タンパク質組成物を乾燥させる方法、乾燥タンパク質組成物、及び乾燥タンパク質を含有する薬学的組成物
本発明は、タンパク質溶液を噴霧乾燥させる方法、及び噴霧乾燥させたタンパク質生成物に関する。また本発明は、このような噴霧乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物、本発明の噴霧乾燥させたタンパク質を使用する糖尿病及び高血糖症を治療する方法、及び糖尿病及び高血糖症の治療におけるこのような噴霧乾燥させたタンパク質の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質溶液を乾燥させる方法及び乾燥させたタンパク質生成物に関する。また本発明は、このような乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物、本発明の乾燥させたタンパク質を使用する糖尿病及び高血糖症を治療する方法、及び糖尿病及び高血糖症の処置における、このような乾燥させたタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾燥とは、固体、半固体又は液体から、固形状態になるまで、蒸発により水分を除去する物質移動方法である。可能な乾燥方法は真空乾燥であり、生じた蒸気を真空システムにより除去しつつ、接触伝導又は放射線(又は電磁波)により、熱が供給される。他の技術はドラム乾燥であり、室外に蒸気を引き出す吸引装置及びエネルギーを提供するために、加熱表面が使用される。
フリーズドライ又凍結乾燥は、生化学工業で通常使用されている乾燥方法である。乾燥前に溶媒を凍結させ、ついで昇華させる、すなわち、溶媒の融点以下で固相から直接ガス相にさせる。フリーズドライは、多くの場合、乾燥可能な高圧下で実施され、適切な速度で続行される。タンパク質及びペプチドの変性は凍結中に生じ、品質の乏しいフリーズドライ製品に至るおそれがある。
噴霧乾燥は、化学工業、食品工業、及び生化学及び製薬工業において、広範囲に応用されている。噴霧乾燥は、１９４０年代の初期より製薬工業に使用されている。予め定められた特性、例えば粒度分布及び形状を有するパウダーを得る手段が提案されているため、薬剤可能の有用な方法であるとされている。さらに、多くの調製プロセスが、噴霧乾燥では一工程で達成可能であり：これらには、カプセル化、錯体形成、及び重合が含まれる。また噴霧乾燥は、熱に敏感な製薬、例えば活性の損失を最小限にしたタンパク質製剤を乾燥するのに便利な方法である。
【０００３】
国際特許出願ＷＯ００／００１７６号には、所望しない多量の塩又は他の割形剤が同時に生成することなく、治療剤の実質的に純粋な溶液を噴霧乾燥させることにより得られる、微小粒子処方物が開示されている。塩は安定化効果を有しておらず、実際に、塩の量を減少させると安定化が増すために、塩は所望されないと言われている。インスリン微小粒子は、酸にＺｎ-インスリンを溶解させ、インスリン溶液が例えばｐＨ７以上になるようにアルカリ(ＮａＯＨ)を添加し、インスリン溶液を噴霧乾燥させることで得られる。添加された塩酸及び水酸化ナトリウムは、塩分と共に、噴霧乾燥された微小粒子処方物中に残る。さらに、得られた処方物は、水に添加されると、噴霧乾燥に送られたタンパク質溶液と同じｐＨを有するようになるであろう。
【０００４】
国際特許公開ＷＯ９５／２４１８３号は、インスリンの肺送達についての方法及び組成物に関する。インスリンパウダーは、７．５ｍｇ／ｍｌの最終固体濃度及び６．７±０．３のｐＨが付与されるように、賦形剤(マンニトール及び／又はラフィノース)を含有するクエン酸バッファー中でバルク結晶インスリンを混合し、ついで、インスリン溶液を噴霧乾燥させることにより生成される。
国際特許公開ＷＯ０５／０９２３０１号は、インスリンの等電点以下、好ましくは５．４以下のｐＨで、インスリンの透明溶液を噴霧乾燥させることに関する。ヒトＧＬＰ-１は、とりわけ回腸末端部のＬ-細胞、膵臓及び脳で合成される、プレプログルカゴンに由来する、３７のアミノ酸残基ペプチドである。ＧＬＰ-１は、グルコース代謝及び消化管の分泌及び代謝における調節機能を有する重要な消化管ホルモンである。ＧＬＰ-１はグルコース依存性方式におけるインスリン分泌を刺激し、インスリンの生合成を刺激し、ベータ細胞の救助を促進し、グルカゴンの分泌、胃内容排出及び食物の取込を低下させる。ヒトＧＬＰ-１は、双方ともインスリン分泌ペプチドである、ＧＬＰ-１(７-３７)及びＧＬＰ-１(７-３６)に加水分解される。
【０００５】
治療用のホルモンインスリンは、血糖値に影響を与える小タンパク質である。それは、数百万の人々の糖尿病の薬物療法に、日々使用されている。糖尿病は、長期にわたる合併症に至る、高血糖値(高血糖症)に帰する、インスリン及びインスリン耐性の絶対的又は相対的欠乏症に起因する慢性病である。
【０００６】
現在、１型糖尿病及び２型糖尿病の双方の糖尿病の処置は、いわゆる強化インスリン療法に依存する度合いがますます増加している。この治療法によれば、患者は、基礎インスリン必要量を補うための持続型インスリンの１日１又は２回の注射を含む複数回の毎日のインスリン注射に、食事に関連したインスリン必要量を補うための速効型インスリンのボーラス注射が補填された治療を受ける。
【０００７】
インスリン分子は、それぞれ２１及び３０残基を有する２本の鎖Ａ及びＢからなる。Ａ鎖は、鎖内ジスルフィド結合により、ヘリックスの一方に結合した短い伸長部分により離間した、２つのらせん状断片から組立られている。２つの付加的なジスルフィド結合が、Ａ鎖とより長いＢ鎖とを結合させている。生物学的に活性な形態では、インスリンはモノマーとして存在しており、Ｂ鎖は２つの伸長した部分の側面に配された中心ヘリックス領域を含む。亜鉛等の二価イオンの存在下、モノマーはヘキサマーに組立られ、ここで、それぞれ２つの中心亜鉛イオンは、３つのヒスチジン残基に配位している。
インスリンは、十分に順序付けされたクロス-βアセンブリに至らしめる、フィブリル化、ミスフォールディングプロセスに敏感である。β細胞におけるフィブリル化の保護は、亜鉛ヘキサマー内の敏感な分子の金属イオン封鎖により提供される。インスリンの噴霧乾燥中にフィブリル化が生じた場合は、ノズルが詰まり、乾燥プロセスが中断されるおそれがある。
噴霧乾燥用ノズルの詰まりを回避するための他の重要な要因は、乾燥されるタンパク質が適切に溶液中に溶解していることである。送られる溶液に分散しているタンパク質により、装置の詰まりに至るおそれがある。
さらに、乾燥させたタンパク質のｐＨは非常に重要である。多くの場合、特定のｐＨ、例えば生理的ｐＨに匹敵するｐＨを有する乾燥生成物を得ることが所望されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、タンパク質溶液を乾燥させる方法に関し、ここで
ａ）賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質を混合し、タンパク質溶液がアルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、場合によっては非揮発性酸を用いて、ｐＨを調節することによって、タンパク質溶液を得、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる。
さらに本発明は、上述した方法により得られる乾燥させたタンパク質、乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物、及び糖尿病を使用するための方法に関する。
【０００９】
(定義)
ここに記載するような「タンパク質溶液」とは、酸を使用することなく、タンパク質の等電点以上のｐＨ値で溶解する、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体又はグルカゴンの溶液を意味する。
「揮発性塩基」とは、室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する塩基、又は室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する塩基を含む水性共沸混合物等、加熱及び／又は減圧時に、ある程度蒸発するであろう塩基を意味する。
ここに記載するような「非揮発性塩基」とは、室温で６５Ｐａ以下の蒸気圧を有する塩基等、加熱時に蒸発しない又は一部のみが蒸発する塩基を意味する。
【００１０】
ここに記載するような「非揮発性酸」とは、リン酸等、室温で６５Ｐａ以下の蒸気圧を有する酸等、加熱時に蒸発しない又は一部のみが蒸発する酸を意味する。
ここに記載するような「強酸」とは、塩酸及び硫酸等、１以下のｐＫａ値を有する酸を意味する。
ここで使用されるような「インスリン」とは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７との間、及びＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９との間にジスルフィド架橋、及びＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１との間に内部ジスルフィド架橋を有するヒトインスリン、ブタインスリン又はウシインスリン、又はそのインスリンアナログ又は誘導体を意味する。
ここで使用されるような「ＧＬＰ-１」とは、グルカゴン様ペプチド-１を意味する。ヒトＧＬＰ-１は３７のアミノ酸残基のペプチドである。ヒトＧＬＰ-１は、双方ともインスリン分泌ペプチドである、ＧＬＰ-１(７-３７)及びＧＬＰ-１(７-３６)に加水分解される。
【００１１】
「タンパク質溶液／インスリン溶液／ＧＬＰ-１溶液／グルカゴン溶液のｐＨ」とは、揮発性及び非揮発性塩基で調節した後、またタンパク質溶液を噴霧乾燥する前の、タンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴン溶液のｐＨを意味する。
「乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンのｐＨ」とは、少なくとも２０ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質と０．５ｍｌの脱塩水を混合し、脱塩水のｍｌ当たり少なくとも４０ｍｇ濃度のタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１が得られるようにし、ｐＨを測定した場合の、乾燥した／噴霧乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンのｐＨを意味する。乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１のｐＨは、約３００ｍｇまでの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１と０．５ｍｌの脱塩水を混合し、ｐＨを測定することにより決定することができる。例えば、ｐＨは、約２０〜約２５０ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、約２０〜約２００ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、約２０〜約１５０ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、又は約２０〜約１００ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、ｐＨを測定することにより決定される。
【００１２】
「乾燥させたタンパク質の標的ｐＨ」とは、乾燥させたタンパク質を得るのに望ましい、乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンのｐＨを意味し、例えば、乾燥させたタンパク質の化学的安定性が最適であるか、又は乾燥させたタンパク質が生理的ｐＨに匹敵するｐＨである。
「タンパク質溶液の標的ｐＨ」とは、乾燥した場合に、タンパク質溶液／インスリン溶液／ＧＬＰ-１溶液／グルカゴン溶液にとって望ましいであろうｐＨを意味し、例えば高溶解性又は低凝集性とするのに、溶解したタンパク質にとっては最適なｐＨである。
【００１３】
ここで使用される場合「アナログ」とは、天然に生じるインスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び／又は交換することにより、及び／又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、タンパク質の構造から形式的には誘導することができる分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加された及び／又は交換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じる残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れかとすることができる。インスリンアナログは、Ｂ鎖の２８位が、天然Ｐｒｏ残基から、Ａｓｐ、Ｌｙｓ又はＩｌｅの一つに修飾され得るものであってよい。他の態様において、インスリンのＢ２９位のＬｙｓは、Ｐｒｏ又はＧｌｕに修飾されている。また、Ａ２１位のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、好ましくはＧｌｙに修飾されてもよい。さらに、Ｂ３位のＡｓｎはＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐに修飾されてよい。インスリンアナログのさらなる具体例は、ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン；ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンアナログ；ＰｈｅＢ１が欠失しているインスリンアナログ；Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ-末端伸長を有しているインスリンアナログ、及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ-末端伸長を有しているインスリンアナログである。例えば、１又は２のＡｒｇが、Ｂ１位に付加されていてもよい。
【００１４】
このＧＬＰ-１ペプチドのアナログを記載するために、単純なシステムが使用される。よって、例えば[Ｇｌｙ８]ＧＬＰ-１(７-３７)は、Ｇｌｙで８位において自然に生じたアミノ酸残基(Ａｌａ)を置換することにより、ＧＬＰ-１(７-３７)から形式的に誘導されたＧＬＰ-１(７-３７)のアナログを表す。ＧＬＰ-１アナログは、ＧＬＰ-１(７-３７)の３４位にある自然に生じたＬｙｓが、Ａｒｇで置換されているものであってよい。光学異性体が記載されていない全てのアミノ酸は、Ｌ-異性体を意味していると理解される。
【００１５】
本発明の態様においては、最大１７のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大１５のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大１０のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大８のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大７のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大６のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大５のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大４のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大３のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大２のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、１のアミノ酸が修飾される。
【００１６】
「ｄｅｓＢ３０インスリン」、「ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠くインスリン又はそのアナログを意味する。
「親インスリン」とは、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリン又はブタインスリンを意味する。また親インスリンはインスリンアナログであってもよい。
ここで使用される場合「誘導体」とは、例えばタンパク質骨格の一又は複数の一に置換基を導入することにより、又はタンパク質のアミノ酸残基の基を酸化又は還元することにより、又は遊離のアミノ基又はヒドロキシ基をアシル化することにより、化学的に修飾された天然に生じるタンパク質又はそのアナログを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法を用いることで、乾燥されるタンパク質溶液のｐＨとは異なるｐＨを有する、乾燥させたタンパク質パウダーを得ることができる。
本発明は、タンパク質溶液を乾燥させる方法に関し、ここで
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質とを混合することで得、アルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、場合によっては非揮発性酸を用いて、タンパク質溶液のｐＨを調節し、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる；
ものである。
【００１８】
本発明の一態様において、本方法は：
ａ）乾燥させたタンパク質の標的ｐＨの選択、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨの選択、
ｃ）水相の提供、
ｄ）タンパク質の添加、
ｅ）場合によっては賦形剤の添加、
ｆ）非揮発性塩基、及び場合によっては非揮発性酸を用いた、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｇ）揮発性塩基を用いた、乾燥されるタンパク質溶液の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｈ）タンパク質溶液の噴霧乾燥、
を含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施することができる。
【００１９】
一態様において、タンパク質溶液は、揮発性塩基及び非揮発性塩基で調節される。本方法の一態様において、タンパク質溶液は、約８℃以下、約６℃以下、約５℃以下、約４℃以下、約３℃以下、約２℃以下、又は約１℃以下の温度で得られる。
一態様において、水の凝固点は低下し、タンパク質溶液は０℃以下の温度で得られる。
【００２０】
一態様において、タンパク質溶液は、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０、約８．２、約８．４又は約８．６以上のｐＨ又は標的ｐＨを有する。
タンパク質溶液のｐＨが約７．６〜約１１．０、約７．６〜約１０．５、約７．８〜約１１．０、約７．８〜約１０．５、約８．０〜約１１．０、約８．０〜約１０．５、約８．２〜約１１．０、約８．４〜約１１．０、約８．６〜約１０．０、約８．８〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、又は約９．２〜約１０．０である場合、タンパク質のフィブリル化傾向はあまり顕著ではない。
【００２１】
本発明の一態様において、タンパク質は水溶液に添加される。水溶液は純水であってよく、また賦形剤又はアルカリを含有していてもよい。
本発明の一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、非揮発性塩基を含有するアルカリ溶液で調節される。非揮発性塩基は、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はその組合せからなる群から選択可能である。例えば、ｐＨは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、又は任意のその組合せを用いて調節可能である。
【００２２】
本発明の一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、揮発性塩基を含有するアルカリ溶液で調節される。揮発性塩基は、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又は組合せからなる群から選択可能である。例えば、揮発性塩基は、重炭酸塩、炭酸塩、アンモニア、ヒドラジン、又は有機塩基、例えば低級脂肪族アミン類、特にトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン類、トリエタノールアミン類、及びそれらの塩であってよい。さらに、揮発性塩基は、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せであってよい。
インスリンを含有する水溶液に水酸化アンモニウムを添加すると、タンパク質、例えばインスリンはより素早く溶解するであろう。
【００２３】
本発明の一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、揮発性塩基及び非揮発性塩基を含有するアルカリ溶液で調節される。一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、乾燥させたタンパク質についての標的ｐＨには水酸化ナトリウムで、噴霧乾燥されるタンパク質溶液についての選択されたｐＨを得るには水酸化アンモニウムを用いて調節される。
【００２４】
本発明の一態様において、揮発性塩基は、少なくとも約０．５ｐＨ単位、少なくとも約０．７ｐＨ単位、又は少なくとも約０．９ｐＨ単位、又は少なくとも約１．１ｐＨ単位、又は少なくとも約１．３ｐＨ単位、又は少なくとも約１．５ｐＨ単位でタンパク質溶液のｐＨを調節するために使用される。
【００２５】
溶液において、インスリンの自己会合パターンは、タンパク質濃度、金属イオン、ｐＨ、イオン強度、及び溶媒組成の複合機能である。インスリン、亜鉛イオン、塩及びフェノール化合物を含有する、現在使用の溶液のいくつかについて、以下の平衡を考慮しなければならない：
６Ｉｎ ⇔ ３Ｉｎ２
３Ｉｎ２ ＋ ２Ｚｎ２＋Ｈ ⇔ Ｉｎ６（Ｔ６）
Ｔ６ ⇔ Ｔ３Ｒ３ ⇔ Ｒ６
ここで、Ｉｎはインスリンであり、Ｉｎ２は二量体インスリンであり、Ｉｎ６は六量体インスリンであり、Ｔ６はＴ６立体構造中の六量体インスリンであり、Ｔ３Ｒ３はＴ３Ｒ３立体構造中の六量体インスリンであり、Ｒ６は六量体Ｒ６状態での六量体インスリンである。
インスリンの公知の分解パターンには、ａ）線維形成；ｂ）Ａ１８、Ａ２１及びＢ３でのアミド分解；ｃ）アミノ基転移又はシッフ塩基形成を介した二量体形成；ｄ）ジスルフィド交換反応が含まれる。
【００２６】
Brange (Stability of Insulin, Kluwer Academic Press, 1994)によれば、これら分解反応のそれぞれは、六量体状態よりも単量体状態である方が、かなり早く進行する。よって、インスリン調製物を安定化させる最も効果的な手段は、上述した平衡をできる限り右側に押すことによる。質量作用のこの一般的効果に加えて、選択された残基の反応性は、Ｔ→Ｒ立体構造変化におけるそれらの直接的関与に依存して、さらに修飾される。例えば、Ｂ３Ａｓｎの反応性はＴ-状態にあるよりもＲ-状態(残基がアルファ-ヘリックスに存在する場合)にある方がかなり低い。２つの亜鉛インスリン六量体のＴ６、Ｔ３Ｒ３及びＲ６立体構造の間の相互変換は、Ｔ６、Ｔ３Ｒ３及びＲ６型に結合するリガンドにより修飾される。塩化物等のアニオンは、Ｔ３Ｒ３及びＲ６の金属イオンの第４配位位置に対する親和性を有し、さらにフェノール等の防腐剤はＴ３Ｒ３及びＲ６型の表面近傍に位置する疎水性ポケットに結合している(Derewenda, Nature and, Brzovic, Biochemistry 33, 130557,1994)。
よって、溶液中のインスリンのＲ６立体構造に好ましい条件は、インスリンの変性を回避するための乾燥方法中、及び化学的安定性を最大にするための棚保管中の双方に有利である。
【００２７】
本発明の一態様において、タンパク質溶液はフェノールを含有する。一態様において、タンパク質溶液は、タンパク質１モル当たり少なくとも約２モルのフェノール、又はタンパク質１モル当たり少なくとも約３モルのフェノール、又はタンパク質１モル当たり少なくとも約４モルのフェノールを含有する。一態様において、タンパク質溶液は、インスリン１モル当たり約４モルのフェノールを含有する。一態様において、タンパク質溶液は、インスリン１モル当たり約４モルのフェノールを含有し、タンパク質溶液は亜鉛を含有する。タンパク質溶液がインスリンを含有する場合、フェノールはインスリン六量体を安定化させる。
【００２８】
本発明の一対応において、タンパク質は、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、及びＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又は任意のそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２９】
本発明の一態様において、タンパク質溶液は、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含有し、溶液は亜鉛をさらに含有する。インスリンを含有するタンパク質溶液の亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２〜約４亜鉛イオンの範囲とすることができ、又は亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２．１〜約３亜鉛イオンの範囲とすることができ、又は亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２．２〜約２．７亜鉛イオンの範囲とすることができる。インスリンを含有するタンパク質溶液の亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２．３亜鉛イオンとすることができる。
【００３０】
本発明の一態様において、タンパク質溶液は、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤(absorption protacting agent)、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤を含有する。
本発明の一態様において、タンパク質溶液はグリシルグリシンを含有する。グリシルグリシンがタンパク質溶液に添加されている場合、タンパク質はさらに素早く溶解する。一態様において、グリシルグリシンは、インスリンを含有する水溶液に添加される。溶液中のグリシルグリシンの濃度は、約４ｍＭ〜約２００ｍＭの間であるであろう。
【００３１】
本発明の一態様において、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨで、タンパク質溶液を乾燥又は噴霧乾燥する方法が決定される。乾燥又は噴霧乾燥されるタンパク質溶液のｐＨは、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨ以上である。タンパク質溶液のｐＨは、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨ以上、少なくとも約０．５ｐＨ単位であってよい。タンパク質溶液のｐＨは、噴霧乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも約０．７、少なくとも約０．９、少なくとも約１．１、少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．５、又は少なくとも約２．０、又は少なくとも約２．５ｐＨ単位であってよい。
【００３２】
本発明の一態様において、噴霧乾燥させたタンパク質のｐＨ又は標的ｐＨは、約６．０〜約８．５、約６．２〜約８．４、約６．４〜約８．３、約６．６〜約８．２、約６．８〜約８．１、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．９、約７．４〜約７．８、又は約７．６〜約７．７である。
【００３３】
本発明の一態様において、タンパク質溶液は、約１０％以下の水分含有量となるように乾燥又は噴霧乾燥される。水分含有量は、実験部分で記載されているように、乾燥テスト(重量測定)において算出して／損失を測定して、約６％以下、約４％以下、約２％以下、又は約１％以下であってよい。
【００３４】
本発明の一態様において、乾燥又は噴霧乾燥されるタンパク質は、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される。
一態様において、本発明は、本発明の方法により得られる乾燥させたタンパク質に関する。
一態様において、本発明は、実施例に記載されるような乾燥させたタンパク質に関する。
【００３５】
一態様において、本発明は、治療的有効量の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又は本発明のそれらの任意の組合せを含有する薬学的組成物に関し、ここで該組成物により、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の処置を提供することができる。
一態様において、本発明は、治療的有効量の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又はそれらの任意の組合せを、製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物に関し、ここで該組成物により、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の処置を提供することができる。
【００３６】
本発明の一態様において、本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを含有する薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する方法を提供する。
本発明の一態様において、本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明の一態様において、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する薬学的組成物を提供し、該組成物は、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンを、１又は２の本発明の噴霧乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンと混合して、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は添加剤と共に含有する。
【００３８】
本発明の一態様において、本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンを、１又は２の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンと混合して、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する方法を提供する。
【００３９】
本発明の一態様は、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物で、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の肺処置用に提供可能な薬学的組成物に関する。
【００４０】
本発明の一態様は、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の肺処置用の薬学的組成物の用途に関し、該薬学的組成物は、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては急速に作用を開始するインスリン又はインスリンアナログと混合して、製薬的に許容可能な担体及び／又は添加剤と共に含有する。
【００４１】
本発明の一態様において、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の処置に使用される薬学的組成物を製造する方法を提供し、該組成物は肺に使用され、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては急速に作用を開始するインスリン又はインスリンアナログと混合して、製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する。
【００４２】
(インスリンの生成)
インスリン又はその前駆体は、よく知られたペプチド合成、又は適切に形質転換された微生物におけるよく知られた組換え生成のいずれかにより生成させることができる。例えば、インスリンは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、ペプチドの発現が可能な条件下、適切な栄養培地でポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培養体から回収することを含む方法により生成することができる。
本発明の製薬用処方物に使用されるインスリン誘導体を調製する場合、置換用の出発生成物、親インスリン又はインスリンアナログ又はその前駆体は、よく知られたペプチド合成、又は適切に形質転換された微生物におけるよく知られた組換え生成のいずれかにより生成させることができる。例えば、インスリン出発生成物は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、ペプチドの発現が可能な条件下、適切な栄養培地でポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培養体から回収することを含む方法により生成することができる。国際特許出願ＷＯ２００５／０１２３４７号が参照される。
【００４３】
(薬学的組成物)
この発明の乾燥させたタンパク質は、例えば皮下的、経口的、経鼻的又は肺的に投与することができる。
皮下投与用として、乾燥したインスリンは、公知のインスリンの処方物と同じように処方される。さらに、皮下投与用として、この発明の乾燥したインスリンは、公知のインスリンの投与と同じように投与され、一般的に、医者はこの手順に通じている。
【００４４】
この発明の乾燥したインスリンは、循環インスリンレベルを増加させ、及び／又は循環グルコースレベルを低下させるための用量効果的方式で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖症等の疾患を治療するのに効果的である。インスリンの効果的な投与を達成するには、この発明の乾燥したインスリンを、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ以上の吸入量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血糖値、患者の身体コンディション、患者の肺の状態等を含む要因を考慮し、博識な実施者により決定することができる。
【００４５】
本発明において、この発明の乾燥したインスリンは、その素早い吸収を達成するために、吸入により送達されてもよい。吸入による投与は、インスリンの皮下投与に匹敵する薬物動態をもたらすことができる。この発明の乾燥したインスリンを吸入することで、循環インスリンレベルの素早い上昇、続いて血糖値の素早い低下に至る。同様の粒子径及び同様の肺沈着レベルで比較される場合、典型的には、種々の吸入装置により、同様の薬物動態が提供される。
【００４６】
本発明において、この発明の乾燥したインスリンは、吸入による治療剤の投与において、当該技術で公知の任意の様々な吸入装置により送達され得る。これらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、スプレー等が含まれる。この発明の乾燥したインスリンは、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達される。この発明の乾燥したインスリンを投与するための吸入装置には、いくつかの所望される特徴がある。例えば、吸入装置による送達には、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。良好な呼吸性のためには、吸入装置は、小粒子、例えば約１０μｍ未満、例えば約１-５μｍ未満の粒子を送達すべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、TurbohalerＴＭ(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosＴＭ吸入器(Dura)、吸入治療用に市販されている装置、AERxＴＭ(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量噴霧式吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
【００４７】
当業者が認識しているように、本発明の乾燥させたタンパク質の処方、送達される処方物の量、及び単一用量の投与の持続時間は、使用される吸入装置の種類に依存している。ネブライザー等、いくつかのエアゾール送達システムにとって、投与頻度及びシステムが稼働している時間の長さは、主として、エアゾール中のインスリンコンジュゲートの濃度に依存するであろう。例えば、投与時間が短いと、ネブライザー溶液においては、より高い濃度のインスリンコンジュゲートを使用することができる。定量噴霧式吸入器等の装置は、高濃度のエアゾールを生成することができ、所望の量のインスリンコンジュゲートの送達を、より短い時間で作動させることができる。パウダー吸入器等の装置は、付与された充填量の薬剤が装置から排出されるまで、活性剤を送達させる。この種の吸入器において、付与されたパウダー量における、この発明の乾燥したインスリンの量は、一回の投与で送達される用量を決定する。
【００４８】
吸入装置で送達される処方物におけるこの発明の乾燥したインスリンの粒子径は、肺、気道下部及び肺胞内においてなされる、インスリンの能力に関して重要である。この発明の乾燥したインスリンは、送達されるインスリンコンジュゲートの少なくとも約１０％、例えば約１０％〜２０％、又はそれ以上が肺に沈着するように処方される。口呼吸するヒトにとって、肺沈着の最大効率は、約２μｍ〜約３μｍの粒子径で得られることが知られている。粒子径が約５μｍ以上になると、肺沈着はかなり低減する。粒子径が約１μｍ以下であると、肺沈着の低下が引き起こされ、治療に有効な十分な量の粒子を送達することが困難になる。よって、吸入器により送達される乾燥させたタンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜５μｍの範囲の粒子径を有する。乾燥させたタンパク質の処方は、選択された吸入装置において所望される粒子径が生じるように選択される。
【００４９】
乾燥パウダーとしての投与に有利には、この発明の乾燥させたタンパク質は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの粒子径を有する微粒子型に調製される。粒子径は、患者の肺の肺胞に送達するのに効果的なものである。乾燥パウダーは、多くの粒子が所望する範囲のサイズを有するように生成された粒子から、ほとんどなる。有利には、乾燥パウダーの少なくとも５０％が、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。
【００５０】
粒子は、通常、容器中で乾燥パウダー処方物から分離され、ついで運搬気流を介して患者の肺に移送される。典型的には、現在の乾燥パウダー吸入器において、固形物を破壊する力は、単に、患者の吸入により提供される。他の種類の吸入器においては、患者の吸入により生じる気流が、粒子を凝集させない推進モーターを駆動させる。
【００５１】
乾燥パウダー吸入器から投与されるこの発明の乾燥させたタンパク質の処方物は、典型的には、乾燥させたタンパク質を含有する微細に分割された乾燥パウダーを含むが、パウダーは、さらに増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をさらに含むことができる。例えば特定のパウダー吸入器から送達させるのに必要なパウダーを希釈するため、処方のプロセシングを容易にするため、処方物に有利なパウダー性を付与するため、吸入装置からのパウダーの分散を容易にするため、処方物を安定させるため(例えば、酸化防止剤又はバッファー)、処方物に味を付与するため等に、添加剤をインスリンコンジュゲートの乾燥パウダー処方物に含有させることができる。有利には、添加剤は患者の気道に悪影響を与えないものである。乾燥させたタンパク質は分子レベルで添加剤と混合することができ、又は固体状処方物は添加剤の粒子と混合、又はこれでコーティングされて、タンパク質コンジュゲートの粒子を含有することができる。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類、及び多糖類；糖アルコール類及び他のポリオール類、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述した目的に対して有効な量、多くの場合は処方物の重量に対して約５０％〜約９０％の量で存在している。インスリンアナログタンパク質等の、タンパク質の処方物について、当該技術で公知の添加剤も、本処方物に含めることができる。
【００５２】
タンパク質溶液は、場合によっては、呼吸器官及び肺投与に適した製薬用の担体又は賦形剤と組合せてもよい。このような担体は、患者に送達されるパウダー中のインスリン濃度を低下させることが所望されている場合は、単に増量剤として供給されてもよいが、インスリン組成物の安定性を高め、インスリンのさらに効率的で再生可能な送達を提供するのに、パウダー分散装置内におけるパウダーの分散性を改善し、インスリンの操作性、トリ製造及びパウダー充填が容易になるような流動性及びコンシステンシーを改善するために供給されてもよい。
【００５３】
適切な担体物質は、非晶質パウダー、結晶質パウダー、又は非晶質及び結晶質パウダーの組合せの形態であってもよい。適切な物質には、炭水化物、例えば単糖類、特にフルクトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ-マンノース、ソルボース等；二糖類、例えばラクトース、トレハロース、セロビオース等；シクロデキストリン類、例えば２-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン；及び多糖類、例えばラフィノース、マルトデキストリン類、デキストラン類等；(ｂ)アミノ酸、例えばグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リジン等；(ｃ)有機酸と塩基から調製される有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、塩酸トロメタミン等；(ｄ)ペプチド及びタンパク質、例えばアスパルテーム、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等；(ｅ)アルジトール類、例えばマンニトール、キシリトール等は含まれる。担体の好ましい群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩酸トロメタミン、ヒト血清アルブミン、及びマンニトール含まれる。
このような担体物質は、噴霧乾燥前に、すなわち噴霧乾燥用に調製されるタンパク質溶液又は水溶液に担体物質を添加することにより、インスリンと組合せられてもよい。そのように、担体物質はタンパク質粒子の一部として、又は同時に形成されるであろう。
【００５４】
典型的には、担体がタンパク質と共に噴霧乾燥により形成される場合、タンパク質は５％〜９５％、好ましくは２０％〜８０％の範囲の重量パーセントで、個々の粒子に存在しているであろう。粒子の残りは、主として担体物質(典型的には、重量で５％〜９５％、通常は２０％〜８０％)であるが、上述した他の成分を含む、バッファー(類)を含有していてもよい。
【００５５】
また、担体は、乾燥パウダー形態に別々に調製され、混合することにより、乾燥パウダータンパク質を組合せてもよい。別々に調製されたパウダー状担体は、通常、結晶質(水分吸収を回避するため)であるが、いくつかのケースでは、非晶質、又は結晶質と非晶質の混合であってもよい。担体粒子のサイズは、典型的には２５ｍ〜１００ｍの範囲である、インスリンパウダーの流動性が改善されるように選択されてよい。このサイズ範囲の担体粒子は、一般的には、肺の肺胞領域に浸透せず、多くの場合、吸入前に、送達装置においてインスリンから分離するであろう。よって、肺の肺胞領域に浸透する粒子は、本質的にインスリンとバッファーとからなるであろう。好ましい担体物質は、上述した範囲のサイズを有する結晶性マンニトールである。
【００５６】
本発明の乾燥インスリンパウダーは、他の活性成分と組合せられてもよい。例えば、糖尿病の処置性を改善するために、インスリンパウダーに、少量のアミリン又は活性アミリンアナログを組合せることが望ましい場合もある。アミリンは、正常な(糖尿病ではない)個人において、膵臓０-細胞からインスリンと共に分泌されるホルモンである。アミリンはインビボにおいてインスリン活性を調節すると考えられており、インスリンとアミリンの同時投与により、血中グルコースの制御を改善することが提案されている。本発明の組成物において、インスリンと乾燥パウダーアミリンとを組合せることにより、このような同時投与を達成するための、特に簡便な生成物が提供されるであろう。アミリンは、０．１重量％〜１０重量％(一服中のインスリンの全重量に基づく)、好ましくは０．５重量％〜２．５重量％のインスリンと組合せてよい。アミリンは商業的供給者、例えばAmylin Corporation, San Diego, Californiaから入手され、本発明の組成物に容易に処方することができる。例えば、アミリンは、インスリン、場合によっては担体、パウダー状生成物を生成するために乾燥された溶液スプレーと共に、水溶液又は他の適切な溶液に溶解されていてもよい。
【００５７】
この発明の乾燥させたタンパク質を含むスプレーは、タンパク質コンジュゲートの懸濁液又は溶液を、加圧下にて、強いてノズルを通過させることにより製造することができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給速度は、所望する出量及び粒子径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続した電場により、電気スプレーを製造することができる。有利には、スプレーにより送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子径を有する。
【００５８】
スプレーを用いて使用するのに適したこの発明の乾燥したインスリンの処方物は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり、約１ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質コンジュゲート濃度で、水溶液中にタンパク質を含有している。処方物は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤、例えば亜鉛等の薬剤を含有することができる。また処方物は、賦形剤、又は結晶を安定化させるための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をさらに含有可能である。乾燥させたタンパク質コンジュゲートの処方に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。タンパク質コンジュゲートの処方に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等が含まれる。また結晶処方物は、エアゾールの形成において、溶液の噴霧化により生じるインスリンコンジュゲートの表面誘起凝集を低減又は防止可能な界面活性剤を、さらに含有することができる。種々の従来からの界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを使用することができる。量は、一般的には、処方物の重量に対して約０．００１〜約４％の範囲である。
【００５９】
また、本発明の乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物は、経鼻的に投与されてよい。薬学的組成物は、液状組成物、乾燥組成物又はゲルとして投与されてもよい。鼻を介した薬剤送達にとって、鼻腔への沈着を保証し、粒子が気道内及び肺領域にさらに運ばれるのを回避するために、結晶は１０μｍ以上であってよい。サイズの上限についての理解は明らかではないが、多くの理由で、粒子が効能を示さず、局所刺激に至らしめるおそれのある粒子サイズ以上が、おそらく上限であろう。
【００６０】
本発明の乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物は、このような処置を必要とする患者に、非経口的に投与されてもよい。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射で実施されてよい。また非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。
【００６１】
本発明の乾燥させたタンパク質の注射用組成物は、所望する最終生成物が付与されるのに適切なように、成分を溶解及び混合することを含む、製薬工業の従来からの技術を使用して調製することができる。よって、一手順において、本発明のインスリンを含有する結晶は、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、等張剤、防腐剤及びバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨ値が調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が付与されるように、水を用いて調節される。
【００６２】
本発明のさらなる態様において、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シタラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーのそれぞれ一つは、本発明の別の態様を構成する。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、処方物は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサル(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択され得る、製薬的に許容可能な防腐剤をさらに含有する。本発明のさらなる態様において、防腐剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、防腐剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、防腐剤は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、防腐剤は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の防腐剤各自は、本発明の別の態様を構成する。薬学的組成物に防腐剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版、1995が挙げられる。
【００６４】
本発明のさらなる態様において、処方物は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤をさらに含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一態様において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一態様において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、限定されて固定されるものではない。一態様において、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明のさらなる態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、本発明のさらなる態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張剤各自は、本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版、1995が挙げられる。
【００６５】
典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な防腐剤は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
【００６６】
この発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンを含有する組成物は、インスリンに対して敏感な状態の処置に使用することができる。よってそれらは、１型糖尿病、２型糖尿病及び例えば重篤に傷害を被った人及び大手術を受けた人にしばしば見られる高血糖症の処置に使用することができる。任意の患者に対する最適な用量レベルは、用いられる特定のインスリンの効能、年齢、体重、身体活動性、及び患者の食事、他の薬剤との併用の可能性、治療される状態の重篤度を含む様々な要因に依存する。この発明の乾燥させたタンパク質の毎日の投薬量が、既知の薬学的組成物に対するものと同様の方法で当業者によって各個々の患者に対して決定されることが推奨される。
都合がよいことに、この発明の乾燥させたタンパク質は、他のタイプのタンパク質、例えばさらに速効で作用を開始するインスリンアナログと混合して使用してもよい。このようなインスリンアナログの具体例は、例えば、公開番号EP214826(Novo Nordisk A/S)、EP375437(Novo Nordisk A/S)及びEP383472(Eli Lilly & Co)を有する欧州特許出願に記載されている。
【００６７】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈されない。
ここで提供される任意の及び全ての例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に、本発明をより解明することを意図したものであり、特に示さない限りは、本発明の範囲を制限するものではない。明細書におけるいずれの言語も、請求項に記載していない要素を本発明の実施に必須であることを示していると解してはならない。
ここでの特許公報の引用及び導入は便宜上のものであって、このような特許公報の正当性、特許性及び／又は執行可能性についての見解を示すものではない。
この発明は、適応される法律により許容されるよう、ここに提案された請求項に列挙された主題事項の全ての修正及び等価事項を含む。
【００６８】
本発明は以下のパラグラフに要約されるであろう。
１．タンパク質溶液を乾燥させる方法であって、
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質とを混合することで得、アルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、場合によっては非揮発性酸を用いて、タンパク質溶液のｐＨを調節し、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる；
方法。
【００６９】
２．ａ）乾燥させたタンパク質の標的ｐＨの選択、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨの選択、
ｃ）水相の提供、
ｄ）タンパク質の添加、
ｅ）場合によっては賦形剤の添加、
ｆ）非揮発性塩基、及び場合によっては非揮発性酸を用いた、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｇ）揮発性塩基を用いた、乾燥されるタンパク質溶液の標的ｐＨへのｐＨの調節、及び
ｈ）タンパク質溶液の噴霧乾燥、
を含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施可能である、パラグラフ１の方法。
３．工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施可能である、パラグラフ２の方法。
【００７０】
４．タンパク質溶液が８℃以下の温度で得られる、パラグラフ１-３の方法。
５．タンパク質溶液が、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、又は１℃以下の温度で得られる、パラグラフ１-４の方法。
６．水相の凝固点が低下し、タンパク質溶液が０℃以下の温度で得られる、パラグラフ１-５の方法。
７．乾燥方法が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥からなる群から選択される、パラグラフ１-６の方法。
【００７１】
８．タンパク質溶液が７．４以上のｐＨを有している、パラグラフ１-７の方法。
９．タンパク質溶液が、７．６以上、７．８以上、８．０以上、８．２以上、８．４以上又は８．６以上のｐＨを有する、パラグラフ１-８の方法。
１０．タンパク質溶液が７．４〜１１．０のｐＨを有している、パラグラフ１-８の方法。
１１．タンパク質溶液が、約７．６〜約１１．０、約７．６〜約１０．５、約７．８〜約１１．０、約７．８〜約１０．５、約８．０〜約１１．０、約８．０〜約１０．５、約８．２〜約１１．０、約８．４〜約１１．０、約８．６〜約１０．０、約８．８〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、又は約９．２〜約１０．０のｐＨを有する、パラグラフ１-８及び１０の方法。
【００７２】
１２．非揮発性塩基が、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１-１１の方法。
１３．非揮発性塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、又はそれらの任意の組合せをである、パラグラフ１２の方法。
１４．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１-１３の方法。
１５．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せである、パラグラフ１４の方法。
【００７３】
１６．揮発性塩基で、少なくとも０．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１-１５の方法。
１７．揮発性塩基で、少なくとも０．７ｐＨ単位、又は少なくとも０．９ｐＨ単位、又は少なくとも１．１ｐＨ単位、又は少なくとも１．３ｐＨ単位、又は少なくとも１．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１-１６の方法。
１８．タンパク質溶液のｐＨが、水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムを含有する溶液で調節される、パラグラフ１-１７の方法。
【００７４】
１９．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、及びＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ１-１８の方法。
２０．タンパク質溶液が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含有し、溶液が亜鉛をさらに含有する、パラグラフ１-１９の方法。
２１．タンパク質溶液がフェノールを含有する、パラグラフ２０の方法。
２２．タンパク質溶液が、タンパク質１モル当たり約４モルのフェノールを含有する、パラグラフ２０-２１の方法。
【００７５】
２３．タンパク質溶液が、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤、又はそれらの組合せを含有する、パラグラフ１-２２の方法。
２４．タンパク質溶液がグリシルグリシンを含有する、パラグラフ２３の方法。
【００７６】
２５．タンパク質溶液のｐＨが乾燥させたタンパク質のｐＨ以上である、パラグラフ１-２４の方法。
２６．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．５ｐＨ単位である、パラグラフ２５の方法。
２７．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．７、少なくとも０．９、少なくとも１．１、少なくとも１．３、又は少なくとも１．５ｐＨ単位である、パラグラフ１-２６の方法。
【００７７】
２８．乾燥させたタンパク質のｐＨが約６．０〜約８．５である、パラグラフ１-２７の方法。
２９．乾燥させたタンパク質のｐＨが、約６．２〜約８．４、約６．４〜約８．３、約６．６〜約８．２、約６．８〜約８．１、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．９、約７．４〜約７．８、又は約７．６〜約７．７である、パラグラフ１-２８の方法。
３０．タンパク質溶液が、約１０％以下、約６％以下、約４％以下、約２％以下、又は約１％以下の水分含有量の噴霧乾燥させたタンパク質が得られるように乾燥される、パラグラフ１-２９の方法。
３１．タンパク質がインスリンアナログであり、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される、パラグラフ１-３０の方法。
【００７８】
３２．パラグラフ１-３１の方法により得られる乾燥させたタンパク質。
【００７９】
３３．パラグラフ３２の噴霧乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する薬学的組成物。
３４．組成物が、糖尿病又は高血糖症の肺、非経口、鼻又は経口処置用である、パラグラフ３３の薬学的組成物。
３５．パラグラフ３２の乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する、このような処置を必要とする患者における糖尿病又は高血糖症を治療するための薬学的組成物であって、該タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される組成物。
【００８０】
３６．パラグラフ３２の乾燥させたタンパク質、又はパラグラフ３３-３５の薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における糖尿病の処置方法。
３７．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ３６の方法。
３８．実施例に記載するような乾燥させたタンパク質。
【００８１】
１ａ．タンパク質溶液を乾燥させる方法であって、
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質とを混合することで得、アルカリ性になるようにｐＨを調節し、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる；
方法。
【００８２】
２ａ．ａ）乾燥させたタンパク質の標的ｐＨの選択、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨの選択、
ｃ）水相の提供、
ｄ）タンパク質の添加、
ｅ）場合によっては賦形剤の添加、
ｆ）非揮発性塩基を用いた、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｇ）揮発性塩基を用いた、乾燥されるタンパク質溶液の標的ｐＨへのｐＨの調節、及び
ｈ）タンパク質溶液の噴霧乾燥、
を含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施可能である、タンパク質溶液から乾燥させたタンパク質を生成する方法。
３ａ．タンパク質溶液が、揮発性塩基及び非揮発性塩基を用いて調節される、パラグラフ１ａの方法。
【００８３】
４ａ．タンパク質溶液が８℃以下の温度で得られる、パラグラフ１ａ-３ａの方法。
５ａ．タンパク質溶液が、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、又は１℃以下の温度で得られる、パラグラフ１ａ-４ａの方法。
６ａ．水相の凝固点が低下し、タンパク質溶液が０℃以下の温度で得られる、パラグラフ１ａ-５ａの方法。
７ａ．乾燥方法が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥からなる群から選択される、パラグラフ１ａ-６ａの方法。
【００８４】
８ａ．タンパク質溶液が７．４以上のｐＨを有している、パラグラフ１ａ-７ａの方法。
９ａ．タンパク質溶液が、７．６以上、７．８以上、８．０以上、８．２以上、８．４以上又は８．６以上のｐＨを有する、パラグラフ１ａ-８ａの方法。
１０ａ．タンパク質溶液が７．４〜１１．０のｐＨを有している、パラグラフ１ａ-８ａの方法。
１１ａ．タンパク質溶液が、約７．６〜約１１．０、約７．６〜約１０．５、約７．８〜約１１．０、約７．８〜約１０．５、約８．０〜約１１．０、約８．０〜約１０．５、約８．２〜約１１．０、約８．４〜約１１．０、約８．６〜約１０．０、約８．８〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、又は約９．２〜約１０．０のｐＨを有する、パラグラフ１ａ-８ａ及び１０ａの方法。
【００８５】
１２ａ．非揮発性塩基が、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-１１ａの方法。
１３ａ．非揮発性塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、又はそれらの任意の組合せをである、パラグラフ１２ａの方法。
１４ａ．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-１１ａの方法。
１５ａ．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せである、パラグラフ１４ａの方法。
【００８６】
１６ａ．揮発性塩基で、少なくとも０．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１ａ-１５ａの方法。
１７ａ．揮発性塩基で、少なくとも０．７ｐＨ単位、又は少なくとも０．９ｐＨ単位、又は少なくとも１．１ｐＨ単位、又は少なくとも１．３ｐＨ単位、又は少なくとも１．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１ａ-１６ａの方法。
１８ａ．タンパク質溶液のｐＨが、水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムを含有する溶液で調節される、パラグラフ１ａ-１７ａの方法。
【００８７】
１９ａ．タンパク質溶液がフェノールを含有する、パラグラフ１ａ-１８ａの方法。
２０ａ．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、エキセンディン、エキセンディンアナログ及び誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-１９ａの方法。
２１ａ．タンパク質が、アミリン、アミリンアナログ、アミリン誘導体、α-ＭＳＨ、α-ＭＳＨアナログ、α-ＭＳＨ誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-２０ａの方法。
２２ａ．タンパク質溶液が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含有し、溶液が亜鉛をさらに含有する、パラグラフ１ａ-２０ａの方法。
【００８８】
２３ａ．タンパク質溶液が、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤、又はそれらの組合せを含有する、パラグラフ１ａ-２２ａの方法。
２４ａ．タンパク質溶液がグリシルグリシンを含有する、パラグラフ２３ａの方法。
【００８９】
２５ａ．タンパク質溶液のｐＨが乾燥させたタンパク質のｐＨ以上である、パラグラフ１ａ-２４ａの方法。
２６ａ．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．５ｐＨ単位である、パラグラフ２５ａの方法。
２７ａ．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．７、少なくとも０．９、少なくとも１．１、少なくとも１．３、又は少なくとも１．５ｐＨ単位である、パラグラフ１ａ-２６ａの方法。
【００９０】
２８ａ．乾燥させたタンパク質のｐＨが約６．０〜約８．５である、パラグラフ１ａ-２７ａの方法。
２９ａ．乾燥させたタンパク質のｐＨが、約６．２〜約８．４、約６．４〜約８．３、約６．６〜約８．２、約６．８〜約８．１、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．９、約７．４〜約７．８、又は約７．６〜約７．７である、パラグラフ１ａ-２８ａの方法。
３０ａ．タンパク質溶液が、約１０％以下、約６％以下、約４％以下、約２％以下、又は約１％以下の水分含有量の噴霧乾燥させたタンパク質が得られるように乾燥される、パラグラフ１ａ-２９ａの方法。
３１ａ．タンパク質がインスリンアナログであり、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-３０ａの方法。
【００９１】
３２ａ．パラグラフ１ａ-３１ａの方法により得られる乾燥させたタンパク質。
【００９２】
３３ａ．パラグラフ３２の噴霧乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する薬学的組成物。
３４ａ．組成物が、糖尿病又は高血糖症の肺、非経口、鼻又は経口処置用である、パラグラフ３３ａの薬学的組成物。
３５ａ．パラグラフ３２ａの乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する、このような処置を必要とする患者における糖尿病又は高血糖症を治療するための薬学的組成物であって、該タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、エキセンディン、エキセンディンアナログ及び誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される組成物。
【００９３】
３６ａ．パラグラフ３２ａの乾燥させたタンパク質、又はパラグラフ３３ａ-３５ａの薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における糖尿病の処置方法。
３７ａ．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、エキセンディン、エキセンディンアナログ及び誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ３６ａの方法。
３８ａ．実施例に記載するような乾燥させたタンパク質。
【００９４】
分析方法
ＨＭＷＰ含有量を、Ph. Eur法に基づき、アイソクラチックサイズ排除コンジュゲート法により測定した。ウォーターズ(Waters)インスリンＨＭＷＰ７．８ｘ３００ｍｍカラムを、６５％の１．０ｍｇ／ｍｌ Ｌ-アルギニン溶液、２０％のアセトニトリル、及び１５％の氷酢酸を含有する、０．５ｍｌ／分流速の移動相と共に使用した。注射容量は１００μｌであった。カラム温度を周囲であった。２７６ｎｍの紫外吸光度により検出を行った。ピーク面積対全ピーク面積基準において、クロマトグラムを分析した。
【００９５】
ウォーターズ・サンファイア(Sunfire)Ｃ１８、３．５μｍ、内径１５０ｘ４．６ｍｍのカラムを利用し、逆相コンジュゲート法を使用して純度を測定した。カラム温度を３５℃にし、流速を１ｍｌ／分にした。勾配系には、１．４％(ｗ／ｗ)の硫酸ナトリウム、０．２％(ｗ／ｗ)のｏ-リン酸、７．７％(ｗ／ｗ)のアセトニトリルを含有する移動相Ａ、ｐＨ３．６と、水中に４２．８％(ｗ／ｗ)のアセトニトリルを含有する移動相Ｂを使用した。勾配系は、３０分で、約４２％の移動相Ｂに均一濃度化し始めた。ついで、移動相Ｂが、３分以上かけて４２％から８０％に直線的に増加し、２分で均一濃度のままであった。ついで、１分以上かけて、初期条件が４２％の移動相Ｂに戻り、２０分、そのままであった。２１４ｎｍでの紫外吸光度により検出した。注射容量は１０μｌであった。ピーク面積対全ピーク面積基準において、クロマトグラムを分析した。本方法により、インスリンのデスアミノ(desamido)形態を含む不純物に関連したインスリンが検出される。
【００９６】
噴霧乾燥したパウダーの容量粒度分布を、湿潤モードで操作されるレーザー回折装置、マスターサイザー(Mastersizer) (Malvern Instruments, United Kingdom)を使用して測定した。装置を湿潤分散システム(Malvern QS Small Volume Sample Dispersion Unit)に取り付け、微小粒子を、約０．０５％のトゥイーン８０を含有するイソプロパノールに懸濁させた。ついで、サンプルを測定し、マルバーン(Malvern)ソフトウェアを使用し、散乱データに基づき粒度分布を算出する。体積中央径Ｄ[ｖ,０．５]は直径であり、分布の５０％が上で、５０％が下である。
【００９７】
噴霧乾燥したパウダーの空気力学的粒度分布を、流れ加速ノズル(flow accelerating nozzle)の直接下流の粒子速度に基づき、個々の粒子の空気力学的直径を測定するレーザーベースの粒子測定器である、モデル３３２１エアロダイナミック・パーティクル・サイザー(Aerodynamic Particle Sizer)(登録商標)(ＡＰＳ)分光計(TSI incorporated)を使用して測定した。スモール・スケール・パウダー・ディスパーサーモデル３４３３(Small Scale powder Disperser model)(TSI incorporated)を用いて、パウダーをエアロゾル化した。これらの測定から、ほぼリアルタイムで、サイズ分布が測定される。空気動力学的質量中央径(ＭＭＡＤ)は空気力学的径であり、分布の５０％が上で、５０％が下である。
噴霧乾燥したパウダーの残留水分量を、パーキンエルマー・ピリス ＴＧＡ１ 熱質量分析器(PerkinElmer Pyris TGA1 thermogravimetric analyzer)を使用し、最小で３時間、１１０℃で乾燥させることによる損失で測定した。水分損失による重量変化を記録し、重量によるパーセンテージで表した。
【実施例】
【００９８】
実施例１
ｐＨ９．５でのヒトインスリンの溶解
１０．０ｇのヒトインスリンを、３８７．３ｇの氷冷水に分散させた。分散液を氷浴に配し、ｐＨが５．０３と測定された。ついで、氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを、ｐＨ８．９９になるまで段階的に添加した。４５分後、ｐＨを８．７７まで低下させ、さらに４時間以上かけて、氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを、ｐＨ８．７５になるまで添加した。溶液はまだ透明ではなく、一晩、冷蔵庫に配した。
次の日、ｐＨが８．７５と測定され、溶液はまだ透明ではなかった。氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムにより、ｐＨを９．４８に調節し、ついで、不透明溶液を、次の５日間、冷蔵庫に配した。
５日後、溶液は透明になり、０．２Ｎの塩化水素を用いて、９．３７から７．５９になるまでｐＨを調節した。
【００９９】
実施例２
Ａ）揮発性塩基を用いたタンパク質溶液の噴霧乾燥
Ｂ）噴霧乾燥させたタンパク質のｐＨの測定
９．５ｇのヒトインスリンを、２００ｇ氷冷水に分散させた。分散液を氷浴に配し、最初のｐＨはｐＨ５．１２と測定された。ついで、氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを５．８ｇ使用し、ｐＨを７．０４に調節した。溶液をさらに２時間、氷浴で保持し、ついで、脱塩水を全重量２４０ｇになるまで添加した。
ｐＨ７．４の溶液の５０ｇをさらに処理した。氷冷された１ＮのＮＨ４ＯＨを用いて、７．０４から７．５０にｐＨを調節し、ついで、一晩、冷蔵庫に配した。次の日、ｐＨが７．３２と測定され、氷冷された１ＮのＮＨ４ＯＨを用いて、ｐＨをｐＨ８．０６に調節した。ついで、６０．０ｇになるまで水を添加した。ヒトインスリンの最終濃度は、約３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１００】
乾燥した固形微小粒子を、０．７ｍｍの並流２液ノズル(co-current two-fluid nozzle)を具備するブッチ製(Buchi)Ｂ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)で調製した。ヒトインスリン溶液を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、乾燥チャンバー内の温気流に霧化した。
乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は約７０℃であった。
固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉し、収集し、乾燥条件下で保存した。
噴霧乾燥したヒトインスリン(噴霧乾燥する前、タンパク質溶液のｐＨは８．０６であった)を、４０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ及び１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で脱塩水に再溶解させ、様々な濃度が測定されるｐＨ値に影響を及ぼすかどうかを研究した：
２５．３ｍｇを６３３μＬの水に添加した：ｐＨは６．９５と測定された
４３．５ｍｇを５４５μＬの水に添加した：ｐＨは６．９５と測定された
８１．７ｍｇを５１０μＬの水に添加した：ｐＨは７．０１と測定された
【０１０１】
実施例３
噴霧乾燥したインスリンアスパルト(Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン)を、様々な比率の揮発性及び非揮発性塩によって、溶解させた。
噴霧乾燥前に、安定化賦形剤を含むか又は含まない様々なインスリンアスパルト溶液を調製した：
【０１０２】
調製物Ａ
溶液Ａ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。ついで、２．６ｍｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．５３になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ａ２：６５ｍｌの溶液Ａ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０３】
調製物Ｂ
溶液Ｂ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初２．２ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで７５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．５２になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｂ２：６５ｍｌの溶液Ｂ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０４】
調製物Ｃ
溶液Ｃ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初４．４ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで７５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．４８になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｃ２：６５ｍｌの溶液Ｃ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０５】
調製物Ｄ
溶液Ｄ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初６．６ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで３７０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．４７になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｄ２：６５ｍｌの溶液Ｄ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
調製物Ｅ
溶液Ｅ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初６．６ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで３７０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．４７になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｅ２：６５ｍｌの溶液Ｅ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０７】
調製物Ｆ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初１７５μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．８３になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、８５μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９９に調製し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０８】
調製物Ｇ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初２８８μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、１２０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．８６になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、８０μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを８．０３に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
調製物Ｈ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初８６４μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．８５になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、６０μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
調製物Ｉ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初１５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．９９になるまで段階的に添加した。
４．６ｍｌの０．２５Ｍ グリシルグリシン溶液、１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液及び３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、２４５μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１１】
調製物Ｊ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初２８８μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、１２５μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが８．１８になるまで段階的に添加した。
４．６ｍｌの０．２５Ｍ グリシルグリシン溶液、１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液及び３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、１２５μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１２】
調製物Ｋ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初２８８μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、１２５μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．９３になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と１．９ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、４０μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１３】
乾燥固形微小粒子を、０．７ｍｍの並流２液ノズルを具備するブッチＢ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)で調製した。液状供給物(調製物Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫ)を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、乾燥チャンバー内の温気流に霧化した。
乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は４１〜６１℃で変化した。
固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉し、収集し、乾燥条件下で保存した。
【０１１４】
４０℃で１ヶ月保存した後のインスリンの化学的不安定性を、Hvass, 2003, (A. Hvass, M. Hach, and M. U. Jars. Complementary analytical HPLC methods for insulin-related degradation products. American Biotechnology Laboratory 21 (2): 8-12, 2003)に記載されているようにして、ＨＰＬＣ分析により研究した。共有結合したダイマーと高分子量のポリマー(ＨＭＷＰ)を、サイズ排除(ＳＥ)クロマトグラフィーで分析した。勾配溶離での逆相(ＲＰ)クロマトグラフィー(ｐＨ３．６)を、分解産物(インスリンのデスアミド形態及び他のインスリン関連不純物)の分離に使用した。
【０１１５】
噴霧乾燥した微小粒子の水分量を、パーキンエルマー・ピリス ＴＧＡ１ 熱質量分析器を使用し、最小で３時間、１１０℃での乾燥時の損失によって決定した。水分損失により生じた重量変化を記録し、重量パーセントで表した。
エアロダイナミック・パーティクル・サイザー(登録商標)(ＡＰＳ)分光計を使用して、粒度分布(空気動力学的中央粒子径)を決定した。
噴霧乾燥したインスリンのｐＨを、約４０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで、脱塩水に噴霧乾燥パウダーを溶解させ、電位差計(Radiometer, Denmark)によりｐＨを測定することにより、測定した。
【０１１６】
噴霧乾燥した調製物Ａ−Ｋの特徴付けした結果を、以下の表１にまとめる。
【０１１７】
実施例４
インスリンアスパルトの噴霧乾燥
３６１．８ｇのインスリンアスパルトを、４．５リットルの氷冷された脱塩水に分散させた。氷冷された０．２のＮａＯＨを用い、ｐＨを７．６８に調節した。９リットルになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの最終濃度は３７ｇ／ｌであった。噴霧乾燥する前に、滅菌フィルター(０．２μｍ)を介して溶液を濾過した。
インスリンアスパルト溶液の噴霧乾燥を、１．０ｍｍの開口径を有する２流体ノズルを具備するパイロットスケールのスプレー乾燥機(model Mobile Minor, Niro, Denmark)で実施した。乾燥ガス及び噴霧ガスとして、窒素を使用した。
【０１１８】
入口及び出口温度は、それぞれ１１０及び６２℃であった。供給流は約１ｋｇ／ｈであり、ガス／供給比は約１１であった。
スプレー乾燥機は、サイクロンとバグフィルターの双方を具備している。噴霧乾燥中、サイクロンとバグフィルターの双方から同時にパウダーを収集した。
粒度分布を、レーザー回折(Mastersizer, Malvern)及びエアロダイナミック・パーティクル・サイジング分光計(ＡＰＳ)の双方により、粒度分布を分析した。４０℃で１ヶ月保存した後の、噴霧乾燥されたインスリンアスパルトの化学的完全性を、実施例２に記載したようにして、ＳＥ又はＲＰ-ＨＰＬＣにより研究した。
【０１１９】
実施例５
様々なｐＨ値での凍結乾燥インスリンアスパルト乾燥パウダーの保存安定性
０．８０６ｇのインスリンアスパルトを、１０ｍｌの氷冷水に分散させた。懸濁液を氷浴に配し、最初のｐＨはｐＨ４．５８と測定された。氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．３９に調節し、これによりインスリンアスパルトを溶解させた。全重量が２０．４ｇになるまで、脱塩水を添加した。
溶解したインスリンアスパルトを２．５ｍｌの６つのアリコートに分割し、それぞれｐＨ７．０、７．７、８．０、８．５、９．０及び９．５に調節した。全重量が３．０６ｇになるまで、脱塩水を添加した。
インスリンアスパルト溶液を、標準的な凍結乾燥プログラムを使用し、ガラスバイアルにおいて、０．９ｍｌのアリコートに、クリスト・アルファ２-４ＬＳＣ(Christ Alpha 2-4 LSC(Christ Alpha, Germany))装置にて凍結乾燥した。
０．５ｍｌの脱塩水を、約３３ｍｇのインスリンアスパルトパウダーに添加し、ついで、１５分後、ｐＨ電極を具備する電位差計を用いてｐＨを測定することにより、凍結乾燥したインスリンアスパルトパウダーのｐＨを測定した。
【０１２０】
−１８℃のコントロールと比較して、４０℃で２週間、乾燥(シリカゲル上)保存した後の、噴霧乾燥インスリンアスパルトの化学的完全性を、実施例２に記載したようにして、ＳＥ-ＨＰＬＣにより研究した。
【０１２１】
実施例６
様々なｐＨ値での噴霧乾燥インスリンアスパルト乾燥パウダーの保存安定性
２０．６ｇのインスリンアスパルトを、３００ｍｌの氷冷水に分散させた。懸濁液を氷浴に配し、最初のｐＨはｐＨ４．６３と測定された。１００ｍｌの氷冷された０．１Ｎ 水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．５０に調節し、これによりインスリンアスパルトを溶解させた。
溶解したインスリンアスパルトを６つのアリコート６５ｇに分割し、それぞれｐＨ７．０、７．７、８．０、８．５、９．０及び９．５に調節した。全重量が８０．０ｇになるまで、各アリコートに脱塩水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は約３８ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２２】
乾燥した固形微小粒子を、０．７ｍｍの並流２液ノズルを具備するブッチ製Ｂ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)で調製した。液状供給物(８０ｍｌ)を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、乾燥チャンバー内の温気流に霧化した。
乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は４９〜６１℃で変化した。固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉し、収集し、乾燥条件下で保存した。
【０１２３】
噴霧乾燥したインスリンアスパルトのｐＨを、７０−８０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで、脱塩水に噴霧乾燥したパウダーを溶解させ、電位差計(Radiometer, Denmark)によりｐＨを測定することにより測定した。−１８℃のコントロールと比較して、４０℃で４週間、乾燥(シリカゲル上)保存した後の、噴霧乾燥インスリンアスパルトの化学的な完全性を、実施例２に記載したようにして、ＳＥ-ＨＰＬＣ及びＲＰ-ＨＰＬＣにより研究した。
【０１２４】
実施例７
２００００ｎｍｏｌのリジン-アシル化ＧＬＰ１アナログＮ-イプシロン２６-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[(Ｓ)-４カルボキシ-４-(１７カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]-エトキシ}エトキシ)アセチル][Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)を、４０００ｎｍｏｌ／ｍＬ(分子量４１１３ｇ／ｍｏｌ)になるように、水に溶解させた。水酸化ナトリウムにより、２ｍＬの溶液をｐＨ７．６に調節し、さらに２つに分け、一方には、ｐＨ９．６になるまでアンモニア(水中に２５％)を添加した。同様に、２ｍＬの溶液には、ｐＨ８．７になるまで水酸化ナトリウムを添加し、２つに分け、一方には、ｐＨ１０．３になるまでアンモニア(水中に２５％)を添加した。最後に、１ｍＬのＧＬＰ１アナログ溶液には、ｐＨ１０．３になるまで水酸化ナトリウムを添加した。５つのサンプルを全て凍結乾燥し、４０ｍｇ／ｍＬなるように再溶解させた。サンプルのｐＨ値を測定したところ、それぞれ７．５、７．６、８．６、８．６及び９．７であった。
【０１２５】
実施例８
揮発性塩基を用いたＧＬＰ-１アナログの噴霧乾燥
１８０ｍｇ(４３８００ｎｍｏｌ)のリジン-アシル化ＧＬＰ１アナログＮ-イプシロン２６-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[(Ｓ)-４-カルボキシ-４-(１７-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)を、７ｍｌの脱塩水に溶解させ、０．２Ｎの塩酸を用いて、ｐＨ７．５３からｐＨ７．０３に調節した。ついで、０．２５％ｗ／ｗのアンモニア水を用い、溶液をｐＨ９．９６に調節し、脱塩水を添加したところ、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ-１アナログが得られた。
溶液を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、０．７ｍｍの並流２液ノズルを具備するブッチ製Ｂ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)の乾燥チャンバー内において、温気流に霧化した。乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は約６３℃であった。固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉した。
１２０ｍｇ／ｍｌになるように、パウダーを脱塩水に再溶解させたところ、ｐＨはｐＨ６．９と測定された。
【０１２６】
実施例９
強アルカリのｐＨ値でのインスリンアスパルトの化学的不安定性
７２０ｍｇのインスリンアスパルトを、９ｍｌの脱塩水に溶解させた。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液を用い、２．２５ｍｌの溶液をｐＨ７．６からｐＨ１０．０に調節した。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液を用い、さらなる２．２５ｍｌの溶液をｐＨ１１．０に調節した。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液と１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を用い、さらなる２．２５ｍｌの溶液をｐＨ１２．０に調節した。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液と１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を用い、最後の２．２５ｍｌの溶液をｐＨ１２．６に調節した。
４つのｐＨ調節された溶液を、３−８℃の冷蔵庫で２４時間保持し、その後、化学的分解を停止させるために、１Ｎの塩酸を用いて、４つの溶液を中性のｐＨに調節した。
中和された溶液におけるインスリンの化学的不安定性を、実施例２に記載したような、サイズ排除及び逆相ＨＰＬＣにより研究した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質溶液を乾燥させる方法及び乾燥させたタンパク質生成物に関する。また本発明は、このような乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物、本発明の乾燥させたタンパク質を使用する糖尿病及び高血糖症を治療する方法、及び糖尿病及び高血糖症の処置における、このような乾燥させたタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾燥とは、固体、半固体又は液体から、固形状態になるまで、蒸発により水分を除去する物質移動方法である。可能な乾燥方法は真空乾燥であり、生じた蒸気を真空システムにより除去しつつ、接触伝導又は放射線(又は電磁波)により、熱が供給される。他の技術はドラム乾燥であり、室外に蒸気を引き出す吸引装置及びエネルギーを提供するために、加熱表面が使用される。
フリーズドライ又凍結乾燥は、生化学工業で通常使用されている乾燥方法である。乾燥前に溶媒を凍結させ、ついで昇華させる、すなわち、溶媒の融点以下で固相から直接ガス相にさせる。フリーズドライは、多くの場合、乾燥可能な高圧下で実施され、適切な速度で続行される。タンパク質及びペプチドの変性は凍結中に生じ、品質の乏しいフリーズドライ製品に至るおそれがある。
噴霧乾燥は、化学工業、食品工業、及び生化学及び製薬工業において、広範囲に応用されている。噴霧乾燥は、１９４０年代の初期より製薬工業に使用されている。予め定められた特性、例えば粒度分布及び形状を有するパウダーを得る手段が提案されているため、薬剤可能の有用な方法であるとされている。さらに、多くの調製プロセスが、噴霧乾燥では一工程で達成可能であり：これらには、カプセル化、錯体形成、及び重合が含まれる。また噴霧乾燥は、熱に敏感な製薬、例えば活性の損失を最小限にしたタンパク質製剤を乾燥するのに便利な方法である。
【０００３】
国際特許出願ＷＯ００／００１７６号には、所望しない多量の塩又は他の割形剤が同時に生成することなく、治療剤の実質的に純粋な溶液を噴霧乾燥させることにより得られる、微小粒子処方物が開示されている。塩は安定化効果を有しておらず、実際に、塩の量を減少させると安定化が増すために、塩は所望されないと言われている。インスリン微小粒子は、酸にＺｎ-インスリンを溶解させ、インスリン溶液が例えばｐＨ７以上になるようにアルカリ(ＮａＯＨ)を添加し、インスリン溶液を噴霧乾燥させることで得られる。添加された塩酸及び水酸化ナトリウムは、塩分と共に、噴霧乾燥された微小粒子処方物中に残る。さらに、得られた処方物は、水に添加されると、噴霧乾燥に送られたタンパク質溶液と同じｐＨを有するようになるであろう。
【０００４】
国際特許公開ＷＯ９５／２４１８３号は、インスリンの肺送達についての方法及び組成物に関する。インスリンパウダーは、７．５ｍｇ／ｍｌの最終固体濃度及び６．７±０．３のｐＨが付与されるように、賦形剤(マンニトール及び／又はラフィノース)を含有するクエン酸バッファー中でバルク結晶インスリンを混合し、ついで、インスリン溶液を噴霧乾燥させることにより生成される。
国際特許公開ＷＯ０５／０９２３０１号は、インスリンの等電点以下、好ましくは５．４以下のｐＨで、インスリンの透明溶液を噴霧乾燥させることに関する。ヒトＧＬＰ-１は、とりわけ回腸末端部のＬ-細胞、膵臓及び脳で合成される、プレプログルカゴンに由来する、３７のアミノ酸残基ペプチドである。ＧＬＰ-１は、グルコース代謝及び消化管の分泌及び代謝における調節機能を有する重要な消化管ホルモンである。ＧＬＰ-１はグルコース依存性方式におけるインスリン分泌を刺激し、インスリンの生合成を刺激し、ベータ細胞の救助を促進し、グルカゴンの分泌、胃内容排出及び食物の取込を低下させる。ヒトＧＬＰ-１は、双方ともインスリン分泌ペプチドである、ＧＬＰ-１(７-３７)及びＧＬＰ-１(７-３６)に加水分解される。
【０００５】
治療用のホルモンインスリンは、血糖値に影響を与える小タンパク質である。それは、数百万の人々の糖尿病の薬物療法に、日々使用されている。糖尿病は、長期にわたる合併症に至る、高血糖値(高血糖症)に帰する、インスリン及びインスリン耐性の絶対的又は相対的欠乏症に起因する慢性病である。
【０００６】
現在、１型糖尿病及び２型糖尿病の双方の糖尿病の処置は、いわゆる強化インスリン療法に依存する度合いがますます増加している。この治療法によれば、患者は、基礎インスリン必要量を補うための持続型インスリンの１日１又は２回の注射を含む複数回の毎日のインスリン注射に、食事に関連したインスリン必要量を補うための速効型インスリンのボーラス注射が補填された治療を受ける。
【０００７】
インスリン分子は、それぞれ２１及び３０残基を有する２本の鎖Ａ及びＢからなる。Ａ鎖は、鎖内ジスルフィド結合により、ヘリックスの一方に結合した短い伸長部分により離間した、２つのらせん状断片から組立られている。２つの付加的なジスルフィド結合が、Ａ鎖とより長いＢ鎖とを結合させている。生物学的に活性な形態では、インスリンはモノマーとして存在しており、Ｂ鎖は２つの伸長した部分の側面に配された中心ヘリックス領域を含む。亜鉛等の二価イオンの存在下、モノマーはヘキサマーに組立られ、ここで、それぞれ２つの中心亜鉛イオンは、３つのヒスチジン残基に配位している。
インスリンは、十分に順序付けされたクロス-βアセンブリに至らしめる、フィブリル化、ミスフォールディングプロセスに敏感である。β細胞におけるフィブリル化の保護は、亜鉛ヘキサマー内の敏感な分子の金属イオン封鎖により提供される。インスリンの噴霧乾燥中にフィブリル化が生じた場合は、ノズルが詰まり、乾燥プロセスが中断されるおそれがある。
噴霧乾燥用ノズルの詰まりを回避するための他の重要な要因は、乾燥されるタンパク質が適切に溶液中に溶解していることである。送られる溶液に分散しているタンパク質により、装置の詰まりに至るおそれがある。
さらに、乾燥させたタンパク質のｐＨは非常に重要である。多くの場合、特定のｐＨ、例えば生理的ｐＨに匹敵するｐＨを有する乾燥生成物を得ることが所望されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、タンパク質溶液を乾燥させる方法に関し、ここで
ａ）賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質を混合し、タンパク質溶液がアルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、場合によっては非揮発性酸を用いて、ｐＨを調節することによって、タンパク質溶液を得、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる。
さらに本発明は、上述した方法により得られる乾燥させたタンパク質、乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物、及び糖尿病を使用するための方法に関する。
【０００９】
(定義)
ここに記載するような「タンパク質溶液」とは、酸を使用することなく、タンパク質の等電点以上のｐＨ値で溶解する、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体又はグルカゴンの溶液を意味する。
「揮発性塩基」とは、室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する塩基、又は室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する塩基を含む水性共沸混合物等、加熱及び／又は減圧時に、ある程度蒸発するであろう塩基を意味する。
ここに記載するような「非揮発性塩基」とは、室温で６５Ｐａ以下の蒸気圧を有する塩基等、加熱時に蒸発しない又は一部のみが蒸発する塩基を意味する。
【００１０】
ここに記載するような「非揮発性酸」とは、リン酸等、室温で６５Ｐａ以下の蒸気圧を有する酸等、加熱時に蒸発しない又は一部のみが蒸発する酸を意味する。
ここに記載するような「強酸」とは、塩酸及び硫酸等、１以下のｐＫａ値を有する酸を意味する。
ここで使用されるような「インスリン」とは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７との間、及びＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９との間にジスルフィド架橋、及びＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１との間に内部ジスルフィド架橋を有するヒトインスリン、ブタインスリン又はウシインスリン、又はそのインスリンアナログ又は誘導体を意味する。
ここで使用されるような「ＧＬＰ-１」とは、グルカゴン様ペプチド-１を意味する。ヒトＧＬＰ-１は３７のアミノ酸残基のペプチドである。ヒトＧＬＰ-１は、双方ともインスリン分泌ペプチドである、ＧＬＰ-１(７-３７)及びＧＬＰ-１(７-３６)に加水分解される。
【００１１】
「タンパク質溶液／インスリン溶液／ＧＬＰ-１溶液／グルカゴン溶液のｐＨ」とは、揮発性及び非揮発性塩基で調節した後、またタンパク質溶液を噴霧乾燥する前の、タンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴン溶液のｐＨを意味する。
「乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンのｐＨ」とは、少なくとも２０ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質と０．５ｍｌの脱塩水を混合し、脱塩水のｍｌ当たり少なくとも４０ｍｇ濃度のタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１が得られるようにし、ｐＨを測定した場合の、乾燥した／噴霧乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンのｐＨを意味する。乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１のｐＨは、約３００ｍｇまでの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１と０．５ｍｌの脱塩水を混合し、ｐＨを測定することにより決定することができる。例えば、ｐＨは、約２０〜約２５０ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、約２０〜約２００ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、約２０〜約１５０ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、又は約２０〜約１００ｍｇの噴霧乾燥した／乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンと０．５ｍｌの脱塩水を混合し、ｐＨを測定することにより決定される。
【００１２】
「乾燥させたタンパク質の標的ｐＨ」とは、乾燥させたタンパク質を得るのに望ましい、乾燥させたタンパク質／インスリン／ＧＬＰ-１／グルカゴンのｐＨを意味し、例えば、乾燥させたタンパク質の化学的安定性が最適であるか、又は乾燥させたタンパク質が生理的ｐＨに匹敵するｐＨである。
「タンパク質溶液の標的ｐＨ」とは、乾燥した場合に、タンパク質溶液／インスリン溶液／ＧＬＰ-１溶液／グルカゴン溶液にとって望ましいであろうｐＨを意味し、例えば高溶解性又は低凝集性とするのに、溶解したタンパク質にとっては最適なｐＨである。
【００１３】
ここで使用される場合「アナログ」とは、天然に生じるインスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び／又は交換することにより、及び／又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、タンパク質の構造から形式的には誘導することができる分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加された及び／又は交換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じる残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れかとすることができる。インスリンアナログは、Ｂ鎖の２８位が、天然Ｐｒｏ残基から、Ａｓｐ、Ｌｙｓ又はＩｌｅの一つに修飾され得るものであってよい。他の態様において、インスリンのＢ２９位のＬｙｓは、Ｐｒｏ又はＧｌｕに修飾されている。また、Ａ２１位のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、好ましくはＧｌｙに修飾されてもよい。さらに、Ｂ３位のＡｓｎはＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐに修飾されてよい。インスリンアナログのさらなる具体例は、ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン；ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンアナログ；ＰｈｅＢ１が欠失しているインスリンアナログ；Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ-末端伸長を有しているインスリンアナログ、及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ-末端伸長を有しているインスリンアナログである。例えば、１又は２のＡｒｇが、Ｂ１位に付加されていてもよい。
【００１４】
このＧＬＰ-１ペプチドのアナログを記載するために、単純なシステムが使用される。よって、例えば[Ｇｌｙ８]ＧＬＰ-１(７-３７)は、Ｇｌｙで８位において自然に生じたアミノ酸残基(Ａｌａ)を置換することにより、ＧＬＰ-１(７-３７)から形式的に誘導されたＧＬＰ-１(７-３７)のアナログを表す。ＧＬＰ-１アナログは、ＧＬＰ-１(７-３７)の３４位にある自然に生じたＬｙｓが、Ａｒｇで置換されているものであってよい。光学異性体が記載されていない全てのアミノ酸は、Ｌ-異性体を意味していると理解される。
【００１５】
本発明の態様においては、最大１７のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大１５のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大１０のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大８のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大７のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大６のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大５のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大４のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大３のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大２のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、１のアミノ酸が修飾される。
【００１６】
「ｄｅｓＢ３０インスリン」、「ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠くインスリン又はそのアナログを意味する。
「親インスリン」とは、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリン又はブタインスリンを意味する。また親インスリンはインスリンアナログであってもよい。
ここで使用される場合「誘導体」とは、例えばタンパク質骨格の一又は複数の一に置換基を導入することにより、又はタンパク質のアミノ酸残基の基を酸化又は還元することにより、又は遊離のアミノ基又はヒドロキシ基をアシル化することにより、化学的に修飾された天然に生じるタンパク質又はそのアナログを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法を用いることで、乾燥されるタンパク質溶液のｐＨとは異なるｐＨを有する、乾燥させたタンパク質パウダーを得ることができる。
本発明は、タンパク質溶液を乾燥させる方法に関し、ここで
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質とを混合することで得、アルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、場合によっては非揮発性酸を用いて、タンパク質溶液のｐＨを調節し、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる；
ものである。
【００１８】
本発明の一態様において、本方法は：
ａ）乾燥させたタンパク質の標的ｐＨの選択、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨの選択、
ｃ）水相の提供、
ｄ）タンパク質の添加、
ｅ）場合によっては賦形剤の添加、
ｆ）非揮発性塩基、及び場合によっては非揮発性酸を用いた、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｇ）揮発性塩基を用いた、乾燥されるタンパク質溶液の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｈ）タンパク質溶液の噴霧乾燥、
を含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施することができる。
【００１９】
一態様において、タンパク質溶液は、揮発性塩基及び非揮発性塩基で調節される。本方法の一態様において、タンパク質溶液は、約８℃以下、約６℃以下、約５℃以下、約４℃以下、約３℃以下、約２℃以下、又は約１℃以下の温度で得られる。
一態様において、水の凝固点は低下し、タンパク質溶液は０℃以下の温度で得られる。
【００２０】
一態様において、タンパク質溶液は、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０、約８．２、約８．４又は約８．６以上のｐＨ又は標的ｐＨを有する。
タンパク質溶液のｐＨが約７．６〜約１１．０、約７．６〜約１０．５、約７．８〜約１１．０、約７．８〜約１０．５、約８．０〜約１１．０、約８．０〜約１０．５、約８．２〜約１１．０、約８．４〜約１１．０、約８．６〜約１０．０、約８．８〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、又は約９．２〜約１０．０である場合、タンパク質のフィブリル化傾向はあまり顕著ではない。
【００２１】
本発明の一態様において、タンパク質は水溶液に添加される。水溶液は純水であってよく、また賦形剤又はアルカリを含有していてもよい。
本発明の一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、非揮発性塩基を含有するアルカリ溶液で調節される。非揮発性塩基は、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はその組合せからなる群から選択可能である。例えば、ｐＨは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、又は任意のその組合せを用いて調節可能である。
【００２２】
本発明の一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、揮発性塩基を含有するアルカリ溶液で調節される。揮発性塩基は、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又は組合せからなる群から選択可能である。例えば、揮発性塩基は、重炭酸塩、炭酸塩、アンモニア、ヒドラジン、又は有機塩基、例えば低級脂肪族アミン類、特にトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン類、トリエタノールアミン類、及びそれらの塩であってよい。さらに、揮発性塩基は、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せであってよい。
インスリンを含有する水溶液に水酸化アンモニウムを添加すると、タンパク質、例えばインスリンはより素早く溶解するであろう。
【００２３】
本発明の一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、揮発性塩基及び非揮発性塩基を含有するアルカリ溶液で調節される。一態様において、タンパク質溶液のｐＨは、乾燥させたタンパク質についての標的ｐＨには水酸化ナトリウムで、噴霧乾燥されるタンパク質溶液についての選択されたｐＨを得るには水酸化アンモニウムを用いて調節される。
【００２４】
本発明の一態様において、揮発性塩基は、少なくとも約０．５ｐＨ単位、少なくとも約０．７ｐＨ単位、又は少なくとも約０．９ｐＨ単位、又は少なくとも約１．１ｐＨ単位、又は少なくとも約１．３ｐＨ単位、又は少なくとも約１．５ｐＨ単位でタンパク質溶液のｐＨを調節するために使用される。
【００２５】
溶液において、インスリンの自己会合パターンは、タンパク質濃度、金属イオン、ｐＨ、イオン強度、及び溶媒組成の複合機能である。インスリン、亜鉛イオン、塩及びフェノール化合物を含有する、現在使用の溶液のいくつかについて、以下の平衡を考慮しなければならない：
６Ｉｎ ⇔ ３Ｉｎ２
３Ｉｎ２ ＋ ２Ｚｎ２＋Ｈ ⇔ Ｉｎ６（Ｔ６）
Ｔ６ ⇔ Ｔ３Ｒ３ ⇔ Ｒ６
ここで、Ｉｎはインスリンであり、Ｉｎ２は二量体インスリンであり、Ｉｎ６は六量体インスリンであり、Ｔ６はＴ６立体構造中の六量体インスリンであり、Ｔ３Ｒ３はＴ３Ｒ３立体構造中の六量体インスリンであり、Ｒ６は六量体Ｒ６状態での六量体インスリンである。
インスリンの公知の分解パターンには、ａ）線維形成；ｂ）Ａ１８、Ａ２１及びＢ３でのアミド分解；ｃ）アミノ基転移又はシッフ塩基形成を介した二量体形成；ｄ）ジスルフィド交換反応が含まれる。
【００２６】
Brange (Stability of Insulin, Kluwer Academic Press, 1994)によれば、これら分解反応のそれぞれは、六量体状態よりも単量体状態である方が、かなり早く進行する。よって、インスリン調製物を安定化させる最も効果的な手段は、上述した平衡をできる限り右側に押すことによる。質量作用のこの一般的効果に加えて、選択された残基の反応性は、Ｔ→Ｒ立体構造変化におけるそれらの直接的関与に依存して、さらに修飾される。例えば、Ｂ３Ａｓｎの反応性はＴ-状態にあるよりもＲ-状態(残基がアルファ-ヘリックスに存在する場合)にある方がかなり低い。２つの亜鉛インスリン六量体のＴ６、Ｔ３Ｒ３及びＲ６立体構造の間の相互変換は、Ｔ６、Ｔ３Ｒ３及びＲ６型に結合するリガンドにより修飾される。塩化物等のアニオンは、Ｔ３Ｒ３及びＲ６の金属イオンの第４配位位置に対する親和性を有し、さらにフェノール等の防腐剤はＴ３Ｒ３及びＲ６型の表面近傍に位置する疎水性ポケットに結合している(Derewenda, Nature and, Brzovic, Biochemistry 33, 130557,1994)。
よって、溶液中のインスリンのＲ６立体構造に好ましい条件は、インスリンの変性を回避するための乾燥方法中、及び化学的安定性を最大にするための棚保管中の双方に有利である。
【００２７】
本発明の一態様において、タンパク質溶液はフェノールを含有する。一態様において、タンパク質溶液は、タンパク質１モル当たり少なくとも約２モルのフェノール、又はタンパク質１モル当たり少なくとも約３モルのフェノール、又はタンパク質１モル当たり少なくとも約４モルのフェノールを含有する。一態様において、タンパク質溶液は、インスリン１モル当たり約４モルのフェノールを含有する。一態様において、タンパク質溶液は、インスリン１モル当たり約４モルのフェノールを含有し、タンパク質溶液は亜鉛を含有する。タンパク質溶液がインスリンを含有する場合、フェノールはインスリン六量体を安定化させる。
【００２８】
本発明の一対応において、タンパク質は、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、及びＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又は任意のそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２９】
本発明の一態様において、タンパク質溶液は、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含有し、溶液は亜鉛をさらに含有する。インスリンを含有するタンパク質溶液の亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２〜約４亜鉛イオンの範囲とすることができ、又は亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２．１〜約３亜鉛イオンの範囲とすることができ、又は亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２．２〜約２．７亜鉛イオンの範囲とすることができる。インスリンを含有するタンパク質溶液の亜鉛含有量はインスリン六量体当たり約２．３亜鉛イオンとすることができる。
【００３０】
本発明の一態様において、タンパク質溶液は、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤(absorption protacting agent)、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤を含有する。
本発明の一態様において、タンパク質溶液はグリシルグリシンを含有する。グリシルグリシンがタンパク質溶液に添加されている場合、タンパク質はさらに素早く溶解する。一態様において、グリシルグリシンは、インスリンを含有する水溶液に添加される。溶液中のグリシルグリシンの濃度は、約４ｍＭ〜約２００ｍＭの間であるであろう。
【００３１】
本発明の一態様において、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨで、タンパク質溶液を乾燥又は噴霧乾燥する方法が決定される。乾燥又は噴霧乾燥されるタンパク質溶液のｐＨは、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨ以上である。タンパク質溶液のｐＨは、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨ以上、少なくとも約０．５ｐＨ単位であってよい。タンパク質溶液のｐＨは、噴霧乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも約０．７、少なくとも約０．９、少なくとも約１．１、少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．５、又は少なくとも約２．０、又は少なくとも約２．５ｐＨ単位であってよい。
【００３２】
本発明の一態様において、噴霧乾燥させたタンパク質のｐＨ又は標的ｐＨは、約６．０〜約８．５、約６．２〜約８．４、約６．４〜約８．３、約６．６〜約８．２、約６．８〜約８．１、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．９、約７．４〜約７．８、又は約７．６〜約７．７である。
【００３３】
本発明の一態様において、タンパク質溶液は、約１０％以下の水分含有量となるように乾燥又は噴霧乾燥される。水分含有量は、実験部分で記載されているように、乾燥テスト(重量測定)において算出して／損失を測定して、約６％以下、約４％以下、約２％以下、又は約１％以下であってよい。
【００３４】
本発明の一態様において、乾燥又は噴霧乾燥されるタンパク質は、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される。
一態様において、本発明は、本発明の方法により得られる乾燥させたタンパク質に関する。
一態様において、本発明は、実施例に記載されるような乾燥させたタンパク質に関する。
【００３５】
一態様において、本発明は、治療的有効量の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又は本発明のそれらの任意の組合せを含有する薬学的組成物に関し、ここで該組成物により、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の処置を提供することができる。
一態様において、本発明は、治療的有効量の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又はそれらの任意の組合せを、製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物に関し、ここで該組成物により、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の処置を提供することができる。
【００３６】
本発明の一態様において、本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを含有する薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する方法を提供する。
本発明の一態様において、本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明の一態様において、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する薬学的組成物を提供し、該組成物は、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンを、１又は２の本発明の噴霧乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンと混合して、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は添加剤と共に含有する。
【００３８】
本発明の一態様において、本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンを、１又は２の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンと混合して、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態を治療する方法を提供する。
【００３９】
本発明の一態様は、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する薬学的組成物で、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の肺処置用に提供可能な薬学的組成物に関する。
【００４０】
本発明の一態様は、このような処置を必要とする患者における、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の肺処置用の薬学的組成物の用途に関し、該薬学的組成物は、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては急速に作用を開始するインスリン又はインスリンアナログと混合して、製薬的に許容可能な担体及び／又は添加剤と共に含有する。
【００４１】
本発明の一態様において、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の状態の処置に使用される薬学的組成物を製造する方法を提供し、該組成物は肺に使用され、治療的有効量の本発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せを、場合によっては急速に作用を開始するインスリン又はインスリンアナログと混合して、製薬的に許容可能な担体及び／又は製薬的に許容可能な添加剤と共に含有する。
【００４２】
(インスリンの生成)
インスリン又はその前駆体は、よく知られたペプチド合成、又は適切に形質転換された微生物におけるよく知られた組換え生成のいずれかにより生成させることができる。例えば、インスリンは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、ペプチドの発現が可能な条件下、適切な栄養培地でポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培養体から回収することを含む方法により生成することができる。
本発明の製薬用処方物に使用されるインスリン誘導体を調製する場合、置換用の出発生成物、親インスリン又はインスリンアナログ又はその前駆体は、よく知られたペプチド合成、又は適切に形質転換された微生物におけるよく知られた組換え生成のいずれかにより生成させることができる。例えば、インスリン出発生成物は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、ペプチドの発現が可能な条件下、適切な栄養培地でポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培養体から回収することを含む方法により生成することができる。国際特許出願ＷＯ２００５／０１２３４７号が参照される。
【００４３】
(薬学的組成物)
この発明の乾燥させたタンパク質は、例えば皮下的、経口的、経鼻的又は肺的に投与することができる。
皮下投与用として、乾燥したインスリンは、公知のインスリンの処方物と同じように処方される。さらに、皮下投与用として、この発明の乾燥したインスリンは、公知のインスリンの投与と同じように投与され、一般的に、医者はこの手順に通じている。
【００４４】
この発明の乾燥したインスリンは、循環インスリンレベルを増加させ、及び／又は循環グルコースレベルを低下させるための用量効果的方式で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖症等の疾患を治療するのに効果的である。インスリンの効果的な投与を達成するには、この発明の乾燥したインスリンを、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ以上の吸入量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血糖値、患者の身体コンディション、患者の肺の状態等を含む要因を考慮し、博識な実施者により決定することができる。
【００４５】
本発明において、この発明の乾燥したインスリンは、その素早い吸収を達成するために、吸入により送達されてもよい。吸入による投与は、インスリンの皮下投与に匹敵する薬物動態をもたらすことができる。この発明の乾燥したインスリンを吸入することで、循環インスリンレベルの素早い上昇、続いて血糖値の素早い低下に至る。同様の粒子径及び同様の肺沈着レベルで比較される場合、典型的には、種々の吸入装置により、同様の薬物動態が提供される。
【００４６】
本発明において、この発明の乾燥したインスリンは、吸入による治療剤の投与において、当該技術で公知の任意の様々な吸入装置により送達され得る。これらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、スプレー等が含まれる。この発明の乾燥したインスリンは、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達される。この発明の乾燥したインスリンを投与するための吸入装置には、いくつかの所望される特徴がある。例えば、吸入装置による送達には、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。良好な呼吸性のためには、吸入装置は、小粒子、例えば約１０μｍ未満、例えば約１-５μｍ未満の粒子を送達すべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、TurbohalerＴＭ(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosＴＭ吸入器(Dura)、吸入治療用に市販されている装置、AERxＴＭ(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量噴霧式吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
【００４７】
当業者が認識しているように、本発明の乾燥させたタンパク質の処方、送達される処方物の量、及び単一用量の投与の持続時間は、使用される吸入装置の種類に依存している。ネブライザー等、いくつかのエアゾール送達システムにとって、投与頻度及びシステムが稼働している時間の長さは、主として、エアゾール中のインスリンコンジュゲートの濃度に依存するであろう。例えば、投与時間が短いと、ネブライザー溶液においては、より高い濃度のインスリンコンジュゲートを使用することができる。定量噴霧式吸入器等の装置は、高濃度のエアゾールを生成することができ、所望の量のインスリンコンジュゲートの送達を、より短い時間で作動させることができる。パウダー吸入器等の装置は、付与された充填量の薬剤が装置から排出されるまで、活性剤を送達させる。この種の吸入器において、付与されたパウダー量における、この発明の乾燥したインスリンの量は、一回の投与で送達される用量を決定する。
【００４８】
吸入装置で送達される処方物におけるこの発明の乾燥したインスリンの粒子径は、肺、気道下部及び肺胞内においてなされる、インスリンの能力に関して重要である。この発明の乾燥したインスリンは、送達されるインスリンコンジュゲートの少なくとも約１０％、例えば約１０％〜２０％、又はそれ以上が肺に沈着するように処方される。口呼吸するヒトにとって、肺沈着の最大効率は、約２μｍ〜約３μｍの粒子径で得られることが知られている。粒子径が約５μｍ以上になると、肺沈着はかなり低減する。粒子径が約１μｍ以下であると、肺沈着の低下が引き起こされ、治療に有効な十分な量の粒子を送達することが困難になる。よって、吸入器により送達される乾燥させたタンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜５μｍの範囲の粒子径を有する。乾燥させたタンパク質の処方は、選択された吸入装置において所望される粒子径が生じるように選択される。
【００４９】
乾燥パウダーとしての投与に有利には、この発明の乾燥させたタンパク質は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの粒子径を有する微粒子型に調製される。粒子径は、患者の肺の肺胞に送達するのに効果的なものである。乾燥パウダーは、多くの粒子が所望する範囲のサイズを有するように生成された粒子から、ほとんどなる。有利には、乾燥パウダーの少なくとも５０％が、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。
【００５０】
粒子は、通常、容器中で乾燥パウダー処方物から分離され、ついで運搬気流を介して患者の肺に移送される。典型的には、現在の乾燥パウダー吸入器において、固形物を破壊する力は、単に、患者の吸入により提供される。他の種類の吸入器においては、患者の吸入により生じる気流が、粒子を凝集させない推進モーターを駆動させる。
【００５１】
乾燥パウダー吸入器から投与されるこの発明の乾燥させたタンパク質の処方物は、典型的には、乾燥させたタンパク質を含有する微細に分割された乾燥パウダーを含むが、パウダーは、さらに増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をさらに含むことができる。例えば特定のパウダー吸入器から送達させるのに必要なパウダーを希釈するため、処方のプロセシングを容易にするため、処方物に有利なパウダー性を付与するため、吸入装置からのパウダーの分散を容易にするため、処方物を安定させるため(例えば、酸化防止剤又はバッファー)、処方物に味を付与するため等に、添加剤をインスリンコンジュゲートの乾燥パウダー処方物に含有させることができる。有利には、添加剤は患者の気道に悪影響を与えないものである。乾燥させたタンパク質は分子レベルで添加剤と混合することができ、又は固体状処方物は添加剤の粒子と混合、又はこれでコーティングされて、タンパク質コンジュゲートの粒子を含有することができる。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類、及び多糖類；糖アルコール類及び他のポリオール類、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述した目的に対して有効な量、多くの場合は処方物の重量に対して約５０％〜約９０％の量で存在している。インスリンアナログタンパク質等の、タンパク質の処方物について、当該技術で公知の添加剤も、本処方物に含めることができる。
【００５２】
タンパク質溶液は、場合によっては、呼吸器官及び肺投与に適した製薬用の担体又は賦形剤と組合せてもよい。このような担体は、患者に送達されるパウダー中のインスリン濃度を低下させることが所望されている場合は、単に増量剤として供給されてもよいが、インスリン組成物の安定性を高め、インスリンのさらに効率的で再生可能な送達を提供するのに、パウダー分散装置内におけるパウダーの分散性を改善し、インスリンの操作性、トリ製造及びパウダー充填が容易になるような流動性及びコンシステンシーを改善するために供給されてもよい。
【００５３】
適切な担体物質は、非晶質パウダー、結晶質パウダー、又は非晶質及び結晶質パウダーの組合せの形態であってもよい。適切な物質には、炭水化物、例えば単糖類、特にフルクトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ-マンノース、ソルボース等；二糖類、例えばラクトース、トレハロース、セロビオース等；シクロデキストリン類、例えば２-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン；及び多糖類、例えばラフィノース、マルトデキストリン類、デキストラン類等；(ｂ)アミノ酸、例えばグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リジン等；(ｃ)有機酸と塩基から調製される有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、塩酸トロメタミン等；(ｄ)ペプチド及びタンパク質、例えばアスパルテーム、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等；(ｅ)アルジトール類、例えばマンニトール、キシリトール等は含まれる。担体の好ましい群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩酸トロメタミン、ヒト血清アルブミン、及びマンニトール含まれる。
このような担体物質は、噴霧乾燥前に、すなわち噴霧乾燥用に調製されるタンパク質溶液又は水溶液に担体物質を添加することにより、インスリンと組合せられてもよい。そのように、担体物質はタンパク質粒子の一部として、又は同時に形成されるであろう。
【００５４】
典型的には、担体がタンパク質と共に噴霧乾燥により形成される場合、タンパク質は５％〜９５％、好ましくは２０％〜８０％の範囲の重量パーセントで、個々の粒子に存在しているであろう。粒子の残りは、主として担体物質(典型的には、重量で５％〜９５％、通常は２０％〜８０％)であるが、上述した他の成分を含む、バッファー(類)を含有していてもよい。
【００５５】
また、担体は、乾燥パウダー形態に別々に調製され、混合することにより、乾燥パウダータンパク質を組合せてもよい。別々に調製されたパウダー状担体は、通常、結晶質(水分吸収を回避するため)であるが、いくつかのケースでは、非晶質、又は結晶質と非晶質の混合であってもよい。担体粒子のサイズは、典型的には２５ｍ〜１００ｍの範囲である、インスリンパウダーの流動性が改善されるように選択されてよい。このサイズ範囲の担体粒子は、一般的には、肺の肺胞領域に浸透せず、多くの場合、吸入前に、送達装置においてインスリンから分離するであろう。よって、肺の肺胞領域に浸透する粒子は、本質的にインスリンとバッファーとからなるであろう。好ましい担体物質は、上述した範囲のサイズを有する結晶性マンニトールである。
【００５６】
本発明の乾燥インスリンパウダーは、他の活性成分と組合せられてもよい。例えば、糖尿病の処置性を改善するために、インスリンパウダーに、少量のアミリン又は活性アミリンアナログを組合せることが望ましい場合もある。アミリンは、正常な(糖尿病ではない)個人において、膵臓０-細胞からインスリンと共に分泌されるホルモンである。アミリンはインビボにおいてインスリン活性を調節すると考えられており、インスリンとアミリンの同時投与により、血中グルコースの制御を改善することが提案されている。本発明の組成物において、インスリンと乾燥パウダーアミリンとを組合せることにより、このような同時投与を達成するための、特に簡便な生成物が提供されるであろう。アミリンは、０．１重量％〜１０重量％(一服中のインスリンの全重量に基づく)、好ましくは０．５重量％〜２．５重量％のインスリンと組合せてよい。アミリンは商業的供給者、例えばAmylin Corporation, San Diego, Californiaから入手され、本発明の組成物に容易に処方することができる。例えば、アミリンは、インスリン、場合によっては担体、パウダー状生成物を生成するために乾燥された溶液スプレーと共に、水溶液又は他の適切な溶液に溶解されていてもよい。
【００５７】
この発明の乾燥させたタンパク質を含むスプレーは、タンパク質コンジュゲートの懸濁液又は溶液を、加圧下にて、強いてノズルを通過させることにより製造することができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給速度は、所望する出量及び粒子径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続した電場により、電気スプレーを製造することができる。有利には、スプレーにより送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子径を有する。
【００５８】
スプレーを用いて使用するのに適したこの発明の乾燥したインスリンの処方物は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり、約１ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質コンジュゲート濃度で、水溶液中にタンパク質を含有している。処方物は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤、例えば亜鉛等の薬剤を含有することができる。また処方物は、賦形剤、又は結晶を安定化させるための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をさらに含有可能である。乾燥させたタンパク質コンジュゲートの処方に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。タンパク質コンジュゲートの処方に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等が含まれる。また結晶処方物は、エアゾールの形成において、溶液の噴霧化により生じるインスリンコンジュゲートの表面誘起凝集を低減又は防止可能な界面活性剤を、さらに含有することができる。種々の従来からの界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを使用することができる。量は、一般的には、処方物の重量に対して約０．００１〜約４％の範囲である。
【００５９】
また、本発明の乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物は、経鼻的に投与されてよい。薬学的組成物は、液状組成物、乾燥組成物又はゲルとして投与されてもよい。鼻を介した薬剤送達にとって、鼻腔への沈着を保証し、粒子が気道内及び肺領域にさらに運ばれるのを回避するために、結晶は１０μｍ以上であってよい。サイズの上限についての理解は明らかではないが、多くの理由で、粒子が効能を示さず、局所刺激に至らしめるおそれのある粒子サイズ以上が、おそらく上限であろう。
【００６０】
本発明の乾燥させたタンパク質を含有する薬学的組成物は、このような処置を必要とする患者に、非経口的に投与されてもよい。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射で実施されてよい。また非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。
【００６１】
本発明の乾燥させたタンパク質の注射用組成物は、所望する最終生成物が付与されるのに適切なように、成分を溶解及び混合することを含む、製薬工業の従来からの技術を使用して調製することができる。よって、一手順において、本発明のインスリンを含有する結晶は、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、等張剤、防腐剤及びバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨ値が調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が付与されるように、水を用いて調節される。
【００６２】
本発明のさらなる態様において、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シタラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーのそれぞれ一つは、本発明の別の態様を構成する。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、処方物は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサル(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択され得る、製薬的に許容可能な防腐剤をさらに含有する。本発明のさらなる態様において、防腐剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、防腐剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、防腐剤は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、防腐剤は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の防腐剤各自は、本発明の別の態様を構成する。薬学的組成物に防腐剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版、1995が挙げられる。
【００６４】
本発明のさらなる態様において、処方物は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤をさらに含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一態様において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一態様において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、限定されて固定されるものではない。一態様において、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明のさらなる態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、本発明のさらなる態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張剤各自は、本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版、1995が挙げられる。
【００６５】
典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な防腐剤は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
【００６６】
この発明の乾燥させたタンパク質、例えばインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴンを含有する組成物は、インスリンに対して敏感な状態の処置に使用することができる。よってそれらは、１型糖尿病、２型糖尿病及び例えば重篤に傷害を被った人及び大手術を受けた人にしばしば見られる高血糖症の処置に使用することができる。任意の患者に対する最適な用量レベルは、用いられる特定のインスリンの効能、年齢、体重、身体活動性、及び患者の食事、他の薬剤との併用の可能性、治療される状態の重篤度を含む様々な要因に依存する。この発明の乾燥させたタンパク質の毎日の投薬量が、既知の薬学的組成物に対するものと同様の方法で当業者によって各個々の患者に対して決定されることが推奨される。
都合がよいことに、この発明の乾燥させたタンパク質は、他のタイプのタンパク質、例えばさらに速効で作用を開始するインスリンアナログと混合して使用してもよい。このようなインスリンアナログの具体例は、例えば、公開番号EP214826(Novo Nordisk A/S)、EP375437(Novo Nordisk A/S)及びEP383472(Eli Lilly & Co)を有する欧州特許出願に記載されている。
【００６７】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈されない。
ここで提供される任意の及び全ての例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に、本発明をより解明することを意図したものであり、特に示さない限りは、本発明の範囲を制限するものではない。明細書におけるいずれの言語も、請求項に記載していない要素を本発明の実施に必須であることを示していると解してはならない。
ここでの特許公報の引用及び導入は便宜上のものであって、このような特許公報の正当性、特許性及び／又は執行可能性についての見解を示すものではない。
この発明は、適応される法律により許容されるよう、ここに提案された請求項に列挙された主題事項の全ての修正及び等価事項を含む。
【００６８】
本発明は以下のパラグラフに要約されるであろう。
１．タンパク質溶液を乾燥させる方法であって、
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質とを混合することで得、アルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、場合によっては非揮発性酸を用いて、タンパク質溶液のｐＨを調節し、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる；
方法。
【００６９】
２．ａ）乾燥させたタンパク質の標的ｐＨの選択、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨの選択、
ｃ）水相の提供、
ｄ）タンパク質の添加、
ｅ）場合によっては賦形剤の添加、
ｆ）非揮発性塩基、及び場合によっては非揮発性酸を用いた、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｇ）揮発性塩基を用いた、乾燥されるタンパク質溶液の標的ｐＨへのｐＨの調節、及び
ｈ）タンパク質溶液の噴霧乾燥、
を含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施可能である、パラグラフ１の方法。
３．工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施可能である、パラグラフ２の方法。
【００７０】
４．タンパク質溶液が８℃以下の温度で得られる、パラグラフ１-３の方法。
５．タンパク質溶液が、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、又は１℃以下の温度で得られる、パラグラフ１-４の方法。
６．水相の凝固点が低下し、タンパク質溶液が０℃以下の温度で得られる、パラグラフ１-５の方法。
７．乾燥方法が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥からなる群から選択される、パラグラフ１-６の方法。
【００７１】
８．タンパク質溶液が７．４以上のｐＨを有している、パラグラフ１-７の方法。
９．タンパク質溶液が、７．６以上、７．８以上、８．０以上、８．２以上、８．４以上又は８．６以上のｐＨを有する、パラグラフ１-８の方法。
１０．タンパク質溶液が７．４〜１１．０のｐＨを有している、パラグラフ１-８の方法。
１１．タンパク質溶液が、約７．６〜約１１．０、約７．６〜約１０．５、約７．８〜約１１．０、約７．８〜約１０．５、約８．０〜約１１．０、約８．０〜約１０．５、約８．２〜約１１．０、約８．４〜約１１．０、約８．６〜約１０．０、約８．８〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、又は約９．２〜約１０．０のｐＨを有する、パラグラフ１-８及び１０の方法。
【００７２】
１２．非揮発性塩基が、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１-１１の方法。
１３．非揮発性塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、又はそれらの任意の組合せをである、パラグラフ１２の方法。
１４．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１-１３の方法。
１５．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せである、パラグラフ１４の方法。
【００７３】
１６．揮発性塩基で、少なくとも０．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１-１５の方法。
１７．揮発性塩基で、少なくとも０．７ｐＨ単位、又は少なくとも０．９ｐＨ単位、又は少なくとも１．１ｐＨ単位、又は少なくとも１．３ｐＨ単位、又は少なくとも１．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１-１６の方法。
１８．タンパク質溶液のｐＨが、水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムを含有する溶液で調節される、パラグラフ１-１７の方法。
【００７４】
１９．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、及びＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ１-１８の方法。
２０．タンパク質溶液が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含有し、溶液が亜鉛をさらに含有する、パラグラフ１-１９の方法。
２１．タンパク質溶液がフェノールを含有する、パラグラフ２０の方法。
２２．タンパク質溶液が、タンパク質１モル当たり約４モルのフェノールを含有する、パラグラフ２０-２１の方法。
【００７５】
２３．タンパク質溶液が、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤、又はそれらの組合せを含有する、パラグラフ１-２２の方法。
２４．タンパク質溶液がグリシルグリシンを含有する、パラグラフ２３の方法。
【００７６】
２５．タンパク質溶液のｐＨが乾燥させたタンパク質のｐＨ以上である、パラグラフ１-２４の方法。
２６．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．５ｐＨ単位である、パラグラフ２５の方法。
２７．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．７、少なくとも０．９、少なくとも１．１、少なくとも１．３、又は少なくとも１．５ｐＨ単位である、パラグラフ１-２６の方法。
【００７７】
２８．乾燥させたタンパク質のｐＨが約６．０〜約８．５である、パラグラフ１-２７の方法。
２９．乾燥させたタンパク質のｐＨが、約６．２〜約８．４、約６．４〜約８．３、約６．６〜約８．２、約６．８〜約８．１、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．９、約７．４〜約７．８、又は約７．６〜約７．７である、パラグラフ１-２８の方法。
３０．タンパク質溶液が、約１０％以下、約６％以下、約４％以下、約２％以下、又は約１％以下の水分含有量の噴霧乾燥させたタンパク質が得られるように乾燥される、パラグラフ１-２９の方法。
３１．タンパク質がインスリンアナログであり、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される、パラグラフ１-３０の方法。
【００７８】
３２．パラグラフ１-３１の方法により得られる乾燥させたタンパク質。
【００７９】
３３．パラグラフ３２の噴霧乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する薬学的組成物。
３４．組成物が、糖尿病又は高血糖症の肺、非経口、鼻又は経口処置用である、パラグラフ３３の薬学的組成物。
３５．パラグラフ３２の乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する、このような処置を必要とする患者における糖尿病又は高血糖症を治療するための薬学的組成物であって、該タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される組成物。
【００８０】
３６．パラグラフ３２の乾燥させたタンパク質、又はパラグラフ３３-３５の薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における糖尿病の処置方法。
３７．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ３６の方法。
３８．実施例に記載するような乾燥させたタンパク質。
【００８１】
１ａ．タンパク質溶液を乾燥させる方法であって、
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質とを混合することで得、アルカリ性になるようにｐＨを調節し、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる；
方法。
【００８２】
２ａ．ａ）乾燥させたタンパク質の標的ｐＨの選択、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨの選択、
ｃ）水相の提供、
ｄ）タンパク質の添加、
ｅ）場合によっては賦形剤の添加、
ｆ）非揮発性塩基を用いた、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨへのｐＨの調節、
ｇ）揮発性塩基を用いた、乾燥されるタンパク質溶液の標的ｐＨへのｐＨの調節、及び
ｈ）タンパク質溶液の噴霧乾燥、
を含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続的に攪拌しつつ、任意の順序で実施可能である、タンパク質溶液から乾燥させたタンパク質を生成する方法。
３ａ．タンパク質溶液が、揮発性塩基及び非揮発性塩基を用いて調節される、パラグラフ１ａの方法。
【００８３】
４ａ．タンパク質溶液が８℃以下の温度で得られる、パラグラフ１ａ-３ａの方法。
５ａ．タンパク質溶液が、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、又は１℃以下の温度で得られる、パラグラフ１ａ-４ａの方法。
６ａ．水相の凝固点が低下し、タンパク質溶液が０℃以下の温度で得られる、パラグラフ１ａ-５ａの方法。
７ａ．乾燥方法が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥からなる群から選択される、パラグラフ１ａ-６ａの方法。
【００８４】
８ａ．タンパク質溶液が７．４以上のｐＨを有している、パラグラフ１ａ-７ａの方法。
９ａ．タンパク質溶液が、７．６以上、７．８以上、８．０以上、８．２以上、８．４以上又は８．６以上のｐＨを有する、パラグラフ１ａ-８ａの方法。
１０ａ．タンパク質溶液が７．４〜１１．０のｐＨを有している、パラグラフ１ａ-８ａの方法。
１１ａ．タンパク質溶液が、約７．６〜約１１．０、約７．６〜約１０．５、約７．８〜約１１．０、約７．８〜約１０．５、約８．０〜約１１．０、約８．０〜約１０．５、約８．２〜約１１．０、約８．４〜約１１．０、約８．６〜約１０．０、約８．８〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、又は約９．２〜約１０．０のｐＨを有する、パラグラフ１ａ-８ａ及び１０ａの方法。
【００８５】
１２ａ．非揮発性塩基が、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-１１ａの方法。
１３ａ．非揮発性塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、又はそれらの任意の組合せをである、パラグラフ１２ａの方法。
１４ａ．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又はそれらの組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-１１ａの方法。
１５ａ．揮発性塩基が、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せである、パラグラフ１４ａの方法。
【００８６】
１６ａ．揮発性塩基で、少なくとも０．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１ａ-１５ａの方法。
１７ａ．揮発性塩基で、少なくとも０．７ｐＨ単位、又は少なくとも０．９ｐＨ単位、又は少なくとも１．１ｐＨ単位、又は少なくとも１．３ｐＨ単位、又は少なくとも１．５ｐＨ単位を有するタンパク質溶液のｐＨを調節する、パラグラフ１ａ-１６ａの方法。
１８ａ．タンパク質溶液のｐＨが、水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムを含有する溶液で調節される、パラグラフ１ａ-１７ａの方法。
【００８７】
１９ａ．タンパク質溶液がフェノールを含有する、パラグラフ１ａ-１８ａの方法。
２０ａ．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、エキセンディン、エキセンディンアナログ及び誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-１９ａの方法。
２１ａ．タンパク質が、アミリン、アミリンアナログ、アミリン誘導体、α-ＭＳＨ、α-ＭＳＨアナログ、α-ＭＳＨ誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-２０ａの方法。
２２ａ．タンパク質溶液が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体からなる群から選択されるタンパク質を含有し、溶液が亜鉛をさらに含有する、パラグラフ１ａ-２０ａの方法。
【００８８】
２３ａ．タンパク質溶液が、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤、又はそれらの組合せを含有する、パラグラフ１ａ-２２ａの方法。
２４ａ．タンパク質溶液がグリシルグリシンを含有する、パラグラフ２３ａの方法。
【００８９】
２５ａ．タンパク質溶液のｐＨが乾燥させたタンパク質のｐＨ以上である、パラグラフ１ａ-２４ａの方法。
２６ａ．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．５ｐＨ単位である、パラグラフ２５ａの方法。
２７ａ．タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上、少なくとも０．７、少なくとも０．９、少なくとも１．１、少なくとも１．３、又は少なくとも１．５ｐＨ単位である、パラグラフ１ａ-２６ａの方法。
【００９０】
２８ａ．乾燥させたタンパク質のｐＨが約６．０〜約８．５である、パラグラフ１ａ-２７ａの方法。
２９ａ．乾燥させたタンパク質のｐＨが、約６．２〜約８．４、約６．４〜約８．３、約６．６〜約８．２、約６．８〜約８．１、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．９、約７．４〜約７．８、又は約７．６〜約７．７である、パラグラフ１ａ-２８ａの方法。
３０ａ．タンパク質溶液が、約１０％以下、約６％以下、約４％以下、約２％以下、又は約１％以下の水分含有量の噴霧乾燥させたタンパク質が得られるように乾燥される、パラグラフ１ａ-２９ａの方法。
３１ａ．タンパク質がインスリンアナログであり、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される、パラグラフ１ａ-３０ａの方法。
【００９１】
３２ａ．パラグラフ１ａ-３１ａの方法により得られる乾燥させたタンパク質。
【００９２】
３３ａ．パラグラフ３２の噴霧乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する薬学的組成物。
３４ａ．組成物が、糖尿病又は高血糖症の肺、非経口、鼻又は経口処置用である、パラグラフ３３ａの薬学的組成物。
３５ａ．パラグラフ３２ａの乾燥させたタンパク質を治療的有効量含有する、このような処置を必要とする患者における糖尿病又は高血糖症を治療するための薬学的組成物であって、該タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、エキセンディン、エキセンディンアナログ及び誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される組成物。
【００９３】
３６ａ．パラグラフ３２ａの乾燥させたタンパク質、又はパラグラフ３３ａ-３５ａの薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における糖尿病の処置方法。
３７ａ．タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体、エキセンディン、エキセンディンアナログ及び誘導体、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、パラグラフ３６ａの方法。
３８ａ．実施例に記載するような乾燥させたタンパク質。
【００９４】
分析方法
ＨＭＷＰ含有量を、Ph. Eur法に基づき、アイソクラチックサイズ排除コンジュゲート法により測定した。ウォーターズ(Waters)インスリンＨＭＷＰ７．８ｘ３００ｍｍカラムを、６５％の１．０ｍｇ／ｍｌ Ｌ-アルギニン溶液、２０％のアセトニトリル、及び１５％の氷酢酸を含有する、０．５ｍｌ／分流速の移動相と共に使用した。注射容量は１００μｌであった。カラム温度を周囲であった。２７６ｎｍの紫外吸光度により検出を行った。ピーク面積対全ピーク面積基準において、クロマトグラムを分析した。
【００９５】
ウォーターズ・サンファイア(Sunfire)Ｃ１８、３．５μｍ、内径１５０ｘ４．６ｍｍのカラムを利用し、逆相コンジュゲート法を使用して純度を測定した。カラム温度を３５℃にし、流速を１ｍｌ／分にした。勾配系には、１．４％(ｗ／ｗ)の硫酸ナトリウム、０．２％(ｗ／ｗ)のｏ-リン酸、７．７％(ｗ／ｗ)のアセトニトリルを含有する移動相Ａ、ｐＨ３．６と、水中に４２．８％(ｗ／ｗ)のアセトニトリルを含有する移動相Ｂを使用した。勾配系は、３０分で、約４２％の移動相Ｂに均一濃度化し始めた。ついで、移動相Ｂが、３分以上かけて４２％から８０％に直線的に増加し、２分で均一濃度のままであった。ついで、１分以上かけて、初期条件が４２％の移動相Ｂに戻り、２０分、そのままであった。２１４ｎｍでの紫外吸光度により検出した。注射容量は１０μｌであった。ピーク面積対全ピーク面積基準において、クロマトグラムを分析した。本方法により、インスリンのデスアミノ(desamido)形態を含む不純物に関連したインスリンが検出される。
【００９６】
噴霧乾燥したパウダーの容量粒度分布を、湿潤モードで操作されるレーザー回折装置、マスターサイザー(Mastersizer) (Malvern Instruments, United Kingdom)を使用して測定した。装置を湿潤分散システム(Malvern QS Small Volume Sample Dispersion Unit)に取り付け、微小粒子を、約０．０５％のトゥイーン８０を含有するイソプロパノールに懸濁させた。ついで、サンプルを測定し、マルバーン(Malvern)ソフトウェアを使用し、散乱データに基づき粒度分布を算出する。体積中央径Ｄ[ｖ,０．５]は直径であり、分布の５０％が上で、５０％が下である。
【００９７】
噴霧乾燥したパウダーの空気力学的粒度分布を、流れ加速ノズル(flow accelerating nozzle)の直接下流の粒子速度に基づき、個々の粒子の空気力学的直径を測定するレーザーベースの粒子測定器である、モデル３３２１エアロダイナミック・パーティクル・サイザー(Aerodynamic Particle Sizer)(登録商標)(ＡＰＳ)分光計(TSI incorporated)を使用して測定した。スモール・スケール・パウダー・ディスパーサーモデル３４３３(Small Scale powder Disperser model)(TSI incorporated)を用いて、パウダーをエアロゾル化した。これらの測定から、ほぼリアルタイムで、サイズ分布が測定される。空気動力学的質量中央径(ＭＭＡＤ)は空気力学的径であり、分布の５０％が上で、５０％が下である。
噴霧乾燥したパウダーの残留水分量を、パーキンエルマー・ピリス ＴＧＡ１ 熱質量分析器(PerkinElmer Pyris TGA1 thermogravimetric analyzer)を使用し、最小で３時間、１１０℃で乾燥させることによる損失で測定した。水分損失による重量変化を記録し、重量によるパーセンテージで表した。
【実施例】
【００９８】
実施例１
ｐＨ９．５でのヒトインスリンの溶解
１０．０ｇのヒトインスリンを、３８７．３ｇの氷冷水に分散させた。分散液を氷浴に配し、ｐＨが５．０３と測定された。ついで、氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを、ｐＨ８．９９になるまで段階的に添加した。４５分後、ｐＨを８．７７まで低下させ、さらに４時間以上かけて、氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを、ｐＨ８．７５になるまで添加した。溶液はまだ透明ではなく、一晩、冷蔵庫に配した。
次の日、ｐＨが８．７５と測定され、溶液はまだ透明ではなかった。氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムにより、ｐＨを９．４８に調節し、ついで、不透明溶液を、次の５日間、冷蔵庫に配した。
５日後、溶液は透明になり、０．２Ｎの塩化水素を用いて、９．３７から７．５９になるまでｐＨを調節した。
【００９９】
実施例２
Ａ）揮発性塩基を用いたタンパク質溶液の噴霧乾燥
Ｂ）噴霧乾燥させたタンパク質のｐＨの測定
９．５ｇのヒトインスリンを、２００ｇ氷冷水に分散させた。分散液を氷浴に配し、最初のｐＨはｐＨ５．１２と測定された。ついで、氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを５．８ｇ使用し、ｐＨを７．０４に調節した。溶液をさらに２時間、氷浴で保持し、ついで、脱塩水を全重量２４０ｇになるまで添加した。
ｐＨ７．４の溶液の５０ｇをさらに処理した。氷冷された１ＮのＮＨ４ＯＨを用いて、７．０４から７．５０にｐＨを調節し、ついで、一晩、冷蔵庫に配した。次の日、ｐＨが７．３２と測定され、氷冷された１ＮのＮＨ４ＯＨを用いて、ｐＨをｐＨ８．０６に調節した。ついで、６０．０ｇになるまで水を添加した。ヒトインスリンの最終濃度は、約３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１００】
乾燥した固形微小粒子を、０．７ｍｍの並流２液ノズル(co-current two-fluid nozzle)を具備するブッチ製(Buchi)Ｂ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)で調製した。ヒトインスリン溶液を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、乾燥チャンバー内の温気流に霧化した。
乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は約７０℃であった。
固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉し、収集し、乾燥条件下で保存した。
噴霧乾燥したヒトインスリン(噴霧乾燥する前、タンパク質溶液のｐＨは８．０６であった)を、４０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ及び１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で脱塩水に再溶解させ、様々な濃度が測定されるｐＨ値に影響を及ぼすかどうかを研究した：
２５．３ｍｇを６３３μＬの水に添加した：ｐＨは６．９５と測定された
４３．５ｍｇを５４５μＬの水に添加した：ｐＨは６．９５と測定された
８１．７ｍｇを５１０μＬの水に添加した：ｐＨは７．０１と測定された
【０１０１】
実施例３
噴霧乾燥したインスリンアスパルト(Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン)を、様々な比率の揮発性及び非揮発性塩によって、溶解させた。
噴霧乾燥前に、安定化賦形剤を含むか又は含まない様々なインスリンアスパルト溶液を調製した：
【０１０２】
調製物Ａ
溶液Ａ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。ついで、２．６ｍｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．５３になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ａ２：６５ｍｌの溶液Ａ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０３】
調製物Ｂ
溶液Ｂ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初２．２ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで７５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．５２になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｂ２：６５ｍｌの溶液Ｂ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０４】
調製物Ｃ
溶液Ｃ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初４．４ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで７５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．４８になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｃ２：６５ｍｌの溶液Ｃ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０５】
調製物Ｄ
溶液Ｄ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初６．６ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで３７０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．４７になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｄ２：６５ｍｌの溶液Ｄ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
調製物Ｅ
溶液Ｅ１：１６ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において１５０ｍｌの水に懸濁させた。最初６．６ｍｌの氷冷された１ＮのＮａＯＨ、ついで３７０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．４７になるまで段階的に添加し、透明溶液を得た。最後に、全容量が２００ｍｌになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は８０ｍｇ／ｍｌであった。
溶液Ｅ２：６５ｍｌの溶液Ｅ１を、さらに１３０ｍｌに希釈した。インスリンアスパルトの濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０７】
調製物Ｆ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初１７５μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．８３になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、８５μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９９に調製し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０８】
調製物Ｇ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初２８８μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、１２０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．８６になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、８０μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを８．０３に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
調製物Ｈ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初８６４μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．８５になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、６０μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
調製物Ｉ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初１５０μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．９９になるまで段階的に添加した。
４．６ｍｌの０．２５Ｍ グリシルグリシン溶液、１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液及び３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、２４５μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１１】
調製物Ｊ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初２８８μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、１２５μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが８．１８になるまで段階的に添加した。
４．６ｍｌの０．２５Ｍ グリシルグリシン溶液、１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液及び３．６ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、１２５μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１２】
調製物Ｋ
１．８ｇのインスリンアスパルトを、氷浴において４０ｍｌの水に懸濁させた。最初２８８μｌの氷冷された１Ｎ ＮａＯＨ、ついで、１２５μｌの氷冷された濃アンモニア水(２５％ｗ／ｗ)を、ｐＨが７．９３になるまで段階的に添加した。
１．１ｍｌの０．１Ｍ ＺｎＣｌ２溶液と１．９ｍｌの０．３２Ｍ フェノール溶液を、さらに溶液に添加した。
最後に、４０μｌの希アンモニア水(８％ｗ／ｗ)を用いて、ｐＨを７．９８に調節し、全容量が６０ｍｌになるまで水を添加した。溶液は透明であり、インスリンアスパルトの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１３】
乾燥固形微小粒子を、０．７ｍｍの並流２液ノズルを具備するブッチＢ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)で調製した。液状供給物(調製物Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、及びＫ)を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、乾燥チャンバー内の温気流に霧化した。
乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は４１〜６１℃で変化した。
固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉し、収集し、乾燥条件下で保存した。
【０１１４】
４０℃で１ヶ月保存した後のインスリンの化学的不安定性を、Hvass, 2003, (A. Hvass, M. Hach, and M. U. Jars. Complementary analytical HPLC methods for insulin-related degradation products. American Biotechnology Laboratory 21 (2): 8-12, 2003)に記載されているようにして、ＨＰＬＣ分析により研究した。共有結合したダイマーと高分子量のポリマー(ＨＭＷＰ)を、サイズ排除(ＳＥ)クロマトグラフィーで分析した。勾配溶離での逆相(ＲＰ)クロマトグラフィー(ｐＨ３．６)を、分解産物(インスリンのデスアミド形態及び他のインスリン関連不純物)の分離に使用した。
【０１１５】
噴霧乾燥した微小粒子の水分量を、パーキンエルマー・ピリス ＴＧＡ１ 熱質量分析器を使用し、最小で３時間、１１０℃での乾燥時の損失によって決定した。水分損失により生じた重量変化を記録し、重量パーセントで表した。
エアロダイナミック・パーティクル・サイザー(登録商標)(ＡＰＳ)分光計を使用して、粒度分布(空気動力学的中央粒子径)を決定した。
噴霧乾燥したインスリンのｐＨを、約４０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで、脱塩水に噴霧乾燥パウダーを溶解させ、電位差計(Radiometer, Denmark)によりｐＨを測定することにより、測定した。
【０１１６】
噴霧乾燥した調製物Ａ−Ｋの特徴付けした結果を、以下の表１にまとめる。
【０１１７】
実施例４
インスリンアスパルトの噴霧乾燥
３６１．８ｇのインスリンアスパルトを、４．５リットルの氷冷された脱塩水に分散させた。氷冷された０．２のＮａＯＨを用い、ｐＨを７．６８に調節した。９リットルになるまで水を添加した。インスリンアスパルトの最終濃度は３７ｇ／ｌであった。噴霧乾燥する前に、滅菌フィルター(０．２μｍ)を介して溶液を濾過した。
インスリンアスパルト溶液の噴霧乾燥を、１．０ｍｍの開口径を有する２流体ノズルを具備するパイロットスケールのスプレー乾燥機(model Mobile Minor, Niro, Denmark)で実施した。乾燥ガス及び噴霧ガスとして、窒素を使用した。
【０１１８】
入口及び出口温度は、それぞれ１１０及び６２℃であった。供給流は約１ｋｇ／ｈであり、ガス／供給比は約１１であった。
スプレー乾燥機は、サイクロンとバグフィルターの双方を具備している。噴霧乾燥中、サイクロンとバグフィルターの双方から同時にパウダーを収集した。
粒度分布を、レーザー回折(Mastersizer, Malvern)及びエアロダイナミック・パーティクル・サイジング分光計(ＡＰＳ)の双方により、粒度分布を分析した。４０℃で１ヶ月保存した後の、噴霧乾燥されたインスリンアスパルトの化学的完全性を、実施例２に記載したようにして、ＳＥ又はＲＰ-ＨＰＬＣにより研究した。
【０１１９】
実施例５
様々なｐＨ値での凍結乾燥インスリンアスパルト乾燥パウダーの保存安定性
０．８０６ｇのインスリンアスパルトを、１０ｍｌの氷冷水に分散させた。懸濁液を氷浴に配し、最初のｐＨはｐＨ４．５８と測定された。氷冷された０．２Ｎの水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．３９に調節し、これによりインスリンアスパルトを溶解させた。全重量が２０．４ｇになるまで、脱塩水を添加した。
溶解したインスリンアスパルトを２．５ｍｌの６つのアリコートに分割し、それぞれｐＨ７．０、７．７、８．０、８．５、９．０及び９．５に調節した。全重量が３．０６ｇになるまで、脱塩水を添加した。
インスリンアスパルト溶液を、標準的な凍結乾燥プログラムを使用し、ガラスバイアルにおいて、０．９ｍｌのアリコートに、クリスト・アルファ２-４ＬＳＣ(Christ Alpha 2-4 LSC(Christ Alpha, Germany))装置にて凍結乾燥した。
０．５ｍｌの脱塩水を、約３３ｍｇのインスリンアスパルトパウダーに添加し、ついで、１５分後、ｐＨ電極を具備する電位差計を用いてｐＨを測定することにより、凍結乾燥したインスリンアスパルトパウダーのｐＨを測定した。
【０１２０】
−１８℃のコントロールと比較して、４０℃で２週間、乾燥(シリカゲル上)保存した後の、噴霧乾燥インスリンアスパルトの化学的完全性を、実施例２に記載したようにして、ＳＥ-ＨＰＬＣにより研究した。
【０１２１】
実施例６
様々なｐＨ値での噴霧乾燥インスリンアスパルト乾燥パウダーの保存安定性
２０．６ｇのインスリンアスパルトを、３００ｍｌの氷冷水に分散させた。懸濁液を氷浴に配し、最初のｐＨはｐＨ４．６３と測定された。１００ｍｌの氷冷された０．１Ｎ 水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．５０に調節し、これによりインスリンアスパルトを溶解させた。
溶解したインスリンアスパルトを６つのアリコート６５ｇに分割し、それぞれｐＨ７．０、７．７、８．０、８．５、９．０及び９．５に調節した。全重量が８０．０ｇになるまで、各アリコートに脱塩水を添加した。インスリンアスパルトの濃度は約３８ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２２】
乾燥した固形微小粒子を、０．７ｍｍの並流２液ノズルを具備するブッチ製Ｂ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)で調製した。液状供給物(８０ｍｌ)を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、乾燥チャンバー内の温気流に霧化した。
乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は４９〜６１℃で変化した。固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉し、収集し、乾燥条件下で保存した。
【０１２３】
噴霧乾燥したインスリンアスパルトのｐＨを、７０−８０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで、脱塩水に噴霧乾燥したパウダーを溶解させ、電位差計(Radiometer, Denmark)によりｐＨを測定することにより測定した。−１８℃のコントロールと比較して、４０℃で４週間、乾燥(シリカゲル上)保存した後の、噴霧乾燥インスリンアスパルトの化学的な完全性を、実施例２に記載したようにして、ＳＥ-ＨＰＬＣ及びＲＰ-ＨＰＬＣにより研究した。
【０１２４】
実施例７
２００００ｎｍｏｌのリジン-アシル化ＧＬＰ１アナログＮ-イプシロン２６-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[(Ｓ)-４カルボキシ-４-(１７カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]-エトキシ}エトキシ)アセチル][Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)を、４０００ｎｍｏｌ／ｍＬ(分子量４１１３ｇ／ｍｏｌ)になるように、水に溶解させた。水酸化ナトリウムにより、２ｍＬの溶液をｐＨ７．６に調節し、さらに２つに分け、一方には、ｐＨ９．６になるまでアンモニア(水中に２５％)を添加した。同様に、２ｍＬの溶液には、ｐＨ８．７になるまで水酸化ナトリウムを添加し、２つに分け、一方には、ｐＨ１０．３になるまでアンモニア(水中に２５％)を添加した。最後に、１ｍＬのＧＬＰ１アナログ溶液には、ｐＨ１０．３になるまで水酸化ナトリウムを添加した。５つのサンプルを全て凍結乾燥し、４０ｍｇ／ｍＬなるように再溶解させた。サンプルのｐＨ値を測定したところ、それぞれ７．５、７．６、８．６、８．６及び９．７であった。
【０１２５】
実施例８
揮発性塩基を用いたＧＬＰ-１アナログの噴霧乾燥
１８０ｍｇ(４３８００ｎｍｏｌ)のリジン-アシル化ＧＬＰ１アナログＮ-イプシロン２６-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[(Ｓ)-４-カルボキシ-４-(１７-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ａｉｂ８,Ａｒｇ３４]ＧＬＰ-１-(７-３７)を、７ｍｌの脱塩水に溶解させ、０．２Ｎの塩酸を用いて、ｐＨ７．５３からｐＨ７．０３に調節した。ついで、０．２５％ｗ／ｗのアンモニア水を用い、溶液をｐＨ９．９６に調節し、脱塩水を添加したところ、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ-１アナログが得られた。
溶液を、２ｍｌ／分の液体供給速度、及び６００−８００リットル／時間の霧化空気流で、０．７ｍｍの並流２液ノズルを具備するブッチ製Ｂ-２９０ミニスプレー乾燥機(Buchi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)の乾燥チャンバー内において、温気流に霧化した。乾燥した空気は、１５０℃の入口温度と、３５ｍ３／時間の乾燥空気流速度を有していた。出口温度は約６３℃であった。固形微小粒子を、乾燥チャンバーに接続したサイクロンにより捕捉した。
１２０ｍｇ／ｍｌになるように、パウダーを脱塩水に再溶解させたところ、ｐＨはｐＨ６．９と測定された。
【０１２６】
実施例９
強アルカリのｐＨ値でのインスリンアスパルトの化学的不安定性
７２０ｍｇのインスリンアスパルトを、９ｍｌの脱塩水に溶解させた。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液を用い、２．２５ｍｌの溶液をｐＨ７．６からｐＨ１０．０に調節した。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液を用い、さらなる２．２５ｍｌの溶液をｐＨ１１．０に調節した。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液と１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を用い、さらなる２．２５ｍｌの溶液をｐＨ１２．０に調節した。２Ｎの水酸化アンモニウム溶液と１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を用い、最後の２．２５ｍｌの溶液をｐＨ１２．６に調節した。
４つのｐＨ調節された溶液を、３−８℃の冷蔵庫で２４時間保持し、その後、化学的分解を停止させるために、１Ｎの塩酸を用いて、４つの溶液を中性のｐＨに調節した。
中和された溶液におけるインスリンの化学的不安定性を、実施例２に記載したような、サイズ排除及び逆相ＨＰＬＣにより研究した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質溶液を乾燥させるための方法であって、
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質を混合し、タンパク質溶液がアルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、及び場合によっては非揮発性酸を用いてｐＨを調節することにより得て、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる
方法。
【請求項２】
ａ）乾燥させたタンパク質に対する標的ｐＨを選択し、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨを選択し、
ｃ）水相を提供し、
ｄ）タンパク質を添加し、
ｅ）場合によっては賦形剤を添加し、
ｆ）非揮発性塩基及び場合によっては非揮発性酸を用いて、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨにｐＨを調節し、
ｇ）揮発性塩基を用いて、乾燥せしめられるタンパク質溶液の標的ｐＨにｐＨを調節し、
ｈ）タンパク質溶液を噴霧乾燥させる、
ことを含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続攪拌しながら、任意の順序で実施可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質溶液が８℃以下の温度で得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質溶液が７．４〜１１．０のｐＨを有している、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
揮発性塩基が、少なくとも０．５ｐＨ単位でタンパク質溶液のｐＨを調節する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、及びＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質溶液が、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤、又はそれらの組合せを含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質溶液がグリシルグリシン及び／又はフェノールを含有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質溶液が、タンパク質１モル当たり約４モルのフェノールを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
乾燥方法が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法により得られうる乾燥タンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載の乾燥タンパク質を治療的有効量含有する薬学的組成物。
【請求項１４】
組成物が、糖尿病又は高血糖症の肺、非経口、鼻又は経口処置用である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載の乾燥させたタンパク質、又は請求項１３又は１４に記載の薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における糖尿病の治療方法。
【請求項１６】
実施例に記載された乾燥させたタンパク質。
【請求項１】
タンパク質溶液を乾燥させるための方法であって、
ａ）タンパク質溶液を、賦形剤を場合によっては含有する水とタンパク質を混合し、タンパク質溶液がアルカリ性になるように、揮発性塩基、非揮発性塩基、及び場合によっては非揮発性酸を用いてｐＨを調節することにより得て、
ｂ）タンパク質溶液を乾燥させる
方法。
【請求項２】
ａ）乾燥させたタンパク質に対する標的ｐＨを選択し、
ｂ）タンパク質溶液の標的ｐＨを選択し、
ｃ）水相を提供し、
ｄ）タンパク質を添加し、
ｅ）場合によっては賦形剤を添加し、
ｆ）非揮発性塩基及び場合によっては非揮発性酸を用いて、乾燥させたタンパク質の標的ｐＨにｐＨを調節し、
ｇ）揮発性塩基を用いて、乾燥せしめられるタンパク質溶液の標的ｐＨにｐＨを調節し、
ｈ）タンパク質溶液を噴霧乾燥させる、
ことを含み、
ここで、工程ｄ、ｅ、ｆ及びｇが、連続攪拌しながら、任意の順序で実施可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質溶液が８℃以下の温度で得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質溶液が７．４〜１１．０のｐＨを有している、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
揮発性塩基が、少なくとも０．５ｐＨ単位でタンパク質溶液のｐＨを調節する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、及びＧＬＰ-１誘導体、グルカゴン、及び／又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質溶液が、バッファー、洗浄剤、安定剤、プロテアーゼインヒビター、香料、担体、吸収プロタクト剤、増量剤、又は流動特性を改善する薬剤又は浸透促進剤、又はそれらの組合せを含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質溶液がグリシルグリシン及び／又はフェノールを含有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質溶液が、タンパク質１モル当たり約４モルのフェノールを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質溶液のｐＨが、乾燥させたタンパク質のｐＨ以上である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
乾燥方法が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、及び真空乾燥からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法により得られうる乾燥タンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載の乾燥タンパク質を治療的有効量含有する薬学的組成物。
【請求項１４】
組成物が、糖尿病又は高血糖症の肺、非経口、鼻又は経口処置用である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載の乾燥させたタンパク質、又は請求項１３又は１４に記載の薬学的組成物を治療的有効量、患者に投与することを含む、このような処置を必要とする患者における糖尿病の治療方法。
【請求項１６】
実施例に記載された乾燥させたタンパク質。
【公表番号】特表２０１０−５２６０３９（Ｐ２０１０−５２６０３９Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４７３９（Ｐ２０１０−５０４７３９）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５５３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３２２２４
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（５９６１１３０９６）ノボ・ノルデイスク・エー／エス (241)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５５３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３２２２４
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（５９６１１３０９６）ノボ・ノルデイスク・エー／エス (241)
【Ｆターム（参考）】
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