ニューロパチーを治療するための方法および組成物
内因性ＮＴ−３またはＧＤＮＦ遺伝子の発現を調節することによって、ニューロパチーを治療するための方法および組成物を本明細書で開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年２月４日に出願された米国仮出願第６１／２０６，７７０号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援による研究下でなされた発明に対する権利の記載
非適用。
【０００３】
本開示は、遺伝子発現の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
多くの疾病および状態は、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病としても知られている）、パーキンソン病、網膜変性、シャルコーマリーツース（ＣＭＴ）病、神経因性疼痛、および化学療法誘発ニューロパチーを含むニューロパチーに由来する。さらに、ニューロパチー（例えば、神経因性疼痛）は、神経挫滅および脊髄損傷等の神経組織の外傷に由来する可能性がある。神経再生を促す治療は、これらの状態の症状に有利であろう。
【０００５】
例えば、糖尿病性ニューロパチーは、糖尿病に起因する神経障害の群である。糖尿病を患う人々は、長期間、全身の神経の損傷を経験する可能性がある。ニューロパチーは、痺れ感、場合によっては、手、腕、足、および脚に疼痛および脱力を引き起こす。これらの神経学的疾患は、消化管、心臓、および性器を含む全ての臓器系でも起こり得る。糖尿病を患う人々は、常に神経疾患に罹る可能性があるが、糖尿病を長く患うほど、危険性も大きくなる。パーキンソン病（ＰＤ）では、患者は、黒質におけるドーパミン分泌ニューロンの損失を経験する。ＰＤ患者は、振戦、四肢硬直、無動、および動作緩慢、ならびに不安定および転倒を招く可能性がある姿勢反射障害に罹患する。網膜変性と関連する疾病には、糖尿病性網膜症、網膜色素変性、および加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）が含まれる。これらの疾病は、失明を招く可能性があり、ＡＭＤは、米国における成人の法的盲の主要原因である。
【０００６】
神経変性状態の治療の選択肢は、現在限られている。例えば、糖尿病性ニューロパチーは、現在、主に糖尿病性状態自体をコントロールすることによって治療されている。米国特許出願公開第２００５／０２６７０６１号明細書は、ＶＥＧＦ−Ａ発現を調節する亜鉛フィンガー転写因子を使用するニューロパチーの治療について記載する。米国特許第７，２５３，２７３号明細書は、神経因性疼痛の治療のために、Ｎａｖ１．８、ＴｒｋＡ、およびＶＲ１を標的とした亜鉛フィンガータンパク質を開示する。ＰＤの治療は、症状管理に関係する。最も広範に使用される治療形態はＬ−Ｄｏｐａであるが、外因性Ｌ−Ｄｏｐａの使用は、内因性Ｌ−Ｄｏｐａ産生の減少を引き起こし、最終的には逆効果となる。
【０００７】
いくつかの集団が、神経栄養性分子自体の投与が神経変性を改善する助けとなり得ることを報告している。例えば、Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１０７，１０８３−１０９２は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子導入は、ラット実験モデルにおいて軸索および脱髄の損失を特徴とする糖尿病性ニューロパチーを逆行させる場合もあることを示した。加えて、Ｉｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０；１２（１２）：１５９３−４、Ｓｏｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １２：４２４３−４２５４、Ｓｏｎｄｅｌｌ（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １９（１４）：５７３１−５７４０を参照されたい。
【０００８】
神経向性因子であるＮＴ−３は、ニューロンの生存、成長、および分化の促進において機能すると示されているが、一方でＮＴ−３欠乏は、末梢神経系に機能障害をもたらす。ＮＴ−３の欠乏は、実験用の糖尿病性ラットにおけるニューロパチーとも関係している。ＮＴ−３ｃＤＮＡの遺伝子導入は、多様なニューロパチーの動物モデルにおいて、ニューロパチーに対する前臨床効果を示しているが、ＮＴ−３ｃＤＮＡまたはＮＴ−３タンパク質の使用と関連する潜在的な問題のため、ＮＴ−３に基づく治療は診療所で使用されていない。ＮＴ−３タンパク質の直接使用は、その短い半減期、乏しい生物学的利用率、および用量を制限する毒性によって制限される。Ｐｒａｄａｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：２２３７−２２４９、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｒｅｓｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１６７−１７５、Ｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：４９９−５０７を参照されたい。加えて、ＮＴ−３ｃＤＮＡの遺伝子導入は、ＮＴ−３タンパク質の過剰産生を招き得、望まれない毒性をもたらし得る。
【０００９】
ドーパミンニューロン、線条体ニューロン、運動ニューロン、および視細胞等の神経細胞の多くの異なる種類に対して強力な生存因子であることが示されている別の神経栄養因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。例えば、Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：３８４−３９４を参照されたい。しかしながら、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の注入を受けているパーキンソン病の患者の第２相研究において、総合的な症状改善は観察されなかった。例えば、Ｌａｎｇ（２００６）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５９：４５９−４６６を参照されたい。さらに、Ｌａｎｇらは、ＧＤＮＦの注入が、恐らくタンパク質の高用量の不正確な送達に起因する重大な副作用（例えば、ＧＤＮＦおよび内因性ＧＤＮＦの両方に対して反応する中和抗体の産出）をもたらしたと報告した。
【００１０】
したがって、糖尿病性ニューロパチー、神経因性疼痛、およびニューロンの損失もしくは死滅、または損傷したニューロンを再生できないことを特徴とする多様な神経変性状態等のニューロパチーの治療のための組成物および方法が未だに必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）、糖尿病性ニューロパチー、および神経因性疼痛等のニューロパチーを治療するための方法および組成物が本明細書に開示される。特に、ニューロパチーを治療するために、ＮＴ−３およびＧＤＮＦ等の内因性の向神経性因子を調節するための方法および組成物が記載される。
【００１２】
したがって、一態様では、ＮＴ−３またはＧＤＮＦの発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質が提供される。改変された亜鉛フィンガータンパク質とは、認識ヘリックスが事前選択された標的部位に結合するように変化された、天然に存在しない亜鉛フィンガータンパク質である。本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれも、１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の亜鉛フィンガーを含むことができ、各亜鉛フィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）内の標的亜部位に結合する認識へリックスを有する。特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質は、表１または２に示される認識ヘリックスの１つ以上を有する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を、融合タンパク質の一部として、調節ドメイン（または機能ドメイン）と機能的連鎖状態に配置することができる。ＺＦＰとの融合のために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれか一方を選択することによって、そのような融合タンパク質は、遺伝子発現を活性化するか、または抑制するかのどちらか一方のために使用することができる。例えば、本明細書に記載されるＮＴ−３またはＧＤＮＦ標的ＺＦＰおよび転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６）を含む融合タンパク質は、それぞれ、内因性ＮＴ−３またはＧＤＮＦ発現を上方調節するために使用することができる。
【００１４】
さらに別の態様では、本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
さらに、核酸および／またはＺＦＰ（もしくはＺＦＰを含む融合タンパク質）を含有する薬学的組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、調節配列と操作可能に連結され、医薬的に許容可能な担体または希釈剤と併用される、本明細書に記載されるＺＦＰの１つをコードする配列を備える核酸を含み、調節配列は、細胞内で核酸の発現を可能にする。タンパク質に基づく組成物には、本明細書に開示されるＺＦＰおよび医薬的に許容可能な担体または希釈剤が含まれる。
【００１６】
さらに別の態様では、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチド、および／または組成物のいずれかを含む単離細胞も提供される。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。
【００１７】
別の態様では、神経変性を治療および／または予防するための方法、ならびに本明細書に開示される組成物を使用して神経再生を促すための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法には、糖尿病性ニューロパチーの治療が含まれる。他の実施形態では、方法には、パーキンソン病の治療が含まれる。他の実施形態では、方法には、網膜変性の治療が含まれる。ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）、および／またはその組み合わせを使用して、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を送達することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質は、それらを必要とする対象に投与される幹細胞内にある。
【００１８】
さらに別の態様では、嗜癖行動を治療または予防するための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法には、アルコール依存症の治療が含まれ、他の実施形態では、方法には、薬物依存症の治療が含まれる。
【００１９】
これらおよび他の態様は、全体の開示を考慮して、当業者には容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】パネルＡおよびＢは、本明細書に記載される例示的な亜鉛フィンガータンパク質融合構築体を示す。図１Ａは、ＮＴ−３またはＧＤＮＦ ＺＦＰおよびＮＦ−ｋＢからのｐ６５転写活性化ドメインを含む融合タンパク質を示す概略図である。融合タンパク質はまた、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を含むＳＶ４０ラージＴ抗原、およびアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２）を含むＦＬＡＧエピトープタグ（Ｆｌａｇ）からの核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含む。図１Ｂは、１１９７１の６フィンガー（１Ｆ〜６Ｆ）の各々の認識ヘリックス、ならびに各フィンガーによって認識される標的ヌクレオチドトリプレットを含む１１９７１と指定されるＮＴ−３ ＺＦＰ−ＴＦを示す。図１Ｃは、１７２４８と指定されるＧＤＮＦＺＦＰ−ＴＦ示す。フィンガー設計は、各フィンガーのアルファヘリックスの「−１」から「＋６」の位置において、アミノ酸残基の同一性を示す。
【００２１】
【図２Ａ】パネルＡおよびＢは、ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦを使用した、ヒト初代骨格筋（ＳＫＭＣ）細胞中のＮＴ−３発現を示すグラフである。図２Ａは、１０〜５０の感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したヒトＳＫＭＣ細胞内の、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡに正規化した、ＮＴ−３全ｍＲＮＡ（ｈＮＴ３、薄灰色）、ならびにその代替転写物１Ａ（ｈＮＴ３−１Ａ、白色）および１Ｂ（ｈＮＴ３−１Ｂ、濃灰色）の活性化を示す。
【００２２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、レンチウイルスベクターの不在（「偽」）時に形質導入した細胞と比較して、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５（「１１９７１」としてグラフ上で示される）をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したヒトＳＫＭＣ細胞からのＮＴ−３タンパク質分泌の増加を示す。
【００２３】
【図３】パネルＡおよびＢは、ラットＳＫＭＣ細胞中のＮＴ−３発現を示すグラフである。図３Ａは、１０〜５０の感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したラットＳＫＭＣ細胞内の、ラットＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した、ＮＴ−３ｍＲＮＡの活性化を示す。図３Ｂは、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したラットＳＫＭＣ細胞からのＮＴ−３タンパク質分泌の増加を示す。１１９７１は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）対照非形質導入細胞（「偽」）と比較して、１１９７１−ｐ６５を指す。
【００２４】
【図４Ａ】パネルＡおよびＢは、以下のプラスミド注入を受けた糖尿病性ラットの３つの実験群：偽治療としてｐＶＡＸ−１ベクターを受けた「ベクターのみ」の群、ＮＴ−３標的ＺＦＰ１１９７１をコードするｐＶＡＸベクターを受けた「ＮＴ３」の群、および亜鉛フィンガー転写因子ＳＢ５０９を活性化するＶＥＧＦ−ＡをコードするｐＶＡＸベクターを受けた「ＳＢ５０９」の群における神経伝導速度（ｍ／秒）を示すグラフである。日齢および体重が一致したラットを、非糖尿病性対照として使用した。棒グラフは、注入された（左）肢および注入されていない（右）肢に関する、群平均＋／−標準偏差としての感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）（Ａ）および運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）（Ｂ）データを示す。図４Ａは感覚神経伝導速度を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは運動神経伝導速度を示す。
【００２５】
【図５】パネルＡおよびＢは、ラット初代線条体ニューロンにおけるＧＤＮＦの活性化を示すグラフである。図５Ａは、ラットベータアクチンｍＲＮＡに正規化した、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ（ｒＧＤＮＦ）の活性化を示す。ラット線条体ニューロン細胞は、１０までの感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対照を形質導入した。図５Ｂは、１０までの感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターまたはＧＦＰを形質導入したラット線条体ニューロンの上清におけるＧＤＮＦタンパク質分泌の増加を示す。ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを、対照として使用した。
【００２６】
【図６】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または空プラスミド（偽）をトランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。ＧＤＮＦおよびベータアクチンｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで決定され、相対的なＧＤＮＦレベルは、ＧＤＮＦとベータアクチン（ＧＤＮＦ／ＡＣＴＢ）との間の割合として表された。
【００２７】
【図７】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターをトランスフェクトした細胞または偽トランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現ベクターをトランスフェクトしたアカゲザルＲＦ６Ａ細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。１８Ｓに対するＧＤＮＦｍＲＮＡレベルが示される。
【００２８】
【図８】パネルＡおよびＢは、ＡＡＶ ＧＦＰベクター（対照）またはＡＡＶ ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５（ＧＤＮＦ活性化）のいずれか一方を注入された６−ＯＨＤＡ病変ラットにおける前肢の無動を示すグラフである。図８Ａは、１週間後の６−ＯＨＤＡ病変の結果を示し、図８Ｂは、２週間後の６−ＯＨＤＡ病変の結果を示す。
【００２９】
【図９】ＡＡＶ ＧＦＰベクター（対照）またはＡＡＶ ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５（ＧＤＮＦ活性化）のいずれか一方を注入された６−ＯＨＤＡ病変ラットにおける、「通路タスク」行動試験を使用した感覚運動怠慢の結果を示すグラフである。
【００３０】
【図１０】ＡＡＶ ＧＦＰベクター（対照）またはＡＡＶ ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５（ＧＤＮＦ活性化）のいずれか一方を注入された６−ＯＨＤＡ病変ラットにおけるアンフェタミン誘発性回転行動を示すグラフである。
【００３１】
【図１１】パネルＡおよびＢは、ＡＡＶ１ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２もしくは１６６５５または対照ベクターを注入されたラットからのラット線条体組織において、ＥＬＩＳＡで測定されるＧＤＮＦタンパク質発現を示すグラフである。図１１Ａは、ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２を担持するＡＡＶベクターを受けたラットにおける結果を示す。図１１Ｂは、対照ＡＡＶベクターまたはＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５を担持するＡＡＶベクターを注入された６−ＯＨＤＡで治療されたラットにおける結果を示す。
【００３２】
【図１２】異なるＺＦＰ ＴＦ構築体をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中のＮＴ−３タンパク質分泌を示すグラフである。構築体は、１つの（１１９７１−ｐ６５）または２つの（１１９７１−２ｘｐ６５および２３５７０−２ｘｐ６５）ｐ６５活性化ドメインのいずれか一方を含有した。対照は、プラスミドをコードするＧＦＰ（ＧＦＰ）または空ベクター（ｐｃＤＮＡ）のいずれか一方であった。
【００３３】
【図１３】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。ＧＤＮＦおよびベータアクチンｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで決定され、相対的なＧＤＮＦレベルは、ＧＤＮＦとベータアクチン（ＧＤＮＦ／ＡＣＴＢ）との間の割合として表された。
【００３４】
【図１４】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターをトランスフェクトした細胞または偽トランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現ベクターをヌクレオフェクトしたアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。１８Ｓに対するＧＤＮＦ ｍＲＮＡレベルが示される。
【００３５】
【図１５】パネルＡおよびＢは、インビボのラット特異ＧＤＮＦ ＺＦＰ ＴＦの活性を示す。図１５Ａは、ＺＦＰ−ＴＦ−１４１７２構築体を眼下注入された正常ラットにおけるＧＤＮＦ発現の刺激を示す。図１５Ｂは、ＺＦＰ−ＴＦ−１６６５５構築体を注入されたＲＣＳラットにおける錐体機能の維持を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン病、シャルコーマリーツース病、網膜変性、嗜癖行動、化学療法誘発ニューロパチー等のニューロパチー状態を治療するための組成物および方法が本明細書に開示される。特に、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む転写因子を調節するＮＴ−３およびＧＤＮＦ、ならびにそのようなタンパク質を利用する方法が、ニューロパチーの治療の使用に提供される。これらは、改変された亜鉛フィンガータンパク質、すなわち、所定の核酸標的配列に結合する天然に存在しないタンパク質を含む。
【００３７】
概論
本明細書で開示される方法の実践、ならびに組成物の調製と使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、ＤＮＡ、および関連分野における従来の技術において、当技術分野の技術範囲内である。これらの技術は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３８】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状コンフォメーションで、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸（ホスホロチオエート主鎖）部分内で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成する。
【００３９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４０】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。結合相互作用の全ての構成要素は、相互作用が全体として配列特異的である限り（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触する）、配列特異的である必要はない。そのような相互作用は、一般に、１０-6Ｍ-1以下の解離定数（Ｋd）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指す。高い結合親和性は、低いＫdと関連している。
【００４１】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合においては、それは、それ自体に結合する（その結果、ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができる、および／または異なるタンパク質または複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００４２】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、または構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ配列の領域である、１つ以上の亜鉛フィンガーによって配列特異的な様式でＤＮＡを結合するより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰとして略記される。
【００４３】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、例えば、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質の認識へリックス領域の改変（１つ以上のアミノ酸を変化させる）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合されるように「改変」することができる。したがって、改変された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。亜鉛フィンガータンパク質を改変するための方法の非制限的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成物は、主として合理的基準によってもたらされる。設計のための合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６も参照されたい。
【００４４】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、天然には見出されないタンパク質であり、その産生は、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスによって主にもたらされる。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号明細書、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、および国際公開第０２／０９９０８４を参照されたい。
【００４５】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖もしくは二本鎖のいずれか一方であってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数）長のヌクレオチド、好ましくは、約１００〜１，０００（またはそれらの間の任意の整数）長のヌクレオチド、より好ましくは、約２００〜５００長のヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアが、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて変化する長さ）がヌクレオソームコアの間に延在する。１分子のヒストンＨ１は、一般にリンカーＤＮＡと会合する。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、原核性および真核性の両方の全ての種類の細胞核タンパク質を包含するように意図されている。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００４７】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン錯体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含む全染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。
【００４８】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質錯体、または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００４９】
「標的部位」または「標的配列」は、結合にとって十分な条件が存在すれば、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。多様なＮＴ−３標的ＺＦＰに対する例示的な標的部位は、表２および３に示される。
【００５０】
「外来」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋の胚発生中のみ存在する分子は、成体筋細胞に関しては外来分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全型内在性分子の機能型または正常機能型内在性分子の機能不全型を含むことができる。
【００５１】
外来分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの等の小分子、または、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子の１つ以上を含む任意の錯体等の高分子であってもよい。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、それは一本または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成する能力のあるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号明細書を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
外来分子は、内在性分子と同一の種類の分子、例えば、外来タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外来核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞中に外来分子を導入するための方法が当業者に知られており、脂質媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外来分子はまた、内在性分子と同一の種類の分子であってもよいが、細胞が由来する種とは異なる種に由来する。例えば、ヒトの核酸配列は、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株中に導入され得る。
【００５３】
対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内在性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれてもよい。
【００５４】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同一の化学種類の分子であってもよいか、または異なる化学種類の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）、および融合核酸（例えば、上記に記載される融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送達すること、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することによってもたらされてもよく、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂、およびポリペプチド連結はまた、細胞中のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法が本開示の他所で提示される。
【００５６】
本開示に関して、「遺伝子」は、そのような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接しているかに関わらず、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネータ、リポソーム結合部位および内部リポソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサ、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
「遺伝子発現」は、遺伝子産物への遺伝子に含まれる情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００５８】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００５９】
「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ−細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
「作動的連結」および「作動的に連結」（または「作動可能に連結」という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関連して交換可能に使用され、その中で両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許すように各構成要素が配置される。図示として、プロモーター等の転写調節配列は、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合に、コード配列に作動的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが隣接していなくても、コード配列に作動的に連結される転写調節配列である。
【００６１】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に、それが果たすであろう他の構成要素に連動して同一の機能を実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合される融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＥＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合に、作動的連結状態にある。
【００６２】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一でないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同一の残基数を有することができる、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸（例えば、コード機能、別の核酸をハイブリッド形成する能力）の機能を決定するための方法が、当技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能を決定するための方法がよく知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ開裂を、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的相補性および生化学的相補性の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照されたい。
【００６３】
「ニューロパチー」という用語には、神経組織の中枢および末梢神経系組織の変性が含まれるが、これらに限定されない神経組織の任意の病変または異常が含まれる。中枢および末梢神経系組織には、眼の杆体および錐体等の分化したニューロンを含む任意のニューロンの任意の部分が含まれるが、これらに限定されない。したがって、ニューロパチーを特徴とする状態の非限定的な例には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病としても知られている）、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病性ニューロパチー、網膜変性、シャルコーマリーツース（ＣＭＴ）病、神経因性疼痛、化学療法誘発ニューロパチー、外傷（脳または脊髄）等が挙げられる。用語には、アルコールまたは薬物依存症等の嗜癖行動も含まれる。他のニューロパチー（神経変性）状態が当業者に知られている。
【００６４】
ＤＮＡ結合ドメイン
ＮＴ−３遺伝子またはＧＤＮＦ遺伝子の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。本明細書で開示される組成物および方法で、任意のＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。
【００６５】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。好ましくは、亜鉛フィンガータンパク質は天然に存在せず、それは選択する標的部位に結合するように改変される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたく、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。改変方法には、合理的設計および多様な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列と結合する亜鉛フィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ファージディスプレイおよび２ハイブリッド法を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号明細書、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、および英国第２，３３８，２３７号に開示される。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００６８】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結され得る。また、６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００６９】
標的部位の選択、融合タンパク質（および同一物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法が当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号明細書、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、国際公開第０２／０９９０８４号、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６号に詳しく記載される。
【００７０】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結し得る。また、６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、第６，４７９，６２６号、米国特許同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【００７１】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ，ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号明細書、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５-１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４-２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３-１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５３、およびニューイングランドバイオラボ社カタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然の標的部位に結合するよう改変することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書を参照されたい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナスに由来するＴＡＬエフェクターから改変されたドメインである（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９Ｏｃｔ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）、ならびにＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９Ｏｃｔ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７を参照）。
【００７３】
一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＴ−３遺伝子の標的部位に（配列特異的な様式で）結合し、ＮＴ−３の発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質である。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＤＮＦ遺伝子の標的部位に（配列特異的な様式で）結合し、ＧＤＮＦの発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質である。選択されたＮＴ−３またはＧＤＮＦの標的部位に結合するＺＦＰは、典型的に少なくとも１個の亜鉛フィンガーを含むが、複数の亜鉛フィンガー（例えば、２個、３個、４個、５個、６個以上のフィンガー）が含まれてもよい。通常ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４個または６個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に９個または１０個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に１２〜１４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、一方で、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。ＺＦＰはまた、そのドメインが転写活性化または抑制ドメインであり得る、１つ以上の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。
【００７４】
ＮＴ−３およびＧＤＮＦ標的ＺＦＰの特定の例は、表１ならびに２に開示される。この表の第一の列は、ＺＦＰに対する内部参照名（番号）である。「Ｆ」はフィンガーを指し、「Ｆ」に続く番号は、どの亜鉛フィンガー（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１を指す）かを参照する。
【表１】
【００７５】
全てのＮＴ−３タンパク質に対する標的部位は、ＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＧＴ（配列番号２０）である。この配列は、５３９５４８２で始まり５３９４３９９で終わるヒト染色体１２のプラス鎖で見出される（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｇｅｎｏｍｅ（ｂｕｉｌｄ３５．１），ＮＣＢＩを参照）。この配列はまた、１５６０９８６で始まり１５６０９０６９で終わるラット染色体４のマイナス鎖で見出される（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ（ＲＧＣＳ ｖ３．４），ＮＣＢＩを参照）。
【００７６】
表２は、ＧＤＮＦ標的ＺＦＰの特定の例を示す。
【表２】
【００７７】
これらのＧＤＮＦ結合タンパク質のラット、ヒト、またはアカゲザルにおける標的部位に対する配列および位置は、表３に開示される。遺伝子位置は、以下のＵＣＳＣゲノムデータベース：ラット（２００４年１１月）、ヒト（２００６年３月）、およびアカゲザル（２００６年１月）を参照して示される。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。
【表３】
【００７８】
融合タンパク質
本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）を含む融合タンパク質および異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的フラグメント）も提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー）、サイレンサ、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）、ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連する因子および修飾因子、クロマチン結合性タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）、ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子が含まれる。ＤＮＡ結合ドメインならびにヌクレアーゼ開裂ドメインの融合に関する詳細ついて、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、および同第２００７／０２１８５２８号明細書を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００７９】
活性化を達成するための好適なドメインには、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照）、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ａｎｄ Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ ａｎｄ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ８：２９３７−２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４等の人工キメラ機能ドメイン（Ｓｅｉｆｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２））、ならびにデグロンドメイン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６４３９−６４４７（１９９９）およびＳａｌｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３１１８−３１２３（２０００））が含まれる。さらなる例示的な活性化ドメインには、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌ １：８７−９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。
【００８０】
ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとの間の融合タンパク質（または同一物をコードする核酸）の形成において、活性化ドメインと相互作用する活性化ドメインまたは分子のいずれか一方が、機能ドメインとして好適であることが、当業者には明らかである。基本的に、標的遺伝子に活性化錯体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化等）を補充する能力のある任意の分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子において機能ドメインとしての使用に好適なＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質等の絶縁体ドメイン、局在化ドメイン、ならびにクロマチンリモデリングタンパク質が、例えば、譲受人共通の米国特許出願第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号明細書、ならびに譲受人共通の国際公開第０２／４４３７６号に記載される。
【００８１】
例示的な抑制ドメインには、ＫＲＡＢ、ＫＯＸ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５−３２１、およびＷｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。
【００８２】
融合分子は、当業者によく知られているクローニング法および生化学的接合によって構築される。融合分子には、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）が含まれる。融合分子には、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗原由来等）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素等）も任意的に含まれる。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の成分間で維持されるように設計される。
【００８３】
一方において機能ドメイン（またはその機能的フラグメント）のポリペプチド成分と、他方において非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との間の融合は、当業者に知られている生化学的接合の方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間に融合を起こすための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０−３９３５。
【００８４】
ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質によって結合される標的部位は、細胞クロマチンの到達可能領域に存在する。例えば、同所有の国際公開０１／８３７３２に記載されるように、到達可能領域を決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能領域に存在しない場合、譲受人共通の国際公開第０１／８３７９３号に記載されるように、１つ以上の到達可能領域を生成することができる。さらなる実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が到達可能領域にあるかに関わらず、細胞クロマチンに結合する能力がある。例えば、そのようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合する能力がある。「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインのこの型の例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）で見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：２６１−２７０、Ｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：７１９−７３１、およびＣｉｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２４４−２５４。
【００８５】
融合分子は、当業者に知られているように、医薬的に許容可能な担体で製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５、および譲受人共通の国際公開第００／４２２１９を参照されたい。
【００８６】
融合分子の機能的成分／ドメインは、いったん融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼす能力のある多種多様の異なる成分のいずれかから選択されてもよい。したがって、機能的成分には、活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー、およびサイレンサ等の多様な転写因子ドメインが含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００８７】
さらなる例示的な機能ドメインは、例えば、譲受人共通の米国特許第６，５３４，２６１号明細書および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に開示される。
【００８８】
送達
タンパク質（例えば、ＺＦＰ）、同一物をコードするヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段で標的細胞に送達され得る。好適な細胞には、真核および原核細胞ならびに／または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞またはそのような細胞から生成された細胞株の非制限的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。
【００８９】
本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号明細書に記載され、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質はまた、亜鉛フィンガータンパク質の１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系が使用され得る。また、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号明細書を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのうちのいずれかが、配列をコードする１つ以上の亜鉛フィンガータンパク質を含み得ることは明らかである。したがって、１つ以上のＺＦＰが細胞中に導入される時、ＺＦＰは、同一のベクターまたは異なるベクター上で担持され得る。複数のベクターが使用される時、各ベクターは、１つまたは複数のＺＦＰをコードする配列を含み得る。
【００９１】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して、改変されたＺＦＰをコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。そのような方法を使用して、ＺＦＰをコードする核酸を、細胞にインビトロ投与することもできる。ある特定の実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子療法用途のために投与される。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達媒体と錯体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれか一方を有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子療法手順の総説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５ （１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【００９２】
核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により強化されたＤＮＡの取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
【００９３】
さらなる例示的な核酸送達システムには、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６，００８，３３６号明細書を参照）により提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、米国特許第４，９４６，７８７号明細書、および米国特許第４，８９７，３５５号明細書に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適な陽イオン性および中性脂肪には、Ｆｅｌｇｎｅｒのそれら、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号が含まれる。細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に送達することができる。
【００９４】
免疫脂質錯体等の標的リポソームを含む脂質：核酸錯体の調製は、当業者によく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。
【００９５】
改変されたＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与（インビボ）することができるか、またはインビトロで細胞を治療するために使用することができ、修飾された細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスに基づくシステムには、遺伝子送達のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルス遺伝子送達方法を使用して可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で観察されている。
【００９６】
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的群を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることが可能であり、典型的には高ウイルス価を産生する。レトロウイルス遺伝子送達システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用の長い末端反復から成る。最小限のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、それらは、次いで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するように治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用される。広範囲にわたって使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組み合わせに基づくものが含まれる。（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【００９７】
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い導入効率があり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを使用して、高力価および高レベルの発現が得られている。比較的単純なシステムにおいて、このベクターを多量に産生することができる。アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、およびインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８〜４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）のために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。ＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６〜６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、多数の刊行物に記載される。
【００９８】
現在、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが臨床試験における遺伝子導入に使用可能であり、それらは形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
【００９９】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８〜３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７〜１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３〜１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓパッケージされたベクターに対して、５０％またはそれより大きい導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１００】
アデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノム内への組込みによる効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１〜ＡＡＶ８を含む他のＡＶＶ血清型も本発明に従って使用することができる。
【０１０１】
複製欠損性アデノウイルスベクター（Ａｄ）を高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターの大半は、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し、その後、複製欠損性ベクターが、トランス内の消失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞で増殖するように改変される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるもの等の非分裂の分化した細胞を含む、複数の種類の組織をインビボで形質転換することができる。従来のＡｄベクターは、大きな担持能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例には、筋肉内注入を用いる抗腫瘍免疫のポリヌクレオチド治療が挙げられた（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１０２】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産出細胞株によって生成される。これらのベクターには、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現されるようにタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている他のウイルス配列が含まれる。欠損しているウイルス機能は、パッケージングする細胞株によってトランスで提供される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを所有する。ウイルスＤＮＡは、細胞株内にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠失するヘルパープラスミドを含有する。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。このヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドから、ＡＡＶベクターの複製、およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠失の結果、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスの汚染は、例えば、ＡＡＶよりも敏感であるアデノウイルスに対する熱処理によって減少することができる。
【０１０３】
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターが高度の特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所定の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、関心の細胞型上に存在することで知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７〜９７５１（１９９５）は、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように、モロニーマウス白血病ウイルスを修飾することができ、そのウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、細胞表面受容体に対して、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスがリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで及ぶことができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を表示するように、線状ファージを改変することができる。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用されるが、同一の原理を非ウイルスベクターに適用することができる。特異的標的細胞による取り込みを好む特異的な取り込み配列を含有するように、そのようなベクターを改変することができる。
【０１０４】
遺伝子治療ベクターは、下で説明するように、個々の患者への投与、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所投与によって、インビボで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの幹細胞等の細胞に、ベクターをエクスビボで送達することができ、その後、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者への細胞の再移植が続く。
【０１０５】
診断、研究のため、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物にトランスフェクトした細胞の再注入を介して）が当業者によく知られている。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトし、対象生物（例えば、患者）内に戻って再注入される。エクスビボのトランスフェクションに好適な多様な細胞型は、当業者によく知られている（患者からの細胞の単離および培養方法についての説明は、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４）、およびそこで引用される参考文献を参照）。
【０１０６】
一実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクスビボ処置で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができるか、または、それらが骨髄に生着する哺乳動物（幹細胞のドナー等）に導入し得ることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α等のサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロで分化するための方法が知られている（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照）。
【０１０７】
幹細胞は、周知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化された抗原提示細胞）等の不要な細胞を結合する抗体を有する骨髄細胞をパンニングすることによって骨髄から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照）。
【０１０８】
治療的ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、細胞の形質導入のために、生物にインビボで直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液細胞または組織細胞との最終的な接触内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、使用可能であり、かつ当業者にも知られており、１つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供することができる。
【０１０９】
造血幹細胞にＤＮＡを導入するための方法が、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号明細書に開示される。導入遺伝子の造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４+細胞への導入に有用なベクターには、アデノウイルス３５型が含まれる。
【０１１０】
導入遺伝子の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入に好適なベクターには、非組込みレンチウイルスベクターが含まれる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照されたい。
【０１１１】
医薬的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、下で説明するように、使用可能な医薬組成物の多種多様の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照）。
【０１１２】
上述のように、開示される方法および組成物には、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない、任意の種類の細胞で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株が当業者に知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞（ツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等）、および真菌細胞（サッカロミセス、ピチアおよびシゾサッカロミセス等）が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変種、および誘導体を使用することもできる。
【０１１３】
キット
組成物（例えば、亜鉛フィンガータンパク質、亜鉛フィンガーをコードするタンパク質ポリヌクレオチド、融合タンパク質をコードする融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド）の１つ以上を含むキットが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、キットには、通常、亜鉛フィンガータンパク質（または同一物をコードするポリヌクレオチド）を含む１つ以上の容器が含まれる。キットには、本明細書に記載される方法（例えば、ニューロパチーの治療）のいずれかのために、タンパク質またはポリヌクレオチドの使用に関する指示、通常は書面での指示の好適なセットがさらに含まれ得る。キットには、任意の便利かつ適切なパッケージングが含まれる。指示には、通常、投与量、投薬スケジュール、および所望の使用法のための投与の経路についての情報が含まれる。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数用量包装）、または副次的単位用量であり得る。本発明のキット内に提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）上の書面での指示であるが、機械可読な指示（例えば、磁気または光学式記憶ディスクに保有される指示）も許容範囲である。
【０１１４】
用途
治療および研究用途を含むが、これらに限定されない、ＮＴ−３またはＧＤＮＦの調節が望ましい任意の用途のために、開示される組成物および方法を使用することができる。
【０１１５】
治療薬としてのＮＴ−３活性化ＺＦＰ ＴＦ、またはＮＴ−３活性化ＺＦＰ ＴＦを含有する幹細胞を使用することができる疾病および状態には、糖尿病性ニューロパチー（ＤＮ）、化学療法誘発ニューロパチー、シャルコーマリーツース病、神経因性疼痛、脊髄損傷、パーキンソン病、網膜変性等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
上述のように、ＶＥＧＦ活性化ＺＦＰ−ＴＦは、糖尿病性ニューロパチーの治療のために現在試験されている。ＮＴ−３活性化転写因子（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ）は、ＮＴ−３の活性化が、ＶＥＧＦ活性化に続く血管形成の誘導に関連する安全性の懸念を提起しない時に、これらのＶＥＧＦ活性化ＺＦＰ−ＴＦに対する代替物を提供する。同様に、化学療法を受ける癌患者は、しばしば、ニューロパチーを罹る。多くの癌において、ＶＥＧＦの活性化は、癌の進行を促進し得る。したがって、ＮＴ−３ ＺＦＰ、またはＮＴ−３ ＺＦＰを含有する幹細胞は、糖尿病性ニューロパチーおよび化学療法誘発ニューロパチーのための代替治療を提供する。
【０１１７】
本明細書に記載されるＺＦＰ−ＴＦまたはＮＴ−３ ＺＦＰを含有する幹細胞を使用してのＮＴ−３の調節（活性化）を使用して、シャルコーマリーツース（ＣＭＴ）病、足、下肢、手、前腕の筋肉の緩徐進行性変性を特徴とする一般的な遺伝性神経障害、ならびに肢、指、および爪先の軽度の感覚喪失を治療することができる。これらの疾病に対する治療剤はないが、最近のパイロット臨床研究は、ＮＴ−３の皮下注入が臨床的有益性を提供することができたことを示唆した。Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６５：６８１−９を参照されたい。ＮＴ−３に基づくＺＦＰ−ＴＦアプローチは、生理学的に関連性のあるレベルでＮＴ−３発現を誘発するその能力の結果、ｃＤＮＡまたはタンパク質よりも有効であることを判明し得る。
【０１１８】
慢性疼痛とも見なされる神経因性疼痛は、神経、脊髄、または脳の損傷からもたらされる複雑な障害である。米国特許出願公開第２００６／００４０８８０号明細書には、ＶＲ１、ＮａＶ１．８、およびＴｒｋＡを標的としたＺＦＰ−ＴＦで神経因性疼痛を治療する方法が記載される。近年、ＮＴ−３は、神経因性疼痛状態と関係するナトリウムチャンネル発現を著しく減少させたことが見出されており（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｇｅｒｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２１３（２）：３０３−１４．を参照）、ＮＴ−３が疼痛を調節することに関与することを示す。この関連で、ＮＴ−３活性化ＺＦＰ−ＴＦを使用して、そのような治療を必要とする対象において神経因性疼痛を治療することができる。
【０１１９】
同様に、ＧＤＮＦ調節ＺＦＰ−ＴＦ、またはＧＤＮＦ ＺＦＰ ＴＦを含有する幹細胞を使用して、パーキンソン病、ハンチントン病、網膜変性、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療することができる。ＧＤＮＦは、黒質におけるドーパミンニューロンにとって強力な栄養素であり、その損失がパーキンソン病を引き起こす。パーキンソン病の動物モデルにおけるＧＤＮＦの有効性は、ＧＤＮＦタンパク質およびＧＤＮＦ ｃＤＮＡの過剰発現の両方で示されている。しかしながら、ＧＤＮＦを使用した臨床試験は、パーキンソン病の患者に対する治療的有用性を示し損ね、それは、タンパク質の非常に高い用量の不正確な送達の結果であり得る（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６、上記）。さらに、ＧＤＮＦ発現のより大きい生理学的レベルを誘導するＧＤＮＦのＺＦＰ活性化は、より優れた治療結果を提供する可能性がある。
【０１２０】
ＧＤＮＦ標的ＺＦＰ、またはＧＤＮＦ標的ＺＦＰを含有する幹細胞を使用して、ハンチントン病（ＨＤ）、線条体におけるＧＡＢＡ性中型有棘ニューロンの進行性喪失を伴う神経変性障害を治療することができる。ＧＤＮＦは、興奮毒性障害に対して線条体ニューロンを保護するように示されており、線条体におけるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）媒介ＧＤＮＦ発現は、ラットＨＤモデルにおいて神経保護作用をもたらした。Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：６８２−２８８を参照されたい。したがって、ＧＤＮＦのＺＦＰ活性化を使用して、ＨＤ患者において、線条体ニューロン損失を予防または遅延するために内因性ＧＤＮＦの産生を増加することができた。
【０１２１】
本明細書に記載されるＧＤＮＦおよび／またはＮＴ−３の調節を使用して、網膜変性を治療または予防することができる。網膜変性には、はっきり異なる突然変異に起因する多くの異なる状態が含まれ、その全てが視細胞の喪失を招く。網膜変性と関連する疾病には、網膜色素変性、緑内障、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、および尿病性網膜症が含まれるが、これらに限定されない。ＧＤＮＦは、インビトロで単離された視細胞の生存を促進することを示しており、いくつかの研究は、ＧＤＮＦタンパク質の眼内注入または遺伝子導入によるＧＤＮＦの高い発現が、網膜変性のモデルにおいて桿体細胞死を遅くすることを示している（Ｆｒａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：２７２４−２７３４、ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．４：６２２−６２９）。したがって、視細胞を保護するために、ＧＤＮＦの生理学的に関連性のあるレベルを誘導するように、ＧＤＮＦのＺＦＰ活性化剤を眼内で送達することができる。最近の証拠は、ＡＭＤの治療のための網膜への幹細胞移植の可能性を示唆する（Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５（４）：３９６−４０８）。したがって、ＧＤＮＦのＺＦＰ活性化剤を含有し、その後変性網膜内に移植された幹細胞は、この状態に関連する疾病のための実行可能な治療を表し得る。同様に、ＮＴ−３は、網膜神経節分化および生存を促進することが示されている（Ｄｅ Ｌａ Ｒｏｓｓａ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５８：３４７−３５２）。したがって、ＺＦＰ ＴＦ標的ＮＴ−３は、眼内注入後に視細胞を保護し得る。
【０１２２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のために、本明細書に記載される亜鉛フィンガー転写因子を使用することができる。ＡＬＳは、運動ニューロンの損失に起因する進行性神経変性疾患である。ＧＤＮＦは、運動ニューロンを保護することが示されており、ＡＡＶ媒介ＧＤＮＦ過剰発現は、ＡＬＳのためのマウスモデルにおいて、神経保護的効果を示した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６９２０−６９２８）。重ねて、生理学的レベルのＧＤＮＦを提供する、ＧＤＮＦを標的としたＺＦＰ、またはＧＤＮＦに特異的なＺＦＰを含有する幹細胞を、ＡＬＳ患者における運動ニューロンの生存を促進するために使用することができる。
【０１２３】
嗜癖行動の治療のために、本明細書に記載される組成物を使用することもできる。例えば、高ＧＤＮＦレベルは、アルコールおよび薬物依存症の動物モデルにおいて、嗜癖行動を減少させることが示されている。Ｇｒｅｅｎ−Ｓａｄａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９４：９７−１０５を参照されたい。本明細書に記載されるＧＤＮＦのＺＦＰ活性化剤を使用して、内因性ＧＤＮＦの発現を誘導し、アルコールおよび／または薬物依存症を治療することができる。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：ＮＴ−３−ならびにＧＤＮＦ標的亜鉛フィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）の設計および構築
ＮＴ−３またはＧＤＮＦを標的とした亜鉛フィンガータンパク質は、米国特許第６，５３４，２６１号明細書に記載されるように基本的に改変される。表１は、例示的な６フィンガーＮＴ−３標的ＺＦＰの認識ヘリックスを示す。表２は、例示的な６フィンガーＧＤＮＦ標的ＺＦＰの認識ヘリックスを示す。
【０１２５】
融合タンパク質が構築され、核局在化配列、ＮＴ−３遺伝子またはＧＤＮＦ遺伝子を標的とした本明細書に記載される改変された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＮＦ−ｋＢのｐ６５転写活性化ドメイン、およびＦＬＡＧエピトープタグを含んだ。図１Ａを参照されたい。図１Ｂおよび１Ｃは、例示的なＮＴ−３ならびにＧＤＮＦ ＤＮＡ結合ドメインを示す。
【０１２６】
実施例２：ヒト初代骨格筋細胞中のＮＴ−３の活性化
筋肉内送達を介する糖尿病性ニューロパチーの治療のための、ＮＴ−３活性化ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１を使用する実行可能性を試験するために、以下の実験を実施した。
【０１２７】
Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１およびＺｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０に記載されている、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）およびポリ尿路（ｐｏｌｙｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）を含有する自己不活性化ＨＩＶ由来ベクターＲＲＬを、ＣＭＶプロモーターの制御下で、適切な導入遺伝子発現カセット（ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５またはＧＦＰ）を担持するように修飾した。基本的に、Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：２４１−２４５に記載されている、４個のプラスミドを有する２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション、特異的導入遺伝子発現（すなわち、ＺＦＰ ＴＦ１１９７１−ｐ６５、またはＧＦＰ）のためのレンチウイルス転移ベクター、および３つの追加のパッケージング構築体ｐＭＤＬ、ｐＲＥＶ、ｐＶＳＶ−Ｇ（インビトロゲン）で、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン（商標）２０００（インビトロゲン）を使用して、レンチウイルスベクターを調製した。トランスフェクションの１６時間後に、トランスフェクション培地を成長培地に交換した。次に、さらに２４時間および４８時間培養し、３０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心分離した後、ウイルスを含有する培地を回収した。０．２２μＭのフィルターを通して上清を濾過し、２８，０００ｒｐｍ回の回転数で２時間の超遠心分離法によって１５０倍に濃縮した。次に、ウイルスストックを小アリコートにし、−７０℃で保存した。
【０１２８】
ウイルス調製の感染力価を以下のように決定した。まず最初に、連続的に希釈されたＧＦＰウイルスを使用して、２９３Ｔ細胞を２日間感染させ、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ陽性細胞の割合を定量化し、感染力価を得た。リアルタイムＰＣＲに基づくプロトコルでＺＦＰウイルスの感染力価を決定し、ウイルス感染した２９３Ｔ細胞からの組み込まれたレンチウイルスのコピー数を測定した。簡潔に言うと、２９３Ｔ細胞を、連続的に希釈されたウイルスストック（ＺＦＰ ａｎｄ ＧＦＰ）に２日間感染させた。次に、ゲノムＤＮＡを調製し、記載したリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））を使用して、プロウイルスＤＮＡのレベルを決定した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１３２３−１１３３４）。細胞ごとのプロウイルスＤＮＡのコピー数をハウスキーピング遺伝子（例えば、アルブミン）の正常化によって得て、同一の試料において同様に定量ＰＣＲで決定した。
【０１２９】
プロウイルスＤＮＡプライマー／プローブセット（ＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣ（配列番号６１）、ＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴ（配列番号６２）、ＦＡＭ−ＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＧＣ−ＢＨＱ１（配列番号６３））ならびにアルブミンプライマー／プローブセット（ＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴ（配列番号６４）、ＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＴＡＴ（配列番号６５）、ＦＡＭ−ＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡ−ＢＨＱ１（配列番号６６））を使用して、プロウイルスおよびアルブミンＤＮＡをそれぞれ定量化した。次に、ＧＦＰウイルスに対する（感染力価）／（細胞ごとのプロウイルスＤＮＡの数）の比率を使用して、ＺＦＰウイルスストックの感染力価を細胞ごとのプロウイルスＤＮＡのコピー数から計算した。
【０１３０】
ベクターをＬｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入したヒト初代骨格筋細胞内に導入し、製造業者によって推奨される通りに維持した。
【０１３１】
Ａ．ＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現の分析
ヒトＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現を以下のように分析した。製造業者の推奨に従って、ハイピュアＲＮＡアイソレーションキット（ロシュダイアグノスティックス）またはＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のいずれか一方を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１３２３−１１３３４に記載のように、ＡＢＩ７７００ＳＤＳ機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で、９６のウェルフォーマット内のＴａｑｍａｎ（登録商標）化学を使用してリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実行した。使用されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブが以下に記載される。
【０１３２】
ｈＮＴ−３
ｈＮＴ３−７４３Ｆ ＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡ（配列番号６７）
ｈＮＴ３−８２７Ｒ ＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＴＡＴＴＧＴ（配列番号６８）
ｈＮＴ３−７７６Ｐ ＦＡＭ−ＣＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴＣＣＧＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡ−ＢＨＱ１（配列番号６９）
【０１３３】
ｈＮＴ３−１Ａ
ｈＮＴ３−１ＡＦ，ＡＧＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号７０）
ｈＮＴ３−１ＡＲ，ＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡＴＡＡＡＡ（配列番号７１）
ｈＮＴ３−１ＡＰｒｏ，ＦＡＭ−ＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡ−ＢＨＱ１（配列番号７２）
【０１３４】
ｈＮＴ３−１Ｂ
ｈＮＴ３−１ＢＦ，ＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧ（配列番号７３）
ｈＮＴ３−１ＢＲ，ＡＣＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＴ（配列番号７４）
ｈＮＴ３−１ＢＰｒｏ，ＦＡＭ−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣＴＴＡＣＡ−ＢＨＱ１（配列番号７５）
【０１３５】
ｈＧＡＰＤＨ
ｈＧＡＰＤＨ−Ｆｏｒ，ＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡ（配列番号７６）
ｈＧＡＰＤＨ−Ｒｅｖ，ＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴ（配列番号７７）
ｈＧＡＰＤＨ−Ｐｒｏ，ＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号７８）
【０１３６】
２つの代替プロモーター、プロモーターＡおよびＢでＮＴ−３の転写を誘発し、２つの代替的に開始した転写物、転写物１Ａおよび１Ｂをもたらす。転写物１Ｂは、ＮＴ−３タンパク質を発現する細胞内で主に発現される。
【０１３７】
図２Ａに示されるように、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１は、ヒトＳＫＭＣ細胞内におけるＮＴ−３転写物１Ｂの発現を優先的に促進した。
【０１３８】
Ｂ．ＮＴ−３タンパク質発現分析
４８時間の蓄積期間後（すなわち、新鮮培地を細胞に塗布してから４８時間後）に、分泌ＮＴ−３タンパク質レベルを培地中で決定した。製造業者の指示に従って、ＮＴ−３Ｅｍａｘ（登録商標）ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、培地のアリコート（２００μｌ）をアッセイした。
【０１３９】
図２Ｂに示されるように、ＮＴ標的ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５で治療された細胞は、偽形質導入した細胞よりも多くのＮＴ−３タンパク質を産生した。
【０１４０】
これらの結果は、改変されたＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５が、ヒト骨格筋細胞中のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において、ＮＴ−３を活性化する能力があることを示した。骨格筋は多くの感覚および運動ニューロンで神経支配されるため、ＺＦＰ−ＴＦ媒介ＮＴ−３活性化による骨格筋においてＮＴ−３発現を促進することは、局所の神経系に有益な効果につながる可能性がある。
【０１４１】
実施例３：ラット初代骨格筋細胞におけるＮＴ−３の活性化
ラット初代骨格筋細胞において、ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦがＮＴ−３発現を調節する能力を同様に分析した。Ｈｅｌｌｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０４：６９５−７０４に記載のように、特に、ラット初代骨格筋細胞を調製した。簡潔に言えば、２１日齢のラット胚の後肢から筋肉組織を切開し、０．１％（ｗ／ｖ）のブドウ糖を含有するリン酸緩衝生理食塩水中の０．１％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼおよび０．２％（ｗ／ｖ）のトリプシンで、３７℃で３０分間消化した。消化した組織を成長培地（１０％のウマ血清を含有するＤＭＥＭ（インビトロゲン）および２ｍＭ Ｌグルタミン）中に再懸濁した。１０ｍｌのピペットを用いて、機械的粉砕で細胞を解離した。１０００ｒｐｍの回転数で５分間の遠心分離後、細胞ペレットを成長培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を１００μＭのナイロンメッシュを通して濾過し、培養フラスコ内で４５分間インキュベートした。未付着の筋芽細胞を回収し、０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン被覆プレート内に維持した。
【０１４２】
ラット骨格筋細胞を、１１９７１−ｐ６５またはＧＦＰをコードレンチウイルスベクターに、１０〜５０の感染効率で２日間感染させた。次に、細胞および培地を、それぞれ、ＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現およびＮＴ−３タンパク質分析のために回収した。実施例２に記載のように、ＮＴ−３タンパク質レベルを同様に分析した。
ラットＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現レベルのＴａｑｍａｎ（登録商標）分析に関して、以下のプライマーであった。
ｒＮＴ３ ７７８Ｆ ５’− ＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧ（配列番号７９）
ｒＮＴ３ ８４６Ｒ ５’−ＴＧＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＡ（配列番号８０）
ｒＮＴ３ ８００Ｐ ５’−ＦＡＭ−ＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＧＡＣ−ＢＨＱ１（配列番号８１）
ｒＧＡＰＤＨ−Ｆｏｒ，ＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧ（配列番号８２）
ｒＧＡＰＤＨ−Ｒｅｖ，ＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号８３）
ｒＧＡＰＤＨ−Ｐｒｏ，ＦＡＭ−ＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号８４）
【０１４３】
図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦをコードするレンチウイルスベクターの形質導入は、ＮＴ−３ ｍＲＮＡ（図３Ａ）およびＮＴ−３タンパク質レベル（図３Ｂ）の両方を確実に増加させた。したがって、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５は、ラット初代骨格筋細胞内でＮＴ−３遺伝子発現を活性化した。
【０１４４】
実施例４：ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦによる神経伝導速度の保護
ストレプトゾトシン誘発糖尿病性ニューロパチーの確立されたラットモデルにおいて、ニューロパチーに対するＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦの有効性も同様に試験した。
【０１４５】
ＮＴ−３活性化剤ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするプラスミドベクター、およびＶＥＧＦ活性化剤ＳＢ５０９を構築し、ここで、それぞれを、ＮＴ３、ＳＢ５０９と称する。ＳＢ５０９は糖尿病性ラットにおける神経伝導速度（ＮＣＶ）の保護において有効であることが以前に示されている。例えば、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５５：１８４７−１８５４を参照されたい。
【０１４６】
５％のポロキサマー１８８（ＢＡＳＦ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）の２ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓの濃度、ｐＨ８．０で、ベクター対照（トランス遺伝子なし）とともに両ベクターを製剤化した。
【０１４７】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腹腔内注入（５５ｍｇ／ｋｇ）を介して、成人雄ウィスター系ラット（２５０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）に糖尿病を誘発させた。血糖値が１５ｍｍｏｌ／ｌ未満のラットはこの研究から除外した。日齢および体重が一致したラットを非糖尿病性対照として使用した。ＳＴＺ糖尿病性ラットは、ＳＴＺの２、４、および６週間後に、それらの左腓腹筋／ヒラメ筋の２つの部位間に分割された筋肉内注入（２５０μｇの１１９７１、ＳＢ５０９、またはベクターのみの対照のいずれか）を受けた。日齢および体重が一致したラットを非糖尿病性対照（１群につきｎ＝８）として使用した。
【０１４８】
ＳＴＺ治療の８週間後、ラットをイソフルレンで麻酔し、２つの部位（坐骨切痕およびアキレス腱）における刺激に応じて筋電図を足底筋から記録した。筋電図を、パワーラブ４刺激装置（１．５〜５．０、２ｍｓパルス）に接続する優れた経皮電極を介して引き出し、ＡＢＩスコープソフトウェアでパワーラブ４に記録した。２組のＭ波の間の潜時差を計算し、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）を計算するために、２つの刺激ポイント（エクスビボで測定された）の間の神経間隔を関連付けた。Ｈ反射の潜時差を使用して、同様に感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）を計算した。左側（注入）および右側（非注入）の両方に対してＮＣＶを測定した。ＳＮＣＶおよびＭＮＣＶデータは、群平均＋／−標準偏差として表される。臨界実験は、左側ＮＣＶ対右側ＮＣＶの比較であり、対Ｔ試験によって行われた。
【０１４９】
表４に示されるように、ＳＴＺ治療は、体重の減少および血漿ブドウ糖レベルの増加によって示される、糖尿病の進行を招く。どの治療群も糖尿病のこれらの指標の変化をもたらさなかった。
【表４】
【０１５０】
図４に示されるように、両方のＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦは、感覚（図４Ａ）および運動（図４Ｂ）神経伝導速度の両方を保護した。さらに、図４に示されるように、治療された側のＮＣＶは、治療されていない側よりもはるかに高かった（ｎ＝１０、ＳＮＣＶ、ｐ＝０．００２７、ＭＮＣＶ、ｐ＝０．００００４）。この効果は、陽性対照ＳＢ５０９の効果と類似しており、治療された側におけるＮＣＶ改善もまた観察された（ｎ＝９、ＳＮＣＶ、ｐ＝０．００１４、ＭＮＣＶ、ｐ＝０．０００２）。空ベクター対照を伴っては、ＮＣＶにおける効果は観察されなかった（ｎ＝９、ＳＮＣＶ、ｐ＝０．５９、ＭＮＣＶ、ｐ＝０．１９）。これらのデータは、糖尿病性ニューロパチーのラットモデルにおける感覚および運動神経伝導速度の両方を保護することにおけるＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦの有効性を示した。
【０１５１】
実施例５：内因性ＧＤＮＦの活性化
本明細書に記載されるＧＤＮＦ標的ＺＦＰを、以下のようにラット、ヒト、およびアカゲザル由来細胞において評価した。
【０１５２】
Ａ．ラット線条体ニューロン培養
１８日齢の胎性スプラーグ／ドーリーラットラット線条体細胞を購入し、供給業者によって提案されるように調製した。簡潔に言えば、線条体組織をＮｅｕｒｏＰａｐａｉｎ（商標）を用いて３０℃で３０分間治療し、その後粉砕した。次に、Ｂ２７（インビトロゲン）およびＧｌｕｔａｍａｘ（商標）で捕捉した神経基礎培地（インビトロゲン）中の、新たに被覆されたポリ−Ｄ−リジン（シグマ）６ウェルプレート上に、１ウェルにつき３２０，０００細胞の密度で細胞を播種した。５％のＣＯ２中で、３７℃で３日間のインキュベート後、媒体の半分を新たな媒体に取り換え、さらに３〜４日間培養物を遷延した。
【０１５３】
培養ラット線条体細胞は、ＧＤＮＦＺＦＰ−ＴＦ１４１７２またはＧＦＰを有するレンチウイルスに感染効率（ＭＯＩ）１０〜２０で感染した。感染から４８〜７２時間後、ロシュ社のハイピュアＲＮＡアイソレーションキットおよびＴａｑｍａｎ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲによって分析されたＲＮＡを使用して、全ＲＮＡを感染した細胞から浄化した。ＧＤＮＦおよびアクチンレベルを決定するために使用されたプライマーは、ラットＧＤＮＦ：Ｒｎ００５６９５１０＿ｍ１齧歯類ＧＤＮＦ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびラットＡＣＴＢ：４３５２９３１Ｅ ＡＣＴＢ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。
【０１５４】
加えて、培養ニューロンにおける分泌されたＧＤＮＦのレベルを以下のように決定した。簡潔に言えば、細胞上清を回収し、以下をわずかに修正して、ＧＤＮＦ Ｅｍａｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＥＬＩＳＡに供した：使用された９６ウェルプレートは、白色のＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ（商標）／ＬｕｍｉＮｕｎｃ（商標）プレートであり、セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出試薬は、ＰｉｅｒｃｅのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅであった。加えて、ブロックバッファを各試料に添加して１Ｘ最終濃度にした。
【０１５５】
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ラット線条体細胞へのＧＤＮＦ−ＺＦＰ１４１７２の投与は、内因性ＧＤＮＦ発現を活性化し（図５Ａ）、培養液中にＧＤＮＦタンパク質分泌を増加させた（図５Ｂ）。
【０１５６】
Ｂ．ヒト２９３ＬＴＶ細胞
１０％のＦＢＳで捕捉したＤＭＥＭを用いて、ヒト２９３ＬＴＶ細胞を培養した。１ウェルにつき１Ｅ５細胞の密度で、２４ウェルプレート内に細胞を播種し、翌日、１５９６１、１７２４８、１７２７６、および１７２８７とした、ＺＦＰ−ＴＦをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。ＧＦＰをコードするプラスミドもまた、ベクター対照として含んだ。製造業者のプロトコルを使用して、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）でトランスフェクションを実行した。遺伝子発現分析をトランスフェクションの４８時間後に実行した。特に、ＲｏｃｈｅのハイピュアＲＮＡアイソレーションキットを使用して全ＲＮＡを浄化し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲを用いる遺伝子発現分析ために使用した。ＧＤＮＦおよびアクチンレベルを決定するために使用されたプライマーは、ヒトＧＤＮＦ：Ｈｓ００１８１１８５＿ｍ１またはＨｓ０１０５５３２９＿ｍ１遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびヒトＡＣＴＢ：４３５２９３５Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。
【０１５７】
図６に示されるように、本明細書に記載されるＧＤＮＦ標的ＺＦＰは、ヒトＧＤＮＦ発現を活性化する。
【０１５８】
Ｃ．アカゲザルＲＦ６Ａ細胞
非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および１０％のＦＢＳで捕捉したＭＥＭでアカゲザルＲＦ６Ａ細胞を維持した。ＳＦ溶液およびＥＨ１００プログラムを使用するＡｍａｘａ社の９６ウェルシャトルを使用して、ＧＤＮＦ−ＺＦＰ １５９６１および１７２４８（２Ｅ５細胞につき６００ｎｇ）をコードするプラスミドＤＮＡをフクレオフェクトした。以下のように、トランスフェクション後、４８時間遺伝子発現分析を実行した。ＲｏｃｈｅのハイピュアＲＮＡアイソレーションキットで全ＲＮＡを浄化し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲを用いる遺伝子発現分析のために使用した。ＧＤＮＦおよび１８Ｓレベルを決定するために使用されたプライマー／プローブセットは、
ｈ−ｒｈ−ＧＤＮＦ ＲＴ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧ（配列番号８７）
ｈ−ｒｈ−ＧＤＮＦ ＲＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＧＴＴＡＡＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＴ（配列番号８８）
ｈ−ｒｈ−ＧＤＮＦ ＲＴ−Ｐｒｏｂｅ：ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号８９）
１８ｓ ＲＴ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＴＣＴ（配列番号９０）
１８ｓ ＲＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＡＣＴＴＧＴＣ（配列番号９１）
１８ｓ ＲＴ−Ｐｒｏｂｅ ＴＡＡＣＴＡＧＴＴＡＣＧＣＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧ（配列番号９２）であった。
【０１５９】
図７に示されるように、本明細書に記載されるＧＤＮＦ標的ＺＦＰは、アカゲザルＧＤＮＦ発現を活性化する。
【０１６０】
実施例６：ＧＤＮＦ−ＺＦＰのインビボ分析
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）モデルのラットＧＤＮＦタンパク質レベルおよび行動データを以下のようにアッセイした。ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＣＥＤ）法を使用して、成人ラット（１つの群につきｎ＝６）の線条体（１つの線条体につき１０μＬ）にＡＡＶベクター（ＧＦＰまたはＧＤＮＦ−ＺＦＰ ＴＦ）を注入し、線条体内のベクター分布を最大にした。ベクター送達の４週間後、０．２％のアスコルビン酸塩を含む２０μＬの無菌生理食塩水中で懸濁した１０μｇの６−ＯＨＤＡを、ＣＥＤ法によって右線条体に注入した。ラットを６−ＯＨＤＡ注入の３週間後に安楽死させた。
【０１６１】
３つの異なる行動評価、前肢無動、感覚運動怠慢、および回転行動を用いて、６−ＯＨＤＡ注入後に機能試験に取りかかった。
【０１６２】
Ａ．前肢無動
基本的に、Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３９：７７７に記載のように、標準の「円筒」試験を使用して前肢無動を評価した。簡潔に言えば、ラットを垂直円筒内に個別に配置し、それらが新しい環境を探索する時の、円筒の壁上のそれらの左および右前肢の配置を計数する。６−ＯＨＤＡ注入の後８日および１４日後に、最初の２０回の前肢配置を評価した。
【０１６３】
図８Ａおよび８Ｂに示されるように、６−ＯＨＤＡ投与の８日（図８Ａ）および１４日（図８Ｂ）後において、ＡＶ−ＧＦＰで治療されたラットは右前肢の偏りを示した一方で、ＡＡＶ−１６６５５で治療されたラットは偏りが少なかった。１４日目で、ＡＡＶ−１６６５５で治療されたラット（６２＋８％の右前肢）は、ＡＡＶ２−ＧＦＰで治療されたラット（８３＋７％、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｐ＜０．０５）よりも著しく小さい偏りであった。
【０１６４】
Ｂ．感覚運動怠慢
Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １６９：３５２に記載のように、「通路タスク」を使用して感覚運動怠慢を評価し、通路の左側または右側からの食物の回収を監視した。６−ＯＨＤＡ投与の９日後に、最初の２０回の食物回収を記録した。
【０１６５】
図９に示されるように、６−ＯＨＤＡ投与を受けて、ほとんどのラットが左側（反対側）感覚運動怠慢を示した。６−ＯＨＤＡ投与の９日後の評価は、ＧＦＰ対照ラットが右に偏り、６匹のラットのうちの５匹が通路の右側からのみ食物を摂取することを示した。ＡＡＶ−１６６５５ベクターで治療されたラットは、通路の右側から食物を選択する偏りがその時間の６６±１１％のみと少なく、ＡＡＶ２−ＧＦＰ対照（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｐ＜０．０５）と比較して有意な効果があった。
【０１６６】
Ｃ．回転行動
アンフェタミンは、ドーパミンニューロンの末端からのドーパミンの放出を誘導する。ドーパミンニューロンの片側病変は、ラットが病変した側に向かって回転することを引き起こすドーパミンにおける大きな不均衡を引き起こす。したがって、Ｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９８：１３６に記載のように、５ｍｇ／ｋｇのＤ−アンフェタミンの腹腔内投与を受けて誘導される回転数を計数するために、自動ロータメーターを使用してアンフェタミン誘発性回転行動を評価した。６−ＯＨＤＡ投与の１５日間後、アンフェタミン注入後１時間ラットを評価した。
【０１６７】
ＡＡＶ２−１６６５５での治療は、ＡＡＶ２−ＧＦＰで治療されたラットと比較して、６−ＯＨＤＡ投与の２週間後に回転行動の範囲において著しい減少をもたらした。ＡＡＶ−１６６５５は、対照ＡＡＶ２−ＧＦＰラットの１０．６±２．０と比較して、２．０±０．６ｒｐｍの回転のみを示すこれらのラットに高い保護レベルを与えた。図１０を参照されたい。
【０１６８】
Ｄ．ＧＤＮＦ発現
ＧＤＮＦＺＦＰ−ＴＦを受けたラットおよび対照ラットにおけるＧＤＮＦタンパク質の濃度も同様に、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて決定した。１４１７２の対照ＡＡＶ１およびＡＡＶ２ＧＦＰベクターまたはＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクターならびにＧＦＰを対流強化送達（ＣＥＤ）法で注入し、注入の３週間後に完全な線条体を切開した。加えて、ＡＡＶ−１６６５５を注入され、６−ＯＨＤＡで治療された、行動面で試験したラットの各半球から完全な線条体を切開した。線条体組織を液体窒素内でスナップ冷凍し、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｎｉ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で捕捉した３００ｕＬの溶解バッファ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で、モデル１００Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを均質化し、次に、１３，０００ｒｐｍの回転数で、４℃で１５分間遠心分離した。ＧＤＮＦに特異的な抗体で被覆したウェルに、標準、キット対照または試料を二重に添加した。
【０１６９】
５時間のインキュベート後、ウェルを徹底的に洗浄し、一晩インキュベートするために放置した各ウェルに、ＧＤＮＦに対して酵素結合したポリクローナル抗体を添加した。次に、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識二次抗体とともに２時間インキュベートした。次に、基質溶液（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を各ウェルに添加し、５分間のインキュベート後にプレートを解読した。相対発光量（ＲＬＵ）として表されるＦｌｘ８００マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で化学ルミネッセンスを測定した。次に、標準曲線を参照して組織抽出物（ｐｇ／ｍＬ）中のＧＤＮＦの濃度を計算した。
【０１７０】
図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ＺＦＰ−ＴＦで治療された全てのラットは、線条体組織中に、対照ラットよりも多くのＧＤＮＦタンパク質を有した。
【０１７１】
実施例７：代替の活性化ドメインによって改善されたＮＴ−３タンパク質活性化
製造業者の指示通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン）によって、１１９７１ＺＦＰ（１１９７１−ｐ６５）と連結した１つのｐ６５ドメインを含有する、または１１９７１ＺＦＰ（１１９７１−２ｘ ｐ６５）もしくは２３５７０ＺＦＰ（２３５７０−２ｘ ｐ６５）と連結した２つのｐ６５ドメインを含有する０．５ｕｇのプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を過渡的にトランスフェクトした。４８時間後に、培地中で分泌したＮＴ−３タンパク質レベルを決定した。製造業者の指示に従って、ＮＴ−３ Ｅｍａｘ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、培地のアリコート（２００ｕｌ）をアッセイした。対照には、ＧＦＰ発現プラスミドを伴うトランスフェクションおよび空ベクター（ｐｃＤＮＡ）が含まれる。
【０１７２】
図１２に示されるように、ｐ６５活性化ドメイン（１１９７１−２ｘ ｐ６５または２３５７０−２ｘｐ６５）の２つのコピーを含有するＺＦＰ候補で治療された細胞は、１１９７１−ｐ６５をトランスフェクトした細胞よりも少なくとも１０倍以上のＮＴ−３タンパク質を産出した。したがって、ｐ６５活性化ドメインのコピーは、ＮＴ−３活性化を誘発するために、単一のｐ６５ドメインよりもより効率的に作動する。結果は、１１９７１または２３５７０ＺＦＰによる堅調なＮＴ−３活性化を確証した。
【０１７３】
実施例８：ヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦの活性化
図１３は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較して、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＺＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦ遺伝子活性化を示すグラフである。上の実施例５に記載のように、リアルタイムＰＣＲによってＧＤＮＦおよびベータアクチンｍＲＮＡレベルを決定し、ＧＤＮＦとベータアクチン（ＧＤＮＦ／ＡＣＴＢ）との間の割合として相対的なＧＤＮＦレベルを表した。この結果は、ＧＤＮＦ特異的ＺＦＰによるＧＤＮＦ活性化を示す。
【０１７４】
実施例９：アカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ発現の活性化
１０％のＦＢＳで捕捉したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロゲン）中でＬＬＣ−ＭＫ２細胞を維持し、プログラムＡ−２３を使用するＡｍａｘａのｓｉｎｇｌｅ ｃｕｖｅｔｔｅ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）を使用してフクレオフェクトした。全ＲＮＡを４８時間後に抽出し、実施例５に記載のプライマーを伴ってリアルタイムＰＣＲを実行した。図１４は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターまたは偽トランスフェクトした細胞をトランスフェクトした細胞と比較して、ＺＦＰ発現ベクターをフクレオフェクトしたアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示す。１８Ｓに対するＧＤＮＦレベルを示す。このデータは、これらのＺＦＰ発現ベクターが、アカゲザル細胞中のＧＤＮＦ発現を誘導する能力があること示す。
【０１７５】
実施例１０：インビボでの眼内のラットＧＤＮＦの刺激
ラットＧＤＮＦ活性化剤（ＡＡＶ ＺＦＰ ＴＦ−１４１７２）およびＧＦＰ対照（ＡＡＶ−ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ−２ベクターを正常ラットの網膜下腔に注入した。注入の６週間後、ＲＮＡを眼杯から単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＧＤＮＦ ｍＲＮＡのレベルを測定した。ＡＡＶ−ＧＦＰを注入した眼と比較して、ＡＡＶ２ ＺＦＰ ＴＦ−１４１７２を注入した眼において、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡレベルで５倍までの増加を観察し（図１５を参照）、ＧＤＮＦ特異的ＺＦＰのインビボでの活性を示した。
【０１７６】
実施例１１：ＲＣＳラットにおける錐体機能の維持
生後２１日齢（Ｐ２１）で、ＲＣＳ（Ｒｏｙａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｏｎ）ラットにＡＡＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ−１６６５５の網膜下注入を行った。ＲＣＳラットは、ヒトにおいて常染色体劣性網膜色素変性症を引き起こすＭｅｒｔｋ遺伝子内で突然変異を担持する。Ｐ６０で、網膜電図（ＥＲＧ）を実行し、杆体および錐体視細胞の機能を評価した。４ｃｄ−ｓ／ｍ２の刺激強度で、ＡＡＶ−ＧＦＰ（ｐ＝０．０００６）を注入した眼において５１．９±２６．０μＶであったことと比較して、ＡＡＶ−１６６５５を注入した眼において平均暗順応ｂ波振幅は９７．９±５４．３μＶであり、杆体機能の維持を示唆した（図１５を参照）。２５ｃｄ−ｓ／ｍ２の刺激強度で、平均明順応ｂ波振幅は、ＡＡＶ−ＧＦＰ（ｐ＝０．００５８）を注入した眼において３７．７±１０．８μＶであったことと比較して、ＡＡＶ−１６６５５を注入した眼において６２．５±３６．９であり、錐体機能の維持を示唆した。
【０１７７】
本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０１７８】
理解の明瞭化を目的とした図示および例のために、本開示を多少詳しく提供したが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、多様な変更および修正を実施することができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明および例を限定的であると見なすべきではない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年２月４日に出願された米国仮出願第６１／２０６，７７０号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援による研究下でなされた発明に対する権利の記載
非適用。
【０００３】
本開示は、遺伝子発現の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
多くの疾病および状態は、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病としても知られている）、パーキンソン病、網膜変性、シャルコーマリーツース（ＣＭＴ）病、神経因性疼痛、および化学療法誘発ニューロパチーを含むニューロパチーに由来する。さらに、ニューロパチー（例えば、神経因性疼痛）は、神経挫滅および脊髄損傷等の神経組織の外傷に由来する可能性がある。神経再生を促す治療は、これらの状態の症状に有利であろう。
【０００５】
例えば、糖尿病性ニューロパチーは、糖尿病に起因する神経障害の群である。糖尿病を患う人々は、長期間、全身の神経の損傷を経験する可能性がある。ニューロパチーは、痺れ感、場合によっては、手、腕、足、および脚に疼痛および脱力を引き起こす。これらの神経学的疾患は、消化管、心臓、および性器を含む全ての臓器系でも起こり得る。糖尿病を患う人々は、常に神経疾患に罹る可能性があるが、糖尿病を長く患うほど、危険性も大きくなる。パーキンソン病（ＰＤ）では、患者は、黒質におけるドーパミン分泌ニューロンの損失を経験する。ＰＤ患者は、振戦、四肢硬直、無動、および動作緩慢、ならびに不安定および転倒を招く可能性がある姿勢反射障害に罹患する。網膜変性と関連する疾病には、糖尿病性網膜症、網膜色素変性、および加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）が含まれる。これらの疾病は、失明を招く可能性があり、ＡＭＤは、米国における成人の法的盲の主要原因である。
【０００６】
神経変性状態の治療の選択肢は、現在限られている。例えば、糖尿病性ニューロパチーは、現在、主に糖尿病性状態自体をコントロールすることによって治療されている。米国特許出願公開第２００５／０２６７０６１号明細書は、ＶＥＧＦ−Ａ発現を調節する亜鉛フィンガー転写因子を使用するニューロパチーの治療について記載する。米国特許第７，２５３，２７３号明細書は、神経因性疼痛の治療のために、Ｎａｖ１．８、ＴｒｋＡ、およびＶＲ１を標的とした亜鉛フィンガータンパク質を開示する。ＰＤの治療は、症状管理に関係する。最も広範に使用される治療形態はＬ−Ｄｏｐａであるが、外因性Ｌ−Ｄｏｐａの使用は、内因性Ｌ−Ｄｏｐａ産生の減少を引き起こし、最終的には逆効果となる。
【０００７】
いくつかの集団が、神経栄養性分子自体の投与が神経変性を改善する助けとなり得ることを報告している。例えば、Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１０７，１０８３−１０９２は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子導入は、ラット実験モデルにおいて軸索および脱髄の損失を特徴とする糖尿病性ニューロパチーを逆行させる場合もあることを示した。加えて、Ｉｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０；１２（１２）：１５９３−４、Ｓｏｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １２：４２４３−４２５４、Ｓｏｎｄｅｌｌ（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １９（１４）：５７３１−５７４０を参照されたい。
【０００８】
神経向性因子であるＮＴ−３は、ニューロンの生存、成長、および分化の促進において機能すると示されているが、一方でＮＴ−３欠乏は、末梢神経系に機能障害をもたらす。ＮＴ−３の欠乏は、実験用の糖尿病性ラットにおけるニューロパチーとも関係している。ＮＴ−３ｃＤＮＡの遺伝子導入は、多様なニューロパチーの動物モデルにおいて、ニューロパチーに対する前臨床効果を示しているが、ＮＴ−３ｃＤＮＡまたはＮＴ−３タンパク質の使用と関連する潜在的な問題のため、ＮＴ−３に基づく治療は診療所で使用されていない。ＮＴ−３タンパク質の直接使用は、その短い半減期、乏しい生物学的利用率、および用量を制限する毒性によって制限される。Ｐｒａｄａｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：２２３７−２２４９、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｒｅｓｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１６７−１７５、Ｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：４９９−５０７を参照されたい。加えて、ＮＴ−３ｃＤＮＡの遺伝子導入は、ＮＴ−３タンパク質の過剰産生を招き得、望まれない毒性をもたらし得る。
【０００９】
ドーパミンニューロン、線条体ニューロン、運動ニューロン、および視細胞等の神経細胞の多くの異なる種類に対して強力な生存因子であることが示されている別の神経栄養因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。例えば、Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：３８４−３９４を参照されたい。しかしながら、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の注入を受けているパーキンソン病の患者の第２相研究において、総合的な症状改善は観察されなかった。例えば、Ｌａｎｇ（２００６）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５９：４５９−４６６を参照されたい。さらに、Ｌａｎｇらは、ＧＤＮＦの注入が、恐らくタンパク質の高用量の不正確な送達に起因する重大な副作用（例えば、ＧＤＮＦおよび内因性ＧＤＮＦの両方に対して反応する中和抗体の産出）をもたらしたと報告した。
【００１０】
したがって、糖尿病性ニューロパチー、神経因性疼痛、およびニューロンの損失もしくは死滅、または損傷したニューロンを再生できないことを特徴とする多様な神経変性状態等のニューロパチーの治療のための組成物および方法が未だに必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）、糖尿病性ニューロパチー、および神経因性疼痛等のニューロパチーを治療するための方法および組成物が本明細書に開示される。特に、ニューロパチーを治療するために、ＮＴ−３およびＧＤＮＦ等の内因性の向神経性因子を調節するための方法および組成物が記載される。
【００１２】
したがって、一態様では、ＮＴ−３またはＧＤＮＦの発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質が提供される。改変された亜鉛フィンガータンパク質とは、認識ヘリックスが事前選択された標的部位に結合するように変化された、天然に存在しない亜鉛フィンガータンパク質である。本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれも、１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の亜鉛フィンガーを含むことができ、各亜鉛フィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）内の標的亜部位に結合する認識へリックスを有する。特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質は、表１または２に示される認識ヘリックスの１つ以上を有する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を、融合タンパク質の一部として、調節ドメイン（または機能ドメイン）と機能的連鎖状態に配置することができる。ＺＦＰとの融合のために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれか一方を選択することによって、そのような融合タンパク質は、遺伝子発現を活性化するか、または抑制するかのどちらか一方のために使用することができる。例えば、本明細書に記載されるＮＴ−３またはＧＤＮＦ標的ＺＦＰおよび転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６）を含む融合タンパク質は、それぞれ、内因性ＮＴ−３またはＧＤＮＦ発現を上方調節するために使用することができる。
【００１４】
さらに別の態様では、本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
さらに、核酸および／またはＺＦＰ（もしくはＺＦＰを含む融合タンパク質）を含有する薬学的組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、調節配列と操作可能に連結され、医薬的に許容可能な担体または希釈剤と併用される、本明細書に記載されるＺＦＰの１つをコードする配列を備える核酸を含み、調節配列は、細胞内で核酸の発現を可能にする。タンパク質に基づく組成物には、本明細書に開示されるＺＦＰおよび医薬的に許容可能な担体または希釈剤が含まれる。
【００１６】
さらに別の態様では、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチド、および／または組成物のいずれかを含む単離細胞も提供される。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。
【００１７】
別の態様では、神経変性を治療および／または予防するための方法、ならびに本明細書に開示される組成物を使用して神経再生を促すための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法には、糖尿病性ニューロパチーの治療が含まれる。他の実施形態では、方法には、パーキンソン病の治療が含まれる。他の実施形態では、方法には、網膜変性の治療が含まれる。ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）、および／またはその組み合わせを使用して、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を送達することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質は、それらを必要とする対象に投与される幹細胞内にある。
【００１８】
さらに別の態様では、嗜癖行動を治療または予防するための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法には、アルコール依存症の治療が含まれ、他の実施形態では、方法には、薬物依存症の治療が含まれる。
【００１９】
これらおよび他の態様は、全体の開示を考慮して、当業者には容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】パネルＡおよびＢは、本明細書に記載される例示的な亜鉛フィンガータンパク質融合構築体を示す。図１Ａは、ＮＴ−３またはＧＤＮＦ ＺＦＰおよびＮＦ−ｋＢからのｐ６５転写活性化ドメインを含む融合タンパク質を示す概略図である。融合タンパク質はまた、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を含むＳＶ４０ラージＴ抗原、およびアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２）を含むＦＬＡＧエピトープタグ（Ｆｌａｇ）からの核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含む。図１Ｂは、１１９７１の６フィンガー（１Ｆ〜６Ｆ）の各々の認識ヘリックス、ならびに各フィンガーによって認識される標的ヌクレオチドトリプレットを含む１１９７１と指定されるＮＴ−３ ＺＦＰ−ＴＦを示す。図１Ｃは、１７２４８と指定されるＧＤＮＦＺＦＰ−ＴＦ示す。フィンガー設計は、各フィンガーのアルファヘリックスの「−１」から「＋６」の位置において、アミノ酸残基の同一性を示す。
【００２１】
【図２Ａ】パネルＡおよびＢは、ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦを使用した、ヒト初代骨格筋（ＳＫＭＣ）細胞中のＮＴ−３発現を示すグラフである。図２Ａは、１０〜５０の感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したヒトＳＫＭＣ細胞内の、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡに正規化した、ＮＴ−３全ｍＲＮＡ（ｈＮＴ３、薄灰色）、ならびにその代替転写物１Ａ（ｈＮＴ３−１Ａ、白色）および１Ｂ（ｈＮＴ３−１Ｂ、濃灰色）の活性化を示す。
【００２２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、レンチウイルスベクターの不在（「偽」）時に形質導入した細胞と比較して、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５（「１１９７１」としてグラフ上で示される）をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したヒトＳＫＭＣ細胞からのＮＴ−３タンパク質分泌の増加を示す。
【００２３】
【図３】パネルＡおよびＢは、ラットＳＫＭＣ細胞中のＮＴ−３発現を示すグラフである。図３Ａは、１０〜５０の感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したラットＳＫＭＣ細胞内の、ラットＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した、ＮＴ−３ｍＲＮＡの活性化を示す。図３Ｂは、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターを形質導入したラットＳＫＭＣ細胞からのＮＴ−３タンパク質分泌の増加を示す。１１９７１は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）対照非形質導入細胞（「偽」）と比較して、１１９７１−ｐ６５を指す。
【００２４】
【図４Ａ】パネルＡおよびＢは、以下のプラスミド注入を受けた糖尿病性ラットの３つの実験群：偽治療としてｐＶＡＸ−１ベクターを受けた「ベクターのみ」の群、ＮＴ−３標的ＺＦＰ１１９７１をコードするｐＶＡＸベクターを受けた「ＮＴ３」の群、および亜鉛フィンガー転写因子ＳＢ５０９を活性化するＶＥＧＦ−ＡをコードするｐＶＡＸベクターを受けた「ＳＢ５０９」の群における神経伝導速度（ｍ／秒）を示すグラフである。日齢および体重が一致したラットを、非糖尿病性対照として使用した。棒グラフは、注入された（左）肢および注入されていない（右）肢に関する、群平均＋／−標準偏差としての感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）（Ａ）および運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）（Ｂ）データを示す。図４Ａは感覚神経伝導速度を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは運動神経伝導速度を示す。
【００２５】
【図５】パネルＡおよびＢは、ラット初代線条体ニューロンにおけるＧＤＮＦの活性化を示すグラフである。図５Ａは、ラットベータアクチンｍＲＮＡに正規化した、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ（ｒＧＤＮＦ）の活性化を示す。ラット線条体ニューロン細胞は、１０までの感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対照を形質導入した。図５Ｂは、１０までの感染効率で、ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２−ｐ６５をコードするレンチウイルスベクターまたはＧＦＰを形質導入したラット線条体ニューロンの上清におけるＧＤＮＦタンパク質分泌の増加を示す。ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを、対照として使用した。
【００２６】
【図６】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または空プラスミド（偽）をトランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。ＧＤＮＦおよびベータアクチンｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで決定され、相対的なＧＤＮＦレベルは、ＧＤＮＦとベータアクチン（ＧＤＮＦ／ＡＣＴＢ）との間の割合として表された。
【００２７】
【図７】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターをトランスフェクトした細胞または偽トランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現ベクターをトランスフェクトしたアカゲザルＲＦ６Ａ細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。１８Ｓに対するＧＤＮＦｍＲＮＡレベルが示される。
【００２８】
【図８】パネルＡおよびＢは、ＡＡＶ ＧＦＰベクター（対照）またはＡＡＶ ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５（ＧＤＮＦ活性化）のいずれか一方を注入された６−ＯＨＤＡ病変ラットにおける前肢の無動を示すグラフである。図８Ａは、１週間後の６−ＯＨＤＡ病変の結果を示し、図８Ｂは、２週間後の６−ＯＨＤＡ病変の結果を示す。
【００２９】
【図９】ＡＡＶ ＧＦＰベクター（対照）またはＡＡＶ ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５（ＧＤＮＦ活性化）のいずれか一方を注入された６−ＯＨＤＡ病変ラットにおける、「通路タスク」行動試験を使用した感覚運動怠慢の結果を示すグラフである。
【００３０】
【図１０】ＡＡＶ ＧＦＰベクター（対照）またはＡＡＶ ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５（ＧＤＮＦ活性化）のいずれか一方を注入された６−ＯＨＤＡ病変ラットにおけるアンフェタミン誘発性回転行動を示すグラフである。
【００３１】
【図１１】パネルＡおよびＢは、ＡＡＶ１ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２もしくは１６６５５または対照ベクターを注入されたラットからのラット線条体組織において、ＥＬＩＳＡで測定されるＧＤＮＦタンパク質発現を示すグラフである。図１１Ａは、ＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１４１７２を担持するＡＡＶベクターを受けたラットにおける結果を示す。図１１Ｂは、対照ＡＡＶベクターまたはＧＤＮＦ−ＺＦＰ−ＴＦ１６６５５を担持するＡＡＶベクターを注入された６−ＯＨＤＡで治療されたラットにおける結果を示す。
【００３２】
【図１２】異なるＺＦＰ ＴＦ構築体をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中のＮＴ−３タンパク質分泌を示すグラフである。構築体は、１つの（１１９７１−ｐ６５）または２つの（１１９７１−２ｘｐ６５および２３５７０−２ｘｐ６５）ｐ６５活性化ドメインのいずれか一方を含有した。対照は、プラスミドをコードするＧＦＰ（ＧＦＰ）または空ベクター（ｐｃＤＮＡ）のいずれか一方であった。
【００３３】
【図１３】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。ＧＤＮＦおよびベータアクチンｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで決定され、相対的なＧＤＮＦレベルは、ＧＤＮＦとベータアクチン（ＧＤＮＦ／ＡＣＴＢ）との間の割合として表された。
【００３４】
【図１４】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターをトランスフェクトした細胞または偽トランスフェクトした細胞と比較した、ＺＦＰ発現ベクターをヌクレオフェクトしたアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示すグラフである。１８Ｓに対するＧＤＮＦ ｍＲＮＡレベルが示される。
【００３５】
【図１５】パネルＡおよびＢは、インビボのラット特異ＧＤＮＦ ＺＦＰ ＴＦの活性を示す。図１５Ａは、ＺＦＰ−ＴＦ−１４１７２構築体を眼下注入された正常ラットにおけるＧＤＮＦ発現の刺激を示す。図１５Ｂは、ＺＦＰ−ＴＦ−１６６５５構築体を注入されたＲＣＳラットにおける錐体機能の維持を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン病、シャルコーマリーツース病、網膜変性、嗜癖行動、化学療法誘発ニューロパチー等のニューロパチー状態を治療するための組成物および方法が本明細書に開示される。特に、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む転写因子を調節するＮＴ−３およびＧＤＮＦ、ならびにそのようなタンパク質を利用する方法が、ニューロパチーの治療の使用に提供される。これらは、改変された亜鉛フィンガータンパク質、すなわち、所定の核酸標的配列に結合する天然に存在しないタンパク質を含む。
【００３７】
概論
本明細書で開示される方法の実践、ならびに組成物の調製と使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、ＤＮＡ、および関連分野における従来の技術において、当技術分野の技術範囲内である。これらの技術は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３８】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状コンフォメーションで、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸（ホスホロチオエート主鎖）部分内で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成する。
【００３９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４０】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。結合相互作用の全ての構成要素は、相互作用が全体として配列特異的である限り（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触する）、配列特異的である必要はない。そのような相互作用は、一般に、１０-6Ｍ-1以下の解離定数（Ｋd）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指す。高い結合親和性は、低いＫdと関連している。
【００４１】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合においては、それは、それ自体に結合する（その結果、ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができる、および／または異なるタンパク質または複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００４２】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、または構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ配列の領域である、１つ以上の亜鉛フィンガーによって配列特異的な様式でＤＮＡを結合するより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰとして略記される。
【００４３】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、例えば、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質の認識へリックス領域の改変（１つ以上のアミノ酸を変化させる）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合されるように「改変」することができる。したがって、改変された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。亜鉛フィンガータンパク質を改変するための方法の非制限的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成物は、主として合理的基準によってもたらされる。設計のための合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６も参照されたい。
【００４４】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、天然には見出されないタンパク質であり、その産生は、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスによって主にもたらされる。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号明細書、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、および国際公開第０２／０９９０８４を参照されたい。
【００４５】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖もしくは二本鎖のいずれか一方であってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数）長のヌクレオチド、好ましくは、約１００〜１，０００（またはそれらの間の任意の整数）長のヌクレオチド、より好ましくは、約２００〜５００長のヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアが、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて変化する長さ）がヌクレオソームコアの間に延在する。１分子のヒストンＨ１は、一般にリンカーＤＮＡと会合する。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、原核性および真核性の両方の全ての種類の細胞核タンパク質を包含するように意図されている。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００４７】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン錯体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含む全染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。
【００４８】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質錯体、または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００４９】
「標的部位」または「標的配列」は、結合にとって十分な条件が存在すれば、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。多様なＮＴ−３標的ＺＦＰに対する例示的な標的部位は、表２および３に示される。
【００５０】
「外来」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋の胚発生中のみ存在する分子は、成体筋細胞に関しては外来分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全型内在性分子の機能型または正常機能型内在性分子の機能不全型を含むことができる。
【００５１】
外来分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの等の小分子、または、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子の１つ以上を含む任意の錯体等の高分子であってもよい。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、それは一本または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成する能力のあるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号明細書を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
外来分子は、内在性分子と同一の種類の分子、例えば、外来タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外来核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞中に外来分子を導入するための方法が当業者に知られており、脂質媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外来分子はまた、内在性分子と同一の種類の分子であってもよいが、細胞が由来する種とは異なる種に由来する。例えば、ヒトの核酸配列は、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株中に導入され得る。
【００５３】
対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内在性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれてもよい。
【００５４】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同一の化学種類の分子であってもよいか、または異なる化学種類の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）、および融合核酸（例えば、上記に記載される融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送達すること、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することによってもたらされてもよく、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂、およびポリペプチド連結はまた、細胞中のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法が本開示の他所で提示される。
【００５６】
本開示に関して、「遺伝子」は、そのような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接しているかに関わらず、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネータ、リポソーム結合部位および内部リポソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサ、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
「遺伝子発現」は、遺伝子産物への遺伝子に含まれる情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００５８】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００５９】
「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ−細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
「作動的連結」および「作動的に連結」（または「作動可能に連結」という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関連して交換可能に使用され、その中で両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許すように各構成要素が配置される。図示として、プロモーター等の転写調節配列は、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合に、コード配列に作動的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが隣接していなくても、コード配列に作動的に連結される転写調節配列である。
【００６１】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に、それが果たすであろう他の構成要素に連動して同一の機能を実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合される融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＥＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合に、作動的連結状態にある。
【００６２】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一でないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同一の残基数を有することができる、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸（例えば、コード機能、別の核酸をハイブリッド形成する能力）の機能を決定するための方法が、当技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能を決定するための方法がよく知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ開裂を、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的相補性および生化学的相補性の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照されたい。
【００６３】
「ニューロパチー」という用語には、神経組織の中枢および末梢神経系組織の変性が含まれるが、これらに限定されない神経組織の任意の病変または異常が含まれる。中枢および末梢神経系組織には、眼の杆体および錐体等の分化したニューロンを含む任意のニューロンの任意の部分が含まれるが、これらに限定されない。したがって、ニューロパチーを特徴とする状態の非限定的な例には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病としても知られている）、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病性ニューロパチー、網膜変性、シャルコーマリーツース（ＣＭＴ）病、神経因性疼痛、化学療法誘発ニューロパチー、外傷（脳または脊髄）等が挙げられる。用語には、アルコールまたは薬物依存症等の嗜癖行動も含まれる。他のニューロパチー（神経変性）状態が当業者に知られている。
【００６４】
ＤＮＡ結合ドメイン
ＮＴ−３遺伝子またはＧＤＮＦ遺伝子の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。本明細書で開示される組成物および方法で、任意のＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。
【００６５】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。好ましくは、亜鉛フィンガータンパク質は天然に存在せず、それは選択する標的部位に結合するように改変される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたく、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。改変方法には、合理的設計および多様な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列と結合する亜鉛フィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ファージディスプレイおよび２ハイブリッド法を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号明細書、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、および英国第２，３３８，２３７号に開示される。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００６８】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結され得る。また、６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００６９】
標的部位の選択、融合タンパク質（および同一物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法が当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号明細書、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、国際公開第０２／０９９０８４号、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６号に詳しく記載される。
【００７０】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結し得る。また、６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、第６，４７９，６２６号、米国特許同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【００７１】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ，ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号明細書、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５-１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４-２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３-１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５３、およびニューイングランドバイオラボ社カタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然の標的部位に結合するよう改変することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書を参照されたい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナスに由来するＴＡＬエフェクターから改変されたドメインである（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９Ｏｃｔ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）、ならびにＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９Ｏｃｔ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７を参照）。
【００７３】
一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＮＴ−３遺伝子の標的部位に（配列特異的な様式で）結合し、ＮＴ−３の発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質である。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＤＮＦ遺伝子の標的部位に（配列特異的な様式で）結合し、ＧＤＮＦの発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質である。選択されたＮＴ−３またはＧＤＮＦの標的部位に結合するＺＦＰは、典型的に少なくとも１個の亜鉛フィンガーを含むが、複数の亜鉛フィンガー（例えば、２個、３個、４個、５個、６個以上のフィンガー）が含まれてもよい。通常ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４個または６個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に９個または１０個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に１２〜１４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、一方で、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。ＺＦＰはまた、そのドメインが転写活性化または抑制ドメインであり得る、１つ以上の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。
【００７４】
ＮＴ−３およびＧＤＮＦ標的ＺＦＰの特定の例は、表１ならびに２に開示される。この表の第一の列は、ＺＦＰに対する内部参照名（番号）である。「Ｆ」はフィンガーを指し、「Ｆ」に続く番号は、どの亜鉛フィンガー（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１を指す）かを参照する。
【表１】
【００７５】
全てのＮＴ−３タンパク質に対する標的部位は、ＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＧＴ（配列番号２０）である。この配列は、５３９５４８２で始まり５３９４３９９で終わるヒト染色体１２のプラス鎖で見出される（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｇｅｎｏｍｅ（ｂｕｉｌｄ３５．１），ＮＣＢＩを参照）。この配列はまた、１５６０９８６で始まり１５６０９０６９で終わるラット染色体４のマイナス鎖で見出される（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ（ＲＧＣＳ ｖ３．４），ＮＣＢＩを参照）。
【００７６】
表２は、ＧＤＮＦ標的ＺＦＰの特定の例を示す。
【表２】
【００７７】
これらのＧＤＮＦ結合タンパク質のラット、ヒト、またはアカゲザルにおける標的部位に対する配列および位置は、表３に開示される。遺伝子位置は、以下のＵＣＳＣゲノムデータベース：ラット（２００４年１１月）、ヒト（２００６年３月）、およびアカゲザル（２００６年１月）を参照して示される。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。
【表３】
【００７８】
融合タンパク質
本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）を含む融合タンパク質および異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的フラグメント）も提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー）、サイレンサ、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）、ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連する因子および修飾因子、クロマチン結合性タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）、ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子が含まれる。ＤＮＡ結合ドメインならびにヌクレアーゼ開裂ドメインの融合に関する詳細ついて、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、および同第２００７／０２１８５２８号明細書を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００７９】
活性化を達成するための好適なドメインには、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照）、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ａｎｄ Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ ａｎｄ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ８：２９３７−２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４等の人工キメラ機能ドメイン（Ｓｅｉｆｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２））、ならびにデグロンドメイン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６４３９−６４４７（１９９９）およびＳａｌｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３１１８−３１２３（２０００））が含まれる。さらなる例示的な活性化ドメインには、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌ １：８７−９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。
【００８０】
ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとの間の融合タンパク質（または同一物をコードする核酸）の形成において、活性化ドメインと相互作用する活性化ドメインまたは分子のいずれか一方が、機能ドメインとして好適であることが、当業者には明らかである。基本的に、標的遺伝子に活性化錯体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化等）を補充する能力のある任意の分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子において機能ドメインとしての使用に好適なＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質等の絶縁体ドメイン、局在化ドメイン、ならびにクロマチンリモデリングタンパク質が、例えば、譲受人共通の米国特許出願第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号明細書、ならびに譲受人共通の国際公開第０２／４４３７６号に記載される。
【００８１】
例示的な抑制ドメインには、ＫＲＡＢ、ＫＯＸ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５−３２１、およびＷｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。
【００８２】
融合分子は、当業者によく知られているクローニング法および生化学的接合によって構築される。融合分子には、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）が含まれる。融合分子には、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗原由来等）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素等）も任意的に含まれる。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の成分間で維持されるように設計される。
【００８３】
一方において機能ドメイン（またはその機能的フラグメント）のポリペプチド成分と、他方において非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との間の融合は、当業者に知られている生化学的接合の方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間に融合を起こすための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０−３９３５。
【００８４】
ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質によって結合される標的部位は、細胞クロマチンの到達可能領域に存在する。例えば、同所有の国際公開０１／８３７３２に記載されるように、到達可能領域を決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能領域に存在しない場合、譲受人共通の国際公開第０１／８３７９３号に記載されるように、１つ以上の到達可能領域を生成することができる。さらなる実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が到達可能領域にあるかに関わらず、細胞クロマチンに結合する能力がある。例えば、そのようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合する能力がある。「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインのこの型の例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）で見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：２６１−２７０、Ｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：７１９−７３１、およびＣｉｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２４４−２５４。
【００８５】
融合分子は、当業者に知られているように、医薬的に許容可能な担体で製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５、および譲受人共通の国際公開第００／４２２１９を参照されたい。
【００８６】
融合分子の機能的成分／ドメインは、いったん融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼす能力のある多種多様の異なる成分のいずれかから選択されてもよい。したがって、機能的成分には、活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー、およびサイレンサ等の多様な転写因子ドメインが含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００８７】
さらなる例示的な機能ドメインは、例えば、譲受人共通の米国特許第６，５３４，２６１号明細書および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に開示される。
【００８８】
送達
タンパク質（例えば、ＺＦＰ）、同一物をコードするヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段で標的細胞に送達され得る。好適な細胞には、真核および原核細胞ならびに／または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞またはそのような細胞から生成された細胞株の非制限的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。
【００８９】
本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号明細書に記載され、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質はまた、亜鉛フィンガータンパク質の１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系が使用され得る。また、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号明細書を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのうちのいずれかが、配列をコードする１つ以上の亜鉛フィンガータンパク質を含み得ることは明らかである。したがって、１つ以上のＺＦＰが細胞中に導入される時、ＺＦＰは、同一のベクターまたは異なるベクター上で担持され得る。複数のベクターが使用される時、各ベクターは、１つまたは複数のＺＦＰをコードする配列を含み得る。
【００９１】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して、改変されたＺＦＰをコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。そのような方法を使用して、ＺＦＰをコードする核酸を、細胞にインビトロ投与することもできる。ある特定の実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子療法用途のために投与される。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達媒体と錯体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれか一方を有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子療法手順の総説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５ （１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【００９２】
核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により強化されたＤＮＡの取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
【００９３】
さらなる例示的な核酸送達システムには、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６，００８，３３６号明細書を参照）により提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、米国特許第４，９４６，７８７号明細書、および米国特許第４，８９７，３５５号明細書に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適な陽イオン性および中性脂肪には、Ｆｅｌｇｎｅｒのそれら、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号が含まれる。細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に送達することができる。
【００９４】
免疫脂質錯体等の標的リポソームを含む脂質：核酸錯体の調製は、当業者によく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。
【００９５】
改変されたＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与（インビボ）することができるか、またはインビトロで細胞を治療するために使用することができ、修飾された細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスに基づくシステムには、遺伝子送達のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルス遺伝子送達方法を使用して可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で観察されている。
【００９６】
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的群を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることが可能であり、典型的には高ウイルス価を産生する。レトロウイルス遺伝子送達システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用の長い末端反復から成る。最小限のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、それらは、次いで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するように治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用される。広範囲にわたって使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組み合わせに基づくものが含まれる。（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【００９７】
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い導入効率があり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを使用して、高力価および高レベルの発現が得られている。比較的単純なシステムにおいて、このベクターを多量に産生することができる。アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、およびインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８〜４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）のために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。ＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６〜６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、多数の刊行物に記載される。
【００９８】
現在、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが臨床試験における遺伝子導入に使用可能であり、それらは形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
【００９９】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８〜３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７〜１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３〜１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓパッケージされたベクターに対して、５０％またはそれより大きい導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１００】
アデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノム内への組込みによる効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１〜ＡＡＶ８を含む他のＡＶＶ血清型も本発明に従って使用することができる。
【０１０１】
複製欠損性アデノウイルスベクター（Ａｄ）を高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターの大半は、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し、その後、複製欠損性ベクターが、トランス内の消失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞で増殖するように改変される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるもの等の非分裂の分化した細胞を含む、複数の種類の組織をインビボで形質転換することができる。従来のＡｄベクターは、大きな担持能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例には、筋肉内注入を用いる抗腫瘍免疫のポリヌクレオチド治療が挙げられた（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１０２】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産出細胞株によって生成される。これらのベクターには、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現されるようにタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている他のウイルス配列が含まれる。欠損しているウイルス機能は、パッケージングする細胞株によってトランスで提供される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを所有する。ウイルスＤＮＡは、細胞株内にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠失するヘルパープラスミドを含有する。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。このヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドから、ＡＡＶベクターの複製、およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠失の結果、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスの汚染は、例えば、ＡＡＶよりも敏感であるアデノウイルスに対する熱処理によって減少することができる。
【０１０３】
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターが高度の特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所定の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、関心の細胞型上に存在することで知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７〜９７５１（１９９５）は、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように、モロニーマウス白血病ウイルスを修飾することができ、そのウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、細胞表面受容体に対して、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスがリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで及ぶことができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を表示するように、線状ファージを改変することができる。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用されるが、同一の原理を非ウイルスベクターに適用することができる。特異的標的細胞による取り込みを好む特異的な取り込み配列を含有するように、そのようなベクターを改変することができる。
【０１０４】
遺伝子治療ベクターは、下で説明するように、個々の患者への投与、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所投与によって、インビボで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの幹細胞等の細胞に、ベクターをエクスビボで送達することができ、その後、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者への細胞の再移植が続く。
【０１０５】
診断、研究のため、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物にトランスフェクトした細胞の再注入を介して）が当業者によく知られている。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトし、対象生物（例えば、患者）内に戻って再注入される。エクスビボのトランスフェクションに好適な多様な細胞型は、当業者によく知られている（患者からの細胞の単離および培養方法についての説明は、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４）、およびそこで引用される参考文献を参照）。
【０１０６】
一実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクスビボ処置で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができるか、または、それらが骨髄に生着する哺乳動物（幹細胞のドナー等）に導入し得ることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α等のサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロで分化するための方法が知られている（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照）。
【０１０７】
幹細胞は、周知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化された抗原提示細胞）等の不要な細胞を結合する抗体を有する骨髄細胞をパンニングすることによって骨髄から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照）。
【０１０８】
治療的ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、細胞の形質導入のために、生物にインビボで直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液細胞または組織細胞との最終的な接触内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、使用可能であり、かつ当業者にも知られており、１つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供することができる。
【０１０９】
造血幹細胞にＤＮＡを導入するための方法が、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号明細書に開示される。導入遺伝子の造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４+細胞への導入に有用なベクターには、アデノウイルス３５型が含まれる。
【０１１０】
導入遺伝子の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入に好適なベクターには、非組込みレンチウイルスベクターが含まれる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照されたい。
【０１１１】
医薬的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、下で説明するように、使用可能な医薬組成物の多種多様の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照）。
【０１１２】
上述のように、開示される方法および組成物には、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない、任意の種類の細胞で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株が当業者に知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞（ツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等）、および真菌細胞（サッカロミセス、ピチアおよびシゾサッカロミセス等）が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変種、および誘導体を使用することもできる。
【０１１３】
キット
組成物（例えば、亜鉛フィンガータンパク質、亜鉛フィンガーをコードするタンパク質ポリヌクレオチド、融合タンパク質をコードする融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド）の１つ以上を含むキットが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、キットには、通常、亜鉛フィンガータンパク質（または同一物をコードするポリヌクレオチド）を含む１つ以上の容器が含まれる。キットには、本明細書に記載される方法（例えば、ニューロパチーの治療）のいずれかのために、タンパク質またはポリヌクレオチドの使用に関する指示、通常は書面での指示の好適なセットがさらに含まれ得る。キットには、任意の便利かつ適切なパッケージングが含まれる。指示には、通常、投与量、投薬スケジュール、および所望の使用法のための投与の経路についての情報が含まれる。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数用量包装）、または副次的単位用量であり得る。本発明のキット内に提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）上の書面での指示であるが、機械可読な指示（例えば、磁気または光学式記憶ディスクに保有される指示）も許容範囲である。
【０１１４】
用途
治療および研究用途を含むが、これらに限定されない、ＮＴ−３またはＧＤＮＦの調節が望ましい任意の用途のために、開示される組成物および方法を使用することができる。
【０１１５】
治療薬としてのＮＴ−３活性化ＺＦＰ ＴＦ、またはＮＴ−３活性化ＺＦＰ ＴＦを含有する幹細胞を使用することができる疾病および状態には、糖尿病性ニューロパチー（ＤＮ）、化学療法誘発ニューロパチー、シャルコーマリーツース病、神経因性疼痛、脊髄損傷、パーキンソン病、網膜変性等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
上述のように、ＶＥＧＦ活性化ＺＦＰ−ＴＦは、糖尿病性ニューロパチーの治療のために現在試験されている。ＮＴ−３活性化転写因子（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ）は、ＮＴ−３の活性化が、ＶＥＧＦ活性化に続く血管形成の誘導に関連する安全性の懸念を提起しない時に、これらのＶＥＧＦ活性化ＺＦＰ−ＴＦに対する代替物を提供する。同様に、化学療法を受ける癌患者は、しばしば、ニューロパチーを罹る。多くの癌において、ＶＥＧＦの活性化は、癌の進行を促進し得る。したがって、ＮＴ−３ ＺＦＰ、またはＮＴ−３ ＺＦＰを含有する幹細胞は、糖尿病性ニューロパチーおよび化学療法誘発ニューロパチーのための代替治療を提供する。
【０１１７】
本明細書に記載されるＺＦＰ−ＴＦまたはＮＴ−３ ＺＦＰを含有する幹細胞を使用してのＮＴ−３の調節（活性化）を使用して、シャルコーマリーツース（ＣＭＴ）病、足、下肢、手、前腕の筋肉の緩徐進行性変性を特徴とする一般的な遺伝性神経障害、ならびに肢、指、および爪先の軽度の感覚喪失を治療することができる。これらの疾病に対する治療剤はないが、最近のパイロット臨床研究は、ＮＴ−３の皮下注入が臨床的有益性を提供することができたことを示唆した。Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６５：６８１−９を参照されたい。ＮＴ−３に基づくＺＦＰ−ＴＦアプローチは、生理学的に関連性のあるレベルでＮＴ−３発現を誘発するその能力の結果、ｃＤＮＡまたはタンパク質よりも有効であることを判明し得る。
【０１１８】
慢性疼痛とも見なされる神経因性疼痛は、神経、脊髄、または脳の損傷からもたらされる複雑な障害である。米国特許出願公開第２００６／００４０８８０号明細書には、ＶＲ１、ＮａＶ１．８、およびＴｒｋＡを標的としたＺＦＰ−ＴＦで神経因性疼痛を治療する方法が記載される。近年、ＮＴ−３は、神経因性疼痛状態と関係するナトリウムチャンネル発現を著しく減少させたことが見出されており（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｇｅｒｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２１３（２）：３０３−１４．を参照）、ＮＴ−３が疼痛を調節することに関与することを示す。この関連で、ＮＴ−３活性化ＺＦＰ−ＴＦを使用して、そのような治療を必要とする対象において神経因性疼痛を治療することができる。
【０１１９】
同様に、ＧＤＮＦ調節ＺＦＰ−ＴＦ、またはＧＤＮＦ ＺＦＰ ＴＦを含有する幹細胞を使用して、パーキンソン病、ハンチントン病、網膜変性、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療することができる。ＧＤＮＦは、黒質におけるドーパミンニューロンにとって強力な栄養素であり、その損失がパーキンソン病を引き起こす。パーキンソン病の動物モデルにおけるＧＤＮＦの有効性は、ＧＤＮＦタンパク質およびＧＤＮＦ ｃＤＮＡの過剰発現の両方で示されている。しかしながら、ＧＤＮＦを使用した臨床試験は、パーキンソン病の患者に対する治療的有用性を示し損ね、それは、タンパク質の非常に高い用量の不正確な送達の結果であり得る（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６、上記）。さらに、ＧＤＮＦ発現のより大きい生理学的レベルを誘導するＧＤＮＦのＺＦＰ活性化は、より優れた治療結果を提供する可能性がある。
【０１２０】
ＧＤＮＦ標的ＺＦＰ、またはＧＤＮＦ標的ＺＦＰを含有する幹細胞を使用して、ハンチントン病（ＨＤ）、線条体におけるＧＡＢＡ性中型有棘ニューロンの進行性喪失を伴う神経変性障害を治療することができる。ＧＤＮＦは、興奮毒性障害に対して線条体ニューロンを保護するように示されており、線条体におけるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）媒介ＧＤＮＦ発現は、ラットＨＤモデルにおいて神経保護作用をもたらした。Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：６８２−２８８を参照されたい。したがって、ＧＤＮＦのＺＦＰ活性化を使用して、ＨＤ患者において、線条体ニューロン損失を予防または遅延するために内因性ＧＤＮＦの産生を増加することができた。
【０１２１】
本明細書に記載されるＧＤＮＦおよび／またはＮＴ−３の調節を使用して、網膜変性を治療または予防することができる。網膜変性には、はっきり異なる突然変異に起因する多くの異なる状態が含まれ、その全てが視細胞の喪失を招く。網膜変性と関連する疾病には、網膜色素変性、緑内障、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、および尿病性網膜症が含まれるが、これらに限定されない。ＧＤＮＦは、インビトロで単離された視細胞の生存を促進することを示しており、いくつかの研究は、ＧＤＮＦタンパク質の眼内注入または遺伝子導入によるＧＤＮＦの高い発現が、網膜変性のモデルにおいて桿体細胞死を遅くすることを示している（Ｆｒａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：２７２４−２７３４、ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．４：６２２−６２９）。したがって、視細胞を保護するために、ＧＤＮＦの生理学的に関連性のあるレベルを誘導するように、ＧＤＮＦのＺＦＰ活性化剤を眼内で送達することができる。最近の証拠は、ＡＭＤの治療のための網膜への幹細胞移植の可能性を示唆する（Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５（４）：３９６−４０８）。したがって、ＧＤＮＦのＺＦＰ活性化剤を含有し、その後変性網膜内に移植された幹細胞は、この状態に関連する疾病のための実行可能な治療を表し得る。同様に、ＮＴ−３は、網膜神経節分化および生存を促進することが示されている（Ｄｅ Ｌａ Ｒｏｓｓａ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５８：３４７−３５２）。したがって、ＺＦＰ ＴＦ標的ＮＴ−３は、眼内注入後に視細胞を保護し得る。
【０１２２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のために、本明細書に記載される亜鉛フィンガー転写因子を使用することができる。ＡＬＳは、運動ニューロンの損失に起因する進行性神経変性疾患である。ＧＤＮＦは、運動ニューロンを保護することが示されており、ＡＡＶ媒介ＧＤＮＦ過剰発現は、ＡＬＳのためのマウスモデルにおいて、神経保護的効果を示した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６９２０−６９２８）。重ねて、生理学的レベルのＧＤＮＦを提供する、ＧＤＮＦを標的としたＺＦＰ、またはＧＤＮＦに特異的なＺＦＰを含有する幹細胞を、ＡＬＳ患者における運動ニューロンの生存を促進するために使用することができる。
【０１２３】
嗜癖行動の治療のために、本明細書に記載される組成物を使用することもできる。例えば、高ＧＤＮＦレベルは、アルコールおよび薬物依存症の動物モデルにおいて、嗜癖行動を減少させることが示されている。Ｇｒｅｅｎ−Ｓａｄａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９４：９７−１０５を参照されたい。本明細書に記載されるＧＤＮＦのＺＦＰ活性化剤を使用して、内因性ＧＤＮＦの発現を誘導し、アルコールおよび／または薬物依存症を治療することができる。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：ＮＴ−３−ならびにＧＤＮＦ標的亜鉛フィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）の設計および構築
ＮＴ−３またはＧＤＮＦを標的とした亜鉛フィンガータンパク質は、米国特許第６，５３４，２６１号明細書に記載されるように基本的に改変される。表１は、例示的な６フィンガーＮＴ−３標的ＺＦＰの認識ヘリックスを示す。表２は、例示的な６フィンガーＧＤＮＦ標的ＺＦＰの認識ヘリックスを示す。
【０１２５】
融合タンパク質が構築され、核局在化配列、ＮＴ−３遺伝子またはＧＤＮＦ遺伝子を標的とした本明細書に記載される改変された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＮＦ−ｋＢのｐ６５転写活性化ドメイン、およびＦＬＡＧエピトープタグを含んだ。図１Ａを参照されたい。図１Ｂおよび１Ｃは、例示的なＮＴ−３ならびにＧＤＮＦ ＤＮＡ結合ドメインを示す。
【０１２６】
実施例２：ヒト初代骨格筋細胞中のＮＴ−３の活性化
筋肉内送達を介する糖尿病性ニューロパチーの治療のための、ＮＴ−３活性化ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１を使用する実行可能性を試験するために、以下の実験を実施した。
【０１２７】
Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１およびＺｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０に記載されている、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）およびポリ尿路（ｐｏｌｙｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）を含有する自己不活性化ＨＩＶ由来ベクターＲＲＬを、ＣＭＶプロモーターの制御下で、適切な導入遺伝子発現カセット（ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５またはＧＦＰ）を担持するように修飾した。基本的に、Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：２４１−２４５に記載されている、４個のプラスミドを有する２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション、特異的導入遺伝子発現（すなわち、ＺＦＰ ＴＦ１１９７１−ｐ６５、またはＧＦＰ）のためのレンチウイルス転移ベクター、および３つの追加のパッケージング構築体ｐＭＤＬ、ｐＲＥＶ、ｐＶＳＶ−Ｇ（インビトロゲン）で、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン（商標）２０００（インビトロゲン）を使用して、レンチウイルスベクターを調製した。トランスフェクションの１６時間後に、トランスフェクション培地を成長培地に交換した。次に、さらに２４時間および４８時間培養し、３０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心分離した後、ウイルスを含有する培地を回収した。０．２２μＭのフィルターを通して上清を濾過し、２８，０００ｒｐｍ回の回転数で２時間の超遠心分離法によって１５０倍に濃縮した。次に、ウイルスストックを小アリコートにし、−７０℃で保存した。
【０１２８】
ウイルス調製の感染力価を以下のように決定した。まず最初に、連続的に希釈されたＧＦＰウイルスを使用して、２９３Ｔ細胞を２日間感染させ、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ陽性細胞の割合を定量化し、感染力価を得た。リアルタイムＰＣＲに基づくプロトコルでＺＦＰウイルスの感染力価を決定し、ウイルス感染した２９３Ｔ細胞からの組み込まれたレンチウイルスのコピー数を測定した。簡潔に言うと、２９３Ｔ細胞を、連続的に希釈されたウイルスストック（ＺＦＰ ａｎｄ ＧＦＰ）に２日間感染させた。次に、ゲノムＤＮＡを調製し、記載したリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））を使用して、プロウイルスＤＮＡのレベルを決定した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１３２３−１１３３４）。細胞ごとのプロウイルスＤＮＡのコピー数をハウスキーピング遺伝子（例えば、アルブミン）の正常化によって得て、同一の試料において同様に定量ＰＣＲで決定した。
【０１２９】
プロウイルスＤＮＡプライマー／プローブセット（ＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣ（配列番号６１）、ＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴ（配列番号６２）、ＦＡＭ−ＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＧＣ−ＢＨＱ１（配列番号６３））ならびにアルブミンプライマー／プローブセット（ＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴ（配列番号６４）、ＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＴＡＴ（配列番号６５）、ＦＡＭ−ＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡ−ＢＨＱ１（配列番号６６））を使用して、プロウイルスおよびアルブミンＤＮＡをそれぞれ定量化した。次に、ＧＦＰウイルスに対する（感染力価）／（細胞ごとのプロウイルスＤＮＡの数）の比率を使用して、ＺＦＰウイルスストックの感染力価を細胞ごとのプロウイルスＤＮＡのコピー数から計算した。
【０１３０】
ベクターをＬｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入したヒト初代骨格筋細胞内に導入し、製造業者によって推奨される通りに維持した。
【０１３１】
Ａ．ＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現の分析
ヒトＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現を以下のように分析した。製造業者の推奨に従って、ハイピュアＲＮＡアイソレーションキット（ロシュダイアグノスティックス）またはＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のいずれか一方を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１３２３−１１３３４に記載のように、ＡＢＩ７７００ＳＤＳ機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で、９６のウェルフォーマット内のＴａｑｍａｎ（登録商標）化学を使用してリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実行した。使用されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブが以下に記載される。
【０１３２】
ｈＮＴ−３
ｈＮＴ３−７４３Ｆ ＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡ（配列番号６７）
ｈＮＴ３−８２７Ｒ ＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＴＡＴＴＧＴ（配列番号６８）
ｈＮＴ３−７７６Ｐ ＦＡＭ−ＣＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴＣＣＧＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡ−ＢＨＱ１（配列番号６９）
【０１３３】
ｈＮＴ３−１Ａ
ｈＮＴ３−１ＡＦ，ＡＧＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡ（配列番号７０）
ｈＮＴ３−１ＡＲ，ＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡＴＡＡＡＡ（配列番号７１）
ｈＮＴ３−１ＡＰｒｏ，ＦＡＭ−ＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡ−ＢＨＱ１（配列番号７２）
【０１３４】
ｈＮＴ３−１Ｂ
ｈＮＴ３−１ＢＦ，ＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧ（配列番号７３）
ｈＮＴ３−１ＢＲ，ＡＣＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＴ（配列番号７４）
ｈＮＴ３−１ＢＰｒｏ，ＦＡＭ−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣＴＴＡＣＡ−ＢＨＱ１（配列番号７５）
【０１３５】
ｈＧＡＰＤＨ
ｈＧＡＰＤＨ−Ｆｏｒ，ＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡ（配列番号７６）
ｈＧＡＰＤＨ−Ｒｅｖ，ＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴ（配列番号７７）
ｈＧＡＰＤＨ−Ｐｒｏ，ＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号７８）
【０１３６】
２つの代替プロモーター、プロモーターＡおよびＢでＮＴ−３の転写を誘発し、２つの代替的に開始した転写物、転写物１Ａおよび１Ｂをもたらす。転写物１Ｂは、ＮＴ−３タンパク質を発現する細胞内で主に発現される。
【０１３７】
図２Ａに示されるように、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１は、ヒトＳＫＭＣ細胞内におけるＮＴ−３転写物１Ｂの発現を優先的に促進した。
【０１３８】
Ｂ．ＮＴ−３タンパク質発現分析
４８時間の蓄積期間後（すなわち、新鮮培地を細胞に塗布してから４８時間後）に、分泌ＮＴ−３タンパク質レベルを培地中で決定した。製造業者の指示に従って、ＮＴ−３Ｅｍａｘ（登録商標）ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、培地のアリコート（２００μｌ）をアッセイした。
【０１３９】
図２Ｂに示されるように、ＮＴ標的ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５で治療された細胞は、偽形質導入した細胞よりも多くのＮＴ−３タンパク質を産生した。
【０１４０】
これらの結果は、改変されたＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５が、ヒト骨格筋細胞中のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において、ＮＴ−３を活性化する能力があることを示した。骨格筋は多くの感覚および運動ニューロンで神経支配されるため、ＺＦＰ−ＴＦ媒介ＮＴ−３活性化による骨格筋においてＮＴ−３発現を促進することは、局所の神経系に有益な効果につながる可能性がある。
【０１４１】
実施例３：ラット初代骨格筋細胞におけるＮＴ−３の活性化
ラット初代骨格筋細胞において、ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦがＮＴ−３発現を調節する能力を同様に分析した。Ｈｅｌｌｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０４：６９５−７０４に記載のように、特に、ラット初代骨格筋細胞を調製した。簡潔に言えば、２１日齢のラット胚の後肢から筋肉組織を切開し、０．１％（ｗ／ｖ）のブドウ糖を含有するリン酸緩衝生理食塩水中の０．１％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼおよび０．２％（ｗ／ｖ）のトリプシンで、３７℃で３０分間消化した。消化した組織を成長培地（１０％のウマ血清を含有するＤＭＥＭ（インビトロゲン）および２ｍＭ Ｌグルタミン）中に再懸濁した。１０ｍｌのピペットを用いて、機械的粉砕で細胞を解離した。１０００ｒｐｍの回転数で５分間の遠心分離後、細胞ペレットを成長培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を１００μＭのナイロンメッシュを通して濾過し、培養フラスコ内で４５分間インキュベートした。未付着の筋芽細胞を回収し、０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン被覆プレート内に維持した。
【０１４２】
ラット骨格筋細胞を、１１９７１−ｐ６５またはＧＦＰをコードレンチウイルスベクターに、１０〜５０の感染効率で２日間感染させた。次に、細胞および培地を、それぞれ、ＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現およびＮＴ−３タンパク質分析のために回収した。実施例２に記載のように、ＮＴ−３タンパク質レベルを同様に分析した。
ラットＮＴ−３ ｍＲＮＡ発現レベルのＴａｑｍａｎ（登録商標）分析に関して、以下のプライマーであった。
ｒＮＴ３ ７７８Ｆ ５’− ＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧ（配列番号７９）
ｒＮＴ３ ８４６Ｒ ５’−ＴＧＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＡ（配列番号８０）
ｒＮＴ３ ８００Ｐ ５’−ＦＡＭ−ＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＧＡＣ−ＢＨＱ１（配列番号８１）
ｒＧＡＰＤＨ−Ｆｏｒ，ＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧ（配列番号８２）
ｒＧＡＰＤＨ−Ｒｅｖ，ＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号８３）
ｒＧＡＰＤＨ−Ｐｒｏ，ＦＡＭ−ＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号８４）
【０１４３】
図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦをコードするレンチウイルスベクターの形質導入は、ＮＴ−３ ｍＲＮＡ（図３Ａ）およびＮＴ−３タンパク質レベル（図３Ｂ）の両方を確実に増加させた。したがって、ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５は、ラット初代骨格筋細胞内でＮＴ−３遺伝子発現を活性化した。
【０１４４】
実施例４：ＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦによる神経伝導速度の保護
ストレプトゾトシン誘発糖尿病性ニューロパチーの確立されたラットモデルにおいて、ニューロパチーに対するＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦの有効性も同様に試験した。
【０１４５】
ＮＴ−３活性化剤ＺＦＰ−ＴＦ１１９７１−ｐ６５をコードするプラスミドベクター、およびＶＥＧＦ活性化剤ＳＢ５０９を構築し、ここで、それぞれを、ＮＴ３、ＳＢ５０９と称する。ＳＢ５０９は糖尿病性ラットにおける神経伝導速度（ＮＣＶ）の保護において有効であることが以前に示されている。例えば、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５５：１８４７−１８５４を参照されたい。
【０１４６】
５％のポロキサマー１８８（ＢＡＳＦ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）の２ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓの濃度、ｐＨ８．０で、ベクター対照（トランス遺伝子なし）とともに両ベクターを製剤化した。
【０１４７】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腹腔内注入（５５ｍｇ／ｋｇ）を介して、成人雄ウィスター系ラット（２５０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）に糖尿病を誘発させた。血糖値が１５ｍｍｏｌ／ｌ未満のラットはこの研究から除外した。日齢および体重が一致したラットを非糖尿病性対照として使用した。ＳＴＺ糖尿病性ラットは、ＳＴＺの２、４、および６週間後に、それらの左腓腹筋／ヒラメ筋の２つの部位間に分割された筋肉内注入（２５０μｇの１１９７１、ＳＢ５０９、またはベクターのみの対照のいずれか）を受けた。日齢および体重が一致したラットを非糖尿病性対照（１群につきｎ＝８）として使用した。
【０１４８】
ＳＴＺ治療の８週間後、ラットをイソフルレンで麻酔し、２つの部位（坐骨切痕およびアキレス腱）における刺激に応じて筋電図を足底筋から記録した。筋電図を、パワーラブ４刺激装置（１．５〜５．０、２ｍｓパルス）に接続する優れた経皮電極を介して引き出し、ＡＢＩスコープソフトウェアでパワーラブ４に記録した。２組のＭ波の間の潜時差を計算し、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）を計算するために、２つの刺激ポイント（エクスビボで測定された）の間の神経間隔を関連付けた。Ｈ反射の潜時差を使用して、同様に感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）を計算した。左側（注入）および右側（非注入）の両方に対してＮＣＶを測定した。ＳＮＣＶおよびＭＮＣＶデータは、群平均＋／−標準偏差として表される。臨界実験は、左側ＮＣＶ対右側ＮＣＶの比較であり、対Ｔ試験によって行われた。
【０１４９】
表４に示されるように、ＳＴＺ治療は、体重の減少および血漿ブドウ糖レベルの増加によって示される、糖尿病の進行を招く。どの治療群も糖尿病のこれらの指標の変化をもたらさなかった。
【表４】
【０１５０】
図４に示されるように、両方のＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦは、感覚（図４Ａ）および運動（図４Ｂ）神経伝導速度の両方を保護した。さらに、図４に示されるように、治療された側のＮＣＶは、治療されていない側よりもはるかに高かった（ｎ＝１０、ＳＮＣＶ、ｐ＝０．００２７、ＭＮＣＶ、ｐ＝０．００００４）。この効果は、陽性対照ＳＢ５０９の効果と類似しており、治療された側におけるＮＣＶ改善もまた観察された（ｎ＝９、ＳＮＣＶ、ｐ＝０．００１４、ＭＮＣＶ、ｐ＝０．０００２）。空ベクター対照を伴っては、ＮＣＶにおける効果は観察されなかった（ｎ＝９、ＳＮＣＶ、ｐ＝０．５９、ＭＮＣＶ、ｐ＝０．１９）。これらのデータは、糖尿病性ニューロパチーのラットモデルにおける感覚および運動神経伝導速度の両方を保護することにおけるＮＴ−３標的ＺＦＰ−ＴＦの有効性を示した。
【０１５１】
実施例５：内因性ＧＤＮＦの活性化
本明細書に記載されるＧＤＮＦ標的ＺＦＰを、以下のようにラット、ヒト、およびアカゲザル由来細胞において評価した。
【０１５２】
Ａ．ラット線条体ニューロン培養
１８日齢の胎性スプラーグ／ドーリーラットラット線条体細胞を購入し、供給業者によって提案されるように調製した。簡潔に言えば、線条体組織をＮｅｕｒｏＰａｐａｉｎ（商標）を用いて３０℃で３０分間治療し、その後粉砕した。次に、Ｂ２７（インビトロゲン）およびＧｌｕｔａｍａｘ（商標）で捕捉した神経基礎培地（インビトロゲン）中の、新たに被覆されたポリ−Ｄ−リジン（シグマ）６ウェルプレート上に、１ウェルにつき３２０，０００細胞の密度で細胞を播種した。５％のＣＯ２中で、３７℃で３日間のインキュベート後、媒体の半分を新たな媒体に取り換え、さらに３〜４日間培養物を遷延した。
【０１５３】
培養ラット線条体細胞は、ＧＤＮＦＺＦＰ−ＴＦ１４１７２またはＧＦＰを有するレンチウイルスに感染効率（ＭＯＩ）１０〜２０で感染した。感染から４８〜７２時間後、ロシュ社のハイピュアＲＮＡアイソレーションキットおよびＴａｑｍａｎ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲによって分析されたＲＮＡを使用して、全ＲＮＡを感染した細胞から浄化した。ＧＤＮＦおよびアクチンレベルを決定するために使用されたプライマーは、ラットＧＤＮＦ：Ｒｎ００５６９５１０＿ｍ１齧歯類ＧＤＮＦ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびラットＡＣＴＢ：４３５２９３１Ｅ ＡＣＴＢ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。
【０１５４】
加えて、培養ニューロンにおける分泌されたＧＤＮＦのレベルを以下のように決定した。簡潔に言えば、細胞上清を回収し、以下をわずかに修正して、ＧＤＮＦ Ｅｍａｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＥＬＩＳＡに供した：使用された９６ウェルプレートは、白色のＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ（商標）／ＬｕｍｉＮｕｎｃ（商標）プレートであり、セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出試薬は、ＰｉｅｒｃｅのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅであった。加えて、ブロックバッファを各試料に添加して１Ｘ最終濃度にした。
【０１５５】
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ラット線条体細胞へのＧＤＮＦ−ＺＦＰ１４１７２の投与は、内因性ＧＤＮＦ発現を活性化し（図５Ａ）、培養液中にＧＤＮＦタンパク質分泌を増加させた（図５Ｂ）。
【０１５６】
Ｂ．ヒト２９３ＬＴＶ細胞
１０％のＦＢＳで捕捉したＤＭＥＭを用いて、ヒト２９３ＬＴＶ細胞を培養した。１ウェルにつき１Ｅ５細胞の密度で、２４ウェルプレート内に細胞を播種し、翌日、１５９６１、１７２４８、１７２７６、および１７２８７とした、ＺＦＰ−ＴＦをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。ＧＦＰをコードするプラスミドもまた、ベクター対照として含んだ。製造業者のプロトコルを使用して、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）でトランスフェクションを実行した。遺伝子発現分析をトランスフェクションの４８時間後に実行した。特に、ＲｏｃｈｅのハイピュアＲＮＡアイソレーションキットを使用して全ＲＮＡを浄化し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲを用いる遺伝子発現分析ために使用した。ＧＤＮＦおよびアクチンレベルを決定するために使用されたプライマーは、ヒトＧＤＮＦ：Ｈｓ００１８１１８５＿ｍ１またはＨｓ０１０５５３２９＿ｍ１遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびヒトＡＣＴＢ：４３５２９３５Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。
【０１５７】
図６に示されるように、本明細書に記載されるＧＤＮＦ標的ＺＦＰは、ヒトＧＤＮＦ発現を活性化する。
【０１５８】
Ｃ．アカゲザルＲＦ６Ａ細胞
非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および１０％のＦＢＳで捕捉したＭＥＭでアカゲザルＲＦ６Ａ細胞を維持した。ＳＦ溶液およびＥＨ１００プログラムを使用するＡｍａｘａ社の９６ウェルシャトルを使用して、ＧＤＮＦ−ＺＦＰ １５９６１および１７２４８（２Ｅ５細胞につき６００ｎｇ）をコードするプラスミドＤＮＡをフクレオフェクトした。以下のように、トランスフェクション後、４８時間遺伝子発現分析を実行した。ＲｏｃｈｅのハイピュアＲＮＡアイソレーションキットで全ＲＮＡを浄化し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲを用いる遺伝子発現分析のために使用した。ＧＤＮＦおよび１８Ｓレベルを決定するために使用されたプライマー／プローブセットは、
ｈ−ｒｈ−ＧＤＮＦ ＲＴ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧ（配列番号８７）
ｈ−ｒｈ−ＧＤＮＦ ＲＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＧＴＴＡＡＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＴ（配列番号８８）
ｈ−ｒｈ−ＧＤＮＦ ＲＴ−Ｐｒｏｂｅ：ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号８９）
１８ｓ ＲＴ−Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＴＣＴ（配列番号９０）
１８ｓ ＲＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＡＣＴＴＧＴＣ（配列番号９１）
１８ｓ ＲＴ−Ｐｒｏｂｅ ＴＡＡＣＴＡＧＴＴＡＣＧＣＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧ（配列番号９２）であった。
【０１５９】
図７に示されるように、本明細書に記載されるＧＤＮＦ標的ＺＦＰは、アカゲザルＧＤＮＦ発現を活性化する。
【０１６０】
実施例６：ＧＤＮＦ−ＺＦＰのインビボ分析
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）モデルのラットＧＤＮＦタンパク質レベルおよび行動データを以下のようにアッセイした。ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＣＥＤ）法を使用して、成人ラット（１つの群につきｎ＝６）の線条体（１つの線条体につき１０μＬ）にＡＡＶベクター（ＧＦＰまたはＧＤＮＦ−ＺＦＰ ＴＦ）を注入し、線条体内のベクター分布を最大にした。ベクター送達の４週間後、０．２％のアスコルビン酸塩を含む２０μＬの無菌生理食塩水中で懸濁した１０μｇの６−ＯＨＤＡを、ＣＥＤ法によって右線条体に注入した。ラットを６−ＯＨＤＡ注入の３週間後に安楽死させた。
【０１６１】
３つの異なる行動評価、前肢無動、感覚運動怠慢、および回転行動を用いて、６−ＯＨＤＡ注入後に機能試験に取りかかった。
【０１６２】
Ａ．前肢無動
基本的に、Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３９：７７７に記載のように、標準の「円筒」試験を使用して前肢無動を評価した。簡潔に言えば、ラットを垂直円筒内に個別に配置し、それらが新しい環境を探索する時の、円筒の壁上のそれらの左および右前肢の配置を計数する。６−ＯＨＤＡ注入の後８日および１４日後に、最初の２０回の前肢配置を評価した。
【０１６３】
図８Ａおよび８Ｂに示されるように、６−ＯＨＤＡ投与の８日（図８Ａ）および１４日（図８Ｂ）後において、ＡＶ−ＧＦＰで治療されたラットは右前肢の偏りを示した一方で、ＡＡＶ−１６６５５で治療されたラットは偏りが少なかった。１４日目で、ＡＡＶ−１６６５５で治療されたラット（６２＋８％の右前肢）は、ＡＡＶ２−ＧＦＰで治療されたラット（８３＋７％、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｐ＜０．０５）よりも著しく小さい偏りであった。
【０１６４】
Ｂ．感覚運動怠慢
Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １６９：３５２に記載のように、「通路タスク」を使用して感覚運動怠慢を評価し、通路の左側または右側からの食物の回収を監視した。６−ＯＨＤＡ投与の９日後に、最初の２０回の食物回収を記録した。
【０１６５】
図９に示されるように、６−ＯＨＤＡ投与を受けて、ほとんどのラットが左側（反対側）感覚運動怠慢を示した。６−ＯＨＤＡ投与の９日後の評価は、ＧＦＰ対照ラットが右に偏り、６匹のラットのうちの５匹が通路の右側からのみ食物を摂取することを示した。ＡＡＶ−１６６５５ベクターで治療されたラットは、通路の右側から食物を選択する偏りがその時間の６６±１１％のみと少なく、ＡＡＶ２−ＧＦＰ対照（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｐ＜０．０５）と比較して有意な効果があった。
【０１６６】
Ｃ．回転行動
アンフェタミンは、ドーパミンニューロンの末端からのドーパミンの放出を誘導する。ドーパミンニューロンの片側病変は、ラットが病変した側に向かって回転することを引き起こすドーパミンにおける大きな不均衡を引き起こす。したがって、Ｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９８：１３６に記載のように、５ｍｇ／ｋｇのＤ−アンフェタミンの腹腔内投与を受けて誘導される回転数を計数するために、自動ロータメーターを使用してアンフェタミン誘発性回転行動を評価した。６−ＯＨＤＡ投与の１５日間後、アンフェタミン注入後１時間ラットを評価した。
【０１６７】
ＡＡＶ２−１６６５５での治療は、ＡＡＶ２−ＧＦＰで治療されたラットと比較して、６−ＯＨＤＡ投与の２週間後に回転行動の範囲において著しい減少をもたらした。ＡＡＶ−１６６５５は、対照ＡＡＶ２−ＧＦＰラットの１０．６±２．０と比較して、２．０±０．６ｒｐｍの回転のみを示すこれらのラットに高い保護レベルを与えた。図１０を参照されたい。
【０１６８】
Ｄ．ＧＤＮＦ発現
ＧＤＮＦＺＦＰ−ＴＦを受けたラットおよび対照ラットにおけるＧＤＮＦタンパク質の濃度も同様に、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて決定した。１４１７２の対照ＡＡＶ１およびＡＡＶ２ＧＦＰベクターまたはＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクターならびにＧＦＰを対流強化送達（ＣＥＤ）法で注入し、注入の３週間後に完全な線条体を切開した。加えて、ＡＡＶ−１６６５５を注入され、６−ＯＨＤＡで治療された、行動面で試験したラットの各半球から完全な線条体を切開した。線条体組織を液体窒素内でスナップ冷凍し、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｎｉ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で捕捉した３００ｕＬの溶解バッファ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で、モデル１００Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを均質化し、次に、１３，０００ｒｐｍの回転数で、４℃で１５分間遠心分離した。ＧＤＮＦに特異的な抗体で被覆したウェルに、標準、キット対照または試料を二重に添加した。
【０１６９】
５時間のインキュベート後、ウェルを徹底的に洗浄し、一晩インキュベートするために放置した各ウェルに、ＧＤＮＦに対して酵素結合したポリクローナル抗体を添加した。次に、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識二次抗体とともに２時間インキュベートした。次に、基質溶液（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を各ウェルに添加し、５分間のインキュベート後にプレートを解読した。相対発光量（ＲＬＵ）として表されるＦｌｘ８００マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で化学ルミネッセンスを測定した。次に、標準曲線を参照して組織抽出物（ｐｇ／ｍＬ）中のＧＤＮＦの濃度を計算した。
【０１７０】
図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ＺＦＰ−ＴＦで治療された全てのラットは、線条体組織中に、対照ラットよりも多くのＧＤＮＦタンパク質を有した。
【０１７１】
実施例７：代替の活性化ドメインによって改善されたＮＴ−３タンパク質活性化
製造業者の指示通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン）によって、１１９７１ＺＦＰ（１１９７１−ｐ６５）と連結した１つのｐ６５ドメインを含有する、または１１９７１ＺＦＰ（１１９７１−２ｘ ｐ６５）もしくは２３５７０ＺＦＰ（２３５７０−２ｘ ｐ６５）と連結した２つのｐ６５ドメインを含有する０．５ｕｇのプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を過渡的にトランスフェクトした。４８時間後に、培地中で分泌したＮＴ−３タンパク質レベルを決定した。製造業者の指示に従って、ＮＴ−３ Ｅｍａｘ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、培地のアリコート（２００ｕｌ）をアッセイした。対照には、ＧＦＰ発現プラスミドを伴うトランスフェクションおよび空ベクター（ｐｃＤＮＡ）が含まれる。
【０１７２】
図１２に示されるように、ｐ６５活性化ドメイン（１１９７１−２ｘ ｐ６５または２３５７０−２ｘｐ６５）の２つのコピーを含有するＺＦＰ候補で治療された細胞は、１１９７１−ｐ６５をトランスフェクトした細胞よりも少なくとも１０倍以上のＮＴ−３タンパク質を産出した。したがって、ｐ６５活性化ドメインのコピーは、ＮＴ−３活性化を誘発するために、単一のｐ６５ドメインよりもより効率的に作動する。結果は、１１９７１または２３５７０ＺＦＰによる堅調なＮＴ−３活性化を確証した。
【０１７３】
実施例８：ヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦの活性化
図１３は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較して、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＺＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト２９３ＬＴＶ細胞中のヒトＧＤＮＦ遺伝子活性化を示すグラフである。上の実施例５に記載のように、リアルタイムＰＣＲによってＧＤＮＦおよびベータアクチンｍＲＮＡレベルを決定し、ＧＤＮＦとベータアクチン（ＧＤＮＦ／ＡＣＴＢ）との間の割合として相対的なＧＤＮＦレベルを表した。この結果は、ＧＤＮＦ特異的ＺＦＰによるＧＤＮＦ活性化を示す。
【０１７４】
実施例９：アカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ発現の活性化
１０％のＦＢＳで捕捉したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロゲン）中でＬＬＣ−ＭＫ２細胞を維持し、プログラムＡ−２３を使用するＡｍａｘａのｓｉｎｇｌｅ ｃｕｖｅｔｔｅ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）を使用してフクレオフェクトした。全ＲＮＡを４８時間後に抽出し、実施例５に記載のプライマーを伴ってリアルタイムＰＣＲを実行した。図１４は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターまたは偽トランスフェクトした細胞をトランスフェクトした細胞と比較して、ＺＦＰ発現ベクターをフクレオフェクトしたアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞中のアカゲザルＧＤＮＦ遺伝子の活性化を示す。１８Ｓに対するＧＤＮＦレベルを示す。このデータは、これらのＺＦＰ発現ベクターが、アカゲザル細胞中のＧＤＮＦ発現を誘導する能力があること示す。
【０１７５】
実施例１０：インビボでの眼内のラットＧＤＮＦの刺激
ラットＧＤＮＦ活性化剤（ＡＡＶ ＺＦＰ ＴＦ−１４１７２）およびＧＦＰ対照（ＡＡＶ−ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ−２ベクターを正常ラットの網膜下腔に注入した。注入の６週間後、ＲＮＡを眼杯から単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＧＤＮＦ ｍＲＮＡのレベルを測定した。ＡＡＶ−ＧＦＰを注入した眼と比較して、ＡＡＶ２ ＺＦＰ ＴＦ−１４１７２を注入した眼において、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡレベルで５倍までの増加を観察し（図１５を参照）、ＧＤＮＦ特異的ＺＦＰのインビボでの活性を示した。
【０１７６】
実施例１１：ＲＣＳラットにおける錐体機能の維持
生後２１日齢（Ｐ２１）で、ＲＣＳ（Ｒｏｙａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｏｎ）ラットにＡＡＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ−１６６５５の網膜下注入を行った。ＲＣＳラットは、ヒトにおいて常染色体劣性網膜色素変性症を引き起こすＭｅｒｔｋ遺伝子内で突然変異を担持する。Ｐ６０で、網膜電図（ＥＲＧ）を実行し、杆体および錐体視細胞の機能を評価した。４ｃｄ−ｓ／ｍ２の刺激強度で、ＡＡＶ−ＧＦＰ（ｐ＝０．０００６）を注入した眼において５１．９±２６．０μＶであったことと比較して、ＡＡＶ−１６６５５を注入した眼において平均暗順応ｂ波振幅は９７．９±５４．３μＶであり、杆体機能の維持を示唆した（図１５を参照）。２５ｃｄ−ｓ／ｍ２の刺激強度で、平均明順応ｂ波振幅は、ＡＡＶ−ＧＦＰ（ｐ＝０．００５８）を注入した眼において３７．７±１０．８μＶであったことと比較して、ＡＡＶ−１６６５５を注入した眼において６２．５±３６．９であり、錐体機能の維持を示唆した。
【０１７７】
本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０１７８】
理解の明瞭化を目的とした図示および例のために、本開示を多少詳しく提供したが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、多様な変更および修正を実施することができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明および例を限定的であると見なすべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＴ−３またはＧＤＮＦの発現を調節する亜鉛フィンガータンパク質であって、表１または２の列に示される認識ヘリックスを含む、亜鉛フィンガータンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質および機能ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
前記機能ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ドメインである転写調節ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質または請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質、または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項５に記載の薬学的組成物を含む、単離細胞。
【請求項７】
前記細胞は幹細胞である、請求項６に記載の単離細胞。
【請求項８】
ニューロパチーを特徴とする状態を治療または予防する方法であって、
ＮＴ−３またはＧＤＮＦ発現を活性化する亜鉛フィンガータンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項９】
ニューロパチーを特徴とする状態の治療または予防における、ＮＴ−３またはＧＤＮＦ発現を活性化する、亜鉛フィンガータンパク質の使用。
【請求項１０】
前記亜鉛フィンガータンパク質は、ポリヌクレオチドとして投与される、請求項８に記載の方法または請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターに担持される、請求項１０に記載の方法または使用。
【請求項１２】
前記亜鉛フィンガータンパク質は、それを必要とする対象に投与される幹細胞中に存在する、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記状態は、網膜変性の結果であるか、または嗜癖行動と関連する、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン病、化学療法誘発ニューロパチー、シャルコーマリーツース病である、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記亜鉛フィンガータンパク質は、請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項５に記載の薬学的組成物を含む、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１】
ＮＴ−３またはＧＤＮＦの発現を調節する亜鉛フィンガータンパク質であって、表１または２の列に示される認識ヘリックスを含む、亜鉛フィンガータンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質および機能ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
前記機能ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ドメインである転写調節ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質または請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質、または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項５に記載の薬学的組成物を含む、単離細胞。
【請求項７】
前記細胞は幹細胞である、請求項６に記載の単離細胞。
【請求項８】
ニューロパチーを特徴とする状態を治療または予防する方法であって、
ＮＴ−３またはＧＤＮＦ発現を活性化する亜鉛フィンガータンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項９】
ニューロパチーを特徴とする状態の治療または予防における、ＮＴ−３またはＧＤＮＦ発現を活性化する、亜鉛フィンガータンパク質の使用。
【請求項１０】
前記亜鉛フィンガータンパク質は、ポリヌクレオチドとして投与される、請求項８に記載の方法または請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターに担持される、請求項１０に記載の方法または使用。
【請求項１２】
前記亜鉛フィンガータンパク質は、それを必要とする対象に投与される幹細胞中に存在する、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記状態は、網膜変性の結果であるか、または嗜癖行動と関連する、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン病、化学療法誘発ニューロパチー、シャルコーマリーツース病である、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記亜鉛フィンガータンパク質は、請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項２もしくは３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または請求項５に記載の薬学的組成物を含む、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法または使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５１６６９７（Ｐ２０１２−５１６６９７Ａ）
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４９１５８（Ｐ２０１１−５４９１５８）
【出願日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００３１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９０７４４
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（３０２０４３８３７）サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００３１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９０７４４
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（３０２０４３８３７）サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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