チェックポイントキナーゼの阻害剤
本発明は、ＣＨＫ１活性を阻害する縮合ピラゾールを含む化合物を提供する。本発明はまた、このような阻害化合物を含む組成物及びがんの治療を必要とする患者に本化合物を投与することによってＣＨＫ１活性を阻害する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞周期チェックポイントは、細胞周期移行の順序及びタイミングを制御する調節経路である。それらにより、ＤＮＡ複製及び染色体分離などの重大な事象が高い忠実度で完了されることが確実となる。これらの細胞周期チェックポイントの調節は、腫瘍細胞が多数の化学療法及び放射線照射に応答する様式の重大な決定因子である。多数の効果的ながん療法は、ＤＮＡ損傷を引き起こすことによって働くが、これらの薬剤に対する耐性が、依然としてがんの治療における重大な制限となっている。薬剤耐性のいくつかの機序のうち１つの重要なものは、チェックポイント経路の重要な意味を持つ活性化を制御することによる細胞周期進行の阻止による。これによって、細胞周期を停止して修復のための時間を提供し、修復を促進する遺伝子の転写を誘導し、それによって、即時の細胞死を避ける。例えば、Ｇ２チェックポイントでのチェックポイント停止を無効にすることによって、ＤＮＡ損傷によって誘導される腫瘍細胞死を相乗的に増大させ、耐性を回避することが可能であり得る。
【０００２】
ヒトＣＨＫ１は、ホスファターゼｃｄｃ２５のセリン２１６でのリン酸化によって細胞周期停止の調節において役割を果たしており、これはｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化の防止及び有糸分裂の開始に関与している可能性がある。したがって、ＣＨＫ１の阻害は、ＤＮＡ修復が完了する前に有糸分裂を開始することによってＤＮＡ損傷剤を増強し、それによって腫瘍細胞死を引き起こすはずである。
【０００３】
ＣＨＫ１（Ｃｈｅｋ１とも呼ばれる）の阻害剤である新規化合物を提供することが本発明の目的である。
【０００４】
ＣＨＫ１の阻害剤である新規化合物を含む医薬組成物を提供することも本発明の目的である。
【０００５】
ＣＨＫ１活性の阻害剤などを投与することを含む、がんを治療する方法を提供することも本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、ＣＨＫ１活性を阻害する縮合ピラゾールを含む化合物を提供する。本発明はまた、このような阻害化合物を含む組成物及びがんの治療を必要とする患者に本化合物を投与することによってＣＨＫ１活性を阻害する方法を提供する。これらの縮合ピラゾールは、米国特許出願第６０／６９１，６９４号に報告されるその他の縮合ピラゾールと比較した場合に、改良された血行動態特性を有する。
【０００７】
発明の詳細な記載
本発明の化合物は、ＣＨＫ１の活性の阻害において有用である。本発明の一実施態様では、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ａ：
【０００８】
【化１】
【０００９】
［式中：
Ｒ１は独立してＨ及びＦから選択され、ここで、Ｒ１の少なくとも１個はＦである］
又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体によって示される。
【００１０】
本発明の具体的な化合物として以下がある：
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１２ａ）、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）、
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）及び
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１７）
又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体。
【００１１】
本発明のＨＣｌ塩として、以下がある：
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１２ａ）、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）及び
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）
又はその立体異性体。
【００１２】
本発明のＴＦＡ塩として以下がある：
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１７）
又はその立体異性体。
【００１３】
本発明の化合物は、不斉中心、キラル軸及びキラル面を有する可能性があり（Ｅ．Ｌ．エリール（Ｅｌｉｅｌ）及びＳ．Ｈ．ウィレン（Ｗｉｌｅｎ）、ステレオケミストリー・オブ・カーボン・コンパウンズ（Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、１１１９〜１１９０頁に記載のとおり）、ラセミ体、ラセミ混合物として、また個々のジアステレオマーとして生じる可能性があり、そのすべての可能性ある異性体及び混合物、例えば、光学異性体が本発明に含まれる。更に、本明細書に開示される化合物は、互変異性体として存在する可能性があり、一方の互変異性体構造しか表されていなくとも、両互変異性体の形が本発明の範囲に包含されるものとする。
【００１４】
当業者によって１個以上のシリコン（Ｓｉ）原子を、１個以上の炭素原子の代わりに本発明の化合物に組み込み、化学的に安定であり、かつ容易に入手可能な出発物質から当該技術分野における技術上既知の方法によって容易に合成できる化合物を提供することができるということは理解される。炭素及びシリコンは、類似のＣ成分及びＳｉ成分結合を比較すると、共有結合半径が異なり、これは結合距離及び立体配置の相違をもたらす。これらの相違は、炭素と比較した場合に、シリコン含有化合物の大きさ及び形にわずかな変化をもたらす。当業者ならば、大きさ及び形の相違は、効力、可溶性、標的外活性の欠如、パッケージング特性などにおいてわずかな又は劇的な変化をもたらし得るということは理解される（ディアス（Ｄｉａｓｓ），Ｊ．Ｏ．ら、オルガノメタリクス（Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ）（２００６）５、１１８８〜１１９８頁、ショーウェル（Ｓｈｏｗｅｌｌ），Ｇ．Ａ．らバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）（２００６）１６：２５５５〜２５５８頁）。
【００１５】
式Ａで示される化合物の遊離形、並びにその医薬的に許容され得る塩及び立体異性体も本発明に含まれる。本明細書に例示される単離された具体的な化合物の中には、アミン化合物のプロトン化塩がある。用語「遊離形」とは、非塩の形のアミン化合物を指す。包含される医薬的に許容され得る塩は、本明細書に記載される具体的な化合物の例示される単離された塩だけではなく、式Ａの化合物の遊離形のすべての通常の医薬的に許容され得る塩も含む。記載される具体的な塩化合物の遊離形は、当該技術分野における技術上既知の方法を用いて単離できる。例えば、遊離形は、塩を適した希塩基水溶液、例えば、希ＮａＯＨ、炭酸カリウム、アンモニア及び重炭酸ナトリウム水溶液で処理することによって再生してもよい。遊離形は、特定の物理的特性、例えば、極性溶媒における可溶性において、そのそれぞれの塩の形とはいくらか異なり得るが、酸性及び塩基性塩は、その他の点では、本発明の目的上、そのそれぞれの遊離形と医薬的に同等である。
【００１６】
本化合物の医薬上許容され得る塩は、慣用的な化学法によって塩基性又は酸性部分を含む本発明の化合物から合成できる。通常、塩基性化合物の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによってか、遊離塩基を、適した溶媒又は溶媒の種々の組合せ中で、化学量論量の、又は過剰の所望の塩を形成する無機又は有機酸と反応させることのいずれかによって調製する。同様に、酸性化合物の塩も、適当な無機又は有機塩基との反応によって形成される。
【００１７】
したがって、本発明の化合物の医薬上許容され得る塩として、塩基性の本化合物を無機又は有機酸と反応させることによって形成されるような、本発明の化合物の慣用的な非毒性塩が挙げられる。例えば、慣用的な非毒性塩として、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などから誘導されるもの並びに有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などから調製された塩が挙げられる。
【００１８】
本発明の化合物が酸性である場合、適した「医薬上許容され得る塩」とは、医薬上許容され得る非毒性塩基、例えば、無機塩基及び有機塩基から調製され得る塩を指す。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩が特に好ましい。医薬上許容され得る有機非毒性塩基から誘導される塩としては、第一、第二及び第三アミン、置換アミン、例えば、天然に存在する置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。
【００１９】
上記の医薬上許容され得る塩及びその他の通常の医薬上許容され得る塩の調製は、バーグ（Ｂｅｒｇ）ら、「ファーマシューティカル・サルツ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ）」ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンセズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１９７７：６６：１〜１９頁によって、より十分に記載されている。
【００２０】
生理学的条件下では、化合物中の脱プロトン化酸性部分、例えば、カルボキシル基が陰イオン性であり得、それによりこの電子電荷がプロトン化又はアルキル化された塩基性部分、例えば、第四窒素原子の陽イオン電荷に対して内部的にバランスが崩れている可能性があるので、本発明の化合物は、内部塩又は双性イオンの可能性があるということも留意される。
【００２１】
有用性
本明細書に提供される化合物、組成物及び方法は、がんの治療にとって有用であると特に考えられる。本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、それだけには限らないが以下が挙げられる：心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺：気管支原性肺癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮癌（細気管支癌）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、非小細胞肺；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）結腸、結腸直腸、直腸；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胎生期癌、奇形癌種、絨毛癌、肉腫、間質性細胞癌腫、線維腫、線維線腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管癌、胆芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣腫、肺細胞腫［松果体腫］、多形膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜−莢膜細胞腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫瘍、未分化肺細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）、胸部；血液学的：血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；及び副腎：神経芽腫。したがって、本明細書において提供される用語「がん性細胞」とは、上記で同定される状態のいずれか１種を起こしている細胞が挙げられる。
【００２２】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、それだけには限らないが以下が挙げられる：胸部、前立腺、結腸、結腸直腸、肺、非小細胞肺、脳、精巣、胃、膵臓、皮膚、小腸、大腸、咽頭、頭頸部、口腔、骨、肝臓、膀胱、腎臓、甲状腺及び血液。
【００２３】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、胸部、前立腺、結腸、卵巣、結腸直腸及び肺が挙げられる。
【００２４】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、胸部、結腸、（結腸直腸）及び肺が挙げられる。
【００２５】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、リンパ腫及び白血病が挙げられる。
【００２６】
本発明の化合物はまた、がんを治療するのに有用である医薬を調製するのにも有用である。
【００２７】
本発明の化合物は、標準的な薬学のプラクティスに従い、哺乳動物、例えば、ヒトに、単独又は医薬組成物中で医薬的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤と組合せてのいずれかで投与してもよい。本化合物は、経口的に又は非経口的に投与でき、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸及び局所経路の投与ができる。
【００２８】
有効成分を含む医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性散剤若しくは顆粒剤、エマルジョン、ハード若しくはソフトカプセル剤又はシロップ剤又はエリキシル剤のような経口使用に適した形としてよい。経口使用向きの組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製でき、このような組成物は、医薬的に洗練された、味の良い製剤を提供するために、甘味剤、矯味剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される１種以上の薬剤を含み得る。錠剤は、錠剤の製造に適している、非毒性の医薬上許容され得る賦形剤との混合物中に有効成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えば、マイクロクリスタリンセルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン又はアラビアガム；及び滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよいし、薬物の嫌な味をマスクするため、若しくは消化管における崩壊及び吸収を遅延し、それによって長期間にわたる持続作用を提供するために既知技術によってコーティングされていてもよい。例えば、水溶性の味をマスクする物質、例えば、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロース又は時間遅延物質、例えば、エチルセルロース、酢酸ブチルセルロースを使用してもよい。
【００２９】
経口使用用製剤はまた、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合されているハードゼラチンカプセル剤として、又は有効成分が水溶性担体、例えば、ポリエチレングリコール若しくはオイル媒体、例えば、ピーナッツオイル、流動パラフィン若しくはオリーブオイルと混合されているソフトゼラチンカプセル剤として存在し得る。
【００３０】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。このような賦形剤として、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアガムがあり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、若しくはエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレン−オキシセタノール、若しくはエチレンオキシドの脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、若しくはエチレンオキシドの、脂肪酸及び無水ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液はまた、１種以上の保存料、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートと、１種以上の着色剤と、１種以上の矯味剤と、１種以上の甘味剤、例えば、スクロース、サッカリン若しくはアスパルテームとを含み得る。
【００３１】
油性懸濁液は、有効成分を植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツオイル、又は鉱油、例えば、流動パラフィンに懸濁することによって製剤してもよい。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、ハードパラフィン又はセチルアルコールを含み得る。味の良い経口製剤を提供するために、上記のものなどの甘味剤及び矯味剤を加えてもよい。これらの組成物は、抗酸化物質、例えば、ブチル化ヒドロキシアニソール又はα−トコフェロールの添加によって保存できる。
【００３２】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性散剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１種以上の保存料との混合物中の有効成分を提供する。適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は上記にすでに記載されているものによって示されている。更なる賦形剤として、例えば、甘味剤、矯味剤及び着色剤も存在し得る。これらの組成物は、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸の添加によって保存できる。
【００３３】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形であり得る。油相は、植物油、例えば、オリーブ油若しくはラッカセイ油、又は鉱油、例えば、流動パラフィン又はこれらの混合物であり得る。適した乳化剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、ダイズレシチン、並びに脂肪酸と無水ヘキシトールに由来するエステル若しくは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、並びに前記部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。エマルジョンはまた、甘味料、矯味剤、保存料及び抗酸化物質も含み得る。
【００３４】
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースを用いて製剤してよい。このような製剤はまた、鎮痛薬、防腐剤、矯味剤及び着色剤及び抗酸化薬も含み得る。
【００３５】
本医薬組成物は、滅菌注射用水溶液の形であり得る。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。
【００３６】
滅菌注射用製剤はまた、有効成分が油相に溶解している滅菌注射用水中油型マイクロエマルジョンであり得る。例えば、有効成分をまず、ダイズオイルとレシチンの混合物に溶解してよい。次いで、このオイル溶液を、水とグリセロールの混合物に入れ、マイクロエマルジョンを形成するよう処理する。
【００３７】
注射用溶液又はマイクロエマルジョンは、局所ボーラス注射によって患者の血流中に入れることができる。或いは、本化合物の一定循環濃度を維持するような方法で溶液又はマイクロエマルジョンを投与することが有利であり得る。このような一定濃度を維持するために、連続的静脈内送達装置を利用してもよい。このような装置の一例として、Ｄｅｌｔｅｃ ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）モデル５４００静脈内ポンプがある。
【００３８】
本医薬組成物は、筋肉内投与及び皮下投与用の滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形であり得る。この懸濁液は、上記に記載されている適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用い、既知技術に従って製剤できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であり得る。更に、滅菌硬化油も、溶媒又は懸濁媒体として従来用いられている。この目的には、合成モノ又はジグリセリドをはじめ、任意の無刺激性硬化油を使用してよい。更に、脂肪酸、例えば、オレイン酸は注射用物質の調製において用途がある。
【００３９】
本発明の化合物はまた、薬物の直腸投与のための坐剤の形で投与してもよい。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって、直腸で融解して薬物を放出する適した非刺激性賦形剤と混合することによって調製できる。このような物質として、ココアバター、グリセリン化ゼラチン、硬化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルの混合物が挙げられる。
【００４０】
局所使用用には、式Ａの化合物を含む、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液などが用いられる。（この適用目的上、局所適用はマウスウォッシュ及び口腔洗浄薬を含むものとする。）
【００４１】
本発明の化合物は、適した経鼻ビヒクル及び送達装置の局所使用によって経鼻形態で、又は当業者に周知の経皮皮膚パッチの形のものを用いて経皮経路によって投与できる。経皮送達系の形で投与されるには、投与量の投与は、当然、投薬レジメンを通じて間欠的ではなく連続となる。本発明の化合物はまた、ココアバター、グリセリン化ゼラチン、硬化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルの混合物などの基剤を用いて坐剤として送達してもよい。
【００４２】
本発明の組成物をヒト被験体に投与する場合には、一日用量は、通常、処方医師によって決定され、投与量は、通常、個々の患者の年齢、体重及び応答並びに患者の症状の重篤度に応じて変わる。
【００４３】
一実施態様では、ＣＨＫ１の阻害剤の適した量を、がんの治療を受けている哺乳動物に投与する。投与は、約０．１ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜約６０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の間、又は０．５ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜約４０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の間の阻害剤量で行う。本組成物を含むもう１つの治療投与量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＣＨＫ１の阻害剤を含む。もう１つの実施態様では、投与量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＣＨＫ１の阻害剤を含む。
【００４４】
本化合物はまた、治療薬、化学療法薬及び抗がん剤との組合せにおいて有用である。目下開示される化合物の、治療薬、化学療法薬及び抗がん剤との組合せは本発明の範囲内にある。このような薬剤の例は、Ｖ．Ｔ．デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）及びＳ．ヘルマン（Ｈｅｌｌｍａｎ）（編）によるキャンサー・プリンシプルズ・アンド・プラクティス・オブ・オンコロジー（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第６版（２００１年２月１５日）、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）出版社に見い出すことができる。当業者ならば、薬物及び関与するがんの個々の特徴に基づいて、どの組合せの薬剤が有用であるかを見極めることができる。このような薬剤として、以下が挙げられる：エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤及びその他の血管新生抑制剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤及び細胞周期チェックポイントを干渉する物質。本化合物は、放射線療法と同時投与された場合に特に有用である。
【００４５】
「エストロゲン受容体モジュレーター」とは、機序にかかわらず、エストロゲンの受容体との結合を干渉又は阻害する化合物を指す。エストロゲン受容体モジュレーターの例として、それだけには限らないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾン及びＳＨ６４６が挙げられる。
【００４６】
「アンドロゲン受容体モジュレーター」とは、機序にかかわらず、アンドロゲンの受容体との結合を干渉又は阻害する化合物を指す。アンドロゲン受容体モジュレーターの例として、フィナステリド及びその他の５α−レダクターゼ阻害剤、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾール及び酢酸アビラテロンが挙げられる。
【００４７】
「レチノイド受容体モジュレーター」とは、機序にかかわらず、レチノイドの受容体との結合を干渉又は阻害する化合物を指す。このようなレチノイド受容体モジュレーターの例として、ベキサロテン、トレチノイン、１３−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチナミド及びＮ−４−カルボキシフェニルレチナミドが挙げられる。
【００４８】
「細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤」とは、主に、細胞の機能を直接干渉するか、細胞有糸分裂を阻害又は干渉することによって、細胞死を引き起こすか、又は細胞増殖を阻害する化合物、例えば、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレータ、低酸素活性化可能化合物、微小管阻害剤／微小管安定化剤、有糸分裂キネシンの阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、有糸分裂進行に関与しているキナーゼの阻害剤、増殖因子及びサイトカインシグナル伝達経路に関与しているキナーゼの阻害剤、代謝拮抗剤、生物反応修飾物質、ホルモン／抗ホルモン治療薬、造血性増殖因子、モノクローナル抗体標的化治療薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤及びユビキチンリガーゼ阻害剤及びオーロラキナーゼ阻害剤を指す。
【００４９】
細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤の例として、それだけには限らないが、セルテネフ（ｓｅｒｔｅｎｅｆ）、カケクチン、イフォスファミド、タソネルミン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニムスチン、ジブロモダルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ラニムスチン、ホテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン（ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロフォスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ、ロバプラチン、サトラプラチン、プロフィロマイシン（ｐｒｏｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、イロフルベン（ｉｒｏｆｕｌｖｅｎ）、デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）白金、ベンジルグアニン、グルフォスファミド（ｇｌｕｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＧＰＸ１００、（トランス，トランス，トランス）−ビス−ｍｕ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ｍｕ−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）白金（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジジニルスペルミン（ｄｉａｒｉｚｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビサントレン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピナフィド（ｐｉｎａｆｉｄｅ）、バルルビシン、アムルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アンナマイシン（ａｎｎａｍｙｃｉｎ）、ガラルビシン（ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、エリナフィド（ｅｌｉｎａｆｉｄｅ）、ＭＥＮ１０７５５、４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（ＷＯ００／５００３２参照のこと）、Ｒａｆキナーゼ阻害剤（例えば、Ｂａｙ４３−９００６）及びｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）のＣＣＩ−７７９）が挙げられる。
【００５０】
低酸素活性化可能化合物の一例として、チラパザミンがある。
【００５１】
プロテアソーム阻害剤の例として、それだけには限らないが、ラクタシスチン及びＭＬＮ−３４１（Ｖｅｌｃａｄｅ）がある。
【００５２】
微小管阻害剤／微小管安定化剤の例として、パクリタキセル、硫酸ビンデシン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキセル、リゾキシン、ドラスタチン、イセチオン酸ミボブリン、オーリスタチン、セマドチン、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン、クリプトフィシン、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、アンヒドロビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン（例えば、米国特許第６，２８４，７８１号及び同６，２８８，２３７号参照のこと）及びＢＭＳ１８８７９７が挙げられる。一実施態様では、エポチロンは微小管阻害剤／微小管安定化剤に含まれない。
【００５３】
トポイソメラーゼ阻害剤のいくつかの例として、トポテカン、ハイカプタミン（ｈｙｃａｐｔａｍｉｎｅ）、イリノテカン、ルビテカン、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデン−チャートリューシン（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ）、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ルルトテカン、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、リン酸エトポシド、テニポシド、ソブゾキサン、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、（５ａ、５ａＢ、８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロオキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソール−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナントリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン（ｉｓｏｇｕｉｎｏｌｉｎｅ）−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−ｄｅ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン及びジメスナがある。
【００５４】
有糸分裂キネシン、特に、ヒト有糸分裂キネシンＫＳＰの阻害剤の例は、刊行物ＷＯ０３／０３９４６０、ＷＯ０３／０５００６４、ＷＯ０３／０５０１２２、ＷＯ０３／０４９５２７、ＷＯ０３／０４９６７９、ＷＯ０３／０４９６７８、ＷＯ０４／０３９７７４、ＷＯ０３／０７９９７３、ＷＯ０３／０９９２１１、ＷＯ０３／１０５８５５、ＷＯ０３／１０６４１７、ＷＯ０４／０３７１７１、ＷＯ０４／０５８１４８、ＷＯ０４／０５８７００、ＷＯ０４／１２６６９９、ＷＯ０５／０１８６３８、ＷＯ０５／０１９２０６、ＷＯ０５／０１９２０５、ＷＯ０５／０１８５４７、ＷＯ０５／０１７１９０、ＵＳ２００５／０１７６７７６に記載されている。一実施態様では、有糸分裂キネシンの阻害剤として、それだけには限らないが、ＫＳＰの阻害剤、ＭＫＬＰ１の阻害剤、ＣＥＮＰ−Ｅの阻害剤、ＭＣＡＫの阻害剤及びＲａｂ６−ＫＩＦＬの阻害剤が挙げられる。
【００５５】
「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」の例として、それだけには限らないが、ＳＡＨＡ、ＴＳＡ、オキサムフラチン、ＰＸＤ１０１、ＭＧ９８及びスクリプタイドが挙げられる。その他のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の更なる参照は、以下の原稿中に見い出すことができる；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｔ．Ａ．らジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４６（２４）：５０９７〜５１１６頁（２００３）。
【００５６】
「有糸分裂進行に関与しているキナーゼの阻害剤」として、それだけには限らないが、オーロラキナーゼの阻害剤、Ｐｏｌｏ様キナーゼの阻害剤（ＰＬＫ；特に、ＰＬＫ−１の阻害剤）、ｂｕｂ−１の阻害剤及びｂｕｂ−Ｒ１の阻害剤が挙げられる。「オーロラキナーゼ阻害剤」の例として、ＶＸ−６８０がある。
【００５７】
「抗増殖剤」としては、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１及びＩＮＸ３００１、並びに代謝拮抗剤、例えば、エノシタビン、カルモフール、テガフール、ペントスタチン、ドキシフルリジン、トリメトレキサート、フルダラビン、カペシタビン、ガロシタビン、シタラビンオクホスファート、フォステアビン（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ）ナトリウム水和物、ラルチトレキセド、パルチトレキシド（ｐａｌｔｉｔｒｅｘｉｄ）、エミテフール、チアゾフリン、デシタビン、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ネルザラビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］アデニン、アプリジン、エクテイナシジン（ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）、トロキサシタビン、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン、ロメトレキソール、デクスラゾキサン、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン及びトラスツズマブが挙げられる。
【００５８】
モノクローナル抗体標的化治療薬の例として、がん細胞特異的又は標的細胞特異的モノクローナル抗体と結合している、細胞傷害剤又は放射性同位元素を有する治療薬が挙げられる。例として、ベキサールが挙げられる。
【００５９】
「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤」とは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの阻害剤を指す。使用できるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、ロバスタチン（メバコール（登録商標）；米国特許第４，２３１，９３８号、同４，２９４，９２６号及び同４，３１９，０３９号参照のこと）、シンバスタチン（ゾコール（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号、同４，８２０，８５０号及び同４，９１６，２３９号参照のこと）、プラバスタチン（プラバコール（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号、同４，５３７，８５９号、同４，４１０，６２９号、同５，０３０，４４７号及び同５，１８０，５８９号参照のこと）、フルバスタチン（レスコール（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号、同４，９１１，１６５号、同４，９２９，４３７号、同５，１８９，１６４号、同５，１１８，８５３号、同５，２９０，９４６号及び同５，３５６，８９６号参照のこと）、アトルバスタチン（リピトール（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号、同４，６８１，８９３号、同５，４８９，６９１号及び同５，３４２，９５２号参照のこと）及びセリバスタチン（リバスタチン及びバイコール（ＢＡＹＣＨＯＬ）（登録商標）としても知られている；米国特許第５，１７７，０８０号参照のこと）。本方法において使用できるこれらの及び更なるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の構造式は、Ｍ．ヤルパニ（Ｙａｌｐａｎｉ）、「コレステロール・ロワーリング・ドラッグス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ）」、ケミストリー・アンド・インダストリー（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）、８５〜８９頁（１９９６年２月５日）の８７頁及び米国特許第４，７８２，０８４号及び同４，８８５，３１４号に記載されている。本明細書において、用語ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、医薬上許容され得るラクトン及びオープンアシッド形（すなわち、ラクトン環が開環されて遊離酸を形成している）並びにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害活性を有する化合物の塩及びエステルの形のすべてを含み、したがって、このような塩、エステル、オープンアシッド及びラクトンの形の使用は本発明の範囲内に含まれる。
【００６０】
「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤」とは、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素のうち任意の１種又は任意の組合せを阻害する化合物、例えば、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴアーゼ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩ型（ＧＧＰＴアーゼ−Ｉ）及びゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩＩ型（ＧＧＰＴアーゼ−ＩＩ、Ｒａｂ ＧＧＰＴアーゼとも呼ばれる）を指す。
【００６１】
プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の例は、以下の刊行物及び特許に見ることができる：ＷＯ９６／３０３４３、ＷＯ９７／１８８１３、ＷＯ９７／２１７０１、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／３８６６５、ＷＯ９８／２８９８０、ＷＯ９８／２９１１９、ＷＯ９５／３２９８７、米国特許第５，４２０，２４５号、同５，５２３，４３０号、同５，５３２，３５９号、同５，５１０，５１０号、同５，５８９，４８５号、同５，６０２，０９８号、欧州特許公報０６１８２２１号、同０６７５１１２号、同０６０４１８１号、同０６９６５９３号、ＷＯ９４／１９３５７、ＷＯ９５／０８５４２、ＷＯ９５／１１９１７、ＷＯ９５／１２６１２、ＷＯ９５／１２５７２、ＷＯ９５／１０５１４、米国特許第５，６６１，１５２号、ＷＯ９５／１０５１５、ＷＯ９５／１０５１６、ＷＯ９５／２４６１２、ＷＯ９５／３４５３５、ＷＯ９５／２５０８６、ＷＯ９６／０５５２９、ＷＯ９６／０６１３８、ＷＯ９６／０６１９３、ＷＯ９６／１６４４３、ＷＯ９６／２１７０１、ＷＯ９６／２１４５６、ＷＯ９６／２２２７８、ＷＯ９６／２４６１１、ＷＯ９６／２４６１２、ＷＯ９６／０５１６８、ＷＯ９６／０５１６９、ＷＯ９６／００７３６、米国特許第５，５７１，７９２号、ＷＯ９６／１７８６１、ＷＯ９６／３３１５９、ＷＯ９６／３４８５０、ＷＯ９６／３４８５１、ＷＯ９６／３００１７、ＷＯ９６／３００１８、ＷＯ９６／３０３６２、ＷＯ９６／３０３６３、ＷＯ９６／３１１１１、ＷＯ９６／３１４７７、ＷＯ９６／３１４７８、ＷＯ９６／３１５０１、ＷＯ９７／００２５２、ＷＯ９７／０３０４７、ＷＯ９７／０３０５０、ＷＯ９７／０４７８５、ＷＯ９７／０２９２０、ＷＯ９７／１７０７０、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／２６２４６、ＷＯ９７／３００５３、ＷＯ９７／４４３５０、ＷＯ９８／０２４３６及び米国特許第５，５３２，３５９号。血管新生に対するプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の役割の一例については、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）第３５巻、第９号、１３９４〜１４０１頁（１９９９）参照のこと。
【００６２】
「血管新生抑制剤」とは、機序にかかわらず、新しい血管の形成を阻害する化合物を指す。血管新生抑制剤の例としては、それだけには限らないが、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害剤、上皮由来、繊維芽細胞由来又は血小板由来増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）様アスピリン及びイブプロフェン並びに選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤様セレコキシブ及びロフェコキシブ（ＰＮＡＳ、第８９巻、７３８４頁（１９９２）；ＪＮＣＩ、第６９巻、４７５頁（１９８２）；アーカイブ・オブ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）第１０８巻、５７３頁（１９９０）；アナトミカル・レコード（Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ）、第２３８巻、６８頁（１９９４）；ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３７２巻、８３頁（１９９５）；クリニカル・オルソパイディクス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ）第３１３巻、７６頁（１９９５）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、第１６巻、１０７頁（１９９６）；ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ファルマコロジー（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第７５巻、１０５頁（１９９７）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５７巻、１６２５頁（１９９７）；セル（Ｃｅｌｌ）、第９３巻、７０５頁（１９９８）；インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第２巻、７１５頁（１９９８）；ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７４巻、９１１６頁（１９９９））、ステロイド性抗炎症薬（例えば、副腎皮質ステロイド、ミネラルコルチコイド、デキサミタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレド、ベタメタゾン）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト（フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ら、ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１０５：１４１〜１４５頁（１９８５）参照のこと）及びＶＥＧＦに対する抗体（ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１７巻、９６３〜９６８頁（１９９９年１０月）；キム（Ｋｉｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３６２、８４１〜８４４頁（１９９３）；ＷＯ００／４４７７７及びＷＯ００／６１１８６参照のこと）が挙げられる。
【００６３】
血管新生を調節又は阻害し、また、本発明の化合物と併用できるその他の治療薬として、血液凝固及び繊維素溶解システムを調節又は阻害する薬剤が挙げられる（クリニカル・ケミストリー・アンド・ラボラトリー・メディシン（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３８：６７９〜６９２頁（２０００）における総説を参照のこと）。血液凝固及び繊維素溶解経路を調節又は阻害するような薬剤の例として、それだけには限らないが、ヘパリン（スロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）８０：１０〜２３頁（１９９８）参照）、低分子量ヘパリン及びカルボキシペプチダーゼＵ阻害剤（活性トロンビン活性化可能繊維素溶解阻害剤［ＴＡＦＩａ］の阻害剤としても知られる）（スロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１０１：３２９〜３５４頁（２００１）参照のこと）が挙げられる。ＴＡＦＩａ阻害剤は、米国特許出願番号６０／３１０，９２７号（２００１年８月８日に出願された）及び同６０／３４９，９２５号（２００２年１月１８日に出願された）に記載されている。
【００６４】
「細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤」とは、細胞周期チェックポイントシグナルを伝達するプロテインキナーゼを阻害し、それによってがん細胞をＤＮＡ損傷剤に対して増感させる化合物を指す。このような薬剤として、ＡＴＲ、ＡＴＭ及びＣＨＫ１１及びＣＨＫ１２キナーゼの阻害剤並びにｃｄｋ及びｃｄｃキナーゼ阻害剤が挙げられ、７−ヒドロキシスタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）及びＢＭＳ−３８７０３２によって具体的に示される。
【００６５】
「受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤」とは、ＲＴＫ、ひいては、発がん及び腫瘍進行に関与している機序を阻害する化合物を指す。このような薬剤として、ｃ−Ｋｉｔ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ３及びｃ−Ｍｅｔの阻害剤が挙げられる。更なる薬剤として、ブメ−ジェンセン（Ｂｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ）及びハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４１１：３５５〜３６５頁、２００１によって記載されるＲＴＫの阻害剤が挙げられる。
【００６６】
「細胞増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害剤」とは、細胞表面受容体のシグナル変換カスケード下流を阻害する医薬品を指す。このような薬剤として、セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、それだけには限らないが、例えば、ＷＯ０２／０８３０６４、ＷＯ０２／０８３１３９、ＷＯ０２／０８３１４０、ＵＳ２００４−０１１６４３２、ＷＯ０２／０８３１３８、ＵＳ２００４−０１０２３６０、ＷＯ０３／０８６４０４、ＷＯ０３／０８６２７９、ＷＯ０３／０８６３９４、ＷＯ０３／０８４４７３、ＷＯ０３／０８６４０３、ＷＯ２００４／０４１１６２、ＷＯ２００４／０９６１３１、ＷＯ２００４／０９６１２９、ＷＯ２００４／０９６１３５、ＷＯ２００４／０９６１３０、ＷＯ２００５／１００３５６、ＷＯ２００５／１００３４４、ＵＳ２００５／０２９９４１、ＵＳ２００５／４４２９４、ＵＳ２００５／４３３６１、６０／７３４１８８、６０／６５２７３７、６０／６７０４６９に記載されるようなＡｋｔの阻害剤）、Ｒａｆキナーゼの阻害剤（例えば、ＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害剤（例えば、ＣＩ−１０４０及びＰＤ−０９８０５９）及びｍＴＯＲの阻害剤（例えば、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）ＣＣＩ−７７９）及びＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）が挙げられる。
【００６７】
上記のように、ＮＳＡＩＤとの組合せは、強力なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤの使用を対象とする。本明細書では、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２の阻害について、細胞又はミクロソームアッセイによって測定される１μＭ以下のＩＣ５０を有する場合、有効である。
【００６８】
本発明はまた、選択的ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤとの組合せを包含する。本明細書では、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤であるＮＳＡＩＤは、細胞又はミクロソームアッセイによって評価される、ＣＯＸ−１のＩＣ５０を上回るＣＯＸ−２のＩＣ５０の比によって測定される、少なくとも１００倍の、ＣＯＸ−１を上回るＣＯＸ−２の阻害に対する特異性を有するものとして定義される。このような化合物として、それだけには限らないが、すべて参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７４，９９５号、同５，８６１，４１９号、同６，００１，８４３号、同６，０２０，３４３号、同５，４０９，９４４号、同５，４３６，２６５号、同５，５３６，７５２号、同５，５５０，１４２号、同５，６０４，２６０号、同５，６９８，５８４号、同５，７１０，１４０号、ＷＯ９４／１５９３２、米国特許第５，３４４，９９１号、同５，１３４，１４２号、同５，３８０，７３８号、同５，３９３，７９０号、同５，４６６，８２３号、同５，６３３，２７２号及び同５，９３２，５９８号に開示されるものが挙げられる。
【００６９】
本治療方法において特に有用であるＣＯＸ−２の阻害剤として、３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン及び５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジン又はその医薬上許容され得る塩がある。
【００７０】
ＣＯＸ−２の特異的阻害剤として記載されており、ひいては、本発明において有用である化合物として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：パレコキシブ、ベクストラ（登録商標）及びセレブレックス（登録商標）又はその医薬上許容され得る塩。
【００７１】
血管新生抑制剤のその他の例として、それだけには限らないが、エンドスタチン、ウクライン、ランピルナーゼ、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクタ−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジナナリン、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミン、コンブレタスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタオースホスフェート、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホネート）及び３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）が挙げられる。
【００７２】
上記で用いた「インテグリン遮断薬」とは、生理学的リガンドの、αｖβ３インテグリンとの結合を選択的にアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物、生理学的リガンドの、αｖβ５インテグリンとの結合を選択的にアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物、生理学的リガンドの、αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンの両方との結合をアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物及び毛細血管内皮細胞上に発現される特定のインテグリン（類）の活性をアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物を指す。この用語はまた、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンのアンタゴニストも指す。この用語はまた、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンの任意の組合せのアンタゴニストも指す。
【００７３】
チロシンキナーゼ阻害剤のいくつかの具体的な例として、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、ＳＴＩ５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホネート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミン及びＥＭＤ１２１９７４が挙げられる。
【００７４】
抗がん化合物以外の化合物との組合せも、本方法に包含される。例えば、この特許請求される化合物の、ＰＰＡＲ−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−ガンマ）アゴニスト及びＰＰＡＲ−δ（すなわち、ＰＰＡＲ−デルタ）アゴニストとの組合せは、特定の悪性腫瘍の治療において有用である。ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δとは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ及びδである。内皮細胞上でのＰＰＡＲ−γの発現及び血管新生におけるその関与は、文献に報告されている（ジャーナル・オブ・カルディオバスキュラー・ファルマコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）１９９８；３１：９０９〜９１３頁；ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９９９；２７４：９１１６〜９１２１頁；インベスティゲーション・オフタルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０００；４１：２３０９〜２３１７頁参照のこと）。より最近、ＰＰＡＲ−γアゴニストは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦに対する血管新生反応を阻害することがわかり、トログリタゾン及びマレイン酸ロシグリタゾンは両方とも、マウスにおいて網膜の新血管新生の発生を阻害する（アーカイブ・オブ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）２００１；１１９：７０９〜７１７頁）。ＰＰＡＲ−γアゴニスト及びＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例として、それだけには限らないが、チアゾリジンジオン（例えば、ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾン）、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ０９／７８２，８５６に開示される）及び２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（ＵＳＳＮ６０／２３５，７０８及び６０／２４４，６９７に開示される）が挙げられる。
【００７５】
本発明のもう１つの実施態様は、ここで開示される化合物の、がんの治療のための遺伝子療法との併用である。がんを治療するための遺伝子戦略の概観については、ホール（Ｈａｌｌ）ら（アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）６１：７８５〜７８９頁、１９９７）及びクフェ（Ｋｕｆｅ）ら（キャンサー・メディシン（Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５版、８７６〜８８９頁、ＢＣデッカー（Ｄｅｃｋｅｒ）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）２０００）参照のこと。遺伝子療法は、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達するために使用できる。このような遺伝子の例として、それだけには限らないが、組換えウイルス媒介性遺伝子導入によって送達され得るｐ５３（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号参照のこと）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニスト（ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９８年８月；５（８）：１１０５〜１３頁中、「アデノウイルス・メディエイテッド・デリバリー・オブ・ア・ユーピーエー／ユーピーエーピー・アンタゴニスト・サプレセズ・アンギオジェネシス−ディペンデント・チューモア・グロース・アンド・ディセミネーション・イン・マウス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｕＰＡ／ｕＰＡＲ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ）」、及びインターフェロンγ（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２０００；１６４：２１７〜２２２頁）が挙げられる。
【００７６】
本発明の化合物はまた、生来多剤耐性（ＭＤＲ）、特に、輸送体タンパク質の高レベルの発現と関連しているＭＤＲの阻害剤と併用投与してもよい。このようなＭＤＲ阻害剤として、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害剤、例えば、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３及びＰＳＣ８３３（ｖａｌｓｐｏｄａｒ）が挙げられる。
【００７７】
本発明の化合物は、本発明の化合物の、単独又は放射線療法を伴う使用に起因し得る、悪心又は嘔吐、例えば、急性、遅発性、晩期及び先行嘔吐を治療するための制吐剤と併用してもよい。嘔吐の予防又は治療には、本発明の化合物をその他の制吐剤、特に、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト、例えば、オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン及びザチセトロン（ｚａｔｉｓｅｔｒｏｎ）、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト、例えば、バクロフェン、コルチコステロイド、例えば、デカドロン（デキサメタゾン）、ケナログ、アリストコート、ナサリド（Ｎａｓａｌｉｄｅ）、プレフェリド（Ｐｒｅｆｅｒｉｄ）、ベネコルテン（Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎ）又は米国特許第２，７８９，１１８号、同２，９９０，４０１号、同３，０４８，５８１号、同３，１２６，３７５号、同３，９２９，７６８号、同３，９９６，３５９号、同３，９２８，３２６号及び同３，７４９，７１２号に開示されるものなどのその他のもの；抗ドーパミン、例えば、フェノチアジン（例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジン及びメソリダジン）、メトクロプラミド又はドロナビノールと併用してもよい。別の実施態様では、本化合物の投与に起因し得る嘔吐の治療又は予防のための、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト及びコルチコステロイドから選択される制吐剤を用いる併用療法が開示されている。
【００７８】
本発明の化合物と組合せたニューロキニン−１受容体アンタゴニストの使用は、例えば、米国特許第５，１６２，３３９号、同５，２３２，９２９号、同５，２４２，９３０号、同５，３７３，００３号、同５，３８７，５９５号、同５，４５９，２７０号、同５，４９４，９２６号、同５，４９６，８３３号、同５，６３７，６９９号、同５，７１９，１４７号；欧州特許公報ＥＰ０３６０３９０、同０３９４９８９、同０４２８４３４、同０４２９３６６、同０４３０７７１、同０４３６３３４、同０４４３１３２、同０４８２５３９、同０４９８０６９、同０４９９３１３、同０５１２９０１、同０５１２９０２、同０５１４２７３、同０５１４２７４、同０５１４２７５、同０５１４２７６、同０５１５６８１、同０５１７５８９、同０５２０５５５、同０５２２８０８、同０５２８４９５、同０５３２４５６、同０５３３２８０、同０５３６８１７、同０５４５４７８、同０５５８１５６、同０５７７３９４、同０５８５９１３、同０５９０１５２、同０５９９５３８、同０６１０７９３、同０６３４４０２、同０６８６６２９、同０６９３４８９、同０６９４５３５、同０６９９６５５、同０６９９６７４、同０７０７００６、同０７０８１０１、同０７０９３７５、同０７０９３７６、同０７１４８９１、同０７２３９５９、同０７３３６３２及び同０７７６８９３；ＰＣＴ国際特許公報ＷＯ９０／０５５２５、同９０／０５７２９、同９１／０９８４４、同９１／１８８９９、同９２／０１６８８、同９２／０６０７９、同９２／１２１５１、同９２／１５５８５、同９２／１７４４９、同９２／２０６６１、同９２／２０６７６、同９２／２１６７７、同９２／２２５６９、同９３／００３３０、同９３／００３３１、同９３／０１１５９、同９３／０１１６５、同９３／０１１６９、同９３／０１１７０、同９３／０６０９９、同９３／０９１１６、同９３／１００７３、同９３／１４０８４、同９３／１４１１３、同９３／１８０２３、同９３／１９０６４、同９３／２１１５５、同９３／２１１８１、同９３／２３３８０、同９３／２４４６５、同９４／００４４０、同９４／０１４０２、同９４／０２４６１、同９４／０２５９５、同９４／０３４２９、同９４／０３４４５、同９４／０４４９４、同９４／０４４９６、同９４／０５６２５、同９４／０７８４３、同９４／０８９９７、同９４／１０１６５、同９４／１０１６７、同９４／１０１６８、同９４／１０１７０、同９４／１１３６８、同９４／１３６３９、同９４／１３６６３、同９４／１４７６７、同９４／１５９０３、同９４／１９３２０、同９４／１９３２３、同９４／２０５００、同９４／２６７３５、同９４／２６７４０、同９４／２９３０９、同９５／０２５９５、同９５／０４０４０、同９５／０４０４２、同９５／０６６４５、同９５／０７８８６、同９５／０７９０８、同９５／０８５４９、同９５／１１８８０、同９５／１４０１７、同９５／１５３１１、同９５／１６６７９、同９５／１７３８２、同９５／１８１２４、同９５／１８１２９、同９５／１９３４４、同９５／２０５７５、同９５／２１８１９、同９５／２２５２５、同９５／２３７９８、同９５／２６３３８、同９５／２８４１８、同９５／３０６７４、同９５／３０６８７、同９５／３３７４４、同９６／０５１８１、同９６／０５１９３、同９６／０５２０３、同９６／０６０９４、同９６／０７６４９、同９６／１０５６２、同９６／１６９３９、同９６／１８６４３、同９６／２０１９７、同９６／２１６６１、同９６／２９３０４、同９６／２９３１７、同９６／２９３２６、同９６／２９３２８、同９６／３１２１４、同９６／３２３８５、同９６／３７４８９、同９７／０１５５３、同９７／０１５５４、同９７／０３０６６、同９７／０８１４４、同９７／１４６７１、同９７／１７３６２、同９７／１８２０６、同９７／１９０８４、同９７／１９９４２及び同９７／２１７０２；及び英国特許公報第２２６６５２９号、同２２６８９３１号、同２２６９１７０号、同２２６９５９０号、同２２７１７７４号、同２２９２１４４号、同２２９３１６８号、同２２９３１６９号及び同２３０２６８９号に十分に記載されている。このような化合物の調製は、参照により本明細書に組み込まれる前記の特許及び刊行物に十分に記載されている。
【００７９】
一実施態様では、本発明の化合物と併用するためのニューロキニン−１受容体アンタゴニストは、米国特許第５，７１９，１４７に記載される、２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリン又はその医薬上許容され得る塩から選択される。
【００８０】
本発明の化合物はまた、貧血の治療において有用な薬剤とともに投与してもよい。このような貧血治療薬として、例えば、持続性の（ｅｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）受容体アクチベーター（例えば、エポエチンアルファ）がある。
【００８１】
本発明の化合物はまた、好中球減少症の治療において有用である薬剤とともに投与してもよい。このような好中球減少症治療薬として、例えば、好中球の産生及び機能を調節する造血増殖因子、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、（Ｇ−ＣＳＦ）がある。Ｇ−ＣＳＦの例として、フィルグラスチムが挙げられる。
【００８２】
本発明の化合物はまた、免疫増強薬、例えば、レバミソール、イソプリノシン及びザダキシンとともに投与してもよい。
【００８３】
本発明の化合物はまた、ビスホスホネート（ビスホスホネート、ジホスホネート、ビスホスホン酸及びジホスホン酸を含むと理解される）と組合せて、がん、例えば、骨がんを治療又は予防するのに有用であり得る。ビスホスホネートの例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：エチドロネート（ダイドロネル）、パミドロネート（アレディア）、アレンドロネート（フォサマックス）、リセドロネート（アクトネル）、ゾレドロネート（ゾメタ）、イバンドロネート（ボニバ）、インカドロネート又はシマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、ミノドロネート、ネリドロネート、ピリドロネート及びチルドロネート並びにありとあらゆるその医薬上許容され得る塩、誘導体、水和物及び混合物。
【００８４】
本発明の化合物はまた、アロマターゼ阻害剤と組合せて、乳がんを治療又は予防するのに有用であり得る。アロマターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、アナストロゾール、レトロゾール及びエキセメスタンが挙げられる。
【００８５】
本発明の化合物はまた、ｓｉＲＮＡ治療薬と組合せて、がんを治療又は予防するのに有用であり得る。
【００８６】
本発明の化合物はまた、γ−セクレターゼ阻害剤及び／又はＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤と組合せて投与してもよい。このような阻害剤として、ＷＯ０１／９００８４、ＷＯ０２／３０９１２、ＷＯ０１／７０６７７、ＷＯ０３／０１３５０６、ＷＯ０２／３６５５５、ＷＯ０３／０９３２５２、ＷＯ０３／０９３２６４、ＷＯ０３／０９３２５１、ＷＯ０３／０９３２５３、ＷＯ２００４／０３９８００、ＷＯ２００４／０３９３７０、ＷＯ２００５／０３０７３１、ＷＯ２００５／０１４５５３、ＵＳＳＮ１０／９５７，２５１、ＷＯ２００４／０８９９１１、ＷＯ０２／０８１４３５、ＷＯ０２／０８１４３３、ＷＯ０３／０１８５４３、ＷＯ２００４／０３１１３７、ＷＯ２００４／０３１１３９、ＷＯ２００４／０３１１３８、ＷＯ２００４／１０１５３８、ＷＯ２００４／１０１５３９及びＷＯ０２／４７６７１に記載される化合物（例えば、ＬＹ−４５０１３９）が挙げられる。
【００８７】
本発明の化合物はまた、ＰＡＲＰ阻害剤と組合せて、がんを治療又は予防するのに有用であり得る。
【００８８】
本発明の化合物はまた、以下の治療薬と組合せて、がんを治療するのに有用であり得る：アバレリックス（プレナキシス・デポー（Ｐｌｅｎａｘｉｓ ｄｅｐｏｔ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロキン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標））；アレムツヅマブ（カンパス（登録商標））；アリトレチノイン（パンレチン（登録商標））；アロプリノール（ジロプリム（Ｚｙｌｏｐｒｉｍ）（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサレン（登録商標））；アミホスチン（エチオール（Ｅｔｈｙｏｌ）（登録商標））；アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））；三酸化ヒ素（トリセノックス（登録商標））；アスパラギナーゼ（エルスパール（Ｅｌｓｐａｒ）（登録商標））；アザシチジン（ビダザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標））；ベバクジマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（アバスチン（登録商標））；ベキサロテンカプセル（タルグレチン（登録商標））；ベキサロテンゲル（タルグレチン（登録商標））；ブレオマイシン（ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）（登録商標））；ボルテゾミブ（ベルケード（登録商標））；ブスルファン静脈内（ブスルフェクス（登録商標））；ブスルファン経口（ミレラン（登録商標））；カルステロン（メトサルブ（Ｍｅｔｈｏｓａｒｂ）（登録商標））；カペシタビン（ゼローダ（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；カルムスチン（ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；カルムスチン（グリアデル（登録商標））；ポリフェプロサン（Ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）２０インプラントを伴うカルムスチン（グリアデル ウエハー（登録商標））；セレコキシブ（セレブレックス（登録商標））；セツキシマブ（アービタックス（登録商標））；クロラムブシル（ロイケラン（登録商標））；シスプラチン（プラチノール（登録商標））；クラドリビン（ロイスタチン（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；クロファラビン（クロラー（Ｃｌｏｌａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン注射（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン錠剤（登録商標））；シタラビン（シトサール（Ｃｙｔｏｓａｒ）−Ｕ（登録商標））；シタラビンリポソーム（デポシト（ＤｅｐｏＣｙｔ）（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ−ドム（Ｄｏｍｅ）（登録商標））；ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（コスメゲン（登録商標））；ダルベポエチンアルファ（アラネスプ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダムオキソーム（ＤａｎｕｏＸｏｍｅ）（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（ダウノルビシン（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（セルビジン（登録商標））；デニロイキンジフチトクス（オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標））；デクスラゾキサン（ジネカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（登録商標））；ドセタキセル（タキソテール（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（Ｒｕｂｅｘ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ注射（登録商標））；ドキソルビシンリポソーム（ドキシル（Ｄｏｘｉｌ）（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（ドロモスタノロン（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（マステロン注射（登録商標））；エリオットＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（エリオットＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（登録商標））；エピルビシン（エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（登録商標））；エポエチンアルファ（エポゲン（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；エストラムスチン（エムシト（Ｅｍｃｙｔ）（登録商標））；リン酸エトポシド（エトポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）（登録商標））；エトポシド、ＶＰ−１６（ベプシド（登録商標））；エキセメスタン（アロマシン（登録商標））；フィルグラスチム（ニューポジェン（登録商標））；フロクスウリジン（動脈内）（ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（フルダラ（登録商標））；フルオロウラシル、５−ＦＵ（アドルシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）（登録商標））；フルベストラント（ファスロデックス（登録商標））；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））；ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標））；酢酸ゴセレリン（ゾラデックスインプラント（登録商標））；酢酸ゴセレリン（ゾラデックス（登録商標））；酢酸ヒストレリン（ヒストレリンインプラント（登録商標））；ヒドロキシ尿素（ハイドレア（登録商標））；イブリツモマブ・ティウキセタン（ゼバリン（登録商標））；イダルビシン（イダマイシン（登録商標））；イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；メシル酸イマチニブ（グリーベック（登録商標））；インターフェロンアルファ２ａ（ロフェロンＡ（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ（登録商標））；イリノテカン（カンプトサール（登録商標））；レナリドマイド（レブリミド（登録商標））；レトロゾール（フェマーラ（登録商標））；ロイコボリン（ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（登録商標）、ロイコボリン（登録商標））；酢酸ロイプロリド（エリガード（登録商標））；レバミソール（エルガミソル（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）（登録商標））；ロムスチン、ＣＣＮＵ（ＣｅｅＢＵ（登録商標））；メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード（マスタージェン（登録商標））；酢酸メゲストロール（メゲース（登録商標））；メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ（アルケラン（登録商標））；メルカプトプリン、６−ＭＰ（プリネトール（登録商標））；メスナ（メスネックス（登録商標））；メスナ（メスネックスタブ（登録商標））；メトトレキサート（メトトレキサート（登録商標））；メトキサレン（ウバデックス（Ｕｖａｄｅｘ）（登録商標））；マイトマイシンＣ（ムタマイシン（登録商標））；ミトタン（リソドレン（登録商標））；ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン（デュラボリン−５０（登録商標））；ネララビン（アラノン（Ａｒｒａｎｏｎ）（登録商標））；ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）（ベルルマ（Ｖｅｒｌｕｍａ）（登録商標））；オプレルベキン（ニューメガ（Ｎｅｕｍｅｇａ）（登録商標））；オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標））；パクリタキセル（パキセン（Ｐａｘｅｎｅ）（登録商標））；パクリタキセル（タキソール（登録商標））；パクリタキセルタンパク質結合粒子（アブラキサン（登録商標））；パリフェルミン（ケピバンス（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ）（登録商標））；パミドロネート（アレディア（登録商標））；ペガデマーゼ（アダジェン（ペガデマーゼウシ）（登録商標））；ペガスパルガーゼ（オンカスパール（Ｏｎｃａｓｐａｒ）（登録商標））；ベグフィルグラスチム（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ニューラスタ（登録商標））；ペメトレキセド二ナトリウム（アリムタ（登録商標））；ペントスタチン（ニペント（Ｎｉｐｅｎｔ）（登録商標））；ピポブロマン（ベルサイト（Ｖｅｒｃｙｔｅ）（登録商標））；プリカマイシン、ミトラマイシン（ミトラシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）（登録商標））；ポルフィマーナトリウム（フォトフリン（登録商標））；プロカルバジン（マツラン（登録商標））；キナクリン（アタブリン（登録商標））；ラスブリカーゼ（エリテック（Ｅｌｉｔｅｋ）（登録商標））；リツキシマブ（リツキサン（登録商標））；サルグラモスチム（ロイキン（登録商標））；サルグラモスチム（プロキン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））；ストレプトゾシン（ザノサール（登録商標））；マレイン酸スニチニブ（ステント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））；タルク（スクレロソール（登録商標））；タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（登録商標））；テニポシド、ＶＭ−２６（ブモン（Ｖｕｍｏｎ）（登録商標））；テストラクトン（テスラック（Ｔｅｓｌａｃ）（登録商標））；チオグアニン、６−ＴＧ（チオグアニン（登録商標））；チオテパ（チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）（登録商標））；トポテカン（ハイカムチン（登録商標））；トレミフェン（フェアストン（登録商標））；トシツモマブ（ベキサール（登録商標））；トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（ベキサール（登録商標））；トラスツズマブ（ヘルセプチン（登録商標））；トレチノイン、ＡＴＲＡ（ベサノイド（登録商標））；ウラシルマスタード（ウラシルマスタードカプセル（登録商標））；バルルビシン（バルスター（Ｖａｌｓｔａｒ）（登録商標））；ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））；ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））；ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））及びゾレドロネート（ゾメタ（登録商標））。
【００８９】
したがって、本発明の範囲は、この特許請求される化合物の、エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、生来多剤耐性の阻害剤、制吐剤、貧血の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強薬、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤、細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤及び上記で列挙される治療薬のいずれかから選択される第２の化合物と組合せた使用を包含する。
【００９０】
本発明の化合物に関連して、用語「投与」及びその変形（例えば、化合物を「投与すること」）とは、化合物又は化合物のプロドラッグを、治療を必要とする動物の系に導入することを意味する。本発明の化合物又はそのプロドラッグが、１種以上のその他の活性物質（例えば、細胞傷害剤など）と組合せて提供される場合には、「投与」及びその変形は、本化合物又はそのプロドラッグとその他の物質の同時及び逐次導入を含むと各々理解される。
【００９１】
本明細書において、用語「組成物」とは、指定量の指定成分を含む生成物並びに指定量の指定成分の組合せに直接的又は間接的に起因する任意の生成物を包含するものとする。
【００９２】
本明細書において用語「治療上有効な量」とは、研究者、獣医、医師又はその他の臨床医によって求められている、組織、系、動物又はヒトにおける生物学的反応又は医学的反応を誘発する活性化合物又は医薬品の量を意味する。
【００９３】
用語「がんを治療すること」又は「がんの治療」とは、がん性状態に冒された哺乳動物への投与を指し、またがん性細胞を死滅させることによってがん性状態を軽減する効果だけでなく、がんの増殖及び／又は転移の阻害をもたらす効果も指す。
【００９４】
一実施態様では、第２の化合物として用いられる血管新生阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、上皮由来増殖因子の阻害剤、繊維芽細胞由来増殖因子の阻害剤、血小板由来増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１又はＶＥＧＦに対する抗体から選択される。一実施態様では、エストロゲン受容体モジュレーターは、タモキシフェン又はラロキシフェンである。
【００９５】
治療上有効な量の本発明の化合物を、放射線療法と組合せて、及び／又はエストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、生来多剤耐性の阻害剤、制吐剤、貧血の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強薬、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤、細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤及び上記で列挙される治療薬のいずれかから選択される第２の化合物と組合せて投与することを含むがんを治療する方法も、特許請求の範囲に含まれる。
【００９６】
本発明の更にもう１つの実施態様は、治療上有効な量の本発明の化合物を、パクリタキセル又はトラスツズマブと組合せて投与することを含む、がんを治療する方法である。
【００９７】
本発明は、治療上有効な量の本発明の化合物を、ＣＯＸ−２阻害剤と組合せて投与することを含む、がんを治療又は予防する方法を更に包含する。
【００９８】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の化合物と、エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤、細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤及び上記で列挙される治療薬のいずれかから選択される第２の化合物とを含む、がんを治療又は予防するのに有用な医薬組成物を含む。
【００９９】
特定される、すべての特許、刊行物及び係属特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
化学の説明において、及び以下の実施例において用いられる略語は以下の通りである：ＡＥＢＳＦ（ｐ−アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド）；Ｂｏｃ２Ｏ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＢｕＬｉ（ｎ−ブチルリチウム）；ＣＤＣｌ３（クロロホルム−ｄ）；ＣｕＩ（ヨウ化銅）；ＣｕＳＯ４（硫酸銅）；ＤＣＥ（ジクロロエタン）；ＤＣＭ（ジクロロメタン）；ＤＥＡＤ（ジエチルアゾジカルボキシレート）；ＤＭＡＰ（４−アミノピリジン）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＤＴＴ（ジチオトレイトール）；ＥＤＴＡ（エチレン−ジアミン四酢酸）；ＥＧＴＡ（エチレン−グリコール四酢酸）；ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＨＯＡｃ（酢酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＨＲＭＳ（高分解能質量スペクトル）；ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ−質量分析計）；ＬＨＭＤＳ（リチウムビス（トリメチルシリル）アミド）；ＬＲＭＳ（低分解能質量スペクトル）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ＭＰ−Ｂ（ＣＮ）Ｈ３（マクロ多孔性シアノボロヒドリド）；ＮａＨＣＯ３（炭酸水素ナトリウム）；Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）；Ｎａ（ＯＡｃ）３ＢＨ（ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド）；ＮＨ４ＯＡｃ（酢酸アンモニウム）；ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンアミド）；ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロリジノン）；ＮＭＲ（核磁気共鳴）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；Ｐｄ（ｄｐｐｆ）（［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム）；Ｐｄ（Ｐｈ３）４（パラジウム（０）テトラキス−トリフェニルホスフィン）；ＰＯＣｌ３（オキシ塩化リン）；ＰＳ−ＤＩＥＡ（ポリスチレンジイソプロピルエチルアミン）；ＰＳ−ＰＰｈ３（ポリスチレン−トリフェニルホスフィン）；ＰＴＳＡ（パラ−トルエンスルホン酸）；ＲａＮｉ（ラネー−ニッケル）；Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボレート）；ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；及びＴＭＳＣＨ２Ｎ２（トリメチルシリルジアゾメタン）。
【０１０１】
本発明の化合物は、以下の反応スキームに示される反応、更に、文献において公知であるか、又は実験手順に示されるその他の標準的な操作を用いることによって調製できる。したがって、以下の例示的反応スキームは、列挙される化合物に、又は例示目的のために用いられた任意の特定の置換基に限定されない。反応スキームにおいて示される置換基番号付けは、特許請求の範囲において用いられるものと必ずしも関連しておらず、本明細書において上記の式Ａの定義下で複数の置換基が場合により認められる場合には、わかりやすくするために、しばしば化合物と結合される単一の置換基が示される。
【０１０２】
本発明の化合物を製造するために用いられる反応は、反応スキームＩに示される反応を用いることによって調製される。
【０１０３】
反応スキームの概要
反応スキームＩに示されるように、アミノ安息香酸を、エチルクロロアセテートを用いて環化し、ベンゾオキサジノン（Ａ−１）を提供できる。この潜在性求電子物質を、アセト酢酸メチルのナトリウム陰イオンと反応させ、アクリレートＡ−２を提供できる。Ａ−２は、ナトリウムメトキシドの処理の際、内部環化し、カルボキシル基が除去され、４−ヒドロキシキノリノンＡ−３を提供できる。マイクロ波加熱下で、ピラゾロキノリノン（Ａ−４）が、ヒドラジン及び酸触媒から形成され得る。選択的ベンジル保護は、ピラゾール窒素で起こり、Ｎ−ベンジル化ピラゾロキノリノン（Ａ−５）が得られ、これを炭酸セシウムの存在下、種々のブロミドによってアルキル化させて、Ｎ−アルキル化化合物（Ａ−６）を得ることができる。次いで、炭素上パラジウムを用いる水素化によってベンジル基を除去し、Ａ−７を提供できる。ＨＣｌでのアルキルアミンのＢＯＣ基脱保護によって、十分に合成されたピラゾロキノリノン（Ａ−８）が得られる。
【０１０４】
【化２】
【０１０５】
実施例
提供される実施例は、本発明の更なる理解に役立つよう意図される。用いられる個々の物質、種及び条件は、本発明の更なる例示であり、その合理的範囲を制限するものではないものとする。表された化合物の合成において利用される試薬は、市販されているか、当業者によって容易に調製される。
【０１０６】
【化３】
【０１０７】
３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）
９０℃の、１：１イソプロパノール：水（４００ｍＬ）中、活性化ラネーニッケル（アルミニウム上の水中５０％スラリー、２００ｇ；７００ｍｍｏｌ、１３当量）及び３−アミノ−２−ナフトエ酸（１−１）（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ、１当量）の混合物に、１％ＮａＯＨ水溶液（２００ｍＬ）を１時間かけて加えた。反応混合物を９０℃で１６時間撹拌し、更にラネーニッケル（５０ｇ、１８０ｍｍｏｌ、３．４当量）を加え、得られた混合物を９０℃で２４時間加熱した。この混合物を濾過し、濾液を２００ｍＬの水に濃縮し、１Ｎの塩酸水溶液の添加でｐＨ＝３にし、生成物を沈殿させた。灰白色の沈殿を濾過し、逆相液体クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配ｗ／０．１％ＴＦＡ存在）によって精製すると、３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）が白色固体として得られた。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１９２．２，要求値１９２．１。
【０１０８】
２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）
窒素下、−１０℃のピリジン（５０ｍＬ）中、３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）（５．０ｇ、２６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、クロロギ酸エチル（１０ｍＬ、１１ｇ、１００ｍｍｏｌ、４．０当量）を１時間かけて滴下した。得られた溶液を、２０時間かけて−１０℃〜２３℃で撹拌した。この溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残渣を１時間撹拌しながら、水（１００ｍＬ）に懸濁した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させると、２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）が黄色の固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２４６．４，要求値２４６．１。
【０１０９】
メチル （２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロパ−２−エノエート（１−４）
窒素下、無水ベンゼン（１００ｍＬ）中、水素化ナトリウム（９５％）（０．８０ｇ、３３ｍｍｏｌ、２．１当量）の分散物に、アセト酢酸メチル（５．０ｍＬ、５．４ｇ、４６ｍｍｏｌ、２．９当量）を滴下し、得られた混合物を、２３℃で１時間撹拌した。２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）（３．８ｇ、１６ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を２０時間撹拌した。水を用いて過剰の水素化ナトリウムをクエンチし、有機層を分離し、水で３回抽出し、濃塩酸溶液を用いて合わせた水層を酸性にした。得られた沈殿を濾過し、乾燥させると、メチル （２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロパ−２−エノエート（１−４）が黄色のオイルとして得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３６２．５，要求値３６２．２。
【０１１０】
３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）
窒素下、２３℃のベンゼン（１００ｍＬ）中、水素化ナトリウム（９５％）（０．７０ｇ、２９ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物に、メタノール（２．５ｍＬ、２．０ｇ、６２ｍｍｏｌ、５．４当量）を１０分間かけて滴下した。更に５分間撹拌した後、メチル （２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロパ−２−エノエート（１−４）（４．１ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を加え、得られた混合物を７２℃で２０時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残渣を、撹拌しながら、水（５０ｍＬ）に３０分間、続いて１Ｎの塩酸水溶液（１００ｍＬ）に更に３０分間懸濁させた。固体を濾過し、水（１００ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させると、３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）が灰白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２５８．４，要求値２５８．１。
【０１１１】
３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）
ＤＭＡ（３０ｍＬ）中、３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）（２．０ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１当量）、ヒドラジン（０．４０ｍＬ、０．４１ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．６当量）及び触媒濃塩酸溶液（２滴）の混合物を、窒素下、１４０℃で１６時間加熱した。この溶液を冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿を濾過し、ヘキサン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させると、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）が灰白色固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．５１（ｓ，１Ｈ），１０．９９（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ）７．０４（ｓ，１Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｍ，４Ｈ）．ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２５４．４，要求値２５４．１。
【０１１２】
２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−７）
窒素下、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）（１０．２ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸カリウム（３０．０ｇ、２１７ｍｍｏｌ、５．３８当量）の混合物に、臭化ベンジル（３５．０ｇ、２０５ｍｍｏｌ、５．０９当量）を加え、得られた混合物を２３℃で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾過された固体をエーテル（３×２００ｍＬ）、続いて、水（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させると、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−７）が、白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３４４．２，要求値３４４．２。
【０１１３】
ｔｅｒｔ−ブチル ３−ブロモ−２−フルオロプロピルカルバメート（１−９）
ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中のＮＢＳ（２０ｇ、１１０ｍｍｏｌ、３．０当量）の懸濁液に、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（２８ｇ、１１０ｍｍｏｌ、３．０当量）を滴下した。添加が完了した後、反応混合物を１０分間撹拌し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−ヒドロキシプロピルカルバメート（１−８）（７．０ｇ、３６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液、続いて、ピリジン（３．５ｇ、４４ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。得られた混合物を、窒素下、２３℃で１６時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（１時間かけて１００％ヘキサンから１００％酢酸エチル、ニンヒドリン染色による分析）によって精製すると、ｔｅｒｔ−ブチル ３−ブロモ−２−フルオロプロピルカルバメート（１−９）が、透明なオイルとして得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８９−４．６８（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．４０（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０１１４】
ｔｅｒｔ−ブチル ３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−フルオロプロピルカルバメート（１−１０）
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−７）（８．０ｇ、２３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸セシウム（３７ｇ、１１０ｍｍｏｌ、４．９当量）の混合物に、ｔｅｒｔ−ブチル ３−ブロモ−２−フルオロプロピルカルバメート（１−９）（７．１ｇ、２７．７ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、得られた混合物を４０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（１時間かけて１００％ヘキサンから１００％酢酸エチル）によって精製すると、ｔｅｒｔ−ブチル ３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−フルオロプロピルカルバメート（１−１０）が白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５１９．２，要求値５１９．３。
【０１１５】
ｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバメート（１−１１）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）及びメタノール（１０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル ３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−フルオロプロピルカルバメート（１−１０）（０．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１当量）及び１０％炭素上パラジウム（３００ｍｇ）の混合物を、水素バルーン下、２３℃で７２時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液を濃縮すると、ｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバメート（１−１１）が得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４２９．２，要求値４２９．２。
【０１１６】
ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバメート（１−１１）（０．０８３ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１当量）及びＢｏｃ２Ｏ（０．０５ｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ＤＭＡＰ（０．００５ｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．２当量）を加え、得られた溶液を２３℃で３時間撹拌した。溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１時間かけて１００％ヘキサンから１００％酢酸エチル）によって精製すると、ｔｅｒｔ−ブチル５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２）が白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５２９．３，要求値５２９．３。
【０１１７】
メタノール（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２、１３０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）のラセミ混合物の溶液に、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ溶液（１０ｍＬ）を加え、得られた溶液を２３℃で１６時間撹拌した。透明なゲル沈殿物を濾過し、濾過された固体を酢酸エチルで洗浄し、水に溶解し、濃縮すると、５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オンのラセミ混合物の塩酸塩が、白色固体として得られた（１−１２ａ）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｍ，１Ｈ），４．６６（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２９．２，要求値３２９．２。
【０１１８】
ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｒ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１３）及び（２−Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｓ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１４）
ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２）のラセミ混合物を、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ（５ｃｍ×５０ｃｍ、２０μ）プレップカラムを用い、９０ｍＬ／分で８０％ヘキサン／２０％イソプロパノール勾配を用いてその成分エナンチオマーに分割すると、ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｒ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１３）及び（２−Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｓ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１４）が、白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５２９．３，要求値５２９．３。
【０１１９】
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）及び５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）
分離した、メタノール（２０ｍＬ）中、５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１３）（０．６０ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）及び５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１４）（０．７０ｇ、１．３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ溶液（３０ｍＬ）を加え、得られた溶液を４０℃で１６時間撹拌した。透明なゲル沈殿物を濾過し、濾過された固体を酢酸エチルで洗浄し、水に溶解し、濃縮すると、５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）及び５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）の塩酸塩が、白色固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｍ，１Ｈ），４．６６（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２９．２，要求値３２９．２。
【０１２０】
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１７）は、３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２，２−ジフルオロプロピル・トリフルオロメタンスルホネートをアルキル化剤として用い、上記の方法によって調製した。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
実施例１〜９
本発明の種々の特徴及び利点を更に説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を示す。これらの実施例は特許請求される発明を制限するものではない。
実施例１：リアルタイムＰＣＲを用いるＣＨＫ１ｓｖ１の同定
化合物の阻害特性の測定を容易にするには、ＣＨＫ１をコードするエキソン領域の「正常な」スプライシングの変異体を同定することが望ましい。特に、ＣＨＫ１のＣ末端調節ドメインの喪失をもたらす天然に存在するスプライシング変異が求められた。Ｃ末端の欠失は、ＣＨＫ１に対しより大きなキナーゼ活性を付与する（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２０００、セル（Ｃｅｌｌ）１００：６８１〜６９２頁；カツラギ（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ）及びサガタ（Ｓａｇａｔａ）、２００４、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）１５：１６８０〜１６８９頁）。エキソン２〜８は、触媒キナーゼドメインをコードし、エキソン９はリンカー領域をコードしている。ＳＱ及びＣ末端調節ドメインは、エキソン１０〜１３内に位置している（サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、１９９７、２７７：１４９７〜１５０１頁；カツラギ（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ）及びサガタ（Ｓａｇａｔａ）、２００４、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）１５：１６８０〜１６８９頁）。リアルタイムＰＣＲ実験及びＲＴ−ＰＣＲを用いて、ヒトＣＨＫ１ ｍＲＮＡの新規スプライス変異体の存在を同定し、確認した。ＣＨＫ１阻害ドメインのＣ末端切断をコードする天然に存在するスプライス変異体を、化合物の阻害特性を調べるために有用なＣＨＫ１キナーゼアッセイにおける使用のために、同定し、クローニングし、発現させ、精製した。
【０１２３】
ＲＴ−ＰＣＲ
エキソン８〜１１に相当する領域中のＣＨＫ１ ｍＲＮＡの構造を、ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを用いて、ヒト精巣から抽出したＲＮＡについて調べた。ヒト精巣から単離した全ＲＮＡはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手した。ＣＨＫ１中の参照エキソンコード配列（ＮＭ＿００１２７４）のエキソン８及びエキソン１１中の配列に対して相補的であるＲＴ−ＰＣＲプライマーを選択した。ＣＨＫ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、ＣＨＫ１エキソン８及びエキソン１１プライマーセット（本明細書において以下、ＣＨＫ１８−１１プライマーセット）は、「参照」ＣＨＫ１ ｍＲＮＡ領域に相当する４７８塩基対アンプリコンを増幅すると予想された。ＣＨＫ１８−１１プライマーセットは、エキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングを有する転写物中の３００塩基対アンプリコンを増幅すると予想された。ＣＨＫ１エキソン８フォワードプライマーは以下の配列を有する：
５’ＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＣ３’（配列番号１）；またＣＨＫ１エキソン１１リバースプライマーは以下の配列を有する：
５’ＣＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＣ３’（配列番号２）。
【０１２４】
ヒト精巣由来の全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用い、以下のサイクリング条件を用いて一段階逆転写−ＰＣＲ増幅プロトコールに付した：
１）５０℃で３０分間、
２）９５℃で１５分間、
３）９４℃で３０秒間、
６３．５℃で４０秒間、
７２℃で５０秒間、次いで、
７２℃で１０分間の３５サイクル。
【０１２５】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）は、２％アガロースゲルでサイズ分画した。２５０〜３５０塩基対アンプリコンに相当する選択した断片を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。精製したアンプリコン断片を、ＣＨＫ１８−１１プライマーセットを用いて再増幅し、これらのアンプリコンをアガロースゲルでサイズ分画した。２５０〜３５０塩基対アンプリコンに相当する断片を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。精製したアンプリコン断片を、ＣＨＫ１８−１１プライマーセットを用いてもう一度再増幅した。アガロースゲルでサイズ分画した後、２５０〜３５０塩基対アンプリコンを手作業で抽出し、精製したアンプリコン断片（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を、ＴＯＰＯ ＴＡ クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに提供される試薬及び使用説明書を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。次いで、クローンを、全部で６６００個のクローンについて、プレートあたり４４０コロニーのプールで、１５枚のプレートにプレーティングした。各プレートから、プールした４４０個のコロニーからＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲの鋳型として用いた。
【０１２６】
リアルタイムＰＣＲ／ＴＡＱｍａｎ
ＣＨＫ１参照タンパク質（ＮＰ＿００１２６５）の選択的スプライシングアイソフォームの存在を調べるために、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いた。
【０１２７】
ＣＨＫ１ｓｖ１アイソフォームを検出するために用いたＴＡＱｍａｎプライマー及びプローブは、プレセット混合物として設計し、合成されていた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。ＣＨＫ１参照型（配列番号３、４及び５）及びＣＨＫ１ｓｖ１アイソフォーム（配列番号６、７及び８）を検出するために用いたＴＡＱｍａｎプライマー及びプローブの配列を、表１に示す。スプライスジャンクション特異的プローブは、５’末端で６−ＦＡＭフルオロフォアを用いて（ＦＡＭ）、また３’末端で非蛍光クエンチャーを用いて（ＮＦＱ）標識した。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてヒト精巣ｃＤＮＡで実施した。ＴＡＱｍａｎ反応は以下を含んでいた：
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
ＴＡＱｍａｎ反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実施した。サーモサイクリング条件は５０℃で２分間、９５℃で１０分間及び９５℃を１５秒間と６０℃を１分間の４０サイクルとした。蛍光発光のデータ解析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって実施した。
【０１３０】
ＴＡＱｍａｎアッセイの結果は、１５プレートのうち１３プレートに由来するプールされたＤＮＡは、選択的エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションに相当するクローンを有すると思われるということを示した。４４０コロニーに相当する、これらの陽性プールのうちの１つに由来するＤＮＡを用いて細菌宿主細胞を形質転換した。クローンを、プレートあたり５５コロニーのプールで、全部で１２枚のプレートにプレーティングした。１２枚のプレート各々上のコロニーを再度プールし、ＴＡＱｍａｎアッセイに用いた。１２枚のプレートのうち１枚に由来するプールされたＤＮＡは、選択的エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションに相当するクローンを有すると思われた。この陽性プレート上の５５コロニーを、ＴＡＱｍａｎアッセイを用いて個々にスクリーニングし、１つのクローンを、選択的エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションを有すると同定した。次いで、この陽性クローンを、ＣＨＫ１エキソン８フォワードプライマー（配列番号１）及び配列５’ＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧ３’（配列番号９）を有する異なるエキソン１１リバースプライマーを用いて各末端から配列決定した。
【０１３１】
クローンの配列分析により、ＣＨＫ１へテロ核ＲＮＡのエキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングの予想配列とマッチするということ、すなわち、エキソン１０のコード配列が完全に存在しないということが示された。
【０１３２】
実施例２：ＣＨＫ１ｓｖ１のクローニング
リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定データは、精巣組織及びＭＯＬＴ−４及びダウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞株では、ＣＨＫ１タンパク質、ＮＰ＿００１２６５をコードする正常なＣＨＫ１参照ｍＲＮＡ配列、ＮＭ＿００１２７４の他に、ＣＨＫ１ ｍＲＮＡの新規のスプライス変異体型も存在するということを示す。
【０１３３】
実施例１において同定されたＣＨＫ１ｓｖ１スプライス変異体を含むヌクレオチド配列を有するクローンを、酵母において組換え媒介性プラスミド構築物を用いて単離した。２種のプライマー対のセットを用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１の全ｍＲＮＡコード配列を増幅し、クローニングした。ＣＨＫ１ｓｖ１の場合には、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析により、このスプライス変異体型の転写物は極めて低いレベルで存在するということが示された。ＣＨＫ１ｓｖ１をクローニングするために、参照ＣＨＫ１（ＮＭ＿００１２７４）のコード配列を含むクローンを、所望のエキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションを生じるよう設計された８０塩基対リンカーを用いて、酵母における更なる組換えステップによって変更した。
【０１３４】
ＣＨＫ１ｓｖ１に対応する全長クローンを単離するために、５’「フォワード」プライマー及び３’「リバース」プライマーを設計した。５’「フォワード」ＣＨＫ１ｓｖ１プライマーを、５’ＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴ３’（配列番号１０）というヌクレオチド配列を有するよう、またＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）のエキソン２と相補的である配列を有するよう設計した。３’「リバース」ＣＨＫ１ｓｖ１プライマーは、５’ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧ３’（配列番号１１）というヌクレオチド配列を有するよう、またＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）のエキソン１１と相補的である配列を有するよう設計した。イタリック体で示したプライマー配列の５’末端の４０ヌクレオチドは、ＰＣＲアンプリコンに組み込まれ、その後の酵母におけるプラスミド組換え事象を容易にする「テール」である。これらのＣＨＫ１ｓｖ１「フォワード」及び「リバース」プライマーは、参照ＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）のコード配列を増幅すると予測され、次いで、これをその後の組換えクローニングステップにおいて用い、ＣＨＫ１ｓｖ１特異的配列を作製した。
【０１３５】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＣＨＫ１ｓｖ１ ｃＤＮＡ配列を、逆転写（ＲＴ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の組合せを用いてクローニングした。より詳しくは、約２５ｎｇのＭＯＬＴ−４細胞株ｍＲＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、スーパースクリプトＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びオリゴｄ（Ｔ）プライマー（ＲＥＳＧＥＮ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を用い、スーパースクリプトＩＩ製造業者の使用説明書に従って逆転写した。ＰＣＲのために、４０μｌの水、５μｌの１０×バッファー、１μｌのｄＮＴＰ及び１μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキットから得た酵素に、１μｌの完了したＲＴ反応物を加えた。ＰＣＲは、ＣＨＫ１ｓｖ１のＣＨＫ１ｓｖ１「フォワード」及び「リバース」プライマー（配列番号１０、１１）を用いて、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実施した。最初の９４℃、１分間の変性の後、９４℃で３０秒間の変性と、それに続く、６３．５℃で４０秒間のアニーリング及び７２℃で５０秒間の合成を用いて、３５サイクルの増幅を実施した。３５サイクルのＰＣＲに、７２℃で１０分間の伸長を続けた。次いで、５０μｌの反応物を４℃に冷却した。得られた反応生成物の１０μｌを１％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕｌｔｒａ ｐｕｒｅ）ゲルに流し、０．３μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）で染色した。ゲル中の核酸バンドを可視化し、ＵＶ光ボックス上で撮影し、予想される大きさの生成物、ＣＨＫ１ ｍＲＮＡの場合には、約１２４３塩基対の生成物がＰＣＲによって生じたかどうかを調べた。ＭＯＬＴ−４細胞由来の５０μｌのＰＣＲ反応物の残部を、ＱＩＡｑｕｉｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、キットとともに提供されるＱＩＡｑｕｉｋ ＰＣＲ精製プロトコールに従って精製した。精製プロトコールから得られた約５０μｌの生成物を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ４００（同様にＳａｖａｎｔ製）に取り付けたＳｐｅｅｄ Ｖａｃ Ｐｌｕｓ（ＳＣ１１０Ａ、Ｓａｖａｎｔ、Ｈｏｌｂｒｏｏｋ、ＮＹ製）中で、中程度に加熱し、約３０分間乾燥することによって約６μｌに濃縮した。
【０１３６】
ＣＨＫ１ｓｖ１全長クローンのクローニング及び組み立て並びに酵母形質転換
酵母における相同組換えクローニングによる全長ＣＨＫ１ｓｖ１クローンの組み立てを、レイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）ら（２００２、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２：１９０〜１９７頁）によって先に記載されたものと類似のシクロヘキシミドベースの対抗選択スキームを用いて実施した。
【０１３７】
上記に記載されるＣＨＫ１ｓｖ１フォワード及びリバース「テイルド」プライマーを用いて製造した、１２４３塩基対のＣＨＫ１アンプリコンと、発現ベクターの間の相同組換えによる、全長ＣＨＫ１ｓｖ１全長クローンの組み立てを、これらの部分の酵母細胞への同時形質転換によって実施した。８０塩基対オリゴヌクレオチドリンカーを用いるその後の組換えステップによって、ＣＨＫ１ｓｖ１エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションを作製した。以下の段落において記載されるすべての酵母形質転換ステップは、エレクトロポレーションによって実施した（レイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）ら、２００２年ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２：１９０〜１９７頁）。
【０１３８】
１μｇの１２４３塩基対のＣＨＫ１精製アンプリコンを、１００μｌの酵母株ＣＭＹ１−５（Ｍａｔα、ＵＲＡ３Δ、ＣＹＨ２Ｒ）の同時形質転換によって、１００ｎｇのＳｒｆＩ消化したｐＣＭＲ１１に直接クローニングした。１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＵｒａ欠乏培地プレートで、Ｕｒａ＋、シクロヘキシミド耐性コロニーを選択した。標準酵母培地を用いた（Ｓｈｅｒｍａｎ、１９９１、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１９４：３〜２１頁）。ＣＨＫ１クローンを含む酵母細胞培養物から得た全ＤＮＡを用いて、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）及びウィンストン（Ｗｉｎｓｔｏｎ）（１９８７年ジーン（Ｇｅｎｅ）５７：２６７〜７２頁）に記載の通り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）耐性に形質転換し、大量の組換えプラスミドを調製した。プレートからコロニーを選び取って、２ｍｌの２×ＬＢ培地に入れた。これらの液体培養物を、３７℃で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）Ｑｉａｑｕｉｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
ＣＨＫ１ｓｖ１クローンを構築するために、１μｇの、エキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングの領域にまたがる表３に示される８０塩基対リンカー（配列番号１２、１３）と、１００ｎｇのＢａｍＨＩ消化したＣＨＫ１／ｐＣＭＲ１１クローンを用いて、１００μｌのシクロヘキシミド感受性酵母株を同時形質転換した。リンカーとＣＨＫ１／ｐＣＭＲ１１クローン間で重複するＤＮＡのために、ほとんどの酵母形質転換体が正しく組み立てられた構築物を有することとなる。その後の調製及び大腸菌の形質転換のために、Ｕｒａ＋、シクロヘキシミド耐性コロニーを選択した。大腸菌から抽出したプラスミドＤＮＡを、制限消化によって分析し、ＣＨＫ１ｓｖ１クローンにおいてエキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングの存在を確認した。８個のＣＨＫ１ｓｖ１クローンを配列決定して、同一性を確認し、適当な配列を有するクローンを、複数の系におけるタンパク質発現に用いた。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
ＣＨＫ１ｓｖ１ポリヌクレオチドの概要
ＣＨＫ１ｓｖ１ ｍＲＮＡのポリヌクレオチドコード配列（配列番号１４）は、参照ＣＨＫ１タンパク質（ＮＰ＿００１２６５）と類似するが、参照ＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）の全長コード配列のエキソン１０に相当する１７８塩基対領域によってコードされるアミノ酸を欠く、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質（配列番号１５）をコードするオープンリーディングフレームを含む。１７８塩基対領域の欠失は、参照ＣＨＫ１タンパク質リーディングフレームと比較して、タンパク質翻訳リーディングフレームのシフトをもたらし、ＣＨＫ１ｓｖ１に特有のカルボキシ末端ペプチド領域が生じる（配列番号１５中、イタリック体で示される）。また、フレームシフトによって、エキソン９／エキソン１１スプライスジャンクションの２９ヌクレオチド下流に未熟な終結コドンも生じる。したがって、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質は、参照ＣＨＫ１（ＮＰ＿００１２６５）と比較して、エキソン１０によってコードされるアミノ酸領域に相当する内部の５９アミノ酸領域を失っており、また、未熟な停止コドンの下流のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸も欠いている。エキソン１０は、ＣＨＫ１のＳＱ／ＴＱドメインをコードしており、エキソン１１〜１３は自己抑制的領域をコードしている（サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、１９９７、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７７：１４９７〜１５０１頁；カツラギ（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ）及びサガタ（Ｓａｇａｔａ）、２００４年、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）１５：１６８０〜１６８９頁）。自己抑制的領域の欠失は、ＣＨＫ１キナーゼドメインに構成的な活性を付与するが、ＳＱ／ＴＱドメインも除去される場合には、ＣＨＫ１酵素活性は低下する（ング（Ｎｇ）ら、２００４、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２７９：８８０８〜８８１９頁）。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
実施例３：ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質の発現
バキュロウイルス遺伝子発現ベクター系では、安価であり、維持するのが容易である、タンパク質発現昆虫細胞を使用できる。産生されるタンパク質は、哺乳類細胞におけるものと類似の質のものである（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８８、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１０：４５７〜４６５頁；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８９、バイオエッセイズ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ）１１：９１〜９５頁）。昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現ベクターを用いるタンパク質法発現は、当該技術分野で公知であり、オーライリ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｉｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年及びバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター・システム・インストラクション・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｉｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）、第６版、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９に論じられている。
【０１４５】
昆虫細胞発現のためのＣＨＫ１ｓｖ１のクローニング
ＣＨＫ１ｓｖ１／バキュロウイルストランスファーベクター構築物を作製するために、ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＣＭＲ１１クローン（実施例２参照のこと）をＰＣＲの鋳型として用い、表５に列挙されるプライマー（配列番号１６、１７）を用いてＣＨＫ１ｓｖ１のコード配列（配列番号１４）を増幅した。配列番号１６によって表されるプライマーは、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に最適翻訳開始配列と、アンプリコンに組み込まれるようになる上流ＥｃｏＲＩ制限部位とを含む。配列番号１７によって表されるプライマーは、ＣＨＫ１ｓｖ１コード配列のＣ末端に６個のヒスチジン残基をコードする配列並びにＣＨＫ１ｓｖ１アンプリコンに組み込まれるようになるＥａｇＩ制限部位とを含む。ＣＨＫ１ｓｖ１アンプリコンを、１％アガロースゲルに流した。予想した大きさの選択したアンプリコン断片、ＣＨＫ１ｓｖ１の場合には、約９９４塩基対の産物を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。精製したアンプリコン断片をＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで消化した。ＥｃｏＲＩ／ＥａｇＩ消化したアンプリコンを、ＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化しておいたバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にライゲーションした。次いで、ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＶＬ１３９３構築物を、大腸菌株ＤＨ５αに形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから抽出し、選択したプラスミドＤＮＡを配列決定して同一性を確認し、適当な配列を有するクローンを、昆虫細胞におけるタンパク質発現に用いた。
【０１４６】
【表６】
【０１４７】
ＣＨＫ１ｓｖ１の昆虫細胞発現
ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＶＬ１３９３構築物を、直線化されたＡｃＮＰＶ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに、ＳＦ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に同時トランスフェクトした。個々の組換えウイルスをエンドポイント希釈によって選択した。ウイルスクローンを増幅し、高力価原液を得た。これらのウイルス保存液を、小規模ＳＦ９培養におけるタンパク質発現試験に用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１組換えタンパク質の産生を確認した。トランスフェクトされたＳＦ９細胞溶解物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質発現について分析した。ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質を、クマシー染色によってか、抗ＣＨＫ１抗体（Ｇ４抗体；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ）を用いるウエスタンブロッティングによって可視化した。発現に基づいて、個々のウイルスを、大規模ＣＨＫ１ｓｖ１発現のために選択した。リットル規模での組換えタンパク質発現には、ＳＦ９懸濁培養物を、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０１血清不含培地（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）において２７℃で増殖させ、組換えウイルス保存液を用い、０．３ウイルス／細胞という多重感染度を用いて感染させた。ウイルストランスフェクションの７２時間後、感染したＳＦ９培養物を回収し、遠心分離によってペレットにした。ペレットは−７０℃で保存した。
【０１４８】
ＣＨＫ１ｓｖ１組換えタンパク質の精製
昆虫細胞ペレットを、１μＭのミクロシスチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０μＭのシペルメトリン（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１個の錠剤／５０ｍｌの溶解バッファー）を含有するＢ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて溶解した。タンパク質精製の際のすべての操作は、４℃で実施した。細胞は溶解バッファーに再懸濁し、４５分間撹拌した。次いで、ＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を、２００Ｕ／ｍｌという最終濃度に加え、細胞懸濁液を更に３０分間撹拌した。溶解した細胞懸濁液を、３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。溶解上清をデカントし、３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。清澄化された上清各１０ｍｌにつき、１ｍｌの総容積のＴａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を加え、細胞懸濁液を４５分間撹拌した。親和性樹脂／溶解物懸濁液を、５０００ｇで３分間遠心分離し、次いで、上清を廃棄した。親和性樹脂を、５×容積の樹脂を用いて、４×バッファーＡ（５０μＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；２５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。洗浄した樹脂を、バッファーＡ中に２×スラリーとして再懸濁し、クロマトグラフィーカラムに充填した。樹脂を充填したカラムを、６×総容積のバッファーＡで洗浄した。ＣＨＫ１ｓｖ１−Ｈｉｓタグを付けたタンパク質を、バッファーＡ中イミダゾールの段階的な勾配を用いてカラムから溶出する。２×総容積画分中のイミダゾール濃度は、５、１０、２０、３０、４０、５０及び６０ｍＭとした。溶出画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ、３０，０００ Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて濃縮した。濃縮した酵素画分を、グリセロールで５０％希釈し、−２０℃で保存した。画分を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに続くクマシー染色及び抗ＣＨＫ１抗体（Ｇ４抗体； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ）を用いるウエスタンブロッティングを用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１−Ｈｉｓ−タグを付けたタンパク質の存在について分析した。カラム画分のＣＨＫ１ｓｖ１キナーゼ活性は、以下の項に記載されるキナーゼアッセイを用いて調べた。
【０１４９】
実施例４：ＣＨＫ１ｓｖ１キナーゼアッセイ
ＣＨＫ１ｓｖ１活性を、合成ペプチド基質を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした。ホスホペプチド産物を、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ系を用いて定量した（Ｐａｒｋら、１９９９年、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６９：９４〜１０４頁）。反応混合物は、４０μｌという最終容量中、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；２ｍＭ ジチオトレイトール；０．１％ ＢＳＡ；０．１ｍＭ ＡＴＰ；０．５μＭ ペプチド基質及び０．１ｎＭ ＣＨＫ１ｓｖ１酵素を含んでいた。ペプチド基質はアミノ酸配列アミノ末端−ＧＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧ−カルボキシ末端（ＳｙｎＰｅｐ、Ｄｕｂｌｉｎ ＣＡ）（配列番号１８）を有し、Ｎ末端でビオチン化されている。キナーゼ反応物を、２２℃で３０分間インキュベートし、次いで、６０μｌの停止／検出バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１．２５％ ＢＳＡ；２５０ｎＭ ＰｈｙｃｏＬｉｎｋストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）及び０．７５ｎＭの、ユウロピウム−キレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で標識したＧＳＫ３α抗ホスホセリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；カタログ番号９３３８））を用いて終結させた。反応物を２２℃で２時間平衡にさせ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で相対蛍光単位を読み取った。上記の反応物において阻害化合物をアッセイし、化合物ＩＣ５０を調べた。１μＬの、ＤＭＳＯに溶解した化合物を、各４０μＬの反応物に、１ｎＭ〜１００μＭの範囲に及ぶ１／２ｌｏｇ希釈系列で加えた。ＨＴＲＦ蛍光単位として読み取られる、相対リン酸基質（ｐｈｏｓｐｈｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）形成を、化合物濃度範囲にかけて測定し、４パラメータシグモイドフィットを用いて滴定曲線を作製した。
【０１５０】
本発明の特定の化合物を、上記のアッセイにおいて試験し、基質に対して≦５０μＭのＩＣ５０を有することがわかった。
【０１５１】
実施例５：細胞におけるＣＨＫ１自己リン酸化の阻害
阻害化合物を、そのＣＨＫ１を細胞において阻害する能力について、ＤＮＡ損傷に応じたＣＨＫ１自己リン酸化をモニターすることによってアッセイする。Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を培養培地：１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×非必須アミノ酸及びペニシリン−ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０で増殖させる。Ｔ−７５フラスコから得られた細胞をプールし、計数し、２ｍｌ培地中、２００，０００個／ウェルで６ウェルディッシュに播種し、インキュベートする。各ウェルにＤＭＳＯ中の化合物の段階希釈系列及びＤＭＳＯ対照を、ＤＭＳＯ中の１０００×作業ストックから加え、３７℃で２時間インキュベートする。２時間のインキュベート期間の後、１００ｎＭカンプトテシン（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＰＢＳ中の２００×作業ストックからすべての薬物処理細胞（高用量ウェルの１つを除く）及び１つのＤＭＳＯ対照ウェルに加える。カンプトテシンとともに４時間インキュベートした後、各ウェルを、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、各ウェルに３００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、０．５μＭ Ｎａ３ＶＯ４及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリート−ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を加えた。プレートを４℃で１０〜１５分間振盪し、次いで、溶解物を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、−８０℃で凍結する。溶解物を氷上で解凍し、１５，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化し、上清をきれいな管に移す。
【０１５２】
サンプル（２０μＬ）を、５μＬの５×サンプルローディングバッファーを加えることと、１００℃で５分間加熱変性させることとによってゲル電気泳動用に調製する。サンプルをＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）中で電気泳動し、タンパク質をＰＶＤＦ上にトランスファーする。次いで、ブロットを、ＴＢＳ中３％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、ホスホ−Ｓｅｒ−２９６ＣＨＫ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−カタログ番号２３４６）に対する抗体を用いて探索する。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ−カタログ番号１１１−０３５−０４６）を用いて結合している抗体を可視化し、化学発光を増強する（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．７、２％ＳＤＳ及び１００μＭの２−メルカプトエタノール中、５５℃で３０分間インキュベートすることによって一次抗体セットを取り除いた後、ブロットを、ＣＨＫ１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、カタログ番号ＳＣ−８４０８）を用いて全ＣＨＫ１について再探索する。ＣＨＫ１モノクローナルは、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合しているヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、カタログ番号ＮＡ９３１）を用いて検出し、化学発光を増強する（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ＥＣＬに曝されたフィルムをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて特定のバンドの強度を定量化する。滴定は、全ＣＨＫ１に対して標準化されたホスホ−ＣＨＫ１（Ｓｅｒ２９６）シグナルのレベルについて評価し、ＩＣ５０値を算出する。
【０１５３】
実施例６：チェックポイント回避アッセイにおける阻害剤の機能活性
ＤＮＡ損傷停止
細胞におけるＣＨＫ１阻害剤の機能活性を測定するために、化合物を、ＤＮＡ損傷誘導性細胞周期停止を抑止するその能力についてアッセイする。このアッセイでは、ＤＮＡ損傷剤カンプトテシンによって引き起こされた細胞周期停止後にＭ相に入っている細胞の量の指標として細胞ホスホ−ヌクレオリンレベルを調べる。
【０１５４】
Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）を、５０００個細胞／ウェルという密度で、１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ６４０培地に播種する。５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした後、カンプトテシンを２００ｎＭという最終濃度に加え、１６時間インキュベートする。等容積の、増殖培地及び２００ｎＭカンプトテシン及び３３２ｎＭノコドゾール（ｎｏｃｏｄｏｚｏｌｅ）（最終濃度：５０ｎｇ／ｍｌ）中の試験化合物段階希釈系列を加え、３７℃でのインキュベーションを８時間続ける。培地をウェルから除去し、５０μＬの溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、１×プロテナーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）、１μｌ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、３００μＭバナジン酸ナトリウム、１μＭミクロシスチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加える。溶解バッファーを含むプレートを４℃で３０分間振盪し、２０分間凍結する（−７０℃）。ＩＧＥＮ Ｏｒｉｇｅｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、細胞溶解物中のホスホヌクレオリンのレベルを測定する。
【０１５５】
細胞溶解物中のホスホヌクレオリンの検出
４Ｅ２抗ヌクレオリン抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）を、Ｏｒｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．）を用い、製造業者によって記載されたプロトコールを用いてビオチン化した。ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、ルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）キット（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．；カタログ番号１１００３４）を用い、製造業者によって記載されたプロトコールに従ってルテニウム化した（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）。９６ウェルプレートの各ウェルに、２５μＬの細胞溶解物（上記）とともに、２５μＬの、２μｇ／ｍｌのビオチン化４Ｅ２抗ヌクレオリン抗体及び０．４ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンコートした常磁性ダイナビーズ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．）を含有する抗体バッファー（リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２、１％ウシ血清アルブミン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を加える。抗体及び溶解物を、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。次いで、溶解物ミックスの各ウェルに、５０μＬという容積の抗体バッファー（上記）中の５０ｎｇの抗ホスホヌクレオリンＴＧ３抗体（Ａｐｐｌｉｅｄ ＮｅｕｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を加え、インキュベーションを室温で３０分間続ける。最後に、各ウェルに、２５μｌの、抗体バッファー中のルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）ヤギ抗マウス抗体の２４０ｎｇ／ｍｌ溶液を加え、インキュベーションを室温で３時間続ける。溶解物抗体混合物を、ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｍ−シリーズＭ８アナライザーで読み取り、ホスホル−ヌクレオリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）の増大に依存性の化合物のＥＣ５０を調べる。
【０１５６】
実施例７：その他の生物学的アッセイ
ＣＨＫ１発現及び精製：組換えヒトＣＨＫ１は、標準バキュロウイルスベクター及びＧＩＢＣＯ（商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入する（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標））昆虫細胞発現系を用いて、アミノ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＨＫ１）として発現させることができる。昆虫細胞において発現された組換えタンパク質は、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、製造業者によって記載された標準手順を用いて精製できる。
【０１５７】
ＣＨＫ１蛍光偏光アッセイ：ＣＨＫ１キナーゼ阻害剤は、キナーゼ活性をモニターするための蛍光偏光を用いて同定できる。このアッセイでは、１０ｎＭ ＧＳＴ−ＣＨＫ１を用い、５ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、１μＭ アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、２ｍＭ １，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール（ＤＴＴ）、１μＭペプチド基質（ビオチン−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号１９）、１０ｎＭペプチド基質トレーサー（蛍光−ＧＳＲＲＰ−ｐＳ−ＹＲＫＩ−遊離酸）（ｐＳ＝リン酸化−セリン）（配列番号２０）、６０ｎｇの、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した粗マウス腹水からプロテインＧセファロースで精製された抗ホスホＣＲＥＢ（Ｓ１３３）マウスモノクローナルＩｇＧ、４％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３０μＭ阻害化合物を含む。反応物を室温で１４０分間インキュベートし、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の添加によって終結させる。停止した反応物を室温で１２０分間インキュベートし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ／ＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を標準蛍光設定で用いて蛍光偏光値を調べる。
【０１５８】
ＣＨＫ１ ＳＰＡ濾過アッセイ：アッセイ（２５μ．）は、１０ｎＭ ＧＳＴ−ＣＨＫ１、１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、１μＭペプチド基質（ビオチン−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号１９）、１μＭ ＡＴＰ、０．１μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、ＮＥＮ）を含み、室温で９０分間反応させる。５５μｌの、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、６．９ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍｇシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水の添加によって反応を終結させる。ペプチド基質をビーズと室温で１０分間結合させ、続いて、Ｐａｃｋａｒｄ ＧＦ／Ｂ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート上で濾過し、リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄する。乾燥させたプレートを、Ｔｏｐｓｅａｌ（商標）（ＮＥＮ）で密閉し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）シンチレーションカウンターを用い、３３Ｐについての標準設定で、ペプチド基質に組み込まれた３３Ｐ。
【０１５９】
ＣＨＫ１ ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）キナーゼアッセイ：アッセイ（２５μｌ）は、８．７ＧＳＴ−ＣＨＫ１、１０ｍＭ ＭＥＳ、０．１ｍＭ エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、３μＭペプチド基質（ビオチン−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号１９）、１μＭ ＡＴＰ、０．４μＣｉ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ（ＮＥＮ）及び４％ＤＭＳＯを含む。反応物を室温で３０分間インキュベートし、５０μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて終結させる。９０μｌの反応物をストレプトアビジンコートされたＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ（登録商標）（ＮＥＮ）に移し、室温で１時間インキュベートする。プレートを０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。プレートを乾燥させ、Ｔｏｐｓｅａｌ（商標）（ＮＥＮ）で密閉し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）ＮＸＴ（商標）シンチレーションカウンターを用い、標準設定で、ペプチド基質中に組み込まれた３３Ｐの量を測定する。
【０１６０】
ＣＨＫ１ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）キナーゼアッセイ：アッセイ（２５μｌ）は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、２０％グリセロール、５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ（登録商標）２０、１μＭペプチド基質（ビオチン−ＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮ−アミド）（配列番号２１）、２ｍＭ ＤＴＴ、４％ＤＭＳＯ、１２．５μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する６．４ｍＭ ＧＳＴ−ＣＨＫ１を用い、室温で３０分間反応させる。１％ＢＳＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１００ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００μｌ停止バッファーを用いて反応を終結させる。停止された反応物（１００μｌ）を、９６ウェルニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に移し、３０分間の室温インキュベーションの間にビオチンペプチド基質を捕獲する。ウェルを洗浄し、２１．５ｎｇ／ｍｌの、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）製の抗ホスホ−Ｓｅｒ２１６−Ｃｄｃ２５ｃウサギポリクローナル抗体及び２９２ｎｇ／ｍｌのユウロピウム標識抗ウサギ−ＩｇＧを含有するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ａｓｓａｙバッファー１００μｌと室温で１時間反応させる。ウェルを洗浄し、ユウロピウムがＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液（１００μｌ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ）の添加によって結合している抗体から放出され、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（商標）を用い、標準の製造業者の設定を用いて検出する。
【０１６１】
本発明の化合物は、上記のＣＨＫ１ ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）キナーゼアッセイで試験できる。
【０１６２】
ＷＳＴアッセイ：ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６（５０００個細胞／ウェル）又はその他の細胞を、９６ウェル透明底プレートに直線的増殖曲線を提供する密度で７２時間かけて播種する。細胞を、適当な培地で滅菌条件下で培養するが、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６については、この培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するマッコイ５Ａである。細胞の最初の播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で１７〜２４時間インキュベートし、その時点で、適当なＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、５−フルオロウラシル及びエトポシド）を、４８時間以内に少なくとも８０％の細胞死を引き起こすことができる点まで漸増濃度で加える。すべてのＤＮＡ損傷剤及び化合物添加物の最終容積は、２５μｌとする。アッセイは、＜１％のＤＭＳＯ最終を含む。ＤＮＡ損傷剤の添加と同時に、ＣＨＫ１阻害化合物を、各ＤＮＡ損傷剤滴定に対して固定濃度で加え、細胞死の増強を観察する。上記の条件下での細胞生存力／細胞死を、ＤＮＡ損傷及びＣＨＫ１阻害化合物添加の４７時間後に、ＷＳＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ）の添加によって、製造業者に従って調べ、３７℃、５％ＣＯ２で３．５時間又は２．５時間インキュベーションした後にＯＤ４５０を測定する。
【０１６３】
本発明の化合物は、上記のアッセイで試験できる。
【０１６４】
実施例８：その他の生物学的アッセイ
本化合物の生物活性を調べるために利用できるその他のアッセイとして、以下の刊行物に見られるアッセイが挙げられる：ＷＯ０４／０８０９７３、ＷＯ０２／０７０４９４及びＷＯ０３／１０１４４４。
【０１６５】
実施例９：血圧アッセイ
このアッセイは、覚醒ラットにおける化合物のｉ．ｖ．注入の間の血圧（ＢＰ）及び心拍数（ＨＲ）の急性変化を評価するために設計されている。ビヒクルに続いて、３種の化合物濃度を、用量上昇プロトコールにおいて２５μｌ／分という速度で２０分間各々注入する。薬物レベル測定のために各注入（２０分間）の最後に血液サンプルを得、各注入の少なくとも３分の間（１７〜２０分間）ＢＰ及びＨＲを分析する。
【０１６６】
本発明の特定の化合物を上記のアッセイにおいて試験した。
【背景技術】
【０００１】
細胞周期チェックポイントは、細胞周期移行の順序及びタイミングを制御する調節経路である。それらにより、ＤＮＡ複製及び染色体分離などの重大な事象が高い忠実度で完了されることが確実となる。これらの細胞周期チェックポイントの調節は、腫瘍細胞が多数の化学療法及び放射線照射に応答する様式の重大な決定因子である。多数の効果的ながん療法は、ＤＮＡ損傷を引き起こすことによって働くが、これらの薬剤に対する耐性が、依然としてがんの治療における重大な制限となっている。薬剤耐性のいくつかの機序のうち１つの重要なものは、チェックポイント経路の重要な意味を持つ活性化を制御することによる細胞周期進行の阻止による。これによって、細胞周期を停止して修復のための時間を提供し、修復を促進する遺伝子の転写を誘導し、それによって、即時の細胞死を避ける。例えば、Ｇ２チェックポイントでのチェックポイント停止を無効にすることによって、ＤＮＡ損傷によって誘導される腫瘍細胞死を相乗的に増大させ、耐性を回避することが可能であり得る。
【０００２】
ヒトＣＨＫ１は、ホスファターゼｃｄｃ２５のセリン２１６でのリン酸化によって細胞周期停止の調節において役割を果たしており、これはｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化の防止及び有糸分裂の開始に関与している可能性がある。したがって、ＣＨＫ１の阻害は、ＤＮＡ修復が完了する前に有糸分裂を開始することによってＤＮＡ損傷剤を増強し、それによって腫瘍細胞死を引き起こすはずである。
【０００３】
ＣＨＫ１（Ｃｈｅｋ１とも呼ばれる）の阻害剤である新規化合物を提供することが本発明の目的である。
【０００４】
ＣＨＫ１の阻害剤である新規化合物を含む医薬組成物を提供することも本発明の目的である。
【０００５】
ＣＨＫ１活性の阻害剤などを投与することを含む、がんを治療する方法を提供することも本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、ＣＨＫ１活性を阻害する縮合ピラゾールを含む化合物を提供する。本発明はまた、このような阻害化合物を含む組成物及びがんの治療を必要とする患者に本化合物を投与することによってＣＨＫ１活性を阻害する方法を提供する。これらの縮合ピラゾールは、米国特許出願第６０／６９１，６９４号に報告されるその他の縮合ピラゾールと比較した場合に、改良された血行動態特性を有する。
【０００７】
発明の詳細な記載
本発明の化合物は、ＣＨＫ１の活性の阻害において有用である。本発明の一実施態様では、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ａ：
【０００８】
【化１】
【０００９】
［式中：
Ｒ１は独立してＨ及びＦから選択され、ここで、Ｒ１の少なくとも１個はＦである］
又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体によって示される。
【００１０】
本発明の具体的な化合物として以下がある：
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１２ａ）、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）、
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）及び
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１７）
又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体。
【００１１】
本発明のＨＣｌ塩として、以下がある：
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１２ａ）、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）及び
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）
又はその立体異性体。
【００１２】
本発明のＴＦＡ塩として以下がある：
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１７）
又はその立体異性体。
【００１３】
本発明の化合物は、不斉中心、キラル軸及びキラル面を有する可能性があり（Ｅ．Ｌ．エリール（Ｅｌｉｅｌ）及びＳ．Ｈ．ウィレン（Ｗｉｌｅｎ）、ステレオケミストリー・オブ・カーボン・コンパウンズ（Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、１１１９〜１１９０頁に記載のとおり）、ラセミ体、ラセミ混合物として、また個々のジアステレオマーとして生じる可能性があり、そのすべての可能性ある異性体及び混合物、例えば、光学異性体が本発明に含まれる。更に、本明細書に開示される化合物は、互変異性体として存在する可能性があり、一方の互変異性体構造しか表されていなくとも、両互変異性体の形が本発明の範囲に包含されるものとする。
【００１４】
当業者によって１個以上のシリコン（Ｓｉ）原子を、１個以上の炭素原子の代わりに本発明の化合物に組み込み、化学的に安定であり、かつ容易に入手可能な出発物質から当該技術分野における技術上既知の方法によって容易に合成できる化合物を提供することができるということは理解される。炭素及びシリコンは、類似のＣ成分及びＳｉ成分結合を比較すると、共有結合半径が異なり、これは結合距離及び立体配置の相違をもたらす。これらの相違は、炭素と比較した場合に、シリコン含有化合物の大きさ及び形にわずかな変化をもたらす。当業者ならば、大きさ及び形の相違は、効力、可溶性、標的外活性の欠如、パッケージング特性などにおいてわずかな又は劇的な変化をもたらし得るということは理解される（ディアス（Ｄｉａｓｓ），Ｊ．Ｏ．ら、オルガノメタリクス（Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ）（２００６）５、１１８８〜１１９８頁、ショーウェル（Ｓｈｏｗｅｌｌ），Ｇ．Ａ．らバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）（２００６）１６：２５５５〜２５５８頁）。
【００１５】
式Ａで示される化合物の遊離形、並びにその医薬的に許容され得る塩及び立体異性体も本発明に含まれる。本明細書に例示される単離された具体的な化合物の中には、アミン化合物のプロトン化塩がある。用語「遊離形」とは、非塩の形のアミン化合物を指す。包含される医薬的に許容され得る塩は、本明細書に記載される具体的な化合物の例示される単離された塩だけではなく、式Ａの化合物の遊離形のすべての通常の医薬的に許容され得る塩も含む。記載される具体的な塩化合物の遊離形は、当該技術分野における技術上既知の方法を用いて単離できる。例えば、遊離形は、塩を適した希塩基水溶液、例えば、希ＮａＯＨ、炭酸カリウム、アンモニア及び重炭酸ナトリウム水溶液で処理することによって再生してもよい。遊離形は、特定の物理的特性、例えば、極性溶媒における可溶性において、そのそれぞれの塩の形とはいくらか異なり得るが、酸性及び塩基性塩は、その他の点では、本発明の目的上、そのそれぞれの遊離形と医薬的に同等である。
【００１６】
本化合物の医薬上許容され得る塩は、慣用的な化学法によって塩基性又は酸性部分を含む本発明の化合物から合成できる。通常、塩基性化合物の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによってか、遊離塩基を、適した溶媒又は溶媒の種々の組合せ中で、化学量論量の、又は過剰の所望の塩を形成する無機又は有機酸と反応させることのいずれかによって調製する。同様に、酸性化合物の塩も、適当な無機又は有機塩基との反応によって形成される。
【００１７】
したがって、本発明の化合物の医薬上許容され得る塩として、塩基性の本化合物を無機又は有機酸と反応させることによって形成されるような、本発明の化合物の慣用的な非毒性塩が挙げられる。例えば、慣用的な非毒性塩として、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などから誘導されるもの並びに有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などから調製された塩が挙げられる。
【００１８】
本発明の化合物が酸性である場合、適した「医薬上許容され得る塩」とは、医薬上許容され得る非毒性塩基、例えば、無機塩基及び有機塩基から調製され得る塩を指す。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩が特に好ましい。医薬上許容され得る有機非毒性塩基から誘導される塩としては、第一、第二及び第三アミン、置換アミン、例えば、天然に存在する置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。
【００１９】
上記の医薬上許容され得る塩及びその他の通常の医薬上許容され得る塩の調製は、バーグ（Ｂｅｒｇ）ら、「ファーマシューティカル・サルツ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ）」ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンセズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１９７７：６６：１〜１９頁によって、より十分に記載されている。
【００２０】
生理学的条件下では、化合物中の脱プロトン化酸性部分、例えば、カルボキシル基が陰イオン性であり得、それによりこの電子電荷がプロトン化又はアルキル化された塩基性部分、例えば、第四窒素原子の陽イオン電荷に対して内部的にバランスが崩れている可能性があるので、本発明の化合物は、内部塩又は双性イオンの可能性があるということも留意される。
【００２１】
有用性
本明細書に提供される化合物、組成物及び方法は、がんの治療にとって有用であると特に考えられる。本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、それだけには限らないが以下が挙げられる：心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺：気管支原性肺癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮癌（細気管支癌）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、非小細胞肺；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）結腸、結腸直腸、直腸；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胎生期癌、奇形癌種、絨毛癌、肉腫、間質性細胞癌腫、線維腫、線維線腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管癌、胆芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣腫、肺細胞腫［松果体腫］、多形膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜−莢膜細胞腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫瘍、未分化肺細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）、胸部；血液学的：血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；及び副腎：神経芽腫。したがって、本明細書において提供される用語「がん性細胞」とは、上記で同定される状態のいずれか１種を起こしている細胞が挙げられる。
【００２２】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、それだけには限らないが以下が挙げられる：胸部、前立腺、結腸、結腸直腸、肺、非小細胞肺、脳、精巣、胃、膵臓、皮膚、小腸、大腸、咽頭、頭頸部、口腔、骨、肝臓、膀胱、腎臓、甲状腺及び血液。
【００２３】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、胸部、前立腺、結腸、卵巣、結腸直腸及び肺が挙げられる。
【００２４】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、胸部、結腸、（結腸直腸）及び肺が挙げられる。
【００２５】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療できるがんとして、リンパ腫及び白血病が挙げられる。
【００２６】
本発明の化合物はまた、がんを治療するのに有用である医薬を調製するのにも有用である。
【００２７】
本発明の化合物は、標準的な薬学のプラクティスに従い、哺乳動物、例えば、ヒトに、単独又は医薬組成物中で医薬的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤と組合せてのいずれかで投与してもよい。本化合物は、経口的に又は非経口的に投与でき、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸及び局所経路の投与ができる。
【００２８】
有効成分を含む医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性散剤若しくは顆粒剤、エマルジョン、ハード若しくはソフトカプセル剤又はシロップ剤又はエリキシル剤のような経口使用に適した形としてよい。経口使用向きの組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製でき、このような組成物は、医薬的に洗練された、味の良い製剤を提供するために、甘味剤、矯味剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される１種以上の薬剤を含み得る。錠剤は、錠剤の製造に適している、非毒性の医薬上許容され得る賦形剤との混合物中に有効成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；造粒剤及び崩壊剤、例えば、マイクロクリスタリンセルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン又はアラビアガム；及び滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよいし、薬物の嫌な味をマスクするため、若しくは消化管における崩壊及び吸収を遅延し、それによって長期間にわたる持続作用を提供するために既知技術によってコーティングされていてもよい。例えば、水溶性の味をマスクする物質、例えば、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロース又は時間遅延物質、例えば、エチルセルロース、酢酸ブチルセルロースを使用してもよい。
【００２９】
経口使用用製剤はまた、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合されているハードゼラチンカプセル剤として、又は有効成分が水溶性担体、例えば、ポリエチレングリコール若しくはオイル媒体、例えば、ピーナッツオイル、流動パラフィン若しくはオリーブオイルと混合されているソフトゼラチンカプセル剤として存在し得る。
【００３０】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。このような賦形剤として、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアガムがあり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、若しくはエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレン−オキシセタノール、若しくはエチレンオキシドの脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、若しくはエチレンオキシドの、脂肪酸及び無水ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液はまた、１種以上の保存料、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートと、１種以上の着色剤と、１種以上の矯味剤と、１種以上の甘味剤、例えば、スクロース、サッカリン若しくはアスパルテームとを含み得る。
【００３１】
油性懸濁液は、有効成分を植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツオイル、又は鉱油、例えば、流動パラフィンに懸濁することによって製剤してもよい。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、ハードパラフィン又はセチルアルコールを含み得る。味の良い経口製剤を提供するために、上記のものなどの甘味剤及び矯味剤を加えてもよい。これらの組成物は、抗酸化物質、例えば、ブチル化ヒドロキシアニソール又はα−トコフェロールの添加によって保存できる。
【００３２】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性散剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１種以上の保存料との混合物中の有効成分を提供する。適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は上記にすでに記載されているものによって示されている。更なる賦形剤として、例えば、甘味剤、矯味剤及び着色剤も存在し得る。これらの組成物は、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸の添加によって保存できる。
【００３３】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形であり得る。油相は、植物油、例えば、オリーブ油若しくはラッカセイ油、又は鉱油、例えば、流動パラフィン又はこれらの混合物であり得る。適した乳化剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、ダイズレシチン、並びに脂肪酸と無水ヘキシトールに由来するエステル若しくは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、並びに前記部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。エマルジョンはまた、甘味料、矯味剤、保存料及び抗酸化物質も含み得る。
【００３４】
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースを用いて製剤してよい。このような製剤はまた、鎮痛薬、防腐剤、矯味剤及び着色剤及び抗酸化薬も含み得る。
【００３５】
本医薬組成物は、滅菌注射用水溶液の形であり得る。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。
【００３６】
滅菌注射用製剤はまた、有効成分が油相に溶解している滅菌注射用水中油型マイクロエマルジョンであり得る。例えば、有効成分をまず、ダイズオイルとレシチンの混合物に溶解してよい。次いで、このオイル溶液を、水とグリセロールの混合物に入れ、マイクロエマルジョンを形成するよう処理する。
【００３７】
注射用溶液又はマイクロエマルジョンは、局所ボーラス注射によって患者の血流中に入れることができる。或いは、本化合物の一定循環濃度を維持するような方法で溶液又はマイクロエマルジョンを投与することが有利であり得る。このような一定濃度を維持するために、連続的静脈内送達装置を利用してもよい。このような装置の一例として、Ｄｅｌｔｅｃ ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）モデル５４００静脈内ポンプがある。
【００３８】
本医薬組成物は、筋肉内投与及び皮下投与用の滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形であり得る。この懸濁液は、上記に記載されている適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用い、既知技術に従って製剤できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であり得る。更に、滅菌硬化油も、溶媒又は懸濁媒体として従来用いられている。この目的には、合成モノ又はジグリセリドをはじめ、任意の無刺激性硬化油を使用してよい。更に、脂肪酸、例えば、オレイン酸は注射用物質の調製において用途がある。
【００３９】
本発明の化合物はまた、薬物の直腸投与のための坐剤の形で投与してもよい。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって、直腸で融解して薬物を放出する適した非刺激性賦形剤と混合することによって調製できる。このような物質として、ココアバター、グリセリン化ゼラチン、硬化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルの混合物が挙げられる。
【００４０】
局所使用用には、式Ａの化合物を含む、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液などが用いられる。（この適用目的上、局所適用はマウスウォッシュ及び口腔洗浄薬を含むものとする。）
【００４１】
本発明の化合物は、適した経鼻ビヒクル及び送達装置の局所使用によって経鼻形態で、又は当業者に周知の経皮皮膚パッチの形のものを用いて経皮経路によって投与できる。経皮送達系の形で投与されるには、投与量の投与は、当然、投薬レジメンを通じて間欠的ではなく連続となる。本発明の化合物はまた、ココアバター、グリセリン化ゼラチン、硬化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルの混合物などの基剤を用いて坐剤として送達してもよい。
【００４２】
本発明の組成物をヒト被験体に投与する場合には、一日用量は、通常、処方医師によって決定され、投与量は、通常、個々の患者の年齢、体重及び応答並びに患者の症状の重篤度に応じて変わる。
【００４３】
一実施態様では、ＣＨＫ１の阻害剤の適した量を、がんの治療を受けている哺乳動物に投与する。投与は、約０．１ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜約６０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の間、又は０．５ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜約４０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の間の阻害剤量で行う。本組成物を含むもう１つの治療投与量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＣＨＫ１の阻害剤を含む。もう１つの実施態様では、投与量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＣＨＫ１の阻害剤を含む。
【００４４】
本化合物はまた、治療薬、化学療法薬及び抗がん剤との組合せにおいて有用である。目下開示される化合物の、治療薬、化学療法薬及び抗がん剤との組合せは本発明の範囲内にある。このような薬剤の例は、Ｖ．Ｔ．デビタ（Ｄｅｖｉｔａ）及びＳ．ヘルマン（Ｈｅｌｌｍａｎ）（編）によるキャンサー・プリンシプルズ・アンド・プラクティス・オブ・オンコロジー（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第６版（２００１年２月１５日）、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）出版社に見い出すことができる。当業者ならば、薬物及び関与するがんの個々の特徴に基づいて、どの組合せの薬剤が有用であるかを見極めることができる。このような薬剤として、以下が挙げられる：エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤及びその他の血管新生抑制剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤及び細胞周期チェックポイントを干渉する物質。本化合物は、放射線療法と同時投与された場合に特に有用である。
【００４５】
「エストロゲン受容体モジュレーター」とは、機序にかかわらず、エストロゲンの受容体との結合を干渉又は阻害する化合物を指す。エストロゲン受容体モジュレーターの例として、それだけには限らないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾン及びＳＨ６４６が挙げられる。
【００４６】
「アンドロゲン受容体モジュレーター」とは、機序にかかわらず、アンドロゲンの受容体との結合を干渉又は阻害する化合物を指す。アンドロゲン受容体モジュレーターの例として、フィナステリド及びその他の５α−レダクターゼ阻害剤、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾール及び酢酸アビラテロンが挙げられる。
【００４７】
「レチノイド受容体モジュレーター」とは、機序にかかわらず、レチノイドの受容体との結合を干渉又は阻害する化合物を指す。このようなレチノイド受容体モジュレーターの例として、ベキサロテン、トレチノイン、１３−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチナミド及びＮ−４−カルボキシフェニルレチナミドが挙げられる。
【００４８】
「細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤」とは、主に、細胞の機能を直接干渉するか、細胞有糸分裂を阻害又は干渉することによって、細胞死を引き起こすか、又は細胞増殖を阻害する化合物、例えば、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレータ、低酸素活性化可能化合物、微小管阻害剤／微小管安定化剤、有糸分裂キネシンの阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、有糸分裂進行に関与しているキナーゼの阻害剤、増殖因子及びサイトカインシグナル伝達経路に関与しているキナーゼの阻害剤、代謝拮抗剤、生物反応修飾物質、ホルモン／抗ホルモン治療薬、造血性増殖因子、モノクローナル抗体標的化治療薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤及びユビキチンリガーゼ阻害剤及びオーロラキナーゼ阻害剤を指す。
【００４９】
細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤の例として、それだけには限らないが、セルテネフ（ｓｅｒｔｅｎｅｆ）、カケクチン、イフォスファミド、タソネルミン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニムスチン、ジブロモダルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ラニムスチン、ホテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン（ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロフォスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ、ロバプラチン、サトラプラチン、プロフィロマイシン（ｐｒｏｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、イロフルベン（ｉｒｏｆｕｌｖｅｎ）、デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）白金、ベンジルグアニン、グルフォスファミド（ｇｌｕｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＧＰＸ１００、（トランス，トランス，トランス）−ビス−ｍｕ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ｍｕ−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）白金（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジジニルスペルミン（ｄｉａｒｉｚｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビサントレン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピナフィド（ｐｉｎａｆｉｄｅ）、バルルビシン、アムルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アンナマイシン（ａｎｎａｍｙｃｉｎ）、ガラルビシン（ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、エリナフィド（ｅｌｉｎａｆｉｄｅ）、ＭＥＮ１０７５５、４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（ＷＯ００／５００３２参照のこと）、Ｒａｆキナーゼ阻害剤（例えば、Ｂａｙ４３−９００６）及びｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）のＣＣＩ−７７９）が挙げられる。
【００５０】
低酸素活性化可能化合物の一例として、チラパザミンがある。
【００５１】
プロテアソーム阻害剤の例として、それだけには限らないが、ラクタシスチン及びＭＬＮ−３４１（Ｖｅｌｃａｄｅ）がある。
【００５２】
微小管阻害剤／微小管安定化剤の例として、パクリタキセル、硫酸ビンデシン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキセル、リゾキシン、ドラスタチン、イセチオン酸ミボブリン、オーリスタチン、セマドチン、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン、クリプトフィシン、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、アンヒドロビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン（例えば、米国特許第６，２８４，７８１号及び同６，２８８，２３７号参照のこと）及びＢＭＳ１８８７９７が挙げられる。一実施態様では、エポチロンは微小管阻害剤／微小管安定化剤に含まれない。
【００５３】
トポイソメラーゼ阻害剤のいくつかの例として、トポテカン、ハイカプタミン（ｈｙｃａｐｔａｍｉｎｅ）、イリノテカン、ルビテカン、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデン−チャートリューシン（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ）、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ルルトテカン、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、リン酸エトポシド、テニポシド、ソブゾキサン、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、（５ａ、５ａＢ、８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロオキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソール−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナントリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン（ｉｓｏｇｕｉｎｏｌｉｎｅ）−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−ｄｅ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン及びジメスナがある。
【００５４】
有糸分裂キネシン、特に、ヒト有糸分裂キネシンＫＳＰの阻害剤の例は、刊行物ＷＯ０３／０３９４６０、ＷＯ０３／０５００６４、ＷＯ０３／０５０１２２、ＷＯ０３／０４９５２７、ＷＯ０３／０４９６７９、ＷＯ０３／０４９６７８、ＷＯ０４／０３９７７４、ＷＯ０３／０７９９７３、ＷＯ０３／０９９２１１、ＷＯ０３／１０５８５５、ＷＯ０３／１０６４１７、ＷＯ０４／０３７１７１、ＷＯ０４／０５８１４８、ＷＯ０４／０５８７００、ＷＯ０４／１２６６９９、ＷＯ０５／０１８６３８、ＷＯ０５／０１９２０６、ＷＯ０５／０１９２０５、ＷＯ０５／０１８５４７、ＷＯ０５／０１７１９０、ＵＳ２００５／０１７６７７６に記載されている。一実施態様では、有糸分裂キネシンの阻害剤として、それだけには限らないが、ＫＳＰの阻害剤、ＭＫＬＰ１の阻害剤、ＣＥＮＰ−Ｅの阻害剤、ＭＣＡＫの阻害剤及びＲａｂ６−ＫＩＦＬの阻害剤が挙げられる。
【００５５】
「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」の例として、それだけには限らないが、ＳＡＨＡ、ＴＳＡ、オキサムフラチン、ＰＸＤ１０１、ＭＧ９８及びスクリプタイドが挙げられる。その他のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の更なる参照は、以下の原稿中に見い出すことができる；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｔ．Ａ．らジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４６（２４）：５０９７〜５１１６頁（２００３）。
【００５６】
「有糸分裂進行に関与しているキナーゼの阻害剤」として、それだけには限らないが、オーロラキナーゼの阻害剤、Ｐｏｌｏ様キナーゼの阻害剤（ＰＬＫ；特に、ＰＬＫ−１の阻害剤）、ｂｕｂ−１の阻害剤及びｂｕｂ−Ｒ１の阻害剤が挙げられる。「オーロラキナーゼ阻害剤」の例として、ＶＸ−６８０がある。
【００５７】
「抗増殖剤」としては、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１及びＩＮＸ３００１、並びに代謝拮抗剤、例えば、エノシタビン、カルモフール、テガフール、ペントスタチン、ドキシフルリジン、トリメトレキサート、フルダラビン、カペシタビン、ガロシタビン、シタラビンオクホスファート、フォステアビン（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ）ナトリウム水和物、ラルチトレキセド、パルチトレキシド（ｐａｌｔｉｔｒｅｘｉｄ）、エミテフール、チアゾフリン、デシタビン、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ネルザラビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］アデニン、アプリジン、エクテイナシジン（ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）、トロキサシタビン、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン、ロメトレキソール、デクスラゾキサン、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン及びトラスツズマブが挙げられる。
【００５８】
モノクローナル抗体標的化治療薬の例として、がん細胞特異的又は標的細胞特異的モノクローナル抗体と結合している、細胞傷害剤又は放射性同位元素を有する治療薬が挙げられる。例として、ベキサールが挙げられる。
【００５９】
「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤」とは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの阻害剤を指す。使用できるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、ロバスタチン（メバコール（登録商標）；米国特許第４，２３１，９３８号、同４，２９４，９２６号及び同４，３１９，０３９号参照のこと）、シンバスタチン（ゾコール（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号、同４，８２０，８５０号及び同４，９１６，２３９号参照のこと）、プラバスタチン（プラバコール（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号、同４，５３７，８５９号、同４，４１０，６２９号、同５，０３０，４４７号及び同５，１８０，５８９号参照のこと）、フルバスタチン（レスコール（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号、同４，９１１，１６５号、同４，９２９，４３７号、同５，１８９，１６４号、同５，１１８，８５３号、同５，２９０，９４６号及び同５，３５６，８９６号参照のこと）、アトルバスタチン（リピトール（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号、同４，６８１，８９３号、同５，４８９，６９１号及び同５，３４２，９５２号参照のこと）及びセリバスタチン（リバスタチン及びバイコール（ＢＡＹＣＨＯＬ）（登録商標）としても知られている；米国特許第５，１７７，０８０号参照のこと）。本方法において使用できるこれらの及び更なるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の構造式は、Ｍ．ヤルパニ（Ｙａｌｐａｎｉ）、「コレステロール・ロワーリング・ドラッグス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ）」、ケミストリー・アンド・インダストリー（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）、８５〜８９頁（１９９６年２月５日）の８７頁及び米国特許第４，７８２，０８４号及び同４，８８５，３１４号に記載されている。本明細書において、用語ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、医薬上許容され得るラクトン及びオープンアシッド形（すなわち、ラクトン環が開環されて遊離酸を形成している）並びにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害活性を有する化合物の塩及びエステルの形のすべてを含み、したがって、このような塩、エステル、オープンアシッド及びラクトンの形の使用は本発明の範囲内に含まれる。
【００６０】
「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤」とは、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素のうち任意の１種又は任意の組合せを阻害する化合物、例えば、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴアーゼ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩ型（ＧＧＰＴアーゼ−Ｉ）及びゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩＩ型（ＧＧＰＴアーゼ−ＩＩ、Ｒａｂ ＧＧＰＴアーゼとも呼ばれる）を指す。
【００６１】
プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の例は、以下の刊行物及び特許に見ることができる：ＷＯ９６／３０３４３、ＷＯ９７／１８８１３、ＷＯ９７／２１７０１、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／３８６６５、ＷＯ９８／２８９８０、ＷＯ９８／２９１１９、ＷＯ９５／３２９８７、米国特許第５，４２０，２４５号、同５，５２３，４３０号、同５，５３２，３５９号、同５，５１０，５１０号、同５，５８９，４８５号、同５，６０２，０９８号、欧州特許公報０６１８２２１号、同０６７５１１２号、同０６０４１８１号、同０６９６５９３号、ＷＯ９４／１９３５７、ＷＯ９５／０８５４２、ＷＯ９５／１１９１７、ＷＯ９５／１２６１２、ＷＯ９５／１２５７２、ＷＯ９５／１０５１４、米国特許第５，６６１，１５２号、ＷＯ９５／１０５１５、ＷＯ９５／１０５１６、ＷＯ９５／２４６１２、ＷＯ９５／３４５３５、ＷＯ９５／２５０８６、ＷＯ９６／０５５２９、ＷＯ９６／０６１３８、ＷＯ９６／０６１９３、ＷＯ９６／１６４４３、ＷＯ９６／２１７０１、ＷＯ９６／２１４５６、ＷＯ９６／２２２７８、ＷＯ９６／２４６１１、ＷＯ９６／２４６１２、ＷＯ９６／０５１６８、ＷＯ９６／０５１６９、ＷＯ９６／００７３６、米国特許第５，５７１，７９２号、ＷＯ９６／１７８６１、ＷＯ９６／３３１５９、ＷＯ９６／３４８５０、ＷＯ９６／３４８５１、ＷＯ９６／３００１７、ＷＯ９６／３００１８、ＷＯ９６／３０３６２、ＷＯ９６／３０３６３、ＷＯ９６／３１１１１、ＷＯ９６／３１４７７、ＷＯ９６／３１４７８、ＷＯ９６／３１５０１、ＷＯ９７／００２５２、ＷＯ９７／０３０４７、ＷＯ９７／０３０５０、ＷＯ９７／０４７８５、ＷＯ９７／０２９２０、ＷＯ９７／１７０７０、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／２６２４６、ＷＯ９７／３００５３、ＷＯ９７／４４３５０、ＷＯ９８／０２４３６及び米国特許第５，５３２，３５９号。血管新生に対するプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の役割の一例については、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）第３５巻、第９号、１３９４〜１４０１頁（１９９９）参照のこと。
【００６２】
「血管新生抑制剤」とは、機序にかかわらず、新しい血管の形成を阻害する化合物を指す。血管新生抑制剤の例としては、それだけには限らないが、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害剤、上皮由来、繊維芽細胞由来又は血小板由来増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）様アスピリン及びイブプロフェン並びに選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤様セレコキシブ及びロフェコキシブ（ＰＮＡＳ、第８９巻、７３８４頁（１９９２）；ＪＮＣＩ、第６９巻、４７５頁（１９８２）；アーカイブ・オブ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）第１０８巻、５７３頁（１９９０）；アナトミカル・レコード（Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ）、第２３８巻、６８頁（１９９４）；ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３７２巻、８３頁（１９９５）；クリニカル・オルソパイディクス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ）第３１３巻、７６頁（１９９５）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、第１６巻、１０７頁（１９９６）；ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ファルマコロジー（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第７５巻、１０５頁（１９９７）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５７巻、１６２５頁（１９９７）；セル（Ｃｅｌｌ）、第９３巻、７０５頁（１９９８）；インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第２巻、７１５頁（１９９８）；ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７４巻、９１１６頁（１９９９））、ステロイド性抗炎症薬（例えば、副腎皮質ステロイド、ミネラルコルチコイド、デキサミタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレド、ベタメタゾン）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト（フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ら、ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１０５：１４１〜１４５頁（１９８５）参照のこと）及びＶＥＧＦに対する抗体（ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１７巻、９６３〜９６８頁（１９９９年１０月）；キム（Ｋｉｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３６２、８４１〜８４４頁（１９９３）；ＷＯ００／４４７７７及びＷＯ００／６１１８６参照のこと）が挙げられる。
【００６３】
血管新生を調節又は阻害し、また、本発明の化合物と併用できるその他の治療薬として、血液凝固及び繊維素溶解システムを調節又は阻害する薬剤が挙げられる（クリニカル・ケミストリー・アンド・ラボラトリー・メディシン（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３８：６７９〜６９２頁（２０００）における総説を参照のこと）。血液凝固及び繊維素溶解経路を調節又は阻害するような薬剤の例として、それだけには限らないが、ヘパリン（スロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）８０：１０〜２３頁（１９９８）参照）、低分子量ヘパリン及びカルボキシペプチダーゼＵ阻害剤（活性トロンビン活性化可能繊維素溶解阻害剤［ＴＡＦＩａ］の阻害剤としても知られる）（スロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１０１：３２９〜３５４頁（２００１）参照のこと）が挙げられる。ＴＡＦＩａ阻害剤は、米国特許出願番号６０／３１０，９２７号（２００１年８月８日に出願された）及び同６０／３４９，９２５号（２００２年１月１８日に出願された）に記載されている。
【００６４】
「細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤」とは、細胞周期チェックポイントシグナルを伝達するプロテインキナーゼを阻害し、それによってがん細胞をＤＮＡ損傷剤に対して増感させる化合物を指す。このような薬剤として、ＡＴＲ、ＡＴＭ及びＣＨＫ１１及びＣＨＫ１２キナーゼの阻害剤並びにｃｄｋ及びｃｄｃキナーゼ阻害剤が挙げられ、７−ヒドロキシスタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）及びＢＭＳ−３８７０３２によって具体的に示される。
【００６５】
「受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤」とは、ＲＴＫ、ひいては、発がん及び腫瘍進行に関与している機序を阻害する化合物を指す。このような薬剤として、ｃ−Ｋｉｔ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ３及びｃ−Ｍｅｔの阻害剤が挙げられる。更なる薬剤として、ブメ−ジェンセン（Ｂｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ）及びハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４１１：３５５〜３６５頁、２００１によって記載されるＲＴＫの阻害剤が挙げられる。
【００６６】
「細胞増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害剤」とは、細胞表面受容体のシグナル変換カスケード下流を阻害する医薬品を指す。このような薬剤として、セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、それだけには限らないが、例えば、ＷＯ０２／０８３０６４、ＷＯ０２／０８３１３９、ＷＯ０２／０８３１４０、ＵＳ２００４−０１１６４３２、ＷＯ０２／０８３１３８、ＵＳ２００４−０１０２３６０、ＷＯ０３／０８６４０４、ＷＯ０３／０８６２７９、ＷＯ０３／０８６３９４、ＷＯ０３／０８４４７３、ＷＯ０３／０８６４０３、ＷＯ２００４／０４１１６２、ＷＯ２００４／０９６１３１、ＷＯ２００４／０９６１２９、ＷＯ２００４／０９６１３５、ＷＯ２００４／０９６１３０、ＷＯ２００５／１００３５６、ＷＯ２００５／１００３４４、ＵＳ２００５／０２９９４１、ＵＳ２００５／４４２９４、ＵＳ２００５／４３３６１、６０／７３４１８８、６０／６５２７３７、６０／６７０４６９に記載されるようなＡｋｔの阻害剤）、Ｒａｆキナーゼの阻害剤（例えば、ＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害剤（例えば、ＣＩ−１０４０及びＰＤ−０９８０５９）及びｍＴＯＲの阻害剤（例えば、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）ＣＣＩ−７７９）及びＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）が挙げられる。
【００６７】
上記のように、ＮＳＡＩＤとの組合せは、強力なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤの使用を対象とする。本明細書では、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２の阻害について、細胞又はミクロソームアッセイによって測定される１μＭ以下のＩＣ５０を有する場合、有効である。
【００６８】
本発明はまた、選択的ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤとの組合せを包含する。本明細書では、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤であるＮＳＡＩＤは、細胞又はミクロソームアッセイによって評価される、ＣＯＸ−１のＩＣ５０を上回るＣＯＸ−２のＩＣ５０の比によって測定される、少なくとも１００倍の、ＣＯＸ−１を上回るＣＯＸ−２の阻害に対する特異性を有するものとして定義される。このような化合物として、それだけには限らないが、すべて参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７４，９９５号、同５，８６１，４１９号、同６，００１，８４３号、同６，０２０，３４３号、同５，４０９，９４４号、同５，４３６，２６５号、同５，５３６，７５２号、同５，５５０，１４２号、同５，６０４，２６０号、同５，６９８，５８４号、同５，７１０，１４０号、ＷＯ９４／１５９３２、米国特許第５，３４４，９９１号、同５，１３４，１４２号、同５，３８０，７３８号、同５，３９３，７９０号、同５，４６６，８２３号、同５，６３３，２７２号及び同５，９３２，５９８号に開示されるものが挙げられる。
【００６９】
本治療方法において特に有用であるＣＯＸ−２の阻害剤として、３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン及び５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジン又はその医薬上許容され得る塩がある。
【００７０】
ＣＯＸ−２の特異的阻害剤として記載されており、ひいては、本発明において有用である化合物として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：パレコキシブ、ベクストラ（登録商標）及びセレブレックス（登録商標）又はその医薬上許容され得る塩。
【００７１】
血管新生抑制剤のその他の例として、それだけには限らないが、エンドスタチン、ウクライン、ランピルナーゼ、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクタ−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジナナリン、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミン、コンブレタスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタオースホスフェート、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホネート）及び３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）が挙げられる。
【００７２】
上記で用いた「インテグリン遮断薬」とは、生理学的リガンドの、αｖβ３インテグリンとの結合を選択的にアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物、生理学的リガンドの、αｖβ５インテグリンとの結合を選択的にアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物、生理学的リガンドの、αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンの両方との結合をアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物及び毛細血管内皮細胞上に発現される特定のインテグリン（類）の活性をアンタゴナイズ、阻害、又は無効にする化合物を指す。この用語はまた、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンのアンタゴニストも指す。この用語はまた、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンの任意の組合せのアンタゴニストも指す。
【００７３】
チロシンキナーゼ阻害剤のいくつかの具体的な例として、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、ＳＴＩ５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホネート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミン及びＥＭＤ１２１９７４が挙げられる。
【００７４】
抗がん化合物以外の化合物との組合せも、本方法に包含される。例えば、この特許請求される化合物の、ＰＰＡＲ−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−ガンマ）アゴニスト及びＰＰＡＲ−δ（すなわち、ＰＰＡＲ−デルタ）アゴニストとの組合せは、特定の悪性腫瘍の治療において有用である。ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δとは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ及びδである。内皮細胞上でのＰＰＡＲ−γの発現及び血管新生におけるその関与は、文献に報告されている（ジャーナル・オブ・カルディオバスキュラー・ファルマコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）１９９８；３１：９０９〜９１３頁；ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９９９；２７４：９１１６〜９１２１頁；インベスティゲーション・オフタルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０００；４１：２３０９〜２３１７頁参照のこと）。より最近、ＰＰＡＲ−γアゴニストは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦに対する血管新生反応を阻害することがわかり、トログリタゾン及びマレイン酸ロシグリタゾンは両方とも、マウスにおいて網膜の新血管新生の発生を阻害する（アーカイブ・オブ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）２００１；１１９：７０９〜７１７頁）。ＰＰＡＲ−γアゴニスト及びＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例として、それだけには限らないが、チアゾリジンジオン（例えば、ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾン）、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ０９／７８２，８５６に開示される）及び２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（ＵＳＳＮ６０／２３５，７０８及び６０／２４４，６９７に開示される）が挙げられる。
【００７５】
本発明のもう１つの実施態様は、ここで開示される化合物の、がんの治療のための遺伝子療法との併用である。がんを治療するための遺伝子戦略の概観については、ホール（Ｈａｌｌ）ら（アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）６１：７８５〜７８９頁、１９９７）及びクフェ（Ｋｕｆｅ）ら（キャンサー・メディシン（Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５版、８７６〜８８９頁、ＢＣデッカー（Ｄｅｃｋｅｒ）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）２０００）参照のこと。遺伝子療法は、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達するために使用できる。このような遺伝子の例として、それだけには限らないが、組換えウイルス媒介性遺伝子導入によって送達され得るｐ５３（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号参照のこと）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニスト（ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９８年８月；５（８）：１１０５〜１３頁中、「アデノウイルス・メディエイテッド・デリバリー・オブ・ア・ユーピーエー／ユーピーエーピー・アンタゴニスト・サプレセズ・アンギオジェネシス−ディペンデント・チューモア・グロース・アンド・ディセミネーション・イン・マウス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｕＰＡ／ｕＰＡＲ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ）」、及びインターフェロンγ（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２０００；１６４：２１７〜２２２頁）が挙げられる。
【００７６】
本発明の化合物はまた、生来多剤耐性（ＭＤＲ）、特に、輸送体タンパク質の高レベルの発現と関連しているＭＤＲの阻害剤と併用投与してもよい。このようなＭＤＲ阻害剤として、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害剤、例えば、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３及びＰＳＣ８３３（ｖａｌｓｐｏｄａｒ）が挙げられる。
【００７７】
本発明の化合物は、本発明の化合物の、単独又は放射線療法を伴う使用に起因し得る、悪心又は嘔吐、例えば、急性、遅発性、晩期及び先行嘔吐を治療するための制吐剤と併用してもよい。嘔吐の予防又は治療には、本発明の化合物をその他の制吐剤、特に、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト、例えば、オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン及びザチセトロン（ｚａｔｉｓｅｔｒｏｎ）、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト、例えば、バクロフェン、コルチコステロイド、例えば、デカドロン（デキサメタゾン）、ケナログ、アリストコート、ナサリド（Ｎａｓａｌｉｄｅ）、プレフェリド（Ｐｒｅｆｅｒｉｄ）、ベネコルテン（Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎ）又は米国特許第２，７８９，１１８号、同２，９９０，４０１号、同３，０４８，５８１号、同３，１２６，３７５号、同３，９２９，７６８号、同３，９９６，３５９号、同３，９２８，３２６号及び同３，７４９，７１２号に開示されるものなどのその他のもの；抗ドーパミン、例えば、フェノチアジン（例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジン及びメソリダジン）、メトクロプラミド又はドロナビノールと併用してもよい。別の実施態様では、本化合物の投与に起因し得る嘔吐の治療又は予防のための、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト及びコルチコステロイドから選択される制吐剤を用いる併用療法が開示されている。
【００７８】
本発明の化合物と組合せたニューロキニン−１受容体アンタゴニストの使用は、例えば、米国特許第５，１６２，３３９号、同５，２３２，９２９号、同５，２４２，９３０号、同５，３７３，００３号、同５，３８７，５９５号、同５，４５９，２７０号、同５，４９４，９２６号、同５，４９６，８３３号、同５，６３７，６９９号、同５，７１９，１４７号；欧州特許公報ＥＰ０３６０３９０、同０３９４９８９、同０４２８４３４、同０４２９３６６、同０４３０７７１、同０４３６３３４、同０４４３１３２、同０４８２５３９、同０４９８０６９、同０４９９３１３、同０５１２９０１、同０５１２９０２、同０５１４２７３、同０５１４２７４、同０５１４２７５、同０５１４２７６、同０５１５６８１、同０５１７５８９、同０５２０５５５、同０５２２８０８、同０５２８４９５、同０５３２４５６、同０５３３２８０、同０５３６８１７、同０５４５４７８、同０５５８１５６、同０５７７３９４、同０５８５９１３、同０５９０１５２、同０５９９５３８、同０６１０７９３、同０６３４４０２、同０６８６６２９、同０６９３４８９、同０６９４５３５、同０６９９６５５、同０６９９６７４、同０７０７００６、同０７０８１０１、同０７０９３７５、同０７０９３７６、同０７１４８９１、同０７２３９５９、同０７３３６３２及び同０７７６８９３；ＰＣＴ国際特許公報ＷＯ９０／０５５２５、同９０／０５７２９、同９１／０９８４４、同９１／１８８９９、同９２／０１６８８、同９２／０６０７９、同９２／１２１５１、同９２／１５５８５、同９２／１７４４９、同９２／２０６６１、同９２／２０６７６、同９２／２１６７７、同９２／２２５６９、同９３／００３３０、同９３／００３３１、同９３／０１１５９、同９３／０１１６５、同９３／０１１６９、同９３／０１１７０、同９３／０６０９９、同９３／０９１１６、同９３／１００７３、同９３／１４０８４、同９３／１４１１３、同９３／１８０２３、同９３／１９０６４、同９３／２１１５５、同９３／２１１８１、同９３／２３３８０、同９３／２４４６５、同９４／００４４０、同９４／０１４０２、同９４／０２４６１、同９４／０２５９５、同９４／０３４２９、同９４／０３４４５、同９４／０４４９４、同９４／０４４９６、同９４／０５６２５、同９４／０７８４３、同９４／０８９９７、同９４／１０１６５、同９４／１０１６７、同９４／１０１６８、同９４／１０１７０、同９４／１１３６８、同９４／１３６３９、同９４／１３６６３、同９４／１４７６７、同９４／１５９０３、同９４／１９３２０、同９４／１９３２３、同９４／２０５００、同９４／２６７３５、同９４／２６７４０、同９４／２９３０９、同９５／０２５９５、同９５／０４０４０、同９５／０４０４２、同９５／０６６４５、同９５／０７８８６、同９５／０７９０８、同９５／０８５４９、同９５／１１８８０、同９５／１４０１７、同９５／１５３１１、同９５／１６６７９、同９５／１７３８２、同９５／１８１２４、同９５／１８１２９、同９５／１９３４４、同９５／２０５７５、同９５／２１８１９、同９５／２２５２５、同９５／２３７９８、同９５／２６３３８、同９５／２８４１８、同９５／３０６７４、同９５／３０６８７、同９５／３３７４４、同９６／０５１８１、同９６／０５１９３、同９６／０５２０３、同９６／０６０９４、同９６／０７６４９、同９６／１０５６２、同９６／１６９３９、同９６／１８６４３、同９６／２０１９７、同９６／２１６６１、同９６／２９３０４、同９６／２９３１７、同９６／２９３２６、同９６／２９３２８、同９６／３１２１４、同９６／３２３８５、同９６／３７４８９、同９７／０１５５３、同９７／０１５５４、同９７／０３０６６、同９７／０８１４４、同９７／１４６７１、同９７／１７３６２、同９７／１８２０６、同９７／１９０８４、同９７／１９９４２及び同９７／２１７０２；及び英国特許公報第２２６６５２９号、同２２６８９３１号、同２２６９１７０号、同２２６９５９０号、同２２７１７７４号、同２２９２１４４号、同２２９３１６８号、同２２９３１６９号及び同２３０２６８９号に十分に記載されている。このような化合物の調製は、参照により本明細書に組み込まれる前記の特許及び刊行物に十分に記載されている。
【００７９】
一実施態様では、本発明の化合物と併用するためのニューロキニン−１受容体アンタゴニストは、米国特許第５，７１９，１４７に記載される、２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリン又はその医薬上許容され得る塩から選択される。
【００８０】
本発明の化合物はまた、貧血の治療において有用な薬剤とともに投与してもよい。このような貧血治療薬として、例えば、持続性の（ｅｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）受容体アクチベーター（例えば、エポエチンアルファ）がある。
【００８１】
本発明の化合物はまた、好中球減少症の治療において有用である薬剤とともに投与してもよい。このような好中球減少症治療薬として、例えば、好中球の産生及び機能を調節する造血増殖因子、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、（Ｇ−ＣＳＦ）がある。Ｇ−ＣＳＦの例として、フィルグラスチムが挙げられる。
【００８２】
本発明の化合物はまた、免疫増強薬、例えば、レバミソール、イソプリノシン及びザダキシンとともに投与してもよい。
【００８３】
本発明の化合物はまた、ビスホスホネート（ビスホスホネート、ジホスホネート、ビスホスホン酸及びジホスホン酸を含むと理解される）と組合せて、がん、例えば、骨がんを治療又は予防するのに有用であり得る。ビスホスホネートの例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：エチドロネート（ダイドロネル）、パミドロネート（アレディア）、アレンドロネート（フォサマックス）、リセドロネート（アクトネル）、ゾレドロネート（ゾメタ）、イバンドロネート（ボニバ）、インカドロネート又はシマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、ミノドロネート、ネリドロネート、ピリドロネート及びチルドロネート並びにありとあらゆるその医薬上許容され得る塩、誘導体、水和物及び混合物。
【００８４】
本発明の化合物はまた、アロマターゼ阻害剤と組合せて、乳がんを治療又は予防するのに有用であり得る。アロマターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、アナストロゾール、レトロゾール及びエキセメスタンが挙げられる。
【００８５】
本発明の化合物はまた、ｓｉＲＮＡ治療薬と組合せて、がんを治療又は予防するのに有用であり得る。
【００８６】
本発明の化合物はまた、γ−セクレターゼ阻害剤及び／又はＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤と組合せて投与してもよい。このような阻害剤として、ＷＯ０１／９００８４、ＷＯ０２／３０９１２、ＷＯ０１／７０６７７、ＷＯ０３／０１３５０６、ＷＯ０２／３６５５５、ＷＯ０３／０９３２５２、ＷＯ０３／０９３２６４、ＷＯ０３／０９３２５１、ＷＯ０３／０９３２５３、ＷＯ２００４／０３９８００、ＷＯ２００４／０３９３７０、ＷＯ２００５／０３０７３１、ＷＯ２００５／０１４５５３、ＵＳＳＮ１０／９５７，２５１、ＷＯ２００４／０８９９１１、ＷＯ０２／０８１４３５、ＷＯ０２／０８１４３３、ＷＯ０３／０１８５４３、ＷＯ２００４／０３１１３７、ＷＯ２００４／０３１１３９、ＷＯ２００４／０３１１３８、ＷＯ２００４／１０１５３８、ＷＯ２００４／１０１５３９及びＷＯ０２／４７６７１に記載される化合物（例えば、ＬＹ−４５０１３９）が挙げられる。
【００８７】
本発明の化合物はまた、ＰＡＲＰ阻害剤と組合せて、がんを治療又は予防するのに有用であり得る。
【００８８】
本発明の化合物はまた、以下の治療薬と組合せて、がんを治療するのに有用であり得る：アバレリックス（プレナキシス・デポー（Ｐｌｅｎａｘｉｓ ｄｅｐｏｔ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロキン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標））；アレムツヅマブ（カンパス（登録商標））；アリトレチノイン（パンレチン（登録商標））；アロプリノール（ジロプリム（Ｚｙｌｏｐｒｉｍ）（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサレン（登録商標））；アミホスチン（エチオール（Ｅｔｈｙｏｌ）（登録商標））；アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））；三酸化ヒ素（トリセノックス（登録商標））；アスパラギナーゼ（エルスパール（Ｅｌｓｐａｒ）（登録商標））；アザシチジン（ビダザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標））；ベバクジマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（アバスチン（登録商標））；ベキサロテンカプセル（タルグレチン（登録商標））；ベキサロテンゲル（タルグレチン（登録商標））；ブレオマイシン（ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）（登録商標））；ボルテゾミブ（ベルケード（登録商標））；ブスルファン静脈内（ブスルフェクス（登録商標））；ブスルファン経口（ミレラン（登録商標））；カルステロン（メトサルブ（Ｍｅｔｈｏｓａｒｂ）（登録商標））；カペシタビン（ゼローダ（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；カルムスチン（ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；カルムスチン（グリアデル（登録商標））；ポリフェプロサン（Ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）２０インプラントを伴うカルムスチン（グリアデル ウエハー（登録商標））；セレコキシブ（セレブレックス（登録商標））；セツキシマブ（アービタックス（登録商標））；クロラムブシル（ロイケラン（登録商標））；シスプラチン（プラチノール（登録商標））；クラドリビン（ロイスタチン（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；クロファラビン（クロラー（Ｃｌｏｌａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン注射（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン錠剤（登録商標））；シタラビン（シトサール（Ｃｙｔｏｓａｒ）−Ｕ（登録商標））；シタラビンリポソーム（デポシト（ＤｅｐｏＣｙｔ）（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ−ドム（Ｄｏｍｅ）（登録商標））；ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（コスメゲン（登録商標））；ダルベポエチンアルファ（アラネスプ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダムオキソーム（ＤａｎｕｏＸｏｍｅ）（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（ダウノルビシン（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（セルビジン（登録商標））；デニロイキンジフチトクス（オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標））；デクスラゾキサン（ジネカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（登録商標））；ドセタキセル（タキソテール（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（Ｒｕｂｅｘ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ注射（登録商標））；ドキソルビシンリポソーム（ドキシル（Ｄｏｘｉｌ）（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（ドロモスタノロン（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（マステロン注射（登録商標））；エリオットＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（エリオットＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（登録商標））；エピルビシン（エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（登録商標））；エポエチンアルファ（エポゲン（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））；エストラムスチン（エムシト（Ｅｍｃｙｔ）（登録商標））；リン酸エトポシド（エトポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）（登録商標））；エトポシド、ＶＰ−１６（ベプシド（登録商標））；エキセメスタン（アロマシン（登録商標））；フィルグラスチム（ニューポジェン（登録商標））；フロクスウリジン（動脈内）（ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（フルダラ（登録商標））；フルオロウラシル、５−ＦＵ（アドルシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）（登録商標））；フルベストラント（ファスロデックス（登録商標））；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））；ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））；ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標））；酢酸ゴセレリン（ゾラデックスインプラント（登録商標））；酢酸ゴセレリン（ゾラデックス（登録商標））；酢酸ヒストレリン（ヒストレリンインプラント（登録商標））；ヒドロキシ尿素（ハイドレア（登録商標））；イブリツモマブ・ティウキセタン（ゼバリン（登録商標））；イダルビシン（イダマイシン（登録商標））；イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；メシル酸イマチニブ（グリーベック（登録商標））；インターフェロンアルファ２ａ（ロフェロンＡ（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ（登録商標））；イリノテカン（カンプトサール（登録商標））；レナリドマイド（レブリミド（登録商標））；レトロゾール（フェマーラ（登録商標））；ロイコボリン（ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（登録商標）、ロイコボリン（登録商標））；酢酸ロイプロリド（エリガード（登録商標））；レバミソール（エルガミソル（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）（登録商標））；ロムスチン、ＣＣＮＵ（ＣｅｅＢＵ（登録商標））；メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード（マスタージェン（登録商標））；酢酸メゲストロール（メゲース（登録商標））；メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ（アルケラン（登録商標））；メルカプトプリン、６−ＭＰ（プリネトール（登録商標））；メスナ（メスネックス（登録商標））；メスナ（メスネックスタブ（登録商標））；メトトレキサート（メトトレキサート（登録商標））；メトキサレン（ウバデックス（Ｕｖａｄｅｘ）（登録商標））；マイトマイシンＣ（ムタマイシン（登録商標））；ミトタン（リソドレン（登録商標））；ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン（デュラボリン−５０（登録商標））；ネララビン（アラノン（Ａｒｒａｎｏｎ）（登録商標））；ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）（ベルルマ（Ｖｅｒｌｕｍａ）（登録商標））；オプレルベキン（ニューメガ（Ｎｅｕｍｅｇａ）（登録商標））；オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標））；パクリタキセル（パキセン（Ｐａｘｅｎｅ）（登録商標））；パクリタキセル（タキソール（登録商標））；パクリタキセルタンパク質結合粒子（アブラキサン（登録商標））；パリフェルミン（ケピバンス（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ）（登録商標））；パミドロネート（アレディア（登録商標））；ペガデマーゼ（アダジェン（ペガデマーゼウシ）（登録商標））；ペガスパルガーゼ（オンカスパール（Ｏｎｃａｓｐａｒ）（登録商標））；ベグフィルグラスチム（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ニューラスタ（登録商標））；ペメトレキセド二ナトリウム（アリムタ（登録商標））；ペントスタチン（ニペント（Ｎｉｐｅｎｔ）（登録商標））；ピポブロマン（ベルサイト（Ｖｅｒｃｙｔｅ）（登録商標））；プリカマイシン、ミトラマイシン（ミトラシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）（登録商標））；ポルフィマーナトリウム（フォトフリン（登録商標））；プロカルバジン（マツラン（登録商標））；キナクリン（アタブリン（登録商標））；ラスブリカーゼ（エリテック（Ｅｌｉｔｅｋ）（登録商標））；リツキシマブ（リツキサン（登録商標））；サルグラモスチム（ロイキン（登録商標））；サルグラモスチム（プロキン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））；ストレプトゾシン（ザノサール（登録商標））；マレイン酸スニチニブ（ステント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））；タルク（スクレロソール（登録商標））；タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（登録商標））；テニポシド、ＶＭ−２６（ブモン（Ｖｕｍｏｎ）（登録商標））；テストラクトン（テスラック（Ｔｅｓｌａｃ）（登録商標））；チオグアニン、６−ＴＧ（チオグアニン（登録商標））；チオテパ（チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）（登録商標））；トポテカン（ハイカムチン（登録商標））；トレミフェン（フェアストン（登録商標））；トシツモマブ（ベキサール（登録商標））；トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（ベキサール（登録商標））；トラスツズマブ（ヘルセプチン（登録商標））；トレチノイン、ＡＴＲＡ（ベサノイド（登録商標））；ウラシルマスタード（ウラシルマスタードカプセル（登録商標））；バルルビシン（バルスター（Ｖａｌｓｔａｒ）（登録商標））；ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））；ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））；ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））及びゾレドロネート（ゾメタ（登録商標））。
【００８９】
したがって、本発明の範囲は、この特許請求される化合物の、エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、生来多剤耐性の阻害剤、制吐剤、貧血の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強薬、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤、細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤及び上記で列挙される治療薬のいずれかから選択される第２の化合物と組合せた使用を包含する。
【００９０】
本発明の化合物に関連して、用語「投与」及びその変形（例えば、化合物を「投与すること」）とは、化合物又は化合物のプロドラッグを、治療を必要とする動物の系に導入することを意味する。本発明の化合物又はそのプロドラッグが、１種以上のその他の活性物質（例えば、細胞傷害剤など）と組合せて提供される場合には、「投与」及びその変形は、本化合物又はそのプロドラッグとその他の物質の同時及び逐次導入を含むと各々理解される。
【００９１】
本明細書において、用語「組成物」とは、指定量の指定成分を含む生成物並びに指定量の指定成分の組合せに直接的又は間接的に起因する任意の生成物を包含するものとする。
【００９２】
本明細書において用語「治療上有効な量」とは、研究者、獣医、医師又はその他の臨床医によって求められている、組織、系、動物又はヒトにおける生物学的反応又は医学的反応を誘発する活性化合物又は医薬品の量を意味する。
【００９３】
用語「がんを治療すること」又は「がんの治療」とは、がん性状態に冒された哺乳動物への投与を指し、またがん性細胞を死滅させることによってがん性状態を軽減する効果だけでなく、がんの増殖及び／又は転移の阻害をもたらす効果も指す。
【００９４】
一実施態様では、第２の化合物として用いられる血管新生阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、上皮由来増殖因子の阻害剤、繊維芽細胞由来増殖因子の阻害剤、血小板由来増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１又はＶＥＧＦに対する抗体から選択される。一実施態様では、エストロゲン受容体モジュレーターは、タモキシフェン又はラロキシフェンである。
【００９５】
治療上有効な量の本発明の化合物を、放射線療法と組合せて、及び／又はエストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、生来多剤耐性の阻害剤、制吐剤、貧血の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強薬、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤、細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤及び上記で列挙される治療薬のいずれかから選択される第２の化合物と組合せて投与することを含むがんを治療する方法も、特許請求の範囲に含まれる。
【００９６】
本発明の更にもう１つの実施態様は、治療上有効な量の本発明の化合物を、パクリタキセル又はトラスツズマブと組合せて投与することを含む、がんを治療する方法である。
【００９７】
本発明は、治療上有効な量の本発明の化合物を、ＣＯＸ−２阻害剤と組合せて投与することを含む、がんを治療又は予防する方法を更に包含する。
【００９８】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の化合物と、エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療薬、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を干渉する薬剤、細胞周期チェックポイントを干渉する薬剤及び上記で列挙される治療薬のいずれかから選択される第２の化合物とを含む、がんを治療又は予防するのに有用な医薬組成物を含む。
【００９９】
特定される、すべての特許、刊行物及び係属特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
化学の説明において、及び以下の実施例において用いられる略語は以下の通りである：ＡＥＢＳＦ（ｐ−アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド）；Ｂｏｃ２Ｏ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＢｕＬｉ（ｎ−ブチルリチウム）；ＣＤＣｌ３（クロロホルム−ｄ）；ＣｕＩ（ヨウ化銅）；ＣｕＳＯ４（硫酸銅）；ＤＣＥ（ジクロロエタン）；ＤＣＭ（ジクロロメタン）；ＤＥＡＤ（ジエチルアゾジカルボキシレート）；ＤＭＡＰ（４−アミノピリジン）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＤＴＴ（ジチオトレイトール）；ＥＤＴＡ（エチレン−ジアミン四酢酸）；ＥＧＴＡ（エチレン−グリコール四酢酸）；ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＨＯＡｃ（酢酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＨＲＭＳ（高分解能質量スペクトル）；ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ−質量分析計）；ＬＨＭＤＳ（リチウムビス（トリメチルシリル）アミド）；ＬＲＭＳ（低分解能質量スペクトル）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ＭＰ−Ｂ（ＣＮ）Ｈ３（マクロ多孔性シアノボロヒドリド）；ＮａＨＣＯ３（炭酸水素ナトリウム）；Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）；Ｎａ（ＯＡｃ）３ＢＨ（ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド）；ＮＨ４ＯＡｃ（酢酸アンモニウム）；ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンアミド）；ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロリジノン）；ＮＭＲ（核磁気共鳴）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；Ｐｄ（ｄｐｐｆ）（［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム）；Ｐｄ（Ｐｈ３）４（パラジウム（０）テトラキス−トリフェニルホスフィン）；ＰＯＣｌ３（オキシ塩化リン）；ＰＳ−ＤＩＥＡ（ポリスチレンジイソプロピルエチルアミン）；ＰＳ−ＰＰｈ３（ポリスチレン−トリフェニルホスフィン）；ＰＴＳＡ（パラ−トルエンスルホン酸）；ＲａＮｉ（ラネー−ニッケル）；Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボレート）；ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；及びＴＭＳＣＨ２Ｎ２（トリメチルシリルジアゾメタン）。
【０１０１】
本発明の化合物は、以下の反応スキームに示される反応、更に、文献において公知であるか、又は実験手順に示されるその他の標準的な操作を用いることによって調製できる。したがって、以下の例示的反応スキームは、列挙される化合物に、又は例示目的のために用いられた任意の特定の置換基に限定されない。反応スキームにおいて示される置換基番号付けは、特許請求の範囲において用いられるものと必ずしも関連しておらず、本明細書において上記の式Ａの定義下で複数の置換基が場合により認められる場合には、わかりやすくするために、しばしば化合物と結合される単一の置換基が示される。
【０１０２】
本発明の化合物を製造するために用いられる反応は、反応スキームＩに示される反応を用いることによって調製される。
【０１０３】
反応スキームの概要
反応スキームＩに示されるように、アミノ安息香酸を、エチルクロロアセテートを用いて環化し、ベンゾオキサジノン（Ａ−１）を提供できる。この潜在性求電子物質を、アセト酢酸メチルのナトリウム陰イオンと反応させ、アクリレートＡ−２を提供できる。Ａ−２は、ナトリウムメトキシドの処理の際、内部環化し、カルボキシル基が除去され、４−ヒドロキシキノリノンＡ−３を提供できる。マイクロ波加熱下で、ピラゾロキノリノン（Ａ−４）が、ヒドラジン及び酸触媒から形成され得る。選択的ベンジル保護は、ピラゾール窒素で起こり、Ｎ−ベンジル化ピラゾロキノリノン（Ａ−５）が得られ、これを炭酸セシウムの存在下、種々のブロミドによってアルキル化させて、Ｎ−アルキル化化合物（Ａ−６）を得ることができる。次いで、炭素上パラジウムを用いる水素化によってベンジル基を除去し、Ａ−７を提供できる。ＨＣｌでのアルキルアミンのＢＯＣ基脱保護によって、十分に合成されたピラゾロキノリノン（Ａ−８）が得られる。
【０１０４】
【化２】
【０１０５】
実施例
提供される実施例は、本発明の更なる理解に役立つよう意図される。用いられる個々の物質、種及び条件は、本発明の更なる例示であり、その合理的範囲を制限するものではないものとする。表された化合物の合成において利用される試薬は、市販されているか、当業者によって容易に調製される。
【０１０６】
【化３】
【０１０７】
３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）
９０℃の、１：１イソプロパノール：水（４００ｍＬ）中、活性化ラネーニッケル（アルミニウム上の水中５０％スラリー、２００ｇ；７００ｍｍｏｌ、１３当量）及び３−アミノ−２−ナフトエ酸（１−１）（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ、１当量）の混合物に、１％ＮａＯＨ水溶液（２００ｍＬ）を１時間かけて加えた。反応混合物を９０℃で１６時間撹拌し、更にラネーニッケル（５０ｇ、１８０ｍｍｏｌ、３．４当量）を加え、得られた混合物を９０℃で２４時間加熱した。この混合物を濾過し、濾液を２００ｍＬの水に濃縮し、１Ｎの塩酸水溶液の添加でｐＨ＝３にし、生成物を沈殿させた。灰白色の沈殿を濾過し、逆相液体クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配ｗ／０．１％ＴＦＡ存在）によって精製すると、３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）が白色固体として得られた。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１９２．２，要求値１９２．１。
【０１０８】
２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）
窒素下、−１０℃のピリジン（５０ｍＬ）中、３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）（５．０ｇ、２６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、クロロギ酸エチル（１０ｍＬ、１１ｇ、１００ｍｍｏｌ、４．０当量）を１時間かけて滴下した。得られた溶液を、２０時間かけて−１０℃〜２３℃で撹拌した。この溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残渣を１時間撹拌しながら、水（１００ｍＬ）に懸濁した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させると、２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）が黄色の固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２４６．４，要求値２４６．１。
【０１０９】
メチル （２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロパ−２−エノエート（１−４）
窒素下、無水ベンゼン（１００ｍＬ）中、水素化ナトリウム（９５％）（０．８０ｇ、３３ｍｍｏｌ、２．１当量）の分散物に、アセト酢酸メチル（５．０ｍＬ、５．４ｇ、４６ｍｍｏｌ、２．９当量）を滴下し、得られた混合物を、２３℃で１時間撹拌した。２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）（３．８ｇ、１６ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を２０時間撹拌した。水を用いて過剰の水素化ナトリウムをクエンチし、有機層を分離し、水で３回抽出し、濃塩酸溶液を用いて合わせた水層を酸性にした。得られた沈殿を濾過し、乾燥させると、メチル （２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロパ−２−エノエート（１−４）が黄色のオイルとして得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３６２．５，要求値３６２．２。
【０１１０】
３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）
窒素下、２３℃のベンゼン（１００ｍＬ）中、水素化ナトリウム（９５％）（０．７０ｇ、２９ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物に、メタノール（２．５ｍＬ、２．０ｇ、６２ｍｍｏｌ、５．４当量）を１０分間かけて滴下した。更に５分間撹拌した後、メチル （２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロパ−２−エノエート（１−４）（４．１ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を加え、得られた混合物を７２℃で２０時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残渣を、撹拌しながら、水（５０ｍＬ）に３０分間、続いて１Ｎの塩酸水溶液（１００ｍＬ）に更に３０分間懸濁させた。固体を濾過し、水（１００ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させると、３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）が灰白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２５８．４，要求値２５８．１。
【０１１１】
３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）
ＤＭＡ（３０ｍＬ）中、３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）（２．０ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１当量）、ヒドラジン（０．４０ｍＬ、０．４１ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．６当量）及び触媒濃塩酸溶液（２滴）の混合物を、窒素下、１４０℃で１６時間加熱した。この溶液を冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿を濾過し、ヘキサン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させると、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）が灰白色固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．５１（ｓ，１Ｈ），１０．９９（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ）７．０４（ｓ，１Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｍ，４Ｈ）．ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２５４．４，要求値２５４．１。
【０１１２】
２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−７）
窒素下、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）（１０．２ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸カリウム（３０．０ｇ、２１７ｍｍｏｌ、５．３８当量）の混合物に、臭化ベンジル（３５．０ｇ、２０５ｍｍｏｌ、５．０９当量）を加え、得られた混合物を２３℃で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾過された固体をエーテル（３×２００ｍＬ）、続いて、水（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させると、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−７）が、白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３４４．２，要求値３４４．２。
【０１１３】
ｔｅｒｔ−ブチル ３−ブロモ−２−フルオロプロピルカルバメート（１−９）
ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中のＮＢＳ（２０ｇ、１１０ｍｍｏｌ、３．０当量）の懸濁液に、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（２８ｇ、１１０ｍｍｏｌ、３．０当量）を滴下した。添加が完了した後、反応混合物を１０分間撹拌し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−ヒドロキシプロピルカルバメート（１−８）（７．０ｇ、３６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液、続いて、ピリジン（３．５ｇ、４４ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。得られた混合物を、窒素下、２３℃で１６時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（１時間かけて１００％ヘキサンから１００％酢酸エチル、ニンヒドリン染色による分析）によって精製すると、ｔｅｒｔ−ブチル ３−ブロモ−２−フルオロプロピルカルバメート（１−９）が、透明なオイルとして得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８９−４．６８（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．４０（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０１１４】
ｔｅｒｔ−ブチル ３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−フルオロプロピルカルバメート（１−１０）
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−７）（８．０ｇ、２３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸セシウム（３７ｇ、１１０ｍｍｏｌ、４．９当量）の混合物に、ｔｅｒｔ−ブチル ３−ブロモ−２−フルオロプロピルカルバメート（１−９）（７．１ｇ、２７．７ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、得られた混合物を４０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（１時間かけて１００％ヘキサンから１００％酢酸エチル）によって精製すると、ｔｅｒｔ−ブチル ３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−フルオロプロピルカルバメート（１−１０）が白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５１９．２，要求値５１９．３。
【０１１５】
ｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバメート（１−１１）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）及びメタノール（１０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル ３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−フルオロプロピルカルバメート（１−１０）（０．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１当量）及び１０％炭素上パラジウム（３００ｍｇ）の混合物を、水素バルーン下、２３℃で７２時間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾液を濃縮すると、ｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバメート（１−１１）が得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４２９．２，要求値４２９．２。
【０１１６】
ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル ２−フルオロ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバメート（１−１１）（０．０８３ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１当量）及びＢｏｃ２Ｏ（０．０５ｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ＤＭＡＰ（０．００５ｇ、０．０４ｍｍｏｌ、０．２当量）を加え、得られた溶液を２３℃で３時間撹拌した。溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１時間かけて１００％ヘキサンから１００％酢酸エチル）によって精製すると、ｔｅｒｔ−ブチル５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２）が白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５２９．３，要求値５２９．３。
【０１１７】
メタノール（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２、１３０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）のラセミ混合物の溶液に、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ溶液（１０ｍＬ）を加え、得られた溶液を２３℃で１６時間撹拌した。透明なゲル沈殿物を濾過し、濾過された固体を酢酸エチルで洗浄し、水に溶解し、濃縮すると、５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オンのラセミ混合物の塩酸塩が、白色固体として得られた（１−１２ａ）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｍ，１Ｈ），４．６６（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２９．２，要求値３２９．２。
【０１１８】
ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｒ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１３）及び（２−Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｓ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１４）
ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１２）のラセミ混合物を、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ（５ｃｍ×５０ｃｍ、２０μ）プレップカラムを用い、９０ｍＬ／分で８０％ヘキサン／２０％イソプロパノール勾配を用いてその成分エナンチオマーに分割すると、ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｒ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１３）及び（２−Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル ５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−（Ｓ）−フルオロプロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシレート（１−１４）が、白色固体として得られた。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５２９．３，要求値５２９．３。
【０１１９】
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）及び５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）
分離した、メタノール（２０ｍＬ）中、５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１３）（０．６０ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）及び５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１４）（０．７０ｇ、１．３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ジオキサン中の４ＮのＨＣｌ溶液（３０ｍＬ）を加え、得られた溶液を４０℃で１６時間撹拌した。透明なゲル沈殿物を濾過し、濾過された固体を酢酸エチルで洗浄し、水に溶解し、濃縮すると、５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１５）及び５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１６）の塩酸塩が、白色固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｍ，１Ｈ），４．６６（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２９．２，要求値３２９．２。
【０１２０】
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１７）は、３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２，２−ジフルオロプロピル・トリフルオロメタンスルホネートをアルキル化剤として用い、上記の方法によって調製した。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
実施例１〜９
本発明の種々の特徴及び利点を更に説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を示す。これらの実施例は特許請求される発明を制限するものではない。
実施例１：リアルタイムＰＣＲを用いるＣＨＫ１ｓｖ１の同定
化合物の阻害特性の測定を容易にするには、ＣＨＫ１をコードするエキソン領域の「正常な」スプライシングの変異体を同定することが望ましい。特に、ＣＨＫ１のＣ末端調節ドメインの喪失をもたらす天然に存在するスプライシング変異が求められた。Ｃ末端の欠失は、ＣＨＫ１に対しより大きなキナーゼ活性を付与する（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２０００、セル（Ｃｅｌｌ）１００：６８１〜６９２頁；カツラギ（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ）及びサガタ（Ｓａｇａｔａ）、２００４、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）１５：１６８０〜１６８９頁）。エキソン２〜８は、触媒キナーゼドメインをコードし、エキソン９はリンカー領域をコードしている。ＳＱ及びＣ末端調節ドメインは、エキソン１０〜１３内に位置している（サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、１９９７、２７７：１４９７〜１５０１頁；カツラギ（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ）及びサガタ（Ｓａｇａｔａ）、２００４、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）１５：１６８０〜１６８９頁）。リアルタイムＰＣＲ実験及びＲＴ−ＰＣＲを用いて、ヒトＣＨＫ１ ｍＲＮＡの新規スプライス変異体の存在を同定し、確認した。ＣＨＫ１阻害ドメインのＣ末端切断をコードする天然に存在するスプライス変異体を、化合物の阻害特性を調べるために有用なＣＨＫ１キナーゼアッセイにおける使用のために、同定し、クローニングし、発現させ、精製した。
【０１２３】
ＲＴ−ＰＣＲ
エキソン８〜１１に相当する領域中のＣＨＫ１ ｍＲＮＡの構造を、ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを用いて、ヒト精巣から抽出したＲＮＡについて調べた。ヒト精巣から単離した全ＲＮＡはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手した。ＣＨＫ１中の参照エキソンコード配列（ＮＭ＿００１２７４）のエキソン８及びエキソン１１中の配列に対して相補的であるＲＴ−ＰＣＲプライマーを選択した。ＣＨＫ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、ＣＨＫ１エキソン８及びエキソン１１プライマーセット（本明細書において以下、ＣＨＫ１８−１１プライマーセット）は、「参照」ＣＨＫ１ ｍＲＮＡ領域に相当する４７８塩基対アンプリコンを増幅すると予想された。ＣＨＫ１８−１１プライマーセットは、エキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングを有する転写物中の３００塩基対アンプリコンを増幅すると予想された。ＣＨＫ１エキソン８フォワードプライマーは以下の配列を有する：
５’ＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＣ３’（配列番号１）；またＣＨＫ１エキソン１１リバースプライマーは以下の配列を有する：
５’ＣＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＣ３’（配列番号２）。
【０１２４】
ヒト精巣由来の全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用い、以下のサイクリング条件を用いて一段階逆転写−ＰＣＲ増幅プロトコールに付した：
１）５０℃で３０分間、
２）９５℃で１５分間、
３）９４℃で３０秒間、
６３．５℃で４０秒間、
７２℃で５０秒間、次いで、
７２℃で１０分間の３５サイクル。
【０１２５】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）は、２％アガロースゲルでサイズ分画した。２５０〜３５０塩基対アンプリコンに相当する選択した断片を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。精製したアンプリコン断片を、ＣＨＫ１８−１１プライマーセットを用いて再増幅し、これらのアンプリコンをアガロースゲルでサイズ分画した。２５０〜３５０塩基対アンプリコンに相当する断片を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。精製したアンプリコン断片を、ＣＨＫ１８−１１プライマーセットを用いてもう一度再増幅した。アガロースゲルでサイズ分画した後、２５０〜３５０塩基対アンプリコンを手作業で抽出し、精製したアンプリコン断片（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を、ＴＯＰＯ ＴＡ クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに提供される試薬及び使用説明書を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。次いで、クローンを、全部で６６００個のクローンについて、プレートあたり４４０コロニーのプールで、１５枚のプレートにプレーティングした。各プレートから、プールした４４０個のコロニーからＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲの鋳型として用いた。
【０１２６】
リアルタイムＰＣＲ／ＴＡＱｍａｎ
ＣＨＫ１参照タンパク質（ＮＰ＿００１２６５）の選択的スプライシングアイソフォームの存在を調べるために、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いた。
【０１２７】
ＣＨＫ１ｓｖ１アイソフォームを検出するために用いたＴＡＱｍａｎプライマー及びプローブは、プレセット混合物として設計し、合成されていた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。ＣＨＫ１参照型（配列番号３、４及び５）及びＣＨＫ１ｓｖ１アイソフォーム（配列番号６、７及び８）を検出するために用いたＴＡＱｍａｎプライマー及びプローブの配列を、表１に示す。スプライスジャンクション特異的プローブは、５’末端で６−ＦＡＭフルオロフォアを用いて（ＦＡＭ）、また３’末端で非蛍光クエンチャーを用いて（ＮＦＱ）標識した。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてヒト精巣ｃＤＮＡで実施した。ＴＡＱｍａｎ反応は以下を含んでいた：
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
ＴＡＱｍａｎ反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実施した。サーモサイクリング条件は５０℃で２分間、９５℃で１０分間及び９５℃を１５秒間と６０℃を１分間の４０サイクルとした。蛍光発光のデータ解析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって実施した。
【０１３０】
ＴＡＱｍａｎアッセイの結果は、１５プレートのうち１３プレートに由来するプールされたＤＮＡは、選択的エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションに相当するクローンを有すると思われるということを示した。４４０コロニーに相当する、これらの陽性プールのうちの１つに由来するＤＮＡを用いて細菌宿主細胞を形質転換した。クローンを、プレートあたり５５コロニーのプールで、全部で１２枚のプレートにプレーティングした。１２枚のプレート各々上のコロニーを再度プールし、ＴＡＱｍａｎアッセイに用いた。１２枚のプレートのうち１枚に由来するプールされたＤＮＡは、選択的エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションに相当するクローンを有すると思われた。この陽性プレート上の５５コロニーを、ＴＡＱｍａｎアッセイを用いて個々にスクリーニングし、１つのクローンを、選択的エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションを有すると同定した。次いで、この陽性クローンを、ＣＨＫ１エキソン８フォワードプライマー（配列番号１）及び配列５’ＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧ３’（配列番号９）を有する異なるエキソン１１リバースプライマーを用いて各末端から配列決定した。
【０１３１】
クローンの配列分析により、ＣＨＫ１へテロ核ＲＮＡのエキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングの予想配列とマッチするということ、すなわち、エキソン１０のコード配列が完全に存在しないということが示された。
【０１３２】
実施例２：ＣＨＫ１ｓｖ１のクローニング
リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定データは、精巣組織及びＭＯＬＴ−４及びダウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞株では、ＣＨＫ１タンパク質、ＮＰ＿００１２６５をコードする正常なＣＨＫ１参照ｍＲＮＡ配列、ＮＭ＿００１２７４の他に、ＣＨＫ１ ｍＲＮＡの新規のスプライス変異体型も存在するということを示す。
【０１３３】
実施例１において同定されたＣＨＫ１ｓｖ１スプライス変異体を含むヌクレオチド配列を有するクローンを、酵母において組換え媒介性プラスミド構築物を用いて単離した。２種のプライマー対のセットを用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１の全ｍＲＮＡコード配列を増幅し、クローニングした。ＣＨＫ１ｓｖ１の場合には、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析により、このスプライス変異体型の転写物は極めて低いレベルで存在するということが示された。ＣＨＫ１ｓｖ１をクローニングするために、参照ＣＨＫ１（ＮＭ＿００１２７４）のコード配列を含むクローンを、所望のエキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションを生じるよう設計された８０塩基対リンカーを用いて、酵母における更なる組換えステップによって変更した。
【０１３４】
ＣＨＫ１ｓｖ１に対応する全長クローンを単離するために、５’「フォワード」プライマー及び３’「リバース」プライマーを設計した。５’「フォワード」ＣＨＫ１ｓｖ１プライマーを、５’ＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴ３’（配列番号１０）というヌクレオチド配列を有するよう、またＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）のエキソン２と相補的である配列を有するよう設計した。３’「リバース」ＣＨＫ１ｓｖ１プライマーは、５’ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧ３’（配列番号１１）というヌクレオチド配列を有するよう、またＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）のエキソン１１と相補的である配列を有するよう設計した。イタリック体で示したプライマー配列の５’末端の４０ヌクレオチドは、ＰＣＲアンプリコンに組み込まれ、その後の酵母におけるプラスミド組換え事象を容易にする「テール」である。これらのＣＨＫ１ｓｖ１「フォワード」及び「リバース」プライマーは、参照ＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）のコード配列を増幅すると予測され、次いで、これをその後の組換えクローニングステップにおいて用い、ＣＨＫ１ｓｖ１特異的配列を作製した。
【０１３５】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＣＨＫ１ｓｖ１ ｃＤＮＡ配列を、逆転写（ＲＴ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の組合せを用いてクローニングした。より詳しくは、約２５ｎｇのＭＯＬＴ−４細胞株ｍＲＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、スーパースクリプトＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びオリゴｄ（Ｔ）プライマー（ＲＥＳＧＥＮ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を用い、スーパースクリプトＩＩ製造業者の使用説明書に従って逆転写した。ＰＣＲのために、４０μｌの水、５μｌの１０×バッファー、１μｌのｄＮＴＰ及び１μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキットから得た酵素に、１μｌの完了したＲＴ反応物を加えた。ＰＣＲは、ＣＨＫ１ｓｖ１のＣＨＫ１ｓｖ１「フォワード」及び「リバース」プライマー（配列番号１０、１１）を用いて、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実施した。最初の９４℃、１分間の変性の後、９４℃で３０秒間の変性と、それに続く、６３．５℃で４０秒間のアニーリング及び７２℃で５０秒間の合成を用いて、３５サイクルの増幅を実施した。３５サイクルのＰＣＲに、７２℃で１０分間の伸長を続けた。次いで、５０μｌの反応物を４℃に冷却した。得られた反応生成物の１０μｌを１％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕｌｔｒａ ｐｕｒｅ）ゲルに流し、０．３μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）で染色した。ゲル中の核酸バンドを可視化し、ＵＶ光ボックス上で撮影し、予想される大きさの生成物、ＣＨＫ１ ｍＲＮＡの場合には、約１２４３塩基対の生成物がＰＣＲによって生じたかどうかを調べた。ＭＯＬＴ−４細胞由来の５０μｌのＰＣＲ反応物の残部を、ＱＩＡｑｕｉｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、キットとともに提供されるＱＩＡｑｕｉｋ ＰＣＲ精製プロトコールに従って精製した。精製プロトコールから得られた約５０μｌの生成物を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ４００（同様にＳａｖａｎｔ製）に取り付けたＳｐｅｅｄ Ｖａｃ Ｐｌｕｓ（ＳＣ１１０Ａ、Ｓａｖａｎｔ、Ｈｏｌｂｒｏｏｋ、ＮＹ製）中で、中程度に加熱し、約３０分間乾燥することによって約６μｌに濃縮した。
【０１３６】
ＣＨＫ１ｓｖ１全長クローンのクローニング及び組み立て並びに酵母形質転換
酵母における相同組換えクローニングによる全長ＣＨＫ１ｓｖ１クローンの組み立てを、レイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）ら（２００２、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２：１９０〜１９７頁）によって先に記載されたものと類似のシクロヘキシミドベースの対抗選択スキームを用いて実施した。
【０１３７】
上記に記載されるＣＨＫ１ｓｖ１フォワード及びリバース「テイルド」プライマーを用いて製造した、１２４３塩基対のＣＨＫ１アンプリコンと、発現ベクターの間の相同組換えによる、全長ＣＨＫ１ｓｖ１全長クローンの組み立てを、これらの部分の酵母細胞への同時形質転換によって実施した。８０塩基対オリゴヌクレオチドリンカーを用いるその後の組換えステップによって、ＣＨＫ１ｓｖ１エキソン９からエキソン１１へのスプライスジャンクションを作製した。以下の段落において記載されるすべての酵母形質転換ステップは、エレクトロポレーションによって実施した（レイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）ら、２００２年ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２：１９０〜１９７頁）。
【０１３８】
１μｇの１２４３塩基対のＣＨＫ１精製アンプリコンを、１００μｌの酵母株ＣＭＹ１−５（Ｍａｔα、ＵＲＡ３Δ、ＣＹＨ２Ｒ）の同時形質転換によって、１００ｎｇのＳｒｆＩ消化したｐＣＭＲ１１に直接クローニングした。１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＵｒａ欠乏培地プレートで、Ｕｒａ＋、シクロヘキシミド耐性コロニーを選択した。標準酵母培地を用いた（Ｓｈｅｒｍａｎ、１９９１、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１９４：３〜２１頁）。ＣＨＫ１クローンを含む酵母細胞培養物から得た全ＤＮＡを用いて、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）及びウィンストン（Ｗｉｎｓｔｏｎ）（１９８７年ジーン（Ｇｅｎｅ）５７：２６７〜７２頁）に記載の通り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）耐性に形質転換し、大量の組換えプラスミドを調製した。プレートからコロニーを選び取って、２ｍｌの２×ＬＢ培地に入れた。これらの液体培養物を、３７℃で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）Ｑｉａｑｕｉｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
ＣＨＫ１ｓｖ１クローンを構築するために、１μｇの、エキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングの領域にまたがる表３に示される８０塩基対リンカー（配列番号１２、１３）と、１００ｎｇのＢａｍＨＩ消化したＣＨＫ１／ｐＣＭＲ１１クローンを用いて、１００μｌのシクロヘキシミド感受性酵母株を同時形質転換した。リンカーとＣＨＫ１／ｐＣＭＲ１１クローン間で重複するＤＮＡのために、ほとんどの酵母形質転換体が正しく組み立てられた構築物を有することとなる。その後の調製及び大腸菌の形質転換のために、Ｕｒａ＋、シクロヘキシミド耐性コロニーを選択した。大腸菌から抽出したプラスミドＤＮＡを、制限消化によって分析し、ＣＨＫ１ｓｖ１クローンにおいてエキソン９からエキソン１１への選択的スプライシングの存在を確認した。８個のＣＨＫ１ｓｖ１クローンを配列決定して、同一性を確認し、適当な配列を有するクローンを、複数の系におけるタンパク質発現に用いた。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
ＣＨＫ１ｓｖ１ポリヌクレオチドの概要
ＣＨＫ１ｓｖ１ ｍＲＮＡのポリヌクレオチドコード配列（配列番号１４）は、参照ＣＨＫ１タンパク質（ＮＰ＿００１２６５）と類似するが、参照ＣＨＫ１ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２７４）の全長コード配列のエキソン１０に相当する１７８塩基対領域によってコードされるアミノ酸を欠く、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質（配列番号１５）をコードするオープンリーディングフレームを含む。１７８塩基対領域の欠失は、参照ＣＨＫ１タンパク質リーディングフレームと比較して、タンパク質翻訳リーディングフレームのシフトをもたらし、ＣＨＫ１ｓｖ１に特有のカルボキシ末端ペプチド領域が生じる（配列番号１５中、イタリック体で示される）。また、フレームシフトによって、エキソン９／エキソン１１スプライスジャンクションの２９ヌクレオチド下流に未熟な終結コドンも生じる。したがって、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質は、参照ＣＨＫ１（ＮＰ＿００１２６５）と比較して、エキソン１０によってコードされるアミノ酸領域に相当する内部の５９アミノ酸領域を失っており、また、未熟な停止コドンの下流のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸も欠いている。エキソン１０は、ＣＨＫ１のＳＱ／ＴＱドメインをコードしており、エキソン１１〜１３は自己抑制的領域をコードしている（サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、１９９７、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７７：１４９７〜１５０１頁；カツラギ（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ）及びサガタ（Ｓａｇａｔａ）、２００４年、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ）１５：１６８０〜１６８９頁）。自己抑制的領域の欠失は、ＣＨＫ１キナーゼドメインに構成的な活性を付与するが、ＳＱ／ＴＱドメインも除去される場合には、ＣＨＫ１酵素活性は低下する（ング（Ｎｇ）ら、２００４、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２７９：８８０８〜８８１９頁）。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
実施例３：ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質の発現
バキュロウイルス遺伝子発現ベクター系では、安価であり、維持するのが容易である、タンパク質発現昆虫細胞を使用できる。産生されるタンパク質は、哺乳類細胞におけるものと類似の質のものである（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８８、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１０：４５７〜４６５頁；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８９、バイオエッセイズ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ）１１：９１〜９５頁）。昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現ベクターを用いるタンパク質法発現は、当該技術分野で公知であり、オーライリ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｉｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年及びバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター・システム・インストラクション・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｉｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）、第６版、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９に論じられている。
【０１４５】
昆虫細胞発現のためのＣＨＫ１ｓｖ１のクローニング
ＣＨＫ１ｓｖ１／バキュロウイルストランスファーベクター構築物を作製するために、ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＣＭＲ１１クローン（実施例２参照のこと）をＰＣＲの鋳型として用い、表５に列挙されるプライマー（配列番号１６、１７）を用いてＣＨＫ１ｓｖ１のコード配列（配列番号１４）を増幅した。配列番号１６によって表されるプライマーは、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に最適翻訳開始配列と、アンプリコンに組み込まれるようになる上流ＥｃｏＲＩ制限部位とを含む。配列番号１７によって表されるプライマーは、ＣＨＫ１ｓｖ１コード配列のＣ末端に６個のヒスチジン残基をコードする配列並びにＣＨＫ１ｓｖ１アンプリコンに組み込まれるようになるＥａｇＩ制限部位とを含む。ＣＨＫ１ｓｖ１アンプリコンを、１％アガロースゲルに流した。予想した大きさの選択したアンプリコン断片、ＣＨＫ１ｓｖ１の場合には、約９９４塩基対の産物を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。精製したアンプリコン断片をＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで消化した。ＥｃｏＲＩ／ＥａｇＩ消化したアンプリコンを、ＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化しておいたバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にライゲーションした。次いで、ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＶＬ１３９３構築物を、大腸菌株ＤＨ５αに形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから抽出し、選択したプラスミドＤＮＡを配列決定して同一性を確認し、適当な配列を有するクローンを、昆虫細胞におけるタンパク質発現に用いた。
【０１４６】
【表６】
【０１４７】
ＣＨＫ１ｓｖ１の昆虫細胞発現
ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＶＬ１３９３構築物を、直線化されたＡｃＮＰＶ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに、ＳＦ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に同時トランスフェクトした。個々の組換えウイルスをエンドポイント希釈によって選択した。ウイルスクローンを増幅し、高力価原液を得た。これらのウイルス保存液を、小規模ＳＦ９培養におけるタンパク質発現試験に用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１組換えタンパク質の産生を確認した。トランスフェクトされたＳＦ９細胞溶解物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質発現について分析した。ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質を、クマシー染色によってか、抗ＣＨＫ１抗体（Ｇ４抗体；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ）を用いるウエスタンブロッティングによって可視化した。発現に基づいて、個々のウイルスを、大規模ＣＨＫ１ｓｖ１発現のために選択した。リットル規模での組換えタンパク質発現には、ＳＦ９懸濁培養物を、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０１血清不含培地（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）において２７℃で増殖させ、組換えウイルス保存液を用い、０．３ウイルス／細胞という多重感染度を用いて感染させた。ウイルストランスフェクションの７２時間後、感染したＳＦ９培養物を回収し、遠心分離によってペレットにした。ペレットは−７０℃で保存した。
【０１４８】
ＣＨＫ１ｓｖ１組換えタンパク質の精製
昆虫細胞ペレットを、１μＭのミクロシスチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０μＭのシペルメトリン（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１個の錠剤／５０ｍｌの溶解バッファー）を含有するＢ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて溶解した。タンパク質精製の際のすべての操作は、４℃で実施した。細胞は溶解バッファーに再懸濁し、４５分間撹拌した。次いで、ＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を、２００Ｕ／ｍｌという最終濃度に加え、細胞懸濁液を更に３０分間撹拌した。溶解した細胞懸濁液を、３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。溶解上清をデカントし、３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。清澄化された上清各１０ｍｌにつき、１ｍｌの総容積のＴａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を加え、細胞懸濁液を４５分間撹拌した。親和性樹脂／溶解物懸濁液を、５０００ｇで３分間遠心分離し、次いで、上清を廃棄した。親和性樹脂を、５×容積の樹脂を用いて、４×バッファーＡ（５０μＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；２５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。洗浄した樹脂を、バッファーＡ中に２×スラリーとして再懸濁し、クロマトグラフィーカラムに充填した。樹脂を充填したカラムを、６×総容積のバッファーＡで洗浄した。ＣＨＫ１ｓｖ１−Ｈｉｓタグを付けたタンパク質を、バッファーＡ中イミダゾールの段階的な勾配を用いてカラムから溶出する。２×総容積画分中のイミダゾール濃度は、５、１０、２０、３０、４０、５０及び６０ｍＭとした。溶出画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ、３０，０００ Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて濃縮した。濃縮した酵素画分を、グリセロールで５０％希釈し、−２０℃で保存した。画分を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに続くクマシー染色及び抗ＣＨＫ１抗体（Ｇ４抗体； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ）を用いるウエスタンブロッティングを用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１−Ｈｉｓ−タグを付けたタンパク質の存在について分析した。カラム画分のＣＨＫ１ｓｖ１キナーゼ活性は、以下の項に記載されるキナーゼアッセイを用いて調べた。
【０１４９】
実施例４：ＣＨＫ１ｓｖ１キナーゼアッセイ
ＣＨＫ１ｓｖ１活性を、合成ペプチド基質を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした。ホスホペプチド産物を、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ系を用いて定量した（Ｐａｒｋら、１９９９年、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６９：９４〜１０４頁）。反応混合物は、４０μｌという最終容量中、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；２ｍＭ ジチオトレイトール；０．１％ ＢＳＡ；０．１ｍＭ ＡＴＰ；０．５μＭ ペプチド基質及び０．１ｎＭ ＣＨＫ１ｓｖ１酵素を含んでいた。ペプチド基質はアミノ酸配列アミノ末端−ＧＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧ−カルボキシ末端（ＳｙｎＰｅｐ、Ｄｕｂｌｉｎ ＣＡ）（配列番号１８）を有し、Ｎ末端でビオチン化されている。キナーゼ反応物を、２２℃で３０分間インキュベートし、次いで、６０μｌの停止／検出バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１．２５％ ＢＳＡ；２５０ｎＭ ＰｈｙｃｏＬｉｎｋストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）及び０．７５ｎＭの、ユウロピウム−キレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で標識したＧＳＫ３α抗ホスホセリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；カタログ番号９３３８））を用いて終結させた。反応物を２２℃で２時間平衡にさせ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で相対蛍光単位を読み取った。上記の反応物において阻害化合物をアッセイし、化合物ＩＣ５０を調べた。１μＬの、ＤＭＳＯに溶解した化合物を、各４０μＬの反応物に、１ｎＭ〜１００μＭの範囲に及ぶ１／２ｌｏｇ希釈系列で加えた。ＨＴＲＦ蛍光単位として読み取られる、相対リン酸基質（ｐｈｏｓｐｈｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）形成を、化合物濃度範囲にかけて測定し、４パラメータシグモイドフィットを用いて滴定曲線を作製した。
【０１５０】
本発明の特定の化合物を、上記のアッセイにおいて試験し、基質に対して≦５０μＭのＩＣ５０を有することがわかった。
【０１５１】
実施例５：細胞におけるＣＨＫ１自己リン酸化の阻害
阻害化合物を、そのＣＨＫ１を細胞において阻害する能力について、ＤＮＡ損傷に応じたＣＨＫ１自己リン酸化をモニターすることによってアッセイする。Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を培養培地：１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×非必須アミノ酸及びペニシリン−ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０で増殖させる。Ｔ−７５フラスコから得られた細胞をプールし、計数し、２ｍｌ培地中、２００，０００個／ウェルで６ウェルディッシュに播種し、インキュベートする。各ウェルにＤＭＳＯ中の化合物の段階希釈系列及びＤＭＳＯ対照を、ＤＭＳＯ中の１０００×作業ストックから加え、３７℃で２時間インキュベートする。２時間のインキュベート期間の後、１００ｎＭカンプトテシン（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＰＢＳ中の２００×作業ストックからすべての薬物処理細胞（高用量ウェルの１つを除く）及び１つのＤＭＳＯ対照ウェルに加える。カンプトテシンとともに４時間インキュベートした後、各ウェルを、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、各ウェルに３００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、０．５μＭ Ｎａ３ＶＯ４及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリート−ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を加えた。プレートを４℃で１０〜１５分間振盪し、次いで、溶解物を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、−８０℃で凍結する。溶解物を氷上で解凍し、１５，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化し、上清をきれいな管に移す。
【０１５２】
サンプル（２０μＬ）を、５μＬの５×サンプルローディングバッファーを加えることと、１００℃で５分間加熱変性させることとによってゲル電気泳動用に調製する。サンプルをＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）中で電気泳動し、タンパク質をＰＶＤＦ上にトランスファーする。次いで、ブロットを、ＴＢＳ中３％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、ホスホ−Ｓｅｒ−２９６ＣＨＫ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−カタログ番号２３４６）に対する抗体を用いて探索する。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ヤギ抗ウサギＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ−カタログ番号１１１−０３５−０４６）を用いて結合している抗体を可視化し、化学発光を増強する（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．７、２％ＳＤＳ及び１００μＭの２−メルカプトエタノール中、５５℃で３０分間インキュベートすることによって一次抗体セットを取り除いた後、ブロットを、ＣＨＫ１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、カタログ番号ＳＣ−８４０８）を用いて全ＣＨＫ１について再探索する。ＣＨＫ１モノクローナルは、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合しているヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、カタログ番号ＮＡ９３１）を用いて検出し、化学発光を増強する（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ＥＣＬに曝されたフィルムをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて特定のバンドの強度を定量化する。滴定は、全ＣＨＫ１に対して標準化されたホスホ−ＣＨＫ１（Ｓｅｒ２９６）シグナルのレベルについて評価し、ＩＣ５０値を算出する。
【０１５３】
実施例６：チェックポイント回避アッセイにおける阻害剤の機能活性
ＤＮＡ損傷停止
細胞におけるＣＨＫ１阻害剤の機能活性を測定するために、化合物を、ＤＮＡ損傷誘導性細胞周期停止を抑止するその能力についてアッセイする。このアッセイでは、ＤＮＡ損傷剤カンプトテシンによって引き起こされた細胞周期停止後にＭ相に入っている細胞の量の指標として細胞ホスホ−ヌクレオリンレベルを調べる。
【０１５４】
Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）を、５０００個細胞／ウェルという密度で、１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ６４０培地に播種する。５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした後、カンプトテシンを２００ｎＭという最終濃度に加え、１６時間インキュベートする。等容積の、増殖培地及び２００ｎＭカンプトテシン及び３３２ｎＭノコドゾール（ｎｏｃｏｄｏｚｏｌｅ）（最終濃度：５０ｎｇ／ｍｌ）中の試験化合物段階希釈系列を加え、３７℃でのインキュベーションを８時間続ける。培地をウェルから除去し、５０μＬの溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、１×プロテナーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）、１μｌ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、３００μＭバナジン酸ナトリウム、１μＭミクロシスチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加える。溶解バッファーを含むプレートを４℃で３０分間振盪し、２０分間凍結する（−７０℃）。ＩＧＥＮ Ｏｒｉｇｅｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、細胞溶解物中のホスホヌクレオリンのレベルを測定する。
【０１５５】
細胞溶解物中のホスホヌクレオリンの検出
４Ｅ２抗ヌクレオリン抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）を、Ｏｒｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．）を用い、製造業者によって記載されたプロトコールを用いてビオチン化した。ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、ルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）キット（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．；カタログ番号１１００３４）を用い、製造業者によって記載されたプロトコールに従ってルテニウム化した（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）。９６ウェルプレートの各ウェルに、２５μＬの細胞溶解物（上記）とともに、２５μＬの、２μｇ／ｍｌのビオチン化４Ｅ２抗ヌクレオリン抗体及び０．４ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンコートした常磁性ダイナビーズ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐ．）を含有する抗体バッファー（リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２、１％ウシ血清アルブミン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を加える。抗体及び溶解物を、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。次いで、溶解物ミックスの各ウェルに、５０μＬという容積の抗体バッファー（上記）中の５０ｎｇの抗ホスホヌクレオリンＴＧ３抗体（Ａｐｐｌｉｅｄ ＮｅｕｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を加え、インキュベーションを室温で３０分間続ける。最後に、各ウェルに、２５μｌの、抗体バッファー中のルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）ヤギ抗マウス抗体の２４０ｎｇ／ｍｌ溶液を加え、インキュベーションを室温で３時間続ける。溶解物抗体混合物を、ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｍ−シリーズＭ８アナライザーで読み取り、ホスホル−ヌクレオリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）の増大に依存性の化合物のＥＣ５０を調べる。
【０１５６】
実施例７：その他の生物学的アッセイ
ＣＨＫ１発現及び精製：組換えヒトＣＨＫ１は、標準バキュロウイルスベクター及びＧＩＢＣＯ（商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入する（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標））昆虫細胞発現系を用いて、アミノ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＨＫ１）として発現させることができる。昆虫細胞において発現された組換えタンパク質は、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、製造業者によって記載された標準手順を用いて精製できる。
【０１５７】
ＣＨＫ１蛍光偏光アッセイ：ＣＨＫ１キナーゼ阻害剤は、キナーゼ活性をモニターするための蛍光偏光を用いて同定できる。このアッセイでは、１０ｎＭ ＧＳＴ−ＣＨＫ１を用い、５ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、１μＭ アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、２ｍＭ １，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール（ＤＴＴ）、１μＭペプチド基質（ビオチン−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号１９）、１０ｎＭペプチド基質トレーサー（蛍光−ＧＳＲＲＰ−ｐＳ−ＹＲＫＩ−遊離酸）（ｐＳ＝リン酸化−セリン）（配列番号２０）、６０ｎｇの、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した粗マウス腹水からプロテインＧセファロースで精製された抗ホスホＣＲＥＢ（Ｓ１３３）マウスモノクローナルＩｇＧ、４％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３０μＭ阻害化合物を含む。反応物を室温で１４０分間インキュベートし、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の添加によって終結させる。停止した反応物を室温で１２０分間インキュベートし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ／ＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を標準蛍光設定で用いて蛍光偏光値を調べる。
【０１５８】
ＣＨＫ１ ＳＰＡ濾過アッセイ：アッセイ（２５μ．）は、１０ｎＭ ＧＳＴ−ＣＨＫ１、１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、１μＭペプチド基質（ビオチン−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号１９）、１μＭ ＡＴＰ、０．１μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、ＮＥＮ）を含み、室温で９０分間反応させる。５５μｌの、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、６．９ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍｇシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水の添加によって反応を終結させる。ペプチド基質をビーズと室温で１０分間結合させ、続いて、Ｐａｃｋａｒｄ ＧＦ／Ｂ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート上で濾過し、リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄する。乾燥させたプレートを、Ｔｏｐｓｅａｌ（商標）（ＮＥＮ）で密閉し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）シンチレーションカウンターを用い、３３Ｐについての標準設定で、ペプチド基質に組み込まれた３３Ｐ。
【０１５９】
ＣＨＫ１ ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）キナーゼアッセイ：アッセイ（２５μｌ）は、８．７ＧＳＴ−ＣＨＫ１、１０ｍＭ ＭＥＳ、０．１ｍＭ エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、３μＭペプチド基質（ビオチン−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号１９）、１μＭ ＡＴＰ、０．４μＣｉ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ（ＮＥＮ）及び４％ＤＭＳＯを含む。反応物を室温で３０分間インキュベートし、５０μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて終結させる。９０μｌの反応物をストレプトアビジンコートされたＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ（登録商標）（ＮＥＮ）に移し、室温で１時間インキュベートする。プレートを０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。プレートを乾燥させ、Ｔｏｐｓｅａｌ（商標）（ＮＥＮ）で密閉し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）ＮＸＴ（商標）シンチレーションカウンターを用い、標準設定で、ペプチド基質中に組み込まれた３３Ｐの量を測定する。
【０１６０】
ＣＨＫ１ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）キナーゼアッセイ：アッセイ（２５μｌ）は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、２０％グリセロール、５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ（登録商標）２０、１μＭペプチド基質（ビオチン−ＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮ−アミド）（配列番号２１）、２ｍＭ ＤＴＴ、４％ＤＭＳＯ、１２．５μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する６．４ｍＭ ＧＳＴ−ＣＨＫ１を用い、室温で３０分間反応させる。１％ＢＳＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１００ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００μｌ停止バッファーを用いて反応を終結させる。停止された反応物（１００μｌ）を、９６ウェルニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に移し、３０分間の室温インキュベーションの間にビオチンペプチド基質を捕獲する。ウェルを洗浄し、２１．５ｎｇ／ｍｌの、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）製の抗ホスホ−Ｓｅｒ２１６−Ｃｄｃ２５ｃウサギポリクローナル抗体及び２９２ｎｇ／ｍｌのユウロピウム標識抗ウサギ−ＩｇＧを含有するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ａｓｓａｙバッファー１００μｌと室温で１時間反応させる。ウェルを洗浄し、ユウロピウムがＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液（１００μｌ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ）の添加によって結合している抗体から放出され、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（商標）を用い、標準の製造業者の設定を用いて検出する。
【０１６１】
本発明の化合物は、上記のＣＨＫ１ ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）キナーゼアッセイで試験できる。
【０１６２】
ＷＳＴアッセイ：ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６（５０００個細胞／ウェル）又はその他の細胞を、９６ウェル透明底プレートに直線的増殖曲線を提供する密度で７２時間かけて播種する。細胞を、適当な培地で滅菌条件下で培養するが、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６については、この培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するマッコイ５Ａである。細胞の最初の播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で１７〜２４時間インキュベートし、その時点で、適当なＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、５−フルオロウラシル及びエトポシド）を、４８時間以内に少なくとも８０％の細胞死を引き起こすことができる点まで漸増濃度で加える。すべてのＤＮＡ損傷剤及び化合物添加物の最終容積は、２５μｌとする。アッセイは、＜１％のＤＭＳＯ最終を含む。ＤＮＡ損傷剤の添加と同時に、ＣＨＫ１阻害化合物を、各ＤＮＡ損傷剤滴定に対して固定濃度で加え、細胞死の増強を観察する。上記の条件下での細胞生存力／細胞死を、ＤＮＡ損傷及びＣＨＫ１阻害化合物添加の４７時間後に、ＷＳＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ）の添加によって、製造業者に従って調べ、３７℃、５％ＣＯ２で３．５時間又は２．５時間インキュベーションした後にＯＤ４５０を測定する。
【０１６３】
本発明の化合物は、上記のアッセイで試験できる。
【０１６４】
実施例８：その他の生物学的アッセイ
本化合物の生物活性を調べるために利用できるその他のアッセイとして、以下の刊行物に見られるアッセイが挙げられる：ＷＯ０４／０８０９７３、ＷＯ０２／０７０４９４及びＷＯ０３／１０１４４４。
【０１６５】
実施例９：血圧アッセイ
このアッセイは、覚醒ラットにおける化合物のｉ．ｖ．注入の間の血圧（ＢＰ）及び心拍数（ＨＲ）の急性変化を評価するために設計されている。ビヒクルに続いて、３種の化合物濃度を、用量上昇プロトコールにおいて２５μｌ／分という速度で２０分間各々注入する。薬物レベル測定のために各注入（２０分間）の最後に血液サンプルを得、各注入の少なくとも３分の間（１７〜２０分間）ＢＰ及びＨＲを分析する。
【０１６６】
本発明の特定の化合物を上記のアッセイにおいて試験した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
［式中、
Ｒ１は独立してＨ及びＦから選択され、ここで、Ｒ１の少なくとも１個はＦである］
で示される化合物又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体。
【請求項２】
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン、
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン若しくは
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン
である、請求項１に記載の化合物又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体。
【請求項３】
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン若しくは
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン
である、請求項１に記載の化合物のＨＣｌ塩又はその立体異性体。
【請求項４】
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン
である、請求項１に記載の化合物のＴＦＡ塩又はその立体異性体。
【請求項５】
医薬担体と、担体に分散されている治療上有効な量の請求項１に記載の化合物とを含む医薬組成物。
【請求項６】
がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療又は予防において有用な医薬の調製のための請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
［式中、
Ｒ１は独立してＨ及びＦから選択され、ここで、Ｒ１の少なくとも１個はＦである］
で示される化合物又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体。
【請求項２】
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン、
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン若しくは
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン
である、請求項１に記載の化合物又はその医薬的に許容され得る塩若しくは立体異性体。
【請求項３】
５−（３−アミノ−２−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン、
５−（３−アミノ−２−（Ｒ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン若しくは
５−（３−アミノ−２−（Ｓ）−フルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン
である、請求項１に記載の化合物のＨＣｌ塩又はその立体異性体。
【請求項４】
５−（３−アミノ−２，２−ジフルオロプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン
である、請求項１に記載の化合物のＴＦＡ塩又はその立体異性体。
【請求項５】
医薬担体と、担体に分散されている治療上有効な量の請求項１に記載の化合物とを含む医薬組成物。
【請求項６】
がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療又は予防において有用な医薬の調製のための請求項１に記載の化合物の使用。
【公表番号】特表２００９−５２２３５９（Ｐ２００９−５２２３５９Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４９５１０（Ｐ２００８−５４９５１０）
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９５０６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１５７２
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９５０６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１５７２
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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