ニューロテンシン受容体３に由来するペプチドおよび精神疾患の治療におけるその使用
本発明は、ニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）に由来するペプチド、および精神疾患の治療におけるその使用に関する。本発明は詳細には、医薬品（例えば抗鬱薬）の製造のためのかかるペプチドの使用に関する。本発明のペプチドはその配列が添付の配列番号２であることを特徴とする。本発明は製薬業の分野、特には精神疾患の治療に使用される薬物開発の領域に使用される。本発明は新規な抗鬱薬の開発に特に使用される。また、本発明は痛みおよび炎症の治療に使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）に由来するペプチド、および精神疾患の治療におけるその使用に関する。本発明は詳細には、医薬品（例えば抗鬱薬）の製造のためのかかるペプチドの使用に関する。
【０００２】
本発明は製薬業の分野、特には精神疾患の治療に使用される薬物開発の領域に応用される。
本発明は新規な抗鬱薬の開発に特に応用される。また、本発明は痛みの治療に応用される。
【０００３】
以下の説明では、括弧間の参照数字（ｘ）は、実施例の最後の参考文献一覧を指す。
【背景技術】
【０００４】
精神疾患は現実の公衆衛生の問題である。最新の研究によると鬱病の高い罹患率が確認されており、一生涯にわたって、女性の２０％および男性の１０％は非特許文献１に記載されているような鬱病症状の発現を有しているか、または有すると予想される。そのような数字は明らかに顕著になっており、鬱病の主な併発症である自殺を考慮した場合にも、非特許文献２に記載されているようにフランス等の国では年間の死亡者が１２０００人に達する。
【０００５】
鬱病はしばしば無能力になる非常に流行している疾患である。鬱病は工業先進国の人口の２０％以下に影響を及ぼす可能性がある。その起源は多様かつ多数である。鬱病は心理と患者の行動および生理的状態との両方に影響を及ぼす。鬱病の治療もまた多数あり、使用される医薬品の作用機序は明確には確立されていない。
【０００６】
世界保健機構（ＷＨＯ）は、単極性鬱病が２０２０年には障害者の第２の原因になるだろうと予測している。鬱病に罹患している個人および家族が示すのと同様、この病気には重要な社会負担がある。鬱病は、既に仕事を休職する主な理由の１つとなっており、経済的負担は年間３００億ユーロを超える。医療従事者に利用可能な治療薬の蓄積にもかかわらず、特定のＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害剤）およびＳＮＲＩ（セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害剤）では、鬱病の人口の３０％は治療を受けていない。さらに、抗鬱薬の作用の遅延は約３〜６週間であり、重大な副作用がある場合が多い。
【０００７】
一般に、鬱病患者の１５％が自殺で死亡していると推測されている。非特許文献３に記載されているように、ほとんどの患者では、鬱病は遺伝的素因と、素取れるまたは情緒的トラウマ等の環境要因との間の相互作用による。
【０００８】
鬱病はよくある疾患であり、抗鬱薬（ＡＤ）の市場は巨大である（少なくとも１００億ユーロ／年）。
しかしながら、これらの抗鬱薬は症例の約７０％で患者の状態を改善するが、疾患の完全寛解に至るのはたった３０〜４０％でしかない。さらにほとんど、治療された患者のほぼ３分の１は既存の治療に耐性を示す。したがって、これらの状況から、非特許文献の鬱病の機序を考慮することが可能な、新規な治療薬を考える必要がある。
【０００９】
医療従事者に利用可能な治療薬の蓄積では、アミトリプチリンおよびイミプラミンを含む三環系抗うつ薬（ＴＣＡ）が初めに発見され、次にモノアミン酸化酵素阻害剤（ＭＡＯ
Ｉ）が発見され、フェネルジンおよびパルギリン等の不可逆的かつ非選択的な薬が発見された。望ましくない効果、特にＴＣＡの心臓毒性（特に過剰投与の場合）およびＭＡＯＩの高血圧の発症（食品中のチラミンとの相互作用、「チーズ効果」として有名）は、同じ治療効果を有するが受容性により優れた新規な分子の研究を推進した。
【００１０】
その後、ノルエピネフリン（ＮＥ）またはセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンすなわち５−ＨＴ）の回復の特異的阻害剤に関し、選択性の概念が現われた。かかる阻害剤分子に対する第ＩＩＩ相臨床試験により、特に過剰投与の場合に、第一世代の抗鬱薬と透過な有効性とより優れた安全性が実証された。
【００１１】
非特許文献４および非特許文献５に記載されているように、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）および選択的ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）は、現在最も使用されている分子である。ＡＤは、このようにモノアミン作用系の伝達の促進に最も繁く関与している。
【００１２】
セロトニン、ノルエピネフリンおよびドーパミンが関与していることは疑いないが、現在、ＡＤにより生じたモノアミンのレベルの変化および結果として乗じた適応プロセス、特には特定の受容体の感度の変化は、それ自体のみで抗鬱薬の作用機序を説明することができないと考えられている。
【００１３】
したがって、ＡＤが効果を現わすまでの３〜６週間の遅延を、製品の最初の投与で生じるシナプスレベルのモノアミンの増大と相関させるのは難しい。ほぼ半世紀の間、鬱病の原因とその治療に関する仮説の数は絶えず増加している。
【００１４】
例えば、高濃度のグルココルチコイドは一般に、非特許文献６に記載されているようにＢＤＮＦ（「脳由来神経栄養因子」）の合成、グルタミン酸の過剰分泌、および／またはグルコース取込みの減少を介して、気分のネガティブな影響と、海馬での構造の変化とに関与している。
【００１５】
これらの知見によれば、グルココルチコイドおよびグルココルチコイド受容体アンタゴニストの合成の阻害剤は、非特許文献７に記載されているようなＡＤ型の効果を発揮する。
【００１６】
特にサブスタンスＰ（特にはＮＫ１）またはＣＲＦ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）受容体に作用するアンタゴニストや、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが開発されており、特定の効果を奏している（非特許文献８〜１０参照）。
【００１７】
ストレス状況下および鬱病モデルで行なわれた種々の最近の研究は、非特許文献１１〜１３に記載されているように、大鬱病性障害の病因に神経新生を関連付けている。電気ショック療法を含むすべての慢性ＡＤ治療は、海馬の顆粒層のニューロンの起源である始原細胞の増殖を刺激することが実証された。
【００１８】
ＡＤが、ＣＲＥＢ、Ｂｃｌ２またはＭＡＰキナーゼ等の細胞の生存および成長に関与する種々の因子の発現を調節することも知られている。しかしながら、気分障害の生理病理状態におけるかかる新しく形成されたニューロンの機能の重要性は、未だ論争中である。（非特許文献１４参照）
上記から、鬱病が多元的生理病理状態の複合病であることは明らかである。従って、この病理状態の治療は未だ課題である。
【００１９】
４０年超の間、鬱病の研究および有効な薬物治療の開発は、モノアミン作動仮説により
支配されていた。モノアミン作動性神経伝達物質（セロトニン、ノルエピネフリンおよびドーパミン）は疑いなく関与しているが、鬱病の生理病理状態およびＡＤの作用機序に関する仮説の数は増加し続けている。
【００２０】
抗鬱薬の既知の副作用は、その作用様式と関係する。例えば、抗鬱薬は頻脈、体重増加、性欲減少、発汗、食欲減退、ならびに神経学的変化（例えば頭痛）の発現、脳血管発作（ＣＶＡ）、および癲癇性発作を誘発する場合がある。
【００２１】
現在使用中の抗鬱薬は、口腔乾燥症、目のかすみ、および腸の不調（下痢または便秘）を含む一連の望ましくない作用を生じさせる。多くの副作用（例えば嘔気）は一時的であるが、一部にはより永続的（例えば性的作用）であるように思われ、治療薬の長期遵守に影響を及ぼす危険性がある。そのため、鬱病で最近同定された受容体またはチャネルに作用する、新規な分子を発見することは重大である。
【００２２】
鬱病の分子機構には、特定のタンパク質（受容体およびチャネル）が関与している。これは元々ソルチリンと呼ばれていたニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）およびマウスでの不活性化により鬱病耐性の表現型が生じるＴＲＥＫ−１バックグラウンドカリウムチャネル（非特許文献１５）で特に当てはまる。これらのチャネルと有効に相互作用する分子は現在まで同定されていない。
【００２３】
したがって、精神障害（特に鬱病）の治療に使用可能な新規な分子−より効果が高く、許容性に優れ、かつ迅速に作用する分子−が実際に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Wong, M. & Licinio, J. "Research and treatment approaches to depression" Nat Rev Neurosci. 2, 343-351 (2001)
【非特許文献２】Moller HJ. "Suicide, suicidality and suicide prevention in affective disorders" Acta Psychiatr Scand 418 (suppl): 73-80 (2003)
【非特許文献３】Nestler E., Barrot M., DiLeone R.J., Eisch A.J., Gold S.J., Monteggia, L.M. "Neurobiology of depression" Neuron 34, 13-25 (2002)
【非特許文献４】Baghai TC, Volz HP, Moller HJ. "Drug treatment of depression in the 2000s: An overview of achievements in the last 10 years and future possibilities" World J Biol Psychiatry; 7: 198-222 (2006)
【非特許文献５】Weilburg JB. "An overview of SSRI and SNRI therapies for depression" Manag Care, 13 (6 Suppl Depression): 25-33 (2004)
【非特許文献６】Manji HK, Gottesman II, Gould TD. "Signal transduction and genes-to-behaviors pathways in psychiatric diseases" Sci STKE; 207: pe49 (2003)
【非特許文献７】Reus VI, Wolkowitz OM. "Antiglucocorticoid drugs in the treatment of depression" Expert Opin Investig Drugs; 10: 1789-1796 (2001)
【非特許文献８】Griebel G, Simiand J, Steinberg R, et al. "4-(2−C hloro-4-methoxy-5-methylphenyl)-N-[(1S)-2-cyclopropyl-1-(3-fluoro-4-methylphenyl)ethyl]5-methyl-N-(2-propynyl)-1,3-thiazol-2-amine hydrochloride (SSR125543A), a potent and selective corticotrophin-releasing factor (1) receptor antagonist. II. Characterization in rodent models of stress-related disorders" J Pharmacol Exp Ther; 301: 333-345 (2002)
【非特許文献９】Kramer MS, Cutler N, Feighner J, et al. "Distinct mechanism for antidepressant activity by blockade of central substance P receptors" Science; 281: 1640-1645 (1998)
【非特許文献１０】Skolnick P. "Antidepressants for the new millennium" Eur J Pharmacol; 375: 31-40 (1999)
【非特許文献１１】Kempermann G, Kronenberg G. "Depressed new neurons: Adult hippocampal neurogenesis and a cellular plasticity hypothesis of major depression" Biol Psychiatry; 54: 499-503 (2003)
【非特許文献１２】Malberg JE, Schecter LE. Increasing hippocampal neurogenesis: a novel mechanism for antidepressant drugs" Curr Pharm Des; 11: 145-155 (2005)
【非特許文献１３】Duman, R. & Monteggia, L. "A neurotrophic model for stress-related mood disorders" Biol Psychiatry; 9: 1116-1127 (2006)
【非特許文献１４】Henn FA, Vollmayr B. "Neurogenesis and depression: etiology or epiphenomenon?" Biol Psychiatry, 56: 146-50 (2004)
【非特許文献１５】Heurteaux, Lucas, Guy, El Yacoubi, Thummler, Peng, Noble, Blondeau, Widmann et al. "Deletion of TREK-1, a background potassium channel, results in a depression-resistant phenotype" Nature Neurosci., 9, 1134-1141 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、上記必要性に取り組み、先行技術の欠点を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
ＮＴＳＲ３の成熟は、プロペプチドと呼ばれるペプチドを放出し、このプロペプチドが同じタイプの受容体のリガンドになる。興味深いことに、このプロペプチドは、ＴＲＥＫ−１チャネルの活動を遮断することも可能である。
【００２７】
実際、ＮＴＳＲ３は前駆物質（ｐｒｏＮＴＲ３−ソルチリン）の形で合成される。前駆物質の成熟は、フリンによってもたらされ、以下の配列の４４個のアミノ酸からなるペプチド（プロペプチド）を放出する：
ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ （配列番号１）
このペプチドは、成熟（ＮＴＳＲ３）受容体にも結合可能である。構造と機能の関係に関する研究により、このペプチドの１７個のアミノ酸部分がすべての受容体結合活性を担っていることが分かっている。そのペプチド部分とは以下の通りである：
ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ （配列番号２）
この配列番号２の配列は、上記の主たるペプチド中の下線部分に相当する。下記に記載する実験に使用されたのは、このペプチドである（これを本願発明者らはプロペプチドと称する）。
【００２８】
したがって、本発明は、配列番号２のペプチドもしくは該ペプチドの断片、またはニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のリガンドである該ペプチドの誘導体に関する。それは。このペプチドの「断片」および「誘導体」は、例えばアミノ酸をその等価物に置換するかまたは結果としてその活性を変更させずにペプチドを短くすることにより、当業者が添付の配列番号１または２から容易に得ることが可能なものである。
【００２９】
これらの「断片」または「誘導体」は、本発明のペプチドが有するニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のリガンド特性を保存するものである。以下の説明では、本発明のペプチドを「ペプチド」または「プロペプチド」とも称する。「誘導体または断片」は本
発明のペプチドのアナログと見なすことも可能である。
【００３０】
本ペプチドの生体内半減期はまだ確立されていないが、ペプチドの安定性または生体内利用率（バイオアベイラビリティ）を改善するために、本願発明者らは、各アミノ酸に対し、および各アミノ酸間の結合の性質に対し、既に改変を想定している。改変は例えば以下の通りである：
−少なくとも１つのアミノ酸の、同じファミリー（芳香性アミノ酸、疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸等）からの別のアミノ酸への置換；
−天然アミノ酸（Ｌアミノ酸）の、Ｄ形の同じアミノ酸による置換；
−２つのアミノ酸間のペプチド結合の、疑似ペプチド結合による置換。
【００３１】
実際、これらの改変は、ペプチダーゼおよびプロテアーゼによるタンパク質分解の攻撃に強いペプチドを生成する。
本発明は、上記ペプチドまたはペプチド断片もしくはペプチド誘導体をコードする核酸配列にも関する。ソルチリンＳＯＲＴ １のメッセンジャーＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋ受入番号：マウス、ＮＭ＿０１９９７２：ヒト、ＮＭ＿００２９５９。このペプチド配列は、例えば添付の配列表の配列番号２を有する配列である。かかる配列は、本発明のペプチド、ペプチド断片、またはペプチド誘導体をコードする任意の適切な配列であってよい。この配列は、トランスフェクションにより本発明のペプチドもしくは断片または誘導体を作製するために好ましくは使用される。
【００３２】
本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターにも関する。ベクターは、細胞により、遺伝子組換え技術で、本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体を製造するために宿主細胞を形質転換するのに適した任意のベクターであってよい。ベクターは、ｐＩＲＥＳならびにｐＩＲＥＳ２およびその派生物、ｐｃＤＮＡ３およびその派生物、ならびにｐＧＥＸおよびその派生物を含むグループから選択されたベクターから得られ得る。
【００３３】
したがって、本発明は、本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体、本発明の核酸配列、および／または本発明のベクターを有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、形質転換されるか、または本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体を製造するのに適した任意の細胞であってよい。宿主細胞は、例えばＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ ２９３およびその派生物、ならびにＮ１Ｅ１１５およびその関連細胞であってよい。
【００３４】
したがって、本発明は、本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体
誘導体を生産する方法であって、
−本発明の核酸で宿主細胞をトランスフェクトするか、または本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
−配列番号２のペプチドもしくは該ペプチドの断片または該ペプチドの誘導体の発現を許容する条件で、前記宿主細胞を培養する工程、および
−配列番号２のペプチドもしくは該ペプチドの断片または該ペプチドの誘導体を回収する工程
からなる方法にも関する。
【００３５】
本発明のペプチドもしくは該ペプチドの断片または該ペプチドの誘導体を製造するのに使用できるトランスフェクションの技術および形質転換の技術は、当業者に周知である。例えばKrieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. "Affinity purification of synthetic peptides" Proc Natl Acad Sci USA; 73: 3160-3164 (1976)（１６）に記載。
【００３６】
本発明によれば、ペプチドの製造の好ましい方法は、例えば固相での化学合成である。当業者に周知のいかなる技術を使用することも可能である。例えば、ペプチドは、Krieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. "Affinity purification of synthetic peptides" Proc Natl Acad Sci USA; 73: 3160-3164 (1976)（１６）の固相法により合成可能である。
【００３７】
本発明の分子は、新しいクラスの抗鬱薬の開発における新規な経路および精神疾患の新規な治療戦略を切り開く。
したがって、本発明は、医薬品としての本発明のペプチドもしくはその断片または該ペプチドの誘導体の使用方法にも関する。
【００３８】
特に、本発明は、精神障害の治療の治療を意図した医薬品の製造のための、例えば抗鬱薬および／または鎮痛薬の製造のための、ペプチドもしくはその断片または該ペプチド誘導体の使用方法にも関する。
【００３９】
本発明のペプチドもしくはその断片またはその誘導体は、上記に定義したように、新しいタイプの抗鬱薬を構成する天然産物であり、精神障害の治療に現在使用されている医薬品の望ましくない副作用をすべて回避することを可能にする。先行技術で使用されている医薬品の副作用は、それ自体の化学的性質から生じている。先行技術のこれらの医薬品は、細胞の原形質膜を受動的に横切る特性をしばしば有する分子であり、これは細胞内のエフェクターとの非特異的相互作用につながる。本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの疑似ペプチド特性により、かかる問題を回避することが可能となる。
【００４０】
さらに、ＴＲＥＫ−１カリウムチャネルに対する本発明のペプチドの直接作用は、従来の抗鬱薬の作用のしばしば長期になる遅延を低減させ得る（上記の先行技術を参照）。
さらに、ＴＲＥＫ−１チャネルは、伸張、浸透圧、および温度に対する感度が高い。本願発明者は、ＴＲＥＫ−１が痛みの認識に関与する分子の１つであることを実証した。ＴＲＥＫ−１は、脊髄の後根神経節の小感覚ニューロンに多く発現しており、ペプチド作動性ニューロンと非ペプチド作動性ニューロンの両方で存在し、ＴＲＰＶ１（温熱性痛覚過敏に関係するカプサイシン活性化非選択的イオンチャネル）と共に存在している。ＫＯ（「ノックアウト」）マウスは、痛みの感覚と熱に対してより敏感である。この表現型は、熱により敏感な多モードのＣ線維に局在化している。また、ＫＯマウスは低閾値の機械的刺激により敏感であり、炎症の状態では熱および機械に対する知覚過敏が増加する。かかる研究は、Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, No・ J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. "TREK-1, a K+ channel involved in polymodal pain perception" EMBO J; 25: 2368-2376 (2006)（１７）に記載されており、新規な鎮痛薬の開発
のための非常に興味深い標的としてＴＲＥＫ−１チャネルを指定している。従って、かかるＴＲＥＫ−１チャネルに対して活性な分子であればいかなるものも、侵害受容の領域で重要な治療効果を有する可能性がある。
【００４１】
さらに、ＮＴＳＲ３は炎症に関係する。本願発明者は、ＮＴＳＲ３が、ミクログリア細胞由来の炎症性サイトカインの移動および放出に対するニューロテンシン（ＮＴ）の効果の原因であることを実証した（Martin S, Vincent JP, Mazella J. "Involvement of the
neurotensin receptor-3 in the neurotensin-induced migration of human microglia"
J Neurosci. 23: 1198-1205 (2003) （１８）およびMartin S, Dicou E, Vincent JP, Mazella J. "Neurotensin and the neurotensin receptor-3 in microglial cells" J Neurosci Res.; 81: 322-326 (2005)（１９）参照）。
【００４２】
本発明のペプチドは、ＮＴの効果に拮抗する特性を有する。従って、ＮＴの炎症性作用
を遮断可能な分子であればいかなるものも、大脳の炎症領域に重要な治療効果を有し得る。
【００４３】
他の利点は、添付の図面を参照して、限定ではなく例示の目的で与えられた以下の実施例を読めば当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＮＴＳＲ３受容体有りまたは無しで、抗ＴＲＥＫ−１抗体により免疫沈降させた、ＴＲＥＫ−１チャネルでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の膜抽出物から準備されたウェスタンブロットを示す。ＮＴＳＲ３／ソルチリン受容体は抗ソルチリン抗体により明らかにされる。
【図２】ＴＲＥＫ−１チャネル活性の阻害の測定の実験結果を示す曲線を示す。グラフＡでは、電流密度Ｉ（ｐＡ／ｐＦ）を横軸に示し、ｍＶで表わされる印加電圧（Ｖ）を縦軸に示す。挿入部分で、プロットは種々の電圧における電流の振幅を表わす。対照：標準状態、ＡＡ：１０μＭのアラキドン酸による電流の活性化、ＡＡ＋ＰＥ：１００ｎＭのＰＥの存在下での１０μＭのアラキドン酸による電流の活性化。グラフＢでは、１０μＭのアラキドン酸により活性化されたＴＲＥＫ−１電流の阻害率を横軸に示し（０ｍＶで測定された阻害％）、ｎＭで表わされるＰＥの濃度を縦軸に示す。これらの図では、ｐＡ＝ピコアンペアおよびｐＦ＝ピコファラドである。
【図３】３つの異なる注射方法、および異なる注射物質に関して行なわれた強制的な水泳試験の実験結果のヒストグラムを示す。これは断念の試験である。３つのグラフにおいて、動物が動かない時間（単位：秒−ｓｅｃ）を横軸に示し、異なる試験物質を縦軸に示す。
【図４】異なる注射物質に関する断念ＣＳＭＴ（条件付き運動性抑制）およびＴＳＴ（尾懸垂試験）の試験の実験結果のヒストグラムを示す。ＣＭＳＴグラフで、ある箱から別の箱までの通過の数および動物が直立した回数を横軸で示し、異なる試験物質を縦軸で示す。ＴＳＴグラフにおいて、動物が運動できない時間（単位：秒−ｓｅｃ）を横軸に示し、異なる試験物質を縦軸に示す。
【図５】２週間注射された、生理食塩水の存在下、フルオキセチンの存在下、または本発明のペプチドの存在下での、神経新生の測定のグラフを示す。横軸：ＢｒｄＵ標識に陽性の細胞数。縦軸：試験した物質。
【図６】痛みに対する感度の試験のヒストグラムを示す（左：ホットプレート試験；右：テイルフリック試験）。ヒストグラムＡおよびＢで、縦軸はマウスが反応した時間（秒）であり、横軸は注射によりマウスに投与された溶液である。
【図７】マウスにおける癲癇性発作のヒストグラムを示す。ヒストグラムで、縦軸はマウスの数を示し、横軸は癲癇の段階を示す。測定は、１００μｌの生理食塩溶液または１００μｌの１０-5Ｍペプチド溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ」）で処理されたマウスでの３０ｍｇ／ｋｇ カイニン酸の注射の関数として行なわれる。
【図８】マウスにおいて局所的虚血（脳血管障害のモデル）により引き起こされた梗塞のサイズを定量するヒストグラムを示す。ヒストグラムにおいて、縦軸は梗塞の体積を示し、横軸は、注射された溶液：生理食塩水の溶液（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）またはプロペプチドの溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ）」）のいずれかである。
【図９】１５日間毎日注射されたマウスにおける最後の処理後の６時間および７２時間目の飲料水および餌の摂取量を示すヒストグラム。ヒストグラムにおいて、縦軸が重量（グラム）を示し、横軸は注射される溶液を示す：生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）または１０-5Ｍの濃度のプロペプチド溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ」）。
【図１０】４日間の治療後のマウスでの神経新生のヒストグラムを示す。ヒストグラムにおいて、縦軸が、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）に陽性の細胞数を示し、横軸は、注射された溶液を示す：生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）または１０-5Ｍの濃度のプロペプチド溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ）または３ｍｇ／ｋｇ（「ＦＬＵＯＸＥＴＩＮＥ（３ｍｇ／ｋｇ）」）の濃度のフルオキセチンを含み溶液。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
実施例
本願発明者は、本発明のプロペプチドによるＴＲＥＫ−１チャネルの活動の阻害を実証する電気生理学的試験と、プロペプチドの抗鬱性特性を有効にすることを目的とする種々のいわゆる行動学的試験とを試みた。実際、Ｃ．Ｈｅｕｒｔｅａｕｘ博士の率いるチームは、マウスでは、ＴＲＥＫ−１チャネル遺伝子（ＴＲＥＫ−１−／−またはＫＯ−ＴＲＥＫ−１）のノックアウトが、鬱病に関係していることが認められる行動学的試験により測定された耐鬱病性の表現型を動物に与えることを実証した。従って、ＴＲＥＫ−１を阻害するか、またはＴＲＥＫ−１−／−型の行動を再現することが可能な任意の分子を、抗鬱薬として見なすことが可能である。
【００４６】
本願発明者は、マウス脳幹部分に対するＴＲＥＫ−１とソルチリンの間の同時局在化の実験も実行した。
実施例１：ＴＲＥＫ−１の試験
Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｈｅｕｒｔｅａｕｘの率いるチームは、ＴＲＥＫ−１カリウムチャネルが鬱病の治療の標的となり得ること、およびかかるチャネルのアンタゴニストがよく効く抗鬱薬の特性を有し得ることを実証した。
【００４７】
ＴＲＥＫ−１は、５−ＨＴ（セロトニン）受容体等のＧｑタンパク質経路を活性化する受容体を介してｃＡＭＰレベルを調節する神経伝達物質により制御される。ＴＲＥＫ−１が欠失すると、５−ＨＴ神経伝達が有効に増加する抗鬱の表現型が生じる。ＫＯ−ＴＲＥＫ−１マウスは従来の抗鬱薬で処理された未処理マウスの行動と似た行動を呈する（１５）。これらのデータは、現在存在しないＴＲＥＫ−１チャネルのブロッカーが、新しい世代の抗鬱薬につながる可能性があることを示唆している。したがって、ＴＲＥＫ−１チャネルの往来、アドレス指定、および機能に影響しうるすべてを同定することが重要である。それは、かかる特性を調節するパートナーを発見するという問題である。
【００４８】
本願発明者は、優れた候補が、ソルチリンとも呼ばれるニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）であることを本明細書で実証する。この多機能タンパク質（ＮＴＳＲ３／ソルチリン）は、実際、受容体または同時受容体の役割を果たすことが可能であり、ＮＴＳＲ３／ソルチリンの前駆物質の成熟中に放出されるニューロテンシン、リポタンパク質リパーゼおよびプロペプチド等のいくつかのリガンドを有する。このプロペプチドはニューロテンシンの作用の特異的拮抗薬であり、ＮＴＳＲ３／ソルチリンも、細胞表面での他のタンパク質のアドレス指定に役割を果たす。
【００４９】
ＮＴＳＲ３／ソルチリンがＴＲＥＫ−１チャネルの往来に役割を果たすか否かを確かめるために、本願発明者は２つのタンパク質間の相互作用を検知する目的で実験を行なった。これについて、本願発明者は２つのタンパク質ＮＴＳＲ３／ソルチリンおよびＴＲＥＫ−１によるＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションを行なった。
【００５０】
結果は、抗ＴＲＥＫ−１抗体による細胞抽出物の免疫沈降がＮＴＳＲ３／ソルチリンを共沈させることを示す（図１）。さらに、本願発明者は、電気生理学実験によりＴＲＥＫ−１とＮＴＳＲ３／ソルチリンの間の機能的相互作用を実証した：アラキドン酸によるＴＲＥＫ−１の活性化は、ＮＴＳＲ３／ソルチリンの特異的かつ選択的阻害剤であるプロペプチドにより阻止される（図２）。
【００５１】
図１に示されるゲルを得るために、ＴＲＥＫ−１およびＮＴＳＲ３／ソルチリンでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を溶解させた。上精をプロテインＡセファロースの存在
下で抗ＴＲＥＫ−１抗体（ＩＰ：α−ＴＲＥＫ−１）と４℃で１６時間培養した。
【００５２】
このように沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに配置し、次に、ニトロセルロースに移す。ＮＴＳＲ３／ソルチリンタンパク質は抗ＮＴＳＲ３／ソルチリン抗体により検知される。
【００５３】
実施例２：ＴＲＥＫ−１チャネルの活動に対するプロペプチドの作用
プロペプチドの作用を測定するためのすべての実験を、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザルのサバンナモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓繊維芽細胞に由来する細胞系統）で行なった。これらの細胞を、１μｇのｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＴＲＥＫ−１プラスミドでＤＥＡＥデキストラン方法により細胞をトランスフェクトする２４時間前に、直径３５ｍｍの皿に２０ ０００個の細胞の密度で蒔く。電流の測定値をトランスフェクション後の４８〜７２時間目に得た。
【００５４】
ＣＯＳ−７細胞の培養。ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ参照番号：ＣＲＬ−１６５１）を、５％ＣＯ2の存在下で３７℃でＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣ
Ｓ、ＩＣＮ社）で培養する。
【００５５】
ＤＥＡＥデキストランを使用したトランスフェクション。１日目、ＣＯＳ−７細胞を、２ｍｌの培養培地を含む直径３５ｍｍの皿に２０ ０００個の細胞で蒔く。２日目、培地を除去し、細胞を１μｇのｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＴＲＥＫ−１プラスミドおよび１００μｇのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ社）を含む２００μｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で覆い、その後、３７℃／５％ＣＯ2に配置した。３０分間のインキュベーション後
、２ｍｌの培地ＤＭＥＭ／１０％ ＮｕＳｅｒｕｍ／８０μＭ クロロキンを添加する。３時間後、培地を２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳと取り替え、細胞を電気生理学的方法による測定前の４８〜７２時間培養する。
【００５６】
電気生理学的測定：すべての測定値は室温つまり２１〜２２℃で得られる。プラスミドでトランスフェクトした細胞を、４８０ｎｍでの励起後にＥＧＦＰにより放射された蛍光から検知する。
【００５７】
細胞全体のパッチクランプ技術を使用して、ＴＲＥＫ−１チャネルの活動を測定した。使用した装置はＲＫ ４００パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アメリカ合衆国所在）である。１．３〜８ＭΩの抵抗を有するパッチピペットはホウケイ酸ガラスの毛細管から製造されており、１５５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨｐＨ７．２溶液で充填される。
【００５８】
細胞培養培地を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ テトラエチル塩化アンモニウムを含む１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ ４−アミノピリジンからなる溶液と取り替える。細胞をこの溶液で連続的に潅流する。測定される細胞の細胞膜の残留電位は−８０ｍＶに固定する。
【００５９】
電圧の変化が、連続的ランプ（−１００から＋５０ｍＶまで）でも、または１０ｍＶの電位のジャンプ（−１００から＋４０ｍＶ、１つのジャンプ当たり１．５秒）でも得られる。
【００６０】
得られたデータをＰｃｌａｍｐソフトウェアで分析した。図２Ｂに記載された電流は０ｍＶで得られたものであり、表わされた結果は平均値±標準偏差である。ＩＣ50値はシグモイド関数での実験データのプロットにより得た。
【００６１】
その後、チャネルの活性を上述したように細胞全体の構成でのパッチクランプ技術により測定する。
基準状態では、つまりアラキドン酸（ＴＲＥＫ−１チャネルのよく効く活性薬であることが知られている）による活性化がない状態では、１００μＭのプロペプチドは０ｍＶで測定したチャネル活性の２５％を阻害する（２３ｐＡ／ｐＦに対して３１ｐＡ／ｐＦ）。
【００６２】
チャネルが１０μＭ アラキドン酸で活性化された状態では（１３０ｐＡ／ｐＦに対して３１ｐＡ／ｐＦ）、１００μＭのプロペプチドは０ｍＶで測定したチャネル活性の６７％を阻害する（５６ｐＡ／ｐＦに対して１３０ｐＡ／ｐＦ）。
【００６３】
同じ実験条件では、０ｍＶで測定したＴＲＥＫ−１チャネル活性の阻害の用量反応曲線が構築され、これが図２Ｂに示される。図２Ｂは７０．７ｎＭの半数効果濃度（ＩＣ50）を示している。
【００６４】
実施例３：行動学的試験
本願発明者は、物質の抗鬱活性を決定するための古典的試験と見なされている３種類の行動学的実験を行なった（Nestler E.J., Gould E., Manji H., Buncan M., Duman R.S.,
Greshenfeld H.K., Hen, R. et al. "Preclinical models: status of basic research in depression" Biol Psychiatry. 15, 503-528 (2002)（２０）およびCryan, J. & Holmes, A. "The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety" Nat Rev Drug Discov. 4, 775-790 (2005)（２１））。本発明のプロペプチドの効果を、それを溶解させる食塩水および臨床で最も使用されている抗鬱薬の１つであるフルオキセチンのそれと比較した。使用されるマウス系統はＣ５７Ｂｌａｃｋ／Ｊ系統である。ＴＲＥＫ−１-/-マウスもこれらの種々の試験で測定した。
【００６５】
プロペプチドを１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍおよび１０-8Ｍの所望の濃度となるよう０．９％ＮａＣｌ食塩水に溶解させる。使用した技術に依存して異なる量を注射する：
−脳室内注射：５μｌ
−静脈内注射：１００μｌ
−腹腔内注射：１００μｌ
脳室内（ＩＣＶ）注射の場合、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ社）（商標）を使用する。静脈内（ＩＶ）注射または腹腔内（ＩＰ）注射の場合、０．４５×１２ｍｍの針を使用する。
【００６６】
Ａ．強制的水泳試験（ＦＳＴ）（Ｃｒｙａｎ＆Ｈｏｌｍｅｓ、２００５（２１））
試験物質の注射の３０分後の実験は、２２℃で１１ｃｍの水を入れた直径１５ｃｍおよび高さ３０ｃｍの容器に６分間マウスを浸すことと、最後の４分間の不動時間を測定することとから成る。抗鬱薬で処理したマウスの不動時間は対照マウスより短い。本願発明者は、ペプチドおよび食塩水の種々の注射経路を試験した：脳室内（ＩＣＶ）、静脈内（ＩＶ）、または腹腔内（ＩＰ）。フルオキセチンの投与に対してはＩＰ注射のみを使用した。生理食塩水の注射による対照試験を行なった。
【００６７】
これらの試験の結果を図３のＦＳＴ試験に示す。値±ＳＥＭを対照条件（生理食塩水）と統計学的に比較する。***ｐ＜０．００１、２要因分散分析試験＝事後分析試験が後続
する差異分析試験）。
【００６８】
投与経路にかかわらず、本発明のプロペプチドの効果はフルオキセチンにより生じた効果に匹敵する。プロペプチドで処理したマウスはＫＯ−ＴＲＥＫ−１マウスと同じ行動をする。
【００６９】
次の２つの試験では、本発明のプロペプチドを動物一匹当たり１μＭで１００μｌの割合で静脈内（ＩＶ）経路で投与した。
Ｂ．尾懸垂試験（ＴＳＴ）
（Ｃｒｙａｎ，Ｊ．＆Ｈｏｌｍｅｓ，Ａ．（２００５）（２１）およびRipoll, N., David, D., Dailly, E., Hascoet, M. & Bourin, M. "Antidepressant-like effects in various mice strains in the tail suspension" Behav Brain Res. 143(2:193-200 (2003)（２２）参照）
マウスへの試験物質の注射の３０分後の実験は、粘着性リボンでマウスを尾部で懸垂することと、６分間不動時間を測定することとから成る。
【００７０】
図４（ＴＳＴ）のグラフに示されるように、抗鬱薬で処理したマウスの不動時間は対照マウスよりも短い。
この実験では、再び、本発明のプロペプチドの効果がフルオキセチンにより生じた効果に匹敵し、プロペプチドで処理したマウスはＴＲＥＫ−１-/-マウスと同じ行動をする（
図４、ＴＳＴ）。
【００７１】
プロペプチドを、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍおよび１０-8Ｍの所望の濃度となるよう０．９％ＮａＣｌ食塩水に溶解させる。使用した技術に依存して異なる量を注射する：
−脳室内注射：５μｌ
−静脈内注射：１００μｌ
−腹腔内注射：１００μｌ
脳室内（ＩＣＶ）注射の場合、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ社）（商標）を使用する。静脈内（ＩＶ）注射または腹腔内（ＩＰ）注射の場合、０．４５×１２ｍｍの針を使用する。
【００７２】
Ｃ．条件付き運動抑制試験（ＣＭＳＴ）（Dauge, V., Sebret, A., Beslot, F., Matsui, T., & Roques B. "Behavioral profile of CCK2 receptor-deficient mice" Neuropsychopharmacol; 25: 690-698 (2001)（２３）参照）。
【００７３】
実験は、１日目にマウスを条件付けすることと、２日目に物質の効果を測定することとから成る。
１日目に、床が電気刺激装置に接続された金属鉄格子である箱に各マウスを入れる。条件付けは、電気ショック（１．８ｍＡ、２００ｍｓ）と後続する１２秒の潜伏期とから構成された３０シーケンスの生成から成る（合計条件付け時間：６分）。その後、マウスをケージに戻し、２４時間回復させる。
【００７４】
２日目に、マウスに種々の試験物質を注射し、次に３０分後に、条件付けに使用した箱に戻した。この箱では、床が６つの同じ箱に分割されている。電気ショックは伝えない。
測定は、マウスが箱を変更した回数または直立した回数を６分間手作業で数えることから成る。
【００７５】
未処理のショックを受けたマウス（生理食塩水）はほとんど移動せず（「不動」）、処理したショックを受けたマウスは、未処理のショックを受けたマウスに比べてかなりの運動性を回復し：フルオキセチン（３ｍｇ／ｋｇの注射の割合）では５倍大きく、本発明のプロペプチドでは７倍大きかった。
【００７６】
この試験の実験結果を図４に示す。ＴＲＥＫ−１-/-マウスは対照よりも６倍の大きな
運動性を有する（図４のＣＳＭＴ）。
これらの実験結果はすべて、本発明のプロペプチドがフルオキセチンと少なくとも同程
度か、「条件付き運動性抑制」試験の場合にはそれよりも大きな抗鬱薬特性を有することを明らかに実証している。
【００７７】
さらに、本発明のプロペプチドが、大槽内経路だけでなく静脈内経路または腹腔内経路によっても作用するという事実は、本発明のペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に横切ってその効果を及ぼすことを示している。この特性は臨床試験の場合に容易に置換される慢性治療薬の可能性を開いている。
【００７８】
実施例４：神経新生に対するプロペプチドの効果
抗鬱薬による治療は海馬の神経新生を増加させることが知られている（Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O, Belzung, C, Hen, R et al. "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003)（２４））。この細胞増殖は、マーカーである５−ブロモ−２−デオキシウリジン（
ＢｒｄＵ）を組込み、かつ成熟ニューロンに変形される「先祖」細胞の増加から測定される。ＢｒｄＵは免疫組織化学により検知される。
【００７９】
１日目に、動物に３００μｌの１０ｍＭ ＢｒｄＵ水溶液を腹腔内注射し、その後ケージに戻した。
２日目に、動物を安楽死させ、組織を４％ パラホルムアルデヒドの冷溶液の心臓内潅流により固定する。脳を敵手巣し、−２０℃で凍結させる。
【００８０】
一連の４０μｍ切片を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ社）を使用して、海馬の構造全体を網羅するように調製する。６つの切片ののうちの１つを、モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によるＢｒｄＵ取り込みの測定のために保持する。この一次抗体は、ビオチンおよびアビジンペルオキシダーゼに結合する二次抗体により顕在化される。ペルオキシダーゼ活性をＤＡＢの加水分解により目で見えるようにする。このように標識付けされた細胞を各切片について数える。
【００８１】
各群、食塩水、プロペプチドまたはフルオキセチンに対し、各切片のＢｒｄＵ標識された細胞の数を合計され、全体構造を表わすように６を乗算する。各群はそれぞれ３匹のマウスから構成され、表された結果は３匹の動物の平均値である。
【００８２】
得られた結果を、図５にヒストグラムで示す。このグラフは神経新生の測定を示す。生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）および１０μＭプロペプチド（「ＰＥ １０-5Ｍ」）を２週間注射した。また、フルオキセチンも飲料水に入れて８０ｍｇ／ｌ溶液を、フルオキセチンの効能を得るのに必要であることが分かっている期間２週間投与した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【００８３】
これらの結果は、プロペプチドが、フルオキセチンによって引き起こされる神経新生に匹敵する多くの神経新生を誘発することを明白に実証している。プロペプチドで得られた測定値と、フルオキセチンで得られた測定値との間に有意差はない（事後分析試験が後続する１要因分散分析試験）。
【００８４】
実施例５：痛みに対するプロペプチドの効果
本発明のペプチドは、ＴＲＥＫ−１チャネルの活性を阻害する。考えられる主な副作用は、ＴＲＥＫ−１チャネル活性の遮断により引き起こされる副作用である。実際、Ｃ．Ｈｅｕｒｔｅａｕｘが率いるチームによる研究（Heurteaux C., Guy, N., Laigle, C., Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann, C. et al. "TREK-1, a K(+) channel involved in neuroprotection and general anesthesia" EMBO J, 2
3: 2684-2695 (2004) （２５）およびAlloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noel J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. "TREK-1, a K+ channel involved
in polymodal pain perception" EMBO J; 25: 2368-2376 (2006)（１７））によると、
ＴＲＥＫ−１チャネルをノックアウトしたマウス（ＴＲＥＫ−１-/-）が以下の通りであ
ることが示された：
−野生マウスよりも痛みに対して敏感である（Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noel J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto
M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. "TREK-1, a K+ channel involved in polymodal pain perception" EMBO J; 25: 2368-2376 (2006)（１７）。
【００８５】
−αリノレン酸等の多価不飽和脂肪酸の神経保護効果が、脳虚血の場合にノックアウトマウスで消失した。
−カイニン酸の注射により誘発される癲癇性発作は、ＴＲＥＫ−１-/-マウスでははる
かに十度で、死に至ることが非常に多かった（Heurteaux C., Guy, N., Laigle, C., Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann, C. et al. "TREK-1, a K(+) channel involved in neuroprotection and general anesthesia" EMBO J, 23: 2684-2695 (2004)（２５）。
【００８６】
痛みに対する感度は２つの試験、すなわちホットプレート試験と「テイルフリック」試験で測定した。
１．ホットプレート
この試験は、所定温度に維持したプレート上にマウスを置いた時に、マウスが自身の後足を舐めた時間を測定することから成る。５０℃と５６℃の２つの温度を使用した。
【００８７】
使用したマウスはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスであった。各群はそれぞれ１０匹のマウスから構成された。
第１群の「未処理」マウスは注射を受けず、第２の群のマウスは、１００μｌの生理食塩水の静脈注射を受け（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）、最後に第３の群は、１００μｌの本発明のペプチドを含む溶液の注射を１０-6Ｍの濃度で受けた（「ＰＥ １０-6Ｍ」）。
【００８８】
その後、熱に対する感度をマウスの３つの群で測定し、得られた結果を比較した。
測定値は注射の３０分後に得た。
結果を図６Ａに示す。
【００８９】
これらの結果は、５０℃では動物の３つの群の間で統計学的差がないことを明白に実証している：未処理：１９．４＋／−１．６秒、生理食塩水注射：２１．３＋／−２．１秒、およびＰＥ注射：２１．１＋／−１．５秒秒。５６℃では、未処理：５．３＋／ −１．６秒、生理食塩水注射：３．８＋／−０．７秒およびＰＥ注射：４．６＋／−０．９秒。
【００９０】
統計学的差は、事後分析試験が後続する１要因分散分析試験を使用して測定した。
この実施例は、本発明のペプチドが痛覚過敏を引き起こさないことを明白に実証している。
【００９１】
２．２．「テイルフリック」試験
この試験は、４８℃の湯浴にマウスの尾を浸し、湯浴から尾を引っ込めるのにかかる時間を測定することから成る。任意の注射の前に、マウスに馴化試験を行なった。馴化試験は、任意の処理前に（１２秒未満の反応時間を得る）、群が均質になるよう各動物の尾を
２回湯浴に浸すことから成る。その後、マウスに１００μｌの生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）または１００μｌの配列番号２のペプチドを１０-6Ｍの濃度で（「ＰＥ
１０-6Ｍ」）注射した。
【００９２】
使用したマウスはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスであった。各群はそれぞれ１０匹のマウスから構成された。
測定値は注射の３０分後に得た。図６Ｂに示した結果は、マウスの２つの群間に有意差がないことを示している：生理食塩水：７．０＋／−０．６秒およびＰＥ：８．３＋／ −０．７秒。
【００９３】
差はステューデントｔ検定を使用して評価した。この試験により２つの群間に有意差がないことが確認された。
上記ホットプレート試験および「テイルフリック試験」は、配列番号２のペプチドの注射が痛覚過敏を引き起こさないことを明白に実証している。
【００９４】
実施例６：癲癇に対するプロペプチドの効果
この実験では、使用したマウスはＣ５７ＢＬ６／Ｊであり、１つの実験群当たり１０匹のマウスとした：「生理食塩水」群（１００μｌの生理食塩水の腹腔内注射を受けた）および「ＰＥ １０-5Ｍ」群（１００μｌの本発明のペプチドを含む溶液を１０-5Ｍの濃度で受けた）。各実験群で、１００μｌの３０ｍｇ／ｋｇの割合のカイニン酸の腹腔内注射により癲癇性発作を引き起こした。癲癇性発作の段階についての観察をカイニン酸注射の９０分後に行なった。これはマウスの行動の観察に基づいた。
【００９５】
癲癇性発作の異なる段階はTsirka S.E., Gualandris, A., Amaral, D.G., Strickland,
S. "Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator", Nature, 377: 340-344 (1995)（２６）の文献に示されてい
る。
【００９６】
癲癇の攻撃の強さについて記述するために６つの段階が定義されている：
段階１：不動
段階２：頭および襟首の動き
段階３：片側の慢性的活動
段階４：両側の慢性的活動
段階５：全身の痙攣
段階６：動物の死
図７に示した結果は、「生理食塩水」群では５匹が段階５に達したのに対し、ペプチドを注射した動物では２匹しか段階５に達しないため、本発明のペプチドはカイニン酸誘発性の発作を悪化させないだけでなく、逆に有益な効果があることを示す。さらに、死んだただ１匹の動物は「生理食塩水」群にいた。
【００９７】
統計分析を、事後分析試験が後続する２要因分散分析試験を使用して行った。
したがって、この実施例は、プロペプチドが癲癇性発作を誘発せず、逆に癲癇に対して保護効果を有することを明白に実証している。
【００９８】
実施例７：脳血管発作（ＣＶＡ）の危険に対するプロペプチドの効果
ＣＶＡを誘発するために使用したモデルは、糸を用いた中大脳動脈の閉塞から成る局所虚血モデルである。（Heurteaux C., Laigle, C., Blondeau, N., Jarretou, G., Lazdunski, M. "Alpha-linolenic acid and riluzole treatment confer cerebral protection and improve survival after focal brain ischemia" Neuroscience, 137: 241-251 (2006)（２７））。この局所虚血により誘発された梗塞のサイズを、クレシルバイオレットで
脳切片を染色した後で測定した。梗塞は、Heurteauxら、2006（２７）に記載された方法
に従って画像解析システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ Ｓｏｆｔ社）で梗塞領域の輪郭をトレースすることにより測定される。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（１実験群当たり１０匹のマウスの割合）の脳を、１０-5Ｍの濃度の１００μｌの配列番号２のぺプチドを含む溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ」群）または生理食塩水の溶液（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」群）の腹腔内注射で毎日一週間処理する。値は２つの群間で比較した。
【００９９】
図８に示した結果は、動物の２つの群間に有意差がないことを明白に実証している。
差はステューデントｔ検定を使用して評価した。この試験により２つの群間に有意差がないことが確認された。
【０１００】
この実施例は、局所虚血によって誘発された梗塞のサイズにペプチドが有意な効果を有しないことを明白に実証している。したがって、この実施例は、配列番号２のペプチドがニューロン損傷の増加を引き起こさず、かつ脳血管発作の危険を増大させないことを明白に実証している。
【０１０１】
実施例８：餌摂取に対するプロペプチドの影響
餌および飲料水の摂取量も測定した。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（１群当たりｎ＝１０）の２つの実験群を使用した：第１の群は、１００μｌの生理食塩水を１５日間腹腔内注射で毎日受け取り（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）、第２の群は１００μｌの配列番号２のペプチドを含む溶液を１０-5Ｍの濃度で１５日間腹腔内注射で毎日受け取った（「ＰＥ １０-5Ｍ」）。
【０１０２】
これらの測定値を長期処理の終了後の６時間目および７２時間目に得た。餌の摂取量または飲料水の摂取量に関し、処理動物と未処理動物の間に有意差はない（図９）。
差はステューデントｔ検定を使用して評価した。この試験により2つの群間の餌および
飲料水の摂取量に有意差がないことが確認された。
【０１０３】
この実施例は、配列番号２のペプチドが動物の餌の摂取に有意な効果がないことを明白に実証している。
実施例９：プロペプチドの作用の遅延の測定
現在一般に使用されている多くの抗鬱薬とは対照的に、本発明のペプチドの作用の効能は非常に迅速である。実際、抗鬱薬の効能を実証する実験的方法の１つは、新しい神経の新生（Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O, Belzung, C, Hen, R et al. "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003)（２４））の測定である。実際、フルオキセチン等の抗鬱薬は
約２週後に神経新生を誘発する。この神経新生は、抗鬱薬の作用機序の重要な要素である。臨床では、鬱病が海馬の錐状体細胞の萎縮（Sheline, Y.I., Wang, P.W., Gado, M.H.,
Csernansky, J.G., Vannier, M.W. "Hippocampal atrophy in recurrent major depression" Proc Natl Acad Sci placecountry-regionUSA. 93: 3908-3913 (1996)（２８））と、海馬歯状回における神経新生の相当な減少（Gould, E., Tanapat, P., McEwen, B.S., Flugge, G., Fuchs, E. "Proliferation of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress" Proc Natl Acad Sci USA, 95: 3168-3171 (1998)（２９））とに関係していることが実証されている。
【０１０４】
実験プロトコルは、４日間の処理期間を除き、Santarelliらの研究（Santarelli et al., "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003)（２４））のmaterials and methods（補足）に記載されたものとする。
【０１０５】
図１０の結果は、神経新生の誘発におけるペプチドの作用の非常な速さを示している。ペプチド（「ＰＥ １０-5Ｍ」）で、神経新生に有意な増加がある。フルオキセチン（「フルオキセチン、３ｍｇ／ｋｇ」）により誘発された神経新生は、４日間の期間に生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）の注射により誘発された神経新生と同一である。
【０１０６】
増加を、事後分析試験が後続する１要因分散分析試験を使用して評価した。ポストホック試験が後続する１つの要因分散分析試験を使用して評価された。この試験により、「生理食塩水」群に比べて、フルオキセチンによってではなく本発明のペプチドによって誘発される神経新生に有意な増加があることが確認された。
【０１０７】
したがって、上記実施例は、精神疾患および炎症性現象ならびに／もしくは疼痛現象の治療に本発明のペプチドを使用可能であることを明白に実証している。さらに、本発明のペプチドは、先行技術の抗鬱薬の既知の副作用を引き起こさず、先行技術の抗鬱薬よりも作用の遅延が短い（つまり作用が大幅に迅速である）。
【０１０８】
参考文献一覧
【０１０９】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）に由来するペプチド、および精神疾患の治療におけるその使用に関する。本発明は詳細には、医薬品（例えば抗鬱薬）の製造のためのかかるペプチドの使用に関する。
【０００２】
本発明は製薬業の分野、特には精神疾患の治療に使用される薬物開発の領域に応用される。
本発明は新規な抗鬱薬の開発に特に応用される。また、本発明は痛みの治療に応用される。
【０００３】
以下の説明では、括弧間の参照数字（ｘ）は、実施例の最後の参考文献一覧を指す。
【背景技術】
【０００４】
精神疾患は現実の公衆衛生の問題である。最新の研究によると鬱病の高い罹患率が確認されており、一生涯にわたって、女性の２０％および男性の１０％は非特許文献１に記載されているような鬱病症状の発現を有しているか、または有すると予想される。そのような数字は明らかに顕著になっており、鬱病の主な併発症である自殺を考慮した場合にも、非特許文献２に記載されているようにフランス等の国では年間の死亡者が１２０００人に達する。
【０００５】
鬱病はしばしば無能力になる非常に流行している疾患である。鬱病は工業先進国の人口の２０％以下に影響を及ぼす可能性がある。その起源は多様かつ多数である。鬱病は心理と患者の行動および生理的状態との両方に影響を及ぼす。鬱病の治療もまた多数あり、使用される医薬品の作用機序は明確には確立されていない。
【０００６】
世界保健機構（ＷＨＯ）は、単極性鬱病が２０２０年には障害者の第２の原因になるだろうと予測している。鬱病に罹患している個人および家族が示すのと同様、この病気には重要な社会負担がある。鬱病は、既に仕事を休職する主な理由の１つとなっており、経済的負担は年間３００億ユーロを超える。医療従事者に利用可能な治療薬の蓄積にもかかわらず、特定のＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害剤）およびＳＮＲＩ（セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害剤）では、鬱病の人口の３０％は治療を受けていない。さらに、抗鬱薬の作用の遅延は約３〜６週間であり、重大な副作用がある場合が多い。
【０００７】
一般に、鬱病患者の１５％が自殺で死亡していると推測されている。非特許文献３に記載されているように、ほとんどの患者では、鬱病は遺伝的素因と、素取れるまたは情緒的トラウマ等の環境要因との間の相互作用による。
【０００８】
鬱病はよくある疾患であり、抗鬱薬（ＡＤ）の市場は巨大である（少なくとも１００億ユーロ／年）。
しかしながら、これらの抗鬱薬は症例の約７０％で患者の状態を改善するが、疾患の完全寛解に至るのはたった３０〜４０％でしかない。さらにほとんど、治療された患者のほぼ３分の１は既存の治療に耐性を示す。したがって、これらの状況から、非特許文献の鬱病の機序を考慮することが可能な、新規な治療薬を考える必要がある。
【０００９】
医療従事者に利用可能な治療薬の蓄積では、アミトリプチリンおよびイミプラミンを含む三環系抗うつ薬（ＴＣＡ）が初めに発見され、次にモノアミン酸化酵素阻害剤（ＭＡＯ
Ｉ）が発見され、フェネルジンおよびパルギリン等の不可逆的かつ非選択的な薬が発見された。望ましくない効果、特にＴＣＡの心臓毒性（特に過剰投与の場合）およびＭＡＯＩの高血圧の発症（食品中のチラミンとの相互作用、「チーズ効果」として有名）は、同じ治療効果を有するが受容性により優れた新規な分子の研究を推進した。
【００１０】
その後、ノルエピネフリン（ＮＥ）またはセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンすなわち５−ＨＴ）の回復の特異的阻害剤に関し、選択性の概念が現われた。かかる阻害剤分子に対する第ＩＩＩ相臨床試験により、特に過剰投与の場合に、第一世代の抗鬱薬と透過な有効性とより優れた安全性が実証された。
【００１１】
非特許文献４および非特許文献５に記載されているように、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）および選択的ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）は、現在最も使用されている分子である。ＡＤは、このようにモノアミン作用系の伝達の促進に最も繁く関与している。
【００１２】
セロトニン、ノルエピネフリンおよびドーパミンが関与していることは疑いないが、現在、ＡＤにより生じたモノアミンのレベルの変化および結果として乗じた適応プロセス、特には特定の受容体の感度の変化は、それ自体のみで抗鬱薬の作用機序を説明することができないと考えられている。
【００１３】
したがって、ＡＤが効果を現わすまでの３〜６週間の遅延を、製品の最初の投与で生じるシナプスレベルのモノアミンの増大と相関させるのは難しい。ほぼ半世紀の間、鬱病の原因とその治療に関する仮説の数は絶えず増加している。
【００１４】
例えば、高濃度のグルココルチコイドは一般に、非特許文献６に記載されているようにＢＤＮＦ（「脳由来神経栄養因子」）の合成、グルタミン酸の過剰分泌、および／またはグルコース取込みの減少を介して、気分のネガティブな影響と、海馬での構造の変化とに関与している。
【００１５】
これらの知見によれば、グルココルチコイドおよびグルココルチコイド受容体アンタゴニストの合成の阻害剤は、非特許文献７に記載されているようなＡＤ型の効果を発揮する。
【００１６】
特にサブスタンスＰ（特にはＮＫ１）またはＣＲＦ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）受容体に作用するアンタゴニストや、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが開発されており、特定の効果を奏している（非特許文献８〜１０参照）。
【００１７】
ストレス状況下および鬱病モデルで行なわれた種々の最近の研究は、非特許文献１１〜１３に記載されているように、大鬱病性障害の病因に神経新生を関連付けている。電気ショック療法を含むすべての慢性ＡＤ治療は、海馬の顆粒層のニューロンの起源である始原細胞の増殖を刺激することが実証された。
【００１８】
ＡＤが、ＣＲＥＢ、Ｂｃｌ２またはＭＡＰキナーゼ等の細胞の生存および成長に関与する種々の因子の発現を調節することも知られている。しかしながら、気分障害の生理病理状態におけるかかる新しく形成されたニューロンの機能の重要性は、未だ論争中である。（非特許文献１４参照）
上記から、鬱病が多元的生理病理状態の複合病であることは明らかである。従って、この病理状態の治療は未だ課題である。
【００１９】
４０年超の間、鬱病の研究および有効な薬物治療の開発は、モノアミン作動仮説により
支配されていた。モノアミン作動性神経伝達物質（セロトニン、ノルエピネフリンおよびドーパミン）は疑いなく関与しているが、鬱病の生理病理状態およびＡＤの作用機序に関する仮説の数は増加し続けている。
【００２０】
抗鬱薬の既知の副作用は、その作用様式と関係する。例えば、抗鬱薬は頻脈、体重増加、性欲減少、発汗、食欲減退、ならびに神経学的変化（例えば頭痛）の発現、脳血管発作（ＣＶＡ）、および癲癇性発作を誘発する場合がある。
【００２１】
現在使用中の抗鬱薬は、口腔乾燥症、目のかすみ、および腸の不調（下痢または便秘）を含む一連の望ましくない作用を生じさせる。多くの副作用（例えば嘔気）は一時的であるが、一部にはより永続的（例えば性的作用）であるように思われ、治療薬の長期遵守に影響を及ぼす危険性がある。そのため、鬱病で最近同定された受容体またはチャネルに作用する、新規な分子を発見することは重大である。
【００２２】
鬱病の分子機構には、特定のタンパク質（受容体およびチャネル）が関与している。これは元々ソルチリンと呼ばれていたニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）およびマウスでの不活性化により鬱病耐性の表現型が生じるＴＲＥＫ−１バックグラウンドカリウムチャネル（非特許文献１５）で特に当てはまる。これらのチャネルと有効に相互作用する分子は現在まで同定されていない。
【００２３】
したがって、精神障害（特に鬱病）の治療に使用可能な新規な分子−より効果が高く、許容性に優れ、かつ迅速に作用する分子−が実際に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Wong, M. & Licinio, J. "Research and treatment approaches to depression" Nat Rev Neurosci. 2, 343-351 (2001)
【非特許文献２】Moller HJ. "Suicide, suicidality and suicide prevention in affective disorders" Acta Psychiatr Scand 418 (suppl): 73-80 (2003)
【非特許文献３】Nestler E., Barrot M., DiLeone R.J., Eisch A.J., Gold S.J., Monteggia, L.M. "Neurobiology of depression" Neuron 34, 13-25 (2002)
【非特許文献４】Baghai TC, Volz HP, Moller HJ. "Drug treatment of depression in the 2000s: An overview of achievements in the last 10 years and future possibilities" World J Biol Psychiatry; 7: 198-222 (2006)
【非特許文献５】Weilburg JB. "An overview of SSRI and SNRI therapies for depression" Manag Care, 13 (6 Suppl Depression): 25-33 (2004)
【非特許文献６】Manji HK, Gottesman II, Gould TD. "Signal transduction and genes-to-behaviors pathways in psychiatric diseases" Sci STKE; 207: pe49 (2003)
【非特許文献７】Reus VI, Wolkowitz OM. "Antiglucocorticoid drugs in the treatment of depression" Expert Opin Investig Drugs; 10: 1789-1796 (2001)
【非特許文献８】Griebel G, Simiand J, Steinberg R, et al. "4-(2−C hloro-4-methoxy-5-methylphenyl)-N-[(1S)-2-cyclopropyl-1-(3-fluoro-4-methylphenyl)ethyl]5-methyl-N-(2-propynyl)-1,3-thiazol-2-amine hydrochloride (SSR125543A), a potent and selective corticotrophin-releasing factor (1) receptor antagonist. II. Characterization in rodent models of stress-related disorders" J Pharmacol Exp Ther; 301: 333-345 (2002)
【非特許文献９】Kramer MS, Cutler N, Feighner J, et al. "Distinct mechanism for antidepressant activity by blockade of central substance P receptors" Science; 281: 1640-1645 (1998)
【非特許文献１０】Skolnick P. "Antidepressants for the new millennium" Eur J Pharmacol; 375: 31-40 (1999)
【非特許文献１１】Kempermann G, Kronenberg G. "Depressed new neurons: Adult hippocampal neurogenesis and a cellular plasticity hypothesis of major depression" Biol Psychiatry; 54: 499-503 (2003)
【非特許文献１２】Malberg JE, Schecter LE. Increasing hippocampal neurogenesis: a novel mechanism for antidepressant drugs" Curr Pharm Des; 11: 145-155 (2005)
【非特許文献１３】Duman, R. & Monteggia, L. "A neurotrophic model for stress-related mood disorders" Biol Psychiatry; 9: 1116-1127 (2006)
【非特許文献１４】Henn FA, Vollmayr B. "Neurogenesis and depression: etiology or epiphenomenon?" Biol Psychiatry, 56: 146-50 (2004)
【非特許文献１５】Heurteaux, Lucas, Guy, El Yacoubi, Thummler, Peng, Noble, Blondeau, Widmann et al. "Deletion of TREK-1, a background potassium channel, results in a depression-resistant phenotype" Nature Neurosci., 9, 1134-1141 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、上記必要性に取り組み、先行技術の欠点を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
ＮＴＳＲ３の成熟は、プロペプチドと呼ばれるペプチドを放出し、このプロペプチドが同じタイプの受容体のリガンドになる。興味深いことに、このプロペプチドは、ＴＲＥＫ−１チャネルの活動を遮断することも可能である。
【００２７】
実際、ＮＴＳＲ３は前駆物質（ｐｒｏＮＴＲ３−ソルチリン）の形で合成される。前駆物質の成熟は、フリンによってもたらされ、以下の配列の４４個のアミノ酸からなるペプチド（プロペプチド）を放出する：
ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ （配列番号１）
このペプチドは、成熟（ＮＴＳＲ３）受容体にも結合可能である。構造と機能の関係に関する研究により、このペプチドの１７個のアミノ酸部分がすべての受容体結合活性を担っていることが分かっている。そのペプチド部分とは以下の通りである：
ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ （配列番号２）
この配列番号２の配列は、上記の主たるペプチド中の下線部分に相当する。下記に記載する実験に使用されたのは、このペプチドである（これを本願発明者らはプロペプチドと称する）。
【００２８】
したがって、本発明は、配列番号２のペプチドもしくは該ペプチドの断片、またはニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のリガンドである該ペプチドの誘導体に関する。それは。このペプチドの「断片」および「誘導体」は、例えばアミノ酸をその等価物に置換するかまたは結果としてその活性を変更させずにペプチドを短くすることにより、当業者が添付の配列番号１または２から容易に得ることが可能なものである。
【００２９】
これらの「断片」または「誘導体」は、本発明のペプチドが有するニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のリガンド特性を保存するものである。以下の説明では、本発明のペプチドを「ペプチド」または「プロペプチド」とも称する。「誘導体または断片」は本
発明のペプチドのアナログと見なすことも可能である。
【００３０】
本ペプチドの生体内半減期はまだ確立されていないが、ペプチドの安定性または生体内利用率（バイオアベイラビリティ）を改善するために、本願発明者らは、各アミノ酸に対し、および各アミノ酸間の結合の性質に対し、既に改変を想定している。改変は例えば以下の通りである：
−少なくとも１つのアミノ酸の、同じファミリー（芳香性アミノ酸、疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸等）からの別のアミノ酸への置換；
−天然アミノ酸（Ｌアミノ酸）の、Ｄ形の同じアミノ酸による置換；
−２つのアミノ酸間のペプチド結合の、疑似ペプチド結合による置換。
【００３１】
実際、これらの改変は、ペプチダーゼおよびプロテアーゼによるタンパク質分解の攻撃に強いペプチドを生成する。
本発明は、上記ペプチドまたはペプチド断片もしくはペプチド誘導体をコードする核酸配列にも関する。ソルチリンＳＯＲＴ １のメッセンジャーＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋ受入番号：マウス、ＮＭ＿０１９９７２：ヒト、ＮＭ＿００２９５９。このペプチド配列は、例えば添付の配列表の配列番号２を有する配列である。かかる配列は、本発明のペプチド、ペプチド断片、またはペプチド誘導体をコードする任意の適切な配列であってよい。この配列は、トランスフェクションにより本発明のペプチドもしくは断片または誘導体を作製するために好ましくは使用される。
【００３２】
本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターにも関する。ベクターは、細胞により、遺伝子組換え技術で、本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体を製造するために宿主細胞を形質転換するのに適した任意のベクターであってよい。ベクターは、ｐＩＲＥＳならびにｐＩＲＥＳ２およびその派生物、ｐｃＤＮＡ３およびその派生物、ならびにｐＧＥＸおよびその派生物を含むグループから選択されたベクターから得られ得る。
【００３３】
したがって、本発明は、本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体、本発明の核酸配列、および／または本発明のベクターを有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、形質転換されるか、または本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体を製造するのに適した任意の細胞であってよい。宿主細胞は、例えばＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ ２９３およびその派生物、ならびにＮ１Ｅ１１５およびその関連細胞であってよい。
【００３４】
したがって、本発明は、本発明のペプチドもしくはペプチド断片またはペプチド誘導体
誘導体を生産する方法であって、
−本発明の核酸で宿主細胞をトランスフェクトするか、または本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
−配列番号２のペプチドもしくは該ペプチドの断片または該ペプチドの誘導体の発現を許容する条件で、前記宿主細胞を培養する工程、および
−配列番号２のペプチドもしくは該ペプチドの断片または該ペプチドの誘導体を回収する工程
からなる方法にも関する。
【００３５】
本発明のペプチドもしくは該ペプチドの断片または該ペプチドの誘導体を製造するのに使用できるトランスフェクションの技術および形質転換の技術は、当業者に周知である。例えばKrieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. "Affinity purification of synthetic peptides" Proc Natl Acad Sci USA; 73: 3160-3164 (1976)（１６）に記載。
【００３６】
本発明によれば、ペプチドの製造の好ましい方法は、例えば固相での化学合成である。当業者に周知のいかなる技術を使用することも可能である。例えば、ペプチドは、Krieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. "Affinity purification of synthetic peptides" Proc Natl Acad Sci USA; 73: 3160-3164 (1976)（１６）の固相法により合成可能である。
【００３７】
本発明の分子は、新しいクラスの抗鬱薬の開発における新規な経路および精神疾患の新規な治療戦略を切り開く。
したがって、本発明は、医薬品としての本発明のペプチドもしくはその断片または該ペプチドの誘導体の使用方法にも関する。
【００３８】
特に、本発明は、精神障害の治療の治療を意図した医薬品の製造のための、例えば抗鬱薬および／または鎮痛薬の製造のための、ペプチドもしくはその断片または該ペプチド誘導体の使用方法にも関する。
【００３９】
本発明のペプチドもしくはその断片またはその誘導体は、上記に定義したように、新しいタイプの抗鬱薬を構成する天然産物であり、精神障害の治療に現在使用されている医薬品の望ましくない副作用をすべて回避することを可能にする。先行技術で使用されている医薬品の副作用は、それ自体の化学的性質から生じている。先行技術のこれらの医薬品は、細胞の原形質膜を受動的に横切る特性をしばしば有する分子であり、これは細胞内のエフェクターとの非特異的相互作用につながる。本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの疑似ペプチド特性により、かかる問題を回避することが可能となる。
【００４０】
さらに、ＴＲＥＫ−１カリウムチャネルに対する本発明のペプチドの直接作用は、従来の抗鬱薬の作用のしばしば長期になる遅延を低減させ得る（上記の先行技術を参照）。
さらに、ＴＲＥＫ−１チャネルは、伸張、浸透圧、および温度に対する感度が高い。本願発明者は、ＴＲＥＫ−１が痛みの認識に関与する分子の１つであることを実証した。ＴＲＥＫ−１は、脊髄の後根神経節の小感覚ニューロンに多く発現しており、ペプチド作動性ニューロンと非ペプチド作動性ニューロンの両方で存在し、ＴＲＰＶ１（温熱性痛覚過敏に関係するカプサイシン活性化非選択的イオンチャネル）と共に存在している。ＫＯ（「ノックアウト」）マウスは、痛みの感覚と熱に対してより敏感である。この表現型は、熱により敏感な多モードのＣ線維に局在化している。また、ＫＯマウスは低閾値の機械的刺激により敏感であり、炎症の状態では熱および機械に対する知覚過敏が増加する。かかる研究は、Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, No・ J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. "TREK-1, a K+ channel involved in polymodal pain perception" EMBO J; 25: 2368-2376 (2006)（１７）に記載されており、新規な鎮痛薬の開発
のための非常に興味深い標的としてＴＲＥＫ−１チャネルを指定している。従って、かかるＴＲＥＫ−１チャネルに対して活性な分子であればいかなるものも、侵害受容の領域で重要な治療効果を有する可能性がある。
【００４１】
さらに、ＮＴＳＲ３は炎症に関係する。本願発明者は、ＮＴＳＲ３が、ミクログリア細胞由来の炎症性サイトカインの移動および放出に対するニューロテンシン（ＮＴ）の効果の原因であることを実証した（Martin S, Vincent JP, Mazella J. "Involvement of the
neurotensin receptor-3 in the neurotensin-induced migration of human microglia"
J Neurosci. 23: 1198-1205 (2003) （１８）およびMartin S, Dicou E, Vincent JP, Mazella J. "Neurotensin and the neurotensin receptor-3 in microglial cells" J Neurosci Res.; 81: 322-326 (2005)（１９）参照）。
【００４２】
本発明のペプチドは、ＮＴの効果に拮抗する特性を有する。従って、ＮＴの炎症性作用
を遮断可能な分子であればいかなるものも、大脳の炎症領域に重要な治療効果を有し得る。
【００４３】
他の利点は、添付の図面を参照して、限定ではなく例示の目的で与えられた以下の実施例を読めば当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＮＴＳＲ３受容体有りまたは無しで、抗ＴＲＥＫ−１抗体により免疫沈降させた、ＴＲＥＫ−１チャネルでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の膜抽出物から準備されたウェスタンブロットを示す。ＮＴＳＲ３／ソルチリン受容体は抗ソルチリン抗体により明らかにされる。
【図２】ＴＲＥＫ−１チャネル活性の阻害の測定の実験結果を示す曲線を示す。グラフＡでは、電流密度Ｉ（ｐＡ／ｐＦ）を横軸に示し、ｍＶで表わされる印加電圧（Ｖ）を縦軸に示す。挿入部分で、プロットは種々の電圧における電流の振幅を表わす。対照：標準状態、ＡＡ：１０μＭのアラキドン酸による電流の活性化、ＡＡ＋ＰＥ：１００ｎＭのＰＥの存在下での１０μＭのアラキドン酸による電流の活性化。グラフＢでは、１０μＭのアラキドン酸により活性化されたＴＲＥＫ−１電流の阻害率を横軸に示し（０ｍＶで測定された阻害％）、ｎＭで表わされるＰＥの濃度を縦軸に示す。これらの図では、ｐＡ＝ピコアンペアおよびｐＦ＝ピコファラドである。
【図３】３つの異なる注射方法、および異なる注射物質に関して行なわれた強制的な水泳試験の実験結果のヒストグラムを示す。これは断念の試験である。３つのグラフにおいて、動物が動かない時間（単位：秒−ｓｅｃ）を横軸に示し、異なる試験物質を縦軸に示す。
【図４】異なる注射物質に関する断念ＣＳＭＴ（条件付き運動性抑制）およびＴＳＴ（尾懸垂試験）の試験の実験結果のヒストグラムを示す。ＣＭＳＴグラフで、ある箱から別の箱までの通過の数および動物が直立した回数を横軸で示し、異なる試験物質を縦軸で示す。ＴＳＴグラフにおいて、動物が運動できない時間（単位：秒−ｓｅｃ）を横軸に示し、異なる試験物質を縦軸に示す。
【図５】２週間注射された、生理食塩水の存在下、フルオキセチンの存在下、または本発明のペプチドの存在下での、神経新生の測定のグラフを示す。横軸：ＢｒｄＵ標識に陽性の細胞数。縦軸：試験した物質。
【図６】痛みに対する感度の試験のヒストグラムを示す（左：ホットプレート試験；右：テイルフリック試験）。ヒストグラムＡおよびＢで、縦軸はマウスが反応した時間（秒）であり、横軸は注射によりマウスに投与された溶液である。
【図７】マウスにおける癲癇性発作のヒストグラムを示す。ヒストグラムで、縦軸はマウスの数を示し、横軸は癲癇の段階を示す。測定は、１００μｌの生理食塩溶液または１００μｌの１０-5Ｍペプチド溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ」）で処理されたマウスでの３０ｍｇ／ｋｇ カイニン酸の注射の関数として行なわれる。
【図８】マウスにおいて局所的虚血（脳血管障害のモデル）により引き起こされた梗塞のサイズを定量するヒストグラムを示す。ヒストグラムにおいて、縦軸は梗塞の体積を示し、横軸は、注射された溶液：生理食塩水の溶液（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）またはプロペプチドの溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ）」）のいずれかである。
【図９】１５日間毎日注射されたマウスにおける最後の処理後の６時間および７２時間目の飲料水および餌の摂取量を示すヒストグラム。ヒストグラムにおいて、縦軸が重量（グラム）を示し、横軸は注射される溶液を示す：生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）または１０-5Ｍの濃度のプロペプチド溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ」）。
【図１０】４日間の治療後のマウスでの神経新生のヒストグラムを示す。ヒストグラムにおいて、縦軸が、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）に陽性の細胞数を示し、横軸は、注射された溶液を示す：生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）または１０-5Ｍの濃度のプロペプチド溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ）または３ｍｇ／ｋｇ（「ＦＬＵＯＸＥＴＩＮＥ（３ｍｇ／ｋｇ）」）の濃度のフルオキセチンを含み溶液。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
実施例
本願発明者は、本発明のプロペプチドによるＴＲＥＫ−１チャネルの活動の阻害を実証する電気生理学的試験と、プロペプチドの抗鬱性特性を有効にすることを目的とする種々のいわゆる行動学的試験とを試みた。実際、Ｃ．Ｈｅｕｒｔｅａｕｘ博士の率いるチームは、マウスでは、ＴＲＥＫ−１チャネル遺伝子（ＴＲＥＫ−１−／−またはＫＯ−ＴＲＥＫ−１）のノックアウトが、鬱病に関係していることが認められる行動学的試験により測定された耐鬱病性の表現型を動物に与えることを実証した。従って、ＴＲＥＫ−１を阻害するか、またはＴＲＥＫ−１−／−型の行動を再現することが可能な任意の分子を、抗鬱薬として見なすことが可能である。
【００４６】
本願発明者は、マウス脳幹部分に対するＴＲＥＫ−１とソルチリンの間の同時局在化の実験も実行した。
実施例１：ＴＲＥＫ−１の試験
Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｈｅｕｒｔｅａｕｘの率いるチームは、ＴＲＥＫ−１カリウムチャネルが鬱病の治療の標的となり得ること、およびかかるチャネルのアンタゴニストがよく効く抗鬱薬の特性を有し得ることを実証した。
【００４７】
ＴＲＥＫ−１は、５−ＨＴ（セロトニン）受容体等のＧｑタンパク質経路を活性化する受容体を介してｃＡＭＰレベルを調節する神経伝達物質により制御される。ＴＲＥＫ−１が欠失すると、５−ＨＴ神経伝達が有効に増加する抗鬱の表現型が生じる。ＫＯ−ＴＲＥＫ−１マウスは従来の抗鬱薬で処理された未処理マウスの行動と似た行動を呈する（１５）。これらのデータは、現在存在しないＴＲＥＫ−１チャネルのブロッカーが、新しい世代の抗鬱薬につながる可能性があることを示唆している。したがって、ＴＲＥＫ−１チャネルの往来、アドレス指定、および機能に影響しうるすべてを同定することが重要である。それは、かかる特性を調節するパートナーを発見するという問題である。
【００４８】
本願発明者は、優れた候補が、ソルチリンとも呼ばれるニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）であることを本明細書で実証する。この多機能タンパク質（ＮＴＳＲ３／ソルチリン）は、実際、受容体または同時受容体の役割を果たすことが可能であり、ＮＴＳＲ３／ソルチリンの前駆物質の成熟中に放出されるニューロテンシン、リポタンパク質リパーゼおよびプロペプチド等のいくつかのリガンドを有する。このプロペプチドはニューロテンシンの作用の特異的拮抗薬であり、ＮＴＳＲ３／ソルチリンも、細胞表面での他のタンパク質のアドレス指定に役割を果たす。
【００４９】
ＮＴＳＲ３／ソルチリンがＴＲＥＫ−１チャネルの往来に役割を果たすか否かを確かめるために、本願発明者は２つのタンパク質間の相互作用を検知する目的で実験を行なった。これについて、本願発明者は２つのタンパク質ＮＴＳＲ３／ソルチリンおよびＴＲＥＫ−１によるＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションを行なった。
【００５０】
結果は、抗ＴＲＥＫ−１抗体による細胞抽出物の免疫沈降がＮＴＳＲ３／ソルチリンを共沈させることを示す（図１）。さらに、本願発明者は、電気生理学実験によりＴＲＥＫ−１とＮＴＳＲ３／ソルチリンの間の機能的相互作用を実証した：アラキドン酸によるＴＲＥＫ−１の活性化は、ＮＴＳＲ３／ソルチリンの特異的かつ選択的阻害剤であるプロペプチドにより阻止される（図２）。
【００５１】
図１に示されるゲルを得るために、ＴＲＥＫ−１およびＮＴＳＲ３／ソルチリンでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を溶解させた。上精をプロテインＡセファロースの存在
下で抗ＴＲＥＫ−１抗体（ＩＰ：α−ＴＲＥＫ−１）と４℃で１６時間培養した。
【００５２】
このように沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに配置し、次に、ニトロセルロースに移す。ＮＴＳＲ３／ソルチリンタンパク質は抗ＮＴＳＲ３／ソルチリン抗体により検知される。
【００５３】
実施例２：ＴＲＥＫ−１チャネルの活動に対するプロペプチドの作用
プロペプチドの作用を測定するためのすべての実験を、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザルのサバンナモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓繊維芽細胞に由来する細胞系統）で行なった。これらの細胞を、１μｇのｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＴＲＥＫ−１プラスミドでＤＥＡＥデキストラン方法により細胞をトランスフェクトする２４時間前に、直径３５ｍｍの皿に２０ ０００個の細胞の密度で蒔く。電流の測定値をトランスフェクション後の４８〜７２時間目に得た。
【００５４】
ＣＯＳ−７細胞の培養。ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ参照番号：ＣＲＬ−１６５１）を、５％ＣＯ2の存在下で３７℃でＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣ
Ｓ、ＩＣＮ社）で培養する。
【００５５】
ＤＥＡＥデキストランを使用したトランスフェクション。１日目、ＣＯＳ−７細胞を、２ｍｌの培養培地を含む直径３５ｍｍの皿に２０ ０００個の細胞で蒔く。２日目、培地を除去し、細胞を１μｇのｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＴＲＥＫ−１プラスミドおよび１００μｇのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ社）を含む２００μｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で覆い、その後、３７℃／５％ＣＯ2に配置した。３０分間のインキュベーション後
、２ｍｌの培地ＤＭＥＭ／１０％ ＮｕＳｅｒｕｍ／８０μＭ クロロキンを添加する。３時間後、培地を２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳと取り替え、細胞を電気生理学的方法による測定前の４８〜７２時間培養する。
【００５６】
電気生理学的測定：すべての測定値は室温つまり２１〜２２℃で得られる。プラスミドでトランスフェクトした細胞を、４８０ｎｍでの励起後にＥＧＦＰにより放射された蛍光から検知する。
【００５７】
細胞全体のパッチクランプ技術を使用して、ＴＲＥＫ−１チャネルの活動を測定した。使用した装置はＲＫ ４００パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アメリカ合衆国所在）である。１．３〜８ＭΩの抵抗を有するパッチピペットはホウケイ酸ガラスの毛細管から製造されており、１５５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨｐＨ７．２溶液で充填される。
【００５８】
細胞培養培地を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ テトラエチル塩化アンモニウムを含む１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ ４−アミノピリジンからなる溶液と取り替える。細胞をこの溶液で連続的に潅流する。測定される細胞の細胞膜の残留電位は−８０ｍＶに固定する。
【００５９】
電圧の変化が、連続的ランプ（−１００から＋５０ｍＶまで）でも、または１０ｍＶの電位のジャンプ（−１００から＋４０ｍＶ、１つのジャンプ当たり１．５秒）でも得られる。
【００６０】
得られたデータをＰｃｌａｍｐソフトウェアで分析した。図２Ｂに記載された電流は０ｍＶで得られたものであり、表わされた結果は平均値±標準偏差である。ＩＣ50値はシグモイド関数での実験データのプロットにより得た。
【００６１】
その後、チャネルの活性を上述したように細胞全体の構成でのパッチクランプ技術により測定する。
基準状態では、つまりアラキドン酸（ＴＲＥＫ−１チャネルのよく効く活性薬であることが知られている）による活性化がない状態では、１００μＭのプロペプチドは０ｍＶで測定したチャネル活性の２５％を阻害する（２３ｐＡ／ｐＦに対して３１ｐＡ／ｐＦ）。
【００６２】
チャネルが１０μＭ アラキドン酸で活性化された状態では（１３０ｐＡ／ｐＦに対して３１ｐＡ／ｐＦ）、１００μＭのプロペプチドは０ｍＶで測定したチャネル活性の６７％を阻害する（５６ｐＡ／ｐＦに対して１３０ｐＡ／ｐＦ）。
【００６３】
同じ実験条件では、０ｍＶで測定したＴＲＥＫ−１チャネル活性の阻害の用量反応曲線が構築され、これが図２Ｂに示される。図２Ｂは７０．７ｎＭの半数効果濃度（ＩＣ50）を示している。
【００６４】
実施例３：行動学的試験
本願発明者は、物質の抗鬱活性を決定するための古典的試験と見なされている３種類の行動学的実験を行なった（Nestler E.J., Gould E., Manji H., Buncan M., Duman R.S.,
Greshenfeld H.K., Hen, R. et al. "Preclinical models: status of basic research in depression" Biol Psychiatry. 15, 503-528 (2002)（２０）およびCryan, J. & Holmes, A. "The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety" Nat Rev Drug Discov. 4, 775-790 (2005)（２１））。本発明のプロペプチドの効果を、それを溶解させる食塩水および臨床で最も使用されている抗鬱薬の１つであるフルオキセチンのそれと比較した。使用されるマウス系統はＣ５７Ｂｌａｃｋ／Ｊ系統である。ＴＲＥＫ−１-/-マウスもこれらの種々の試験で測定した。
【００６５】
プロペプチドを１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍおよび１０-8Ｍの所望の濃度となるよう０．９％ＮａＣｌ食塩水に溶解させる。使用した技術に依存して異なる量を注射する：
−脳室内注射：５μｌ
−静脈内注射：１００μｌ
−腹腔内注射：１００μｌ
脳室内（ＩＣＶ）注射の場合、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ社）（商標）を使用する。静脈内（ＩＶ）注射または腹腔内（ＩＰ）注射の場合、０．４５×１２ｍｍの針を使用する。
【００６６】
Ａ．強制的水泳試験（ＦＳＴ）（Ｃｒｙａｎ＆Ｈｏｌｍｅｓ、２００５（２１））
試験物質の注射の３０分後の実験は、２２℃で１１ｃｍの水を入れた直径１５ｃｍおよび高さ３０ｃｍの容器に６分間マウスを浸すことと、最後の４分間の不動時間を測定することとから成る。抗鬱薬で処理したマウスの不動時間は対照マウスより短い。本願発明者は、ペプチドおよび食塩水の種々の注射経路を試験した：脳室内（ＩＣＶ）、静脈内（ＩＶ）、または腹腔内（ＩＰ）。フルオキセチンの投与に対してはＩＰ注射のみを使用した。生理食塩水の注射による対照試験を行なった。
【００６７】
これらの試験の結果を図３のＦＳＴ試験に示す。値±ＳＥＭを対照条件（生理食塩水）と統計学的に比較する。***ｐ＜０．００１、２要因分散分析試験＝事後分析試験が後続
する差異分析試験）。
【００６８】
投与経路にかかわらず、本発明のプロペプチドの効果はフルオキセチンにより生じた効果に匹敵する。プロペプチドで処理したマウスはＫＯ−ＴＲＥＫ−１マウスと同じ行動をする。
【００６９】
次の２つの試験では、本発明のプロペプチドを動物一匹当たり１μＭで１００μｌの割合で静脈内（ＩＶ）経路で投与した。
Ｂ．尾懸垂試験（ＴＳＴ）
（Ｃｒｙａｎ，Ｊ．＆Ｈｏｌｍｅｓ，Ａ．（２００５）（２１）およびRipoll, N., David, D., Dailly, E., Hascoet, M. & Bourin, M. "Antidepressant-like effects in various mice strains in the tail suspension" Behav Brain Res. 143(2:193-200 (2003)（２２）参照）
マウスへの試験物質の注射の３０分後の実験は、粘着性リボンでマウスを尾部で懸垂することと、６分間不動時間を測定することとから成る。
【００７０】
図４（ＴＳＴ）のグラフに示されるように、抗鬱薬で処理したマウスの不動時間は対照マウスよりも短い。
この実験では、再び、本発明のプロペプチドの効果がフルオキセチンにより生じた効果に匹敵し、プロペプチドで処理したマウスはＴＲＥＫ−１-/-マウスと同じ行動をする（
図４、ＴＳＴ）。
【００７１】
プロペプチドを、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍおよび１０-8Ｍの所望の濃度となるよう０．９％ＮａＣｌ食塩水に溶解させる。使用した技術に依存して異なる量を注射する：
−脳室内注射：５μｌ
−静脈内注射：１００μｌ
−腹腔内注射：１００μｌ
脳室内（ＩＣＶ）注射の場合、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ社）（商標）を使用する。静脈内（ＩＶ）注射または腹腔内（ＩＰ）注射の場合、０．４５×１２ｍｍの針を使用する。
【００７２】
Ｃ．条件付き運動抑制試験（ＣＭＳＴ）（Dauge, V., Sebret, A., Beslot, F., Matsui, T., & Roques B. "Behavioral profile of CCK2 receptor-deficient mice" Neuropsychopharmacol; 25: 690-698 (2001)（２３）参照）。
【００７３】
実験は、１日目にマウスを条件付けすることと、２日目に物質の効果を測定することとから成る。
１日目に、床が電気刺激装置に接続された金属鉄格子である箱に各マウスを入れる。条件付けは、電気ショック（１．８ｍＡ、２００ｍｓ）と後続する１２秒の潜伏期とから構成された３０シーケンスの生成から成る（合計条件付け時間：６分）。その後、マウスをケージに戻し、２４時間回復させる。
【００７４】
２日目に、マウスに種々の試験物質を注射し、次に３０分後に、条件付けに使用した箱に戻した。この箱では、床が６つの同じ箱に分割されている。電気ショックは伝えない。
測定は、マウスが箱を変更した回数または直立した回数を６分間手作業で数えることから成る。
【００７５】
未処理のショックを受けたマウス（生理食塩水）はほとんど移動せず（「不動」）、処理したショックを受けたマウスは、未処理のショックを受けたマウスに比べてかなりの運動性を回復し：フルオキセチン（３ｍｇ／ｋｇの注射の割合）では５倍大きく、本発明のプロペプチドでは７倍大きかった。
【００７６】
この試験の実験結果を図４に示す。ＴＲＥＫ−１-/-マウスは対照よりも６倍の大きな
運動性を有する（図４のＣＳＭＴ）。
これらの実験結果はすべて、本発明のプロペプチドがフルオキセチンと少なくとも同程
度か、「条件付き運動性抑制」試験の場合にはそれよりも大きな抗鬱薬特性を有することを明らかに実証している。
【００７７】
さらに、本発明のプロペプチドが、大槽内経路だけでなく静脈内経路または腹腔内経路によっても作用するという事実は、本発明のペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に横切ってその効果を及ぼすことを示している。この特性は臨床試験の場合に容易に置換される慢性治療薬の可能性を開いている。
【００７８】
実施例４：神経新生に対するプロペプチドの効果
抗鬱薬による治療は海馬の神経新生を増加させることが知られている（Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O, Belzung, C, Hen, R et al. "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003)（２４））。この細胞増殖は、マーカーである５−ブロモ−２−デオキシウリジン（
ＢｒｄＵ）を組込み、かつ成熟ニューロンに変形される「先祖」細胞の増加から測定される。ＢｒｄＵは免疫組織化学により検知される。
【００７９】
１日目に、動物に３００μｌの１０ｍＭ ＢｒｄＵ水溶液を腹腔内注射し、その後ケージに戻した。
２日目に、動物を安楽死させ、組織を４％ パラホルムアルデヒドの冷溶液の心臓内潅流により固定する。脳を敵手巣し、−２０℃で凍結させる。
【００８０】
一連の４０μｍ切片を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ社）を使用して、海馬の構造全体を網羅するように調製する。６つの切片ののうちの１つを、モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によるＢｒｄＵ取り込みの測定のために保持する。この一次抗体は、ビオチンおよびアビジンペルオキシダーゼに結合する二次抗体により顕在化される。ペルオキシダーゼ活性をＤＡＢの加水分解により目で見えるようにする。このように標識付けされた細胞を各切片について数える。
【００８１】
各群、食塩水、プロペプチドまたはフルオキセチンに対し、各切片のＢｒｄＵ標識された細胞の数を合計され、全体構造を表わすように６を乗算する。各群はそれぞれ３匹のマウスから構成され、表された結果は３匹の動物の平均値である。
【００８２】
得られた結果を、図５にヒストグラムで示す。このグラフは神経新生の測定を示す。生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）および１０μＭプロペプチド（「ＰＥ １０-5Ｍ」）を２週間注射した。また、フルオキセチンも飲料水に入れて８０ｍｇ／ｌ溶液を、フルオキセチンの効能を得るのに必要であることが分かっている期間２週間投与した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【００８３】
これらの結果は、プロペプチドが、フルオキセチンによって引き起こされる神経新生に匹敵する多くの神経新生を誘発することを明白に実証している。プロペプチドで得られた測定値と、フルオキセチンで得られた測定値との間に有意差はない（事後分析試験が後続する１要因分散分析試験）。
【００８４】
実施例５：痛みに対するプロペプチドの効果
本発明のペプチドは、ＴＲＥＫ−１チャネルの活性を阻害する。考えられる主な副作用は、ＴＲＥＫ−１チャネル活性の遮断により引き起こされる副作用である。実際、Ｃ．Ｈｅｕｒｔｅａｕｘが率いるチームによる研究（Heurteaux C., Guy, N., Laigle, C., Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann, C. et al. "TREK-1, a K(+) channel involved in neuroprotection and general anesthesia" EMBO J, 2
3: 2684-2695 (2004) （２５）およびAlloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noel J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. "TREK-1, a K+ channel involved
in polymodal pain perception" EMBO J; 25: 2368-2376 (2006)（１７））によると、
ＴＲＥＫ−１チャネルをノックアウトしたマウス（ＴＲＥＫ−１-/-）が以下の通りであ
ることが示された：
−野生マウスよりも痛みに対して敏感である（Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noel J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto
M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. "TREK-1, a K+ channel involved in polymodal pain perception" EMBO J; 25: 2368-2376 (2006)（１７）。
【００８５】
−αリノレン酸等の多価不飽和脂肪酸の神経保護効果が、脳虚血の場合にノックアウトマウスで消失した。
−カイニン酸の注射により誘発される癲癇性発作は、ＴＲＥＫ−１-/-マウスでははる
かに十度で、死に至ることが非常に多かった（Heurteaux C., Guy, N., Laigle, C., Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann, C. et al. "TREK-1, a K(+) channel involved in neuroprotection and general anesthesia" EMBO J, 23: 2684-2695 (2004)（２５）。
【００８６】
痛みに対する感度は２つの試験、すなわちホットプレート試験と「テイルフリック」試験で測定した。
１．ホットプレート
この試験は、所定温度に維持したプレート上にマウスを置いた時に、マウスが自身の後足を舐めた時間を測定することから成る。５０℃と５６℃の２つの温度を使用した。
【００８７】
使用したマウスはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスであった。各群はそれぞれ１０匹のマウスから構成された。
第１群の「未処理」マウスは注射を受けず、第２の群のマウスは、１００μｌの生理食塩水の静脈注射を受け（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）、最後に第３の群は、１００μｌの本発明のペプチドを含む溶液の注射を１０-6Ｍの濃度で受けた（「ＰＥ １０-6Ｍ」）。
【００８８】
その後、熱に対する感度をマウスの３つの群で測定し、得られた結果を比較した。
測定値は注射の３０分後に得た。
結果を図６Ａに示す。
【００８９】
これらの結果は、５０℃では動物の３つの群の間で統計学的差がないことを明白に実証している：未処理：１９．４＋／−１．６秒、生理食塩水注射：２１．３＋／−２．１秒、およびＰＥ注射：２１．１＋／−１．５秒秒。５６℃では、未処理：５．３＋／ −１．６秒、生理食塩水注射：３．８＋／−０．７秒およびＰＥ注射：４．６＋／−０．９秒。
【００９０】
統計学的差は、事後分析試験が後続する１要因分散分析試験を使用して測定した。
この実施例は、本発明のペプチドが痛覚過敏を引き起こさないことを明白に実証している。
【００９１】
２．２．「テイルフリック」試験
この試験は、４８℃の湯浴にマウスの尾を浸し、湯浴から尾を引っ込めるのにかかる時間を測定することから成る。任意の注射の前に、マウスに馴化試験を行なった。馴化試験は、任意の処理前に（１２秒未満の反応時間を得る）、群が均質になるよう各動物の尾を
２回湯浴に浸すことから成る。その後、マウスに１００μｌの生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）または１００μｌの配列番号２のペプチドを１０-6Ｍの濃度で（「ＰＥ
１０-6Ｍ」）注射した。
【００９２】
使用したマウスはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスであった。各群はそれぞれ１０匹のマウスから構成された。
測定値は注射の３０分後に得た。図６Ｂに示した結果は、マウスの２つの群間に有意差がないことを示している：生理食塩水：７．０＋／−０．６秒およびＰＥ：８．３＋／ −０．７秒。
【００９３】
差はステューデントｔ検定を使用して評価した。この試験により２つの群間に有意差がないことが確認された。
上記ホットプレート試験および「テイルフリック試験」は、配列番号２のペプチドの注射が痛覚過敏を引き起こさないことを明白に実証している。
【００９４】
実施例６：癲癇に対するプロペプチドの効果
この実験では、使用したマウスはＣ５７ＢＬ６／Ｊであり、１つの実験群当たり１０匹のマウスとした：「生理食塩水」群（１００μｌの生理食塩水の腹腔内注射を受けた）および「ＰＥ １０-5Ｍ」群（１００μｌの本発明のペプチドを含む溶液を１０-5Ｍの濃度で受けた）。各実験群で、１００μｌの３０ｍｇ／ｋｇの割合のカイニン酸の腹腔内注射により癲癇性発作を引き起こした。癲癇性発作の段階についての観察をカイニン酸注射の９０分後に行なった。これはマウスの行動の観察に基づいた。
【００９５】
癲癇性発作の異なる段階はTsirka S.E., Gualandris, A., Amaral, D.G., Strickland,
S. "Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator", Nature, 377: 340-344 (1995)（２６）の文献に示されてい
る。
【００９６】
癲癇の攻撃の強さについて記述するために６つの段階が定義されている：
段階１：不動
段階２：頭および襟首の動き
段階３：片側の慢性的活動
段階４：両側の慢性的活動
段階５：全身の痙攣
段階６：動物の死
図７に示した結果は、「生理食塩水」群では５匹が段階５に達したのに対し、ペプチドを注射した動物では２匹しか段階５に達しないため、本発明のペプチドはカイニン酸誘発性の発作を悪化させないだけでなく、逆に有益な効果があることを示す。さらに、死んだただ１匹の動物は「生理食塩水」群にいた。
【００９７】
統計分析を、事後分析試験が後続する２要因分散分析試験を使用して行った。
したがって、この実施例は、プロペプチドが癲癇性発作を誘発せず、逆に癲癇に対して保護効果を有することを明白に実証している。
【００９８】
実施例７：脳血管発作（ＣＶＡ）の危険に対するプロペプチドの効果
ＣＶＡを誘発するために使用したモデルは、糸を用いた中大脳動脈の閉塞から成る局所虚血モデルである。（Heurteaux C., Laigle, C., Blondeau, N., Jarretou, G., Lazdunski, M. "Alpha-linolenic acid and riluzole treatment confer cerebral protection and improve survival after focal brain ischemia" Neuroscience, 137: 241-251 (2006)（２７））。この局所虚血により誘発された梗塞のサイズを、クレシルバイオレットで
脳切片を染色した後で測定した。梗塞は、Heurteauxら、2006（２７）に記載された方法
に従って画像解析システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ Ｓｏｆｔ社）で梗塞領域の輪郭をトレースすることにより測定される。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（１実験群当たり１０匹のマウスの割合）の脳を、１０-5Ｍの濃度の１００μｌの配列番号２のぺプチドを含む溶液（「ＰＥ １０-5Ｍ」群）または生理食塩水の溶液（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」群）の腹腔内注射で毎日一週間処理する。値は２つの群間で比較した。
【００９９】
図８に示した結果は、動物の２つの群間に有意差がないことを明白に実証している。
差はステューデントｔ検定を使用して評価した。この試験により２つの群間に有意差がないことが確認された。
【０１００】
この実施例は、局所虚血によって誘発された梗塞のサイズにペプチドが有意な効果を有しないことを明白に実証している。したがって、この実施例は、配列番号２のペプチドがニューロン損傷の増加を引き起こさず、かつ脳血管発作の危険を増大させないことを明白に実証している。
【０１０１】
実施例８：餌摂取に対するプロペプチドの影響
餌および飲料水の摂取量も測定した。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（１群当たりｎ＝１０）の２つの実験群を使用した：第１の群は、１００μｌの生理食塩水を１５日間腹腔内注射で毎日受け取り（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）、第２の群は１００μｌの配列番号２のペプチドを含む溶液を１０-5Ｍの濃度で１５日間腹腔内注射で毎日受け取った（「ＰＥ １０-5Ｍ」）。
【０１０２】
これらの測定値を長期処理の終了後の６時間目および７２時間目に得た。餌の摂取量または飲料水の摂取量に関し、処理動物と未処理動物の間に有意差はない（図９）。
差はステューデントｔ検定を使用して評価した。この試験により2つの群間の餌および
飲料水の摂取量に有意差がないことが確認された。
【０１０３】
この実施例は、配列番号２のペプチドが動物の餌の摂取に有意な効果がないことを明白に実証している。
実施例９：プロペプチドの作用の遅延の測定
現在一般に使用されている多くの抗鬱薬とは対照的に、本発明のペプチドの作用の効能は非常に迅速である。実際、抗鬱薬の効能を実証する実験的方法の１つは、新しい神経の新生（Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O, Belzung, C, Hen, R et al. "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003)（２４））の測定である。実際、フルオキセチン等の抗鬱薬は
約２週後に神経新生を誘発する。この神経新生は、抗鬱薬の作用機序の重要な要素である。臨床では、鬱病が海馬の錐状体細胞の萎縮（Sheline, Y.I., Wang, P.W., Gado, M.H.,
Csernansky, J.G., Vannier, M.W. "Hippocampal atrophy in recurrent major depression" Proc Natl Acad Sci placecountry-regionUSA. 93: 3908-3913 (1996)（２８））と、海馬歯状回における神経新生の相当な減少（Gould, E., Tanapat, P., McEwen, B.S., Flugge, G., Fuchs, E. "Proliferation of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress" Proc Natl Acad Sci USA, 95: 3168-3171 (1998)（２９））とに関係していることが実証されている。
【０１０４】
実験プロトコルは、４日間の処理期間を除き、Santarelliらの研究（Santarelli et al., "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003)（２４））のmaterials and methods（補足）に記載されたものとする。
【０１０５】
図１０の結果は、神経新生の誘発におけるペプチドの作用の非常な速さを示している。ペプチド（「ＰＥ １０-5Ｍ」）で、神経新生に有意な増加がある。フルオキセチン（「フルオキセチン、３ｍｇ／ｋｇ」）により誘発された神経新生は、４日間の期間に生理食塩水（「ＰＨＹＳ ＳＡＬＩＮＥ」）の注射により誘発された神経新生と同一である。
【０１０６】
増加を、事後分析試験が後続する１要因分散分析試験を使用して評価した。ポストホック試験が後続する１つの要因分散分析試験を使用して評価された。この試験により、「生理食塩水」群に比べて、フルオキセチンによってではなく本発明のペプチドによって誘発される神経新生に有意な増加があることが確認された。
【０１０７】
したがって、上記実施例は、精神疾患および炎症性現象ならびに／もしくは疼痛現象の治療に本発明のペプチドを使用可能であることを明白に実証している。さらに、本発明のペプチドは、先行技術の抗鬱薬の既知の副作用を引き起こさず、先行技術の抗鬱薬よりも作用の遅延が短い（つまり作用が大幅に迅速である）。
【０１０８】
参考文献一覧
【０１０９】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のペプチド、該ペプチドの断片、またはニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のリガンドである該ペプチドの誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体をコードする核酸配列。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体と、
請求項２に記載の核酸配列と、
請求項３に記載のベクターと、
のうちの少なくともいずれか一つを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体を生産する方法であって、
−請求項２に記載の核酸で宿主細胞をトランスフェクトするか、または請求項３に記載のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
−請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体の発現を許容する条件で、前記宿主細胞を培養する工程、および
−前記ペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体を回収する工程
からなる方法。
【請求項６】
精神障害と、炎症性現象および疼痛性現象のうちの少なくとも一方の現象との治療を意図した医薬品の製造のための請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体の使用方法。
【請求項７】
抗鬱薬の製造のための請求項６に記載の使用方法。
【請求項１】
配列番号２のペプチド、該ペプチドの断片、またはニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のリガンドである該ペプチドの誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体をコードする核酸配列。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体と、
請求項２に記載の核酸配列と、
請求項３に記載のベクターと、
のうちの少なくともいずれか一つを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体を生産する方法であって、
−請求項２に記載の核酸で宿主細胞をトランスフェクトするか、または請求項３に記載のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
−請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体の発現を許容する条件で、前記宿主細胞を培養する工程、および
−前記ペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体を回収する工程
からなる方法。
【請求項６】
精神障害と、炎症性現象および疼痛性現象のうちの少なくとも一方の現象との治療を意図した医薬品の製造のための請求項１に記載のペプチドもしくはペプチドの断片、またはペプチドの誘導体の使用方法。
【請求項７】
抗鬱薬の製造のための請求項６に記載の使用方法。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５０５８６４（Ｐ２０１１−５０５８６４Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８８４４（Ｐ２０１０−５３８８４４）
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／００１７８４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０３８９８
【国際公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（５０５０４５６１０）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ スィヤンティフィック（セーエヌエルエス） (41)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ（ＣＮＲＳ）
【出願人】（５１０１７１９１１）ユニヴェルシテ ドゥ ニース ソフィア アンティポリス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＮＩＣＥ ＳＯＰＨＩＡ ＡＮＴＩＰＯＬＩＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／００１７８４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０３８９８
【国際公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（５０５０４５６１０）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ スィヤンティフィック（セーエヌエルエス） (41)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ（ＣＮＲＳ）
【出願人】（５１０１７１９１１）ユニヴェルシテ ドゥ ニース ソフィア アンティポリス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＮＩＣＥ ＳＯＰＨＩＡ ＡＮＴＩＰＯＬＩＳ
【Ｆターム（参考）】
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