ハタ類イリドウイルスの抗原性ペプチド及びその使用
【課題】イリドウイルス感染を検出する方法及びイリドウイルス治療薬を提供する。
【解決手段】ハタ類イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され抗原活性を有するポリペプチドを単離し、該ポリペプチドに対する抗体を作製して、免疫測定法によりイリドウイルスを検出することからなる。また、イリドウイルスの検出のためのキット、及び抗原性ペプチド並びに抗体を含むイリドウイルスの感染を処置または予防するための医薬組成物からなる。
【解決手段】ハタ類イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され抗原活性を有するポリペプチドを単離し、該ポリペプチドに対する抗体を作製して、免疫測定法によりイリドウイルスを検出することからなる。また、イリドウイルスの検出のためのキット、及び抗原性ペプチド並びに抗体を含むイリドウイルスの感染を処置または予防するための医薬組成物からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学の分野及び疾病の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ハタ類（Ｇｒｏｕｐｅｒ：グルーパー，ハタ科の魚）は、アジア太平洋地域の最も重要で経済的な魚類としてよく知られており、台湾の水産養殖産業に多額の経済的価値をもたらした。年間生産価値は２〜５億新台湾ドル（ＮＴＤ）にまで達する可能性があり、世界的な市場占有率は４２％にまで、生産量は１２．３６７メートルトンにまで達すると推定されており、生産価値及び生産占有率は世界一である。しかし、稚魚及び幼魚は屋内で集約的に養殖されていることから、この魚には深刻な感染症が発生している。台湾で養殖ハタ類の感染症を引き起こしているウイルスは、神経壊死症ウイルス及びイリドウイルスであり、これらは稚魚が大量死するという事実をしばしばもたらし、台湾の養殖産業を大いに脅かしている。
【０００３】
イリドウイルスは、１２０〜３００ｎｍのサイズを有する２０面体の２本鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは２０を超える種の魚類で感染を引き起こす可能性があり、ハタ類の稚魚の感染率は６０％を超えることが、ここ数年の間に実証されている。イリドウイルス科（Iridoviridae）には、５つの属、即ち、イリドウイルス（Iridovirus）、クロルイリドウイルス（Chlorirdovirus）、ラナウイルス（Ranavirus）、リンホシスティウイルス（Lymphocystivirus）、そして２００３年に同定されたばかりのメガロシティウイルス（Megalocystivirus）の５つの属が含まれる。これらの中で、ラナウイルスとメガロシティウイルスが台湾で生息が確認されており、いずれも高い発病率と死亡率を引き起こしている。
【０００４】
現在のイリドウイルスの検出方法は、主に、時間と材料が多くかかり、操作すべき実験装置類を必要とするポリメラーゼ連鎖反応に基づいて確立されている。漁業者にとって、これは非常に不便で費用がかかる。従って、感染を裸眼だけで確認できる携帯型の高速検出キットの開発が必要とされている。このようなキットは、疾病の発生を容易に確認できることで、感染した稚魚を購入することによる養殖業者の経済的損失を低減できるだけでなく、各国での検疫の必要性及び輸出貿易の競争に起因して、市場における高い産業上の適用可能性も備えている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、イリドウイルスの抗原決定領域の１つである新規のアミノ酸配列を特徴とし、前記抗原決定領域に従って産生されたモノクローナル又はポリクローナル抗体を提供する。前記抗体は更に、従来技術で使用される複雑な細胞培養段階やウイルス単離段階の欠点を克服し、水生動物におけるイリドウイルスの感染を高速且つ経済的な方法で検出することができる、種々の検出法及び高速検出ストリップを含むキットで使用される。
【０００６】
従って、本発明の一態様は、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明の別の態様は、上述のポリペプチドを含む組成物に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、上述のポリペプチドを使用して産生された抗体、及び前記抗体を産生する方法に関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、上述の抗体の少なくとも１つを使用してイリドウイルスの感染を検出する方法に関する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、イリドウイルスの感染を検出するためのキットであって、（１）固体支持体と、（２）前記固体支持体に付着された上述の抗体の少なくとも１つと、（３）イリドウイルス又はそのタンパク質断片と上述の抗体とを、信号を発生するように作用的に結合させる信号発生手段と、（４）関連する試薬及び界面活性剤と、を含むキットに関する。
【００１１】
本発明の更に別の態様は、上述の抗体の少なくとも１つを含む組成物に関する。
【００１２】
本発明の更に別の態様は、イリドウイルスの感染を処置又は予防するための医薬組成物であって、医薬的に許容される担体と共に、上述の抗体の少なくとも１つを含む、医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、上述の抗体の少なくとも１つを含む飼料添加物に関する。
【００１４】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面には現在の好ましい実施形態を示している。しかし、本発明は、図に示された正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体を使用した間接蛍光免疫測定の結果を示す図である。「Ｍ１」、「Ｍ２」及び「Ｍ３」という記号は、それぞれ異なる実験番号を付けたモノクローナル抗体を指し、「Ｃ−」は陰性対照を指す。
【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットの結果を示す図である。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ１：２５０、１：２０００、１：５０００に希釈した抗体の結果を示している。「Ｍ」の記号は、標準タンパク質分子量マーカー（ＫＤａ）を指す。レーン１及びレーン２は、イリドウイルスのウイルス粒子を指し、レーン３はマウス組織試料を指し、レーン４はハタ類の試料を指す。
【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体を使用した免疫ブロットの結果を示す図である。実線四角内の６０個のドットは、遺伝子型に基づいてラナウイルスに属する６０株を指し、破線四角内の２０個のドットは、遺伝子型に基づいてメガロシティウイルスに属する２０株を指す。「Ｃ＋」の記号は、陽性対照としてのラナウイルスの遺伝子型のウイルス試料を指し、最初のウェルはｌ０5.8ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルス力価を指し、それに続く各ウェルは最初のウェルのウイルス力価からの１０倍連続希釈系列を指す。「Ｃ−」の記号は、陰性対照としてのハタ類の試料を指す。
【図４】図４は、同じ保存配列を有するラナウイルス及びメガロシティウイルスのカプシドタンパク質のアミノ酸断片に基づいて合成した１１個のポリペプチドの免疫ブロットの結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の高速検出ストリップの構造を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、高速検出ストリップに示された結果の判定方法を説明する図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の高速検出ストリップを使用した結果を示す図であり、１〜６番はそれぞれ１０9ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０8ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０7ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０6ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０5ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０4ＴＣ１Ｄ50／ｍＬのウイルス力価を指し、７番は陰性試料を指す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ウイルス力価と、高速スキャン装置による図５Ａの結果に示された反応線との間の関係を示す図である。
【図７】図７は、本発明の高速検出ストリップを使用した４種類の異なる試料の結果を示す図であり、１〜４番はそれぞれ、力価が１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬのイリドウイルス、リンホシスティウイルス、陰性の魚乳剤、神経壊死症ウイルスを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにその構造的及び機能的な変異体を提供する。「構造的及び機能的な変異体」という用語は、配列番号１３のアミノ酸配列との８０％を超える類似性を有し、抗原活性を保持するポリペプチドを指す。この変異体は、配列番号１３の突然変異、例えば抗原活性に影響を及ぼさない位置の突然変異に由来してよい。配列番号１３には１３個のアミノ酸残基しかないため、当業者であれば、抗原活性に関連するアミノ酸位置と関連しない位置とを容易に決定することができ、当該技術分野で既知の技法、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して本発明の変異体を作製することができる。更に、ポリペプチドの抗原活性に影響を及ぼすことなく類似の化学的特性を有するアミノ酸置換基が使用されてもよい。配列番号１３の構造的な変異体はいずれも、抗原活性を保持すると予想される。この変異体の活性は、後述の実施例４に記載の方法により決定することができる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離及び精製することもできれば、核酸組み換え法又は化学合成法により得ることもできる。
【００１８】
抗原活性により、本発明のポリペプチドは、動物飼料と共に動物に経口投与できる組成物に含めることができ、これにより動物の体内にイリドウイルスに対する抗体を産生し、治療的及び予防的効果を達成することができる。このような組成物はまた、イリドウイルスワクチンと組み合わせて使用することもできる。この組成物の経口投与及び注射のいずれによっても、イリドウイルスに対する抗体の産生を誘導することができ、それによってワクチンの効果を向上させることができる。当業者であれば、本明細書の開示内容に基づき、本発明の組成物の処方を容易に完成することができる。
【００１９】
「抗体」という用語は、動物の血液又は体液に存在し、細菌、ウイルス又は特殊な構造を有する分子などの外部物質を認識してその後の免疫応答を引き起こすことを機能とする免疫グロブリンを指す。更に、抗体は、抗原性分子を中和し、食細胞を活性化し、認識された物質を消化する能力を有する。抗体は主にＢ細胞により産生される。一旦Ｂ細胞が特定の抗原を認識すると、そのＢ細胞はその抗原に特異的な抗体を産生する形質細胞に分化する。上述の通り、本発明のポリペプチドを含む組成物は、Ｂ細胞を活性化させる能力を特徴とし、そのためモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製するために使用することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、本発明の組成物及びアジュバントを動物の体内に注射し、一定期間の経過後にその動物から血液を採取し、更に精製を行うことによって調製することができる。モノクローナル抗体は、上述の免疫した動物から脾臓細胞を更に単離し、その脾臓細胞を骨髄腫細胞とハイブリダイズさせてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を産生することにより調製することができる。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、本発明のポリペプチドを含む組成物を使用してモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製する方法を完成することができる。
【００２０】
本発明に開示するポリペプチドによるモノクローナル又はポリクローナル抗体は、ラナウイルス及びメガロシティウイルスのいずれのイリドウイルスの属も検出することができる。国内領域で優位を占めるイリドウイルスは、その遺伝子型に基づき、ＧＩＶ局在株（ラナウイルス）、ＲＳＩＶ様の日本近似株（メガロシティウイルス）、及びＩＳＫＮＶ様株（メガロシティウイルス）を含む３つの株に分類することができる。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを使用して得られるモノクローナル又はポリクローナル抗体で、イリドウイルスの感染を検出する方法を提供する。後述の実施例５によると、本発明の方法では、２６株のラナウイルス及び８株のメガロシティウイルスを含む広範なラナウイルス及びメガロシティウイルスを検出することができる。
【００２１】
本発明の検出方法は、固相免疫クロマトグラフィー法、間接免疫蛍光染色法、及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの、抗体を使用した種々の従来の免疫測定法に適用することができる。更に、従来の検出法で必要とされるような実験機器の使用を避けるため、本発明の抗体は、高速検出ストリップと組み合わせて使用される。このストリップによれば、結果は、流体試料がそれにロードされた後に、裸眼で確認される。
【００２２】
従って、本発明は更に、イリドウイルスを検出するためのキットであって、（１）固体支持体と、（２）その固体支持体に付着（結合）された上述のような少なくとも１つの抗体と、（３）イリドウイルス又はそのタンパク質断片と前記抗体とを、信号を発生するように作用的（機能的）に結合させる信号発生手段と、（４）関連する試薬（群）及び界面活性剤（群）と、を含むキットを提供する。
【００２３】
「固体支持体」という用語は、反応物をロード（装填）するための固体の手段を指す。固体支持体は、反応プレート、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーション用の膜又はテストストリップであってよい。本発明のキットは、直接又は間接免疫測定法に基づき使用することができる。直接免疫測定法でも間接免疫測定法でも、抗体がその抗原を認識すると、信号発生手段は、検出を行う者によって確認され得る発色又は蛍光により陽性信号を発現することができ、被験試料が感染していることを示す。信号発生手段は、ハイパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン又は蛍光標識であってよい。
【００２４】
実施例７は、本発明による高速検出ストリップの一例である。高速検出ストリップのカセットは、台湾・ユニゾン・バイオテク・インコーポレイテッド（Taiwan Unison Biotech Inc.）により開発及び提供された。このカセットに関しては、２件の台湾特許、即ち、第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号がある。本発明のモノクローナル抗体は、適切な濃度でコロイド金に固定化され、ガラス繊維上に噴霧された後、台湾特許第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号に開示された方法に従い他の構成要素と共に組み立てられる。組み立てられた高速検出ストリップを図５Ａに示す。当業者であれば、必要に応じてストリップの構造を設計し、本明細書の開示内容に基づき本発明の抗体を使用してイリドウイルスの検出を行うことができる。
【００２５】
本発明の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗ウイルス活性は感受性及び特異性が高いため、この抗体は、イリドウイルスの感染の予防及び処置に使用するための医薬組成物における活性成分として使用することができる。
【００２６】
従って、本発明は、イリドウイルスの感染を処置又は予防するための医薬組成物であって、上述の少なくとも１つの抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
この医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法に従って１つ以上の医薬的に許容される担体を用いて処方することができる。「医薬的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な医薬担体を指す。このような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、選択された投与様式に好適ないずれの形態にも構成することができる。例えば、口径投与に好適な組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、及び粉剤などの固体形態と、溶液、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液などの液体形態とが含まれる。非経口投与に有用な形態には、無菌溶液、乳剤、及び懸濁液が含まれる。
【００２９】
標準的な担体に加えて、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、増粘剤、着色剤、甘味剤、香料添加剤、及び保存料などの、経口製剤で通常使用される１つ以上の賦形剤を本発明の経口医薬組成物に補うことができる。このような賦形剤は当業者に周知である。
【００３０】
経口投与に加えて、この医薬組成物は、水生動物が生息する水域環境に固体又は液体の形態で添加して、水中に生息するイリドウイルスを中和することができ、これにより水生動物のイリドウイルスによる感染率を低下させることができる。
【００３１】
医薬組成物に加えて、本発明の抗体は、動物に経口投与するために動物飼料に添加することができる飼料添加物として使用することができる。
【００３２】
本発明の方法に従うポリペプチド又は抗体の投与量は、処置されるべき動物の大きさ、年齢及び状態に基づいて養殖業者又は専門家が決定することができる。
【００３３】
本発明を以下の実施例で詳細に例示するが、これらの実施例は限定ではなく実証を目的として提供されるものである。
【００３４】
実施例
実施例１：試料収集及び分析
ここで使用した試料は、２００１年から２００６年の間に南台湾の海水魚及び淡水魚の孵化場から収集した。収集した試料は、イリドウイルスの感染を確かめるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により更に確認した。先ず、腎臓をすりつぶし、ＱｌＡａｍｐ ＤＮＡ（登録商標）ミニキット（ＱＩＡＧＮ、ドイツ）によりＤＮＡの精製を行った。次に、収集したＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００３５】
５μｇの収集したＤＮＡの増幅は、０．５μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μＬ；ギブコＢＲＬ（GibcoBRL）（登録商標）、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）、５μＬの１０倍ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）、１．５μＬの２４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia）、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、及び２．５μＬの１０ｍＭ プライマーを有する５０μＬの最終容量にて行った。ここで使用したプライマーの配列を表１に列挙した。反応は、ＭＪサーマルサイクラー（ＭＪリサーチ・インコーポレイテッド（MJ Research INC）、米国）で、以下の条件を使用して行った：９４℃にて２分間の最初の変性；９４℃にて２分間の変性、１分間のアニーリング（ＧＩＶ：５４℃、ＲＳＩＶ：５８℃、ＩＳＫＮＶ：４７℃）、７２℃にて１分間の伸長のサイクルを４０回；７２℃にて１０分間。反応生成物を使用して２％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して試料が感染しているかどうかを観察した。ＰＣＲの結果によると、１７種の魚に属する合計１５９個の試料がイリドウイルスに感染していることが確認された。結果を表２に示した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【００３８】
実施例２：ウイルスの増幅
海水魚からの試料をすりつぶし、１０倍ライボビッツＬ−１５培地に浸漬した。０．４５μｍの膜でろ過した後、０．５ｍＬのろ液を使用してマハタ属の腎臓及び胚細胞株（７ＧＫ、自己生成）とＥ１１細胞株（自己生成）とを感染させ、ウイルスを増幅した。細胞をろ液と共に１時間インキュベートし、次いで２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するライボビッツＬ−１５培地中で２５℃にて培養した。細胞変性効果を毎日観察し、感染力価をリード・メンチ法（Reed and Muench Methods）（１９３８）により決定した。
【００３９】
実施例３：ウイルスの精製
３度の凍結及び再凍結に引き続き、増幅したウイルスを１２０００ｘｇ、４℃にて２０分間遠心分離にかけ、沈殿物及び最初の上清をそれぞれ収集した。沈殿物をＴＮ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解し、超音波処理器によって破砕した。破砕した細胞を４０００ｘｇ、４℃にて２０分間遠心分離にかけた。その上清と最初の上清とを混合し、混合物を更に１００００ｘｇ、４℃にて８時間遠心分離にかけた。沈降物を１５％〜６０％のスクロース勾配にロードし、４℃にて１時間、高速の遠心分離にかけて、ウイルスの沈降線を得た。注射針を使用してこの線上の溶液を吸引し、次いでこの吸引した溶液をＴＮ緩衝液に溶解した。１０００００ｘｇにて２時間の遠心分離の後、沈殿物をＴＮ緩衝液に溶解し、ウイルス濃度を測定する試験を行った。
【００４０】
実施例４：モノクローナル及びポリクローナル抗体の産生及び単離
フロインド完全アジュバントと混合した、実施例３で得た０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．５ｍｇ／ｍＬの精製ウイルスにより、ニュージーランド白ウサギを免疫した。２週間毎に、このウサギを、フロインド不完全アジュバントと混合した同濃度のウイルスで追加免疫した。４回追加免疫を行った後、ウサギの耳静脈から血液を採取し、更にポリクローナル抗体の単離に供した。モノクローナル抗体は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにハイブリドーマ細胞を注射し、腹水を収集することによって産生した。
【００４１】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、ウサギの血清及びマウスの腹水からＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）プロテインＡにより単離した。最初に、適切な容量のＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）プロテインＡゲルをカラムに装填し、結合緩衝液Ａ（１．５Ｍ グリシン／ＮａＯＨ緩衝液、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）により平衡化した。試料を結合緩衝液Ａと混合し、その後０．５ｍＬ／分の流速でカラムにロードした。カラムを結合緩衝液Ａにより洗浄した後、溶出緩衝液（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９）をカラムにロードして、ＩｇＧ抗体を溶出させた。
【００４２】
実施例５：抗体活性の特徴付け及び試験
間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）
７ＧＫ細胞株に１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルス溶液を２５℃にて１時間接種し、次いで２％のＦＢＳを含有するＬ−１５培地を添加した。接種から４８時間後に、８０％のアセトンで１５分間細胞を固定し、その後実施例４で単離したモノクローナル抗体（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３と表記）の１０００倍希釈液を、１倍ＰＢＳでの３回の洗浄に続いて細胞に添加した。その細胞を１倍ＰＢＳにより３回洗浄し、その後二次抗体としてヤギ抗マウスＦＩＴＣ標識抗体の１０００倍希釈液を添加した。結果は、倒立蛍光顕微鏡（ツァイス・アキシオベルト１３５（Zeiss, Axiovert 135））で観察し、図１に示した。
【００４３】
図１に示す通り、３つのモノクローナル抗体（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３）のすべてが、細胞核内及び血漿内の両方におけるウイルスの存在を検出し、陰性対照としてのＣ−群では信号が観察されなかった。従って、本発明のモノクローナル抗体が、ＩＦＡにおいて有用であり、ウイルスを認識する活性を有することが確認された。
【００４４】
ウェスタンブロット
単離したウイルス粒子を４〜１２％のＳＤＳゲルで分析し、異なるサイズのウイルスタンパク質ごとに分離した。ウェスタンブロット分析のために、ウイルスタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングした膜を本発明に従う希釈抗体溶液（１：２５０、１：２０００、１：５０００）、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＩｇＧ（１：１０００）、及び３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質で順次インキュベートし、Ｘ線フィルムをブロットに曝露させた。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ１：２５０、１：２０００、１：２５００に希釈した抗体の結果を示している。「Ｍ」は標準タンパク質分子マーカー（ｋＤａ）である。レーン１及びレーン２はイリドウイルス粒子の試料であり、レーン３はマウスからの組織であり、レーン４はマハタ属の試料である。
【００４５】
図２Ａ〜Ｃに示す通り、５８ｋＤａのタンパク質が１：２０００及び１：２５００に希釈した抗体の下で出現した。従って、本発明の抗体は、イリドウイルスの５８ｋＤａのタンパク質を認識することが証明された。このタンパク質の配列を、マトリックス・サイエンス・インコーポレイテッド（Matrix Science Inc.）（英国）により開発されたＭａｓｃｏｔデータベースと比較し、イリドウイルスの主要なカプシドタンパク質であると特徴付けた。
【００４６】
ドットブロット試験
０．２μｍのニトロセルロース膜を再蒸留水で２分間すすぎ、その後Ｂｉｏ−Ｄｏｔカセット内に配置した。各ウェルに、１００μＬのラナウイルス遺伝子型６０株（実線、―）、メガロシティウイルス（Megalocytivirus）遺伝子型２０株（破線、‐‐‐）、マハタ属の陰性試料（Ｃ−）、及びマハタ属の陽性試料（Ｃ＋）をそれぞれロードした。３７℃にて１時間２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、ブロッキングした膜を、３７℃にて１時間本発明の希釈したモノクローナル抗体で順次インキュベートし、１倍ＰＰＢＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＩｇＧ（１：１０００）及びＤＡＢ基質と反応させて、陽性ブロットを褐色に呈させた。
【００４７】
図３に示す通り、モノクローナル抗体は、２６株のラナウイルス遺伝子型及び８株のメガロシティウイルス遺伝子型を検出した。従って、本発明の抗体は広範なイリドウイルスを検出することが証明された。一点鎖線（‐・‐）の四角部分においては、Ｃ＋をラナウイルスの遺伝子型のウイルス溶液と共にロードし、最初のウェルにはｌ０5.8ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルスをロードし、２番目〜６番目のウェルには１０倍連続希釈したものをロードした。図３に示す通り、本発明の抗体は、１０3.8ＴＣｌＤ50／ｍＬの力価でのウイルスの検出に成功した。陰性対照群（Ｃ−）では信号は認められなかった。
【００４８】
実施例６：本発明の抗体により認識されるエピトープ配列の知見
ラナウイルス及びメガロシティウイルスの主要なカプシドタンパク質の保存ドメインを１１個のペプチドに切断し、それらの配列を表３に列挙した。次いで、これらの１１個のペプチドを使用して、既述の通りにドットブロットを行った。レーン１〜３はそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、及び０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチドを指す。「Ｃ−」は陰性対照群を指し、「ｖ１」（ラナウイルス株）及び「ｖ２」（メガロシティウイルス株）は陽性ウイルス試料を指す。結果は図４に示した。
【００４９】
図４に示す通り、Ｐ７番は陽性信号（褐色ドット）を示すため、配列ＰＩＫＳＡＳＬＴＹＥＮＴＴＲＬＡＮ（配列番号１３）が、本発明の抗体により認識されるエピトープ部位であることが示された。又、本発明が、イリドウイルスのエピトープである新規のペプチドを開示していることも示唆された。更に、ｖ１及びｖ２もまた陽性信号を有するため、ラナウイルス及びメガロシティウイルスの両方がこの新規のエピトープを有することも示唆された。従って、本発明の抗体は、ラナウイルス及びメガロシティウイルスの存在を検出することが証明された。
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例７：高速検出キットの仕様及び感度の試験
本発明の抗体は、広範なラナウイルス及びメガロシティウイルスを検出することができ、且つ、高い感受性を有することから、高速のイリドウイルス検出キットへの応用に適している。
【００５２】
高速検出ストリップのカセットは、台湾・ユニゾン・バイオテク・インコーポレイテッド（Taiwan Unison Biotech Inc.）により開発及び提供された。このカセットに関しては、２件の台湾特許、即ち、第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号がある。本発明のモノクローナル抗体を、３０μｇ／ｍＬの濃度でコロイド金に固定化し、幅１．２ｃｍ、長さ３０ｃｍのガラス繊維（３００〜４００μｌ／ｃｍ2）に噴霧した。繊維は、乾燥させた後、台湾特許第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号に開示された方法に従い、他の構成要素と共に組み立てた。組み立てた高速検出ストリップを図５Ａに示す。
【００５３】
本発明の高速検出ストリップの利点は、試料が感染しているかどうかの判定が容易な点である。判定は裸眼で行うことができる。図５Ｂに示す通り、この高速検出ストリップは３つの異なる結果を示す。流れ方向を基準にして、奥の線のみが出た場合は陰性の結果を意味し、手前と奥の線の両方が出た場合は陽性の結果を意味し、手前の線のみが出た場合は検査の失敗を意味する。
【００５４】
感度試験
１０9ＴＣＩＤ50／ｍＬのイリドウイルス溶液を１０3ＴＣＩＤ50／ｍＬの濃度に１０倍連続希釈し、１００μＬの希釈溶液を高速検出ストリップ上にロードした。１５〜３０分後に結果が得られた。１〜６番のストリップには、それぞれｌ０9ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０6ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬ、及び１０4ＴＣＩＤ50／ｍＬをロードし、７番のストリップは陰性対照であった。図６Ａに示す通り、５番のストリップは陽性の結果を示しており、この高速検出ストリップが達成した下限は１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬであることが示された。
【００５５】
更に、携帯型スキャナー（ユニスキャン（Uniscan）（登録商標）、台湾・ユニゾン・バイオテク・インコーポレイテッド（Taiwan Unison Biotech Inc.）、台湾特許第Ｉ２４５８９９号）を使用して信号を更に確認した。携帯型スキャナーは信号を数値に定量化することができ、その数値は褐色の色合いと正の相関を有する。図６Ｂに示す通り、１〜６番のストリップに対応する値は、それぞれ２７１、１４３、６０、１６、４、０であり、ウイルス活性が褐色の色合いと完全に相関することが示された。従って、ストリップ上の褐色の色合いでウイルス活性を簡便に推定することができる。更に、表１に列挙した１５９個の試料もすべてこの高速検出ストリップに適用し、１３８個の試料が陽性感染と見なされた。そのため、本発明の高速検出ストリップは、少なくとも８６．８％の感度を有することが証明された。
【００５６】
特異性試験の分析
この試験では次の４つの試料を使用した。１番はｌ０8ＴＣＩＤ50／ｍＬのイリドウイルス、２番はリンホシスティウイルス、３番は陰性対照、４番はノダウイルス。結果は図７に示した。図７に示す通り、イリドウイルスをロードした１番のストリップのみが陽性の結果を示した。従って、本発明の高速検出ストリップは、イリドウイルスに対して高い特異性を有することが証明された。
【００５７】
当業者であれば、広範な発明の概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を加えることができることを理解するであろう。そのため、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神及び範囲内での改変を包含するものとして意図されることを理解されたい。
【符号の説明】
【００５８】
１ 試料吸収パッド
２ 連結パッド
３ プラスチック支持ベース
４ 吸収パッド
５ ニトロセルロース膜
６ 検査線
７ 対照線
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学の分野及び疾病の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ハタ類（Ｇｒｏｕｐｅｒ：グルーパー，ハタ科の魚）は、アジア太平洋地域の最も重要で経済的な魚類としてよく知られており、台湾の水産養殖産業に多額の経済的価値をもたらした。年間生産価値は２〜５億新台湾ドル（ＮＴＤ）にまで達する可能性があり、世界的な市場占有率は４２％にまで、生産量は１２．３６７メートルトンにまで達すると推定されており、生産価値及び生産占有率は世界一である。しかし、稚魚及び幼魚は屋内で集約的に養殖されていることから、この魚には深刻な感染症が発生している。台湾で養殖ハタ類の感染症を引き起こしているウイルスは、神経壊死症ウイルス及びイリドウイルスであり、これらは稚魚が大量死するという事実をしばしばもたらし、台湾の養殖産業を大いに脅かしている。
【０００３】
イリドウイルスは、１２０〜３００ｎｍのサイズを有する２０面体の２本鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは２０を超える種の魚類で感染を引き起こす可能性があり、ハタ類の稚魚の感染率は６０％を超えることが、ここ数年の間に実証されている。イリドウイルス科（Iridoviridae）には、５つの属、即ち、イリドウイルス（Iridovirus）、クロルイリドウイルス（Chlorirdovirus）、ラナウイルス（Ranavirus）、リンホシスティウイルス（Lymphocystivirus）、そして２００３年に同定されたばかりのメガロシティウイルス（Megalocystivirus）の５つの属が含まれる。これらの中で、ラナウイルスとメガロシティウイルスが台湾で生息が確認されており、いずれも高い発病率と死亡率を引き起こしている。
【０００４】
現在のイリドウイルスの検出方法は、主に、時間と材料が多くかかり、操作すべき実験装置類を必要とするポリメラーゼ連鎖反応に基づいて確立されている。漁業者にとって、これは非常に不便で費用がかかる。従って、感染を裸眼だけで確認できる携帯型の高速検出キットの開発が必要とされている。このようなキットは、疾病の発生を容易に確認できることで、感染した稚魚を購入することによる養殖業者の経済的損失を低減できるだけでなく、各国での検疫の必要性及び輸出貿易の競争に起因して、市場における高い産業上の適用可能性も備えている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、イリドウイルスの抗原決定領域の１つである新規のアミノ酸配列を特徴とし、前記抗原決定領域に従って産生されたモノクローナル又はポリクローナル抗体を提供する。前記抗体は更に、従来技術で使用される複雑な細胞培養段階やウイルス単離段階の欠点を克服し、水生動物におけるイリドウイルスの感染を高速且つ経済的な方法で検出することができる、種々の検出法及び高速検出ストリップを含むキットで使用される。
【０００６】
従って、本発明の一態様は、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明の別の態様は、上述のポリペプチドを含む組成物に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、上述のポリペプチドを使用して産生された抗体、及び前記抗体を産生する方法に関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、上述の抗体の少なくとも１つを使用してイリドウイルスの感染を検出する方法に関する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、イリドウイルスの感染を検出するためのキットであって、（１）固体支持体と、（２）前記固体支持体に付着された上述の抗体の少なくとも１つと、（３）イリドウイルス又はそのタンパク質断片と上述の抗体とを、信号を発生するように作用的に結合させる信号発生手段と、（４）関連する試薬及び界面活性剤と、を含むキットに関する。
【００１１】
本発明の更に別の態様は、上述の抗体の少なくとも１つを含む組成物に関する。
【００１２】
本発明の更に別の態様は、イリドウイルスの感染を処置又は予防するための医薬組成物であって、医薬的に許容される担体と共に、上述の抗体の少なくとも１つを含む、医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、上述の抗体の少なくとも１つを含む飼料添加物に関する。
【００１４】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面には現在の好ましい実施形態を示している。しかし、本発明は、図に示された正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体を使用した間接蛍光免疫測定の結果を示す図である。「Ｍ１」、「Ｍ２」及び「Ｍ３」という記号は、それぞれ異なる実験番号を付けたモノクローナル抗体を指し、「Ｃ−」は陰性対照を指す。
【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットの結果を示す図である。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ１：２５０、１：２０００、１：５０００に希釈した抗体の結果を示している。「Ｍ」の記号は、標準タンパク質分子量マーカー（ＫＤａ）を指す。レーン１及びレーン２は、イリドウイルスのウイルス粒子を指し、レーン３はマウス組織試料を指し、レーン４はハタ類の試料を指す。
【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体を使用した免疫ブロットの結果を示す図である。実線四角内の６０個のドットは、遺伝子型に基づいてラナウイルスに属する６０株を指し、破線四角内の２０個のドットは、遺伝子型に基づいてメガロシティウイルスに属する２０株を指す。「Ｃ＋」の記号は、陽性対照としてのラナウイルスの遺伝子型のウイルス試料を指し、最初のウェルはｌ０5.8ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルス力価を指し、それに続く各ウェルは最初のウェルのウイルス力価からの１０倍連続希釈系列を指す。「Ｃ−」の記号は、陰性対照としてのハタ類の試料を指す。
【図４】図４は、同じ保存配列を有するラナウイルス及びメガロシティウイルスのカプシドタンパク質のアミノ酸断片に基づいて合成した１１個のポリペプチドの免疫ブロットの結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の高速検出ストリップの構造を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、高速検出ストリップに示された結果の判定方法を説明する図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の高速検出ストリップを使用した結果を示す図であり、１〜６番はそれぞれ１０9ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０8ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０7ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０6ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０5ＴＣ１Ｄ50／ｍＬ、１０4ＴＣ１Ｄ50／ｍＬのウイルス力価を指し、７番は陰性試料を指す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ウイルス力価と、高速スキャン装置による図５Ａの結果に示された反応線との間の関係を示す図である。
【図７】図７は、本発明の高速検出ストリップを使用した４種類の異なる試料の結果を示す図であり、１〜４番はそれぞれ、力価が１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬのイリドウイルス、リンホシスティウイルス、陰性の魚乳剤、神経壊死症ウイルスを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにその構造的及び機能的な変異体を提供する。「構造的及び機能的な変異体」という用語は、配列番号１３のアミノ酸配列との８０％を超える類似性を有し、抗原活性を保持するポリペプチドを指す。この変異体は、配列番号１３の突然変異、例えば抗原活性に影響を及ぼさない位置の突然変異に由来してよい。配列番号１３には１３個のアミノ酸残基しかないため、当業者であれば、抗原活性に関連するアミノ酸位置と関連しない位置とを容易に決定することができ、当該技術分野で既知の技法、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して本発明の変異体を作製することができる。更に、ポリペプチドの抗原活性に影響を及ぼすことなく類似の化学的特性を有するアミノ酸置換基が使用されてもよい。配列番号１３の構造的な変異体はいずれも、抗原活性を保持すると予想される。この変異体の活性は、後述の実施例４に記載の方法により決定することができる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離及び精製することもできれば、核酸組み換え法又は化学合成法により得ることもできる。
【００１８】
抗原活性により、本発明のポリペプチドは、動物飼料と共に動物に経口投与できる組成物に含めることができ、これにより動物の体内にイリドウイルスに対する抗体を産生し、治療的及び予防的効果を達成することができる。このような組成物はまた、イリドウイルスワクチンと組み合わせて使用することもできる。この組成物の経口投与及び注射のいずれによっても、イリドウイルスに対する抗体の産生を誘導することができ、それによってワクチンの効果を向上させることができる。当業者であれば、本明細書の開示内容に基づき、本発明の組成物の処方を容易に完成することができる。
【００１９】
「抗体」という用語は、動物の血液又は体液に存在し、細菌、ウイルス又は特殊な構造を有する分子などの外部物質を認識してその後の免疫応答を引き起こすことを機能とする免疫グロブリンを指す。更に、抗体は、抗原性分子を中和し、食細胞を活性化し、認識された物質を消化する能力を有する。抗体は主にＢ細胞により産生される。一旦Ｂ細胞が特定の抗原を認識すると、そのＢ細胞はその抗原に特異的な抗体を産生する形質細胞に分化する。上述の通り、本発明のポリペプチドを含む組成物は、Ｂ細胞を活性化させる能力を特徴とし、そのためモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製するために使用することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、本発明の組成物及びアジュバントを動物の体内に注射し、一定期間の経過後にその動物から血液を採取し、更に精製を行うことによって調製することができる。モノクローナル抗体は、上述の免疫した動物から脾臓細胞を更に単離し、その脾臓細胞を骨髄腫細胞とハイブリダイズさせてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を産生することにより調製することができる。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、本発明のポリペプチドを含む組成物を使用してモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製する方法を完成することができる。
【００２０】
本発明に開示するポリペプチドによるモノクローナル又はポリクローナル抗体は、ラナウイルス及びメガロシティウイルスのいずれのイリドウイルスの属も検出することができる。国内領域で優位を占めるイリドウイルスは、その遺伝子型に基づき、ＧＩＶ局在株（ラナウイルス）、ＲＳＩＶ様の日本近似株（メガロシティウイルス）、及びＩＳＫＮＶ様株（メガロシティウイルス）を含む３つの株に分類することができる。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを使用して得られるモノクローナル又はポリクローナル抗体で、イリドウイルスの感染を検出する方法を提供する。後述の実施例５によると、本発明の方法では、２６株のラナウイルス及び８株のメガロシティウイルスを含む広範なラナウイルス及びメガロシティウイルスを検出することができる。
【００２１】
本発明の検出方法は、固相免疫クロマトグラフィー法、間接免疫蛍光染色法、及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの、抗体を使用した種々の従来の免疫測定法に適用することができる。更に、従来の検出法で必要とされるような実験機器の使用を避けるため、本発明の抗体は、高速検出ストリップと組み合わせて使用される。このストリップによれば、結果は、流体試料がそれにロードされた後に、裸眼で確認される。
【００２２】
従って、本発明は更に、イリドウイルスを検出するためのキットであって、（１）固体支持体と、（２）その固体支持体に付着（結合）された上述のような少なくとも１つの抗体と、（３）イリドウイルス又はそのタンパク質断片と前記抗体とを、信号を発生するように作用的（機能的）に結合させる信号発生手段と、（４）関連する試薬（群）及び界面活性剤（群）と、を含むキットを提供する。
【００２３】
「固体支持体」という用語は、反応物をロード（装填）するための固体の手段を指す。固体支持体は、反応プレート、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーション用の膜又はテストストリップであってよい。本発明のキットは、直接又は間接免疫測定法に基づき使用することができる。直接免疫測定法でも間接免疫測定法でも、抗体がその抗原を認識すると、信号発生手段は、検出を行う者によって確認され得る発色又は蛍光により陽性信号を発現することができ、被験試料が感染していることを示す。信号発生手段は、ハイパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン又は蛍光標識であってよい。
【００２４】
実施例７は、本発明による高速検出ストリップの一例である。高速検出ストリップのカセットは、台湾・ユニゾン・バイオテク・インコーポレイテッド（Taiwan Unison Biotech Inc.）により開発及び提供された。このカセットに関しては、２件の台湾特許、即ち、第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号がある。本発明のモノクローナル抗体は、適切な濃度でコロイド金に固定化され、ガラス繊維上に噴霧された後、台湾特許第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号に開示された方法に従い他の構成要素と共に組み立てられる。組み立てられた高速検出ストリップを図５Ａに示す。当業者であれば、必要に応じてストリップの構造を設計し、本明細書の開示内容に基づき本発明の抗体を使用してイリドウイルスの検出を行うことができる。
【００２５】
本発明の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗ウイルス活性は感受性及び特異性が高いため、この抗体は、イリドウイルスの感染の予防及び処置に使用するための医薬組成物における活性成分として使用することができる。
【００２６】
従って、本発明は、イリドウイルスの感染を処置又は予防するための医薬組成物であって、上述の少なくとも１つの抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
この医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法に従って１つ以上の医薬的に許容される担体を用いて処方することができる。「医薬的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な医薬担体を指す。このような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、選択された投与様式に好適ないずれの形態にも構成することができる。例えば、口径投与に好適な組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、及び粉剤などの固体形態と、溶液、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液などの液体形態とが含まれる。非経口投与に有用な形態には、無菌溶液、乳剤、及び懸濁液が含まれる。
【００２９】
標準的な担体に加えて、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、増粘剤、着色剤、甘味剤、香料添加剤、及び保存料などの、経口製剤で通常使用される１つ以上の賦形剤を本発明の経口医薬組成物に補うことができる。このような賦形剤は当業者に周知である。
【００３０】
経口投与に加えて、この医薬組成物は、水生動物が生息する水域環境に固体又は液体の形態で添加して、水中に生息するイリドウイルスを中和することができ、これにより水生動物のイリドウイルスによる感染率を低下させることができる。
【００３１】
医薬組成物に加えて、本発明の抗体は、動物に経口投与するために動物飼料に添加することができる飼料添加物として使用することができる。
【００３２】
本発明の方法に従うポリペプチド又は抗体の投与量は、処置されるべき動物の大きさ、年齢及び状態に基づいて養殖業者又は専門家が決定することができる。
【００３３】
本発明を以下の実施例で詳細に例示するが、これらの実施例は限定ではなく実証を目的として提供されるものである。
【００３４】
実施例
実施例１：試料収集及び分析
ここで使用した試料は、２００１年から２００６年の間に南台湾の海水魚及び淡水魚の孵化場から収集した。収集した試料は、イリドウイルスの感染を確かめるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により更に確認した。先ず、腎臓をすりつぶし、ＱｌＡａｍｐ ＤＮＡ（登録商標）ミニキット（ＱＩＡＧＮ、ドイツ）によりＤＮＡの精製を行った。次に、収集したＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００３５】
５μｇの収集したＤＮＡの増幅は、０．５μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μＬ；ギブコＢＲＬ（GibcoBRL）（登録商標）、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）、５μＬの１０倍ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）、１．５μＬの２４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia）、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、及び２．５μＬの１０ｍＭ プライマーを有する５０μＬの最終容量にて行った。ここで使用したプライマーの配列を表１に列挙した。反応は、ＭＪサーマルサイクラー（ＭＪリサーチ・インコーポレイテッド（MJ Research INC）、米国）で、以下の条件を使用して行った：９４℃にて２分間の最初の変性；９４℃にて２分間の変性、１分間のアニーリング（ＧＩＶ：５４℃、ＲＳＩＶ：５８℃、ＩＳＫＮＶ：４７℃）、７２℃にて１分間の伸長のサイクルを４０回；７２℃にて１０分間。反応生成物を使用して２％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して試料が感染しているかどうかを観察した。ＰＣＲの結果によると、１７種の魚に属する合計１５９個の試料がイリドウイルスに感染していることが確認された。結果を表２に示した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【００３８】
実施例２：ウイルスの増幅
海水魚からの試料をすりつぶし、１０倍ライボビッツＬ−１５培地に浸漬した。０．４５μｍの膜でろ過した後、０．５ｍＬのろ液を使用してマハタ属の腎臓及び胚細胞株（７ＧＫ、自己生成）とＥ１１細胞株（自己生成）とを感染させ、ウイルスを増幅した。細胞をろ液と共に１時間インキュベートし、次いで２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するライボビッツＬ−１５培地中で２５℃にて培養した。細胞変性効果を毎日観察し、感染力価をリード・メンチ法（Reed and Muench Methods）（１９３８）により決定した。
【００３９】
実施例３：ウイルスの精製
３度の凍結及び再凍結に引き続き、増幅したウイルスを１２０００ｘｇ、４℃にて２０分間遠心分離にかけ、沈殿物及び最初の上清をそれぞれ収集した。沈殿物をＴＮ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解し、超音波処理器によって破砕した。破砕した細胞を４０００ｘｇ、４℃にて２０分間遠心分離にかけた。その上清と最初の上清とを混合し、混合物を更に１００００ｘｇ、４℃にて８時間遠心分離にかけた。沈降物を１５％〜６０％のスクロース勾配にロードし、４℃にて１時間、高速の遠心分離にかけて、ウイルスの沈降線を得た。注射針を使用してこの線上の溶液を吸引し、次いでこの吸引した溶液をＴＮ緩衝液に溶解した。１０００００ｘｇにて２時間の遠心分離の後、沈殿物をＴＮ緩衝液に溶解し、ウイルス濃度を測定する試験を行った。
【００４０】
実施例４：モノクローナル及びポリクローナル抗体の産生及び単離
フロインド完全アジュバントと混合した、実施例３で得た０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．５ｍｇ／ｍＬの精製ウイルスにより、ニュージーランド白ウサギを免疫した。２週間毎に、このウサギを、フロインド不完全アジュバントと混合した同濃度のウイルスで追加免疫した。４回追加免疫を行った後、ウサギの耳静脈から血液を採取し、更にポリクローナル抗体の単離に供した。モノクローナル抗体は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにハイブリドーマ細胞を注射し、腹水を収集することによって産生した。
【００４１】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、ウサギの血清及びマウスの腹水からＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）プロテインＡにより単離した。最初に、適切な容量のＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）プロテインＡゲルをカラムに装填し、結合緩衝液Ａ（１．５Ｍ グリシン／ＮａＯＨ緩衝液、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）により平衡化した。試料を結合緩衝液Ａと混合し、その後０．５ｍＬ／分の流速でカラムにロードした。カラムを結合緩衝液Ａにより洗浄した後、溶出緩衝液（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９）をカラムにロードして、ＩｇＧ抗体を溶出させた。
【００４２】
実施例５：抗体活性の特徴付け及び試験
間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）
７ＧＫ細胞株に１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルス溶液を２５℃にて１時間接種し、次いで２％のＦＢＳを含有するＬ−１５培地を添加した。接種から４８時間後に、８０％のアセトンで１５分間細胞を固定し、その後実施例４で単離したモノクローナル抗体（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３と表記）の１０００倍希釈液を、１倍ＰＢＳでの３回の洗浄に続いて細胞に添加した。その細胞を１倍ＰＢＳにより３回洗浄し、その後二次抗体としてヤギ抗マウスＦＩＴＣ標識抗体の１０００倍希釈液を添加した。結果は、倒立蛍光顕微鏡（ツァイス・アキシオベルト１３５（Zeiss, Axiovert 135））で観察し、図１に示した。
【００４３】
図１に示す通り、３つのモノクローナル抗体（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３）のすべてが、細胞核内及び血漿内の両方におけるウイルスの存在を検出し、陰性対照としてのＣ−群では信号が観察されなかった。従って、本発明のモノクローナル抗体が、ＩＦＡにおいて有用であり、ウイルスを認識する活性を有することが確認された。
【００４４】
ウェスタンブロット
単離したウイルス粒子を４〜１２％のＳＤＳゲルで分析し、異なるサイズのウイルスタンパク質ごとに分離した。ウェスタンブロット分析のために、ウイルスタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングした膜を本発明に従う希釈抗体溶液（１：２５０、１：２０００、１：５０００）、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＩｇＧ（１：１０００）、及び３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質で順次インキュベートし、Ｘ線フィルムをブロットに曝露させた。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ１：２５０、１：２０００、１：２５００に希釈した抗体の結果を示している。「Ｍ」は標準タンパク質分子マーカー（ｋＤａ）である。レーン１及びレーン２はイリドウイルス粒子の試料であり、レーン３はマウスからの組織であり、レーン４はマハタ属の試料である。
【００４５】
図２Ａ〜Ｃに示す通り、５８ｋＤａのタンパク質が１：２０００及び１：２５００に希釈した抗体の下で出現した。従って、本発明の抗体は、イリドウイルスの５８ｋＤａのタンパク質を認識することが証明された。このタンパク質の配列を、マトリックス・サイエンス・インコーポレイテッド（Matrix Science Inc.）（英国）により開発されたＭａｓｃｏｔデータベースと比較し、イリドウイルスの主要なカプシドタンパク質であると特徴付けた。
【００４６】
ドットブロット試験
０．２μｍのニトロセルロース膜を再蒸留水で２分間すすぎ、その後Ｂｉｏ−Ｄｏｔカセット内に配置した。各ウェルに、１００μＬのラナウイルス遺伝子型６０株（実線、―）、メガロシティウイルス（Megalocytivirus）遺伝子型２０株（破線、‐‐‐）、マハタ属の陰性試料（Ｃ−）、及びマハタ属の陽性試料（Ｃ＋）をそれぞれロードした。３７℃にて１時間２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、ブロッキングした膜を、３７℃にて１時間本発明の希釈したモノクローナル抗体で順次インキュベートし、１倍ＰＰＢＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＩｇＧ（１：１０００）及びＤＡＢ基質と反応させて、陽性ブロットを褐色に呈させた。
【００４７】
図３に示す通り、モノクローナル抗体は、２６株のラナウイルス遺伝子型及び８株のメガロシティウイルス遺伝子型を検出した。従って、本発明の抗体は広範なイリドウイルスを検出することが証明された。一点鎖線（‐・‐）の四角部分においては、Ｃ＋をラナウイルスの遺伝子型のウイルス溶液と共にロードし、最初のウェルにはｌ０5.8ＴＣＩＤ50／ｍＬのウイルスをロードし、２番目〜６番目のウェルには１０倍連続希釈したものをロードした。図３に示す通り、本発明の抗体は、１０3.8ＴＣｌＤ50／ｍＬの力価でのウイルスの検出に成功した。陰性対照群（Ｃ−）では信号は認められなかった。
【００４８】
実施例６：本発明の抗体により認識されるエピトープ配列の知見
ラナウイルス及びメガロシティウイルスの主要なカプシドタンパク質の保存ドメインを１１個のペプチドに切断し、それらの配列を表３に列挙した。次いで、これらの１１個のペプチドを使用して、既述の通りにドットブロットを行った。レーン１〜３はそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、及び０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチドを指す。「Ｃ−」は陰性対照群を指し、「ｖ１」（ラナウイルス株）及び「ｖ２」（メガロシティウイルス株）は陽性ウイルス試料を指す。結果は図４に示した。
【００４９】
図４に示す通り、Ｐ７番は陽性信号（褐色ドット）を示すため、配列ＰＩＫＳＡＳＬＴＹＥＮＴＴＲＬＡＮ（配列番号１３）が、本発明の抗体により認識されるエピトープ部位であることが示された。又、本発明が、イリドウイルスのエピトープである新規のペプチドを開示していることも示唆された。更に、ｖ１及びｖ２もまた陽性信号を有するため、ラナウイルス及びメガロシティウイルスの両方がこの新規のエピトープを有することも示唆された。従って、本発明の抗体は、ラナウイルス及びメガロシティウイルスの存在を検出することが証明された。
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例７：高速検出キットの仕様及び感度の試験
本発明の抗体は、広範なラナウイルス及びメガロシティウイルスを検出することができ、且つ、高い感受性を有することから、高速のイリドウイルス検出キットへの応用に適している。
【００５２】
高速検出ストリップのカセットは、台湾・ユニゾン・バイオテク・インコーポレイテッド（Taiwan Unison Biotech Inc.）により開発及び提供された。このカセットに関しては、２件の台湾特許、即ち、第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号がある。本発明のモノクローナル抗体を、３０μｇ／ｍＬの濃度でコロイド金に固定化し、幅１．２ｃｍ、長さ３０ｃｍのガラス繊維（３００〜４００μｌ／ｃｍ2）に噴霧した。繊維は、乾燥させた後、台湾特許第Ｍ３０３０００号及び第Ｍ３ｌ５８３０号に開示された方法に従い、他の構成要素と共に組み立てた。組み立てた高速検出ストリップを図５Ａに示す。
【００５３】
本発明の高速検出ストリップの利点は、試料が感染しているかどうかの判定が容易な点である。判定は裸眼で行うことができる。図５Ｂに示す通り、この高速検出ストリップは３つの異なる結果を示す。流れ方向を基準にして、奥の線のみが出た場合は陰性の結果を意味し、手前と奥の線の両方が出た場合は陽性の結果を意味し、手前の線のみが出た場合は検査の失敗を意味する。
【００５４】
感度試験
１０9ＴＣＩＤ50／ｍＬのイリドウイルス溶液を１０3ＴＣＩＤ50／ｍＬの濃度に１０倍連続希釈し、１００μＬの希釈溶液を高速検出ストリップ上にロードした。１５〜３０分後に結果が得られた。１〜６番のストリップには、それぞれｌ０9ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０6ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬ、及び１０4ＴＣＩＤ50／ｍＬをロードし、７番のストリップは陰性対照であった。図６Ａに示す通り、５番のストリップは陽性の結果を示しており、この高速検出ストリップが達成した下限は１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬであることが示された。
【００５５】
更に、携帯型スキャナー（ユニスキャン（Uniscan）（登録商標）、台湾・ユニゾン・バイオテク・インコーポレイテッド（Taiwan Unison Biotech Inc.）、台湾特許第Ｉ２４５８９９号）を使用して信号を更に確認した。携帯型スキャナーは信号を数値に定量化することができ、その数値は褐色の色合いと正の相関を有する。図６Ｂに示す通り、１〜６番のストリップに対応する値は、それぞれ２７１、１４３、６０、１６、４、０であり、ウイルス活性が褐色の色合いと完全に相関することが示された。従って、ストリップ上の褐色の色合いでウイルス活性を簡便に推定することができる。更に、表１に列挙した１５９個の試料もすべてこの高速検出ストリップに適用し、１３８個の試料が陽性感染と見なされた。そのため、本発明の高速検出ストリップは、少なくとも８６．８％の感度を有することが証明された。
【００５６】
特異性試験の分析
この試験では次の４つの試料を使用した。１番はｌ０8ＴＣＩＤ50／ｍＬのイリドウイルス、２番はリンホシスティウイルス、３番は陰性対照、４番はノダウイルス。結果は図７に示した。図７に示す通り、イリドウイルスをロードした１番のストリップのみが陽性の結果を示した。従って、本発明の高速検出ストリップは、イリドウイルスに対して高い特異性を有することが証明された。
【００５７】
当業者であれば、広範な発明の概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を加えることができることを理解するであろう。そのため、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神及び範囲内での改変を包含するものとして意図されることを理解されたい。
【符号の説明】
【００５８】
１ 試料吸収パッド
２ 連結パッド
３ プラスチック支持ベース
４ 吸収パッド
５ ニトロセルロース膜
６ 検査線
７ 対照線
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３】
飼料添加物又はイリドウイルスワクチンと組み合せて使用される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物を使用してイリドウイルスに対する抗体を産生する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により調製される、イリドウイルスに対する単離された抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体である請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ポリクローナル抗体である請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
ラナウイルスに結合することができる請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
メガロシティウイルスに結合することができる請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
ラナウイルス及びメガロシティウイルスを同時に検出することができる請求項５に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項５に記載の抗体を使用してイリドウイルスの感染を検出する方法。
【請求項１２】
固相免疫クロマトグラフィー法、間接免疫蛍光染色法、及び酵素結合免疫吸着測定法である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イリドウイルスの感染を検出するためのキットであって、
（１）固体支持体と、
（２）前記固体支持体に付着された請求項５に記載の抗体と、
（３）イリドウイルス又はそのタンパク質断片と前記抗体とを、信号を発生するように作用的に結合させることができる信号発生手段と、
（４）関連する試薬及び界面活性剤と、
を含むキット。
【請求項１４】
直接又は間接免疫測定法により実施される請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記固体支持体は、反応プレート、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーション用の膜、又はテストストリップである請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記信号発生手段は、ハイパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン又は蛍光標識である請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
請求項５に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１８】
飼料添加物、イリドウイルス治療薬又はイリドウイルスワクチンと組み合せて使用される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
イリドウイルスの感染を処置又は予防するための医薬組成物であって、請求項５に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２０】
動物に経口投与される請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
水生動物が生息する水域環境に対して、前記環境に生息するイリドウイルスを中和するために添加される請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体を含む飼料添加物。
【請求項１】
イリドウイルスのカプシドタンパク質から単離され、抗原活性を有する、配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３】
飼料添加物又はイリドウイルスワクチンと組み合せて使用される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物を使用してイリドウイルスに対する抗体を産生する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により調製される、イリドウイルスに対する単離された抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体である請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ポリクローナル抗体である請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
ラナウイルスに結合することができる請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
メガロシティウイルスに結合することができる請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
ラナウイルス及びメガロシティウイルスを同時に検出することができる請求項５に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項５に記載の抗体を使用してイリドウイルスの感染を検出する方法。
【請求項１２】
固相免疫クロマトグラフィー法、間接免疫蛍光染色法、及び酵素結合免疫吸着測定法である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イリドウイルスの感染を検出するためのキットであって、
（１）固体支持体と、
（２）前記固体支持体に付着された請求項５に記載の抗体と、
（３）イリドウイルス又はそのタンパク質断片と前記抗体とを、信号を発生するように作用的に結合させることができる信号発生手段と、
（４）関連する試薬及び界面活性剤と、
を含むキット。
【請求項１４】
直接又は間接免疫測定法により実施される請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記固体支持体は、反応プレート、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーション用の膜、又はテストストリップである請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記信号発生手段は、ハイパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン又は蛍光標識である請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
請求項５に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１８】
飼料添加物、イリドウイルス治療薬又はイリドウイルスワクチンと組み合せて使用される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
イリドウイルスの感染を処置又は予防するための医薬組成物であって、請求項５に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２０】
動物に経口投与される請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
水生動物が生息する水域環境に対して、前記環境に生息するイリドウイルスを中和するために添加される請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体を含む飼料添加物。
【図６Ｂ】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図７】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１２０９１８（Ｐ２０１０−１２０９１８Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−３１７６４７（Ｐ２００８−３１７６４７）
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【出願人】（５０８３６６０３１）アニマル ヘルス リサーチ インスティチュート カウンスル オブ アグリカルチャー エグゼクティブ ヤン (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＮＩＭＡＬ ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ ＥＸＥＣＵＴＩＶＥ ＹＵＡＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１７６４７（Ｐ２００８−３１７６４７）
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【出願人】（５０８３６６０３１）アニマル ヘルス リサーチ インスティチュート カウンスル オブ アグリカルチャー エグゼクティブ ヤン (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＮＩＭＡＬ ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ ＥＸＥＣＵＴＩＶＥ ＹＵＡＮ
【Ｆターム（参考）】
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