は上述したような高張溶液のような従来の医薬から選択することができる。特定の例は、上記記載に示した通りである。
【０１０６】
別の実施例では又は更に加えて、前記活性剤はまた、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドとすることができる。理想的には、前記活性剤は、治療している疾病又は疾患を標的とする更なるｓｉＲＮＡであり、それによってＢＢＢの開放後に、更なるｓｉＲＮＡ分子が脳内に送達されて特定の疾病又は疾患を治療できるようにする。
【０１０７】
理想的には、前記医薬組成物は、全身ハイドロダイナミックデリバリーに適しており、製薬的に許容できる担体内に存在する。
【０１０８】
前記ｓｉＲＮＡ及び活性剤が同時投与又は連続投与に適したもので有り得ることは理解される。従って、ｓｉＲＮＡは単独で又は活性剤と組み合わせて投与することができる。にも拘わらず、ＢＢＢが開いた後の連続投与は、幾つかの活性剤にとって好ましい送達方法である。
【０１０９】
本発明の更に別の側面によれば、血液脳関門の細胞間通路の可逆的、一次的かつ選択されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的な開放のために、脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞において血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の一時的かつ可逆的ＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜細胞への透過を可能にする、タイト結合タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡ有効量の送達、好ましくは全身送達の過程からなる方法が提供される。
【０１１０】
本発明の更に別の側面によれば、血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的な開放からなる、疾病又は疾患の治療のための方法であって、前記方法が、
前記疾患又は疾病を発症する虞がある対象を識別する過程と、
ＲＮＡｉ誘導剤の送達好ましくは全身送達により、タイト結合タンパク質を標的とした有効量の、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤を投与して、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ理想的には１５ｋＤａ未満の、前記疾患又は疾病の治療に使用される活性剤の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞への透過を可能にする過程と、
前記疾患又は疾病の治療に適した活性剤を投与する過程とからなる方法が提供される。
【０１１１】
好都合なことに、この方法によって、薬剤又は他の活性剤に対するＢＢＢの透過率が増加する。
【０１１２】
本願発明者らは従前に、問題の領域即ちＢＢＢへのｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック及び非ハイドロダイナミックデリバリーの双方を論じてきた。
【０１１３】
ＢＢＢを横切る分子の経細胞、受容体仲介送達のような他の送達方法が考えられる。例えば、ｓｉＲＮＡは、エレクトロポレーション又は脂質媒介トランスフェクションを用いて送達することができる。別の送達方法には、カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、脂質、リボゾーム、非カチオン性ポリマー及び／又はウイルスベクターをＲＮＡｉ誘導剤の送達のために使用することが含まれる。
【０１１４】
更に別の送達方法には、ＢＢＢへの送達に作用するように前記ｓｉＲＮＡを封入すること又は共役化することがある。上述したように、「ミクロのトロイの木馬」と称される遺伝子組み換えタンパク質を用いて、ＢＢＢへの送達に作用させることができる。今では、細胞の形質膜を横切ってｓｉＲＡＮの拡散を可能にするために、ｓｉＲＮＡを例えばコレステロール部位で化学的に修飾する多くの方法がある。基本的に、これらのコレステロールで修飾した、ｃｌａｕｄｉｎ−５又はタイト結合タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡは、ハイドロダイナミック注入を必要とすることなく、投与することができる。
【０１１５】
他のウイルス仲介送達システムが考えらる。例えば、ＢＢＢを横切るタンパク質の標的送達は、レンチウイルスベクターシステムの影響を受ける場合がある。
【０１１６】
別の実施例では、モザイクベクター粒子について上述したが、これは特に脈管構造へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の標的送達に大きな見込みが有ることを示している（Stachler MD他、2006）。更に、Work LM他（2006）は、ＡＡＶ粒子上に独特のカプシド修飾を行うことによって、その脳に関連するものを含む特定のウイルス床にウイルスベクターを標的化することが可能になることを示している。この技術は、送達ベクターにクローン化するために短いヘアピンを用いる場合にｓｉＲＮＡを使用するときに必要である。上述したように、このような誘導ベクターシステムによって、血液脳関門の制御された一時的な抑制が得られる。
【０１１７】
このように、本発明のこの側面によれば、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制に特異的な抗生物質／薬物性ｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）配列を含む内皮細胞特異型ＡＡＶを生成して、ｃｌａｕｄｉｎ−５に対するｓｈＲＮＡを含むＡＡＶによる脳微小血管系内皮細胞の感染後にＢＢＢ又はＢＲＢを誘導開放するための方法を提供することができる。他のウイルスベクターも考えることができる。
【０１１８】
更に、最近では、Szymanski他（2007）が、ＦＤＡ承認の薬剤ミフェブリストン（ＭＦＰ）により制御され、かつ基本的にＡＡＶウイルス粒子内にパッケージ化されかつその後に送達されるのに十分小さい流動プラスミドｐＢＲＥＳの発生について報告している。ｐＢＲＥＳはモジュラーに設計され、トランス活性化誘導タンパク質、ＴＡからなり、薬剤ＭＦＰと相互作用して問題の導入遺伝子、即ちｓｈＲＮＡ（調節プロモーター（例えば、６×Ｇａｌ４／ＴＡＴ）から）の発現を可能にするプロモーターの選択により駆動される。この最小のプロモーターが標準的なＰｏｌ II要素を用いて設計されているので、Ｐｏｌ IIIプロモーターを必要とする従来のｓｈＲＮＡ遺伝子を駆動することは考えられず、ｓｈＲＮＡ配列をマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）バックボーン（ｓｈＲＮＡｍｉｒｓ）でｐｃＤＮＡ ６．２-ＧＷ／ＥｍＧＦＰ-ｍｉＲにクローン化すべきである（BLOCK-iT Pol Il miRNAi Expression Vector Kit; Invitrogen cat.
no.K4935-00）。得られたＥｍＧＦＰタグ付加ｓｈＲＮＡｍｉｒは次に切り取られて、調節プロモーターの後にｐＢＲＥＳ内に挿入することができる。更に、ｓｈＲＮＡの適当でない発現に対して更に保護を加えるために、ＴＡタンパク質（次にｓｈＲＮＡ発現誘導を招くことになる）は、脳内皮内で他の組織と比較して高度な発現を駆動するトランスフェリン、ｃｌａｕｄｉｎ−１２、Ｔｉｅ−２又はｐ糖プロテインのプロモーターを用いて駆動される。生物情報分析後に得られたこれらの遺伝子からの推定プロモーターは、次にＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ no．ＣＲＬ−１７３０）及びｂｅｎｄ．３（ＡＴＣＣ no．ＣＲＬ−２２９９）内皮細胞系におけるＥＧＦＰの発現を駆動するときに効率及び組織特異性を試験することができ、最も効率的なプロモーターが前記誘導システムに組み込まれてＴＡタンパク質を駆動することになる。最後に、得られたＭＦＰ−誘導、内皮特異型ｓｈＲＮＡ発現ｐＢＲＥＳプラスミドは、直線化され、かつＡＡＶシャトルベクターｐＡＡＶ２ ＣＭＶにクローン化され、血管内皮への送達のためにカプシド修飾ＡＡＶ１にパッケージされる。
【０１１９】
今日まで、ＡＡＶ−１の使用における主な制限は、しかしながら、効率的な小規模精製戦略がないことであった。しかしながら最近では、２つのＡＡＶ−１カプシドタンパク質修飾が、ベクター粒子の簡単な精製を容易にしつつ、血管遺伝子導入を大きく増進し得ることが開示されている。脈間系を覆う内皮細胞の内腔面上に存在するインデグリンを標的とするべく十分に特徴付けられたＲＧＤ４Ｃ修飾を含むカプシドタンパク質と、アビジンアフィニティークロマトグラフィーによるモザイク粒子の代謝的ゼオチン化及び効率的な精製を可能にする修飾を含むカプシドタンパク質とからなるモザイクベクター粒子を用いて、今では高効率で特異的に内皮細胞を導入する修飾ＡＡＶ−１粒子を生成することが可能である（Stachler & Bartlett, 2006）。このように、特にＢＢＢ及び／又はＢＲＢへのｓｈＲＮＡの送達のためにＡＡＶ−１を使用することが、今では実用的に実行可能である。
【０１２０】
本明細書中、「からなる」などの用語及びその活用形、及び用語「を含む」並びにそれらの活用形は、相対的に相互に変換可能であると解され、もっとも広く解釈すべきものと考えられる。
【０１２１】
本発明は上述した実施例に限定されるものでなく、その技術的範囲において様々に変形又は変更することができる。
【０１２２】
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【０１２３】
以下に本発明を、以下の非限定的な図面及び実施例を参照しつつ詳細に説明する。
図１は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質及びｍＲＮＡのレベルの定量化の結果を示している。
【０１２４】
図１Ａは、ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４、４８、７２時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現のウェスタンブロット分析である。使用したコントロールには、非注射のコントロール、ＰＢＳ注射のコントロール及び非標準化（ロドプシン）ｓｉＲＮＡ注射コントロールの各マウスが含まれる。ｓｉＲＮＡの送達後２４時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現のウェスタンプロット分析は、非注射、ＰＢＳ注射及び非標準化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、発現の現象を示した。この抑制はまた、注射後４８時間（ＣＬＤＮ５ Ａ＋Ｂ；２つの異なるマウスからのリゼイト）においても明確であった。ｃｌａｕｄｉｎ−５のレベルは、同じ列におけるβ−アクチンの対応するレベルと比較したとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後７２時間及び１週間におけるコントロール群に類似していた（図１Ａ）。
【０１２５】
図１Ｂは、コントロール群−非注射コントロール、ＰＢＦ注射コントロール及び非標準化（ロドプシン）ｓｉＲＮＡ注射コントロールのマウスと比較したｓｉＲＮＡの注射後におけるｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡのレベルが、検査後Tukey-Kramer法によるＡＮＯＶＡ後にＰ＝０．０４２７（＊）であるコントロール群と比較して、ｓｉＲＮＡの注射後２４時間で大きく減少したことを示しつつ、Ｐ＝０．０４７８（＊）であるｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間における抑制をも示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡのレベルは、注射後７２時間（Ｐ＝０．０６２７）及び１週間（Ｐ＝０．２２６４）において、非標準化コントロール群と比較して大きく変化しておらず、０．０５より大きいＰ値を示し、有意でないことを表している（図１Ｂ）。
【０１２６】
図２は、脳の微小血管におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の発現及び局所化の免疫組織化学分析の結果を示しており、非注射、ＰＢＳ注射及び非標準化コントロールのマウスの脳微小血管系における染色パターンが全ての時点において連続的かつ独特なことを表している（赤色＝ｃｌａｕｄｉｎ−５、青色−ＤＡＰＩ＝核）。この染色パターンは、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後２４時間において減少しかつ非連続的であることを示し、注射後４８時間には発現が顕著に減少している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後７２時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５染色の現れかたは明確であるが連続的ではなく、注射後１週間では、ｃｌａｕｄｉｎ−５の発現がコントロール群のそれに似ていることを示している。目盛は２０μｍである。これらの結果は、少なくとも５つの別個の実験の典型である。
【０１２７】
図３は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制後のｃｌａｕｄｉｎ−１、Ｔｉｅ−２及びｏｃｃｌｕｄｉｎの発現の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後２４、４８、７２時間及び１週間におけるｃｌａｕｄｉｎ−１（２３ｋＤａ）発現のウェスタンブロット分析は、いずれの時点においても変化がないことを示した。anti−Tie−２（１４０ｋＤａ）抗体でブロットをプローブした時、この内皮細胞特異型チロシンキナーゼ受容体の発現のレベルには、いずれの時点においても、いずれの処置によっても、全く顕著な変化が観察されなかった（図３Ａ）。また、タイト結合タンパク質ｏｃｃｌｕｄｉｎの発現のレべルは、ｓｉＲＮＡの送達後の全ての時点において変化しないままであることを示した（図３Ｂ）。
【０１２８】
図４は、脳の凍結切片におけるｃｌａｕｄｉｎ−１及びｃｌａｕｄｉｎ−５の２重免疫染色の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後に適当なコントロールを用いて脳の凍結切片をラットanti−ｃｌａｕｄｉｎ−１抗体及びラビットanti−ｃｌａｕｄｉｎ−５抗体で染色した。使用した２次抗体はラットＩｇＧ（Ｃｙ３；赤）及びラビットｌｇＧ（Ｃｙ２；緑）であった。図２における結果と同様に、ｃｌａｕｄｉｎ−５の染色パターンは、ｓｉＲＮＡの注射後４８時間（図４Ｂ）において非常にばらばらにかつ不連続に現れた。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後７２時間におけるｃｌａｕｄｉｎ−５染色の現れかたは明らかなものであったが、コントロール群（図４Ｃ）ほど強いものではなかった。注射後の各時点において、ｃｌａｕｄｉｎ−１の発現のレベルは、コントロール群において観察されたそれに似た状態で現れた。
【０１２９】
図５は、４４３ダルトンの分子に対するＢＢＢ完全性の評価の結果を示している。ＢＢＢ完全性は、全てのコントロール群の微小血管内における緑色蛍光として観察された。しかしながら、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間では、検出した蛍光が、同じ時点におけるコントロール群と対照して、拡散してかつ微小血管の外側にあった。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間では、ビオチン化分子の分布が脳実質において豊富であったが、この透過性は、コントロール群と比較したとき、ｓｉＲＮＡの送達後７２時間においても明らかであった。ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後１週間におけるマウスでは、ビオチン化試薬が５分間の灌流後に実質に沈着しないことが観察された。EZ-Link TM Sulfo-NHS-Biotinが、脳の微小血管内に観察された。２４時間及び４８時間における目盛は約２００μｍを示している。７２時間及び１週間の時点における目盛は約１００μｍを示している。全てのトレーサー実験は、マウスにおいて少なくとも５回繰り返した。
【０１３０】
図６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間におけるHoechst３３３４２及びＦＤ−４の同時灌流を示すことにより、脳及び網膜の微小血管からのHoechst Ｈ３３３４２染料の溢出の結果を示している。脳微小血管からのHoechst Ｈ３３３４２の溢出は、コントロール群と比較したとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間における周囲の神経細胞及びグリア細胞の核の顕著な染色により明示されている。この溢出は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間又は１週間における切片では明らかでなかった。ｓｉＲＮＡ注射後のあらゆる時点において又はコントロール群において脳実質組織には、ＦＤ−４の溢出が全く観察されなかった。これは、ｃｌａｕｄｉｎ−５のＲＮＡｉ仲介標的化のサイズ選択的な特徴を強調している。目盛は約２０μｍである（図６Ａ）。
【０１３１】
また、Hoechstの溢出は、１２μｍの網膜凍結切片において明らかであり、内顆粒層（ＩＮＬ）は、ＣＬＤＮ５ ｓｉＲＮＡの送達後２４時間において染色されたことを、外顆粒層（ＯＮＬ）は、４８時間において顕著に染色されたことを示している。全てのコントロール群において、Hoechst染色は、もっぱら網膜血管の核内に現れ、網膜内に外網状層（ＯＰＬ）まで拡散している。目盛は約２０μｍである。（ＩＰＬ）内網状層、（ＧＣＬ）神経節細胞層（図６Ｂ）。
【０１３２】
図７Ａは、血液脳関門の完全性を生体内で評価する注射後のＭＲＩスキャンの結果を示している。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡを用いて、ｃｌａｕｄｉｎ−５転写物のアブレーション後のマウスにおけるＢＢＢ完全性を、コントロール群−非注射コントロール、ＢＰＳ注射コントロール及び非標準化（ロデプシン）ｓｉＲＮＡ注射コントールのマウスと比較して確認した。同図の左側の画像は、Ｇｄ−ＤＴＰＡの注射前のマウス脳の映像であり、右側の画像はＧｄ−ＤＴＰＡの注射後のマウス脳の映像である。これらの画像は、冠状断像的に撮影され、脳の腹面から背面（下側の画像）に向けて移動し、その間の画像は、海馬領域及び皮質領域内の映像を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後２４時間及び４８時間において、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＢＢＢを横切り、脳内に沈着したことが観察された。また、目では動物のコントロール群と比較したとき、強いコントラストが４８時間の時点で観察されたが、他の時点ではそうではなかった。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（７４２Ｄａ）の実質内への最も大きな浸透及び沈着は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡ注射後２４時間及び４８時間において発生した。（全てのＭＲＩスキャンは最低で２回繰り返した）。この造影剤の浸透は、コントロール群のマウスには存在せず、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間又は１週間におけるマウスにも存在しなかった。
【０１３３】
図７Ｂは、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの全身投与後のマウス脳におけるＭＲＩ画像の濃度分析の結果を示している。各時点において及び各処置について、小脳、海馬及び皮質の選択した領域におけるＭＲＩスキャンの濃度分析は結合され、図７Ｂにおいて棒グラフとして表されている。これらの領域には、コントロール群と比較したとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後２４時間（＊＊Ｐ＜０．０５）及び４８時間（＊＊Ｐ＜０．０５）においてコントラストが大きく増加した。
【０１３４】
図７Ｃは、定量的なＭＲＩ画像の結果を示している。図７Ｃの画像は、以下を表している。即ち赤の端部はマウスのＭＲＩスキャンにおける各ピクセルについて決定される、線形回帰の傾斜の変化が非常に小さいことを示している。緑色の領域は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ沈着の速度に少し変化があることを示し、かつ青色の領域は大きな変化があることを表している。図７Ｃにおける定量的画像の下側のグラフは、Ｇｄ−ＤＴＰＡ注射後の２８分間に亘る左心室における強度の変化を示している。同グラフのデータは、Ｘ軸上の分単位の時間（Ｘ軸上の１単位は、１２８秒の長さ）に対する信号強度の自然対数（ｌｎ）（Ｙ軸）として描いた。赤線は、非標準化コントロールｓｉＲＮＡ注射マウスを表し、黄線はｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間の時点を表し、緑線はｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間の時点を表している。細線＝１４の時点における強度の生データ、太線＝各時点について数学的に計算した線形回帰、破線＝カイ２重評価法を用いた線形回帰の標準誤差。
【０１３５】
図８は、ｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質のアブレーション後のマウスへの２０ｍｇ／ｋｇのＴＲＷの投与の結果を示している。このグラフは、非標的化ｓｉＲＮＡの尾静脈注射後４８時間マウスとｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間のマウスにおける２０ｍｇ／ｋｇのＴＲＨ投与時に観察された移動度の顕著な変化を描いている。ＢＢＢが弱められたとき、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間におけるＴＲＷ注射後の行動出力は、非標準化コントロールマウスにおいて観察されたそれ（＊＊Ｐ＝０．００４１）よりも５倍以上長い時間維持される移動度の有意な停止で現れた。
【０１３６】
図９は、肝臓結切片における内皮細胞の形態学を示している。マウス肝臓の１２μｍ凍結切片を、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後にかつ適当なコントロール群を用いて準備した。前記切片における茶色／紅バラ色の発色性染色は、肝臓微小血管及び特にこの微小血管を覆う内皮細胞において結合するGriffonia simplicifoliaイソレクチンを表している。全ての切片及び全ての処置において、前記肝臓の微小血管は類似しかつ崩壊していないことが表れている。各切片はヘマトキシリンで対比染色した。
【０１３７】
図１０は、肺の凍結切片における上皮細胞形態学を示している。マウス肺の凍結切片はＨＲＰ標識Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ-イソレクチンＢ４で染色した。肺組織を微小血管が広く覆っていることは明確であるが、これら血管の形態学は、全ての実験群においてかつ注射後の全ての時間において変わらないままである。切片は、ヘマキトシリン対比染色した。
【０１３８】
図１１は腎臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示している。マウス腎臓凍結切片は、ｓｉＲＮＡの注射後に、かつ適当なコントロール群を用いて準備し、次にＨＲＰ標識Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ
ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ-イソレクチンＢ４で染色した。茶色／紅バラ色の染色が、全ての処置においてかつｓｉＲＮＡ注射後の全ての時点において無傷の腎臓微小血管を示している。切片は、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１３９】
図１２は、心臓凍結切片における内皮細胞の形態学を示している。マウス心臓をｓｉＲＮＡの送達後２４、４８、７２時間及び１週間で解剖し、かつ適当なコントロールを用いた。１２μｍ切片を準備し、かつＧｒｉｆｆｏｎｉａ
ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ-イソレクチンＢ４で染色したのち、心臓関連微小血管は、全ての時点でかつ全てのｓｉＲＮＡ処置について類似の形態学を示した。切片はヘマトキシリンで対比染色した。
【０１４０】
図１３は、脳凍結切片におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ発現の免疫組織化学分析を示している。脳の微小血管におけるｏｃｃｌｕｄｉｎ発現及び局所化の免疫組織化学分析は、全てのマウスの微小血管系における全ての時点での連続的かつ独特の染色パターンを示した（赤；Ａｌｅｘａ５６８＝ｏｃｃｌｕｄｉｎ；青−ＤＡＰＩ＝核）。
【０１４１】
図１４は、ｓｉＲＮＡ注射後の網膜におけるｃｌａｕｄｉｎ−５抑制の結果を示している。網膜タンパク質リゼイトにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現のウェスタンブロット分析は、ｃｌａｕｄｉｎ−５に対するｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後４８時間における発現の減少を示した。発現のレベルは、非注射ＰＢＳ注射及び非標準化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと同様のレベルに戻ることが観察された。
【０１４２】
図１５は、網膜のフラットマウントにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の結果を示している。非標的化ｓｉＲＮＡを受けるマウス及びｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡ注射後２４、４８及び７２時間におけるマウスからの網膜フラットマウントにおけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の免疫組織化学分析は、網膜微小血管を覆う内皮細胞の周辺部におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の局所化の減少を示した。このｃｌａｕｄｉｎ−５の発現の減少は網膜微小血管透過率の増加を伴った。
【０１４３】
図１６は、ｉＢＲＢを横切るＧｄ−ＤＴＰＡ拡散のＭＲＩ分析の結果を示している。ＭＲＩ分析のコントラストを増強したのち、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間のマウスにおいてｉＢＲＢが弱められることが明らかである。これは、Ｇｄ−ＤＴＰＡが血管構造から血管外腔に通過したことから、目の硝子体内における影像コントラストの増加として説明される。
【０１４４】
図１７は、Hoechst３３３５２（５６２Ｄａ）でのマウスの灌流後の網膜フラットマウントの結果を示している。Hoechst３３３５２でのマウスの灌流後に、網膜を切り分けてフラットマウントした。Hoechst３３３５２は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの網膜において、非注射のマウス、ＰＢＳのみを受けたマウス又は非標的化ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射を受けたマウスと比較したとき、血管外核を染色したことが示された。
【０１４５】
図１８は、ＩＭＰＤＨ−／−マウスにおけるＧＴＰ注射後のＥＲＧ結果を示している。野生Ｃ−５７マウスにおける杆体応答が、左目及び右目双方において７９３ｕＶであることが観察された。生後１１カ月ＩＭＰＤＨ−／−では、しかしながら、杆体応答は、右目及び左目それぞれにおいて５０．８ｕＶ及び２．４８ｕＶであることが観察された。しかしながら、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制及び次のＥＲＧを行う時点でのＧＴＰの注射後に、杆体の記録は、右目及び左目についてそれぞれ１９３ｕＶ及び１２１ｕＶのｂ波を示し、大きく増加することを示した。この杆体応答における増加は、ｃｌａｕｄｉｎ−５の抑制及びＧＴＰの注射後の更に３つのＩＭＰDＨ−／−マウスにおいて観察された。
【０１４６】
図１９は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈送達後のｏｃｃｌｕｄｉｎ発現のウェスタンブロット分析の結果を示している。ｏｃｃｌｕｄｉｎの発現のレベルは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（４）の注射後２４時間にｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（２）よりも少ない程度まで減少することが示された。しかしながら、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（１）及びｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（２）の注射後４８時間では、ｏｃｃｌｕｄｉｎ発現のレベルが、非標的化ｓｉＲＮＡの注射を受けたマウスと比較して大きく減少した。
【０１４７】
図２０は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後のｏｃｃｌｕｄｉｎ免疫組織化学の結果を示している。脳微小血管系におけるｏｃｃｌｕｄｉｎの連続的な染色パターンは、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡの注射後２４時間に崩壊することが観察された。この不連続な染色パターンはまた、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（１）及び（２）についても４８時間の時点で明らかであった。しかしながら、ｏｃｃｌｕｄｉｎ ｓｉＲＮＡ（３）及び（４）の注射後４８時間の染色パターンは、非標的化コントロールにおいて観察されたそれと同様のレベルに戻っていた。
【０１４８】
図２１は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後のアルブミン免疫組織化学の結果を示している。脳ビブラトーム切片におけるアルブミンの免疫組織化学分析は、（３）及び（４）の番号を付したｓｉＲＮＡの注射後２４時間における血管外アルブミンを示した。これは、ｓｉＲＮＡ注射後２４時間において７０ｋＤａまでの分子のＢＢＢの通過を可能にする程度に細胞間通路が弱められていることを示唆している。Hoechstの灌流による青色の染色は、ＢＢＢが５６２Ｄａの分子に対して弱められた証拠を示している。
【０１４９】
図２２は、ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後の脳ビブラトーム切片における免疫グロブリン染色の結果を示している。ｏｃｃｌｕｄｉｎの抑制後のマウス免疫グロブリンのためのマウス脳切片の染色は、ＩｇＧの脳内への通過が全くないことを示した。マウスＩｇＧは約１５００００Ｄａの分子量を有し、ｏｃｃｌｕｄｉｎを抑制したときも以前として脳から排除されていることが明らかである。
【０１５０】
図２３は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後のｃｌａｕｄｉｎ−１発現のウェスタンブロット分析の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−１を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後、注射後２４時間において、ｃｌａｕｄｉｎ−１のレベルが、ｓｉＲＮＡ（２）及び（４）を用いたときに減少したことが観察された。この抑制は、注射後４８時間の時点におけるｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡ（４）においてのみ明らかであり、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡ（１）については２４時間の時点において明確でないにも拘わらず、この特定のｓｉＲＮＡが注射後４８時間にｃｌａｕｄｉｎ−１発現を大きく減少させた。
【０１５１】
図２４は、ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈デリバリー後２４時間及び４８時間におけるHoechst（５６２Ｄａ）及びＦＤ−４（４４００Ｄａ）の灌流の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−１を標的としたある範囲のｓｉＲＮＡの送達後、Hoechst及びＦＤ−４の混合物が、マウス内で灌流し、脳のビブラトーム切片を準備した。使用した全てのｃｌａｕｄｉｎ−１ ｓｉＲＮＡにおいて、周囲の神経細胞が、同じ時点における非標的化コントロールマウスと比較したとき、明らかに青色の蛍光を発していたことから、脳の微小血管からのHoechstの拡散の証拠があったことは明らかである。全ての場合において、ＦＤ−４は、血管内に残ることが観察された。
【０１５２】
図２５はハツカネズミｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡにおいて実験で使用した１種のｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの位置（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対応するｓｉＲＮＡ ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−５’−ＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＵＵＵＣＣＡＡＣＧＵＵ−３’）を示している。ハツカネズミｃｌａｕｄｉｎ−５ ｍＲＮＡにおけるこのｓｉＲＮＡの標的配列は、３’−ＡＡＣＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴ−５’である。
【０１５３】
図２６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのデリバリー後４８時間におけるマウス脳の海馬領域のＴ１強調ＭＲＩ画像を示しており、Ｇｄ−ＤＴＰＡが脳微小血管から溢出している脳内のコントラストが強調して明確に示されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡは７４２ダルトンの分子量を有し、その脳内への透過は、ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間においてのみ観察された。
【０１５４】
図２７は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの大容量尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内における血流量及び血液量に関係するＭＲＩ情報を示している。このデータによって、２つの事柄に関する情報、即ち平均通過時間（ＭＴＴ）及び毛細血管通過時間（ＣＴＴ）が得られる。ＭＴＴは、ラベリングしたスピンがラベリング面（頸動脈の画像スライスから１ｃｍまで）から画像スライスまで移動するのに要する時間を表している。
【０１５５】
図２８は、試験した各実験群について実験データに適合させた脳血流量及び脳血液量の理論的モデルを示している。これらは、各グループについて殆ど同じであり、図２７に示した棒グラフの結果に一致している。
【０１５６】
図２９は、Ｂ値（Ｘ軸）とその上にプロットしたＭＲＩ信号強度（Ｙ軸）を示しており、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内の水分拡散の速度に変化がないこと示している。この脳から血液への水分の拡散が一定の速度であることは、一次的なＢＢＢの開放それ自体がマウス脳内における水分の拡散になんら強い影響を与えていないことを示唆している。
【０１５７】
図３０は、ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示している。ｃｌａｕｄｉｎ−１２の染色パターンは、非標的化コントロールｓｉＲＮＡ注射後４８時間における脳微小血管系に関係していることが観察された。しかしながら、ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間において、脳の微小血管における発現のレベルは、試験した両方のｓｉＲＮＡ（即ち、ＣＬＤＮ１２ ｓｉＲＮＡ（３）及びＣＬＤＮ１２ ｓｉＲＮＡ（４））において減少することを示した。
【０１５８】
図３１は、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後の結果を示している。マウスは、左心室を通して、ＦＩＴＣ−デキストラン−４及びHoechst３３３４２（５６２Ｄａ）を含む溶液を灌流させた。ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後に、血管外の核の染色により明示されるように、微小血管系からHoechstの溢出があったことが観察された。ＦＴ−４は、非標的化ｓｉＲＮＡ及びｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後の双方において微小血管内に観察された。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの全身ハイドロダイナミック微小脈デリバリーを用いたＣ５７／ＢＬ−６マウスの血液脳関門におけるｃｌａｕｄｉｎ−５発現の生体内抑制
材料
ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
既知のｃＤＮＡ配列の保存領域を標的としたｓｉＲＮＡを選択した。これを行うため、マウスからのｃＤＮＡ配列は、Reynolds他（２００４）により概略が記述されている基準から元々引き出された最新のウェブベースのプロトコル（Dharmacon, Ambion, Genescript）を条件としてｃｌａｕｄｉｎ−５遺伝子及び完全な相同性を有する領域について整合させた。この検討において使用したｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡの配列は以下の通りであった。
【０１６０】
【化５】
【０１６１】
ヒトロドプシンを標的とした非標的化コントロールｓｉＲＮＡを、ロドプシンが網膜の光受容体細胞においてのみ、かつ脳の松果腺において低レベルで発現する（O'Reilly、M他、２００７）ことから、非標的化コントロールとして用いた。
【０１６２】
【化６】
【０１６３】
プロトコル
大容量のハイドロダイナミック注射によるマウス（murine）ＢＢＢへのｓｉＲＮＡの生体内送達及びそれに続くＲＮＡ並びにタンパク質分析
高速高圧大容量尾静脈注射を行った（Kiang他、２００５）。体重２０〜３０ｇの野生C５７／Ｂｌ６マウスを、６０ｍｌ容量のプラスチック管内に個々に拘束した。突出する尾を６０Ｗのランプで注射前に５分間温め、尾静脈を下側からの照明で明確に見えるようにした。２０μｇの標的化ｓｉＲＮＡ、又はＰＢＳで体重のｇ量での１０％のｍｌ量での容積に調整した非標的化ｓｉＲＮＡ若しくはＰＢＳ単体を、２６ゲージ（２６Ｇ ３／８)の針を用いて１ｍｌ／秒の速度で尾静脈に注射した。２４、４８、７２時間及び１週間後、脳を液体窒素中で微粉末に粉砕し、かつ次に６２．５ｍＭのトリス（Tris）、２％ＳＤＳ、１０ｍＭのジチオトレイトール、１０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル／１００ｍｌを含むライシスバッファー（Sigma Aldrich、アイルランド)を用いることにより、タンパク質を全脳組織から分離した。ホモジネートを１０，０００ｇで２０分間４℃で遠心分離し、ｃｌａｕｄｉｎ−５分析のために上清を除去した。
【０１６４】
簡単に言えば、タンパク質サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ウェット式エレクトロブロッティング装置を用いてニトロセルロース膜に一晩転写した。タンパク質の転写の効率は、Ponceau-S溶液（Sigma Aldrich、アイルランド）を用いて決定した。非特異的結合部位は、前記膜を室温でトリス干渉生理食塩水（ＴＢＳ）（トリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、５％脱脂粉乳により２時間インキュベートすることによってブロックした。膜をＴＢＳで短時間洗浄し、かつポリクローナル・ラビット抗ｃｌａｕｄｉｎ−５（Zymed Laboratories、サンフランシスコ、ＣＡ）（１：５００）又はポリクローナル・ラビット抗β−アクチン（Abcam、ケンブリッジ、ＵＫ）（１：１０００）によりインキュベートした。抗体を膜で一晩４℃でインキュベートした。膜をＴＢＳで洗浄し、西洋わさびフェルオキシラーゼ（ＨＲＰ）共役を有する２次抗ラビット（ｌｇＧ）抗体により３時間室温でインキュベートした。増強化学ルミネセンス（ＥＣＬ）を用いて免疫複合体を検出した。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡの送達後の同じ時点で、トリゾール（インビトロジェン）を用いて全ＲＮＡを脳から分離した。次に、ＲＮＡをRNase-free DNase(Promega、マジソン、ＷＩ、米国)で処理し、かつ次にクロロフォルム抽出し、イソプロパノール沈澱させ、ＲＮＡグレードのエタノール７５％で洗浄し、かつRNase-フリー水１００μｌに再懸濁させた。
【０１６６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡを、Quantitect Sybr
Green Kitを用いて、製造者（Qiagen-Xeragon）が概略説明するように、LightCycler（Roche Diagnostics、ルイス、英国)上で以下の条件：５０℃２０分間；９５℃１５分間；９４℃１５秒間、５７℃２０秒間、７２℃１０秒間の３８サイクルで、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【０１６７】
増幅した配列のプライマー（Sigma-Genosys、ケンブリッジ、英国）は次のとおりであった。
【０１６８】
【化７】
【０１６９】
ｃＤＮＡフラグメントをｃｌａｕｄｉｎ−５及びβ−アクチンから、各ＲＮＡサンプルについて少なくとも４回増幅した。結果は、同様に標準化した適当な対照実験から得られた結果の割合として表した。非標的化コントロールｓｉＲＮＡと対比した逆数の値により、ｃｌａｕｄｉｎ−５発現の抑制の割合が得られた。平均値、標準偏差及びpooled t検定は、GraphPad Prism(登録商標)を用いて計算した。差はＰ＜０．０５において統計学的に有意と考えられる。
【０１７０】
分析のための共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いたｃｌａｕｄｉｎ−５の間接的免疫染色
脳凍結切片を、ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清で２０分間室温でブロックした。１次抗体（ラビット抗ｃｌａｕｄｉｎ−５、Zymed、カルフォルニア）を切片上で一晩４℃でインキュベートした。このインキュベーション後、切片をＰＢＳ中で３度洗浄し、かつ次に５％ＮＧＳで室温で再びブロックした。ラビットＩｇＧ−Ｃｙ３ ２次抗体を前記切片で２時間３７℃でインキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。全部の切片をＤＡＰＩにより原液１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：５０００の希釈率で３０秒間対比染色した。染色した切片の分析はOlympus FluoView TM FV1000共焦点顕微鏡により行った。
【０１７１】
ビオチン化トレーサー分子の灌流によるＢＢＢ完全性の評価
ｃｌａｕｄｉｎ−５をエンコードする転写物のＲＮＡｉ仲介アブレーション後、トレーサー分子を用いて、ＢＢＢのＴＪが影響を受けた範囲を決定した。ビオチン化試薬EZ-Link TM Sulfo-NHS-Biotin（Pierce）(２ｍｇ／ｍｌのEZ-Link TM Sulfo-NHS-Biotin,４４３Ｄａの体重１ｍｌ／ｇ)、をｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間におけるマウスの左心室を介して５分間灌流させた。トレーサー分子による灌流後脳全体を切り分けてｐＨ７．４の４％ＰＦＡ中に一晩４℃で置き、かつ次にＰＢＳで４×１５分間洗浄した。スクロースによる凍結保護の後、凍結切片をクリオスタット（凍結切片作成機）で−２０℃で切断し、蛍光プローブＦＩＴＣに共役化したストレプトアビジンによりインキュベートした。これによって、脳の微小血管からの分子量４４３Ｄａのビオチン化試薬の漏れの評価が可能となった。全切片を４’、６−ジアミジン−２−フェニルインドール−ジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ；Sigma Aldrich、アイルランド）により原液１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：５０００の希釈率で３０秒間対比染色し、かつ切片をOlympus FluoView TM FV1000共焦点顕微鏡を用いて可視化した。
【０１７２】
５６２ダルトン及び４４００ダルトンの分子に対するＢＢＢ／ＢＲＢ透過率の評価
５６２ダルトンの分子に対する脳及び網膜微小血管の透過率を測定するために、ｃｌａｕｄｉｎ−５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミックデリバリー後２４、４８、７２時間及び１週間において、１００μｇ／ｍｌのHoechst染料Ｈ３３３４２(Sigma Aldrich、アイルランド)及び１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン−４（ＦＤ−４）を含むＰＢＳの体重当たり５００μｌ／ｇを用いてマウスを左心室を通して灌流させた。灌流後、脳全体を切り分けかつｐＨ７．４の４％ＰＦＡ中に一晩４℃で置き、かつ次にＰＢＳで４×１５分間洗浄した。次に、脳を４％アガロース中に包埋し、Vibratome(登録商標)を用いて５０μｍ切片を切断した。眼全体を取り除きかつ４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳによる洗浄及びショ糖勾配を用いた冷凍保護の後、クリオスタットを用いて１２μｍ冷凍切片を切断した。Olympus FluoView TM FV1000共焦点顕微鏡による網膜冷凍切片の分析後、アドビ（登録商標）Photoshop(登録商標)を用いて画像を正しく配向した。
【０１７３】
磁気共鳴イメ−ジング
ｓｉＲＮＡの注射に続いてかつ適当なコントロールを用いて、アクティブ磁気シールドＵＳＲ Magnetを有する小げっ歯類専用Bruker BioSpec70/30（即ち、７Ｔ、ボア径３０ｃｍ）を用いて、ＢＢＢ完全性をＭＲＩにより生体内で評価した。マウスをイソフルオランで麻酔し、生理学的にモニターし（ＥＣＧ、呼吸及び温度）、動物体温を３７℃に維持するためのシステムを組み込んだＭＲＩ互換型支持クレードル上に置いた。次に、前記クレードルをＭＲＩスキャナー内に配置した。正確な配置は、最初の高速パイロット画像を得ることによって確保され、次にこれを用いて正しいジオメトリーが後の全てのＭＲＩ実験においてスキャンされる。ＭＲＩスキャナー内に挿入すると、脳の高解像度解剖画像が得られた（平面１００μｍ及び交差面５００μｍ空間分解能）。次にＢＢＢ完全性を、尾静脈を介して投与したＧｄ−ＤＴＰＡ（ガドリニウム・ジエチレン−トリアミン五酢酸）の０．１ｍＭ／Ｌ／ｋｇボーラスの注射前後において高解像度Ｔ1強調ＭＲ画像に可視化した。
【０１７４】
ＩＭＰＤＨ−／−マウスの網膜電図検査分析及びＧＴＰ注射
ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック注射を受けたＩＭＰＤＨ−／−マウスを一晩暗順応させ、薄暗い赤ランプの下で網膜電図検査を準備した。１％シクロペントラート（cyclopentalate）及び２．５％フェニレフリンのインストールにより瞳孔散大を行った。ケタミン（体重１５ｇ当たり２．０８ｍｇ）及びキシラジン（体重１５ｇ当たり０．２１ｍｇ）の腹腔内注射により動物を麻酔させた。動物が一端麻酔されると、ＧＴＰを腹腔内に注射した。ＥＲＧは、麻酔薬の投与後１０分に開始した。ガンツフェルトボウル内で前記マウスに標準規格の光のフラッシュ照射を行って、網膜の均一な照明を確実にした。ＥＲＧ応答は、Vidisic(Dr Mann Pharma、ドイツ国)を導電剤としてかつ角膜水化を維持するために用いて金線電極（Roland
Consulting Gmbh）により両眼から同時に記録した。前記眼は、眼球の背後に配置した小さいプラスチックバンドにより検査の間中前方下垂した位置に保持した。基準電極及び接地電極を皮下に、側頭眼角から約１ｍｍ及び尾の前方へそれぞれ配置した。体温は、直腸温度探針により制御された加温装置を用いて３７℃に維持した。応答は、RetiScan RetiPort電子生理学装置（Roland Consulting
Gmbh）を用いて分析した。前記プロトコールは、人間の網膜電図検査に関してInternational
Clinical Standards Committeeが承認したものに基づいたものであった。
【０１７５】
フラットマウントした網膜の免疫組織化学分析
眼全体を４％パラホルムアルデヒド中で４時間固定し、その後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。網膜を眼から切り分け、かつ０．５％トリトンＸ−１００及び５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳを用いたインキュベーションによりブロック／透過化した。次に網膜を、１％ＮＧＳ及び希釈率１：５０のラビット抗ｃｌａｕｄｉｎ−５抗体（Zymed)を含む透過化バッファー中で一晩インキュベートした。２時間に亘ってＰＢＳで１０回洗浄した後、蛍光プローブＣｙ−３と共役化したラビットＩｇＧ抗体で網膜を６時間室温でインキュベートした。２時間に亘ってＰＢＳで１０回洗浄した後、網膜をフラットマウントし、かつ共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１７６】
主要器官の内皮細胞形態学
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック注射後、冷凍切片を心臓、肺及び腎臓の主要器官全部について準備した。器官の内皮細胞を染色するために、切片をＨＲＰ標識Griffonia simplicifoliaイソレクチンＢ４により一晩４℃でインキュベートした。
【０１７７】
結果
ＣＬＤＮ５ ｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射がclaudin-５発現を減衰する
claudin-５ ｓｉＲＮＡ２０μｍの送達後、マウスを２４，４８，７２時間及び１週間そのままに置き、その後脳を切り開いてタンパク質及びＲＮＡを上述したように分離した。２４時間後、claudin-５の発現は、コントロール（非注射）、ＰＢＳ注射コントロール及び非標的化（ロドプシン）コントロールと比較したとき、著しく減少した。ＣＬＤＮ５
ｓｉＲＮＡを注射しかつその後４８時間置いたマウスも同様に、使用したコントロールと比較したとき、claudin-５発現の有意な減少を示した。注射後７２時間では、この観察されたclaudin-５発現の減少がそれより明確でなく、発現のレベルがコントロール群で観察されたそれと同様に現れた。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後１週間では、claudin-５発現のレベルが動物のコントロール群のそれと同様であった。全ブロットは、少なくとも３つの別々の実験を表したものである（図１Ａ）。
【０１７８】
claudin-５ ｍＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定し、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間に有意な減少を示した。この非常に有意な減少は後の時点で観察されず、claudin-５
ｍＲＮＡのレベルが非標的化コントロールｓｉＲＮＡに関して９５％まで抑制された（図１Ｂ）。注射後２４，４８，７２時間及び１週間におけるclaudin-５
ｍＲＮＡのレベルは、前記コントロール群において観察されたそれと同様であった（図１Ｂ）。
【０１７９】
claudin-５発現及び局所化は脳毛細血管内皮細胞においてclaudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後に変容する
脳毛細血管内皮細胞のＴＪにおけるclaudin-５の発現レベルは、claudin-５発現の抑制後に劇的に変化した。図２に示すように、脳の微小血管におけるclaudin-５発現及び局所化の免疫組織化学分析は、注射後の全時点で非注射、ＰＢＳ注射、及び非標的化コントロール（ロドプシン）マウスのＢＢＢの内皮細胞の周辺部における線形かつ顕著な染色パターンを示した。
【０１８０】
claudin-５発現は、非注射、ＰＢＳ注射、及び非標的化ｓｉＲＮＡ（ロドプシン）注射のコントロール群の微小血管を覆う内皮細胞の周辺部において線形かつ強かった。しかしながら、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後２４時間では、この染色パターンがそれほど強くなく現れ、かつ注射後４８時間までに、脳全体に亘って脳毛細血管内皮細胞の周辺部におけるclaudin-５発現の存在に、非注射、ＰＢＳ注射、又は非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、著しい低下があった。注射後７２時間に、claudin-５発現は以前として減衰していたが、線形の染色パターンは凍結切片において明らかであった（図２）。
【０１８１】
これらの結果は、少なくとも５つの別個の実験の典型である。
【０１８２】
claudin-５
ｓｉＲＮＡがＢＢＢにおける透過性を増進する
図５は、ビオチン化トレーサー分子の拡散による血液脳関門の評価結果を示している。ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinを、実験条件に晒した後にマウスの左心室を介して灌流させた。蛍光プローブＦＩＴＣに共役化したストレプトアビジンによる凍結切片のインキュベーションで、ＢＢＢの完全性をコントロール群（非注射、ＰＢＳ注射及び非標的化ｓｉＲＮＡ）の微小血管内における緑色蛍光として観察した。しかしながら、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間に、検出した蛍光が、同じ時点における前記コントロール群と対照して、拡散しかつ微小血管の外側にあることを観察した。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後４８時間に、ビオチン化分子の拡散は脳実質において豊富であったが、この透過性はｓｉＲＮＡの送達後７２時間に、同じ時点の前記コントロール群と比較したとき、以前として明確であった。claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後１週間のマウスにおいて、第一アミン反応性ビオチン化試薬が５分間の拡散後に脳実質に沈着しなかったことを観察した。ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の微小血管に残っていることが無傷のＢＢＢによって観察された。
【０１８３】
全トレーサー実験をマウスにおいて少なくとも５回繰り返した。
【０１８４】
要約すれば、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡを脳毛細血管内皮細胞に送達すると、ビオチン化小分子（４４３Ｄａ）に対する透過性の上昇が２４時間後に観察された。このＢＢＢを横切る分子の通過が注射後４８時間に非常に顕著になり、多量のＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の実質組織に浸透した。このＢＢＢを横切る分子の通過は、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後７２時間において以前として明確であったが、注射後１週間にＢＢＢ弱体化の証拠は無く、ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の微小血管内に残っていることを示した（図５）。
【０１８５】
図６は、ビオチン化トレーサー分子の拡散による血液脳関門の完全性の評価の結果を高倍率で示している。claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間における第一アミン反応性ビオチン化試薬（４４３Ｄａ）の５分間の拡散で、非注射、ＰＢＳ注射及び非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、前記分子の脳の実質内への浸透が生じたことを観察した。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後１週間に、ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinが脳の微小血管内に残って、実質内に沈着していないことを観察した。
【０１８６】
要約すれば、claudin-５ ｓｉＲＮＡの注射後１週間に、ＢＢＢが、ｓｉＲＮＡの注射後４８時間には非常に明確に示されたＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinの通過を不可能していることは、海馬の歯状回領域における高倍率での脳凍結切片の分析（識別を簡単にするため）に基づいて、明らかであった（図６）。
【０１８７】
claudin-５
ｓｉＲＮＡが６５２ダルトンの分子に対するＢＢＢ及びＢＲＢにおける透過性の増進を生じる
興味深いことに、核染料Hoechst
Ｈ３３３４２（５６２ダルトン）及びＦＩＴＣ標的デキストランＦＤ−４（４４００ダルトン）の拡散で、Hoechstの溢出がclaudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間までは観察されたが、この溢出が、ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinとは異なり、ｓｉＲＮＡ送達後７２時間には明確でなく、５６２ダルトンの分子に対するバリアー完全性の回復を示唆し、ＢＢＢの開放が時間依存型でサイズ選択的であることを意味している。Hoechst Ｈ３３３４２染料の脳微小血管からの溢出は、実質における周辺の神経細胞及びグリア細胞の核染色によって証明された。ＦＤ−４は脳血管構造の微小血管内に残り、ｓｉＲＮＡ注射後の全時点で溢出は明らかでなかった（図６Ｂ）。更に、網膜冷凍切片の分析で、本願発明者らは、Hoechst Ｈ３３３４２が網膜微小血管から溢出し、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間まで網膜の内網状層（ＩＮＬ）及び外網状層（ＯＰＬ）を染色していることを観察した（図６Ａ）。
【０１８８】
ＭＲＩ分析はclaudin-５ ｓｉＲＮＡの注射後４８時間にＢＢＢ完全性の減損を示した
図７Ａは、血液脳関門の完全性を評価する注射後のＭＲＩスキャンの結果を示している。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡを用いて、claudin-５転写物のアブレーション後のマウスのＢＢＢ完全性を確認した。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後４８時間に、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＢＢＢを通過しかつ脳の実質組織に沈着したことを観察した。前記図面の左側の画像はＧｄ−ＤＴＰＡの注射前のマウス脳の造影コントラストであり、右側の画像はＧｄ−ＤＴＰＡの注射後のマウス脳の造影コントラストである。前記画像は、脳の腹面から背面に移動して冠状断像に撮影したもので、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間におけるＧｄ−ＤＴＰＡ（７４２Ｄａ）の実質への有意な沈着を表している。
【０１８９】
この造影剤の浸透は、非注射、ＰＢＳ注射又は非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスでは存在せず、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間又は１週間のマウスにも存在しなかった。
【０１９０】
要約すれば、Ｇｄ−ＤＴＰＡの脳実質組織内への浸透は、非注射、ＰＢＳ注射及び非標的化ｓｉＲＮＡ注射のマウスと比較したとき、広範で強い造影コントラストとして観察され、サイズで７４２Ｄａの分子の通過を可能にする程度にＢＢＢが弱体化していることを示していた。claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後７２時間及び１週間のマウスについて行ったＭＲＩスキャンは、実質組織にＧｄ−ＤＴＰＡの沈着が無い無傷のバリアーを示し、このＢＢＢの崩壊が一時的な事象であることを強調していた（図７Ａ）。
【０１９１】
結論
実施例１に示したように、脳微小血管系の内皮細胞へのｓｉＲＮＡの送達のハイドロダイナミック方法は、claudin-５発現を抑制するのに非常に有効である（図１Ａ及び図１Ｂ）。この送達方法は、ほとんど害を与えずかつマウスに十分な耐性があった。ウェスタン法のデータは、claudin-５発現抑制がｓｉＲＮＡの送達後４８時間に最大となり、claudin-５の発現レベルが注射後７２時間から１週間の間に正常に戻ることを示した。このように現在は、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡを用いたＢＢＢの可逆的なＲＮＡｉ仲介開放が可能である。
【０１９２】
次に、ＢＢＢが、claudin-５ノックアウトマウスと同様に、claudin-５発現を抑制したときに小分子に対して弱体化されたかどうかを測定した。脳微小血管系の内皮細胞の周辺部において、claudin-５のレベルは、使用した全コントロール群の免疫組織化学分析で強くかつ「線形状」であることを示した。しかしながら、claudin-５を標的としたとき、この線形に現れた発現が不連続かつばらばらになり、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後４８時間において劇的に低下するように現れた（図２）。更に、ビオチン化ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinによる５分間のマウスの灌流で、バリアー機能の有意な弱体化が、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後７２時間までは観察された。ＥＺ-Link ＴＭ Sulfo-NHS-Biotinは、分子量が４４３Ｄａであり、コントロール群で観察されたようにＴＪが無傷である場合、通常はＢＢＢを通過しない。興味深いことに、この分子は、claudin-５
ｓｉＲＮＡの注射後１週間にはもはやＢＢＢを通過せず、このＢＢＢ機能の弱体化が、リアルタイムＰＣＲ及びウェスタン法の分析に矛盾することなく、一時的で可逆的なプロセスであることを示唆している。
【０１９３】
この研究の間、これらのマウスに顕著な又は目に付く行動の変化は無かったが、脳のビブラトーム切片及び凍結切片双方の肉眼組織学的検査は、全ての実験条件下で正常に現れた。
【０１９４】
claudin-５ノックアウトマウスと同様に、前記ＭＲＩ造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡもまた、ｓｉＲＮＡ注射後にＢＢＢを横切りかつ脳の実質組織に沈着することが分かった。実際、非常に大量のＧｄ−ＤＴＰＡがclaudin-５
ｓｉＲＮＡの送達後４８時間に脳に沈着した。この７４２Ｄａの分子に対するＢＢＢの崩壊は、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後７２時間及び１週間においてＧｄ−ＤＴＰＡの沈着が全く現れなかったことから、一時的な事象であった。これらの結果の有意性は、一時的な事象であることと同様に、４４３Ｄａの分子がｓｉＲＮＡの送達後７２時間にＢＢＢを横断したのに対し、同じ時点で７４２Ｄａの分子はそのようにできず（図７Ａ）、５６２Ｄａの分子はｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間にＢＢＢを横断したが、４４００Ｄａの分子はそのようにできなかった（図６Ａ及び図６Ｂ）ことが観察されたことで証明されるように、claudin-５の抑制がバリアーの透過性にサイズ選択的な変化を生じさせているように現れたことであった。
【０１９５】
ｓｉＲＮＡが尾静脈を介して投与され、かつclaudin-５が肺及び心臓の微小血管の内皮細胞に発現するという事実を考慮すると、本願発明者らは、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡが肝臓、肺、腎臓又は心臓の内皮細胞形態学に悪影響を与えるかどうか評価したいと考えた。これら器官のそれぞれの凍結切片を、claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後の全時点でかつ適当なコントロールを組み入れて準備した。切片を、無傷の内皮細胞に結合するＨＲＰ標識Griffonia simplicifoliaイソレクチンＢ４で染色し、内皮細胞形態学が、コントロール群と比較したとき、ｓｉＲＮＡの注射後に全時点でかつ全部の主要器官で同様に現れた（図９〜図１２）ことを示した。脳及び眼以外の器官におけるclaudin-５の役割が十分には特徴付けられていないが、それがこれら他の器官に関連したタイト結合のサイズ選択的な特性を維持する上で根本的なことではないように見えることに注意することが重要である。
【０１９６】
最後に、今ではＢＢＢ及びＢＲＢの内皮細胞にｓｉＲＮＡ分子を全身送達することが可能である。ＴＪタンパク質claudin-５を標的とした抑制が、バリアーの細胞間透過性を一時的かつサイズ選択的に増加させ、これが、さもなければ脳から排除されていたであろう分子の送達を可能にすることがてきる。
【０１９７】
実施例２：甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）の血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ったclaudin-５抑制マウスへの送達
材料及び方法
甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）（Sigma Aldirich、アイルランド）
ＴＲＨは、顕著な神経保護作用を有するものとして提案した。これはまた、ラットに投与したとき、「wet dog shake」（全身の身震い）という行動出力を引き起こす。しかしながら、ＴＲＨは、その不安定性及びその結果である短い作用の持続時間、並びにＢＢＢを横切る透過が遅いことを含むいくつかの欠点を有する。
【０１９８】
ＴＲＨのclaudin-５抑制マウスへの送達
実施例１のプロトコルに従って、一時的にclaudin-５抑制したマウスを生産した。
【０１９９】
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡの送達後４８時間に、２０ｍｇ／ｋｇの甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）を含む溶液２００μｌをclaudin-５抑制マウスに注射した。ＴＲＨを尾静脈に注射しかつ即座に、マウスの行動出力を、それらを透明なPerspex（商品名）箱内で撮影することによって評価した。
【０２００】
結果及び結論
図８に示したように、claudin-１タンパク質のアブレーション後、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスがＴＲＨ２０ｍｇ／ｋｇの投与で動けない状態にある時間の長さの顕著な変化を観察した。
【０２０１】
この行動出力は、非標的化コントロールマウスにおいて観察された行動とは有意に異なり、ＢＢＢが弱まったときにＴＲＨの送達が有意に増進されたことを明確に示唆した。
【０２０２】
これらの結果は、実施例１のプロトコルを用いてＢＢＢを開放して、以前は可能でなかった成分のＢＢＢへの送達を可能にできることを示している。これらの結果は、ＢＢＢが制御されたサイズ選択的な手法で可逆的かつ一時的に開いたとき、ＴＲＨ（３５９．５Ｄａ）の送達が有意に増進したことを明確に示唆している。
【０２０３】
実施例３
claudin-１を標的としたｓｉＲＮＡの全身ハイドロダイナミック尾静脈デリバリーを用いたＣ５７／ＢＬ６マウスの血液脳関門におけるclaudin-１発現の生体内抑制
材料
claudin-１を標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
【０２０４】
【化８】
【０２０５】
方法
使用したプロトコルは、実施例１で使用したプロトコルと同一であった。
【０２０６】
結果及び結論
結果を図３Ａ、図２３及び図２４に示す。
【０２０７】
この実施例は、claudin-１に向けたｓｉＲＮＡがＢＢＢにおける細胞間透過性を５６２ダルトンの分子に対して増加させるが、４４００ダルトンの分子に対してはそうでないことを示している。claudin-１の抑制は、claudin-５が抑制されたときに観察されたそれと同様にしてＢＢＢのサイズ選択的に開放させるように現れている。
【０２０８】
実施例４
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの全身ハイドロダイナミック尾静脈デリバリーを用いたＣ５７／ＢＬ６マウスの血液脳関門におけるoccludin発現の生体内抑制
材料
occludinを標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
【０２０９】
【化９】
【０２１０】
方法
使用したプロトコルは、実施例１で使用したプロトコルと同一であった。
【０２１１】
結果及び結論
結果を図３Ｂ、図１９、図２０、図２１及び図２２に示す。
【０２１２】
この実施例は、occludinに向けたｓｉＲＮＡが、７０，０００ダルトン超の分子に対して、これが大凡アルブミンの分子量であることから、ＢＢＢにおける細胞間透過性を増加させることを示している。しかしながら、ＢＢＢにおけるoccludinの抑制が、より大きなサイズ篩い分け限界を生み出す。アルブミンの沈着はoccludin ｓｉＲＮＡ３及び４の注射後２４時間に発生したが、血液中の免疫グロブリン（ＩｇＧ）の溢出は無かったことが観察された。ＩｇＧは、分子量が約１２０，０００ダルトンである。
【０２１３】
材料
claudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡ設計のＷｅｂベースのプロトコル
【０２１４】
【化１０】
【０２１５】
方法
使用したプロトコルは、実施例１で使用したプロトコルと同一であった。
【０２１６】
結果及び結論
claudin-１２のレベルは、claudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後に減少することを示した（図１２）。claudin-１２の染色パターンは、非標的化コントロールｓｉＲＮＡの注射後４８時間において脳微小血管系に関連していることが観察された。しかしながら、claudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後４８時間に、脳の微小血管における発現のレベルが、試験した両方のｓｉＲＮＡ（即ち、ＣＬＤＮ１２
ｓｉＲＮＡ（３）及びＣＬＤＮ１２
ｓｉＲＮＡ（４））において減少することを示した。
【０２１７】
非標的化ｓｉＲＮＡ又はclaudin-１２を標的としたｓｉＲＮＡのハイドロダイナミック尾静脈注射後に、マウスは、左心室を通して、ＦＩＴＣ−デキストラン−４及びHoechst３３３４２（５６２Ｄａ）を含む溶液を灌流させた。ｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後に、血管外の核の染色により明示されるように、微小血管系からHoechstの溢出があったことが観察された。ＦＴ−４は、非標的化ｓｉＲＮＡ及びｃｌａｕｄｉｎ−１２を標的としたｓｉＲＮＡの注射後の双方において微小血管内に観察された（図３１）。
【０２１８】
実施例６
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡの送達後４８時間のＧｄ−ＤＴＰＡ
材料及び方法
実施例１のプロトコルに従って、一時的にclaudin-５抑制したマウスを生産した。
【０２１９】
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡの送達後４８時間に、Ｇｄ−ＤＴＰＡを含む溶液をclaudin-５抑制マウスに注射した。Ｇｄ−ＤＴＰＡを尾静脈に注射して、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＢＢＢを透過するかどうかを評価した。ｓｉＲＮＡの注射後にかつ適当なコントロールを用いて、７４２ダルトンの分子に対するＢＢＢ完全性をＭＲＩによって、アクティブ磁気シールドＵＳＲ
Magnetを有する小げっ歯類専用Bruker BioSpec70/30（即ち、７Ｔ、ボア径３０ｃｍ）を用いて評価した。マウスをイソフルオランで麻酔し、生理学的にモニターし（ＥＣＧ、呼吸及び温度）、動物体温を３７℃に維持するためのシステムを組み込んだＭＲＩ互換型支持クレードル上に置いた。次に、前記クレードルをＭＲＩスキャナー内に配置した。正確な配置は、最初の高速パイロット画像を得ることによって確保され、次にこれを用いて正しいジオメトリーが後の全てのＭＲＩ実験においてスキャンされる。ＭＲＩスキャナー内に挿入すると、脳の高解像度解剖画像が得られた（平面１００μｍ及び交差面５００μｍ空間分解能）。次にＢＢＢ完全性を、尾静脈を介して投与したＧｄ−ＤＴＰＡ（ガドリニウム・ジエチレン−トリアミン五酢酸）の０．１ｍＭ／Ｌ／ｋｇボーラスの注射前後において高解像度Ｔ1強調ＭＲ画像に可視化した。Ｇｄ−ＤＴＰＡの注射後、３分Ｔ1強調スキャンの繰り返しを３０分間に亘って行ったが、図示した画像は、この３０分間の最後のスキャンの典型的なものを表している。小脳、海馬及び皮質の結合領域の全濃度測定結果の統計学的分析をＡＮＯＶＡを用いて行い、有意をＰ値≦０．０５により示したが、結果は、図表と脳内のＧｄ−ＤＴＰＡ沈着の速度を示す定量的画像との両方で表している。全部のＭＲＩスキャンを各実験処置から２匹のマウスについて実行した。
【０２２０】
結果
図２６は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡのデリバリー後４８時間におけるマウス脳の海馬領域のＴ１強調ＭＲＩ画像を示しており、Ｇｄ−ＤＴＰＡが脳微小血管から溢出している脳内のコントラストが強調して明確に示されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡは７４２ダルトンの分子量を有し、その脳内への透過は、ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間においてのみ観察された。
【０２２１】
図２７は、ｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの大容量尾静脈注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内における血流量及び血液量に関係するＭＲＩ情報を示している。このデータによって、２つの事柄に関する情報、即ち平均通過時間（ＭＴＴ）及び毛細血管通過時間（ＣＴＴ）が得られる。ＭＴＴは、ラベリングしたスピンがラベリング面（頸動脈の画像スライスから１ｃｍまで）から画像スライスまで移動するのに要する時間を表している。
【０２２２】
これは曲線の１次モーメント又は平均から計算される。曲線の二次モーメント（分散）から、ラベリングしたスピンが毛細血管床から組織への変換により画像スライス全体に分散されるのに要する時間であるＣＴＴが得られる。群毎に８匹までの動物について、脳の主要な血管又は毛細血管内の血流に有意な差は見ていないが、これは、claudin-５
ｓｉＲＮＡを脳の微小血管内皮細胞に送達するのに大容量の注射が必要なことを考えると、相当有望である。
【０２２３】
図２８は、試験した各実験群について実験データに適合させた脳血流量及び脳血液量の理論的モデルを示している。これらは、各グループについて殆ど同じであり、図２７に示した棒グラフの結果に一致している。
【０２２４】
結論
最後に、これらの結果は、脳の大きな血管又は微小血管系における血流量又は血液量の差を全く観察していないことを示しており、脳浮腫の場合には、claudin-５
ｓｉＲＮＡが実際に、脳の外傷の部位における水分拡散の速度の増加を可能にできることを示唆している。
【０２２５】
実施例７
非標的化又はclaudin-５ ｓｉＲＮＡを受け取った後２４時間又は４８時間のマウスの脳内における水分拡散
材料及び方法
実施例１のプロトコルに従って、一時的にclaudin-５抑制したマウスを生産した。
【０２２６】
claudin-５を標的としたｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡの送達後２４時間及び４８時間に、マウスをイソフルオランで麻酔し、生理学的にモニターし（ＥＣＧ、呼吸及び温度）、動物体温を３７℃に維持するためのシステムを組み込んだＭＲＩ互換型支持クレードル上に置いた。次に、前記クレードルをＭＲＩスキャナー内に配置した。正確な配置は、最初の高速パイロット画像を得ることによって確保され、次にこれを用いて正しいジオメトリーが後の全てのＭＲＩ実験においてスキャンされる。ＭＲＩスキャナー内に挿入すると、脳の高解像度解剖画像が得られた（平面１００μｍ及び交差面５００μｍ空間分解能）。水分拡散のスキャンに引き続き着手した。広範なｂ値について画像を得るために、拡散勾配（Stejskal-Taner勾配）を有するスピンエコーＥＰＩ画像シーケンスのような標準の拡散イメージングシーケンスを用いた。このようにして、血管コンパートメント内及び脳実質組織内における技術の効果を比較することができる。全実験は、最大磁気勾配強度４００ｍＴ／ｍの７Ｔ
Ｂｒｕｋｅｒ小口径システムで行った。画像処理及びＡＤＣの計算は、ＩＤＬを用いて行った。
【０２２７】
結果
図２９は、Ｂ値（Ｘ軸）とその上にプロットしたＭＲＩ信号強度（Ｙ軸）を示しており、非標的化ｓｉＲＮＡ又はｃｌａｕｄｉｎ−５を標的としたｓｉＲＮＡの注射後２４時間及び４８時間におけるマウスの脳内の水分拡散の速度に変化がないこと示している。この脳から血液への水分の拡散が一定の速度であることは、一次的なＢＢＢの開放それ自体がマウス脳内における水分の拡散になんら強い影響を与えていないことを示唆している。
【０２２８】
最後に、図３０に示す結果は、非標的化ｓｉＲＮＡ又はclaudin-５ ｓｉＲＮＡを受け取った後２４時間又は４８時間のマウスの脳内における水分拡散の速度を示している。基本的に、これらの実験条件下でいずれのマウスも拡散に変化は無い。これは別の重要な観察結果であり、かつ実施例６のように、脳浮腫の場合には、claudin-５
ｓｉＲＮＡが実際に、脳の外傷の部位における水分拡散の速度の増加を可能にできることをも示唆している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的に開放するための方法において使用するための、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉ誘導剤の前記対象への送達からなり、かつ脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、理想的には１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞の透過を可能にする方法において使用するための請求項１に記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項３】
前記方法が好ましくは前記ＲＮＡｉ誘導剤の前記対象への全身送達を含み、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターである請求項１又は２に記載のＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項４】
治療での使用のために血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的に開放するためにタイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターである請求項１又は２に記載のＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項５】
脳又は網膜の疾病又は疾患の治療のための薬剤の製造において、タイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達後における血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的な開放からなり、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、脳又は網膜の疾病又は疾患の治療に関する活性剤の透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項６】
タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤が、一時的に血液脳関門を開いて、前記血液脳関門を横切る前記活性剤の送達を可能にし、かつ前記治療が前記活性剤及びＲＮＡｉ誘導剤の同時投与又は連続投与からなる請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記活性剤が、神経機能を調節する薬剤、網膜機能を調節する薬剤、又は化学療法／抗腫瘍効果を有する薬剤である請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
外傷性脳損傷又は脳卒中の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤の全身送達からなり、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、前記血液脳関門を横切る水分の透過及び自由拡散、頭蓋内圧の低下、及び／又は脳浮腫の減少を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項９】
高張食塩水又は糖液のような活性剤の連続又は同時投与を更に含む請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
神経変性疾患又は精神神経疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合調節ペプチド転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、神経機能を調節する活性剤の脳毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１１】
脳腫瘍の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、抗腫瘍剤又は化学療法剤の脳毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１２】
網膜の疾病の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、血液脳関門及び／又は血液網膜関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、網膜機能を調節する活性剤の網膜毛細血管内皮細胞及び脳毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１３】
送達が全身送達により行われる請求項５乃至１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
高濃度の前記ＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡを前記対象に送達する請求項５乃至１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
全身送達がハイドロダイナミックデリバリー又は非ハイドロダイナミックデリバリーにより行われる請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達のために、カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、脂質、リポゾーム、非カチオン性ポリマー及び／又はウイルスベクターを使用する請求項５乃至１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞を、１ｋＤａ未満、好ましくは８００Ｄａ未満の分子が透過する請求項５乃至１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
ＲＮＡｉ仲介抑制が、ＲＮＡｉ誘導剤の送達後２４時間から開始し、前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達後７２時間まで持続する請求項５乃至１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記タイト結合タンパク質が、膜貫通タンパク質及び／又はタイト結合関連分子から選択される請求項５乃至１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記膜貫通タンパク質が接合部接着分子（ＪＡＭ）である請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記タイト結合関連分子が、次のｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ及び／又はｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎの１種又は２種以上から選択される請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記ｃｌａｕｄｉｎがｃｌａｕｄｉｎ−１乃至ｃｌａｕｄｉｎ−１９及び／又はｃｌａｕｄｉｎ−２１の１種又は２種以上から選択される請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ｃｌａｕｄｉｎがｃｌａｕｄｉｎ−１、ｃｌａｕｄｉｎ−５及び／又はｃｌａｕｄｉｎ−１２から選択される請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＲＮＡｉ誘導剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターである請求項５乃至２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記ＲＮＡｉ誘導剤がｓｉＲＮＡである請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及び２；３及び４；５及び６；７及び８；９及び１０；１１及び１２；１３及び１４；１５及び１６；１７及び１８；１９及び２０；２１及び２２；２４及び２５；２６及び２７；２８及び２９；又は３０及び３１のいずれか１つから選択される請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
異なるＴＪタンパク質を標的とした１種又は２種以上のｓｉＲＮＡを使用する請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
ａ．血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的な開放を生じるべく、タイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤と、
ｂ．特定された疾病又は疾患の治療のための活性剤と
からなる医薬組成物。
【請求項２９】
全身送達、好ましくは全身ハイドロダイナミックデリバリーに適した請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記活性剤が、神経機能又は網膜機能を調節する薬剤、又は化学療法／抗腫瘍効果を有する薬剤である請求項２８又は２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記活性剤が低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである請求項２８乃至３０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３２】
血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的に開放するための方法であって、タイト結合タンパク質を標的とした有効量のＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、それが脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ好ましくは１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を横切る透過を可能にする方法。
【請求項３３】
血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的な開放からなる、疾病又は疾患の治療のための方法であって、前記方法が、
前記疾患又は疾病を発症する虞がある対象を識別する過程と、
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達により、タイト結合タンパク質を標的とした有効量の、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤を投与して、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ理想的には１５ｋＤａ未満の、前記疾患又は疾病の治療に使用される活性剤の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞への透過を可能にする過程と、
前記疾患又は疾病の治療に適した活性剤を投与する過程とからなる方法。
【請求項３４】
全身送達、好ましくは全身ハイドロダイナミックデリバリーを含む請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患又は疾病が、次の神経変性疾患、精神神経疾患、脳腫瘍、網膜疾病、外傷性脳損傷及び／又は脳卒中のいずれか１つから選択される請求項３２乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
条件付きタイト結合タンパク質ノックアウトマウスを育成して広範囲の医薬生成物の効果を試験しかつ／又は細胞間システムを研究するべく、血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的に開放するためにタイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１】
対象における血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的に開放するための方法において使用するための、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉ誘導剤の前記対象への送達からなり、かつ脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、理想的には１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞の透過を可能にする方法において使用するための請求項１に記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項３】
前記方法が好ましくは前記ＲＮＡｉ誘導剤の前記対象への全身送達を含み、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターである請求項１又は２に記載のＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項４】
治療での使用のために血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的に開放するためにタイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターである請求項１又は２に記載のＲＮＡｉ誘導剤。
【請求項５】
脳又は網膜の疾病又は疾患の治療のための薬剤の製造において、タイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達後における血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的な開放からなり、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、脳又は網膜の疾病又は疾患の治療に関する活性剤の透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項６】
タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤が、一時的に血液脳関門を開いて、前記血液脳関門を横切る前記活性剤の送達を可能にし、かつ前記治療が前記活性剤及びＲＮＡｉ誘導剤の同時投与又は連続投与からなる請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記活性剤が、神経機能を調節する薬剤、網膜機能を調節する薬剤、又は化学療法／抗腫瘍効果を有する薬剤である請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
外傷性脳損傷又は脳卒中の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤の全身送達からなり、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、前記血液脳関門を横切る水分の透過及び自由拡散、頭蓋内圧の低下、及び／又は脳浮腫の減少を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項９】
高張食塩水又は糖液のような活性剤の連続又は同時投与を更に含む請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
神経変性疾患又は精神神経疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的とした前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合調節ペプチド転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、神経機能を調節する活性剤の脳毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１１】
脳腫瘍の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、脳毛細血管内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、抗腫瘍剤又は化学療法剤の脳毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１２】
網膜の疾病の治療のための薬剤の製造における、請求項５乃至７のいずれかに記載のタイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の使用であって、
前記治療が、タイト結合タンパク質を標的としたＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、血液脳関門及び／又は血液網膜関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じて、好ましくは１５ｋＤａ未満の、網膜機能を調節する活性剤の網膜毛細血管内皮細胞及び脳毛細血管内皮細胞を横切る透過及び送達を可能にするＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【請求項１３】
送達が全身送達により行われる請求項５乃至１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
高濃度の前記ＲＮＡｉ誘導剤、好ましくはｓｉＲＮＡを前記対象に送達する請求項５乃至１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
全身送達がハイドロダイナミックデリバリー又は非ハイドロダイナミックデリバリーにより行われる請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達のために、カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、脂質、リポゾーム、非カチオン性ポリマー及び／又はウイルスベクターを使用する請求項５乃至１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞を、１ｋＤａ未満、好ましくは８００Ｄａ未満の分子が透過する請求項５乃至１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
ＲＮＡｉ仲介抑制が、ＲＮＡｉ誘導剤の送達後２４時間から開始し、前記ＲＮＡｉ誘導剤の送達後７２時間まで持続する請求項５乃至１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記タイト結合タンパク質が、膜貫通タンパク質及び／又はタイト結合関連分子から選択される請求項５乃至１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記膜貫通タンパク質が接合部接着分子（ＪＡＭ）である請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記タイト結合関連分子が、次のｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ及び／又はｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎの１種又は２種以上から選択される請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記ｃｌａｕｄｉｎがｃｌａｕｄｉｎ−１乃至ｃｌａｕｄｉｎ−１９及び／又はｃｌａｕｄｉｎ−２１の１種又は２種以上から選択される請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ｃｌａｕｄｉｎがｃｌａｕｄｉｎ−１、ｃｌａｕｄｉｎ−５及び／又はｃｌａｕｄｉｎ−１２から選択される請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＲＮＡｉ誘導剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターである請求項５乃至２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記ＲＮＡｉ誘導剤がｓｉＲＮＡである請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及び２；３及び４；５及び６；７及び８；９及び１０；１１及び１２；１３及び１４；１５及び１６；１７及び１８；１９及び２０；２１及び２２；２４及び２５；２６及び２７；２８及び２９；又は３０及び３１のいずれか１つから選択される請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
異なるＴＪタンパク質を標的とした１種又は２種以上のｓｉＲＮＡを使用する請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
ａ．血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的な開放を生じるべく、タイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤と、
ｂ．特定された疾病又は疾患の治療のための活性剤と
からなる医薬組成物。
【請求項２９】
全身送達、好ましくは全身ハイドロダイナミックデリバリーに適した請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記活性剤が、神経機能又は網膜機能を調節する薬剤、又は化学療法／抗腫瘍効果を有する薬剤である請求項２８又は２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記活性剤が低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである請求項２８乃至３０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３２】
血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的に開放するための方法であって、タイト結合タンパク質を標的とした有効量のＲＮＡｉ誘導剤の送達からなり、それが脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ好ましくは１５ｋＤａ未満の分子の脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞を横切る透過を可能にする方法。
【請求項３３】
血液脳関門の細胞間通路の一時的、可逆的かつ制御されたＲＮＡｉ仲介サイズ選択的な開放からなる、疾病又は疾患の治療のための方法であって、前記方法が、
前記疾患又は疾病を発症する虞がある対象を識別する過程と、
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達により、タイト結合タンパク質を標的とした有効量の、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内での存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産となるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤を投与して、脳毛細血管内皮細胞又は網膜内皮細胞における血液脳関門タイト結合タンパク質転写物の可逆的かつ一時的なＲＮＡｉ仲介抑制を生じ、かつ理想的には１５ｋＤａ未満の、前記疾患又は疾病の治療に使用される活性剤の脳毛細血管内皮細胞及び／又は網膜内皮細胞への透過を可能にする過程と、
前記疾患又は疾病の治療に適した活性剤を投与する過程とからなる方法。
【請求項３４】
全身送達、好ましくは全身ハイドロダイナミックデリバリーを含む請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患又は疾病が、次の神経変性疾患、精神神経疾患、脳腫瘍、網膜疾病、外傷性脳損傷及び／又は脳卒中のいずれか１つから選択される請求項３２乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
条件付きタイト結合タンパク質ノックアウトマウスを育成して広範囲の医薬生成物の効果を試験しかつ／又は細胞間システムを研究するべく、血液脳関門の細胞間通路を一時的、可逆的かつ制御されたサイズ選択的に開放するためにタイト結合タンパク質を標的とした、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は、その細胞内における存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの生産を生じるＲＮＡｉ誘導ベクターであるＲＮＡｉ誘導剤の使用。
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ａ１】
【図７Ａ２】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ａ１】
【図７Ａ２】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公表番号】特表２０１１−５０１６６２（Ｐ２０１１−５０１６６２Ａ）
【公表日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８４３０（Ｐ２０１０−５２８４３０）
【出願日】平成２０年１０月１３日（２００８．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３７３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７３６２
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５９９０４９９４５）ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ Ｆｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｙ ａｎｄ Ｕｎｄｉｖｉｄｅｄ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎｅａｒ Ｄｕｂｌｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１３日（２００８．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３７３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７３６２
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５９９０４９９４５）ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ Ｆｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｙ ａｎｄ Ｕｎｄｉｖｉｄｅｄ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎｅａｒ Ｄｕｂｌｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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