ドーパミン神経細胞の分離方法
【課題】ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞の有効な分離方法を提供する。
【解決手段】ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：(a)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；(b)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；(c)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、のいずれかで特徴づけられる細胞を分離する。
【解決手段】ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：(a)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；(b)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；(c)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、のいずれかで特徴づけられる細胞を分離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、ドーパミン神経細胞が減少した病態脳のドーパミン神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる、ドーパミン神経細胞のみに分化させられるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を生み出す細胞を分離する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明にある細胞は、増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞であり、それ自身（増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞）とドーパミン神経細胞を生み出す。増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞を、シャーレ内で増殖させることにより、ドーパミン神経細胞が減少した病態脳のドーパミン神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる移植細胞を準備できる。中脳大脳基底核領域のドーパミン神経細胞が減少したパーキンソン病の治療を行う治療行為を可能にする移植用細胞を準備する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の神経細胞には興奮性の神経細胞と抑制性の神経細胞がある。また同二種類の神経細胞以外に、反応は遅いが両方向性に神経細胞の活動を調節し神経細胞の様々な活動を促進する物質、例えばドーパミンを放出する神経細胞も含まれている。しかしながら時として、ドーパミン神経細胞の活性が落ち、死滅していくことがある。ドーパミン神経細胞が減少すると随意運動機能障害が生じる。その治療法として、初期であるならば、ドーパミンの前駆物質であるL-dopaを経口投与することにより、残存しているドーパミン神経細胞により多くのドーパミンを合成させて、一時的に症状を緩和することができる。しかし、L-dopa投与による効果を維持するためには日々増量しなければならなくなり、ドーパミン神経細胞死が進めば、どの様に多量のL-dopaを投与してもまったく効果が無くなる。このような経過を辿って患者は感染症及び合併症を併発して死に至る。現在のところ完全治癒させる治療法は無く、将来的に、細胞移植により失われたドーパンミン神経細胞を補う治療法に期待が寄せられている。
【０００３】
しかし、これまで脳は再生しないと考え続けられてきたために、移植用に使う細胞を準備するすべが無かった。その様な中、中枢神経系でも生涯神経細胞産生が続いていることが知られるようになり、患者の脳内から神経幹細胞を取り出して増殖させて移植に使おうという考えも出された。また、患者自身の神経幹細胞を刺激して、脱落した神経細胞を再生させよう言う気運も高まっている。しかし患者から十分量の神経幹細胞取り出すことは難しく、内在性の神経幹細胞を刺激して増殖させることは、広範な領域の神経幹細胞の増殖を招き、脳腫瘍の発生頻度を著しく上昇させる可能性がある。また再生医療によく用いられているES細胞から、神経幹細胞や神経細胞を産生して移植に使おうとする試みもあるが、移植細胞へES細胞が混入することによるteratoma（奇形腫）が生じる危険性や、神経幹細胞や星状膠細胞が混入することによるグリア瘢痕の形成が絶えず危惧される。また現在の技術では、神経細胞のみをセルソーターで分離して移植しても、大半の移植神経細胞は、ソート時の損傷により死滅して移植部位に炎症反応を引き起こし、生き残っていた神経細胞も炎症反応で死滅してしまい、有効な結果がなかなか得られていないのが現実である。
【０００４】
なお、ドーパミン作動性ニューロンを分離する方法としては、特許文献１が知られている。この特許文献１は、ドーパミン作動性ニューロンで発現する遺伝子（例えばtyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現させ、蛍光を発する細胞を細胞集団から分離する方法を開示している。
【０００５】
また、この出願の発明に深く関連する他の刊行物を以下に挙げる。
【特許文献１】特開2002-51775
【特許文献２】国際公開WO2004/058965号パンフレット
【特許文献３】国際公開WO2005/095588号パンフレット
【特許文献４】特開2002-51775
【非特許文献１】Wu SX, Goebbels S, Nakamura K, Nakamura K, Kometani K, Minato N, Kaneko T, Nave KA, Tamamaki N, Pyramidal neurons of upper cortical layers generated by NEX-positive progenitor cells in the subventricular zone. PNAS 2005,102(47):17172-17177.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の方法は、ドーパミン作動性ニューロンとして、その前駆細胞（ドーパミン神経細胞にのみ分化する細胞）を単離することも含んでいる。しかしながら、この特許文献１の方法では、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来るドーパミン神経前駆細胞を効率よく分離することは困難である。
【０００７】
この出願は、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞の有効な分離方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願は、前記の課題を解決するために、この出願では、
ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞を提供する。
【０００９】
またこの出願は、前記の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
さらに、前記の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
さらにまた、前記の細胞を主に含む細胞集団を分離方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
またさらに、前記各方法では、工程(a)において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製することを好ましい態様とする。あるはまた、工程(a)において、ドナーのドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製することを別の好ましい態様とする。
【００１３】
そしてさらに、前記の胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来であり、哺乳動物がヒトであること、前記ドナーが哺乳動物であり、哺乳動物がヒトであることをそれぞれ好ましい態様とする。
【００１４】
さらには、前記各発明においては、ステップ(d)で分離した細胞をレシピエントに移植することを含むことを好ましい態様としている。
【００１５】
この出願はまた、前記の細胞（ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞）を得るために試用する試薬および細胞のキットを提供する。
【００１６】
なお、この発明において、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞は、それ自体を細胞増殖により生み出す細胞である。分裂により生じた娘細胞は、生体内で「ドーパミン神経細胞」へと分化する場合も、「それ自体」に留まる場合もあること意味する。
【発明の効果】
【００１７】
これまで、胚性幹細胞や神経幹細胞の培養条件を調節することで、ドーパミン神経細胞を始め様々な細胞が誘導されてきた。しかし何れの条件でも、単一種の細胞のみを産生する系はなく、治療に用いる前に再度の分離が必要となり、細胞活性を損なうこととなっていた。この出願の発明によって、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞が純度高く得られる。ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞はTH陽性であり、脳内ではTH陽性細胞はドーパミン神経細胞とノルアドレナリン神経細胞だけであり、ノルアドレナリン神経細胞も移植すると、パーキンソン病症状を軽減することを考えると、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を分離して培養することにより、ドーパミン神経細胞の欠落を補う、ES細胞の混入の無い安全な移植細胞を生み出す系が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本願発明者らは、生体内での神経細胞産生過程を調べることにより、胎児脳の実質内には神経細胞に運命が決まっているが尚増殖を続け神経細胞を生み出すintermediate neuron progenitorというこれまでにまったく知られていなかった細胞分化の中間状態に有る細胞が存在すること発見した(特許文献２−３、非特許文献１)。 Intermediate neuron progenitorにはGABA神経細胞ばかりを生み出すものや（特許文献２）、興奮性神経細胞ばかりを生み出すものがあり（特許文献２）、それぞれを特徴付ける遺伝子のプロモーター活性を利用して蛍光蛋白を発現させることによりセルソーターを利用して選別することができる。セルソーターで選別すると、上でも述べたように、頻繁に細胞に傷がついてしまうが、Intermediate neuron progenitorの場合は、回復させるために一時的に培養増殖させても、また十分な数を得るために長く培養増殖させても、適切な培養条件を整えることで他の種の細胞が生じることが無いと考えられる。それ故、teratomaを引き起こすES細胞の混入がないことを確認してからIntermediate neuron progenitorを培養することで、乃至は培養してから混入の有無を確認することで、安全な移植用細胞が安定して得られる可能性がある。
【００１９】
Intermediate neuron progenitorは生体内のみで見られるものではなく、ES細胞や神経幹細胞を培養する際に適切な培養条件を設けると、培養細胞中に現れ、神経細胞マーカー（MAP2, Tuj1, GABA, tyrosin hydroxylaseなど）と細胞増殖マーカー、DNA合成酵素、細胞周期マーカー（Ki-67, PCNA, DNApolymerase, cyclinなど）を共発現している細胞として確認することができる。Intermediate neuron progenitorはその種類ごとに異なる神経分化因子により、Intermediate neuron progenitorのみならず神経細胞も産生するようになる。このようなIntermediate neuron progenitorがGABA神経細胞を生み出すものであるならば、癲癇症患者の発作フォーカスに移植することにより、分裂してGABA神経細胞を供給し癲癇発作を抑えることも期待さている（特許文献２）。またこのようなIntermediate neuron progenitorが大脳皮質興奮性神経細胞を生み出すものもあり、外傷性乃至は脳梗塞に拠る機能障害を起こした脳の領域の興奮性神経細胞を補うことが期待されている（特許文献３）。
【００２０】
今回、発明者らの研究により、GABA神経細胞と大脳皮質興奮性神経細胞の脳内での産生過程を観察している際に確認されたIntermediate neuron progenitorと呼ばれる細胞分化状態が、ドーパミン神経細胞の産生過程にも存在することが確認された（下記の実施例）。それ故、GABA神経細胞と大脳皮質興奮性神経細胞のIntermediate neuron progenitorの場合と同様に、安全な移植用のドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を安定して得る方法が準備でき、パーキンソン病の移植治療に貢献できる。
【００２１】
具体的には、Intermediate neuron progenitorの性質を備えたドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞は、これまでに提案されている方法（特許文献３）で分離された細胞群に混入するが、これまでの方法では、分離された細胞は神経細胞でありそれ以上は分裂しないものと考えて、直ちに脳に移植するのが常であった。しかし（特許文献３）にある方法により分離された細胞群は、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を獲るための原材料となる。
【００２２】
この出願の前記発明において、神経幹細胞は、中枢神経系を構成する全ての種の細胞を供給することのできる細胞であるのに対し、Intermediate progenitorとは、神経幹細胞から生み出され、増殖することができるが、限られた細胞種に分化しうる細胞のことをいう。例えば、希突起膠細胞の前駆細胞として、 oligodendrocyte precursor cell(OPC)が知られているし、GABA作動性神経細胞の前駆細胞としては、嗅球顆粒細胞を供給する前脳胞脳室下帯の細胞がIntermediate neuron progenitorに当たる。しかしこれまでに、中脳の実質内にドーパミン神経細胞を生み出すIntermediate neuron progenitorが存在することは知られていなかった。この出願の発明者による以下の観察結果は、ドーパミン神経細胞を生み出すIntermediate neuron progenitorが中脳実質内に存在する直接および間接証拠である。
1．胎生E14.5のマウスにBrdUを取り込ませ、直ちに還流固定してBrdU、THの二重免疫染色をすると、中脳実質のTH陽性細胞がBrdU免疫染色と重なるものが見つかる（図３）。これは、中脳実質のドーパミン神経前駆細胞が細胞分裂に備えて、DNAを複製していたことを意味する。
2．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、ガラススライド表面に塗布した細胞サンプルで、免疫細胞化学的にTH（緑）と細胞増殖マーカーのKi-67（赤）を検出したところ、二つの免疫抗原性が重なることがあることが分かった。これは分散したTH陽性細胞の一部は細胞増殖の何れかの状態にあったことを意味している。
3．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、顕微鏡下で単一細胞を吸い上げ、顕微鏡下で吸い上げた単一細胞をmRNA逆転写酵素溶液に射出し、逆転写反応とPCR反応を行って、単一細胞内で発現している遺伝子を調べた。その結果、20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
【００２３】
よって胎生期の中脳脳室帯にある神経幹細胞はTH陰性であるのに対し、中脳実質のドーパミン神経細胞前駆細胞は、THを発現し神経細胞マーカーとしても使われるドーパミンを合成して含むが、同時に分裂能を持つものがあることが明らかになった。これは、Intermediate neuron progenitorの重要な特徴であり、GABA神経細胞、グルタメイト作動性神経細胞でも確認された中間的な細胞分化状態が、ドーパミン神経細胞が産生される際にも存在することを示している。それ故、増殖能を持ったドーパミン神経前駆細胞は、これまでにGABA神経前駆細胞とグルタメイト作動性神経前駆細胞で特許出願された発明（特許文献２、３）と同様の有効な使用法があると容易に類推することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
胎生E14.5の妊娠期にあるマウスにBrdU 50 mg/gの割合で母体の体重分BrdU溶液を腹腔内に注入し、30分後に胎仔を10％ホルマリンで灌流固定し、中脳領域を取り出し、30％ショ糖液に漬けてから凍結切片を作成した。作成した切片を抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)に浸漬し、THを緑の蛍光で標識した。その後、ホルマリン処理、アルカリ処理、中和処理を経て、抗BrdUラット抗体に浸漬し、BrdUを赤色の蛍光で標識した。染色後、切片を共焦点顕微鏡で観察したところ、二重に標識される細胞が散在して見られた。図中にある二重標識された細胞は二つが隣り合って存在し、繰り返し分裂を続けるTH陽性のドーパミン神経前駆細胞と考えられる（図３）。
実施例２
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、スライドグラスに塗布して乾燥させてから、抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)（緑）と、抗Ki-67 (Becton Dickinson, USA)マウス抗体（赤）で染色し、二重に標識される細胞を探すと、其処此処に見つかった（図４）。
実施例３
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、顕微鏡下でランダムに単一の細胞をガラス管で吸い上げ、顕微鏡下で単一の細胞をmRNA逆転写反応液の中に射出するのを確認して、single cell RT-PCRを行った。その内20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった（図５）。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
【００２５】
なお、Single cell RT-PCRは下記のとおりに行った。
1．以下の溶液を単一細胞に加え、65℃で10分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷で冷却した。
【００２６】
DNase RNase Free water 6.5 ml
10 mM dNTP mixture 1.0 ml
Oligo(dT) primer (0.5 mg/ml) 1.0 ml
2．以下の溶液を加え、50℃で60分間インキュベートした。
【００２７】
5 X First strand buffer 4.0 ml
0.1 M DTT 1.0 ml
RNase inhibitor (40 U/ml, Ambion) 0.5 ml
Superscript III (200 U/ml, invitrogen) 0.5 ml
3．混合溶液を70℃で15分間加熱して反応を停止させた後、冷却した。
4．0.5 ml RNaseH を添加し、37℃で20分間インキュベートした。
5．標的遺伝子断片を、単一のGFPポジティブSVZ細胞のcDNAを鋳型とするnested PCRまたはsemi-nested PCRによって増幅した。
【００２８】
第1回目のPCRは、多量の標的遺伝子に基づいたcDNA溶液（1〜3μl）を用いて行った。
・第1回目PCR増幅（Qiagen HotstarTaq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 5 ml
第1回目PCR用のプライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
cDNA 1-3 ml
HotStarTaq (5 U/ ml) 1 ml
DDW to 50 ml
・第1回目PCR条件
95 °C 10分（1サイクル）
95 °C 30秒
57 °C（変動） 30秒
72 °C 1分（40サイクル）
72 °C 10分
・第2回PCR増幅（Toyobo Blend Taq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 4 ml
第2回PCR用プライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
Blend Taq (5 U/ ml) 0.5 ml
First-round PCR product 1-2 ml
DDW to 50 ml
・第2回PCR条件
94 °C 2分（1サイクル）
94 °C 30秒
57 °C（変動） 30 秒
72 °C 30秒（25-30サイクル）
72 °C 7分
6．第2回PCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで可視化した。
【００２９】
なお、PCRプライマーセットは、各標的遺伝子のGenBank配列に基づきデザインした。1対の各プライマーはゲノムDNAの増幅を避けるため、異なるエクソンに位置するようにデザインした。詳細は以下のとおりである。
・マウスβ-actin（GenBank accession number: X03672）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：556 bp）
Upper: 5'-gccaaccgtgaaaagatgac-3'：配列番号1（位置：420-459；エクソン4内）
Lower: 5'-gcactgtgttggcatagagg-3'：配列番号2（位置：956-975；エクソン5内）
アニーリング温度： 57.9 °C
第2回目PCRプライマーセット（産物長：391 bp）
Upper: 5'-ggctgtgctgtccctgtatg-3'：配列番号3（位置：491-510；エクソン4内）
Lower: 5'-caagaaggaaggctggaaaa-3'：配列番号4（位置：862-881；エクソン5内
アニーリング温度：57.0 °C
・マウスβIII-tubμlin（GenBank accession number NM_023279）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：609 bp）
Upper: 5'-agtgcggcaaccagataggg-3'：配列番号5（位置：74 - 93；エクソン1内）
Lower: 5'-tgcggaagcagatgtcgtag-3'：配列番号6（位置：663-682；エクソン4内）
アニーリング温度：58.8 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：323 bp）
Upper: 5'-tctggcgcctttggacacct-3'：配列番号7（位置：274-293；エクソン3内）
Lower: 5'-gcgttgtagggtccaccac-3'：配列番号8（位置：577-598；エクソン4内）
アニーリング温度：59.3 °C
・Ki-67（GenBank accession No. X82786）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：675 bp）
Upper: 5'-caacattacaaagcaaaagca-3'：配列番号9（位置：8396-8416；エクソン13内）
Lower: 5'-gcttaggttcactgtccaaa-3'：配列番号10（位置：9051-9070；エクソン14内）
アニーリング温度：53.5 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：380 bp）
Upper: 5'-caccaaagcaggaagcaaca-3'：配列番号11（位置：8492-8511；エクソン13内）
Lower: 5'-ttggccccgagatgtagatt-3'：配列番号12（位置：8852-8871；エクソン14内）
アニーリング温度：54.7 °C
・マウスtyrosine hydroxylase（GenBank accession No. M69200）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：571 bp）
Upper: 5’-cccaaggaaagtgtcagagt-3’：配列番号13（位置：506；エクソン4内）
Lower: 5’-cagagatgcaagtccaatgt-3’：配列番号14（位置：1057；エクソン10内）
好適アニーリング温度：56.6 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：354 bp）
Upper: 5’-ttgaccctgacctggacctg-3’：配列番号15（位置：556；エクソン4内）
Lower: 5’-ccagaaaatcacgggcagac-3’：配列番号16（位置：890；エクソン8内）
好適アニーリング温度：58.4 °C;
【産業上の利用可能性】
【００３０】
パーキンソン病の治療法として、ドーパミン神経細胞の欠落を補う、ES細胞の混入の無い安全な移植細胞を効率的に生み出す適切な系はこれまでなかったが、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を分離して培養することにより、生物工学的に産生が可能となると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】この発明の方法を実施するのに必要となるDNAコンストラクトを1から５に示す。１−２は、直接tyrosin hydroxylase（TH）遺伝子プロモーターにGFP遺伝子やneo mycin耐性遺伝子をつないだもので、ドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞でGFPやneo mycin耐性遺伝子が発現し、ドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞を分離するために利用する。３−５はTH遺伝子プロモーター活性によって発現するCre recombinaseを利用して、GFPやneo mycin耐性遺伝子をドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞に発現させて、ドーパミン神経前駆細胞を分離するために利用する。詳しくは、３は、TH遺伝子プロモーターにCre recombinase DNAをつないだコンストラクトであり、４はドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞を、Cre recombinaseを介したGFPの発現を利用して分離する方法に使うDNAコンストラクトである。５はドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞を、Cre recombinaseを介したneo mycin耐性遺伝子の発現を使って分離する方法に使うDNAコンストラクトである。
【図２】発明の実施の形態の説明図である。生体細胞を可視化できるレポーターDNA(GFP)を利用したドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞の分離法を示す。図１にある１番目のDNAコンストラクトを細胞に導入した場合、ドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞ではTH遺伝子プロモーター活性のためGFPの発現が始まる。結果GFP蛍光の有無によりセルソーターを使ってドーパミン神経細胞とドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を選別することができる。またGFPに代えて、シグナルペプタイドをつけた標識蛋白を細胞表面に発現させて、抗体などを介して固層に吸着させて細胞を選別することもできる。上記遺伝子の導入には、レトロウイルスや一時的な発現をさせる真核細胞での複製オリジンを持つアデノウイルスなどによって導入が可能である。続いて選別されたドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を増殖させて、ES細胞などの混入がないことを確かめて、移植に用いる細胞が準備される。
【図３】マウスE14胎児の中脳部分でTH陽性細胞（緑の細胞）がDNAの構成分子Thymidineの類似物質であるBrdU(Bromo-deoxi-Urydine；赤い核)を取り込んだ細胞を示す。厚さ20ミクロンの切片中で。
【図４】マウスE14胎児の中脳部分を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散して、ガラス板に塗布して乾燥後、免疫組織化学を行なった。TH陽性細胞（緑の細胞）ほぼ全て神経細胞マーカーであるTuj1（B,Cの赤い細胞と緑と重なり黄色になった細胞）陽性であったが、TH陽性細胞（緑の細胞）の一部は、細胞増殖マーカーであるKi-67（E,Fの赤い細胞）陽性であった。TH陽性細胞の細胞の一部はまだ分裂増殖をしていることを示している。
【図５】マウスE14胎児の中脳部分を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散し、顕微鏡かでランダムに単一の細胞をガラス管で吸い上げ、single cell RT-PCRを行った。その内20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、ドーパミン神経細胞が減少した病態脳のドーパミン神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる、ドーパミン神経細胞のみに分化させられるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を生み出す細胞を分離する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明にある細胞は、増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞であり、それ自身（増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞）とドーパミン神経細胞を生み出す。増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞を、シャーレ内で増殖させることにより、ドーパミン神経細胞が減少した病態脳のドーパミン神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる移植細胞を準備できる。中脳大脳基底核領域のドーパミン神経細胞が減少したパーキンソン病の治療を行う治療行為を可能にする移植用細胞を準備する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の神経細胞には興奮性の神経細胞と抑制性の神経細胞がある。また同二種類の神経細胞以外に、反応は遅いが両方向性に神経細胞の活動を調節し神経細胞の様々な活動を促進する物質、例えばドーパミンを放出する神経細胞も含まれている。しかしながら時として、ドーパミン神経細胞の活性が落ち、死滅していくことがある。ドーパミン神経細胞が減少すると随意運動機能障害が生じる。その治療法として、初期であるならば、ドーパミンの前駆物質であるL-dopaを経口投与することにより、残存しているドーパミン神経細胞により多くのドーパミンを合成させて、一時的に症状を緩和することができる。しかし、L-dopa投与による効果を維持するためには日々増量しなければならなくなり、ドーパミン神経細胞死が進めば、どの様に多量のL-dopaを投与してもまったく効果が無くなる。このような経過を辿って患者は感染症及び合併症を併発して死に至る。現在のところ完全治癒させる治療法は無く、将来的に、細胞移植により失われたドーパンミン神経細胞を補う治療法に期待が寄せられている。
【０００３】
しかし、これまで脳は再生しないと考え続けられてきたために、移植用に使う細胞を準備するすべが無かった。その様な中、中枢神経系でも生涯神経細胞産生が続いていることが知られるようになり、患者の脳内から神経幹細胞を取り出して増殖させて移植に使おうという考えも出された。また、患者自身の神経幹細胞を刺激して、脱落した神経細胞を再生させよう言う気運も高まっている。しかし患者から十分量の神経幹細胞取り出すことは難しく、内在性の神経幹細胞を刺激して増殖させることは、広範な領域の神経幹細胞の増殖を招き、脳腫瘍の発生頻度を著しく上昇させる可能性がある。また再生医療によく用いられているES細胞から、神経幹細胞や神経細胞を産生して移植に使おうとする試みもあるが、移植細胞へES細胞が混入することによるteratoma（奇形腫）が生じる危険性や、神経幹細胞や星状膠細胞が混入することによるグリア瘢痕の形成が絶えず危惧される。また現在の技術では、神経細胞のみをセルソーターで分離して移植しても、大半の移植神経細胞は、ソート時の損傷により死滅して移植部位に炎症反応を引き起こし、生き残っていた神経細胞も炎症反応で死滅してしまい、有効な結果がなかなか得られていないのが現実である。
【０００４】
なお、ドーパミン作動性ニューロンを分離する方法としては、特許文献１が知られている。この特許文献１は、ドーパミン作動性ニューロンで発現する遺伝子（例えばtyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現させ、蛍光を発する細胞を細胞集団から分離する方法を開示している。
【０００５】
また、この出願の発明に深く関連する他の刊行物を以下に挙げる。
【特許文献１】特開2002-51775
【特許文献２】国際公開WO2004/058965号パンフレット
【特許文献３】国際公開WO2005/095588号パンフレット
【特許文献４】特開2002-51775
【非特許文献１】Wu SX, Goebbels S, Nakamura K, Nakamura K, Kometani K, Minato N, Kaneko T, Nave KA, Tamamaki N, Pyramidal neurons of upper cortical layers generated by NEX-positive progenitor cells in the subventricular zone. PNAS 2005,102(47):17172-17177.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の方法は、ドーパミン作動性ニューロンとして、その前駆細胞（ドーパミン神経細胞にのみ分化する細胞）を単離することも含んでいる。しかしながら、この特許文献１の方法では、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来るドーパミン神経前駆細胞を効率よく分離することは困難である。
【０００７】
この出願は、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞の有効な分離方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願は、前記の課題を解決するために、この出願では、
ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞を提供する。
【０００９】
またこの出願は、前記の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
さらに、前記の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
さらにまた、前記の細胞を主に含む細胞集団を分離方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
またさらに、前記各方法では、工程(a)において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製することを好ましい態様とする。あるはまた、工程(a)において、ドナーのドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製することを別の好ましい態様とする。
【００１３】
そしてさらに、前記の胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来であり、哺乳動物がヒトであること、前記ドナーが哺乳動物であり、哺乳動物がヒトであることをそれぞれ好ましい態様とする。
【００１４】
さらには、前記各発明においては、ステップ(d)で分離した細胞をレシピエントに移植することを含むことを好ましい態様としている。
【００１５】
この出願はまた、前記の細胞（ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞）を得るために試用する試薬および細胞のキットを提供する。
【００１６】
なお、この発明において、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞は、それ自体を細胞増殖により生み出す細胞である。分裂により生じた娘細胞は、生体内で「ドーパミン神経細胞」へと分化する場合も、「それ自体」に留まる場合もあること意味する。
【発明の効果】
【００１７】
これまで、胚性幹細胞や神経幹細胞の培養条件を調節することで、ドーパミン神経細胞を始め様々な細胞が誘導されてきた。しかし何れの条件でも、単一種の細胞のみを産生する系はなく、治療に用いる前に再度の分離が必要となり、細胞活性を損なうこととなっていた。この出願の発明によって、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞が純度高く得られる。ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞はTH陽性であり、脳内ではTH陽性細胞はドーパミン神経細胞とノルアドレナリン神経細胞だけであり、ノルアドレナリン神経細胞も移植すると、パーキンソン病症状を軽減することを考えると、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を分離して培養することにより、ドーパミン神経細胞の欠落を補う、ES細胞の混入の無い安全な移植細胞を生み出す系が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本願発明者らは、生体内での神経細胞産生過程を調べることにより、胎児脳の実質内には神経細胞に運命が決まっているが尚増殖を続け神経細胞を生み出すintermediate neuron progenitorというこれまでにまったく知られていなかった細胞分化の中間状態に有る細胞が存在すること発見した(特許文献２−３、非特許文献１)。 Intermediate neuron progenitorにはGABA神経細胞ばかりを生み出すものや（特許文献２）、興奮性神経細胞ばかりを生み出すものがあり（特許文献２）、それぞれを特徴付ける遺伝子のプロモーター活性を利用して蛍光蛋白を発現させることによりセルソーターを利用して選別することができる。セルソーターで選別すると、上でも述べたように、頻繁に細胞に傷がついてしまうが、Intermediate neuron progenitorの場合は、回復させるために一時的に培養増殖させても、また十分な数を得るために長く培養増殖させても、適切な培養条件を整えることで他の種の細胞が生じることが無いと考えられる。それ故、teratomaを引き起こすES細胞の混入がないことを確認してからIntermediate neuron progenitorを培養することで、乃至は培養してから混入の有無を確認することで、安全な移植用細胞が安定して得られる可能性がある。
【００１９】
Intermediate neuron progenitorは生体内のみで見られるものではなく、ES細胞や神経幹細胞を培養する際に適切な培養条件を設けると、培養細胞中に現れ、神経細胞マーカー（MAP2, Tuj1, GABA, tyrosin hydroxylaseなど）と細胞増殖マーカー、DNA合成酵素、細胞周期マーカー（Ki-67, PCNA, DNApolymerase, cyclinなど）を共発現している細胞として確認することができる。Intermediate neuron progenitorはその種類ごとに異なる神経分化因子により、Intermediate neuron progenitorのみならず神経細胞も産生するようになる。このようなIntermediate neuron progenitorがGABA神経細胞を生み出すものであるならば、癲癇症患者の発作フォーカスに移植することにより、分裂してGABA神経細胞を供給し癲癇発作を抑えることも期待さている（特許文献２）。またこのようなIntermediate neuron progenitorが大脳皮質興奮性神経細胞を生み出すものもあり、外傷性乃至は脳梗塞に拠る機能障害を起こした脳の領域の興奮性神経細胞を補うことが期待されている（特許文献３）。
【００２０】
今回、発明者らの研究により、GABA神経細胞と大脳皮質興奮性神経細胞の脳内での産生過程を観察している際に確認されたIntermediate neuron progenitorと呼ばれる細胞分化状態が、ドーパミン神経細胞の産生過程にも存在することが確認された（下記の実施例）。それ故、GABA神経細胞と大脳皮質興奮性神経細胞のIntermediate neuron progenitorの場合と同様に、安全な移植用のドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を安定して得る方法が準備でき、パーキンソン病の移植治療に貢献できる。
【００２１】
具体的には、Intermediate neuron progenitorの性質を備えたドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞は、これまでに提案されている方法（特許文献３）で分離された細胞群に混入するが、これまでの方法では、分離された細胞は神経細胞でありそれ以上は分裂しないものと考えて、直ちに脳に移植するのが常であった。しかし（特許文献３）にある方法により分離された細胞群は、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を獲るための原材料となる。
【００２２】
この出願の前記発明において、神経幹細胞は、中枢神経系を構成する全ての種の細胞を供給することのできる細胞であるのに対し、Intermediate progenitorとは、神経幹細胞から生み出され、増殖することができるが、限られた細胞種に分化しうる細胞のことをいう。例えば、希突起膠細胞の前駆細胞として、 oligodendrocyte precursor cell(OPC)が知られているし、GABA作動性神経細胞の前駆細胞としては、嗅球顆粒細胞を供給する前脳胞脳室下帯の細胞がIntermediate neuron progenitorに当たる。しかしこれまでに、中脳の実質内にドーパミン神経細胞を生み出すIntermediate neuron progenitorが存在することは知られていなかった。この出願の発明者による以下の観察結果は、ドーパミン神経細胞を生み出すIntermediate neuron progenitorが中脳実質内に存在する直接および間接証拠である。
1．胎生E14.5のマウスにBrdUを取り込ませ、直ちに還流固定してBrdU、THの二重免疫染色をすると、中脳実質のTH陽性細胞がBrdU免疫染色と重なるものが見つかる（図３）。これは、中脳実質のドーパミン神経前駆細胞が細胞分裂に備えて、DNAを複製していたことを意味する。
2．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、ガラススライド表面に塗布した細胞サンプルで、免疫細胞化学的にTH（緑）と細胞増殖マーカーのKi-67（赤）を検出したところ、二つの免疫抗原性が重なることがあることが分かった。これは分散したTH陽性細胞の一部は細胞増殖の何れかの状態にあったことを意味している。
3．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、顕微鏡下で単一細胞を吸い上げ、顕微鏡下で吸い上げた単一細胞をmRNA逆転写酵素溶液に射出し、逆転写反応とPCR反応を行って、単一細胞内で発現している遺伝子を調べた。その結果、20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
【００２３】
よって胎生期の中脳脳室帯にある神経幹細胞はTH陰性であるのに対し、中脳実質のドーパミン神経細胞前駆細胞は、THを発現し神経細胞マーカーとしても使われるドーパミンを合成して含むが、同時に分裂能を持つものがあることが明らかになった。これは、Intermediate neuron progenitorの重要な特徴であり、GABA神経細胞、グルタメイト作動性神経細胞でも確認された中間的な細胞分化状態が、ドーパミン神経細胞が産生される際にも存在することを示している。それ故、増殖能を持ったドーパミン神経前駆細胞は、これまでにGABA神経前駆細胞とグルタメイト作動性神経前駆細胞で特許出願された発明（特許文献２、３）と同様の有効な使用法があると容易に類推することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
胎生E14.5の妊娠期にあるマウスにBrdU 50 mg/gの割合で母体の体重分BrdU溶液を腹腔内に注入し、30分後に胎仔を10％ホルマリンで灌流固定し、中脳領域を取り出し、30％ショ糖液に漬けてから凍結切片を作成した。作成した切片を抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)に浸漬し、THを緑の蛍光で標識した。その後、ホルマリン処理、アルカリ処理、中和処理を経て、抗BrdUラット抗体に浸漬し、BrdUを赤色の蛍光で標識した。染色後、切片を共焦点顕微鏡で観察したところ、二重に標識される細胞が散在して見られた。図中にある二重標識された細胞は二つが隣り合って存在し、繰り返し分裂を続けるTH陽性のドーパミン神経前駆細胞と考えられる（図３）。
実施例２
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、スライドグラスに塗布して乾燥させてから、抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)（緑）と、抗Ki-67 (Becton Dickinson, USA)マウス抗体（赤）で染色し、二重に標識される細胞を探すと、其処此処に見つかった（図４）。
実施例３
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、顕微鏡下でランダムに単一の細胞をガラス管で吸い上げ、顕微鏡下で単一の細胞をmRNA逆転写反応液の中に射出するのを確認して、single cell RT-PCRを行った。その内20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった（図５）。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
【００２５】
なお、Single cell RT-PCRは下記のとおりに行った。
1．以下の溶液を単一細胞に加え、65℃で10分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷で冷却した。
【００２６】
DNase RNase Free water 6.5 ml
10 mM dNTP mixture 1.0 ml
Oligo(dT) primer (0.5 mg/ml) 1.0 ml
2．以下の溶液を加え、50℃で60分間インキュベートした。
【００２７】
5 X First strand buffer 4.0 ml
0.1 M DTT 1.0 ml
RNase inhibitor (40 U/ml, Ambion) 0.5 ml
Superscript III (200 U/ml, invitrogen) 0.5 ml
3．混合溶液を70℃で15分間加熱して反応を停止させた後、冷却した。
4．0.5 ml RNaseH を添加し、37℃で20分間インキュベートした。
5．標的遺伝子断片を、単一のGFPポジティブSVZ細胞のcDNAを鋳型とするnested PCRまたはsemi-nested PCRによって増幅した。
【００２８】
第1回目のPCRは、多量の標的遺伝子に基づいたcDNA溶液（1〜3μl）を用いて行った。
・第1回目PCR増幅（Qiagen HotstarTaq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 5 ml
第1回目PCR用のプライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
cDNA 1-3 ml
HotStarTaq (5 U/ ml) 1 ml
DDW to 50 ml
・第1回目PCR条件
95 °C 10分（1サイクル）
95 °C 30秒
57 °C（変動） 30秒
72 °C 1分（40サイクル）
72 °C 10分
・第2回PCR増幅（Toyobo Blend Taq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 4 ml
第2回PCR用プライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
Blend Taq (5 U/ ml) 0.5 ml
First-round PCR product 1-2 ml
DDW to 50 ml
・第2回PCR条件
94 °C 2分（1サイクル）
94 °C 30秒
57 °C（変動） 30 秒
72 °C 30秒（25-30サイクル）
72 °C 7分
6．第2回PCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで可視化した。
【００２９】
なお、PCRプライマーセットは、各標的遺伝子のGenBank配列に基づきデザインした。1対の各プライマーはゲノムDNAの増幅を避けるため、異なるエクソンに位置するようにデザインした。詳細は以下のとおりである。
・マウスβ-actin（GenBank accession number: X03672）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：556 bp）
Upper: 5'-gccaaccgtgaaaagatgac-3'：配列番号1（位置：420-459；エクソン4内）
Lower: 5'-gcactgtgttggcatagagg-3'：配列番号2（位置：956-975；エクソン5内）
アニーリング温度： 57.9 °C
第2回目PCRプライマーセット（産物長：391 bp）
Upper: 5'-ggctgtgctgtccctgtatg-3'：配列番号3（位置：491-510；エクソン4内）
Lower: 5'-caagaaggaaggctggaaaa-3'：配列番号4（位置：862-881；エクソン5内
アニーリング温度：57.0 °C
・マウスβIII-tubμlin（GenBank accession number NM_023279）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：609 bp）
Upper: 5'-agtgcggcaaccagataggg-3'：配列番号5（位置：74 - 93；エクソン1内）
Lower: 5'-tgcggaagcagatgtcgtag-3'：配列番号6（位置：663-682；エクソン4内）
アニーリング温度：58.8 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：323 bp）
Upper: 5'-tctggcgcctttggacacct-3'：配列番号7（位置：274-293；エクソン3内）
Lower: 5'-gcgttgtagggtccaccac-3'：配列番号8（位置：577-598；エクソン4内）
アニーリング温度：59.3 °C
・Ki-67（GenBank accession No. X82786）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：675 bp）
Upper: 5'-caacattacaaagcaaaagca-3'：配列番号9（位置：8396-8416；エクソン13内）
Lower: 5'-gcttaggttcactgtccaaa-3'：配列番号10（位置：9051-9070；エクソン14内）
アニーリング温度：53.5 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：380 bp）
Upper: 5'-caccaaagcaggaagcaaca-3'：配列番号11（位置：8492-8511；エクソン13内）
Lower: 5'-ttggccccgagatgtagatt-3'：配列番号12（位置：8852-8871；エクソン14内）
アニーリング温度：54.7 °C
・マウスtyrosine hydroxylase（GenBank accession No. M69200）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：571 bp）
Upper: 5’-cccaaggaaagtgtcagagt-3’：配列番号13（位置：506；エクソン4内）
Lower: 5’-cagagatgcaagtccaatgt-3’：配列番号14（位置：1057；エクソン10内）
好適アニーリング温度：56.6 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：354 bp）
Upper: 5’-ttgaccctgacctggacctg-3’：配列番号15（位置：556；エクソン4内）
Lower: 5’-ccagaaaatcacgggcagac-3’：配列番号16（位置：890；エクソン8内）
好適アニーリング温度：58.4 °C;
【産業上の利用可能性】
【００３０】
パーキンソン病の治療法として、ドーパミン神経細胞の欠落を補う、ES細胞の混入の無い安全な移植細胞を効率的に生み出す適切な系はこれまでなかったが、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を分離して培養することにより、生物工学的に産生が可能となると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】この発明の方法を実施するのに必要となるDNAコンストラクトを1から５に示す。１−２は、直接tyrosin hydroxylase（TH）遺伝子プロモーターにGFP遺伝子やneo mycin耐性遺伝子をつないだもので、ドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞でGFPやneo mycin耐性遺伝子が発現し、ドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞を分離するために利用する。３−５はTH遺伝子プロモーター活性によって発現するCre recombinaseを利用して、GFPやneo mycin耐性遺伝子をドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞に発現させて、ドーパミン神経前駆細胞を分離するために利用する。詳しくは、３は、TH遺伝子プロモーターにCre recombinase DNAをつないだコンストラクトであり、４はドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞を、Cre recombinaseを介したGFPの発現を利用して分離する方法に使うDNAコンストラクトである。５はドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞を、Cre recombinaseを介したneo mycin耐性遺伝子の発現を使って分離する方法に使うDNAコンストラクトである。
【図２】発明の実施の形態の説明図である。生体細胞を可視化できるレポーターDNA(GFP)を利用したドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞の分離法を示す。図１にある１番目のDNAコンストラクトを細胞に導入した場合、ドーパミン神経細胞とドーパミン神経前駆細胞ではTH遺伝子プロモーター活性のためGFPの発現が始まる。結果GFP蛍光の有無によりセルソーターを使ってドーパミン神経細胞とドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を選別することができる。またGFPに代えて、シグナルペプタイドをつけた標識蛋白を細胞表面に発現させて、抗体などを介して固層に吸着させて細胞を選別することもできる。上記遺伝子の導入には、レトロウイルスや一時的な発現をさせる真核細胞での複製オリジンを持つアデノウイルスなどによって導入が可能である。続いて選別されたドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を増殖させて、ES細胞などの混入がないことを確かめて、移植に用いる細胞が準備される。
【図３】マウスE14胎児の中脳部分でTH陽性細胞（緑の細胞）がDNAの構成分子Thymidineの類似物質であるBrdU(Bromo-deoxi-Urydine；赤い核)を取り込んだ細胞を示す。厚さ20ミクロンの切片中で。
【図４】マウスE14胎児の中脳部分を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散して、ガラス板に塗布して乾燥後、免疫組織化学を行なった。TH陽性細胞（緑の細胞）ほぼ全て神経細胞マーカーであるTuj1（B,Cの赤い細胞と緑と重なり黄色になった細胞）陽性であったが、TH陽性細胞（緑の細胞）の一部は、細胞増殖マーカーであるKi-67（E,Fの赤い細胞）陽性であった。TH陽性細胞の細胞の一部はまだ分裂増殖をしていることを示している。
【図５】マウスE14胎児の中脳部分を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散し、顕微鏡かでランダムに単一の細胞をガラス管で吸い上げ、single cell RT-PCRを行った。その内20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞を主に含む細胞集団を分離方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
工程(a)において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する請求項２から４のいずれかの方法。
【請求項６】
工程(a)において、ドナーのドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製する請求項１から４のいずれかの方法。
【請求項７】
胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来である、請求項５の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項７の方法。
【請求項９】
ドナーが哺乳動物である、請求項６の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項９の方法。
【請求項１１】
さらに、ステップ(d)で分離した細胞をレシピエントに移植することを含む、請求項２から４のいずれかの方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の細胞を得るために試用する試薬および細胞のキット。
【請求項１】
ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞を主に含む細胞集団を分離方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
工程(a)において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する請求項２から４のいずれかの方法。
【請求項６】
工程(a)において、ドナーのドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製する請求項１から４のいずれかの方法。
【請求項７】
胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来である、請求項５の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項７の方法。
【請求項９】
ドナーが哺乳動物である、請求項６の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項９の方法。
【請求項１１】
さらに、ステップ(d)で分離した細胞をレシピエントに移植することを含む、請求項２から４のいずれかの方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の細胞を得るために試用する試薬および細胞のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−５０１７２（Ｐ２００９−５０１７２Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１７４７１（Ｐ２００７−２１７４７１）
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０４１５９２３５）国立大学法人 熊本大学 (314)
【Ｆターム（参考）】
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