ヒトサイクリン依存的キナーゼ（ｈＰＮＱＡＬＲＥ）
【課題】新生物形成の診断および処置、ならびに細胞周期の調節のための試薬および方法を提供すること。
【解決手段】ｈＰＮＱＡＬＲＥと称する新規サイクリン依存的キナーゼをコードするヒト遺伝子、およびこの新規サイクリン依存的キナーゼの発現産物は、新生物形成を検出するための試薬、および新生物形成を検出するための方法を提供し得る。増殖可能な障害および新生物形成を処置するための組成物、ならびに増殖可能な障害および新生物形成を処置するための方法もまた、提供される。本発明はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質に対するポリヌクレオチド抗体を提供する。
【解決手段】ｈＰＮＱＡＬＲＥと称する新規サイクリン依存的キナーゼをコードするヒト遺伝子、およびこの新規サイクリン依存的キナーゼの発現産物は、新生物形成を検出するための試薬、および新生物形成を検出するための方法を提供し得る。増殖可能な障害および新生物形成を処置するための組成物、ならびに増殖可能な障害および新生物形成を処置するための方法もまた、提供される。本発明はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質に対するポリヌクレオチド抗体を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、タンパク質キナーゼの領域に関する。より詳細には、本発明は、サイクリン依存的タンパク質キナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有糸分裂および移動の調節の原因である経路、ならびに細胞における環境ストレスシグナルの伝達の原因である経路は、完全には記載されていない。このようなタンパク質は、操作され得、例えば、疾患または環境条件によるストレスに対して細胞を防護し、そして、新生物形成のように有糸分裂および移動における変化を含む障害を処置する。したがって、当該分野において、これらの経路に含まれるタンパク質の同定のための必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、種々の実施形態において、新生物形成の診断および処置、ならびに細胞周期の調節のための試薬および方法を提供する。
【０００４】
本発明の１つの実施形態は、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を有するポリヌクレオチドを提供する。他の関連する実施形態は、配列番号６のアミノ酸２６〜３８および／またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもまた提供される。
【０００５】
本発明の他の実施形態は、第一および第二のタンパク質セグメントを含む融合タンパク質を提供する。これらは、ペプチド結合によってともに融合される。本発明の第一のタンパク質は、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を含む。配列番号６のアミノ酸２６〜３８またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第一のタンパク質セグメントを提供する
本発明のなお他の実施形態は、配列番号４、配列番号６および／または配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合する抗体の調製を含む。関連する実施形態は、配列番号６および／または配列番号８のアミノ酸２６〜３８および／または配列番号６の１８１〜２０１の全体または一部によって規定されるエピトープに特異的に結合する抗体調製物を含む。
【０００６】
さらなる実施形態は、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を提供する。類似の実施形態は、配列番号６のアミノ酸２６〜３８および／またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡを提供する。配列番号５のヌクレオチド７６〜１１４に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列、および／または配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列、および／または配列番号５のヌクレオチド５４２〜６０３に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む、本発明のｃＤＮＡ分子はまた提供される。配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子もまた、提供される。
【０００７】
本発明のなおさらなる実施形態は、配列番号５のヌクレオチド７６から１１４および／または配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離されたサブゲノムポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。
【０００８】
他の本発明の実施形態は、プロモーター、ならびに、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸をコードポリヌクレオチドセグメントを含む構築物を含む。模範的な構築物によって、ポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置され、そしてポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始される。類似の実施形態は、プロモーターおよび配列番号６のアミノ酸２６〜３８および／またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む構築物を含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置され得、そしてポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始され得る。本発明の構築物はまた、プロモーター、ならびに、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。
【０００９】
他の本発明の実施形態は、本明細書中で提供される任意の構築物を含む宿主細胞を含む。
【００１０】
さらなる実施形態は、新しい転写開始ユニットを組み込む相同組換え細胞を提供する。本発明の新しい転写開始ユニットは、外因性調節配列、外因性エキソンおよびスプライスドナー部位を含み得る。新しい転写開始ユニットは、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるコード配列を有する遺伝子のコード配列の上流に位置され得る。外因性調節配列は、遺伝子のコード配列の転写を指向し得る。
【００１１】
なおさらなる実施形態は、新生物形成の診断または予防の方法を提供する。このような方法は、新生物形成が予想される第一の組織における第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現を、正常である第二の組織における第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現と比較する工程を含み得る。第一および第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるコード配列を含み得る。これらの方法によって、第一の組織における第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の過剰発現は、第一の組織における新生物形成を示す。新生物形成を診断または予防する類似の方法によって、第一および／または第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド７６〜１１４、配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、または配列番号５のヌクレオチド５４２〜６０３からなる群より選択されるコード配列を含み得る。
【００１２】
したがって、本発明は、サイクリン依存的キナーゼファミリーの独特のメンバーであるｈＰＮＱＡＬＲＥのアミノ酸配列およびｈＰＮＱＡＬＲＥをコードするＤＮＡ配列を用いる技術を提供する。とりわけ、本発明を用いて、新生物形成および他の増殖性疾患を処置し得る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸２６から３８に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸２６から３８に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸１８１から２０１に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸１８１から２０１に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
（項目２）配列番号６のアミノ酸２６から３８に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３）配列番号６のアミノ酸１８１から２０１に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
（項目４）第一のタンパク質セグメントおよび第二のタンパク質セグメントを含む融合タンパク質であって、ここで、該第一のタンパク質セグメントは、該第二のタンパク質セグメントとペプチド結合によって融合され、ここで、該第一のタンパク質セグメントは、請求項１に記載の単離されたポリペプチドを含む、融合タンパク質。
（項目５）請求項１に記載の単離されたポリペプチドの全体または一部によって規定されるエピトープに特異的に結合する、抗体の調製物。
（項目６）請求項１に記載の単離されたポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目７）請求項２に記載の単離されたポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目８）請求項３に記載の単離されたポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目９）ｃＤＮＡ分子であって、以下：
（ａ）配列番号５のヌクレオチド７６から１１４に、少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド７６から１１４に同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチド５０３から５６４、または配列番号５のヌクレオチド５４２から６０３に、少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５０３から５６４、または配列番号５のヌクレオチド５４２から６０３に同一であるヌクレオチド配列；および
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ｃＤＮＡ分子。
（項目１０）単離されたサブゲノムポリヌクレオチドまたはその相補体であって、ストリンジェントな条件下で、配列番号５のヌクレオチド７６から１１４、および配列番号３のヌクレオチド５０３から５６４からなる群より選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離されたサブゲノムポリヌクレオチドまたはその相補体。
（項目１１）構築物であって、以下：
プロモーター；および
請求項６に記載のｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドセグメントであって、ここで、該ポリヌクレオチドセグメントは、該プロモーターから下流に位置され、そして該ポリヌクレオチドセグメントの転写は、該プロモーターから開始する、
構築物。
（項目１２）構築物であって、以下：
プロモーター；および
請求項９に記載のｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドセグメントであって、ここで、該ポリヌクレオチドセグメントは、該プロモーターから下流に位置され、そして該ポリヌクレオチドセグメントの転写は、該プロモーターから開始する、
構築物。
（項目１３）請求項１１に記載の構築物を含む、宿主細胞。
（項目１４）請求項１２に記載の構築物を含む、宿主細胞。
（項目１５）そこに組み込まれた新しい転写開始ユニットを有する相同組換え細胞であって、該新しい転写開始ユニットは、以下：
（ａ）外因性調節配列；
（ｂ）外因性エキソン；および
（ｃ）スプライスドナー部位であって、ここで、該新しい転写開始ユニットが遺伝子のコード配列の上流に位置され、ここで、該遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるコード配列を有し、そして該外因性調節配列は、該遺伝子のコード配列の転写を指向する、スプライスドナー部位、
を含む、細胞。
（項目１６）新生物形成を診断または予防する方法であって、該方法は、新生物形成の疑いのある第一の組織における第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現を、正常な第二の組織における第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現と比較する工程を含有し、ここで、該第一および第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、以下：
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号３；
（ｃ）配列番号５；
（ｄ）配列番号７；
（ｅ）配列番号５の７６から１１４のヌクレオチド；
（ｆ）配列番号３の５０３から５６４のヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号５の５４２から６０３のヌクレオチド、
からなる群より選択されるコード配列を含み、
ここで、該第一の組織における該第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の過剰発現は、該第一の組織における新生物形成を示す、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態のアミノ酸配列を比較する。
【図１−２】図１は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態のアミノ酸配列を比較する。
【図２−１】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【図２−２】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【図２−３】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【図２−４】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
ｈＰＮＱＡＬＲＥと称する新規のヒトサイクリン依存的キナーゼは、本発明の発見である。ｈＰＮＱＡＬＲＥは、サイクリン依存的キナーゼファミリーのメンバーである。ｈＰＮＱＡＬＲＥは、腫瘍において過剰発現し、診断的および治療的に使用され得る。
ヒトｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の４つの形態のアミノ酸配列（配列番号２，４，６および８）、ならびにｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１，３，５および７）は、本明細書中に記載される。サイクリン依存的キナーゼのすべての重要な部位は、このタンパク質中に保存される。ｃｄｋ２に見出された、分子のＮ末端の調節リン酸化部位（１４位のスレオニンおよび１５位のチロシン）は、ｈＰＮＱＡＬＲＥにおいては、これらの部位にリン酸化されない２つの残基（グルタミンおよびフェニルアラニン）をまた有するＣＤＫ７型サイクリン依存的キナーゼと類似して、それぞれ、アラニンおよびヒスチジンによって置換される。サイクリン依存的キナーゼの調節リン酸化部位は、とりわけ以下に記載される：Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ、Ｐｒｏｇｒ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．１、２２９−４０（１９９５）；ＬｅｗおよびＫｏｒｎｂｌｕｔｈ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８、７９５−８０４（１９９６）；およびＭｏｒｇａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、２６１−９１（１９９７）。サイクリン依存的キナーゼのサイクリン結合ドメインを特徴付ける配列モチーフ（Ｃｄｋ２中のＰＳＴＡＩＲＥ；配列番号１５）は、ｈＰＮＱＡＬＲＥにおいて、ＰＮＱＡＬＲＥ（配列番号９）によって置換され、これは、ｈＰＮＱＡＬＲＥが、その調節サイクリンサブユニットに関して異なる特異性を有することを示す。
【００１５】
ｈＰＮＱＡＬＲＥの種々のアミノ酸は置換されて、１つ以上の変化した生物学的活性を有するｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体を形成し得る。例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン依存的キナーゼ活性またはサイクリン結合ドメインは、変化され得るか、または置換は、タンパク質をリン酸化され得るよう作製し得る。このような置換は、野生型のｈＰＮＱＡＬＲＥと比較して、変化した調節または生物学的活性の特定のサブセットを、ｈＰＮＱＡＬＲＥに提供し得る。他のサイクリン依存的キナーゼのサイクリン結合ドメイン（例えば、ＰＦＴＡＩＲＥ（配列番号１０）、ＰＩＳＳＬＲＥ（配列番号１１）、ＰＩＴＡＬＲＥ（配列番号１２）、ＰＬＳＴＩＲＥ（配列番号１３）、ＰＩＳＴＶＲＥ（配列番号１４）、ＰＳＴＡＩＲＥ（配列番号１５）およびＮＲＴＡＬＲＥ（配列番号１６））は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合特異性を変化させるために、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合ドメインであるＰＮＱＡＬＲＥ（配列番号９；配列番号２または４のアミノ酸４４〜５１：配列番号６または８のアミノ酸５８〜６４）と置換され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン依存的キナーゼ活性は、例えば、１４５位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換すること（この置換は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの「キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）」形態を生じる）によって改変され得る。
【００１６】
種々の置換はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥをリン酸化され得るように作製され得る。例えば、１５位のヒスチジンのフェニルアラニンまたはチロシンへの置換、または１４位のアラニンのスレオニンへの置換は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのリン酸化を可能にする。ｈＰＮＱＡＬＲＥの特性に影響する他の置換は、当業者が考えつき、そして標準組換えＤＮＡ技術を用いてｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質になされ得る。
【００１７】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのキナーゼ活性またはサイクリン結合活性に影響しない他のアミノ酸置換は、天然に存在し得るか、または研究室において作製し、生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体を形成し得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥの生物学的に活性な改変体は、細胞周期調節に含まれ、サイクリン依存的キナーゼ活性を示し、そして、腫瘍において過剰発現される。生物学的活性または免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基が置換されるか、挿入されるか、または欠失されるかの決定におけるガイダンスは、当該分野において周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を用いて見出し得る。
【００１８】
好ましくは、生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体におけるアミノ酸置換は、保存的なアミノ酸変化（すなわち、類似の電荷のアミノ酸または非電荷アミノ酸の置換）である。保存的アミノ酸変化は、アミノ酸の側鎖に関するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非電化極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として両方に分類される。ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの孤立した置換を除いて、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリン、または構造的に関連するアミノ酸とのアミノ酸の類似の置換が（特に、置換がｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合部位またはそのキナーゼドメインのアミノ酸を含まない場合）、生じる分子の結合特性に主要な影響を及ぼさないことを予期することは妥当である。
【００１９】
生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体は、グリコシル化形態、他の分子と凝集結合体、および非関連化学部分を有する共有結合体を含む。共有結合性改変体は、当該分野において公知のアミノ酸鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見出される基に対する連結官能基によって調製され得る。生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体はまた、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインを含む。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン依存的キナーゼ活性に影響しない領域の短縮化または欠失もまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体である。
【００２０】
アミノ酸置換が、機能的ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはポリペプチドを生じるかどうかは、例えば、そのサイクリン依存的キナーゼ活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。サイクリン依存的キナーゼ活性のためのアッセイが、例えば、Ｌｏｃｋら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：３９９−４０９に教示される。好ましい天然または非天然に存在する生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、これらの分子は、少なくとも９８％または９９％同一である。同一性パーセントは、当該分野において公知の任意の方法またはアルゴリズムを用いて計算され得る。制限されない例示は、以下のパラメータを有するアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ）検索を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムである：１２のギャップ開放（ｏｐｅｎ）ペナルティおよび１のギャップ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティ。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示される。
【００２１】
ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、全長より短いｈＰＮＱＡＬＲＥを含み、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の少なくとも２２３、２２５、２５０、２７５、３００または３２５以上の連続するアミノ酸を含む。ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合ドメインであるＰＮＱＡＬＲＥ（配列番号９；配列番号２または４のアミノ酸４４〜５１または配列番号６または８のアミノ酸５８〜６４）を含み得るか、またはｈＰＮＱＡＬＲＥアミノ酸配列を、上記のような他のサイクリン依存的キナーゼサイクリン結合ドメインとともに含むキメラポリペプチドを含み得る。種々のアミノ酸置換がｈＰＮＱＡＬＲＥをリン酸化させるか、またはｈＰＮＱＡＬＲＥのキナーゼ活性を減少するように作製されたポリペプチドはまた、構築され得る。
【００２２】
本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含み得る。さらに、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、配列番号６または８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含み得る。
【００２３】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８のポリペプチドに、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの改変体を意図する。例えば、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるか、または配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドを提供する。
【００２４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥは、標準的ナ生化学的方法を用いて、ｈＰＮＱＡＬＲＥ産生ヒト細胞（例えば、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、または膵臓から単離され得る。単離および精製されたｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、通常細胞内でｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドに結合する他の化合物（例えば、サイクリンまたは他のタンパク質、糖質、脂質、あるいは細胞内器官）から分離される。単離および精製されたｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの調製物は、少なくとも純度８０％であり；好ましくは、この調製物は、純度９０％、９５％、または９９％である。
【００２５】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質およびｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ法または合成化学法によって産生され得る。組換えｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの産生のために、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質または生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体もしくは変化したｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体をコードする配列番号１、３、５、および７に示されるｈＰＮＱＡＬＲＥのヌクレオチド配列、あるいはこれらの配列の改変体から選択されるコード配列は、原核生物発現系または真核生物発現系において発現され得る。細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の発現系が、当該分野において公知であるように使用され得る。酵素を用いて、全長ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の酵素的タンパク質分解によって、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドを作製し得る。
【００２６】
あるいは、合成化学法（例えば、固相ペプチド合成）は、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドを合成するために使用され得る。ペプチド、アナログまたは誘導体の産生のための一般的手段は、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ，ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−Ａ ＳＵＲＶＥＹ ＯＦ ＲＥＣＥＮＴ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編（１９８３）に要約される。さらに、正常なＬ−立体異性体に対するＤ−アミノ酸の置換は、分子の半減期を増加するために実施され得る。生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥまたは変化した改変体は、同様に産生され得る。
【００２７】
少なくとも２２３、２２５、２５０、２７５、３００または３１５以上の連続するｈＰＮＱＡＬＲＥアミノ酸を含む融合タンパク質もまた、構築され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ誘導タンパク質は、ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープに特異的に結合し、種々のアッセイ系における使用のための抗体の作製のために有用である。例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質を使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質と相互作用（例えば、異なるサイクリン、およびその官能基の影響）するタンパク質を同定し得る。物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティクロマトグラフィー）またはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーベースアッセイ（例えば、酵母２ハイブリッド系またはファージディスプレイ系）はまた、この目的のために使用され得る。このような方法は、当該分野において公知であり、そして薬剤スクリーニングとしても使用され得る。
【００２８】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質は、ペプチド結合によってともに融合された２つのタンパク質セグメントを有する。第一のタンパク質セグメントは、都合のよいように、Ｎ末端またはＣ末端であり得る。第一のタンパク質セグメントは、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の少なくとも２２３、２２５、２５０、２７５、３００または３１５以上の連続するアミノ酸を含む。アミノ酸は、配列番号２、４、６、および８に示されるアミノ酸配列、またはこれらの配列の生物学的に活性な改変体もしくは変化した改変体より選択され得る。本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含み得る。配列番号６または配列番号８の１８１〜２０１、もしくは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含む融合タンパク質もまた、好ましい。第一のタンパク質セグメントもまた、全長ｈＰＮＱＡＬＲＥまたは改変体を含み得る。第一のセグメントは、都合のよいように、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置され得る。
【００２９】
この第２のタンパク質セグメントは、完全長タンパク質またはタンパク質フラグメントもしくはポリペプチドであり得る。融合タンパク質構築物において通常用いられるタンパク質としては、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光性タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む）が挙げられる。エピトープタグは、融合タンパク質構築物において用いられ得、これにはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含む。他の融合構築物としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）のＢＰ１６タンパク質融合物が挙げられ得る。
【００３０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質は、第１および第２のタンパク質セグメントの共有結合により、または分子生物学の分野の標準的手順により作製され得る。組換えＤＮＡ方法は、当該分野で公知のように、例えば、第２のタンパク質セグメントをコードし、そして宿主細胞においてＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドを用いて、適切なリーディングフレームにおける配列番号１、３、５、または７から選択されるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製することによって、ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質を調製するために用いられ得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットは、実験のためのツールを研究室に供給する会社から入手可能である。これには、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）、および Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）が挙げられる。
【００３１】
単離かつ精製されたｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な改変体もしくは変化した改変体または融合タンパク質は、配列番号２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列を有するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、あるいは生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体または変化したｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体のエピトープに特異的に結合する抗体の調製物を得るために、免疫原として用いられ得る。好ましくは、抗体は、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合部位に結合することによって、ｈＰＮＱＡＬＲＥと他のサイクリン依存的キナーゼとの間で区別し得る。より好ましくは、本発明の抗体は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８の全体または一部によって規定されるエピトープに結合する。配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８の全体または一部によって規定されるエピトープに結合する抗体もまた、好ましい。代表的には、少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸は、ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープを形成するために要求される。しかし、非連続的アミノ酸を含むエピトープは、より多く（例えば、少なくとも１５、２５、または５０アミノ酸）要求され得る。
【００３２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または生物学的に活性な改変体のエピトープに特異的に結合する抗体は、以下を含むがそれらに限定されない免疫化学的アッセイにおいて用いられ得る：ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当該分野で公知の他の免疫化学的アッセイ。代表的には、本発明の抗体は、このような免疫化学アッセイで用いられた場合、他のタンパク質で提供される検出シグナルより少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープに特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして溶液からｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥのポリペプチドフラグメントを免疫沈降し得る。
【００３３】
特に抗原性であるｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープは、例えば、抗原性についてのｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの慣用的なスクリーニングにより、または配列番号２、４、６、または８に示されたアミノ酸配列に対するタンパク質の抗原性領域を選択するための理論的な方法を適用することにより選択され得る。このような方法は、例えば、以下において教示される：ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８、３８２４〜２８（１９８１）、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、４８３〜４８９（１９８３）、ならびにＳｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９、６６０〜６６６（１９８３）。
【００３４】
当該分野で公知の任意の型の抗体は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープに特異的に結合するように産生され得る。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製物は、当該分野で周知の標準的方法を用いて作製され得る。同様に、単鎖抗体もまた調製され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープに特異的に結合する単鎖抗体は、例えば、当該分野で公知であるような単鎖免疫グロブリンディスプレーライブラリーから、単離され得る。このライブラリーは、ｈＰＮＱＡＬＲＥのアミノ酸配列に対して「パン」され（ｐａｎｎｅｄ）、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥのタンパク質の異なるエピトープに対して高親和性で結合する多数の単一の鎖の抗体が単離され得る。Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ｇｅｎｅ １６０：１２９〜１３０。単鎖抗体はまた、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅法を用いて構築され得る。Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５：５０７〜１１。
【００３５】
単鎖抗体は、単一抗原特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二抗原特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり得、そして２価または４価であり得る。４価の二抗原特異的な単鎖抗体の構築は、例えば、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９〜１６３に教示される。２価の二抗原特異的な単鎖抗体の構築は、とりわけ、ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９〜２０６に教示される。
【００３６】
単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、以下に記載のように、手動または自動のヌクレオチド合成を用いて構築され得、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて発現構築物にクローンされ得、そして細胞に導入されてコード配列を発現し得る。あるいは、単鎖抗体は、例えば、線状ファージ技術を用いて直接産生され得る。Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１：４９７〜５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５：８１〜９１。
【００３７】
モノクローナル抗体および他の抗体はまた、それが治療的に用いられる場合、その抗体に対する免疫応答の上昇から患者を保護するため「ヒト化」され得る。このような抗体は、治療に直接用いられるヒト抗体に対して十分に類似の配列であり得、または２〜３の主要な残基の変化を必要とし得る。例えば、げっ歯類の抗体とヒト配列との間の配列の差異は、ヒト配列における残基と異なる残基で置換することにより（例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発により、または全相補性決定領域の移植により）最小にされ得る。あるいは、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように、組換え方法を用いてヒト化抗体を産生し得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープに特異的に結合する抗体は、米国特許第５、５６５、３３２号に開示されるように、部分的にかまたは完全にのいずれかでヒト化される抗原結合部位を含み得る。
【００３８】
抗体の他の型は、本発明の方法において構築され得、そして用いられ得る。例えば、キメラ抗体は、例えばＷＯ９３／０３１５１に開示されるように構築され得る。免疫グロブリンに由来する結合タンパク質、ならびにＷＯ９４／１３８０４に開示された「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」のような多価および複数抗原特異的な（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合タンパク質はまた、調製され得る。
【００３９】
本発明の抗体は、当該分野において周知の方法により精製され得る。例えば、抗体は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのタンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な改変体または融合タンパク質が結合するカラムにわたって抗体を通過させることによりアフィニティー精製され得る。次いで、この結合抗体は、高塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出され得る。
【００４０】
抗体以外のｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的結合ポリペプチドはまた、産生され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的結合ポリペプチドは、ｈＰＮＱＡＬＲＥまたはその改変体と結合するポリペプチドであり、そして、ｈＰＮＱＡＬＲＥおよびｈＰＮＱＡＬＲＥのポリペプチド誘導体に対して、結合を試験された他のポリペプチドよりも、はっきりとより高い結合親和性を有するポリペプチドである。１０倍（ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ １０）まで高い親和性が好ましく、１００倍高い親和性がより好ましい。このようなポリペプチドは、例えば酵母ツーハイブリッド系を用いて見出され得る。
【００４１】
抗体を用いて、とりわけ、ヒト組織中の野生型ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質およびその機能を検出し得る。抗体をまた用いて、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子における変異の存在を検出し得る。この変異は、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の過小発現または過剰発現を生じるか、または変化した大きさまたは電気泳動上の移動度を有するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質発現を生じる。必要に応じて、本発明の抗体を用いて、ｈＰＮＱＡＬＲＥサイクリン結合部位をブロックし得るか、または機能的ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の有効レベルを変化し得る。あるいは、抗体を用いて、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含むポリペプチドを検出し得る。好ましい抗体は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含むＴループ領域によって規定される生物学的活性に結合し、そしてブロックする。
【００４２】
本発明はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な改変体もしくは変化した改変体、融合タンパク質などをコードするサブゲノムポリヌクレオチドを提供する。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドは、全体より少ない染色体を含み、そして二本鎖または一本鎖であり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、イントロンを含まない。
【００４３】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、または７に示されるヌクレオチド配列またはこれらの相補体から選択される、少なくとも１５６２、１５６３、１６７０、１５７５、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０または２１００以上の連続するヌクレオチドを含み得る。相補的ヌクレオチド配列を使用して、、ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供され得る。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４によって含まれるオリゴヌクレオチドである。配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３によって含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた好ましい。ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドはまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的単鎖抗体、リボザイム、および生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体もしくは変化したｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００４４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質または生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体のアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに配列番号１、３、５、または７に示されるヌクレオチド配列に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である相同なヌクレオチド配列もまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドである。好ましいサブゲノムポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４および配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチドを含む。配列同一性パーセントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、以下のパラメーター（１２のギャップ開放ペナルティーおよび１のギャップ伸長ペナルティー）を用いるアフィンギャップ検索を使用する、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるような）を用いるコンピュータープログラムを使用して決定され得る。
【００４５】
配列番号１、３、５、および７に示されるコード配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列または多くとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５％の塩基対ミスマッチを有するその相補体はまた、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドである。好ましいヌクレオチド配列は、多くとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５％の塩基対ミスマッチを有して、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４および配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３にハイブリダイズする。例えば、以下の洗浄条件（２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、各３０分；次いで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分；次いで、２×ＳＳＣ、室温で２回、各１０分）を使用して、相同的なｈＰＮＱＡＬＲＥ配列が同定され得、この相同的な配列は、配列番号１、３、５、または７あるいはその相補体に多くて約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む。より好ましくは、相同的な核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチを含み、さらにより好ましくは、５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００４６】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドの種ホモログはまた、適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして他の種（例えば、マウス、サル、酵母、または細菌）由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。二本鎖ＤＮＡのＴmは、相同性における１％減少毎に、１〜１．５℃減少することが周知である（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１、１２３（１９７３））。従って、相同的なｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドは、例えば、推定相同的ｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドを、配列番号１、３、５、または７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズして、その試験ハイブリッドの融解温度を、配列番号１、３、５、または７を有するポリヌクレオチドおよびその配列に完全に相補的であるポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較して、そして試験ハイブリッド内の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを計算することによって、同定され得る。
【００４７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に続いて、配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらの相補体に示されるコード配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は、当該分野で周知であり、そして理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ 第２版、１９８９、９．５０−９．５１頁に開示される。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドの好ましい種ホモログは、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４および配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００４８】
代表的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件について、温度および塩濃度の組合せは、研究中のハイブリッドの計算されたＴmより約１２〜２０℃低く、選択されるべきである。配列番号１、３、５、または７に示されるｈＰＮＱＡＬＲＥ配列と、その配列に６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴmは、例えば、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の式を使用して計算され得る。
【００４９】
【数１】
ストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、４×ＳＳＣ、６５℃、または５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃、または０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃が挙げられる。高度にストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、０．２×ＳＳＣ、６５℃が挙げられる。
【００５０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドは、標準の核酸精製技術を使用して、他のヌクレオチド配列を含まずに、単離および精製され得る。例えば、制限酵素およびプローブを使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質または改変体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドフラグメントを単離し得る。単離および精製されたサブゲノムポリヌクレオチドは、他の分子を含まないか、少なくとも９０％含まない調製物中に存在する。
【００５１】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質をコードする相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子もまた、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドである。ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｃＤＮＡ分子は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡを鋳型として使用する、標準の分子生物学技術を用いて作製され得る。その後、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｃＤＮＡ分子は複製され得る。増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドのさらなるコピーを、ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として用いることにより、取得し得る。
【００５２】
あるいは、合成化学技術を使用して、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチド分子を合成し得る。遺伝コードの縮重は、別のヌクレオチド配列が、配列番号２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列を有するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、あるいはそれらの配列の１つの生物学的に活性な改変体をコードするように合成されることを可能にする。そのような全てのヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【００５３】
本発明はまた、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングまたはインサイチュハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーションプロトコールにおいて、ｈＰＮＱＡＬＲＥ配列を検出するために使用され得る、ポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１、３、５、または７から選択される少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましいプローブは、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４、あるいは配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、および配列番号５または配列番号７の５４２〜６０３より選択される少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続するヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドプローブは、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素的標識、または化学発光標識のような検出可能な標識を含み得る。
【００５４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む発現構築物であり得る。当業者は、当該分野で公知で、そして使用される多くの細胞型特異的プロモーターから、適切なプロモーターを容易に選択し得る。発現構築物はまた、宿主細胞内で機能的な転写ターミネーターを含み得る。発現構築物は、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのタンパク質、改変体、融合タンパク質、抗体またはリボザイムの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、このプロモーターの下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターで始まる。
【００５５】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ構築物を含む組換え宿主細胞が構築されて、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の全てまたは一部を発現し得る。好ましい宿主細胞は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含む、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の一部を発現する。また好ましいのは、配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、ならびに配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含む、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の一部を発現する宿主細胞である。ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物を含む組換え宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。種々の宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、およびヒトの発現系での使用に利用可能であり、そしてそれら宿主細胞を使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物を増殖させ得るか、または発現させ得る。
【００５６】
構築物を、当該分野で公知の任意の技術を使用して、宿主細胞内に導入し得る。これらの技術として、トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸のまたはカプセル化した核酸によるトランスフェクション、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡを被覆したラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム媒介トランスフェクションが挙げられる。
【００５７】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物を発現するための細菌系としては、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７、ＥＰ３６，７７６、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１−２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９において記載される細菌系が挙げられる。
【００５８】
酵母における発現系としては、以下に示すものに記載される発現系が挙げられる：Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２）Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６、米国特許第４，８３７，１４８号、米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：４９、Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１、Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−１４７４、ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９；ＥＰ２４４，２３４、およびＷＯ９１／００３５７。
【００５９】
昆虫におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物の発現を、以下に示すものに記載されるように実行し得る；米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５５，４７６、およびＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：７６５−７７６、Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；およびＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびに対応する許容的な、宿主由来の昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編）、第８巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）２７７〜２７９頁、およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８５）３１５：５９２−５９４に記載される。
【００６０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物の哺乳動物での発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されるように達成され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物の哺乳動物での発現の他の特徴は、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、および米国再発行特許第３０，９８５号に記載されるように促進され得る。
【００６１】
本発明のサブゲノムポリヌクレオチドはまた、遺伝子送達ビヒクルにおいて、ｈＰＮＱＡＬＲＥのｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ネイティブなｈＰＮＱＡＬＲＥのｍＲＮＡまたはその相補体の配列のいずれかとともに）、全長ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチド、生物学的に活性な改変体もしくは改変された改変体、またはｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的リボザイムもしくは単鎖抗体を細胞に、好ましくは真核生物細胞に送達する目的のために用いられ得る。本発明によれば、遺伝子送達ビヒクルは、例えば、裸のプラスミドＤＮＡ、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含むウイルス発現ベクターまたはリポソームもしくは縮合剤と結合したｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドであり得る。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターおよび細胞増殖により活性化されるプロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーターおよびチミジル酸シンターゼプロモーター）である。他の好ましいプロモーターとしては、ウイルス感染により活性化され得るプロモーター（例えば、およびインターフェロンプロモーター）、およびホルモン（例えば、エストロゲン）により活性化され得るプロモーターが挙げられる。使用可能な他のプロモーターとしては、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。
【００６３】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスの複製起点またはパッケージングシグナルのような、ウイルス配列を含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択され得る。好ましい実施形態において、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、例えば、以下を含む多くの参考文献に記載されている；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９８３、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９、１９８４、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４、１９９０、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号および同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２，４６８号、ＷＯ８９／０５，３４９、およびＷＯ９０／０２，８０６。
【００６４】
多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、本発明で利用され得、例えば、以下に示されるものに記載されるものが挙げられる；ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４，１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７，１９９３；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８，１９９３；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３，１９９２；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５，１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１／０２８０５）。
【００６５】
特に好ましいレトロウイルスは、ニワトリ白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３５およびＶＲ−２４７）、ウシ白血病ウイルス（ＶＲ−１３１５）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス（Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒ．４９：８２８、１９８４；およびＯｌｉｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒ．４８：５４２、１９８３）、マウス肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−８４４、４５０１０および４５０１６）、細網内皮症ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９４、ＶＲ−７７０および４５０１１）、ラウス肉腫ウイルス、メイソン−パイツァーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、内因性ネコレトロウイルス（例えば、ＲＤ１１４）、およびレトロウイルスベクターとして使用されるマウスまたはラットのｇＬ３０配列を含む、レトロウイルスに由来する。
【００６６】
組換えレトロウイルスが生成され得る、特に好ましいＭＬＶの株としては、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ、Ｊ．Ｖｉｒ．１９：１９，１９７６）、アーベルソン（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラフィ（Ｒｕら、Ｊ．Ｖｉｒ．６７：４７２２，１９９３；およびＹａｎｔｃｈｅｖ Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ２６：３９７，１９７９）、グロス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）（Ａｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ハーベイ肉腫ウイルス（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０、１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）およびラウシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、ならびにモロニーＭＬＶ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。
【００６７】
特に好ましい非マウスレトロウイルスは、ラウス肉腫ウイルスである。好ましいラウス肉種ウイルスとしては、ブラチスラバウイルス（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０、１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ブライアン高力価ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９、およびＶＲ−７２８）、ブライアン標準ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４０）、カール−ジルバー（Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ）ウイルス（Ａｄｇｉｇｈｉｔｏｖら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ２７：１５９、１９８０）、エンゲルブレス−ホルム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ）ウイルス（Ｌａｕｒｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９０８：２４１、１９８７）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ウイルス、プラハ（Ｐｒａｇｕｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７７２および４５０３３）、およびシュミット−ルピン（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７２４、ＶＲ−７２５、ＶＲ−３５４）が挙げられる。
【００６８】
任意の上記のレトロウイルスは、本明細書中に提供される開示および当該分野で公知の標準的な組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＫｕｎｋｌｅ、ＰＮＡＳ ８２：４８８、１９８５）を考慮して、レトロウイルスｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルをアセンブルまたは構築するために容易に利用され得る。レトロウイルスｈＰＮＱＡＬＲＥ発現ベクターの一部は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロベクターＬＴＲはマウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第２鎖合成の起点はニワトリ白血病ウイルスに由来し得る。
【００６９】
組換えレトロウイルスベクターを用い、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって、形質導入能力のあるレトロウイルスベクター粒子を作製し得る（１９９１年１１月２９日出願の出願第０７／８００，９２１号を参照のこと）。組換えレトロウイルスゲノムの、宿主細胞ＤＮＡの特異的領域内への部位特異的組込みを指向する組換えレトロウイルスが、生成され得る。部位特異的組込みは、レトロウイルス粒子内に取り込まれるキメラインテグラーゼにより媒介され得る（１９９５年５月２２日出願の出願第０８／４４５，４６６号を参照のこと）。組換えウイルス遺伝子送達ビヒクルが、複製欠損の組換えウイルスであることが好ましい。
【００７０】
上記レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルとの使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（１９９４年５月９日出願の出願第０８／２４０，０３０号を参照のこと；ＷＯ ９２／０５２６６もまた参照のこと）、そして組換えウイルス粒子の産生のためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株、すなわち「ＶＣＬ」とも称される）を作製するために使用され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、ヒト親細胞株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、それにより、ヒト血清における不活化を生き延び得る組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの産生を可能にする。組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築は、ＷＯ９１／０２８０５に詳細に記載される。
【００７１】
組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって、形質導入能力のあるレトロウイルス粒子を作製するために使用され得る（出願第０７／８００，９２１号を参照のこと）。同様に、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルもまた、容易に調節され得、そして本明細書に提供される開示を参照して利用され得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、１９９１、ＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３およびＷＯ９３／０７２８２もまた参照のこと）。
【００７２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルはまた、組換えアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであり得る。このようなビヒクルは、本明細書中に提供される開示（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６，１９８８，およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１，１９９１，ＷＯ ９３／０７２８３，ＷＯ ９３／０６２２３，およびＷＯ ９３／０７２８２を参照のこと）を参照すれば、容易に調製および利用され得る。アデノ随伴ウイルスｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルはまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥのアミノ酸またはヌクレオチドを送達するために構築および使用され得る。
【００７３】
アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルのインビトロでの使用は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１４８５−１４８８（１９９２），Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：７２５７−７２６１（１９９２），Ｗａｌｓｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１４４０−１４４８（１９９４），Ｆｌｏｔｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０（１９９３），Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：７３３−７３８（１９９４），Ｍｉｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０１８３−１０１８７（１９９４），Ｅｉｎｅｒｈａｎｄら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：３３６−３４３（１９９５），Ｌｕｏら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：１２６１−１２６７（１９９５），およびＺｈｏｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２２３−２２９（１９９６）に記載される。これらのビヒクルのインビボでの使用は、Ｆｌｏｔｔｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０６１３−１０６１７（１９９３）、およびＫａｐｌｉｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５３（１９９４）に記載される。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルは、トガウイルスに由来する。好ましいトガウイルスとしては、アルファウイルス、特に、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ ９５／０７９９４に記載されるアルファウイルスが挙げられる。シンドビスウイルスおよびＥＬＶＳウイルスを含むアルファウイルスは、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドについての遺伝子送達ビヒクルであり得る。アルファウイルスは、ＷＯ ９４／２１７９２、ＷＯ ９２／１０５７８およびＷＯ ９５／０７９９４に記載される。いくつかの異なるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクル系は、本発明に従ってｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを細胞に送達するために構築および使用され得る。このような系の代表例としては、米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号に記載される系が挙げられる。本発明に使用するために特に好ましいアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルとしては、ＷＯ ９５／０７９９４、および米国特許出願第０８／４０５，６２７号に記載されるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【００７５】
好ましくは、組換えウイルスビヒクルは、シンドビスウイルスに基づく組換えアルファウイルスウイルスビヒクルである。シンドビス構築物、ならびに多数の同様の構築物は、米国特許第出願第０８／１９８，４５０号に本質的に記載される通りに容易に調製され得る。シンドビスウイルス遺伝子送達ビヒクルは、代表的に、シンドビスウイルス転写を開始し得る５’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノムフラグメント転写を防止するように不活化されたウイルス連結領域、およびシンドビスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。必要に応じて、このウイルス連結領域は、サブゲノムポリヌクレオチド転写が減少、増加、または保持されるように改変され得る。当業者によって理解されるように、他のアルファウイルス由来の対応する領域は、上記に記載される領域の代わりに用いられ得る。
【００７６】
アルファウイルス由来遺伝子送達ビヒクルのウイルス連結領域は、サブゲノムポリヌクレオチドの転写を妨害するために不活化された第１のウイルス連結領域、およびサブゲノムポリヌクレオチド転写が減少するように改変された第２のウイルス連結領域を含み得る。アルファウイルス由来ビヒクルはまた、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および転写終結を制御する３’配列を含み得る。
【００７７】
本発明において利用され得る他の組換えトガウイルス遺伝子送達ビヒクルとしては、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ミッデルブルグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ロス川（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ヴェネズエラウマ脳炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）に由来するもの、および米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号、ならびにＷＯ ９２／１０５７８に記載されるものが挙げられる。上記のシンドビスビヒクル、ならびに多数の同様の構築物は、米国特許出願第０８／１９８，４５０号に本質的に記載される通りに容易に調製され得る。
【００７８】
本発明における使用のために適切な他のウイルス遺伝子送達ビヒクルとしては、例えば、ポリオウイルス（Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５，１９８９およびＳａｂｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５，１９７３）（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８）；ライノウイルス（Ａｒｎｏｌｄら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１，１９９０）（ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１０）；ポックスウイルス（例えば、カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら，ＰＮＡＳ ８６：３１７，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７，１９９０；Ｕ．Ｓ．４，６０３，１１２およびＵ．Ｓ．４，７６９，３３０；ＷＯ ８９／０１９７３）（ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１；ＡＴＣＣ ＶＲ−２０１０）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８，１９７９）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５）、（Ｍａｄｚａｋら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７３：１５３３，１９９２）；およびインフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら，Ｃｅｌｌ ５９：１１０７，１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０９：１３，１９８３；およびＹａｐら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８，１９７８）（ＡＴＣＣ ＶＲ−７９７）由来のウイルス遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【００７９】
遺伝子送達ビヒクルを誘導するために用いられ得る他のウイルスとしては、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２，１９８９，およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６６：１５４，１９８８）（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４５）；単純ヘルペスウイルス（Ｋｉｔら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９，１９８９）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９７７；ＡＴＣＣ ＶＲ−２６０）；Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８，１９７９）；ヒト免疫不全ウイルス（ＥＰＯ ３８６，８８２，Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒ． ６６：２７３１，１９９２）；および麻疹ウイルス（ＥＰＯ ４４０，２１９）（ＡＴＣＣ ＶＲ−２４）；Ａ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）が挙げられる。
【００８０】
アウラ（Ａｕｒａ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６００；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）、キャバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）、チクングンヤウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）、キジルアガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）、ヌヅム（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）、ワタロア（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）、Ｙ−６２−３３（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）、オニオン（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ）ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６５；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１；ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）、およびコロナウイルス（Ｈａｍｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１２１：１９０，１９６６）（ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）もまた、遺伝子送達ビヒクルを提供するために用いられ得る。
【００８１】
本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを形成する縮合剤と組み合わされ得る。好ましい実施形態では、この縮合剤は、ポリカチオン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン）である。このような結合を作製するための多くの適切な方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許出願第０８／３６６，７８７号（１９９４年１２月３０日出願）を参照のこと）。
【００８２】
あるいは、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドは、リポソームと組み合わされて遺伝子送達ビヒクルを形成し得る。リポソームは、脂質二重層により取囲まれた水性区画から構成される、代表的には、球状またはわずかに伸長した構造の、直径数百オングストロームの小さな脂質小胞である。適切な条件下で、リポソームは、細胞の原形質膜と、またはリポソームをインターナリゼーションした細胞内のエンドサイトーシス性小胞の膜と融合し得、その結果、その内容物を細胞質に放出する。しかし、細胞の表面との相互作用の前に、リポソーム膜は、その内容物を、例えば、分解酵素から隔離および防御する比較的不透過性の障壁として作用する。
【００８３】
さらに、リポソームは合成構造物であるので、所望の特徴を取り込んだ、特別に設計したリポソームが生成され得る。Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３６−２４０頁，１９７５（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；Ｓｚｏｋａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６００：１，１９８０；Ｂａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４，１９７９；Ｒｉｖｎａｙら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９，１９８７；Ｗａｎｇら．，ＰＮＡＳ ８４：７８５１，１９８７，Ｐｌａｎｔら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０，１９８９および米国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと。リポソームは、本発明に開示されるポリヌクレオチドのようなｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含む、種々の核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、および発現構築物を含む）をカプセル化し得る。
【００８４】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６，１９８７）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１，１９８９）、および精製転写因子（Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２，１９９０）の機能的形態での細胞内送達を媒介することが示された。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５１４８−５１５２．８７，１９９４もまた参照のこと。
【００８５】
他の市販のリポソームとしては、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を用いて、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明に関して、Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８，１９７８；およびＷＯ ９０／１１０９２を参照のこと。
【００８６】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、容易に入手可能であるか（例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から）、または容易に入手可能な材料を用いて容易に調製され得る。このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な比で混合され得る。これらの材料を用いてリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。
【００８７】
リポソームは、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、または大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），第１０１巻，５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３，１９７５；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ １７：７７，１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９，１９７６；Ｏｓｔｒｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６，１９７７；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８，１９７９；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５，１９７９；Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１，１９８０；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５，１９７９；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６，１９８２を参照のこと。
【００８８】
さらに、リポタンパク質は、細胞への送達のためにｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドに含まれ得る。このようなリポタンパク質の例としては、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた使用され得る。天然に存在するリポタンパク質の改変物（例えば、アセチル化ＬＤＬ）もまた、使用され得る。これらのリポタンパク質は、ポリヌクレオチドの送達を、リポタンパク質レセプターを発現する細胞に標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質がポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化するリガンドは組成物中に含まれない。
【００８９】
「裸の」ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチド分子はまた、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように、遺伝子送達ビヒクルとして使用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＤＮＡまたはｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡのいずれかであり得、そして特定の実施形態では、死滅したアデノウイルスに連結される（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２）。他の適切なビヒクルとしては、ＤＮＡ−リガンド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、脂質−ＤＮＡの組合せ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５，１９８７）および微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０，１９９１）が挙げられる。
【００９０】
裸のｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの細胞への摂り込みの効率は、生分解性ラテックスビーズ上にポリヌクレオチドをコーティングすることにより上昇され得、これらのビーズは、効率良く輸送され、そして細胞の核周囲領域に濃縮される。ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドでコーティングしたラテックスビーズは、細胞内に注入され得、そしてビーズがエンドサイトーシスを開始した後、効率良く細胞内に輸送され、従って遺伝子移入および発現効率を上昇させる。この方法は、ビーズの疎水性を増加させるためにビーズを処理することによりさらに改良され得、これにより、エンドソームの破壊および細胞質へのｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの放出を容易にする。
【００９１】
ｈＰＮＱＡＬＲＥは、種々のサイクリンと相互作用して、細胞内で種々の効果を達成し得る。例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥに結合するサイクリンは、転写を調節するために機能し得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥに結合するサイクリンは、酵母ツーハイブリッドアッセイのようなスクリーニングを使用して同定され得る。このアッセイは、とりわけＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−４６，１９８９に記載される。
【００９２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡは、正常組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡ発現レベルと比較すると、腫瘍において過剰発現される。本発明に従って、腫瘍は、（例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのレベルを減少させるか、またはその機能をブロックもしくは減少させることによって）腫瘍における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させ得る組成物と、腫瘍を接触させることにより処置され得る。処置され得る新形成としては、結腸直腸癌、黒色腫、扁平上皮癌、腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、肉腫、筋肉腫、非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中枢神経系腫瘍（例えば、グリオーム、星状細胞腫、乏突起膠腫、および神経芽腫）、乳癌、混合した起源の腫瘍（例えば、ウィルムス腫瘍および奇形癌）ならびに転移性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。増殖性障害（例えば、無汗性（ａｎｈｙｄｒｉｃ）遺伝性外胚葉性形成異常、先天性肺胞性形成異常、頸部の上皮形成異常、線維性骨形成異常、および乳房形成異常もまた、本発明に従って処置され得る。過形成（例えば、子宮内膜過形成、副腎過形成、乳房過形成、前立腺過形成、もしくは甲状腺過形成）または皮膚の偽上皮腫性増殖もまた、本発明に従って処置され得る。
【００９３】
組成物は、腫瘍細胞のような細胞における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させるように、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現産物に特異的に結合する試薬を含む。本発明の１つの実施形態では、試薬はリボザイム、触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１５３２−１５３９；１９８７；Ｃｅｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８；１９９０、Ｃｅｃｈ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６０５−６０９；１９９２、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５；１９９６を参照のこと。当該分野で公知であるように（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号）、リボザイムは、ＲＮＡ配列を切断することにより、遺伝子機能を阻害するために使用され得る。
【００９４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子のコード配列は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子から転写されるｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを生成するために使用され得る。高度に配列特異的な様式で、トランスで他のＲＮＡ分子を切断し得るリボザイムを、設計し、構築する方法が、当該分野で開発されそして記載されてきた（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１、１９８８を参照のこと）。例えば、リボザイムの切断活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域をリボザイム内に操作することにより、特異的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡに対して標的化され得る。ハイブリダイゼーション領域は、標的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡに相補的な配列を含み、従ってこの標的に特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、ＥＰ ３２１，２０１を参照のこと）。配列番号１、３、５、および７に示されるヌクレオチド配列は、適切なハイブリダイゼーション領域の配列の供給源を提供する。好ましいリボザイム「ハイブリダイゼーション」領域は、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４を、全体にまたは部分的に含む。他の好ましいリボザイム「ハイブリダイゼーション」領域は、配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３を、全体にまたは部分的に含む。より長い相補的配列が、ハイブリダイゼーション配列の標的への親和性を増加させるために使用され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥリボザイムのハイブリダイズ領域および切断領域は、全体的に関連し得；従って相補的領域を通して標的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡにハイブリダイズする際に、リボザイムの触媒領域は、標的を切断し得る。
【００９５】
当該分野で公知であり、そして上記のように、ｈＰＮＱＡＬＲＥリボザイムは、構築物の一部として細胞内に導入され得る。機械的方法（例えば、微量注入、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿）は、上記のように、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現を減少させることが所望される細胞内に、リボザイム含有構築物を導入するために使用され得る。あるいは、当該分野で公知のように、細胞が構築物を安定に保持することが望ましい場合、その構築物は、プラスミドに供給され、そして別のエレメントとして維持され得るか、または細胞のゲノムへ統合され得る。この構築物は、転写調節エレメント（例えば、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナル）を、細胞内におけるｈＰＮＱＡＬＲＥリボザイムの転写を制御するために、含み得る。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を使用することにより減少される。アンチセンス配列は、配列番号１、３、５、および７に示されるヌクレオチド配列から選択される、ｈＰＮＱＡＬＲＥをコードする配列の少なくとも１部分に相補的である。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のヌクレオチド長であり得る。より好ましくは、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列が、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４に相補的であり、あるいは配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３に相補的である。より長い配列もまた使用され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、構築物中に提供され得、そして本明細書中に開示されるように細胞内に導入されて、細胞における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させ得る。
【００９７】
ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方の組合せであり得る。非ホスホジエステルヌクレオチド間連結（例えば、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステル）で、一方のヌクレオチドの５’末端を、他方のヌクレオチドの３’末端と共有結合で連結することにより、オリゴヌクレオチドは、手動で、または自動合成器で合成され得る。Ｂｒｏｗｎ、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１−８，１９９４；Ｓｏｎｖｅａｕｘ、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１−７２，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８３，１９９０を参照のこと。
【００９８】
正確な相補性は、アンチセンス分子とｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の相補性コード配列との間の首尾良い２重鎖形成のために必要とされない。連続的なヌクレオチド部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）（隣接するｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列に相補的でない）によって各々が隔てられる、例えば２、３、４、または５以上の連続的なヌクレオチド部分（ｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列に正確に相補的である）を含むアンチセンス分子は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡに標的化特異性を提供し得る。好ましくは、連続したヌクレオチドの各部分は、少なくとも４、５、６、７、または８以上のヌクレオチド長である。非相補性介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列との間で耐えられるミスマッチの程度を決定するために、当業者はアンチセンス−センス対の算出された融点を容易に使用し得る。
【００９９】
ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらのｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列にハイブリダイズする能力に影響することなく、改変され得る。これらの改変は、アンチセンス分子の内部または一方の末端もしくは両末端であり得る。例えば、ヌクレオシド間ホスフェート連結は、種々の炭素数の残基を有するコレステリル部分またはジアミン部分を、アミノ基と末端リボースとの間に加えることにより改変され得る。改変された塩基および／もしくは糖（例えば、リボースの代りのアラビノース）または３’，５’−置換オリゴヌクレオチド（３’ヒドロキシル基または５’ホスフェート基が置換されている）はまた、改変アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。これらの改変オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法により調製され得る。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８，１９９２；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４，１９９０；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２１５：３５３９−３５４２，１９８７を参照のこと。
【０１００】
ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープに特異的に結合し、特にｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合ドメインに結合する本発明の抗体はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質に結合し、そして細胞内で機能し得るｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させることにより、機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを変更するために使用され得る。本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドは、上記のように細胞内に導入され得る。
【０１０１】
好ましくは、細胞における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥのレベルを減少させるために使用される機構は、機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％減少させる。最も好ましくは、機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルは、少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％減少される。機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させるために選ばれる機構の有効性は、当該分野で周知の方法（例えば、ヌクレオチドプローブのｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的抗体を使用するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の検出、またはサイクリン依存性キナーゼ活性の測定）を使用して評価され得る。サイクリン依存性キナーゼ活性についてのアッセイは、例えばＬｏｃｋら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：３９９−４０９に教示される。
【０１０２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ抗体、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。このようなキャリアとしては、大きくて、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子）が挙げられるが、これに限定されない。薬学的に受容可能な塩はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物において使用され得、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩のような鉱酸塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸塩が挙げられる。ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物はまた、液体（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール）ならびに湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソーム（例えば、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９１／１４４４５、またはＥＰ５２４，９６８Ｂ１に記載されるリポソーム）はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物のためのキャリアとして使用され得る。
【０１０３】
代表的に、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物は、注射可能物質として（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）調製される；しかし注射の前の液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適切な固体形態も調製され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物はまた、腸溶性錠剤またはゲルカプセル内に、当該分野で公知の方法（例えば、米国特許第４，８５３，２３０号、ＥＰ ２２５，１８９、ＡＵ ９，２２４，２９６、およびＡＵ ９，２３０，８０１に記載される方法）により、処方され得る。
【０１０４】
本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の投与は、局所投与または全身投与（注射、経口投与、パーティクルガン、またはカテーテル挿入投与を含む）ならびに表面（ｔｏｐｉｃａｌ）投与を含み得る。種々の方法が、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物を直接身体中の特定の部位に投与するために使用され得る。腫瘍におけるアポトーシスを誘導するために、例えば、適切なｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物が、腫瘍の本体内の数ヶ所の異なる場所に、数回注射される。あるいは、腫瘍に供給する動脈が同定され得、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物がこのような動脈内に、組成物を腫瘍へ送達するために、注入され得る。
【０１０５】
壊死中心を有する腫瘍は吸引され得、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物が、今や空になった腫瘍の中心に直接注入され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物はまた、腫瘍の表面に、例えばこの組成物の表面適用により直接投与され得る。Ｘ線画像化は、これらの送達方法の確実性を補助するために使用され得る。組合せた治療剤（ｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的な抗体、リボザイム、もしくはオリゴヌクレオチドまたはｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的な抗体、リボザイム、もしくはオリゴヌクレオチドをコードするサブゲノムｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドを含む）が、他の治療剤と同時に、または続けて投与され得る。
【０１０６】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物は、レセプター媒介標的化送達を使用して、特定の組織に送達され得る。レセプター媒介ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：２０２−０５，（１９９３）；Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６２１−２４，１９８８；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５４２−４６、１９９４；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、３６５５−５９、１９９０；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３３８−４２，１９９１に教示される。
【０１０７】
特定のｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の用量およびこの組成物を投与する手段の両方は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の特定の特性、患者の状態、患者の年齢、および患者の体重、処置される特定の疾患の進行度、ならびに関連する要因に基づいて、決定され得る。組成物がｈＰＮＱＡＬＲＥ抗体を含む場合、この組成物の有効な投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約５μｇ〜約５０ｍｇの範囲、１ｋｇあたり約５０μｇ〜約５ｍｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約５００μｇの範囲、および１ｋｇあたり約２００μｇ〜約２５０μｇの範囲である。
【０１０８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムコード配列または抗体コード配列を含む、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含む組成物は、局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与され得る。適切な濃度は、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの範囲である。作用の方法ならびに形質転換および発現の効力のような要因は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の最終的な効力のために必要とされる投薬量に影響する、考慮すべき問題である。より広い面積の組織にわたってより高い発現が所望される場合、より大量のｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物、もしくは連続して投与される同じ量、または別々の（例えば、腫瘍部位の）隣接した組織部分または近傍の組織部分への数回の投与が、正の治療結果を遂げるために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用的な実験により、最適な治療効果のための特定の範囲が決定される。
【０１０９】
細胞における内因性ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現は、内因性ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子とインフレームで、ＤＮＡ構築物（ｈＰＮＱＡＬＲＥ標的化配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー部位を含む）を相同組換えにより導入することにより変更され得、その結果、新しいｈＰＮＱＡＬＲＥ転写ユニットを含む相同組換え細胞が、形成される。この新しい転写ユニットは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子を所望により開始または終了させるために使用され得る。内因性遺伝子発現に影響を及ぼすこの方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示される。
【０１１０】
標的化配列は、配列番号１、３、５、または７に示されるヌクレオチド配列から選択される、少なくとも１０、１２、１５、２０、または５０の連続したヌクレオチドのセグメントである。好ましい標的化配列は、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３から選択される。新しい転写ユニットは、内因性ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子のコード配列の上流に配置される。外因性調節配列は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子のコード配列の転写を指向する。
【０１１１】
本発明はまた、哺乳動物（好ましくはヒト）における新形成を、診断または予後判定する方法を提供する。新形成であることが疑われる第一の組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現は、正常である第二の組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現と比較され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号１、３、５、または７に示されるコード配列を有し得る。好ましくは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに／あるいは配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３を含む。
【０１１２】
例えば、当該分野で公知であるように、第一および第二の組織における、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡまたはｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを測定することにより、比較がなされ得る。第一の組織および第二の組織は、同じ被験体か、または異なる被験体に由来し得る。第一の組織および第二の組織は、異なる型であり得るが、好ましくは同じ型の組織（例えば、腸ポリープ）由来である。あるいは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子発現の標準曲線は、多数の正常組織サンプルから決定され得、そして新形成であることが疑われる組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子発現との比較のために使用され得る。
【０１１３】
第二組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子発現または標準曲線との比較による、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の第一組織における過剰発現は、第一組織における新形成を示す。過剰発現のレベルは、新形成の病期と相関し得、そして例えば、患者（好ましくはヒト患者）の処置をモニターするために使用され得る。
【０１１４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドはまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの細胞への移入を増加させるために有用な化合物、またはｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの細胞内でのその後の生物学的効果を強めるために有用な化合物についての、試験化合物のスクリーニングの目的のために、被験体に送達され得る。このような生物学的効果としては、相補的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションおよびその翻訳の阻害、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡ、単鎖抗体、リボザイム、オリゴヌクレオチド、もしくはタンパク質および／またはｈＰＮＱＡＬＲＥを形成するｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの発現、ならびにｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの複製および組込みが挙げられる。被験体は、細胞培養物または動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）であり得る。
【０１１５】
スクリーニングされ得る試験化合物は、天然の産物または合成的なもののどちらでも、任意の物質を含み、この物質はインビトロまたはインビボで被験体に投与され得る。化合物のライブラリーまたは混合物が試験され得る。化合物または物質は、薬学的効果が以前に既知かまたは未知であるものであり得る。化合物または物質は、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの前、後、またはそれと同時に送達され得る。それらは、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドと別々に、または混合して、投与され得る。
【０１１６】
送達されたｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの組込みは、当該分野で公知の任意の手段でモニターされ得る。例えば、送達されたｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドのサザンブロットが行なわれ得る。送達されたポリヌクレオチドのフラグメントのサイズにおける変化は、組込みを示す。送達されたポリヌクレオチドの複製は、とりわけ、ｈＰＮＱＡＬＲＥプローブへのハイブリダイゼーションを用いて結合された標識ヌクレオチドの取り込みを検出することにより、モニターされ得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの発現は、送達されたポリヌクレオチドにハイブリダイズするｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの産生を検出することにより、またはｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質を検出することにより、モニターされ得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質は、免疫学的に検出され得る。従って、本発明に従ったｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの送達は、インビトロまたはインビボでの動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）の細胞における、送達、組込み、ハイブリダイゼーション、発現、複製または取込みを高めることにより、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドの細胞への移入を高める能力について、試験化合物をスクリーニングするための、優秀なシステムを提供する。
【０１１７】
本開示中で引用される全ての参考文献の全内容は、本明細書中に参考として明白に援用される。以下のものは、例示的な目的のためのみに提供され、上記の広範な用語で記載された本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【０１１８】
（実施例）
（実施例１）
本実施例は、ヒト組織および細胞株におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの発現を示す。
【０１１９】
人の心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血リンパ球のノーザンブロットを、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現のためにアッセイした。細胞株ＨＬ−６０、Ｈｅｌａ、Ｍｏｌｔ−４、Ｋ５６５、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９およびＧ３６１もまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡ発現のためにアッセイした。
【０１２０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡは、ほとんどの組織において非常に低いレベルで発現する。発現は、脳、脾臓、精巣、および卵巣において最も目立った。対照的に、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡは、癌細胞株においてより高いレベルで発現した。ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの発現は、細胞株Ｋ５６５、Ａ５４９、Ｇ３６１およびＳＷ４８０において最も高かった。
【０１２１】
これらの結果は、対応する正常組織における発現レベルと比較して、ｈＰＮＱＡＬＲＥが癌細胞株において過剰発現することを示す。
【０１２２】
（実施例２）
本実施例は、発達中のマウス胚におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの分布を記載する。
【０１２３】
マウス胚を、Ｎｉｅｔｏら、１９９６、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５１：２１９−３５に記載のような、全量（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーションのためにプロセスし、そしてＬｙｎ，Ｓ．Ｄ．、１９９８、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９：６７−６９に記載されるような当該分野において周知の方法によって実施し得る。全量胚上に対するインサイチュハイブリダイゼーションは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡが胚組織において、特に発達中の肢において全体的に発現することを示す。
【０１２４】
これらの結果は、ｈＰＮＱＡＬＲＥが、胚発達の時期にわたって特定の組織において差示的に発現されえることを示す。
【０１２５】
（実施例３）
本実施例は、ｈＰＮＱＡＬＲＥに対するポリクローナル抗体の産生を示す。
【０１２６】
ウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンに結合したＮ−ＨＤＦＨＶＤＲＰＬＥＥＳＬＩＮＰＥＬＩＲＰ−Ｃ（配列番号１７）の配列を有するｈＰＮＱＡＬＲＥのペプチドフラグメントで免疫した。ポリクローナル抗体の調製物を産生した。この抗体は、ＣＯＳ細胞およびＵ８７細胞から発現したｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質を認識した。
【０１２７】
これらの結果は、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドフラグメントを免疫原として用い得ることを実証する。
【０１２８】
当業者は、せいぜい慣用的実験法を用いて、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認する。このような特定の実施形態および等価物は、添付の特許請求の範囲によって含まれることが意図される。
【０１２９】
すべての特許、公開された特許出願、および本明細書中に引用された出版物は、本明細書中に完全に示されるように、参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、タンパク質キナーゼの領域に関する。より詳細には、本発明は、サイクリン依存的タンパク質キナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有糸分裂および移動の調節の原因である経路、ならびに細胞における環境ストレスシグナルの伝達の原因である経路は、完全には記載されていない。このようなタンパク質は、操作され得、例えば、疾患または環境条件によるストレスに対して細胞を防護し、そして、新生物形成のように有糸分裂および移動における変化を含む障害を処置する。したがって、当該分野において、これらの経路に含まれるタンパク質の同定のための必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、種々の実施形態において、新生物形成の診断および処置、ならびに細胞周期の調節のための試薬および方法を提供する。
【０００４】
本発明の１つの実施形態は、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を有するポリヌクレオチドを提供する。他の関連する実施形態は、配列番号６のアミノ酸２６〜３８および／またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもまた提供される。
【０００５】
本発明の他の実施形態は、第一および第二のタンパク質セグメントを含む融合タンパク質を提供する。これらは、ペプチド結合によってともに融合される。本発明の第一のタンパク質は、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を含む。配列番号６のアミノ酸２６〜３８またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第一のタンパク質セグメントを提供する
本発明のなお他の実施形態は、配列番号４、配列番号６および／または配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合する抗体の調製を含む。関連する実施形態は、配列番号６および／または配列番号８のアミノ酸２６〜３８および／または配列番号６の１８１〜２０１の全体または一部によって規定されるエピトープに特異的に結合する抗体調製物を含む。
【０００６】
さらなる実施形態は、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を提供する。類似の実施形態は、配列番号６のアミノ酸２６〜３８および／またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡを提供する。配列番号５のヌクレオチド７６〜１１４に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列、および／または配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列、および／または配列番号５のヌクレオチド５４２〜６０３に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む、本発明のｃＤＮＡ分子はまた提供される。配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子もまた、提供される。
【０００７】
本発明のなおさらなる実施形態は、配列番号５のヌクレオチド７６から１１４および／または配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離されたサブゲノムポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。
【０００８】
他の本発明の実施形態は、プロモーター、ならびに、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸をコードポリヌクレオチドセグメントを含む構築物を含む。模範的な構築物によって、ポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置され、そしてポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始される。類似の実施形態は、プロモーターおよび配列番号６のアミノ酸２６〜３８および／またはアミノ酸１８１〜２０１に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む構築物を含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置され得、そしてポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始され得る。本発明の構築物はまた、プロモーター、ならびに、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。
【０００９】
他の本発明の実施形態は、本明細書中で提供される任意の構築物を含む宿主細胞を含む。
【００１０】
さらなる実施形態は、新しい転写開始ユニットを組み込む相同組換え細胞を提供する。本発明の新しい転写開始ユニットは、外因性調節配列、外因性エキソンおよびスプライスドナー部位を含み得る。新しい転写開始ユニットは、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるコード配列を有する遺伝子のコード配列の上流に位置され得る。外因性調節配列は、遺伝子のコード配列の転写を指向し得る。
【００１１】
なおさらなる実施形態は、新生物形成の診断または予防の方法を提供する。このような方法は、新生物形成が予想される第一の組織における第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現を、正常である第二の組織における第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現と比較する工程を含み得る。第一および第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるコード配列を含み得る。これらの方法によって、第一の組織における第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の過剰発現は、第一の組織における新生物形成を示す。新生物形成を診断または予防する類似の方法によって、第一および／または第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド７６〜１１４、配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、または配列番号５のヌクレオチド５４２〜６０３からなる群より選択されるコード配列を含み得る。
【００１２】
したがって、本発明は、サイクリン依存的キナーゼファミリーの独特のメンバーであるｈＰＮＱＡＬＲＥのアミノ酸配列およびｈＰＮＱＡＬＲＥをコードするＤＮＡ配列を用いる技術を提供する。とりわけ、本発明を用いて、新生物形成および他の増殖性疾患を処置し得る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群より選択されるｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の、少なくとも２２３の連続するアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸２６から３８に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸２６から３８に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸１８１から２０１に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸１８１から２０１に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
（項目２）配列番号６のアミノ酸２６から３８に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３）配列番号６のアミノ酸１８１から２０１に、少なくとも６５％同一であるアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
（項目４）第一のタンパク質セグメントおよび第二のタンパク質セグメントを含む融合タンパク質であって、ここで、該第一のタンパク質セグメントは、該第二のタンパク質セグメントとペプチド結合によって融合され、ここで、該第一のタンパク質セグメントは、請求項１に記載の単離されたポリペプチドを含む、融合タンパク質。
（項目５）請求項１に記載の単離されたポリペプチドの全体または一部によって規定されるエピトープに特異的に結合する、抗体の調製物。
（項目６）請求項１に記載の単離されたポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目７）請求項２に記載の単離されたポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目８）請求項３に記載の単離されたポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目９）ｃＤＮＡ分子であって、以下：
（ａ）配列番号５のヌクレオチド７６から１１４に、少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド７６から１１４に同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチド５０３から５６４、または配列番号５のヌクレオチド５４２から６０３に、少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５０３から５６４、または配列番号５のヌクレオチド５４２から６０３に同一であるヌクレオチド配列；および
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ｃＤＮＡ分子。
（項目１０）単離されたサブゲノムポリヌクレオチドまたはその相補体であって、ストリンジェントな条件下で、配列番号５のヌクレオチド７６から１１４、および配列番号３のヌクレオチド５０３から５６４からなる群より選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離されたサブゲノムポリヌクレオチドまたはその相補体。
（項目１１）構築物であって、以下：
プロモーター；および
請求項６に記載のｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドセグメントであって、ここで、該ポリヌクレオチドセグメントは、該プロモーターから下流に位置され、そして該ポリヌクレオチドセグメントの転写は、該プロモーターから開始する、
構築物。
（項目１２）構築物であって、以下：
プロモーター；および
請求項９に記載のｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドセグメントであって、ここで、該ポリヌクレオチドセグメントは、該プロモーターから下流に位置され、そして該ポリヌクレオチドセグメントの転写は、該プロモーターから開始する、
構築物。
（項目１３）請求項１１に記載の構築物を含む、宿主細胞。
（項目１４）請求項１２に記載の構築物を含む、宿主細胞。
（項目１５）そこに組み込まれた新しい転写開始ユニットを有する相同組換え細胞であって、該新しい転写開始ユニットは、以下：
（ａ）外因性調節配列；
（ｂ）外因性エキソン；および
（ｃ）スプライスドナー部位であって、ここで、該新しい転写開始ユニットが遺伝子のコード配列の上流に位置され、ここで、該遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群より選択されるコード配列を有し、そして該外因性調節配列は、該遺伝子のコード配列の転写を指向する、スプライスドナー部位、
を含む、細胞。
（項目１６）新生物形成を診断または予防する方法であって、該方法は、新生物形成の疑いのある第一の組織における第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現を、正常な第二の組織における第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現と比較する工程を含有し、ここで、該第一および第二のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、以下：
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号３；
（ｃ）配列番号５；
（ｄ）配列番号７；
（ｅ）配列番号５の７６から１１４のヌクレオチド；
（ｆ）配列番号３の５０３から５６４のヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号５の５４２から６０３のヌクレオチド、
からなる群より選択されるコード配列を含み、
ここで、該第一の組織における該第一のｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の過剰発現は、該第一の組織における新生物形成を示す、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態のアミノ酸配列を比較する。
【図１−２】図１は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態のアミノ酸配列を比較する。
【図２−１】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【図２−２】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【図２−３】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【図２−４】図２は、は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするヌクレオチドコード配列を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
ｈＰＮＱＡＬＲＥと称する新規のヒトサイクリン依存的キナーゼは、本発明の発見である。ｈＰＮＱＡＬＲＥは、サイクリン依存的キナーゼファミリーのメンバーである。ｈＰＮＱＡＬＲＥは、腫瘍において過剰発現し、診断的および治療的に使用され得る。
ヒトｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の４つの形態のアミノ酸配列（配列番号２，４，６および８）、ならびにｈＰＮＱＡＬＲＥの４つの形態をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１，３，５および７）は、本明細書中に記載される。サイクリン依存的キナーゼのすべての重要な部位は、このタンパク質中に保存される。ｃｄｋ２に見出された、分子のＮ末端の調節リン酸化部位（１４位のスレオニンおよび１５位のチロシン）は、ｈＰＮＱＡＬＲＥにおいては、これらの部位にリン酸化されない２つの残基（グルタミンおよびフェニルアラニン）をまた有するＣＤＫ７型サイクリン依存的キナーゼと類似して、それぞれ、アラニンおよびヒスチジンによって置換される。サイクリン依存的キナーゼの調節リン酸化部位は、とりわけ以下に記載される：Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ、Ｐｒｏｇｒ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．１、２２９−４０（１９９５）；ＬｅｗおよびＫｏｒｎｂｌｕｔｈ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８、７９５−８０４（１９９６）；およびＭｏｒｇａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、２６１−９１（１９９７）。サイクリン依存的キナーゼのサイクリン結合ドメインを特徴付ける配列モチーフ（Ｃｄｋ２中のＰＳＴＡＩＲＥ；配列番号１５）は、ｈＰＮＱＡＬＲＥにおいて、ＰＮＱＡＬＲＥ（配列番号９）によって置換され、これは、ｈＰＮＱＡＬＲＥが、その調節サイクリンサブユニットに関して異なる特異性を有することを示す。
【００１５】
ｈＰＮＱＡＬＲＥの種々のアミノ酸は置換されて、１つ以上の変化した生物学的活性を有するｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体を形成し得る。例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン依存的キナーゼ活性またはサイクリン結合ドメインは、変化され得るか、または置換は、タンパク質をリン酸化され得るよう作製し得る。このような置換は、野生型のｈＰＮＱＡＬＲＥと比較して、変化した調節または生物学的活性の特定のサブセットを、ｈＰＮＱＡＬＲＥに提供し得る。他のサイクリン依存的キナーゼのサイクリン結合ドメイン（例えば、ＰＦＴＡＩＲＥ（配列番号１０）、ＰＩＳＳＬＲＥ（配列番号１１）、ＰＩＴＡＬＲＥ（配列番号１２）、ＰＬＳＴＩＲＥ（配列番号１３）、ＰＩＳＴＶＲＥ（配列番号１４）、ＰＳＴＡＩＲＥ（配列番号１５）およびＮＲＴＡＬＲＥ（配列番号１６））は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合特異性を変化させるために、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合ドメインであるＰＮＱＡＬＲＥ（配列番号９；配列番号２または４のアミノ酸４４〜５１：配列番号６または８のアミノ酸５８〜６４）と置換され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン依存的キナーゼ活性は、例えば、１４５位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換すること（この置換は、ｈＰＮＱＡＬＲＥの「キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ）」形態を生じる）によって改変され得る。
【００１６】
種々の置換はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥをリン酸化され得るように作製され得る。例えば、１５位のヒスチジンのフェニルアラニンまたはチロシンへの置換、または１４位のアラニンのスレオニンへの置換は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのリン酸化を可能にする。ｈＰＮＱＡＬＲＥの特性に影響する他の置換は、当業者が考えつき、そして標準組換えＤＮＡ技術を用いてｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質になされ得る。
【００１７】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのキナーゼ活性またはサイクリン結合活性に影響しない他のアミノ酸置換は、天然に存在し得るか、または研究室において作製し、生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体を形成し得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥの生物学的に活性な改変体は、細胞周期調節に含まれ、サイクリン依存的キナーゼ活性を示し、そして、腫瘍において過剰発現される。生物学的活性または免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基が置換されるか、挿入されるか、または欠失されるかの決定におけるガイダンスは、当該分野において周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を用いて見出し得る。
【００１８】
好ましくは、生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体におけるアミノ酸置換は、保存的なアミノ酸変化（すなわち、類似の電荷のアミノ酸または非電荷アミノ酸の置換）である。保存的アミノ酸変化は、アミノ酸の側鎖に関するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非電化極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として両方に分類される。ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの孤立した置換を除いて、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリン、または構造的に関連するアミノ酸とのアミノ酸の類似の置換が（特に、置換がｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合部位またはそのキナーゼドメインのアミノ酸を含まない場合）、生じる分子の結合特性に主要な影響を及ぼさないことを予期することは妥当である。
【００１９】
生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体は、グリコシル化形態、他の分子と凝集結合体、および非関連化学部分を有する共有結合体を含む。共有結合性改変体は、当該分野において公知のアミノ酸鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見出される基に対する連結官能基によって調製され得る。生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体はまた、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインを含む。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン依存的キナーゼ活性に影響しない領域の短縮化または欠失もまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体である。
【００２０】
アミノ酸置換が、機能的ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはポリペプチドを生じるかどうかは、例えば、そのサイクリン依存的キナーゼ活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。サイクリン依存的キナーゼ活性のためのアッセイが、例えば、Ｌｏｃｋら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：３９９−４０９に教示される。好ましい天然または非天然に存在する生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、これらの分子は、少なくとも９８％または９９％同一である。同一性パーセントは、当該分野において公知の任意の方法またはアルゴリズムを用いて計算され得る。制限されない例示は、以下のパラメータを有するアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ）検索を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムである：１２のギャップ開放（ｏｐｅｎ）ペナルティおよび１のギャップ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティ。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示される。
【００２１】
ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、全長より短いｈＰＮＱＡＬＲＥを含み、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の少なくとも２２３、２２５、２５０、２７５、３００または３２５以上の連続するアミノ酸を含む。ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合ドメインであるＰＮＱＡＬＲＥ（配列番号９；配列番号２または４のアミノ酸４４〜５１または配列番号６または８のアミノ酸５８〜６４）を含み得るか、またはｈＰＮＱＡＬＲＥアミノ酸配列を、上記のような他のサイクリン依存的キナーゼサイクリン結合ドメインとともに含むキメラポリペプチドを含み得る。種々のアミノ酸置換がｈＰＮＱＡＬＲＥをリン酸化させるか、またはｈＰＮＱＡＬＲＥのキナーゼ活性を減少するように作製されたポリペプチドはまた、構築され得る。
【００２２】
本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含み得る。さらに、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、配列番号６または８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含み得る。
【００２３】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８のポリペプチドに、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの改変体を意図する。例えば、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるか、または配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドを提供する。
【００２４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥは、標準的ナ生化学的方法を用いて、ｈＰＮＱＡＬＲＥ産生ヒト細胞（例えば、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、または膵臓から単離され得る。単離および精製されたｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドは、通常細胞内でｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドに結合する他の化合物（例えば、サイクリンまたは他のタンパク質、糖質、脂質、あるいは細胞内器官）から分離される。単離および精製されたｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの調製物は、少なくとも純度８０％であり；好ましくは、この調製物は、純度９０％、９５％、または９９％である。
【００２５】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質およびｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ法または合成化学法によって産生され得る。組換えｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの産生のために、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質または生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体もしくは変化したｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体をコードする配列番号１、３、５、および７に示されるｈＰＮＱＡＬＲＥのヌクレオチド配列、あるいはこれらの配列の改変体から選択されるコード配列は、原核生物発現系または真核生物発現系において発現され得る。細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の発現系が、当該分野において公知であるように使用され得る。酵素を用いて、全長ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の酵素的タンパク質分解によって、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドを作製し得る。
【００２６】
あるいは、合成化学法（例えば、固相ペプチド合成）は、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドを合成するために使用され得る。ペプチド、アナログまたは誘導体の産生のための一般的手段は、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ，ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−Ａ ＳＵＲＶＥＹ ＯＦ ＲＥＣＥＮＴ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編（１９８３）に要約される。さらに、正常なＬ−立体異性体に対するＤ−アミノ酸の置換は、分子の半減期を増加するために実施され得る。生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥまたは変化した改変体は、同様に産生され得る。
【００２７】
少なくとも２２３、２２５、２５０、２７５、３００または３１５以上の連続するｈＰＮＱＡＬＲＥアミノ酸を含む融合タンパク質もまた、構築され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ誘導タンパク質は、ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープに特異的に結合し、種々のアッセイ系における使用のための抗体の作製のために有用である。例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質を使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質と相互作用（例えば、異なるサイクリン、およびその官能基の影響）するタンパク質を同定し得る。物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティクロマトグラフィー）またはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーベースアッセイ（例えば、酵母２ハイブリッド系またはファージディスプレイ系）はまた、この目的のために使用され得る。このような方法は、当該分野において公知であり、そして薬剤スクリーニングとしても使用され得る。
【００２８】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質は、ペプチド結合によってともに融合された２つのタンパク質セグメントを有する。第一のタンパク質セグメントは、都合のよいように、Ｎ末端またはＣ末端であり得る。第一のタンパク質セグメントは、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の少なくとも２２３、２２５、２５０、２７５、３００または３１５以上の連続するアミノ酸を含む。アミノ酸は、配列番号２、４、６、および８に示されるアミノ酸配列、またはこれらの配列の生物学的に活性な改変体もしくは変化した改変体より選択され得る。本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含み得る。配列番号６または配列番号８の１８１〜２０１、もしくは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含む融合タンパク質もまた、好ましい。第一のタンパク質セグメントもまた、全長ｈＰＮＱＡＬＲＥまたは改変体を含み得る。第一のセグメントは、都合のよいように、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置され得る。
【００２９】
この第２のタンパク質セグメントは、完全長タンパク質またはタンパク質フラグメントもしくはポリペプチドであり得る。融合タンパク質構築物において通常用いられるタンパク質としては、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光性タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む）が挙げられる。エピトープタグは、融合タンパク質構築物において用いられ得、これにはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含む。他の融合構築物としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）のＢＰ１６タンパク質融合物が挙げられ得る。
【００３０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質は、第１および第２のタンパク質セグメントの共有結合により、または分子生物学の分野の標準的手順により作製され得る。組換えＤＮＡ方法は、当該分野で公知のように、例えば、第２のタンパク質セグメントをコードし、そして宿主細胞においてＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドを用いて、適切なリーディングフレームにおける配列番号１、３、５、または７から選択されるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製することによって、ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質を調製するために用いられ得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットは、実験のためのツールを研究室に供給する会社から入手可能である。これには、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）、および Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）が挙げられる。
【００３１】
単離かつ精製されたｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な改変体もしくは変化した改変体または融合タンパク質は、配列番号２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列を有するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、あるいは生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体または変化したｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体のエピトープに特異的に結合する抗体の調製物を得るために、免疫原として用いられ得る。好ましくは、抗体は、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合部位に結合することによって、ｈＰＮＱＡＬＲＥと他のサイクリン依存的キナーゼとの間で区別し得る。より好ましくは、本発明の抗体は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８の全体または一部によって規定されるエピトープに結合する。配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８の全体または一部によって規定されるエピトープに結合する抗体もまた、好ましい。代表的には、少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸は、ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープを形成するために要求される。しかし、非連続的アミノ酸を含むエピトープは、より多く（例えば、少なくとも１５、２５、または５０アミノ酸）要求され得る。
【００３２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または生物学的に活性な改変体のエピトープに特異的に結合する抗体は、以下を含むがそれらに限定されない免疫化学的アッセイにおいて用いられ得る：ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当該分野で公知の他の免疫化学的アッセイ。代表的には、本発明の抗体は、このような免疫化学アッセイで用いられた場合、他のタンパク質で提供される検出シグナルより少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープに特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして溶液からｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質またはｈＰＮＱＡＬＲＥのポリペプチドフラグメントを免疫沈降し得る。
【００３３】
特に抗原性であるｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープは、例えば、抗原性についてのｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドの慣用的なスクリーニングにより、または配列番号２、４、６、または８に示されたアミノ酸配列に対するタンパク質の抗原性領域を選択するための理論的な方法を適用することにより選択され得る。このような方法は、例えば、以下において教示される：ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８、３８２４〜２８（１９８１）、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、４８３〜４８９（１９８３）、ならびにＳｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９、６６０〜６６６（１９８３）。
【００３４】
当該分野で公知の任意の型の抗体は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープに特異的に結合するように産生され得る。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製物は、当該分野で周知の標準的方法を用いて作製され得る。同様に、単鎖抗体もまた調製され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープに特異的に結合する単鎖抗体は、例えば、当該分野で公知であるような単鎖免疫グロブリンディスプレーライブラリーから、単離され得る。このライブラリーは、ｈＰＮＱＡＬＲＥのアミノ酸配列に対して「パン」され（ｐａｎｎｅｄ）、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥのタンパク質の異なるエピトープに対して高親和性で結合する多数の単一の鎖の抗体が単離され得る。Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ｇｅｎｅ １６０：１２９〜１３０。単鎖抗体はまた、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅法を用いて構築され得る。Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５：５０７〜１１。
【００３５】
単鎖抗体は、単一抗原特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二抗原特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり得、そして２価または４価であり得る。４価の二抗原特異的な単鎖抗体の構築は、例えば、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９〜１６３に教示される。２価の二抗原特異的な単鎖抗体の構築は、とりわけ、ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９〜２０６に教示される。
【００３６】
単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、以下に記載のように、手動または自動のヌクレオチド合成を用いて構築され得、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて発現構築物にクローンされ得、そして細胞に導入されてコード配列を発現し得る。あるいは、単鎖抗体は、例えば、線状ファージ技術を用いて直接産生され得る。Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１：４９７〜５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５：８１〜９１。
【００３７】
モノクローナル抗体および他の抗体はまた、それが治療的に用いられる場合、その抗体に対する免疫応答の上昇から患者を保護するため「ヒト化」され得る。このような抗体は、治療に直接用いられるヒト抗体に対して十分に類似の配列であり得、または２〜３の主要な残基の変化を必要とし得る。例えば、げっ歯類の抗体とヒト配列との間の配列の差異は、ヒト配列における残基と異なる残基で置換することにより（例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発により、または全相補性決定領域の移植により）最小にされ得る。あるいは、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように、組換え方法を用いてヒト化抗体を産生し得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥのエピトープに特異的に結合する抗体は、米国特許第５、５６５、３３２号に開示されるように、部分的にかまたは完全にのいずれかでヒト化される抗原結合部位を含み得る。
【００３８】
抗体の他の型は、本発明の方法において構築され得、そして用いられ得る。例えば、キメラ抗体は、例えばＷＯ９３／０３１５１に開示されるように構築され得る。免疫グロブリンに由来する結合タンパク質、ならびにＷＯ９４／１３８０４に開示された「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」のような多価および複数抗原特異的な（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合タンパク質はまた、調製され得る。
【００３９】
本発明の抗体は、当該分野において周知の方法により精製され得る。例えば、抗体は、ｈＰＮＱＡＬＲＥのタンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な改変体または融合タンパク質が結合するカラムにわたって抗体を通過させることによりアフィニティー精製され得る。次いで、この結合抗体は、高塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出され得る。
【００４０】
抗体以外のｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的結合ポリペプチドはまた、産生され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的結合ポリペプチドは、ｈＰＮＱＡＬＲＥまたはその改変体と結合するポリペプチドであり、そして、ｈＰＮＱＡＬＲＥおよびｈＰＮＱＡＬＲＥのポリペプチド誘導体に対して、結合を試験された他のポリペプチドよりも、はっきりとより高い結合親和性を有するポリペプチドである。１０倍（ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ １０）まで高い親和性が好ましく、１００倍高い親和性がより好ましい。このようなポリペプチドは、例えば酵母ツーハイブリッド系を用いて見出され得る。
【００４１】
抗体を用いて、とりわけ、ヒト組織中の野生型ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質およびその機能を検出し得る。抗体をまた用いて、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子における変異の存在を検出し得る。この変異は、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の過小発現または過剰発現を生じるか、または変化した大きさまたは電気泳動上の移動度を有するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質発現を生じる。必要に応じて、本発明の抗体を用いて、ｈＰＮＱＡＬＲＥサイクリン結合部位をブロックし得るか、または機能的ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の有効レベルを変化し得る。あるいは、抗体を用いて、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含むポリペプチドを検出し得る。好ましい抗体は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、あるいは配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含むＴループ領域によって規定される生物学的活性に結合し、そしてブロックする。
【００４２】
本発明はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な改変体もしくは変化した改変体、融合タンパク質などをコードするサブゲノムポリヌクレオチドを提供する。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドは、全体より少ない染色体を含み、そして二本鎖または一本鎖であり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、イントロンを含まない。
【００４３】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、または７に示されるヌクレオチド配列またはこれらの相補体から選択される、少なくとも１５６２、１５６３、１６７０、１５７５、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０または２１００以上の連続するヌクレオチドを含み得る。相補的ヌクレオチド配列を使用して、、ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供され得る。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４によって含まれるオリゴヌクレオチドである。配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３によって含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた好ましい。ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドはまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的単鎖抗体、リボザイム、および生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体もしくは変化したｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００４４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質または生物学的に活性なｈＰＮＱＡＬＲＥ改変体のアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに配列番号１、３、５、または７に示されるヌクレオチド配列に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である相同なヌクレオチド配列もまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドである。好ましいサブゲノムポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４および配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチドを含む。配列同一性パーセントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、以下のパラメーター（１２のギャップ開放ペナルティーおよび１のギャップ伸長ペナルティー）を用いるアフィンギャップ検索を使用する、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるような）を用いるコンピュータープログラムを使用して決定され得る。
【００４５】
配列番号１、３、５、および７に示されるコード配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列または多くとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５％の塩基対ミスマッチを有するその相補体はまた、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドである。好ましいヌクレオチド配列は、多くとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５％の塩基対ミスマッチを有して、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４および配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３にハイブリダイズする。例えば、以下の洗浄条件（２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、各３０分；次いで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分；次いで、２×ＳＳＣ、室温で２回、各１０分）を使用して、相同的なｈＰＮＱＡＬＲＥ配列が同定され得、この相同的な配列は、配列番号１、３、５、または７あるいはその相補体に多くて約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む。より好ましくは、相同的な核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチを含み、さらにより好ましくは、５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００４６】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドの種ホモログはまた、適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして他の種（例えば、マウス、サル、酵母、または細菌）由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。二本鎖ＤＮＡのＴmは、相同性における１％減少毎に、１〜１．５℃減少することが周知である（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１、１２３（１９７３））。従って、相同的なｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドは、例えば、推定相同的ｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドを、配列番号１、３、５、または７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズして、その試験ハイブリッドの融解温度を、配列番号１、３、５、または７を有するポリヌクレオチドおよびその配列に完全に相補的であるポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較して、そして試験ハイブリッド内の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを計算することによって、同定され得る。
【００４７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に続いて、配列番号１、３、５、または７、あるいはそれらの相補体に示されるコード配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は、当該分野で周知であり、そして理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ 第２版、１９８９、９．５０−９．５１頁に開示される。ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドの好ましい種ホモログは、配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４および配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００４８】
代表的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件について、温度および塩濃度の組合せは、研究中のハイブリッドの計算されたＴmより約１２〜２０℃低く、選択されるべきである。配列番号１、３、５、または７に示されるｈＰＮＱＡＬＲＥ配列と、その配列に６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴmは、例えば、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の式を使用して計算され得る。
【００４９】
【数１】
ストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、４×ＳＳＣ、６５℃、または５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃、または０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃が挙げられる。高度にストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、０．２×ＳＳＣ、６５℃が挙げられる。
【００５０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドは、標準の核酸精製技術を使用して、他のヌクレオチド配列を含まずに、単離および精製され得る。例えば、制限酵素およびプローブを使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質または改変体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドフラグメントを単離し得る。単離および精製されたサブゲノムポリヌクレオチドは、他の分子を含まないか、少なくとも９０％含まない調製物中に存在する。
【００５１】
ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質をコードする相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子もまた、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチドである。ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｃＤＮＡ分子は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡを鋳型として使用する、標準の分子生物学技術を用いて作製され得る。その後、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｃＤＮＡ分子は複製され得る。増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドのさらなるコピーを、ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として用いることにより、取得し得る。
【００５２】
あるいは、合成化学技術を使用して、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥのサブゲノムポリヌクレオチド分子を合成し得る。遺伝コードの縮重は、別のヌクレオチド配列が、配列番号２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列を有するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、あるいはそれらの配列の１つの生物学的に活性な改変体をコードするように合成されることを可能にする。そのような全てのヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【００５３】
本発明はまた、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングまたはインサイチュハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーションプロトコールにおいて、ｈＰＮＱＡＬＲＥ配列を検出するために使用され得る、ポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１、３、５、または７から選択される少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましいプローブは、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４、あるいは配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、および配列番号５または配列番号７の５４２〜６０３より選択される少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続するヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドプローブは、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素的標識、または化学発光標識のような検出可能な標識を含み得る。
【００５４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む発現構築物であり得る。当業者は、当該分野で公知で、そして使用される多くの細胞型特異的プロモーターから、適切なプロモーターを容易に選択し得る。発現構築物はまた、宿主細胞内で機能的な転写ターミネーターを含み得る。発現構築物は、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのタンパク質、改変体、融合タンパク質、抗体またはリボザイムの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、このプロモーターの下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターで始まる。
【００５５】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ構築物を含む組換え宿主細胞が構築されて、例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の全てまたは一部を発現し得る。好ましい宿主細胞は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸２６〜３８を含む、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の一部を発現する。また好ましいのは、配列番号６または配列番号８のアミノ酸１８１〜２０１、ならびに配列番号４のアミノ酸１６８〜１８８を含む、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の一部を発現する宿主細胞である。ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物を含む組換え宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。種々の宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、およびヒトの発現系での使用に利用可能であり、そしてそれら宿主細胞を使用して、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物を増殖させ得るか、または発現させ得る。
【００５６】
構築物を、当該分野で公知の任意の技術を使用して、宿主細胞内に導入し得る。これらの技術として、トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸のまたはカプセル化した核酸によるトランスフェクション、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡを被覆したラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム媒介トランスフェクションが挙げられる。
【００５７】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物を発現するための細菌系としては、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７、ＥＰ３６，７７６、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１−２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９において記載される細菌系が挙げられる。
【００５８】
酵母における発現系としては、以下に示すものに記載される発現系が挙げられる：Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２）Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６、米国特許第４，８３７，１４８号、米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：４９、Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１、Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−１４７４、ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９；ＥＰ２４４，２３４、およびＷＯ９１／００３５７。
【００５９】
昆虫におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物の発現を、以下に示すものに記載されるように実行し得る；米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５５，４７６、およびＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：７６５−７７６、Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；およびＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびに対応する許容的な、宿主由来の昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編）、第８巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）２７７〜２７９頁、およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８５）３１５：５９２−５９４に記載される。
【００６０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物の哺乳動物での発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されるように達成され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現構築物の哺乳動物での発現の他の特徴は、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、および米国再発行特許第３０，９８５号に記載されるように促進され得る。
【００６１】
本発明のサブゲノムポリヌクレオチドはまた、遺伝子送達ビヒクルにおいて、ｈＰＮＱＡＬＲＥのｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ネイティブなｈＰＮＱＡＬＲＥのｍＲＮＡまたはその相補体の配列のいずれかとともに）、全長ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質、ｈＰＮＱＡＬＲＥ融合タンパク質、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチド、生物学的に活性な改変体もしくは改変された改変体、またはｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的リボザイムもしくは単鎖抗体を細胞に、好ましくは真核生物細胞に送達する目的のために用いられ得る。本発明によれば、遺伝子送達ビヒクルは、例えば、裸のプラスミドＤＮＡ、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含むウイルス発現ベクターまたはリポソームもしくは縮合剤と結合したｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドであり得る。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターおよび細胞増殖により活性化されるプロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーターおよびチミジル酸シンターゼプロモーター）である。他の好ましいプロモーターとしては、ウイルス感染により活性化され得るプロモーター（例えば、およびインターフェロンプロモーター）、およびホルモン（例えば、エストロゲン）により活性化され得るプロモーターが挙げられる。使用可能な他のプロモーターとしては、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。
【００６３】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスの複製起点またはパッケージングシグナルのような、ウイルス配列を含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択され得る。好ましい実施形態において、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、例えば、以下を含む多くの参考文献に記載されている；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９８３、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９、１９８４、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４、１９９０、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号および同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２，４６８号、ＷＯ８９／０５，３４９、およびＷＯ９０／０２，８０６。
【００６４】
多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、本発明で利用され得、例えば、以下に示されるものに記載されるものが挙げられる；ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４，１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７，１９９３；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８，１９９３；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３，１９９２；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５，１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１／０２８０５）。
【００６５】
特に好ましいレトロウイルスは、ニワトリ白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３５およびＶＲ−２４７）、ウシ白血病ウイルス（ＶＲ−１３１５）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス（Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒ．４９：８２８、１９８４；およびＯｌｉｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒ．４８：５４２、１９８３）、マウス肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−８４４、４５０１０および４５０１６）、細網内皮症ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９４、ＶＲ−７７０および４５０１１）、ラウス肉腫ウイルス、メイソン−パイツァーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、内因性ネコレトロウイルス（例えば、ＲＤ１１４）、およびレトロウイルスベクターとして使用されるマウスまたはラットのｇＬ３０配列を含む、レトロウイルスに由来する。
【００６６】
組換えレトロウイルスが生成され得る、特に好ましいＭＬＶの株としては、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ、Ｊ．Ｖｉｒ．１９：１９，１９７６）、アーベルソン（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラフィ（Ｒｕら、Ｊ．Ｖｉｒ．６７：４７２２，１９９３；およびＹａｎｔｃｈｅｖ Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ２６：３９７，１９７９）、グロス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）（Ａｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ハーベイ肉腫ウイルス（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０、１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）およびラウシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、ならびにモロニーＭＬＶ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。
【００６７】
特に好ましい非マウスレトロウイルスは、ラウス肉腫ウイルスである。好ましいラウス肉種ウイルスとしては、ブラチスラバウイルス（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０、１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ブライアン高力価ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９、およびＶＲ−７２８）、ブライアン標準ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４０）、カール−ジルバー（Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ）ウイルス（Ａｄｇｉｇｈｉｔｏｖら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ２７：１５９、１９８０）、エンゲルブレス−ホルム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ）ウイルス（Ｌａｕｒｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９０８：２４１、１９８７）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ウイルス、プラハ（Ｐｒａｇｕｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７７２および４５０３３）、およびシュミット−ルピン（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７２４、ＶＲ−７２５、ＶＲ−３５４）が挙げられる。
【００６８】
任意の上記のレトロウイルスは、本明細書中に提供される開示および当該分野で公知の標準的な組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＫｕｎｋｌｅ、ＰＮＡＳ ８２：４８８、１９８５）を考慮して、レトロウイルスｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルをアセンブルまたは構築するために容易に利用され得る。レトロウイルスｈＰＮＱＡＬＲＥ発現ベクターの一部は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロベクターＬＴＲはマウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第２鎖合成の起点はニワトリ白血病ウイルスに由来し得る。
【００６９】
組換えレトロウイルスベクターを用い、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって、形質導入能力のあるレトロウイルスベクター粒子を作製し得る（１９９１年１１月２９日出願の出願第０７／８００，９２１号を参照のこと）。組換えレトロウイルスゲノムの、宿主細胞ＤＮＡの特異的領域内への部位特異的組込みを指向する組換えレトロウイルスが、生成され得る。部位特異的組込みは、レトロウイルス粒子内に取り込まれるキメラインテグラーゼにより媒介され得る（１９９５年５月２２日出願の出願第０８／４４５，４６６号を参照のこと）。組換えウイルス遺伝子送達ビヒクルが、複製欠損の組換えウイルスであることが好ましい。
【００７０】
上記レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルとの使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（１９９４年５月９日出願の出願第０８／２４０，０３０号を参照のこと；ＷＯ ９２／０５２６６もまた参照のこと）、そして組換えウイルス粒子の産生のためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株、すなわち「ＶＣＬ」とも称される）を作製するために使用され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、ヒト親細胞株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、それにより、ヒト血清における不活化を生き延び得る組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの産生を可能にする。組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築は、ＷＯ９１／０２８０５に詳細に記載される。
【００７１】
組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって、形質導入能力のあるレトロウイルス粒子を作製するために使用され得る（出願第０７／８００，９２１号を参照のこと）。同様に、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルもまた、容易に調節され得、そして本明細書に提供される開示を参照して利用され得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、１９９１、ＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３およびＷＯ９３／０７２８２もまた参照のこと）。
【００７２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルはまた、組換えアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであり得る。このようなビヒクルは、本明細書中に提供される開示（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６，１９８８，およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１，１９９１，ＷＯ ９３／０７２８３，ＷＯ ９３／０６２２３，およびＷＯ ９３／０７２８２を参照のこと）を参照すれば、容易に調製および利用され得る。アデノ随伴ウイルスｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルはまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥのアミノ酸またはヌクレオチドを送達するために構築および使用され得る。
【００７３】
アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルのインビトロでの使用は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１４８５−１４８８（１９９２），Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：７２５７−７２６１（１９９２），Ｗａｌｓｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１４４０−１４４８（１９９４），Ｆｌｏｔｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０（１９９３），Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：７３３−７３８（１９９４），Ｍｉｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０１８３−１０１８７（１９９４），Ｅｉｎｅｒｈａｎｄら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：３３６−３４３（１９９５），Ｌｕｏら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：１２６１−１２６７（１９９５），およびＺｈｏｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２２３−２２９（１９９６）に記載される。これらのビヒクルのインビボでの使用は、Ｆｌｏｔｔｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０６１３−１０６１７（１９９３）、およびＫａｐｌｉｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５３（１９９４）に記載される。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子送達ビヒクルは、トガウイルスに由来する。好ましいトガウイルスとしては、アルファウイルス、特に、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ ９５／０７９９４に記載されるアルファウイルスが挙げられる。シンドビスウイルスおよびＥＬＶＳウイルスを含むアルファウイルスは、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドについての遺伝子送達ビヒクルであり得る。アルファウイルスは、ＷＯ ９４／２１７９２、ＷＯ ９２／１０５７８およびＷＯ ９５／０７９９４に記載される。いくつかの異なるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクル系は、本発明に従ってｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを細胞に送達するために構築および使用され得る。このような系の代表例としては、米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号に記載される系が挙げられる。本発明に使用するために特に好ましいアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルとしては、ＷＯ ９５／０７９９４、および米国特許出願第０８／４０５，６２７号に記載されるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【００７５】
好ましくは、組換えウイルスビヒクルは、シンドビスウイルスに基づく組換えアルファウイルスウイルスビヒクルである。シンドビス構築物、ならびに多数の同様の構築物は、米国特許第出願第０８／１９８，４５０号に本質的に記載される通りに容易に調製され得る。シンドビスウイルス遺伝子送達ビヒクルは、代表的に、シンドビスウイルス転写を開始し得る５’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノムフラグメント転写を防止するように不活化されたウイルス連結領域、およびシンドビスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。必要に応じて、このウイルス連結領域は、サブゲノムポリヌクレオチド転写が減少、増加、または保持されるように改変され得る。当業者によって理解されるように、他のアルファウイルス由来の対応する領域は、上記に記載される領域の代わりに用いられ得る。
【００７６】
アルファウイルス由来遺伝子送達ビヒクルのウイルス連結領域は、サブゲノムポリヌクレオチドの転写を妨害するために不活化された第１のウイルス連結領域、およびサブゲノムポリヌクレオチド転写が減少するように改変された第２のウイルス連結領域を含み得る。アルファウイルス由来ビヒクルはまた、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および転写終結を制御する３’配列を含み得る。
【００７７】
本発明において利用され得る他の組換えトガウイルス遺伝子送達ビヒクルとしては、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ミッデルブルグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ロス川（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ヴェネズエラウマ脳炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）に由来するもの、および米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号、ならびにＷＯ ９２／１０５７８に記載されるものが挙げられる。上記のシンドビスビヒクル、ならびに多数の同様の構築物は、米国特許出願第０８／１９８，４５０号に本質的に記載される通りに容易に調製され得る。
【００７８】
本発明における使用のために適切な他のウイルス遺伝子送達ビヒクルとしては、例えば、ポリオウイルス（Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５，１９８９およびＳａｂｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５，１９７３）（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８）；ライノウイルス（Ａｒｎｏｌｄら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１，１９９０）（ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１０）；ポックスウイルス（例えば、カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら，ＰＮＡＳ ８６：３１７，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７，１９９０；Ｕ．Ｓ．４，６０３，１１２およびＵ．Ｓ．４，７６９，３３０；ＷＯ ８９／０１９７３）（ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１；ＡＴＣＣ ＶＲ−２０１０）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８，１９７９）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５）、（Ｍａｄｚａｋら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７３：１５３３，１９９２）；およびインフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら，Ｃｅｌｌ ５９：１１０７，１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０９：１３，１９８３；およびＹａｐら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８，１９７８）（ＡＴＣＣ ＶＲ−７９７）由来のウイルス遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【００７９】
遺伝子送達ビヒクルを誘導するために用いられ得る他のウイルスとしては、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２，１９８９，およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６６：１５４，１９８８）（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４５）；単純ヘルペスウイルス（Ｋｉｔら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９，１９８９）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９７７；ＡＴＣＣ ＶＲ−２６０）；Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８，１９７９）；ヒト免疫不全ウイルス（ＥＰＯ ３８６，８８２，Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒ． ６６：２７３１，１９９２）；および麻疹ウイルス（ＥＰＯ ４４０，２１９）（ＡＴＣＣ ＶＲ−２４）；Ａ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）が挙げられる。
【００８０】
アウラ（Ａｕｒａ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６００；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）、キャバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）、チクングンヤウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）、キジルアガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）、ヌヅム（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）、ワタロア（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）、Ｙ−６２−３３（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）、オニオン（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ）ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６５；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１；ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）、およびコロナウイルス（Ｈａｍｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１２１：１９０，１９６６）（ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）もまた、遺伝子送達ビヒクルを提供するために用いられ得る。
【００８１】
本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを形成する縮合剤と組み合わされ得る。好ましい実施形態では、この縮合剤は、ポリカチオン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン）である。このような結合を作製するための多くの適切な方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許出願第０８／３６６，７８７号（１９９４年１２月３０日出願）を参照のこと）。
【００８２】
あるいは、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドは、リポソームと組み合わされて遺伝子送達ビヒクルを形成し得る。リポソームは、脂質二重層により取囲まれた水性区画から構成される、代表的には、球状またはわずかに伸長した構造の、直径数百オングストロームの小さな脂質小胞である。適切な条件下で、リポソームは、細胞の原形質膜と、またはリポソームをインターナリゼーションした細胞内のエンドサイトーシス性小胞の膜と融合し得、その結果、その内容物を細胞質に放出する。しかし、細胞の表面との相互作用の前に、リポソーム膜は、その内容物を、例えば、分解酵素から隔離および防御する比較的不透過性の障壁として作用する。
【００８３】
さらに、リポソームは合成構造物であるので、所望の特徴を取り込んだ、特別に設計したリポソームが生成され得る。Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３６−２４０頁，１９７５（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；Ｓｚｏｋａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６００：１，１９８０；Ｂａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４，１９７９；Ｒｉｖｎａｙら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９，１９８７；Ｗａｎｇら．，ＰＮＡＳ ８４：７８５１，１９８７，Ｐｌａｎｔら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０，１９８９および米国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと。リポソームは、本発明に開示されるポリヌクレオチドのようなｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含む、種々の核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、および発現構築物を含む）をカプセル化し得る。
【００８４】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６，１９８７）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１，１９８９）、および精製転写因子（Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２，１９９０）の機能的形態での細胞内送達を媒介することが示された。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５１４８−５１５２．８７，１９９４もまた参照のこと。
【００８５】
他の市販のリポソームとしては、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を用いて、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明に関して、Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８，１９７８；およびＷＯ ９０／１１０９２を参照のこと。
【００８６】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、容易に入手可能であるか（例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から）、または容易に入手可能な材料を用いて容易に調製され得る。このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な比で混合され得る。これらの材料を用いてリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。
【００８７】
リポソームは、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、または大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），第１０１巻，５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３，１９７５；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ １７：７７，１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９，１９７６；Ｏｓｔｒｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６，１９７７；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８，１９７９；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５，１９７９；Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１，１９８０；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５，１９７９；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６，１９８２を参照のこと。
【００８８】
さらに、リポタンパク質は、細胞への送達のためにｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドに含まれ得る。このようなリポタンパク質の例としては、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた使用され得る。天然に存在するリポタンパク質の改変物（例えば、アセチル化ＬＤＬ）もまた、使用され得る。これらのリポタンパク質は、ポリヌクレオチドの送達を、リポタンパク質レセプターを発現する細胞に標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質がポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化するリガンドは組成物中に含まれない。
【００８９】
「裸の」ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチド分子はまた、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように、遺伝子送達ビヒクルとして使用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＤＮＡまたはｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡのいずれかであり得、そして特定の実施形態では、死滅したアデノウイルスに連結される（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２）。他の適切なビヒクルとしては、ＤＮＡ−リガンド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、脂質−ＤＮＡの組合せ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５，１９８７）および微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０，１９９１）が挙げられる。
【００９０】
裸のｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの細胞への摂り込みの効率は、生分解性ラテックスビーズ上にポリヌクレオチドをコーティングすることにより上昇され得、これらのビーズは、効率良く輸送され、そして細胞の核周囲領域に濃縮される。ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドでコーティングしたラテックスビーズは、細胞内に注入され得、そしてビーズがエンドサイトーシスを開始した後、効率良く細胞内に輸送され、従って遺伝子移入および発現効率を上昇させる。この方法は、ビーズの疎水性を増加させるためにビーズを処理することによりさらに改良され得、これにより、エンドソームの破壊および細胞質へのｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの放出を容易にする。
【００９１】
ｈＰＮＱＡＬＲＥは、種々のサイクリンと相互作用して、細胞内で種々の効果を達成し得る。例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥに結合するサイクリンは、転写を調節するために機能し得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥに結合するサイクリンは、酵母ツーハイブリッドアッセイのようなスクリーニングを使用して同定され得る。このアッセイは、とりわけＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−４６，１９８９に記載される。
【００９２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡは、正常組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡ発現レベルと比較すると、腫瘍において過剰発現される。本発明に従って、腫瘍は、（例えば、ｈＰＮＱＡＬＲＥのレベルを減少させるか、またはその機能をブロックもしくは減少させることによって）腫瘍における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させ得る組成物と、腫瘍を接触させることにより処置され得る。処置され得る新形成としては、結腸直腸癌、黒色腫、扁平上皮癌、腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、肉腫、筋肉腫、非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中枢神経系腫瘍（例えば、グリオーム、星状細胞腫、乏突起膠腫、および神経芽腫）、乳癌、混合した起源の腫瘍（例えば、ウィルムス腫瘍および奇形癌）ならびに転移性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。増殖性障害（例えば、無汗性（ａｎｈｙｄｒｉｃ）遺伝性外胚葉性形成異常、先天性肺胞性形成異常、頸部の上皮形成異常、線維性骨形成異常、および乳房形成異常もまた、本発明に従って処置され得る。過形成（例えば、子宮内膜過形成、副腎過形成、乳房過形成、前立腺過形成、もしくは甲状腺過形成）または皮膚の偽上皮腫性増殖もまた、本発明に従って処置され得る。
【００９３】
組成物は、腫瘍細胞のような細胞における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させるように、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現産物に特異的に結合する試薬を含む。本発明の１つの実施形態では、試薬はリボザイム、触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１５３２−１５３９；１９８７；Ｃｅｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８；１９９０、Ｃｅｃｈ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６０５−６０９；１９９２、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５；１９９６を参照のこと。当該分野で公知であるように（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号）、リボザイムは、ＲＮＡ配列を切断することにより、遺伝子機能を阻害するために使用され得る。
【００９４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子のコード配列は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子から転写されるｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを生成するために使用され得る。高度に配列特異的な様式で、トランスで他のＲＮＡ分子を切断し得るリボザイムを、設計し、構築する方法が、当該分野で開発されそして記載されてきた（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１、１９８８を参照のこと）。例えば、リボザイムの切断活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域をリボザイム内に操作することにより、特異的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡに対して標的化され得る。ハイブリダイゼーション領域は、標的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡに相補的な配列を含み、従ってこの標的に特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、ＥＰ ３２１，２０１を参照のこと）。配列番号１、３、５、および７に示されるヌクレオチド配列は、適切なハイブリダイゼーション領域の配列の供給源を提供する。好ましいリボザイム「ハイブリダイゼーション」領域は、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４を、全体にまたは部分的に含む。他の好ましいリボザイム「ハイブリダイゼーション」領域は、配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４、または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３を、全体にまたは部分的に含む。より長い相補的配列が、ハイブリダイゼーション配列の標的への親和性を増加させるために使用され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥリボザイムのハイブリダイズ領域および切断領域は、全体的に関連し得；従って相補的領域を通して標的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ＲＮＡにハイブリダイズする際に、リボザイムの触媒領域は、標的を切断し得る。
【００９５】
当該分野で公知であり、そして上記のように、ｈＰＮＱＡＬＲＥリボザイムは、構築物の一部として細胞内に導入され得る。機械的方法（例えば、微量注入、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿）は、上記のように、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現を減少させることが所望される細胞内に、リボザイム含有構築物を導入するために使用され得る。あるいは、当該分野で公知のように、細胞が構築物を安定に保持することが望ましい場合、その構築物は、プラスミドに供給され、そして別のエレメントとして維持され得るか、または細胞のゲノムへ統合され得る。この構築物は、転写調節エレメント（例えば、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナル）を、細胞内におけるｈＰＮＱＡＬＲＥリボザイムの転写を制御するために、含み得る。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を使用することにより減少される。アンチセンス配列は、配列番号１、３、５、および７に示されるヌクレオチド配列から選択される、ｈＰＮＱＡＬＲＥをコードする配列の少なくとも１部分に相補的である。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のヌクレオチド長であり得る。より好ましくは、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列が、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４に相補的であり、あるいは配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３に相補的である。より長い配列もまた使用され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、構築物中に提供され得、そして本明細書中に開示されるように細胞内に導入されて、細胞における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させ得る。
【００９７】
ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方の組合せであり得る。非ホスホジエステルヌクレオチド間連結（例えば、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステル）で、一方のヌクレオチドの５’末端を、他方のヌクレオチドの３’末端と共有結合で連結することにより、オリゴヌクレオチドは、手動で、または自動合成器で合成され得る。Ｂｒｏｗｎ、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１−８，１９９４；Ｓｏｎｖｅａｕｘ、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１−７２，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８３，１９９０を参照のこと。
【００９８】
正確な相補性は、アンチセンス分子とｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の相補性コード配列との間の首尾良い２重鎖形成のために必要とされない。連続的なヌクレオチド部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）（隣接するｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列に相補的でない）によって各々が隔てられる、例えば２、３、４、または５以上の連続的なヌクレオチド部分（ｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列に正確に相補的である）を含むアンチセンス分子は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡに標的化特異性を提供し得る。好ましくは、連続したヌクレオチドの各部分は、少なくとも４、５、６、７、または８以上のヌクレオチド長である。非相補性介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列との間で耐えられるミスマッチの程度を決定するために、当業者はアンチセンス−センス対の算出された融点を容易に使用し得る。
【００９９】
ｈＰＮＱＡＬＲＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらのｈＰＮＱＡＬＲＥコード配列にハイブリダイズする能力に影響することなく、改変され得る。これらの改変は、アンチセンス分子の内部または一方の末端もしくは両末端であり得る。例えば、ヌクレオシド間ホスフェート連結は、種々の炭素数の残基を有するコレステリル部分またはジアミン部分を、アミノ基と末端リボースとの間に加えることにより改変され得る。改変された塩基および／もしくは糖（例えば、リボースの代りのアラビノース）または３’，５’−置換オリゴヌクレオチド（３’ヒドロキシル基または５’ホスフェート基が置換されている）はまた、改変アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。これらの改変オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法により調製され得る。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８，１９９２；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４，１９９０；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２１５：３５３９−３５４２，１９８７を参照のこと。
【０１００】
ｈＰＮＱＡＬＲＥエピトープに特異的に結合し、特にｈＰＮＱＡＬＲＥのサイクリン結合ドメインに結合する本発明の抗体はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質に結合し、そして細胞内で機能し得るｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させることにより、機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを変更するために使用され得る。本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドは、上記のように細胞内に導入され得る。
【０１０１】
好ましくは、細胞における機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥのレベルを減少させるために使用される機構は、機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％減少させる。最も好ましくは、機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルは、少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％減少される。機能性ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを減少させるために選ばれる機構の有効性は、当該分野で周知の方法（例えば、ヌクレオチドプローブのｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的抗体を使用するｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質の検出、またはサイクリン依存性キナーゼ活性の測定）を使用して評価され得る。サイクリン依存性キナーゼ活性についてのアッセイは、例えばＬｏｃｋら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：３９９−４０９に教示される。
【０１０２】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ抗体、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。このようなキャリアとしては、大きくて、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子）が挙げられるが、これに限定されない。薬学的に受容可能な塩はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物において使用され得、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩のような鉱酸塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸塩が挙げられる。ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物はまた、液体（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール）ならびに湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソーム（例えば、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９１／１４４４５、またはＥＰ５２４，９６８Ｂ１に記載されるリポソーム）はまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物のためのキャリアとして使用され得る。
【０１０３】
代表的に、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物は、注射可能物質として（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）調製される；しかし注射の前の液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適切な固体形態も調製され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物はまた、腸溶性錠剤またはゲルカプセル内に、当該分野で公知の方法（例えば、米国特許第４，８５３，２３０号、ＥＰ ２２５，１８９、ＡＵ ９，２２４，２９６、およびＡＵ ９，２３０，８０１に記載される方法）により、処方され得る。
【０１０４】
本発明のｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の投与は、局所投与または全身投与（注射、経口投与、パーティクルガン、またはカテーテル挿入投与を含む）ならびに表面（ｔｏｐｉｃａｌ）投与を含み得る。種々の方法が、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物を直接身体中の特定の部位に投与するために使用され得る。腫瘍におけるアポトーシスを誘導するために、例えば、適切なｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物が、腫瘍の本体内の数ヶ所の異なる場所に、数回注射される。あるいは、腫瘍に供給する動脈が同定され得、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物がこのような動脈内に、組成物を腫瘍へ送達するために、注入され得る。
【０１０５】
壊死中心を有する腫瘍は吸引され得、そしてｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物が、今や空になった腫瘍の中心に直接注入され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物はまた、腫瘍の表面に、例えばこの組成物の表面適用により直接投与され得る。Ｘ線画像化は、これらの送達方法の確実性を補助するために使用され得る。組合せた治療剤（ｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的な抗体、リボザイム、もしくはオリゴヌクレオチドまたはｈＰＮＱＡＬＲＥ特異的な抗体、リボザイム、もしくはオリゴヌクレオチドをコードするサブゲノムｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドを含む）が、他の治療剤と同時に、または続けて投与され得る。
【０１０６】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物は、レセプター媒介標的化送達を使用して、特定の組織に送達され得る。レセプター媒介ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：２０２−０５，（１９９３）；Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６２１−２４，１９８８；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５４２−４６、１９９４；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、３６５５−５９、１９９０；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３３８−４２，１９９１に教示される。
【０１０７】
特定のｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の用量およびこの組成物を投与する手段の両方は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の特定の特性、患者の状態、患者の年齢、および患者の体重、処置される特定の疾患の進行度、ならびに関連する要因に基づいて、決定され得る。組成物がｈＰＮＱＡＬＲＥ抗体を含む場合、この組成物の有効な投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約５μｇ〜約５０ｍｇの範囲、１ｋｇあたり約５０μｇ〜約５ｍｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約５００μｇの範囲、および１ｋｇあたり約２００μｇ〜約２５０μｇの範囲である。
【０１０８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムコード配列または抗体コード配列を含む、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドを含む組成物は、局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与され得る。適切な濃度は、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの範囲である。作用の方法ならびに形質転換および発現の効力のような要因は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物の最終的な効力のために必要とされる投薬量に影響する、考慮すべき問題である。より広い面積の組織にわたってより高い発現が所望される場合、より大量のｈＰＮＱＡＬＲＥ組成物、もしくは連続して投与される同じ量、または別々の（例えば、腫瘍部位の）隣接した組織部分または近傍の組織部分への数回の投与が、正の治療結果を遂げるために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用的な実験により、最適な治療効果のための特定の範囲が決定される。
【０１０９】
細胞における内因性ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現は、内因性ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子とインフレームで、ＤＮＡ構築物（ｈＰＮＱＡＬＲＥ標的化配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー部位を含む）を相同組換えにより導入することにより変更され得、その結果、新しいｈＰＮＱＡＬＲＥ転写ユニットを含む相同組換え細胞が、形成される。この新しい転写ユニットは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子を所望により開始または終了させるために使用され得る。内因性遺伝子発現に影響を及ぼすこの方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示される。
【０１１０】
標的化配列は、配列番号１、３、５、または７に示されるヌクレオチド配列から選択される、少なくとも１０、１２、１５、２０、または５０の連続したヌクレオチドのセグメントである。好ましい標的化配列は、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３から選択される。新しい転写ユニットは、内因性ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子のコード配列の上流に配置される。外因性調節配列は、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子のコード配列の転写を指向する。
【０１１１】
本発明はまた、哺乳動物（好ましくはヒト）における新形成を、診断または予後判定する方法を提供する。新形成であることが疑われる第一の組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現は、正常である第二の組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の発現と比較され得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号１、３、５、または７に示されるコード配列を有し得る。好ましくは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子は、配列番号５および配列番号７のヌクレオチド７６〜１１４ならびに／あるいは配列番号３のヌクレオチド５０３〜５６４または配列番号５もしくは配列番号７のヌクレオチド５４２〜６０３を含む。
【０１１２】
例えば、当該分野で公知であるように、第一および第二の組織における、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡまたはｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質のレベルを測定することにより、比較がなされ得る。第一の組織および第二の組織は、同じ被験体か、または異なる被験体に由来し得る。第一の組織および第二の組織は、異なる型であり得るが、好ましくは同じ型の組織（例えば、腸ポリープ）由来である。あるいは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子発現の標準曲線は、多数の正常組織サンプルから決定され得、そして新形成であることが疑われる組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子発現との比較のために使用され得る。
【０１１３】
第二組織におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子発現または標準曲線との比較による、ｈＰＮＱＡＬＲＥ遺伝子の第一組織における過剰発現は、第一組織における新形成を示す。過剰発現のレベルは、新形成の病期と相関し得、そして例えば、患者（好ましくはヒト患者）の処置をモニターするために使用され得る。
【０１１４】
ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドはまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの細胞への移入を増加させるために有用な化合物、またはｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの細胞内でのその後の生物学的効果を強めるために有用な化合物についての、試験化合物のスクリーニングの目的のために、被験体に送達され得る。このような生物学的効果としては、相補的ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションおよびその翻訳の阻害、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡ、単鎖抗体、リボザイム、オリゴヌクレオチド、もしくはタンパク質および／またはｈＰＮＱＡＬＲＥを形成するｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの発現、ならびにｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの複製および組込みが挙げられる。被験体は、細胞培養物または動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）であり得る。
【０１１５】
スクリーニングされ得る試験化合物は、天然の産物または合成的なもののどちらでも、任意の物質を含み、この物質はインビトロまたはインビボで被験体に投与され得る。化合物のライブラリーまたは混合物が試験され得る。化合物または物質は、薬学的効果が以前に既知かまたは未知であるものであり得る。化合物または物質は、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの前、後、またはそれと同時に送達され得る。それらは、ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドと別々に、または混合して、投与され得る。
【０１１６】
送達されたｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの組込みは、当該分野で公知の任意の手段でモニターされ得る。例えば、送達されたｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドのサザンブロットが行なわれ得る。送達されたポリヌクレオチドのフラグメントのサイズにおける変化は、組込みを示す。送達されたポリヌクレオチドの複製は、とりわけ、ｈＰＮＱＡＬＲＥプローブへのハイブリダイゼーションを用いて結合された標識ヌクレオチドの取り込みを検出することにより、モニターされ得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの発現は、送達されたポリヌクレオチドにハイブリダイズするｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの産生を検出することにより、またはｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質を検出することにより、モニターされ得る。ｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質は、免疫学的に検出され得る。従って、本発明に従ったｈＰＮＱＡＬＲＥサブゲノムポリヌクレオチドの送達は、インビトロまたはインビボでの動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）の細胞における、送達、組込み、ハイブリダイゼーション、発現、複製または取込みを高めることにより、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリヌクレオチドの細胞への移入を高める能力について、試験化合物をスクリーニングするための、優秀なシステムを提供する。
【０１１７】
本開示中で引用される全ての参考文献の全内容は、本明細書中に参考として明白に援用される。以下のものは、例示的な目的のためのみに提供され、上記の広範な用語で記載された本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【０１１８】
（実施例）
（実施例１）
本実施例は、ヒト組織および細胞株におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの発現を示す。
【０１１９】
人の心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血リンパ球のノーザンブロットを、ｈＰＮＱＡＬＲＥ発現のためにアッセイした。細胞株ＨＬ−６０、Ｈｅｌａ、Ｍｏｌｔ−４、Ｋ５６５、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９およびＧ３６１もまた、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡ発現のためにアッセイした。
【０１２０】
ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡは、ほとんどの組織において非常に低いレベルで発現する。発現は、脳、脾臓、精巣、および卵巣において最も目立った。対照的に、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡは、癌細胞株においてより高いレベルで発現した。ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの発現は、細胞株Ｋ５６５、Ａ５４９、Ｇ３６１およびＳＷ４８０において最も高かった。
【０１２１】
これらの結果は、対応する正常組織における発現レベルと比較して、ｈＰＮＱＡＬＲＥが癌細胞株において過剰発現することを示す。
【０１２２】
（実施例２）
本実施例は、発達中のマウス胚におけるｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡの分布を記載する。
【０１２３】
マウス胚を、Ｎｉｅｔｏら、１９９６、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５１：２１９−３５に記載のような、全量（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーションのためにプロセスし、そしてＬｙｎ，Ｓ．Ｄ．、１９９８、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９：６７−６９に記載されるような当該分野において周知の方法によって実施し得る。全量胚上に対するインサイチュハイブリダイゼーションは、ｈＰＮＱＡＬＲＥ ｍＲＮＡが胚組織において、特に発達中の肢において全体的に発現することを示す。
【０１２４】
これらの結果は、ｈＰＮＱＡＬＲＥが、胚発達の時期にわたって特定の組織において差示的に発現されえることを示す。
【０１２５】
（実施例３）
本実施例は、ｈＰＮＱＡＬＲＥに対するポリクローナル抗体の産生を示す。
【０１２６】
ウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンに結合したＮ−ＨＤＦＨＶＤＲＰＬＥＥＳＬＩＮＰＥＬＩＲＰ−Ｃ（配列番号１７）の配列を有するｈＰＮＱＡＬＲＥのペプチドフラグメントで免疫した。ポリクローナル抗体の調製物を産生した。この抗体は、ＣＯＳ細胞およびＵ８７細胞から発現したｈＰＮＱＡＬＲＥタンパク質を認識した。
【０１２７】
これらの結果は、ｈＰＮＱＡＬＲＥポリペプチドフラグメントを免疫原として用い得ることを実証する。
【０１２８】
当業者は、せいぜい慣用的実験法を用いて、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認する。このような特定の実施形態および等価物は、添付の特許請求の範囲によって含まれることが意図される。
【０１２９】
すべての特許、公開された特許出願、および本明細書中に引用された出版物は、本明細書中に完全に示されるように、参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【公開番号】特開２０１０−１６２０３６（Ｐ２０１０−１６２０３６Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４８４１０（Ｐ２０１０−４８４１０）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【分割の表示】特願２０００−５８８３６７（Ｐ２０００−５８８３６７）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１６日（１９９９．１２．１６）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【出願人】（５０１２４２１４７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【分割の表示】特願２０００−５８８３６７（Ｐ２０００−５８８３６７）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１６日（１９９９．１２．１６）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【出願人】（５０１２４２１４７）
【Ｆターム（参考）】
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